MX2012006467A - PROTEINAS DE ENLACE A ANTIGENOS HUMANAS QUE ENLAZAN ß-KLOTHO, RECEPTORES FGF Y COMPLEJOS DE LOS MISMOS. - Google Patents

PROTEINAS DE ENLACE A ANTIGENOS HUMANAS QUE ENLAZAN ß-KLOTHO, RECEPTORES FGF Y COMPLEJOS DE LOS MISMOS.

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Abstract

La descripción actual proporciona composiciones y métodos relacionados con o derivados de proteínas de enlace a antígenos que activan la señalización mediada por FGF21. En modalidades, las proteínas de enlace a antígenos enlazan específicamente a (i) ß-Klotho; (ii) FGFR1c, FGFR2c, FGFR3c o FGFR4; o (iii) un complejo que comprende ß-Klotho y uno de FGFR1c, FGFR2c, FGFR3c, y FGFR4. En algunas modalidades las proteínas de enlace a antígenos inducen señalización del tipo FGF21. En algunas modalidades, las proteínas de enlace a antígenos son anticuerpos completamente humanos, humanizados, o quiméricos, fragmentos de enlace y derivados de tales anticuerpos, y polipéptidos que enlazan específicamente a (i) ß-Klotho; (ii) FGFR1c, FGFR2c, FGFR3c o FGFR4; o (iii) un complejo que comprende ß-Klotho y uno de FGFR1c, FGFR2c, FGFR3c, y FGFR4. Otras modalidades proporcionan ácidos nucleicos que codifican tales proteínas de enlace a antígenos, y fragmentos y derivados de las mismas, y polipéptidos, células que comprenden tales polinucleótidos, métodos de elaboración de tales proteínas de enlace a antígenos, y fragmentos y derivados de las mismas, y polipéptidos, y métodos de uso de tales proteínas de enlace a antígenos, fragmentos y derivados de las mismas, y polipéptidos, que incluyen métodos de tratamiento o diagnóstico de sujetos que padecen de diabetes tipo 2, obesidad, NASH, síndrome metabólico y trastornos o condiciones relacionadas.

Description

PROTEÍNAS DE ENLACE A ANTÍGENOS HUMANAS QUE ENLAZAN B-KLOTHO RECEPTORES FGF Y COMPLEJOS DE LOS MISMOS CAMPO DE LA INVENCIÓN La presente descripción se refiere a moléculas de ácido nucleico que codifican proteínas de enlace a antígenos que enlazan a (i) ß-Klotho; (ii) FGFRlc, FGFR2c, FGFR3c o FGFR4 ; o (iii) un complejo que comprende ß-Klotho y uno de FGFRlc, FGFR2c, FGFR3c, y FGFR . La presente descripción también proporciona proteínas de enlace a antígenos que enlazan a (i) ß-Klotho; (ii) FGFRlc, FGFR2c, FGFR3c o FGFR4 ; o (iii) un complejo que comprende ß-Klotho y uno de FGFRlc, FGFR2c, FGFR3c, y FGFR4, incluyendo proteínas de enlace a antígenos que inducen la señalización del tipo FGF21, así como composiciones farmacéuticas que comprenden proteínas de enlace a antígenos que enlazan a (i) ß-Klotho; (ii) FGFRlc, FGFR2c, FGFR3c o FGFR ; o (iii) un complejo que comprende ß-Klotho y uno de FGFRlc, FGFR2c, ' FGFR3c, y FGFR4, incluyendo proteínas de enlace a antígenos que inducen la señalización del tipo FGF21, y métodos para el tratamiento de trastornos metabólicos al usar tales ácidos nucleicos, polipéptidos, o composiciones farmacéuticas. También se proporcionan métodos de diagnóstico al usar .las proteínas de enlace a antígenos.
ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN El Factor 21 de Crecimiento de Fibroblastos (FGF21) es un polipéptido secretado que pertenece a una subfamilia de Factores de Crecimiento de Fibroblastos (FGFs) que incluye FGF19, FGF21, y FGF23 (Itoh et al., (2004) Trend Genet. 2_0: 563-69). FGF21 es un FGF atipico en que es independiente de la heparina y funciona como una hormona en la regulación de la glucosa, lipidos, y- metabolismo de energía.
Es altamente expresado en el hígado y el páncreas y es el único miembro de la familia FGF que se expresa principalmente en el hígado. Los ratones transgénicos que sobreexpresan FGF21 muestran fenotipos metabólicos de baja tasa de crecimiento, bajos niveles de glucosa en plasma y triglicéridos, y una ausencia de diabetes tipo 2 asociada con la edad, hiperplasia de isletas, y obesidad. La administración farmacológica de proteína recombinante FGF21 en modelos de roedores y de primates resulta en niveles normalizados de glucosa en plasma, niveles reducidos de colesterol y triglicéridos y tolerancia mejorada a la glucosa y sensibilidad a la insulina. Además, el FGF21 reduce el peso corporal y la grasa corporal por incremento en el gasto de energía, actividad física, y tasa metabólica. La investigación experimental proporciona apoyo para la administración farmacológica de FGF21 para el tratamiento de diabetes tipo 2, obesidad, dislipidemia, y otras afecciones o trastornos metabólicos en humanos.
FGF21 es una hormona endocrina derivada del hígado que estimula la absorción de la glucosa en los adipocitos y la homeostasis de lípidos a través de la activación de su receptor. De manera interesante, además del receptor canónico FGF, el receptor FGF21 también comprende la ß-Klotho asociada a membranas como un cofactor esencial. La activación del receptor FGF21 lleva a efectos múltiples en una variedad de parámetros metabólicos..
En los mamíferos, los FGFs median su acción por medio de un conjunto de cuatro receptores FGF, FGFR1-4, que a su vez se expresan en múltiples variantes empalmadas, por ejemplo, FGFRlc, FGFR2c, FGFR3c y FGFR4. Cada receptor FGF contiene un dominio intracelular de tirosina ' cinasa que se activa con el enlace a ligandos, lo · que conduce a trayectorias de señalización cadena abajo que involucran MAPKs (Erkl/2), RAF1, AKT1 y STATs . ( Kharitonenkov et al., (2008) BioDrugs 2_2: 37-44). Diversos informes sugirieron que las variantes de empalme del reportero "c" de FGFR1-3 muestran afinidad específica a ß-Klotho y puede actuar como receptor endógeno para FGF21 (Kurosu et al., (2007) J. Biol . Chem. 282:26687-26695); Ogawa et al., (2007) Proc. Nati. Acad. Sci. USA 104:7432-7437); Kharitonenkov et al., (2008) J. Cell Physiol. 215:1-7) . En el hígado, que expresa abundantemente tanto ß-Klotho y FGFR4, FGF21 no induce la fosforilación de MAPK si bien es cierto el fuerte enlace de FGF21 al complejo p-Klotho-FGFR4. En las células 3T3-L1 y el tejido adiposo blanco, FGFR1 es por mucho el receptor más abundante, y es por lo tanto más probable que los receptores funcionales principales de FGF21 en este tejido sean los complejos de ß-Klotho/FGFRlc.
La presente descripción proporciona una proteína de enlace a antígenos humana (o humanizada) , tal como un anticuerpo monoclonal, que induce la señalización del tipo FGF21, por ejemplo, un anticuerpo agonista que imita la función de FGF21. Tal anticuerpo es una molécula con actividad y selectividad del tipo FGF21 pero con características terapéuticamente deseables añadidas típicas de un anticuerpo tal como estabilidad de proteínas, carencia de inmunogenicidad, facilidad de producción y vida media prolongada in vivo.
SUMARIO DE LA INVENCION Una proteína aislada- de enlace a antígenos que induce la señalización mediada por FGF21 se proporciona.
También se proporciona una proteína aislada de enlace a antígenos que enlaza específicamente a al menos uno de: (i) ß-Klotho; (ii) FGFRlc, FGFR2c, FGFR3c o FGFR ; y (iii) un complejo que comprende ß-Klotho y uno de FGFRlc, FGFR2c, FGFR3c y FGFR4. en donde la proteína de enlace a antígenos induce señalización mediada por FGF21.
En una modalidad, las proteínas de enlace a antígenos proporcionadas comprenden una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste, en: (a) una CD3 de cadena ligera que comprende una secuencia seleccionada del grupo que consiste en: (i) una secuencia de cadena ligera CDR3 que difiere por no más de un total de tres adiciones, sustituciones, y/o eliminaciones de aminoácidos a partir de una secuencia CDR3 seleccionada del grupo que consiste en las secuencias de cadena ligera CDR3 de L1-L18, SEQ ID NOs : 180-194; (ii) QVWDXiX2SDHW (SEQ ID NO: 276); (iii) QQX3GXX5X6X7T (SEQ ID NO: 283); (iv) LQHNSYPLT (SEQ ID NO: 267); (v) MQSLQTPFT (SEQ ID NO: 268); (vi) QQYNNWPPT (SEQ ID NO: 269); (vii) MQSIQLPRT (SEQ ID NO: ' 270);. (viii) QQANDFPIT (SEQ ID NO: 271); (ix) MQALQTPCS (SEQ ID- NO: 272); (b) una secuencia de cadena pesada CDR3 que comprende una secuencia seleccionada del grupo ' que consiste en: (i) una secuencia de cadena pesada CDR3 que difiere por no más de un total de cuatro adiciones, sustituciones, y/o eliminaciones de aminoácidos de una secuencia CDR3 seleccionada del grupo que consiste en las secuencias de cadena pesada CDR3 de H1-H18, SEQ ID NOs:145-157; (ii) X34X16X17X18GXi9YYYX2oGMDV (SEQ ID NO: 322); (iii) SLIVVX21VY ' X22LDX23 (SEQ ID NO: 326); (iv) IVVVPAAIQSYYYYYGMGV (SEQ ID NO : 311); (v) DPDGDYYYYGMDV (SEQ ID NO: 312); (vi) TYSSGWYVWDYYGMDV (SEQ ID NO: 313); (vii) DRVLSYYAMAV. (SEQ ID NO : 314); (viii) VRIAGDYYYYYGMDV (SEQ ID NO: 315); (ix) ENIVVIPAAIFAGWFDP (SEQ ID NO: 316); y (x) DRAAAGLHYYYGMDV (SEQ ID NO : 317); o (c) la secuencia de cadena ligera CDR3 de (a) y la secuencia de cadena pesada CDR3 de (b) ; en donde, Xi es G, S o N; X2 es N, S o T; X3 es C, Y o S; X4 es G o S; X5 es A o S; X6 es P o F; X7 is L o está ausente; X34 es I, V .0 S; X1G es L o V; X1 es L, T o V; Xi8 es L, V, G o T; X19' es A, G o está ausente; X2o es Y, C o D; X2 i es I o M; X22 es A o V; y X23 es H o Y; y en donde la proteina de enlace a antigenos enlaza específicamente (i) ß-Klotho; (ii) FGFRlc, . FGFR2c, FGFR3c o FGFR ; o (iii) un complejo que comprende ß-Klotho y uno de FGFRlc, FGFR2c, FGFR3c, y FGFR .
En otra modalidad las proteínas de enlace a antígenos proporcionadas comprenden ya sea: (a) una secuencia de cadena ligera CDR1 seleccionada del grupo que consiste en: (i) una CDR1 de cadena ligera que difiere por no más de tres adiciones, sustituciones, y/o eliminaciones de aminoácidos de una secuencia de CDR1 de L1-L18, SEQ ID NOs: 158-170; (ii) RASQ X9 Xi0XiiXi2Xi3Xi LA (SEQ ID NO: 304); (iii) GGNNIGSX15SVH (SEQ ID NO: 307); (iv) RS SQSLLX29X30NGX31X32X33LD (SEQ ID NO: 310); (v) RASQSVNSNLA (SEQ ID NO:' 295); (vi) RASQDIRYDLG (SEQ ID NO: 296); (vii) RASQGISIWLA (SEQ ID NO: 297); y (viii) KSSQSLLQSDGKTYLY (SEQ ID NO: 298); (b) una secuencia de cadena ligera CDR2 seleccionada del grupo que consiste en: (i) una CDR2 de cadena ligera que difiere por no más de dos adiciones, sustituciones, y/o eliminaciones de aminoácidos de una secuencia CDR2 de L1-L18, SEQ ID NOs: 171-179; (ii) LGSX27RAS (SEQ ID NO: 290); (iii) GX8SX28RAT (SEQ ID NO: 294); (iv) AASSLQS (SEQ ID NO: 284); (v) GVSTRAT (SEQ ID NO: 285); (vi) DDSDRPS (SEQ ID NO: 286); (vii) EVSNRFS (SEQ ID NO: 287); (c) una secuencia de cadena pesada CDR1 seleccionada del grupo que consiste en: (i) una CDR1 de cadena pesada que difiere por no más de dos adiciones, sustituciones, y/o eliminaciones de aminoácidos de una secuencia de CDR1 de Hl-H18, SEQ ID NOs: 121-131; y (ii) NARMGVX39 (SEQ ID NO: 352); (iii) X40YG IH (SÉQ ID NO: 355); (iv) DLS H (SEQ ID NO: 345); (v) DAWMS (SEQ ID NO: 346); (vi) TYAMS (SEQ ID NO: 347); (vii) SYFWS (SEQ ID NO: 348); (viii) SYY S (SEQ ID NO: 131); (ix) SGGYNWS (SEQ ID NO: 349); (d) una CDR2 de cadena pesada seleccionada del grupo que consiste en: (i) una secuencia pesada que difiere por no más de tres adiciones, sustituciones, y/o eliminaciones . de aminoácidos de una secuencia CDR2 de H1-H18, SEQ ID NOs: 132-144; (ii) HIFSNDEKSYSTSLKX24 (SEQ ID NO: 333); (iii) X25ISGSGVSTX26YADSVKG (SEQ . ID NO: 338); (iv) VI YDGSX35 YYX36DSVKG . (SEQ ID NO: 341); (v) X37IYX38SGSTX4iYNPSLKS (SEQ ID NO: 344); (vi) GFDPEDGETIYAQKFQG (SEQ ID NO:- 327); (vii) RIKSKTDGGTTDYAAPVKG (SEQ ID NO: 328); (viii) RIYTSGSTNYNPSLKS (SEQ ID NO: 329); (ix) RIKSKDGGTTDYAAPVKG (SEQ ID NO: 330); (x) RIKSKX42DGGTTDYAAPVKG (SEQ ID NO: 483); en donde X9 es N o S; X10 es V o F; Xn es D o S; X12 es G o S; X13 es S, N o T; Xi4 es S o Y; Xi5 es E o Q; X29 es Y o H; X30 es Y o S; X31 es F o Y; X32 es T o N; X33 es Y o F; X27 es N o D; X9 es A o T; X28 es S o F; X39 es S o N; X24 es S o N; X25 es G o A; X26 es H, Y o N; X35 es D o I; X36 es A o G; X37 es N o R; X38 es Y o T; X41 es Y o N; X42 es T o está ausente; (e) la CDRl de cadena ligera de (a) y la CDR2 de cadena ligera de (b) ; (f ) la CDRl de cadena ligera de (a) y la CDRl de cadena pesada de (c) ; (g) la CDRl de cadena ligera de (a) y la CDR2 de cadena pesada de (d) ; (h) la CDRl de cadena ligera (b) y la CDRl de cadena pesada de (c) ; (i) la CDRl de cadena pesada de (c) y la CDR2 de cadena pesada de (d) ; (j) la CDR2 de cadena ligera de (b) y la CDR2 de cadena pesada de (d) ; (k) la CDRl de cadena ligera de (a), la CDR2 de cadena ligera de (b) , y la CDRl de cadena pesada de (c) ; (1) la CDR2 de cadena ligera de (b) , la CDRl pesada de (c) , y la CDR2 de cadena pesada de (d) ; (m) la CDRl de cadena ligera de (a) , la CDRl de cadena pesada de (c) , y la CDR2 de cadena pesada de (d) ; o (n) la CDRl de cadena ligera de (a) , la CDR2 de cadena ligera de (b) , la CDR2 de cadena pesada de (c) , y la CDR2 de cadena pesada de (d) , en donde la. proteina de enlace a antigenos enlaza especificamente (i) ß-Klotho; (ii) FGFRlc, FGFR2c, FGFR3c o FGFR4; o (iii) un complejo que comprende ß-Klotho y uno de FGFRlc , FGFR2c, FGFR3c, y FGFR .
Todavía en otra modalidad, las proteínas de enlace a antígenos proporcionadas comprenden ya sea: (a) un dominio variable de cadena ligera que comprende; (i) una secuencia de cadena ligera CDRl seleccionada de SEQ ID NOs : 158-170 ; (ii) una secuencia de cadena ligera CDR2 seleccionada de SEQ ID NOs: 171-179; (iii) · una secuencia de cadena ligera CDR3 seleccionada de SEQ ID NOs: 180-194; y (b) un dominio variable de cadena pesada que comprende: (i) una secuencia de cadena pesada CDRl seleccionada ' de SEQ ID NOs:121-131; (ii) una secuencia de cadena pesada CDR2 seleccionada de SEQ ID NOs: 132-144; y (iii) una secuencia de cadena pesada CDR3 seleccionada de SEQ ID NOs : 145-157 ; o (c) el dominio variable de cadena ligera de '(a) y el dominio variable de cadena pesada de (b) , en donde la proteína de enlace a antígenos enlaza específicamente (i) ß-Klotho; (ii) FGFRlc, FGFR2c, FGFR3c o FGFR4; o (iii) un complejo que comprende ß-Klotho y uno de FGFRlc, FGFR2c, FGFR3c, y FGFR4.
En una modalidad adicional las proteínas de enlace a antígenos proporcionadas comprenden ya sea: (a) una secuencia de dominio variable de cadena ligera seleccionada del grupo que consiste en: (i) aminoácidos que tienen una secuencia al menos 80% idéntica a una secuencia de dominio variable de cadena ligera seleccionada de VL1-VL18, SEQ ID NOs: 8-65; (ii) una secuencia de aminoácidos codificada por una secuencia de poliriucleótidos que es al menos 80% idéntica a una secuencia de polinucleótidos que codifica la secuencia de dominio variable de cadena ligera de VL1-VL18, SEQ ID NOs: 48-65; (b) una secuencia de dominio variable de cadena pesada seleccionada del grupo que consiste en: (i) una secuencia de aminoácidos que es al menos 80% idéntica a una secuencia de dominio variable de cadena pesada de VH1-VH18 de SEQ ID NOs: 66-84; (ii) una secuencia de aminoácidos codificada por una secuencia de polinucleótidos que es al menos 80% idéntica a una secuencia de polinucleótidos que codifica la secuencia de dominio variable de cadena pesada de VH1-VH18, SEQ ID NOs: 66-84; o (c) el dominio variable de cadena ligera de (a) y el dominio variable de. cadena pesada de (b) ; en donde la proteína de enlace a antígenos enlaza específicamente (i) ß-Klotho; (ii) FGFRlc, FGFR2c, FGFR3c o FGFR ; o (iii) un complejo que comprende ß-Klotho y uno de FGFRlc, FGFR2c, FGFR3c, y FGFR4. En modalidades particulares las proteínas de enlace a antígenos proporcionadas comprenden ya sea: (a) una secuencia de dominio · variable de cadena ligera seleccionada del grupo que consiste en: VL1-VL18 de SEQ ID NOs: 48-65; (b) una secuencia de dominio variable de cadena pesada seleccionada del grupo que consiste en: VH1-VH18 de SEQ ID NOs: 66-84; o (c) el dominio variable de cadena ligera de (a) y el dominio variable de cadena pesada de (b) , en donde la proteína de enlace a antígenos enlaza específicamente (i) ß-Klotho; (ii) FGFRlc, FGFR2c, FGFR3c o FGFR ; o (iii) un complejo que comprende ß-Klotho y uno de FGFRlc, FGFR2c, FGFR3c, y FGFR4. En otras modalidades particulares, las proteínas de enlace a antígenos proporcionadas el dominio variable de cadena ligera y un dominio variable de cadena pesada son seleccionadas del grupo de combinaciones que consisten en: VL1VH1, VL2VH2, VL3VH3, VL3VH4, VL4VH5, VL5VH6, VL6VH7, VL7VH8, VL8VH8, VL9VH9, VL9VH10, VL10VH11, Vl11Vh11, Vl12Vh12, VL13VH13, Vl14Vh14, Vl15Vh15, VL16VH16, VL17VH17, y VL18VH18, en donde la proteína de enlace a antígenos enlaza específicamente (i) ß-Klotho; (ii) FGFRlc, FGFR2c, FGFR3c o FGFR4; o (iii) un complejo que comprende ß-Klotho y uno de FGFRlc, FGFR2c, FGFR3c, y FGFR4. Todavía en modalidades adicionales las proteínas de enlace a antígenos proporcionadas además comprenden: (a) la secuencia constante de cadena ligera de SEQ ID NO: 10; (b) la secuencia constante de cadena ligera de SEQ ID NO: 11; (c) la secuencia constante de cadena pesada de SEQ ID NO: 9; o (d) la secuencia constante de cadena ligera de SEQ ID NO: 10 o SEQ ID NO: 11 y la secuencia constante de cadena pesada de SEQ ID NO: 9.
Las proteínas de enlace a antigenos proporcionadas pueden tomar muchas formas y pueden ser, por ejemplo, un anticuerpo humano, un anticuerpo humanizado, anticuerpo quimérico, un anticuerpo monoclonal, un anticuerpo policlonal, un anticuerpo recombinante, un fragmento de anticuerpo de enlace a antígenos, un anticuerpo de cadena sencilla, un diacuerpo, .un triacuerpo, un tetracuerpo, un fragmento Fab, un fragmento F(fab')2f un anticuerpo de dominio, un anticuerpo ' IgD, un anticuerpo IgE, un anticuerpo Ig , un anticuerpo IgGl, un anticuerpo IgG2, un anticuerpo IgG3, un anticuerpo IgG4, o un anticuerpo IgG4 que tiene al menos una mutación en la región de articulación.
En otra modalidad, las proteínas de enlace a antígenos proporcionadas cuando se enlazan a (i) ß-Klotho; (ii) FGFRlc, FGFR2c, FGFR3c o FGFR4 ; o (iii) un complejo que comprende ß-Klotho y uno de FGFRlc, FGFR2c, FGFR3c, y FGFR4 : (a) enlazan a (i) ß-Klotho; (ii) FGFRlc, FGFR2c, FGFR3c o FGFR4; o (iii) un complejo que comprende ß-Klotho y uno de FGFRlc, FGFR2c, FGFR3c, y FGFR4, sustancialmente con la misma Kd como un anticuerpo de referencia; (b) induce la señalización del tipo FGF21 de 10 % o mayor que la señalización inducida por un estándar de tipo natural FGF2 que comprende la forma madura de SEQ ID NO: 2 cuando se mide en un ensayo reportero de ELK-luciferasa; (c) exhibe . una EC50 de ???? o menos de señalización del tipo FGF21 en un ensayo seleccionado del grupo que consiste en: (i) un ensayo basado en células recombinantes de FGFRlc/mediado por ß-Klotho in vi tro; y (ii) un ensayo funcional de adipocitos humanos in vitro; (d) exhibe una EC50 de menos de ???? de actividad agonista sobre FGFRlc en la presencia de ß-Klotho en un ensayo de reportero mediado por el receptor FGFRlc recombinante in vitro; y (e) exhibe una EC50 mayor que ?µ de actividad agonista sobre FGFRlc en la ausencia de ß-Klotho en un ensayo de reportero mediado por el receptor FGFRlc recombinante in vitro; o (f) compite por enlace con un anticuerpo de referencia para (i) ß-Klotho; (ii) FGFRlc, FGFR2c , FGFR3c o FGFR4; o (iii) un complejo que comprende ß-Klotho y uno de FGFRlc, FGFR2c, FGFR3c, y FGFR4, ert donde el anticuerpo de referencia comprende una combinación de secuencias de dominio variable de cadena ligera y cadena pesada seleccionadas del grupo que consiste en VL1VH1, VL2VH2, VL3VH3, VL3VH4, VL4VH5, VL5VH6, VL6VH7, VL7VH8, VL8VH8, VL9VH9, VL9VH10, VL10VH11, VL11VH11, VL12VH12, VL13VH13, VL14VH14, ' VL15VH15, VL16VH16, VL17VH17, y VL18VH18. En otras modalidades- las proteínas de enlace a antígenos proporcionadas pueden luego enlazarse a (i) ß-Klotho (ii) FGFRlc, FGFR2c, FGFR3c o FGFR4; o (iii) un complejo que comprende ß-Klotho y uno de FGFRlc, FGFR2c, FGFR3c, y FGFR : (a) disminuir la glucosa en la sangre en un modelo animal; (b) disminuir los niveles de lípidos en suero en un modelo animal;, (c) disminuir los niveles sw insulina en un modelo animal; o (d) dos o más de (a) y (b) y (c) .
En modalidades especificas las proteínas de enlace a antígenos proporcionadas comprenden: (a) una cadena pesada que comprende una de SEQ ID NOs:31, 32, 390-401, 404-405; (b) una cadena ligera que comprende una de SEQ ID NO: 13, 14, 385- 389, 402-403; o (c) una combinación que comprende una cadena pesada de (a) y una cadena ligera de (b) .
También se proporcionan proteínas de enlace a antígenos que pueden enlazar a ß-Klotho humana de tipo natural (SEQ ID NO: 7) pero que no enlazan a la forma quimérica de ß-Klotho en donde la forma quimérica de ß-Klotho comprende una estructura humana de ß-Klotho en donde las secuencias murinas de ß-Klotho reemplazan los residuos humanos de tipo natural en al menos una de (a) posiciones 1-80; (b) posiciones 303-522; (c) posiciones 852-1044; y (d) combinaciones de las mismas.
En otro aspecto, la presente descripción proporciona proteínas de enlace a antígenos que pueden enlazar a ß-Klotho humana de tipo natural (SEQ ID NO: 7) en al menos una de (a) posiciones 1-80; (b) posiciones 303-522; (c) posiciones 852-1044; y (d) combinaciones de las mismas.
Todavía en otro aspecto, la presente descripción proporciona proteínas de enlace a antígenos que pueden competir con una proteína de enlace a antígenos de las reivindicaciones 8 o 13 para enlazar a residuos ß-Klotho de tipo natural humanos en al menos una de (a) posiciones 1-80; (b) posiciones 303-522; (c) posiciones 852-1044; . y (d) combinaciones de las mismas. .
También se proporciona una composición farmacéutica que comprende una o más proteínas de enlace a antígenos aquí proporcionados, en mezcla con un portador farmacéuticamente aceptable del mismo.
En un aspecto adicional, también se proporcionan moléculas aisladas de ácido nucleico que codifican las proteínas de enlace a antígenos descritas en la presente. En algunos casos, las moléculas aisladas de ácido nucleico se ligan operativamente a una secuencia de control. En modalidades, tales ácidos nucleicos comprenden una secuencia de polinucleótidos que codifica el dominio variable de cadena ligera, el dominio . variable de. cadena pesada, o ambos, de una proteina de enlace a antigenos aquí proporcionada. En modalidades particulares los ácidos nucleicos comprenden (a) VL1-VL18 (SEQ ID NOs: 48-65); (b) VH1-VH18 (SEQ ID NOs : 66-84); o (c) una o más secuencias de (a) y una o más secuencias de (b) .
En otro aspecto, también se proporcionan vectores de expresión y células hospederas transformadas o transfectadas con los vectores de expresión que comprenden las moléculas aisladas de ácido nucleico antes mencionadas que codifican las proteínas de enlace a- antigenos descritas en la presente.
En otro aspecto, también se proporcionan métodos de preparación de proteínas de enlace a antígenos que enlazan específica o selectivamente (i) ß-Klotho; (ii) FGFRlc, FGFR2c, FGFR3c o FGFR4; o (iii) un complejo que comprende ß-Klotho y uno de FGFRlc, FGFR2c, FGFR3c, y FGFR4 y comprende la etapa de preparar la proteína de enlace a antígenos a partir de una célula hospedera que segrega la proteína de enlace a antígenos.
Otras modalidades proporcionan un método para la prevención o tratamiento de una condición en un sujeto que necesita de tal tratamiento que comprende administrar una cantidad terapéuticamente efectiva de una composición farmacéutica aquí proporcionada a un sujeto, en donde la condición es tratable para disminuir los niveles de glucosa en la sangre, insulina o lípidos en suero. En modalidades, la afección es diabetes tipo 2, obesidad, dislipidemia, NASH, enfermedad cardiovascular o síndrome metabólico.
Estos y otros aspectos se describen en mayor detalle en la presente. Cada uno de los aspectos proporcionados puede abarcar diversas modalidades aquí proporcionadas. Por lo tanto se anticipa que cada una de las modalidades que involucran un elemento o' combinaciones de elementos puede incluirse en cada aspecto descrito, y todas esas combinaciones de los aspectos anteriores y modalidades se consideran expresamente. Otras características, objetos, y ventajas de las proteínas de enlace a antígenos descritas y métodos y composiciones asociados son evidentes en la descripción detallada que sigue.
BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS La Figura 1A-1B es una alineación que muestra la homología de secuencias entre FGFRlc humano (No Acceso al Genbank P11362; SEQ ID NO: 356) y FGFRlc murino (No Acceso al Genbank NP_034336; SEQ ID NO: 357); se resaltan diversos aspectos, incluyendo el péptido de señal, secuencia de transmembrana, región de enlace a heparina, y se proporciona una secuencia de consenso (SEQ ID NO: 358).
Las Figuras 2a-2c es una alineación que muestra la homología de secuencias entre ß-Klotho humana (No Acceso al Genbank NP_783864; SEQ ID NO: 359) y ß-Klotho murino (No Acceso al Genbank NP_112457; SEQ ID NO: 360); diversos aspectos se resaltan, incluyendo la secuencia de transmembrana y dos. dominios de glicosil hidrolasa, y se proporciona una secuencia de consenso (SEQ ID NO: 361) .
La Figura 3 es un perfil de citometría de flujo de células teñidas con FGF21-Alexa 647 que se usaron como un inmunogeno para generar proteínas de enlace a antígenos; la Figura muestra el nivel' de expresión de un FGF21R (un complejo que comprende FGFRlc y ß-Klotho) y enlace a FGF21.
La Figura 4 es una secuencia (SEQ ID NO: 362) que muestra una proteína de fusión Fe que se usó como un inmunogeno para generar proteínas de enlace a antígenos; el inmunogeno comprende el dominio extracelular (ECD) de FGFRlc humano fusionado a un IgGl Fe por medio de una ligadura Gly5 (SEQ ID NO: 379) ; el componente FGFRlc está en mayúsculas, la ligadura está en cursiva y subrayada y la Fe está en letras minúsculas.
La Figura 5 es una' secuencia (SEQ ID NO: 363) que muestra una proteína de fusión Fe que se usó como un inmunogeno para generar proteínas de enlace a antígenos; el inmunogeno comprende el dominio extracelular (ECD) de ß-Klotho humana fusionada a un Ig.Gl Fe por medio de una ligadura Gly5 (SEQ ID NO: 379); -el componente ß-Klotho está en mayúsculas, la ligadura está en cursiva y subrayada y el Fe está en letras minúsculas.
La Figura 6 es un gel SDS PAGE que muestra el nivel de pureza alcanzado a partir de las preparaciones del complejo receptor soluble FGF21 que comprende FGFRlc ECD-Fc y ß-Klotho ECD-Fc, que se empleó como un inmunógeno para generar proteínas de enlace a antígenos.
La Figura 7 es una serie de gráficas generadas a partir de un ensayo reportero de ELK-luciferasa como se describe en la presente efectuado en CHO recombinante clon 2E10, que demuestra la capacidad de . algunas de las proteínas de enlace a antígenos para inducir la señalización del tipo FGF21 en células CHO recombinantes que expresan un complejo del receptor FGF21 que comprende FGFRlc y ß-Klotho.
La Figura 8 es una serie de gráficas generadas a partir de un ensayo de fosforilación ERK1/2 como se describe en la presente, que demuestra la capacidad de algunas de las proteínas de enlace a antígenos para inducir señalización del tipo FGF21 en células de rata L6. El eje "X" es las concentraciones de las proteínas- de enlace a antígenos y el eje "Y" es el porcentaje, de ERK1/2 fosforilado del ERK1/2 total.
La Figura 9 es una serie de gráficas generadas a partir de un ensayo de fosforilación ERK1/2 como se describe en la presente, que demuestra que la señalización del tipo FGF21 mediada por proteínas de enlace a antígeno en células L6 es específica de FGFRlc/ -Klotho .
La Figura 10 es una serie de gráficas generadas a partir de un ensayo de fosforilación ERK como se describe en la presente, que demuestra que algunas proteínas de enlace a antígenos pueden inducir la señalización del tipo FGF21 en células de adipocitos humanos.
La Figura lia es una serie de sensogramas de enlace (unidades de respuesta vs tiempo) que demuestra que algunas de las proteínas de enlace a antígenos que inducen señalización mediada por FGF21 se enlazan a ß-Klotho humana en dos sitios de enlace · diferentes pero que se traslapan parcialmente representados por 24H11 (Grupo A) y 17D8 (Grupo B) , mientras las proteínas de enlace a antígenos que no inducen señalización mediada por FGF21 (2G10, 1A2) no se enlazan a estos sitios..
La Figura 11b es una serie de sensogramas de enlace (unidades de respuesta vs tiempo) que demuestra un tercer sitio de enlace sobre ß-Klotho humana que se identificó para proteínas de enlace a antígenos del Grupo C representadas por 39F7.
La Figura 12 es una serie de sensogramas de enlace (unidades de respuesta vs tiempo) que demuestra que algunas de las proteínas de enlace a antígenos (12E4, 24H11, 17C3, 18B11) que inducen señalización mediada por FGF21 interfieren con el enlace de ß-Klotho a ' FGF21, mientras otras proteínas de enlace a antígenos (21H2, 17D8-, 18G1) no lo hacen.
La Figura 13 es una alineación de las regiones variables de algunas de las proteínas de enlace a antígenos que se generaron; las regiones de estructura y CDR son identificadas. La Figura 13 describe SEQ ID NOS: 364, 59, 365, 60, 366, 61, 367, 62, 368, 57, 369, 55, 51-52, 56, 56, 53-54, 63-65, 370, 58, 371, 50, 50, 49, 48, 372, 78, 373, 66-69, 79, 374, 76, 81, 375, 70, 73, 73, 71-72, 376, 83, 82, 84, 377, 80, 378, 75 y 74, respectivamente, en orden de aparición.
La Figura 14 es un diagrama- que detalla gráficamente el diseño del estudio para un estudio de 68 días efectuado en monos cynomolgus obesos.
La Figura 15 es una gráfica que detalla los efectos de vehículo y 16H7 en la ingesta de alimento de harina AM de los monos cynomolgus obesos estudiados.
La Figura 16 son dos gráficas que detallan los efectos del vehículo y 16H7 en la ingesta de fruta y la ingesta de alimento PM de los monos cynomolgus obesos estudiados.
La Figura 17 es una gráfica que detalla los efectos de vehículo y 16H7 en el peso corporal de los monos cynomolgus obesos estudiados.
La Figura 18 es una gráfica que muestra los efectos de vehículo y 16H7 en el índice de masa corporal (BMI) de los monos cynomolgus obesos estudiados.
La Figura 19 es una gráfica que muestra los efectos de vehículo en la circunferencia abdominal (AC) de los monos cynomolgus obesos estudiados.
La Figura 20 es una gráfica que muestra los efectos de vehículo y 16H7 en el grosor de pliegue de la piel (SFT) de los monos cynomolgus obesos estudiados.
La Figura 21 es una gráfica que muestra los efectos de vehículo y 16H7 en los niveles de glucosa durante las pruebas de tolerancia a la glucosa de los monos cynomolgus- obesos estudiados .
La Figura 22 es una gráfica que muestra los efectos de vehículo y 16H7 en los niveles de insulina en plasma durante las pruebas de tolerancia a la glucosa de los monos cynomolgus obesos estudiados.
La Figura 23 es una gráfica que muestra los efectos de vehículo y 16H7 sobre los niveles de glucosa en plasma en ayuno de los monos cynomolgus obesos estudiados.
La Figura 24 es una gráfica que muestra los efectos de vehículo y 16H7 sobre los niveles de insulina en plasma en ayuno de los monos cynomolgus obesos estudiados.
La Figura 25 es una gráfica que muestra los efectos de vehículo y 16H7 en los niveles de glucosa en plasma en alimentación de los monos cynomolgus obesos estudiados.
La Figura 26 es una gráfica que muestra los efectos de vehículo y 16H7 en los niveles de insulina en alimentación de los monos cynomolgus obesos estudiados.
La Figura 27 es una gráfica que muestra los efectos de vehículo y 16H7 en los niveles de triglicéridos en plasma en ayuno de los monos cynomolgus obesos estudiados.
La Figura 28 es una gráfica que muestra los efectos de vehículo y 16H7 en los nivele de triglicéridos en plasma en alimentación de los monos cynomolgus obesos estudiados.
La Figura 29 es un esquema que detalla quimeras humano-ratón de ß-Klotho que fueron construidas y usadas para estudiar el enlace de las proteínas de enlace a antígenos.
La Figura 30 es un esquema que detalla quimeras humano-ratón ß-Klotho que fueron construidas y también incluye datos cualitativos de enlace para FGF21, 16H7, 37D3 y 39F7.
Las Figuras 31A-31C son una serie de gráficas que detallan los datos de enlace para ócho de las variantes 16H7 y 22H5 que fueron construidas, así como para 22H5 y 16H7.
Las Figuras 32A-32C' son una serie de gráficas que detallan los resultados de los ensayos ELISA que se usaron para demostrar las diversas variantes 22H5 y 16H7 que tienen capacidad de enlace.
La Figura 33 es una gráfica de barras que compara constantes de disociación para diversas variantes 22H5 y 17H7 que fueron generadas.
La Figura 34 son- dos gráficas que detallan curvas de enlace para 39F11 cuando se titula con FGF21 y para FGF21 cuando se titula con 39F11; las gráficas demuestran un efecto aditivo.
La Figura 35 son dos gráficas que detallan curvas de enlace para 16H7 cuando se titula con 39F11 y 39F11 cuando se titula con 16H7; las gráficas demuestran un efecto aditivo.
DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN Los encabezados de sección usados en la presente son solamente para propósitos de organización y no se constituyen como limitantes de la materia objeto descrita.
A menos que se defina de otra manera en la presente, los términos científicos y técnicos usados en conjunto con la solicitud actual tendrán los significados que se entienden comúnmente por aquellos expertos en la técnica. Además, a menos que se requiera de otra manera por el contexto, los términos en singular incluirán pluralidades y los términos en plural incluirán el singular.
Generalmente, las nomenclaturas usadas en conjunto con, y las técnicas de cultivo de células y tejidos, biología molecular, inmunología, microbiología, genética y química de proteínas y ácidos nucleicos e hibridización descritas en la presente son aquellas bien conocidas y comúnmente usadas en la técnica. Los métodos y técnicas de la presente solicitud se efectúan generalmente de acuerdo con métodos convencionales bien conocidos en la técnica y como se describen en diversas referencias generales y más específicas que se citan y discuten a lo largo de la especificación actual a menos que se indique de otra manera. Ver, por ejemplo, Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3rd ed. , Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (2001), Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, Greene- Publishing Associates (1992), y Harlow y Lañe Antibodies: A Laboratory Manual Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1990), las cuales están incorporadas en la presente como referencia. Las reacciones enzimáticas y técnicas de purificación se efectúan de acuerdo con las especificaciones del fabricante, como se consigue comúnmente en la técnica o como se describe en la presente. Tal terminología usada en conjunto con, y los procedimientos y técnicas de laboratorio de química analítica, química orgánica sintética, y química farmacéutica y medicinal descritas en la presente son aquellas bien conocidas y comúnmente usadas en la técnica. Las técnicas estándar pueden ser usadas para síntesis química, análisis químicos, preparación, formulación y administración farmacéutica, y tratamiento de pacientes.
Se entenderá que la descripción actual no se limita a la metodología, protocolos y reactivos, etc., en particular descritos en la presente y como tal pueden variar. La terminología usada en la presente es para el propósito de describir modalidades . en particular solamente, y no se pretende que limite el alcance de la presente descripción.
Excepto en los ejemplos de operación, o donde se indique de otra manera, todos los números que expresan cantidades de ingredientes o condiciones de reacción usados en la presente se deben entender como modificados en todos los casos por el término "alrededor de." El término "alrededor de" cuando se usa en conjunto con los porcentajes, puede significar ±5%, por ejemplo, 1%, 2%, 3%, o 4%.
I . DEFINICIONES Como se usa en la presente, los términos "un" y "uno" significan "uno o más" a menos que se establezca específicamente de otra manera.
Una "proteina de enlace a antigenos" es una proteina que comprende una porción que enlaza a un antigeno u objetivo y opcionalmente, una porción de andamiaje o estructura que permite a la porción de enlace a antigeno adoptar una conformación que promueve' el enlace de la proteina de enlace a antigenos al antigeno.. Ejemplos de proteínas de enlace a antígenos incluyen un anticuerpo humano, un anticuerpo humanizado; un anticuerpo quimérico; un anticuerpo recombinante ; un anticuerpo de cadena sencilla; un diacuerpo; un triacuerpo; un tetracuerpo; un fragmento Fab; un fragmento F(ab' ) 2i un anticuerpo IgD; un anticuerpo IgE; un anticuerpo IgM; un anticuerpo IgGl; un anticuerpo IgG2; un anticuerpo IgG3; o un anticuerpo IgG4, y fragmentos de los mismos. La proteína de enlace a antígenos puede comprender, por ejemplo, un andamiaje de proteína' alternativo o andamiaje artificial con CDRs injertadas o derivados de CDR. Tales andamiajes incluyen, pero no se limitan a, andamiajes derivados de anticuerpos que comprenden mutaciones introducidas para, por ejemplo, estabilizar la estructura tridimensional de la proteína de enlace a antígenos así como andamiajes completamente sintéticos que comprenden, por ejemplo, un polímero biocompatible . Ver, por ejemplo, Korndorfer et al., 2003, Proteins: Structure, Function, y Bioinformatícs, 53 (1) : 121-129 (2003); Roque et al., Biotechnol. Prog. 20:639-654 (2004). Además, las imitaciones de anticuerpos de péptidos ("PAMs") pueden ser usadas, asi como andamiajes con base en la imitación de anticuerpos que utilizan componentes de fibronectina como un andamiaje.
Una proteína de enlace a antígenos puede tener, por ejemplo, la estructura de una inmunoglobulina que se presenta naturalmente. Una "inmunoglobulina" es una molécula tetramérica. En una inmunoglobulina que se presenta naturalmente, cada tetrámero está compuesto de dos pares idénticos de cadenas de polipéptidos, cada par que tiene una cadena "ligera" (alrededor de 25 kDa) y una cadena "pesada" (alrededor de 50-70 kDa) . La porción en el terminal amino de cada cadena incluye una región variable.de alrededor de 100 a 110 o más aminoácidos principalmente responsables del reconocimiento de antígenos. La porción en el terminal carboxi de cada cadena define una región constante principalmente, responsable de la función del efector. Las cadenas ligeras humanas se clasifican como cadenas ligeras kappa y lambda. Las cadenas pesadas se clasifican como mu, delta, gamma, alpha, o epsilon, y definen el isotipo del anticuerpo como IgM, IgD, IgG, IgA, y IgE, respectivamente. Dentro de las cadenas ligera y pesada, las regiones variables y constantes se unen por una región "J" de alrededor de 12 o más aminoácidos, con la cadena pesada que también incluye una región "D" de alrededor de 10 más aminoácidos. Ver generalmente, Fundamental Immunology Ch. 7 (Paul, W., ed. , 2nd ed. Raven Press, N.Y. (1989)) (incorporada por referencia en su totalidad para ' todos los propósitos) . Las regiones variables de cada par de cadena ligera/cadena forman el sitio de enlace a anticuerpos tal que la inmunoglobulina intacta tiene dos sitios de enlace.
Las cadenas de inmunoglobulina que se presentan naturalmente muestran la misma estructura general de regiones de andamiaje (FR) relativamente conservadas unidas por tres regiones hipervariables , también llamadas regiones determinantes de la complementariedad o CDRs. Desde la terminación N a la terminación C, tanto las cadenas ligeras como pesadas comprenden los dominios FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, . CDR3 y FR . La asignación de los aminoácidos a cada dominio se puede hacer de acuerdo con las definiciones de Kabat et al. en Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed., US Dept. of Health and Human Services, PHS, NIH, NIH Publicación no. 91-3242, 1991. Cuando se desee, las CDRs también pueden redefinirse de acuerdo con un esquema de nomenclatura alternativo, tal como aquel de Chothia (ver Chothia & Lesk, 1987, J. Mol. Biol. 196:901-917; Chothia et al., 1989, Nature 342:878-883 o Honegger & Pluckthun, 2001, J. Mol. Biol. 309:657-670).
En el contexto de la descripción actual una proteina de enlace a antigenos se dice que se "enlaza específicamente" o "enlaza selectivamente." a su antígeno objetivo cuando la constante de disociación (KD) es =10"8 M. El antígeno que enlaza específicamente al anticuerpo con "alta afinidad" cuando la KD es =5x.l0~9 M, y con "muy alta afinidad" cuando la KD es =5x 10"10 . En una modalidad, los anticuerpos enlazarán a FGFRlc, ß-Klotho, ambos FGFRlc y ß-Klotho o un complejo que comprende FGFRlc y ß-Klotho, incluyendo FGFRlc humano, ß-Klotho humana o ambos FGFRlc humano y ß-Klotho humana, con una KD de entre alrededor de 10"7 M y 10"12 M, y en todavía otra modalidad los anticuerpos se enlazarán con una KD <5X 10"9.
Un "anticuerpo" . se refiere a una inmunoglobulina intacta o a una porción de enlace a antígenos de la misma que compite con el anticuerpo intacto para enlace específico, a menos que se especifique de otra manera. Las porciones de enlace a antígenos pueden ser producidas por técnicas de ADN recombinante o por escisión enzimática o química de anticuerpos intactos. Las porciones de enlace a antígenos incluyen, ínter alia, Fab, Fab' , F(ab')2, Fv, anticuerpos de dominio (dAbs), fragmentos que incluyen regiones determinantes de la complementariedad (CDRs), anticuerpos de cadena sencilla (scFv), anticuerpos quiméricos, diacuerpos, triacuerpos, tetracuerpos, y polipéptidos que contienen al menos una porción de una inmunoglobulina que es suficiente para conferir enlace especifico de antigenos al polipéptido.
Un fragmento Fab es un fragmento monovalente que tiene los dominios VL, VH, CL y CH1; un fragmento F(ab' ) 2 es un fragmento divalente que tiene dos fragmentos Fab ligados por un puente bisulfuro a la región de articulación; un fragmento Fd tiene los dominios VH y CH1; un fragmento Fv tiene los dominios VL y VH de un brazo sencillo de un anticuerpo; y un fragmento dAb tiene un dominio VH, un dominio VL, o un fragmento de enlace a antigenos de un dominio VH o VL (patentes de E.U.A. Nos. 6,846,634, 6,696,245, Pub. de solicitud de E.U.A. Nos. 05/0202512, 04/0202995, 04/0038291, 04/0009507, 03/0039958, Ward et al., Nature 341:544-546 (1989)).
Un anticuerpo de cadena sencilla (scFv) es un anticuerpo en el cual una región VL y una VH se unen por medio de una ligadura (por ejemplo, una secuencia sintética de residuos de aminoácidos) para formar una cadena continua de proteínas en donde la ligadura es lo suficientemente larga para permitir que la cadena de proteína' se pliegue sobre sí misma y forme una sitio de enlace a antígenos monovalente (ver, por ejemplo, Bird et al., Science 242:423-26 (1988) y Huston et al., 1988, ' Proc. Nati. Acad. Sci. USA 85:5879-83 (1988)).
Los diacuerpos son anticuerpos divalentes que comprenden dos cadenas de polipéptidos, en donde cada una de la cadena de polipéptidos comprende dominios VH y VL unidos por una ligadura que es demasiado corta para permitir el apareamiento entre dos dominios en la misma cadena, permitiendo asi que cada dominio se aparee con un dominio complementarios en otra cadena de polipéptidos (Ver, por ejemplo, Holliger et al., 1993, Proc. Nati. Acad. Sci . USA 90:6444-48 (1993), y Poljak et al., Structure 2:1121-23 (1994)). Si las dos cadenas de polipéptidos de un diacuerpo son idénticas, entonces un diacuerpo que resulta de su apareamiento tendrá dos sitios de enlace a antigenos idénticos. Cadenas de polipéptidos que tienen diferentes secuencias pueden ser usadas para hacer un diacuerpo con dos diferentes sitios de enlace a antigenos. Similarmente , tricuerpos o tetracuerpos son anticuerpos que comprenden tres y cuatro cadenas de polipéptidos, respectivamente, y que . forman tres y cuatro sitios de enlace a antigenos, respectivamente, los cuales pueden ser iguales o di ferentes .
Regiones determinantes de la complementariedad (CDRs) y regiones de andamiaje (FR) de un anticuerpo dado pueden ser identificadas al usar el sistema descrito por Kabat et al. en Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed., US Dept. of Health and Human Services, PHS, NIH, NIH Publicación no. 91-3242, 1991. Como sea deseado, las CDRs también pueden ser redefinidas de acuerdo con una esquema alternativo de nomenclatura, tal como aquel de Chothia (Ver Chothia & Lesk, 1987, J. Mol. Biol. 1 6:901-917; Chothia et al., 1989, Nature 342:878-883 o Honegger & Pluckthun, 2001, J. Mol. Biol. 309:657-670. Una o más CDRs pueden estar incorporadas en una molécula ya sea de forma covalente o no covalente para hacer una proteína de enlace a antígenos. Una proteína de enlace a antígenos puede incorporar la(s) CDR(s) como parte de una cadena de polipéptidos más grandes, puede ligar de forma covalente la CDR(s) con otra cadena de polipéptidos, o puede incorporar la CDR(s) de forma no covalente. Las CDRs permiten que la proteína dé enlace a antígenos se enlace específicamente a un antígeno de interés en particular.
Una proteína de enlace a antígenos puede tener uno o más sitios de enlace. Si- hay más de un sitio de enlace, los sitios de enlace pueden ser idénticos uno con el otro o pueden ser diferentes. Por ejemplo, una inmunoglobulina humana que se presenta naturalmente típicamente tiene dos sitios de enlace idénticos, mientras que un anticuerpo "biespecífico" o "bifuncional" tiene dos diferentes sitios de enlace.
El término "anticuerpo humano" incluye todos los anticuerpos que tengan una o- más regiones variable y constante derivadas de secuencias de inmunoglobulina humana. En una modalidad, todos los dominios variable y constante se derivan de secuencias de inmunoglobulina humana (un anticuerpo humano completo) . Estos anticuerpos pueden ser preparados por diversas formas, ejemplos de las cuales se describen a continuación, incluyendo a través de la inmunización con un antigeno de interés de un ratón que está genéticamente modificado para expresar anticuerpos derivados de genes que codifican cadena pesada y/o ligera, tales como un ratón derivado de un sistema Xenomouse®, Ulti ab™, o Velocimmune®. También pueden emplearse los métodos basados en fagos.
Un anticuerpo humanizado tiene una secuencia que difiere de la secuencia de un anticuerpo derivado de una especie no humana por una o más sustituciones, eliminaciones, y/o adiciones de aminoácidos, tal que el anticuerpo humanizado es menos propenso a inducir una respuesta inmunitaria, y/o induce una respuesta inmunitaria menos severa, en comparación con el anticuerpo de especies no humanas, cuando se administra a un sujeto humano. En una modalidad, determinados aminoácidos en los dominios de estructura y constantes de las cadenas pesadas y/o ligeras del anticuerpo de especies no humanas están mutados para producir el anticuerpo humanizado. En otra modalidad, el o los dominios constantes de un anticuerpo humano se fusionan al o los dominios variables de una especie no humana. En otra modalidad, uno o más residuos de aminoácidos en una o más secuencias CDR de un anticuerpo no humano son cambiados para reducir la inmunogenicidad probable del anticuerpo no humano cuando se administra a un sujeto humano, en donde los residuos de aminoácidos cambiados no son ya sea críticos pata el enlace inmunoespecífico del anticuerpo a su antígeno, o los cambios a la secuencia de aminoácidos que se hacen son cambios conservadores,, tal que el enlace del anticuerpo humanizado al antígeno no es significativamente peor que el enlace del anticuerpo no humano al antígeno. Ejemplos de cómo hacer anticuerpos humanizados se pueden encontrar en las patentes de E.U.A.. Nos. 6,054,297, 5,886,152 y 5,877,293.
El término "anticuerpo quimérico" se refiere a un anticuerpo que contiene una o más regiones de un anticuerpo y una o más regiones de uno o más de otros anticuerpos. En una modalidad, una o más de las CDRs se derivan de un anticuerpo humano que enlaza (i) ß-Klotho; (ii) FGFRlc, FGFR2c, FGFR3c o FGFR4; o (iii) un complejo que comprende ß-Klotho y uno de FGFRlc, FGFR2c, FGFR3c, y FGFR . En otra modalidad, todas las CDRs se derivan de un anticuerpo humano que enlaza (i) ß-Klotho (ii) FGFRlc, FGFR2c, FGFR3c o FGFR4; o (iii) un complejo que comprende ß-Klotho y uno de FGFRlc, FGFR2c, FGFR3c, y FGFR4. En otra modalidad, las CDRs de más de un anticuerpo humano que- enlaza (i) ß-Klotho; (ii) FGFRlc, FGFR2c, FGFR3c o FGFR4 ; o (iii) un complejo que comprende ß-Klotho y uno de FGFRlc, FGFR2c, FGFR3c, y FGFR4 se mezclan y coinciden en un anticuerpo quimérico. Por ejemplo, un anticuerpo quimérico puede comprender una CDR1 de la cadena ligera de un primer anticuerpo humano que enlaza (i) ß-Klotho; (ii) FGFRlc, FGFR2c, FGFR3c o FGFR4; o (iii) un complejo que comprende ß-Kl'otho y uno de FGFRlc, FGFR2c, FGFR3c, y FGFR4, una CDR2 y una . CDR3 de la cadena ligera de un segundo anticuerpo humano que enlaza (i) ß-Klotho; (ii) FGFRlc, FGFR2c, FGFR3c o FGFR4; o (iii) un complejo que comprende ß-Klotho y uno de FGFRlc, FGFR2c, FGFR3c, y FGFR4 , y la CDRs de la cadena pesada de un tercer anticuerpo que enlaza (i) ß-Klotho; (ii) FGFRlc, FGFR2c, FGFR3c o FGFR4; o (iii) un complejo que comprende ß-Klotho y uno de FGFRlc, FGFR2c, FGFR3c, y FGFR . Además, las regiones de andamiaje pueden ser derivadas de uno de los mismos anticuerpos que enlazan (i) ß-Klotho; (ii) FGFRlc, FGFR2c, FGFR3c o FGFR4; o (iii) un complejo que comprende- ß-Klotho y uno de FGFRlc, FGFR2c, FGFR3c, y FGFR4, de uno o más anticuerpos diferentes, tal como un anticuerpo humano, o de un anticuerpo humanizado. En un ejemplo de un anticuerpo quimérico, una porción de la cadena pesada y/o ligera es idéntica con, homologa a, o derivada de un anticuerpo de una especie en particular o que pertenece a una clase o subclase de anticuerpo en particular, mientras que el resto de la(s) cadena (s) es/son idéntica (s) con, homologas a, o derivadas de un anticuerpo o anticuerpos de otra especie o que pertenecen a otra clase o subclase de anticuerpos. También se incluyen fragmentos de tales anticuerpos que muestran la actividad biológica deseada (por ejemplo, la capacidad de enlazar específicamente (i) ß-Klotho; (ii) FGFRlc, FGFR2c, FGFR3c o FGFR4; o (iii) un complejo que comprende ß-Klotho y uno de FGFRlc, FGFR2c, FGFR3c, y FGFR4 ) .
El término "cadena ligera" incluye una cadena ligera de longitud completa y fragmentos de la misma que tienen una secuencia de región variable suficiente para conferir especificidad de enlace. Una cadena ligera de longitud completa incluye un dominio de región variable, VL, y un dominio de región constante, CL. El dominio de región variable de la cadena ligera está en la terminación amino del polipéptido. Las cadenas ligeras incluyen cadenas kappa ("?") y cadenas lambda ("?") .
El término "cadena pesada" incluye una cadena pesada de longitud completa y. fragmentos de la misma que tienen una secuencia de región variable suficiente para conferir especificidad de enlace. Una cadena pesada de longitud completa incluye un dominio de región variable, VH, y tres dominios de región constante, CH1, CH2, y CH3. El dominio VH está en la terminación amino del polipéptido, y los dominios CH están en la terminación carboxi, con el CH3 que está más cercano a la terminación carboxi del polipéptido. Cadena pesadas pueden ser de cualquier isotipo, incluyendo IgG (incluyendo subtipos ' IgGl, IgG2, IgG3 y IgG4), IgA (incluyendo subtipos IgAl e IgA2) , Ig y IgE.
El término "fragmento inmunológicamente funcional" (o simplemente "fragmento") de una proteina de enlace a antigenos, por ejemplo, un anticuerpo o cadena de inmunoglobulina (cadena ligera o pesada) , como se usa en la presente, es una proteina de enlace a antigenos que comprende una porción (independientemente de cómo se obtiene o sintetiza esa porción) de un anticuerpo que carece de al menos algunos de los aminoácidos presentes en una cadena de longitud completa pero que es capaz de enlazar específicamente a un antígeno. Tales fragmentos son biológicamente activos en que se enlazan específicamente al antígeno objetivo y pueden competir con otras proteínas de enlace a antígenos, incluyendo anticuerpos intactos, para enlace específico a un epítopo dado. En un aspecto, tal fragmento retendrá al menos una CDR presente en la cadena ligera o pesada de longitud completa, y en algunas modalidades comprenderán una cadena pesada y/o cadena ligera sencilla o porción dé la misma. Estos fragmentos biológicamente activos pueden ser producidos por técnicas de ADN recombinante, o pueden ser producidos por escisión enzimática o química de proteínas de enlace a antígenos, incluyendo anticuerpos intactos. Los fragmentos de inmunoglobulina inmunológicamente funcional incluyen, per no se limitan a, Fab, Fab' , F(ab')2, Fv, anticuerpos de dominio y anticuerpos de cadena sencilla, y pueden ser derivados de cualquier fuente de mamífero, incluyendo pero no limitado a humano, ratón, rata, camélido o conejo. Se contempla además que una porción funcional de las proteínas de enlace a antígenos descritas en la presente, por ejemplo, una o más CDRs, se pueden enlazar de forma covalente a una segunda proteína o a una molécula pequeña para crear un agente terapéutico dirigido a un objetivo particular en el cuerpo, al poseer propiedades terapéuticas bifuncionales, o tener una vida media en suero prolongada.
Una región "Fe" contiene dos fragmentos de cadena pesada que comprenden los dominios CH2 y CH3 de un anticuerpo. Los dos fragmentos de cadena pesada se mantienen juntos por dos o más enlaces bisulfuro y por interacciones hidrofóbicas de los dominios CH3.
