BR112012013876B1 - Anticorpo isolado ou um fragmento do mesmo e composição farmacêutica que compreende o mesmo - Google Patents

Anticorpo isolado ou um fragmento do mesmo e composição farmacêutica que compreende o mesmo Download PDF

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Abstract

anticorpo isolado ou um fragmento do mesmo e composição farmacêutica que compreende o mesmo a presente revelação fornece composições e métodos relacionados ou derivados de proteínas de ligação de antígeno que ativam a sinalização mediada por fgf21. em modalidades, as proteínas de ligação de antígeno se ligam especificamente a (i) ß-klotho; (ii) fgfr1c, fgfr2c, fgfr3c ou fgfr4; ou(iii) um complexo que compreende ß-klotho e um de fgfr1c, fgfr2c, fgfr3c e fgfr4. em algumas modalidades, as proteínas de ligação de antígeno induzem sinalização do tipo fgf21. em algumas modalidades, as proteínas de ligação de antígeno são anticorpos totalmente humanos, humanizados ou quiméricos, fragmentos e derivados de ligação desses anticorpos, e polipeptídeos que se ligam especificamente a(i) ß-klotho;(ii) fgfr1c, fgfr2c, fgfr3c ou fgfr4; ou (iii) um complexo que compreende ß-klotho e um de fgfr1c, fgfr2c, fgfr3c e fgfr4. outras modalidades fornecem ácidos nucléicos que codificam essas proteínas de ligação de antígeno, e fragmentos e derivados destas, e polipeptídeos, células que compreendem esses polinucleotídeos, métodos de produção dessas proteínas de ligação de antígeno, e fragmentos e derivados destas, e polipeptídeos, e métodos de utilização dessas proteínas de ligação de antígeno, fragmentos e derivados destas, e polipeptídeos, incluindo métodos de tratamento ou diagnóstico de indivíduos que sofrem de diabetes tipo 2, obesidade, nash, síndrome metabólica e distúrbios ou condições relacionadas.

Description

ANTICORPO ISOLADO OU UM FRAGMENTO DO MESMO E COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA QUE COMPREENDE O MESMO
Este pedido reivindica o benefício do Pedido U.S. Provisório N° 61/267.321, depositado em 7 de dezembro de 2009, e Pedido U.S. Provisório N° 61/381.846, depositado em 10 de setembro de 2 010, que são aqui incorporados por referência.
LISTAGEM DE SEQÜÊNCIAS
O presente pedido contém uma Listagem de Seqüências que foi submetida em formato ASCII por meio de EFS-Web e é aqui incorporada por referência em sua totalidade. A referida cópia ASCII, criada em 24 de novembro de 2010, é denominada A-1519-WO-PCT.txt e tem o tamanho de 645.894 bytes.
CAMPO DA INVENÇÃO
A presente revelação está relacionada às moléculas de ácido nucléico que codificam proteínas de ligação de antígeno que se ligam a (i) β-Klotho; (ii) FGFR1c, FGFR2c, FGFR3c ou FGFR4; ou (iii) a um complexo que compreende β-Klotho e um de FGFR1c, FGFR2c, FGFR3c e FGFR4. A presente revelação também fornece proteínas de ligação de antígeno que se ligam a (i) β-Klotho; (ii) FGFR1c, FGFR2c, FGFR3c ou FGFR4; ou (iii) a um complexo que compreende β-Klotho e um de FGFR1c, FGFR2c, FGFR3c e FGFR4, incluindo proteínas de ligação de antígeno que induzem sinalização do tipo FGF21 (FGF21-like), além de composições farmacêuticas que compreendem proteínas de ligação de antígeno que se ligam a (i) β-Klotho; (ii) FGFR1c, FGFR2c, FGFR3c ou FGFR4; ou (iii) a um complexo que compreende β-Klotho e um de FGFR1c, FGFR2c, FGFR3c e FGFR4, incluindo proteínas de ligação de
Petição 870190023322, de 11/03/2019, pág. 12/18 antígeno que induzem sinalização do tipo FGF21, e métodos para o tratamento de distúrbios metabólicos com o uso desses ácidos nucléicos, polipeptídeos ou composições farmacêuticas. Também são fornecidos métodos diagnósticos com utilização das proteínas de ligação de antígeno.
FUNDAMENTOS DA INVENÇÃO fator de crescimento de fibroblasto 21 (FGF21) é um polipeptídeo secretado que pertence a uma subfamília de fatores de crescimento de fibroblastos (FGFs) que inclui FGF19, FGF21 e FGF23 (Itoh e cols., (2004) Trend Genet. 20: 563-69) . FGF21 é um FGF atípico na medida em que é independente de heparina e funciona como um hormônio na regulação do metabolismo de glicose, lipídeo e energia.
Ele é altamente expresso no fígado e pâncreas e é o único membro da família de FGF a ser primariamente expresso no fígado. Camundongos transgênicos que superexpressam FGF21 exibem fenótipos metabólicos de taxa de crescimento lenta, níveis plasmáticos baixos de glicose e triglicerídeo, e uma ausência de diabetes tipo 2 associado à idade, hiperplasia da ilhota e obesidade. A administração farmacológica de proteína de FGF21 recombinante em modelos em roedores e primatas resulta em níveis normalizados de glicemia, níveis reduzidos de triglicerídeo e colesterol e tolerância à glicose e sensibilidade à insulina aumentadas. Além disso, FGF21 reduz o peso corporal e gordura corporal por aumento do gasto de energia, atividade física e taxa metabólica. Pesquisas experimentais fornecem apoio para a administração farmacológica de FGF21 para o tratamento de diabetes tipo 2, obesidade, dislipidemia e outras condições ou distúrbios metabólicos em humanos.
FGF21 é um hormônio endócrino derivado do fígado que estimula a captação de glicose em adipócitos e homeostasia de lipídeos por meio da ativação de seu receptor. Curiosamente, além do receptor canônico de FGF, o receptor de FGF21 também compreende o β-Klotho associado à membrana como um co-fator essencial. A ativação do receptor de FGF21 leva a múltiplos efeitos sobre diversos parâmetros metabólicos.
Em mamíferos, FGFs medeia sua ação por meio de um conjunto de quatro receptores de FGF, FGFR1 - 4, que, por sua vez, são expressos em múltiplas variantes de splicing, por exemplo, FGFRlc, FGFR2c, FGFR3c e FGFR4. Cada receptor de FGF contém um domínio de tirosina quinase intracelular que é ativado mediante ligação de ligante, levando às vias de sinalização downstream que envolvem MAPKs (Erkl/2), RAFI, AKT1 e STATs (Kharitonenkov e cols., (2008) BioDrugs 22: 37-44). Vários relatos sugerem que as variantes de splicing c-repórter de FGFR1-3 exibem afinidade específica para β-Klotho e poderíam atuar como receptor endógeno para FGF21 (Kurosu e cols., (2007) J. Biol. Chem. 282: 26.687-26.695; Ogawa e cols., (2007) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 104: 7.432-7.437; Kharitonenkov e cols., (2008) J. Cell. Physiol. 215: 1-7). No fígado, que expressa abundantemente tanto β-Klotho quanto FGFR4, FGF21 não induz fosforilação de MAPK, apesar da forte ligação de FGF21 ao complexo p-Klotho-FGFR4. Em células 3T3-L1 e tecido adiposo branco, FGFR1 é de longe o receptor mais abundante e é, portanto, mais provável que os principais receptores funcionais de FGF21 nesse tecido sejam os complexos βKlotho/FGFRlc.
A presente revelação fornece uma proteína de ligação de antígeno humana (ou humanizada), por exemplo, um anticorpo monoclonal, que induz sinalização do tipo FGF21, por exemplo, um anticorpo agonista que mimetiza a função de FGF21. Um anticorpo desse tipo é uma molécula com atividade e seletividade do tipo FGF21, mas com características terapeuticamente desejáveis adicionadas típicas para um anticorpo como, por exemplo, estabilidade da proteína, ausência de imunogenicidade, facilidade de produção e meiavida in vivo longa.
SUMÁRIO DA INVENÇÃO
Ê fornecida uma proteína de ligação de antígeno isolada que induz sinalização mediada por FGF21. Também é fornecida uma proteína de ligação de antígeno isolada que se liga especificamente a pelo menos um de: (i) β-Klotho; (ii) FGFRlc, FGFR2C, FGFR3c ou FGFR4; e (iii) um complexo que compreende β-Klotho e um de FGFRlc, FGFR2c, FGFR3C e FGFR4, em que a proteína de ligação de antígeno induz sinalização mediada por FGF21.
Em uma modalidade, as proteínas de ligação de antígeno fornecidas compreendem uma seqüência de aminoácidos selecionada do grupo que consiste em: (a) uma CDR3 de cadeia leve que compreende uma seqüência selecionada do grupo que consiste em: (i) uma seqüência de CDR3 de cadeia leve que difere por, no máximo, um total de três adições, substituições e/ou deleções de aminoácidos de uma seqüência de CDR3 selecionada do grupo que consiste nas seqüências de CDR3 de cadeia leve de L1-L18, IDS. DE SEQ. Nos: 180-194; (ii) QVWDXxXaSDHW (ID. DE SEQ. N° : 276); (Üi) QQX3GX4X5X6X7T (ID. DE SEQ. N° : 283); (iv) LQHNSYPLT (ID. DE
SEQ. N° : 267); (v) MQSLQTPFT (ID. DE SEQ. N° : 268); (vi)
QQYNNWPPT (ID. DE SEQ. N° : 269); (vii) MQSIQLPRT (ID. DE SEQ. N° : 270); (viíí) QQANDFPIT (ID. DE SEQ. N°: 271); (ix) MQALQTPCS (ID. DE SEQ. N° : 272); (b) utna sequência de CDR3 de cadeia pesada que compreende uma seqüência selecionada do grupo que consiste em: (i) uma seqüência de CDR3 de cadeia pesada que difere por, no máximo, um total de quatro adições, substituições e/ou deleções de aminoácidos de uma seqüência de CDR3 selecionada do grupo que consiste nas seqüências de CDR3 de cadeia pesada de H1-H18, IDS. DE SEQ. Nos: 145-157; (Ü) X34Xi6Xi7Xi8GXi9YYYX2oGMDV (ID. DE SEQ. N° :
322); (Üi) SLIWX2iVYX22LDX23 (ID. DE SEQ. N° : 326); (iv) IVWPAAIQSYYYYYGMGV (ID. DE SEQ. N° : 311); (v)
DPDGDYYYYGMDV (ID. DE SEQ. N° : 312); (vi) TYSSGWYVWDYYGMDV (ID. DE SEQ. N° : 313); (vii) DRVLSYYAMAV (ID. DE SEQ. N° : 314); (viii) VRIAGDYYYYYGMDV (ID. DE SEQ. N° : 315); (ix) ENIWIPAAIFAGWFDP (ID. DE SEQ. N° : 316); e (x)
DRAAAGLHYYYGMDV (ID. DE SEQ. N° : 317); ou (c) a seqüência de CDR3 de cadeia leve de (a) e a seqüência de CDR3de cadeia pesada de (b) ; em que Xx é G, S ou N; X2 é N, Sou
T; X3 é C, Y ou S; X4 é G OU S; X5 é A OU S; X6 é P ou F;X é L ou ausente; X34 é I, V ou S; X16 é L ou V; X17 é L, Tou
V; X18 é L, V, G ou T; Xi9 é A, G ou ausente; X2o é Y, C ou D; X21 é I ou M; X22 é A ou V; e X23 é H ou Y; e em que a proteína de ligação de antígeno se liga especificamente a:
(i) β-Klotho; (ii) FGFRlc, FGFR2c, FGFR3c ou FGFR4; ou (iii) um complexo que compreende β-Klotho e um de FGFRlc, FGFR2C, FGFR3C e FGFR4.
Em outra modalidade, as proteínas de ligação de antígeno fornecidas compreendem: (a) uma seqüência de CDR1 de cadeia leve selecionada do grupo que consiste em: (i) uma CDR1 de cadeia leve que difere por, no máximo, três adições, substituições e/ou deleções de aminoácidos de uma seqüência de CDR1 de L1-L18, IDS. DE SEQ. Nos: 158-17 0;
(ii) RASQX9X10X11X12X13X14LA (ID. DE SEQ. N° : 304); (iii)
GGNNIGSX15SVH (ID. DE SEQ. N° : 307); (iv)
RSSQSLLX29X30NGX31X32X33LD (ID. DE SEQ. N° : 310); (v)
RASQSVNSNLA (ID. DE SEQ. N°: 295); (vi) RASQDIRYDLG (ID. DE SEQ. N° : 296); (vii) RASQGISIWLA (ID. DE SEQ. N° : 297); e (viii) KSSQSLLQSDGKTYLY (ID. DE SEQ. N° : 298); (b) uma seqüência de CDR2 de cadeia leve selecionada do grupo que consiste em: (i) uma CDR2 de cadeia leve que difere por, no máximo, duas adições, substituições e/ou deleções de
aminoácidos de uma seqüência de CDR2 de I ..1-L18, IDS. DE
SEQ. Nos : 171-179; (ii) LGSX2^ iRAS (ID . DE SEQ. N° : 290) ;
(ÍÜ) GX; 8SX28RAT (ID. DE SEQ. Ν' 0: 2 94) ; (iv) AASSLQS (ID. DE
SEQ. N° : 2 84) ; (v) GVSTRAT ( ID. DE SEQ. N°: 285 ) ; (vi)
DDSDRPS (ID. DE SEQ . N°: 286) ; (vii) EVSNRFS (ID . DE SEQ.
N° : 287) ) ; (O uma seqüência de CDR1 de cadeia pesada
selecionada do grupo que consiste em: (i) uma CDR1 de cadeia pesada que difere por, no máximo, duas adições, substituições e/ou deleções de aminoácidos de uma seqüência de CDR1 de H1-H18, IDS. DE SEQ. Nos : 121-131; e (ii)
NARMGVX39 (ID. DE SEQ. N° : 352); (iii) X40YGIH (ID. DE SEQ. N° : 355); (iv) DLSMH (ID. DE SEQ. N° : 345); (v) DAWMS (ID. DE SEQ. N° : 346); (vi) TYAMS (ID. DE SEQ. N°: 347); (vii) SYFWS (ID. DE SEQ. N° : 348); (viii) SYYWS (ID. DE SEQ. N°: 131); (ix) SGGYNWS (ID. DE SEQ. N° : 349); (d) uma CDR2 de cadeia pesada selecionada do grupo que consiste em: (i) uma seqüência pesada que difere por, no máximo, três adições, substituições e/ou deleções de aminoácidos de uma seqüência
de CDR2 de H1-H18 , IDS DE SEQ. Nos: 132-144; (ii)
HI FSNDEKS YSTSLKX24 (ID. DE SEQ. N° : 333) ; (iii)
x25isgsgvstx26yadsvkg (ID. DE SEQ. N° : 338) ; (iv)
viwydgsx35kyyx3Sdsvkg (ID. DE SEQ. N° : 341) ; (v)
X37IYX38SGSTX4iYNPSLKS (ID. DE SEQ. N° : 344) ; (Vi)
GFDPEDGETIYAQKFQG (ID. DE SEQ. N° : 327) ; (vii)
RIKSKTDGGTTDYAAPVKG (ID. DE SEQ. N° : 328) ; (viii)
RIYTSGSTNYNPSLKS ( ID. DE SEQ. N° : 329) ; (ix)
RIKSKDGGTTDYAAPVKG (ID. DE SEQ. N° : 330) ; (x)
RIKSKX42DGGTTDYAAPVKG (ID. DE SEQ. N° : 483); em que X9 é N OU S; X10 é V ou F; Xn é D OU S; X32 é G ou S; X13 é S, Nou
T; X14 é S OU Y; X15 é E ou Q; X29 é Y OU H; X30 é Y OU S;X é F ou Y; X32 é T ou N; X33 é Y ou F; X27 é N ou D; X8 é A ou T; X28 é S ou F; X39 é S ou N; X24 é S ou N; X25 é G OU A;X é Η, Y ou N; X35 é D ou I; X36 é A ou G; X37 é N ou R; X38 é
Y ou T; X4i é Y ou N; X42 é T ou ausente; (e) a CDR1 de cadeia leve de (a) e a CDR2 de cadeia leve de (b) ; (f) a CDR1 de cadeia leve de (a) e a CDR1 de cadeia pesada de (c) ; (g) a CDR1 de cadeia leve de (a) e a CDR2 de cadeia pesada de (d) ; (h) a CDR1 de cadeia leve (b) e a CDR1 de cadeia pesada de (c); (i) a CDR1 de cadeia pesada de (c) e a CDR2 de cadeia pesada de (d); (j) a CDR2 de cadeia leve de (b) e a CDR2 de cadeia pesada de (d) ; (k) a CDR1 de cadeia leve de (a) , a CDR2 de cadeia leve de (b) e a CDR1 de cadeia pesada de (c); (1) a CDR2 de cadeia leve de (b), a CDR1 da cadeia pesada de (c) e a CDR2 de cadeia pesada de (d) ; (m) a CDR1 de cadeia leve de (a) , a CDR1 de cadeia pesada de (c) e a CDR2 de cadeia pesada de (d) ; ou (n) a CDR1 de cadeia leve de (a), a CDR2 de cadeia leve de (b), a
CDR2 de cadeia pesada de (c) e a CDR2 de cadeia pesada de (d) , em que a referida proteína de ligação de antígeno se liga especificamente a (i) β-Klotho; (ii) FGFRlc, FGFR2c, FGFR3c ou FGFR4; ou (iii) um complexo que compreende βKlotho e um de FGFRlc, FGFR2c, FGFR3c e FGFR4.
Ainda em outra modalidade, as proteínas de ligação de antígeno fornecidas compreendem: (a) um domínio variável da cadeia leve que compreende: (i) uma seqüência de CDR1 de cadeia leve selecionada dos IDS. DE SEQ. Nos: 158-170; (ii) uma seqüência de CDR2 de cadeia leve selecionada dos IDS. DE SEQ. Nos: 171-179; (iii) uma seqüência de CDR3 de cadeia leve selecionada dos IDS. DE SEQ. N°s: 180-194; e (b) um domínio variável da cadeia pesada que compreende: (i) uma seqüência de CDR1 de cadeia pesada selecionada dos IDS. DE SEQ. Nos: 121-131; (ii) uma seqüência de CDR2 de cadeia pesada selecionada dos IDS. DE SEQ. Nos: 132-144; e (iii) uma seqüência de CDR3 de cadeia pesada selecionada dos IDS. DE SEQ. Nos: 145-157; ou (c) o domínio variável da cadeia leve de (a) e o domínio variável da cadeia pesada de (b) , em que a proteína de ligação de antígeno se liga especificamente a (i) β-Klotho; (ii) FGFRlc, FGFR2c, FGFR3c ou FGFR4; ou (iii) um complexo que compreende β-Klotho e um de FGFRlc, FGFR2c, FGFR3C e FGFR4.
Em uma modalidade adicional, as proteínas de ligação de antígeno fornecidas compreendem: (a) uma seqüência do domínio variável da cadeia leve selecionada do grupo que consiste em: (i) aminoácidos que possuem uma seqüência pelo menos 80% idêntica a uma seqüência do domínio variável da cadeia leve selecionada de VL1-VL18, IDS. DE SEQ. Nos: 4865; (ii) uma seqüência de aminoácidos codificada por uma seqüência de polinucleotídeos que é pelo menos 80% idêntica a uma seqüência de polinucleotídeos que codifica a sequência do domínio variável da cadeia leve de VL1-VL18, IDS. DE SEQ. N°s: 48-65; (b) uma seqüência do domínio variável da cadeia pesada selecionada do grupo que consiste em: (i) uma seqüência de aminoácidos que é pelo menos 8 0% idêntica a uma seqüência do domínio variável da cadeia pesada de VH1-VH18 dos IDS. DE SEQ. Nos: 66-84; (ii) uma seqüência de aminoácidos codificada por uma seqüência de polinucleotídeos que é pelo menos 80% idêntica a uma seqüência de polinucleotídeos que codifica a seqüência do domínio variável da cadeia pesada de VH1-VH18, IDS. DE SEQ. Nos: 66-84; ou (c) o domínio variável da cadeia leve de (a) e o domínio variável da cadeia pesada de (b) ; em que a proteína de ligação de antígeno se liga especificamente a: (i) β-Klotho; (ii) FGFRlc, FGFR2C, FGFR3C ou FGFR4; ou (iii) um complexo que compreende β-Klotho e um de FGFRlc, FGFR2c, FGFR3c e FGFR4. Em modalidades particulares, as proteínas de ligação de antígeno fornecidas compreendem: (a) uma seqüência do domínio variável da cadeia leve selecionada do grupo que consiste em: VL1-VL18 dos IDS. DE SEQ. Nos: 48-65; (b) uma seqüência do domínio variável da cadeia pesada selecionada do grupo que consiste em: VH1Vh18 dos IDS. DE SEQ. N°s: 66-84; ou (c) o domínio variável da cadeia leve de (a) e o domínio variável da cadeia pesada de (b) , em que a proteína de ligação de antígeno se liga especificamente a (i) β-Klotho; (ii) FGFRlc, FGFR2c, FGFR3c ou FGFR4; ou (iii) um complexo que compreende β-Klotho e um de FGFRlc, FGFR2c, FGFR3c e FGFR4. Em outras modalidades particulares, as proteínas de ligação de antígeno fornecidas, o domínio variável da cadeia leve e um domínio variável da cadeia pesada são selecionados do grupo de combinações que consiste em: VL1VH1, VL2VH2, VL3VH3, VL3VH4, Vl4Vh5, Vl5Vh6, Vl6Vh7 , VL7VH8, VL8VH8, VL9VH9, VL9VH10, VL10VHll, Vl11Vh11, Vl12Vh12 , VL13VH13, VL14VH14, VL15VH15,
VL16VH16, Vl17Vh17 e VL18VH18, em que a proteína de ligação de antígeno se liga especificamente a: (i) β-Klotho; (ii) FGFRlc, FGFR2c, FGFR3c ou FGFR4; ou (iii) um complexo que compreende β-Klotho e um de FGFRlc, FGFR2c, FGFR3c e FGFR4. Ainda em outras modalidades adicionais, as proteínas de ligação de antígeno fornecidas ainda compreendem: (a) a sequência constante da cadeia leve de ID. DE SEQ. N° : 10; (b) a sequência constante da cadeia leve de ID. DE SEQ. N° : 11; (c) a seqüência constante da cadeia pesada de ID. DE
SEQ. N°: 9; ou (d) a seqüência constante da cadeia leve de ID. DE SEQ. N° : 10 ou ID. DE SEQ. N° : 11 e a seqüência constante da cadeia pesada de ID. DE SEQ. N°: 9.
As proteínas de ligação de antígeno fornecidas podem assumir muitas formas e podem ser, por exemplo, um anticorpo humano, um anticorpo humanizado, um anticorpo quimérico, um anticorpo monoclonal, um anticorpo policlonal, um anticorpo recombinante, um fragmento de anticorpo de ligação de antígeno, um anticorpo de cadeia única, um diabody, um triabody, um tetrabody, um fragmento Fab, um fragmento F(fab')2, um anticorpo de domínio, um anticorpo IgD, um anticorpo IgE, um anticorpo IgM, um anticorpo IgGl, um anticorpo IgG2, um anticorpo IgG3, um anticorpo IgG4 ou um anticorpo IgG4 que possuem pelo menos uma mutação na região de dobradiça.
Em outra modalidade, as proteínas de ligação de antígeno fornecidas quando ligadas a: (i) β-Klotho; (ii) FGFRlc, FGFR2c, FGFR3c ou FGFR4; ou (iii) um complexo que compreende β-Klotho e um de FGFRlc, FGFR2c, FGFR3c e FGFR4: (a) ligam-se a: (i) β-Klotho; (ii) FGFRlc, FGFR2c, FGFR3c ou FGFR4; ou (iii) um complexo que compreende β-Klotho e um de FGFRlc, FGFR2c, FGFR3c e FGFR4, com substancialmente a mesma Kd que um anticorpo de referência; (b) induzem sinalização do tipo FGF21 de 10% ou mais do que a sinalização induzida por um padrão de FGF21 do tipo selvagem que compreende a forma madura do ID. DE SEQ. N° : 2, como medido em um ensaio-repórter de ELK-luciferase; (c) exibem uma EC50 de 10 nM ou menos de sinalização do tipo FGF21 em um ensaio selecionado do grupo que consiste em: (i) um ensaio in vitro à base de célula recombinant e mediado por FGFRlc/β-Klotho; e (ii) um ensaio funcional in vitro de adipócito humano; (d) exibem uma EC50 de menos do que 10 nM de atividade agonista em FGFRlc na presença de βKlotho em um ensaio-repórter in vitro mediado por receptor de FGFRlc recombinante; e (e) exibem uma EC50 maior do que 1 pM de atividade agonista em FGFRlc na ausência de βKlotho em um ensaio-repórter in vitro mediado por receptor de FGFRlc recombinante; ou (f) competem pela ligação com um anticorpo de referência para: (i) β-Klotho; (ii) FGFRlc, FGFR2c, FGFR3c ou FGFR4; ou (iii) um complexo que compreende β-Klotho e um de FGFRlc, FGFR2c, FGFR3c e FGFR4, em que o anticorpo de referência compreende uma combinação de seqüências do domínio variável da cadeia leve e da cadeia pesada selecionadas do grupo que consiste em VL1VH1, Vl2Vh2 , Vl3Vh3 , Vl3Vh4, Vl4Vh5 , VL5VH6, VL6VH7, VL7VH8, VL8VH8,
Vl9Vh9, Vl9Vh10, Vl10Vh11, Vl11Vh11, Vl12Vh12, Vl13Vh13,
Vl14Vh14, Vl15Vh15, Vl16Vh16, Vl17Vh17 e VL18VH18. Em outras modalidades, as proteínas de ligação de antígeno fornecidas podem, quando ligadas a (i) β-Klotho; (ii) FGFRlc, FGFR2c, FGFR3c ou FGFR4; ou (iii) um complexo que compreende βKlotho e um de FGFRlc, FGFR2c, FGFR3c e FGFR4: (a) reduzir a glicemia em um modelo animal; (b) reduzir os níveis séricos de lipídeos em um modelo animal; (c) reduzir os níveis de insulina em um modelo animal; ou (d) dois ou mais de (a) e (b) e (c) .
Em modalidades específicas, as proteínas de ligação de antígeno fornecidas compreendem: (a) uma cadeia pesada que compreende um dos IDS. DE SEQ. Nos: 31, 32, 390-401, 4 04405; (b) uma cadeia leve que compreende um dos IDS. DE SEQ. Nos: 13, 14, 385-389, 402-403; ou (c) uma combinação que compreende uma cadeia pesada de (a) e uma cadeia leve de (b) .
Também são fornecidas proteínas de ligação de antígeno que são capazes de se ligar ao β-Klotho humano do tipo selvagem (ID. DE SEQ. N° : 7), mas que não se ligam a uma forma quimérica de β-Klotho, em que a forma quimérica de βKlotho compreende um arcabouço de β-Klotho humano, em que seqüências de β-Klotho murídeo substituem os resíduos humanos do tipo selvagem em pelo menos uma das (a) posições 1-80; (b) posições 303-522; (c) posições 852-1.044; e (d) combinações destas.
Em outro aspecto, a presente revelação fornece proteínas de ligação de antígeno que são capazes de se ligar ao β-Klotho humano do tipo selvagem (ID. DE SEQ. N° :
7) em pelo menos uma das (a) posições 1-80; (b) posições 303-522; (c) posições 852-1.044; e (d) combinações destas.
Ainda em outro aspecto, a presente revelação fornece proteínas de ligação de antígeno que são capazes de 5 competir com uma proteína de ligação de antígeno das reivindicações 8 ou 13 pela ligação aos resíduos de βKlotho humano do tipo selvagem em pelo menos uma das (a) posições 1-80; (b) posições 303-522; (c) posições 8521.044; e (d) combinações destas.
Também é fornecida uma composição farmacêutica que compreende uma ou mais proteínas de ligação de antígeno aqui fornecidas, misturadas com um veículo farmaceuticamente aceitável destas.
Em um aspecto adicional, também são fornecidas moléculas isoladas de ácido nucléico que codificam as proteínas de ligação de antígeno aqui reveladas. Em alguns casos, as moléculas isoladas de ácido nucléico estão ligadas operacionalmente a uma seqüência de controle. Em modalidades, esses ácidos nucléicos compreendem uma seqüência de polinucleotídeos que codifica o domínio variável da cadeia leve, o domínio variável da cadeia pesada, ou ambos, de uma proteína de ligação de antígeno aqui fornecida. Em modalidades particulares, os ácidos nucléicos compreendem: (a) VL1-VL18 (IDS. DE SEQ. Nos: 4825 65); (b) VH1-VH18 (IDS. DE SEQ. Nos: 66-84); ou (c) uma ou mais seqüências de (a) e uma ou mais seqüências de (b).
Em outro aspecto, também são fornecidos vetores de expressão e células hospedeiras transformadas ou transfectadas com os vetores de expressão que compreendem 30 as moléculas isoladas de ácido nucléico mencionadas anteriormente que codificam as proteínas de ligação de antígeno aqui reveladas.
Em outro aspecto, também são fornecidos métodos de preparação de proteínas de ligação de antígeno que se ligam específica ou seletivamente a: (i) β-Klotho; (ii) FGFRlc, FGFR2c, FGFR3c ou FGFR4; ou (iii) um complexo que compreende β-Klotho e um de FGFRlc, FGFR2c, FGFR3c e FGFR4 e compreende a etapa de preparação da proteína de ligação de antígeno por uma célula hospedeira que secreta a proteína de ligação de antígeno.
Outras modalidades fornecem um método de prevenção ou tratamento de uma condição em um indivíduo que necessita desse tratamento, que compreende a administração de uma quantidade terapeuticamente eficaz de uma composição farmacêutica aqui fornecida a um indivíduo, em que a condição é tratável por redução da glicemia, insulina ou níveis séricos de lipídeos. Em modalidades, a condição é diabetes tipo 2, obesidade, dislipidemia, NASH, doença cardiovascular ou síndrome metabólica.
Esses e outros aspectos são aqui descritos com mais detalhes. Cada um dos aspectos fornecidos pode englobar várias modalidades aqui fornecidas. Prevê-se, portanto, que cada uma das modalidades que envolvem um elemento ou combinações de elementos possa ser incluída em cada aspecto descrito, e todas essas combinações dos aspectos e modalidades acima são expressamente consideradas. Outras características, objetos e vantagens das proteínas de ligação de antígeno reveladas e métodos e composições associados são aparentes na descrição detalhada que será apresentada a seguir.
BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS
As Figura 1A-IB são um alinhamento que mostra a homologia de seqüência entre FGFRlc humano (Ν’ de Acesso no GenBank P11362; ID. DE SEQ. N° : 356) e FGFRlc murídeo (N° de Acesso no GenBank NP_034336; ID. DE SEQ. N° : 357);
várias características estão destacadas, incluindo o peptídeo sinalizador, seqüência transmembrana, região de ligação de heparina, e uma seqüência de consenso (ID. DE SEQ. N°: 358) é fornecida.
As Figura 2A-2C são um alinhamento que mostra a homologia de seqüência entre β-Klotho humano (N° de Acesso no GenBank NP_783864; ID. DE SEQ. N° : 359) e β-Klotho murídeo (Ν’ de Acesso no GenBank NP_112457; ID. DE SEQ. N°:
360) ; várias características estão destacadas, incluindo a seqüência transmembrana e dois domínios de glicosil hidrolase, e uma seqüência de consenso (ID. DE SEQ. N° :
361) é fornecida.
A Figura 3 é um perfil de citometria de fluxo de células coradas com FGF21-Alexa 647 que foram usadas como um imunógeno para gerar proteínas de ligação de antígeno; a figura mostra o nível de expressão de um FGF21R (um complexo que compreende FGFRlc e β-Klotho) e a ligação a FGF21.
A Figura 4 é uma seqüência (ID. DE SEQ. N° : 362) que mostra uma proteína de fusão Fc que foi usada como um imunógeno para gerar proteínas de ligação de antígeno; o imunógeno compreende o domínio extracelular (ECD) de FGFRlc humano fundido a um Fc de IgGl por meio de um vinculador de Gly5 (ID. DE SEQ. N°: 379); o componente de FGFRlc está em letras maiúsculas, o vinculador está em itálico e sublinhado, e o Fc está em letras minúsculas.
A Figura 5 é uma seqüência (ID. DE SEQ. N° : 363) que mostra uma proteína de fusão Fc que foi usada como um imunógeno para gerar proteínas de ligação de antígeno; o imunógeno compreende o domínio extracelular (ECD) de βKlotho humano fundido a um Fc de IgGl por meio de um vinculador de Gly5 (ID. DE SEQ. N° : 379); o componente de β-Klotho está em letras maiúsculas, o vinculador está em itálico e sublinhado, e o Fc está em letras minúsculas.
A Figura 6 é um gel de SDS-PAGE que mostra o nível de pureza obtido por preparações de um complexo de receptor de FGF21 solúvel que compreende ECD-Fc de FGFRlc e ECD-Fc de β-Klotho, que foi empregado como um imunógeno para gerar proteínas de ligação de antígeno.
A Figura 7 é uma série de gráficos gerados por um ensaio-repórter de ELK-luciferase como aqui descrito realizado no clone de CHO recombinante 2E10, demonstrando a habilidade de algumas das proteínas de ligação de antígeno para induzir sinalização do tipo FGF21 em células CHO recombinantes que expressam um complexo de receptor de FGF21 que compreende FGFRlc e β-Klotho.
A Figura 8 é uma série de gráficos gerados por um ensaio de fosforilação de ERK1/2 como aqui descrito, demonstrando a habilidade de algumas das proteínas de ligação de antígeno para induzir sinalização do tipo FGF21 em células L6 de rato. O eixo X são as concentrações das proteínas de ligação de antígeno e o eixo Y é a percentagem de ERK1/2 fosforilado de ERK1/2 total.
A Figura 9 é uma série de gráficos gerados por um ensaio de fosforilação de ERK1/2 como aqui descrito, demonstrando que a sinalização do tipo FGF21 mediada pela proteína de ligação de antígeno em células L6 é FGFRlc/βKlotho-específica.