Un "fragmento Fab'" contiene una cadena ligera y una porción de una cadena pesada que contiene el dominio VH y el dominio CH1 y también la región entre los dominios CH1 y CH2, tal que el enlace bisulfuro entre cadenas se puede formar entre las dos cadenas pesadas de dos fragmentos Fab' para formar una molécula F(ab' )2- Un "fragmento F(ab' )2" contiene dos cadenas ligeras y dos cadenas pesadas que contienen una porción de la región constante entre los dominios CH1 y CH2, tal que un enlace bisulfuro entre cadenas se forma entre las dos cadenas pesadas. Un fragmento F(ab' )2 asi está compuesto de dos fragmentos Fab' que .se mantienen juntos por un enlace bisulfuro entre las dos cadenas pesadas.
La "región Fv" comprende las regiones variables tanto para cadenas pesadas como ligeras, pero carece de las regiones constantes.
Un "anticuerpo de dominio" es un fragmento de inmunoglobulina inmunológicamente funcional que contiene solamente la región variable de una cadena pesada o la región variable de una cadena ligera. En algunos casos, dos o más regiones VH se unen de forma covalente con una ligadura de péptido para crear un anticuerpo de dominio divalente. Las dos regiones VH de un anticuerpo de dominio divalente pueden dirigirse a antigenos iguales o diferentes.
Un "hemicuerpo" es un constructo de inmunoglobulina inmunológicamente funcional que comprende una cadena pesada completa, una cadena ligera completa y una segunda región de cadena pesada Fe apareada con la' región Fe de la cadena pesada completa. Una ligadura puede, pero no necesita, emplearse para unir la ' región de cadena pesada Fe y la segunda región de cadena pesada Fe. En modalidades particulares un hemicuerpo es una forma monovalente de una proteina de enlace a antigenos descrita en la presente. En otras modalidades, pares de residuos cargados pueden emplearse para asociar una región Fe con la segunda región Fe. La segunda región de cadena pesada Fe puede comprender, por ejemplo, SEQ ID NO: 41 y puede unirse a la cadena ligera por medio de una ligadura (por ejemplo, SEQ ID NO: 440). Un hemicuerpo ejemplar de cadena pesada comprende la secuencia SEQ ID NO:453.
Una "proteina de enlace a antigenos divalente" o "anticuerpo divalente" comprende dos sitios de enlace a antigenos. En algunos casos, los dos sitios de enlace tienen las mismas especificidades de antigenos. Las proteínas de enlace a antígenos divalentes y anticuerpos divalentes pueden ser biespecíficos, como se describe en la presente.
Una "proteína multiespecífica de enlace a antígenos" o "anticuerpo multiespecífico" es uno que ataca a más de un antígeno o epítopo.
Una proteina de enlace a antigenos o anticuerpo "biespecífico", "especifico doble" o "bifuncional" es una proteina híbrida de. enlace a antígenos o anticuerpo, respectivamente, que tiene dos diferentes sitios de enlace a antígenos. Las proteínas biespecíficas de enlace a antígenos y anticuerpos son una especie de proteínas multiespecíficas de enlace a antígenos o anticuerpo multiespecífico y pueden ser producidas por una diversidad de métodos incluyendo, pero no limitado a, fusión de hibridomas o ligadura de fragmentos Fab' . Ver, por ejemplo, Songsivilai y Lachmann, 1990, Clin. Exp. Immunol. 79:315-321; Kostelny et al., 1992, J. Immunol. 148:1547-1553. Los dos sitios de enlace de un proteína biespecífica de enlace a antígenos o anticuerpo se enlazará a dos epítopos diferentes, que pueden residir en los mismos o diferentes objetivos de proteínas.
Los términos "señalización tipo FGF21" e "induce la señalización del tipo FGF21," cuando se aplican a una proteina de enlace a antígenos de la presente descripción, significa que la proteina de enlace a antígenos imita, o modula, un efecto biológico in vivo inducido por el enlace de (i) ß-Klotho; ( ii ) FGFRlc, FGFR2c, FGFR3c o FGFR4; o (iii) un complejo que comprende ß-Klotho y uno de FGFRlc, FGFR2c, FGFR3c, y FGFR4 e induce una ' respuesta biológica que resultaría de otra manera del enlace de FGF21 a (i) ß-Klotho; (ii) FGFRlc, FGFR2c, FGFR3c o FGFR4; o (iii) un complejo que comprende ß-Klotho y uno.de FGFRlc, FGFR2c, FGFR3c, y FGFR4 in vivo. Al evaluar el enlace y especificidad de una proteina de enlace a antígenos, por ejemplo, un anticuerpo o fragmento inmunológicamente funcional del mismo, un anticuerpo o fragmento se considera que induce una respuesta biológica cuando la respuesta es igual a o mayor que 5%, y preferiblemente igual a o mayor que 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90% o 95%, de la actividad de un estándar de tipo natural de FGF21 que comprende la forma madura de SEQ ID NO: 2 (es decir, la forma madura de la secuencia humana FGF21) y tiene las siguientes propiedades: mostrar un nivel de eficacia igual a o mayor que 5% de un estándar FGF21, con una EC50 de igual a o menor que ?????, por ejemplo, 90 nM, 80 nM, 70nM, 60nM, 50nM, 40n , 30nM, 20nM o 10 nM en (1) el ensayo de células de reportero de luciferasa mediado por el receptor FGF21 recombinante de Ejemplo 5; (2) fosforilación ERK en el ensayo de células mediado por el receptor FGF21 recombinante de Ejemplo 5; y (3) fosforilación ERK en adipocitos humanos como se describe en el Ejemplo 7. La "potencia" de una proteína de enlace a antígenos se define como que muestra un EC50 igual a o menor que ?????, por ejemplo, 90nM, 80nM, 70nM, 60nM, 50nM, 40nM, 30nM, 20nM, 10 nM y preferiblemente menor de ???? de la proteína de enlace a antigenos en los siguientes ensayos: (1) el ensayo de células de reportero de luciferasa mediado por el receptor FGF21 recombinante de Ejemplo 5; (2) la fosforilación ERK en el ensayo de células mediado por el receptor FGF21 recombinante de Ejemplo 5; y (3) fosforilación ERK en adipocitos humanos como se describe en el Ejemplo 7.
Se observa que no todas las proteínas de enlace a antígenos de la presente descripción inducen la señalización mediada por FGF21, ni es esta propiedad deseable en todas las circunstancias. No obstante, las proteínas de enlace a antígenos que no inducen señalización mediada por FGF21 forman aspectos de la presente descripción y puede ser útiles como reactivos de diagnóstico u otras aplicaciones.
Como se usa en la presente, el término "FGF21R" significa un complejo de receptor multimérico que FGF21 se sabe o sospecha que forma in vivo. En diversas modalidades, FGF21R comprende (i) un FGFR, por ejemplo, FGFRlc, FGFR2c, FGFR3C o FGFR4, y (ii) ß-Klotho.
El término "polinucleotido" o "ácido nucleico" incluye tanto polímeros de nucleótidos de hebra sencilla como de hebra doble. Los nucleótidos que. comprende el polinucleotido pueden ser ribonucleótidos o desoxiribonucleótidos o una forma modificada de cualquier tipo de nucleótido. Dichas modificaciones incluyen modificaciones a las bases tales como bromouridina y derivados de inosina, modificaciones de ribosa tales como 2', 3' -didesoxiribosa, y modificaciones a la ligadura internucleótidos tales como fosforotioato, fosforoditioato, fosforoselenoato, fosforodiselenoato, fosforoanilotioato, fosforaniladato y fosforoamidato .
El término "oligonucleótido" significa un polinucleótido que comprende 200 o menos nucleótidos. En algunas modalidades, los oligonucleótidos tienen de 10 a 60 bases de longitud. En otras modalidades, los oligonucleótidos tienen 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, o 20 a 40 nucleótidos de longitud. Los oligonucleótidos pueden ser de hebra sencilla o de hebra doble, por ejemplo, para uso en la construcción de un gen mutante. ¦ Los oligonucleótidos pueden ser oligonucleótidos de sentido o antisentido. Un oligonucleótido puede incluir una etiqueta, incluyendo una radioetiqueta, una etiqueta fluorescente, un hapteno o una etiqueta antigénica, para ensayos de detección. Los oligonucleótidos pueden ser usados, por ejemplo, como cebadores PCR, cebadores de clonación o sondas de hibridización .
Una "molécula aislada de ácido nucleico" significa un ADN o ARN de origen genómico, mRNA, cDNA, o sintético o alguna combinación de lo mismo que no se asocial con todo o una porción de un polinucleótido en' el cual el polinucleótido aislado se encuentra en la naturaleza, o se liga a un polinucleótido al cual no' se liga en la naturaleza. Para los propósitos de esta descripción, se entiende que "una molécula de ácido nucleico que comprende" una secuencia particular de nucleótido no abarca cromosomas intactos. Moléculas aisladas de ácido nucleico "que comprenden" secuencias especificas de ácidos nucleicos pueden incluir, además de las secuencias especificadas, secuencias de codificación por hasta diez o incluso hasta veinte diferentes proteínas o porciones de las mismas, o pueden incluir secuencias reguladoras ligadas operativamente que controlan la expresión de la región de codificación de las secuencias mencionadas de ácidos nucleicos, y/o pueden incluir secuencias de vectores.
A menos que se especifique de otra manera, el extremo del lado izquierdo de cualquier secuencia de polinucleótido de hebra sencilla aquí discutida es el extremo 5' ; la dirección del lado izquierdo de las secuencias de polinucleótido de hebra doble se refiere como la dirección 5'. La dirección de adición 5' a 3' de transcritos de ARN nacientes se refiere a la dirección de la transcripción; las regiones de secuencias en la hebra de ADN que tienen la misma secuencia como el transcrito de ARN que están en 5' hasta el extremo 5' del transcrito de ARN se refieren como "secuencias cadena arriba" en la hebra de ADN que tiene la misma secuencia como el transcrito de ARN que está 3' al extremo 3' del transcrito de ARN se refieren como "secuencias cadena aba o." El término "secuencia de control" se refiere a una secuencia de polinucleótidos que puede afectar la expresión y procesamiento de las secuencias de codificación a las cuales se liga. La naturaleza, de tales secuencias de control puede depender del organismo hospedero. En modalidades particulares, las secuencias de control para procariotas pueden incluir un promotor, un sitio de enlace a ribosomas, y una secuencia de terminación de la transcripción. Por ejemplo, las secuencias de control para eucariotas pueden incluir promotores que comprenden uno o una pluralidad de sitios de reconocimiento para factores de transcripción, secuencias potenciadoras de la transcripción, y secuencia de terminación de la transcripción. Las "secuencias de control" pueden incluir secuencias líder y/o secuencias del compañero de fusión.
El término "vector" significa cualquier molécula o entidad (por ejemplo, ácido nucleico, plásmido, bacteriófago o virus) usado para transferir información de codificación de proteínas dentro de una célula hospedera.
El término "vector · de expresión" o "constructo de expresión" se refiere a un vector que es adecuado para transformación de una célula hospedera y contiene secuencias de ácidos nucleicos que dirigen y/o controlan (en conjunto con la célula hospedera) la expresión de una o más regiones de codificación heterólogas ligadas operativamente a ello. Un constructo de expresión puede incluir, pero no se limita a, secuencias que afecta o controlan la transcripción, traducción, y, si están presentes intrones, afecta el empalme del ARN de una región de codificación ligada operativamente a ello.
Como se usa en la presente, "ligado operativamente" significa que los componentes a los cuales se aplica el término están en una relación que les permite llevar a cabo sus funciones, inherentes bajo condiciones adecuadas. Por ejemplo, una secuencia de control en un vector que está "ligado operativamente" a una secuencia de codificación de la proteina se liga a ello de manera que la expresión de la secuencia de codificación de la proteina se alcanza bajo condiciones que son compatibles con la actividad transcripcional de las secuencias de control.
El término "célula hospedera" significa una célula que se ha transformado, o es capaz de transformarse, con una secuencia de ácido nucleico y por ello expresa un gen de interés. El término incluye la progenie de la célula precursora, si o no la progenie es idéntica en morfología o en composición genética para la célula precursora original, siempre que el gen de interés se presente.
El término "transducción" significa la transferencia de genes de una bacteria a otra, usualmente por bacteriófago. "Transducción" también se refiere a la adquisición y transferencia de secuencias celulares eucarióticas por retrovirus de replicación-defectiva .
El término "transíección" significa la absorción de ADN externo o exógeno por una célula, y una célula ha sido "transfectada" cuando el . ADN exógeno ha sido introducido dentro de la membrana celular. Diversas técnicas de transfección son bien conocidas en la técnica y son descritas en la presente. Ver, por ejemplo, Graham et al., (1973) Virology 52 : 56; Sambrook et al., (2001) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, supra; Davis et al., (1986) Basic Los métodos in Molecular Biology, Elsevier; Chu et al., (1981) Gene 1_3:197. Tales técnicas pueden ser usadas para introducir una o más porciones de ADN exógenos dentro de células hospederas adecuadas.
El término "transformación" se refiere a un cambio en las características genéticas de la célula, y una célula se ha transformado cuando se ha modificado para contener nuevo ADN o ARN. Por ejemplo, una célula se transforma donde se modifica genéticamente de su estado nativo al introducir nuevo material genético por medio de transíección, transducción, u otras técnicas. Después de la transfección o transducción, el ADN transformado puede recombinarse con el de la célula al integrarse físicamente en un cromosoma de la célula, o pueden mantenerse transitoriamente como un elemento episomal sin replicarse, o pueden replicarse independientemente como un plásmido. Una célula se considera que se ha "establemente transformado" cuando el ADN transformado se replica con la división de la célula.
Los términos "polipéptido" o "proteína" se usan de manera intercambiable en la presente para referirse a un polímero de residuos de aminoácidos. Los términos también aplican a polímeros de aminoácidos en los cuales uno o más residuos de aminoácidos es un análogo o imitación de un aminoácido que se presenta naturalmente correspondiente, así como a polímeros de¦ aminoácidos que se presentan naturalmente. Los términos también pueden abarcar polímeros de aminoácido que se han modificado, por ejemplo, por la adición de residuos de carbohidrato para formar glicoproteínas, o fosforilados . Los polipéptidos y proteínas pueden producirse por una célula que se presenta naturalmente y no recombinante, o los polipéptidos y proteínas pueden producirse por una célula células recombinante o genéticamente preparada por ingeniería. Los polipéptidos y proteínas pueden comprender moléculas que tienen la secuencia de aminoácidos de una proteína nativa, o moléculas que tienen eliminaciones de, adiciones a, y/o sustituciones de uno o más aminoácidos de la secuencia nativa. Los términos "polipéptido" y "proteína" abarcan proteínas de enlace a antígenos que enlazan específica o selectivamente (i) ß-Klotho; (ii) FGFRlc, FGFR2c, FGFR3c o FGFR4; o (iii) un complejo que comprende ß-Klotho y uno de FGFRlc, FGFR2c, FGFR3c, y FGFR4, o secuencias que tienen eliminaciones de , adiciones a, y/o sustituciones de uno o más aminoácidos de una proteína de enlace a antígenos que enlaza específica o selectivamente (i) ß-Klotho; (ii) FGFRlc, FGFR2c, FGFR3c o FGFR ; o (iii) un complejo que comprende ß-Klotho y uno de FGFRlc, FGFR2c, FGFR3c, y FGFR4. El término "fragmento de polipéptido" se refiere, a un polipéptido que tiene una eliminación de terminal amino, una eliminación de terminal carboxilo, y/o una eliminación interna como se compara con la proteína de longitud .completa. Tales fragmentos también pueden contener aminoácidos modificados como se compara con la proteína de longitud completa. En determinadas modalidades, los fragmentos están alrededor de cinco hasta 500 aminoácidos de longitud. Por ejemplo, los fragmentos pueden ser al menos 5, 6, 8, 10, 14, 20, 50, 70, .100, 110, 150, 200, 250, 300, 350, 400, ó '450 aminoácidos de longitud. Los fragmentos útiles de polipéptidos incluyen fragmentos inmunológicamente funcionales de anticuerpos, incluyendo dominios de enlace. En el caso de una proteina de enlace a antígenos que enlaza a (i) ß-Klotho; (ii) FGFRlc, FGFR2c, FGFR3c o FGFR4; o (iii) un complejo que comprende ß-Klotho y uno de FGFRlc, FGFR2c, FGFR3c, y FGFR4, los fragmentos útiles incluyen pero no se limitan a una región CDR, un dominio variable de una cadena ligera o pesada, una porción de una cadena de anticuerpo o justo su región variable que incluye dos CDRs, y los similares.
El término "proteina aislada" referido significa que una proteina sujeto (1.) está libre de al menos algunas otras proteínas con- las cuales debe normalmente encontrarse, (2) está esencialmente libre de otras proteínas de la misma fuente, por ejemplo, de la misma especie, (3) se expresa por una célula de una especie diferente, (4) se ha separado de al menos alrededor de 50 por ciento de los polinucleótidos, lípidos, carbohidratos, u otros materiales con los cuales se asocia en naturaleza, (5) se asocia operablemente (por interacción covalente o no covalente) con un polipéptido con el cual no se asocia en naturaleza, o (6) no ocurre en la naturaleza. Típicamente, una "proteína aislada" constituye al menos alrededor de 5%, al menos alrededor de 10%, al menos alrededor de 25%, o al menos alrededor de 50% de una muestra dada. El ADN genómico, cADN, mARN u otro ARN, de origen sintético, o cualquier combinación de los mismos puede codificar tal proteína aislada. Preferiblemente, la proteína aislada está sustancialmente libre de proteínas o polipéptidos u otros contaminantes que se encuentran en su ambiente natural que deben interferir con su uso terapéutico, de diagnostico, profiláctico, de búsqueda u otro uso.
Una "variante" de un polipéptido (por ejemplo, una proteína de enlace a antígenos, o un anticuerpo) comprende una secuencia de aminoácidos en donde uno o más residuos de aminoácidos se insertan en, eliminan de y/o sustituyen dentro de la secuencia de aminoácidos con relación a otra secuencia de polipéptidos. Las variantes incluyen proteínas de fusión.
Un "derivado" de un polipéptido es un polipéptido (por ejemplo, una proteína de enlace a antígenos, o un anticuerpo) que ha sido modificado químicamente en alguna manera diferente a las variantes de inserción, eliminación o sustitución, por ejemplo, por conjugación con otra porción química .
El término "que se presenta naturalmente" como se usa a lo largo de la especificación en conexión con materiales biológicos tales como polipéptidos, ácidos nucleicos, células hospederas, y los similares, se refiere a materiales que se encuentran en la naturaleza.
"Región de enlace a antígenos" significa una proteína, o una porción de una prpteína, que enlaza específicamente un antígeno específico, por ejemplo, FGFRlc, ß-Klotho o tanto FGFRlc como ß-Klotho. Por ejemplo, tal porción de una proteína de enlace a antígenos que contiene los residuos de aminoácidos que interactúan con un antígeno y otorga a la proteína de enlace a antígenos su especificidad y la afinidad para el antígeno se refiere como "región de enlace a antígenos." Una región de enlace a antígenos típicamente incluye una o más "regiones de enlace complementarias" ("CDR", por sus siglas en inglés). Ciertas regiones de enlace a antígenos también incluyen una o más regiones de "estructura". Una "CDR" es una secuencia de aminoácidos que contribuye a la especificidad y afinidad de enlace a antígenos. Las regiones de "estructura" pueden ayudar a mantener la conformación adecuada de las CDRs para promover el enlace entre la región de' enlace a antígenos y un antígeno.
En ciertos aspectos, las proteínas de enlace a antígenos recombinantes que enlazan (i) ß-Klotho; (ii) FGFRlc, FGFR2c, FGFR3c o FGFR4; o (iii) un complejo que comprende ß-Klotho y uno de FGFRlc, FGFR2c, · FGFR3c, y FGFR4, se proporcionan. En este contexto, una "proteína recombinante" es una proteína hecha usando técnicas recombinantes , esto es, a través de la expresión de un ácido nucleico recombinante como se describe en la presente. Los métodos y técnicas para la producción de proteínas recombinantes son bien conocidos en la técnica.
El término "competir" cuando se usa en el contexto de proteínas de enlace a antígenos (por ejemplo, proteínas de enlace a antígenos neutralizantes, anticuerpos neutralizantes, proteínas agonistas de enlace a antígenos, anticuerpos agonistas y proteínas de enlace que se enlazan a (i) ß-Klotho; (ii) FGFRlc, FGFR2c, FGFR3c o FGFR4; o (iii) un complejo que comprende ß-Klotho y uno de FGFRlc, FGFR2c, FGFR3c, y FGFR4) que compiten por el mismo epítopo o sitio de enlace en un objetivo significa competencia entre proteínas de enlace a antígenos como se determina por un ensayo en el cual la proteína de enlace a antígenos (por ejemplo, anticuerpo o fragmento inmunológicamente funcional del mismo) bajo estudio evita o inhibe el enlace específico de una molécula de referencia (por ejemplo, un ligando de referencia, o proteína de enlace a antígenos de referencia, tal como un anticuerpo de referencia) para un antígeno común (por ejemplo, FGFRlc, FGFR2c, FGFR3c, FGFR4, ß-Klotho o un fragmento de los mismos) . Los numerosos tipos de ensayos de enlace competitivos pueden usarse para determinar si una molécula de prueba compite con una molécula de referencia para enlace. Los ejemplos de ensayos que pueden emplearse incluyen radioinmunoensayo indirecto o directo en fase sólida (RIA, por sus siglas en inglés) , inmunoensayo de enzima indirecta o directa en fase sólida (EIA, por sus siglas en inglés), ensayo de competencia intercalado (Ver, por ejemplo, Stahli et al., (1983) Methods in Enzymology 9:242-253); EIA de biotina-avidina directo en fase sólida (Ver, por ejemplo, Kirkland et al., (1986) J. Immunol. 137:3614-3619) ensayo etiquetado directo en fase sólida, ensayo intercalado etiquetado directo, en fase sólida (Ver, por ejemplo, Harlow y Lañe, (1988) ñntibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press) ; RIA etiquetado directo en fase sólida usando etiqueta 1-125 (Ver, por ejemplo, Morel et al., (1988) Molec. Immunol. 2_5:7-15); EIA de biotina-avidina directo en fase sólida (Ver, por ejemplo, Cheung, et al., (1990) Virology 176: 546-552) ; y RIA etiquetado directo (Moldenhauer et al., (1990) Scand. J. Immunol. 32:77-8.2). Típicamente, tal ensayo involucra el uso de un antígeno purificado enlazado a una superficie sólida o células que portan cualquiera de una proteína de enlace a antígenos de prueba no etiquetada o una proteína de enlace a antígenos de referencia etiquetada. La inhibición competitiva se mide al determinar la cantidad de la etiqueta enlazada a la superficie sólida o células en la presencia de la proteína de enlace a antígenos de prueba.
Usualmente la proteína de enlace a antígenos de prueba está presente en exceso. Las proteínas de enlace a antígenos identificadas por ensayo de competencia (proteínas de enlace a antígenos competentes) incluyen proteínas de enlace a antígenos enlazadas al mismo epítopo como las proteínas de enlace a antígenos de referencia y proteínas de enlace a antígenos enlazadas a un epítopo adyacente suficientemente próximo al enlace de epítopo por la proteína de enlace a antígenos de referencia para gue ocurra el obstáculo esférico. Los detalles adicionales con respecto a los métodos para determinar enlace competitivo se proporcionan en los ejemplos aquí. Usualmente, cuando una proteína competente de enlace a antígenos está presente en exceso, inhibirá el enlace específico de una proteína de referencia de enlace a antígenos a un antígeno común por al menos 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70% o 75%. En algún caso, el enlace se inhibe por al menos 80%, 85%, 90%, 95%, o 97% o más.
El término "antígeno" se refiere a una molécula o una porción de una molécula capaz de enlazarse por un agente selectivo de enlace, tal como una proteína de enlace a antígenos (incluyendo, por ejemplo, un anticuerpo o fragmento inmunológico funcional del mismo) , y también puede ser capaz de usarse en un animal para producir anticuerpos capaces de enlaza a tal antígeno. Un antígeno puede poseer uno o más epítopos que son capaces de interactuar con proteínas de enlace a antígenos diferentes, por ejemplo, anticuerpos. - El término "epítopo" significa los aminoácidos de una molécula objetivo que se ponen en contacto por una proteína de enlace a antígenos (por ejemplo, un anticuerpo) cuando la proteína de enlace a antígenos se enlaza a la molécula objetivo. El término incluye cualquier subconjunto de la lista completa de aminoácidos de la molécula objetivo que se ponen en . contacto cuando una proteína de enlace a antígenos, tal como un anticuerpo, se enlaza a la molécula objetivo. un epítopo puede ser contiguo o no contiguo (por ejemplo, (i) en un polipéptido de cadena sencilla, los residuos de aminoácidos que no son .contiguos uno con el otro en la secuencia de polipéptidos pero que dentro del contexto de la molécula objetivo se enlazan por la proteína de enlace a antígenos, o (ii) en un receptor multimérico que comprende dos o más componentes individuales, por ejemplo, (i) FGFRlc, FGFR2c, FGFR3c o FGFR4, y (ii) ß-Klotho, los residuos de aminoácidos que están presentes en uno o más de los componentes individuales, pero que están todavía enlazados por la proteína de enlace a antígenos) . En determinadas modalidades, los epítopos pueden imitarse en que comprenden una estructura tridimensional que es similar a un epítopo antigénico usado para generar la proteína de enlace a antigenos, aún comprenden ninguno o solamente algunos de los residuos de aminoácidos encontrados en tal epítopo usados para generar la proteína de enlace a antígenos. Más a menudo, los epítopos residen en las proteínas, pero en algunos casos pueden residir en otros tipos de moléculas, tales como ácidos nucleicos. Los determinantes de epítopos pueden incluir agrupamientos de . superficie químicamente activos de moléculas tales como aminoácidos, cadenas laterales de azúcares, grupos fosforilo o sulfonilo, y pueden tener características estructurales tridimensionales, y/o características de carga específicas. Generalmente, las proteínas de enlace a antígenos específicas para una molécula objetivo particular reconocerán preferencialmente un epítopo en la molécula objetivo en una mezcla de complejo de proteínas y/o macromoléculas.
El término "identidad" se refiere a una relación entre las secuencias de dos o más moléculas de polipéptidos o dos o más moléculas de ácido nucleico, cuando se determina por alineación y comparación · de las secuencias. "Porcentaje de identidad" significa el. porcentaje de residuos idénticos entre los aminoácidos o nucleótidos en las moléculas comparadas y se calcula con base en el tamaño de la más pequeña de las moléculas que se comparan. Para estos cálculos, los espacios en las alineaciones (si fuera necesario) deben direccionarse por un modelo matemático particular o programa de computadora (esto es, un "algoritmo"). Los métodos que pueden usarse para calcular la identidad de los ácidos nucleicos o polipéptidos alineados incluyen aquellos descritos en Computa tional Molecular Biology, (Lesk, A. M . , ed. ) , (1988) New York: Oxford University Press; Biocomputing Informatics y Genome Projects, (Smith, D. ., ed.), 1993, New York: Academic Press; Computer Analysis de SEQuence Data, Parte I, (Griffin, A. ., y Griffin, H. G., eds . ) , 1994, New Jersey: Humana Press; von Heinje, G., (1987) Sequence Analysis in Molecular Biology, New York: Academic Press; Sequence Analysis Primer, (Gribskov, M. y Devereux, J. , eds.), 1991, New York: M. Stockton Press; Carillo et al., (1988) SIAM J. Applied Math. 4j3:1073.
Al calcular el porcentaje de identidad, las secuencias que se comparan se alinean en una forma que da la mayor coincidencia entre las secuencias. El programa de computadora usados para determinar el porcentaje de identidad es el paquete de programa- GCG, que incluye GAP (Devereux et al., (1984) Nucí. Acid' Res. 12:387; Genetics Computer Group, University de Wisconsin, Madison, WI) . El GAP de algoritmo de computadora se usa para alinear los dos polipéptidos o polinucleótidos para los cuales el porcentaje de identidad de secuencia es a determinarse. Las secuencias se alinean para coincidencia óptima de su aminoácido o nucleótido respectivo (el "espacio en coincidencia", como se determina por el algoritmo) . Una penalizacion por abertura de espacio (que se calcula como 3x la diagonal promedio, en donde la "diagonal promedio" es el promedio de la diagonal de la matriz de comparación que se usa; la "diagonal" es el registro o número asignado a cada coincidencia de aminoácido perfecta por la matriz de comparación particular) y un penalizacion por extensión de espacio (que es usualmente 1/10 veces la penalizacion por abertura de espacio) , asi como una matriz de comparación tal como PAM 250 o BLOSU 62 se usan en conjunto con el algoritmo. En determinadas modalidades, una matriz de comparación estándar (Ver, Dayhoff- et al., (1978) Atlas de Protein Sequence y Structure 5:345-352 for the PAM 250 comparison matrix; Henikoff et al., (1992) Proc. Nati. Acad. Sci. E.U.A. 89:10915-10919 for the BLOSUM 62 comparison matrix) también se usa por el algoritmo.
Los parámetros recomendados para determinar el porcentaje de identidad para polipéptidos o secuencias de nucleótidos al usar el programa GAP son los siguientes: Algoritmo: Needleman et al., 1970, J. Mol. Biol. 48:443- 453; Matriz de comparación: BLOSUM 62 de Henikoff et al., 1992, supra; Penalización por espacio: 12 (pero sin ninguna penalización por huecos finales) Penalización por Longitud de Espacio: 4 Umbral de Similitud: 0 Ciertos esquemas de alineación para alinear dos secuencias de aminoácidos pueden resultar en igualado de solamente una región corta de las dos secuencias, y esta región alineada pequeña puede tener identidad de secuencia muy alta aunque no existe relación importante entre las dos secuencias de longitud completa. En consecuencia, el método de alineación seleccionado (por ejemplo, el programa GAP) puede ajustarse si se desea para resultar en una alineación que se extiende al menos 50 aminoácidos contiguos del polipéptido objetivo.
Como se usa en la presente, "sustancialmente pura" significa que la especie descrita de la molécula es la especie predominante presente, esto es, en una base molar es más abundante que cualquier otra especie individual en la misma mezcla. En determinadas modalidades, una molécula sustancialmente pura es una composición en donde la especie objetivo comprende al menos 50% (en una base molar) de todas las especies macromoleculares presentes. En otras modalidades, una composición sustancialmente pura comprenderá al menos 80%, 85%, 90%,. 95%, o 99% de todas las especies macromoleculares presentes en la composición. En otras modalidades, la especie objetivo se purifica para homogeneidad esencial en donde las especies contaminantes no pueden detectarse en la composición por métodos de detección convencionales y de esta manera la composición consiste de una especie macromolecular detectable sencilla.
Los términos "tratar" y "tratamiento" se refieren a cualquier indicación de éxito en el tratamiento o alivio de una lesión, patología o afección, incluyendo cualquier parámetro objetivo o subjetivo tal como reducción; remisión; disminución de síntomas o hacer la lesión, patología o afección más tolerable para el paciente; disminución en la velocidad de degeneración o descenso; hacer el punto final de degeneración menos debilitante; mejorando el bienestar mental o físico del paciente. El tratamiento o aminoramiento de los síntomas se puede basar en parámetros objetivos o subjetivos; incluyendo los resultados del examen físico, exámenes neuropsiquiátricos, y/o una evaluación psiquiátrica. Por ejemplo, ciertos métodos aquí presentados pueden emplearse para tratar Diabetes tipo 2, obesidad y/o dislipidemia, ya sea profilácticamente o. como un tratamiento agudo, para disminuir niveles de glucosa en plasma, para disminuir niveles de triglicéridos en circulación, para disminuir niveles de colesterol en circulación y/o aminorar un síntoma asociado con diabetes tipo 2, obesidad y dislipidemia .
Una "cantidad efectiva" es generalmente una cantidad suficiente para reducir la severidad y/o frecuencia de los síntomas, eliminar los síntomas y/o causa subyacente, prevenir la presencia de los síntomas y/o su causa subyacente, y/o mejorar o remediar el daño que resulta de o se asocia con diabetes, obesidad y dislipidemia. En algunas modalidades, la cantidad efectiva es una cantidad terapéuticamente efectiva o una cantidad profilácticamente efectiva. Una "cantidad terapéuticamente efectiva" es una cantidad suficiente para remediar un estado de enfermedad (por ejemplo, diabetes, obesidad o dislipidemia) o síntomas, particularmente un estado o síntomas asociados con el estado de enfermedad,' o evitar, obstaculizar, retardar o invertir de otra manera el avance del estado de enfermedad o cualquier otro síntoma indeseado asociado con la enfermedad de ninguna manera. Una "cantidad profilácticamente efectiva" es una cantidad de una composición farmacéutica que, cuando se administra a un sujeto, tendrá el efecto profiláctico pretendido, por ejemplo, prevenir o retardar el comienzo (o reaparición) de diabetes, obesidad o dislipidemia, o reduce la probabilidad del comienzo (o reaparición) de diabetes, obesidad o dislipidemia o síntomas asociados. El efecto profiláctico o terapéutico completo no ocurre necesariamente por administración de una dosis, y puede ocurrir solamente después de la administración de una serie de dosis. Asi, una cantidad efectiva terapéutica o ' profilácticamente puede ser administrada en una o más administraciones.
"Aminoácido" toma su significado normal en la técnica. Los veinte aminoácidos que se presentan naturalmente y sus abreviaturas siguen el uso convencional. Ver, Immunology-A Synthesis, 2a Edición,. (E. S. Golub y D. R. Green, eds . ) , Sinauer Associates: Sunderland, Mass. (1991), incorporada en la presente como referencia para cualquier propósito. Los estereoisómeros (por ejemplo, aminoácidos D) de los veinte aminoácidos convencionales, aminoácidos no naturales o que no se presentan naturalmente tales como aminoácido a-,a-disustituidos, aminoácidos N-alquilo, y otros aminoácidos no convencionales también pueden ser componentes adecuados para polipéptidos y se incluyen en la frase "aminoácido." Los ejemplos de aminoácidos no naturales (que pueden sustituirse por cualquier aminoácido que se presenta naturalmente encontrado en cualquier secuencia descrita en la presente, como se desea) incluyen: 4-hidroxiprolina, ?-carboxiglutamato, e-?, , N-trimetilisina, e-?-acetilisina , 0-fosfoserina, N-acetilserina, ' N-formilmetionina, 3-metilhistidina, 5-hidroxilisina, s-?-metilarginina, y otro aminoácidos similares y ácidos imino (por ejemplo, 4-hidroxiprolina) . En la notación del polipéptido usada en la presente, la dirección a la izquierda es la dirección de terminal amino y la dirección a la derecha es la dirección de terminal carboxilo, de acuerdo con uso y convención estándar. Las listas no limitantes de ejemplos de aminoácidos que no se presentan naturalmente que pueden insertarse en una secuencia de proteina de enlace a antigenos o sustituirse por un residuos de tipo natural en una secuencia de enlace a antigeno incluye aminoácidos ß, homoaminoácidos , aminoácidos cíclicos y aminoácidos con cadenas laterales derivadas. Los ejemplos incluyen (en la forma L o forma D; abreviados como en los paréntesis): citrulina (Cit), homocitrulina (hCit), Na-metilcitrulina (NMeCit) , ?a-metilhomocitrulina (Na- eHoCit) , ornitina . (Orn) , Na-Metilornitina (?a-MeOrn o NMeOrn), sarcosina (Sar) , homolisina (hLys o hK) , h moarginina (hArg o hR) , ' homoglutamina (hQ), ?a-metilarginina (NMeR) , Na-metileucina (?a-MeL o NMeL) , N-metilhomolisina (N eHoK) , ?a-metilglutamina (NMeQ) , norleucina (Nle) , norvalina (Nva) , 1,2,3,4-tétrahidroisoquinolina (Tic) , ácido octahidroindol-2-carboxílico (Oic) , 3- ( 1-naftil ) alanina (1-Nal), 3- (2-naftil ) alanina (2-Nal) , 1, 2, 3, 4-tetrahidroisoquinolina (Tic), 2-indanilglicina (Igl), para-yodofenilalanina (pl-Phe) , para-aminofenilalanina (4AmP o 4-Amino-Phe) , 4-guanidino fenilalanina (Guf ) , glicilisina (abreviado "K (?e-glicilo) " o "K(glicilo)" o "K(gly)"), nitrofenilalanina (nitrophe) , aminofenilalanina (aminophe o Amino-Phe) , bencilfenilalanina (bencilfe) , ácido ?-carboxiglutámico (?-carboxiglu) , hidroxiprolina (hidroxipro) , p-carboxil-fenilalanina (Cpa) , ácido oí-aminoadípico (Aad) , ?a-metil valina (NMeVal), N-a-metil leucina (NMeLeu) , ?a-metilnorleucina (NMeNle) , ciclopentilglicina (Cpg) , ciclohexilglicina (Chg) , acetilarginina (acetilarg) , ácido , ß-diaminopropionoico (Dpr), ácido o¡, ?-diaminobutirico (Dab), ácido diaminopropiónico (Dap) , ciclohexilalanina (Cha) , 4-metil-fenilalanina (MePhe) , ß, ß-difenil-alanina (BiPhA) , ácido arainobutirico (Abu) , 4-fenil-fenilalanina (o bifenilalanina ; 4Bip) , ácido a-amino-isobutírico (Aib) , beta-alanina, ácido beta-aminopropiónico, ácido piperidinico, ácido aminocaprioico, ácido aminoheptanoico, ácido aminopimélico, desmosina, ácido diaminopimélico, N-etilglicina, N-etilaspargina, hidroxilisina , allo-hidroxilisina, isodesmosina, allo-isoleucina, N-metilglicina, N-metilisoleucina, N-metilvalina, 4-hidroxiprolina (Hyp) , ?-carboxiglutamato, e-?, N, -trimetilisina, e-?-acetilisina, 0-fosfoserina, N-acetilserina, -formilmetionina, 3-metilhistidina, 5-hidroxilisina,. ?-metilarginina, ácido 4-Amino-O-ftálico (4APA) , y otros aminoácidos similares, y formas derivadas de cualquiera de aquellos enlistados específicamente .
II. PANORAMA. GENERAL Se proporcionan en la presente proteínas de enlace a antígenos que enlazan (i) ß-Klotho; (ii) FGFRlc, FGFR2c, FGFR3c o FGFR4; o (iii) un complejo que comprende ß-Klotho y uno de FGFRlc, FGFR2c, FGFR3c, y FGFR . Una propiedad única de las proteínas de enlace a antígenos descritas en la presente es la naturaleza antagónica de estas proteínas, específicamente la capacidad para imitar el efecto in vivo de FGF21 y para inducir señalización del tipo FGF21. De forma más remarcable y específicamente, algunas de las proteínas de enlace a antígenos descritas en la presente inducen señalización del tipo FGF21 en varios ensayos con base en célula in vitro, incluyendo el ensayo reportero de ELK-luciferasa del Ejemplo 5 bajo las siguientes condiciones: (1) el enlace a y actividad del receptor FGF21 es dependiente de ß-Klotho; (2) la actividad es selectiva para complejo FGFRlc^Klotho; (3) el enlace a la FGFRlc/^Klotho dispara trayectorias de señalización del tipo FGF21; y (4) 'la potencia (EC50) es comparable con un estándar FGF21 de tipo natural que comprende la forma madura de la SEQ ID NO: 2, como se mide en los siguientes ensayos con base en célula: (1) el ensayo de células de reportero de luciferasa mediado por el receptor FGF21 recombinante del Ejemplo 5; (2) la fosforilación ERK en el ' ensayo de células mediado por el receptor FGF21 recombinante del Ejemplo 5; y (3) fosforilación ERK en adipocitos humanos como se describe en más detalle en el Ejemplo 7. Las proteínas de enlace a antígenos descritas, por lo tanto, se esperan para mostrar actividades in vivo que son consistentes con la función biológica natural .de FGF21. Esta propiedad hace las proteínas de enlace a antígenos descritas viables terapéuticos para el tratamiento de enfermedades metabólicas tales como diabetes tipo 2, obesidad, dislipidemia, NASH, enfermedad cardiovascular, síndrome metabólico y ampliamente cualquier enfermedad o afección en la cual es deseable imitar o aumentar los efectos in vivo de FGF21.
En algunas modalidades de la presente descripción las proteínas ¦ de enlace a antígenos proporcionadas pueden comprender polipéptidos en .los cuales una o más regiones determinantes de la complementariedad (CDRs) pueden enterrarse y/o unirse. En tales proteínas de enlace a antígenos, las CDRs pueden enterrarse en una región de "estructura", que orienta las CDRs de manera que las propiedades de enlace a antígeno propias de las CDRs se alcanzan. En general, tales proteínas de enlace a antígenos que se proporcionan pueden facilitar o potencial la interacción entre FGFRlc y ß-Klotho, y pueden sustancialmente inducir señalización del tipo FGF21.
Ciertas proteínas de enlace a antígenos descritas en la presente son anticuerpos o se derivan de anticuerpos. En determinadas modalidades, la estructura de polipéptido de la proteína de enlace a antígenos es con base en los anticuerpos, incluyendo, pero no limitado a, anticuerpos monoclonales, anticuerpos biespecífieos , minicuerpos, anticuerpos de dominio, anticuerpos sintéticos (algunas veces referidos en la presente como "imitaciones de anticuerpos") , anticuerpos quiméricos, anticuerpos humanizados, anticuerpos humanos, fusiones de anticuerpo (algunas veces referido en la presente como "conjugados de anticuerpo") , hemicuerpos y fragmentos de los mismos. Las varias estructuras se describen además en la presente a continuación.
Las proteínas de enlace a antígenos proporcionadas en la presente se han demostrado para enlazar a (i) ß-Klotho; (ii) FGFRlc, FGFR2c, FGFR3c o FGFR ; o (iii) un complejo que comprende ß-Klotho y uno de FGFRlc, ' FGFR2c, FGFR3c, y FGFR4, y particularmente a (i) ß-Klotho humana; (ii) FGFRlc humano, FGFR2c humano, FGFR3c humano o FGFR4 humano; o (iii) un complejo que comprende ß- lotho humana y uno de FGFRlc humano, FGFR2c humano, FGFR3c humano, y FGFR4 humano. Como se describe y muestra en los Ejemplos presentados en la presente, con base en los resultados Western blot, anticuerpos anti-p-Klotho o anti-FGFRlc comercialmente disponibles enlazados a ß-Klotho o FGFRlc desnaturalizado mientras que la proteina de enlace a antigenos (anticuerpos agonistas) no. En cambio, las proteínas de enlace a antigenos proporcionadas reconocen la estructura nativa del FGFRlc y ß-Klotho en la superficie celular mientras que .los anticuerpos comerciales no, con base en los resultados FACS proporcionados. Ver Ejemplo 9. Las proteínas de enlace a antígenos que se proporcionan por lo tanto imitan la actividad biológica in vivo natural de FGF21. Como una consecuencia, las proteínas de enlace a antígenos proporcionadas en la presente son capaces de activar la actividad de señalización del tipo FGF21. En particular, las proteínas de enlace a antígenos descritas pueden tener una o más de las siguientes actividades in vivo: inducción de trayectorias de transducción de señal tipo FGF21, niveles de glucosa en la sangre disminuidos, niveles de lípido circulantes ¦ disminuidos, parámetros metabólicos mejorados y otros efectos fisiológicos inducidos in vivo por la formación del complejo ternario de FGFRlc, ß-Klotho y FGF21, por ejemplo en condiciones tales como diabetes tipo 2, obesidad, dislipidemia, NASH, enfermedad cardiovascular, y síndrome metabólico.
Las proteínas de enlace a antígenos ' que enlazan específicamente a (i) ß-Klotho; (ii) FGFRlc, FGFR2c, FGFR3c o FGFR4; o (iii) un complejo que comprende ß-Klotho y uno de FGFRlc, FGFR2c, FGFR3c, y FGFR4 que están descritas en la presente, tienen una variedad de usos. Algunas de las proteínas de enlace a antígenos, por ejemplo, son útiles en ensayos específicos de enlace, en la purificación por afinidad de (i) ß-Klotho; (ii) FGFRlc, FGFR2c, FGFR3c o FGFR4 ; o (iii) un complejo que comprende ß-Klotho y uno de FGFRlc, FGFR2c , . FGFR3c, y FGFR4 , incluyendo las formas humanas de estas proteínas descritas, y en ensayos de selección para identificar agonistas de la actividad de señalización del tipo FGF21.
Las proteínas de enlace a antígenos que enlazan específicamente (i) ß-Klotho; (ii) FGFRlc, FGFR2c, . FGFR3c o FGFR4; o (iii) un complejo que comprende ß-Klotho y uno de FGFRlc, FGFR2.C , FGFR3c, y FGFR4 que se describen en la presente pueden usarse en una variedad de aplicaciones de tratamiento, como se explica en la presente. Por ejemplo, ciertas proteínas de enlace a antígenos son útiles para tratar afecciones asociadas con procesos de señalización del tipo FGF21 en un paciente, tales como reducir, aliviar, o tratar diabetes tipo 2, obesidad, dislipidemia, NASH, enfermedad cardiovascular, y síndrome metabólico. Otros usos para las proteínas de enlace a antígenos incluyen, por ejemplo, diagnostico de enfermedades o afecciones asociadas con ß-Klotho, FGFRlc, FGFR2c, FGFR3c, FGFR4 o FGF21, y ensayos de separación por exclusión para determinar la presencia o ausencia de estas moléculas. Algunas de las proteínas de enlace a antígenos descritas en la presente pueden ser útiles en el tratamiento de afecciones, síntomas y/o la patología asociada con la actividad disminuida de señalización del tipo FGF21. Las condiciones ejemplares incluyen, pero no se limitan a, diabetes, obesidad, NASH y dislipidemia .
FGF21 Las proteínas de enlace a antígenos descritas en la presente inducen .señalización mediada por FGF21, como se define en la presente. In vivo, la forma madura de FGF21 es la forma activa de la molécula. La secuencia de nucleótidos que codifica FGF21 de longitud completa se proporciona; los nucleótidos que codifican la secuencia de señal están subrayados.
ATG GAC TCG GAC GAG ACC GGG TTC GAG CAC TCA GGA CTG TGG GTT TCT GTG CTG GCT GGT CTT CTG CTG GGA GCC TGC CAG GCA CAC CCC ATC CCT GAC TCC AGT CCT CTC CTG CAA TTC GGG GGC CAA GTC CGG CAG CGG TAC CTC TAC ACA GAT GAT GCC CAG CAG ACA GAA GCC CAC CTG GAG ATC AGG GAG GAT GGG ACG GTG GGG GGC GCT GCT GAC CAG AGC CCC GAA AGT CTC CTG CAG CTG AAA GCC TTG AAG CCG GGA GTT ATT CAA ATC TTG GGA GTC AAG ACA TCC AGG TTC CTG TGC CAG CGG CCA GAT GGG GCC CTG TAT GGA TCG CTC CAC TTT GAC CCT GAG GCC TGC AGC TTC CGG GAG CTG CTT CTT GAG GAC GGA TAC AAT GTT TAC CAG TCC GAA GCC CAC GGC CTC CCG CTG CAC CTG CCA GGG AAC AAG TCC CCA CAC CGG GAC CCT GCA CCC CGA GGA CCA GCT CGC TTC CTG CCA CTA CCA GGC CTG CCC CCC GCA CCC CCG GAG CCA CCC GGA ATC CTG GCC CCC CAG CCC CCC GAT GTG GGC TCC TCG GAC CCT CTG AGC ATG GTG GGA CCT TCC CAG GGC CGA AGC CCC AGC TAC GCT TCC TGA (SEQ ID NO: 1) La secuencia de aminoácidos de FGF21 de longitud completa se proporciona; los aminoácidos que constituyen la secuencia de señal están subrayados: MDSDETGFEHSGLWVSVLAGLLLGACOAHPIPDSSPLLOFGGO VRQRYLYTDDAQQTEAHLEIREDGTVGGAADQSPESLLQL A LKPGVIQILGVKTSRFLCQRPDGALYGSLHFDPEACSFRELLLE DGYNVYQSEAHGLPLHLPGN .SPHRDPAPRGPARFLPLPGLPP APPEPPG1LAPQPPDVGSSDPLSMVGPSQGRSPSYAS (SEQ ID NO: FGFRlc Las proteínas de enlace a. antígenos descritas en la presente se enlazan a FGFRlc, en particular FGFRlc humano, cuando se asocia con ß-Klotho. La secuencia de nucleótidos que codifica FGFRlc humano (Número de Acceso al GenBank NM_023110) se proporciona: ATGTGGAGCTGGAAGTGCCTCCTCTTCTGGGCTGTGCTGGTCACAGCC ACACTCTGCACCGCTAGGCCGTCCCCGACCTTGCCTGAACAAGCCCAG CCCTGGGGAGCCCCTGTGGAAGTGGAGTCCTTCCTGGTCCACCCCGGT GACCTGCTGCAGCTTCGCTGTCGGCTGCGGGACGATGTGCAGAGCATC AACTGGCTGCGGGACGGGGTGCAGCTGGCGGAAAGCAACCGCACCCG CATCACAGGGGAGGAGGTGGAGGTGCAGGACTCCGTGCCCGCAGACT CCGGCCTCTATGCTTGCGTAACCAGCAGCCCCTCGGGCAGTGACACCA CCTACTTCTCCGTCAATGTTTCAGATGCTCTCCCCTCCTCGGAGGATGA TGATGATGATGATGACTCCTCTTCAGAGGAGAAAGAAACAGATAACA CCAAACCAAACCGTATGCCCGTAGCTCCATATTGGACATCACCAGAAA AGATGGAAAAGAAATTGCATGCAGTGCCGGCTGCCAAGACAGTGAAG TTCAAATGCCCTTCCAGTGGGACACCAAACCCAACACTGCGCTGGTTG AAAAATGGCAAAGAATTCAAACCTGACCACAGAATTGGAGGCTACAA GGTCCGTTATGCCACCTGGAGCATCATAATGGACTCTGTGGTGCCCTC TGACAAGGGCAACTACACCTGCATTGTGGAGAATGAGTACGGCAGCA TCAACCACACATACCAGCTGGATGTCGTGGAGCGGTCCCCTCACCGGC CCATCCTGCAAGCAGGGTTGCCCGCCAACAAAACAGTGGCCCTGGGT AGCAACGTGGAGTTCATGTGTAAGGTGTACAGTGACCCGCAGCCGCAC ATCCAGTGGCTAAAGCACATCGAGGTGAATGGGAGCAAGATTGGCCC AGACAACCTGCCTTATGTCCAGATCTTGAAGACTGCTGGAGTTAATAC CACCGACAAAGAGATGGAGGTGCTTCACTTAAGAAATGTCTCCTTTGA GGACGCAGGGGAGTATACGTGCTTGGCGGGTAACTCTATCGGACTCTC CCATCACTCTGCATGGTTGACCGTTCTGGAAGCCCTGGAAGAGAGGCC GGCAGTGATGACCTCGCCCCTGTACCTGGAGATCATCATCTATTGCAC AGGGGCCTTCCTCATCTCCTGCATGGTGGGGTCGGTCATCGTCTACAA GATGAAGAGTGGTACCAAGAAGAGTGACTTCCACAGCCAGATGGCTG TGCACAAGCTGGCCAAGAGCATCCCTCTGCGCAGACAGGTAACAGTG TCTGCTGACTCCAGTGCATCCATGAACTCTGGGGTTCTTCTGGTTCGGC CATCACGGCTCTCCTCCAGTGGGACTCCCATGCTAGCAGGGGTCTCTG AGTATGAGCTTCCCGAAGACCCTCGCTGGGAGCTGCCTCGGGACAGAC TGGTCTTAGGCAAACCCCTGGGAGAGGGCTGCTTTGGGCAGGTGGTGT TGGCAGAGGCTATCGGGCTGG ACAAGGACAAACCCAACCGTGTGACC AAAGTGGCTGTGAAGATGTTGAAGTCGGACGCAACAGAGAAAGACTT GTCAGACCTGATCTCAGAAATGGAGATGATGAAGATGATCGGGAAGC ATAAGAATATCATCAACCTGCTGGGGGCCTGCACGCAGGATGGTCCCT TGTATGTCATCGTGGAGTATGCCTCCAAGGGCAACCTGCGGGAGTACC TGCAGGCCCGGAGGCCCCCAGGGCTGGAATACTGCTACAACCCCAGC CACAACCCAG AGGAGCAGCTCTCCTCCAAGG ACCTGGTGTCCTGCGCC TACCAGGTGGCCCGAGGCATGGAGTATCTGGCCTCCAAGAAGTGCATA CACCGAGACCTGGCAGCCAGGAATGTCCTGGTGACAGAGGACAATGT GATGAAGATAGCAGACTTTGGCCTCGCACGGGACATTCACCACATCGA CTACTATAAAAAGACAACCAACGGCCGACTGCCTGTGAAGTGGATGG CACCCGAGGCATTATTTGACCGGATCTACACCCACCAGAGTGATGTGT GGTCTTTCGGGGTGCTCCTGTGGGAGATCTTCACTCTGGGCGGCTCCCC ATACCCCGGTGTGCCTGTGGAGGAACTTTTCAAGCTGCTGAAGGAGGG TCACCGCATGGACAAGCCCAGTAACTGCACCAACGAGCTGTACATGAT GATGCGGGACTGCTGGCATGCAGTGCCCTCACAGAGACCCACCTTCAA GCAGCTGGTGGAAGACCTGGACCGCATCGTGGCCTTGACCTCCAACCA GGAGTACCTGGACCTGTCCATGCCCCTGGACCAGTACTCCCCCAGCTT TCCCGACACCCGGAGCTCTACGTGCTCCTCAGGGGAGGATTCCGTCTT CTCTCATGAGCCGCTGCCCGAGGAGCCCTGCCTGCCCCGACACCCAGC CCAGCTTGCCAATGGCGGACTCAAACGCCGCTGA (SEQ ID N0:3).
La secuencia de aminoácidos de FGFRlc humano (Número de Acceso al GenBank NP_075598) se proporciona: MWSWKCLLFWAVLVTATLCTARPSPTLPEQAQPWGAPVEVESFLVHPG DLLQLRCRLRDDVQSTNWLRDGVQLAESNRTRTTGEEVEVQDSVPADSGL YACVTSSPSGSDTTYFSVMVSDALPSSEDDDDDDDSSSEEKETDNT LPNR MPVAPYWTSPEKMEKKLHAVPAAKTVKF CPSSGTPNPTLRWLK GKEF KPDHRIGGY VRYATWSIIMDSVVPSD GNYTCrVENEYGSINHTYQLDV VERSPHRPTLQAGLPANKTVALGSNVEFMCKVYSDPQPHTQWLKHIEVNG S 1GPDNLPYVQIL TAGVNTTD EMEVLHLRMVSFEDAGEYTCLAGNSI GLSHHSAWLTVLEALEERPAVMTSPLYLEIIIYCTGAFLISCMVGSVIVYK MKSGTKXSDFHSQ1V1AVHK A SIPLPJ QVTVSADSSASMNSGVLLVRPS RLSSSGTPMLAGVSEYELPEDPRWELPRDRLVLG PLGEGCFGQVVLAEA 1GLDKDKPNRVTKVAVKMLKSDATEKJDLSDL1SEMEM LLGACTQDGPLYVrVEYAS GNLREYLQARRPPGLEYCYNPSHNPEEQLS SKDLVSCAYQVARG EYLAS KCTHRDLAARNVLVTEDNV TADFGL ARD1HH1DYYKXTTNGRLPVKWMAPEALFDR1YTHQSDVWSFGVLLWE1 FTLGGSPYPGVPV££LFKLL £GHRMD SNCTNELYMMMR CWHAVP SQRPTFKQLVEDLDRIVALTSNQEYLDLSMPLDQYSPSFPDTRSSTCSSGE DS VF SHEPLPEEPCLPR HP AQL ANGGL R R (SEQ TD NO: 4).
Las proteínas de enlace a antígenos descritas en la presente se enlazan a la porción extracelular de FGFRlc. Un ejemplo de una región extracelular de FGFRlc es: WSWKCLLFWAVLVTATLCTARPSPTLPEQAQPWGAPVEVESFLVHPGDLLQL RCRLRDDVQS1NWLRDGVQLAESNRTR1TGEEVEVQDSVPADSGLYACVTSSPS GSDTTYFSVNVSDALPSSEDDDDDDDSSSEEKLETDNTKPNRMPVAPYWTSPE M EKJ LHAVPAAKTVKF CPSSGTPNPTLRWLK GKEFKPDHRJGGYKVRYATWSI TMDSVVPSDKGNYTCTVENEYGSTNHTYQLDVVERSPHRPTLQAGLPAN TVALG SNVEFMCKVYSDPQPH1QWLKH1EVNGSKJGPDNLPYVQ1L TAGVNTTD EME VLHLR VSFEDAGEYTCLAGNS1GLSHHSAWLTVLEALEERPAVMTSPLY (SEQ ID NO: 5).
Como se describe en la presente, las proteínas FGFRlc también pueden incluir fragmentos. Como se usa en la presente, los términos se usan de manera intercambiable para significar un -receptor, en particular y a menos que se especifique de otra manera, un receptor humano, que en asociación con ß-Klotho y FGF21 induce actividad de señalización del tipo FGF21.
El término FGFRlc también incluye modificaciones post- traduccionales de la secuencia de aminoácido FGFRlc, por ejemplo, sitios de glicosilación ligados a N posibles. De esta manera, las proteínas de enlace a antigenos pueden enlazar a o generarse de proteínas glicosiladas en una o más de las posiciones. ß-Klotho Las proteínas de enlace a antígenos aquí descritas se enlazan a ß-Klotho, en particular ß-Klotho humana. La secuencia de nucleótidos que codifica ß-Klotho humana (Número de Acceso al GenBank NM_175737) se proporciona: ATGAAGCC AGGCTGTGCGGCAGGATCTCCAGGG AATGAATGGATTTTC TTCAGCACTGATGAAATAACCACACGCTATAGGAATACAATGTCCAAC GGGGGATTGCAAAGATCTGTCATCCTGTCAGCACTTATTCTGCTACGA GCTGTTACTGGATTCTCTGGAGATGGAAGAGCTATATGGTCTAAAAAT' CCTAATTTTACTCCGGTAAATGAAAGTCAGCTGTTTCTCTATGACACTT TCCCTAAAAACTTTTTCTGGGGTATTGGGACTGGAGCATTGCAAGTGG A AGGGAGTTGGA AGA AGGATGGA A AAGGACCTTCTATATGGG ATCAT TTCATCCACACACACCTTAAAAATGTCAGCAGCACGAATGGTTCCAGT GACAGTTATATTTTTCTGGAAAAAGACTTATCAGCCCTGGATTTTATAG GAGTTTCTTTTTATCAATTTTCAATTTCCTGGCCAAGGCTTTTCCCCGAT GGAATAGTAACAGTTGCCAACGCAAAAGGTCTGCAGTACTACAGTACT CTTCTGGACGCTCTAGTGCTTAGAAACATTGAACCTATAGTTACTTTAT ACCACTGGGATTTGCCTTTGGCACTACAAG AAAAATATGGGGGGTGGA AAAATGATACCATAATAGATATCTTCAATGACTATGCCACATACTGTT TCCAGÁTGTTTGGGGACCGTGTCAAATATTGGATTACAATTCACAACC CATATCTAGTGGCTTGGCATGGGTATGGGACAGGTATGCATGCCCCTG GAGAGAAGGGAAATTTAGCAGCTGTCTACACTGTGGGACACAACTTG ATCAAGGCTCACTCGAAAGTTTGGCATAACTACAACACACATTTCCGC CCACATCAGAAGGGTTGGTTATCGATCACGTTGGGATCTCATTGGATC GAGCCAAACCGGTCGGAAAACACGATGGATATATTCAAATGTCAACA ATCCATGGTTTCTGTGCTTGGATGGTTTGCCAACCCTATCCATGGGGAT GGCGACTATCCAGAGGGGATGAGAAAGAAGTTGTTCTCCGTTCTACCC ATTTTCTCTGAAGCAGAGAAGCATGAGATGAGAGGCACAGCTGATTTC TTTGCCTTTTCTTTTGGACCCAACAACTTCAAGCCCCTAAACACCATGG CTAAAATGGGACAAAATGTTTCACTTAATTTAAGAGAAGCGCTGAACT GGATTAAACTGGAATACAACAACCCTCGAATCTTGATTGCTGAGAATG GCTGGTTCACAGACAGTCGTGTGAAAACAGAAGACACCACGGCCATC TACATGATGAAGAATTTCCTCAGCCAGGTGCTTCAAGCAATAAGGTTA GATGAAATACGAGTGTTTGGTTATACTGCCTGGTCTCTCCTGGATGGCT TTGAATGGCAGGATGCTTACACCATCCGCCGAGGATTATTTTATGTGG ATTTTAACAGTAAACAGAAAGAGCGGAAACCTAAGTCTTCAGCACACT ACTACAAACAGATCATACGAGAAAATGGTTTTTCTTTAAAAGAGTCCA CGCCAGATGTGCAGGGCCAGTTTCCCTGTGACTTCTCCTGGGGTGTCA CTGAATCTGTTCTTAAGCCCGAGTCTGTGGCTTCGTCCCCACAGTTCAG CGATCCTCATCTGT ACGTGTGGAACGCCACTGGCAACAG ACTGTTGCA CCGAGTGGAAGGGGTGAGGCTGAAAACACGACCCGCTCAATGCACAG ATTTTGTAAACATCAAAAAACAACTTGÁGATGTTGGCAAGAATGAAA GTCACCCACTACCGGTTTGCTCTGGATTGGGCCTCGGTCCTTCCCACTG GCAACCTGTCCGCGGTGAACCGACAGGCCCTGAGGTACTACAGGTGC GTGGTCAGTGAGGGGCTGAAGCTTGGCATCTCCGCGATGGTCACCCTG TATTATCCGACCCACGCCCACCTAGGCCTCCCCGAGCCTCTGTTGCAT GCCGACGGGTGGCTGAACCCATCGACGGCCGAGGCCTTCCAGGCCTA CGCTGGGCTGTGCTTCCAGGAGCTGGGGGACCTGGTGAAGCTCTGGAT CACCATCAACGAGCCTAACCGGCTAAGTGACATCTACAACCGCTCTGG CAACGACACCTACGGGGCGGCGCACAACCTGCTGGTGGCCCACGCCC TGGCCTGGCGCCTCTACGACCGGCAGTTCAGGCCCTCACAGCGCGGGG CCGTGTCGCTGTCGCTGCACGCGGACTGGGCGGAACCCGCCAACCCCT ATGCTGACTCGCACTGGAGGGCGGCCGAGCGCTTCCTGCAGTTCGAGA TCGCCTGGTTCGCCGAGCCGCTCTTCAAGACCGGGGACTACCCCGCGG CCATGAGGGAATACATTGCCTCCAAGCACCGACGGGGGCTTTCCAGCT CGGCCCTGCCGCGCCTCACCGAGGCCGAAAGGAGGCTGCTCAAGGGC ACGGTCGACTTCTGCGCGCTCAACCACTTCACCACTAGGTTCGTGATG CACGAGCAGCTGGCCGGCAGCCGCTACGACTCGGACAGGGACATCCA GTTTCTGCAGGACATCACCCGCGTGAGCTCCCCCACGCGCCTGGCTGT GATTCCCTGGGGGGTGCGCAAGCTGCTGCGGTGGGTCCGGAGGAACT ACGGCGACATGGACATTTACATCACCGCCAGTGGCATCGACGACCAG GCTCTGGAGGATGACCGGCTCCGGAAGTACTACCTAGGGAAGTACCTT CAGGAGGTGCTGAAAGCATACCTGATTGATAAAGTCAGAATCAAAGG CTATTATGCATTCAAACTGGCTGAAGAGAAATCTAAACCCAGATTTGG ATTCTTCACATCTGATTTTAAAGCTAAATCCTCAATACAATTTTACAAC AAAGTGATCAGCAGCAGGGGCTTCCCTTTTGAGAACAGTAGTTCTAGA TGCAGTCAGACCCAAGAAAATACAGAGTGCACTGTCTGCTTATTCCTT GTGCAGAAGAAACCACTGATATTCCTGGGTTGTTGCTTCTTCTCCACCC TGGTTCTACTCTTATCAATTGCCATTTTTCAAAGGCAGAAGAGAAGAA AGTTTTGGAAAGCAAAAAACTTACAACACATACCATTAAAGAAAGGC AAGAGAGTTGTTAGCTAA (SEQ ID NO: 6).
La secuencia de aminoácidos de ß-Klotho humana de longitud completa (Número- de Acceso al GenBank NP_783864) es proporcionada: MKPGCAAGSPGNEW1FFSTDE1TTRY TMSNGGLQRSV1LSAL1LLRAVT GFSGDGRAIWSKNPNFTPV ESQLFLYDTFPÍ FFWGIGTGALQVEGSWK DGKGPSTWDHFTHTHLKNVSSTNGSSDSYTFLEKDLSALDFTGVSFYQFST SWPRLFPDGIVTVANAKGLQYYSTLLDALVLRNTEPTVTLYHWDLPLALQ E YGGWKNDTI1D1FNDYATYCFQMFGDRVK.YW1T1HNPYLVAWHGYGT GMHAPGE GNLAAVYTVGHNLIKAHS VWHNTOTHFRPHQ GWLSITL GSHWTEPNRSENTMDTFKCQQSMVSVLGWFANPTHGDGDYPEG RKKLF SVLPTFSEAEKHEMRGTADFFAFSFGPNNFKPLNTMAKMGQNVSLNLREA LNWIKLEYNNPRILIAENGWFTDSRV TEDTTAIYMMKJSIFLSQVLQAIRL DEIRVFGYTAWSLLDGFEWQDAYTIRRGLFYVDFNSKQKERKP SSAHY YKQTTRENGFSLKESTPDVQGQFPCDFSWGVTESVLKPESVASSPQFSDPH LYVWNATGNRLLHRVEGVRL TRPAQCTDFV TK QLE LARMKVTHY RFALDWASVLPTGNLSAVNRQALRYYRCVVSEGL LG1SAMVTLYYPTH AHLGLPEPLLHADGWLNPSTAEAFQAYAGLCFQELGDLV LWITINEPNR LSDÍY RSGNDTYGAAHNLLVAHALAWRLYDRQFRPSQRGAVSLSLHAD WAEP ANP Y AD SH WR A AER FLQFET A WF AEPLFKTGDYP A AMREYT A S H RRGLSSSALPRLTEAERRLL GTVDFCALNHFTTRFVMHEQLAGSRYDSD RDIQFLQDITRLSSPTRLAVIPWGVRKLLRWVRR YGDMDIYITASGIDDQ ALEDDRLRKYYLG YLQEVLKAYLIDKVRTKGYYAFKLAEEKSKPRFGFF TSDF AKSSTQFY KVISSRGFPFENSSSRCSQTQENTECTVCLFLVQKKPL Las proteínas de enlace a antigenos aquí descritas enlazan la porción extracelular de ß-Klotho. Un ejemplo de una región extracelular de ß-Klotho es: MK PGC A AGSPGNEWTFFSTDETTTR YRNTM SNGGLQR S VTL S A L1LLR A VTGF S G DGRA1WSKNPNFTPVNESQLFLYDTFPKNFFWG1GTGALQVEGSW J DG GPS1 WDHF1HTHLK VSSTNGSSDSY1FLEKDLSALDF1GVSFYQFS1SWPRLFPDG1VTV ANAKGLQYYSTLLDALVLRNIEPIVTLYHWDLPLALQEKYGGWKNDTIIDIFNDY ATYCFQMFGDRVKYWTT1HNPYLVAWHGYGTGMHAPGEKGNLAAVYTVGHNL 1KAHSKVWHNYNTHFRPHQKGWLS1TLGSHW1EPNRSENTMD1FKCQQSMVSVL GWFANP1HGDGDYPEGMRKKLFSVLP1FSEAEKHEMRGTADFFAFSFGPNNF PL NTMAmGQNVSLNLREALNWIKLEY NPmLIAENGWFTDSRVKTEDTTAIYM NFLSQVLQAIRLDETRVFGYTAWSLLDGFEWQDAYTIRRGLFYVDFNS QKE RKPKSSAHYY Q11RENGFSLKJESTPDVQGQFPCDFSWGVTESVL PESVASSPQF SDPHLYVWNATGNRLLHRVEGVRLKTRPAQCTDFVNll KQLEMLARMi VTHY RFALDWASVLPTGNLSAVNRQALRYYRCVVSEGLKLGISAMVTLYYPTHAHLG LPEPLLHADGWLNPSTAEAFQAYAGLCFQELGDLVKLWTTTNEPNRLSDTYNRSG NDTYGAAHNLLVAHALAWRLYDRQFRPSQRGAVSLSLHADWAEPAMPYADSH WRAAERFLQFE1 A WF AEPLFKTG D Y P AAMRE Y 1 ASKHRRG L S S S ALPRJLTE AJERR LL GTVDFCALNHFTTRFVMHEQLAGSRYDSDRDIQFLQDITRLSSPTRLAVIPW GVRKLLRWVRRNYGD DTYITASGTDDQALEDDRLRKYYLGKYLQEVLKAYLT D VR1KGYYAFKLAEEKS PRFGFFTSDF AKSS1QFYNKV1SSRGFPFENSSSRCS QTQENTECTVCLFLVQKKP (SEQ ID N0: 8.) La forma ' murina de ß-Klotho, y fragmentos y subsecuencias de la misma; pueden ser de uso en el estudio y/o construcción de las moléculas aquí proporcionadas. La secuencia de nucleótidos ' que codifica ß-Klotho murino (Número de Acceso al GenBank NM_031180) se proporciona: ATGAAGACAGGCTGTGCAGCAGGGTCTCCGGGGAATGAATGGATTTTCTTCA GCTCTGATGAAAGAAACACACGCTCTAGGAAAACAATGTCCAACAGGGCACT GCAAAGATCTGCCGTGCTGTCTGCGTTTGTTCTGCTGCGAGCTGTTACCGGCT TCTCCGGAGACGGGAAAGCAATATGGGATAAAAAACAGTACGTGAGTCCGG TAAACCCAAGTCAGCTGTTCCTCTATGACACTTTCCCTAAAAACTTTTCCTGG GGCGTTGGGACCGGAGCATTTCAAGTGGAAGGGAGTTGGAAGACAGATGGA AGAGGACCCTCGATCTGGGATCGGTACGTCTACTCACACCTGAGAGGTGTCA ACGGCACAGACAGATCCACTGACAGTTACATCTTTCTGGAA AA AGACTTGTT GGCTCTGGATTTTTTAGGAGTTTCTTTTTATCAGTTCTCAATCTCCTGGCCACG GTTGTTTCCCAATGGAACAGTAGCAGCAGTGAATGCGCAAGGTCTCCGGTAC TACCGTGCACTTCTGGACTCGCTGGTACTTAGGAATATCGAGCCCATTGTTAC CTTGTACCATTGGGATTTGCCTCTGACGCTCCAGGAAGAATATGGGGGCTGG AAAAATGCAACTATGATAGATCTCTTCAACGACTATGCCACATACTGCTTCCA GACCTTTGGAGACCGTGTCAAATATTGGATTACAATTCACAACCCTTACCTTG TTGCTTGGCATGGGTTTGGCACAGGTATGCATGCACCAGGAGAGAAGGGAAA TTTAACAGCTGTCTACACTGTGGGACACAACCTGATCAAGGCACATTCGAAA GTGTGGCATAACTACGACAAAAACTTCCGCCCTCATCAGAAGGGTTGGCTCT CCATCACCTTGGGGTCCCATTGGATAGAGCCAAACAGAACAGACAACATGGA GGACGTGATCAACTGCCAGCACTCCATGTCCTCTGTGCTTGGATGGTTCGCCA ACCCCATCCACGGGGACGGCGACTACCCTGAGTTCATGAAGACGGGCGCCAT GATCCCCGAGTTCTCTGAGGCAGAGAAGGAGGAGGTGAGGGGCACGGCTGA TTTCTTTGCCTTTTCCTTCGGGCCCAACAACTTCAGGCCCTCAAACACCGTGG TGAAAATGGGACAAAATGTATCACTCAACTTAAGGCAGGTGCTGAACTGGAT TAAACTGGAATACGATGACCCTCAAATCTTGATTTCGGAGAACGGCTGGTTC ACAGATAGCTATATAAAGACAGAGGACACCACGGCCATCTACATGATGAAG AATTTCCTAAACCAGGTTCTTCAAGCAATAAAATTTGATGAAATCCGCGTGTT TGGTTATACGGCCTGGACTCTCCTGGATGGCTTTGAGTGGCAGGATGCCTATA CGACCCGACGAGGGCTGTTTTATGTGGACTTTAACAGTGAGCAGAAAGAGAG GAAACCCAAGTCCTCGGCTCATTACTACAAGCAGATCATACAAGACAACGGC TTCCCTTTGAAAGAGTCCACGCCAGACATGAAGGGTCGGTTCCCCTGTGATTT CTCTTGGGGAGTCACTGAGTCTGTTCTTAAGCCCGAGTTTACGGTCTCCTCCC CGCAGTTTACCGATCCTCACCTGTATGTGTGGAATGTCACTGGCAACAGATTG CTCTACCGAGTGGAAGGGGTAAGGCTGAAAACAAGACCATCCCAGTGCACA GATTATGTGAGCATCAAAAAACGAGTTGAAATGTTGGCAAAAATGAAAGTCA CCCACTACCAGTTTGCTCTGGACTGGACCTCTATCCTTCCCACTGGCAATCTG TCCAAAGTTAACAGACAAGTGTTAAGGTACTATAGGTGTGTGGTGAGCGAAG GACTGAAGCTGGGCGTCTTCCCCATGGTGACGTTGTACCACCCAACCCACTCC CATCTCGGCCTCCCCCTGCCACTTCTGAGCAGTGGGGGGTGGCTAAACATGA AC ACAGCCA AGGCCTTCC AGGACT ACGCTGAGCTGTGCTTCCGGGAGTTGGG GGACTTGGTGAAGCTCTGGATCACCATCAATGAGCCTAACAGGCTGAGTGAC ATGTACAACCGCACGAGTAATGACACCTACCGTGCAGCCCACAACCTGATGA TCGCCCATGCCCAGGTCTGGCACCTCTATGATAGGCAGTATAGGCCGGTCCA GCATGGGGCTGTGTCGCTGTCCTTACATTGCGACTGGGCAGAACCTGCCAAC CCCTTTGTGGATTCACACTGGAAGGCAGCCGAGCGCTTCCTCCAGTTTGAGAT GGCCTGGTTTGCAGATCCGCTCTTCAAGACTGGCGACTATCCATCGGTTATGA AGGAATACATCGCCTCCAAGAACCAGCGAGGGCTGTCTAGCTCAGTCCTGCC GCGCTTCACCGCGAAGGAGAGCAGGCTGGTGAAGGGTACCGTCGACTTCTAC GCACTGAACCACTTCACTACGAGGTTCGTGATACACAAGCAGCTGAAC ACCA ACCGCTCAGTTGCAGACAGGGACGTCCAGTTCCTGCAGGACATCACCCGCCT AAGCTCGCCCAGCCGCCTGGCTGTAACACCCTGGGGAGTGCGCAAGCTCCTT GCGTGGATCCGGAGGAACTACAGAGACAGGGATATCTACATCACAGCCAATG GCATCGATGACCTGGCTCTAGAGGATGATCAGATCCGAAAGTACTACTTGGA GAAGTATGTCCAGGAGGCTCTGAAAGCATATCTCATTGACAAGGTCAAAATC AAAGGCTACTATGCATTCAAACTGACTGAAGAGAAATCTAAGCCTAGATTTG GATTTTTCACCTCTGACTTCAGAGCTAAGTCCTCTGTCCAGTTTTACAGCAAG CTGATCAGCAGCAGTGGCCTCCCCGCTGAGAACAGAAGTCCTGCGTGTGGTC AGCCTGCGGAAGACACAGACTGCACCATTTGCTCATTTCTCGTGGAGAAGAA ACCACTCATCTTCTTCGGTTGCTGCTTCATCTCCACTCTGGCTGTACTGCTATC CATCACCGTTTTTCATCATCAAAAGAGAAGAAAATTCCAGAAAGCAAGGAAC TTACAAAATATACCATTGAAGAAAGGCCACAGCAGAGTTTTCAGCTAA (SEQ ID NO:469) La secuencia de aminoácidos de ß-Klot o murino de longitud completa (Número, de Acceso al GenBank NP_112457) se proporciona: MKTGCAAGSPGNEWIFFSSDER TRSRKTMSNRALQRSAVLSAFVLLRA VTGFSGDGKAIWDKKQYVSPVNPSQLFLYDTFPK FSWGVGTGAFQVEG SWKTDGRGPSTWDRYVYSHLRGVNGTDRSTDSYTFLEKDLLALDFLGVSF YQFS1SWPRLFPNGTVAAVNAQGLRYYRALLDSLVLRN1EP1VTLYHWDL PLTLQEEYGGWKNATMIDLFNDYATYCFQTFGDRVKYWITIHNPYLVAW HGFGTGMHAPGE GNLTAVYTVGH LIKAHSKVWHNYDK FRPHQKG WLS1TLGSHW1EPNRTDNMEDVT CQHSMSSVLGWFANPTHGDGDYPEF MKTGAM1PEFSEAEKEEVRGTADFFAFSFGPNNFRPSNTVVKMGQNVSLN LRQVLNWIKLEYDDPQILISENGWFTDSYIKTEDTTAIYMMKNFLNQVLQ AIKFDEIRVFGYTAWTLLDGFEWQDAYTTRRGLFYVDF SEQKERKPKSS AHYYKQTTQDNGFPLKESTPDMKGRFPCDFSWGVTESVLKPEFTVSSPQFT DPHLYVWNVTGNRLLYRVEGVRL TRPSQCTDYVS1 KRVEMLAKMKV THYQFALDWTSILPTGNLSKVNRQVLRYYRCVVSEGLKLGVFPMVTLYH PTHSHLGLPLPLLSSGGWLNMNTAKAFQDYAELCFRELGDLVKLWITINE PNRLSDMYNRTSNDTYRAAHNL TAHAQVWHLYDRQYRPVQHGAVSLS LHCDWAEPAJSPFVDSHW AAERFLQFE1AWFADPLFK.TGDYPSVMKEY1 ASKNQRGLSSSVLPRPTA ESPvLVKGTVDFYALNHFTTRFVIHKQLNTNR SVADRDVQFLQDITRLSSPSRLAVTPWGVRKLLAWIRRNYRDRDIYITA GTDDLALEDDQTRKYYLE YVQEALKAYLTDKVKÍKGYYAFKLTEEKSKP RFGFFTSDFRAKSSVQFYS LISSSGLPAENRSPACGQPAEDTDCT1CSFLV EKKPLTFFGCCFTSTLAVLLSTTVFHHQ RRKFQ ARNLQNTPL KGHSRVF S (SEQ lD O:468) Como se describe en la presente, las proteínas ß-Klotho también pueden incluir fragmentos. Como se usa en la presente, los términos se usan de manera intercambiable para significar un co-receptor, en particular y a menos que se especifique de otra manera, un co-receptor humano, que en asociación con FGFRlc y FGF21 induce actividad de señalización del tipo FGF21.
El término ß-Klotho también incluye modificaciones post-t raduccionales de la secuencia de aminoácido ß- Klotho, por ejemplo, sitios de g icosilación ligados a N posibles. De esta manera, las proteínas de enlace a antígenos pueden enlazar a o generarse de proteínas glicosiladas en una o más de las posiciones.
Proteínas de enlace a antígenos que enlazan específicamente uno o más de ß-Klotho, FGFRlc, FGFR2c, FGFR3C, FGFR4 c Una variedad de agentes selectivos de enlace útiles para modular señalización del tipo FGF21 se proporcionan.
Estos agentes incluyen, por ejemplo, proteínas de enlace a antígenos que contienen un dominio de enlaza a antígeno (por ejemplo, anticuerpos de cadena sencilla, anticuerpos de dominio, hemicuerpos , inmunoadhesiones , y polipéptidos con una región de enlace a antígenos) y enlazan específicamente a FGFRlc, ß-Klotho o tanto FGFRlc como ß-Klotho, en particular FGFRlc humano y ß-Klotho humana. Algunos de los agentes, por ejemplo, son útiles en imitar el efecto de señalización generado in vivo por la asociación de FGFRlc con ß-Klotho y con FGF21, y pueden de esta manera usarse para potenciar o modular una o más actividades asociadas con la señalización del tipo FGF21.
En general, las proteínas de enlace a antígenos que se proporcionan típicamente comprenden uno o más CDRs como se describe en la presente (por ejemplo, 1, 2, 3, 4, 5 ó 6 CDRs). En algunas modalidades las proteínas de enlace a antígenos naturalmente se expresan por clones, mientras que en otras modalidades, la proteína de enlace a antígenos puede comprender (a) una estructura de armazón del polipéptido y (b) uno o más CDRs que se insertan en y/o unen a la estructura de armazón del polipéptido. En algunas de estas modalidades una CDR forma un componente de las cadenas pesadas o ligeras expresadas por los clones descritos en la presente; en otras modalidades una CDR puede insertarse en un armazón en el cual la CDR no se expresa naturalmente. Una estructura de armazón del polipéptido puede tomar una variedad de diferentes formas. Por ejemplo, una estructura de armazón del polipéptido puede ser, o comprender, el armazón de un anticuerpo que se presenta naturalmente, o fragmento o variante de la misma, o puede estar completamente sintético en la naturaleza. Los ejemplos de varias estructuras de proteina de enlace a antígenos se describen además a continuación.
En algunas modalidades en las cuales la proteina de enlace a antigenos comprende (a) una estructura de armazón del polipéptido y (b) una o más CDR que se insertan en y/o unen a la estructura de armazón del polipéptido, la estructura de armazón del polipéptido de una proteina de enlace a antigenos es un anticuerpo o se deriva de un anticuerpo, incluyendo, pero no limitado a, anticuerpos monoclonales , anticuerpos , biespecí fieos , minicuerpos, anticuerpos de dominio, anticuerpos sintéticos (algunas veces referidos en la presente como "imitaciones de anticuerpos"), anticuerpos quiméricos, anticuerpos humanizados, fusiones de anticuerpo (algunas veces referidos como "conjugados de anticuerpo"), y porciones o fragmentos de cada uno, respectivamente. En algunos casos, la proteína de enlace a. antígenos es un fragmento inmunológico de un anticuerpo (por ejemplo, un Fab, un Fab' , un F(ab' )2, o un. scFv) .
Ciertas e las proteínas de enlace a antígenos como se proporcionan en la presente enlazan específicamente a (i) ß-Klotho; (ii) FGFRlc, FGFR2c, FGFR3c o FGFR4; o (iii) un complejo que comprende ß-Klotho y uno de FGFRlc, FGFR2c, FGFR3c, y FGFR4 , incluyendo las formas humanas de estas proteínas. En una modalidad, una proteína de enlace a antígenos enlaza específicamente a tanto FGFRlc humano que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 5, como ß-Klotho humana que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 8, y en otra modalidad una proteína de enlace a antígenos enlaza específicamente a tanto FGFRlc humano que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 5 como ß-Klotho humana que tiene la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 8 e induce señalización del tipo FGF21. De esta manera, una proteína de enlace a antígenos puede, pero no necesariamente, inducir señalización del tipo FGF21.
Estrtuctura de Proteínas de enlace a antígenos Algunas de las proteínas de enlace a antígenos que enlazan específicamente (i) ß-Klotho; (ii) FGFRlc, FGFR2c, FGFR3c o FGFR4; o (iii) un complejo que comprende ß-Klotho y uno de FGFRlc, FGFR2c, FGFR3c, y FGFR , incluyendo las formas humanas de estas proteínas que se proporcionan en la presente tienen una estructura típicamente asociada con anticuerpos que se presentan naturalmente. Las unidades estructurales de estos anticuerpos típicamente comprenden uno o más tetrámeros, cada uno compuesto de dos pares idénticos de cadenas de polipéptidos , aunque algunas especies de mamíferos también producen anticuerpos que tienen solamente una cadena pesada sencilla. En un anticuerpo típico, cada par o couplet incluye una cadena "ligera" de longitud completa (en determinadas modalidades, alrededor de 25 kDa) y una cadena "pesada" de longitud completa (en determinadas modalidades, alrededor de 50-70 kDa) .' Cada cadena de inmunoglobulina individual está compuesta de diversos "dominios de inmunoglobulina," cada uno consiste de de aproximadamente 90 hasta 110 aminoácidos y que expresan un patrón de pliegue característico. Estos- dominios son las unidades básicas de las cuales los polipéptidos de anticuerpo se componen. La porción de terminal amino de cada cadena típicamente incluye un dominio variable que es responsable para el reconocimiento de antígenos. La porción de terminal carboxi se conserva más evolutivamente que el otro extremo de la cadena y se refiere como la "región constante" o "región C". Las cadenas ligeras humanas generalmente se clasifican como cadenas ligeras kappa (" ") y lambda ("?"), y cada una de estas contiene un dominio variable y un dominio constante. Las cadenas pesadas típicamente se clasifican como cadenas mu, delta, gamma, alfa, o epsilon, y estas definen el isotipo del anticuerpo como Ig , IgD, IgG, IgA, y IgE, respectivamente. El IgG tiene diversos subtipos, incluyendo, pero no limitado, IgGl, IgG2, IgG3, y IgG . Los subtipos IgM incluyen IgM, y IgM2. Los subtipos .IgA incluyen IgAl y IgA2. En humanos, los isotipos IgA e IgD contienen cuatro cadenas pesadas y cuatro cadenas ligeras; los isotipos IgG e IgE contienen dos cadenas pesadas y dos cadenas ligeras; y el isotipo IgM contiene cinco cadenas pesadas y cinco cadenas ligeras. La región C de cadena pesada típicamente comprende uno o más dominios que pueden ser responsables para efectuar la función. El número de dominios de región . constante de cadena pesada dependerá del isotipo. Las cadenas pesadas IgG, por ejemplo, cada una contiene tres dominios de región C conocidos como CH1, CH2 y CH3. Los anticuerpos que se proporcionan pueden tener cualquiera de estos isotipos y subtipos. En determinadas modalidades, una proteína de enlace a antígenos que enlaza específicamente uno o más de (i) ß-Klotho; (ii) FGFRlc, FGFR2c, FGFR3c o FGFR ; o (iii) un complejo que comprende ß-Klotho y uno de FGFRlc, FGFR2c, FGFR3c, y FGFR4 es un anticuerpo del subtipo IgGl, IgG2, o IgG4.
En cadenas pesadas y ligeras de longitud completa, las regiones variables y constantes se unen por una región "J" de alrededor de doce o más aminoácidos, con la cadena pesada también incluyendo una región "D" de alrededor de más de diez aminoácidos. Ver, por ejemplo,. Fundamental Immunology, 2a ed., Capitulo 7 (Paul, ., ed.) 1989, New York: Raven Press (incorporada en la presente por referencia en su totalidad para todos los propósitos) . Las regiones variables de cada par de cadena pesada/ligera típicamente forman el sitio de enlace a antígeno.
Un ejemplo de un dominio constante pesado IgG2 de un anticuerpo monoclonal ejemplar que enlaza específicamente (i) ß-Klotho; (ii) FGFRlc, FGFR2c, FGFR3c o FGFR ; o (iii) un complejo que comprende ß-Kl'otho y uno de FGFRlc, FGFR2c, FGFR3c, y FGFR4 tiene la secuencia de aminoácido: AST GPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLV DYFPEPVTVSWNSGALTSGV HTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSNFGTQTYTCNVDH PSNT VD TVER KCCVECPPCPAPPVAGPSVFLFPPI PKLDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPE VQFNWYVDGVEVHNA TKPREEQFNSTFRVVSVLTVVHQDWLNGKEYK CKVSN GLPAPTE TTSKT GQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKG FYPSD1AVEWESNGQPENNY TTPPMLDSDGSFFLYSKLTVD SRWQQG VFSCS VMHEALH HYTQKSLSLSPGK (SEQ ID NO: 9).
Un ejemplo de un dominio constante ligero kappa de un anticuerpo monoclonal ejemplar que enlaza (i) ß- lotho; (ii) FGFRlc, FGFR2c , .FGFR3c o FGFR4; o (iii) un complejo que comprende ß-Klotho y uno de FGFRlc, FGFR2c, FGFR3c, y FGFR4 tiene la secuencia de aminoácido: RTVAAPSVFTFPPSDEQLKSGTASWCLL FYPREAKVQW VDNALQSG NSQESVTEQDS DSTYSLSSTLTLSKADYEKH VYACEVTHQGLSSPVT SFNRGEC (SEQ ID NO: 10).
Un ejemplo de un dominio constante ligero lambda de un anticuerpo monoclonal ejemplar que enlaza (i) ß-Klotho; (ii) FGFRlc, FGFR2c, FGFR3c o FGFR4 ; o (iii) un complejo que comprende ß-Klotho y uno de FGFRlc, FGFR2c, FGFR3c, y FGFR4 tiene la secuencia de aminoácido: GQPKANPTVTLFPPSSEELQAN ATLVCLTSDFYPGAVTVAWKADGSPVK AGVETTKPS QSNN YAASSYLSLTPEQWKSHRSYSCQVTHEGSTVEKT VAPTECS (SEQ ID NO: 1 1) Las regiones variables de cadenas inmunoglobulina generalmente muestran la misma estructura general, que comprende regiones de estructura relativamente conservadas (FR) unidas por tres regiones hipervariables , más a menudo nombradas "regiones determinantes de la complementariedad" o CDRs. Las CDR de las dos cadenas de cada par de cadena pesada/cadena ligera · mencionadas arriba típicamente se alinean por las regiones de estructura para formar una estructura que se enlaza específicamente con un epítopo específico en la proteína objetivo (por ejemplo, (i) ß-Klotho (ii) FGFRlc , FGFR2c, FGFR3c o FGFR4; o (iii) un complejo que comprende ß-Klotho y uno de FGFRlc, FGFR2c, FGFR3c, y FGFR4). De la terminal N hasta la terminal C, las regiones variables de cadena pesada y ligera que se presentan naturalmente ambas típicamente conformadas en el siguiente orden de estos elementos: FR1, CDR1, FR2 , CDR2, FR3, CDR3 y FR4. Un sistema de numeración se ha creado para asignar números a los aminoácidos que ocupan posiciones en cada uno de estos dominios. Este sistema de numeración se define en Kabat Sequences of Proteins of Immunological Interest (1987 y 1991, NIH, Bethesda, MD) . Como se desea, las CDRs también pueden redefinirse de acuerdo a un esquema de nomenclatura alternativa, tal como aquella de Chothia (Ver Chothia & Lesk, 1987, J. Mol. Biol. 196:901-917; Chothia et al., 1989, Nature 342:878-883 o Honegger & Pluckthun, 2001, J. Mol. Biol. 309 : 657-670.
Las diversas regiones variables de cadena ligera y cadena pesada de proteínas de enlace a antígenos proporcionadas en la presente se describen en la Tabla 2. Cada una de estas regiones variables pueden enlazarse a las regiones constantes de cadena ligera y pesada de arriba para formar una cadena ligera y pesada de anticuerpo completo, respectivamente. Además, cada una de las secuencias de cadena ligera y pesada asi generadas pueden combinarse para formar una estructura ' de anticuerpo completo. Debe entenderse que las regiones variables de cadena pesada y cadena ligera proporcionadas en la presente también pueden enlazarse a otros dominios constantes que tienen secuencias diferentes que las secuencias ejemplares enlistadas arriba.
Los ejemplos específicos de algunas de las cadenas pesadas y' ligeras de longitud completa de los anticuerpos que se proporcionan y sus secuencias de aminoácidos correspondientes se resumen en las Tablas 1A y IB. La Tabla 1A muestra secuencias de cadena ligera ejemplares, y la Tabla IB muestra . secuencias de cadena pesada ejemplares.
Tabla 1A - Secuencias de Cadena Ligera de Anticuerpo Ejemplares Tabla IB - Secuencias da Cadena Pesada de Anticuerpos EjTlares De nuevo, cada una de las cadenas pesadas ejemplares (Hl, H2, H3 etc.) enlistadas en la Tabla IB y 6A, infra, pueden combinarse con cualquiera · de las cadenas ligeras ejemplares mostradas en la Tabla 1A y 6A, infra, para formar un anticuerpo. Los ejemplos de tales combinaciones incluyen Hl combinado con cualquiera de Ll hasta L18; H2 combinado con cualquiera de Ll hasta L18; H3 comparado con cualquiera de Ll hasta L18, y asi sucesivamente. En algunos casos, los anticuerpos incluyen al menos una cadena pesada y una cadena, ligera de aquellos enlistados en las Tablas 1A y IB y 6A, infra; los ejemplos de emparejamientos particulares de cadenas ligeras y cadenas pesadas incluyen Ll con Hl, L2 con H2, L3 con H3, L4 con H4, L5 con H5, L6 con H6, L7 con H7, L8 con H8 , L9 con H9, LIO con H10, Lll con Hll, L12 con H12, L13 con H13, L14 con H14, L15 con H15, L16 con H16, L17 con H17, y L18 con H18. Además de las proteínas de enlace a antígenos que comprenden una cadena pesada y una ligera del mismo clon, una cadena pesada de un primer clon puede emparejarse con una cadena ligera de un segundo clon (por ejemplo, una cadena pesada de 46D11 emparejada con una cadena ligera de 16H7 o una cadena pesada de 16H7 emparejada con una cadena ligera de 46D11) . Generalmente, tales emparejamientos pueden incluir VL con 90% o mayor homología puede estar en par con la cadena pesada del clon que se presenta naturalmente clone. En algunos casos, los anticuerpos comprenden dos diferentes cadena pesadas y dos diferentes cadenas ligeras enlistadas en las Tablas 1A y IB y 6A, infra. En otros casos, los anticuerpos contienen dos cadenas ligeras idénticas y dos cadenas pesadas idénticas. Como un ejemplo, un anticuerpo o fragmento inmunológicamente funcional puede incluir dos cadena pesadas Hl y dos cadenas ligeras Ll, o dos cadenas pesadas H2 y dos cadenas ligeras L2, o dos cadenas pesadas H3 y dos cadenas ligeras L3 y otras combinaciones similares de pares de cadenas ligeras y pares de cadenas pesadas como se enlista en las Tablas 1A y IB y 6A, infra.
En otro aspecto de la descripción inmediata, los "hemicuerpos" se proporcionan. Un hemicuerpo es una proteina de enlace a antígenos monovalente que comprende (i) una cadena ligera intacta, y (ii) una cadena pesada fusionada a una región Fe (por ejemplo, una región Fe IgG2 de SEQ ID NO: 441), opcionálmente por medio de una ligadura. La ligadura puede ser una ligadura .(G^SJx donde "x" es un entero distinto de cero (por ejemplo, (G4S)8; SEQ ID NO: 440) . Los hemicuerpos pueden construirse usando los componentes de cadena ligera y pesada proporcionados. Los ej emplos¦ específicos de hemicuerpos se describen en el Ejemplo 14.
Otras proteínas de enlace a antígenos que se proporcionan son variantes de anticuerpos formados por combinación de las cadenas ligeras y pesadas mostradas en las Tablas 1A y IB y 6A, ínfra y comprenden cadenas pesadas y/o ligeras que cada una tiene al menos 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% de identidad a la secuencias de aminoácidos de estas cadenas. En algunos casos, tales anticuerpos incluyen al menos una cadena pesada y una cadena ligera, mientras que en otros casos las formas variantes contienen dos cadenas ligeras idénticas y dos cadenas pesadas idénticas.
Dominios Variables de Proteinas de enlace a antigenos También se proporcionan proteínas de enlace a antígenos que contienen una región variable de cadena pesada de anticuerpos seleccionada del grupo que consiste en VH1, VH2, VH3, VH4, VH5, VH6, VH7, VH8, VH9, VH10, VH11, VH12 , VH13, VH14, VH15 , VH16 , VH17 y VH18 como se muestra en la Tabla 2B y/o una región variable de cadena ligera de anticuerpos seleccionada del grupo que consiste en VL1, VL2, VL3, VL4, VL5, VL6, VL7, VL8., VL9, VL10, VL11, VL12, VL13, VL14, VL15, VL16, VL17 y VL18 como se muestra en la Tabla 2A, y fragmentos inmunológicamente funcional, derivados, muteinas y variantes de estas regiones variables de cadena pesada y cadena ligera.
Tabla 2A - Cadenas Ligeras Variables (VL) de Anticuerpo Ejemplares Tabla 2B - Cadenas Pesadas Variables de Anticuerpo Ejemplares (VH) Tabla 2C - Secuencia de codificación para Cadenas Ligeras Variables (VL) de Anticuerpo Tabla 2D - Secuencia de codificación para Cadenas Pesadas Variables (VH) de Anticuerpo Cada una de las regiones variables de cadena pesada enlistadas en la Tabla 2B pueden combinarse con cualquiera de las regiones variables .de cadena ligera mostradas en la Tabla 2A para formar una proteína de enlace a antígenos. Los ejemplos de tales combinaciones incluyen VH1 combinado con cualquiera de VL1, VL2, VL3, VL4 , VL5, VL6, VL7 , VL8, VL9, VL10, VL11, VL12, VL13, VL14, VL15, VL16, VL17 o VL18; VH2 combinado con cualquiera de VL1., VL2, VL3, VL4, VL5, VL6, VL7, VL8, VL9, VL10, VL11, VL12, VL13, VL14, VL15, VL16, VL17 o VL18; VH3 combinado con cualquiera de VL1, VL2, VL3, VL , VL5, VL6, VL7 , VL8, VL9, VL10, VL11, VL12, VL13, VL14, VL15, VL16, VL17 o VL18; y asi sucesivamente.
En algunos casos, la proteina de enlace a antigenos incluye al menos una región variable de cadena pesada y/o una región variable de cadena ligera de aquellas enlistadas en las Tablas 2A y 2B. En algunos casos, la proteina de enlace a antigenos incluye al menos dos diferentes regiones variables de cadena pesada y/o regiones variables de cadena ligera de aquellas enlistadas en la Tabla 2B* Un ejemplo de tal proteina de enlace a antigenos comprende (a) un VH1, y (b) uno de VH2, VH3, VH , VH5, VH6, V„7, VH8, VH9, VH10, VH11, VH12, VH13, VH14, VH15, VH16, VHi7 o VHi8. Otro ejemplo comprende (a) un VH2 , y (b) uno de VH1, VH3, VH , VH5, VH6, VH7, VH8, VH9, VH10, VH11, VH12, VH13, VH14, VH15, VH16, VH17 o VH18. De nuevo otro ejemplo comprende (a) un VH3, y (b) uno de VH1, VH2, VH4, VH5, VH6, VH7, VH8, VH9, VH10, VH11, VH12, VH13, VH14, VH15 VH16, VH17 o VH18, etc.
De nuevo otro ejemplo de tal proteina de enlace a antigenos comprende (a) un VL1, y (b) uno de VL2, VL3, VL4 , VL5, VL6, VL7, VL8, VL9, VL10, VL11, VL12, VL13, VL14, VL15, VL16, VL17, o VL18. De nuevo otro ejemplo de tal proteina de enlace a antigenos comprende (a) un VL2, y (b) uno de VL1, VL3, VL4,, VL5, VL6, VL , VL8, VL9, VL10, VL11 o VL12. De nuevo otro ejemplo de tal proteina de enlace a antigenos comprende (a) un VL3, y (b) uno de VL1, VL2, VL4, VL5, VL6, VL7, VL8, VL9, VL10, VL11, VL12, VL13, VL14, VL15, VL16, VL17, o VL18, etc.
Las varias combinaciones de regiones variables de cadena pesada pueden combinarse con . cualquiera de las varias combinaciones de regiones variables de cadena ligera.
En otras modalidades, una proteina de enlace a antigenos comprende dos regiones variables de cadena ligera idénticas y/o dos regiones variables de cadena pesada idénticas. Como un ejemplo, la proteina de enlace a antigenos puede ser un anticuerpo o fragmento inmunológicamente funcional del mismo que incluye dos regiones variables de cadena ligera y dos regiones variables de cadena pesada en combinaciones de pares de regiones variables de cadena ligera y pares de regiones variables de cadena pesada como se enlista en las Tablas 2A y 2B.
Algunas proteínas de enlace a antígenos que se proporcionan comprenden un dominio variable de cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos que difiere de la secuencia de un dominio variable de cadena pesada seleccionada de VH1, VH2, VH3, VH4, VH5, VH6, VH7, VH8, VH9, VH10, VH11, VH12, VH13, VH14, VH15, VH16, VH17 y VH18 en solamente 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 o 15 residuos de aminoácidos, en donde cada diferencia de secuencia es independientemente ya sea una eliminación, inserción o sustitución de un aminoácido, con las eliminaciones, inserciones y/o sustituciones que resultan en no más de 15 cambios de aminoácido con relación a las secuencias de dominio variable anteriores. La región variable de cadena pesada en alguna proteínas de enlace a antígenos comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97% o 99% de identidad de secuencia a las secuencias de aminoácidos de la región variable de cadena pesada de VH1, VH2 , VH3, VH4, VH5, VH6, VH7, VH8, VH9, VH10, VH11, VH12, VH13, VH14, VH15, VH16, VH17 y VH18.
Ciertas proteínas de enlace a antígenos comprenden un dominio variable de cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos que difiere de la secuencia de un dominio variable de cadena ligera seleccionado de VL1, VL2, VL3, VL4, VL5, VL6, VL7, VL8, VL9„ VL10, VL11, VL12, VL13, VL14, VL15, VL16, VL17 y VL18 en solamente 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 o 15 residuos de aminoácidos, en donde cada diferencia · de secuencia es independientemente ya sea una eliminación, inserción o sustitución de un aminoácido, con las eliminaciones, inserciones y/o sustituciones que resultan en no más de 15 cambios de aminoácido con relación a las secuencias de dominio variable anteriores. La región variable de cadena ligera en algunas proteínas de enlace a antígenos comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97% o 99% de identidad de secuencia a la secuencias de aminoácidos de la región variable de cadena ligera de VL1, VL2, VL3, VL4, VL5, VL6, VL7 , VL8, VL9, VL10, VL11, VL12, VL13, VL14, VL15, VL16, VL17 o VL18.
En casos adicionales, las proteínas de enlace a antígenos comprenden los siguientes emparejamientos de dominios variables de cadena ligera y cadena pesadas: VL1 con VH1, Vl2 con VH2, VL2 con' VH3, VL3 con VH , VL4 con VH5, VL5 con VH6, VL6 con VH7, VL7 con VH8 , VL8 con VH8, VL9 con VH9, VL9 con VH10, VL10 con VH11, VL11 con VH11, VL12 con VH12, VL13 con VH13, VL14 con VH14, VL15 con VH15, VL16 con VH16, VL17 con VH17 y VL18 con VH18. En algunos casos, las proteínas de enlace a antígenos en los emparejamientos de arriba pueden comprender secuencias de aminoácidos que tienen 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ó 99% de ' identidad de secuencia con los dominios variable específicos.
' Todavía otras proteínas de enlace a antígenos, por ejemplo, anticuerpos o fragmentos inmunológicamente funcionales, incluyen formas variantes de una cadena pesada variante y una cadena ligera variante como justo se describe .
CDRs de Proteína de enlace' a antígenos En diversas modalidades, las proteínas de enlace a antígenos descritas en la presente pueden comprender polipéptidos en los cuales uno o más CDRs se injertan, insertan y/o unen. Una proteína de enlace a antígenos puede tener 1, 2, 3, 4, 5 ó 6 CDRs. Una proteína de enlace a antígenos de esta manera puede tener, por ejemplo, una CDR1 de cadena pesada ("CDRH1" ) , y/o una CDR2 de cadena pesada ("CDRH2"), y/o una cadena pesada CDR3 ( "CDRH3" ) , y/o una CDR1 de cadena ligera ("CDRLl"), y/o una CDR2 de cadena ligera ( "CDRL2 " ) , y/o una CDR3 dé cadena ligera ("CDRL3") . Algunas proteínas de enlace a antígenos incluyen tanto una CDRH3 como una CDRL3. Las CDRs de cadena ligera y pesada específicas se identifican en las Tablas 3A y 3B, respectivamente y en la Tabla 6C, infra.
Las regiones determinantes de la complementariedad (CDRs) y regiones de estructura (FR) de un anticuerpo dado pueden identificarse usando el sistema descrito por Kabat et al., in Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5a Ed., US Dept. of Health y Human Services, PHS, NIH, NIH Publicación no. 91-3242, ' 1991. Como se desea, las CDRs también pueden redefinirse de acuerdo a un esquema de nomenclatura alternativa, tal como aquel de Chothia (Ver Chothia & Lesk, 1987, J. Mol. Biol. 196:901-917; Chothia et 1989, Nature 342:878-883 or Honegger & Pluckthun, 2001, J. Mol. Biol. 309 : 657-670 ) . Ciertos anticuerpos que se describen en la presente comprenden una o más secuencias de aminoácidos que son idénticos o tienen identidad de secuencia sustancial a las secuencias de aminoácidos de uno o más de la CDRs presentados en la Tabla 3A (CDRHs) y Tabla 3B (CDRLs) y Tabla 6C, infra.
Tabla 3A - Secuencias CDRH Ejemplares Tabla 3B - Secuencias CDRL Ejemplares Tabla 3C - Secuencias de Codificación para CDRHs Tabla 3D - Secuencias de Codificación para CDRLs La estructura . y propiedades de las CDRs dentro de un anticuerpo que se presenta- naturalmente se ha descrito, supra. Brevemente, en un anticuerpo tradicional, las CDRs se entierran dentro de una estructura en la región variable de cadena ligera y. pesada donde se constituyen las regiones responsables para enlace y reconocimiento de antigeno. Una región variable comprende al menos tres CDRs de cadena ligera y pesada, ver, supra (Kabat et al., 1991, Sequences of Proteins of Immunological Interest, Public Health Service N.I.H., Bethesda, MD; ver también Chothia y Lesk, 1987, J. Mol. Biol. 196:901-917; Chothia et al., 1989, Nature 342: 877-883), dentro de una región de estructura (designada regiones de estructura 1-4, FR1 , FR2, FR3, y FR4, por Kabat et al., 1991; ver también Chothia y Lesk, 1987, supra). Las CDRs proporcionadas en la presente, sin embargo, no pueden solamente usarse para definir el dominio de enlace a antigeno de una estructura de anticuerpo tradicional, pero puede enterrarse en. una variedad de otras estructuras de polipéptido, como se describe en la presente.
En un aspecto, las CDRs proporcionadas son (a) una CDRH seleccionada del grupo que consiste en (i) una CDRH1 seleccionada del grupo que consiste en la SEQ ID NO: 121-131; (ii) una CDRH2 seleccionada del grupo que consiste en la SEQ ID NO: 132-144; ''(iii) una CDRH3 seleccionada del grupo que consiste en la SEQ ID NO:145-157; y (iv) una CDRH de (i), (ii) y (üi) que contiene una o más sustituciones, eliminaciones o inserciones de aminoácido de no más de cinco, cuatro, tres, dos, o ' un aminoácidos; (B) una CDRL seleccionada del grupo que consiste en (i) una CDRL1 seleccionada del grupo que consiste en la SEQ ID NO: 158-170; (ii) una CDRL2 seleccionada del grupo que consiste en la SEQ ID NO:171-179; (iii) una CDRL3 seleccionada del grupo que consiste en la SEQ ID NO: 180-194; y (iv) una CDRL de (i), (ii) y (iii) que contiene una o más sustituciones, eliminaciones o inserciones de aminoácidos de no más de 1, 2, 3, .4, ó 5 aminoácidos.
En otro aspecto, una proteina de enlace a antigenos comprende 1, 2, 3, 4, 5, ó 6 formas variantes de las CDRs enlistadas en las Tablas 3A y 3B y Tabla 6C, infra, cada una tiene al menos 80%, 85%, 90%, 95%,. 96%, 97%, 98%, o 99% de identidad de secuencia a una secuencia CDR enlistada en las Tablas 3A y 3B y Tabla- 6C, infra. Algunas proteínas de enlace a antígenos comprenden 1, 2, 3, 4, 5, o 6 de las CDRs enlistadas en las Tablas 3A y 3B y Tabla 6C, infra, cada una difiere por no más de 1, 2, 3, 4 o 5 aminoácidos de las CDRs enlistadas en estas tablas.
Todavía en otro aspecto, una proteína de enlace a antígenos incluye las siguientes asociaciones de CDRLl, CDRL2 y CDRL3: SEQ ID NOs:167, 176, y 190; SEQ ID NOs:167, 176, y 189, SEQ ID NOs:166, 176, y 188; SEQ ID NOs:166, 176, y 188; SEQ ID NOs:161, 174, y 183; SEQ ID NOs:162, 173, y 184; SEQ ID NOs:162, 173, y 186; SEQ ID NOs:164, 173, y 186; SEQ ID NOs:160, 173, y 182; SEQ ID NOs:163, 173, y 185; SEQ ID. NOs:163, 173, y 185; SEQ ID NOs:159, 172, y 181; SEQ ID NOs:165, 175, y 187; SEQ ID NOs:158, 171, y 180; SEQ ID NOs:168, 171, y 191; . SEQ ID NOs:169, 177 y 192; SEQ ID NOs:170, 178, y 193; SEQ ID NOs:163, 173, y 194; SEQ ID NOs:163, 173 y 194; y SEQ ID NOs:163, 179, y 194.
En un aspecto adicional, una proteína de enlace a antígenos incluye las siguientes asociaciones de CDRHl, CDRH2 y CDRH3: SEQ ID NOs:122, 133, y 146; SEQ ID NOs:122, 133, y 147; SEQ ID NOs:122, 133, y 148; SEQ ID NOs:122, 134, y 148; SEQ ID NOs:124, 136, y 150; SEQ ID NOs:124, 138, y 152; SEQ ID NOs:124, 139, y 152; SEQ ID NOs:124, 137, y 151; SEQ ID NOs:124, 137, y 151; SEQ ID NOs:131, 140, y 153; SEQ ID NOs:125, 140, y 153; SEQ ID NOs:123, 135, y 149; SEQ ID NOs:123, 135, y 149; SEQ ID NOs:121, 132, y 145; SEQ ID NOs:126, 133, y 154; SEQ ID NOs:130, 144, y 157; SEQ ID NOs : 127, 135, y 155; SEQ ID NOs:129, 142, y 156; SEQ ID •NOs:128, 141, y 156; y SEQ ID NOs:128, 143, y 156.
En otro aspecto, una proteína de enlace a ántigenos incluye las siguientes asociaciones de CDRLl, CDRL2 y CDRL3 con CDRH1, CDRH2 y CDRH3: SEQ ID NOs :167, 176, y 190; SEQ ID NOs: 167, 176, y 189, SEQ ID NOs: 166, 176, y 188; SEQ ID NOs: 166, 176, y 188; SEQ ID NOs: 161, 174, y 183; SEQ ID NOs : 162, 173, y 184; SEQ ID NOs: 162, 173, y 186; SEQ ID NOs: 164, 173, y 186; SEQ ID NOs: 160, 173, y 182; SEQ ID NOs: 163, 173, y 185; SEQ ID NOs: 163, 173, y 185; SEQ ID NOs: 159, 172, y 181; SEQ ID NOs: 165, 175, y 187; SEQ ID NOs: 158, 171, y 180; SEQ ID NOs: 168, 171, y 191; SEQ ID NOs: 169, 177 y 192; SEQ ID NOs: 170, 178, y 193; SEQ ID NOs: 163, 173, y 194; SEQ ID NOs:163, 173 y 194; SEQ ID NOs: 163, 179, y 194 con SEQ ID NOs: 122, 133, y 146; SEQ ID NOs: 122, 133, y 147; SEQ ID NOs: 122, 133, y 148; SEQ ID NOs:122, 134, y 148; SEQ ID NOs: 124, 136, y 150; SEQ ID NOS :124, 138, y 152; SEQ ID NOs: 124, 139, y 152; SEQ ID NOs :124, 137, y 151; SEQ ID NOs: 124, 137, y 151; SEQ ID NOs :131, 140, y 153; SEQ ID NOs: 125, 140, y 153; SEQ ID NOs :123, 135, y 149; SEQ ID NOs: 123, 135, y 149; SEQ ID NOs : 121, 132, y 145; SEQ ID NOs: 126, 133, y 154; SEQ ID NOs : 130, 144, y 157; SEQ ID NOs: 127, 135, y 155; SEQ ID NOs :129, 142, y 156; SEQ ID NOs:128, 141, y 156; y SEQ ID NOs:128, 143, y 156.
Secuencias de consenso Aún en otro aspecto, las CDRs descritas en la presente incluyen secuencias de consenso derivadas de grupos de anticuerpos monoclonales relacionadas. Como se describe en la presente, una "secuencia de consenso" se refiere a secuencias de aminoácidos que tienen aminoácidos conservados entre un número de secuencias y aminoácidos variables que varían dentro de las secuencias de aminoácidos dadas. Las secuencias de consenso de CDR proporcionadas incluyen CDRs correspondiente a cada uno de CDRH1, CDRH2, CDRH3, CDRL1, CDRL2 y CDRL3.
Las secuencias de consenso se determinaron usando análisis estándares de las CDRs correspondientes a la VH y VL de los anticuerpos descritos, algunos de los cuales específicamente enlazan (i) ß-Klotho; (ii) FGFRlc, FGFR2c, FGFR3c o FGFR4; o (iii) un complejo que comprende ß-Klotho y uno de FGFRlc, FGFR2c, FGFR3c, y FGFR4. Las secuencias de consenso se determinaron al mantener las CDRs contiguas dentro de la misma secuencia correspondiente a una VH o VL.
CDR3 de Cadena Ligera Grupo 1 LQHNSYPLT (SEQ ID NO:.267) Grupo 2 MQSLQTPFT (SEQ ID NO: 268) Grupo 3 QQYNNWPPT (SEQ ID NO: 269) Grupo 4 MQSIQLPRT (SEQ ID NO: 270) Grupo 5 QQANDFPIT (SEQ ID NO: 271) Grupo 6 MQALQTPCS (SEQ ID NO: 272) Grupo 7 QVWD G N SDHVV (SEQ ID NO: 273) QVWD N T SDHVV (SEQ ID NO: 274) QVWD S S SDHVV (SEQ ID NO: 275) QVWD ? X2 SDHW (SEQ ' ID NO: 276) en donde ?? es G, S o N y.X2 es S, T o N.
Grupo 8 QQ C G S S P L T (SEQ ID NO: 277) QQ Y G G S P .L T (SEQ ID NO: 278) QQ Y G S A P L T (SEQ ID NO: 279) QQ Y G S . S F T (SEQ ID NO: 280) QQ Y G S S P L T (SEQ ID NO: 281) QQ S G S S P L T (SEQ ID NO: 282) QQ X3 S X4 X5 X6 X7 T (SEQ ID NO: 283) en donde X3 es C, Y o S, ¾ es S o G, X5 es S o A, X6 es P o F y X7 es L o está ausente.
CDR2 de Cadena Ligera Grupo 1 AASSLQS (SEQ ID NO: 284) Grupo 2 GVSTRAT (SEQ ID NO: 285) Grupo 3 DDSDRPS (SEQ ID NO: 286) Grupo A EVSNRFS (SEQ ID NO: 287) Grupo 5 L G S N. R . A S (SEQ ID NO: 288) L G S D R A S (SEQ ID NO: 289) L G S X27 R A S (SEQ ID NO: 290) en donde X27 es N o D.
Grupo 6 G A S S RAT (SEQ ID NO: 291) G T S S RAT (SEQ ID NO: 292) G A S F RAT (SEQ ID NO: 293) G X8 S X28 RAT (SEQ ID NO: 294) en donde X8 es A o T y X2s es S o.F.
CDRl de cadena ligera Grupo 1 RASQSVNSNLA (SEQ ID NO: 295) Grupo 2 RASQDIRYDLG (SEQ ID NO: 296) Grupo 3 RASQGISIWLA (SEQ ID' O: 297) .
Grupo 4 KSSQSLLQSDGKTYLY (SEQ ID NO: 298) Grupo 5 RASQ N F D S S S LA (SEQ ID NO: 299) RASQ N F D S S Y LA (SEQ ID NO: 300) RASQ S V S G N. Y LA (SEQ ID NO: 301) RASQ S V S G ' T Y LA (SEQ ID NO: 302) RASQ N F ' D S N Y LA (SEQ ID NO: 303) RASQ X9 Xio Xn Xi2 Xi3 Xi4 LA (SEQ ID NO: 304) en donde X9 es A o S, Xio es V o F, Xn es D o S, Xi2 es G o S, Xi3 es S, N o T, y Xi4 es S o Y.
Grupo 6 GGNNIGS E SVH (SEQ ID ??': 305) GGNNIGS Q SVH (SEQ ID NO: 306) GGNNIGS is SVH (SEQ ID. NO: 307) en donde 15 es E o Q.
Grupo 7 RSSQSLL Y Y NG F T Y LD (SEQ ID NO: 308) RSSQSLL H S NG . Y N F LD (SEQ ID NO: 309) RSSQSLL X29 X30 NG X31 X32 X33 LD .(SEQ ID NO: 310) en donde X29 es Y o H, X30 es Y o S, X31 es F o Y, X32 es T o N y X33 es Y o F.
CDR3 PESADA Grupo 1 IVVVPAAIQSYYYYYGMGV (SÉQ ID NO: 311) Grupo 2 DPDGDYYYYGMDV (SEQ ID NO: 312) Grupo 3 TYSSGWYVWDYYGMDV (SEQ ID NO: 313) Grupo 4 DRVLSYYAMAV (SEQ ID NO: 314) Grupo 5 VRIAGDYYYYYGMDV (SEQ. ID NO: 315) Grupo 6 ENIVVIPAAI FAGWFDP (SEQ ID NO: 316) Grupo 7 DRAAAGLHYYYGMDV (SEQ ID NO: 317) I L L L G- A . YYY Y GMDV (SEQ ID NO: 318) I L L V G A YYY C GMDV (SEQ ID NO: 319) V V T G G YYY D GMDV (SEQ ID NO: 320) S V V T G G YYY D' GMDV (SEQ ID NO: 321) X34 Xl6 Xl7 Xl8 G 19 YYY ?20 GMDV (SEQ ID NO: 322) En donde X34 es I, V. o S, X16 es L o V, X17 es L, T o V, Xi8 es L, V, G o T, X19 es A, G o está ausente y X2o es Y, C o D.