A Figura 10 é uma série de gráficos gerados por um ensaio de fosforilação de ERK como aqui descrito, demonstrando que algumas proteínas de ligação de antígeno são capazes de induzir sinalização do tipo FGF21 em células de adipócitos humanos.
A Figura 11a é uma série de sensogramas de ligação (unidades de resposta versus tempo) demonstrando que algumas das proteínas de ligação de antígeno que induzem sinalização mediada por FGF21 se ligam ao β-Klotho humano em dois sítios de ligação diferentes, mas parcialmente superpostos, representados por 24H11 (Grupo A) e 17D8 (Grupo B) , enquanto proteínas de ligação de antígeno que não induzem sinalização mediada por FGF21 (2G10, 1A2) não se ligam a esses sítios.
A Figura 11b é uma série de sensogramas de ligação (unidades de resposta versus tempo) que demonstra um terceiro sítio de ligação em β-Klotho humano que foi identificado para proteínas de ligação de antígeno do Grupo C representado por 39F7.
A Figura 12 é uma série de sensogramas de ligação (unidades de resposta versus tempo) demonstrando que algumas das proteínas de ligação de antígeno (12E4, 24H11, 17C3, 18B11) que induzem sinalização mediada por FGF21 interferem com ligação de β-Klotho ao FGF21, enquanto outras proteínas de ligação de antígeno (21H2, 17D8, 18G1) não o fazem.
A Figura 13 é um alinhamento das regiões variáveis de algumas das proteínas de ligação de antígeno que foram 5 geradas; as regiões framework e CDR estão identificadas.
Figura 13 revela IDS. DE SEQ. Nos: 364, 59, 365, 60, 366,
61, 367, 62, 368, 57, 369, , 55 , 51-52, 56, 56, 53-54 , 63 -65
370, , 58, 371, , 50, 50, 49, 48, 372 , 78, , 373 , 66 -69, 79, 374
76, 81, 375, 70, 73 , 73, 71- 72, 376, 83, 82 , 84 , 377, 80
378, 75 e 74, respectivamente, em ordem de ocorrência.
A Figura 14 é um diagrama que ilustra graficamente o design de estudo para um estudo de 68 dias realizado em macacos Cynomolgus obesos.
A Figura 15 é um gráfico que descreve os efeitos de 15 veículo e 16H7 sobre a ingestão de alimentos na refeição da manhã dos macacos Cynomolgus obesos estudados.
A Figura 16 consiste em dois gráficos que descrevem os efeitos de veículo e 16H7 sobre a ingestão de frutas e ingestão de alimentos à tarde dos macacos Cynomolgus obesos 20 estudados.
A Figura 17 é um gráfico que descreve os efeitos de veículo e 16H7 sobre o peso corporal dos macacos Cynomolgus obesos estudados.
A Figura 18 é um gráfico que mostra os efeitos de 25 veículo e 16H7 sobre o índice de massa corporal (BMI) dos macacos Cynomolgus obesos estudados.
A Figura 19 é um gráfico que mostra os efeitos de veículo sobre a circunferência abdominal (AC) dos macacos Cynomolgus obesos estudados.
A Figura 20 é um gráfico que mostra os efeitos de veículo e 16H7 sobre a espessura da prega da pele (SFT) dos macacos Cynomolgus obesos estudados.
A Figura 21 é um gráfico que mostra os efeitos de veículo e 16H7 sobre os níveis de glicose durante testes de tolerância â glicose dos macacos Cynomolgus obesos estudados.
A Figura 22 é um gráfico que mostra os efeitos de veículo e 16H7 sobre os níveis plasmáticos de insulina durante testes de tolerância à glicose dos macacos Cynomolgus obesos estudados.
A Figura 23 é um gráfico que mostra os efeitos de veículo e 16H7 sobre os níveis de glicemia de jejum dos macacos Cynomolgus obesos estudados.
A Figura 24 é um gráfico que mostra os efeitos de veículo e 16H7 sobre os níveis plasmáticos de jejum de insulina dos macacos Cynomolgus obesos estudados.
A Figura 25 é um gráfico que mostra os efeitos de veículo e 16H7 sobre os níveis prandiais de glicemia dos macacos Cynomolgus obesos estudados.
A Figura 26 é um gráfico que mostra os efeitos de veículo e 16H7 sobre os níveis plasmáticos prandiais de insulina dos macacos Cynomolgus obesos estudados.
A Figura 27 é um gráfico que mostra os efeitos de veículo e 16H7 sobre os níveis plasmáticos de jejum de triglicerídeos dos macacos Cynomolgus obesos estudados.
A Figura 28 é um gráfico que mostra os efeitos de veículo e 16H7 sobre os níveis plasmáticos prandiais de triglicerídeos dos macacos Cynomolgus obesos estudados.
A Figura 29 é uma representação esquemática que
descreve quimeras de β-Klotho humano-de camundongo que
foram construídas e usadas para estudo da ligação de
proteínas de ligação de antígeno.
Ά Figura 30 é uma representação esquemática que descreve as quimeras de β-Klotho humano-de camundongo que foram construídas, e também inclui dados da ligação qualitativa para FGF21, 16H7, 37D3 e 39F7.
As Figuras 31A-C consistem em uma série de gráficos que descrevem dados de ligação para oito das variantes de 16H7 e 22H5 que foram construídas, bem como para 22H5 e 16H7.
As Figuras 32A-C consistem em uma série de gráficos que descrevem os resultados de ensaios ELISA que foram usados para demonstrar que diversas das variantes de 22H5 e 16H7 possuem habilidade de ligação.
A Figura 33 é um gráfico de barras que compara offrates para diversas variantes de 22H5 e 17H7 que foram geradas.
A Figura 34 consiste em dois gráficos que descrevem as curvas de ligação para 39F11 quando titulado com FGF21 e para FGF21 quando titulado com 39F11; os gráficos demonstram um efeito aditivo.
A Figura 35 consiste em dois gráficos que descrevem as curvas de ligação para 16H7 quando titulado com 39F11 e 39F11 quando titulado com 16H7; os gráficos demonstram um efeito aditivo.
DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO
Os cabeçalhos das seções aqui usados têm finalidade apenas organizacional e não devem ser considerados como limitantes do tema descrito.
A menos que aqui definido de forma diferente, os termos científicos e técnicos usados em relação ao presente pedido possuem os significados que são comumente subentendidos por aqueles habilitados na técnica. Além disso, a menos que necessário de forma diferente pelo contexto, os termos no singular devem incluir pluralidades e os termos no plural devem incluir o singular.
Geralmente, as nomenclaturas usadas em relação às técnicas de cultura de células e tecido, biologia molecular, imunologia, microbiologia, genética e química e hibridização de proteínas e ácidos nucléicos aqui descritas são bem conhecidas e comumente usadas na técnica. Os métodos e técnicas do presente pedido são geralmente realizados de acordo com métodos convencionais bem conhecidos na técnica e como descritos em várias referências gerais e mais específicas que são citadas e discutidas ao longo da presente especificação, a menos que indicado de forma diferente. Veja, por exemplo, Sambrook e cols., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3a Edição, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (2001), Ausubel e cols., Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Associates (1992), e Harlow e Lane Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1990), que são aqui incorporados por referência. Reações enzimáticas e técnicas de purificação são realizadas de acordo com as especificações do fabricante, como comumente obtidas na técnica ou como aqui descritas. A terminologia usada e os procedimentos e técnicas laboratoriais de química analítica, química orgânica sintética e química medicinal e farmacêutica aqui descritos são aqueles bem conhecidos e comumente usados na técnica. Técnicas-padrão podem ser usadas para sínteses químicas, análises químicas, preparação, formulação e liberação farmacêutica, e tratamento de pacientes.
Deve ser entendido que a presente revelação não está limitada à metodologia, protocolos e reagentes particulares etc. aqui descritos na medida em que estes podem variar. A terminologia aqui usada visa apenas descrever modalidades particulares, e não tem a intenção de limitar o escopo da presente revelação.
A não ser nos exemplos operacionais, ou quando indicado de forma diferente, todos os números que expressam quantidades de ingredientes ou condições de reação aqui usadas devem ser subentendidos como modificados em todos os casos pelo termo cerca de. 0 termo cerca de, quando usado em conexão com percentagens, pode significar ± 5%, por exemplo, 1%, 2%, 3% ou 4%.
I. DEFINIÇÕES
Como aqui usados, os termos um e uma significam um ou mais, a menos que especificamente estabelecido de forma diferente.
Uma proteína de ligação de antígeno é uma proteína que compreende uma porção que se liga a um antígeno ou alvo e, opcionalmente, uma porção de arcabouço ou framework que permite que a porção de ligação de antígeno adote uma conformação que promove a ligação da proteína de ligação de antígeno ao antígeno. Exemplos de proteínas de ligação de antígeno incluem um anticorpo humano, um anticorpo humanizado; um anticorpo quimérico; um anticorpo recombinante; um anticorpo de cadeia única; um diabody; um triabody; um tetrabody; um fragmento Fab; um fragmento F(ab')2; um anticorpo IgD; um anticorpo IgE; um anticorpo IgM; um anticorpo IgGl; um anticorpo IgG2; um anticorpo IgG3; ou um anticorpo IgG4, e fragmentos destes. A proteína de ligação de antígeno pode compreender, por exemplo, um arcabouço de proteína alternativo ou um arcabouço artificial com CDRs ou derivados de CDR enxertados. Esses arcabouços incluem, sem limitação, arcabouços derivados de anticorpo que compreendem mutações introduzidas, por exemplo, para estabilizar a estrutura tridimensional da proteína de ligação de antígeno, além de arcabouços totalmente sintéticos que compreendem, por exemplo, um polímero biocompatível. Veja, por exemplo, Korndorfer e cols., 2003, Proteins: Structure, Function, and Bioinformatics, 53(1): 121-129 (2003); Roque e cols., Biotechnol. Prog. 20: 639-654 (2004). Além disso, miméticos de anticorpo peptídico (PAMs) podem ser usados, além de arcabouços baseados em miméticos de anticorpo que utilizam componentes de fibronectina como um arcabouço.
Uma proteína de ligação de antígeno pode ter, por exemplo, a estrutura de uma imunoglobulina de ocorrência natural. Uma imunoglobulina é uma molécula tetramérica. Em uma imunoglobulina de ocorrência natural, cada tetrâmero é composto por dois pares idênticos de cadeias polipeptídicas, cada par possuindo uma cadeia leve (cerca de 25 kDa) e uma cadeia pesada (cerca de 50-70 kDa) . A porção do terminal amino de cada cadeia inclui uma região variável de cerca de 100 a 110 ou mais aminoácidos primariamente responsáveis pelo reconhecimento de antígeno. A porção do terminal carbóxi de cada cadeia define uma região constante primariamente responsável pela função efetora. Cadeias leves humanas são classificadas como cadeias leves kappa e lambda. As cadeias pesadas são classificadas como mu, delta, gama, alfa ou épsilon, e definem o isótipo do anticorpo como IgM, IgD, IgG, IgA e IgE, respectivamente. Dentro das cadeias leves e pesadas, as regiões variáveis e constantes são unidas por uma região J de cerca de 12 ou mais aminoácidos, com a cadeia pesada também incluindo uma região D de cerca de mais 10 aminoácidos. Veja, geralmente, Fundamental Immunology, Capítulo 7 (Paul, W., ed., 2a Edição Raven Press, N.Y.
(1989)) (incorporado por referência em sua totalidade para todas as finalidades). As regiões variáveis de cada par de cadeia leve/pesada formam o sítio de ligação de anticorpo, de tal forma que uma imunoglobulina intacta possui dois sítios de ligação.
As cadeias de imunoglobulina de ocorrência natural exibem a mesma estrutura geral de regiões framework relativamente conservadas (FR) unidas por três regiões hipervariáveis, também denominadas regiões determinantes de complementaridade ou CDRs. Do terminal N para o terminal C, tanto cadeias leves quanto pesadas compreendem os domínios FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3 e FR4. A designação de aminoácidos para cada domínio pode ser feita de acordo com as definições de Kabat e cols, em Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5a Edição, US Dept, of Health and
Human Services, PHS, NIH, Publicação NIH N° 91-3242, 1991. Como desejado, as CDRs também podem ser redefinidas de acordo com um esquema de nomenclatura alternativo, por exemplo, aquele de Chothia (veja Chothia e Lesk, 1987, J. Mol. Biol. 196: 901-917; Chothia e cols., 1989, Nature 342: 878-883 ou Honegger e Pluckthun, 2001, J. Mol. Biol. 309: 657-670).
No contexto da presente revelação, diz-se que uma proteína de ligação de antígeno se liga especificamente ou se liga seletivamente ao seu antígeno-alvo quando a constante de dissociação (KD) é < 10-8 Μ. O anticorpo se liga especificamente ao antígeno com afinidade elevada quando a KD é < 5 x 10'9 M, e com afinidade muito elevada quando a KD é < 5 x 10_1° M. Em uma modalidade, os anticorpos se ligarão ao FGFRlc, β-Klotho, tanto ao FGFRlc quanto ao β-Klotho, ou a um complexo que compreende FGFRlc e β-Klotho, incluindo FGFRlc humano, β-Klotho humano, ou tanto ao FGFRlc humano quanto ao β-Klotho humano, com uma KD entre cerca de IO'7 M e IO’12 M e, ainda em outra modalidade, os anticorpos se ligarão com uma KD < 5 x IO'9.
Um anticorpo se refere a uma imunoglobulina intacta ou a uma porção de ligação de antígeno desta que compete com o anticorpo intacto por ligação específica, a menos que especificado de forma diferente. Porções de ligação de antígeno podem ser produzidas por técnicas de DNA recombinante ou por divagem enzimática ou química de anticorpos intactos. Porções de ligação de antígeno incluem, inter alia, Fab, Fab', F(ab')2, Fv, anticorpos de domínio (dAbs), fragmentos que incluem regiões determinantes de complementaridade (CDRs), anticorpos de cadeia única (scFv), anticorpos quiméricos, diabodies, triabodies, tetrabodies e polipeptídeos que contêm pelo menos uma porção de uma imunoglobulina que é suficiente para conferir ligação de antígeno específica ao polipeptídeo.
Um fragmento Fab é um fragmento monovalente que possui os domínios de VL, VH, CL e CH1; um fragmento F(ab')2 é um fragmento bivalente que possui dois fragmentos Fab ligados por uma ponte dissulfeto na região de dobradiça; um fragmento Fd possui os domínios de VH e CH1; um fragmento Fv possui os domínios de VL e VH de um único braço de um anticorpo; e um fragmento dAb possui um domínio de VH, um domínio de VL, ou um fragmento de ligação de antígeno de um domínio de VH ou VL (Patentes U.S. Nos 6.846.634, 6.696.245, Publicações de Pedidos U.S. Nos 05/0202512, 04/0202995, 04/0038291, 04/0009507, 03/0039958, Ward e cols ., Nature 341 : 544-546 (1989) ) .
Um anticorpo de cadeia única (scFv) é um anticorpo no qual uma região de VL e uma de VH são unidas por meio de um vinculador (por exemplo, uma seqüência sintética de resíduos de aminoácidos) para formar uma cadeia de proteína contínua em que o vinculador é suficientemente longo para permitir que a cadeia de proteína se dobre sobre si mesma e forme um sítio de ligação de antígeno monovalente (veja, por exemplo, Bird e cols., Science 242: 423-26 (1988) e Huston e cols., 1988, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 85: 5.87983 (1988)). Diabodies são anticorpos bivalentes que compreendem duas cadeias polipeptídicas, em que cada cadeia polipeptídica compreende domínios de VH e VL unidos por um vinculador que é muito curto para permitir o pareamento entre dois domínios na mesma cadeia, permitindo, dessa forma, que cada domínio pareie com um domínio complementar em outra cadeia polipeptídica (veja, por exemplo, Holliger e cols., 1993, Proc. Natl . Acad. Sei. USA 90: 6.444-48 (1993), e Poljak e cols., Structure 2: 1.121-23 (1994)). Se as duas cadeias polipeptídicas de um diabody são idênticas, então um diabody resultante de seu pareamento terá dois sítios de ligação de antígeno idênticos. Cadeias polipeptídicas que possuem sequências diferentes podem ser usadas para produzir um diabody com dois sítios de ligação de antígeno diferentes. Similarmente, tribodies e tetrabodies são anticorpos que compreendem três e quatro cadeias polipeptídicas, respectivamente, e que formam três e quatro sítios de ligação de antígeno, respectivamente, que podem ser iguais ou diferentes.
Regiões determinantes de complementaridade (CDRs) e regiões framework (FR) de certo anticorpo podem ser identificadas usando o sistema descrito por Kabat e cols. em Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5a Edição, US Dept, of Health and Human Services, PHS, NIH, Publicação NIH N° 91-3242, 1991. Como desejado, as CDRs também podem ser redefinidas de acordo com um esquema de nomenclatura alternativo, por exemplo, aquele de Chothia (veja Chothia e Lesk, 1987, J. Mol. Biol. 196: 901-917; Chothia e cols., 1989, Nature 342: 878-883 ou Honegger e Pluckthun, 2001, J. Mol. Biol. 309: 657-670). Uma ou mais CDRs podem ser incorporadas em uma molécula de forma covalente ou não covalente para torná-la uma proteína de ligação de antígeno. Uma proteína de ligação de antígeno pode incorporar a(s) CDR(s) como parte de uma cadeia polipeptídica maior, pode ligar covalentemente a(s) CDR(s) a outra cadeia polipeptídica, ou pode incorporar a(s) CDR(s) não covalentemente. As CDRs permitem que a proteína de ligação de antígeno se ligue especificamente a um antígeno de interesse em particular.
Uma proteína de ligação de antígeno pode ter um ou mais sítios de ligação. Caso haja mais de um sítio de ligação, os sítios de ligação podem ser idênticos uns aos outros ou podem ser diferentes. Por exemplo, uma imunoglobulina humana de ocorrência natural tipicamente possui dois sítios de ligação idênticos, enquanto um anticorpo biespecífico ou bifuncional possui dois sítios de ligação diferentes.
O termo anticorpo humano inclui todos os anticorpos que possuem uma ou mais regiões variáveis e constantes derivadas de seqüências de imunoglobulina humana. Em uma modalidade, todos os domínios variáveis e constantes são derivados de seqüências de imunoglobulina humana (um anticorpo totalmente humano). Esses anticorpos podem ser preparados de diversas formas, cujos exemplos são descritos abaixo, incluindo por meio da imunização com um antígeno de interesse de um camundongo que é modificado geneticamente para expressar anticorpos derivados de genes que codificam cadeia pesada e/ou leve humana, por exemplo, um camundongo derivado de um sistema Xenomouse®, UltiMab™ ou Velocimmune®. Abordagens à base de fago também podem ser empregadas.
Um anticorpo humanizado possui uma seqüência que difere da seqüência de um anticorpo derivado de uma espécie não humana por uma ou mais substituições, deleções e/ou adições de aminoácidos, de tal forma que o anticorpo humanizado tenha menos probabilidade de induzir uma resposta imune e/ou induza uma resposta imune menos severa, quando comparado com o anticorpo de espécie não humana, quando é administrado a um indivíduo humano. Em uma modalidade, certos aminoácidos nos domínios framework e constantes das cadeias pesadas e/ou leves do anticorpo de espécie não humana são mutados para produzir o anticorpo humanizado. Em outra modalidade, o(s) domínio(s) constante(s) de um anticorpo humano são fundidos ao(s) domínio(s) variável(variáveis) de uma espécie não humana. Em outra modalidade, um ou mais resíduos de aminoácidos em uma ou mais seqüências de CDR de um anticorpo não humano são alteradas para reduzir a imunogenicidade provável do anticorpo não humano quando ele é administrado a um indivíduo humano, em que os resíduos de aminoácidos alterados não são cruciais para ligação imunoespecífica do anticorpo ao seu antígeno, ou as alterações da seqüência de aminoácidos que são feitas são alterações conservadoras, de tal forma que a ligação do anticorpo humanizado ao antígeno não seja significativamente pior do que a ligação do anticorpo não humano ao antígeno. Exemplos de como produzir anticorpos humanizados podem ser encontrados nas Patentes U.S. Nos 6.054.297, 5.886.152 e 5.877.293.
O termo anticorpo quimérico se refere a um anticorpo que contém uma ou mais regiões de um anticorpo e uma ou mais regiões de um ou mais outros anticorpos. Em uma modalidade, uma ou mais das CDRs são derivadas de um anticorpo humano que se liga a: (i) β-Klotho; (ii) FGFRlc, FGFR2c, FGFR3c ou FGFR4; ou (iii) um complexo que compreende β-Klotho e um de FGFRlc, FGFR2c, FGFR3c e FGFR4. Em outra modalidade, todas as CDRs são derivadas de um anticorpo humano que se liga a: (i) β-Klotho; (ii) FGFRlc, FGFR2c, FGFR3c ou FGFR4; ou (iii) um complexo que compreende β-Klotho e um de FGFRlc, FGFR2c, FGFR3c e FGFR4. Em outra modalidade, as CDRs de mais de um anticorpo humano que se ligam a (i) β-Klotho; (ii) FGFRlc, FGFR2c, FGFR3c ou FGFR4; ou (iii) a um complexo que compreende β-Klotho e um de FGFRlc, FGFR2c, FGFR3c e FGFR4 são misturados e combinados em um anticorpo quimérico. Por exemplo, um anticorpo quimérico pode compreender uma CDR1 da cadeia leve de um primeiro anticorpo humano que se liga a: (i) βKlotho; (ii) FGFRlc, FGFR2c, FGFR3C ou FGFR4; ou (iii) um complexo que compreende β-Klotho e um de FGFRlc, FGFR2c, FGFR3c e FGFR4, a CDR2, e uma CDR3 da cadeia leve de um segundo anticorpo humano que se liga a: (i) β-Klotho; (ii) FGFRlc, FGFR2C, FGFR3C ou FGFR4; ou (iii) um complexo que compreende β-Klotho e um de FGFRlc, FGFR2c, FGFR3c e FGFR4, e as CDRs da cadeia pesada de um terceiro anticorpo que se liga a: (i) β-Klotho; (ii) FGFRlc, FGFR2c, FGFR3C ou FGFR4; ou (iii) um complexo que compreende β-Klotho e um de FGFRlc, FGFR2c, FGFR3c e FGFR4. Além disso, as regiões framework podem ser derivadas de um dos mesmos anticorpos que se ligam a (i) β-Klotho; (ii) FGFRlc, FGFR2c, FGFR3C ou FGFR4; ou (iii) a um complexo que compreende β-Klotho e um de FGFRlc, FGFR2c, FGFR3c e FGFR4, de um ou mais anticorpos diferentes, por exemplo, um anticorpo humano, ou de um anticorpo humanizado. Em um exemplo de um anticorpo quimérico, uma porção da cadeia pesada e/ou leve é idêntica, homóloga ou derivada de um anticorpo de uma espécie particular ou que pertence a uma classe ou subclasse de anticorpo em particular, enquanto o restante da(s) cadeia(s) é idêntico, homólogo ou derivado de um anticorpo ou anticorpos de outra espécie ou que pertence a outra classe ou subclasse de anticorpo. Também são incluídos fragmentos desses anticorpos que exibem a atividade biológica desejada (por exemplo, a habilidade para se ligar especificamente a: (i) β-Klotho; (ii) FGFRlc, FGFR2c, FGFR3c ou FGFR4; ou (iii) um complexo que compreende β-Klotho e um de FGFRlc, FGFR2c, FGFR3c e FGFR4).
O termo cadeia leve inclui uma cadeia leve de comprimento total e fragmentos desta que possuem seqüência da região variável suficiente para conferir especificidade de ligação. Uma cadeia leve de comprimento total inclui um domínio da região variável, VL, e um domínio da região constante, CL. 0 domínio da região variável da cadeia leve está no terminal amino do polipeptídeo. Cadeias leves incluem cadeias kappa (K) e cadeias lambda (λ).
termo cadeia pesada inclui uma cadeia pesada de comprimento total e fragmentos desta que possuem seqüência da região variável suficiente para conferir especificidade
de ligação. Uma cadeia pesada de comprimento total inclui
um domínio da região variável, VH, e três domínios da
região constante , CH1, Ch2 e Ch3.
0 domínio de VH está no terminal amino do
polipeptídeo, e os domínios de CH estão no terminal
carboxil, com a CH3 estando mais perto do terminal carbóxi do polipeptídeo. Cadeias pesadas podem ser de qualquer isótipo, incluindo IgG (incluindo subtipos IgGl, IgG2, IgG3 e IgG4), IgA (incluindo subtipos IgAl e IgA2), IgM e IgE.
O termo fragmento imunologicamente funcional (ou simplesmente fragmento) de uma proteína de ligação de antígeno, por exemplo, um anticorpo ou cadeia de imunoglobulina (cadeia pesada ou leve), como aqui usado, é uma proteína de ligação de antígeno que compreende uma porção (independentemente de como aquela porção é obtida ou sintetizada) de um anticorpo desprovida de pelo menos alguns dos aminoácidos presentes em uma cadeia de comprimento total, mas que é capaz de se ligar especificamente a um antígeno. Esses fragmentos são biologicamente ativos na medida em que se ligam especificamente ao antígeno-alvo e podem competir com outras proteínas de ligação de antígeno, incluindo anticorpos intactos, pela ligação específica a certo epitopo. Em um aspecto, um fragmento desse tipo reterá pelo menos uma CDR presente na cadeia leve ou pesada de comprimento total e, em algumas modalidades, compreenderá uma única cadeia pesada e/ou cadeia leve ou porção desta. Esses fragmentos biologicamente ativos podem ser produzidos por técnicas de DNA recombinante, ou podem ser produzidos por divagem enzimática ou química de proteínas de ligação de antígeno, incluindo anticorpos intactos. Fragmentos de imunoglobulina imunologicamente funcionais incluem, sem limitação, Fab, Fab', F(ab')2, Fv, anticorpos de domínio e anticorpos de cadeia única, e podem ser derivados de qualquer fonte mamífera, incluindo, sem limitação, humanos, de camundongo, rato, camelídeo ou coelho. É ainda contemplado que uma porção funcional das proteínas de ligação de antígeno aqui reveladas, por exemplo, uma ou mais CDRs, poderia ser ligada covalentemente a uma segunda proteína ou a uma pequena molécula para criar um agente terapêutico dirigido a um alvo particular no corpo, que possui propriedades terapêuticas bifuncionais, ou que possui uma meia-vida sérica prolongada.
Uma região Fc contém dois fragmentos de cadeia pesada que compreendem os domínios de CH2 e CH3 de um anticorpo. Os dois fragmentos de cadeia pesada são mantidos juntos por duas ou mais ligações dissulfeto e por interações hidrofóbicas dos domínios de CH3 .
Um fragmento Fab' contém uma cadeia leve e uma porção de uma cadeia pesada que contém o domínio de VH e o domínio de CH1 e também a região entre os domínios de CH1 e Ch2, de tal forma que a ligação dissulfeto intercadeias possa ser formada entre as duas cadeias pesadas de dois fragmentos Fab' para formar uma molécula de F(ab')2.
Um fragmento F(ab')2 contém duas cadeias leves e duas cadeias pesadas que contêm uma porção da região constante entre os domínios de CH1 e CH2, de tal forma que ligação dissulfeto intercadeias é formada entre as duas cadeias pesadas. Dessa forma, um fragmento F(ab')2 é composto por dois fragmentos Fab' que são mantidos juntos por uma ligação dissulfeto entre as duas cadeias pesadas.
A região Fv compreende as regiões variáveis tanto das cadeias pesadas quanto das leves, mas é desprovida das regiões constantes.
Um anticorpo de domínio é um fragmento de imunoglobulina imunologicamente funcional que contém apenas a região variável de uma cadeia pesada ou a região variável de uma cadeia leve. Em alguns casos, duas ou mais regiões VH estão unidas covalentemente com um vinculador peptídico para criar um anticorpo de domínio bivalente. As duas regiões VH de um anticorpo de domínio bivalente podem visar o mesmo antígeno ou antígenos diferentes.
Um hemibody é uma construção de imunoglobulina imunologicamente funcional que compreende uma cadeia pesada completa, uma cadeia leve completa e uma segunda região Fc de cadeia pesada pareada com a região Fc da cadeia pesada completa. Um vinculador pode, mas não necessariamente, ser empregado para unir a região Fc de cadeia pesada e a segunda região Fc de cadeia pesada. Em modalidades particulares, um hemibody é uma forma monovalente de uma proteína de ligação de antígeno aqui revelada. Em outras modalidades, pares de resíduos carregados podem ser empregados para associar uma região Fc com a segunda região Fc. A segunda região Fc de cadeia pesada pode compreender, por exemplo, o ID. DE SEQ. N° : 441, e pode ser unida à cadeia leve por meio de um vinculador (por exemplo, o ID. DE SEQ. N° : 440). Uma cadeia pesada de hemibody exemplar compreende a seqüência ID. DE SEQ. N°: 453.
Uma proteína de ligação de antígeno bivalente ou anticorpo bivalente compreende dois sítios de ligação de antígeno. Em alguns casos, os dois sítios de ligação possuem as mesmas especificidades de antígeno. Proteínas de ligação de antígeno bivalentes e anticorpos bivalentes podem ser biespecíficos, como aqui descrito.
Uma proteína de ligação de antígeno multiespecífica ou anticorpo multiespecífico é aquele que visa mais de um antígeno ou epitopo.
Uma proteína de ligação de antígeno ou anticorpo biespecífico, duplamente específico ou bifuncional é uma proteína de ligação de antígeno ou anticorpo híbrido, respectivamente, que possui dois sítios de ligação de antígeno diferentes. Proteínas de ligação de antígeno e anticorpos biespecíficos são uma espécie de proteína de ligação de antígeno multiespecífica ou anticorpo multiespecífico e podem ser produzidos por diversos métodos, incluindo, sem limitação, fusão de hibridomas ou ligação de fragmentos Fab'. Veja, por exemplo, Songsivilai e Lachmann, 1990, Clin. Exp. Immunol. 79: 315-321; Kostelny e cols., 1992, J. Immunol. 148: 1.547-1.553. Os dois sítios de ligação de uma proteína de ligação de antígeno ou anticorpo biespecífico se ligarão a dois epitopos diferentes, que podem residir nos mesmos alvos protéicos ou em alvos protéicos diferentes.
Os termos sinalização do tipo FGF21 e induz sinalização do tipo FGF21, quando aplicados a uma proteína de ligação de antígeno da presente revelação, significam que a proteína de ligação de antígeno mimetiza ou modula um efeito biológico in vivo induzido pela ligação de: (i) βKlotho; (ii) FGFRlc, FGFR2C, FGFR3C ou FGFR4; ou (iii) um complexo que compreende β-Klotho e um de FGFRlc, FGFR2c, FGFR3c e FGFR4 e induz uma resposta biológica que de outro modo resultaria da ligação de FGF21 a: (i) β-Klotho; (ii) FGFRlc, FGFR2C, FGFR3c ou FGFR4; ou (iii) um complexo que compreende β-Klotho e um de FGFRlc, FGFR2c, FGFR3c e FGFR4 in vivo. Na avaliação da ligação e especificidade de uma proteína de ligação de antígeno, por exemplo, um anticorpo ou fragmento imunologicamente funcional deste, considera-se que um anticorpo ou fragmento induz uma resposta biológica quando a resposta é igual ou maior do que 5% e, preferivelmente, igual ou maior do que 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90% ou 95% da atividade de um padrão de FGF21 do tipo selvagem que compreende a forma madura do ID. DE SEQ. N°: 2 (ou seja, a forma madura da seqüência de FGF21 humano) e possui as seguintes propriedades: exibe um nível de eficácia igual ou maior do que 5% de um padrão de FGF21, com uma EC50 igual ou menor do que 100 nM, por exemplo, 90 nM, 80 nM, 70 nM, 60 nM, 50 nM, 40 nM, 30 nM, 20 nM ou 10 nM: (1) no ensaio celular repórter de luciferase mediado por receptor de FGF21 recombinante do Exemplo 5; (2) fosforilação de ERK no ensaio celular mediado por receptor de FGF21 recombinante do Exemplo 5; e (3) fosforilação de ERK em adipócitos humanos, como descrito no Exemplo 7. A potência de uma proteína de ligação de antígeno é definida como exibindo uma EC50 igual ou menor do que 100 nM, por exemplo, 90 nM, 80 nM, 70 nM, 60 nM, 50 nM, 40 nM, 30 nM, 20 nM, 10 nM e preferivelmente menos do que 10 nM da proteína de ligação de antígeno nos seguintes ensaios: (1) o ensaio celular repórter de luciferase mediado por receptor de FGF21 recombinante do Exemplo 5; (2) a fosforilação de ERK no ensaio celular mediado por receptor de FGF21 recombinante do Exemplo 5; e (3) fosforilação de ERK em adipócitos humanos como descrito no Exemplo 7.
Deve ser observado que nem todas as proteínas de ligação de antígeno da presente revelação induzem sinalização mediada por FGF21, nem que essa propriedade é desejável em todas as circunstâncias. Todavia, proteínas de ligação de antígeno que não induzem sinalização mediada por FGF21 formam aspectos da presente revelação e podem ser úteis como reagentes diagnósticos ou outras aplicações.
Como aqui usado, o termo FGF21R significa um complexo receptor multimérico que FGF21 sabida ou supostamente forma in vivo. Em várias modalidades, FGF21R compreende: (i) um FGFR, por exemplo, FGFRlc, FGFR2c, FGFR3C ou FGFR4, e (ii) β-Klotho.
O termo polinucleotídeo ou ácido nucléico inclui polímeros de nucleotídeos tanto de fita simples quanto de fita dupla. Os nucleotídeos que compreendem o polinucleotídeo podem ser ribonucleotídeos ou desoxirribonucleotídeos ou uma forma modificada de um dos tipos de nucleotídeos. As referidas modificações incluem modificações de base como, por exemplo, bromouridina e derivados de inosina, modificações de ribose como, por exemplo, 2',3'-didesoxirribose, e modificações da ligação internucleotídeos como, por exemplo, fosforotiotato, fosforoditiotato, fosforoselenoato, fosforodisselenoato, fosforoanilotiotato, fosforaniladato e fosforoamidato.
termo oligonucleotideo significa um polinucleotídeo que compreende 200 ou menos nucleotídeos. Em algumas modalidades, oligonucleotídeos possuem 10 a 60 bases de comprimento. Em outras modalidades, oligonucleotídeos possuem 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, ou 20 a 40 nucleotídeos de comprimento. Oligonucleotídeos podem ser de fita simples ou de fita dupla, por exemplo, para uso na construção de um gene mutante. Oligonucleotídeos podem ser oligonucleotídeos senso ou anti-senso. Um oligonucleotideo pode incluir um marcador, incluindo um radiomarcador, um marcador fluorescente, um hapteno ou um marcador antigênico, para ensaios de detecção. Oligonucleotídeos podem ser usados, por exemplo, como iniciadores de PCR, iniciadores de clonagem ou sondas de hibridização.
Uma molécula isolada de ácido nucléico significa um DNA ou RNA de origem genômica, de mRNA, cDNA ou sintética ou alguma combinação destas que não está associado a todo ou a uma porção de um polinucleot ideo no qual o polinucleotídeo isolado é encontrado na natureza, ou está ligado a um polinucleotídeo ao qual não está ligado na natureza. Para os objetivos desta revelação, subentende-se que uma molécula de ácido nucléico que compreende uma seqüência de nucleotídeos em particular não engloba cromossomos intactos. Moléculas isoladas de ácido nucléico que compreendem seqüências de ácidos nucléicos especificadas podem incluir, além das seqüências especificadas, seqüências codificadoras para até dez ou até mesmo para até vinte outras proteínas ou porções destas, ou podem incluir seqüências reguladoras ligadas operacionalmente que controlam a expressão da região codificadora das seqüências de ácidos nucléicos citadas e/ou podem incluir seqüências de vetor.
A menos que especificado de forma diferente, a extremidade para a esquerda de qualquer seqüência de polinucleotídeos de fita simples aqui discutida é a extremidade 5' ; a direção para a esquerda seqüências de polinucleotídeos de fita dupla é denominada a direção 5'. A direção da adição 5' para 3' de transcritos de RNA nascentes é denominada como a direção de transcrição;
regiões da seqüência na fita de DNA que possuem a mesma seqüência que o transcrito de RNA que estão 5' para a extremidade 5' do transcrito de RNA são denominadas seqüências upstream; regiões da seqüência na fita de DNA que possuem a mesma seqüência que o transcrito de RNA que estão 3' para a extremidade 3' do transcrito de RNA são denominadas seqüências downstream.
termo seqüência de controle se refere a uma seqüência de polinucleotídeos que pode afetar a expressão e processamento de seqüências codificadoras às quais está ligada. A natureza dessas seqüências de controle pode depender do organismo hospedeiro. Em modalidades particulares, seqüências de controle para procariotas podem incluir um promotor, um sítio de ligação de ribossomo e uma seqüência de terminação da transcrição. Por exemplo, seqüências de controle para eucariotas podem incluir promotores que compreendem um ou diversos sítios de reconhecimento para fatores de transcrição, seqüências intensificadoras da transcrição e seqüência de terminação da transcrição. Seqüências de controle podem incluir seqüências-líderes e/ou seqüências de parceiro de fusão.
termo vetor significa qualquer molécula ou entidade (por exemplo, ácido nucléico, plasmídeo, bacteriófago ou vírus) usada para transferir informação de
codificação de proteína em uma célula hospedeira.
0 termo vetor de expressão ou construção de
expressão se refere a um vetor que é adequado à
transformação de uma célula hospedeira e contém seqüências de ácidos nucléicos que dirigem e/ou controlam (em conjunto com a célula hospedeira) a expressão de uma ou mais regiões codificadoras heterólogas ligadas operativamente a ela. Uma construção de expressão pode incluir, sem limitação, seqüências que afetam ou controlam a transcrição, tradução e, se introns estiverem presentes, afetam o splicing de RNA de uma região codificadora operacionalmente ligada a ela.
Como aqui usado, o termo ligado operacionalmente significa que os componentes aos quais o termo é aplicado estão em um relacionamento que os permite realizar suas funções inerentes sob condições adequadas. Por exemplo, uma seqüência de controle em um vetor que está ligado operacionalmente a uma seqüência codificadora de proteína está a ela ligada de tal forma que a expressão da seqüência codificadora de proteína seja obtida sob condições compatíveis com a atividade transcricional das seqüências de controle.
termo célula hospedeira significa uma célula que foi transformada, ou é capaz de ser transformada, com uma seqüência de ácidos nucléicos e, desse modo, expressa um gene de interesse. O termo inclui a prole da célula parente, seja a prole idêntica ou não em morfologia ou em constituição genética à célula parente original, desde que o gene de interesse esteja presente.
O termo transdução significa a transferência de genes de uma bactéria para outra, normalmente por bacteriófago. Transdução também se refere à aquisição e transferência de seqüências celulares eucarióticas por retrovirus com replicação defeituosa.
O termo transfecção significa a captação de DNA estranho ou exógeno por uma célula, e uma célula foi transfectada quando o DNA exógeno foi introduzido dentro da membrana da célula. Diversas metodologias de transfecção são bem conhecidas na técnica e são aqui reveladas. Veja, por exemplo, Graham e cols., (1973) Virology 52: 456; Sambrook e cols., (2001) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, supra; Davis e cols., (1986) Basic Methods in Molecular Biology, Elsevier; Chu e cols., (1981) Gene 13: 197. Essas técnicas podem ser usadas para introduzir uma ou mais porções de DNA exógeno em células hospedeiras adequadas.
termo transformação se refere a uma alteração nas características genéticas de uma célula, e uma célula foi transformada quando ela foi modificada para conter novo DNA ou RNA. Por exemplo, uma célula é transformada quando ela está modificada geneticamente em relação ao seu estado nativo por introdução de novo material genético por meio de transfecção, transdução, ou por outras técnicas. Após transfecção ou transdução, o DNA transformante pode recombinar com o da célula por integração física em um cromossomo da célula, ou pode ser mantido transitoriamente como um elemento epissômico sem ser replicado, ou pode replicar independentemente como um plasmídeo. Uma célula é considerada como tendo sido transformada estavelmente quando o DNA transformante é replicado com a divisão da célula.
Os termos polipeptídeo ou proteína são aqui usados de forma intercambiável para se referir a um polímero de resíduos de aminoácidos. Os termos também se aplicam aos polímeros de aminoácidos nos quais um ou mais resíduos de aminoácidos são um análogo ou mimético de um aminoácido de ocorrência natural correspondente, bem como aos polímeros de aminoácidos de ocorrência natural. Os termos também englobam polímeros de aminoácidos que foram modificados, por exemplo, pela adição de resíduos de carboidrato para formar glicoproteínas, ou fosforilados. Polipeptídeos e proteínas podem ser produzidos por uma célula de ocorrência natural e não recombinante, ou polipeptídeos e proteínas podem ser produzidos por uma célula modificada geneticamente ou recombinante. Polipeptídeos e proteínas podem compreender moléculas que possuem a seqüência de aminoácidos de uma proteína nativa, ou moléculas que possuem deleções, adições e/ou substituições de um ou mais aminoácidos da seqüência nativa. Os termos polipeptídeo e proteína englobam proteínas de ligação de antígeno que se ligam específica ou seletivamente a: (i) β-Klotho; (ii) FGFRlc, FGFR2c, FGFR3c ou FGFR4; ou (iii) um complexo que compreende β-Klotho e um de FGFRlc, FGFR2c, FGFR3c e FGFR4, ou seqüências que possuem deleções, adições e/ou substituições de um ou mais aminoácidos de uma proteína de ligação de antígeno que se liga especificamente ou seletivamente a: (i) β-Klotho; (ii) FGFRlc, FGFR2c, FGFR3c ou FGFR4; ou (iii) um complexo que compreende β-Klotho e um de FGFRlc, FGFR2c, FGFR3c e FGFR4. 0 termo fragmento de polipeptídeo se refere a um polipeptídeo que possui uma deleção do terminal amino, uma deleção do terminal carboxil e/ou uma deleção interna, quando comparado com a proteína de comprimento total. Esses fragmentos também podem conter aminoácidos modificados, quando comparados com a proteína de comprimento total. Em certas modalidades, fragmentos possuem cerca de cinco a 500 aminoácidos de comprimento. Por exemplo, fragmentos podem ter pelo menos 5, 6, 8, 10,
14, 20, 50, 70, 100, 110, 150, 200, 250, 300, 350, 400 ou 450 aminoácidos de comprimento. Fragmentos de polipeptídeo úteis incluem fragmentos imunologicamente funcionais de anticorpos, incluindo domínios de ligação. No caso de uma proteína de ligação de antígeno que se liga a (i) β-Klotho; (ii) FGFRlc, FGFR2c, FGFR3c ou FGFR4; ou (iii) um complexo que compreende β-Klotho e um de FGFRlc, FGFR2c, FGFR3c e FGFR4, fragmentos úteis incluem, sem limitação, uma região de CDR, um domínio variável de uma cadeia pesada ou leve, uma porção de uma cadeia de anticorpo ou apenas sua região variável, incluindo duas CDRs, e semelhantes.
O termo proteína isolada significa que uma proteína em questão: (1) é livre de pelo menos algumas outras proteínas com as quais normalmente seria encontrada, (2) é essencialmente livre de outras proteínas da mesma fonte, por exemplo, da mesma espécie, (3) é expressa por uma célula de uma espécie diferente, (4) foi separada de pelo menos cerca de 50 por cento de polinucleotídeos, lipídeos, carboidratos ou outros materiais com os quais está associada na natureza, (5) está operacionalmente associada (por interação covalente ou não covalente) com um polipeptídeo com o qual não está associada na natureza, ou (6) não ocorre na natureza. Tipicamente, uma proteína isolada constitui pelo menos cerca de 5%, pelo menos cerca de 10%, pelo menos cerca de 25% ou pelo menos cerca de 50% de certa amostra. DNA genômico, cDNA, mRNA ou outro RNA, de origem sintética, ou qualquer combinação destes, podem codificar essa proteína isolada. De preferência, a proteína isolada é substancialmente livre de proteínas ou polipeptídeos ou outros contaminantes que são encontrados em seu ambiente natural que iriam interferir com seu uso terapêutico, diagnóstico, profilático, de pesquisa, ou outro.
Uma variante de um polipeptídeo (por exemplo, uma proteína de ligação de antígeno, ou um anticorpo) compreende uma seqüência de aminoácidos em que um ou mais resíduos de aminoácidos são inseridos, deletados e/ou substituídos na seqüência de aminoácidos em relação a outra seqüência polipeptídica. Variantes incluem proteínas de fusão.
Um derivado de um polipeptídeo é um polipeptídeo (por exemplo, uma proteína de ligação de antígeno, ou um anticorpo) que foi modificado quimicamente de alguma forma distinta de variantes de inserção, deleção ou substituição, por exemplo, por conjugação com outra porção química.
termo de ocorrência natural, como usado ao longo da especificação em conexão com materiais biológicos como, por exemplo, polipeptídeos, ácidos nucléicos, células hospedeiras, e semelhantes, se refere aos materiais que são encontrados na natureza.
A região de ligação de antígeno significa uma proteína, ou uma porção de uma proteína, que se liga especificamente a um antígeno especificado, por exemplo, FGFRlc, β-Klotho, ou tanto FGFRlc quanto β-Klotho. Por exemplo, aquela porção de uma proteína de ligação de antígeno que contém os resíduos de aminoácidos que interagem com um antígeno e conferem ã proteína de ligação de antígeno sua especificidade e afinidade para o antígeno é denominada região de ligação de antígeno. Uma região de ligação de antígeno tipicamente inclui uma ou mais regiões de ligação complementares (CDRs). Certas regiões de ligação de antígeno também incluem uma ou mais regiões framework. Uma CDR é uma seqüência de aminoácidos que contribui para a especificidade e afinidade de ligação de antígeno. Regiões framework podem auxiliar na manutenção da conformação adequada das CDRs para promover a ligação entre a região de ligação de antígeno e um antígeno.
Em certos aspectos, são fornecidas proteínas de ligação de antígeno recombinantes que se ligam a (i) βKlotho; (ii) FGFRlc, FGFR2c, FGFR3C ou FGFR4; ou (iii) a um complexo que compreende β-Klotho e um de FGFRlc, FGFR2c, FGFR3c e FGFR4. Nesse contexto, uma proteína recombinante é uma proteína feita com o uso de técnicas recombinantes, ou seja, por meio da expressão de um ácido nucléico recombinante como aqui descrito. Métodos e técnicas para a produção de proteínas recombinantes são bem conhecidos na técnica.
O termo competir, quando usado no contexto de proteínas de ligação de antígeno (por exemplo, proteínas de ligação de antígeno neutralizantes, anticorpos neutralizantes, proteínas de ligação de antígeno agonistas, anticorpos agonistas e proteínas de ligação que se ligam a (i) β-Klotho; (ii) FGFRlc, FGFR2c, FGFR3C ou FGFR4; ou (iii) um complexo que compreende β-Klotho e um de FGFRlc, FGFR2c, FGFR3c e FGFR4, que competem pelo mesmo epitopo ou sítio de ligação em um alvo, significa competição entre proteínas de ligação de antígeno, como determinado por um ensaio no qual a proteína de ligação de antígeno (por exemplo, anticorpo ou fragmento imunologicamente funcional deste) sob estudo evita ou inibe a ligação específica de uma molécula de referência (por exemplo, um ligante de referência ou proteína de ligação de antígeno de referência, por exemplo, um anticorpo de referência) a um antígeno comum (por exemplo, FGFRlc, FGFR2c, FGFR3c, FGFR4, β-Klotho, ou um fragmento destes). Diversos tipos de ensaios de ligação competitiva podem ser usados para determinar se uma molécula de teste compete com uma molécula de referência pela ligação. Exemplos de ensaios que podem ser empregados incluem radioimunoensaio direto ou indireto de fase sólida (RIA), imunoensaio de enzima direto ou indireto de fase sólida (EIA), ensaio de competição em sanduíche (veja, por exemplo, Stahli e cols., (1983) Methods in Enzymology 9: 242-253); EIA direto de biotinaavidina de fase sólida (veja, por exemplo, Kirkland e cols., (1986) J. Immunol. 137: 3.614-3.619); ensaio marcado direto de fase sólida, ensaio em sanduíche marcado direto de fase sólida (veja, por exemplo, Harlow e Lane, (1988) Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press); RIA marcado direto de fase sólida usando marcador de 1-125 (veja, por exemplo, Morei e cols., (1988) Molec. Immunol. 25: 7-15); EIA direto de biotina-avidina de fase sólida (veja, por exemplo, Cheung, e cols., (1990) Virology 176: 546-552); e RIA marcado direto (Moldenhauer e cols., (1990) Scand. J. Immunol. 32:77-82). Tipicamente, um ensaio desse tipo envolve o uso de um antígeno purificado ligado a uma superfície sólida ou células que abrigam uma proteína de ligação de antígeno de teste não marcada ou uma proteína de ligação de antígeno de referência marcada. A inibição competitiva é medida por determinação da quantidade de marcador ligado à superfície sólida ou às células na presença da proteína de ligação de antígeno de teste. Normalmente, a proteína de ligação de antígeno de teste está presente em excesso. Proteínas de ligação de antígeno identificadas por ensaio de competição (proteínas de ligação de antígeno que competem) incluem proteínas de ligação de ligação de antígeno ao mesmo epitopo que as proteínas de ligação de antígeno de referência e proteínas de ligação de ligação de antígeno a um epitopo adjacente suficientemente próximo ao epitopo ligado pela proteína de ligação de antígeno de referência para que ocorra impedimento estérico. Detalhes adicionais em relação aos métodos para determinação de ligação competitiva serão fornecidos nos exemplos aqui apresentados. Normalmente, quando uma proteína de ligação de antígeno competitiva está presente em excesso, ela exibirá ligação específica de uma proteína de ligação de antígeno de referência a um antígeno comum em pelo menos 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70% ou 75%. Em alguns casos, a ligação é inibida em pelo menos 80%, 85%, 90%, 95% ou 97% ou mais.
O termo antígeno se refere a uma molécula ou uma porção de uma molécula capaz de ser ligada por um agente aglutinante seletivo, por exemplo, uma proteína de ligação de antígeno (incluindo, por exemplo, um anticorpo ou fragmento imunológico funcional deste), e também pode ser capaz de ser usada em um animal para produzir anticorpos capazes de ligação àquele antígeno. Um antígeno pode possuir um ou mais epitopos que são capazes de interagir com diferentes proteínas de ligação de antígeno, por exemplo, anticorpos.
termo epitopo significa os aminoácidos de uma molécula-alvo que são colocados em contato por uma proteína de ligação de antígeno (por exemplo, um anticorpo) quando a proteína de ligação de antígeno está ligada à molécula5 alvo. O termo inclui qualquer subconjunto da lista completa de aminoácidos da molécula-alvo que são colocados em contato quando uma proteína de ligação de antígeno, por exemplo, um anticorpo, está ligada à molécula-alvo. Um epitopo pode ser contíguo ou não contíguo (por exemplo, (i) 10 em um polipeptídeo de cadeia única, resíduos de aminoácidos que não são contíguos entre eles na seqüência polipeptídica, mas que dentro do contexto da molécula-alvo são ligados pela proteína de ligação de antígeno, ou (ii) em um receptor multimérico que compreende dois ou mais 15 componentes individuais, por exemplo, (i) FGFRlc, FGFR2c,
FGFR3c ou FGFR4, e (ii) β-Klotho, resíduos de aminoácidos que estão presentes em um ou mais dos componentes individuais, mas que ainda estão ligados pela proteína de ligação de antígeno). Em certas modalidades, epitopos podem 2 0 ser miméticos, na medida em que compreendem uma estrutura tridimensional que é similar a um epitopo antigênico usado para gerar a proteína de ligação de antígeno, embora não compreendam nenhum ou apenas alguns dos resíduos de aminoácidos encontrados naquele epitopo usado para gerar a 25 proteína de ligação de antígeno. Mais freqüentemente, epitopos residem em proteínas, mas, em alguns casos, podem residir em outros tipos de moléculas, por exemplo, ácidos nucléicos. Determinantes de epitopo podem incluir agrupamentos quimicamente tensoativos de moléculas como, 30 por exemplo, aminoácidos, cadeias laterais de açúcar, grupos fosforil ou sulfonil, e podem ter características estruturais tridimensionais específicas e/ou características de carga específicas. Geralmente, proteínas de ligação de antígeno específicas para uma molécula-alvo em particular preferencialmente reconhecerão um epitopo na molécula-alvo em uma mistura complexa de proteínas e/ou macromoléculas.
O termo identidade se refere a um relacionamento entre as seqüências de duas ou mais moléculas de polipeptídeo ou duas ou mais moléculas de ácido nucléico, como determinado por alinhamento e comparação das seqüências. O termo identidade percentual significa o percentual de resíduos idênticos entre os aminoácidos ou nucleotídeos nas moléculas comparadas, e é calculado com base no tamanho da menor das moléculas que estão sendo comparadas. Para esses cálculos, lacunas (gaps) em alinhamentos (caso existam) devem ser abordadas por um modelo matemático ou programa de computador em particular (ou seja, um algoritmo). Métodos que podem ser usados para calcular a identidade dos ácidos nucléicos ou polipeptídeos alinhados incluem aqueles descritos em Computational Molecular Biology (Lesk, A.M. , ed.) (1988) Nova York: Oxford University Press; Biocomputing Informatics and Genome Projects (Smith, D.W., ed.), 1993, Nova York: Academic Press; Computer Analysis of Sequence Data, Parte I, (Griffin, A.M. e Griffin, H.G., eds.), 1994, Nova Jersey: Humana Press; von Heinje, G., (1987) Sequence Analysis in Molecular Biology, Nova York: Academic Press; Sequence Analysis Primer (Gribskov, M. e
Devereux, J., eds.), 1991, Nova York: M. Stockton Press; e Carillo e cols., (1988) SIAM J. Applied Math. 48 : 1.073.
No cálculo da identidade percentual, as sequências que estão sendo comparadas são alinhadas de uma forma que gere a maior combinação entre as sequências. O programa de computador usado para determinar a identidade percentual é a suíte de programas GCG, que inclui GAP (Devereux e cols., (1984) Nucl. Acid Res. 12 : 387; Genetics Computer Group, University of Wisconsin, Madison, WI). O algoritmo de computador GAP é usado para alinhar os dois polipeptídeos ou polinucleotídeos para os quais a identidade de seqüência percentual deve ser determinada. As seqüências são alinhadas para combinação ótima de seus respectivos aminoácidos ou nucleotídeos (o trecho combinado, como determinado pelo algoritmo). Uma penalidade de lacuna aberta (que é calculada como 3x a diagonal média, em que a diagonal média é a média da diagonal da matriz de comparação que está sendo usada; a diagonal é a pontuação ou o número atribuído a cada combinação perfeita de aminoácidos pela matriz de comparação particular) e uma penalidade de extensão de lacuna (que é normalmente 1/10 vezes a penalidade de lacuna aberta) , bem como uma matriz de comparação como, por exemplo, PAM 250 ou BLOSUM 62, são usadas em conjunto com o algoritmo. Em certas modalidades, uma matriz de comparação-padrão (veja Dayhoff e cols., (1978) Atlas of Protein Sequence and Structure 5: 345-352 para a matriz de comparação PAM 250; Henikoff e cols., (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 89: 10.915-10.919 para a matriz de comparação BLOSUM 62) também é usada pelo algoritmo.
Os parâmetros recomendados para a determinação do percentual de identidade para seqüências de polipeptídeos ou nucleotídeos com o uso do programa GAP são os seguintes:
Algoritmo: Needleman e cols., 1970, J. Mol. Biol. 48: 443-453;
Matriz de comparação: BLOSUM 62 de Henikoff e cols., 1992, supra;
Penalidade de lacuna: 12 (mas sem penalidade para lacunas de extremidade);
Penalidade de comprimento de lacuna: 4;
Limiar de similaridade: 0.
Certos esquemas de alinhamento para alinhar duas seqüências de aminoácidos podem resultar em combinação de apenas uma região curta das duas seqüências e essa pequena região alinhada pode ter identidade de seqüência muito alta, embora não haja relação significativa entre as duas seqüências de comprimento total. Conseqüentemente, o método de alinhamento selecionado (por exemplo, o programa GAP) pode ser ajustado se assim desejado para resultar em um alinhamento que transpõe pelo menos 50 aminoácidos contíguos do polipeptídeo-alvo.
Como aqui usado, substancialmente puro significa que a espécie de molécula descrita é a espécie presente predominante, ou seja, em termos molares ela é mais abundante do que qualquer outra espécie individual na mesma mistura. Em certas modalidades, uma molécula substancialmente pura é uma composição em que a espécie em questão compreende pelo menos 50% (em termos molares) de todas as espécies macromoleculares presentes. Em outras modalidades, uma composição substancialmente pura compreenderá pelo menos 80%, 85%, 90%, 95% ou 99% de todas as espécies macromoleculares presentes na composição. Em outras modalidades, a espécie em questão é purificada até a homogeneidade essencial em que espécies contaminantes não podem ser detectadas na composição por métodos convencionais de detecção e, dessa forma, a composição consiste em uma espécie macromolecular detectável única.
Os termos tratar e tratamento se referem a quaisquer indícios de sucesso no tratamento ou melhora de uma lesão, patologia ou condição, incluindo qualquer parâmetro objetivo ou subjetivo como, por exemplo, abatimento; remissão; diminuição de sintomas ou fazer com que a lesão, patologia ou condição seja mais tolerável para o paciente; tornar mais lenta a taxa de degeneração ou declínio; tornar o ponto final de degeneração menos debilitante; melhorar o bem-estar físico ou mental do paciente. O tratamento ou melhora de sintomas pode ser baseado em parâmetros objetivos ou subjetivos; incluindo os resultados de um exame físico, exames neuropsiquiátricos e/ou uma avaliação psiquiátrica. Por exemplo, certos métodos aqui apresentados podem ser empregados para tratar diabetes Tipo 2, obesidade e/ou dislipidemia, profilaticamente ou como um tratamento agudo, para diminuir os níveis de glicemia, para diminuir os níveis circulantes de triglicerídeos, para diminuir os níveis circulantes de colesterol e/ou melhorar um sintoma associado ao diabetes tipo 2, obesidade e dislipidemia.
Uma quantidade eficaz é geralmente uma quantidade suficiente para reduzir a gravidade e/ou freqüência de sintomas, eliminar os sintomas e/ou causa subjacente, evitar a ocorrência de sintomas e/ou sua causa subjacente e/ou melhorar ou remediar os danos que resultam ou estão associados ao diabetes, obesidade e dislipidemia. Em algumas modalidades, a quantidade eficaz é uma quantidade terapeuticamente eficaz ou uma quantidade profilaticamente eficaz. Uma quantidade terapeuticamente eficaz é uma quantidade suficiente para remediar um estado de doença (por exemplo, diabetes, obesidade ou dislipidemia) ou sintomas, particularmente, um estado ou sintomas associados ao estado de doença, ou de algum outro modo evitar, impedir, retardar ou reverter a progressão do estado de doença ou qualquer outro sintoma indesejável associado à doença de qualquer forma. Uma quantidade profilaticamente eficaz é uma quantidade de uma composição farmacêutica que, quando administrada a um indivíduo, terá o efeito profilático desejado, por exemplo, evitar ou retardar o surgimento (ou recorrência) de diabetes, obesidade ou dislipidemia, ou redução da probabilidade do surgimento (ou recorrência) de diabetes, obesidade ou dislipidemia ou sintomas associados. O efeito terapêutico ou profilático pleno não ocorre necessariamente por administração de uma dose, e pode ocorrer apenas após administração de uma série de doses. Dessa forma, uma quantidade terapêutica ou profilaticamente eficaz pode ser administrada em uma ou mais administrações.
O termo aminoácido assume seu significado normal na técnica. Os vinte aminoácidos de ocorrência natural e suas abreviações seguem o uso convencional. Veja Immunology-A Synthesis, 2a Edição (E.S. Golub e D.R. Gren, eds.), Sinauer Associates: Sunderland, Mass. (1991), aqui incorporados por referência para quaisquer objetivos. Estereoisômeros (por exemplo, D-aminoácidos) dos vinte aminoácidos convencionais, aminoácidos não naturais ou de ocorrência não natural como, por exemplo, aminoácidos α,αdissubstituídos, N-alquil aminoácidos, e outros aminoácidos não convencionais, também podem ser componentes adequados para os polipeptídeos e são incluídos na frase aminoácido. Exemplos de aminoácidos de ocorrência não natural (que podem substituir qualquer aminoácido de ocorrência natural encontrado em qualquer seqüência aqui revelada, como desejado) incluem: 4-hidroxiprolina, γcarboxiglutamato, ε-Ν,Ν,Ν-trimetillisina, ε-Ν-acetillisina, O-fosfosserina, N-acetilserina, N-formilmetionina, 3metilhistidina, 5-hidroxilisina, σ-Ν-metilarginina, e outros aminoácidos e iminoácidos similares (por exemplo, 4hidroxiprolina). Na anotação de polipeptídeos aqui usada, a direção da esquerda é a direção do terminal amino e a direção da direita é a direção do terminal carboxil, de acordo com uso e convenção-padrão. Uma lista não-limitante de exemplos de aminoácidos de ocorrência não natural que podem ser inseridos em uma seqüência de proteína de ligação de antígeno ou que podem substituir um resíduo do tipo selvagem em uma seqüência de ligação de antígeno incluem βaminoácidos, homoaminoácidos, aminoácidos cíclicos e aminoácidos com cadeias laterais derivatizadas. Exemplos incluem (na forma L ou na forma D; abreviada entre parênteses) : citrulina (Cit) , homocitrulina (hCit) , Ncxmetilcitrulina (NMeCit), Να-metilhomocitrulina (NaMeHoCit), ornitina (Orn), Na-Metilornitina (Να-MeOrn ou NMeOrn), sarcosina (Sar), homolisina (hLys ou hK) , homoarginina (hArg ou hR), homoglutamina (hQ) , Nametilarginina (NMeR), Na-metilleucina (Να-MeL ou NMeL), Nmetilhomolisina (NMeHoK), Να-metilglutamina (NMeQ), norleucina (Nle), norvalina (Nva), 1,2,3,4tetrahidroisoquinolina (Tic), ácido octahidroindol-2carboxilico (Oic), 3-(1-naftil)alanina (1-Nal), 3-(2naftil)alanina (2-Nal), 1,2,3,4-tetrahidroisoquinolina (Tic), 2-indanilglicina (Igl), para-iodofenilalanina (plPhe) , para-aminofenilalanina (4AmP ou 4-Amino-Phe), 4guanidino fenilalanina (Guf), glicillisina (abreviado K (Νε-glicil) ou K(glicil) ou K(gly)), nitrofenilalanina (nitrophe) , aminofenilalanina (aminophe ou Amino-Phe), benzilfenilalanina (benzilphe), ácido γcarboxiglutâmico (γ-carboxiglu), hidroxiprolina (hidroxipro), p-carboxil-fenilalanina (Cpa), ácido αaminoadípico (Aad), Να-metil valina (NMeVal), N-a-metil leucina (NMeLeu) , Na-metilnorleucina (NMeNle) , ciclopentilglicina (Cpg), ciclohexilglicina (Chg), acetilarginina (acetilarg), ácido a,β-diaminopropionóico (Dpr) , ácido α,γ-diaminobutírico (Dab) , ácido diaminopropiônico (Dap), ciclohexilalanina (Cha), 4-metilfenilalanina (MePhe), β, β-difenil-alanina (BiPhA) , ácido aminobutirico (Abu), 4-fenil-fenilalanina (ou bifenilalanina; 4Bip), ácido α-amino-isobutírico (Aib), beta-alanina, ácido beta-aminopropiônico, ácido piperidínico, ácido aminocaprióico, ácido aminoheptanóico, ácido aminopimélico, desmosina, ácido diaminopimélico, Netilglicina, N-etilaspargina, hidroxilisina, alohidroxilisina, isodesmosina, alo-isoleucina, Nmetilglicina, N-metilisoleucina, N-metilvalina, 456 hidroxiprolina (Hyp), γ-carboxiglutamato, ε-Ν,Ν,Νtrimetillisina, ε-Ν-acetillisina, 0-fosfosserina, Nacetilserina, N-formilmetionina, 3-metilhistidina, 5hidroxilisina, GJ-metilarginina, ácido 4-amino-O-ftalico (4APA), e outros aminoácidos similares, e formas derivatizadas de qualquer um daqueles especificamente listados .
II. VISÃO GERAL
São aqui fornecidas proteínas de ligação que se ligam a (i) β-Klotho; (ii) FGFRlc, FGFR2C, FGFR3C ou FGFR4; ou (iii) a um complexo que compreende β-Klotho e um de FGFRlc, FGFR2c, FGFR3c e FGFR4. Uma propriedade única das proteínas de ligação de antígeno aqui reveladas é a natureza agonista dessas proteínas, especificamente a habilidade para mimetizar o efeito in vivo de FGF21 e para induzir sinalização do tipo FGF21. Mais especificamente de forma marcante, algumas das proteínas de ligação de antígeno aqui reveladas induzem sinalização do tipo FGF21 em vários ensaios in vitro à base de células, incluindo o ensaiorepórter de ELK-luciferase do Exemplo 5 sob as seguintes condições: (1) a ligação e atividade do receptor de FGF21 é β-Klotho-dependente; (2) a atividade é seletiva para complexo de FGFRlc/β-Klotho; (3) a ligação a FGFRlc/βKlotho desencadeia as vias de sinalização do tipo FGF21; e (4) a potência (EC50) é comparável com um padrão de FGF21 do tipo selvagem que compreende a forma madura do ID. DE SEQ. N° : 2, como medida nos seguintes ensaios à base de células: (1) o ensaio celular repórter de luciferase mediado por receptor de FGF21 recombinante do Exemplo 5;
(2) a fosforilação de ERK no ensaio celular mediado por receptor de FGF21 recombinante do Exemplo 5; e (3) a fosforilação de ERK em adipócitos humanos, como descrito com mais detalhes no Exemplo 7. Espera-se, portanto, que as proteínas de ligação de antígeno reveladas exibam atividades in vivo que são consistentes com a função biológica natural de FGF21. Essa propriedade torna as proteínas de ligação de antígeno reveladas substâncias terapêuticas viáveis para o tratamento de doenças metabólicas como, por exemplo, diabetes tipo 2, obesidade, dislipidemia, NASH, doença cardiovascular, síndrome metabólica e amplamente qualquer doença ou condição na qual seja desejável mimetizar ou aumentar os efeitos in vivo de FGF21.
Em algumas modalidades da presente revelação, as proteínas de ligação de antígeno fornecidas podem compreender polipeptídeos nos quais uma ou mais regiões determinantes de complementaridade (CDRs) podem estar embutidas e/ou unidas. Nessas proteínas de ligação de antígeno, as CDRs podem ser embutidas em uma região framework, que orienta a(s) CDR(s) de tal forma que sejam obtidas as propriedades de ligação de antígeno adequadas da(s) CDR(s). Em geral, essas proteínas de ligação de antígeno que são fornecidas podem facilitar ou intensificar a interação entre FGFRlc e β-Klotho, e podem substancialmente induzir sinalização do tipo FGF21.
Certas proteínas de ligação de antígeno aqui descritas são anticorpos ou são derivadas de anticorpos. Em certas modalidades, a estrutura polipeptídica das proteínas de ligação de antígeno se baseia em anticorpos, incluindo, sem limitação, anticorpos monoclonais, anticorpos biespecificos, minibodies, anticorpos de domínio, anticorpos sintéticos (algumas vezes aqui denominados miméticos de anticorpo), anticorpos quiméricos, anticorpos humanizados, anticorpos humanos, fusões de anticorpo (algumas vezes aqui denominadas conjugados de anticorpo), hemibodies, e fragmentos destes. As várias estruturas serão adicionalmente aqui descritas abaixo.