Grupo 9 SLIVV I VY ' A LD H (SEQ ID NO: 323) SLIVV I VY A LD Y (SEQ ID NO: 324) SLIVV M VY V LD Y (SEQ ID NO: 325) SLIW 2i VY X22. LD X23 (SEQ ID NO: 326) En donde X2i es I o M, X22 es A o V y X23 es H o Y.
CDR2 PESADA Grupo 1 GFDPEDGETIYAQKFQG (SEQ ID NO: 327) Grupo 2 RIKSK T DGGTTDYAAPVKG (SEQ ID NO: 328) RIKSK DGGTTDYAAPVKG (SEQ ID NO: 330) RIKSK ¾2 DGGTTDYAAPVKG (SEQ ID NO: 483) en donde X42 es T o está ausente.
Grupo 3 HIFSNDEKSYSTSLK S (SEQ ID NO: 331) HIFSNDEKSYSTSLK N (SEQ' ID NO: 332) HIFSNDEKSYSTSLK X24 (SEQ ID NO: 333) en donde X24 es S o N.
Grupo 4 G ISGSGVST H YADSVKG (SEQ ID NO: 334) G ISGSGVST Y YADSVKG (SEQ ID NO: 335) A ISGSGVST Y YADSVKG (SEQ ID NO: 336) A ISGSGVST N YADSVKG (SEQ ID NO: 337) X25 ISGSGVST X26 YADSVKG (SEQ ID NO: 338) en donde 25 es G o A y X26 es H, Y o N.
Grupo 5 VI YDGS D KYY A DSVKG (SEQ ID NO: 339) VI YDGS I KYY G DSVKG (SEQ ID NO: 340) VIWYDGS X35 KYY 36 DSVKG (SEQ ID NO: 341) en donde X35 es D o I y X36 es A o G.
Grupo 6 N IY Y SGST Y YNPSLKS (SEQ ID NO: 342) R IY T SGST Y YNPSLKS (SEQ ID NO: 343) R IY T SGST N YNPSLKS (SEQ ID NO: 329) 37 i X38 SGST X41 YNPSLKS (SEQ ID NO: 344) en donde X37 es N o R, X38 es Y o T y X 1 es Y o N.
CDRl PESADA Grupo 1 DLSMH (SEQ ID NO: 345) Grupo 2 DAWMS ( SEQ ID NO: 346) Grupo 3 TYAMS ( SEQ ID NO: 347) Grupo 4 SYFWS (SEQ ID NO: 348) Grupo 5 SGGYNWS (SEQ ID NO: 349) Grupo 6 NARMGV S (SEQ ID NO: 350) NARMGV N (SEQ ID NO: 351) NARMGV X39 (SEQ ID NO: 352) en donde X3g es S o N. · Grupo 7 S YGIH (SEQ ID NO : 353) N YGIH (SEQ ID NO: 354) X40 YGIH (SEQ ID NO: 355) en donde ?40 es S o N.
En algunos casos una proteina de enlace a antigenos comprende al menos una CDR1 de cadena pesada, CDR2, o CDR3 que tiene una de las secuencias de consenso de arriba. En algunos casos, una proteina de enlace a antigenos comprende al menos una CDR1 de cadena ligera, CDR2, o CDR3 que tiene una de las secuencias de consenso de arriba. En otros casos, la proteina de enlace a antigenos comprende al menos dos CDRs de cadena pesada de acuerdo a las secuencias de consenso de arriba, y/o al menos dos CDRs de cadena ligera de acuerdo a las secuencias de consenso de arriba. Todavía en otros casos, la proteína de enlace a antígenos comprende al menos tres CDRs de cadena pesada de acuerdo a las secuencias de consenso de arriba, y/o al menos tres CDRs de cadena ligera de acuerdo a las secuencias de consenso de arriba.
Proteínas de enlace a antígenos ejemplares De acuerdo a un aspecto, una proteína de enlace a antígenos aislada que comprende (a) una o más regiones determinantes de la complementariedad de (CDRHs) seleccionadas del grupo que consiste en: (i) una CDRH1 seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 121-131; (ii) una CDRH2 seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 132-144; (iii) una CDRH3 seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 145-157; y (iv) una CDRH de (i), (ii) y (iii) que contiene una o más sustituciones, eliminaciones o inserciones de aminoácido de no más de 1, 2, 3, 4, o 5 aminoácidos; (b) una o más regiones determinantes de la complementariedad de cadena ligera (CDRLs) seleccionadas del grupo que consiste en: (i) una CDRL1 seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 158-170; (ii) una CDRL2 seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 171-179; (iii) una CDRL3 seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 180-194; y (iv) una CDRL de (i) , (ii) y (iii) que contiene una o más sustituciones, eliminaciones o inserciones de aminoácido de no más de cinco, cuatro, tres, cuatro, dos o un aminoácidos; o (c) uno o más CDRHs de cadena pesada (a) y uno o más CDRLs de cadena ligera (b) .
En otra modalidad, las CDRHs tienen al menos 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% de identidad de secuencia con una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en la SEQ ID NO: 121-157, y/o las CDRLs tienen al menos 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%,· 97%, 98% o 99% de identidad de secuencia con una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en la SEQ ID NO: 158-194. En una modalidad adicional, la VH se selecciona del grupo que consiste en la SEQ ID NO: 121-157, y/o la VL se selecciona del grupo que consiste en SEQ ID NO: 158-194.
De acuerdo a un aspecto, una proteína de enlace a antigenos aislada que comprende (a) una o más cadenas pesadas variables (VHs) seleccionadas del grupo que consiste en: (i) SEQ ID NO: 121-157; y (ii) una VH de (i) que contiene uno o más sustituciones, eliminaciones o inserciones de aminoácido de no más de cinco, cuatro, tres, cuatro, dos o un aminoácidos; (b) una o más cadenas ligeras variables (VLs) seleccionadas del grupo que consiste en: (i) SEQ ID NO: 158-194, y (ii) una VL de (i) que contiene una o más sustituciones, eliminaciones o inserciones de aminoácido de no más de cinco, cuatro, tres, cuatro, dos o un aminoácidos; o (c) · una o más cadenas pesadas variables de (a) y una o más cadenas ligeras variables de (b) .
En otra modalidad, la cadena pesada variable (VH) tiene al menos 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% de identidad de secuencia con una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en la SEQ ID NO: 121-157, y/o la cadena ligera variable (VL) tiene al menos 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%. 98% o 99% de identidad de secuencia con una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en la SEQ ID NO: 158-194.
En un aspecto, también se proporciona una proteína de enlace a antígenos que enlaza específicamente a un epítopo que comprende uno o más residuos de aminoácidos de FGFRlc, FGRF2c, FGFR3c, y FGFR4.
En un aspecto,' también se proporciona una proteina de enlace a antigenos que enlaza específicamente a un epítopo que comprende uno o más residuos de aminoácidos de ß-Klotho.
En otro aspecto, también se proporciona una proteína de enlace a antígenos aislada que enlaza específicamente a un epítopo que comprende uno o más residuos de aminoácidos de tanto ß-Klotho como uno o más residuos de aminoácidos de FGFRlc, FGFR2c, FGFR3c, o FGFR4.
Aún en otra modalidad, la proteina aislada de enlace a antígenos descrita en la presente arriba comprende una primera secuencia de aminoácidos que comprende al menos una de las secuencias de consenso CDRH descritas en la presente, y una segunda secuencia de aminoácidos que comprende al menos una de las secuencias de consenso CDRL descritas en la presente.
En un aspecto, la primera secuencia de aminoácidos comprende al menos dos de las secuencias de consenso CDRH, y/o la segunda secuencia de aminoácidos comprende al menos dos de las secuencias de consenso CDRL. En determinadas modalidades, la primera y la segunda secuencia de aminoácidos se enlazan covalentemente una con la otra.
En una modalidad adicional, la primera secuencia de aminoácidos de la proteína aislada de enlace a antígenos comprende la CDRH3 de SEQ ID NO: 146, la CDRH2 de SEQ ID NO: 133, y la CDRH1 de SEQ ID NO: 122 , y/o la segunda secuencia de aminoácidos de la proteina aislada de enlace a antigenos comprende la CDRL3 de SEQ ID NO: 190, la CDRL2 de SEQ ID NO: 176, y la CDRL1 de SEQ ID NO: 167.
En una modalidad adicional, la primera secuencia de aminoácidos de la proteina aislada de enlace a antigenos comprende la CDRH3 de SEQ ID NO: 147, la CDRH2 de SEQ ID NO: 133, y la CDRH1 de SEQ ID NO: 122, y/o la segunda secuencia de aminoácidos de la proteina aislada de enlace a antigenos comprende la CDRL3 de SEQ ID NO: 189, la CDRL2 de SEQ ID NO: 176, y la CDRL1 de SEQ ID NO: 167.
En una modalidad, adicional, la primera secuencia de aminoácidos de la proteina aislada de enlace a antigenos comprende la CDRH3 de SEQ ID NO:148, la CDRH2 de SEQ ID NO:133, y la CDRH1 de SEQ. ID NO: 122, y/o la segunda secuencia de aminoácidos de la proteina aislada de enlace a antigenos comprende la CDRL3 de SEQ ID NO:18'8,..la CDRL2 de SEQ ID NO:176, y la CDRL1 de SEQ ID NO: 166.
En una modalidad adicional, la primera secuencia de aminoácidos de la proteina aislada de enlace a antigenos comprende la CDRH3 de SEQ ID NO: 148, la CDRH2 de SEQ ID NO: 134, y la CDRH1 de SEQ ID. NO: 122, y/o la segunda secuencia de aminoácidos de la proteina aislada de enlace a antigenos comprende la CDRL3 de SEQ ID NO: 188, la CDRL2 de SEQ ID NO: 176, y la CDRL1 de SEQ ID NO: 166.
En una modalidad adicional, la primera secuencia de aminoácidos de la proteina aislada de enlace a antigenos comprende la CDRH3 de SEQ ID NO: 150, la CDRH2 de SEQ ID NO: 136, y la CDRH1 de SEQ ID NO: 124, y/o la segunda secuencia de aminoácidos de la proteina aislada de enlace a antigenos comprende la CDRL3 de SEQ ID NO: 183, la CDRL2 de SEQ ID NO: 174, y la CDRL1 de SEQ ID NO: 161.
En una modalidad adicional, la primera secuencia de aminoácidos de la proteina aislada de enlace a antígenos comprende la CDRH3 de SEQ ID NO: 152, la CDRH2 de SEQ ID NO: 138, y la CDRH1 de SEQ ID NO: 124, y/o la segunda secuencia de aminoácidos de la proteina aislada de enlace a antigenos comprende la CDRL3 de SEQ ID NO: 184, la CDRL2 de SEQ ID NO: 173, y la CDRL1 de SEQ ID NO: 162.
En- una modalidad adicional, la primera secuencia de aminoácidos de la proteina · aislada de enlace a antigenos comprende la CDRH3 de SEQ ID NO: 152, la CDRH2 de SEQ ID NO: 139, y la CDRH1 de SEQ ID NO: 124, y/o la segunda secuencia de aminoácidos de la proteina aislada de enlace a antigenos comprende la CDRL3 de SEQ ID NO: 186, la CDRL2 de SEQ ID NO: 173, y la CDRL1 de SEQ ID NO: 162.
En una modalidad adicional, la primera secuencia de aminoácidos de la proteina aislada de enlace a antigenos comprende la CDRH3 de SEQ ID NO: 151, la CDRH2 de SEQ ID NO: 137, y la CDRH1 de SEQ ID NO: 124, y/o la segunda secuencia de aminoácidos de la proteina aislada de enlace a antigenos comprende la CDRL3 de SEQ ID NO: 186, la CDRL2 de SEQ ID NO: 173, y la CDRL1 de SEQ ID NO: 164. ??· una modalidad adicional, la primera secuencia de aminoácidos de la proteina aislada de enlace a antigenos comprende la CDRH3 de SEQ ID NO: 151, la CDRH2 de SEQ ID NO: 137, y la CDRH1 de SEQ ID NO: 124, y/o la segunda secuencia de aminoácidos de la proteina aislada de enlace a antigenos comprende la CDRL3 de SEQ ID NO: 182, la CDRL2 de SEQ ID NO: 173, y la CDRL1 de SEQ ID NO: 160.
En una modalidad adicional, la primera secuencia de aminoácidos de la proteina aislada de enlace a antigenos comprende la CDRH3 de SEQ ID NO:153, la CDRH2 de SEQ ID NO:140, y la CDRH1 de SEQ ID NO: 131, y/o la segunda secuencia de aminoácidos de la proteina aislada de enlace a antigenos comprende la CDRL3 de SEQ ID NO: 185, la CDRL2 de SEQ ID NO: 173, y la CDRL1 de SEQ ID NO: 163.
En una modalidad adicional, la primera secuencia de aminoácidos de la proteina aislada de enlace a antigenos comprende la CDRH3 de SEQ ID NO: 153, la CDRH2 de SEQ ID NO: 140, y la CDRH1 de SEQ ID NO: 125, y/o la segunda secuencia de aminoácidos de la proteina aislada de enlace a antigenos comprende la CDRL3 de SEQ ID NO:185, la CDRL2 de SEQ ID NO:173, y la CDRL1 de SEQ ID NO: 163.
En una modalidad adicional, la primera secuencia" de aminoácidos de la proteina aislada de enlace a antigenos comprende la CDRH3 de SEQ ID NO: 149, la CDRH2 de SEQ ID NO: 135, y la CDRH1 de SEQ ID NO: 123, y/o la segunda secuencia de aminoácidos de la proteina aislada d enlace a antigenos comprende la CDRL3 de SEQ ID NO: 181, la CDRL2 de SEQ ID NO: 172, y la CDRL1 de SEQ ID NO: 159.
En una modalidad adicional, la primera secuencia de aminoácidos de la¦ proteina aislada de enlace a antigenos comprende la CDRH3 de SEQ ID NO: 149, la CDRH2 de SEQ ID NO: 135, y la CDRH1 de SEQ ID. NO: 123, y/o -la segunda secuencia de aminoácidos de la proteina aislada de enlace a antigenos comprende la CDRL3 de SEQ ID NO: 187, la CDRL2 de SEQ ID NO: 175, y la CDRL1 de SEQ ID NO: 165.
En una modalidad adicional, la primera secuencia de aminoácidos de la proteina aislada de enlace a antígenos comprende la CDRH3 de SEQ ID NO: 145, la CDRH2 de SEQ ID NO: 132, y la CDRH1 de SEQ ID NO: 121, y/o la segunda secuencia de aminoácidos de la proteína aislada de enlace a antígenos comprende la CDRL3 de SEQ ID NO: 180, la CDRL2 de SEQ ID NO: 171, y la CDRL1 de SEQ ID NO: 158.
En una modalidad adicional, la primera secuencia de aminoácidos de la proteína aislada de enlace a antígenos comprende la CDRH3 de SEQ ID NO: 154, la CDRH2 de SEQ ID NO: 133, y la CDRH1 dé SEQ ID NO: 126, y/o la segunda secuencia de aminoácidos de la proteína aislada de enlace a antígenos comprende la CDRL3 de SEQ ID NO: 191, la CDRL2 de SEQ ID NO: 171, y la CDRL1 de SEQ ID NO: 168..
En una modalidad adicional, la primera secuencia de aminoácidos de la prdteína aislada de enlace a antígenos comprende la CDRH3 de- SEQ ID NO:157, la CDRH2 de SEQ ID NO:144, y la CDRH1 de SEQ ID NO: 130, y/o la segunda secuencia de aminoácidos de la 'proteína aislada de enlace a antígenos comprende la CDRL3 de SEQ ID NO: 192, la CDRL2 de SEQ ID NO: 177, y la CDRL1 de SEQ ID NO: 169.
En una modalidad adicional, . la primera secuencia de aminoácidos de la proteína aislada de enlace a antígenos comprende la CDRH3 de SEQ .ID NO: 155, la CDRH2 de SEQ ID NO: 135, y la CDRH1 de SEQ ID NO: 127, y/o la segunda secuencia de aminoácidos de la prdteína aislada de enlace a antígenos comprende la CDRL3 de SEQ ID NO: 193, la CDRL2 de SEQ ID NO: 178, y la CDRL1 de SEQ ID NO: 170.
En una modalidad adicional, la primera secuencia de aminoácidos de la proteína aislada de enlace a antígenos comprende la CDRH3 de SEQ ID NO:156, la CDRH2 de SEQ ID NO:142, y la CDRH1 de SEQ ID NO: 129, y/o la segunda secuencia de aminoácidos de la proteina aislada de enlace a antígenos comprende la CDRL3 de SEQ ID NO: 19 , la CDRL2 de SEQ ID NO: 173, y la CDRL1 de SEQ ID NO: 163.
En una modalidad adicional, la primera secuencia de aminoácidos de la proteina aislada de enlace a antigenos comprende la CDRH3 de SEQ ID NO: 156, la CDRH2 de SEQ ID NO: 141, y la CDRH1 de SEQ ID NO: 128, y/o la segunda secuencia de aminoácidos de la proteina aislada de enlace a antigenos comprende la CDRL3 /de SEQ ID NO': 194, la CDRL2 de SEQ ID NO:173, y la CDRL1 de SEQ ID NO: 163.
En una modalidad adicional, la primera secuencia de aminoácidos de la proteina aislada de enlace a antigenos comprende la CDRH3 de SEQ ID ÑO: 156, la CDRH2 de SEQ ID NO: 143, y la CDRH1 de SEQ ID NO: 128, y/o la segunda secuencia de aminoácidos de la proteina aislada ' de enlace a antigenos comprende la CDRL3 de SEQ ID NO: 194, la CDRL2 de SEQ ID NO: 179, y la CDRL1 de SEQ ID NO: 163.
En una modalidad adicional, la proteina de enlace a antigenos comprende al menos dos secuencias CDRH de secuencias de cadena pesada Hl, H2, H3, H4, H5, H6, H7, H8, H9, H10, Hll, H12, H13, H14, H15, . H16, H17 o H18, como se muestra en la Tabla 4A. De nuevo en una modalidad adicional, la proteina. de enlace a antigenos comprende al menos dos secuencias CDRL de secuencias de cadena ligera Ll, L2, L3, L4, L5, L6, L7, L8, L9, LIO, Lll, L12, L13, L14, L15, L16; L17 o L18, como se muestra en la Tabla 4B. Todavía en una modalidad adicional, la proteína de enlace a antígenos comprende al menos dos secuencias CDRH de secuencias de cadena pesada Hl,¦ H2, H3, H4, H5, H6, H7, H8, H9, H10, Hll, H12, H13, H14, H15, H16, H17 o H18 como se muestra en la Tabla 4A, y al menos dos CDRLs de secuencias de cadena ligera Ll, L2, L3, L4, L5, L6, L7, L8, L9, LIO, Lll, L12, L13, L14, L15, L16, L17 o L18 como se muestra en la Tabla 4B.
De nuevo en otra modalidad, la proteína de enlace a antígenos comprende las secuencias CDRH1, CDRH2, y CDRH3 de secuencias de cadena pesada Hl, H2, H3, H4, H5, H6, H7, H8, H9, H10, Hll, H12, H13, H14, H15, H16, H17 o H18 como se muestra en la Tabla 4A. Aún en otra modalidad, la proteína de enlace a antígenos comprende las secuencias CDRL1, CDRL2, y CDRL3 de secuencias de cadena ligera Ll, L2, L3, L4, L5, L6, L7, L8, L9, LIO, Lll, L12, L13, L14, L15, L16, L17 o L18 como se muestra en la Tabla 4B.
Aún en otra modalidad, la proteína de enlace a antígenos comprende todas las seis CDRs de Ll y Hl, o L2 y H2, o L3 y H3, o L3 y H4, o L4 y H5, o L5 y H6, c L6 y H7, o L7 y H8, o L8 y H7, o L9 y H9, o L9 y H10, o LIO y Hll, o Lll y Hll, o L12 y H12, o L13 y H13, o L14 y H14, o L15 y H15, o L16 y H16, o L17 y H17, o L18 y H18, como se muestra en las Tablas 4A y 4B.
Tabla 4A - Secuencias de Cadena Pesada Tabla 4B - Secuencias de Cadena Ligera En un aspecto, las proteínas de enlace a antigenos asiladas " que enlazan, específicamente (i) ß-Klotho; (ii) FGFRlc, FGFR2c, FGFR3c o FGFR4 o (iii) un complejo que comprende ß-Klotho y uno de FGFRlc, FGFR2c, FGFR3c, y FGFR4 proporcionados en la presente pueden ser un anticuerpo monoclonal, un anticuerpo policlonal, un anticuerpo recombinante, un anticuerpo humano, un anticuerpo humanizado, un anticuerpo quimérico, un anticuerpo multiespecífico, o un fragmento de anticuerpo del mismo.
En otra modalidad, el fragmento de anticuerpo de las proteínas que enlazan a antígeno aisladas proporcionadas en la presente pueden ser. un fragmento Fab, un fragmento Fab' , un fragmento F(ab' )2/ un fragmento Fv, un diacuerpo, o una molécula de anticuerpo de cadena sencilla.
En una modalidad adicional, una proteína de enlace a antígenos aislada que enlaza específicamente (i) ß- lotho; (ii) FGFRlc, FGFR2c, FGFR3c o FGFR4; o (iii) un complejo que comprende ß-Klotho y uno de FGFRlc, FGFR2c, FGFR3c, y- FGFR4 proporcionados en la presente es un anticuerpo humano y puede ser del tipo IgGl, IgG2, IgG3 o IgG4.
En otra modalidad, una proteína de enlace a antígenos aislada que enlaza específicamente (i) ß-Klotho; (ii) FGFRlc, FGFR2c, FGFR3c o FGFR ; o (iii) un complejo que comprende ß-Klotho y uno de FGFRlc,, FGFR2c, FGFR3c, y FGFR4 comprende un polipép.tido de cadena pesada o ligera como se establece en las Tablas 1A-1B. En algunas modalidades, una proteina de enlace- a antigenos que enlaza específicamente (i) ß-Klotho; (ii) FGFRlc, FGFR2c, FGFR3c o FGFR4; o (iii) un complejo que comprende ß-Klotho y uno de FGFRlc, FGFR2c, FGFR3c, y FGFR4 comprende un dominio ligero variable o pesado variable tal como aquellos enlistados en las Tablas 2A-2B. Todavía en otras modalidades, una proteína de enlace a antígenos que enlaza específicamente (i) ß-Klotho; (ii) FGFRlc, FGFR2c, FGFR3c o FGFR4; o (iii) un complejo que comprende ß-Klotho y uno de FGFRlc, FGFR2c, FGFR3c, y ' FGFR4 comprende uno, dos o tres CDRHs o uno, dos o tres CDRLs como se establece en las Tablas 3A-3B, 4A-4B y Tabla 6C, infra. Tales proteínas de enlace a antígenos, y es más cualquiera de las proteínas de enlace a antígenos descritas en la presente, pueden PEGilarse con una o más moléculas PEG, por ejemplo moléculas PEG que tienen un pero molecular seleccionado del grupo que consiste en 5K, 10K, 20K, 40K, 50K, 60K,- 80K, 100K o mayor que 100K.
Aún en otro aspecto, cualquier proteína de enlace a antígenos que enlaza específicamente (i) ß-Klotho; (ii) FGFRlc, FGFR2c, FGFR3c o FGFR4; o (iii) un complejo que comprende ß-Klotho y uno de FGFRlc, FGFR2c,. FGFR3c, y FGFR4 proporcionados en la presente pueden acoplarse a un grupo etiquetado y pueden competir para enlazar a la porción extracelular de (i) ß-Klotho; (ii) FGFRlc, FGFR2c, FGFR3c o FGFR4; o (iii) un complejo que comprende ß-Klotho y uno de FGFRlc, FGFR2c, FGFR3c, y FGFR4 con una proteína de enlace a antigenos de una de las proteínas de enlace a antígenos aisladas proporcionadas en la presente. En una modalidad, la proteína aislada de enlace a antígenos proporcionada en la presente puede reducir niveles de glucosa en la sangre, triglicérido disminuido y niveles de colesterol o mejorar otros parámetros glicémicos y factores de riesgo cardiovasculares cuando se administran a. un paciente.
Como se apreciará, para cualquier proteína de enlace a antígenos que comprende más de una CDR proporcionada en las Tablas 3A-3B, y 4A-4B, cualquier combinación de CDRs independientemente seleccionada de las secuencias descritas puede utilizarse. De esta manera, las proteínas de enlace a antígenos con uno, dos, tres, cuatro, cinco o seis de independientemente CDRs seleccionados pueden generarse. Sin embargo, como se. apreciará por aquellos en la técnica, las modalidades específicas generalmente utilizan combinaciones de CDRs que no son repetitivas, por ejemplo, proteínas de enlace a antígenos generalmente no se hacen con dos regiones CDRH2, etc.
Algunas de las proteínas de enlace a antígenos que enlazan específicamente (i) ß-Klotho; (ii) FGFRlc, FGFR2c, FGFR3c o FGFR4; o (iii), un complejo que comprende ß-Klotho y uno de FGFRlc, FGFR2C, FGFR3C, y FGFR4 que se proporcionan en la presente se discuten en más detalle a continuación.
Proteínas de enlace a antigenos y Epitopos de Enlace y Dominios de Enlace Cuando una proteína de enlace a antígenos es para enlazar un epítopo en (i) ß-Klotho; (ii) FGFRlc, FGFR2c, FGFR3c o FGFR4; o (iii) un complejo que comprende ß-Klotho y uno de FGFRlc, FGFR2c, FGFR3c, y FGFR4, ' o el dominio extracelular de ß-Klotho, FGFRlc, FGFR2c, FGFR3c o FGFR4 , por ejemplo, que significa que es la proteína de enlace a antígenos enlaza específicamente a una porción específica de (i) ß-Klotho; (ii) FGFRlc, FGFR2c, FGFR3c o FGFR4; o (iii) un complejo que comprende ß-Klotho y uno de FGFRlc, FGFR2c, FGFR3c, y FGFR4. En algunas modalidades, por ejemplo, en ciertos casos donde la proteína de .enlace a antígenos enlaza solamente FGFRlc o ß-Klotho, la proteína de enlace a antígenos puede enlazar específicamente a un polipéptido que consiste de residuos específicos (por ejemplo, un segmento específico de ß-Klotho, FGFRlc, FGFR2c, FGFR3c o FGFR4, tal como aquellos residuos descritos en el Ejemplo 14). En otras modalidades, por ejemplo, en ciertos casos donde una proteína de enlace a antígenos interactúa con tanto ß-Klotho como uno o más de FGFRlc, FGFR2c, FGFR3c y FGFR , la proteína de enlace a antígenos puede enlazar residuos, secuencias de residuos, o regionas en tanto ß-Klotho y FGFRlc, FGFR2c, FGFR3c o FGFR4, dependiendo en cuyo receptor la proteina de enlace a antigenos se reconoce. Todavía en otras modalidades la proteina de enlace a . antígenos enlazará residuos, secuencia o residuos o regiones de un complejo que comprende ß-Klotho y uno de FGFRlc, FGFR2c, FGFR3c, y FGFR4, por ejemplo FGFRlc.
En cualquiera de las modalidades anteriores, tal proteína de enlace a antígenos no necesita tener contacto con cada residuo de (i) ß-Klotho;¦ (ii) FGFRlc, FGFR2c, FGFR3c o FGFR4; o (iii) un complejo que comprende ß-Klotho y uno de FGFRlc, FGFR2c, FGFR3c, y FGFR4 , o el dominio extracelular de las proteínas o complejos recitados. Tampoco cada sustitución o eliminación de aminoácido sencilla dentro de (i) ß-Klotho; (ii) FGFRlc, FGFR2c, FGFR3c o FGFR4; o (iii) un complejo que comprende ß-Klotho y uno de FGFRlc, FGFR2c, FGFR3c, y FGFR4, o el dominio extracelular de las proteínas o complejos recitados, necesariamente de manera significativa afecta la afinidad de enlace.
La especificidad del epítopo y los dominios de enlace de una proteína de enlace a antígenos puede determinarse por una variedad de métodos. Algunos métodos, por ejemplo, pueden usar porciones truncadas de un antígeno. Otros métodos utilizan antígeno mutados en uno o más residuos específicos, tal como al emplear un enfoque tipo barrido de arginina o barrido de alanina o por la generación y estudio de proteínas quiméricas en las cuales varios dominios, regiones o aminoácidos se intercambian entre dos proteínas (por ejemplo, formas de ratón y humanas de uno o más de los antígenos o proteínas objetivo), o por ensayos de protección de proteasa.
Proteínas de enlace a antígenos competentes En otro aspecto, las proteínas de enlace a antígenos se proporcionan que compiten con uno de los anticuerpos ejemplificados o fragmentos funcionales para enlazar a (i) ß-Klotho; (ii) FGFRlc, 'FGFR2c, FGFR3c o FGFR4; o (iii) un complejo que comprende ß- lotho y uno de FGFRlc, FGFR2c, FGFR3c, y FGFR . Tales proteínas de enlace a antígenos también pueden enlazar al mismo epítopo como una de las proteínas de enlace a antígenos ejemplificadas en la presente, o un epítopo traslapado. Las proteínas de enlace a antígenos y fragmentos que compiten con o enlazan al mismo epítopo como las proteínas de enlace a antígenos ejemplificadas se esperan para mostrar propiedades funcionales similares. Las proteínas de enlace a antígenos ejemplificadas y fragmentos incluyen aquellas con las cadenas ligeras y pesadas H1-H18 y L1-L18, dominios de región variable VL1-VL18 y VH1-VH18, y CDRs proporcionados en la presente, incluyendo aquellos en las Tablas 1, 2, 3, y 4. De esta manera, como un ejemplo específico, las proteínas de enlace a antígenos que se proporcionan incluyen aquellas que compiten con un anticuerpo que comprende: (a) 1, 2, 3, 4, 5 o todas las 6 de las CDRs enlistadas para un anticuerpo enlistado en las Tablas 3? y 3B, y 4A y 4B y Tabla 6C, infra; (b) una VH y una VL seleccionada de VL1-VL18 y VH1-VH18 y enlistada por un anticuerpo enlistado en las Tablas 2A y 2B; o (c) dos cadenas ligeras y dos cadena pesadas como se especifica por un anticuerpo enlistado en las Tablas 1A y 12B y Tabla 6A, infra.
De esta manera, ' en una modalidad, la presente descripción proporciona proteínas de enlace a antígenos que compiten para enlace a (i) ß-Klotho; (ii) FGFRlc, FGFR2c, FGFR3c o FGFR4; o (iii) un complejo que comprende ß-Klotho y uno de FGFRlc, FGFR2c, FGFR3c, y FGFR4 con un anticuerpo de referencia, en donde el anticuerpo de referencia comprende una combinación de secuencias de dominio variable de cadena ligera y cadena pesada .seleccionada del grupo que consiste en L1H1, L2H2, L3H3, L3H4, L4H5, L5H6, L6H7, L7H8, L8H8, L9H9, L9H10, L10H11, LllHll, L1'2H12, L13H13, L14H14, L15H15, L16H16, L17H17 o L18H18. En otra modalidad, la presente descripción proporciona anticuerpos humanos que compiten para enlace a (i) ß-Klotho; (ii) FGFRlc, FGFR2c, FGFR3c o FGFR4; o (iii) un complejo que comprende ß-Klotho y uno de FGFRlc, FGFR2c, FGFR3c, y FGFR4 con un anticuerpo de referencia, en donde el anticuerpo de referencia es 17C3, 22H5, 16H7, 24H11, 18G1, 17D8, 26H11, 12E4, 12C11, 21H2, 21B4, 18B11.1, 18B11.2, 20D4, 46D11, 40D2, 37D3, 39F7, 39F1 o 39G5.
En una modalidad adicional, un anticuerpo humano aislado se proporciona que enlaza a (i) ß-Klotho; (ii) FGFRlc, FGFR2c, FGFR3c o FGFR ; o (iii) un complejo que comprende ß-Klotho y uno de FGFRlc, FGFR2c, FGFR3c, y FGFR4 con sustancialmente la misma Kd como un anticuerpo de referencia; inicia la señalización del tipo FGF21 en un ensayo de ELK-Luciferasa in vitro al mismo grado como un anticuerpo de referencia; disminuir la glucosa en la sangre; disminuir los niveles de lípido en el suero; y/o competir para enlace con el anticuerpo de referencia para (i) ß-Klotho; (ii) FGFRlc, FGFR2c, FGFR3C o FGFR ; o (iii) un complejo que comprende ß-Klotho y uno de FGFRlc, FGFR2c, FGFR3c, y FGFR4, en donde el anticuerpo de referencia se selecciona del grupo que consiste de 17C3, 22H5, 16H7, 24H11, 18G1, 17D8, 26H11, 12E4, 12C11, 21H2, 21B4, 18B11.1, 18B1Í.2, 20D4,. 46D11, 40D2, 37D3, 39F7, 39F1 o 39G5.
La capacidad para .competir con 'un anticuerpo puede determinarse usando cualquier ensayo adecuado, tal como aquel descrito en el Ejemplo 8, en el cual las proteínas de enlace a antígenos 17C3, 22H5, 16H7, 24H11, 18G1, 17D8, 26H11, 12E4, 12C11, 21H2, 21B4, 18B11.1, 18B11.2, 20D4, 46D11, 40D2, 37D3, 39F7, 39F1 o 39G5 pueden usarse como el anticuerpo de referencia.
Anticuerpos monoclonales Las proteínas de enlace a antígenos que se proporcionan incluyen anticuerpos monoclonales que enlazan a (i) ß-Klotho; (ii) FGFRlc, FGFR2c, FGFR3c o FGFR4; o (iii) un complejo que comprende ß-Klotho y uno de FGFRlc, FGFR2c, FGFR3c, y FGFR4, e inducen señalización del tipo FGF21 a varios grados. Los anticuerpos monoclonales pueden producirse usando cualquier técnica conocida en la técnica, por ejemplo, al inmortalizar células de bazo cosechadas del animal transgénico después de la terminación del programa de inmunización. Las células de bazo pueden inmortalizarse usando cualquier técnica conocida en el arte, por ejemplo, al fusionarlas con células de mieloma para producir hibridomas. Las células de mieloma para uso en procedimientos de fusión que producen hibridoma preferiblemente que se producen sin anticuerpo, tienen eficiencia de fusión alta, y deficiencias de la enzima que las vuelve incapaces de crecer en cierto medio selectivo que soporta el crecimiento de solamente las células fusionadas deseadas (hibridomas) . Los ejemplos de lineas celulares adecuadas para uso en fusiones de ratón incluyen Sp-20, P3-X63/Ag8, P3-X63-Ag8.653 , NSl/l.Ag 4 1, Sp210-Agl4, FO, NSO/U, MPC-11, MPC11-X45-GTG 1.7' y S194/5XXO Bul; los ejemplos de las lineas celulares usadas en fusiones de rata incluyen R210.RCY3, Y3-Ag 1.2.3, IR983F y 4B210. Otras lineas celulares útiles para las fusiones celulares son U-266, GM1500-GRG2, LICR-L0N-HMy2 y UC729-6.
En algunos casos, una linea celular de hibridoma se produce al inmunizar un animal (por ejemplo, un animal transgénico que tiene secuencias de inmunoglobulina humana) con un inmunógeno FGFRlc, ß-Klotho o FGFRlc y/o ß-Klotho (por ejemplo, un complejo soluble que comprende los dominios extracelulares de FGFRlc, FGFR2c, FGFR3c o FGFR4 y/o ß-Klotho como se muestra en los Ejemplos 2, y 3; membranas en las cuales los dominios extracelulares de FGFRlc, FGFR2c, FGFR3c o FGFR4 y/o ß-Klotho se expresan, como se muestra en los Ejemplos 1 y 3; o' células completas que expresan FGFRlc y/o ß- lotho, como se muestra en los Ejemplos 1 y 3) ; células de bazo cosechadas del animal inmunizado; fusionando las células de bazo cosechadas a una linea celular de mieloma, por ello generan células de hibridoma; estableciendo lineas celulares de hibridoma de las células de hibridoma, e identificando una línea celular de hibridoma que produce un anticuerpo que enlaza a (i) ß-Klotho; (ii) FGFRlc, FGFR2c, FGFR3c o FGFR4; o (iii) un complejo que comprende 3~Klotho y uno de FGFRlc, FGFR2c, FGFR3c, y FGFR4 (por ejemplo, como se describe en el Ejemplo 4) y puede inducir señalización del tipo FGF21 (por ejemplo, como se describe en los Ejemplos 5-7) . Tales líneas celulares de hibridoma, y los anticuerpos monoclonales producidos por ellas, forman aspectos de la presente descripción .
Los anticuerpos monoclonales secretados por una línea celular de hibridoma pueden purificarse usando cualquier técnica conocida en el arte. Los hibridomas o mAbs pueden separarse por exclusión adicional para identificar mAbs con propiedades particulares, tal como la capacidad para inducir señalización del tipo FGF21. Los ejemplos de tales separaciones por exclusión se proporcionan en la presente.
Anticuerpos humanizados y quiméricos Los anticuerpos humanizados y quiméricos con base en las secuencias anteriores pueden fácilmente generarse. Un ejemplo es un anticuerpo quimérico, el cual es un anticuerpo compuesto de segmentos de proteína de anticuerpos diferentes que se unen de forma covalente para producir cadenas pesadas o ligera de inmunoglobulina funcional o porciones inmunológicamente funcionales de los mismos. Generalmente, una porción de la cadena pesada y/o cadena ligera es idéntica con u homologa a una secuencia correspondiente en anticuerpos derivada de una especie particular o que pertenece a una clase o subclase de anticuerpo particular, mientras que el resto de las cadenas son idénticas con u homologas a una secuencia correspondiente en anticuerpos derivados de otra especie o que pertenece a otra clase o subclase de anticuerpo. Para los métodos relacionados con anticuerpos quiméricos, ver, por ejemplo, Patente de E.U.A. No. 4,816,567; y Morrison et al., 1985, Proc. Nati. Acad. Sci. USA 81: 6851-6855, q e> se incorporan en la presente como referencia. El injerto CDR se describe, por ejemplo, en la Patente de E.U.A. No. 6,180,370, No. 5,693,762, No. 5,693, 761, No. 5, 585, 089, y No-. 5,530,101.
Generalmente, el objetivo de hacer un anticuerpo quimérico es crear una quimera en la cual el número de aminoácidos de la especie del paciente/receptor pretendida se maximiza. Un ejemplo es el anticuerpo "injertado con CDR", en el cual el anticuerpo comprende una o más regiones determinantes de la complementariedad (CDRs) de una especie particular o que pertenece a una clase o subclase de anticuerpo particular, mientras que el resto de las cadenas de anticuerpo son idénticas con u homologas a una secuencia correspondiente en anticuerpos derivados de otra especie o que pertenece a otra clase o subclase de anticuerpo. Para uso en humanos, la región variable o CDRs seleccionados de un anticuerpo de roedor a menudo se injertan en un anticuerpo humano, reemplazando las regiones variables que se presentan naturalmente o CDRs del anticuerpo humano.
Un tipo útil de anticuerpo quimérico es un anticuerpo "humanizado". Generalmente, un anticuerpo humanizado se produce de un anticuerpo monoclonal elevado inicialmente en un animal no humano.' Ciertos residuos de aminoácidos en este anticuerpo monoclonal, típicamente de porciones que no reconocen al antígeno del anticuerpo, se modifican para ser homologas a residuos correspondientes en un anticuerpo humano de isotipo correspondientes. Las humanización puede realizarse, por ejemplo, usando varios métodos al sustituir al menos una porción de una región variable de roedor para las regiones correspondientes de un anticuerpo humano (Ver, por ejemplo, Patente de E.U.A. No. 5,585,089, y No. 5,693,762; Jones et al., 1986, Wature 321:522-525; Riechmann et al., 1988, Nature 332 : 323-27; Verhoeyen et al., 1988, Science 239 : 1534-1536) .
En un aspecto, las CDRs de regiones variables cadena pesada y ligera de los anticuerpos proporcionados en la presente (por ejemplo, en las Tablas 3 y 4) se injertan a regiones de estructura (FRs) de anticuerpos del mismo, o una diferente, especie filogenétlca . Por ejemplo, las CDRs de las regiones variables de cadena ligera y pesada VHI, Vh2, VH3, VH4, VH5, VH6, VH7, VH8, VH9, VH10, VH11, VH12, VH13, VH14, VH15, VH16, VH17 o VH18- y/o VL1, VL2 , VL3, VL4 , VL5, VL6, VL7, VL8, VL9, VL10, VL11, VH12, VL13, VL14, VL15, VL16, VL17 o VL18 pueden injertarse a FRs humanas de consenso. Para crear FRs humanas de consenso, las FRs de varias secuencias de aminoácidos de cadena ligera o cadena pesada humanas pueden alinearse para identificar una secuencia de aminoácido de consenso. En otras modalidades, las FRs de una cadena pesada o cadena ligera descritas en la presente se reemplazan con las FRs de una cadena pesada o cadena ligera diferente. En un aspecto, los aminoácidos raros en las FRs de las cadenas pesadas y ligeras de una prcteina de enlace a antigenos (por ejemplo, un anticuerpo) que enlazan específicamente (i) ß-Klotho; (ii) FGFRlc, FGFR2c, FGFR3c o FGFR4; o (iii) un complejo que comprende ß-Klotho y uno de FGFRlc, FGFR2c, FGFR3c, y FGFR4 no se reemplazan, mientras que el resto de los aminoácidos FR se reemplazan. Un "aminoácido raro" es un aminoácido específico que está en una posición en la cual, este aminoácido particular no se encuentra usualmente en un FR. Alternativamente, las regiones variables injertadas de la cadena ligera o pesada pueden usarse con una región constante que es diferente de la región constante de tal cadena ligera o pesada particular como se describen en la presente. En otras modalidades, las regiones variables injertadas son parte de un anticuerpo Fv de cadena sencilla.
En determinadas modalidades, las regiones constantes de especies diferentes a humano pueden usarse junto con las regiones variables humanas para producir anticuerpos híbridos.
Anticuerpos Completamente Humanos Los anticuerpos completamente humanos también se proporcionan por la descripción instantánea. Los métodos están disponibles para hacer anticuerpos completamente humanos específicos para un antígeno dado sin exponer a los seres humanos al antígeno ("anticuerpos completamente humanos") . Un medio específico proporcionado para implementar la producción de anticuerpos completamente humanos es la "humanización" del sistema inmunitario humoral de ratón. La introducción de la ubicación de inmunoglobulina humana (Ig) en ratones en la cual los genes Ig endógenos se han inactivado es un medio para producir anticuerpos monóclonales completamente humanos (mAbs) en ratones, un animal que puede inmunizarse, con cualquier antígeno deseado. Usando anticuerpos completamente humanos puede minimizar las respuestas inmunogenoicas y alérgicas que pueden algunas veces provocarse al administrar mAbs de ratón o derivados de ratón a humanos como agentes terapéuticos.
Los anticuerpos completamente humanos pueden producirse al inmunizar animales transgénicos (típicamente ratones) que son capaces de producir un repertorio de anticuerpos humanos en la ausencia de producción de inmunoglobulina endógena. Los antígenos para este propósito típicamente tienen seis o más aminoácidos contiguos, y opcionalmente se conjugan para un portador, tal como un hapteno. Ver, por ejemplo, Jakobovits et al., (1993) Proc. Nati. Acad. Sci. USA 90:2551-2555; Jakobovits et al., (1993) Nature 362 : 255-258 ; y Bruggermann et al., (1993) Year in Immunol. 1^:33. En un ejemplo de tal método, los animales transgénicos se producen al incapacitar la ubicación de inmunoglobulina de ratón endógena que codifica las cadenas de inmunoglobulina ligeras y pesadas de ratón en ellos, e insertar en los fragmentos grandes del genoma de ratón de ADN de genoma humano que contiene la ubicación que codifica las proteínas de cadena ligera y pesada humanas. Los animales parcialmente modificados, que tienen menos que el complemento completo de ubicación de . inmunoglobulina humana, luego se cruzan para obtener un animal que tiene todas de las modificaciones del sistema inmunitario deseadas. Cuando se administra un inmunógeno, estos animales transgénicos producen anticuerpos que son inmunoespecificos para el inmunógeno pero tienen secuencias de aminoácidos humanas en vez de secuencias de aminoácidos de murino, incluyendo las regiones variables. Para detalles adicionales de tales métodos, ver, por ejemplo, W096/33735 y WO94/02602. . Los métodos adicionales con relación a los ratones transgénicos para hacer anticuerpos humanos se describen en la Patente de E.U.A. No. 5,545,807; No. 6,713,610; No. 6,673,986; No. 6,162,963; No. 5,545,807; No. 6,300,129; No. 6,255,458; No. 5,877,397; No. 5,874,299 y No. 5,545,806; en publicaciones PCT WO91/10741, WO90/04036, y en EP 546073B1 y EP 546073A1. .
Los ratones transgénicos descritos arriba, referidos en la presente como ratones "HuMab", contienen una miniubicación del gen de inmunoglobulina humana que codifica las secuencias de inmunoglobulina de cadena ligera y pesada humanas no reconfiguradas ( [µ, mu] y [?, gamma] ) y [?, kappa] , junto con mutaciones dirigidas que inactivan la ubicación de cadena µ [mu] y K [kappa] endógenas (Lonberg et al., 1994, Nature 368 : 856-859) . En consecuencia, los ratones muestran expresión reducida de IgM de ratón o [ , kappa] y en respuesta a la inmunización, y los transgenes de cadena ligera y pesada humanos introducidos experimentan intercambio de clase y mutación somática para generar anticuerpos monoclonales IgG humanos de alta afinidad [?, kappa] (Lonberg et al., supra.; Lonberg y Huszar, (1995) Intern. Rev. Immunol. 1_3: 65-93; Harding y Lonberg, (1995) Ann. N.Y Acad. Sci. 764 : 536-546) . La preparación de ratones HuMab se describen en detalle en Taylor et al., (1992) Nucleic Acids Research 20:6287-6295; Chen et al., (1993) International Immunology 5:647-656; Tuaillon et al., (1994) J. Immunol. 152:2912-2920; Lonberg et al., (1994) Nature 368: 856-859; Lonberg, (1994) Handbook de Exp. Pharmacology 113 : 49-101; Taylor et al., (1994) International Immunology 6:579-591; Lonberg y Huszar, (1995) Intern. Rev. Immunol. 13:65-93; Harding y Lonberg, (1995.) Ann. N.Y Acad. Sci. 76 : 536-546; Fish ild et al., (1996) Nature Biotechnology 14:845-851; las referencias anteriores' se incorporan en la presente como referencia en su totalidad para todos los propósitos. Ver, además Patente de E.U.A. No. 5,545,806; No. 5,569,825; No. 5,625,126; No. 5,633,425; No. 5,789,650; No. 5,877,397; No. 5,661,016; No. 5,814,318; No. 5,874,299; y No. 5,770,429; asi como Patente de E.U.A. No. 5,545,807; Publicación Internacional Nos. WO 93/1227; WO .92/22646; y WO 92/03918, las descripciones de todas de las cuales se incorporan en la presente como referencia en su totalidad para todos los propósitos. Las tecnologías utilizadas para producir anticuerpos humanos 'en estos ratones transgénicos se describen también en WO 98/24893, y Méndez et al., (1997) Nature Genetics 1_5: 146-156, que se incorporan en la presente como referencia. Por ejemplo, las cepas de ratones transgénicos HCo7 y HCol2 pueden usarse para generar proteínas de enlace a antígenos (por ejemplo, anticuerpos) que enlazan a (i) ß-Klotho; (ii) FGFRlc, FGFR2c, FGFR3c o FGFR4; o (iii) un complejo que comprende ß-Klotho y uno de FGFRlc, FGFR2c, FGFR3c, y FGFR4 y puede inducir señalización del tipo FGF21. Los detalles adicionales con respecto a la producción de anticuerpos humanos usando ratones transgénicos se proporcionan en los ejemplos a continuación.
Usando tecnología de hibridoma, los mAbs humanos de antígeno específicos con la especificidad deseada pueden producirse y seleccionarse de los ratones transgénicos tales como aquellos descritos arriba. Tales anticuerpos pueden clonarse y expresarse usando un vector adecuado y célula hospedera, o los anticuerpos pueden cosecharse de células de hibridoma cultivadas.
Los anticuerpos completamente humanos también pueden derivarse de de bibliotecas de exhibición de fago (como se describe en Hoogenboom et al., (1991) J. Mol. Biol. 227:381; y Marks et al., (1991). J. Mol. Biol. 222 : 581) . Las técnicas de exhibición de fago imitan la selección inmunitaria a través de la exhibición de repertorios de anticuerpo en la superficie de bacteriófago filamentoso, y selección posterior de fago por su enlace a un antigeno de elección. Una técnica se describe en la Publicación PCT No. WO 99/10494 (incorporada en la presente como referencia) , que describe el aislamiento de anticuerpos agonistas funcionales y de alta afinidad para receptores MPL y msk usando tal enfoque.
Proteínas de enlace a antigenos biespecíficas o bifuncionales También se proporcionan anticuerpos biespecíficos y bifuncionales que incluyen una o más CDRs o una o más regiones variables como se describe arriba. Un anticuerpo biespecífico o bifuncional en algunos casos puede ser un anticuerpo híbrido artificial que tiene dos diferentes pares de cadena pesada/ligera y dos diferentes sitios de enlace. Los anticuerpos biespecíficos pueden producirse por una variedad de los métodos incluyendo, pero no limitados a, fusión de hibridomas o ligación de fragmentos Fab' . Ver, por ejemplo, Songsivilai y Lachmann, 1990, Clin. Exp. Immunol. 19: 315-321; Kostelny et al., 1992, J. Immunol.- 148:1547-1553. Cuando una proteína de enlace a antígenos de la descripción instantánea enlaza (i) tanto ß-Klotho y uno o más de FGFRlc, FGFR2c, FGFR3c o FGFR4; o (ii) un complejo que comprende ß-Klotho y uno de FGFRlc, FGFR2c, FGFR3c, y FGFR4 , el enlace puede llevar a la activación de actividad tipo FGF21 como se mide por los ensayos de señalización y funcionales tipo FGF21 descritos en los Ejemplos 5-7; cuando una prot'eina de enlace a antigenos es un anticuerpo se refiere como un .anticuerpo antagónico.
Varias Otras Formas Algunas de las proteínas de enlace a antígenos que enlazan específicamente (i) ß-Klotho; (ii) FGFRlc, FGFR2c, FGFR3c o FGFR4; o (iii) un complejo que comprende ß-Klotho y uno de FGFRlc, FGFR2c, FGFR3c, y FGFR4 que se proporcionan en la presente descripción incluyen formas variantes de las proteínas de enlace a antígenos descritas en la presente (por ejemplo, aquellas que tienen las secuencias como se enlista en las Tablas 1-4) .
En diversas modalidades, las proteínas de enlace a antígenos descritas en la presente pueden comprender uno o más aminoácidos que no se presenta naturalmente. Por ejemplo, algunas de las proteínas de enlace a antígenos tienen uno o más sustituciones de aminoácido que no se presentan naturalmente en una o más de las cadenas ligeras o pesadas, regiones variables o CDRs enlistadas en las Tablas 1-4. Los ejemplos de aminoácidos que no se presentan naturalmente (que pueden sustituirse de cualquier aminoácido que se presenta naturalmente- encontrado en cualquier secuencia descrita en la .presente, como se desea) incluyen: 4-hidroxiprolina, ?-carboxiglutamato, ¦ e-?, N, N-trimetilisina, e-?-acetj.lisina, 0-fosfoserina, N-acetilserina, N-formilmetionina, 3-metilhistidina, 5-hidroxilisina, s-?-metilarginina, y otros aminoácidos similares y ácidos imino (por ejemplo, 4-hidroxiprolina) . En la anotación del polipéptido usada en la presente, la dirección a la izquierda es la dirección de terminal amino y la dirección a la derecha es la dirección de terminal carboxilo, de acuerdo con uso y convención estándar. Las. listas no limitantes de ejemplos de aminoácidos que no se presentan naturalmente que pueden insertarse en una secuencia de proteina de enlace a antigenos o sustituidos por un residuo de tipo natural en la secuencia de enlace a antigeno incluyen aminoácidos ß, homoaminoácidos , aminoácidos cíclicos y aminoácidos con cadenas laterales derivadas. Los ejemplos incluyen (en la forma L o forma D; abreviados como en el paréntesis): citrulina (Cit), homocitrulina (hCit) , ?a-metilcitrulina (NMeCit) , Na-metilhomocitrulina (?a-MeHoCit) , ornitina (Orn) , a-Metilornitina (?a-MeOrn. o NMeOrn) , sarcosina (Sar) , homolisina (hLys o hK) , homoarginina (hArg o hR) , homoglutamina (hQ) , ?a-metilarginina (NMeR) , Na-metileucina (Noí-MeL o NMeL) , N-metilhomolisina (NMeHoK) , NOÍ-metilglutamina (NMeQ) , norleucina (Nle) , norvalina (Nva) , 1 , 2 , 3 , -tetrahidroisoquinolina (Tic), ácido octahidroindol-2-carboxílico (Oic) , 3- ( 1-naftil) alanina (1-Nal), 3- (2-náftil) alanina (2-Nal), 1, 2, 3, 4-tetrahidroisoquinolina (Tic), 2-indanilglicina (Igl), para-yodofenilalanina (pI-Fe) , para-aminofenilalanina (4AmP o 4-Amino-Fe) , 4-guanidino fenilalanina (Guf) , glicilisina (abreviado "K (?e-glicilo) " o "K(glicilo)" o "K(gly)"), nitrofenilalanina (nitrofe), aminofenilalanina (aminofe o Amino-Fe) , bencilfenilalanina (bencilfe) , ácido ' ?-carboxiglutámico (?-carboxiglu) , hidroxiprolina (hidroxipro) , p-carboxil-fenilalanina (Cpa) , ácido a-aminoadípico (Aad) , ?a-metil valina (NMeVal), N- -metil leucina . (NMeLeu) , ?a-metilnorleucina (NMeNle) , ciclopentilglicina (Cpg) , ciclohexilglicina (Chg) , acetilarginina (acetilarg) , ácido a, ß-diaminopropionoico (Dpr), ácido OÍ, ?-diaminobutirico (Dab) , ácido diaminopropiónico (Dap) , ciclohexilalanina (Cha) , 4-metil-fenilalanina ( ePhe) , ß, ß-difenil-alanina (BiPhA) , ácido aminobutirico (Abu) , 4-fenil-fenilalanina (o bifenilalanina; 4Bip) , ácido Oí-amino-isobutirico (Aib) , beta-alanina, ácido beta-aminopropionico, ácido piperidinico, ácido aminocaprioico, ácido aminoheptanoico, ácido aminopimélico, desmosina, ácido diaminopimélico, N-etilglicina, N-etilaspargina , hidroxilisina, alo-hidroxilisina, isodesmosina, alo-isoleucina, N-metilglicina, N-metilisoleucina, N-metilvalina, 4-hidroxiprolina (Hyp) , y-carboxiglutamato, e-?, , -trimetilisina, e-?-acetilisina, 0-fosfoserina, N-acetilserina, N-formilmetionina, 3-metilhistidina, 5-hidroxilisina, ?-metilarginina , ácido 4-Amino-O-ftálico (4APA), y otros aminoácidos similares, y formas derivadas de cualquiera de aquellos específicamente enlistados.
Adicionalmente , las proteínas de enlace a antígenos pueden tener una o más sustituciones conservadoras de aminoácidos en una o más de las cadenas ligeras o pesadas, regiones variables o CDRs enlistadas en las Tablas 1-4. Los aminoácidos que se presenta naturalmente pueden dividirse en clases con base en las propiedades de cadena lateral comunes: 1) hidrofóbicas : norleucina, Met, Ala, Val, Leu, lie; 2) hidrofílicas neutras: Cys, Ser, Thr, Asn, Gln; 3) ácidas: Asp, Glu; 4) básicas: His, Lys, Arg; 5) residuos que incluyen en .la orientación de la cadena: Gly, Pro; y 6) aromáticas: Trp, Tyr, Phe .
Las sustituciones conservadoras de aminoácidos pueden involucrar intercambiar de un miembro de una de estas clases con otro miembro de la misma clase. Las sustituciones conservadoras de aminoácidos pueden abarcar residuos de aminoácidos que no se presentan naturalmente, que se incorporan típicamente por síntesis de péptido química en vez de por síntesis en sistemas biológicos. Ver Tabla 5, infra. Estas incluyen péptidoimitadores y otras formas invertidas o inversas de porciones de aminoácido.
¦ Las sustituciones no conservadoras pueden involucrar el intercambio de un miembro de una de las clases de arriba para un miembro de otra clase. Tales residuos sustituidos pueden introducirse en regiones del anticuerpo que son homologas con anticuerpos humanos, o en las regiones no homologas de la molécula.
Al hacer tales cambios, de acuerdo a determinadas modalidades, el índice hidropático de aminoácidos puede considerarse. El perfil hidropático de una proteína se calcula al asignar a. cada aminoácido un valor numérico ("índice hidropatía") y luego repetitivamente promediar estos valores a lo largo de la cadena de péptido. Cada aminoácido se le ha asignado un índice hidropático en la base de su hidrofobicidad y características de carga. Que son:, isoleucina (+4.5); valina (+4.2) ; ' leucina (+3.8); fenilalanina (+2.8); cisteína/cistina (+2.5); metionina (+1.9); alanina (+1.8); glicina (-0.4); treonina (-0.7); serina (-0.8); triptofano (-0.9); tirosina (-1.3); prolina (-1.6); histidina (-3.2); glutamato (-3.5); glutamina (-3.5); aspartato (-3.5); asparagina (-3.5); lisina (-3.9); y arginina (-4.5).
La importancia del perfil hidropático al conferir la función biológica interactiva en una proteina se entiende en el arte (Ver, por ejemplo, Kyte et al., 1982, J. -Mol. Biol. 157:105-131) . Se conoce que ciertos aminoácidos pueden sustituirse para otros aminoácidos que tienen un índice hidropático similar o registro y todavía mantienen una actividad biológica similar. Al hacer los cambios con base en el índice hidropático, en determinadas modalidades, la sustitución de aminoácidos cuyos índices hidropáticos están dentro de ±2 se incluye. En algunos aspectos, aquellos que están dentro de ±1 se incluyen, y en otros aspectos, aqellos dentro de +0.5 se incluyen.
También se entiende en la técnica que la sustitución de aminoácidos similares puede hacerse efectivamente en la base de hidrofilicidad, particularmente donde la proteína o péptido biológicamente funcional por ello creada se pretende para uso en modalidades inmunológicas, como en el caso presente. En determinadas modalidades, la hidrofilicidad promedio local mayor de una proteína, como se gobierna por la hidrofilicidad de sus aminoácidos adyacentes, se correlaciona con su inmunogenicidad y enlace al antígeno o inmunogenicidad, esto es, con una propiedad biológica de la proteína .