Foi demonstrado que as proteínas de ligação de antígeno aqui fornecidas se ligam a (i) β-Klotho; (ii) FGFRlc, FGFR2c, FGFR3c ou FGFR4; ou (iii) a um complexo que compreende β-Klotho e um de FGFRlc, FGFR2c, FGFR3c e FGFR4, e particularmente ao: (i) β-Klotho humano; (ii) FGFRlc humano, FGFR2c humano, FGFR3c humano ou FGFR4 humano; ou (iii) um complexo que compreende β-Klotho humano e um de FGFRlc humano, FGFR2c humano, FGFR3c humano e FGFR4 humano. Como descrito e mostrado nos Exemplos aqui apresentados, com base nos resultados de Western blot, anticorpos anti-βKlotho ou anti-FGFRlc disponíveis comercialmente se ligam ao β-Klotho ou FGFRlc desnaturados, enquanto a proteína de ligação de antígeno (anticorpos agonistas) não o faz. Inversamente, as proteínas de ligação de antígeno fornecidas reconhecem a estrutura nativa do FGFRlc e βKlotho na superfície celular, enquanto os anticorpos comerciais não o fazem, com base nos resultados de FACS fornecidos. Veja o Exemplo 9. As proteínas de ligação de antígeno que são fornecidas, portanto, mimetizam a atividade biológica natural de FGF21 in vivo. Em conseqüência, as proteínas de ligação de antígeno aqui fornecidas são capazes de ativar atividade de sinalização do tipo FGF21. Em particular, as proteínas de ligação de antígeno reveladas podem ter uma ou mais das seguintes atividades in vivo: indução de vias de transdução de sinal do tipo FGF21, redução dos níveis de glicemia, redução dos níveis circulantes de lipídeos, melhora dos parâmetros metabólicos e de outros efeitos fisiológicos induzidos in vivo pela formação do complexo ternário de FGFRlc, β-Klotho e FGF21, por exemplo, em condições como, por exemplo, diabetes tipo 2, obesidade, dislipidemia, NASH, doença cardiovascular e síndrome metabólica.
As proteínas de ligação de antígeno que se ligam especificamente a (i) β-Klotho; (ii) FGFRlc, FGFR2c, FGFR3c ou FGFR4; ou (iii) um complexo que compreende β-Klotho e um de FGFRlc, FGFR2c, FGFR3c e FGFR4 que são aqui reveladas possuem uma variedade de utilidades. Algumas das proteínas de ligação de antígeno, por exemplo, são úteis em ensaios de ligação específica, na purificação por afinidade de: (i) β-Klotho; (ii) FGFRlc, FGFR2c, FGFR3c ou FGFR4; ou (iii) um complexo que compreende β-Klotho e um de FGFRlc, FGFR2c, FGFR3c e FGFR4, incluindo as formas humanas dessas proteínas reveladas, e em ensaios de avaliação para identificar outros agonistas da atividade de sinalização do
tipo FGF21. de antígeno que se ligam
As proteínas de ligação
especificamente a (i) β-Klotho; (ii) FGFRlc, FGFR2c, FGFR3c
ou FGFR4; ou (iii) um complexo que compreende β-Klotho e um
de FGFRlc, FGFR2c, FGFR3c e FGFR4 que são aqui reveladas podem ser usadas em diversas aplicações de tratamento, como aqui explicado. Por exemplo, certas proteínas de ligação de antígeno são úteis para o tratamento de condições associadas a processos de sinalização do tipo FGF21 em um paciente, por exemplo, redução, alívio ou tratamento de diabetes tipo 2, obesidade, dislipidemia, NASH, doença cardiovascular e síndrome metabólica. Outros usos para as proteínas de ligação de antígeno incluem, por exemplo, diagnóstico de doenças ou condições associadas a β-Klotho, FGFRlc, FGFR2C, FGFR3c, FGFR4 ou FGF21, e ensaios de avaliação para determinar a presença ou ausência dessas moléculas. Algumas das proteínas de ligação de antígeno aqui descritas podem ser úteis no tratamento de condições, sintomas e/ou da patologia associada à atividade de sinalização do tipo FGF21 diminuída. Condições exemplares incluem, sem limitação, diabetes, obesidade, NASH e dislipidemia.
FGF21
As proteínas de ligação de antígeno aqui reveladas induzem sinalização mediada por FGF21, como aqui definido. In vivo, a forma madura de FGF21 é a forma ativa da molécula. A seqüência de nucleotídeos que codifica FGF21 de comprimento total é fornecida; os nucleotídeos que codificam a seqüência sinalizadora estão sublinhados.
ATG GAC TCG GAC GAG ACC GGG TTC GAG CAC TCA GGA CTG TGG GTT
TCT GTG CTG GCT GGT CTT CTG CTG GGA GCC TGC CAG GCA CAC CCC
ATC CCT GAC TCC AGT CCT CTC CTG CAA TTC GGG GGC CAA GTC CGG
CAG CGG TAC CTC TAC ACA GAT GAT GCC CAG CAG ACA GAA GCC CAC
CTG GAG ATC AGG GAG GAT GGG ACG GTG GGG GGC GCT GCT GAC CAG
AGC CCC GAA AGT CTC CTG CAG CTG AAA GCC TTG AAG CCG GGA GTT
ATT CAA ATC TTG GGA GTC AAG ACA TCC AGG TTC CTG TGC CAG CGG
CCA GAT GGG GCC CTG TAT GGA TCG CTC CAC TTT GAC CCT GAG GCC
TGC AGC TTC CGG GAG CTG CTT CTT GAG GAC GGA TAC AAT GTT TAC
CAG TCC GAA GCC CAC GGC CTC CCG CTG CAC CTG CCA GGG AAC AAG
TCC CCA CAC CGG GAC CCT GCA CCC CGA GGA CCA GCT CGC TTC CTG
CCA CTA CCA GGC CTG CCC CCC GCA CCC CCG GAG CCA CCC GGA ATC
CTG GCC CCC CAG CCC CCC GAT GTG GGC TCC TCG GAC CCT CTG AGC
ATG GTG GGA CCT TCC CAG GGC CGA AGC CCC AGC TAC GCT TCC TGA
(ID. . DE SEQ. . N° : : D .
A seqüência de aminoácidos de FGF21 de comprimento total é fornecida; os aminoácidos que constituem a seqüência sinalizadora estão sublinhados: MDSDETGFEHSGLWVSVLAGLLLGACQAHPIPDS S PLLQFGGQVRQRYLYTDDAQQTEA HLEIREDGTVGGAADQSPESLLQLKALKPGVIQILGVKTSRFLCQRPDGALYGSLHFDP EACSFRELLLEDGYNVYQSEAHGLPLHLPGNKSPHRDPAPRGPARFLPLPGLPPAPPEP PGILAPQPPDVGSSDPLSMVGPSQGRSPSYAS (ID. DE SEQ. N°: 2).
FGFRlc
As proteínas de ligação de antígeno aqui reveladas se ligam a FGFRlc, em particular FGFRlc humano, quando associadas a β-Klotho. A seqüência de nucleotídeos que codifica FGFRlc humano (Número de Acesso no GenBank NM_023110) é fornecida: ATGTGGAGCTGGAAGTGCCTCCTCTTCTGGGCTGTGCTGGTCACAGCCACACTCTGCAC CGCTAGGCCGTCCCCGACCTTGCCTGAACAAGCCCAGCCCTGGGGAGCCCCTGTGGAAG TGGAGTCCTTCCTGGTCCACCCCGGTGACCTGCTGCAGCTTCGCTGTCGGCTGCGGGAC GATGTGCAGAGCATCAACTGGCTGCGGGACGGGGTGCAGCTGGCGGAAAGCAACCGCAC CCGCATCACAGGGGAGGAGGTGGAGGTGCAGGACTCCGTGCCCGCAGACTCCGGCCTCT ATGCTTGCGTAACCAGCAGCCCCTCGGGCAGTGACACCACCTACTTCTCCGTCAATGTT TCAGATGCTCTCCCCTCCTCGGAGGATGATGATGATGATGATGACTCCTCTTCAGAGGA GAAAGAAACAGATAACACCAAACCAAACCGTATGCCCGTAGCTCCATATTGGACATCAC CAGAAAAGATGGAAAAGAAATTGCATGCAGTGCCGGCTGCCAAGACAGTGAAGTTCAAA TGCCCTTCCAGTGGGACACCAAACCCAACACTGCGCTGGTTGAAAAATGGCAAAGAATT CAAACCTGACCACAGAATTGGAGGCTACAAGGTCCGTTATGCCACCTGGAGCATCATAA TGGACTCTGTGGTGCCCTCTGACAAGGGCAACTACACCTGCATTGTGGAGAATGAGTAC
GGCAGCATCAACCACACATACCAGCTGGATGTCGTGGAGCGGTCCCCTCACCGGCCCAT CCTGCAAGCAGGGTTGCCCGCCAACAAAACAGTGGCCCTGGGTAGCAACGTGGAGTTCA TGTGTAAGGTGTACAGTGACCCGCAGCCGCACATCCAGTGGCTAAAGCACATCGAGGTG AATGGGAGCAAGATTGGCCCAGACAACCTGCCTTATGTCCAGATCTTGAAGACTGCTGG AGTTAATACCACCGACAAAGAGATGGAGGTGCTTCACTTAAGAAATGTCTCCTTTGAGG ACGCAGGGGAGTATACGTGCTTGGCGGGTAACTCTATCGGACTCTCCCATCACTCTGCA TGGTTGACCGTTCTGGAAGCCCTGGAAGAGAGGCCGGCAGTGATGACCTCGCCCCTGTA CCTGGAGATCATCATCTATTGCACAGGGGCCTTCCTCATCTCCTGCATGGTGGGGTCGG TCATCGTCTACAAGATGAAGAGTGGTACCAAGAAGAGTGACTTCCACAGCCAGATGGCT GTGCACAAGCTGGCCAAGAGCATCCCTCTGCGCAGACAGGTAACAGTGTCTGCTGACTC CAGTGCATCCATGAACTCTGGGGTTCTTCTGGTTCGGCCATCACGGCTCTCCTCCAGTG GGACTCCCATGCTAGCAGGGGTCTCTGAGTATGAGCTTCCCGAAGACCCTCGCTGGGAG CTGCCTCGGGACAGACTGGTCTTAGGCAAACCCCTGGGAGAGGGCTGCTTTGGGCAGGT GGTGTTGGCAGAGGCTATCGGGCTGGACAAGGACAAACCCAACCGTGTGACCAAAGTGG CTGTGAAGATGTTGAAGTCGGACGCAACAGAGAAAGACTTGTCAGACCTGATCTCAGAA ATGGAGATGATGAAGATGATCGGGAAGCATAAGAATATCATCAACCTGCTGGGGGCCTG CACGCAGGATGGTCCCTTGTATGTCATCGTGGAGTATGCCTCCAAGGGCAACCTGCGGG AGTACCTGCAGGCCCGGAGGCCCCCAGGGCTGGAATACTGCTACAACCCCAGCCACAAC CCAGAGGAGCAGCTCTCCTCCAAGGACCTGGTGTCCTGCGCCTACCAGGTGGCCCGAGG CATGGAGTATCTGGCCTCCAAGAAGTGCATACACCGAGACCTGGCAGCCAGGAATGTCC TGGTGACAGAGGACAATGTGATGAAGATAGCAGACTTTGGCCTCGCACGGGACATTCAC CACATCGACTACTATAAAAAGACAACCAACGGCCGACTGCCTGTGAAGTGGATGGCACC CGAGGCATTATTTGACCGGATCTACACCCACCAGAGTGATGTGTGGTCTTTCGGGGTGC TCCTGTGGGAGATCTTCACTCTGGGCGGCTCCCCATACCCCGGTGTGCCTGTGGAGGAA CTTTTCAAGCTGCTGAAGGAGGGTCACCGCATGGACAAGCCCAGTAACTGCACCAACGA GCTGTACATGATGATGCGGGACTGCTGGCATGCAGTGCCCTCACAGAGACCCACCTTCA AGCAGCTGGTGGAAGACCTGGACCGCATCGTGGCCTTGACCTCCAACCAGGAGTACCTG GACCTGTCCATGCCCCTGGACCAGTACTCCCCCAGCTTTCCCGACACCCGGAGCTCTAC GTGCTCCTCAGGGGAGGATTCCGTCTTCTCTCATGAGCCGCTGCCCGAGGAGCCCTGCC
TGCCCCGACACCCAGCCCAGCTTGCCAATGGCGGACTCAAACGCCGCTGA (ID. DE SEQ. N°: 3).
A seqüência de aminoácidos de FGFRlc humano (Número de Acesso no GenBank NP_075598) é fornecida:
MWSWKCLLFWAVLVTATLCTARPSPTLPEQAQPWGAPVEVESFLVHPGDLLQLRCRLRD DVQSINWLRDGVQLAESNRTRITGEEVEVQDSVPADSGLYACVTSSPSGSDTTYFSVNV SDALPSSEDDDDDDDSSSEEKETDNTKPNRMPVAPYWTSPEKMEKKLHAVPAAKTVKFK CPSSGTPNPTLRWLKNGKEFKPDHRIGGYKVRYATWSIIMDSWPSDKGNYTCIVENEY GSINHTYQLDWERSPHRPILQAGLPANKTVALGSNVE FMCKVYSDPQPHIQWLKHIEV NGSKIGPDNLPYVQILKTAGVNTTDKEMEVLHLRNVSFEDAGEYTCLAGNSIGLSHHSA WLTVLEALEERPAVMTSPLYLEIIIYCTGAFLISCMVGSVIVYKMKSGTKKSDFHSQMA VHKLAKSIPLRRQVTVSADSSASMNSGVLLVRPSRLSSSGTPMLAGVSEYELPEDPRWE LPRDRLVLGKPLGEGCFGQWLAEAIGLDKDKPNRVTKVAVKMLKSDATEKDLSDLISE MEMMKMIGKHKNIINLLGACTQDGPLYVIVEYASKGNLREYLQARRPPGLEYCYNPSHN PEEQLSSKDLVSCAYQVARGMEYLASKKCIHRDLAARNVLVTEDNVMKIADFGLARDIH HIDYYKKTTNGRLPVKWMAPEALFDRIYTHQSDVWSFGVLLWEIFTLGGSPYPGVPVEE LFKLLKEGHRMDKPSNCTNELYMMMRDCWHAVPSQRPTFKQLVEDLDRIVALTSNQEYL DLSMPLDQYSPSFPDTRSSTCSSGEDSVFSHEPLPEEPCLPRHPAQLANGGLKRR (ID. DE SEQ. N°: 4).
As proteínas de ligação de antígeno aqui descritas se ligam à porção extracelular de FGFRlc. Um exemplo de uma região extracelular de FGFRlc é:
MWSWKCLLFWAVLVTATLCTARPSPTLPEQAQPWGAPVEVESFLVHPGDLLQLRCRLRD DVQSINWLRDGVQLAESNRTRITGEEVEVQDSVPADSGLYACVTSSPSGSDTTYFSVNV SDALPSSEDDDDDDDSSSEEKETDNTKPNRMPVAPYWTSPEKMEKKLHAVPAAKTVKFK CPSSGTPNPTLRWLKNGKEFKPDHRIGGYKVRYATWSIIMDSWPSDKGNYTCIVENEY GSINHTYQLDWERSPHRPILQAGLPANKTVALGSNVEFMCKVYSDPQPHIQWLKHIEV NGSKIGPDNLPYVQILKTAGVNTTDKEMEVLHLRNVSFEDAGEYTCLAGNSIGLSHHSA WLTVLEALEERPAVMTSPLY (ID. DE SEQ. N°: 5).
Como aqui descrito, proteínas de FGFRlc também podem incluir fragmentos. Como aqui usados, os termos são usados de forma intercambiável para significar um receptor, em particular, e, a menos que especificado de forma diferente, um receptor humano que, mediante associação com β-Klotho e FGF21, induz atividade de sinalização do tipo FGF21.
termo FGFRlc também inclui modificações pós-tradução da seqüência de aminoácidos de FGFRlc, por exemplo, possíveis sítios de glicosilação ligados ao N. Dessa forma, as proteínas de ligação de antígeno podem se ligar ou ser geradas por proteínas glicosiladas em uma ou mais das posições.
β-Klotho
As proteínas de ligação de antígeno aqui reveladas se ligam a β-Klotho, em particular β-Klotho humano. A seqüência de nucleotídeos que codifica β-Klotho humano (Número de Acesso no GenBank NM_175737) é fornecida:
ATGAAGCCAGGCTGTGCGGCAGGATCTCCAGGGAATGAATGGATTTTCTTCAGCACTGA TGAAATAACCACACGCTATAGGAATACAATGTCCAACGGGGGATTGCAAAGATCTGTCA TCCTGTCAGCACTTATTCTGCTACGAGCTGTTACTGGATTCTCTGGAGATGGAAGAGCT ATATGGTCTAAAAATCCTAATTTTACTCCGGTAAATGAAAGTCAGCTGTTTCTCTATGA CACTTTCCCTAAAAACTTTTTCTGGGGTATTGGGACTGGAGCATTGCAAGTGGAAGGGA GTTGGAAGAAGGATGGAAAAGGACCTTCTATATGGGATCATTTCATCCACACACACCTT AAAAATGTCAGCAGCACGAATGGTTCCAGTGACAGTTATATTTTTCTGGAAAAAGACTT ATCAGCCCTGGATTTTATAGGAGTTTCTTTTTATCAATTTTCAATTTCCTGGCCAAGGC TTTTCCCCGATGGAATAGTAACAGTTGCCAACGCAAAAGGTCTGCAGTACTACAGTACT CTTCTGGACGCTCTAGTGCTTAGAAACATTGAACCTATAGTTACTTTATACCACTGGGA TTTGCCTTTGGCACTACAAGAAAAATATGGGGGGTGGAAAAATGATACCATAATAGATA TCTTCAATGACTATGCCACATACTGTTTCCAGATGTTTGGGGACCGTGTCAAATATTGG ATTACAATTCACAACCCATATCTAGTGGCTTGGCATGGGTATGGGACAGGTATGCATGC
CCCTGGAGAGAAGGGAAATTTAGCAGCTGTCTACACTGTGGGACACAACTTGATCAAGG
CTCACTCGAAAGTTTGGCATAACTACAACACACATTTCCGCCCACATCAGAAGGGTTGG
TTATCGATCACGTTGGGATCTCATTGGATCGAGCCAAACCGGTCGGAAAACACGATGGA
TATATTCAAATGTCAACAATCCATGGTTTCTGTGCTTGGATGGTTTGCCAACCCTATCC
ATGGGGATGGCGACTATCCAGAGGGGATGAGAAAGAAGTTGTTCTCCGTTCTACCCATT
TTCTCTGAAGCAGAGAAGCATGAGATGAGAGGCACAGCTGATTTCTTTGCCTTTTCTTT
TGGACCCAACAACTTCAAGCCCCTAAACACCATGGCTAAAATGGGACAAAATGTTTCAC
TTAATTTAAGAGAAGCGCTGAACTGGATTAAACTGGAATACAACAACCCTCGAATCTTG
ATTGCTGAGAATGGCTGGTTCACAGACAGTCGTGTGAAAACAGAAGACACCACGGCCAT
CTACATGATGAAGAATTTCCTCAGCCAGGTGCTTCAAGCAATAAGGTTAGATGAAATAC
GAGTGTTTGGTTATACTGCCTGGTCTCTCCTGGATGGCTTTGAATGGCAGGATGCTTAC
ACCATCCGCCGAGGATTATTTTATGTGGATTTTAACAGTAAACAGAAAGAGCGGAAACC
TAAGTCTTCAGCACACTACTACAAACAGATCATACGAGAAAATGGTTTTTCTTTAAAAG
AGTCCACGCCAGATGTGCAGGGCCAGTTTCCCTGTGACTTCTCCTGGGGTGTCACTGAA
TCTGTTCTTAAGCCCGAGTCTGTGGCTTCGTCCCCACAGTTCAGCGATCCTCATCTGTA
CGTGTGGAACGCCACTGGCAACAGACTGTTGCACCGAGTGGAAGGGGTGAGGCTGAAAA
CACGACCCGCTCAATGCACAGATTTTGTAAACATCAAAAAACAACTTGAGATGTTGGCA
AGAATGAAAGTCACCCACTACCGGTTTGCTCTGGATTGGGCCTCGGTCCTTCCCACTGG
CAACCTGTCCGCGGTGAACCGACAGGCCCTGAGGTACTACAGGTGCGTGGTCAGTGAGG
GGCTGAAGCTTGGCATCTCCGCGATGGTCACCCTGTATTATCCGACCCACGCCCACCTA
GGCCTCCCCGAGCCTCTGTTGCATGCCGACGGGTGGCTGAACCCATCGACGGCCGAGGC
CTTCCAGGCCTACGCTGGGCTGTGCTTCCAGGAGCTGGGGGACCTGGTGAAGCTCTGGA
TCACCATCAACGAGCCTAACCGGCTAAGTGACATCTACAACCGCTCTGGCAACGACACC
TACGGGGCGGCGCACAACCTGCTGGTGGCCCACGCCCTGGCCTGGCGCCTCTACGACCG
GCAGTTCAGGCCCTCACAGCGCGGGGCCGTGTCGCTGTCGCTGCACGCGGACTGGGCGG
AACCCGCCAACCCCTATGCTGACTCGCACTGGAGGGCGGCCGAGCGCTTCCTGCAGTTC
GAGATCGCCTGGTTCGCCGAGCCGCTCTTCAAGACCGGGGACTACCCCGCGGCCATGAG
GGAATACATTGCCTCCAAGCACCGACGGGGGCTTTCCAGCTCGGCCCTGCCGCGCCTCA
CCGAGGCCGAAAGGAGGCTGCTCAAGGGCACGGTCGACTTCTGCGCGCTCAACCACTTC
ACCACTAGGTTCGTGATGCACGAGCAGCTGGCCGGCAGCCGCTACGACTCGGACAGGGA
CATCCAGTTTCTGCAGGACATCACCCGCCTGAGCTCCCCCACGCGCCTGGCTGTGATTC CCTGGGGGGTGCGCAAGCTGCTGCGGTGGGTCCGGAGGAACTACGGCGACATGGACATT TACATCACCGCCAGTGGCATCGACGACCAGGCTCTGGAGGATGACCGGCTCCGGAAGTA CTACCTAGGGAAGTACCTTCAGGAGGTGCTGAAAGCATACCTGATTGATAAAGTCAGAA TCAAAGGCTATTATGCATTCAAACTGGCTGAAGAGAAATCTAAACCCAGATTTGGATTC TTCACATCTGATTTTAAAGCTAAATCCTCAATACAATTTTACAACAAAGTGATCAGCAG CAGGGGCTTCCCTTTTGAGAACAGTAGTTCTAGATGCAGTCAGACCCAAGAAAATACAG AGTGCACTGTCTGCTTATTCCTTGTGCAGAAGAAACCACTGATATTCCTGGGTTGTTGC TTCTTCTCCACCCTGGTTCTACTCTTATCAATTGCCATTTTTCAAAGGCAGAAGAGAAG AAAGTTTTGGAAAGCAAAAAACTTACAACACATACCATTAAAGAAAGGCAAGAGAGTTG TTAGCTAA (ID. DE SEQ. N° : 6).
A seqüência de aminoácidos de β-Klotho humano de comprimento total (Número de Acesso no GenBank NP_783864) é fornecida : MKPGCAAGSPGNEWIFFSTDEITTRYRNTMSNGGLQRSVILSALILLRAVTGFSGDGRA IWSKNPNFTPVNESQLFLYDTFPKNFFWGIGTGALQVEGSWKKDGKGPSIWDHFIHTHL KNVSSTNGSSDSYIFLEKDLSALDFIGVSFYQFSISWPRLFPDGIVTVANAKGLQYYST LLDALVLRNIEPIVTLYHWDLPLALQEKYGGWKNDTIIDIFNDYATYCFQMFGDRVKYW ITIHNPYLVAWHGYGTGMHAPGEKGNLAAVYTVGHNLIKAHSKVWHNYNTHFRPHQKGW LSITLGSHWIEPNRS ENTMDIFKCQQSMVSVLGWFANPIHGDGDYPEGMRKKL FSVL PI FS EAE KHEMRGTAD F FAFS FGPNNFKPLNTMAKMGQNVS LNLREALNWIKLEYNNPRIL IAENGWFTDSRVKTEDTTAIYMMKNFLSQVLQAIRLDEIRVFGYTAWSLLDGFEWQDAY TIRRGLFYVDFNSKQKERKPKSSAHYYKQIIRENGFSLKESTPDVQGQFPCDFSWGVTE SVLKPESVASSPQFSDPHLYVWNATGNRLLHRVEGVRLKTRPAQCTDFVNIKKQLEMLA RMKVTHYRFALDWASVLPTGNLSAVNRQALRYYRCVVSEGLKLGISAMVTLYYPTHAHL GLPEPLLHADGWLNPSTAEAFQAYAGLCFQELGDLVKLWITINEPNRLSDIYNRSGNDT YGAAHNLLVAHALAWRLYDRQFRPSQRGAVSLSLHADWAEPANPYADSHWRAAERFLQF EIAWFAEPLFKTGDYPAAMREYIASKHRRGLSSSALPRLTEAERRLLKGTVDFCALNHF TTRFVMHEQLAGSRYDSDRDIQFLQDITRLSSPTRLAVIPWGVRKLLRWVRRNYGDMDI YITASGIDDQALEDDRLRKYYLGKYLQEVLKAYLIDKVRIKGYYAFKLAEEKSKPRFGF
FTSDFKAKSSIQFYNKVISSRGFPFENSSSRCSQTQENTECTVCLFLVQKKPLIFLGCC FFSTLVLLLSIAIFQRQKRRKFWKAKNLQHIPLKKGKRWS (ID. DE SEQ. N° : 7) .
As proteínas de ligação de antígeno aqui descritas se ligam à porção extracelular de β-Klotho. Um exemplo de uma região extracelular de β-Klotho é: MKPGCAAGSPGNEWIFFSTDEITTRYRNTMSNGGLQRSVILSALILLRAVTGFSGDGRA IWSKNPNFTPVNESQLFLYDTFPKNFFWGIGTGALQVEGSWKKDGKGPSIWDHFIHTHL KNVSSTNGSSDSYIFLEKDLSALDFIGVSFYQFSISWPRLFPDGIVTVANAKGLQYYST LLDALVLRNIEPIVTLYHWDLPLALQEKYGGWKNDTIIDIFNDYATYCFQMFGDRVKYW ITIHNPYLVAWHGYGTGMHAPGEKGNLAAVYTVGHNLIKAHS KVWHNYNTHFRPHQKGW LSITLGSHWIEPNRSENTMDIFKCQQSMVSVLGWFANPIHGDGDYPEGMRKKLFSVLPI FSEAEKHEMRGTADFFAFSFGPNNFKPLNTMAKMGQNVSLNLREALNWIKLEYNNPRIL IAENGWFTDSRVKTEDTTAIYMMKNFLSQVLQAIRLDEIRVFGYTAWSLLDGFEWQDAY TIRRGLFYVDFNSKQKERKPKSSAHYYKQIIRENGFSLKESTPDVQGQFPCDFSWGVTE SVLKPESVASSPQFSDPHLYVWNATGNRLLHRVEGVRLKTRPAQCTDFVNIKKQLEMLA RMKVTHYRFALDWASVLPTGNLSAVNRQALRYYRCVVSEGLKLGISAMVTLYYPTHAHL GLPEPLLHADGWLNPSTAEAFQAYAGLCFQELGDLVKLWITINEPNRLSDIYNRSGNDT YGAAHNLLVAHALAWRLYDRQFRPSQRGAVSLSLHADWAEPANPYADSHWRAAERFLQF EIAWFAEPLFKTGDYPAAMREYIASKHRRGLSSSALPRLTEAERRLLKGTVDFCALNHF TTRFVMHEQLAGSRYDSDRDIQFLQDITRLSSPTRLAVIPWGVRKLLRWVRRNYGDMDI YITASGIDDQALEDDRLRKYYLGKYLQEVLKAYLIDKVRIKGYYAFKLAEEKSKPRFGF FTSDFKAKSSIQFYNKVISSRGFPFENSSSRCSQTQENTECTVCLFLVQKKP (ID. DE SEQ. N° : 8).
A forma murídea de β-Klotho, e fragmentos e subseqüências deste, podem ser úteis no estudo e/ou construção das moléculas aqui fornecidas. A seqüência de nucleotídeos que codifica β-Klotho murídeo (Número de Acesso no GenBank NM_031180) é fornecida:
ATGAAGACAGGCTGTGCAGCAGGGTCTCCGGGGAATGAATGGATTTTCTTCAGCTCTGA
TGAAAGAAACACACGCTCTAGGAAAACAATGTCCAACAGGGCACTGCAAAGATCTGCCG
TGCTGTCTGCGTTTGTTCTGCTGCGAGCTGTTACCGGCTTCTCCGGAGACGGGAAAGCA
ATATGGGATAAAAAACAGTACGTGAGTCCGGTAAACCCAAGTCAGCTGTTCCTCTATGA
CACTTTCCCTAAAAACTTTTCCTGGGGCGTTGGGACCGGAGCATTTCAAGTGGAAGGGA
GTTGGAAGACAGATGGAAGAGGACCCTCGATCTGGGATCGGTACGTCTACTCACACCTG
AGAGGTGTCAACGGCACAGACAGATCCACTGACAGTTACATCTTTCTGGAAAAAGACTT
GTTGGCTCTGGATTTTTTAGGAGTTTCTTTTTATCAGTTCTCAATCTCCTGGCCACGGT
TGTTTCCCAATGGAACAGTAGCAGCAGTGAATGCGCAAGGTCTCCGGTACTACCGTGCA
CTTCTGGACTCGCTGGTACTTAGGAATATCGAGCCCATTGTTACCTTGTACCATTGGGA
TTTGCCTCTGACGCTCCAGGAAGAATATGGGGGCTGGAAAAATGCAACTATGATAGATC
TCTTCAACGACTATGCCACATACTGCTTCCAGACCTTTGGAGACCGTGTCAAATATTGG
ATTACAATTCACAACCCTTACCTTGTTGCTTGGCATGGGTTTGGCACAGGTATGCATGC
ACCAGGAGAGAAGGGAAATTTAACAGCTGTCTACACTGTGGGACACAACCTGATCAAGG
CACATTCGAAAGTGTGGCATAACTACGACAAAAACTTCCGCCCTCATCAGAAGGGTTGG
CTCTCCATCACCTTGGGGTCCCATTGGATAGAGCCAAACAGAACAGACAACATGGAGGA
CGTGATCAACTGCCAGCACTCCATGTCCTCTGTGCTTGGATGGTTCGCCAACCCCATCC
ACGGGGACGGCGACTACCCTGAGTTCATGAAGACGGGCGCCATGATCCCCGAGTTCTCT
GAGGCAGAGAAGGAGGAGGTGAGGGGCACGGCTGATTTCTTTGCCTTTTCCTTCGGGCC
CAACAACTTCAGGCCCTCAAACACCGTGGTGAAAATGGGACAAAATGTATCACTCAACT
TAAGGCAGGTGCTGAACTGGATTAAACTGGAATACGATGACCCTCAAATCTTGATTTCG
GAGAACGGCTGGTTCACAGATAGCTATATAAAGACAGAGGACACCACGGCCATCTACAT
GATGAAGAATTTCCTAAACCAGGTTCTTCAAGCAATAAAATTTGATGAAATCCGCGTGT
TTGGTTATACGGCCTGGACTCTCCTGGATGGCTTTGAGTGGCAGGATGCCTATACGACC
CGACGAGGGCTGTTTTATGTGGACTTTAACAGTGAGCAGAAAGAGAGGAAACCCAAGTC
CTCGGCTCATTACTACAAGCAGATCATACAAGACAACGGCTTCCCTTTGAAAGAGTCCA
CGCCAGACATGAAGGGTCGGTTCCCCTGTGATTTCTCTTGGGGAGTCACTGAGTCTGTT
CTTAAGCCCGAGTTTACGGTCTCCTCCCCGCAGTTTACCGATCCTCACCTGTATGTGTG
GAATGTCACTGGCAACAGATTGCTCTACCGAGTGGAAGGGGTAAGGCTGAAAACAAGAC
CATCCCAGTGCACAGATTATGTGAGCATCAAAAAACGAGTTGAAATGTTGGCAAAAATG
AAAGTCACCCACTACCAGTTTGCTCTGGACTGGACCTCTATCCTTCCCACTGGCAATCT
GTCCAAAGTTAACAGACAAGTGTTAAGGTACTATAGGTGTGTGGTGAGCGAAGGACTGA AGCTGGGCGTCTTCCCCATGGTGACGTTGTACCACCCAACCCACTCCCATCTCGGCCTC CCCCTGCCACTTCTGAGCAGTGGGGGGTGGCTAAACATGAACACAGCCAAGGCCTTCCA GGACTACGCTGAGCTGTGCTTCCGGGAGTTGGGGGACTTGGTGAAGCTCTGGATCACCA TCAATGAGCCTAACAGGCTGAGTGACATGTACAACCGCACGAGTAATGACACCTACCGT GCAGCCCACAACCTGATGATCGCCCATGCCCAGGTCTGGCACCTCTATGATAGGCAGTA
TAGGCCGGTCCAGCATGGGGCTGTGTCGCTGTCCTTACATTGCGACTGGGCAGAACCTG CCAACCCCTTTGTGGATTCACACTGGAAGGCAGCCGAGCGCTTCCTCCAGTTTGAGATC GCCTGGTTTGCAGATCCGCTCTTCAAGACTGGCGACTATCCATCGGTTATGAAGGAATA CATCGCCTCCAAGAACCAGCGAGGGCTGTCTAGCTCAGTCCTGCCGCGCTTCACCGCGA AGGAGAGCAGGCTGGTGAAGGGTACCGTCGACTTCTACGCACTGAACCACTTCACTACG AGGTTCGTGATACACAAGCAGCTGAACACCAACCGCTCAGTTGCAGACAGGGACGTCCA
GTTCCTGCAGGACATCACCCGCCTAAGCTCGCCCAGCCGCCTGGCTGTAACACCCTGGG GAGTGCGCAAGCTCCTTGCGTGGATCCGGAGGAACTACAGAGACAGGGATATCTACATC ACAGCCAATGGCATCGATGACCTGGCTCTAGAGGATGATCAGATCCGAAAGTACTACTT GGAGAAGTATGTCCAGGAGGCTCTGAAAGCATATCTCATTGACAAGGTCAAAATCAAAG GCTACTATGCATTCAAACTGACTGAAGAGAAATCTAAGCCTAGATTTGGATTTTTCACC TCTGACTTCAGAGCTAAGTCCTCTGTCCAGTTTTACAGCAAGCTGATCAGCAGCAGTGG
CCTCCCCGCTGAGAACAGAAGTCCTGCGTGTGGTCAGCCTGCGGAAGACACAGACTGCA CCATTTGCTCATTTCTCGTGGAGAAGAAACCACTCATCTTCTTCGGTTGCTGCTTCATC TCCACTCTGGCTGTACTGCTATCCATCACCGTTTTTCATCATCAAAAGAGAAGAAAATT CCAGAAAGCAAGGAACTTACAAAATATACCATTGAAGAAAGGCCACAGCAGAGTTTTCA GCTAA (ID. DE SEQ. N° : 469).