Los siguientes valores de hidrofilicidad se han asignado para estos residuos de aminoácidos: arginina (+3.0); lisina (+3.0); aspartato (+3.0+1); glutamato (+3.0±1); serina (+0.3); asparagina (+0.2); glutamina (+0.2); glicina (0) ; treonina (-0.4); prolina (-0.5+1) ; alanina (-0.5); histidina (-0.5); cisteina (-1.0);. metionina (-1.3); valina (-1.5); leucina (-1.8); isoleucina (-1.8); tirosina (-2.3); fenilalanina (-2.5) y triptofano (-3.4). Al hacer los cambios con base en los valores de hidrofilicidad similares, en determinadas modalidades, la sustitución de aminoácidos cuyos valores de hidrofilicidad están dentro de ±2 se incluye, en otras modalidades, aquellos que están dentro de ±1 se incluyen, y todavía en otras modalidades, aquellos dentro de ±0.5 se incluyen. En algunos casos, alguien también puede identificar epítopos de secuencias de aminoácidos primarias en la base de hidrofilicidad. Estas regiones también se refieren como "regiones de núcleo epitópicas." Las sustituciones conservadoras de aminoácidos ejemplares se establecen en la Tabla 5.
Tabla 5 Sustituciones conservadoras de aminoácidos Un experto en la materia será capaz de determinar variantes de polipéptidos adecuados como se establece en la presente usando técnicas bien conocidas acopladas con la información proporcionada en la presente. Un experto en la técnica puede identificar áreas adecuadas de la molécula que se pueden cambiar sin destruir actividad por regiones objetivo que no se cree que son importantes para actividad. El técnico experto también será capaz de identificar residuos y ' porciones de las moléculas que se conservan entre polipéptidos similares. En modalidades adicionales, aún en áreas que pueden ser importantes para actividad biológica o para estructura puede ser objeto de sustituciones conservadoras de aminoácidos sin destruir la actividad biológica o sin afectar negativamente la estructura de polipéptido.
Adicionalmente, un experto en la técnica puede revisar estudios de función de estructura gue identifican residuos en polipéptidos similares que son .importantes para actividad o estructura. En vista de tal comparación, se puede predecir la importancia de residuos de aminoácidos en una proteina que corresponde a residuos de aminoácidos importantes para actividad o estructura en proteínas similares. Un experto en la técnica puede optar por sustituciones de aminoácido químicamente similares para tales residuos de aminoácidos importantes previstos.
Un experto -en la técnica también puede analizar la estructura tri-dimensional y secuencia de aminoácidos en relación a esa estructura en polipéptidos similares. En vista de tal información, un experto en la técnica puede predecir la alineación de residuos de aminoácidos de un anticuerpo con respecto a su estxuctura tri-dimensional. Un experto en la técnica puede elegir no hacer cambios radicales a residuos de aminoácidos previstos para estar en la superficie de la proteína, ya que tales residuos se pueden implicar en importantes interacciones con otras moléculas. Por otra parte, un experto, en la técnica puede generar variantes de prueba que contienen una sustitución de aminoácido sencillo en cada residuo de aminoácido deseado. Estas variantes se pueden luego separar por exclusión usando ensayos para señalización del tipo FGF21, (Ver los Ejemplos proporcionados en la presente) proporcionando asi información con respecto a cuales aminoácidos se pueden cambiar y cuáles no se deben cambiar. En otras palabras, con base en información recolectada de tales experimentos de rutina, un experto en la técnica puede fácilmente determinar las posiciones de aminoácido donde las . sustituciones adicionales se deben evitar ya sea solo o en combinación con otras mutaciones.
Un número de publicaciones científicas se han dedicado a la estructura secundaria de predicción. Ver, Moult, (1996) Curr. Op. in Biotech. 7:422-427; Chou et al., (1974) Biochem. 13:222-245; Chou et al., (1974) . Biochemistry 113:211-222; Chou et al., (1978) Adv. Enzymol. Relat. Areas Mol. Biol. 47: 45-148; Chou et al., (1979) Ann. Rev. Biochem. 42:251-276; y Chou et al., (1979) Biophys . J. 2_6:367-384. Por otra parte, programas de computadora están actualmente disponibles para ayudar con estructura secundaria de predicción. Un método de estructura secundaria de predicción se basa en modelado de homología. Por ejemplo, dos polipéptidos o proteínas que tienen una identidad de secuencia mayor que 30%, o similitud mayor que 40% pueden' tener topologías estructurales similares. El crecimiento de la base de datos estructural de proteina (PDB) ha proporcionado una mayor previsibilidad de estructura secundaria, incluyendo el número potencial de pliegues dentro de una estructura de polipéptido o proteína. Ver, Holm et al., (1999) Nucí. Acid. Res. 27:244-247. Se ha sugerido (Brenner . et al., (1997) Curr. Op. Struct. Biol .1_: 369-376) que hay un número limitado de pliegues en una proteína o polipéptido dado y que una vez que un número crítico de estructuras se ha resuelto, la predicción estructural se ha convertido drásticamente más precisa.
Los métodos adicionales de predicción de la estructura secundaria incluyen "formación de filamentos" (Jones, (1997) Curr. Opin. Struct. Biol. 7:377-387; Sippl et al., (1996) Structure 4_: 15-19), "análisis de perfiles" (Bowie et al., (1991) Science 25_3: 164-170; . Gribskov et al., (1990) Meth. Enzym. 183:146-159; Gribskov et al., (1987) Proc. Nat. Acad. Sci. 84: 355-4358) , y "ligadura evolutiva" (Ver, Holm, (1999) supra; y Brenner, (1997) supra) .
En algunas modalidades, sustituciones de aminoácido se realizan: (1) reduce susceptibilidad a la proteolisis, (2) reduce susceptibilidad a- oxidación, (3) altera afinidad de enlace para formar complejos de proteína, (4) alterar afinidades de enlace de ligando o antígeno, y/o (4) confiere o modifica otras propiedades fisicoquímicas o funcionales en tales polipéptidos . Por ejemplo, sustituciones de aminoácido sencillas o múltiples (en determinadas modalidades, sustituciones conservadoras de aminoácidos) se pueden hacer en la secuencia que se presenta naturalmente. Las sustituciones se pueden hacer en esa porción del anticuerpo que se encuentra fuera de los dominios que forman contactos intramoleculares). En tales modalidades, las sustituciones, conservadoras de aminoácidos se ' pueden usar que no cambian sustancialmente las características estructurales de la secuencia precursora (por ejemplo, uno o más aminoácidos de reemplazo que no interrumpen la estructura secundaria que caracteriza la proteína de enlace a antíqenos precursora o nativa) . Los ejemplos de estructuras secundarias y terciarias de polipéptido reconocidas en la técnica se describen en Proteíns , Structures and Molecular Principies (Creiqhton, Ed.), 1984, W. H. New York: Freeman and Company; Introduction to Protein Structure (Branden y Tooze, eds.), 1991, New York: Garland Publishing; and Thornton et al., (1991) Nature 354:105, que cada uno se incorpora en la presente como referencia .
Las variantes de anticuerpo adicionales preferidas incluyen variantes de cisteína en donde uno o más residuos de cisteína en la secuencia de aminoácidos precursora o nativa se eliminan de o sustituyen con otro aminoácido (por ejemplo, serina) . Las varaintes de cisteina son útiles, inter alia cuando los anticuerpos se deben replegar en una conformación biológicamente activa. Las variantes de cisteina pueden tener menos residuos de cisteina que el anticuerpo nativo, y típicamente tienen un número par para minimizar interacciones que resultan de cisteínas desapareadas.
Las cadenas pesadas y ligeras, dominios de regiones variables y CDRs que se describen se pueden usar para preparar polipéptidos que contienen una región de enlace a antígenos que puede específicamente enlazar (i) ß-Klotho; (ii) FGFRlc, FGFR2c, FGFR3c o FGFR4; o (iii) un complejo que comprende ß-Klotho y uno de FGFRlc, FGFR2c, FGFR3c, y FGFR4 y puede inducir señalización del tipo FGF21. Por ejemplo, uno o más de los CDRs enlistados en las Tablas 3 y 4 se pueden incorporar en una molécula (por ejemplo, un polipéptido) covalentemente o no covalentemente para hacer una inmunoadhesión. Una inmunoadhesión puede incorporar las CDR(s) como parte de una cadena de polipéptidos más larga, puede covalentemente ligar la CDR(s) a otra cadena de polipéptidos, o puede incorporar las CDR(s) no covalentemente. Las CDR(s) permiten la inmunoadhesión para enlazar específicamente a un antígeno particular de interés (por ejemplo, (i) ß- lotho; (ii) FGFRlc, FGFR2c, FGFR3c o FGFR4; o (iii) un complejo que comprende ß-Klotho y uno de FGFRlc, FGFR2c, FGFR3c, y FGFR4 o un epitopo al respecto) .
Las cadenas pesadas y ligeras, dominios de regiones variables y CDRs que se describen se pueden usar para preparar polipéptidos que contienen una región de enlace a antigenos que puede específicamente enlazar (i) ß-Klotho; (ii) FGFRlc, FGFR2c, FGFR3c o FGFR4; o (iii) un complejo que comprende ß-Klotho y uno de FGFRlc, FGFR2c, FGFR3c, y FGFR4 y puede inducir señalización del tipo FGF21. Por ejemplo, uno o más de los CDRs enlistados en las Tablas 3 y 4 se pueden incorporar en una molécula (por ejemplo, un polipéptido) que es estructuralmente similar a un anticuerpo "medio" que comprende la cadena pesada, la cadena ligera de una proteína de enlace a antígenos emparejada con. un fragmento Fe de manera que la región de enlace¦ a antígenos es monovalente (tipo un fragmento Fab) pero con una porción Fe dimérica.
Los miméticos (por ejemplo, "miméticos de péptido" o "péptidomiméticos" ) basados en los dominios de región variable y CDRs que se describen en la presente también se proporcionan. Estos análogos pueden ser péptidos, no péptidos o combinaciones de regiones de péptido y no péptido. Fauchere, 1986, Adv. Drug Res. 1^:29; Veber and Freidinger, 1985, TINS p. 392; and Evans et al., 1987, J. Med. Chem. 3_0:1229, que se incorpora en la presente como referencia para cualquier propósito. Los miméticos de péptido que son estructuralmente similares a péptidos terapéuticamente útiles se pueden usar para producir un efecto terapéutico o profiláctico similar. Tales compuestos se desarrollan frecuentemente con la ayuda de modelado molecular computarizado . Generalmente, peptidomiméticos son proteínas que son estructuralmente similares a un anticuerpo que exhibe una actividad biológica deseada, tal como se muestra la capacidad para enlazar específicamente (i) ß-Klotho; (ii) FGFRlc, FGFR2c, FGFR3c D FGFR4; o (iii) un complejo que comprende ß-Klotho y uno de FGFRlc, FGFR2c, FGFR3c, y FGFR4, pero tiene uno o más ligaduras de péptido opcionalmente reemplazadas por una ligadura seleccionada de: -CH2NH-, -CH2S-, -CH2-CH2-, -CH-CH-(cis y trans), -COCH2-, -CH(OH)CH2-, y -CH2SO-, por métodos bien conocidos en la técnica. La sustitución sistemática de uno o más aminoácidos de una secuencia de consenso con un D-aminoácido del mismo tipo (por ejemplo, D-lisina en lugar de L-lisina) se pueden usar en determinadas modalidades para generar proteínas más estables. Además, los péptidos restringidos que comprenden una secuencia de consenso o una variación de secuencia de consenso sustancialmente idéntica se puede generar por métodos conocidos en la técnica (Rizo and Gierasch, 1992, Ann. Rev. Biochem. _61_:387), incorporada en la presente como referencia) , por ejemplo, al agregar residuos de cisteina internos capaces de formar puentes de bisulfuro intramoleculares que ciclizan el péptido.
Los derivados de las proteínas de enlace a antígenos que enlazan específicamente (i) ß-Klotho; (ii) FGFRlc, FGFR2c, FGFR3c o FGFR4; o (iii) un complejo que comprende ß-Klotho y uno de FGFRlc, FGFR2c, FGFR3c, y FGFR4 que se describen en la presente también se proporcionan'. Las proteínas de enlace a antígenos derivatizadas pueden comprender cualquier molécula o sustancia que imparte una propiedad deseada al anticuerpo o fragmento, tal como vida media incrementada en un uso particular. La proteína de enlace a antígenos derivatizada puede comprender, por. ejemplo, una porción detectable (o etiqueta) (por ejemplo, una molécula radioactiva, colorimétrica, antigénica o enzimática, una perla detectable (tal como una perla magnética o electrodensa (por ejemplo, de oro) ) , o una molécula que enlaza a otra molécula (por ejemplo, biotina o estreptavidiná) ) , una porción terapéutica o diagnóstica (por ejemplo, una porción radioactiva, citotóxica, o farmacéuticamente activa) , o una molécula que incrementa la conveniencia de la proteína de enlace a antígenos para un uso particular (por ejemplo, administración a un sujeto, tal como un sujeto humano, u otros usos in vivo o in vitro) . Los ejemplos de moléculas que se pueden usar para derivar una proteina de enlace a antígenos incluye albúmina (por ejemplo, albúmina de suero humano) y polietilen glicol (PEG). Derivados ligados a albúmina y PEGilados de proteínas de enlace a antígenos se pueden preparar usando técnicas bien conocidas en el arte. Ciertas proteínas de enlace a antígenos incluyen un polipéptido de cadena sencilla PEGilada como se describe en la presente. En una modalidad, la proteína de enlace a antígenos se conjuga o de otra manera liga a transtiretina (TTR) o una variante TTR. El TTR o variante TTR se puede modificar químicamente con, por ejemplo, un químico seleccionado del grupo que consiste en dextrano, poli (n-vinil . pirrolidona) , polietilenglicoles, homopolímeros de propi'lenglicol, óxido de polipropileno/co-polímeros de óxido de etileno, polioles de polioxietilado y alcoholes de polivinilo.
Otros derivados incluyen conjugados covalente o de agregaciones de las proteínas de enlace a antígenos que enlazan específicamente (i) ß-Klotho; (ii) FGFRlc, FGFR2c, FGFR3c o FGFR4; o (iii) un complejo que comprende ß- lotho y uno de FGFRlc, FGFR2c, FGFR3c, y FGFR4 que se describen en la presente con otras proteínas o polipéptidos, tales como por expresión de proteínas de fusión recombinante que comprenden polipéptidos heterólogos fusionados a la terminal N o terminal C de una proteína de enlace a antígenos que induce señalización del tipo FGF21. Por ejemplo, el péptido conjugado puede ser una señal heteróloga (o líder) polipéptido, por ejemplo, el ' líder de factor alfa de levadura, o un péptido tal como una etiqueta de epítopo. Una proteína de fusión que contiene proteína de enlace a antígenos de la presente descripción puede comprender péptidos agregados para facilitar la purificación o identificación de una. proteína de enlace a antígenos que enlaza específicamente (i) ß-Klotho; (ii) FGFRlc, FGFR2c, FGFR3c o FGFR4; o (iii) un complejo que comprende ß-Klotho y uno de FGFRlc, FGFR2c, FGFR3c, y FGFR4 (por ejemplo, una etiqueta poli-His) y que puede inducir señalización del tipo FGF21. Una proteína de enlacé a antígenos que enlaza específicamente (i) ß-Klotho; (ii) FGFRlc, FGFR2c, FGFR3c o FGFR4; o (iii) un complejo que comprende ß-Klotho y - uno de FGFRlc, FGFR2c, FGFR3c, y FGFR4 también se puede ligar al péptido FLAG como se describe en Hopp et al., 1988, Bio/Technology 6:1204;. y patente de Estados Unidos No. 5,011,912. El péptido FLAG es altamente antigénico y proporciona un epitopo reversiblemente enlazado por un anticuerpo monoclonal específico (mAb) , que permite análisis rápido y purificación fácil de proteína recombinante expresada. Los reactivos útiles para preparar proteínas de fusión en las cuales el péptido FLAG se fusiona a un polipéptido dado están comercialmente disponibles (Sigma, St. Louis, MO) .
Los multímeros' que comprenden una o más proteínas de enlace a antígenos que enlazan específicamente (i) ß-Klotho; (ii) FGFRlc, FGFR2c, FGFR3c o FGFR4; o (iii) un complejo que comprende ß-Klotho y uno de FGFRlc, FGFR2c, FGFR3c, y FGFR4 forma otro aspecto de la presente descripción. Los multímeros pueden tomar la forma de.dímeros ligados covalentemente o no ligados covalentemente, trímeros, o multímeros superiores. Los multímeros que comprenden dos o más proteínas de enlace a antígenos que enlazan (i) ß-Klotho; (ii) FGFRlc, FGFR2c , FGFR3c o FGFR4; o (iii) un complejo que comprende ß-Klotho y uno de FGFRlc, FGFR2c, FGFR3c, y FGFR4 y que pueden inducir señalización del tipo FGF21 se contemplan para usar como terapéuticos, diagnósticos y para otros usos también, con un ejemplo de tal multímero que es un homodímero. Otros multímeros ejemplares incluyen heterodímeros , homotrímeros, heterotrímeros, homotetrámeros, heterotetrámeros, etc.
Una modalidad se dirige a multímeros que comprenden múltiples proteínas de enlace a antígenos que enlazan específicamente (i) ß-Klotho; (ii) FGFRlc, FGFR2c, FGFR3c o FGFR4; o (iii) un complejo que comprende ß-Klotho y uno de FGFRlc, FGFR2c, FGFR3c, y FGFR4 ligado por medio de interacciones covalentes o no covalentes entre porciones de péptido fusionadas a una proteina de enlace a antigenos que enlaza específicamente (i) ß-Kloto; (ii) FGFRlc, FGFR2c, FGFR3c o FGFR4; o (iii) un complejo que comprende ß-Klotho y uno de FGFRlc, FGFR2c, FGFR3c, y FGFR4. Tales péptidos pueden ser ligaduras de péptido (espaciadores), o péptidos que tienen la propiedad de multimerización de promoción. Cremalleras de leucina y ciertos polipéptidos derivados de anticuerpos están entre los péptidos que pueden promover multimerización de proteínas de enlace a antígenos enlazadas a ello, como se describe en más detalle en la presente.
En modalidades particulares, los multímeros comprenden desde dos hasta cuatro proteínas de enlace a antígenos que enlazan (i) ß-Klotho; (ii) FGFRlc, FGFR2c, FGFR3c o FGFR4; o (iii) un complejo que comprende ß-Klotho y uno de FGFRlc, FGFR2c, FGFR3c, y FGFR4. Las porciones de proteína de enlace a antígenos del multímero pueden ser en cualquiera de las formas descritas arriba, por ejemplo, variantes o fragmentos. Preferiblemente, los multímeros comprenden proteínas de enlace a antígenos que tienen la capacidad para enlazar específicamente (i) ß-Klotho; (ii) FGFRlc, FGFR2c, FGFR3c o FGFR4; o (iii) un complejo que comprende ß-Klotho y uno de FGFRlc, FGFR2c, FGFR3c, y FGFR4.
En una modalidad, un oligómero se prepara usando polipéptidos derivados de inmunoglobulinas . La preparación de proteínas de fusión que comprenden ciertos polipéptidos heterólogos fusionados a varias porciones de polipéptidos derivados de anticuerpo (incluyendo el dominio Fe) se ha descrito, por ejemplo, por Ashkenazi et al., (1991) Proc. Nati. Acad. Sci. USA 88:10535; Byrn et al., (1990) Nature 3 ?-.6??; and Hollenbaugh et al., 1992 "Construction of Immunoglobulin Fusión Proteins", in Current Protocols in Immunology, Suppl . 4, pages 10.19.1-10.19.11.
Una modalidad comprende un dímero que comprende dos proteínas de fusión creadas al fusionar una proteína de enlace' a antígenos que enlaza específicamente (i) ß-Klotho; (ii) FGFRlc, FGFR2c, FGFR3c o FGFR4; o (iii) un complejo que ' comprende ß-Klotho y uno de FGFRlc, FGFR2c, FGFR3c, y FGFR4 a la región Fe de un anticuerpo. El dímero se puede hacer por, por ejemplo, insertar una fusión de gen que codifica la proteína de fusión en un vector de expresión apropiado, que expresa la fusión de gen en células hospederas transformadas con el vector de expresión recombinante, y permitir la proteína de fusión expresada para ensamblar como las moléculas de anticuerpo, con lo cual enlaces de bisulfuro de intercadena se forman entre las porciones Fe para proporcionar el dímero.
El término "polipéptido Fe" como se usa en la presente incluye formas nativas y de muteina de polipéptidos derivados de la región Fe de un anticuerpo. Las formas truncadas de tales polipéptidos que contienen la región de articulación que promueve la dimerización también se incluyen. Las proteínas de fusión que comprenden porciones Fe (y oligómeros formados de ello) ofrecen la ventaja de purificación fácil por cromatografía de afinidad sobre las columnas de Proteína A o Proteína G.
Un polipéptido Fe adecuado, descrito en solicitud PCT WO 93/10151 y Patente de Estados Unidos. No. 5,426,048 y No. 5,262,522, es un polipéptido de cadena sencilla que se extiende desde la región de articulación de terminal N hasta la terminal C nativa de la región Fe de un anticuerpo IgGl humano. Otro polipéptido Fe útil es la muteina Fe descrita en la Patente de Estados Unidos No. 5,457,035, y en Baum et al., (1994) EMBO J. 13 : 3992-4001. La secuencia de aminoácidos de esta muteina es idéntica a la de la secuencia Fe nativa presentada en la WO 93/10151, excepto que 19 aminoácidos se han cambiado de Leu a Ala, 20 aminoácidos se han cambiado de Leu a Glu, y 22 aminoácidos se han. cambiado de Gly a Ala. La muteina exhibe afinidad reducida para receptores Fe.
En otras modalidades,, la porción variable de las cadenas pesadas y/o ligeras de una proteína de enlace a antígenos tal como la descrita en la presente se puede sustituir por la porción variable de cadena pesada y/o ligera de anticuerpo.
Alternativamente, el oligómero es una proteína de fusión que comprende múltiples proteínas de. enlace a antígenos que enlazan específicamente (i) ß-Klotho; (ii) FGFRlc, FGFR2c, FGFR3c o FGFR4; o (iii) un complejo que comprende ß-Klotho y uno de FGFRlc, FGFR2c, FGFR3c, y FGFR4 , con o sin ligaduras de péptido (péptidos de espaciador) . Entre las ligaduras de péptido adecuadas se describen aquellos en la Patente de Estados Unidos. No. 4,751,180 y No. 4,935,233.
Otro método para preparar derivados oligoméricos que comprenden esas proteínas de enlace a antígenps que enlazan específicamente (i) ß-Klotho; (ii) FGFRlc, FGFR2c, FGFR3c o FGFR4; o (iii) un complejo que comprende ß-Klotho y uno de FGFRlc, FGFR2c, FGFR3C, y FGFR4 implican el uso de una cremallera de leucina. Los dominios de cremallera de leucina son péptidos que promueven la oligomerización de las proteínas en las cuales se encuentran. Las cremalleras de leucina se identificaron originalmente en diversas proteínas que enlazan ADN (Landschulz et al., (1988) Science 240 : 1759) , y desde entonces se han encontrado en una variedad de diferentes proteínas. Entre las cremalleras de leucina conocidas están péptidos que se presentan naturalmente y derivados de las mismas que d merizan o trimerizan. Los ejemplos de dominios de cremallera de leucina adecuados para producir proteínas oligoméricas solubles se describen en solicitud PC-T WO 94/10308, y la cremallera de leucina derivada de proteína D de tensoactivo pulmonar (SPD) descrita en Hoppe et al., (1994) FEBS Letters 344:191, incorporada por la presente como referencia. El uso de una cremallera de leucina modificada que permiten trimerización estable de una proteína heterologa fusionada al mismo se describe en Fanslow et al., (1994) Semln. Immunol. 6: 267-278. En un enfoque, las proteínas de fusión recombinantes que comprenden un fragmento o derivado de proteína de enlace a antígenos que enlaza específicamente (i) ß-Klotho; (ii) FGFRlc, FGFR2c, FGFR3c o FGFR4; o (iii) un complejo que comprende ß-Klotho y uno de FGFRlc, FGFR2c, FGFR3c, y FGFR4 se fusiona a un péptido de cremallera de leucina, se expresan en células hospederas adecuadas, y los fragmentos o derivados de proteína que enlaza a antígenos oligoméricos solubles que forman se recubren del sobrenadante de cultivo.
En determinadas modalidades, la proteína de enlace a antígenos tiene un KD (afinidad de enlace de equilibrio) de menos de 1 pM, 10 p , 100 pM, 1 nM, 2 nM, 5 nM, 10 nM, 25 n o 50 nM.
En otro aspecto la descripción actual proporciona una proteína de enlace a antígenos que tiene una vida media de al menos un día in vitro o in vivo (por ejemplo, cuando se administra a un sujeto humano) . En una modalidad, la proteína de enlace a antígénos tiene una vida media de al menos tres días. En otra modalidad, el anticuerpo o porción del mismo tiene una vida media de cuatro días o más tiempo. En otra modalidad, el anticuerpo o porción del mismo tiene una vida media de ocho días o más tiempo. En otra modalidad, el anticuerpo o porción del mismo tiene una vida media de diez días o más tiempo. En otra modalidad, el anticuerpo o porción del mismo tiene una vida media de once días o más tiempo. En otra modalidad, el anticuerpo o porción del mismo tiene una vida media de quince días o más tiempo. En otra modalidad, el anticuerpo o porción ' que enlaza antigeno del mismo se derivatiza o modifica de tal manera que tiene una vida media de más tiempo como se compara con el anticuerpo no derivatizado o no modificado. En otra modalidad, una proteina de enlace a antígénos que enlaza específicamente (i) ß-Klotho; (ii) FGFRlc, FGFR2c, FGFR3c o FGFR4; o (iii) un complejo que comprende ß-Klotho y uno de FGFRlc, FGFR2c, ' FGFR3c, y FGFR4 contiene mutaciones de punto para incrementar vida media de suero, tal como se describe en WO 00/09560, publicado el 24 de febrero 2000, incorporado como referencia.
Glicosilación Una proteína de enlace antígénos que enlaza específicamente (i) ß-Klotho; ( FGFRlc, FGFR2C, FGFR3c O FGFR4; o (iii) un complejo que' comprende ß-Klotho y uno de FGFRlc, FGFR2c, FGFR3c, y FGFR4 puede tener un patrón de glicosilación que es diferente o alterado del que se encontró en las especies nativas. Como se conoce en la técnica, los patrones de glicosilación pueden depender tanto de la scuencia de la proteina (por ejemplo, la presencia o ausencia de residuos de aminoácidos de glicosilación particular, descritos abajo) , o el organismo o célula hospedera en la cual la proteina se produce. Los sistemas de expresión particular se discuten abajo.
La glicosilación de · polipéptidos es típicamente ya sea ligada a o ligada a O. El ligado a N se refiere al enlace de la porción de carbohidrato a la cadena lateral de un residuo de asparagina. Las secuencias de tri-péptido asparagina-X-serina y asparagina-X-treonina, donde X es cualquier aminoácido excepto prolina, son las secuencias de reconocimiento para enlace enzimático de la porción de carbohidrato a la cadena lateral de asparagina. Así, la presencia de cualquiera de estas secuencias de tri-péptido en un polipéptido crea un sitio de glicosilación potencial. La glicosilación ligada a 0 se refiere al enlace de uno de los azúcares N-acetilgalactosamina, galactosa, o xilosa, a un ácido hidroxiamino, más comúnmente serina o treonina, a través de 5-hidroxiprolina o 5-hidroxilisina se puede también usar.
La adición de sitios de glicosilación a la proteina¦ de enlace a antigenos se realiza convenientemente al alterar la secuencia de aminoácidos tal que esto contiene una o más de las secuencias de tri-péptido. descritas arriba (para sitios de glicosilación ligados a N) . La alteración también se puede hacer por la adición de, o sustitución por, uno o más residuos de serina o treonina a la secuencia de partida (para sitios de glicosilación ligados a 0) . Para mayor facilidad, la secuencia de aminoácidos de proteina que enlaza a antigenos se puede alterar a través de cambios en el nivel de ADN, particularmente por la -mutación del ADN que codifica el polipéptido objetivo en bases preseleccionadas tal que los codones se generan que se traducirán en los aminoácidos deseados.
Otros medios para incrementar el número de porciones de carbohidrato en la proteina de enlace a antigenos es por acoplamiento químico o enzimático de glucósidos a la proteína. Estos procedimientos tienen la ventaja de que no requieren producción de la proteína en una célula hospedera que tiene capacidades de glicosilación para glicosilación ligada a N y 0. Dependiendo del modo de acoplamiento usado, los azúcares se pueden enlazar a (a) arginina e histidina, (b) grupos de carboxilo libre, (c) grupos de sulfhidrilo libre tales como aquellos de cisteína, (d) grupos de hidroxilo libre tales como aquellos de serina, treonina, o hidroxiprolina, (e) residuos aromáticos tales como aquellos de fenilalanina, tirosina, o tripto'fan, o (f) el grupo amida de glutamina. Estos métodos se describen en O 87/05330 y en Aplin and riston, (1981) CRC Crit. Rev. Biochem., pp . 259-306.
La remoción de porciones de carbohidrato presentes en la proteina de enlace a antigenos de partida se puede realizar químicamente o enzimáticamente . La deglicosilación química requiere exposición de . la proteína al ácido trifluorometansulfónico de compuesto, o un compuesto equivalente. Este tratamiento resulta en el desdoblamiento de la mayoría o todos los azúcares excepto el azúcar de ligado (N-acetilglucosamina o N-acetilgalactosamina) , mientras se deja el polipéptido intacto. La deglicosilación química se describe por Hakimuddin et al., (1987) Arch. Biochem. Biophys. 259:52 y por Edge et al., (1981) Anal. Biochem. 118:131. El desdoblamiento enzimático de porciones de carbohidrato en polipéptidos se puede alcanzar por el uso de una variedad de endo- y exo-glicosidasas como se describe por Thotakura et al., (1987) Meth. Enzymol. 138:350. La glicosilación en los sitios de glicosilación potencial se pueden prevenir por el uso del compuesto tunicamicina como se describe por Duskin et al., (1982) J. Biol. Chem. 257:3105.
Los bloques tunicamicina la formación de ligaduras de proteina-N-glicosida .
Por lo tanto, los aspectos de la presente descripción incluyen variantes de glicosilación de proteínas de enlace a antígenos gue enlazan específicamente (i) ß-Klotho; (ii) FGFRlc, FGFR2c, FGFR3c o FGFR4; o (iii) un complejo que comprende ß-Klotho y uno ' de FGFRlc, FGFR2c, FGFR3c, y FGFR4 en donde el número y/o tipo de sitios de glicosilación se ha alterado comparado con las secuencias de aminoácidos del polipéptido precursor. En determinadas modalidades, variantes de proteína de anticuerpo comprenden a mayor o menor número de sitios de glicosilación ligados a N que el anticuerpo nativo. Un sitio dé glicosilación ligado a. N se caracteriza por la secuencia: Asn-X-Ser o Asn-X-Thr, en donde el residuo de aminoácido designado como X puede ser cualquier residuo de aminoácido excepto prolina. La sustitución de residuos de aminoácidos para crear esta secuencia proporciona un nuevo sitio potencial para la adición de una cadena de carbohidrato ligado a N. Alternativamente, las sustituciones que eliminan o alteran esta secuencia prevendrán la adición de una cadena de carbohidrato ligado a N presente en el polipéptido nativo. Por ejemplo, la glicosilación se puede reducir por la eleiminación de un Asn o al sustituir el Asn con un aminoácido diferente. En otras modalidades, uno o más sitios ligados a N nuevos se crean. Los anticuerpos típicamente tienen un sitio de glicosilación ligado a N en la región Fe.' Etiquetas y Grupos Efectores ' En algunas modalidades, una proteína de enlace a antígenos que enlaza específicamente (i) ß-Klotho; (ii) FGFRlc, FGFR2c, FGFR3c o FGFR4 o (iii) un complejo que comprende ß-Klotho y uno de FGFRlc, FGFR2c, FGFR3c, y FGFR4 comprende uno o más etiquetas. El término "grupo de etiquetado" o "etiqueta" significa cualquier etiqueta detectable. Los ejemplos de grupos de etiquetado adecuados incluyen, pero no se limitan a, lo siguiente: radioisótopos o radionucleidos (por ejemplo, 3H, 14C, 15N, 35S, 90Y, 99Tc, mIn, 1251 , 131I), grupos fluorescentes [por ejemplo, FITC, rodamina, fósforos de lantánido) , grupos, enzimáticos (por ejemplo, peroxidasa de raíz de rábano, ß-galactosidasa, luciferasa, fosfatasa alcalina) , grupos quimioluminiscentes, grupos de biotinilo, o epítopos de polipéptido predeterminado reconociodos por un reportero secundario (por ejemplo, secuencias pares de cremallera de leucina, sitios de enlace para anticuerpos secundarios, dominios que enlazan metal, etiquetas de epítopo) . En algunas modalidades, el grupo de etiquetado se acopla a la proteína de enlace a antígenos por medio de articulaciones del espaciador de diversas longitudes para reducir obstáculo estérico potencial. Diversos métodos para etiquetar proteínas se conocen en la técnica y se pueden usar como se ve en el ajuste.
El término "grupo efector" significa cualquier grupo acoplado a una proteína de enlace a antígenos que enlaza específicamente un (i) ß-Klotho; (ii) FGFRlc, FGFR2c, FGFR3c o FGFR4 ; o (iii) un complejo que' comprende ß-Klotho y uno de FGFRlc, FGFR2c, FGFR3c, y FGFR4 que actúa como un agente citotóxico. Los ejemplos para grupos efectores adecuados son radioisótopos o radionucleidos (por ejemplo, 3H, 14C, 15N, 35S, 90Y, 9Tc, inIn, 125I, 131I) . Otros grupos adecuados incluyen toxinas, grupos terapéuticos, o grupos quimioterapéuticos . Los ejemplos de- grupos adecuados incluyen caliqueamicina, auristatinas , geldanamicina y cantansina. En algunas modalidades, el grupo efector se acopla a la proteína de enlace a antígenos por medio de articulaciones del espaciador de diversas longitudes para reducir obstáculo estérico potencial.
En general, las etiquetas caen en una variedad de clases, dependiendo del ensayo en el cual han de detectarse: a) etiquetas isotópicas, que pueden ser radioactivas o isótopos pesados; b) . etiquetas magnéticas (por ejemplo, partículas magnéticas) ; c) porciones activas redox; d) pigmentos ópticos; grupos enzimáticos (por ejemplo peroxidasa de raíz de rábano, ß-galactosidasa, luciferasa, fosfatasa alcalina); e) grupos biotinilados ; y f) epitopos de polipéptido predeterminado reconocidos por un reportero secundario (por ejemplo, secuencias pares de cremallera de leucina, sitios de enlace para anticuerpos secundarios, dominios que enlazan metal, etiquetas de epítopo, etc.)- En algunas modalidades, el grupo de etiquetado se acopla a la proteína de enlace a antígenos por medio de articulaciones del espaciador de diversas longitudes para reducir, obstáculo estérico potencial. Los ' diversos métodos para etiquetar proteínas se conocen en la técnica.
Las etiquetas específicas incluyen pigmentos ópticos, que incluyen, pero no se limitan a, cromóforos, fósforos y fluoróforos, con este^ último siendo- específico en muchos casos. Los fluoróforos pueden ser ya sea fluorescencia de "molécula pequeña", o fluorescencia proteinica.
Por "etiqueta · fluorescente" se entiende cualquier molécula que se puede detectar por medio de sus propiedades fluorescentes inherentes. Las etiquetas fluorescentes adecuadas incluyen, pero no se limitan a, fluoresceina, rodamina, tetrametilrodamina, eosina, eritrosina, coumarina, metil-coumarinas, pireno, verde de alacite, etilbeno, Amarillo Lucifer, Azul Cascada, Rojo Texas, IAEDANS, EDANS, BODIPY FL, LC Red 640, Cy 5, Cy 5.5, LC Red 705, verde Oregón, los pigmentos Alexa-Fluor (Alexa Fluor 350, Alexa Fluor 430, Alexa Fluor 488, Alexa Fluor 546, Alexa Fluor 568, Alexa Fluor 594, Alexa Fluor 633, Alexa Fluor 647, Alexa Fluor 660, Alexa Fluor 680), Azul Cascada-, Amarillo Cascada y R-ficoeritrina (PE) (Molecular Probes, Eugene, OR) , FITC, Rodamina, y Rojo Texas (Pierce, Rockford, IL) , Cy5, Cy5.5, Cy7 (Amersham Life Science, Pittsburgh, PA) . Pigmentos ópticos adecuados, incluyendo fluoróforos, se describen en Molecular Probes Handbook por Richard P. Haugland, expresamente incorporada en la presente como referencia.
Las Suitable etiquetas de proteina fluorescentes también incluyen, pero no se limitan a, proteina fluorescente verde, incluyendo una especie de Renilla, Ptilosarcus, o Aequorea de GFP (Chalfie et al., (1994) Science 263: 802-805) , EGFP (Clontech Labs., Inc., Número de Acceso al GenBank U55762),. proteina fluorescente azul (BFP, Quantum Biotechnologies , Inc., Quebec, Canadá; Stauber, (1998) Biotechniques 24 : 62-471; Heim et al., (1996) Curr. Biol. 6:178-182), proteína fluorescente amarilla mejorada (EYFP, Clontech Labs., Inc.), luciferasa (Ichiki et al., (1993) J. Immunol. 150 : 5408-5417 ) , ß galactosidasa (Nolan et al., (1988) Proc. Nati. Acad. Sci . U.S. A. 85:2603-2607) y Renilla ¦ ( 092/15673, WO95/07463, WO98/14605, W098/26277, WO99/49019, Patentes de Estados Unidos No. 5292658, No. '5418155, No. 5683888, No. 5741668, No. 5777079, No. 5804387, .No. 5874304, No. 5876995, No. 5925558).
Preparación de Proteínas de Enlace a Antigenos Los anticuerpos no humanos que se proporcionan pueden ser, por ejemplo, derivados de cualquier animal que produce anticuerpo, tal como ratón, rata, conejo, cabra, burro, o primate no humano (tal como mono (por ejemplo, mono cynomolgus o rhesus) o simio (por ejemplo, chimpancé) ) .¦ Los anticuerpos no humanos se pueden usar, por ejemplo, en cultivo celular in vitro y aplicaciones basadas en cultivo celular, o cualquier otra aplicación donde una respuesta inmunitaria al anticuerpo no ocurre o es insignificante, se puede prevenir, no es un problema, o se desea. En determinadas modalidades, los anticuerpos se pueden producir al inmunizar con ß-Klotho de longitud completa, FGFRlc, FGFR2c, FGFR3c o FGFR4 (Ejemplo 1), con el dominio extracelular de ß-Klotho, FGFRlc, FGFR2c, FGFR3c o FGFR4 (Ejemplo 2), o dos de ß-Klotho, FGFRlc, FGFR2c, FGFR3c y FGFR4 (Ejemplo 1), con células completas que expresan FGFRlc, ß-Klotho o tanto FGFRlc como ß-Klotho (Ejemplo 1 y 3) , con membranas preparadas de células que expresan FGFRlc, ß-Klotho o tanto FGFRlc como ß-Klotho (Ejemplo 1 y 3) , con proteínas de fusión, por ejemplo, fusiones Fe que comprenden FGFRlc, ß-Klotho ' o FGFRlc y ß-Klotho (o dominios extracelulares del mismo) fusionadas a Fe (Ejemplo 2 y 3) , y otros métodos conocidos en la técnica, por ejemplo, como se describe en los Ejemplos presentados en la presente. Alternativamente, ciertos anticuerpos no humanos se pueden elevar al inmunizar con aminoácidos que son segmentos de uno o más de ß-Klotho, FGFRlc, FGFR2c, FGFR3c o FGFR4 que forman parte del epitopo al cual ciertos anticuerpos proporcionados en la presente enlazan. Los anticuerpos pueden ser policlonales, monoclonales , o se pueden sintetizar en células hospederas por expresión de ADN recombinante .
Completamente los anticuerpos humanos se pueden preparar como se describe arriba al inmunizar animales transgénicos que contienen lugares de inmunoglobulina humana o al seleccionar una biblioteca de despliegue de fago que expresa un repertorio de anticuerpos humanos.
Los anticuerpos monoclonales (mAbs) se pueden producir por una variedad de técnicas, incluyendo metodología monoclonal de anticuerpo convencional, por ejemplo, la técnica de hibridización celular somática estándar de Kohler and Milstein, (1975) Nature 256: 495. Alternativamente, otras técnicas para producir anticuerpos monoclonales se pueden emplear, por ejemplo, la transformación viral u oncogénica de B-linfocitos . Un sistema animal adecuado para preparar hibridomas es el sistema murino, que es un procedimiento muy bien establecido. Los protocolos de inmunización y técnicas para el aislamiento de esplenocitos inmunizados para fusión se conocen en la técnica. Para tales procedimientos, las células B de ratones inmunizados se fusionan con un compañero de fusión inmortalizado adecuado, tal como linea celular de mieloma de murino. Si se desea, las ratas u otros mamíferos además se pueden inmunizar en lugar de ratones y células B de tales animales se puede .fusionar con la línea celular de mieloma de murino para formar hibridomas. Alternativamente, una línea celular de mieloma de una fuente diferente a ratón se pueden usar. Los procedimientos de fusión para hacer hibridomas también son bien conocidos. La tecnología SLAM también se puede emplear en la producción de anticuerpos.
Los anticuerpos de cadena sencilla que se proporcionan se pueden formar al ligar fragmentos (región Fv) de dominio variable de cadena pesada y ligera por medio de un puente de aminoácido (ligadura de péptido ' corto) , que resulta en una cadena de polipéptido sencillo. Tales Fvs de cadena sencilla (scFvs) se pueden preparar al fusionar ADN que codifica una ligadura de péptido entre los ADN que codifican los dos polipéptidos de dominio variable (VL y VH) . Los polipéptidos resultantes pueden plegarse de nuevo en ellos mismos para formar monómeros que enlazan antígenos, o pueden formar multimeros (por ejemplo, dímeros, trímeros, o tetrámeros), dependiendo de la longitud de una ligadura flexible entre los dos dominios variables (Kortt et al., (1997) Prot. Eng. 10:423; Kortt et al., (2001) Biomol. Eng. 18:95-108). Al combinar diferente polipéptidos que comprenden VL y VH, se pueden formar scFvs multiméricos que enlazan a diferentes epítopos (Kriangkum et al., (2001) Biomol. Eng. 18 : 31-40) . Las técnicas desarrolladas para la producción de anticuerpos de cadena sencilla incluyen aquellas descritas en Patente de E.U.A. No. 4,946,778; Bird, (1988) Science 242:423; Huston et al., (1988) Proc. Nati. Acad. Sci. U.S. A. 85:5879; Ward et al., (1989) Nature 334': 544, de Graaf et al., (2002) Methods Mol Biol. 178 : 379-387. Los anticuerpos de cadena sencilla derivados de anticuerpos proporcionados en la presente incluyen, pero no se. limitan a scFvs que comprende las combinaciones de dominio variable de las regiones variables de cadena pesada y ligera descritas en la Tabla 2, o combinaciones de dominios variables de cadena pesada y ligera que incluyen CDRs descritos en las Tablas 3 y 4.
Los anticuerpos proporcionados, en la presente que son de una subclase se pueden cambiar a anticuerpos de una diferente subclase usando métodos de conmutación de subclase. Así, los anticuerpos IgG se pueden derivar de un anticuerpo IgM, por ejemplo, y vice versa. Tales técnicas permiten la preparación de nuevos anticuerpos que poseen las propiedades de enlace de antigeno de un anticuerpo dado (el anticuerpo precursor) , pero también exhiben propiedades biológicas asociadas con un anticuerpo isotipo o subclase diferente del anticuerpo precursor. Las técnicas de ADN recombinante se pueden emplear. El ADN clonado que codifica polipéptidos de anticuerpo particular se puede emplear en tales procedimientos, por ejemplo, ' ADN que codifica el dominio constante de un anticuerpo del isotipo deseado. Ver, por ejemplo, Lantto et al., (2002) Methods Mol. Biol. 178 : 303-316.
En consecuencia, los anticuerpos que se proporcionan incluyen aquellos que ' comprenden, por ejemplo, las combinaciones de dominio variable descritas, supra . , que tienen un isotipo deseado (por ejemplo, IgA, IgGl, IgG2, IgG3, IgG4, IgE, y IgD) así como fragmentos Fab o F(ab')2 del mismo. Por otra parte, · si un IgG4 se desea, se puede también desear para introducir una mutación de punto (CPSCP->CPPCP (SEQ ID NOS 380-381, respectivamente, en orden de aparición) ) en la región de articulación como se describe en Bloom et al., (1997) Protein Science ¡6:407, incorporado como referencia en la presente) para aliviar una tendencia para formar enlaces bisulfuro de cadena intra-H que pueden conducir a heterogeneidad en los anticuerpos IgG .
Por otra parte, las técnicas para derivar anticuerpos que tienen diferentes propiedades (esto es, diversas afinidades para el ántigeno al cual se unen) también se conocen. Una de estas técnicas, denominadas como arrastre de cadena, implica exhibir repertorios de gen de dominio variable de inmunoglobulina en la superficie de bacteriófago filamentoso, frecuentemente denominados como despliegue de fago. El arrastre de cadena se ha usado para preparar anticuerpos de alta ' afinidad al 2-feniloxazol-5-ona de hapteno, como se describe por Marks et al., (1992) BioTechnology 10:779.
Las modificaciones conservadoras se pueden hacer a las regiones variables de cadena pesada y ligera descritas en la Tabla 2, o las CDRs descritas en las Tablas 3A y 3B, 4A y 4B, y Tabla 6C, infra (y modificaciones correspondientes a los ácidos nucleicos de codificación) para producir una proteina de enlace a antigenos que tienen características funcionales y bioquímicas. Los métodos para alcanzar tales modificaciones se describen arriba.
Las proteínas de enlace a antígenos que enlazan específicamente uno o más de (i) ß-Klotho; (ii) FGFRlc, FGFR2c, FGFR3c o FGFR4 ; o (iii) un complejo que comprende ß-Klotho y uno de FGFRlc, FGFR2c, FGFR3c, y FGFR4 se pueden además modificar en diferentes formas. Por ejemplo, si se van a usar para propósitos terapéuticos, se pueden conjugar con polietilen glicol (PEGilado) para prolongar la vida media del suero o para aumentar el suministro de proteína. Alternativamente, la región . V de los anticuerpos objeto o fragmentos del mismo se puede fusionar con la región Fe de una molécula de anticuerpo diferente. La región Fe usada para este propósito se puede modificar dé modo que no se enlaza el complemento, reduciendo así la probabilidad de inducir lisis celular en el paciente cuando la proteína de fusión se usa como un agente terapéutico. Además, los anticuerpos objeto o fragmentos funcionales del mismo se pueden conjugar con albúmina de suero humano para aumentar la vida media del suero del anticuerpo o fragmento del mismo. Otro compañero de fusión útil para las proteínas de enlace a antígenos o fragmentos del mismo es transtiretina (TTR) . La TTR tiene la capacidad para formar un tetrámero, así una proteína de fusión anticuerpo-TTR puede formar un anticuerpo multivalente que puede incrementar su avidez de enlace.
Alternativamente, modificaciones sustanciales en las características funcionales y/o químicas de las proteínas de enlace a antígenos descritas en la presente se pueden alcanzar al crear sustituciones en la secuencia de aminoácidos de las cadenas pesadas y ligeras que difieren significativamente en su efecto sobre el mantenimiento (a) la estructura del armazón' molecular en el área de la sustitución, por ejemplo, como una hoja o conformación helicoidal, (b) la carga o hidrofobicidad de la molécula en el sitio objetivo, o (c) el volumen de la cadena lateral. Una "sustitución de aminoácido conservadora" puede implicar una sustitución de un residuo de aminoácido nativo con un residuo no-nativo que tiene, poco o ningún efecto en la polaridad o carga del residuo de aminoácido en esa posición. Ver, Tabla 5, supra. Por otra parte, cualquier residuo nativo en el polipéptido se puede también sustituir con alanina, como se ha descrito previamente para mutagenesis de exploración de alanina.
Las sustituciones de aminoácido (ya sea conservadora o no conservadora) de los anticuerpos objeto se pueden implementar por aquellos expertos en la técnica al aplicar técnicas de rutina. Las sustituciones de- aminoácido se pueden usar para identificar importantes residuos de los anticuerpos proporcionados en la presente, o para incrementar o disminuir la afinidad de estos anticuerpos para uno o más de (i) ß-Klotho; (ii) FGFRlc, FGFR2c, FGFR3c o FGFR4; o (iii) un complejo que comprende ß-Klotho y uno de FGFRlc, FGFR2c, FGFR3c, y FGFR4 o para modificar la afinidad de enlace de otras proteínas que enlazan antigeno descritas en la presente.
Métodos para Expresar Proteínas de Enlace a Antigenos Los sistemas de expresión y constructos en la forma de plásmidos, vectores de expresión, transcripción o casetes de expresión que comprenden al menos un polinucleótido como se describe arriba también se proporcionan en la presente, también células hospederas que comprenden tales sistemas de expresión o constructos.
Las proteínas de enlace a antígenos proporcionadas en la presente se pueden preparar por cualquiera de un número de técnicas convencionales. Por ejemplo, proteínas de enlace a antígenos que enlazan específicamente (i) ß- lotho; (ii) FGFRlc, FGFR2c, FGFR3c o FGFR4 ; o (iii) un complejo que comprende ß-Klotho y uno de FGFRlc, FGFR2c, FGFR3c, y FGFR4 se puede producir por sistemas de expresión recombinantes, usando cualquier ¦ técnica conocida en el arte. Ver, por ejemplo^ Monoclonal Antibodies, Hybridomas: A New Dimensión in Biological Analyses, Kennet et al. (eds.) Plenum Press, New York (1980); and Antibodies: A Laboratory Manual, Harlow y Lañe (eds.), Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1988).
Las proteínas de enlace a antígenos se pueden expresar en líneas celulares de hibridoma (por ejemplo, en particular los anticuerpos se pueden expresar en hibridomas) o en líneas celulares diferentes a hibridomas. Los constructos de expresión que codifican los anticuerpos se pueden usar para transformar un mamífero, insecto o célula hospedera microbiana. La transformación se puede realizar usando cualquier método conocido para introducir polinucleótidos en una célula hospedera, incluyendo, por ejemplo empacar el polinucleótido en un virus o bacteriófago y traducir una célula hospedera con el constructo por transfección de procedimientos conocida en la técnica, como se ejemplifica por Patente de Estados Unidos No. 4,399,216; No. 4,912,040; No. 4,740,461; No. 4,959,455. El procedimiento de transformación óptimo usado dependerá de que tipo de célula hospedera se transforma. Los métodos para introducción de polinucleótidos heterólogos en células de mamífero son bien conocidos en la técnica e incluyen, pero no se limitan a, transfección mediada por dextrano, precipitación de fosfato de calcio, transfección mediada por polibreno, fusión de protoplasto, electroporación, encapsulación de los polinucleótidos en liposomas, mezcla de ácido nucleico cpon lipidos positivamente cargados, y microinyección directa del ADN en núcleos.
Los constructos de expresión¦ recombinantes típicamente comprenden una molécula de ácido nucleico que codifica un polipéptido que comprende, uno o más de lo siguiente: uno o más CDRs proporcionados en la presente; una región constante de cadena ligera; una región variable de cadena ligera; una región constante de . cadena pesada (por ejemplo, CH1, CH2 y/o CH3) ; y/u otra porción de andamio de una proteina de enlace a antigenos. Estas secuencias de ácido nucleico se insertan en un vector de expresión apropiado usando técnicas de ligadura estándar. En una modalidad, la región constante de cadena pesada o ligera se agrega a la terminal C de la región variable de cadena pesada o ligera especifica de anti-ß- Klotho, -FGFRlc, -FGFR2c, -FGFR3c, -FGFR4, o ß-Klotho y FGFRlc- y se liga en un vector de expresión. El vector se selecciona típicamente para ser funccional en la célula hospedera particular empleada (esto es, el vector es compatible con la maquinaria de célula hospedera, permitiendo que la amplificación y/o expresión del gen pueda ocurrir). En algunas modalidades, los vectores usados que emplean ensayos de complementacion de fragmento de proteina usando reporteros de proteína, tal como reductasa de dihidrofolato (Ver, por ejemplo-, Patente de E.U.A. No. 6,270, 964, que se incorpora por la presente como referencia) . Los vectores de expresión adecuados se pueden adquirir, por ejemplo, de Invitrogen Life Technologies o BD Biosciences (anteriormente "Clontech"). Otros vectores útiles para clonación y expresión de los anticuerpos y fragmentos incluyen aquellos descritos en Bianchi and McGrew, (2003) Biotech. Biotechnol . Bioeng. 84_: 439-44, que se. incorpora por la presente como referencia. Los vectores de expresión adecuados adicionales se discuten, por ejemplo, en Methods Enzymol., vol. 185 (D. V. Goeddel, ed. ) , 1990, New York: Academic Press.
Típicamente, vectores de expresión usados en cualquiera de las células hospederas contendrán secuencias para mantenimiento de plásmido y para clonación y expresión de secuencias de nucleótidos exógenas. Tales secuencias, colectivamente denominadas como "secuencias de acompañamiento" en determinadas modalidades típicamente incluirán uno o más' de las siguientes secuencias · de nucleótidos: un promotor, una o más secuencias de aumentador, un origen de replicación, una secuencia de terminación transcripcional , una secuencia de intrón completa que contiene un sitio de empalme de donador y receptor, una secuencia que codifica una secuencia líder para secreción de polipéptido, un sitio que enlaza ribosoma, una secuencia de poliadenilación, una región de poliligador para insertar el ácido nucleico que condifica el polipéptido a expresarse, y un elemento marcador seleccionable . Cada una de estas secuencias se discute abajo.
Opcionalmente , el vector puede contener una secuencia que codifica "etiqueta", esto es, una molécula de oligonucleótido ubicada en el extremo 5' o 3' de una secuencia que codifica una proteina de enlace a 'antígenos; la secuencia de oligonucleótido codifica polyHis (tal como hexaHis (SEQ ID NO: 382)),. u otro "etiqueta" tal como FLAG , HA (virus de influenza hemaglutinina) , o myc, para el cual los anticuerpos comercialmente disponibles existen. Esta etiqueta se fusiona típicamente al polipéptido sobre la expresión del polipéptido, y puede servir como un medio para purificación de afinidad o detección de la proteína de enlace a antígenos de la célula hospedera. La purificación de afinidad se puede realizar, por ejemplo, por cromatografía de columna usando anticuerpos contra la etiqueta como una matriz de afinidad. Opcionalmente, la etiqueta se puede remover posteriormente de la proteína de enlace a antígenos purificada por varios medios tales como usar ciertas peptidasas para desdoblamiento.
Las secuencias de acompañamiento pueden ser homologas (esto es, de la misma especie y/o cepa como la célula hospedera), heterólogas (esto es, de una especie diferente a la especie o cepa de célula hospedera), híbridas (esto es, una combinación de secuencias de acompañamiento de más de una fuente), sintéticas o nativas. Como tal, la fuente de una secuencia de acompañamiento puede ser cualquier organismo procariótico o eucariótico, cualquier organismo vertebrado o invertebrado, o cualquier planta, siempre que la secuencia de acompañamiento es funcional en, y se puede activar por, la maquinaria de célula hospedera.
Las secuencias de acompañamiento útiles en los vectores se pueden obtener por cualquiera de diversos métodos bien conocidos en la técnica. Típicamente, las secuencias de acompañamiento útiles en la presente se identificarán previamente al trazar y/o por digestión de endonucleasa de restricción y pueden así aislarse de la fuente de tejido adecuada usando las endonucleasas de restricción apropiadas. En algunos casos, la secuencia de nucleótido completa de una secuencia de. acompañamiento puede ser conocida. En este caso, la secuencia de acompañamiento se puede sintetizar usando los métodos descritos en la presente para síntesis de ácido nucleico o clonación.
Si toda c solamente una porción de la secuencia de acompañamiento se conoce, se puede obtener usando reacción de cadena de polimerasa (PCR) y/o por separación por exclusión de una biblioteca genómica con una sonda adecuada tal como un oligonucleótido y/o fragmento de. secuencia de acompañamiento del mismo u otra especie. Cuando la secuencia de acompañamiento no se conoce, un fragmento de ADN que contiene una secuencia de acompañamiento se puede aislar de un pedazo más grande de ADN que puede contener, por ejemplo, una secuencia de codificación o aún otro gene o genes. El aislamiento se puede realizar por digestión de endonucleasa de restricción para producir el fragmento de ADN adecuado seguido por el aislamiento usando purificación de gel de agarosa, cromatografía de columna Qiagen® (Chatsworth, CA) , u otros métodos conocidos por el técnico experto. La selección de enzimas adecuadas para realizar este propósito serán fácilmente evidentes a uno de experiencia ordinaria en la ¦ técnica .
Un origen de replicación es típicamente una parte de aquellos vectores de expresión procarióticos adquiridos comercialmente, y el origen ayuda en la aplicación del vector en una célula hospedera. Si el vector de elección no contiene un origen de sitio de replicación, se puede químicamente sintetizar con base en una secuencia conocida, y ligar en el vector. Por ejemplo, el origen de replicación del plasmido pBR322 (New England Biolabs, Beverly, MA) es adecuado para la mayoría de las bacterias gram negativas, y diversos orígenes virales (por ejemplo, SV40, polioma, adenovirus, vesicular virus stomatitus (VSV) , o virus de papiloma tal como HPV o BPV) son útiles para vectores de clonación en células de mamífero. Generalmente, el origen de componente de replicación no es necesario para vectores de expresión de mamífero (por ejemplo, el origen de SV40 se usa frecuentemente solamente debido a que también contiene el promotor temprano de virus) .
Una secuencia de terminación de transcripción se ubica típicamente 3' en el extremo de una región de codificación de polipéptido y sirve para terminar la transcripción. Usualmente, una secuencia de terminación de transcripción en células procarióticas es, un fragmento enriquecido con G-C seguido por una secuencia poli-T. Mientras que la secuencia se clona fácilmente de 'una biblioteca o aún comercialmente se adquiere como parte de un vector, también se puede sintetizar fácilmente usando métodos para síntesis de ácido nucleico tal como aquellas descritas en la presente.
Un gen marcador seleccionable codifica una proteína necesaria para la sobrevivencia y crecimiento de una célula hospedera que crece en un medio de cultivo selectivo. Los genes marcadores de selección típicos codifican proteínas que (a) confieren resistencia, a antibióticos u otras toxinas, por ejemplo, ampicilina, tetraciclina, o canamicina para células hospederas procarióticas; (b) deficiencias auxotróficas de complemento de la célula; o (c) suministro de nutrientes críticos no disponibles de complejo o medio definido. Los Marcadores seleccionables específicos son el gen de resistencia de canamicina, el gen de resistencia a la ampicilina, y el gen de resistencia a la tetraciclina. Ventajosamente, un gen de resistencia de neomicina también se puede usar para selección en ambas células hospederas procarióticas y eucarioticas.