A seqüência de aminoácidos de β-Klotho murideo de comprimento total (Número de Acesso no GenBank NP_112457) é fornecida: MKTGCAAGSPGNEWIFFSSDERNTRSRKTMSNRALQRSAVLSAFVLLRAVTGFSGDGKA IWDKKQYVSPVNPSQLFLYDTFPKNFSWGVGTGAFQVEGSWKTDGRGPSIWDRYVYSHL RGVNGTDRSTDSYIFLEKDLLALDFLGVSFYQFSISWPRLFPNGTVAAVNAQGLRYYRA
LLDS LVLRNIE PIVTLYHWDL PLTLQE EYGGWKNATMIDLFNDYATYCFQTFGDRVKYW ITIHNPYLVAWHGFGTGMHAPGEKGNLTAVYTVGHNLIKAHS KVWHNYDKNFRPHQKGW LSITLGSHWIEPNRTDNMEDVINCQHSMSSVLGWFANPIHGDGDYPEFMKTGAMIPEFS EAEKEEVRGTADFFAFSFGPNNFRPSNTWKMGQNVSLNLRQVLNWIKLEYDDPQILIS ENGWFTDSYIKTEDTTAIYMMKNFLNQVLQAIKFDEIRVFGYTAWTLLDGFEWQDAYTT RRGLFYVDFNSEQKERKPKSSAHYYKQIIQDNGFPLKESTPDMKGRFPCDFSWGVTESV LKPEFTVSSPQFTDPHLYVWNVTGNRLLYRVEGVRLKTRPSQCTDYVSIKKRVEMLAKM KVTHYQFALDWTSILPTGNLSKVNRQVLRYYRCVVSEGLKLGVFPMVTLYHPTHSHLGL PLPLLSSGGWLNMNTAKAFQDYAELCFRELGDLVKLWITINEPNRLSDMYNRTSNDTYR AAHNLMIAHAQVWHLYDRQYRPVQHGAVSLSLHCDWAEPANPFVDSHWKAAERFLQFEI AWFADPLFKTGDYPSVMKEYIASKNQRGLSSSVLPRFTAKESRLVKGTVDFYALNHFTT RFVIHKQLNTNRSVADRDVQFLQDITRLSSPSRLAVTPWGVRKLLAWIRRNYRDRDIYI TANGIDDLALEDDQIRKYYLEKYVQEALKAYLIDKVKIKGYYAFKLTEEKSKPRFGFFT SDFRAKSSVQFYSKLISSSGLPAENRSPACGQPAEDTDCTICSFLVEKKPLIFFGCCFI STLAVLLSITVFHHQKRRKFQKARNLQNIPLKKGHSRVFS (ID. DE SEQ. N°: 468) .
Como aqui descrito, proteínas de β-Klotho também podem incluir fragmentos. Como aqui usados, os termos são usados de forma intercambiável para significar um co-receptor, em particular, e, a menos que especificado de forma diferente, um co-receptor humano que, mediante associação com FGFRlc e FGF21, induz atividade de sinalização do tipo FGF21.
O termo β-Klotho também inclui modificações póstradução da seqüência de aminoácidos de β-Klotho, por exemplo, possíveis sítios de glicosilação ligados ao N. Dessa forma, as proteínas de ligação de antígeno podem se ligar ou ser geradas por proteínas glicosiladas em uma ou mais das posições.
Proteínas de ligação de antígeno que se ligam especificamente a um ou mais de β-Klotho, FGFRlc, FGFR2c, FGFR3C e FGFR4c
São fornecidos diversos agentes aglutinantes seletivos úteis para modulação de sinalização do tipo FGF21. Esses agentes incluem, por exemplo, proteínas de ligação de antígeno que contêm um domínio de ligação de antígeno (por exemplo, anticorpos de cadeia única, anticorpos de domínio, hemibodies, imunoadesões e polipeptídeos com uma região de ligação de antígeno) e se ligam especificamente a FGFRlc, β-Klotho, ou tanto FGFRlc quanto β-Klotho, em particular FGFRlc humano e β-Klotho humano. Alguns dos agentes, por exemplo, são úteis na mimetização do efeito de sinalização gerado in vivo pela associação de FGFRlc com β-Klotho e com FGF21 e, dessa forma, podem ser usados para intensificar ou modular uma ou mais atividades associadas à sinalização do tipo FGF21.
Em geral, as proteínas de ligação de antígeno que são fornecidas tipicamente compreendem uma ou mais CDRs, como aqui descritas (por exemplo, 1, 2, 3, 4, 5 ou 6 CDRs) . Em algumas modalidades, as proteínas de ligação de antígeno são expressas naturalmente por clones, enquanto, em outras modalidades, a proteína de ligação de antígeno pode compreender (a) uma estrutura polipeptídica de arcabouço e (b) uma ou mais CDRs que são inseridas e/ou unidas à estrutura polipeptídica de arcabouço. Em algumas dessas modalidades, uma CDR forma um componente de cadeias pesadas ou leves expressas pelos clones aqui descritos; em outras modalidades, uma CDR pode ser inserida em um arcabouço no qual a CDR não é expressa naturalmente. Uma estrutura polipeptídica de arcabouço pode assumir diversas formas diferentes. Por exemplo, uma estrutura polipeptídica de arcabouço pode ser, ou compreender, o arcabouço de um anticorpo de ocorrência natural, ou fragmento ou variante deste, ou ela pode ser de natureza completamente sintética. Exemplos de várias estruturas de proteína de ligação de antígeno serão adicionalmente descritos abaixo.
Em algumas modalidades nas quais a proteína de ligação de antígeno compreende (a) uma estrutura polipeptídica de arcabouço e (b) uma ou mais CDRs que são inseridas e/ou unidas à estrutura polipeptídica de arcabouço, a estrutura polipeptídica de arcabouço de uma proteína de ligação de antígeno é um anticorpo ou é derivada de um anticorpo, incluindo, sem limitação, anticorpos monoclonais, anticorpos biespecíficos, minibodies, anticorpos de domínio, anticorpos sintéticos (algumas vezes aqui denominados miméticos de anticorpo), anticorpos quiméricos, anticorpos humanizados, fusões de anticorpo (algumas vezes denominadas conjugados de anticorpo), e porções ou fragmentos de cada um deles, respectivamente. Em alguns casos, a proteína de ligação de antígeno é um fragmento imunológico de um anticorpo (por exemplo, um Fab, um Fab', um F(ab')2 ou um scFv) .
Algumas das proteínas de ligação de antígeno como aqui fornecidas se ligam especificamente a: (i) β-Klotho; (ii) FGFRlc, FGFR2C, FGFR3c ou FGFR4; ou (iii) um complexo que compreende β-Klotho e um de FGFRlc, FGFR2c, FGFR3c e FGFR4, incluindo as formas humanas dessa proteínas. Em uma modalidade, uma proteína de ligação de antígeno se liga especificamente tanto ao FGFRlc humano que compreende a seqüência de aminoácidos do ID. DE SEQ. N° : 5 quanto ao βKlotho humano que compreende a seqüência de aminoácidos do ID. DE SEQ. N°: 8 e, em outra modalidade, uma proteína de ligação de antígeno se liga especificamente tanto ao FGFRlc humano que compreende a seqüência de aminoácidos do ID. DE SEQ. N°: 5 quanto ao β-Klotho humano que possui a seqüência de aminoácidos do ID. DE SEQ. N°: 8 e induz sinalização do tipo FGF21. Dessa forma, uma proteína de ligação de antígeno pode induzir, mas não necessariamente, a sinalização do tipo FGF21.
Estrutura da proteína de ligação de antígeno
Algumas das proteínas de ligação de antígeno que se ligam especificamente a (i) β-Klotho; (ii) FGFRlc, FGFR2c, FGFR3c ou FGFR4; ou (iii) um complexo que compreende βKlotho e um de FGFRlc, FGFR2c, FGFR3c e FGFR4, incluindo as formas humanas dessas proteínas que são aqui fornecidas, possuem uma estrutura tipicamente associada a anticorpos de ocorrência natural. As unidades estruturais desses anticorpos tipicamente compreendem um ou mais tetrâmeros, cada um composto por dois pares idênticos de cadeias polipeptídicas, embora algumas espécies de mamíferos também produzam anticorpos que possuem apenas uma única cadeia pesada. Em um anticorpo típico, cada par ou dupleto inclui uma cadeia leve de comprimento total (em certas modalidades, cerca de 25 kDa) e uma cadeia pesada de comprimento total (em certas modalidades, cerca de 50-70 kDa) . Cada cadeia de imunoglobulina individual é composta por vários domínios de imunoglobulina, cada um consistindo em aproximadamente 90 a 110 aminoácidos e expressando um padrão de dobra característico. Esses domínios são as unidades básicas das quais os polipeptídeos do anticorpo são compostos. A porção do terminal amino de cada cadeia tipicamente inclui um domínio variável que é responsável pelo reconhecimento de antígeno. A porção do terminal carbóxi é mais conservada evolutivamente do que a outra extremidade da cadeia e é denominada a região constante ou região C. Cadeias leves humanas geralmente são classificadas como cadeias leves kappa (K) e lambda (X), e cada uma destas contém um domínio variável e um domínio constante. Cadeias pesadas são tipicamente classificadas como cadeias mu, delta, gama, alfa ou épsilon, e estas definem o isótipo do anticorpo como IgM, IgD, IgG, IgA e IgE, respectivamente. IgG possui vários subtipos, incluindo, sem limitação, IgGl, IgG2, IgG3 e IgG4. Subtipos de IgM incluem IgM e IgM2 . Subtipos de IgA incluem IgAl e IgA2. Em humanos, os isótipos de IgA e IgD contêm quatro cadeias pesadas e quatro cadeias leves; os isótipos de IgG e IgE contêm duas cadeias pesadas e duas cadeias leves; e o isótipo de IgM contém cinco cadeias pesadas e cinco cadeias leves. A região C da cadeia pesada tipicamente compreende um ou mais domínios que podem ser responsáveis pela função efetora. O número de domínios da região constante da cadeia pesada dependerá do isótipo. Cada uma das cadeias pesadas de IgG, por exemplo, contém três domínios da região C conhecidos como CH1, CH2 e CH3. Os anticorpos que são fornecidos podem ter qualquer um desses isótipos e subtipos. Em certas modalidades, uma proteína de ligação de antígeno que se liga especificamente a um ou mais de (i) β-Klotho; (ii) FGFRlc, FGFR2c, FGFR3c ou FGFR4; ou (iii) um complexo que compreende β-Klotho e um de
FGFRlc, FGFR2C, FGFR3c e FGFR4 é um anticorpo do subtipo IgGl, IgG2 ou IgG4.
Em cadeias leves e pesadas de comprimento total, as regiões variáveis e constantes são unidas por uma região J de cerca de doze ou mais aminoácidos, com a cadeia pesada também incluindo uma região D de cerca de mais dez aminoácidos. Veja, por exemplo, Fundamental Immunology, 2a Edição, Capítulo 7 (Paul, W. , ed.) 1989, Nova York: Raven Press (aqui incorporado por referência em sua totalidade para todas as finalidades). As regiões variáveis de cada par de cadeia leve/pesada tipicamente formam o sítio de ligação de antígeno.
Um exemplo de um domínio constante pesado de IgG2 de um anticorpo monoclonal exemplar que se liga especificamente a (i) β-Klotho; (ii) FGFRlc, FGFR2c, FGFR3c ou FGFR4; ou (iii) um complexo que compreende β-Klotho e um de FGFRlc, FGFR2c, FGFR3c e FGFR4 possui a seqüência de aminoácidos: ASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQS SGLYSLSSWTVPSSNFGTQTYTCNVDHKPSNTKVDKTVERKCCVECPPCPAPPVAGPS VFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVWDVSHEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNS TFRWSVLTWHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPAPIEKTISKTKGQPREPQVYTLPPSREE MTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPMLDSDGSFFLYSKLTVDKSR WQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK (ID. DE SEQ. N°: 9).
Um exemplo de um domínio constante leve kappa de um anticorpo monoclonal exemplar que se liga a (i) β-Klotho; (ii) FGFRlc, FGFR2C, FGFR3c ou FGFR4; ou (iii) um complexo que compreende β-Klotho e um de FGFRlc, FGFR2c, FGFR3c e FGFR4 possui a seqüência de aminoácidos: RTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASWCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQ
DSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC (ID. DE SEQ. N°: 10).
Um exemplo de um domínio constante leve lambda de urn anticorpo monoclonal exemplar que se liga a (i) β-Klotho; (ii) FGFRlc, FGFR2C, FGFR3C ou FGFR4; ou (iii) um complexo que compreende β-Klotho e um de FGFRlc, FGFR2c, FGFR3c e FGFR4 possui a seqüência de aminoácidos:
GQPKANPTVTLFPPSSEELQANKATLVCLISDFYPGAVTVAWKADGSPVKAGVETTKPS KQSNNKYAASSYLSLTPEQWKSHRSYSCQVTHEGSTVEKTVAPTECS (ID. DE SEQ. N°: 11).
Regiões variáveis de cadeias de imunoglobulina geralmente exibem a mesma estrutura global, que compreende regiões framework relativamente conservadas (FR) unidas por três regiões hipervariáveis, mais freqüentemente denominadas regiões determinantes de complementaridade ou CDRs. As CDRs das duas cadeias de cada par de cadeia pesada/cadeia leve mencionado acima tipicamente estão alinhadas pelas regiões framework para formar uma estrutura que se liga especificamente a um epitopo específico na proteína-alvo (por exemplo, (i) β-Klotho; (ii) FGFRlc, FGFR2c, FGFR3c ou FGFR4; ou (iii) um complexo que compreende β-Klotho e um de FGFRlc, FGFR2c, FGFR3c e FGFR4). Do terminal N para o terminal C, as regiões variáveis da cadeia leve e pesada de ocorrência natural tipicamente estão de acordo com a seguinte ordem desses elementos: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3 e FR4 . Foi desenvolvido um sistema de numeração para a atribuição de números aos aminoácidos que ocupam posições em cada um desses domínios. Esse sistema de numeração é definido em Kabat Sequences of Proteins of Immunological Interest (1987 e 1991, NIH, Bethesda, MD) . Como desejado, as CDRs também podem ser redefinidas de acordo com um esquema de nomenclatura alternativo, por exemplo, aquele de Chothia (veja Chothia e Lesk, 1987, J. Mol. Biol. 196: 901-917; Chothia e cols., 1989, Nature 342: 878-883 ou Honegger e Pluckthun, 2001, J. Mol. Biol. 309: 657-670) .
As várias regiões variáveis da cadeia pesada e da cadeia leve de proteínas de ligação de antígeno aqui fornecidas são reveladas na Tabela 2. Cada uma dessas regiões variáveis pode ser anexada às regiões constantes da cadeia pesada e leve acima para formar uma cadeia pesada e leve de anticorpo completa, respectivamente. Além disso, cada uma das seqüências da cadeia pesada e leve assim gerada pode ser combinada para formar uma estrutura de anticorpo completa. Deve ser entendido que as regiões variáveis da cadeia pesada e da cadeia leve aqui fornecidas também podem ser anexadas a outros domínios constantes que possuem seqüências diferentes das seqüências exemplares listadas acima.
Exemplos específicos de algumas das cadeias leves e pesadas de comprimento total dos anticorpos que são fornecidos e suas seqüências de aminoácidos correspondentes estão resumidos nas Tabelas IA e IB. A Tabela IA mostra seqüências da cadeia leve exemplares, e a Tabela 1B mostra seqüências da cadeia pesada exemplares.
Tabela IA - Seqüências exemplares da cadeia leve de anticorpo
ID. DE SEQ. N° : Designação Contida no clone Seqüência de aminoácidos
ID. DE SEQ. N° : Designação Contida no clone Seqüência de aminoácidos
12 LI 17C3 SYVLTQPPSVSVAPGQTARITCGGNNIGSQSV HWYQQKPGQAPVLWYDDSDRPSGI PERFSGS NSGNTATLTISRVEAGDEADYYCQVWDSSSDH WFGGGTKLTVLGQPKANPTVTLFPPSSEELQ ANKATLVCLISDFYPGAVTVAWKADGSPVKAG VETTKPSKQSNNKYAASSYLSLTPEQWKSHRS YSCQVTHEGSTVEKTVAPTECS
13 L2 22H5 SYVLTQPPSVSVAPGQTARITCGGNNIGSQSV HWYQQKPGQAPVLWYDDSDRPSGI PERFSGS NSGNTATLTISRVEAGDEADYYCQVWDNTSDH WFGGGTKLTVLGQPKANPTVTLFPPSSEELQ ANKATLVCLISDFYPGAVTVAWKADGS PVKAG VETTKPSKQSNNKYAASSYLSLTPEQWKSHRS YSCQVTHEGSTVEKTVAPTECS
14 L3 16H7 24H11 SYVLTQPPSVSVAPGQTARITCGGNNIGSESV HWYQQKPGQAPVLWYDDSDRPSGI PERFSGS NSGNTATLTISRVEAGDEADYYCQVWDGNSDH WFGGGTKLTVLGQPKANPTVTLFPPSSEELQ ANKATLVCLISDFYPGAVTVAWKADGS PVKAG VETTKPSKQSNNKYAASSYLSLTPEQWKSHRS YSCQVTHEGSTVEKTVAPTECS
15 L4 18G1 EIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRASQNFDSS YLAWYQQKPGQAPRLLIYGTSSRATGIPDRFS GIGSGTDFTLTINRLEPEDFAMYYCQQYGGSP LTFGGGTEVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKS GTASWCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNS QESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKV
ID. DE SEQ. N° : Designação Contida no clone Seqüência de aminoácidos
YACEVTHQGLS S PVTKS FNRGEC
16 L5 17D8 EIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRASQSVSGN YLAWYQQKPGQAPRLLIYGASSRATGIPDRFS GSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCQQYGSAP LTFGGGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKS GTASWCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNS QESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKV YACEVTHQGLS S PVTKS FNRGEC
17 L6 26H11 EIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRASQSVSGN YLAWYQQKPGQAPRLLIYGASSRATGIPDRFS GSGSGTDFTLTISRLEPEDFAMYYCQQYGSSP LTFGGGSKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKS GTASWCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNS QESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKV YACEVTHQGLS S PVTKS FNRGEC
18 L7 12E4 EIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRASQNFDSN YLAWYQQKPGQAPRLLIYGASSRATGIPDNFS GSGSGTDFTLTISRLEPEDFAMYYCQQYGSSP LTFGGGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKS GTASWCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNS QESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKV YACEVTHQGLS S PVTKS FNRGEC
19 L8 12C11 EIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRASQNFDSS SLAWYQQKPGQAPRLLIYGASSRATGIPDRFS GSGSGTDFTLTISRLEPEDFAMYYCQQCGSSP LTFGGGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKS GTASWCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNS
ID. DE SEQ. N° : Designação Contida no clone Seqüência de aminoácidos
QESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKV YACEVTHQGL S S PVTKS FNRGEC
20 L9 21H2 21B4 EIVLTQS PGTLSLS PGERATLS CRASQSVS ST YLAWHQQKPGQGLRLLIYGASSRATGIPDRFS GSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCQQYGSSF TFGGGTRVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSG TASWCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQ ESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVY ACEVTHQGL S S PVTKS FNRGEC
21 LIO 18B11.1 DIVMTQSPLSLPVTPGEPASISCRSSQSLLYY NGFTYLDWFLQKPGQS PHLLIYLGSNRASGVP DRFSGSVSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCMQS LQTPFTFGPGTKVDIKRTVAAPSVFIFPPSDE QLKSGTASWCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQ SGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYE KHKVYACEVTHQGLS S PVTKS FNRGEC
22 Lil 18B11.2 EIVMTQSPATLSVSPGERATLSCRASQSVNSN LAWYQQKPGQAPRLLIYGVSTRATGIPARFSG SGSGTEFTLTIRSLQSEDFAVYYCQQYNNWPP TFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSG TASWCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQ ESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVY ACEVTHQGLS S PVTKS FNRGEC
23 L12 2 0D4 DIQLTQSPSSLSASIGDRVTITCRASQDIRYD LGWYQQKPGKAPKRLIYAASSLQSGVPSRFSG SGSGTEFTLTVSSLQPEDFATYYCLQHNSYPL TFGGGTKVEIERTVAAPSVFIFPPSDEQLKSG
ID. DE SEQ. N° : Designação Contida no clone Seqüência de aminoácidos
TASWCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQ ESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVY ACEVTHQGLS S PVTKS FNRGEC
24 L13 46D11 DIQMTQSPSSVSASVGDRVTITCRASQGISIW LAWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQSGVPSRFSG SGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQANDFPI TFGQGTRLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSG TASWCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQ ESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVY ACEVTHQGLS S PVTKS FNRGEC
25 L14 4 0D2 DFVMTQTPLSLSVTPGQPASISCKSSQSLLQS DGKTYLYWYLQKPGQPPHLLIYEVSNRFSGVP DRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCMQS IQLPRTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDE QLKSGTASWCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQ SGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYE KHKVYACEVTHQGL S S PVTKS FNRGE C
26 L15 37D3 DIVMTQSPLSLPVTPGEPASISCRSSQSLLHS NGYNFLDWYLQKPGQSPQLLIYLGSDRASGVP DRFSGSGSGTEFTLKISRVEAEDVGLYYCMQA LQTPCSFGQGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDE QLKSGTASWCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQ SGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYE KHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
27 L16 39F7 EIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRASQSVSST YLAWYQQKPGQAPRLLIYGAS SRATGIPDRFS GSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCQQSGSSP
ID. DE SEQ. N° : Designação Contida no clone Seqüência de aminoácidos
LTFGGGTEVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKS GTASWCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNS QESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKV YACEVTHQGLS S PVTKS FNRGEC
28 L17 39F11 EIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRASQSVSST YLAWYQQKPGQAP S LLIYGAS SRATGIPDRFS GSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCQQSGSSP LTFGGGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKS GTASWCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNS QESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKV YACEVTHQGLS S PVTKS FNRGEC
29 L18 3 9G5 EIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRASQSVSST YLAWYQQKPGQAPRLLIYGASFRATGIPDRFS GSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCQQSGSSP LTFGGGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKS GTASWCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNS QESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKV YACEVTHQGLS S PVTKS FNRGE C
Tabela IB - Seqüências exemplares da cadeia pesada de anticorpo
ID. DE SEQ. N° : Designação Contida no clone Seqüência
30 H1 17C3 QVTLKESGPVLVKPTETLTLTCTVSGFSLSNA RMGVSWIRQPPGKALEWLAHIFSNDEKSYSTS LKS RLTIS KDTS KSQWLTMTNMDP VDTAT Y Y CARILLLGAYYYYGMDVWGQGTTVTVS SASTK GPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEP VTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSV
ID. DE SEQ. N° : Designação Contida no clone Seqüência
VTVPSSNFGTQTYTCNVDHKPSNTKVDKTVER KCCVECPPCPAPPVAGPSVFLFPPKPKDTLMI SRTPEVTCVWDVSHEDPEVQFNWYVDGVEVH NAKTKPREEQFNSTFRWSVLTVVHQDWLNGK EYKCKVSNKGLPAPIEKTISKTKGQPREPQVY TLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEW ESNGQPENNYKTTPPMLDSDGSFFLYSKLTVD KS RWQQGNVFS CSVMHEALHNHYTQKS LS LS P GK
31 H2 22H5 QVTLKESGPVLVKPTETLTLTCTVSGFSLSNA RMGVSWIRQPPGKALEWLAHIFSNDEKSYSTS LKS RLTIS KDTS KS Q WLTMTNMD P VDTAT Y Y CARILLVGAYYYCGMDVWGQGTTVTVSSASTK GPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEP VTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSV VTVPSSNFGTQTYTCNVDHKPSNTKVDKTVER KCCVECPPCPAPPVAGPSVFLFPPKPKDTLMI SRTPEVTCVWDVSHEDPEVQFNWYVDGVEVH NAKTKPREEQFNSTFRVVSVLTWHQDWLNGK EYKCKVSNKGLPAPIEKTISKTKGQPREPQVY TLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEW ESNGQPENNYKTTPPMLDSDGSFFLYSKLTVD KSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSP GK
ID. DE SEQ. N° : Designação Contida no clone Seqüência
32 H3 16H7 QVTLKESGPVLVKPTETLTLTCTVSGFSLNNA RMGVSWIRQPPGKALEWLAHIFSNDEKSYSTS LKSRLTISKDTSKSQWLIMTNMDPVDTATYY CARSWTGGYYYDGMDVWGQGTTVTVSSASTK GPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEP VTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSV VTVPSSNFGTQTYTCNVDHKPSNTKVDKTVER KCCVECPPCPAPPVAGPSVFLFPPKPKDTLMI SRTPEVTCWVDVSHEDPEVQFNWYVDGVEVH NAKTKPREEQFNSTFRWSVLTWHQDWLNGK EYKCKVSNKGLPAPIEKTISKTKGQPREPQVY TLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEW ESNGQPENNYKTTPPMLDSDGSFFLYSKLTVD KS RWQQGNVFS CSVMHEALHNHYTQKS L S LS P GK
33 H4 24H11 QVTLKESGPVLVKPTETLTLTCTVSGFSLSNA RMGVSWIRQPPGKALEWLAHIFSNDEKSYSTS LKNRLTIS KDTS KS Q WLIMTNMD P VDTAT Y Y CARSWTGGYYYDGMDVWGQGTTVTVSSASTK GPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCL.VKDYFPEP VTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSV VTVPSSNFGTQTYTCNVDHKPSNTKVDKTVER KCCVECPPCPAPPVAGPSVFLFPPKPKDTLMI SRTPEVTCVWDVSHEDPEVQFNWYVDGVEVH NAKTKPREEQFNSTFRWSVLTWHQDWLNGK EYKCKVSNKGLPAPIEKTISKTKGQPREPQVY TLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEW ESNGQPENNYKTTPPMLDSDGSFFLYSKLTVD KSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSP GK
34 H5 18G1 EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASRFTFSTY AMSWVRQAPGKGLEWVSGISGSGVSTHYADSV KGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYC AKSLIWIVYALDHWGQGTLVTVSSASTKGPS VFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTV SWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSWTV PSSNFGTQTYTCNVDHKPSNTKVDKTVERKCC VECPPCPAPPVAGPSVFLFPPKPKDTLMISRT
ID. DE SEQ. N° : Designação Contida no clone Seqüência
PEVTCWVDVSHEDPEVQFNWYVDGVEVHNAK TKPREEQFNSTFRWSVLTWHQDWLNGKEYK CKVSNKGLPAPIEKTISKTKGQPREPQVYTLP PSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESN GQPENNYKTTPPMLDSDGSFFLYSKLTVDKSR WQQGNVFS CSVMHEALHNHYTQKS L S L S PGK
35 H6 17D8 EVQLLESGGGLVQPGGYLRLSCAASGFTFSTY AMSWVRQAPGKGLEWVSAISGSGVSTYYADSV KGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYC AKSLIWMVYVLDYWGQGTLVTVSSASTKGPS VFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTV SWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSWTV PSSNFGTQTYTCNVDHKPSNTKVDKTVERKCC VECPPCPAPPVAGPSVFLFPPKPKDTLMISRT PEVTCWVDVSHEDPEVQFNWYVDGVEVHNAK TKPREEQFNSTFRWSVLTWHQDWLNGKEYK CKVSNKGLPAPIEKTISKTKGQPREPQVYTLP PSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESN GQPENNYKTTPPMLDSDGSFFLYSKLTVDKSR WQQGNVFS CSVMHEALHNHYTQKS LS L S PGK
36 H7 26H11 EVQLLESGGGLVQPGGYLRLSCAASGFTFSTY AMSWVRQAPGKGLEWVSAISGSGVSTNYADSV KGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYC AKS LIWMVYVLDYWGQGTLVTVS SAS TKGPS VFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTV SWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSWTV PSSNFGTQTYTCNVDHKPSNTKVDKTVERKCC VECPPCPAPPVAGPSVFLFPPKPKDTLMISRT PEVTCWVDVSHEDPEVQFNWYVDGVEVHNAK TKPREEQFNSTFRWSVLTWHQDWLNGKEYK CKVSNKGLPAPIEKTISKTKGQPREPQVYTLP PSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESN GQPENNYKTTPPMLDSDGSFFLYSKLTVDKSR WQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
37 H8 12E4 12C11 EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASRFTFSTY AMSWVRQAPGKGLEWVSGISGSGVSTYYADSV KGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYC AKSLIWIVYALDYWGQGTLVTVSSASTKGPS
ID. DE SEQ. N° : Designação Contida no clone Seqüência
VFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTV SWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSWTV PSSNFGTQTYTCNVDHKPSNTKVDKTVERKCC VECPPCPAPPVAGPSVFLFPPKPKDTLMISRT PEVTCWVDVSHEDPEVQFNWYVDGVEVHNAK TKPRE EQ FNS T FRWS VLT WHQDWLNGKE YK CKVSNKGLPAPIEKTIS KTKGQPRE PQVYTLP PSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESN GQPENNYKTTPPMLDSDGSFFLYSKLTVDKSR WQQGNVF S CSVMHEALHNHYTQKS L S LS PGK
38 H9 21H2 QVQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGGSISSY YWSWIRQPAGKGLEWIGRIYTSGSTNYNPSLK SRVTMSKDTSKNQFSLKLRSVTAADTAVYYCA RDPDGDYYYYGMDVWGQGTSVTVSSASTKGPS VFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTV SWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSWTV PSSNFGTQTYTCNVDHKPSNTKVDKTVERKCC VECPPCPAPPVAGPSVFLFPPKPKDTLMISRT PEVTCWVDVSHEDPEVQFNWYVDGVEVHNAK TKPRE EQ FNS T FRWS VLT WHQDWLNGKE YK CKVSNKGLPAPIEKTISKTKGQPREPQVYTLP PSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESN GQPENNYKTTPPMLDSDGSFFLYSKLTVDKSR WQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
39 H10 21B4 QVQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGGSISSY FWSWIRQPAGKGLEWIGRIYTSGSTNYNPSLK SRVTMSIDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCA RDPDGDYYYYGMDVWGQGTTVTVSSASTKGPS VFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTV SWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSWTV PSSNFGTQTYTCNVDHKPSNTKVDKTVERKCC VECPPCPAPPVAGPSVFLFPPKPKDTLMISRT PEVTCWVDVSHEDPEVQFNWYVDGVEVHNAK TKPREEQFNSTFRWSVLTWHQDWLNGKEYK CKVSNKGLPAPIEKTISKTKGQPREPQVYTLP PSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESN GQPENNYKTTPPMLDSDGSFFLYSKLTVDKSR WQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
ID. DE SEQ. N° : Designação Contida no clone Seqüência
40 Hll 18B11.1 18B11.2 EVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCAASGFTFSDA WMSWVRQAPGKGLEWVGRIKSKTDGGTTDYAA PVKGRFTISRDDSKNTLYLQMNSLKTEDTAVY F CTS TYS S GWYVWDYYGMDVWGQGTTVTVS SA STKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYF PEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSL SSWTVPSSNFGTQTYTCNVDHKPSNTKVDKT VERKCCVECPPCPAPPVAGPSVFLFPPKPKDT LMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVQFNWYVDGV EVHNAKTKPREEQFNSTFRVVSVLTVVHQDWL NGKEYKCKVSNKGLPAPIEKTISKTKGQPREP QVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIA VEWESNGQPENNYKTTPPMLDSDGSFFLYSKL TVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLS LSPGK
41 H12 20D4 QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKVSGYTLTDL SMHWVRQAPGKGLEWMGGFDPEDGETIYAQKF QGRITMTEDTSTDTAYMELSSLRSEDTAVYYC ASIWVPAAIQSYYYYYGMGVWGQGTTVTVSS ASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDY FPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYS LSSWTVPSSNFGTQTYTCNVDHKPSNTKVDK TVERKCCVECPPCPAPPVAGPSVFLFPPKPKD TLMISRTPEVTCVWDVSHEDPEVQFNWYVDG VEVHNAKTKPREEQFNSTFRWSVLTWHQDW LNGKEYKCKVSNKGLPAPIEKTISKTKGQPRE PQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDI AVEWESNGQPENNYKTTPPMLDSDGSFFLYSK LTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSL SLSPGK
42 H13 46D11 QVTLKEAGPVLVKPTETLTLTCTVSGFSLSNA RMGVNWIRQPPGKALEWLAHIFSNDEKSYSTS LKSRLTISKDTSKSQWLTMTNMDPVDTATYY CARVRIAGDYYYYYGMDVWGQGTTVTVSSAST KGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPE PVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSS WTVPSSNFGTQTYTCNVDHKPSNTKVDKTVE RKCCVECPPCPAPPVAGPSVFLFPPKPKDTLM
ID. DE SEQ. N° : Designação Contida no clone Seqüência
ISRTPEVTCVWDVSHEDPEVQFNWYVDGVEV HNAKTKPREEQFNSTFRWSVLTWHQDWLNG KEYKCKVSNKGLPAPIEKTISKTKGQPREPQV YTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVE WESNGQPENNYKTTPPMLDSDGSFFLYSKLTV DKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLS PGK
43 H14 39F11 QVQLVESGGGWQPGRSLRLSCAASGFTFSSY GIHWVRQAPGKGLEWVAVIWYDGSDKYYADSV KGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYC ARDRAAAGLHYYYGMDVWGQGTTVTVSSASTK GPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEP VTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSV VTVPSSNFGTQTYTCNVDHKPSNTKVDKTVER KCCVECPPCPAPPVAGPSVFLFPPKPKDTLMI SRTPEVTCWVDVSHEDPEVQFNWYVDGVEVH NAKTKPREEQ FNS T FRWS VLT WHQDWLNGK EYKCKVSNKGLPAPIEKTIS KTKGQPRE PQVY TLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEW ESNGQPENNYKTTPPMLDSDGSFFLYSKLTVD KSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSP GK
44 H15 39F7 QVQLVESGGGWQPGRSLRLSCAASGFTFSNY GIHWVRQAPGKGLEWVAVIWYDGSIKYYADSV KGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYC ARDRAAAGLHYYYGMDVWGQGTTVTVS S AS TK GPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEP VTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSV VTVPSSNFGTQTYTCNVDHKPSNTKVDKTVER KCCVECPPCPAPPVAGPSVFLFPPKPKDTLMI SRTPEVTCVWDVSHEDPEVQFNWYVDGVEVH NAKTKPREEQFNSTFRWSVLTWHQDWLNGK EYKCKVSNKGLPAPIEKTISKTKGQPREPQVY TLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEW ESNGQPENNYKTTPPMLDSDGSFFLYSKLTVD KSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSP GK
ID. DE SEQ. N° : Designação Contida no clone Seqüência
45 H16 39G5 QVQLVESGGGWQPGRSLRLSCAVSGFTFSSY GIHWVRQAPGKGLEWVAVIWYDGSDKYYGDSV KGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYC ARDRAAAGLHYYYGMDVWGQGTTVTVSSASTK GPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEP VTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSV VTVPSSNFGTQTYTCNVDHKPSNTKVDKTVER KCCVECPPCPAPPVAGPSVFLFPPKPKDTLMI SRTPEVTCVVVDVSHEDPEVQFNWYVDGVEVH NAKTKPREEQFNSTFRWSVLTWHQDWLNGK EYKCKVSNKGL PAPIEKTISKTKGQPRE PQVY TLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEW ESNGQPENNYKTTPPMLDSDGSFFLYSKLTVD KSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSP GK
46 H17 40D2 QVQLQESGPGLVKPSQTLSLTCTVSGGSISSG GYNWSWIRQHPGKGLEWIGNIYYSGSTYYNPS LKSRVTISVDTSKNQFSLKLRSVTAADTAVYY CARENIWIPAAIFAGWFDPWGQGTLVTVS SA STKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYF PEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSL SSWTVPSSNFGTQTYTCNVDHKPSNTKVDKT VERKCCVECPPCPAPPVAGPSVFLFPPKPKDT LMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVQFNWYVDGV EVHNAKTKPREEQFNSTFRWSVLTWHQDWL NGKEYKCKVSNKGLPAPIEKTISKTKGQPREP QVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIA VEWESNGQPENNYKTTPPMLDSDGSFFLYSKL TVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLS LSPGK
47 H18 37D3 EVHLVESGGGLAKPGGSLRLSCAASGFTFRNA WMSWVRQAPGKGLEWVGRIKSKTDGGTTDYAA PVKGRFTISRDDSKNTLYLQMNSLKTEDTAEY YCITDRVLSYYAMAVWGQGTTVTVS SASTKGP SVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVT VSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSWT VPSSNFGTQTYTCNVDHKPSNTKVDKTVERKC CVECPPCPAPPVAGPSVFLFPPKPKDTLMISR
ID. DE SEQ. N° : Designação Contida no clone Seqüência
TPEVTCVWDVSHEDPEVQFNWYVDGVEVHNA KTKPRE EQ FNS TFRWS VLT WHQDWLNGKE Y KCKVSNKGLPAPIEKTISKTKGQPREPQVYTL PPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWES NGQPENNYKTTPPMLDSDGSFFLYSKLTVDKS RWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
Novamente, cada uma das cadeias pesadas exemplares (Hl, H2, H3 etc.) listadas nas Tabelas IB e 6A, infra, pode ser combinada com qualquer uma das cadeias leves exemplares mostradas nas Tabelas IA e 6A, infra, para formar um anticorpo. Exemplos dessas combinações incluem Hl combinada com qualquer uma de LI a L18; H2 combinada com qualquer uma de LI a L18; H3 combinada com qualquer uma de LI a L18, e assim por diante. Em alguns casos, os anticorpos incluem pelo menos uma cadeia pesada e uma cadeia leve daquelas listadas nas Tabelas IA e IB e 6A, infra; exemplos particulares de pareamentos de cadeias leves e cadeias pesadas incluem LI com HI, L2 com H2, L3 com H3, L4 com H4, L5 com H5, L6 com H6, L7 com H7, L8 com H8, L9 com H9, LIO com H10, Lll com Hll, L12 com H12, L13 com H13, L14 com H14, L15 com H15, L16 com H16, L17 com H17 e L18 com H18. Além de proteínas de ligação de antígeno que compreendem uma cadeia pesada e uma cadeia leve do mesmo clone, uma cadeia pesada de um primeiro clone pode ser pareada com uma cadeia leve de um segundo clone (por exemplo, uma cadeia pesada de 46D11 pareada com uma cadeia leve de 16H7 ou uma cadeia pesada de 16H7 pareada com uma cadeia leve de 46D11). Geralmente, esses pareamentos podem incluir VL com
90% ou mais de homologia que pode ser pareada com a cadeia pesada do clone de ocorrência natural. Em alguns casos, os anticorpos compreendem duas cadeias pesadas diferentes e duas cadeias leves diferentes listadas nas Tabelas IA e 1B e 6A, infra. Em outros casos, os anticorpos contêm duas cadeias leves idênticas e duas cadeias pesadas idênticas. Como exemplo, um anticorpo ou fragmento imunologicamente funcional pode incluir duas cadeias pesadas H1 e duas cadeias leves Ll, ou duas cadeias pesadas H2 e duas cadeias leves L2, ou duas cadeias pesadas H3 e duas cadeias leves L3, e outras combinações similares de pares de cadeias leves e pares de cadeias pesadas, como listadas nas Tabelas IA e IB e 6A, infra.
Em outro aspecto da presente revelação, são fornecidos hemibodies. Um hemibody é uma proteína de ligação de antígeno monovalente que compreende (i) uma cadeia leve intacta, e (ii) uma cadeia pesada fundida a uma região Fc (por exemplo, uma região Fc de IgG2 do ID. DE SEQ. N° : 441), opcionalmente por meio de um vinculador. O vinculador pode ser um vinculador (G4S)X, em que x é um número inteiro diferente de zero (por exemplo, (G4S)8; ID. DE SEQ. N° : 440). Hemibodies podem ser construídos usando os componentes de cadeia pesada e leve fornecidos. Exemplos específicos de hemibodies são revelados no Exemplo 14.
Outras proteínas de ligação de antígeno que são fornecidas são variantes de anticorpos formadas por combinação das cadeias pesadas e leves mostradas nas Tabelas IA e IB e 6A, infra, e compreendem cadeias leves e/ou pesadas que possuem, cada uma, pelo menos 7 0%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade para as seqüências de aminoácidos dessas cadeias. Em alguns casos, esses anticorpos incluem pelo menos uma cadeia pesada e uma cadeia leve, enquanto, em outros casos, as formas variantes contêm duas cadeias leves idênticas e duas cadeias pesadas idênticas.
Domínios variáveis de proteínas de ligação de antígeno
Também são fornecidas proteínas de ligação de antígeno que contêm uma região variável da cadeia pesada de anticorpo selecionada do grupo que consiste em VH1, VH2, Vh3, Vh4, VhS, Vh6, Vh7, Vh8 , VH9, VH10, VH11, VH12, VH13, Vh14, Vh15, Vh16, Vh17 e VH18, como mostrado na Tabela 2B, e/ou uma região variável da cadeia leve de anticorpo selecionada do grupo que consiste em VL1, VL2, VL3, VL4, VLS, Vl6, Vl7, Vl8, Vl9, Vl10, Vl11, Vl12 , VL13, VL14, VL15, Vl16, Vl17 e Vl18, como mostrado na Tabela 2A, e fragmentos imunologicamente funcionais, derivados, muteínas e variantes dessas regiões variáveis de cadeia leve e de cadeia pesada.
Tabela 2A - Cadeias leves variáveis (VL) de anticorpo exemplares.
Contida no clone Designação ID. DE SEQ. N°: Seqüência de aminoácidos
17C3 VL1 48 SYVLTQPPSVSVAPGQTARITCGGNNIGSQ SVHWYQQKPGQAPVLWYDDSDRPSGI PER FSGSNSGNTATLTISRVEAGDEADYYCQVW DSSSDHWFGGGTKLTVL
22H5 VL2 49 SYVLTQPPSVSVAPGQTARITCGGNNIGSQ SVHWYQQKPGQAPVLWYDDSDRPSGI PER FSGSNSGNTATLTISRVEAGDEADYYCQVW DNTSDHWFGGGTKLTVL
Contida no clone Designação ID. DE SEQ. N°: Seqüência de aminoácidos
16H7 24H11 Vl3 50 SYVLTQPPSVSVAPGQTARITCGGNNIGSE SVHWYQQKPGQAPVLWYDDSDRPSGI PER FSGSNSGNTATLTISRVEAGDEADYYCQVW DGNSDHWFGGGTKLTVL
18G1 Vl4 51 EIVLTQS PGTLSLS PGERATLS CRASQNFD S SYLAWYQQKPGQAPRLLIYGTS SRATGIP DRFSGIGSGTDFTLTINRLEPEDFAMYYCQ QYGGS PLTFGGGTEVEIK
17D8 Vl5 52 EIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRASQSVS GNYLAWYQQKPGQAPRLLIYGASSRATGIP DRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCQ QYGSAPLTFGGGTKVEIK
26H11 Vl6 53 EIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRASQSVS GNYLAWYQQKPGQAPRLLIYGASSRATGIP DRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAMYYCQ QYGSSPLTFGGGSKVEIK
12E4 Vl7 54 EIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRASQNFD SNYLAWYQQKPGQAPRLLIYGASSRATGIP DNFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAMYYCQ QYGS S PLTFGGGTKVEIK
12C11 Vl8 55 EIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRASQNFD S S S LAWYQQKPGQAPRLLIYGASSRATGIP DRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAMYYCQ QCGSSPLTFGGGTKVEIK
21H2 21B4 Vl9 56 EIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRASQSVS S TYLAWHQQKPGQGLRLLIYGASSRATGIP DRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCQ QYGS S FTFGGGTRVEIK
Contida no clone Designação ID. DE SEQ. N°: Seqüência de aminoácidos
18B11.1 VL10 57 DIVMTQSPLSLPVTPGEPASISCRSSQSLL YYNGFTYLDWFLQKPGQS PHLLIYLGSNRA SGVPDRFSGSVSGTDFTLKISRVEAEDVGV YYCMQSLQTPFTFGPGTKVDIK
18B11.2 VL11 58 EIVMTQSPATLSVSPGERATLSCRASQSVN SNLAWYQQKPGQAPRLLIYGVSTRATGIPA RFSGSGSGTEFTLTIRSLQSEDFAVYYCQQ YNNWPPTFGQGTKVEIK
2 0D4 Vl12 59 DIQLTQSPSSLSASIGDRVTITCRASQDIR YDLGWYQQKPGKAPKRLIYAASSLQSGVPS RFSGSGSGTEFTLTVSSLQPEDFATYYCLQ HNSYPLTFGGGTKVEIE
46D11 Vl13 60 DIQMTQSPSSVSASVGDRVTITCRASQGIS IWLAWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQSGVPS RFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQ ANDF PITFGQGTRLEIK
40D2 Vl14 61 DFVMTQTPLSLSVTPGQPASISCKSSQSLL QSDGKTYLYWYLQKPGQPPHLLIYEVSNRF SGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGV YYCMQSIQLPRTFGQGTKVEIK
37D3 Vl15 62 DIVMTQSPLSLPVTPGEPASISCRSSQSLL HSNGYNFLDWYLQKPGQS PQLLIYLGSDRA SGVPDRFSGSGSGTEFTLKISRVEAEDVGL YYCMQALQTPCSFGQGTKLEIK
39F7 Vl16 63 EIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRASQSVS STYLAWYQQKPGQAPRLLIYGASSRATGIP DRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCQ QSGS S PLTFGGGTEVEIK
Contida no clone Designação ID. DE SEQ. N°: Seqüência de aminoácidos
39F11 Vl17 64 EIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRASQSVS STYLAWYQQKPGQAPSLLIYGASSRATGIP DRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCQ QSGSS PLTFGGGTKVEIK
39G5 Vl18 65 EIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRASQSVS S TYLAWYQQKPGQAPRLLIYGAS FRATGIP DRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCQ QSGSSPLTFGGGTKVEIK
Tabela 2B - Cadeias pesadas variáveis (VH) de anticorpo exemplares.
Contida no clone Designação ID. DE SEQ. N°: Seqüência de aminoácidos
17C3 VH1 66 QVTLKESGPVLVKPTETLTLTCTVSGFSLS NARMGVSWIRQPPGKALEWLAHIFSNDEKS YSTSLKSRLTISKDTSKSQWLTMTNMDPV DTATYYCARILLLGAYYYYGMDVWGQGTTV TVSS
22H5 Vh2 67 QVTLKESGPVLVKPTETLTLTCTVSGFSLS NARMGVSWIRQPPGKALEWLAHIFSNDEKS YSTSLKSRLTISKDTSKSQWLTMTNMDPV DTATYYCARILLVGAYYYCGMDVWGQGTTV TVSS
16H7 Vh3 68 QVTLKESGPVLVKPTETLTLTCTVSGFSLN NARMGVSWIRQPPGKALEWLAHIFSNDEKS YSTSLKSRLTISKDTSKSQWLIMTNMDPV DTATYYCARSWTGGYYYDGMDVWGQGTTV TVSS
24H11 Vh4 69 QVTLKESGPVLVKPTETLTLTCTVSGFSLS
Contida no clone Designação ID. DE SEQ. N°: Seqüência de aminoácidos
NARMGVSWIRQPPGKALEWLAHIFSNDEKS YSTSLKNRLTISKDTSKSQWLIMTNMDPV DTATYYCARSWTGGYYYDGMDVWGQGTTV TVSS
18G1 Vh5 70 EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASRFTFS TYAMSWVRQAPGKGLEWVSGISGSGVSTHY ADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAED TAVYYCAKSLIWIVYALDHWGQGTLVTVS S
17D8 Vh6 71 EVQLLESGGGLVQPGGYLRLSCAASGFTFS TYAMSWVRQAPGKGLEWVSAISGSGVSTYY ADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAED TAVYYCAKSLIVVMVYVLDYWGQGTLVTVS S
26H11 Vh7 72 EVQLLESGGGLVQPGGYLRLSCAASGFTFS TYAMSWVRQAPGKGLEWVSAISGSGVSTNY ADSVKGRFTISRDNS KNTLYLQMNSLRAED TAVYYCAKS LIVVMVYVLDYWGQGTLVTVS S
12E4 12C11 Vh8 73 EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASRFTFS TYAMSWVRQAPGKGLEWVS GISGSGVSTYY ADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAED TAVYYCAKS LIWIVYALDYWGQGTLVTVS S
21H2 Vh9 74 QVQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGGSIS SYYWSWIRQPAGKGLEWIGRIYTSGSTNYN PSLKSRVTMSKDTSKNQFSLKLRSVTAADT AVYYCARDPDGDYYYYGMDVWGQGTSVTVS
Contida no clone Designação ID. DE SEQ. N°: Seqüência de aminoácidos
S
21B4 VH10 75 QVQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGGSIS SYFWSWIRQPAGKGLEWIGRIYTSGSTNYN PSLKSRVTMSIDTSKNQFSLKLSSVTAADT AVYYCARDPDGDYYYYGMDVWGQGTTVTVS S
18B11.1 Vh11 76 EVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCAASGFTFS DAWMSWVRQAPGKGLEWVGRIKSKTDGGTT DYAAPVKGRFTISRDDSKNTLYLQMNSLKT EDTAVYF CTS TYS S GWYVWDYYGMDVWGQG TTVTVSS
18B11.2 Vh11 77 EVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCAASGFTFS DAWMSWVRQAPGKGLEWVGRIKSKTDGGTT DYAAPVKGRFTISRDDSKNTLYLQMNSLKT EDTAVYF CTS TYS S GWYVWDYYGMDVWGQG TTVTVSS
2 0D4 Vh12 78 QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKVSGYTLT DLSMHWVRQAPGKGLEWMGGFDPEDGETIY AQKFQGRITMTEDTSTDTAYMELSSLRSED TAVYYCASIVWPAAIQS YYYYYGMGVWGQ GTTVTVSS
46D11 Vh13 79 QVTLKEAGPVLVKPTETLTLTCTVSGFSLS NARMGVNWIRQPPGKALEWLAHIFSNDEKS YSTSLKSRLTISKDTSKSQWLTMTNMDPV DTATYYCARVRIAGDYYYYYGMDVWGQGTT VTVSS
40D2 Vh14 80 QVQLQESGPGLVKPSQTLSLTCTVSGGSIS SGGYNWSWIRQHPGKGLEWIGNIYYSGSTY
Contida no clone Designação ID. DE SEQ. N°: Seqüência de aminoácidos
YNPSLKSRVTISVDTSKNQFSLKLRSVTAA DTAVYYCARENIWIPAAIFAGWFDPWGQG TLVTVSS
37D3 Vh15 81 EVHLVESGGGLAKPGGSLRLSCAASGFTFR NAWMSWVRQAPGKGLEWVGRIKSKTDGGTT DYAAPVKGRFTISRDDSKNTLYLQMNSLKT EDTAEYYCITDRVLSYYAMAVWGQGTTVTV SS
39F7 Vh16 82 QVQLVESGGGWQPGRSLRLSCAASGFTFS NYGIHWVRQAPGKGLEWVAVIWYDGSIKYY ADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAED TAVYYCARDRAAAGLHYYYGMDVWGQGTTV TVSS
39F11 Vh17 83 QVQLVESGGGWQPGRSLRLSCAASGFTFS SYGIHWVRQAPGKGLEWVAVIWYDGSDKYY ADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAED TAVYYCARDRAAAGLHYYYGMDVWGQGTTV TVSS
39G5 Vh18 84 QVQLVESGGGWQPGRSLRLSCAVSGFTFS SYGIHWVRQAPGKGLEWVAVIWYDGSDKYY GDSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAED TAVYYCARDRAAAGLHYYYGMDVWGQGTTV TVSS
Tabela 2C - Seqüência codificadora para cadeias leves variáveis (VL) de anticorpo.
Contida no clone Designação ID. DE SEQ. N°: Seqüência codificadora
17C3 VL1 85 TCCTATGTGCTGACTCAGCCACCCTCGGTG
Contida no clone Designação ID. DE SEQ. N°: Seqüência codificadora
TCAGTGGCCCCAGGTCAGACGGCCAGGATT ACCTGTGGGGGAAACAACATTGGAAGTCAG AGTGTGCACTGGTACCAGCAGAAGCCAGGC CAGGCCCCTGTCCTGGTCGTCTATGATGAT AGCGACCGGCCCTCAGGGATCCCTGAGCGA TTCTCTGGCTCCAACTCTGGGAACACGGCC ACCCTGACCATCAGCAGGGTCGAAGCCGGG GATGAGGCCGACTATTACTGTCAGGTGTGG GATAGTAGTAGTGATCATGTGGTATTCGGC GGAGGGACCAAGCTGACCGTCCTA
22H5 Vl2 86 TCCTATGTGCTGACTCAGCCACCCTCGGTG TCAGTGGCCCCAGGACAGACGGCCAGGATT ACCTGTGGGGGAAACAACATTGGAAGTCAA AGTGTGCACTGGTACCAGCAGAAGCCAGGC CAGGCCCCTGTCCTGGTCGTCTATGATGAT AGCGACCGGCCCTCAGGGATCCCTGAGCGA TTCTCTGGCTCCAACTCTGGGAACACGGCC ACCCTGACCATCAGCAGGGTCGAAGCCGGG GATGAGGCCGACTATTACTGTCAGGTGTGG GATAATACTAGTGATCATGTGGTATTCGGC GGGGGGACCAAACTGACCGTCCTA
16H7 24H11 Vl3 87 TCCTATGTGCTGACTCAGCCACCCTCGGTG TCAGTGGCCCCAGGACAGACGGCCAGGATT ACCTGTGGGGGAAACAACATTGGAAGTGAA AGTGTGCACTGGTACCAGCAGAAGCCAGGC CAGGCCCCTGTGCTGGTCGTCTATGATGAT AGCGACCGGCCCTCAGGGATCCCTGAGCGA TTCTCTGGCTCCAACTCTGGGAACACGGCC
100
Contida no clone Designação ID. DE SEQ. N°: Seqüência codificadora
ACCCTGACCATCAGCAGGGTCGAAGCCGGG GATGAGGCCGACTATTACTGTCAGGTGTGG GATGGTAATAGTGATCATGTGGTATTCGGC GGAGGGACCAAGCTGACCGTCCTA
18G1 Vl4 88 GAAATTGTGTTGACGCAGTCTCCAGGCACC CTGTCTTTGTCTCCAGGGGAAAGAGCCACC CTCTCCTGCAGGGCCAGTCAGAATTTTGAC AGCAGTTACTTAGCCTGGTACCAGCAGAAA CCTGGCCAGGCTCCCCGGCTCCTCATCTAT GGTACATCCAGCAGGGCCACTGGCATCCCA GACAGGTTCAGTGGCATTGGGTCTGGGACA GACTTCACTCTCACCATCAACAGACTGGAG CCTGAAGATTTTGCAATGTATTACTGTCAG CAGTATGGTGGCTCACCGCTCACTTTCGGC GGAGGGACCGAGGTGGAAATCAAA
17D8 Vl5 89 GAAATTGTGTTGACGCAGTCTCCAGGCACC CTGTCTTTGTCTCCAGGGGAAAGAGCCACC CTCTCCTGCAGGGCCAGTCAGAGTGTTAGC GGCAACTACTTGGCCTGGTACCAGCAGAAA CCTGGCCAGGCTCCCAGGCTCCTCATCTAT GGTGCATCCAGCAGGGCCACTGGCATCCCA GACAGGTTCAGTGGCAGTGGGTCTGGGACA GACTTCACTCTCACCATCAGCAGACTGGAG CCTGAAGATTTTGCAGTGTATTATTGTCAG CAGTATGGTAGCGCACCGCTCACTTTCGGC GGAGGGACCAAGGTGGAAATCAAA
26H11 Vl6 90 GAAATTGTGTTGACGCAGTCTCCAGGCACC CTGTCTTTGTCTCCAGGGGAAAGAGCCACC
101
Contida no clone Designação ID. DE SEQ. N°: Seqüência codificadora
CTCTCCTGCAGGGCCAGTCAGAGTGTTAGC GGCAACTACTTGGCCTGGTACCAGCAGAAA CCTGGCCAGGCTCCCAGGCTCCTCATCTAT GGTGCATCCAGCAGGGCCACTGGCATCCCA GACAGATTCAGTGGCAGTGGGTCTGGGACA GACTTCACTCTCACCATCAGCAGACTGGAG CCTGAAGATTTTGCAATGTATTATTGTCAG CAGTATGGTAGCTCACCGCTCACTTTCGGC GGAGGGTCCAAGGTGGAGATCAAA
12E4 Vl7 91 GAAATTGTGTTGACGCAGTCTCCAGGCACC CTGTCTTTGTCTCCAGGGGAAAGAGCCACC CTCTCCTGCAGGGCCAGTCAGAATTTCGAC AGCAACTACTTAGCCTGGTACCAGCAGAAG CCTGGCCAGGCTCCCCGGCTCCTCATCTAT GGTGCATCCAGCAGGGCCACTGGCATCCCA GACAACTTCAGTGGCAGTGGGTCTGGGACA GACTTCACTCTCACCATCAGCAGACTGGAG CCTGAAGATTTTGCAATGTATTACTGTCAG CAGTATGGTAGTTCACCGCTCACTTTCGGC GGAGGGACCAAGGTGGAAATCAAA
12C11 Vl8 92 GAAATTGTGTTGACGCAGTCTCCAGGCACC CTGTCTTTGTCTCCAGGGGAAAGGGCCACC CTCTCCTGCAGGGCCAGTCAGAATTTTGAC AGCAGCTCCTTAGCCTGGTACCAGCAGAAA CCTGGCCAGGCTCCCCGGCTCCTCATCTAT GGTGCATCCAGCAGGGCCACTGGCATCCCA GACAGGTTCAGTGGCAGTGGGTCTGGGACA GACTTCACTCTCACCATCAGCAGACTGGAG
102
Contida no clone Designação ID. DE SEQ. N°: Seqüência codificadora
CCTGAAGATTTTGCAATGTATTACTGTCAG CAGTGTGGTAGCTCACCGCTCACTTTCGGC GGAGGGACCAAGGTGGAAATCAAA
21H2 21B4 Vl9 93 GAAATTGTGTTGACGCAGTCTCCAGGCACC CTGTCTTTGTCTCCAGGGGAAAGAGCCACC CTCTCCTGCAGGGCCAGTCAGAGTGTTAGC AGTACCTACTTAGCCTGGCACCAGCAGAAA CCTGGCCAGGGTCTTAGGCTCCTCATCTAT GGTGCATCCAGCAGGGCCACTGGCATCCCA GACAGGTTCAGTGGCAGTGGGTCTGGGACA GACTTCACTCTTACCATCAGCAGACTGGAG CCTGAAGATTTTGCAGTGTATTACTGTCAG CAGTATGGAAGCTCATTCACTTTCGGCGGA GGGACCAGGGTGGAGATCAAA
18B11.1 VL10 94 GATATTGTGATGACTCAGTCTCCACTCTCC CTGCCCGTCACCCCTGGAGAGCCGGCCTCC ATCTCCTGCAGGTCTAGTCAGAGCCTCCTG TATTATAATGGATTCACCTATTTGGATTGG TTCCTGCAGAAGCCAGGGCAGTCTCCACAT CTCCTGATCTATTTGGGTTCTAATCGGGCC TCCGGGGTCCCTGACAGGTTCAGTGGCAGT GTTTCAGGCACAGATTTTACACTGAAAATC AGCAGAGTGGAGGCTGAGGATGTTGGGGTT TATTATTGCATGCAGTCTCTGCAAACTCCA TTCACTTTCGGCCCTGGGACCAAAGTGGAT ATCAAA
18B11.2 VL11 95 GAAATAGTGATGACGCAGTCTCCAGCCACC CTGTCTGTGTCTCCAGGGGAAAGAGCCACC
103
Contida no clone Designação ID. DE SEQ. N°: Seqüência codificadora
CTCTCCTGCAGGGCCAGTCAGAGTGTTAAC AGCAACTTAGCCTGGTACCAGCAGAAACCT GGCCAGGCTCCCAGGCTCCTCATTTATGGT GTATCCACCAGGGCCACTGGTATCCCAGCC AGGTTCAGTGGCAGTGGGTCTGGGACAGAG TTCACTCTCACCATCCGCAGCCTGCAGTCT GAAGATTTTGCAGTTTATTACTGTCAGCAG TATAATAACTGGCCTCCGACGTTCGGCCAA GGGACCAAGGTGGAAATCAAA
2 0D4 Vl12 96 GACATACAGCTGACCCAGTCTCCATCCTCC CTGTCTGCATCTATAGGAGACAGAGTCACC ATCACTTGCCGGGCAAGTCAGGACATTAGA TATGATTTAGGCTGGTATCAGCAGAAACCA GGGAAAGCCCCTAAGCGCCTGATCTATGCT GCATCCAGTTTGCAAAGTGGGGTCCCTTCA AGGTTCAGCGGCAGTGGATCTGGGACAGAA TTCACTCTCACAGTCAGCAGCCTGCAGCCT GAAGATTTTGCAACTTATTACTGTCTACAG CATAATAGTTACCCTCTCACTTTCGGCGGA GGGACCAAGGTGGAGATCGAA
46D11 Vl13 97 GACATCCAGATGACCCAGTCTCCCTCTTCC GTGTCTGCATCTGTAGGAGACAGAGTCACC ATCACTTGTCGGGCGAGTCAGGGTATTAGC ATCTGGTTAGCCTGGTATCAGCAGAAACCT GGGAAAGCCCCTAAACTCCTGATCTATGCT GCATCCAGTTTGCAAAGTGGGGTCCCATCA AGGTTCAGCGGCAGTGGATCTGGGACAGAT TTCACTCTCACCATCAGCAGCCTGCAGCCT
104
Contida no clone Designação ID. DE SEQ. N°: Seqüência codificadora
GAAGATTTTGCAACTTACTATTGTCAACAG GCTAACGATTTCCCGATCACCTTCGGCCAA GGGACACGACTGGAGATTAAA
40D2 Vl14 98 GATTTTGTGATGACCCAGACTCCACTCTCT CTGTCCGTCACCCCTGGACAGCCGGCCTCC ATCTCCTGCAAGTCTAGTCAGAGCCTCCTA CAGAGTGATGGAAAGACCTATTTGTATTGG TACCTGCAGAAGCCAGGCCAGCCTCCACAT CTCCTGATCTATGAAGTTTCCAACCGATTC TCTGGAGTGCCAGATAGGTTCAGTGGCAGC GGGTCAGGGACAGATTTCACACTGAAAATC AGCCGGGTGGAGGCTGAGGATGTTGGGGTT TATTACTGCATGCAAAGTATACAGCTTCCT CGGACGTTCGGCCAAGGGACCAAGGTGGAA ATCAAA
37D3 Vl15 99 GATATTGTGATGACTCAGTCTCCACTCTCC CTGCCCGTCACCCCTGGAGAGCCGGCCTCC ATCTCCTGCAGGTCTAGTCAGAGCCTCCTG CATAGTAATGGATACAACTTTTTGGATTGG TACCTACAGAAGCCAGGGCAGTCTCCACAG CTCCTGATCTATTTGGGTTCTGATCGGGCC TCCGGGGTCCCTGACAGGTTCAGTGGCAGT GGATCAGGCACAGAGTTTACACTGAAAATC AGCAGAGTGGAGGCTGAGGATGTTGGGCTT TATTACTGCATGCAAGCTCTACAAACTCCG TGCAGTTTTGGCCAGGGGACCAAGCTGGAG ATCAAA
39F7 Vl16 100 GAAATTGTGTTGACGCAGTCTCCAGGCACC
105
Contida no clone Designação ID. DE SEQ. N°: Seqüência codificadora
CTGTCTTTGTCTCCAGGGGAAAGAGCCACC CTCTCCTGCAGGGCCAGTCAGAGTGTTAGT AGCACCTATTTAGCCTGGTACCAGCAGAAA CCTGGCCAGGCTCCCAGGCTCCTCATCTAT GGTGCATCCAGCAGGGCCACTGGCATCCCA GACAGGTTCAGTGGCAGTGGGTCTGGGACA GACTTCACTCTCACCATCAGCAGACTGGAG CCTGAAGATTTTGCAGTTTATTACTGTCAG CAGTCTGGTAGCTCACCGCTCACTTTCGGC GGAGGGACCGAGGTGGAGATCAAA
39F11 Vl17 101 GAAATTGTGTTGACGCAGTCTCCAGGCACC CTGTCTTTGTCTCCAGGGGAAAGAGCCACC CTCTCCTGCAGGGCCAGTCAGAGTGTTAGC AGCACCTACTTAGCCTGGTACCAGCAGAAA CCTGGCCAGGCTCCCAGTCTCCTCATCTAT GGTGCATCCAGCAGGGCCACTGGCATCCCA GACAGGTTCAGTGGCAGTGGGTCTGGGACA GACTTCACTCTCACCATCAGCAGACTGGAG CCTGAGGATTTTGCAGTGTATTACTGTCAG CAGTCTGGTAGCTCACCTCTCACTTTCGGC GGAGGGACCAAGGTGGAGATCAAA
3 0G5 Vl18 102 GAAATTGTGTTGACGCAGTCTCCAGGCACC CTGTCTTTGTCTCCAGGGGAAAGAGCCACC CTCTCCTGCAGGGCCAGTCAGAGTGTTAGC AGCACCTACTTAGCCTGGTACCAGCAGAAA CCTGGCCAGGCTCCCAGGCTCCTCATCTAT GGTGCATCCTTCAGGGCCACTGGCATCCCA GACAGGTTCAGTGGCAGTGGGTCTGGGACA
106
Contida no clone Designação ID. DE SEQ. N°: Seqüência codificadora
GACTTCACTCTCACCATCAGCAGACTGGAG CCTGAGGATTTTGCAGTGTATTACTGTCAG CAGTCTGGTAGCTCACCTCTCACTTTCGGC GGAGGGACCAAGGTGGAGATCAAA
Tabela 2D - Seqüência codificadora para cadeias pesadas variáveis (VH) de anticorpo.