Otros genes seleccionables se pueden usar para amplificar el gen que se expresará. La amplificación es el proceso en donde los genes que se requieren para la producción de una proteina critica para el crecimiento o sobrevivencia celular se reiteran en tándem dentro de los cromosomas de generaciones sucesivas de células recombinantes . Los ejemplos de marcadores seleccionables adecuados para células de mamífero incluyen reductasa de dihidrofolato (DHFR) y genes de timidina quinasa sin promotor. Los Transformantes de célula de mamífero se colocan bajo presión de selección en -donde solamente los transformantes se adaptan únicamente para sobrevivir en virtud del gen seleccionable presente en el vector. La presión de selección se impone al cultivar las células transformadas bajo condiciones en las cuales la concentración de agente de selección en el medio se incrementa sucesivamente, llevando por lo tanto a la aplicación de tanto el gen seleccionable y el ADN que codifica otro gen, tal como una proteína de enlace a antígenos que enlaza (i) ß-Klotho; (ii) FGFRlc, FGFR2c, FGFR3c o FGFR4; o (iii) un complejo que comprende ß-Klotho y uno de FGFRlc, FGFR2c, FGFR3c, y FGFR . Como un resultado, cantidades incrementadas de un polipéptido tal como una proteina de enlace a antígenos se resumen del ADN amplificado.
Un sitio que enlaza ribosoma es usualmente necesario para la iniciación de traducción de mARN y se caracteriza por una secuencia Shine-Dalgarno (procariotas) o una secuencia Kozak (eucariotas) . El elemento se ubica típicamente 3' al promotor y 5' a la secuencia de codificación del polipéptido a expresarse.
En algunos casos, tal como donde la glicosilación se desea en un sistema de expresión de célula hospedera eucariótica, se puede manipular las diversas pre- o prosecuencias para mejorar la glicosilación o rendimiento. Por ejemplo, se puede alterar el sitio de desdoblamiento de peptidasa de un péptido de señal particular, o agregar prosecuencias, que también pueden afectar la glicosilación. El producto de proteina final puede tener, en la posición -1 (relativo al primer aminoácido de la proteína madura) , uno o más aminoácidos adicionales incidente a la expresión, que no se ha podido remover totalmente. Por ejemplo, el producto de proteína final puede tener uno o dos residuos de aminoácidos encontrados en el sitio de desdoblamiento de peptidasa, enlazada a terminal amino. Alternativamente, el uso de algunos sitios de desdoblamiento de enzima puede resultar en una forma ligeramente truncada del polipéptido deseado, si la enzima recorta en tal área dentro del polipéptido maduro.
La expresión y clonación típicamente contendrá un promotor que se reconoce por el organismo hospedero y liga operativamente a la molécula que codifica una proteína de enlace a antígenos que enlaza específicamente (i) ß-Klotho; (ii) FGFRlc, FGFR2c,. FGFR3c o FGFR4; o (iii) un complejo que comprende ß-Klotho y uno de FGFRlc, FGFR2C, FGFR3c, y FGFR4. Los promotores son secuencias no transcritas ubicadas corriente arriba (esto es, 5') al codón de partida de un gen estructural (generalmente dentro de alrededor de 100 hasta 1000 bp) que controla la transcripción del gen estructural. Los promotores se agrupan convencionalmente en uno de dos clases: promotores inducibles y promotores constitutivos. Los promotores inducibles inician el incremento de los niveles de transcripción de ADN bajo su control en respuesta a algún cambio en condiciones de cultivo, tal como la presencia o ausencia de un nutriente o un cambio en la temperatura. Los promotores constitutivos, por otro lado, transcriben uniformemente un gen al cual se liga operativamente, es decir, con poco o sin control sobre la expresión de gen. Un gran número de promotores, reconocidos por una variedad de células hospederas potenciales, son bien conocidos. Un promotor adecuado se liga operativamente al ADN que codifica cadena pesada o cadena ligera que comprende una proteína de enlace a antígenos al remover el promotor desde el ADN de la fuente por digestión de enzima de restricción e insertar la secuencia de promotor deseada en el vector.
Los promotores adecuados para usar con hospederos de levadura también son conocidos en la técnica. Los aumentadores de levadura se usan ventajosamente con promotores de levadura. Los promotores adecuados para usar con células hospederas de mamíferos son bien conocidos e incluyen, pero no se limitan a, aquellos obtendidos de los genomas de virus tales como virus . polioma, virus de viruela aviar, adenovirus (tal como Adenovirus 2), virus de papiloma de bovino, virus de sarcoma aviar, citomegalovirus, retrovirus, virus de hepatitis B, y virus 40 se simios (SV40) . Otros promotores de mamífero adecuados incluyen promotores de mamífero, heterólogas, por ejemplo, promotores de choque de calor y el promotor de actina.
Los promotores adicionales que pueden ser de interés incluyen, pero no . se limitan a: promotor temprano SV40 (Benoist and Chambón, (1981) Nature 290: 304-310); promotor CMV (Thornsen et al., (1984) Proc. Nati. Acad. U.S. A. 81:659-663); el promotor contenido en la repetición de terminal larga 3' de virus de sarcoma Rous (Yamamoto et al., (1980) Cell 2_2: 787-797 ) ; promotor de herpes timidina cinasa ( agner et al., (1981) Proc. Nati. Acad. Sci. U.S. A. 78:1444-1445); secuencias promotoras y reguladoras del gen de metalotionina (Prinster et al., (1982) Nature 296 : 39-42) ; y promotores procarióticos tal como el promotor beta-lactamasa (Villa-Kamaroff et al., (1978) Proc. Nati. Acad. Sci. U.S. A. 75:3727-3731); o el promotor tac (DeBoer et al., (1983) Proc. Nati. Acad. Sci. U.S. A. 80:21-25) . También de interés son las siguientes regiones de control transcripcional de animal, que exhiben especificidades de tejido y se han utilizado en animales transgénicos : la región de control de gen de elastasa I que está, activa en células acinares pancreáticas (Swift et al., (1984) Cell 3_8_:639-646; Ornitz et al., (1986) Cold Spring Harbor Symp. Quant . Biol. 50:399-409; MacDonald, (1987) Hepatology 7:425-515); la región de control de gen de insulina que está ' activa en células beta pancreáticas (Hanahan, (1985) Nature 315 : 115-122) ; la región de control de gen de inmunoglobulina que está activa en células linfoides (Grosschedl et al., (1984) Cell 38:647-658; Adames et al., (1985) Nature 318:533-538; Alexander et al., (1987) Mol. Cell. Biol. 1_: 1436-144 ) ; la región de control de virus de mama de ratón que está activo en células testiculares , de pecho, linfoides y células madre (Leder et al., (1986) Cell 4_5: 85-495) ; la región de control de gen de albúmina que está activa en el hígado (Pinkért et al., (1987) Genes and Devel. _l:268-276); la región de control de gen de alfa-feto-proteína que está activa en el hígado (Krumlauf et al., (1985) Mol. Cell. Biol. 5:1639-1648; Hammer et al., (1987) Science 253 : 53-58 ) ; la región de control de gen de alfa 1-antitripsina que está activa en el hígado (Kelsey et al., (1987) Genes and Devel. ^1:161-171); la región de control de gen de geta-globina que está activa en células mieloides (Mogram et al., (1985) Nature 315: 338-340; Kollias et al., (1986) Cell 46:89-94); la región de control' de gen de proteína básica de mielina que está activa en células de oligodendrocito en el cerebro (Readhead et al., (1987) Cell 4_8: 703-712 ) ; la región de control de gen de cadena 2 ligera de miosina que está activa en músculo esqueletal (Sani, (1985) Nature 314 : 283-286) ; y la la región de control de gen de hormona de liberación gonadotropica que está activa en el hipotálamo (Masón et al., (1986) Science 234:1372-1378).
Una secuencia potenciadora se puede insertar en el vector para incrementar transcripción de ADN que codifica cadena ligera o cadena pesada que comprende una proteína de enlace a antígenos que enlaza específicamente (i) ß-Klotho; (ii) FGFRlc, FGFR2c, FGFR3c o FGFR4; o (iii) un complejo que comprende ß-Klotho y uno de FGFRlc, FGFR2c, FGFR3c, y FGFR4 por eucariotas mayores, por ejemplo, una proteína de enlace a antígenos humana que enlaza específicamente (i) ß-Klotho; (ii) FGFRlc, FGFR2c, FGFR3c o FGFR4; o (iii) un complejo que comprende ß-Klotho y uno de FGFRlc, FGFR2c, FGFR3c, y FGFR4. Los aumentadores son elementos de acción cis de ADN, usualmente alrededor de 10-300 bp de longitud, que actúan en el promotor para incrementar la transcripción. Los aumentadores relativamente son la orientación y posición independiente, que se ha encontrado en las posiciones tanto 5' como 3' a la unidad de transcripción. Diversas secuencias de aumentador disponibles de genes de mamífero se conocen (por ejemplo, globina, elastasa, albúmina, proteína de alfa-feto e insulina) . Típicamente, sin embargo, se usa un aumentador de un virus. El aumentador SV40, el aumentador de promotor temprano de citomegalovirus , el aumentador de polioma, y aumentadores de adenovirus conocidos en la técnica son elementos de mejora ejemplares para la activación de promotores eucarióticos . Mientras que un aumentador se puede colocar en el vector ya sea 5' o 3' a una secuencia de codificación, se ubica típicamente en un sitio 5' del promotor. Una secuencia que codifica una secuencia de señal nativa o heterologa apropiada (secuencia líder o péptido de señal) se puede incorporar en un vector de expresión, para promover la secreción extracelular del anticuerpo. La elección de péptido de señal o líder depende del tipo de células hospederas en las cuales el anticuerpo está para producirse, y una secuencia de señal heterologa puede reemplazar la secuencia de señal nativa. Los ejemplos de péptidos de señal que .son funcionales en células hospederas de mamífero incluyen lo siguiente: la secuencia de señal para interleucina-7 (IL-7) descrita en Patente de E.U.A. No. 4,965,195; la secuencia de señal para receptor de interleucina-2 descrito en Cosman et al., (1984) ature 312:768; el péptido de señal de receptor de inte.rleucina-4 descrito en la Patente EP No. 0367 566; el péptido de señal de receptor de interleucina-1 tipo I descrito en la Patente de E.U.A. No. 4,968,607; el péptido de señal de receptor de interleucina-1 tipo II descrito en la Patente EP No. 0 460 846.
Los vectores de expresión que se proporcionan se pueden construir de un vector de partida tal como un vector comercialmente disponible. Tales vectores pueden pero no deben contener todas de las secuencias de acompañamiento deseadas. Donde una o más de las secuencias de acompañamiento descritas en la presente no están ya presente en el vector, se pueden obtener de forma individual y liqar en el vector. Los métodos usados para obtener cada una de las secuencias de acompañamiento son bien conocidos por un experto en la técnica.
Después el vector se ha construido y una molécula de ácido nucleico codifica cadena ligera, una cadena pesada, o una cadena ligera y una cadena pesada que comprende una proteina de enlace a antigenos que enlaza específicamente (i) ß-Klotho; (ii) FGFRlc, FGFR2c, FGFR3c o FGFR4; o (iii) un complejo que comprende ß-Klotho y uno de FGFRlc, FGFR2c, FGFR3c, y FGFR4 se ha insertado en el sitio adecuado del vector, el vector completado se puede insertar en una célula hospedera adecuada para amplificación y/o expresión de polipéptido. La transformación de un vector de expresión para una proteína de enlace a antígenos en una célula hospedera seleccionada se puede realizar por métodos bien conocidos incluyendo transíección, infección, co-precipitación de fosfato de calcio, electroporación, microinyección, lipofección, Transfección mediada por dextrano DEAE, u otras técnicas conocidas. El método seleccionado será en parte una función del tipo de célula hospedera a usarse. Estos métodos y otros métodos adecuados son bien conocidos por el técnico experto, y se establecen por ejemplo, en Sambrook et al., (2001), supra.
Una célula hospedera, cuando se cultiva bajo condiciones apropiadas, sintetiza una proteína de enlace a antígenos que se puede colectar posteriormente del medio de cultivo (si la célula hospedera secreta esto en el medio) o directamente de la célula hospedera que produce esto (si esto no se secreta) . La selección de una célula hospedera apropiada dependerá sobre varios factores, tales como los niveles de expresión deseados, modificaciones de polipéptido que son deseables o necesarias para actividad (tal como glicosilación o fosforilación) y fácil de plegar en una molécula biológicamente activa.
Las lineas celulares de mamífero disponibles como hospederos para expresión son bien conocidas en la técnica e incluyen, pero no se limitan a, líneas celulares inmortalizadas disponibles de la Colección de Cultivo Tipo Americano (ATCC por sus siglas en ingles) , que incluye pero no se limitan a células de Ovario de hámster chino (CHO) , células HeLa, células de riñon de hámster bebe (BHK), células de riñon de mono (COS) , células de carcinoma hepatocelular humano (por ejemplo, Hep G2), y un número de otras líneas celulares. En determinadas modalidades, las líneas . celulares se pueden seleccionar a través de determinar que líneas celulares tienen altos niveles de expresión y constitutivamente producir proteínas de enlace a antígenos con propiedades · de -enlace deseables (por ejemplo, la capacidad para enlazar (i) ß-Klotho (ii) FGFRlc, FGFR2c, FGFR3c o FGFR4; o (iii) un complejo que comprende ß-Klotho y uno de FGFRlc, FGFR2c, FGFR3c, y FGFR ) . En otra modalidad, una línea celular del linaje de célula B que no hace su propio anticuerpo pero tiene una capacidad para hacer y secretar un anticuerpo heterólogo se puede seleccionar. La capacidad para inducir señalización del tipo FGF21 también puede formar un criterio de selección.
Usos de Proteínas de enlace a antigenos para Propósitos de Diagnóstico y Terapéutico Las proteínas de enlace a antigenos descritas en la presente son útiles para detectar (i) ß-Klotho; (ii) FGFRlc, FGFR2c, FGFR3c o FGFR4 ; o (iii) un complejo qué comprende ß-Klotho y uno de FGFRlc, FGFR2c, FGFR3c, y FGFR4 en muestras biológicas e identificación de células o tejidos que producen uno o más de (i) ß-Klotho; (ii) FGFRlc, FGFR2c, FGFR3c o FGFR4; o (iii) un complejo que comprende ß-Klotho y uno de FGFRlc, FGFR2c, FGFR3c, y FGFR4. Por ejemplo, las proteínas de enlace a antígenos descritas en la presente se pueden usar en ensayos diagnósticos, por ejemplo, ensayos de enlace para detectar y/o cuantificar (i) ß-Klotho; (ii) FGFRlc, FGFR2c, FGFR3c o FGFR4; o (iii) un complejo que comprende ß-Klotho y uno de FGFRlc, FGFR2c, FGFR3c, y FGFR4 expresado en un tejido o célula. Las proteínas .de enlace a antígenos que enlazan específicamente a (i) ß-Klotho; (ii) FGFRlc, FGFR2c, FGFR3c o FGFR4; o (iii) un complejo que comprende ß-Klotho y uno de FGFRlc, FGFR2c, . ' FGFR3c, y FGFR4 se pueden usar en el tratamiento de enfermedades relacionadas a señalización del tipo FGF21 en un paciente que necesita del mismo, tal como diabetes tipo 2, obesidad, dislipidemia, NASH, enfermedad cardiovascular, y síndrome metabólico. Al formar un complejo de señalización que comprende una proteína de enlace a antígenos, y (i) ß-Klotho; (ii) FGFRlc, FGFR2c, FGFR3c o FGFR ; o (iii) un complejo que comprende ß-Klotho y uno de FGFRlc, FGFR2c, FGFR3c, y FGFR4, la actividad in vivo natural de FGF21, que asocia con FGFRlc,' FGFR2c, FGFR3c, FGFR4 y ß-Klotho in vivo para iniciar la señalización, se puede imitar y/o mejorar, llevando a efectos terapéuticos.
Indicaciones Una enfermedad ?· afección asociada con FGF21 humano incluye cualquier enfermedad o afección cuya aparición en un paciente se causa por, al menos en parte, la inducción de señalización del tipo FGF21, que se inicia in vivo por la formación de un complejo que comprende FGFRlc, FGFR2c, FGFR3c o FGFR4 y ß-Klotho y FGF21. La severidad de la enfermedad o afección también se puede disminuir por la inducción de señalización del tipo FGF21. Los ejemplos de enfermedades y afecciones que se pueden tratar con las proteínas de enlace a antígenos incluyen diabetes tipo 2, obesidad, dislipidemia, NASH, enfermedad cardiovascular, y síndrome metabólico.
Las proteínas de enlace a antígenos descritas en la presente se pueden usar para tratar diabetes tipo 2, obesidad, dislipidemia, NASH, enfermedad cardiovascular, y síndrome metabólico, o se pueden emplear como un tratamiento profiláctico administrado, por ejemplo, diariamente, 'semanalmente, bi-semanalmente, mensualmente, bi-mensualmente, bi-anualmente, etc para prevenir o reducir la frecuencia y/o severidad de síntomas, por ejemplo, elevados niveles de glucosa en plasma, niveles elevados de triglicéridos y colesterol, proporcionando de tal. modo un perfil de factor de riesgo glicémico y cardiovascular mejorado.
Métodos de Diagnóstico Las proteínas de enlace a antígenos descritas en la presente se pueden usar para propósitos diagnósticos para detectar, diagnosticar, o monitor enfermedades y/o afecciones asociadas con FGFRlc, FGFR2c, FGFR3c, FGFR4, ß-Klotho, FGF21 o combinaciones del mismo. También se proporcionan métodos para la detección de la presencia de (i) ß-Klotho (ii) FGFRlc, FGFR2c, FGFR3c o FGFR4; o (iii) un complejo que comprende ß-Klbtho y uno de FGFRlc, FGFR2c, FGFR3c, y FGFR4 en una muestra usando métodos inmunohistológicos clásicos conocidos por aquellos de experiencia en la técnica (por ejemplo, Tijssen, 1993, Practice and Theory of Enzyme Immunoassays, Vol 15 (Eds R.H. Burdon and P.H. van Knippenberg, Elsevier, Amsterdam) ; Zola, (1987) Monoclonales Antibodies : A Manual of Techniques, pp. 147-158 (CRC Press, Inc.); Jalkanen et al., (1985) J. Cell. Biol. 101 : 976-985; Jalkanen et al., (1987) J. Cell Biol. 105:3087-3096). La detección de (i) ß-Klotho; (ii) FGFRlc, FGFR2c, FGFR3c o FGFR4; o (iii) un complejo que comprende ß-Klotho y uno de FGFRlc, FGFR2c, FGFR3c, y FGFR4 se puede realizar in vivo o xn vxtro.
Las aplicaciones diagnósticas proporcionadas en la presente incluyen el uso de las proteinas de enlace a antigenos para detectar ' expresión de (i) ß-Klotho; (ii) FGFRlc, FGFR2c, FGFR3c o FGFR4; o (iii) un complejo que comprende ß-Klotho y uno de FGFRlc, FGFR2c, FGFR3c, y FGFR4 y/o enlazar a (i) ß-Klotho; (ii) FGFRlc, FGFR2c, FGFR3c o FGFR4; o (iii) un complejo que comprende ß-Klotho y uno de FGFRlc, FGFR2c, FGFR3c, y FGFR4. Los ejemplos de métodos útiles en la detección de la presencia de (i) ß-Klotho; (ii) FGFRlc, FGFR2c, FGFR3c o FGFR4; o (iii) un complejo que comprende ß-Klotho y uno de FGFRlc, FGFR2c, FGFR3c, y FGFR4 incluye inmunoensayos, tales como, el ensayo inmunosorbente ligado a enzimas (ELISA) y el radioinmunoensayo (RIA) .
Para aplicaciones diagnósticas, la proteina de enlace a antigenos típicamente se etiquetará con un grupo de etiquetado detectable. Los. grupos de etiquetado adecuados incluyen, pero no se limitan a, lo siguiente: radioisótopos o radionucleidos (por ejemplo, 3H, 14G, 15N, 35S, 90Y, S9Tc, niIn, 125I, 131I), grupos fluorescentes (por ejemplo, FITC, rodamina, fósforos de lantánido) , grupos enzimáticos {por ejemplo, peroxidasa de raíz de rábano, ß-galactosidasa, luciferása, fosfatasa alcalina) , grupos quimioluminiscentes , grupos de biotinilo, o építopos de polipéptido predeterminado reconocidos por un reportero secundario (por ejemplo, secuencias pares de cremallera de leucina, sitios de enlace para anticuerpos secundarios, dominios que enlazan metal, etiquetas de epítopo) . En algunas modalidades, el grupo de etiquetado se acopla a la proteína de enlace a ant-ígenos por medio de articulaciones del espaciador de diversas longitudes para reducir obstáculo estérico potencial. Los diversos métodos para etiquetar proteínas se conocen en la técnica y se pueden usar.
En otro aspecto, üna proteína de enlace a antígenos se pueden usar para identificar una célula o células que expresan (i) ß-Klotho; (ii) FGFRlc, FGFR2c, FGFR3c o FGFR4; o (iii) un complejo que comprende ß-Klotho y uno de FGFRlc, FGFR2c, FGFRSc, y FGFR4. En una modalidad específica, la proteina de enlace a antigenos se etiquetan con un grupo de etiquetado y el enlace de la proteina de enlace a antigenos etiquetada a (i) ß-Klotho; (ii) FGFRlc, FGFR2c, ¦ FGFR3c o FGFR4; o (iii) un complejo que comprende ß-Klotho y uno de FGFRlc, FGFR2c, FGFR3c, y FGFR4 se detecta. En una modalidad especifica adicional, el enlace de la proteina de enlace a antigenos a (i) ß-Klotho; (ii) FGFRlc, FGFR2c, FGFR3c o FGFR4; o (iii) un complejo que comprende ß-Klotho y uno de FGFRlc, FGFR2c, FGFR3c, y FGFR4 se detecta in vivo. En una modalidad especifica adicional, la proteina de enlace a antigenos se aisla y mide usando técnicas conocidas en el arte. Ver, por ejemplo, Harlow and Lañe, (1988) Antibodies : A Laboratory Manual, New York: Cold Spring Harbor (ed. 1991 y complementos de periódicos); John E. Coligan, ed. , (1993) Current Protocols In Immunology New York: John Wiley & Sons.
Otro aspecto proporciona detectar la presencia de una molécula de prueba que compite para enlazar a (i) ß-Klotho; (ii) FGFRlc, FGFR2c, FGFR3c o FGFR4; o (iii) un complejo que comprende ß-Klotho y uno de FGFRlc, FGFR2c, FGFR3c, y FGFR4 con las proteínas de enlace a antigenos proporcionados, como se describe en la' presente. Un ejemplo de un ensayo podría implicar detectar la cantidad de proteína de enlace a antigenos libre en una solución que contiene una cantidad de uno o más de (i) ß-Klotho; (ii) FGFRlc, FGFR2c, FGFR3c o FGFR4; o (iii) un complejo que comprende ß-Klotho y uno de FGFRlc, FGFR2c, FG.FR3c, y FGFR4 en la presencia o ausencia de la molécula de prueba. Un incremento en la cantidad de proteina de enlace a antigenos libre (esto es, la proteína de enlace a antígenos no encontrada a (i) ß-Klotho; (ii) FGFRlc, FGFR2c, FGFR3c o FGFR4 ; o (iii) un complejo que comprende ß-Klotho y uno de FGFRlc, FGFR2c, FGFR3c, y FGFR4) indicaría que la molécula de prueba es capaz de competir para enlazar a (i) ß-Klotho; (ii) FGFRlc, FGFR2c, FGFR3c o FGFR4 o (iii) un complejo que comprende ß-Klotho y uno de FGFRlc, FGFR2c, FGFR3c, y FGFR4 con la proteína de enlace a antígenos. En una modalidad, la proteína de enlace a antígenos se etiqueta con un grupo de etiquetado. Alternativamente, la molécula de prueba se etiqueta y la cantidad de molécula de prueba libre se vigila en la presencia y ausencia de una proteína de enlace a antígenos.
Métodos de Tratamiento: Formulaciones farmacéuticas y Vías de Administración Los métodos para usar las proteínas de enlace a antígenos también se proporcionan. En algunos métodos, una proteína de enlace a antígenos se proporciona a un paciente.
La proteína de enlace a antígenos induce la señalización del tipo FGF21.
Las composiciones farmacéuticas que comprenden una cantidad terapéuticamente efectiva de una o una pluralidad de proteínas de enlace a antígenos y un diluyente farmacéuticamente aceptable, portador, solubilizador , emulsificador , conservador, y/o adyuvante también se proporcionan. Además, los métodos de tratamiento de un paciente al administrar tal composición farmacéutica se incluyen. El término "paciente" incluye pacientes humanos.
Los materiales de formulación aceptables son no tóxicos para recipientes en las dosis y concentraciones empleadas. En modalidades específicas, las composiciones farmacéuticas que comprenden una cantidad. terapéuticamente efectiva de proteínas de enlace , a antígenos humanas que enlazan específicamente (i) ß-Klotho; (ii) FGFRlc, FGFR2c, FGFR3c o FGFR4; o (iii) un complejo que comprende ß-Klotho y uno de FGFRlc, FGFR2c, FGFR3c, y FGFR4 se proporcionan.
En determinadas modalidades, materiales de formulación aceptables preferiblemente son no tóxicos para recipientes en las dosis y concentraciones empleadas. En determinadas modalidades, la composición farmacéutica puede contener materiales de formulación para modificar, mantener o conservar, por ejemplo, el pH, osmolaridad, viscosidad, claridad, color, isotonicidad, olor, esterilidad, estabilidad, velocidad de disociación o liberación, adsorpción o penetración de la composición. En tales modalidades, los materiales de formulación adecuados incluyen, pero no se limitan a, aminoácidos (tales como glicina, glutamina, asparagina, arginina o lisina) ; antimicrobiales ; antio-xidantes (tal como ácido ascórbico, , sulfito de sodio o sulfito ácido de sodio) ; soluciones amortiguadoras (tales como borato, bicarbonato, Tris-HCl, citratos, fosfatos u otros ácidos orgánicos); agentes de carga (tales como manitol o glicina) ; agentes quelantes (tal como ácido etilendiamina tetraacético (EDTA) ) ; agentes de complejo (tal como cafeína, polivinilpirrolidona, beta- ciclodextrina o hidroxipropil-beta-ciclodextrina ) ; rellenadores ; monosacáridos ; disacáridos; y otros carbohidratos (tal como glucosa, mañosa o dextrinas) ; proteínas (tales como albúmina de suero, gelatina o inmunoglobulinas) ; colorante, saborizante y agentes de dilución; agentes emulsificantes ; polímeros hidrofílicos (tal como polivinilpirrolidona) ; polipéptidos de bajo peso molecular; cauteriones que forman sal (tal como sodio) ; conservadores (tales como cloruro de benzalconio, ácido benzoico, ácido salicíclico, timerosal, alcohol de fenetilo, metilparabeno,- propilparabeno, clorhexidina, ácido sórbico o peróxido de hidrógeno) ; solventes (tal como glicerina, propilen glicol o polietilen glicol) ; alcoholes de azúcar (tales como manitol o sorbitol) ; agentes de suspensión; tensoactivos o agentes humectantes (tales como Pluronics, PEG, ésteres de sorbitan, polisorbatos tales como polisorbato 20, polisorbato, tritón, trometamina, lecitina, colesterol, tiloxapal) ; agentes que aumentan la estabilidad (tal como sacarosa o sorbitol) ; agentes aumentadores de la tonicidad (tal como haluros de metal alcalino, preferiblemente cloruro de sodio o potasio, manitol sorbitol) ; vehículos de suministro; diluyentes; excipientes y/o adyuvantes farmacéuticos. Ver, Rémington' s Pharmaceutical Sciences, 18th Edition, (A.R. Gennaro, ed.), 1990, Mack Publishing Company.
En determinadas modalidades, la composición, farmacéutica óptima se determinará por un experto en la técnica dependiendo, por ejemplo, la vía pretendida de administración, formato de suministro y dosis deseada. Ver, por ejemplo, Remington's. Pharmaceutical Sciences, supra. En determinadas modalidades, tales composiciones pueden influir en el estado físico, estabilidad, velocidad de liberación in vivo y velocidad de despeje in vivo de las proteínas de enlace a antígenos descritas. En determinadas modalidades, el vehículo primario o portador en una composición farmacéutica puede ser ya sea acuosa o no acuosa en naturaleza. Por ejemplo, un vehículo o portador adecuado puede ser agua para inyección, solución salina fisiológica o líquido cerebroespinal artificial, . posiblemente complementado con otros materiales comunes en composiciones para administración parenteral. La solución salina amortiguada neutral o solución salina mezclada con albúmina de suero son además vehículos ejemplares. En modalidades específicas, las composiciones farmacéuticas comprenden solución amortiguadora Tris de alrededor de pH 7.0-8.5, o solución amortiguadora de acetato de alrededor de pH 4.0-5.5, y puede además incluir sorbitol o un sustituto adecuado. En determinadas modalidades, las composiciones que comprenden proteínas de enlace a. antígenos que enlazan específicamente (i) ß-Klotho; (ii) FGFRlc, FGFR2c, FGFR3c o FGFR4 ; o (iii) un complejo que comprende ß-Klotho y uno de FGFRlc, FGFR2c,- FGFR3c, y FGFR4 se pueden preparar para almacenamiento al mezclar la composición seleccionada que tiene el grado deseado de pureza con agentes de formulación opcionales (Remington's Pharmaceutical Sciences , supra) en la forma de una torta liofilizada o una solución acuosa. Además, en determinadas modalidades, la proteína de enlace a antígenos que enlaza (i) ß-Klotho; (ii) FGFRlc, FGFR2c, FGFR3c o FGFR4; o (iii) un complejo que comprende ß-Klotho y uno de FGFRlc, FGFR2c, FGFR3c, y FGFR4 se puede formular como un liofilizado usando excipientes apropriados tal como sacarosa.
Las composiciones farmacéuticas se pueden seleccionar para suministro parenteral. Alternativamente, las composiciones se pueden seleccionar para la inhalación o para suministrar a través del tracto digestivo, tal como oralmente. La preparación ' de tales composiciones farmacéuticamente aceptables está dentro de la habilidad de la técnica.
Los componentes de formulación están presentes preferiblemente en concentraciones que son aceptables para el sitio de administración. En determinadas modalidades, las soluciones amortiguadoras se usan para mantener la composición en pH fisiológico o en un pH ligeramente menor, típicamente dentro de un intervalo de pH desde alrededor de 5 hasta alrededor de 8.
Cuando la administración parenteral se contempla, las composiciones terapéuticas- se pueden proporcionar en la forma de un pirógeno libre, solución acuosa parenteralmente aceptable que comprende la proteína de enlace a antígenos deseada en un vehículo farmacéuticamente aceptable. Un vehículo particularmente adecuado para inyección parenteral es agua destilada estéril en la cual la proteína de enlace a antígenos se formula como una solución estéril, isotónica, conservada adecuadamente. En determinadas modalidades, la preparación puede implicar la formulación de la molécula deseada con un agente, tal como microesferas inyectables, partículas bio-erosionábles, compuestos poliméricos (tal como ácido poliláctico o ácido poliglicólico) , perlas o liposomas, que pueden proporcionar liberación controlada o sostenida del producto que se puede suministrar por medio de inyección de depósito. En determinadas modalidades, ácido hialurónico también se puede usar, el cual puede tener el efecto de promover duración sostenida en la . circulación. En determinadas modalidades, dispositivos de suministro ' de fármaco implantable se . pueden usar para introducir la proteína de enlace a antígenos deseada.
Ciertas composiciones farmacéuticas se formulan para inhalation. En algunas modalidades, proteínas de enlace a antígenos que enlazan a (i) ß-Klotho; (ii) FGFRlc, FGFR2c, FGFR3c o FGFR4; o (iii) un complejo que comprende ß-Klotho y uno de FGFRlc, FGFR2c, FGFR3c, y FGFR4 se formulan como un polvo inhalable, seco. En modalidades específicas, soluciones de inhalación de proteína de enlace a antígenos también se pueden formular con un propulsor para suministro en aerosol. En determinadas modalidades, las soluciones se pueden nebulizar. La administración pulmonar y métodos de formulación por lo tanto se describen además en Solicitud de patente internacional No. PCT/.US9 /001875 , que se incorpora como referencia y describe suministro pulmonar de proteínas químicamente modificadas. Algunas formulaciones .se pueden administrar oralmente. Las proteínas de enlace a antígenos que enlazan específicamente (i) ß-Klotho; (ii) FGFRlc, FGFR2c, FGFR3c o FGFR4; o (iii) un complejo que comprende ß-Klotho y uno de FGFRlc, FGFR2c, FGFR3c, y FGFR4 que se administran en esta forma se pueden formular con o sin portadores habitualmente usados en la composición de formas de dosificación sólidas tal como comprimidos y cápsulas. En determinadas modalidades, una cápsula se puede diseñar para liberar la porción activa de la formulación en el punto en el tracto gastrointestinal cuando la biodisponibilidad se maximiza y la degradación pre-sistémica se minimiza. Los agentes adicionales .se pueden incluir¦ para facilitar absorpción de una proteína de enlace a antígenos. Los diluyentes, saborizantes, ceras de punto de fusión bajo, aceites vegetales, lubricantes, agentes de suspensión, agentes desintegrantes de comprimido, y aglutinantes también se pueden emplear.
Algunas composiciones farmacéuticas comprenden una cantidad efectiva de una o una pluralidad de proteínas de enlace a antígenos humanas que enlazan específicamente (i) ß-Klotho; (ii) FGFRlc, FGFR2c, FGFR3c o FGFR4; o (iii) un complejo que comprende ß-Klotho y uno de FGFRlc, FGFR2c, FGFR3c, y FGFR4 en una mezcla con excipientes no tóxicos que son adecuados para la fabricación de comprimidos. Al disolver los comprimidos en agua estéril, u otro vehículo adecuado, las soluciones se pueden preparar en forma de dosis unitaria. Los excipientes adecuados incluyen, pero no se limitan a, diluyentes inertes, tal como carbonato de calcio, carbonato de sodio o bicarbonato, lactosa, o fosfato de calcio; o agentes de enlace, tal como almidón, gelatina, o acacia; o agentes de lubricación tal como estearato de magnesio, ácido esteárico, o talco.
Las composiciones farmacéuticas adicionales serán evidentes para aquellos expertos en la técnica, incluyendo las formulaciones que implican proteínas de enlace a antígenos que enlazan específicamente (i) ß-Klotho; (ii) FGFRlc, FGFR2c, FGFR3c o FGFR4; o (iii) un complejo que comprende ß-Klotho y uno de FGFRlc, FGFR2c, FGFR3c, y FGFR4 en formulaciones de liberación controlada o sostenida. Las técnicas para formular una variedad de otros medios de liberación controlada o sostenida, tal como portadores de liposoma, micropartículas micro-erosionables o perlas porosas e inyección de depósitos, también se conocen por aquellos expertos en la técnica. Ver, por ejemplo, Solicitud de Patente Internacional No. PCT/US93/00829, que se incorpora como referencia y describe microparticulas poliméricas porosas de liberación controlada para suministrar composiciones farmacéuticas. Las preparaciones de liberación sostenida pueden incluir matrices de polímero semi-permeables en la forma de artículos formados, por ejemplo, películas, o microcápsulas . Las matrices de liberación sostenida pueden incluir poliésteres, hidrogeles, polilactidos (como se describe en la Patente de E.U.A. No. 3,773,919 y Publicación de Solicitud de Patente Europea No. EP 058481, cada una de las cuales se incorpora como referencia) , copolímeros de ácido L-glutámico y gama etil-L-glutamato (Sidman et al.,-1983, Biopolímeros 2:547-556), poli (2-hidroxietil-inetacrilato) (Langer' et al., 1981, J. Biomed. Mater. Res. 15:167-277 and Langer, 1982, Chem. Tech. 12:98-105), etilen vinil acetato (Langer et al., 1981, . supra) o ácido poli-D(-)-3-hidroxibutírico (Publicación de . solicitud de patente europea No. EP 133, 988).. Las composiciones de liberación sostenida pueden también incluir liposomas que se pueden preparar por cualquiera de diversos métodos conocidos en la técnica. Ver, por ejemplo, Eppstein et al., 1985, Proc. Nati. Acad. Sci. U.S. A. 82:3688-3692; Publicaciones de Solicitud de Patente Europea Nos. EP 036,676; EP 088,046 y EP 143,949, incorporadas como referencia.
Las composiciones farmacéuticas usadas para administración ín vivo típicamente se proporcionan como preparaciones estériles. La esterilización se puede realizar por filtración a través de membranas de filtración estéril. Cuando la composición se liofiliza, la esterilización que usa este método se puede llevar a cabo ya sea antes o después de la liofilización o reconstitución. Las composiciones para administración parenteral se pueden almacenar en forma de liofilización o en una solución. Las composiciones parenterales generalmente se colocan en un recipiente que tiene un puerto de acceso estéril, por ejemplo, una bolsa de solución intravenosa o vial que tiene un tapón perforable por una aguja de inyección hipodérmica.
En determinadas modalidades, las células que expresan una proteína de enlace a antígenos recombinante como se describe en la presente se encapsula para suministrar (Ver, Invest. Ophthalmol Vis Sci (2002) 4_3: 3292-3298 y Proc. Nati. Acad. Sciences USA (2006) 103:3896-3901) .
En ciertas formulaciones, una proteína de enlace a antígenos tiene una concentración de al menos 10 mg/ml, 20 mg/ml, 30 mg/ml, 40 mg/ml, 50 mg/ml, 60 mg/ml, 70 mg/ml, 80 mg/ml, 90 mg/ml, 100 mg/ mi o 150 mg/ml. Algunas formulaciones contienen una solución amortiguadora, sacarosa y polisorbato. Un ejemplo de una formulación es uno que contiene 50-100 mg/ml de proteína de enlace a antígenos, 5-20 mM de acetato de sodio, 5-10% p/v sacarosa, y 0.002 - 0.008% p/v polisorbato. Ciertas, formulaciones, por ejemplo, contienen 65-75 mg/ml de una proteina de enlace a antigenos en solución amortiguadora de acetato de sodio 9-11 mM, 8-10% p/v sacarosa, y 0.005-0.006% p/v polisorbato. El pH de ciertas formulaciones está en el intervalo de 4.5-6. Otras formulaciones tienen un pH de 5.0-5.5 (por ejemplo, pH de 5.0, 5.2 o 5.4) .
Una vez que la composición farmacéutica se ha formulado, esto se puede almacenar en viales estériles como una solución, suspensión, gel, emulsión, sólido, cristal, o como un polvo deshidratado .o liofilizado. Tales formulaciones se pueden almacenar ya sea en una forma fácil de usar o en una forma (por ejemplo, liofilizada) que se reconstituye antes de la administración. Los kits para producir una unidad de administración de dosis sencilla también se proporcionan. Ciertos kits contienen un primer recipiente que tiene una proteina seca y un segundo recipiente que tiene una formulación acuosa. En determinadas modalidades, los kits que contienen jeringas pre-llenadas . sencillas y multi-cámaras (por ejemplo, reringas de liquido y liojeringas) se proporcionan. La cantidad terapéuticamente efectiva de una composición farmacéutica que contiene proteina de enlace a antigenos a emplearse dependerá, por ejemplo, sobre el contexto terapéutico y objetivos. Un experto en la técnica apreciará que los niveles de dosificación apropiados para el tratamiento variarán dependiendo, en parte, sobre la molécula liberada, la indicación para la cual la proteina de enlace a antigenos se está usando, la vía de administración, y el tamaño (peso corporal, superficie del cuerpo o tamaño de órgano) y/o afección (la edad y saluda general) del paciente. En determinadas modalidades, el médico puede titular la dosificación y modificar la vía de administración para obtener el efecto terapéutico óptimo.
Una dosificación típica pueden variar desde · alrededor de 1 pg/kg hasta alrededor de 30 mg/kg o más, dependiendo de los factores mencionados arriba. En modalidades específicas, la dosificación puede variar desde 10 yg/kg hasta alrededor de 30 mg/kg, opcionalmente desde 0.1 mg/kg hasta alrededor de 30 mg/kg, alternativamente desde 0.3 mg/kg hasta alrededor de 20 mg/kg. En algunas, solicitudes, la dosificación es desde 0.5 mg/kg hasta 20 mg/kg. En algunos casos, una proteína de enlace a antígenos se dosifica en 0.3 mg/kg, 0.5mg/kg, 1 mg/kg, 3 mg/kg, 10 mg/kg, o 20 mg/kg. El programa de dosificación en algunos regímenes de tratamiento está en una dosis de 0.3 mg/kg qW, 0.5mg/kg q , 1 mg/kg q , 3 mg/kg qW, 10 mg/kg qW, o 20 mg/kg qW-.
La frecuencia de dosis dependerá de los parámetros farmacocinéticos de la proteína de enlace a antígenos particular en la formulación usada. Típicamente, un médico administra la composición hasta que una dosificación se llega a que logre el efecto deseado. La composición se puede por lo tanto administrar como una dosis sencilla, o como dos o más dosis (que pueden pero no deben contener la misma cantidad de la molécula deseada) durante el tiempo, o como una infusión continua por medio de un dispositivo de implantación o catétér. Las dosificaciones adecuadas se pueden determinar a través del uso de datos de respuesta de dosis apropiada. En determinadas modalidades, las proteínas de enlace a antígenos se pueden administrar a pacientes a través de un periodo de tiempo extendido. La administración crónica de una proteína de enlacé a antígenos minimiza la respuesta inmunltaria o alérgica adversa comúnmente asociada con las proteínas de enlace a antígenos que no son completamente humanas, por ejemplo un anticuerpo elevado contra un antígeno humano en un animal no humano, por ejemplo, un anticuerpo' no completamente humano o anticuerpo no humano producido en una especie no humana.
La vía de administración de la composición farmacéutica es de acuerdo con métodos conocidos, por ejemplo, oralmente, a través de inyección por vías intravenosa, intraperitoneal, intracerebral (intra-parénquima) , intracerebroventricular , intramuscular, intra-ocular , intraarterial , intraportal, o intralesional ; por sistemas de liberación sostenida o por dispositivos de implantación. En determinadas modalidades, las composiciones se pueden administrar por inyección de bolo o continuamente por infusión, o por dispositivo de implantación.
La composición también se puede administrar localmente por medio de implantación de una membrana, esponja u otro material apropiado sobre el cual la molécula deseada se ha absorbido o encapsulado. En determinadas modalidades, donde un dispositivo dé implantación se usa, el dispositivo se puede implantar en cualquier tejido adecuado u órgano, y el suministro de la molécula deseada puede ser por medio de difusión, bolo de liberación por tiempo, o administración continua.
También puede ser deseable para usar composiciones farmacéuticas de proteína de enlace a antígenos ex vivo. En tales casos, las células, tejidos u órganos que se han removido del paciente se exponen a composiciones farmacéuticas de proteína de enlace a antígenos después de que las células, tejidos y/u órganos se implantan posteriormente nuevamente en el paciente.
En particular, las proteínas de enlace a antígenos que enlazan específicamente (i) ¦ ß-Klotho; (ii) FGFRlc, FGFR2c, FGFR3c o FGFR4 ; o (iii) un complejo que comprende ß-Klotho y uno de FGFRlc, FGFR2c, FGFR3c, y FGFR4 se pueden suministrar por ciertas células de implantación que se han fabricado por ingeniería genéticamente, usando métodos tales como aquellos descritos en la presente, para expresar y secretar el polipéptido. En determinadas modalidades, tales células pueden ser células animales o humanas, y pueden ser autólogas, heterólogas, o xenogénicas. En determinadas modalidades, las células se pueden inmortalizar. En otras modalidades, con objeto de disminuir la oportunidad de una respuesta inmunológica, las células se pueden encapsular para evitar la infiltración de tejidos circundantes. En modalidades adicionales, los materiales de encapsulación son típicamente biocompatibles, recintos poliméricos semipermeables o membranas que permiten la liberación de los productos de proteína pero previenen la destrucción de las células por el sistema inmunitar o del paciente o por otros factores detrimentales de los tejidos circundantes.
Terapias de Combinación En otro aspecto, la presente descripción proporciona un método para tratar un .sujeto para diabetes con una proteína de enlace a antígenos terapéutica de la presente descripción, tal como los anticuerpos terapéuticos completamente humanos descritos en la presente, junto con uno o más de otros tratamientos. En una modalidad, tal terapia de combinación alcanza un efecto aditivo o sinérgico. Las proteínas de enlace a antigenos se pueden administrar en combinación con uno o más de los tratamientos de diabetes tipo 2 u obesidad actualmente disponibles. Estos tratamientos para diabetes incluyen biguanida (metaformina ) , y sulfonilureas (tal como gliburida, glipizida) . Los tratamientos adicionales dirigidos a mantener homeostasis de glucosa incluyen agonistas, gama PPAR (pioglitazona., rosiglitazona) ; glinidas (meglitinida, repaglinida, y nateglinida) ; inhibidores DPP-4 (Januvia® y Onglyza®) y inhibidores de glucosidasa alfa (acarbosa, voglibosa) .
Los tratamientos' de combinación adicionales para diabetes incluyen . tratamientos inyectables tal como insulina y miméticos de incretina (Byetta®, Exenatide®) , otros GLP-1 (péptido tipo glucagón) análogos tales como liraglutida, otros agonistas GLP-IR y Symlin® (pramlintida) .
Los tratamientos de combinación adicional dirigidos en pérdida de peso incluyen eridia® y Xenical®.
EJEMPLOS Los siguientes ejemplos, incluyendo los experimentos conducidos y los. resultados alcanzados, se proporcionan para propósitos ilustrativos solamente y no son para construirse como limitantes.
EJEMPLO 1 PREPARACION DE CELULAS FGFRlC SOBRE EXPRESADAS PAPA USO COMO UN ANTIGENO Las secuencias de ácido nucleico que codifican el polipéptido FGFRlc humano de longitud completa (SEQ ID NO: 4; Figuras 1A-1B) y una secuencia separada que codifica el polipéptido ß-Klotho humana de longitud completa (SEQ ID NO: 7; Figuras 2A-2C) se subclonaron en vectores de expresión de célula de mamífero adecuados (por ejemplo, pcDNA3.1 Zeo, pcDNA3.1 Hyg (Invitrogen, Carlsbad, CA) o pDSRa20. El vector pDSRa20 contiene el promotor/potenciador temprano SV40 para expresar el gen de interés y un cásete de expresión DHFR ratón para selección en células hospederas CHO DHFR (-) tales como AM1 CHO (un derivado de DG44, CHO DHFR (-) ) .
Las células CHO AM-1 se sembraron en células 1.5 xlO6 por plato lOOmm. Después de 24 horas, las células se co-transíectaron con ADNs linealizadas de pDSRa20/huFGFRlc y pDSRa20/huP-Klotho con FuGene6 (Roche Applied Science) . Las células transfectadas se triptizaron 2 días después de la transfección y sembraron en un medio de crecimiento selectivo de CHO DHFR que contiene FBS dializado al 10% y sin complemente de hipoxantina/timidina . Después de 2 semanas, las colonias transíectadas resultantes se triptizaron y agruparon .
Las células HEK293T se transfectaron con el huFGFRlc de longitud completa y hu -Klotho en pcDNA3.1 serie o pTT14 (un vector de expresión desarrollado por Durocher, NRCC, con promotor CMV y EBV ori, similar a pTT5 y un marcador de selección de puromicina) con base en el vector y seleccionado con los fármacos correspondientes seguido por el procedimiento similar como para la transfección y seldccion CHO.
Los grupos de célula AM1 CHO o 293T transfectados con FGF21R (esto es, FGFRlc y PKlotho) se clasifican repetidamente usando FGF21 etiquetado con ftlexa 647. Como un reactivo de tinción de célula superficie, FGF21 se etiquetó con Alexa 647-NHS siguiendo el método recomendado por el fabricante (Molecular Probes, Inc. Cat A 2006) . La Alexa 647-etiquetada FGF21 muestra tinción especifica de células que expresan el receptor FGF21R y sin las células parenterales no transfectadas (Figura 3). Las células expresadas altas se recolectaron al final de la clasificación final, expandieron y congelaron en viales. Las' células AM-l/huFGF21R se prepararon para inmunización y las células 293T/huFGF21R se usaron para suero de ratón titulado por FACS después de la inmunización y en separaciones por exclusión de enlace de los sobrenadantes de hibridoma por FMAT (Ver Ejemplo 4).
EJEMPLO 2 PREPARACION DE UN COMPLEJO FGFR1C/ß-KLOTHO SOLUBLE PARA USO COMO ANTIGENO Los constructos del receptor FGF21 solubles se generaron en vectores de expresión pTT14 o pcDNA3.1. El constructo FGFRlc ECD-Fc (SEQ ID NO: 362, Figura 4) comprende el dominio extracelular de terminal N de FGFRlc (residuos de aminoácidos #1 - 374 ; SEQ ID NO:5) fusionado a Fe (SEQ ID NO:384). El constructo ß-Klotha ECD-Fc (SEQ ID NO: 363, Figura 5) comprende el dominio extracelular de terminal N de ß-Klotho (residuos de aminoácidos #1-996; SEQ ID NO: 8) fusionado a Fe (SEQ ID NO: 384) .
Las células HEK293 (293F, Invitrogen) se transfectaron con huFGFRlc ECD-Fc/pTT5, hup-Klotho ECD-Fc/pTT14-puro y dGFP/pcDNA3.1-Neo y seleccionaron en la presencia de los fármacos correspondientes seguido por clasificación FACS repetida con base en la expresión dGFP. Las células se hicieron crecer en medio Eagle Modificado de Dulbecco libre de suero (DMEM) complementado con aminoácidos no esenciales en HyperFlasks (Corning) durante 4 días y acondicionaron al medio (CM) cosechadas para purificación.
El 293 CM se concentró 6 veces y aplicó a Proteina A FF equilibrada en PBS . La proteina se eluyó con solución amortiguadora de elución Pierce Gentle Ag/Ab. El grupo de proteina A se dializó contra Tris-HCl 20mM, pH 7, NaCl lOmM y aplicado a SP HP en pH 7.0. El FGFRlc ECD-Fc se presentó en el flujo continuo (FT) y el heterodimero se eluyó con gradiente lineal de NaCl 0-0.4 M, Tris-HCl 20 mM pH 7.0. El procesado por secuencia de aminoácido de terminal N verifica el FGF21R soluble purificado para ser un heterodimero compuesto de relación '(1:1) de FGFRlc ECD-Fc y ß-Klotho ECD-Fc. El FGF21R-Fc soluble purificado (Figura 6) se usó como el antigeno para inmunización.
EJEMPLO 3 PREPARACION DE ANTICUERPOS MONOCLONALES Las inmunizaciones se condujeron usando una o más formas adecuadas del antigeno de receptor FGF21, incluyendo: (1) receptor de enlace de célula de transfectantes CHO que expresan FGFRlc humano de longitud completa y ß-Klotho en la superficie celular, obtenido por células CHO transfectadas con cADN que codifican un polipéptido FGFRlc de longitud completa humana de SEQ ID NO: (Ver también Figuras la-b) y cADN que codifican un polipéptido ß-Klotho humana de SEQ ID NO: 7 (Ver también Figuras' 2a-c) ; (2) extracto de membrana de las células antes mencionadas que expresan el complejo receptor FGF21R; o (3) receptor FGF21R soluble obtenido al co-expresar el dominio extracelular de terminal N (ECD) de FGFRlc (SEQ ID NO: 5; ver también Figura 4) y el dominio extracelular de terminal N (ECD) de ß-Klotho (SEQ ID NO: 8;' ver también Figura 5) o (4) combinaciones de los mismos.
Una cantidad adecuada de inmunógeno (esto es, 10 pgs/ratón de FGF21R soluble o 3-4 x 106 células/ratón de células CHO establemente transfectadas o 150 pgs/ratón de membranas FGF21R purificadas preparadas de células CHO que expresan establemente FGF21R) se usó para inmunización inicial en XenoMouse™ de acuerdo a los métodos descritos en la Solicitud de Patente de E.U.A. No. de Serie 08/759,620, presentada el 3 de diciembre de 1996 y Solicitud de Patente Internacional Nos. WO 98/24893, y WO 00/76310, las descripciones de las cuales se incorporan en la presente como referencia. Después de la inmunización inicial, las inmunizaciones de estimulación posteriores de inmunógeno (5 g/ratón de FGF21R soluble o 1.7 x 106 células transfectadas con FGF21R/ratón o 75 ugs de membranas FGF21R purificadas) se administraron en un programa y por la duración necesaria para inducir una titulación anti-FGF21R adecuada en los ratones. Las titulaciones se determinaron por un método adecuado, por ejemplo, por inmunoensayo de enzima, clasificación de célula activada por fluorescencia (FACS), o por otros métodos (incluyendo combinaciones de inmunoensayos de enzima y FACS) .
Los animales que muestran . titulaciones adecuadas se identificaron, y los linfocitos se obtuvieron de ganglios linfáticos drenados y, si es necesario, agrupados para cada cohorte. Los linfocitos se disociaron del tejido linfoide al molerse en un medio adecuado (por ejemplo, medio Eagle Modificado de Dulbecco; DMEM;. obtenido de Invitrogen, Carlsbad, CA) para liberar las células de los tejidos, y suspendieron en DMEM. ¦ Las células B se seleccionaron y/o expandieron usando métodos estándares, y fusionaron con el compañero de fusión adecuado, por ejemplo, células P3X63Ag8.653 de mieloma no secretorias (American Type Culture Collection CRL 1580; Kearney et al, J. Immunol. 123, 1979, 1548-1550), usando técnicas que se conocieron en el arte.
En un método de fusión adecuado, los linfocitos se mezclaron con células compañeras de. fusión en una relación de 1:4. La mezcla celular se · peletizó suavemente por centrifugación a 400 x g durante 4 minutos, el sobrenadante decantado, y la mezcla celular se mezclaron suavemente (por ejemplo, al usar una pipeta de 1 mi) . La fusión se indujo con PEG/DMSO (polietilen glicol/sulfóxido de dimetilo; obtenido de Sigma-Aldrich, St. Louis MO; 1 mi por millón de linfocitos) . El PEG/DMSO se agregó lentamente con agitación suave durante un minuto después, por un minuto de mezcla. IDMEM (DMEM sin glutamina; 2 mi por millón de células B) , luego se agregó durante 2 · minutos con agitación suave, seguido por IDMEM adicional (8 mi por millón de célula B) que se agregó durante 3 minutos.
Las células fusionadas se peletizaron (400 x g 6 minutos) y se volvieron a suspender en 20 mi de medio de selección (por ejemplo, DMEM que contiene Azaserina e Hipoxantina [HA] y otros materiales complementarios como sea necesario) por millones de células B. Las células se incubaron durante 20-30 minutos a 37 °C y luego se volvieron a suspender en 200 mi de medio de selección y cultivaron durante tres hasta cuatro días en matraces T175 antes de formar en placa de 96 pozos.
Las células se distribuyeron en placas de 96 pozos usando técnicas estándares para maximizar la clonalidad de las colonias resultantes. Después de varios días de cultivo, los sobrenadantes se recolectaron y sometieron a ensayos de separación por exclusión como se detalla en los ejemplos a continuación, incluyendo confirmación de enlace al receptor FGF21 humano, especificidad y/o actividad de especies cruzada. Las células positivas se seleccionaron además y sometieron a técnicas de clonación y subclonación estándares.
Las lineas clónales se expandieron in vitro, y los anticuerpos humanos secretados obtenidos para análisis.
De esta manera, los ratones se inmunizaron con ya sea células o membranas que expresan células FGF21R de longitud completa, o dominio extracelular FGF21R soluble, con un intervalo de 11-17 inmunizaciones durante un periodo de aproximadamente uno hasta tres meses y medio. Diversos anticuerpos específicos FGF21R que secretan líneas celulares se obtuvieron, .y los anticuerpos se caracterizaron además. Las secuencias de las mismas se presentan en la presente y en el listado de secuencia, y se proporcionan los resultados de varias pruebas usando estos anticuerpos.
Ejemplo SELECCION DE ANTICUERPOS DE ENLACE POR FMAT Después de 14 días, de cultivo, los sobrenadantes de hibridoma se separaron por exclusión para anticuerpos monoclonales FGF21R específicos por Tecnología de Ensayo de Microvolumen Fluorométrico (FMAT) por separación por exclusión contra ya sea la línea celular CHO AMl/huFGF21R o células HEK293 recombinantes que se transfectaron con FGF21R humano y contra-separación por exclusión contra células CHO o HEK293 parentales. Brevemente las células en medio Freestyle (Invitrogen) se sembraron en placas FMAT de 384 pozos en un volumen de 50 pL/pozo a una densidad de 4,000 células/pozo para los transfectantes estables, y a una densidad de 16,000 células/pozo para las células precursoras, y las células se incubaron durante la. noche a 37°C. 10 L/pozo de sobrenadante luego se agregó, y las placas se incubaron durante aproximadamente una hora a 4°C, después de lo cual 10 pL/pozo de anticuerpo secundario IgG-Cy5 anti-humano se agregó a una concentración de 2.8 g/ml (400ng/ml concentración final) . Las placas luego se incubaron durante una hora a 4°C, y fluorescencia se leyó usando un Sistema de Detección Celular FMAT (Applied Biosystems) .
En total, durante 3,000 sobrenadantes de hibridoma se identificaron como enlace a las células que expresan el receptor FGF21 pero no a células precursoras por el método FMAT. Estos sobrenadantes luego se probaron en los ensayos funcionales FGF21 como se describe a continuación.
Ejemplo 5 SELECCION DE ANTICUERPOS QUE INDUCEN LA SEÑALIZACIÓN DEL TIPO FGF21 Los experimentos se realizaron para identificar anticuerpos funcionales que imitan la actividad FGF21 de tipo natural (por ejemplo, la capacidad para inducir señalización del tipo FGF21) usando un ensayo reportero FGF21 adecuado. El ensayo reportero FGF21 descrito mide la activación de señalización FGFR por medio de una lectura de trayectoria MAPK. El ß-Klotho es un co-receptor para la señalización FGF21, y aunque se considera que no tiene cualquier capacidad de señalización inherente débido a su dominio citoplásmico muy corto, se requiere para FGF21 para inducir señalización a través de los FGFRs.
Ejemplo 5.1 ENSAYO REPORTERO DE ELK-LUCIFERASA Los ensayos, de ELK-luciferasa se realizaron usando un sistema celular CHO o célula de riñon 293T humano recombinante . Específicamente, las células hospederas se procesaron por ingeniería para sobre-expresar constructos reporteros de ß-Klotho y luciferasa. Los constructos reporteros contienen secuencias ' que codifican GAL4-ELK1 y 5xUAS^Luc, un reportero · de luciferasa impulsado por un promotor que contiene cinco copias tándem del sitio de enlace Gal4. La activación del complejo receptor FGF21 en estas líneas celulares reporteras recombinantes induce transducción de señal intracelular , .que a su vez lleva a fosforilación ERK y ELK. La actividad de luciferasa se regula por el nivel de ELK fosforilado, y se usa para monitorear y cuantificar indirectamente la actividad FGF21.