Contida no clone Designação ID. DE SEQ. N°: Seqüência codificadora
17C3 VH1 103 CAGGTCACCTTGAAGGAGTCTGGTCCTGTG CTGGTGAAACCCACAGAGACCCTCACGCTG ACCTGCACCGTCTCTGGGTTCTCACTCAGC AATGCTAGAATGGGTGTGAGCTGGATCCGT CAGCCCCCAGGGAAGGCCCTGGAGTGGCTT GCACACATTTTTTCGAATGACGAAAAATCC TACAGCACATCTCTGAAGAGCAGGCTCACC ATCTCCAAGGACACCTCCAAAAGCCAGGTG GTCCTTACCATGACCAACATGGACCCTGTG GACACAGCCACATATTACTGTGCACGGATA TTATTACTGGGAGCTTACTACTACTACGGT ATGGACGTCTGGGGCCAAGGGACCACGGTC ACCGTCTCCTCA
22H5 Vh2 104 CAGGTCACCTTGAAGGAGTCTGGTCCTGTG CTGGTGAAACCCACAGAGACCCTCACGCTG ACCTGCACCGTCTCTGGGTTCTCACTCAGC AATGCTAGAATGGGTGTGAGCTGGATCCGT CAGCCCCCAGGGAAGGCCCTGGAGTGGCTT GCACACATTTTTTCGAATGACGAAAAATCC TACAGCACATCTCTGAAGAGCAGGCTCACC
107
Contida no clone Designação ID. DE SEQ. N°: Seqüência codificadora
ATCTCCAAGGACACCTCCAAAAGCCAGGTG GTCCTTACCATGACCAACATGGACCCTGTG GACACAGCCACATATTACTGTGCACGGATA TTATTAGTGGGAGCTTACTACTACTGCGGT ATGGACGTCTGGGGCCAAGGGACCACGGTC ACCGTCTCCTCA
16H7 Vh3 105 CAGGTCACCTTGAAGGAGTCTGGTCCTGTG CTGGTGAAACCCACAGAGACCCTCACGCTG ACCTGCACCGTCTCTGGGTTCTCACTCAAC AATGCTAGAATGGGTGTGAGCTGGATCCGT CAGCCCCCAGGGAAGGCCCTGGAGTGGCTT GCACACATTTTTTCGAATGACGAAAAATCC TACAGCACATCTCTGAAGAGCAGGCTCACC ATCTCCAAGGACACCTCCAAAAGCCAGGTG GTCCTAATTATGACCAACATGGACCCTGTG GACACAGCCACATATTACTGTGCACGGTCA GTAGTAACTGGCGGCTACTACTACGACGGT ATGGACGTCTGGGGCCAAGGGACCACGGTC ACCGTCTCCTCA
24H11 Vh4 106 CAGGTCACCTTGAAGGAGTCTGGTCCTGTG CTGGTGAAACCCACAGAGACCCTCACGCTG ACCTGCACCGTCTCTGGGTTCTCACTCAGC AATGCTAGAATGGGTGTGAGCTGGATCCGT CAGCCCCCAGGGAAGGCCCTGGAGTGGCTT GCACACATTTTTTCGAATGACGAAAAATCC TACAGCACATCTCTGAAGAACAGGCTCACC ATCTCCAAGGACACCTCCAAAAGCCAGGTG GTCCTTATTATGACCAACATGGACCCTGTG
108
Contida no clone Designação ID. DE SEQ. N°: Seqüência codificadora
GACACAGCCACATATTACTGTGCACGGTCA GTAGTGACTGGCGGCTACTACTACGACGGT ATGGACGTCTGGGGCCAAGGGACCACGGTC ACCGTCTCCTCA
18G1 Vh5 107 GAGGTGCAGCTGTTGGAGTCTGGGGGAGGG TTGGTACAGCCGGGGGGGTCCCTGAGACTC TCCTGTGCAGCCTCTAGATTCACCTTTAGC ACCTATGCCATGAGCTGGGTCCGCCAGGCT CCAGGGAAGGGGCTGGAGTGGGTCTCAGGT ATTAGTGGTAGTGGTGTCAGCACACACTAC GCAGACTCCGTGAAGGGCCGGTTCACCATC TCCAGAGACAATTCCAAGAACACGCTGTAT CTGCAAATGAACAGCCTGAGAGCCGAGGAC ACGGCCGTATATTACTGTGCGAAATCCCTC ATTGTAGTAATAGTATATGCCCTTGACCAC TGGGGCCAGGGAACCCTGGTCACCGTCTCC TCA
17D8 Vh6 108 GAGGTGCAGCTGTTGGAGTCTGGGGGAGGG TTGGTACAGCCGGGGGGGTACCTGAGACTC TCCTGTGCAGCCTCTGGATTCACGTTTAGT ACCTATGCCATGAGCTGGGTCCGCCAGGCT CCAGGGAAGGGACTGGAGTGGGTCTCAGCT ATCAGTGGTAGTGGTGTTAGCACATACTAC GCAGACTCCGTGAAGGGCCGGTTCACCATC TCCAGAGACAATTCCAAGAACACGCTGTAT CTGCAAATGAACAGCCTGAGAGCCGAGGAC ACGGCCGTATATTACTGTGCGAAATCCCTT ATTGTAGTAATGGTGTATGTCCTTGACTAC
109
Contida no clone Designação ID. DE SEQ. N°: Seqüência codificadora
TGGGGCCAGGGAACCCTGGTCACCGTCTCC TCA
26H11 Vh7 109 GAGGTGCAGCTGTTGGAGTCTGGGGGAGGC TTGGTACAGCCGGGGGGGTACCTGAGACTC TCCTGTGCAGCCTCTGGATTCACGTTTAGC ACCTATGCCATGAGCTGGGTCCGCCAGGCT CCAGGGAAGGGACTGGAGTGGGTCTCAGCT ATTAGTGGCAGTGGTGTGAGCACAAACTAC GCAGACTCCGTGAAGGGCCGGTTCACCATC TCCAGAGACAATTCCAAGAACACGCTGTAT CTGCAAATGAACAGCCTGAGAGCCGAGGAC ACGGCCGTATATTACTGTGCGAAATCCCTT ATTGTAGTAATGGTGTATGTCCTTGACTAC TGGGGCCAGGGAACCCTGGTCACCGTCTCC TCA
12E4 12C11 Vh8 110 GAGGTGCAGCTGTTGGAGTCTGGGGGAGGG TTGGTACAGCCGGGGGGGTCCCTGAGACTC TCCTGTGCAGCCTCTAGATTCACCTTTAGC ACCTATGCCATGAGCTGGGTCCGCCAGGCT CCAGGGAAGGGGCTGGAGTGGGTCTCAGGT ATTAGTGGTAGTGGTGTTAGCACATACTAC GCAGACTCCGTGAAGGGCCGGTTCACCATC TCCAGAGACAATTCCAAGAACACGCTGTAT CTGCAAATGAACAGCCTGAGAGCCGAGGAC ACGGCCGTATATTACTGTGCGAAATCCCTT ATTGTAGTAATAGTATATGCCCTTGACTAC TGGGGCCAGGGAACCCTGGTCACCGTCTCC TCA
110
Contida no clone Designação ID. DE SEQ. N°: Seqüência codificadora
21H2 Vh9 111 CAGGTGCAGCTGCAGGAGTCGGGCCCAGGA CTGGTGAAGCCTTCGGAGACCCTGTCCCTC ACCTGCACTGTCTCTGGTGGCTCCATCAGT AGTTACTACTGGAGCTGGATCCGGCAGCCC GCCGGGAAGGGACTGGAGTGGATTGGGCGT ATCTATACCAGTGGGAGCACCAACTACAAC CCCTCCCTCAAGAGTCGGGTCACCATGTCA AAAGACACGTCCAAGAACCAGTTCTCCCTG AAGCTGAGGTCTGTGACCGCCGCGGACACG GCCGTGTATTACTGTGCGAGAGATCCGGAC GGTGACTACTACTACTACGGTATGGACGTC TGGGGCCAAGGGACCTCGGTCACCGTCTCC TCA
21B4 Vh10 112 CAGGTGCAGCTGCAGGAGTCGGGCCCAGGA CTGGTGAAGCCTTCGGAGACCCTGTCCCTC ACCTGCACTGTCTCTGGTGGCTCCATCAGT AGTTACTTCTGGAGCTGGATCCGGCAGCCC GCCGGGAAGGGACTGGAGTGGATTGGGCGT ATCTATACCAGTGGGAGCACCAACTACAAC CCCTCCCTCAAGAGTCGAGTCACCATGTCA ATAGACACGTCCAAGAACCAGTTCTCCCTG AAGCTGAGTTCTGTGACCGCCGCGGACACG GCCGTGTATTACTGTGCGAGAGATCCGGAC GGTGACTACTACTACTACGGTATGGACGTC TGGGGCCAAGGGACCACGGTCACCGTCTCC TCA
18B11.1 18B11.2 Vh11 113 GAGGTGCAGCTGGTGGAGTCTGGGGGAGGC TTGGTAAAGCCTGGGGGGTCCCTTAGACTC
Ill
Contida no clone Designação ID. DE SEQ. N°: Seqüência codificadora
TCCTGTGCAGCCTCTGGATTCACTTTCAGT GACGCCTGGATGAGCTGGGTCCGCCAGGCT CCAGGGAAGGGGCTGGAGTGGGTTGGCCGT attaaaagcaaaactgatggtgggacaaca GACTACGCTGCACCCGTGAAAGGCAGATTC ACCATCTCAAGAGATGATTCAAAAAACACT CTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGAAAACC GAGGACACAGCCGTGTATTTTTGTACCTCT ACGTATAGCAGTGGCTGGTACGTATGGGAC TACTACGGTATGGACGTCTGGGGCCAAGGG ACCACGGTCACCGTCTCCTCA
2 0D4 Vh12 114 CAGGTCCAGCTGGTACAGTCTGGGGCTGAG GTGAAGAAGCCTGGGGCCTCAGTGAAGGTC TCCTGCAAGGTTTCGGGATACACCCTCACT GATTTATCCATGCACTGGGTGCGACAGGCT CCTGGAAAAGGGCTTGAGTGGATGGGAGGT TTTGATCCTGAAGATGGTGAAACAATCTAC GCACAGAAGTTCCAGGGCAGAATCACCATG ACCGAGGACACATCTACAGACACAGCCTAC ATGGAGCTGAGCAGCCTGAGATCTGAGGAC ACGGCCGTGTATTACTGTGCAAGTATTGTA GTAGTCCCAGCTGCTATACAGAGTTACTAC TACTACTACGGTATGGGCGTCTGGGGCCAA GGGACCACGGTCACCGTCTCCTCC
46D11 Vh13 115 CAGGTCACCTTGAAGGAGGCTGGTCCTGTG TTGGTGAAACCCACAGAGACCCTCACGTTG ACCTGCACCGTCTCTGGGTTCTCACTCAGC AATGCTAGAATGGGTGTGAACTGGATCCGT
112
Contida no clone Designação ID. DE SEQ. N°: Seqüência codificadora
CAGCCCCCAGGGAAGGCCCTGGAGTGGCTT GCACACATTTTTTCGAATGACGAAAAATCC TACAGCACATCTCTGAAGAGCAGGCTCACC ATCTCCAAGGACACCTCCAAAAGCCAGGTG GTCCTTACCATGACCAACATGGACCCTGTG GACACAGCCACATATTACTGTGCACGGGTT CGTATAGCAGGTGATTACTACTACTACTAC GGTATGGACGTCTGGGGCCAAGGGACCACG GTCACCGTCTCCTCA
4 0D2 Vh14 116 CAGGTGCAGCTGCAGGAGTCGGGCCCAGGA CTGGTGAAGCCTTCACAGACCCTGTCCCTC ACCTGCACTGTCTCTGGTGGCTCCATCAGC AGTGGTGGTTACAACTGGAGCTGGATCCGC CAGCACCCAGGGAAGGGCCTGGAGTGGATT GGGAACATCTATTACAGTGGGAGCACCTAC TACAACCCGTCCCTCAAGAGTCGAGTTACC ATATCAGTAGACACGTCTAAGAACCAGTTC TCCCTGAAGCTGAGATCTGTGACTGCCGCG GACACGGCCGTGTATTACTGTGCGAGAGAG AATATTGTAGTAATACCAGCTGCTATATTC GCGGGTTGGTTCGACCCCTGGGGCCAGGGA ACCCTGGTCACCGTCTCCTCA
37D3 Vh15 117 GAGGTGCACCTGGTGGAGTCTGGGGGAGGC TTGGCAAAGCCTGGGGGGTCCCTTAGACTC TCCTGTGCAGCCTCTGGATTCACTTTCAGA AACGCCTGGATGAGCTGGGTCCGCCAGGCT CCAGGAAAGGGGCTGGAATGGGTTGGCCGT ATTAAAAGCAAAACTGATGGTGGGACAACA
113
Contida no clone Designação ID. DE SEQ. N°: Seqüência codificadora
GACTACGCTGCACCCGTGAAAGGCAGATTC ACCATCTCGAGAGATGATTCAAAAAACACG CTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGAAAACC GAGGACACAGCCGAGTATTACTGTATCACA GATCGGGTGCTAAGCTACTACGCTATGGCC GTCTGGGGCCAAGGGACCACGGTCACCGTC TCCTCA
39F7 Vh16 118 CAGGTGCAGCTGGTGGAGTCTGGGGGAGGC GTGGTCCAGCCTGGGAGGTCCCTGAGACTC TCCTGTGCAGCGTCTGGATTCACCTTCAGT AACTATGGCATTCACTGGGTCCGCCAGGCT CCAGGCAAGGGGCTGGAGTGGGTGGCAGTT ATATGGTATGATGGAAGTATTAAATACTAT GCAGACTCCGTGAAGGGCCGATTCACCATC TCCAGAGACAATTCCAAGAACACGCTGTAT CTGCAAATGAACAGCCTGAGAGCCGAGGAC ACGGCTGTGTATTACTGTGCGAGAGATAGG GCAGCAGCTGGTCTCCACTACTACTACGGT ATGGACGTCTGGGGCCAAGGGACCACGGTC ACCGTCTCCTCA
39F11 Vh17 119 CAGGTGCAGCTGGTGGAGTCTGGGGGAGGC GTGGTCCAGCCTGGGAGGTCCCTGAGACTC TCCTGTGCAGCGTCTGGATTCACCTTCAGT AGCTATGGCATCCACTGGGTCCGCCAGGCT CCAGGCAAGGGGCTGGAATGGGTGGCAGTT ATATGGTATGATGGAAGTGATAAATACTAT GCAGACTCCGTGAAGGGCCGATTCACCATC TCCAGAGACAATTCCAAGAACACGCTGTAT
114
Contida no clone Designação ID. DE SEQ. N°: Seqüência codificadora
CTACAAATGAACAGCCTGAGAGCCGAGGAC ACGGCTGTGTATTACTGTGCGAGAGATAGG GCAGCAGCTGGTCTCCACTATTATTACGGT ATGGACGTCTGGGGCCAAGGGACCACGGTC ACCGTCTCCTCA
39G5 Vh18 120 CAGGTGCAGCTGGTGGAGTCTGGGGGAGGC GTGGTCCAGCCTGGGAGGTCCCTGAGACTC TCCTGTGCAGTGTCTGGATTCACCTTCAGT AGCTATGGCATCCACTGGGTCCGCCAGGCT CCAGGCAAGGGGCTGGAATGGGTGGCAGTT ATATGGTATGATGGAAGTGATAAATACTAT GGAGACTCCGTGAAGGGCCGATTCACCATC TCCAGAGACAATTCCAAGAACACGCTGTAT CTACAAATGAACAGCCTGAGAGCCGAGGAC ACGGCTGTGTATTACTGTGCGAGAGATAGG GCAGCAGCTGGTCTCCACTATTATTACGGT ATGGACGTCTGGGGCCAAGGGACCACGGTC ACCGTCTCCTCA
Cada uma das regiões variáveis da cadeia pesada listadas na Tabela 2B pode ser combinada com qualquer uma das regiões variáveis da cadeia leve mostradas na Tabela 2A para formar uma proteína de ligação de antígeno. Exemplos dessas combinações incluem VH1 combinada com qualquer uma de VL1, Vl2, Vl3 , VL4, VL5, VL6, VL7, VL8, VL9, VL10, VL11,
Vl12, Vl13, Vl14, Vl15, Vl16, Vl17 ou Vl18; Vh2 combinada com qualquer uma de VL1, VL2, VL3, VL4, VL5, VL6, VL7, VL8,V
VL10, VL11, Vl12, Vl13, Vl14 , VL15, VL16, VL17 ou VL18;V combinada com qualquer uma de VL1, VL2, VL3, VL4, VL5,V
115
Vl7, Vl8 , Vl9, Vl10, Vl11, Vl12, Vl13 , VL14, VL15, VL16, VL17 ou Vl18; e assim por diante.
Em alguns casos, a proteína de ligação de antígeno inclui pelo menos uma região variável da cadeia pesada e/ou uma região variável da cadeia leve daquelas listadas nas Tabelas 2A e 2B. Em alguns casos, a proteína de ligação de antígeno inclui pelo menos duas regiões variáveis da cadeia pesada e/ou regiões variáveis da cadeia leve diferentes daquelas listadas na Tabela 2B. Um exemplo de uma proteína de ligação de antígeno desse tipo compreende (a) uma VH1, e (b) uma de VH2, Vh3 , VH4, VHS, VH6, VH7, VH8, VH9, VH10, VH11, Vh12, Vh13, Vh14, Vh15, Vh16, Vh17 ou Vh18 . Outro exemplo compreende (a) uma VH2, e (b) uma de VH1, VH3, VH4, VHS, VH6, Vh7, Vh8, Vh9, Vh10, Vh11, Vh12, Vh13 , VH14, VH15, VH16, VH17 ou Vh18. Novamente, outro exemplo compreende (a) uma Vh3 , e (b) uma de VH1, VH2, VH4, VH5, VH6, VH7, VH8, VH9, VH10, VH11, Vh12, Vh13, Vh14, Vh15 Vh16, Vh17 ou Vh18 etc.
Novamente, outro exemplo de uma proteína de ligação de antígeno desse tipo compreende (a) uma VL1, e (b) uma de Vl2, Vl3, Vl4, Vl5, Vl6, Vl7 , VL8, VL9, VL10, VL11, VL12, VL13, Vl14, Vl15, Vl16, Vl17 ou Vl18. Novamente, outro exemplo de uma proteína de ligação de antígeno desse tipo compreende (a) uma VL2, e (b) uma de VL1, VL3, VL4, VL5, VL6, VL7, VL8, Vl9, Vl10, Vl11 ou Vl12. Novamente, outro exemplo de uma proteína de ligação de antígeno desse tipo compreende (a) uma VL3, e (b) uma de VL1, VL2, VL4, VL5, VL6, VL7, VL8, VL9, VL10, VL11, Vl12, Vl13, Vl14 , VL15, VL16, VL17 ou VL18 etc.
As várias combinações de regiões variáveis da cadeia pesada podem ser combinadas com qualquer uma das várias combinações de regiões variáveis da cadeia leve.
116
Em outras modalidades, uma proteína de ligação de antígeno compreende duas regiões variáveis da cadeia leve idênticas e/ou duas regiões variáveis da cadeia pesada idênticas. Como exemplo, a proteína de ligação de antígeno pode ser um anticorpo ou fragmento imunologicamente funcional deste que inclui duas regiões variáveis da cadeia leve e duas regiões variáveis da cadeia pesada em combinações de pares de regiões variáveis da cadeia leve e pares de regiões variáveis da cadeia pesada como listadas nas Tabelas 2A e 2B.
Algumas proteínas de ligação de antígeno que são fornecidas compreendem um domínio variável da cadeia pesada que compreende uma seqüência de aminoácidos que difere da seqüência de um domínio variável da cadeia pesada selecionada de VH1, VH2, VH3, VH4, VH5, VH6, VH7, VH8, VH9, VH10, Vh11, Vh12, Vh13, Vh14 , VH15, VH16, VH17 e VH18 em apenas 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 ou 15 resíduos de aminoácidos, em que cada uma dessas diferenças de seqüência é independentemente uma deleção, inserção ou substituição de um aminoácido, com as deleções, inserções e/ou substituições resultando em no máximo 15 alterações de aminoácidos em relação às seqüências do domínio variável citadas anteriormente. A região variável da cadeia pesada, em algumas proteínas de ligação de antígeno, compreende uma seqüência de aminoácidos que possui pelo menos 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97% ou 99% de identidade de seqüência para as seqüências de aminoácidos da região variável da cadeia pesada de VH1, VH2, VH3, VH4, VHS, VH6, VH7, VH8, VH9, VH10, VH11, VH12, Vh13, Vh14, VH15, VH16, VH17 e VH18.
117
Certas proteínas de ligação de antígeno compreendem um domínio variável da cadeia leve que compreende uma seqüência de aminoácidos que difere da seqüência de um domínio variável da cadeia leve selecionada de VL1, VL2, Vl3, Vl4 , VL5, Vl6, Vl7, Vl8 , VL9, VL10, VL11, VL12, VL13, Vl14, Vl15, Vl16, Vl17 e VL18 em apenas 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 ou 15 resíduos de aminoácidos, em que cada uma dessas diferenças de seqüência é independentemente uma deleção, inserção ou substituição de um aminoácido, com as deleções, inserções e/ou substituições resultando em no máximo 15 alterações de aminoácidos em relação às seqüências do domínio variável citadas anteriormente. A região variável da cadeia leve em algumas proteínas de ligação de antígeno compreende uma seqüência de aminoácidos que possui pelo menos 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97% ou 99% de identidade de seqüência para as seqüências de aminoácidos da região variável da cadeia leve de VL1, VL2, VL3, VL4, VL5, VL6, VL7, VL8, VL9, VL10, VL11, Vl12, Vl13, Vl14, VL15, VL16, VL17 ou VL18.
Em casos adicionais, as proteínas de ligação de antígeno compreendem os seguintes pareamentos de domínios variáveis de cadeia leve e de cadeia pesada: VL1 com VH1, Vl2 com Vh2 , Vl2 com VH3, VL3 com VH4, VL4 com VH5, VL5 com
VH6 , Vl6 com Vh7 , VL7 com VH8, VL8 com VH8, VL9 com VH9,V com VH10, Vl10 com VH11, VL11 com VH11, VL12 com VH12,V com Vh13, Vl14 com VH14, VL15 com VH15, VL16 com VH16,V com Vh17, e Vl18 com VH18. Em alguns casos, as proteínas de ligação de antígeno nos pareamentos acima podem compreender seqüências de aminoácidos que possuem 70%, 75%, 80%, 85%,
118
90%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade de seqüência com os domínios variáveis especificados.
Ainda outras proteínas de ligação de antígeno, por exemplo, anticorpos ou fragmentos imunologicamente funcionais, incluem formas variantes de uma cadeia pesada variante e uma cadeia leve variante como descrito acima.
CDRs de proteína de ligação de antígeno
Em várias modalidades, as proteínas de ligação de antígeno aqui reveladas podem compreender polipeptídeos nos quais uma ou mais CDRs são enxertadas, inseridas e/ou unidas. Uma proteína de ligação de antígeno pode ter 1, 2, 3, 4, 5 ou 6 CDRs. Dessa forma, uma proteína de ligação de antígeno pode ter, por exemplo, uma CDR1 de cadeia pesada (CDRH1) e/ou uma CDR2 de cadeia pesada (CDRH2) e/ou uma CDR3 de cadeia pesada (CDRH3) e/ou uma CDR1 de cadeia leve (CDRL1) e/ou uma CDR2 de cadeia leve (CDRL2) e/ou uma CDR3 de cadeia leve (CDRL3). Algumas proteínas de ligação de antígeno incluem tanto uma CDRH3 quanto uma CDRL3. CDRs de cadeia pesada e leve específicas são identificadas nas Tabelas 3A e 3B, respectivamente, e na Tabela 6C, infra.
As regiões determinantes de complementaridade (CDRs) e as regiões framework (FR) de certo anticorpo podem ser identificadas com o uso do sistema descrito por Kabat e cols., em Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5a Edição, US Dept. of Health and Human Services, PHS, NIH, Publicação NIH N° 91-3.242, 1991. Como desejado, as CDRs também podem ser redefinidas de acordo com um esquema de nomenclatura alternativo, por exemplo, aquele de Chothia (veja Chothia e Lesk, 1987, J. Mol. Biol.
119
196: 901-917; Chothia e cols., 1989, Nature 342: 878-883 ou Honegger e Pluckthun, 2001, J. Mol. Biol. 309: 657-670).
Certos anticorpos que são aqui revelados compreendem uma ou mais seqüências de aminoácidos que são idênticas ou possuem 5 identidade de seqüência substancial para as seqüências de aminoácidos de uma ou mais das CDRs apresentadas na Tabela 3A (CDRHs) e na Tabela 3B (CDRLs) e na Tabela 6C, infra.
Tabela 3A - Seqüências de CDRH exemplares.
Clone ID. DE SEQ. N°: Contida na referência Designação Seqüência
2 0D4 121 Vh12 CDRH1-1 DLSMH
17C3 22H5 16H7 24H11 122 VH1 Vh2 Vh3 Vh4 CDRH1-2 NARMGVS
18B11.1 18B11.2 123 Vh11 Vh11 CDRH1-3 DAWMS
18G1 Vh5
12C11 Vh8
12E4 124 Vh8 CDRH1-4 TYAMS
17D8 Vh6
26H11 Vh7
21B4 125 Vh10 CDRH1-5 SYFWS
46D11 126 Vh13 CDRH1-6 NARMGVN
37D3 127 Vh15 CDRH1-7 NAWMS
39F11 3 9G5 128 Vh17 Vh18 CDRH1-8 SYGIH
39F7 129 Vh16 CDRH1-9 NYGIH
120
Clone ID. DE SEQ. N°: Contida na referência Designação Seqüência
40D2 130 Vh14 CDRHl-10 SGGYNWS
21H2 131 Vh9 CDRH1-11 SYYWS
20D4 132 Vh12 CDRH2-I GFDPEDGETIYAQKFQG
17C3 22H5 16H7 46D11 133 Vh1 Vh2 Vh3 Vh13 CDRH2-2 HIFSNDEKSYSTSLKS
24H11 134 Vh4 CDRH2-3 HIFSNDEKSYSTSLKN
18B11.1 18B11.2 37D3 135 vhii VHll Vh15 CDRH2-4 RIKSKTDGGTTDYAAPVKG
18G1 136 Vh5 CDRH2-5 GISGSGVSTHYADSVKG
12C11 12E4 137 Vh8 Vh8 CDRH2-6 GISGSGVSTYYADSVKG
17D8 138 Vh6 CDRH2-7 AISGSGVSTYYADSVKG
26H11 139 Vh7 CDRH2- 8 AISGSGVSTNYADSVKG
21B4 21H2 140 Vh10 Vh9 CDRH2- 9 RIYTSGSTNYNPSLKS
39F11 141 Vh17 CDRH2-10 VIWYDGSDKYYADSVKG
39F7 142 Vh16 CDRH2-11 VIWYDGSIKYYADSVKG
3 9G5 143 Vh18 CDRH2-12 VIWYDGSDKYYGDSVKG
4 0D2 144 Vh14 CDRH2-13 NIYYSGSTYYNPSLKS
2 0D4 145 Vh12 CDRH3-1 IVWPAAIQSYYYYYGMGV
17C3 146 Vh1 CDRH3-2 ILLLGAYYYYGMDV
22H5 147 Vh2 CDRH3-3 ILLVGAYYYCGMDV
121
Clone ID. DE SEQ. N°: Contida na referência Designação Seqüência
16H7 24H11 148 Vh3 Vh4 CDRH3-4 SWTGGYYYDGMDV
18B11.1 18B11.2 149 vhii VH11 CDRH3-5 TYS SGWYVWDYYGMDV
18G1 150 Vh5 CDRH3- 6 SLIWIVYALDH
12C11 12E4 151 Vh8 Vh8 CDRH3- 7 SLIWIVYALDY
17D8 26H11 152 Vh6 Vh7 CDRH3- 8 SLIVVMVYVLDY
21B4 21H2 153 VH10 Vh9 CDRH3- 9 DPDGDYYYYGMDV
46D11 154 Vh13 CDRH3-10 VRIAGDYYYYYGMDV
3 7D3 155 Vh15 CDRH3-11 DRVLSYYAMAV
39F11 Vh17
39F7 156 Vh16 CDRH3-12 DRAAAGLHYYYGMDV
39G5 Vh18
4 0D2 157 Vh14 CDRH3-13 ENIWIPAAIFAGWFDP
Tabela 3B - Seqüências de CDRL exemplares.
Clone ID. DE SEQ. N°: Contida na referência Designação Seqüência
20D4 158 Vl12 CDRL1-1 RASQDIRYDLG
18B11.1 159 VL10 CDRL1-2 RSSQSLLYYNGFTYLD
12C11 160 Vl8 CDRL1-3 RASQNFDSSSLA
18G1 161 Vl4 CDRL1-4 RASQNFDSSYLA
17D8 26H11 162 Vl5 Vl6 CDRL1-5 RASQSVSGNYLA
122
Clone ID. DE SEQ. N°: Contida na referência Designação Seqüência
21B4 Vl9
21H2 Vl9
39F7 163 Vl16 CDRL1-6 RASQSVSSTYLA
39F11 Vl17
3 9G5 Vl18
12E4 164 Vl7 CDRL1-7 RASQNFDSNYLA
18B11.2 165 VL11 CDRL1-8 RASQSVNSNLA
16H7 24H11 166 Vl3 Vl3 CDRL1-9 GGNNIGSESVH
22H5 17C3 167 Vl2 VL1 CDRL1-10 GGNNIGSQSVH
46D11 168 Vl13 CDRL1-11 RASQGISIWLA
4 0D2 169 Vl14 CDRL1-12 KSSQSLLQSDGKTYLY
3 7D3 170 Vl15 CDRL1-13 RSSQSLLHSNGYNFLD
2 0D4 46D11 171 Vl12 Vl13 CDRL2-1 AASSLQS
18B11.1 172 VL10 CDRL2-2 LGSNRAS
12C11 Vl8
17D8 Vl5
21B4 Vl9
21H2 26H11 173 Vl9 Vl6 CDRL2-3 GASSRAT
12E4 Vl7
39F7 Vl16
39F11 Vl17
18G1 174 Vl4 CDRL2-4 GTSSRAT
18B11.2 175 VL11 CDRL2-5 GVSTRAT
123
Clone ID. DE SEQ. N°: Contida na referência Designação Seqüência
16H7 Vl3
24H11 22H5 176 Vl3 Vl2 CDRL2-6 DDSDRPS
17C3 VL1
40D2 177 Vl14 CDRL2- 7 EVSNRFS
37D3 178 Vl15 CDRL2- 8 LGSDRAS
39G5 179 Vl18 CDRL2- 9 GASFRAT
2 0D4 180 Vl12 CDRL3-1 LQHNSYPLT
18B11.1 181 VL10 CDRL3-2 MQSLQTPFT
12C11 182 Vl8 CDRL3-3 QQCGSSPLT
18G1 183 Vl4 CDRL3-4 QQYGGSPLT
17D8 184 Vl5 CDRL3-5 QQYGSAPLT
21B4 21H2 185 Vl9 Vl9 CDRL3- 6 QQYGSSFT
26H11 12E4 186 Vl6 Vl7 CDRL3-7 QQYGSSPLT
18B11.2 187 VL11 CDRL3- 8 QQYNNWPPT
16H7 24H11 188 Vl3 Vl3 CDRL3- 9 QVWDGNSDHW
22H5 189 Vl2 CDRL3-10 QVWDNTSDHW
17C3 190 VL1 CDRL3-11 QVWDSSSDHW
46D11 191 Vl13 CDRL3-12 QQANDFPIT
4 0D2 192 Vl14 CDRL3-13 MQSIQLPRT
37D3 193 Vl15 CDRL3-14 MQALQTPCS
39F7 Vl16
39F11 194 Vl17 CDRL3-15 QQSGSSPLT
3 9G5 Vl18
Tabela 3C - Seqüências codificadoras para CDRHs
124
Clone ID. DE SEQ. N° : Contida na referenda Designação Seqüência
2 0D4 195 Vh12 CDRH1-1 GATTTATCCATGCAC
17C3 22H5 16H7 24H11 196 Vh1 Vh2 Vh3 Vh4 CDRH1-2 AATGCTAGAATGGGTGTGAG C
18B11.1 18B11.2 197 VHll Vh11 CDRH1-3 GACGCCTGGATGAGC
18G1 12C11 12E4 17D8 26H11 198 Vh5 Vh8 Vh8 Vh6 Vh7 CDRH1-4 ACCTATGCCATGAGC
21B4 21H2 199 Vh10 Vh9 CDRH1-5 AGTTACTTCTGGAGC
46D11 200 Vh13 CDRH1-6 AATGCTAGAATGGGTGTGAA C
37D3 201 Vh15 CDRH1-7 AACGCCTGGATGAGC
39F11 3 9G5 202 Vh17 Vh18 CDRH1-8 AGCTATGGCATCCAC
39F7 203 Vh16 CDRH1-9 AACTATGGCATTCAC
4 0D2 204 Vh14 CDRH1-10 AGTGGTGGTTACAACTGGAG C
2 0D4 205 Vh12 CDRH2-1 GGTTTTGATCCTGAAGATGG TGAAACAATCTACGCACAGA AGTTCCAGGGC
125
Clone ID. DE SEQ. N° : Contida na referência Designação Seqüência
17C3 22H5 16H7 46D11 206 VH1 Vh2 Vh3 Vh13 CDRH2-2 CACATTTTTTCGAATGACGA AAAATCCTACAGCACATCTC TGAAGAGC
24H11 207 Vh4 CDRH2-3 CACATTTTTTCGAATGACGA AAAATCCTACAGCACATCTC TGAAGAAC
18B11.1 18B11.2 37D3 208 Vh11 Vh11 Vh15 CDRH2-4 CGTATTAAAAGCAAAACTGA TGGTGGGACAACAGACTACG CTGCACCCGTGAAAGGC
18G1 209 Vh5 CDRH2-5 GGTATTAGTGGTAGTGGTGT CAGCACACACTACGCAGACT CCGTGAAGGGC
12C11 12E4 210 Vh8 Vh8 CDRH2- 6 GGTATTAGTGGTAGTGGTGT TAGCACATACTACGCAGACT CCGTGAAGGGC
17D8 211 Vh6 CDRH2-7 GCTATCAGTGGTAGTGGTGT TAGCACATACTACGCAGACT CCGTGAAGGGC
26H11 212 Vh7 CDRH2- 8 GCTATTAGTGGCAGTGGTGT GAGCACAAACTACGCAGACT CCGTGAAGGGC
126
Clone ID. DE SEQ. N° : Contida na referência Designação Seqüência
21B4 21H2 213 VH10 Vh9 CDRH2- 9 CGTATCTATACCAGTGGGAG CACCAACTACAACCCCTCCC TCAAGAGT
39F11 214 Vh17 CDRH2-10 GTTATATGGTATGATGGAAG TGATAAATACTATGCAGACT CCGTGAAGGGC
39F7 215 Vh16 CDRH2-11 GTTATATGGTATGATGGAAG TATTAAATACTATGCAGACT CCGTGAAGGGC
3 9G5 216 Vh18 CDRH2-12 GTTATATGGTATGATGGAAG TGATAAATACTATGGAGACT CCGTGAAGGGC
40D2 217 Vh14 CDRH2-13 AACATCTATTACAGTGGGAG CACCTACTACAACCCGTCCC TCAAGAGT
20D4 218 Vh12 CDRH3-1 ATTGTAGTAGTCCCAGCTGC TATACAGAGTTACTACTACT ACTACGGTATGGGCGTC
17C3 219 Vh1 CDRH3-2 ATATTATTACTGGGAGCTTA CTACTACTACGGTATGGACG TC
22H5 220 Vh2 CDRH3-3 ATATTATTAGTGGGAGCTTA CTACTACTGCGGTATGGACG TC
16H7 221 Vh3 CDRH3-4 TCAGTAGTAACTGGCGGCTA
127
Clone ID. DE SEQ. N° : Contida na referência Designação Seqüência
24H11 Vh4 CTACTACGACGGTATGGACG TC
18B11.1 18B11.2 222 Vh11 vhii CDRH3-5 ACGTATAGCAGTGGCTGGTA CGTATGGGACTACTACGGTA TGGACGTC
18G1 223 Vh5 CDRH3-6 TCCCTCATTGTAGTAATAGT ATATGCCCTTGACCAC
12C11 12E4 224 Vh8 Vh8 CDRH3-7 TCCCTTATTGTAGTAATAGT ATATGCCCTTGACTAC
17D8 26H11 225 Vh6 Vh7 CDRH3- 8 TCCCTTATTGTAGTAATGGT GTATGTCCTTGACTAC
21B4 21H2 226 Vh10 Vh9 CDRH3- 9 GATCCGGACGGTGACTACTA CTACTACGGTATGGACGTC
46D11 227 Vh13 CDRH3-10 GTTCGTATAGCAGGTGATTA CTACTACTACTACGGTATGG ACGTC
3 7D3 228 Vh15 CDRH3-11 GATCGGGTGCTAAGCTACTA CGCTATGGCCGTC
39F11 39F7 3 9G5 229 Vh17 Vh16 Vh18 CDRH3-12 GATAGGGCAGCAGCTGGTCT CCACTATTATTACGGTATGG ACGTC
4 0D2 230 Vh14 CDRH3-13 GAGAATATTGTAGTAATACC AGCTGCTATATTCGCGGGTT GGTTCGACCCC
Tabela 3D - Seqüências codificadoras para CDRLs.