En un ejemplo, las células CHO se transíectaron secuencialmente usando el reactivo de transfección Lipofectamine 20.00 (Invitrogen) de acuerdo al protocolo del fabricante con los constructos receptores que expresan ß-Klotho, FGFRlc y los plásmidos reporteros: 5x Gal4-Luciferasa (promotor TK mínimo con 5xGal4 sitios de enlace cadena arriba de la luciferasa) y Gal4-ELK1. El Gal -ELK1 enlaza a los sitios de enlace Gal4 y activa la transcripción cuando se fosforila por ERK. La transcripción de luciferasa, y por ello la actividad enzimática correspondiente en este contexto se regula por el nivel de ELKl fosforilado, y se usa para monitorear y cuantificar indirectamente la actividad FGF21.
El clon 2E10 se seleccionó como la línea celular reportera FGF21 luciferasa con base en la ventana de ensayo óptima de 10-20 veces con FGF21 nativo que muestra un EC50 en el intervalo nM sencillo.
Para el ensayo, las células reporteras ELK-luciferasa se colocaron en placa en placas de ensayo de 96 pozos, y suero en ayuno durante la noche. El FGF21 o muestras de prueba se agregaron durante 6 horas a 37 grados. Las placas luego se permitieron enfriar a temperatura ambiente y la actividad de luciferasa en los - lisados celulares se midió con Bright-Glo ( Promega ) .
Ejemplo 5.2 ENSAYO DE ERK-FOSFORILACIÓN Las lineas de célula hospedera alternativas específicamente L6 (una línea celular mioblástica de rata) se desarrolló y aplicó · para identificar anticuerpos con actividad de señalización del tipo FGF21. La línea celular L6 de rata es una línea de célula hospedera deseable para el ensayo de actividad debido a que se conoce para expresar niveles mínimos de receptores FGF endógenos. Las células L6 no responden a FGF21 aún cuando se transfectan con el vector de expresión ß-Klotho y por lo tanto proporcionan un respaldo más limpio. (Kurosu et al., (2007) J. Biol. Chem . 282, 26687-26695) .
Las células L6 se mantuvieron en medio de Eagle modificado de Dulbecco complementado con suero de bovino fetal al 10% y penicilina/estreptomicina. Las células se trans'fectaron con plásmido que expresan PKlotho y FGFR individual usando el reactivo de transfección Lipofectamina 2000 (Invitrogen) de acuerdo al protocolo del fabricante.
El análisis de señalización FGF en células L6 se realizó como se describe en la literatura (Kurosu et al., (2007) J. Biol. Chem. 282, 26687-26695). Los cultivos celulares se recolectaron 10 min después del tratamiento de FGF21 o moléculas de prueba y congelaron rápido en nitrógeno líquido, homogenizaron en la solución amortiguadora de lisis y sometieron a análisis western blot usando un anticuerpo anti-fosfo-p44/42 MAP cinasa (ERK1/2) y un anticuerpo anti-ERK (Señalización Celular) . El porcentaje de ERK fosforilado contra proteina ERK total' se determinó de esta manera.
Además, el ensayo de proliferación con base en célula BaF3 de ratón, dependiente del factor usado frecuentemente para .receptores de citoquina también puede desarrollarse y aplicarse.
Entre los sobrenadantes de hibridoma probados en el ensayo reportero FGF21 humano con base en célula CHO (clon 2E10) de ELK-luciferasa, sobre 30 se identificaron como positivos (> 5% de la actividad de ¦ FGF21 ) cuando se comparan con FGF21 20nM como el control positivo. Los anticuerpos luego se purificaron del medio acondicionado de los cultivos de hibridoma de estos positivos y probaron de nuevo en el ensayo reportero con base en célula CHO de ELK-luciferasa . .(Figura 7) que muestra los anticuerpos representativos en el ensayo de potencia receptivo de la dosis con EC50 estimado menor que lpg/ml (o 6.7nM). Las actividades se confirmaron en el ensayo de fosforilación ERK1/2 con base en la célula (Figura 8) con EC50 menor que 10 nM que es consistente para el ensayo de ELK-luciferasa en la linea celular estable CHO 2E10.
EJEMPLO 6 INDUCCION DE SEÑALIZACIÓN DEL TIPO FGF21 ES ESPECIFICO PAPA EL COMPLEJO FGFR1C/3KLOTHO El FGF21 se .ha reportado para señal a través de complejos receptores múltiples incluyendo FGFRlc, 2c, 3c y 4 cuando se empareja con ß-Klotho. La selectividad de los anticuerpos agonistas FGF21 se probó en las células L6 mioblásticas de rata transfectadas con vectores que expresan los FGFRs respectivos y pKlotho. Los resultados mostrados en la Figura 9 demuestran que la actividad se medió selectivamente y exclusivamente a través de FGFRlc y no a través de FGFR2c, 3c o 4 cuando se emparejaron con ß Klotho debido a que la actividad no se detectó en los últimos receptores hasta 100 nM de los anticuerpos agonistas. Esta única selectividad fuertemente sugiere que la acción de estos anticuerpos es dependiente de ß-Klotho aún debe también involucrar específicamente el componente FGFRlc del complejto de señalización.
EJEMPLO 7 ACTIVIDAD EN ADIPOCITOS HUMANOS PRIMARIOS El FGF21 estimula la absorción de glucosa y lipólisis en adipocitos cultivados, y los adipocitos se consideran para ser fisiológicamente más relevantes que el sistema de célula reportero recombinante .
Un panel de los anticuerpos se mostró para mostrar la actividad ERK de fosforilación similar a FGF21 en el ensayo de adipocito humano (Figura 10) con EC50 estimado menor que 10 nM.
EJEMPLO 8 ENLACE DE COMPETENCIA Y CLASIFICACION DE EPITOPO Para comparar la similitud de los sitios de enlace de los anticuerpos en el receptor FGF21, una serie de experimentos de enlace de competencia se realizaron y midieron por Biacore. En un ejemplo (y como se muestra en la Figura 11), dos anticuerpos receptores FGF21 agonistas representativos (24H11 y 17D8) y un anticuerpo de enlace al receptor FGF21 no funcional (1A2.1) se inmovilizaron en la superficie del chip de sensor. El complejo FGFRl.c/ -Klotho ECD-Fc humano soluble o ß-Klotho luego se capturó en las superficies, de anticuerpo inmovilizadas. Finalmente, varios de los anticuerpos del -receptor FGF21 de prueba se inyectaron individualmente sobre el receptor FGF21 humano soluble capturado o ß-Klotho. Si el anticuerpo inyectado reconoce un sitio de enlace distinto relativo a aquellos reconocidos por el anticuerpo inmovilizado, un segundo evento enlazado se observará. Si los anticuerpos reconocen el sitio de enlace muy similar, no se observará más enlace.
Como se muestra en (Figura 11A) , existen dos distintos sitios de enlace traslapados aún parcialmente para los anticuerpos agonistas probados. Un sitio se cubre por 24H11, 21H2, 18B11.1 y 17C3 (Grupo A) y el otro sitio¦ cubierto por 17D8, 12E4 y 18G1 (Grupo B) . Los dos anticuerpos no funcionales 2G10 y 1A2, enlazan a sitios diferentes uno del otro y son distintas de los dos sitios cubiertos por los anticuerpos agonistas en el Grupo A y B. Otros anticuerpos funcionales enlazados a epitopo Grupo A incluyen 20D4, 22H5, 16H7, 40D2 y 46D11. Dos otros anticuerpos funcionales 26H11 y 37D3 se mostraron por este método para enlazar el mismo sitio cubierto por los anticuerpos del Grupo B. Además, un tercer sitio de enlace para -anticuerpos funcionales se identificó para 39F11, 39F7. y 39G5 (grupo C) gue aparece para ser distinto de los sitios de enlace del Grupo A y B (Figura 11B) .
Otro análisis Biacore se llevo a cabo con FGF21 biotinilado inmovilizado en el chip de sensor. El ß-Klotho soluble 10 nM luego se pasó sobre el chip solo o mezclado con los anticuerpos de prueba individuales en ?????. (Figura 12) muestra que varios anticuerpos agonistas en el grupo A (24H11, 18B11, 17C3) y anticuerpo 12E4 (del grupo B) significativamente compiten con FGF21 en el enlace a ß-Klotho soluble mientras que los anticuerpos no funcionales 2G10 y 1A2 y diversos otros anticuerpos funcionales no muestran enlace de competencia con FGF21.
La Figura 11C resume los resultados de clasificación obtenidos.
EJEMPLO 9 RECONOCIMIENTO DE ESTRUCTURAS NATIVAS Y DESNATURALIZADAS La capacidad de proteínas de enlace a antígenos descritas para reconocer estructuras desnaturalizadas y nativas se investigó. El procedimiento y los resultados fueron como sigue.
Ejemplo 9.1 ANTICUERPOS ANTAGONISTAS DEL RECEPTOR FGF21 QUE NO RECONOCEN ESTRUCTURAS DESNATURALI ADAS , COMO SE MUESTRA POR FACS Los lisados celulares de células CHO establemente expresan el receptor FGF21 (FGFRlc y ß-Klotho) o células precursoras CHO se diluyeron con solución amortiguadora de muestra sin beta-mercaptoetanol (sin condiciones de reducción) . 20µ1 de lisado celular se cargó por pista en pistas adyacentes separadas con una pista marcadora de peso molecular en geles SDS-PAGE al 4-20%. Después de la electroforesis, los geles se tiñeron en 0.2µ de filtros de nitrocelulosa . Las tinciones se trataron con Tris-solución amortiguadora salina/Triton-X (TBST) más leche sin grasa al 5% (solución amortiguadora de b.loqueo) durante 30 minutos. Las tinciones luego se cortaron a lo largo de las pistas marcadoras de peso molecular. Las tiras luego se pasaron por sonda con anticuerpos agonistas del receptor FGF21 (12C3, 26H11, 12E4, 21H2, 18B11, o 20D4), y pKlotho anti-murino de cabra comercial o anti-huFGFRl de ratón (R&D Diagnostics) en TBST/leche al 5%. Las tinciones se incubaron con los anticuerpos durante una hora a temperatura ambiente, seguido por tres lavados con TBST + leche al 1%. Las tinciones luego se pasaron por sonda con anticuerpos secundarios IgG-HRP anti-humanos o anti-cabra durante 20 min. Las tinciones se dieron tres 15 min. Los lavados con TBST después del tratamiento con reactivo de desarrollo Pierce Supersignal West Dura (1 min.) y exposición a película de rayos X Kodak Biomax.
Los anticuerpos a.nti-p~Klotho y anti-FGFRl comerciales detectan las proteínas del receptor correspondiente en el SDS-PAGE indicando que enlaza a las proteínas del receptor desnaturalizado. En. contraste, ninguno de los anticuerpos agonistas del receptor FGF21 probados detecta las especies de proteína correspondientes que sugieren que enlaza al epítopo conformacional nativo distinto de los anticuerpos comerciales que enlazan a las secuencias desnaturalizadas.
Ejemplo 9.2 Anticuerpos agonistas del receptor FGF21 enlazan a la estructura del receptor nativo, como se muestra por FACS Un ensayo de enlace FACS' se realizó con diversos anticuerpos FGFRlc y ß-Klotho comercialmente disponibles, y diversos de los anticuerpos agonistas del receptor FGF21 descritos. Los experimentos se realizaron como sigue.
Las células CHO que expresan establemente el receptor FGF21 se trataron con ¦ anticuerpos del receptor anti-huFGFRl de ratón R&D Systems, anti-mu ß-Klotho de cabra, o FGF21 24H11, 17C3, 17D8, 18G1, o 2G10 (l g por lxlO6 células en ???µ? PBS/BSA al 0.5%) . Las células se incubaron con los anticuerpos a 4°C seguido por dos lavados con PBS/BSA. Las células luego se trataron con anticuerpos secundarios etiquetados FITC a 4°C seguido por dos lavados. Las células se volvieron a suspender en lml de PBS/BSA y enlace de anticuerpo se analizó usando un instrumento FACS Calibur.
Consistente con los resultados western blot, todos de los anticuerpos agonistas del receptor FGF21 probados enlazan bien al receptor FGF21 de superficie celular en FACS mientras que los anticuerpos anti- ~Klotho o anti-FGFRl comerciales no. Esta observación confirma además que los anticuerpos agonistas del receptor FGF21 reconocen la estructura nativa mientras que los anticuerpos comerciales a los componentes receptores no.
EJEMPLO 10 BARRIDO DE ARGININA Como se describe arriba, las proteínas de enlace a antígenos que enlazan FGF21R humano, por ejemplo, FGFRlc, ß- Klotho o tanto FGFRlc como ß-Klotho, se crearon y caracterizaron. Para determinar los determinantes neutralizantes en FGFRlc humano y/o ß-Klotho que estas varias proteínas de enlace a ' antígenos enlaza, un número de proteínas FGFRlc mutante y/o ß-Klotho pueden construirse que tienen sustituciones de arginina en residuos de aminoácidos seleccionados de FGFRlc humano y/o ß-Klotho. El barrido de arginina es un método reconocido en la técnica de evaluación donde los anticuerpos, u otras- proteínas, enlazan a otra proteína, ver, por ejemplo, Nanevicz et al., (1995) J. Biol. Chem., 270:37, 21619-21625 y Zupnick et al., (2006) J. Biol. Chem., 281:29, 20464-20473. En general, la cadena lateral de arginina se carga positivamente y está relativamente voluminoso como se compara con otros aminoácidos, que pueden interrumpir el enlace de anticuerpo a una región del antígeno donde la mutación se introduce. El barrido de arginina es un método que determina si un residuo es parte de un determinante neutralizante y/o un epitopo.
Varios aminoácidos distribuidos a lo largo de los dominios extracelulares FGFRlc humano y/o ß-Klotho pueden seleccionarse para mutación de arginina. La selección puede ser parcial hacia los aminoácidos cargados o polares para maximizar la posibilidad del residuo que está en la superficie y reduce la probabilidad de la mutación que resulta en proteina mal plegada. Usando técnicas estándares conocidas en la técnica, oligonucleótidos de sentido y antisentido que contienen los residuos mutados pueden diseñarse con base en el criterio proporcionado por el kit de protocolo Stratagene Quickchange® II (Stratagene/Agilent, Santa Clara, CA) . Las mutagénesis de las secuencias FGFRlc y/o ß-Klotho de tipo natural (TN) pueden realizarse usando un kit Quickchange® II (Stratagene) . Los constructos quiméricos pueden prepararse por ingeniería para codificar una etiqueta FLAG-histidina (seis histidinas' (SEQ ID NO: 382)) en la terminal carboxi del dominio extracelular para facilitar la purificación por medio de la etiqueta poly-His.
El análisis múltiple usando el software y estación de trabajo Bio-Plex (BioRad, Hercules, CA) puede realizarse para determinar determinantes neutralizantes en FGFRlc humano y/o ß-Klotho al analizar mAbs FGFRlc y/o ß-Klotho humanas ejemplares enlazadas diferenciales a mutantes de arginina contra proteínas FGFRlc y/o ß-Klotho de tipo natural. Cualquier número de códigos de perla de perlas recubiertas con pentaHis ("penta-His" descrito como la SEQ ID NO: 383) (Qiagen, Valencia, CA; ver wwwl.qiagen.com) se puede usar para capturar la proteína etiquetada histidina. Los códigos de perla pueden permitir el multiplexado de mutantes de arginina FGFRlc y/o ß-Klotho y FGFRlc y/o ß-Klotho humana de tipo natural.
Para preparar las perlas, lOOul de FGFRlc y/o ß-Klotho de tipo natural y sobrenadantes de mutante de arginina FGFRlc y/o ß-Klotho de cultivo de expresión transitorio se enlazan a perlas recubiertas con penta-His ("penta-His" descritas como SEQ ID NO: 383) durante la noche a 4°C o 2 horas a temperatura ambiente con agitación vigorosa. Las perlas luego se lavan como por el protocolo del fabricante y el conjunto de perla se agrupa y se forma en alícudta en 2 o 3 columnas de un placa de filtro de 96 pozos (Millipore , Belleríca, MA, product #MSBVN1250) para puntos de ensayo en duplicado o triplicado, respectivamente. ???µ? de anticuerpos anti-FGFRlc y/o anti-p-Klotho en diluciones de 4 veces se agregan a los pozos, incuban durante 1 hora a temperatura ambiente, y lavan. ???µ? de una dilución 1:100 de IgG Fe anti-humano conjugado PE (Jackson Labs., Bar Harbor, ME, producto #109-116-170) se agrega a cada pozo, incuba durante 1 hora a temperatura ambiente y lava. Las perlas se vuelven a suspender en BSA al 1%, agitan durante 3 minutos, y leen en la estación de trabajo Bio-Plex. El anticuerpo enlazado a la. proteína mutante de arginina FGFRlc y/o ß-Klotho se compara con el anticuerpo enlazado al FGFRlc y/o ß-Klotho humana de tipo natural del mismo grupo. Una titulación de anticuerpo durante aproximadamente una escala 5 log puede realizarse. La intensidad de fluorescencia media (MFI) de proteínas mutantes.de arginina FGFRlc y/o ß-Klotho pueden graficarse como un porcentaje de señal FGFRlc y/o ß-Klotho humana de tipo natural máxima. Aquellos mutantes para la cual la señal de todos los anticuerpos son a continuación un valor de corte, por ejemplo, 30% de FGFRlc y/o ß-Klotho de tipo natural puede considerarse para ser cualquiera de la concentración de proteína demasiado baja en la perla debido a la expresión pobre en el cultivo transitorio o posiblemente mal plegada y puede, excluirse del análisis. Las mutaciones (esto es, sustituciones de arginina) que incrementan el EC50 para el mAb FGFRlc y/o ß-Klotho por un valor de corte, por ejemplo, 3 veces o mayor (como se calcula por, por ejemplo, GraphPad Prism®) puede .considerarse para tener enlace de mAb FGFRlc y/o ß-Klotho negativamente afectado. Aunque estos métodos, se elucidan los determinantes neutralizantes y epitopos para varios anticuerpos FGFRlc y/o ß-Klotho.
EJEMPLO 11 CONSTRUCCION DE RECEPTOR QUIMERICOS • En otro método de determinar los determinantes de activación en FGFRlc y/o ß-Klotho humana que estas varias proteínas de enlace a antígenos enlazan, las proteínas FGFRlc y/o ß-Klotho quiméricas específicas entre especies humanas y de ratón pueden construirse, expresarse en células 293 o CHO transitorias o estables como se describe antes y se prueba. Por ejemplo, un receptor . FGF21 quimérico puede construirse que comprende FGFRlc humano nativo, FGFR2C, FGFR3c o FGFR4, en un ejemplo FGFRlc, emparejada con ß-Klotho- humana/de ratón quimérico en el cual las regiones o secuencias seleccionadas en el ß-Klotho humana se reemplazan sistemáticamente por - los residuos específicos de ratón correspondientes (Ver, por ejemplo, Figura 2A-2C) . De manera similar, el ß-Klotho humana nativo emparejado con FGFRlc, FGFR2c, FGFR3c o FGFR4 humano/de ratón quimérico, en un ejemplo FGFRlc en el cual las regiones o secuencias seleccionadas en el FGFRlc humano se reemplazan sistemáticamente por los residuos específicos de ratón correspondientes (Ver, por ejemplo, las alineaciones de las Figuras 1A-1B) . Las secuencias críticas involucradas en el enlace y/o actividad de las proteínas de enlace a antígenos pueden derivarse a través del ensayo de enlace o mediciones de la actividad descritas en los Ejemplos previos 4, 5, 6 y 7 con base en los receptor FGF21 quiméricos.
Ejemplo 11.1 Construcción de Quimeras Especificas Las quimeras ß-Klotho humanas-de ratón se construyeron usando la metodología descrita en el Ejemplo 14. Un esquema de las quimeras construido se presenta en la Figura 29; sumariamente, las quimeras generadas comprenden (de la terminal N hasta C) una fusión de una secuencia ß-Klotho humana fusionada a una secuencia ß-Klotho de murino fusionada a una secuencia ß-Klotho humana. El ß-Klotho humana (SEQ ID NO: 8) se usó como una estructura en la cual las regiones de ß-Klotho murino (secuencia de longitud completa se muestra en la SEQ ID NO: 68) se insertaron. Las regiones de ß-Klotho murina que se insertaron fueron como sigue: Residuos Murinos 82P-520P PKJSIFSWGVGTGAFQVEGSWKTDGRGPS1WDRYVYSHLRGV GTDRSTDSY1FLEKDLL ALDFLGVSFYQFS1SWPRLFPNGTVAAVNAQGLRYYRALLDSLVLRN1EP1VTLYHWDLP LTLQEEYGG NAT TDLF DYATYCFQTFGDRVKYWTTTFTNPYLVAWHGFGTGMHA PGE GNLTAVYTVGHNLI AHS VWHNYD NFRPHQKGWLSITLGSFIWÍEPNRTDNM EDVINCQHSMSSVLGWFANPIHGDGDYPEFMKTGAMIPEFSEAE EEVRGTADFFAFSF GPN FRPSNTVVKMGQNVSLNLRQVLN IÍCLEYDDPQILISENGWFTDSYII TEDTTAIY MM INFLNQVLQAI J^DEIRVFGYTAWTLLDGFEWQDAYTTRJGLFYVDFNSEQI^R- P SSAHYY Q11QDNGFPLKESTPDM GRFP (SEQ ID NO:470) Residuos Murinos 506F-1043S FPLKESTPDM GRFPCDFSWGVTESVL PEFTVSSPQFTDPHLYVWNVTGNRLLYRVEG VRL Tf PSQCTDYVSl J RVEMLA JVlKVTHYQFALDWTSlLPTGNLS -V!NRQVLRYYR CVVSEGL LGVFPMVTLYHPTHSHLGLPLPLLSSGGWLNMNTAKAFQDYAELCFRELG DLV LW1TT EPNRLSD1V1Y RTSNDTYRAAHNL 1AHAQVWHLYDRQYRPVQHGAVS LSLHCDWAEPANPFVDSHWKA AERFLQFE1AWFADPLF TGDYPSVMKEYTASKNQRG LSSSVLPRFTAKESRLVKGTVDFYALNHFTTRFVIHKQLNTNRSVADRDVQFLQDITRLS SPSRLAVTPWGVRKLLAWIRRNYRDRDIYITANG1DDLALEDDQIRKYYLEKYVQEAL AYL1DKVK1KGYYAFKLTEE SKPRFGFFTSDFRAK.SSVQFYSI L1SSSGLPAENRSPACG QPAEDTDC ICSFLVEKJS LIFFGCCFISTLAVLLSITVFH^ GHSRVFS (SEQ ID NO:471) Residuos Murinos 1M-193L M TGCAAGSPGNEWIFFSSDER TRSRKTMSNRALQRSAVLSAFVLLRAVTGFSGDGK AIWD QYVSPVNPSQLFLYDTFPK FSWGVGTGAFQVEGSW TDGRGPS1WDRYVYS HLRGVNGTDR STDS YTFLEKDLL ALDFLGVSF YQFS1 S WPRLFPNGTV A A VN AQGLR YY RALLDSLVLRNIEPTVTL (SEQ TD NO:472) Residuos Murinos 82P-302S PKNFSWGVGTGAFQVEGSWKTDGRGPS1WDRYVYSHLRGVNGTDRSTDSYJFLEKDLL ALDFLGVSFYQFSISWPRLFPNGTVAAVNAQGLRYYRALLDSLVLRNTEPrVTLYHWDLP LTLQEEYGGWKNATMTDLFNDYATYCFQTFGDRVKYW1T1HNPYLVAWHGFGTG HA PGEKGNLTAWWGHNLI AHS VWH YDK FRPHQKGWLSITLGS (SEQ ID NO:473) Residuos Murinos 194Y-416G YHWnDLPLTLQEEYGGWKNATMlDLF DYATYCFQTFGDRVKYWITTH PYLVAWHGF GTGMHAPGEKGNLTAVYTVGH LTKAHSKVWH YDKNFRPHQ GWLSTTLGSHWIEP NRTDNMEDVINCQHSMSSVLGWFANPIHGDGDYPEFMKTGAMIPEFSEAJEKEEVRGTA DFFAFSFGPN FRPSNTWK GQNVSLNLRQVLNW1 LEYDDPQ1LTSENG (SEQ ID NO:474) Residuos Murinos 302S-506F SHWTEPNRTDNMEDVINCQHSMSSVLGWFANPTHGDGDYPEFMKTGA TPEFSEAEKEE VRGTADFFAFSFGPNNFRPSNTVV MGQNVSLNLRQVLNWTKLEYDDPQILTSENGWFT DSYIKTEDTTAIYMMKNFLNQVLQAIKFDEIRVFGYTAWTLLDGFEWQDAYTTRRGLFY VDFNSEQKER P SSAHYY QIIQDNGF (SEQ ID NO:475) Residuos Murinos 416G-519P GWFTDSYIKTEDTTAIYMMKNFLNQVLQAT FDEIRVFGYTAWTLLDGFEWQDAYTTR RGLFYVDFNSEQKERJ P SSAHYYKQIIQDNGFPLKESTPDM GRF (SEQ ID NO:476) Residuos Murinos 507P-632G PL ESTPDM GRFPCDFSWGVTESVL PEFTVSSPQFTDPHLYVWNVTGNRLLYRVEGV RLKTRPSQCTDYVST KRVEMLAKMKVTHYQFALDWTSILPTGNLS VNRQVLRYYRC WSEGLKLG (SEQ ID NQ:477) Residuos Murinos 520P-735A PCDFSWGVTESVL PEFTVSSPQFTDPHLYVWNVTGNRLLYRVEGVRLKTRPSQCTDY VSI KRVEMLA M VTHYQFALDWTSILPTGNLSKVNRQVLRYYRCVVSEGLKLGVFP MVTLYHPTHSHLGLPLPLLSSGGWLNMNTAKAFQDYAELCFRELGDLV LWITINEPNR LSDMYNRTSNDTYRAAHNLMIAHAQVWHLYDRQYRPVQHGA (SEQ ID NO:478) Residuos Murinos 632G-849Q GVFPMVTLYHPTHSHLGLPLPLLSSGGWLNAfNTAKAFQDYAELCFRELGDLVKLWITIN EPNRLSDMYNRTSNDTYRAAHNLMIAHAQVWHLYDRQYRPVQHGAVSLSLHCDWAE PANPFVDSHWKAAERFLQFEIAWFADPLFKTGDYPSVM EYIASKNQRGLSSSVLPRFT AKESRXVKGTVDFYALNFIFTTRJFVIHKQLNTmSVADRDVQFLQ (SEQ ID NO:479) Residuos Murinos 735A- 963S.
AVSLSLHCDWAEPANPFVDSHWKAAERFLQFETAWFADPLFKTGDYPSV KEYTASKN QRGLSSSVLPRFTAKESRLVKGTVDFYAINHFTTRFVIHKQLNT RSVADRJDVQFLQDIT P SSPSRLAVTPWGVRKLLAW1RRNYRDRD1YJTANGIDDLALEDDQIRKYYLEK.YVQE AL AYL1D .V JKGYYAF J-TEEKSKPRFGFFTSDFRAK.SSVQFYS L1SSS (SEQ ID NO:480) Residuos Murinos 1M-81F MKTGCAAGSPGNEWIFFSSDER TRSRKTMSNRALQRSAVLSAFVLLRAVTGFSGDGK AIWD KQYVSPVNPSQLFLYDTF (SEQ ID NO:481) Residuos Murinos 82P-193L P NFSWGVGTGAFQVEGSWKTDGRGPSTWDRYWSHLRGVNGTDRSTDSYTFLE DLL ALDFLGVSFYQFSISWPRLFPNGTVAAVNAQGLRYYRALLDSLVLRNIEPIVTL (SEQ ID NO:482) •Las quimeras generadas usando las secuencias ß-Klotho de muríno comprenden los siguientes componentes: Las quimeras generadas comprenden las siguientes secuencias de aminoácidos: (i) huBeta_Klotho (1-81, 523-104 ) (muBetaKLOTHO 82-520) MKPGCAAGSPGNEWIFFSTDEITTRYRNTMSNGGLQRSVILSALILLRAV TGFSGDGRAIWS PNFTPVNESQLFLYDTFPK FSWGVGTGAFQVEGSW KTDGRGPS1WDRYVYSHLRGVNGTDRSTDSY1FLEKDLLALDFLGVSFYQ FS1S WPRLFPN GT V AA VN AQGLR Y YRALLDSL VLR 1EP1 VTL Y H WDLPL TLQEEYGGWKNATMTDLFNDYATYCFQTFGDRVKYWTT1FTNPYLVAWHGF GTGMHAPGEKGNLTAVYTVGHNLT AHSKVWHNYDKNFRPHQKGWLSTTL GSHWIEPNRTDNMEDVINCQHSMSSVLGWFANPIHGDGDYPEFM TGAMI PEFSEAEKEEVRGTADFFAFSFGPNNFRPSNTWKMGQNVSLNLRQVLNW 1 EYDDPQ1L1SENGWFTDSY1 TEDTTA1YMM FLNQVLQA1 FDE1 RVFG YTA WTLLDGFE WQD AYTTRRG LF Y VDFN SEQ JERKPKS S AH Y Y Q1 TQDNGFPLKESTPDMKGRFPCDFSWGVTESVL PESVASSPQFSDPHLYV WNATGNRLLHRVEGVRL TRPAQCTDFV TKKQLEMLARMKVTHYRFALD WASVLPTGNLSAVNRQALRYYRCWSEGLKLGISAMVTLYYPTHAHLGLP EPLLHADGWLNPSTAEAFQAYAGLCFQELGDLVKLWITINEPNRLSDIY RSGNDTYGAAHNLLVAHALAWRLYDQQFRPSQRGAVSLSLHADWAEPANP YADSHWPxAAERFLQFElAWFAEPLF TGDYPAAMREYlASKHRRGLSSSA LPRLTEAERRLLKGTVDFCALNHFTTRFVMHEQLAGSRYDSDRDIQFLQD TTRLSSPTRLAVlPWGVRKLLRWVRRNYGDMDrYlTASGTDDQALEDDRL RKYYLG YLQEVL AYLID VRIKGYYAFKLAEEKSKPRFGFFTSDFKAK SS1QFYN VISSRGFPFENSSSRCSQTQENTECTVCLFLVQK PLIFLGC CFFSTLVLLLSlAlFQRQKRRKFWKAKi LQHlPLK G RVVS (SEQ 1D NO:455) (ii) huBeta_Klotho (1-507) (muBetaKLOTHO 506F-1045S) MKPGCAAGSPGNEWTFFSTDETTTRYRNTMSNGGLQRSVTLSALTLLRAV TGFSGDGRA1WSK PNFTPVNESQLFLYDTFP NFFWGIGTGALQVEGSW KK GKGPSIWDHFIHTHL NVSSTNGSSDSYIFLE DLSALDFIGVSFYQ FS1S WPRLFPDG 1 VT V AN AKGLQ Y Y STLL DAL VLRN1EP1 VTL Y H WDLPL ALQE YGGWK DT11DIFNDYATYCFQMFGDRVKYW1T1HNPYLVAWHGY GTGMHAPGEKGNLAAVYTVGH LÍKAHS VWHNYNTHFRPHQKGWLSÍTL GSHWTEPNRSENTMDTFKCQQSMVSVLGWFANP1HGDGDYPEG RKKLFS VLPIFSEAEKHEMRGTADFFAFSFGPNNF PLNTMAKMGQNVSLNLREAL NW1KLEY PRJLIAENGWFTDSRVÍ TEDTTAIYMM FLSQVLQAIRLD E1RVFGYTAWSLLDGFEWQDAYT1RRGLFYVDFNS Q ERKPKSSAHYYK QITRENGFPLKESTPDMKGRFPCDFSWGVTESVLKPEFTVSSPQFTDPHL YVWNVTGNRLLYRVEGVRL TRPSQCTDY^VSIKKRVEMLAKMKVTHYQFA LDWTSILPTGNLSKVNRQVLRYYRCWSEGLKLGVFPMVTLYHPTHSHLG LPLPLLSSGGWLNMNTAKAFQDYAELCFRELGDLV LW1T1NEPNRLSDM YNRTSNDTYRAAHNLM1AHAQVWHLYDRQYRPVQHGAVSLSLHCDWAEPA NPFVDSHWKAAERFLQFETAWFADPLFKTGDYPSV KEYTASKNQRGLSS SVLPRFTA ESRLV GTVDFYALNHFTTRFVTHKQLNTNRSVADRDVQFL QDITRLSSPSRLAVTPWGVRKLLAWIRRNYRDRDIYITA GIDDLALEDD QIRKYYLEKYVQEALKAYLID V IKGYYAFKLTEE SKPRFGFFTSDFR AKSSVQFYS. L1SSSGLPAENRSPACGQPAEDTDCT1CSFLVEKKPL1FF GCCF1STLAVLLS1TVFHHQ RRKFQ ARNLQNIPLKKGHSRVFS (SEQTDNO:456) (iii) huBeta_Klotho (194-1044) (muBetaKLOTHO 1-L193) MKTGCAAGSPGNEWIFFSSDERNTRSRKTMSNRALQRSAVLSAFVLLRAV TGFSGDGKA1WDK QYVSPVNPSQLFLYDTFPKNFSWGVGTGAFQVEGSW KTDGRGPS1WDRYVYSHLRGVNGTDRSTDSY1FLEKDLLALDFLGVSFYQ FSTSWPRLFPNGTVAAV AQGLRYYRALLDSLVLRNTEPTVTLYHWDLPL ALQE YGGWKNDT1TDTFNDYATYCFQMFGDRVKYWTTTH PYLVAWHGY GTGMHAPGE GNLAA TVGEiNLIKAHS VWHNYNTHFRPHQKGWLSITL GSHWIEPNRSENTMDIFKCQQSMVSVLGWFANPIHGDGDYPEGMRKKLFS VLPIFSEAEKHEMRGTADFFAFSFGPNNFJ PLNTMA JVIGQNVSLNLRJEAL NW1 LEYNNPR1L1AENGWFTDSRV TEDTTA1YMM JSFLSQVLQA1RLD ETRVFGYTAWSLLDGFEWQDAYTTRRGLFYVDFNSKQKERKPKSSAHYYK Q1TRENGFSL ESTPDVQGQFPCDFSWGVTESVL PESVASSPQFSDPHL YY ATGNRLLHRVEGVRL TRPAQCTDFV IKKQLEMLAR KVTHYRFA LDWASVL PTGNLSAVNRQALRYYRCVVSEGLKLGISAMVTLYYPTHAHLG LPEPLLHADGWLNPSTAEAFQAYAGLCFQELGDLVKLWIT1NEPNRLSDI YNRSGNDTYGAAHNLLVAHALAWRLYDQQFRPSQRGAVSLSLHADWAEPA NPYADSHWRAAERFLQFEIAWFAEPLF TGDYPAAMREYIAS HRRGLSS SALPRLTEAERRLLKGTVDFCALNHFTTRFVMHEQLAGSRYDSDRD1QFL QDÍTRLSSPTRLAV1PWGVR LLRWVRRNYGDMDTYTTASG1DDQALEDD RLRKYYLGKYLQEVL AYLID VRIKGYYAFKLAEEKS PRFGFFTSDF AKSSIQFYN VISSRGFPFENSSSRCSQTQENTECTVCLFLVQKKPLIFL GCCFFSTLVLLLS1AJFQRQKRRKJFWKAK LQH1PL KGKRVVS (SEQ 1D NO:457) (iv) huBeta_Klotho (1-81, 303-1044) (muBetaKLOTHO 82P-302S) MKPGCAAGSPGNEWTFFSTDETTTRYRNTMSNGGLQRSVTLSALTLLRAV TGFSGDGRAIWSKNPNFTPV ESQLFLYDTFPKNFSWGVGTGAFQVEGSW KTDGRGPSIWDRYVYSHLRGV GTDRSTDSYIFLEB DLLALDFLGVSFYQ FSISWPRLFPNGTVAAV AQGLRYYRALLDSLVLRNIEPIVTLYHWDLPL TLQEEYGGWKNATM1DLFNDYATYCFQTFGDRV YW1T1HNPYLVAWHGF GTGMHAPGEKGNLTAVYTVGHNLTKAHSKVWH YDK FRPHQKGWLSTTL GSHWTEPNRSENTMDTFKCQQSMVSVLGWFANPTHGDGDYPEGMRKKLFS VLPIFSEAEKHEMRGTADFFAFSFGPN FKPLNTMAKMGQNVSLNLREAL NWIKLEY NPRILIAENGWFTDSRVKTEDTTAIYMMfiNFLSQVLQAIRLD E1RVFGYTAWSLLDGFEWQDAYT1RRGLFYVDFNS QKER PKSSAHYYK QIIRENGFSLKESTPDVQGQFPCDFSWGVTESVLKPESVASSPQFSDPHL YVWATGNRLLHRVEGVRL RPAQCTDFVMKKQLEMLARMKVTHYRFA LDWASVLPTGNLSAVNRQALRYYRCVVSEGLI LGlSAMVTLYYPTliAHLG LPEPLLHADGWLNPSTAEAFQAYAGLCFQELGDLVKJLW1T1NEPMRLSD1 YNRSGNDTYGAAHNLLVAHALAWRLYDQQFRPSQRGAVSLSLHADWAEPA NPYADSHWRAAERFLQFETAWFAEPLF TGDYPAAMREYIASKHRRGLSS SALPRLTEAERRLL GTVDFCALNHFTTRFVMHEQLAGSRYDSDRDIQFL QDITRLSSPTRLAVIPWGVRKLLRWVRRNYGDMDIYITASGIDDQALEDD RLRKYYLGKYLQEVL AYL1DKVR1 GYYAF LAEEKSKPRFGFFTSDF AKSS1QFYNKV1SSRGFPFENSSSRCSQTQENTECTVCLFLVQKKPL1FL GCCFFSTLVLLLS1ATFQRQKRR FWKAKNLQH1PLKKGKRVVS (SEQ 1D NO:458) (v) huBeta_Klotho (1-193, 419-1044) (muBetaKLOTHO Y194-416G) MKPGCAAGSPGNEWIFFSTDEITTRYR TMSNGGLQRSVILSALlLLPvAV TGFSGDGRA1WS PNFTPVNESQLFLYDTFP FFWG1GTGALQVEGSW KJ G GPS1WDHF1HTHLKJSIVSSTNGSSDSY1FLE JDLSALDF1GVSFYQ FSTSWPRLFPDGIVTVANAKGLQYYSTLLDALVLRNIEPIVTLYHWDLPL TLQEEYGGWKNATMTDLFNDYATYCFQTFGDRVKYWTTTHNPYLVAWHGF GTGMHAPGE GNLTAVYTVGHNLIKAHSKVWHNYDK FRPHQKGWLSITL GSHWIEPNRTDNMEDVINCQHSMSSVLGWFANPIHGDGDYPEF KTGA I PEFSEAE EEVRGTADFFAFSFGPNNFRPSNTVV MGQNVSLNLRQVLNW 1 LE Y DDPQ1LJ SEN G WFTDSRVKTEDTTA1 Y MMKI FLSQ VLQA1RLDE1 RVFGYTAWSLLDGFEWQDAYTTRRGLFYVDFNSKQ ERKPKSSAHYYKQT TRENGFSLKESTPDVQGQFPCDFSWGVTESVLKPESVASSPQFSDPHLYV W ATGNRLLHRVEGVRL TRPAQCTDFWIKKQLEMLAR VTHYRFALD WASVLPTGNLSAV RQALRYYRCWSEGLKLGISAMVTLYYPTHAHLGLP EPLLHADGWL PSTAEAFQAYAGLCFQELGDLVKLWITINEPNRLSDIYN RSGNDTYGAAHNLLVAHALAWRLYDQQFRPSQRGAVSLSLHADWAEPANP" YADSHWRAAERFLQFE1AWFAEPLFKTGDYPAAMREY1ASKHRRGLSSSA LPRLTEAERRLLKGTVDFCALNHFTTRFVMHEQLAGSRYDSDRDIQFLQD 1TRLSSPTRLAVTPWGVRKLLRWVRRNYGDMDTY1TASGTDDQALEDDRL RKYYLG YLQEVLKAYLIDKVRJKGYYAFKLAEEKSKPRFGFFTSDFKA SSIQFYNKVISSRGFPFENSSSRCSQTQENTECTVCLFLVQKKPLIFLGC CFFSTLVLLLSIAIFQRQK^R EW AKNLQHIPL KGKRVVS (SEQ 1D NO:459) (vi) huBeta_Klotho (1-301, 509-1044) (muBetaKLOTHO S302-F506) MKPGCAAGSPGNEWTFFSTDETTTRYRNT SNGGLQRSVTLSALTLLRAV TGFSGDGRAIWS NPNFTPVNESQLFLYDTFPKNFFWGIGTGALQVEGSW KKDGKGPSIWDHFIHTHLKNVSSTOGSSDSYIFLE DLSALDFIGVSFYQ FS1SWPRLFPDG1VTVANAKGLQYYSTLLDALVLRN1EP1VTLYHWDLPL ALQE YGGW NDT11D1FNDYATYCFQMFGDRV YW1T1EINPYLVAWHGY GTGMHAPGE GNLAAVYTVGHNL1KAHS VWHNYNTHFRPHQKGWLSTTL GSHW1EPNRTDNMEDVTNCQHSMSSVLGWFANPTHGDGDYPEFMKTGA T PEFSEAEKEEVRGTADFFAFSFGP FRPSNTVVKMGQNVSLNLRQVLNW IKLEYDDPQILISENGWTDSYIKTEDTTAIYMMK FLNQVLQAIKFDEI RVFGYTAWTLLDGFEWQDAYTTRRGLFYVDFNSEQ ERKPKSSAHYY QT IQDNGFSLKESTPDVQGQFPCDFSWGVTESVL PESVASSPQFSDPHLYV WNATGNRLLHRVEGVRLK.TRPAQCTDFVNIK QLEMLARM VTHYRFALD WASVLPTGNLSAVNRQALRYYRCVVSEGL GJSAMVTLYYPTHAHLGLP EPLLHADGWLNPSTAEAFQAYAGLCFQELGDLV LW1T1MEPNRLSDIYN RSGNDTYGAAHNLLVAHALAWRLYDQQFRPSQRGAVSLSLHADWAEPANP YADSHWRAAERFLQFETAWFAEPLFKTGDYPAA REYTASKHRRGLSSSA LPRLTEAERRLL GTVDFCALNHFTTRFVMHEQLAGSRYDSDRDIQFLQD ITRLSSPTRLAVIPWGVRi LRWRRNYGDMDmTASGIDDQALEDDRL RKYYLGKYLQEVLKAYLID VRJKGYYAF LAEE S PRFGFFTSDFKA SS1QFYNKVISSRGFPFENSSSRCSQTQENTECTVCLFLVQKKPL1FLGC CFFSTLVLLLSIATFQRQKRRKFWKAKNLQHIPLKKGKRVVS (SEQ TD NO:460) (vii) huBeta_Klotho (1-417, 522-1044) (muBetaKLOTHO G416- F519) MKPGCAAGSPGNEWIFFSTDEITTRYRNTMSNGGLQRSVILSALILLRAV TGFSGDGRAIWS JSIPNFTPVNESQLFLYDTFPKJSIFFWGIGTGALQVEGSW KJ )GKGPS1WDHF1HTHLK VSSTNGSSDSY1FLEKDLSALDF1GVSFYQ FSTSWPRLFPDGIVTVANAKGLQYYSTLLDALVLRNTEPIVTLYHWDLPL ALQEKYGGWKNDTIIDTFNDYATYCFQMFGDRVKYWITTFINPYLVAWHGY GTGMHAPGE GNLAAWTVGH LIK_AHSKVWHNYNTHFRPHQKGWLSITL GSHWIEPNRSENTMDIFKCQQSMVSVLGWFANPIHGDGDYPEGMRKKLFS VLP1FSEAEKHEMRGTADFFAFSFGPNNF PLNTMAKJV1GQNVSLNLREAL NW1KLEYNNPRJL1AENGWFTDSYIKTEDTTAIYMM NFLNQVLQA11 FD E1RVFGYTAWTLLDGFEWQDAYTTRRGLFYVDFNSEQKERKPKSSAHYYK QTTQDNGFPL ESTPDMKGRFPCDFSWGVTESVLKPESVASSPQFSDPHL YVW ATGNRLLHRVEGVRL TRPAQCTDF^VNI KQLEMLARMKVTHYRFA LDWASVLPTGNLSAVNRQALRYYRCVVSEGL LGISAMVTLYYPTHAHLG LPEPLLHADGWLNPSTAEAFQAYAGLCFQELGDLVKLWITINEPNRLSDI YNRSGNDTYGAAHNLLVAHALAWRLYDQQFRPSQRGAVSLSLHADWAEPA NPYADSHWRAAERFLQFE1AWFAEPLFK.TGDYPAAMREY1ASKÜRRGLSS SALPRLTEAERRLLKGTVDFCALNHFTTRFV HEQLAGSRYDSDRD1QFL QDTTRLSSPTRLAVIPWGVR LLRWVRRNYGDMDIYITASGIDDQALEDD RLRKYYLGKYLQEVL AYLIDKVRIKGYYAFKLAEEKS PRFGFFTSDFK AKSSIQFY VISSRGFPFENSSSRCSQTQENTECTVCLFLVQKKPLIFL GCCFFSTLVLLLS1AJFQRQKRRKFW A . LQH1PL J GKRVVS (SEQ 1D NO:4 1) (viii) huBeta_Klotho (1-507, 635-1044) (muBeta KLOTHO F06-G632) MKPGCAAGSPGNEW1FFSTDETTTRYRNTMSNGGLQRSVTLSALTLLRAV TGFSGDGRAIWSKNPNFTPVNESQLFLYDTFPKNFFWGIGTGALQVEOSW KKDGKGPSIWDHFIHTHLK VSSTNGSSDSYIFLE DLSALDFIGVSFYQ FSISWPRLFPDG1VTVANAKGLQYYSTLLDALVLR>J1EP1VTLYHWDLPL ALQEKYGGW J DT11D1FNDYATYCFQMFGDRVKYW1T1HNPYLVAWHGY GTGMHAPGE GNLAAVYTVGHNLTKAHSKVWHNYNTHFRPHQKGWLSTTL GSHWTEPNRSENTMDTFKCQQSMVSVLGWFANPTHGDGDYPEGMRKKLFS VLPIFSEAEKHEMRGTADFFAFSFGPNNF PLNTMA N4GQNVSLNLREAL NWIKLEYNNPRJLIAENGWFTDSRV TEDTTAIYMMItNFLSQVLQAIRLD E1RVFGYTAWSLLDGFEWQDAYT1RRGLFYVDFNS QKERKPKSSAHYYK QIIRENGFPLKESTPDMKGREPCDFSWGVTESVL PEFTVSSPQFTDPHL W VTGNRLLYRVEGVRL TRPSQCTDYVSIKKRVEMLAKMKVTHYQFA LDWTS1LPTGNLSKVNRQVLRYYRCVVSEGLKLG1SAMVTLYYPTHAHLG LPEPLLHADGWLNPSTAEAFQAYAGLCFQELGDLV LW1T1NEPNRLSD1 YNRSGNDTYGAAHNLLVAHALAWRLYDQQFRPSQRGAVSLSLHADWAEPA NPYADSHWRAAERFLQFEIAWFAEPLF TGDYPAAMREY1ASKHRRGLSS SALPRLTEAERRLL GTVDFCALNHFTTRFVMHEQLAGSRYDSDRDIQFL QDITRLSSPTRLAVIPWGVRKELRWVRRNYGDMDIYITASGIDDQALEDD RLR YYLGKYLQEVL AYL1DKVR1 GYYAFICLAEEKS PRFGFFTSDF A SS1QFYNKV1SSRGFPFENSSSRCSQTQENTECTVCLFLVQKJ PL1FL GCCFFSTLVLLLS1ATFQRQKRRKFWKAKNLQH1PL GKRVVS (SEQ 1D NO:462) (ix) huBeta_Klotho (1-521, 738-104 ) (muBeta KLOTHO 520P-735A) MKPGCAAGSPGNEWIFFSTDEITTRYR TMSNGGLQRSVILSAIILLRAV TGFSGDGRAIWS NPNFTPVNESQLFLYDTFPK FFWGIGTGALQVEGSW KKJDGKGPSIWDHFIHTHLKJSIVSSTNGSSDSY FLEI DLSALDFIGVSFYQ FSTSWPRLFPDGrVTVANA GLQYYSTLLDALVLRNlEPlVTLYHWDLPL ALQE YGGWKNDT1ID1F DYATYCFQMFGDRV YWTTTH PYLVAWHGY GTGrvlHAPGEKG LAAWTVGFÍNLIKAHSKVWHNYNTHFRPHQKGWLSITL GSHWIEPNRSENTMDIFKCQQSMVSVLGWFANPIHGDGDYPEGMRKKLFS VLP1FSEAE HEMRGTADFFAFSFGPNNF PLNTMA MGQNVSLNLREAL NW1 LEYNNPR1L1AENGWFTDSRVKTEDTTA1YMM Í FLSQVLQA1RLD E1RVFGYTAWSLLDGFEWQDAYT1RRGLFYVDFNS QKERKPKSSAHYYK Q1TRENGFSL ESTPDVQGQFPCDFSWGVTESVL PEFTVSSPQFTDPHL YV VTGNRLLYRVEGVRLKTRPSQCTDYVSIKKRVEMLAKMKVTHYQFA LDWTSILPTGNLSKVNRQVLRYYRCWSEGLKLGVFPMVTLYHPTHSHLG LPLPLLSSGGWLNMNTAKAFQDYAELCFRELGDLVKLWITINEPNRLSDM YNRTSNDTYRAAHNLM1AHAQVWHLYDRQYRPVQHGAVSLSLHADWAEPA NPYADSHWRAAERFLQFE1AWFAEPLF TGDYPAAMREY1AS HRRGLSS SALPRLTEAERRLL GTVDFCALNHFTTRFV HEQLAGSRYDSDRD1QFL QDTTRLSSPTRLAVIPWGVR LLRWVRRNYGDMDIYITASGIDDQALEDD RLRKYYLGKYLQEVL AYLIDKVRJKGYYAFKLAEE SKPRFGFFTSDFK AKS SIQF YN VISSRGFPFENS S SRC S QTQE TECTVCLFL VQKKPLIFL GCCFFSTLVLLLS1AJFQRQKRRKFWKAK LQH1PL KGKRVVS (SEQ 1D NO:463) (x) huBeta_Klotho (1-633, 852-104 ) (muBeta KLOTHO 632G-849Q) MKPGCAAGSPGNEWTFFSTDETTTRYRNT SNGGLQRSVTLSALTLLRAV TGFSGDGRAIWSKNPNFTPVNESQLFLYDTFPKNFFWGIGTGALQVEGSW KKDGKGPSIWDHFIHTHLKNVSSTNGSSDSYIFLEKDLSALDFIGVSFYQ FS1SWPRLFPDG1VTVANA GLQYYSTLLDALVLRN1EP1VTLYHWDLPL ALQE YGGW DT11D1FNDYATYCFQMFGDRVKYW1T1HNPYLVAWHGY GTGMHAPGEKGNLAAVYTVGHNL1 AHSKVWH Y THFRPHQKGWLS1TL GSHWTEPNRSENTMDTFKCQQS VSVLGWFANPTHGDGDYPEG RKKLFS VLPIFSEAEKHEMRGTADFFAFSFGPNNFKPLNTMAKMGQNVSLNLREAL NWIKLEY PRJLIAENGWFTDSRV TEDTTAIYMMKNFLSQVLQAIRLD E1RVFGYTAWSLLDGFEWQDAYT1RRGLFYVDFNSKQKERKPKSSAHYYK QIIRENGFSLKESTPDVQGQFPCDFSWGVTESVLKPESVASSPQFSDPHL YVWNATGNRLLHRVEGVRLKTRPAQCTDFV IKKQLEMLARMKVTHYRFA LDWASVLPTGNLSAVNRQALRYYRCVVSEGLKLGVFPMVTLYHPTHSHLG LPLPLLSSGGWLNMNTAKAFQDYAELCFRELGDLV LW1T1NEPNRLSDM Y RTSNDTYRAAH LMTAHAQVWHLYDRQYRPVQHGAVSLSLHCDWAEPA NPF VD SHWK AAERFLQFE1A WF A DPLFKTGD YP S VMKEYT A S KNQR GLS S SVLPRFTAKESRLVKGTVDFYAL HF TRFVIHKQLNTNRSVADRDVQFL QDITRLSSPTRLAVIPWGVRKLLRWYRR YGDMDIYITASGIDDQALEDD RJ^PJ.YYLGKYLQEVL AYL1D VR1KGYYAF LAEEKS PRFGFFTSDF A SS1QFYNKV1SSRGFPFENSSSRCSQTQENTECTVCLFLVQ KPL1FL GCCFFSTLVLLLSIATFQRQKRRKFWKAKNLQHIPLKKGKRVVS (SEQ 1D NO:464) (xi) huBeta_Klotho (1-73-6, 967-1044 ) (muBeta KLOTHO 735A-963S) MKPGCAAGSPGNEWIFFSTDEITTRYRNTMSNGGLQRSVILSALILLRAV TGFSGDGRAIWSK PNFTPVNESQLFLYDTFP MFFWG1GTGALQVEGSW KJ DGKGPS1WDHF1HTHL VSSTNGSSDSY1FLEKDLSALDF1GVSFYQ FSTSWPRLFPDG VTVANAKGLQYYSTLLDALVLRNTEPTVTLYHWDLPL ALQE YGGWKNDTUDIF DYATYCFQMFGDRV YWTTTH PYLVAWHGY GTGMHAPGEKGNLAA TVGH LIKAHS VWHNYNTHFRPHQKGWLSITL GSHWIEPNRSENTMDIFKCQQSMVSVLGWFANPIHGDGDYPEGMRKKLFS VLP1FSEAE HEMRGTADFFAFSFGPNNF PLNTMAKMGQNVSLNLREAL NW1KLEYNNPRJL1AENGWFTDSRV .TEDTTA1YMMK FLSQVLQA1RLD EIRVFGYTAWSLLDGFEWQDAYTIRRGLFYVDFNS QKER P SSAHYY QT1RENGFSLKESTPDVQGQFPCDFSWGVTESVL PESVASSPQFSDPHI.
YVW ATGNRLLHRVEGVRLKTRPAQCTDFVNI KQLEMLARMKVTHYRFA LDWASVLPTGNLSAVNRQALRYYRCVVSEGLKLGISAMVTLYYPTHAHLG LPEPLLHADGWLNPSTAEAFQAYAGLCFQELGDLVKLWITINEPNRLSDI YNRSGNDTYGAAHMLLVAHALAWRLYDQQFRPSQRGAVSLSLHCDWAEPA NPFVDSHWKAAERFLQFEJAWFADPLFK.TGDYPSYM EY1AS NQRGLSS SVLPRFTAKESRLV GTVDFYALNHFTTRFVTHKQLNTNRSVADRDVQFL QDTTRLSSPSRLAVTPWGVRKLLAWTRRNYRDRD1YTTANGTDDLALEDD QIRKYYLEKYVQEALKAYLIDKVKIKGYYAFKXTEE SKPRFGFFTSDFR A S S VQFYSKLI SS SGFPFENS S SRCS QTQENTECTVCLFL VQK PLIFL GCCFFSTLVLLLS1A1FQRQKRRKFWKA LQH1PLKKGKRVVS (SEQ 1D NO:465) (xii) huBeta_Klotho (82-1044) (muBeta KLOTHO 1-81F) MKTGCAAGSPGNEWTFFSSDERNTRSR TMSNRALQRSAVLSAFVLLRAV TGFSGDGKAIWDK QYVSPV PSQLFLYDTFPK FFWGIGTGALQVEGSW KKDGKGPSI WDHFIHTFÍLK-NVS STNGSSD S Y1FLE DL S ALDFIGVSF YQ FS1SWPRLFPDG1VTVANA GLQYYSTLLDALVLRN1EPJVTLYHWDLPL ALQEKYGGW DT11D1FNDYATYCFQMFGDRV YW1T1HMPYLVAWHGY GTGMHAPGEKGNLAA TVGHNLÍKAHS VWH YNTHFRPHQKGWLSTTL GSHW1EPNRSENTMDTFKCQQSMVSVLGWFANPTHGDGDYPEGMRKKLFS VLPIFSEAEKHEMRGTADFFAFSFGPNNFKPLNTMAKMGQNVSLNLREAL NWIKLEY PRJLIAENGWFTDSRV TEDTTAIYMMKNFLSQVLQAIRLD E1RVFGYTAWSLLDGFEWQDAYT1RRGLFYVDFNS Q ERKPKSSAHYYK QIIRENGFSLKESTPDVQGQFPCDFSWGVTESVLKPESVASSPQFSDPHL YVW ATGNRLLHRVEGVRL TRPAQCTDFVMKKQLEMLARMKVTHYRFA LDWASVLPTGNLSAVNRQALRYYRCVVSEGL JLG1SAMVTLYYPTHAHLG LPEPLLHADGWLNPSTAEAFQAYAGLCFQELGDLVKJLWIT1NEPNRLSD1 YNRSGNDTYGAAH LLVAHALAWRLYDQQFRPSQRGAVSLSLHADWAEPA NPYADSHWRAAERFLQFETAWFAEPLF TGDYPAAMREYIASKHRRGLSS SALPRLTEAERRLL GTVDFCALNHFTTRFVMHEQLAGSRYDSDRDIQFL QDITRXSSPTRLAVIPWGVRKLLR RR YGDMDIYITASGIDDQALEDD RLR Y YLGKYLQE VLKAYL1D VRIKG Y Y AFK AEEK.S PRFGFFTSDF AKSSIQFYNKV1SSRGFPFEMSSSRCSQTQENTECTVCLFLVQ KPL1FL GCCFFSTLVLLLSIATFQRQKRRKFWKAKNLQHIPLKKGKRVVS (SEQ 1D NO:466) (xiii) huBeta_Klotho (1-81, 194-1044 ) (muBeta KLOTHO 82P-193L) MKPGCAAGSPGNEWIFFSTDEITTRYRNTMSNGGLQRSVILSALILLRAV TGFSGDGRAJWSKNPNFTPVNESQLFLYDTFPKi FSWGVGTGAFQVEGSW TDGRGPS1 WDRY VYSHLRG V GTDRSTDS Y1FLEKJDLLALDFLG VSFYQ FSTSWPRLFPNGTVAAVNAQGLRYYRALLDSLVLRNTEP1VTLYHWDLPL ALQEKYGGWKNDTTTDTF DYATYCFQMFGDRVKYWTTIFI PYLVAWHGY GTGMHAPGEKGNLAAVYTVGHNLIKAHS VWHNYNTHFRPHQKGWLSITL GSHWIEPNRSENTMDIFKCQQSMVSVLGWFANPIHGDGDYPEGMRK LFS VLPIFSEAEKHEMRGTADFFAFSFGPNNFKPLNTMAKMGQNVSLNLREAL NWlKLEYNNPRiLlAENGWFTDSRVKTEDTTAlYMMKJSlFLSQVLQAlRLD ETRVFGYTAWSLLDGFEWQDAYTTRRGLFYVDFNSKQKERKPKSSAHYYK QTTRENGFSLKESTPDVQGQFPCDFSWGVTESVLKPESVASSPQFSDPHL W ATGNRLLHRVEGVRX TRPAQCTDFV XQLEMLARMKVTHYRFA LDWASVLPTGNLSAVNRQALRYYRCVVSEGLKLGISAMVTLYYPTHAHLG LPEPLLHADGWLNPSTAEAFQAYAGLCFQELGDLVKLWITINEPNRLSDI YNRSGNDTYGAAHNLLVAHALAWRLYDQQFRPSQRGAVSLSLHADWAEPA NPYADSHWRAAERFLQFE1AWFAEPLFK.TGDYPAAMREYJAS HRRGLSS SALPRLTEAERRLL GTVDFCALNHFTTRFV HEQLAGSRYDSDRDIQFL QD1TRLSSPTRLAV1PWGVR LLRWVRRNYGD DTY1TASG1DDQALEDD RLRKYYLGKYLQEVL AYLIDKVRJKGYYAFB LAEEKSKPRPGFFTSDF AKSSIQFYN VISSRGFPFENSSSRCSQTQENTECTVCLFLVQK PLIFL GCCFFSTLVLLLS1AIFQRQ JIRKFWKAK LQH1PL KGKRVVS (SEQ 1D NO:467) Varias proteínas de enlace a antigenos proporcionas en la presente, así como FGF21 humano, se probaron por la capacidad para activar las quimeras en células L6. La Figura 30 correlaciona los resultados observados con cada molécula probada.
Estos datos indican .que mientras FGF21 humano fue capaz de activar FGFRlc combinado con todas de las quimeras ß- Klotho humanas/de ratón (el signo "+" indica actividad en el receptor) , las sustituciones de secuencias de ratón en ß- Klotho humana afectan las actividad de 16H7, 37D3, y 39F7.
Ver Figura 30. Estos resultados sugieren que las secuencias ß-Klotho 1-81, 302-522, y 849-1044 son importantes para las actividades de proteínas de enlace a antígenos agonistas y pueden representar un epítopo importante para su función.
EJEMPLO 12 ANALISIS DE PROTECCION DE PROTEASA Las regiones del receptor FGF21 humano enlazado por las ' proteínas de enlace a antígenos que enlazan el receptor FGF21 humano, por ejemplo, FGFRlc, ß-Klotho o FGFRlc y complejo de ß-Klotho puede identificarse por fragmentación del receptor FGF21 humano en péptidos con proteasas especificas, por ejemplo, AspN, Lys-C, quimiotripsina o tripsina. La secuencia de los péptidos del receptor FGF21 humano resultante (esto es, fragmentos de péptido que contienen tanto disulfuro como sin disulfuro de porciones FGFRlc y ß-Klotho) luego pueden determinarse. · En un ejemplo, las formas solubles de un receptor FGF21 humano, por ejemplo, un complejo que comprende el heterodimero FGFRlc ECD-Fc y ß- Klotho ECD-Fc descrito en la presente puede digerirse con AspN (que se desdobla después del ácido aspártico y algunos residuos de ácido glutámico en el extremo amino) al incubar alrededor de 100 µ-g de .receptor FGF21 soluble en 1.0 mg/ml en fosfato de sodio 0.1M (pH 6.5) durante 20 hrs a 37°C con 2 µq de AspN.
Un perfil de péptido de las digestiones AspN luego pueden generarse en cromatografía HPLC mientras que una digestión de control con una cantidad similar de anticuerpo se espera para ser .esencialmente resistente a endoproteasa AspN. Un ensayo de protección de proteasa luego puede realizarse para determinar la digestión proteolítica del receptor FGF21 humano en la presencia de las proteínas, de enlace a antígenos. El principio general de este ensayo es que el enlace de una proteína de enlace a antígenos al receptor FGF21 puede resultar en protección de ciertos sitios de desdoblamiento de proteasa específicos y esta información se puede usar para determinar la región o porción del receptor FGF21 donde la proteína de enlace a antígenos enlaza.
Brevemente, las digestiones de péptido pueden someterse a mapeo de péptido HPLC; los picos individuales se recolectan, y los péptidos se identifican y mapean por análisis CL-MS de ionización de electrorocío en línea (ESI-CL-EM) y/o por procesamiento por secuencia de terminal N. Los análisis HPLC para ' estos estudios pueden realizarse usando una columna C18 de fase inversa de agujero estrecho (Agilent Technologies) para análisis fuera de línea y usando una columna C18 de fase inversa capilar (El Grupo de Separación) para CL-EM. El mapeo de péptido HPLC puede realizarse con un gradiente lineal de ácido trifluoroacético al 0.05% (fase móvil A) hasta acetonitrilo al 90% en ácido trifluoroacético al 0.05%. Las columnas pueden desarrollarse en la constante de flujo deseada para HPLC de agujero estrecho para análisis CL-EM en línea y fuera de línea, y para HPLC capilar para análisis CL-EM en línea.
Los análisis de secuencias pueden conducirse en CL-EM/EM en línea y por procesamiento en secuencia Edman en los picos de péptido recuperados de HPLC. Los análisis CL-EM ESI en linea de la digestión de péptido pueden realizarse para determinar la masa precisa y secuencia de los péptidos que se separan por HPLC. Las identidades de péptidos seleccionados presentes en los picos de péptido de la digestión de proteasa pueden de esta manera determinarse.
EJEMPLO 13 ESTUDIO EN MONOS CYNOMOLGOUS Un constructo que codifica la proteina de enlace a antigenos designada en la presente como 16H7 fue generado al usar la metodología . descrita en los Ejemplos 1-3. 16H7 fue expresado, purificado y caracterizado como se describe en los Ejemplos 1-5 y fue estudiado in vivo en monos cynomolgus obesos. 16H7 es un anticuerpo IgGl completamente humano y se describe por las secuencias proporcionadas en la Tablas 1-4, supra.
Ejemplo 13.1 Diseño del Estudio El estudio se llevó a cabo en monos cynomolgus obesos. Los monos tenían 8-19 años . de edad. Sus pesos corporales estaban en el intervalo desde 7-14 kg y la BMI estaba en el intervalo de 36-74 kg/m2. Los monos se aclimataron por 6 semanas previo al inicio de la administración del compuesto. Durante el periodo de aclimatación, los monos se familizarizaron con procedimientos relacionados con el estudios, incluyendo inyección subcutánea con silla de inmovilización (PBS, 0.1 ml/kg) , cebadura (agua, 10 ml/kg) , y sangre sacada para muestras sin OGTT y con OGTT . Después de 4 semanas de entrenamiento, los parámetros de OGTT de linea basal, y metabólicos del plasma fueron medidos. 20 monos fueron seleccionados y colocados de forma aleatoria en dos grupos de tratamientos .para lograr niveles similares en linea basal de peso corporal, perfiles de glucosa OGTT, y niveles de glucosa y triglicéridos en plasma.
El estudio se. efectuó en una forma ciega. Vehículo (n=10) , 16H7 (n=10). El compuesto se dio una semana sí y otra no (5 mg/kg) . En la semana cuando los animales no fueron inyectados con 16H7, recibieron en su lugar inyección de vehículo. Después de 2 inyecciones de 16H7, los animales se monitorearon durante 6 semanas adicionales para lavado y recuperación del compuesto de los tratamientos. Ingesta de alimento, peso corporal, química clínica y OGTT fueron monitoreados a lo largo del estudio. La ingesta de alimento se midió para cada comida. El peso corporal se midió semanalmente . Se recolectaron muestras de sangre en días diferentes en estado en ayuno o alimentado para medir niveles de^ glucosa, insulina y triglicéridos. Las OGTTs se llevaron a cabo cada dos semanas después del inicio del estudio. El día que inició el tratamiento se designa como 0 y el plan de estudio detallado se muestra en la Figura 14.
Los resultados presentados en este Ejemplo representan los datos recolectados a lo largo de los 68 días del estudio.
Ejemplo 13.2 Efecto de 16H7 en la Ingesta de alimento Los animales fueron- alimentados dos veces al día, con cada animal que recibe 120 g de alimento formulado establecido durante el periodo de aclimatación. El alimento restante fue retirado y pesado después de cada comida para calcular la ingesta de alimento. Los tiempos de alimentación fueron desde las 8:00 AM a 8:30 AM (±30 minutos) y luego desde las 4:30PM a 5:00PM (±30 minutos). La fruta (150 g) fue suministrada a cada animal a las 11:30 a 12:30.PM (±30 minutos) cada día.
En comparación con el vehículo, 16H7 redujo la ingesta de alimento en los monos. El efecto disminuyó y la ingesta de alimento regresó cercana a los niveles de control o línea basal después de alrededor de 21 días de tratamiento. 16H7 no tuvo un efecto importante en la ingesta de alimento AM (Figura 15) y solamente redujo modestamente la ingesta de alimento en la comida PM durante el tratamiento (Figura 16). Un incremento en la ingesta de alimento AM se observó después del día 49 (Figura 15) . A lo largo del estudio (e incluso durante el periodo de aclimatación) , la ingesta de fruta pareció inferior en el grupo 16H7 en comparación con el grupo de vehículo. En general, 16H7 mostró un efecto importante en la inhibición de la ingesta de alimento.
Ejemplo 13.3 Efecto de 16H7 en el Peso corporal El peso corporal se monitoreó semanalmente a lo largo del estudio. Durante el curso de los tratamientos de 4 semanas, el peso corporal de los animales tratados con vehículo permaneció constante mientras que el peso corporal de los animales tratados con 16H7 disminuyó progresivamente. El peso corporal no regresó a la línea basal para el final de las 6 semanas del periodo de lavado (Figura 17) .
Ejemplo 13.4 Efecto de 16H7 en el Indice de Masa Corporal (BMI) , Circunferencia Abdominal (AC) y Grosor en el Pliegue de la Piel (SFT) BMI, AC y SFT fueron monitoreadas semanalmente a lo largo del estudio, tanto antes como después de la administración del compuesto de prueba cuando se tomó el peso corporal. La BMI se define como el peso corporal del individuo dividido por el cuadrado de su altura. SFT es el grosor de una capa doble de piel y la grasa debajo de ella cuando se mide con un calibre. ' BMI, SFT y AC son medidas relativamente precisas, · sencillas y económicas de la composición corporal, particularmente indicativas de la grasa subcutánea. Los animales tratados con vehículo mostraron BMI, SFT y AC relativamente estables a lo largo del estudio. Los animales tratados con 16H7 mostraron niveles disminuidos de BMI, AC y SFT en el curso de un estudio de 4 semanas, lo que sugiere que el compuesto 16H7 resultó en la reducción de masa de grasa. Los .resultados son mostrados en las Figuras 18-20, respectivamente. Estos parámetros medidos no regresaron a los valores de línea basal al final de las 6 semanas de periodo de lavado.
Ejemplo 13.5 Efecto de 16H7 en la Prueba de Tolerancia Oral a la Glucosa (OGTT) Las OGTTs se efectuaron antes y después del inicio de los tratamientos. Antes de las inyecciones de 16H7 los valores de línea basal para los niveles de glucosa e insulina fueron medido a lo largo de la OGTT (Figuras 21 y 22, respectivamente) y no fueron estadísticamente diferentes de forma importante entre los grupos de vehículo y 16H7. Las OGTTs posteriores a la dosis fueron efectuadas cada dos semanas durante el periodo de tratamiento y después de 3 semanas de periodo de lavado. 16H7 mejoró ligeramente la tolerancia a la glucosa después de 4 semanas, de tratamiento y 3 semanas de periodo de lavado. El modelo animal usado no es intolerante a la glucosa lo que explica los efectos modestos observados (Figura 21) . Los niveles de insulina fueron estadísticamente disminuidos de forma importante en los animales tratados con 16H7 (importancia observada en el tiempo 0 durante la OGTT efectuada después de 2 semanas de tratamiento, en el tiempo 0 y 15 minutos durante la OGTT efectuada después de 4 semanas de tratamiento y en el tiempo 0 y 60 minutos durante la OGTT efectuada después de 2 semanas de tratamiento) (Figura 22) .
Ejemplo 13.6 Efecto de 16H7 en los Niveles de insulina y Glucosa en Sangre en Ayuno y con Alimentos Se recolectó la sangre de animales en ayuno durante la noche o en condiciones de alimentación después de la alimentación en AM. En las condiciones de ayuno, se efectuó la extracción de sangre semanalmente 5 días posteriores a cada inyección. En condiciones de alimentación, la extracción de sangre se efectuó en los días 2, 11, 16, 25 y 46 posteriores a la primera inyección. 16H7 no redujo los niveles de glucosa sanguínea en ayuno o alimentación (Figuras 23 y 25) . No se observa ninguna hipoglicemia en ninguno de los monos tratados con 16H7. 16H7 resultó sin embargo, en una disminución estadísticamente importante en los niveles de insulina en plasma en ayuno y con alimentación (Figuras 24 y 26) .
Ejemplo 13.7 Efecto de 16H7 en los Niveles de Trigliceridos Se hicieron mediciones a partir de las mismas muestras recolectadas para mediciones de glucosa e insulina. Los niveles de triglicéridos fueron reducidos significativamente en los animales tratados con 16H7 cuando se miden en condiciones de ayuno o con alimentación (Figuras 27 y 28).
Ejemplo 13.8 Conclusiones En un estudio efectuado en . monos cynomolgus machos obesos, los animales tratados con 16H7 mostraron parámetros metabólicos mejorados. El peso corporal se redujo y la composición corporal fue mejorada. La reducción de corto plazo en la ingesta de alimento fue observada y el efecto disminuyó y la ingesta de alimento se recuperó hasta los niveles de control o línea basal a los 21 días dentro del estudio. Los niveles en ayuno de insulina y triglicéridos también fueron reducidos por 16H7. Los niveles de insulina medidos durante OGTT también fueron mejorados.
EJEMPLO 14 FORMAS VARIANTES DE PROTEÍNAS DE ENLACE A ANTÍGENOS 16H7 y 22H5 Proteínas de enlace a antígenos 16H7 y 22H5, las cuales están descritas en la presente en las Tablas 1-4, fueron mutadas para impartir diferentes propiedades a la molécula, tales como cambios en la solubilidad, pl, carga global, inmunogenicidad en humanos y en modelos animales, estabilidad, etc. Las mutaciones comprendieron adiciones, eliminaciones o sustituciones ya sea en la cadena ligera (designada "LC", SEQ ID NO: 14) o cadena pesada (designada "HC", SEQ ID NO: 32) de la molécula. Las mutaciones de punto sencillo descritas se hicieron individualmente o fueron combinadas dos o más- mutaciones.
Ejemplos de mutaciones y combinaciones de mutaciones que fueron introducidas dentro de las secuencias de cadena ligera y pesada de 16H7 incluyen lo siguiente: I83K (en cadena pesada de 16H7) (SEQ ID NO: 396) E16Q (en cadena pesada de 16H7) + V24F (en cadena pesada de 16H7) + I83T (en cadena pesada de 16H7)+ S100I (en cadena pesada de 16H7)+ T119L (en cadena pesada de 16H7) (SEQ ID NO:395) D109S (en cadena pesada de 16H7) (SEQ ID NO: 401) Eliminación de Y107 (en cadena pesada de 16H7) (SEQ ID NO:400) Inserción de un residuo Y en el lado N-terminal dé Y107 (en cadena pesada de 16H7) (SEQ ID NO: 405) D88R+ P89A+ V90E ' (en cadena pesada de 16H7) (SEQ ID NO:398) D49Y (en cadena ligera de 16H7) (SEQ ID NO:386) D49A (en cadena ligera de 16H7) (SEQ ID NO: 387) D91A (en cadena ligera de 16H7) (SEQ ID NO:388) D49A (en cadena ligera de 16H7)+ D91A (en cadena ligera de 16H7) (SEQ ID NO:389) Q16K (en cadena ligera de 16H7) (SEQ ID NO:385) Ejemplos de mutaciones y combinaciones de mutaciones -que fueron introducidas dentro de las secuencias de cadena ligera y pesada de 22H5 ' incluyen lo siguiente: N92Q (en cadena ligera de 22H5) (SEQ ID NO: 402) S94A (en cadena ligera de 22H5) (SEQ ID NO: 403) C109S (en cadena pesada de 22H5) (SEQ ID NO: 04) En resumen, las proteínas de enlace a antígenos generadas comprendieron los siguientes pares de cadenas ligeras y pesadas de 16H7: (i) cadena ligera de 16H7 (SEQ ID NO: 14) formando pares con una cadena' pesada de 16H7 que comprende I83K (SEQ ID NO: 396) ; (ii) cadena ligera de 16H7 (SEQ ID NO: 14) formando pares con una cadena pesada de 16H7 que comprende E16Q, V24F, I83T, S100I, T119L (SEQ ID NO:395); (iii) cadena ligera de 16H7 (SEQ ID NO: 14) formando pares con una cadena pesada de 16H7 que comprende D109S (SEQ ID NO: 401) ; (iv) cadena ligera de 16H7 (SEQ ID NO: 14) formando pares con una cadena pesada de 16H7 que comprende la eliminación de Y107 (SEQ ID NO: 400); (v) cadena ligera de 16?7 (SEQ ID NO: 14) formando pares con una cadena pesada, de 16H7 que comprende la inserción de un residuo Y en el lado N-terminal de Y107 (SEQ ID NO: 405) ; (vi) cadena ligera de 16H7 (SEQ ID NO: 14) formando pares con una cadena pesada de 16H7 que comprende D88R, P89A, V90E, (SEQ ID NO: 398); (vii) cadena pesada de 16H7 (SEQ ID NO: 32) formando pares con una cadena ligera de 16H7 que comprende D49Y (SEQ ID NO: 386) ; (viii) cadena pesada de 16H7 (SEQ ID NO: 32) formando pares con una cadena ligera de 16H7 que comprende D49A (LC) (SEQ ID NO: 387); (xi) cadena pesada de 16H7 (SEQ ID NO: 32) formando pares con una cadena ligera de 16H7 que comprende D91A (SEQ ID NO: 388) ; (ix) cadena pesada de 16H7 (SEQ ID NO: 32) formando pares con una cadena ligera de 16H7 que comprende D49A, D91A (SEQ ID NO: 389) ; (x) cadena pesada de 16H7 (SEQ ID NO: 32) formando pares con una cadena ligera de 16H7 que comprende Q16K (LC) (SEQ ID NO: 385) ; y los siguientes, pares de las secuencias de cadena ligera y pesada de 22H5: (xi) cadena pesada de 22H5 (SEQ ID NO: 31) formando pares con una cadena ligera de 22H5 que comprende N92Q (LC) (SEQ ID NO: 402) ; (xii) cadena pesada de 22H5 (SEQ ID NO: 31) formando pares con una cadena ligera de 22H5 que comprende S94A (LC) (SEQ ID NO:403); (xiii) cadena ligera de 22H5 (SEQ ID NO: 13) formando pares con una cadena pesada de 22H5 que comprende C109S (HC) (SEQ ID NO:404); · (xiv) cadena ligera de 22H5 (SEQ ID NO: 13) formando pares con una cadena pesada de 22H5 que comprende una inserción de un residuo de tirosina en la posición 107 (SEQ ID NO:405).
La secuencias de aminoácidos para las variantes generadas de cadena ligera' se muestran en la Tabla 6: Tabla 6A Secuencias de aminoácidos de Variantes 16H7 y 22H5 Tabla 6B Secuencias de Ácidos Nucleicos de Variantes 16H7 y 22H5 Tabla 6C Secuencias de aminoácidos de CDR de Variantes Tabla 6D Secuencias de Ácidos Nucleicos de CDR de Variantes Adicionalmente, un "hemicuerpo" fue generado y estudiado. Esta estructura comprendió la cadena ligera de 16H7 (L3; SEQ ID NO: 50), la cual fue formando pares con un una forma preparada por ingeniería de la cadena pesada de 16H7; la cadena pesada preparada por ingeniería comprendió la cadena pesada de 16H7 (SEQ ID NO: 32) unida por medio de una ligadura (G4S)8 (SEQ ID NO: 440) a una secuencia IgG2 Fe (SEQ ID NO: 441), la cual formó pares con la secuencia Fe de la cadena pesada de 16H7. . Las partes componentes del hemicuerp tienen las siguientes secuencias: cadena pesada de 16H7 MDMRVPAQLLGLLLLWLRGARCQVTLKESGPVLV PTETLTLTCTVSGFSLNNARMGV SWIRQPPGKALEWLAHIFSNDEKSYSTSLISRLTIS DTS SQVVLI TNMDPVDTATYY CARSVVTGGYYYDGMDVWGQGTTVTVSSAST GPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLV DYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSS TVPSSNFGTQTYTCNVDHKP SNT .VD TVERKSSVECPPCPAPPVAGPSVFLFPPKLPKDTLM1SRTPEVTCVVVDVSHED PEVQFNWYVDGVEVHNAKTKJPREEQFNSTFRVVSVLTVVHQDWLNG EY .C VSN .G LPAPIEKTISKTKGQPREPQVYTLPPSREEMTKI QVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQP ENNY TTPPMLDSDGSFFLYS LTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALH HYTQ SLSLSP (SEQ ID NO:32) Ligadura GGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGS (SEQ ID NO:440) IgG2 Fe ERKSSVECPPCPAPPVAGPSVFLFPP PKDTLMISRTPEVTCV DVSHEDPEVQFN YV DGVEVH AKT PREEQFNSTFRVVSVLTVVHQDWLNGKEYKC VSN GLPAPIE T1S KTK.GQPREPQVYTLPPSREEMTK.NQVSLTCLV .GFYPSD1AVEWESNGQPENNYKTTPP MLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK (SEQIDNO:441) La cadena pesada completa de hemicuerpo tuvo 1 secuencia de aminoácidos mostrada a continuación: •MDMRVPAQLLGLLLLWLRGARCQVTL ESGPVLVKPTETLTLTCTVSGFSLNNARMGV SW1RQPPGKALEWLAHIFSNDEKSYSTSL SRLTISKDTSKSQVVLIMT MDPVDTATYY CARSVVTGGYYYDG DVWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVK DYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSNFGTQTYTCNVDH P SNT VDKTVER SSVECPPCPAPPVAGPSVFLFPP PKDTLMISRTPEVTCVWDVSHED PEVQFNWYVDGVEVFI AKT PREEQF STFRWSVLWVHQDWLNGKEYRCKVSNKG LPA PI EKTIS T GQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLV GFYPSDIAVEWESNGQP ENNYKTTPPMLDSDGSFFLYSKLTVD SRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSP GGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSERKSSVECPPCPAPPV AGPSVFLFPPKPKDTL ISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREE QFNSTFRVVSVLTVVHQDWLNGKEYK.C .VSN GLPAP1E .T1S T .GQPREPQVYTLPP SR £ TK>JQVSLTCLVKGFYPSD1AVEWESNGQP£NNYK-TTPPMLDSDGSFFLYSKLTV DKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK (SEQ ID NO:453) la cual se codifica por la siguiente secuencia: ATGGACATGAGGGTGCCCGCTCAGCTCCTGGGGCTCCTGCTGCTGTGGCTGAGAGGT GCGCGCTGTCAGGTCACCTTGAAGGAGTCTGGTCCTGTGCTGGTGAAACCCACAGAG ACCCTCACGCTGACCTGCACCGTGTCTGGGTTCTCACTCAACAATGCTAGAATGGGT GTGAGCTGGATCCGTCAGCCCCCAGGGAAGGCCCTGGAGTGGCTTGCACACATTTTT TCGAATGACGAAAAATCCTACAGCACATCTCTGAAGAGCAGGCTCACCATCTCCAA GGACACCTCCAAAAGCCAGGTGGTCCTAATTATGACCAACATGGACCCTGTGGACA CAGCCACATATTACTGTGCACGGTCAGTAGTAACTGGCGGCTACTACTACGACGGTA TGGACGTCTGGGCCCAAGGGACCACGGTCACCGTCTCTAGTGCCAGCACCAAGGGC CCCTCCGTGTTCCCTCTGGCCCCCTGCAGCAGAAGCACCAGCGAGAGCACAGCCGCC CTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAGCCCGTGACCGTGTCTTGGAACAGC GG AGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTTCC AGCCGTGCTGCAGAGCAGCGGCCT GTACAGCCTGAGCAGCGTGGTCACCGTGCCCAGCAGCAACTTCGGCACCCAGACCT ACACCTGTAACGTGGACCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGACAGTGGA GCGGAAGTCCAGCGTGGAGTGCCCTCCTTGTCCTGCCCCTCCTGTGGCCGGACCTAG CGTGTTCCTGTTCCCCCCAAAGCCCAAGGACACCCTGATGATCAGCCGGACCCCCGA AGTGACCTGCGTGGTGGTGGACGTGTCCCACGAGGACCCCGAGGTGCAGTTCAATT GGTACGTGGACGGGGTGGAGGTGCACAACGCCAAGACCAAGCCCCGGGAGGAACA GTTCAACAGCACCTTCCGGGTGGTGTCCGTCCTCACCGTGGTGCACCAGGACTGGCT GAACGGCAAAGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAÁCAAGGGCCTGCCTGCCCCCATCG AGAAAACCATCAGCAAGACCAAGGGCCAGCCTCGGGAGCCTCAGGTGTACACCCTG CCCCCCAGCCGGGAGGAAATGACCAAGAACCAGGTGTCCCTGACCTGCCTCGTGAA GGGCTTCTACCCCAGCGATATGGCCGTGGAGTGGGAGAGCAACGGCCAGCCCGAGA ACAACTACAAGACCACCCCCCCCATGCTGGACAGCGACGGCAGCTTCTTCCTGTACT CCAAACTGACCGTGGACAAGAGCCGGTGGCAGCAGGGCAACGTGTTCAGCTGTAGC GTGATGCACGAGGCCCTGCACAACCACTACACCCAGAAGTCCCTGAGCCTGTCTCCT GGCGGAGGCGGAGGATCTGGCGGCGGAGGAAGTGGAGGGGGCGGATCTGGTGGTG GAGGCAGCGGCGGAGGTGGAAGTGGCGGTGGAGGATCCGGTGGAGGCGGCTCAGG TGGCGGCGGAAGCGAGAGAAAGTCCTCCGTGGAGTGTCCACCATGCCCTGCTCCAC CAGTGGCTGGCCCTTCCGTCTTTCTCTTTCCACCTAAACCTAAGGATACACTCATGAT CTCCAGAACTCCAGAGGTCACATGTGTGGTCGTCGATGTCAGTCATGAGGATCCTGA AGTCCAGTTTAACTGGTATGTGGATGGCGTCGAAGTCCATAATGCTAAGACAAAACC TCGCGAAGAACAGTTTAACTCCACCTTTAGAGTCGTGAGCGTGCTGACAGTCGTCCA TCAGGATTGGCTCAATGGGAAAGAATACAAATGTAAAGTCTCTAACAAAGGACTGC CCGCTCCTATCGAAAAGACCATCTCCAAAAGAAAGGGGCAGCCCAGAGAGCCCCAG GTCTACACACTCCCACCCTCCAGAGAAGAGATGACAAAAAATCAGGTGTCACTCAC CTGTCTGGTCAAGGGGTTTTACCCCTCCGACATTGCCGTGGAATGGGAATCCAATGG GCAGCCTGAAAACAATTATAAGACTACACCTCCTATGCTCGACTCTGATGGGAGTTT CTTTCTCTACTCTAAACTCACAGTGGATAAGTCTAGATGGCAGCAGGGGAATGTCTT TTCCTGCTCCGTCATGCATGAAGCTCTCCACAATCATTATACACAGAAGTCTTTGTCC CTGTCCCCCGGCAAG (SEQ ID N0.454) Ejemplo 14.1 ELISA de Enlace a ß-Klotho para Anticuerpos preparados por Ingeniería Las formas preparadas por ingeniería de 16H7 y 22H5 fueron probadas para el enlace a ß-Klotho usando un ensayo ELISA. Las condiciones para la ELISA fueron como sxguen.
Placas Maxisorp recubiertas por estreptavidina fueron incubadas con 2µ9/?1 de ß- lotho durante la noche a 4 grados.
Los anticuerpos fueron agregados en diluciones en serie 3 veces iniciando a ?µ? 'por 1 hora a temperatura ambiente. El Fe anti-humano conjugado con HRP fue usado como el anticuerpo detector. La señal fue desarrollada con Lumiglo y leída en Envision.
Los resultados del ensayo ELISA se muestran en la Figura 32A-32C e indican que la mayoría de las variantes de 16H7 enlazadas al ß-Kldtho · humana excepto por una inserción de tirosina que lleva mutante en la posición 107.
Ejemplo 14.2 Variantes preparadas por Ingeniería de 16H7 y 22H5 se enlazan a la Estructura del Receptor Nativo, como se muestra por FACS Un ensayo de enlace FACS se llevó a cabo con varias de las formas preparadas por ingeniería de 16H7 y 22H5. Los experimentos se llevaron a cabo como siguen.
Células CHO que expresan establemente el receptor FGF21 fueron tratadas con el anticuerpo precursor 16H7 y 22H5 y también con las variantes preparadas por ingeniería de ellas (?µ? por lxlO6 células en ???µ? de PBS/0.5% BSA) . Las células fueron incubadas con los anticuerpos a 4°C seguido por dos lavados con PBS/BSA. Las células luego fueron tratadas con anticuerpos secundarios etiquetados con FITC a 4°C seguido por dos lavados. Las células fueron suspendidas nuevamente en lml de PBS/BSA y el enlace de anticuerpos se analizó al usar un instrumento FACS Calibur.
Consistente con los resultados de ELISA, la mayoría de las variantes preparadas por ingeniería de los anticuerpos agonistas del receptor FGF21 probaron un buen enlace al receptor FGF21 de la. superficie celular en FACS. Esta observación además confirma que la ingeniería guiada de los anticuerpos agonistas del receptor FGF21 mantienen el enlace a la estructura nativa. En un mutante, en el cual CDR3 se preparó por ingeniería para incluir una tirosina en la posición Y107, se observó una pérdida completa de enlace al receptor de la superficie celular, lo cual es similar a los resultados de ELISA. Esta observación señala el rol del rizo de CDR3 en el enlace a la conformación nativa.
Ejemplo 14.3 Actividad de Variantes 16H7 y 22H5 en Adipocitos humanos pr marios FGF21 estimula la absorción de glucosa y la lipolisis en adipocitos cultivados y, por lo tanto, los adipocitos se consideran con frecuencia ser un ensayo fisiológicamente relevante. UN panel de las variantes preparadas por ingeniería de 16H7 y 22H5 mostró, exhibir la actividad de fosforilación ERK similar a FGF21 en el ensayo de adipocitos humanos con una EC50 estimada menor a 10 n , como se muestra en la Tabla 7.
Tabla 7 Actividad de Variantes en Ensayo de Adipocitos Humanos Ejemplo 14.4 Experimentos de Enlace Biacore y Medición de la constante de disociación El enlace de variantes 16H7 y 22H5 a human . ß-Klotho fue probado al usar ensayos Biacore. En resumen, el anticuerpo de ratón anti-His (Qiagen, Valencia, CA) fue inmovilizado en un chip CM5 al usar reactivos de acoplamiento a aminas (General Electronics/ Piscataway, NJ) . ß-Klotho recombinante humano etiquetado con His fue capturada en la segunda celda de flujo hasta ~100RU. La primera celda de flujo fue usada como un control de respaldo. Las mAbs ????? fueron diluidas en PBS más O.lmg/ml BSA, 0.005% P20 e inyectadas sobre ß-Klotho capturada sobre la superficie del anticuerpo anti-His. Para la medición cinética, 0.78~100nM de mAbs diluida en · PBS más O.lmg/ml BSA, 0.005% P20 fueron inyectadas sobre la superficie ß-Klotho.
Las variantes probadas se resumen en la Tabla 8: Tabla 8 Variantes Estudiadas en Experimentos de Enlace y Constante de Disociación Entre los mAbs preparados por ingeniería probados, la mayoría de ellos mostró un enlace firme a ß-Klotho humana, excepto #15 el cual no mostró enlace. La Tabla 9 a continuación muestra el enlace de mAbs ????? a ß-Klotho capturado en anti-His. La Figura 33 muestra la comparación de la constante de disociación.
Tabla 9 Enlace a ß-Klotho EJEMPLO 15 Combinaciones de Proteínas de enlace a antigenos muestran un Efecto Aditivo Proteínas de enlace a antígenos que representan diferentes intervalos de enlace (E'iguras lia y 11b) fueron seleccionadas y probadas en ensayos de reportero en pares para determinar si el par . de moléculas se comportaría en una forma aditiva. Los ensayos se corrieron como siguen.
El día uno, el clon AM-l/D FGFRlc+p-Klotho Luc fue sembrado en una placa de 96 pozos a 20K células/pozo en medio DMEM + 10% FBS . La placa se incubó de un día para el otro. Al día siguiente, el medio fue reemplazado con medio de ensayo (DMEM + 0.2% FBS) y se incubó de un día para el otro. A partir de una reserva de trabajo de un anticuerpo (1 mg/mL en PBS) , cada anticuerpo bajo estudio fue preparado a una dilución . de 2 µ?/p?? en medio de ensayo. 100 µL de cada anticuerpo a ser probado se combinaron en una placa de fondo en "U". El medio de ensayo se retiró de las células, y 50 µL de las mezclas de anticuerpos fueron transferidos a las células. Las mezclas de anticuerpos fueron incubadas en las células durante 5 hrs . ' Finalmente, cada muestra se leyó con un reactivo SteadyGlo de Luciferasa (50 µ?/????) , según las especificaciones del fabricante.
La Tabla 10 a continuación es un resumen de la actividad (% de actividad de FGF21 del ensayo reportero) observado del estudio; la Tabla 11 expresa las actividades observadas con respecto a los intervalos.
Tabla 10 Actividad de Combinación de Anticuerpos (%) Tabla 11 Combinaciones de Anticuerpos Expresadas en Términos de Intervalos B B Intervalo Ab ID Isotipo 2G10 39F7 12E4.1 26H11.1 16H7 20D4.1 20D4.1 12.5 13.5 21.4 32.0 28.3 19.4 16H7 23.5 27.8 37.0 41.5 36.7 B 26H11.1 17.9 19.1 20.7 21.4 B 12E4.1 25.4 28.8 30.8 39F7 s:2 9.1 2610 ¦1.1 Sorprendentemente, varios pares de moléculas mostraron un efecto aditivo. Como se muestra en las Figuras 34 y 35, respectivamente, 39F11 y FGF21 mostraron un efecto aditivo cuando se mide en el ensayo reportero del Ejemplo 5, como lo hizo 16H7 y 39H11.
Al resumir los datos de este conjunto de experimentos, se observó que las proteínas de enlace a antígenos del mismo intervalo de enlace, por ejemplo, 16H7 cuando forma pares con 20D4 (ambas del Grupo A), la actividad sumada no fue aditiva. Esto también se observó cuando 12E4 formó pares con 26H11 (ambos del Grupo B) . Adicionalmente, proteínas de enlace a antígenos en pares de intervalos que no se traslapan mostraron actividades aditivas, por ejemplo, 16H7 (Grupo A) formó pares con 26H11 o 12E4 (Grupo B) , o formó pares con 39F7 (Grupo C) . Además, las proteínas de enlace a antígenos 26H11 y 12E4 (Grupo B) mostraron un efecto aditivo cuando se combina con Abs a partir del Grupo A pero no del Grupo C, lo que sugiere que puede haber algún traslape entre los sitios de enlace de Grupo B y Grupo C y/o que las conformaciones de activación inducidas por las proteínas de enlace a antígenos del Grupo B y Grupo C no son mutuamente compatibles. Finalmente, como se espera, cuando una proteína funcional de enlace a antígenos está formando pares con una proteína no funcional de enlace a antígenos (por ejemplo, 2G10) la cual enlaza a un sitio de enlace diferente y sin traslape del Grupo A, B o C, no hay efecto con la actividad de la proteína funcional de enlace a antigenos del Grupo A, B o C.
Colectivamente, estos datos sugieren que las proteínas de enlace a antígenos descritas pueden ser co-administradas para potenciar el efecto que puede proporcionar' por sí misma una proteína dada de enlace a antígenos.
Cada referencia citada en la presente se incorpora como referencia en su totalidad para todo lo que enseñe y para todos los propósitos.
La presente descripción no se limita en alcance por las modalidades específicas descritas en la presente, las cuales se pretenden como ilustraciones de aspectos individuales de la descripción, y métodos y componentes funcionalmente equivalentes y aspectos de forma de componentes de la descripción. De hecho, diversas modificaciones de la descripción, además de aquellas mostradas y descritas en la presente se volverán evidentes para aquellos expertos en la técnica a partir de la descripción anterior y los dibujos anexos. Tales modificaciones se pretende que caigan dentro del alcance de las reivindicaciones anexas.

Claims (26)

NOVEDAD DE LA INVENCIÓN Habiendo descrito la presente invención, se considera como novedad, y por lo tanto se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes: REIVINDICACIONES
1. Una proteina aislada. de enlace a antigenos caracterizada porque induce la señalización mediada por FGF21.
2. Una proteina aislada de enlace a antigenos caracterizada porque se enlaza específicamente a al menos uno de: (i) ß-Klotho; (ii) FGFRlc, FGFR2C, FGFR3c O FGFR4; y (iii) un complejo que comprende ß-Klotho y uno de FGFRlc, FGFR2c, FGFR3c y FGFR4 en donde la proteína de enlace a antígenos induce la señalización mediada por FGF21.
3. La proteína de enlace a antígenos de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque la proteína de enlace a antígenos comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en: (a) una CD3 de cadena ligera que comprende una secuencia seleccionada del grupo que consiste en: (i) una secuencia de cadena ligera CDR3 que difiere por no más de un total de tres adicionés, sustituciones, y/o eliminaciones de aminoácidos de una secuencia CDR3 seleccionada del grupo que consiste en la secuencia de cadena ligera CDR3s de L1-L18, SEQ ID NOs : 180-194 ; (ii) QV DXiX2SDHVV (SEQ ID NO: 276); (iii) QQX3GX4X5X6X7T (SEQ ID NO: 283); (iv) LQHNSYPLT (SEQ ID NO: 267); (v) MQSLQTPFT (SEQ ID NO: 268); (vi) QQYNNWPPT (SEQ ID NO: 269); (vii) MQSIQLPRT (SEQ ID NO: 270); (viii) QQANDFPIT (SEQ ID NO: 271); (ix) MQALQTPCS (SEQ ID NO: 272); (b) una secuencia de cadena pesada CDR3 que comprende una secuencia seleccionada del grupo que consiste en: (i) una secuencia de cadena pesada · CDR3 que difiere por no más. de un total de cuatro adiciones, sustituciones, y/o eliminaciones de aminoácidos de una secuencia CDR3 seleccionada del grupo que consiste en las secuencias de cadena 'pesada de CDR3 de H1-H18, SEQ ID NOs : 145-157; (ii) X34X16 1 18GX19YYY 20GMDV (SEQ ID NO: 322); (iii) SLIVVX21VY X22L DX23 (SEQ ID NO: 326); (iv) IVVVPAAIQSYYYYYGMGV (SEQ ID NO: 311); (v) DPDGDYYYYGMDV (SEQ ID NO: 312); (vi) TYSSGWYVWDYYGMDV (SEQ ID NO: 313); (vii) DRVLSYYAMAV (SEQ ID NO: 314); (viii) VRIAGDYYYYYGMDV (SEQ ID NO: 315) ; (ix) ENIVVIPAAIFAGWFDP (SEQ ID NO: 316); y (x) DRAAAGLHYYYGMDV (SEQ ID NO: 317); o (c) la secuencia de cadena ligera CDR3 de (a) y la secuencia de cadena pesada CDR3 de (b) ; en donde, • Xi es G, S o N; X2 es N , S o T ; X3 es C, Y o S; X4 es G o S, X5 es A o S, X6 es P o F; X7 es L o está ausente; X34 es I, V o S; i6 es L o V; X17 es L, T o V; Xi8 es L, V, G o T; X19 es A, G o está ausente; X2o es Y, C o D; X21 es I o M; X22 es A o V; y X23 es H o Y; y en donde la proteína de enlace a antígenos enlaza específicamente (i) ß-Klotho; (ii) FGFRlc, FGFR2c, FGFR3c o FGFR4; o (iii) un complejo que comprende ß-Klotho y uno de FGFRlc, FGFR2c, FGFR3c, y FGFR .
4. La proteína de enlace a antígenos de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque comprende ya sea : (a) una secuencia de cadena ligera CDR1 seleccionada del grupo que consiste en: (i) una CDR1 de cadena ligera que difiere por no más de tres adiciones, sustituciones, y/o eliminaciones de aminoácidos de una secuencia CDR1 de L1-L18, SEQ ID NOs: 158-170; (ii) RASQ X9 X10X11X12X13X14LA (SEQ ID NO: 304); (iii) GGNNIGSX15SVH (SEQ ID NO: 307); (iv) RS SQSLLX29X30NGX31X32X33L D (SEQ ID NO: 310); (v) RASQSVNSNLA (SEQ ID NO: 295); (vi) RASQDIRYDLG (SEQ ID NO: 296); (vii) RASQGISI LA (SEQ ID NO: 297); and (viii) KSSQSLLQSDGKTYLY (SEQ ID NO: 298); (b) una secuencia de cadena ligera CDR2 seleccionada del grupo gue consiste en: (i) un.a CDR2 de cadena ligera gue difiere por no más de dos adiciones, . sustituciones, y/o eliminaciones de aminoácidos de una secuencia CDR2 de L1-L18, SEQ ID NOs : 171-179 ; (ii) LGSX27RAS (SEQ ID NO: 290); (iii) GX8SX28RAT (SEQ ID NO: 294); (iv) AASSLQS (SEQ ID NO: 284); (v) GVSTRAT (SEQ ID NO: 285); (vi) DDSDRPS (SEQ ID NO: 286); (vii) EVSNRFS (SEQ ID NO: 287); (c) una secuencia de cadena pesada CDRl seleccionada del grupo gue consiste en: (i) una CDRl de cadena pesada gue difiere por no más de dos adiciones, sustituciones, y/o eliminaciones de aminoácidos de una secuencia CDRl de H1-H18, SEQ ID NOs : 121-131; y (ii) NARMGVX39 (SEQ ID NO: 352); (iii) X40YGIH (SEQ ID NO: 355); (iv) DLSMH (SEQ ID NO: 345); (v) DAWMS (SEQ ID NO: 346); (vi) TYAMS (SEQ ID NO: 347); (vii) SYFWS (SEQ ID NO: 348); (viii) SYYWS (SEQ ID NO: 131); (ix) SGGYN S (SEQ ID NO: 349); (d) una CDR2 de cadena pesada seleccionada del grupo que consiste en: (i) una secuencia pesada que difiere por no más de tres adiciones, sustituciones, y/o eliminaciones de aminoácidos de una secuencia CDR2 de H1-H18, SEQ ID NOs:132-144; (ii) HIFSNDEKSYSTSLKX24 (SEQ ID NO: 333); (iii) X25ISGSGVSTX26YADSVKG (SEQ ID NO: 338); (iv) VIWYDGSX35KYYX36DSVKG (SEQ ID NO: 341); (v) X37lYX38SGSTX4iYNPSLKS (SEQ ID NO: 344); (vi) GFDPEDGETIYAQKFQG (SEQ ID NO: 327); (vii) RIKSKTDGGTTDYAAPVKG (SEQ ID NO: 328); (viii) RIYTSGSTNYNPSLKS (SEQ ID NO: 329); (ix) RIKSKDGGTTDYAAPVKG (SEQ ID NO: 330); (x) RIKSKX42DGGTTDYAAPVKG (SEQ ID NO: 483) ; en donde Xg es ' o S; X10 es V o F; X11 es D o S; X.12 es G o S; . X13 es S, N o T; X14 es S o Y; Xi5 es E o Q; X29 es Y o H; X30 es Y o S; X31 es F o Y; X32 es T o N; X33 es Y o F; X27 es N o D; X8 es A o T; X28 es S o F; X39 es S o N; X24 es S o N; X25 es G o A; X26 es H, Y o N; X35 es D o I; X36 es A o G; X37 es N o R; X38 es Y o T; X es Y o N; X42 es T o está ausente; (e) la CDRl de cadena ligera de (a) y la CDR2 de cadena ligera de (b) ; (f) la CDRl de cadena ligera de (a) y la CDRl de cadena pesada de (c) ; (g) la CDRl de cadena ligera de (a) y la CDR2 de cadena pesada de (d) ; (h) la CDRl de cadena ligera (b) y la CDRl de cadena pesada de (c) ; (i) la CDRl de cadena pesada de (c) y la CDR2 de cadena pesada de (d) ; (j) la CDR2 de cadena ligera de (b) y la CDR2 de cadena pesada de (d) ; (J) la CDRl de cadena ligera de (a), la CDR2 de cadena ligera de (b)-, y la CDRl de cadena pesada de (c) ; (1) la CDR2 de cadena ligera de (b) , la CDRl pesada de (c) , y la CDR2 de cadena pesada de (d) ; (m) la CDRl de cadena ligera de (a) , la CDRl de cadena pesada de (c) , y la CDR2 de cadena pesada de (d) o (n) la CDRl de cadena ligera de (a) , la CDR2 de cadena ligera de (b) , la CDR2 de cadena pesada de (c) , y la CDR2 de cadena pesada de (d) , en donde dicha proteina de enlace a antigenos enlaza específicamente (i) ß-Klotho; (ii) FGFRlc, FGFR2c, FGFR3c o FGFR4; o (iii) un complejo que comprende ß-Klotho y uno de FGFRlc, FGFR2c, FGFR3C, y FGFR4.
5. La proteína de enlace a antígenos de conformidad con la reivindicación .1, caracterizada porque comprende ya sea: (a) un dominio variable de cadena ligera que comprende; (i) una secuencia de cadena ligera CDRl seleccionada de SEQ ID NOs : 158-170 ; (ii) una secuencia de cadena ligera CDR2 seleccionada de SEQ ID NOs : 171-179 ; (iii) una secuencia de cadena ligera CDR3 seleccionada de SEQ ID NOs:180-194; y (b) un dominio variable de cadena pesada que comprende: (i) una secuencia de cadena pesada CDRl seleccionada de SEQ ID NOs : 121-131 ; (ii) una secuencia de cadena pesada CDR2 seleccionada de SEQ ID NOs: 132-144; y (iii) una secuencia de cadena pesada CDR3 seleccionada de SEQ ID NOs : 145-157 ; o (c) el dominio variable de cadena ligera de (a) y el dominio variable de cadena pesada de (b) , en donde la proteina de enlace a antigenos enlaza específicamente (i) ß-Klotho; (ii) FGFRlc, FGFR2c, FGFR3c o FGFR4; o (iii) un complejo que comprende ß-Klotho y uno de FGFRlc, FGFR2c, FGFR3c, y FGFR4.
6. La proteína de enlace a antígenos de conformidad con la reivindicación 1 caracterizada porque comprende ya sea : (a) una secuencia de dominio variable de cadena ligera seleccionada del grupo que consiste en: (i) aminoácidos que tienen una secuencia al menos 80% idéntica · a una secuencia de dominio variable de cadena ligera seleccionada de VL1- VL18, SEQ ID NOs:48-65; (ii) una secuencia de aminoácidos codificada por una secuencia de polinucleótidos que es al menos 80% idéntica a una secuencia de polinucleótidos que codifica la secuencia de dominio variable de cadena ligera de VL1-VL18, SEQ ID NOs:48-65; una secuencia de dominio variable de cadena pesada seleccionada del grupo que consiste en: (i) una secuencia de aminoácidos que es al menos 80% idéntica a una secuencia de dominio variable, de cadena pesada de VH1-VH18 de SEQ ID NOs : 66-84 ; (ii) una secuencia de aminoácidos codificada por una secuencia de polinucleótidos que es al menos 80% idéntica a una secuencia de polinucleótidos que codifica la secuencia de dominio variable de cadena pesada de VH1-VH18, SEQ ID NOs : 66—84 ; o el dominio variable de cadena ligera de (a) y el dominio variable de cadena pesada de (b) ; en donde la proteína de enlace a antígenos enlaza específicamente (i) ß-Klotho; (ii) FGFRlc, FGFR2c, FGFR3c o FGFR4 ; o (iii) un complejo que comprende ß-Klotho y uno de FGFRlc, FGFR2c, FGFR3c, y FGFR .
7. La proteína de enlace a antígenos de conformidad con la reivindicación 6, caracterizada porque comprende ya sea: (a) una secuencia de dominio variable de cadena ligera seleccionada del grupo que consiste en: VL1-VL18 de SEQ ID NOs: 48-65; (b) una secuencia de dominio variable de cadena pesada seleccionada del grupo que consiste en: VH1-VH18 de SEQ ID NOs: 66-84; o (c) el dominio variable de cadena ligera de (a) y el dominio variable de cadena pesada de (b) , en donde la proteína de enlace a antígenos enlaza específicamente (i) ß-Klotho; (ii) FGFRlc, FGFR2c, FGFR3c o FGFR4; o (iii) un complejo que comprende ß-Klotho y uno de FGFRlc, FGFR2c, FGFR3c, y FGFR4.
8. La proteína de enlace a antígenos de conformidad con la reivindicación 7, caracterizada porque el dominio variable de cadena ligera y un dominio variable de cadena pesada son seleccionados del grupo de combinaciones que consisten en: VL1V„1, Vt2VH2, VL3VH3, VL3VH4 , VL4VH5, VL5V„6, VL6VH7, VL7VH8, VL8VH8, VL9VH9, VL9VH10, VL10VH11, VL11VH11, VL12VH12, VL13VH13, VL14VH14, VL15VH15, VL16VH16, VL17VH17, y VL18VH18, en donde la proteina de enlace a antigenos enlaza específicamente -(i) ß-Klotho; (ii) FGFRlc, FGFR2c, FGFR3c o FGFR4; o (iii) un complejo que comprende ß-Klotho y uno de FGFRlc, FGFR2c, FGFR3c, y FGFR4.
9. La proteína de enlace a antígenos de conformidad con la reivindicación 8, caracterizada porque comprende: (a) la secuencia constante de cadena ligera de SEQ ID NO: 10; (b) la secuencia constante de cadena ligera de SEQ ID NO: 11; (c) la secuencia constante de cadena pesada de SEQ ID NO: 9; o (d) la secuencia constante- de cadena ligera de SEQ ID NO: 10 o SEQ ID. NO: 11 y la secuencia constante de cadena pesada de SEQ ID NO: 9.
10. La proteína de enlace a antígenos de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque la proteína de enlace a antígenos es un anticuerpo humano, un anticuerpo humanizado, anticuerpo quimérico, un anticuerpo monoclonal, un anticuerpo policlonal, un anticuerpo recombinante, un fragmento de anticuerpo de enlace a antígenos, un anticuerpo de cadena sencilla, un diacuerpo, un triacuerpo, un tetracuerpo, un fragmento Fab, un fragmento F(fab')2/ un anticuerpo de dominio, ¦ un anticuerpo IgD, un anticuerpo IgE, un anticuerpo IgM, un anticuerpo IgGl, un anticuerpo IgG2, un anticuerpo IgG3, un anticuerpo IgG4, o un anticuerpo IgG4 que tiene al menos una mutación en la región de articulación.
11. La proteina de enlace a antigenos de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque cuando se enlaza a (i) ß-Klotho; (ii) FGFRlc, FGFR2c, FGFR3c o FGFR4 ; o (iii) un complejo que comprende ß-Klotho y uno de FGFRlc, FGFR2c, FGFR3c, y FGFR : (a) se enlaza a (i) ß-Klotho; (ii) FGFRlc, FGFR2c, FGFR3c o FGFR4; o (iii) un complejo que comprende ß-Klotho y uno de FGFRlc, FGFR2c, FGFR3c, y FGFR , con sustancialmente la misma Kd como un anticuerpo de referencia; (b) induce la señalización del tipo FGF21 de 10 % o mayor que la señalización inducida por un estándar de tipo natural FGF21 que comprende la forma madura de SEQ ID NO: 2 cuando se mide en un ensayo reportero de ELK-luciferasa; (c) muestra un EC50 de 10nM o menor de señalización del tipo FGF21 en un ensayo seleccionado del grupo que consiste en: (i) un ensayo basado en células recombinantes in vitro mediado por FGFRlc/p-Klotho; y (ii) un ensayo funcional de adipocitos humanos in vitro; (d) muestra un EC50 de menos de ???? de actividad agonista en FGFRlc en la presencia de ß-Klotho en un ensayo reportero mediado por receptor FGFRlc recombinante in vitro; y (e) muestra un EC50 .mayor que ?µ? de actividad agonista en FGFRlc en la ausencia de ß-Klotho en un un ensayo reportero mediado por receptor FGFRlc recombinante in vitro; o (f) compite 'por enlace con un anticuerpo de referencia para (i) ß-Klotho; (ii) FGFRlc, FGFR2c, FGFR3c o FGFR4; o (iii) un complejo que comprende ß-Klotho y uno de FGFRlc, FGFR2c, FGFR3c, y FGFR4 , en donde el anticuerpo de referencia comprende una combinación de secuencias de dominio variable de cadena ligera y cadena pesada seleccionada del grupo que consiste en VL1VH1, VL2VH2, VL3VH3, VL3VH4, VL4VH5, VL5VH6, VL6VH7, VL7VH8, ¦ VL8VH8, VL9VH9, VL9VH10, VL10VH11, VLIIVHII, Vl12Vh12, Vl13Vh13, Vl14Vh14, Vl15Vh15, VL16VH16, VL17VH17, y VL18VH18.
12. La proteína de enlace a antigenos de conformidad con la reivindicación 11, caracterizada porque cuando se enlaza a (i) ß-Klotho; (ii) FGFRlc, FGFR2c, FGFR3c o FGFR4; o (iii) un complejo que comprende ß-Klotho y uno de FGFRlc, FGFR2c, FGFR3c, y FGFR4': (a) disminuye la glucosa en sangre en un modelo animal; (b) disminuye los niveles de lípidos en suero en un modelo animal; (c) disminuye los niveles de insulina en un modelo animal; o (d) dos o más de (a) y (b) y (c) .
13. La proteína de enlace a antígenos de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque la proteína de enlace a antígenos comprende: (a) una cadena pesada que comprende una de SEQ ID N0s:31, 32, 390-401, 404-405; (b) una cadena ligera que comprende una de SEQ ID N0:13, 14, 385-389, 402-403; o (c) una combinación que comprende una cadena pesada de (a) y una cadena ligera de (b) .
14. Una proteína de enlace a antígenos que es capaz de enlazarse a ß-Klotho humana de tipo natural (SEQ ID NO: 7) pero que no se enlaza a una forma quimérica de ß-Klotho caracterizada porque la forma quimérica de ß-Klotho comprende un armazón de ß-Klotho humana en .donde las secuencias murinas de ß-Klotho reemplazan los residuos humanos de tipo natural en al menos una de (a)' posiciones 1-80; (b) posiciones 303-522; (c) posiciones 852-1044; y (d) combinaciones de las mismas .
.15. Una proteína, de enlace a antígenos caracterizada porque es capaz de enlazar a ß-Klotho humana de tipo natural (SEQ ID NO:7) en al menos una de (a) posiciones 1-80; (b) posiciones 303-522.; (c) posiciones 852-1044; y (d) combinaciones de las mismas.
16. ¦ Una proteína de enlace a antígenos caracterizada porque es capaz de competir con una proteína de enlace a antígenos de conformidad con las reivindicaciones 8 o 13 para enlace a residuos de ß- lotho humana de tipo natural en al menos una de (a) posiciones 1-80; (b) posiciones 303-522; (c) posiciones 852-1044; y '(d) combinaciones de las mismas.
17. Una composición farmacéutica caracterizada porque comprende una o más proteínas de enlace a antígenos de conformidad con la reivindicación 1 en mezcla con un portador farmacéuticamente aceptable del mismo.
18. Una composición farmacéutica caracterizada porque comprende la una o más proteínas de enlace a antígenos de conformidad con la reivindicación 11 en mezcla con un portador farmacéuticamente aceptable del mismo.
19. Un ácido nucleico aislado caracterizado porque comprende una secuencia de polihucleótidos que codifica el dominio variable de cadena ligera, el dominio variable de cadena pesada, o ambos, de la proteina de enlace a antigenos de conformidad con la reivindicación 6.
20. El ácido nucleico aislado de conformidad con la reivindicación 19, caracterizado porque la secuencia comprende: (a) VL1-VL18 (SEQ ID NOs: 48-65); (b) VH1-V„18 (SEQ ID NOs: 66-84); o (c) una o más secuencias de (a) y una o más secuencias de (b) .
21. Un vector de ' expresión caracterizado porque comprende el ácido nucleico de conformidad con la reivindicación 20.
22. Una célula aislada caracterizada porque comprende el ácido nucleico de conformidad con la reivindicación 21.
23. Una célula aislada caracterizada porque comprende el vector de expresión de conformidad con la reivindicación 22.
24. Un método de producción de una proteina de enlace a antigenos que enlazan específicamente a (i) ß-Klotho; (ii) FGFRlc, FGFR2c, , FGFR3c o FGFR4 ; o (iii) un complejo que comprende ß-Klotho y uno de FGFRlc, FGFR2c, FGFR3c, y FGFR4, caracterizado porque comprende incubar la célula hospedera de conformidad con la reivindicación 23 bajo condiciones que permitan su expresión en la proteina de enlace a antigenos.
25. Un método de prevención o tratamiento de una afección en un sujeto que necesita de tal tratamiento, caracterizado porque comprende administrar una cantidad terapéuticamente efectiva de la composición de conformidad con la reivindicación 17 al sujeto, en donde la afección es tratable al disminuir los niveles de glucosa en la sangre, insulina o lipidos en suero.
26. El método de conformidad con la reivindicación 25, caracterizado porque la afección es diabetes tipo 2, obesidad, dislipidemia, NASH, enfermedad cardiovascular o síndrome metabólico. RESUMEN DE LA INVENCIÓN La descripción .actual proporciona composiciones y métodos relacionados con o derivados de proteínas de enlace a antígenos que activan la señalización mediada por FGF21. En modalidades, las proteínas de enlace a antígenos enlazan específicamente a (i) ß-Klotho; (ii) FGFRlc, FGFR2c, FGFR3c o FGFR4; o (iii) un complejo que comprende ß-Klotho y uno de FGFRlc, FGFR2c, FGFR3c, y FGFR4. En algunas modalidades las proteínas de enlace a antígenos inducen señalización del tipo FGF21. En algunas modalidades, las proteínas de enlace a antígenos son anticuerpos completamente humanos, humanizados, o quiméricos, fragmentos de enlace y derivados de tales anticuerpos, y polipéptidos que enlazan específicamente a (i) ß-Klotho; (ii) FGFRlc, FGFR2c, FGFR3c o FGFR4 ; o (iii) un complejo que comprende ß-Kl.otho y uno de FGFRlc, FGFR2c, FGFR3c, y FGFR4. Otras modalidades proporcionan ácidos nucleicos que codifican tales proteínas de enlace a antígenos, y fragmentos y derivados de las mismas, y polipéptidos, células que comprenden tales polinucleótidos , métodos de elaboración de tales proteínas de enlace a antígenos, y fragmentos y derivados de las mismas, y polipéptidos, y métodos de uso de tales proteínas de enlace a antígenos, fragmentos y derivados de las mismas, y polipéptidos , que incluyen métodos de tratamiento diagnóstico de sujetos que 'padecen de diabetes tipo obesidad, NASH, síndrome metabólico y trastornos condiciones relacionadas. I
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