128
Clone ID. DE SEQ. N° : Contida na referência Designação Seqüência
2 0D4 231 Vl12 CDRL1-1 CGGGCAAGTCAGGACATTAGAT ATGATTTAGGC
18B11.1 232 VL10 CDRL1-2 AGGTCTAGTCAGAGCCTCCTGT ATTATAATGGATTCACCTATTT GGAT
12C11 233 Vl8 CDRL1-3 AGGGCCAGTCAGAATTTTGACA GCAGCTCCTTAGCC
18G1 234 Vl4 CDRL1-4 AGGGCCAGTCAGAATTTTGACA GCAGTTACTTAGCC
17D8 26H11 235 Vl5 Vl6 CDRL1-5 AGGGCCAGTCAGAGTGTTAGCG GCAACTACTTGGCC
21B4 21H2 39F7 39F11 3 9G5 236 Vl9 Vl9 Vl16 Vl17 Vl18 CDRL1-6 AGGGCCAGTCAGAGTGTGAGCA GTACCTACTTAGCC
12E4 237 Vl7 CDRL1-7 AGGGCCAGTCAGAATTTCGACA GCAACTACTTAGCC
18B11.2 238 VL11 CDRL1-8 AGGGCCAGTCAGAGTGTTAACA GCAACTTAGCC
16H7 24H11 239 Vl3 Vl3 CDRL1-9 GGGGGAAACAACATTGGAAGTG AAAGTGTGCAC
22H5 17C3 240 Vl2 VL1 CDRL1-10 GGGGGAAACAACATTGGAAGTG AAAGTGTGCAC
46D11 241 Vl13 CDRL1-11 CGGGCGAGTCAGGGTATTAGCA
129
Clone ID. DE SEQ. N° : Contida na referência Designação Seqüência
TCTGGTTAGCC
AAGTCTAGTCAGAGCCTCCTAC
4 0D2 242 VL14 CDRLl-12 AGAGTGATGGAAAGACCTATTT
GTAT
AGGTCTAGTCAGAGCCTCCTGC
3 7D3 243 Vl15 CDRLl-13 ATAGTAATGGATACAACTTTTT
GGAT
2 0D4 244 Vl12 CDRL2-1 GCTGCATCCAGTTTGCAAAGT
46D11 Vl13
18B11.1 245 VL10 CDRL2-2 TTGGGTTCTAATCGGGCCTCC
12C11 Vl8
17D8 Vl5
21B4 Vl9
21H2 246 Vl9 CDRL2- 3 GGTGCATCCAGCAGGGCCACT
26H11 Vl6
12E4 Vl7
39F7 Vl16
39F11 Vl17
18G1 247 Vl4 CDRL2-4 GGTACATCCAGCAGGGCCACT
18B11.2 248 VLll CDRL2-5 GGTGTATCCACCAGGGCCACT
16H7 VL3
24H11 249 Vl3 CDRL2- 6 GATGATAGCGACCGGCCCTCA
22H5 Vl2
17C3 VLl
40D2 250 Vl14 CDRL2-7 GAAGTTTCCAACCGATTCTCT
37D3 251 Vl15 CDRL2- 8 TTGGGTTCTGATCGGGCCTCC
130
Clone ID. DE SEQ. N° : Contida na referência Designação Seqüência
2 0D4 252 VL12 CDRL3-1 CTACAGCATAATAGTTACCCTC TCACT
18B11.1 253 VL10 CDRL3-2 ATGCAGTCTCTGCAAACTCCAT TCACT
12C11 254 Vl8 CDRL3-3 CAGCAGTGTGGTAGCTCACCGC TCACT
18G1 255 Vl4 CDRL3-4 CAGCAGTATGGTGGCTCACCGC TCACT
17D8 256 Vl5 CDRL3- 5 CAGCAGTATGGTAGCGCACCGC TCACT
21B4 21H2 257 Vl9 Vl9 CDRL3-6 CAGCAGTATGGAAGTTCATTCA CT
26H11 12E4 258 Vl6 Vl7 CDRL3-7 CAGCAGTATGGTAGCTCACCGC TCACT
18B11.2 259 VL11 CDRL3- 8 CAGCAGTATAATAACTGGCCTC CGACG
16H7 24H11 260 Vl3 Vl3 CDRL3- 9 CAGGTGTGGGATGGTAATAGTG ATCATGTGGTA
22H5 261 Vl2 CDRL3-10 CAGGTGTGGGATAATACTAGTG ATCATGTGGTA
17C3 262 VL1 CDRL3-11 CAGGTGTGGGATAGTAGTAGTG ATCATGTGGTA
46D11 263 VL13 CDRL3-12 CAACAGGCTAACGATTTCCCGA TCACC
40D2 264 Vl14 CDRL3-13 ATGCAAAGTATACAGCTTCCTC GGACG
131
Clone ID. DE SEQ. N° : Contida na referência Designação Seqüência
3 7D3 265 Vl15 CDRL3-14 ATGCAAGCTCTACAAACTCCGT GCAGT
39F7 39F11 3 9G5 266 Vl16 Vl17 Vl18 CDRL3-15 CAGCAGTCTGGTAGCTCACCTC TCACT
A estrutura e as propriedades de CDRs dentro de urn anticorpo de ocorrência natural foram descritas, supra. Resumidamente, em um anticorpo tradicional, as CDRs são embutidas dentro de um arcabouço na região variável da cadeia pesada e leve onde constituem as regiões responsáveis pela ligação e reconhecimento de antígeno. Uma região variável compreende pelo menos três CDRs de cadeia pesada ou leve; veja supra (Kabat e cols., 1991, Sequences of Proteins of Immunological Interest, Public Health Service N.I.H., Bethesda, MD; veja também Chothia e Desk, 1987, J. Mol. Biol. 196: 901-917; Chothia e cols., 1989, Nature 342: 877-883), dentro de uma região framework (designadas regiões framework 1-4, FR1, FR2, FR3 e FR4, por Kabat e cols., 1991; veja também Chothia e Lesk, 1987, supra) . As CDRs aqui fornecidas, no entanto, podem ser usadas não somente para definir o domínio de ligação de antígeno de uma estrutura de anticorpo tradicional, mas podem ser embutidas em várias outras estruturas polipeptídicas, como aqui descrito.
Em um aspecto, as CDRs fornecidas são: (a) uma CDRH selecionada do grupo que consiste em (i) uma CDRH1 selecionada do grupo que consiste no ID. DE SEQ. N°: 121
132
131; (ii) uma CDRH2 selecionada do grupo que consiste no ID. DE SEQ. N° : 132-144; (iii) uma CDRH3 selecionada do grupo que consiste no ID. DE SEQ. N° : 145-157; e (iv) uma CDRH de (i), (ii) e (iii) que contém uma ou mais substituições, deleções ou inserções de aminoácidos de, no máximo, cinco, quatro, três, dois ou um aminoácido; (B) uma CDRL selecionada do grupo que consiste em (i) uma CDRL1 selecionada do grupo que consiste no ID. DE SEQ. N° : 15817 0; (ii) uma CDRL2 selecionada do grupo que consiste no ID. DE SEQ. N° : 171-179; (iii) uma CDRL3 selecionada do grupo que consiste no ID. DE SEQ. N° : 180-194; e (iv) uma CDRL de (i), (ii) e (iii) que contém uma ou mais substituições, deleções ou inserções de aminoácidos de, no máximo, 1, 2, 3, 4 ou 5 aminoácidos.
Em outro aspecto, uma proteína de ligação de antígeno compreende 1, 2, 3, 4, 5 ou 6 formas variantes das CDRs listadas nas Tabelas 3A e 3B e Tabela 6C, infra, cada uma tendo pelo menos 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade de seqüência para uma seqüência de CDR listada nas Tabelas 3A e 3B e na Tabela 6C, infra. Algumas proteínas de ligação de antígeno compreendem 1, 2, 3, 4, 5 ou 6 das CDRs listadas nas Tabelas 3A e 3B e Tabela 6C, infra, cada uma diferindo por, no máximo, 1, 2, 3, 4 ou 5 aminoácidos das CDRs listadas nessas tabelas.
Ainda em outro aspecto, uma proteína de ligação de antígeno inclui as seguintes associações de CDRL1, CDRL2 e CDRL3: IDS. DE SEQ. Nos: 167, 176 e 190; IDS. DE SEQ. Nos: 167, 176 e 189, IDS. DE SEQ. Nos: 166, 176 e 188; IDS. DE SEQ. Nos: 166, 176 e 188; IDS. DE SEQ. Nos: 161, 174 e 183; IDS. DE SEQ. Nos: 162, 173 e 184; IDS. DE SEQ. Nos: 162, 173
133
e 186; IDS. DE SEQ. Nos: 164, 173 e 186; IDS. DE SEQ. N°s:
160, 173 e 182; IDS . DE SEQ. Nos: 163, 173 e 185; IDS . DE
SEQ. Nos: 163, 173 e 185, ; IDS. DE SEQ. Nos: 15 9 , 172 e 181;
IDS . DE SEQ. Nos: 165, 175 e 187; IDS. DE SEQ. N°s: 158, 171
e 180 i; IDS. DE SEQ. Nos: 168, 171 e 191; IDS. DE SEQ. Nos:
169, 177 e 192; IDS . DE SEQ. Nos: 170, 178 e 193; IDS . DE
SEQ. N°s: 163, 173 e 194 , ; IDS. DE SEQ. Nos: 163 , 173 e 194 ;
e IDS . DE SEQ. Nos: 163, 179 e 194
Em um aspecto adicional, uma proteína de ligação de
antígeno inclui as seguintes associações de CDRH1, CDRH2 e CDRH3 : IDS. DE SEQ. Nos: 122, 133 e 146; IDS. DE SEQ. Nos: 122, 133 e 147; IDS. DE SEQ. Nos: 122, 133 e 148; IDS. DE SEQ. Nos: 122, 134 e 148; IDS. DE SEQ. Nos: 124, 136 e 150;
IDS. DE SEQ. Nos: 124, 138 e 152; IDS. DE SEQ. Nos: 124, 139 e 152; IDS. DE SEQ. Nos: 124, 137 e 151; IDS. DE SEQ. Nos:
i
124, 137 e 151; IDS. DE SEQ. Nos: 131, 140 e 153; IDS. DE
SEQ. Nos: 125, 140 e 153; IDS. DE SEQ. Nos: 123, 135 e 149; IDS. DE SEQ. Nos: 123, 135 e 149; IDS. DE SEQ. Nos: 121, 132 e 145; IDS. DE SEQ. Nos: 126, 133 e 154; IDS. DE SEQ. Nos:
130, 144 e 157; IDS. DE SEQ. Nos: 127, 135 e 155; IDS. DE SEQ. Nos: 129, 142 e 156; IDS. DE SEQ. Nos: 128, 141 e 156; e IDS. DE SEQ. Nos: 128, 143 e 156.
Em outro aspecto, uma proteína de ligação de antígeno inclui as seguintes associações de CDRL1, CDRL2 e CDRL3 com
CDRH1, CDRH2 e CDRH3: IDS . DE SEQ. Nos: 167, 176 e 190;
IDS. DE SEQ. Nos : 167, 176 e 189, IDS . DE SEQ. Nos: 166, 176
e 188; IDS . DE SEQ. Nos: 166 , 176 e 188; IDS. DE SEQ. Nos :
161, 174 e 183; IDS. DE SEQ . Nos: 162 , 173 e 184; IDS . DE
SEQ. Nos 162 , 173 e 186; IDS. DE SEQ. Nos 1: 164 173 e 186 ;
IDS. DE SEQ. Nos : 160, 173 e 182; IDS . DE SEQ. Nos: 163, 173
134 ί
e 185; IDS. DE SEQ. N°s: 163, 173 e 185; IDS. DE SEQ. Nos: 159, 172 e 181; IDS. DE SEQ. Nos: 165, 175 e 187; IDS. DE SEQ. Nos: 158, 171 e 180; IDS. DE SEQ. Nos: 168, 171 e 191; IDS. DE SEQ. Nos: 169, 177 e 192; IDS. DE SEQ. Nos: 170, 178 e 193; IDS. DE SEQ. Nos: 163, 173 e 194; IDS. DE SEQ. Nos:
163, 173 e 194; IDS. DE SEQ. Nos: 163, 179 e 194 com IDS.
DE SEQ. N°s: 122, 133 e 146; IDS. DE SEQ. Nos: 122, 133 e
147; IDS. DE SEQ. Nos: 122, 133 e 148; IDS. DE SEQ. Nos: 122, 134 e 148; IDS. DE SEQ. Nos: 124, 136 e 150; IDS. DE
SEQ. Nos: 124, 138 e 152; IDS. DE SEQ. Nos: 124, 139 e 152; IDS. DE SEQ. Nos: 124, 137 e 151; IDS. DE SEQ. Nos: 124, 137 e 151; IDS. DE SEQ. Nos: 131, 140 e 153; IDS. DE SEQ. Nos: 125, 140 e 153; IDS. DE SEQ. Nos: 123, 135 e 149; IDS. DE SEQ. Nos: 123, 135 e 149; IDS. DE SEQ. Nos: 121, 132 e 145; IDS. DE SEQ. Nos: 126, 133 e 154; IDS. DE SEQ. Nos: 130, 144 e 157; IDS. DE SEQ. Nos: 127, 135 e 155; IDS. DE SEQ. Nos: 129, 142 e 156; IDS. DE SEQ. Nos: 128, 141 e 156; e IDS. DE
SEQ. Nos: 128, 143 e 156.
Seqüências de consenso
Ainda em outro aspecto, as CDRs aqui reveladas incluem seqüências de consenso derivadas de grupos de anticorpos monoclonais relacionados. Como aqui descrita, uma seqüência de consenso se refere às seqüências de aminoácidos que possuem aminoácidos conservados comuns 25 entre diversas seqüências e aminoácidos variáveis que variam dentro de certas seqüências de aminoácidos. As seqüências de consenso de CDR fornecidas incluem CDRs que correspondem a cada uma de CDRH1, CDRH2, CDRH3, CDRL1,
CDRL2 e CDRL3.
135
Seqüências de consenso foram determinadas usando análises-padrão das CDRs que correspondem à VH e VL dos anticorpos revelados, alguns dos quais se ligam especificamente a: (i) β-Klotho; (ii) FGFRlc, FGFR2c, 5 FGFR3c ou FGFR4; ou (iii) um complexo que compreende βKlotho e um de FGFRlc, FGFR2c, FGFR3c e FGFR4. As seqüências de consenso foram determinadas mantendo-se as CDRs contíguas dentro da mesma seqüência que corresponde a uma VH ou VL.
CDR3 da cadeia leve
Grupo 1
LQHNSYPLT (ID. DE SEQ. N° : 267)
Grupo 2
MQSLQTPFT (ID. DE SEQ. N° : 268)
15 Grupo 3
QQYNNWPPT (ID. DE SEQ. N° : 269)
Grupo 4
MQSIQLPRT (ID. DE SEQ. N ° : 270)
Grupo 5
20 QQANDFPIT (ID. DE SEQ. N °: 271)
Grupo 6
MQALQTPCS (ID. DE SEQ. N °: 272)
Grupo 7
QVWD G N SDHW (ID. . DE SEQ. N° : 273)
25 QVWD N T SDHW (ID. . DE SEQ. N° : 274)
QVWD S S SDHW (ID. . DE SEQ. N° : 275)
QVWD Xi X2 SDHW (ID . DE SEQ. N° : 276)
em que Xi é G, S ou N e X2 é s, T ou N.
Grupo 8
30 QQ C G S S P L T (ID. DE SEQ. N°: 277)
136
QQ Y G G S P L T (ID. . DE SEQ. . N° : : 278)
QQ Y G S A P L T (ID. . DE SEQ. . N° : : 279)
QQ Y G S S F T (ID. . DE SEQ. . N° : : 280)
QQ Y G S S P L T (ID. . DE SEQ. . N° : : 281)
QQ s G S S P L T (ID. . DE SEQ. . N° : : 282)
QQ x3 G X4 χ5 x6 X7 T (ID. DE SEQ. N° : 283)
em que X3 é C, Y ou s, X4 é S ou G, X5 é S ou A, X6 é P
ou F e X7 é L ou ausente.
CDR2 da cadeia leve
Grupo 1
AASSLQS (ID. DE SEQ. N° : 284)
Grupo 2
GVSTRAT (ID. DE SEQ. N° : 285)
Grupo 3
DDSDRPS (ID. DE SEQ. N° : 286)
Grupo 4
EVSNRFS (ID. DE SEQ. N° : 287)
Grupo 5
L G S N R A S (ID. DE SEQ. N° : 288)
L G S D R A S (ID. DE SEQ. N° : 289)
L G S X27 R A S (ID. DE SEQ. N° : 290)
em que X27 é N ou D .
Grupo 6
G A S S RAT (ID. DE SEQ. N° : 291)
G T S S RAT (ID. DE SEQ. N° : 292)
G A S F RAT (ID. DE SEQ. N° : 293)
G χ8 S X28 RAT (ID. DE SEQ. N° : 294)
em que X8 é A ou T θ X28 é S ou F.
CDR1 da cadeia leve
Grupo 1
137
RASQSVNSNLA (ID. DE SEQ. N°: 295)
Grupo 2
RASQDIRYDLG (ID. DE SEQ. N°: 296)
Grupo 3
RASQGISIWLA (ID. DE SEQ. N°: 297)
Grupo 4
KSSQSLLQSDGKTYLY (ID. DE SEQ. N° : 298)
Grupo 5
RASQ N F D S S s LA (ID. DE SEQ. N° : 299)
RASQ N F D S S Y LA (ID. DE SEQ. N° : 300)
RASQ S V S G N Y LA (ID. DE SEQ. N° : 301)
RASQ S V S G T Y LA (ID. DE SEQ. N° : 302)
RASQ N F D S N Y LA (ID. DE SEQ. N° : 303)
RASQ X9 X10 X11 X12 X13 X14 LA (ID. DE SEQ. N° : 304)
em que X9 é A ou S, X10 ê V ou F X11 é D ou s, X12 θ
ou S, X 13 é S, N ou T, e X14 é S c JU Y.
Grupo 6
GGNNIGS E SVH (ID . DE SEQ. N° : 305)
GGNNIGS Q SVH (ID . DE SEQ. N° : 306)
GGNNIGS X15 SVH (ID . DE SEQ. N° : 307)
em que Xi5 é E ou Q.
Grupo 7
RSSQSLL Y Y NG F T Y LD (ID. DE SEQ. N°
308) RSSQSLL H S NG Y N F LD (ID. DE SEQ. N°
309) RSSQSLL X29 X30 NG X31 X32 X33 LD (ID. DE SEQ. N°
310) em que X29 é Y ou H, X30 é Y ou S, X31 é F ou Y , X32 é
ou N e X33 é Y ou F.
138
CDR3 PESADA
Grupo 1
IWVPAAIQSYYYYYGMGV (ID. DE SEQ. N° : 311)
Grupo 2
DPDGDYYYYGMDV (ID. DE SEQ. N° : 312)
Grupo 3
TYSSGWYVWDYYGMDV (ID. DE SEQ. N°: 313)
Grupo 4
DRVLSYYAMAV (ID. DE SEQ. N°: 314)
Grupo 5
VRIAGDYYYYYGMDV (ID. DE SEQ. N°: 315)
Grupo 6
ENIWIPAAIFAGWFDP (ID. DE SEQ. N° : 316)
Grupo 7
15 4 DRAAAGLHYYYGMDV (ID Grupo 8 . DE SEQ . N° : 317)
I L L L G A YYY Y GMDV (ID. DE SEQ
N° : 318)
I L L V G A YYY C GMDV (ID. DE SEQ
20 N° : 319)
V V T G G YYY D GMDV (ID. DE SEQ
N° : 320)
S V V T G G YYY D GMDV (ID. DE SEQ
N° : 321)
25 X34 X16 X17 X18 G X19 YYY X20 GMDV (ID. DE SEQ
N° : 322)
em que X 34 é I, , V ou S , X16 é L ou v, x17 é L, T OU V
Xis é L, V, G ou T, X19 é A, G ou ausente e X2o é Y, C ou D.
Grupo 9
30 SLIW I VY A LD H ( ID. DE SEQ. N °: 323)
139
SLIW I VY A LD Y (ID. DE SEQ. N° : 324)
SLIW M VY V LD Y (ID. DE SEQ. N° : 325)
SLIW X21 VY X22 LD X23 (ID. DE SEQ . N° : 326)
em que X2i é I ou M, X22 é A ou V e X23 é H ou Y.
CDR2 PESADA
Grupo 1
GFDPEDGETIYAQKFQG (ID. DE SEQ. N°: 327)
Grupo 2
RIKSK T DGGTTDYAAPVKG (ID. DE SEQ. N° : 328)
10 RIKSK DGGTTDYAAPVKG (ID. DE SEQ. N° : 330)
RIKSK X42 DGGTTDYAAPVKG (ID. DE SEQ. N° : 483)
em que X42 é T ou ausente.
Grupo 3
HIFSNDEKSYSTSLK S (ID. DE SEQ. N° : 331)
HIFSNDEKSYSTSLK N (ID. DE SEQ. N°: 332)
HIFSNDEKSYSTSLK X24 (ID. DE SEQ. N° : 333) em que X24 é S ou N.
Grupo 4
G ISGSGVST H YADSVKG (ID. DE SEQ. N° : 334)
20 G ISGSGVST Y YADSVKG (ID. DE SEQ. N° : 335)
A ISGSGVST Y YADSVKG (ID. DE SEQ. N° : 336)
A ISGSGVST N YADSVKG (ID. DE SEQ. N° : 337)
X25 ISGSGVST X26 YADSVKG (ID. DE SEQ. N° : 338)
em que X25 é G ou A e X26 é Η, Y ou N.
Grupo 5
VIWYDGS D KYY A DSVKG (ID . DE SEQ. N° : 339)
VIWYDGS I KYY G DSVKG (ID . DE SEQ. N° : 340)
VIWYDGS X35 KYY x36 DSVKG (ID . DE SEQ. N° : 341)
em que X35 é D ou I e X36 é A < DU G.
Grupo 6
140
N IY Y SGST Y YNPSLKS (ID. DE SEQ . N° : 342)
R IY T SGST Y YNPSLKS (ID. DE SEQ . N° : 343)
R IY T SGST N YNPSLKS (ID. DE SEQ . N° : 329)
X37 IY x38 SGST X41 YNPSLKS (ID. DE SEQ. N° : 344)
em que X37 é N ou R, X38 é Y ou T θ X41 θ Y ou N.
CDR1 PESADA
Grupo 1
DLSMH (ID. Grupo DE SEQ. 2 N° : 345)
10 DAWNS (ID . DE SEQ. N° : 346)
Grupo 3
TYAMS (ID. DE SEQ. N° : 347)
Grupo 4
SYFWS (ID. DE SEQ. N° : 348)
15 Grupo 5
SGGYNWS (II d. : DE SEQ. N 0 : 349
Grupo 6
NARMGV S ( (ID. DE SEQ. N° : 350)
NARMGV N ( :id. DE SEQ. N° : 351)
2 0 NARMGV X39 (ID . DE SEQ . N° : 352)
em que X39 é S ou N.
Grupo 7
S YGIH (ID. DE SEQ. N° : 353)
N YGIH (ID. DE SEQ. N° : 354)
25 X40 YGIH (ID. DE SEQ. N° : 355)
em que X40 é S ou N.
Em alguns casos, uma proteína de ligação de antígeno
compreende pelo menos uma CDR1, CDR2 ou CDR3 de cadeia pesada que possui uma das seqüências de consenso acima. Em alguns casos, uma proteína de ligação de antígeno
141 compreende pelo menos uma CDR1, CDR2 ou CDR3 de cadeia leve que possui uma das seqüências de consenso acima. Em outros casos, a proteína de ligação de antígeno compreende pelo menos duas CDRs de cadeia pesada de acordo com as seqüências de consenso acima e/ou pelo menos duas CDRs de cadeia leve de acordo com as seqüências de consenso acima. Ainda em outros casos, a proteína de ligação de antígeno compreende pelo menos três CDRs de cadeia pesada de acordo com as seqüências de consenso acima e/ou pelo menos três
CDRs de cadeia leve de acordo com as seqüências de consenso acima.
Proteínas de ligação de antígeno exemplares
De acordo com um aspecto, uma proteína de ligação de antígeno isolada que compreende (a) uma ou mais regiões 15 determinantes de complementaridade da cadeia pesada (CDRHs) / selecionadas do grupo que consiste em: (i) uma CDRH1 selecionada do grupo que consiste no ID. DE SEQ. N° : 121131; (ii) uma CDRH2 selecionada do grupo que consiste no ID. DE SEQ. N° : 132-144; (iii) uma CDRH3 selecionada do grupo que consiste no ID. DE SEQ. N° : 145-157; e (iv) uma CDRH de (i), (ii) e (iii) que contém uma ou mais substituições, deleções ou inserções de aminoácidos de, no máximo, 1, 2, 3, 4 ou 5 aminoácidos; (b) uma ou mais regiões determinantes de complementaridade da cadeia leve (CDRLs) selecionadas do grupo que consiste em: (i) uma CDRL1 selecionada do grupo que consiste no ID. DE SEQ. N°: 158-170; (ii) uma CDRL2 selecionada do grupo que consiste no ID. DE SEQ. N°: 171-179; (iii) uma CDRL3 selecionada do grupo que consiste no ID. DE SEQ. N° : 180-194; e (iv) uma
CDRL de (i), (ii) (iii) que contém uma ou mais
142 substituições, deleções ou inserções de aminoácidos de, no máximo, cinco, quatro, três, quatro, dois ou um aminoácido; ou (c) uma ou mais CDRHs da cadeia pesada de (a) e uma ou mais CDRLs da cadeia leve de (b).
Em outra modalidade, as CDRHs possuem pelo menos 70%,
75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade de seqüência com uma seqüência de aminoácidos selecionada do grupo que consiste no ID. DE SEQ. N° : 121-157 e/ou as CDRLs possuem pelo menos 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 10 97%, 98% ou 99% de identidade de seqüência com uma seqüência de aminoácidos selecionada do grupo que consiste no ID. DE SEQ. N°: 158-194. Em uma modalidade adicional, a VH é selecionada do grupo que consiste no ID. DE SEQ. N° : 121-157 e/ou a VL é selecionada do grupo que consiste no 15 ID. DE SEQ. N° : 158-194.
De acordo com um aspecto, uma proteína de ligação de antígeno isolada que compreende (a) uma ou mais cadeias pesadas variáveis (VHs) selecionadas do grupo que consiste em: (i) ID. DE SEQ. N°: 121-157; e (ii) uma VH de (i) que 20 contém uma ou mais substituições, deleções ou inserções de aminoácidos de, no máximo, cinco, quatro, três, quatro, dois ou um aminoácido; (b) uma ou mais cadeias leves variáveis (VLs) selecionadas do grupo que consiste em: (i) ID. DE SEQ. N° : 158-194, e (ii) uma VL de (i) que contém 25 uma ou mais substituições, deleções ou inserções de aminoácidos de, no máximo, cinco, quatro, três, quatro, dois ou um aminoácido; ou (c) uma ou mais cadeias pesadas variáveis de (a) e uma ou mais cadeias leves variáveis de (b) .
143
Em outra modalidade, a cadeia pesada variável (VH) possui pelo menos 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade de seqüência com uma seqüência de aminoácidos selecionada do grupo que consiste no ID. DE SEQ. N° : 121-157 e/ou a cadeia leve variável (VL) possui pelo menos 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%. 98% ou 99% de identidade de seqüência com uma seqüência de aminoácidos selecionada do grupo que consiste no ID. DE SEQ. N°: 158-194.
Em um aspecto, também é fornecida uma proteína de ligação de antígeno que se liga especificamente a um epitopo que compreende um ou mais resíduos de aminoácidos de FGFRlc, FGRF2C, FGFR3C e FGFR4.
Em um aspecto, também é fornecida uma proteína de ligação de antígeno que se liga especificamente a um epitopo que compreende um ou mais resíduos de aminoácidos de β-Klotho.
Em outro aspecto, também é fornecida uma proteína de ligação de antígeno isolada que se liga especificamente a um epitopo que compreende um ou mais resíduos de aminoácidos de β-Klotho e um ou mais resíduos de aminoácidos de FGFRlc, FGFR2c, FGFR3C ou FGFR4.
Ainda em outra modalidade, a proteína de ligação de antígeno isolada aqui descrita acima compreende uma primeira seqüência de aminoácidos que compreende pelo menos uma das seqüências de consenso de CDRH aqui reveladas, e uma segunda seqüência de aminoácidos que compreende pelo menos uma das seqüências de consenso de CDRL aqui reveladas.
144
Em um aspecto, a primeira seqüência de aminoácidos compreende pelo menos duas das seqüências de consenso de CDRH e/ou a segunda seqüência de aminoácidos compreende pelo menos duas das seqüências de consenso de CDRL. Em certas modalidades, a primeira e a segunda seqüências de aminoácidos estão ligadas covalentemente entre elas.
Em uma modalidade adicional, a primeira seqüência de aminoácidos da proteína de ligação de antígeno isolada compreende a CDRH3 do ID. DE SEQ. N° : 146, a CDRH2 do ID. DE SEQ. N°: 133 e a CDRH1 do ID. DE SEQ. N° : 122, e/ou a segunda seqüência de aminoácidos da proteína de ligação de antígeno isolada compreende a CDRL3 do ID. DE SEQ. N°: 190, a CDRL2 do ID. DE SEQ. N°: 176 e a CDRL1 do ID. DE SEQ. N°: 167 .
Em uma modalidade adicional, a primeira seqüência de aminoácidos da proteína de ligação de antígeno isolada compreende a CDRH3 do ID. DE SEQ. N° : 147, a CDRH2 do ID. DE SEQ. N° : 133 e a CDRH1 do ID. DE SEQ. N° : 122, e/ou a segunda seqüência de aminoácidos da proteína de ligação de antígeno isolada compreende a CDRL3 do ID. DE SEQ. N° : 189, a CDRL2 do ID. DE SEQ. N°: 176 e a CDRL1 do ID. DE SEQ. N°:
167 .
Em uma modalidade adicional, a primeira seqüência de aminoácidos da proteína de ligação de antígeno isolada compreende a CDRH3 do ID. DE SEQ. N° : 148, a CDRH2 do ID. DE SEQ. N° : 133 e a CDRH1 do ID. DE SEQ. N° : 122, e/ou a segunda seqüência de aminoácidos da proteína de ligação de antígeno isolada compreende a CDRL3 do ID. DE SEQ. N°: 188, a CDRL2 do ID. DE SEQ. N° : 176 e a CDRL1 do ID. DE SEQ. N°:
166 .
145
Em uma modalidade adicional, a primeira seqüência de aminoácidos da proteína de ligação de antígeno isolada compreende a CDRH3 do ID. DE SEQ. N° : 14 8, a CDRH2 do ID. DE SEQ. N° : 134 e a CDRH1 do ID. DE SEQ. N° : 122, e/ou a segunda seqüência de aminoácidos da proteína de ligação de antígeno isolada compreende a CDRL3 do ID. DE SEQ. N°: 188, a CDRL2 do ID. DE SEQ. N°: 176 e a CDRL1 do ID. DE SEQ. N°:
166 .
Em uma modalidade adicional, a primeira seqüência de aminoácidos da proteína de ligação de antígeno isolada compreende a CDRH3 do ID. DE SEQ. N° : 150, a CDRH2 do ID. DE SEQ. N° : 136 e a CDRH1 do ID. DE SEQ. N° : 124, e/ou a segunda seqüência de aminoácidos da proteína de ligação de antígeno isolada compreende a CDRL3 do ID. DE SEQ. N°: 183, a CDRL2 do ID. DE SEQ. N°: 174 e a CDRL1 do ID. DE SEQ. N°:
161 .
Em uma modalidade adicional, a primeira seqüência de aminoácidos da proteína de ligação de antígeno isolada compreende a CDRH3 do ID. DE SEQ. N° : 152, a CDRH2 do ID. DE SEQ. N° : 138 e a CDRH1 do ID. DE SEQ. N° : 124, e/ou a segunda seqüência de aminoácidos da proteína de ligação de antígeno isolada compreende a CDRL3 do ID. DE SEQ. N°: 184, a CDRL2 do ID. DE SEQ. N°: 173 e a CDRL1 do ID. DE SEQ. N°:
162 .
Em uma modalidade adicional, a primeira seqüência de aminoácidos da proteína de ligação de antígeno isolada compreende a CDRH3 do ID. DE SEQ. N°: 152, a CDRH2 do ID. DE SEQ. N°: 139 e a CDRH1 do ID. DE SEQ. N° : 124, e/ou a segunda seqüência de aminoácidos da proteína de ligação de antígeno isolada compreende a CDRL3 do ID. DE SEQ. N°: 186,
146 a CDRL2 do ID. DE SEQ. N°: 173 e a CDRL1 do ID. DE SEQ. N°:
162 .
Em uma modalidade adicional, a primeira seqüência de aminoácidos da proteína de ligação de antígeno isolada compreende a CDRH3 do ID. DE SEQ. N° : 151, a CDRH2 do ID. DE SEQ. N° : 137 e a CDRH1 do ID. DE SEQ. N° : 124, e/ou a segunda seqüência de aminoácidos da proteína de ligação de antígeno isolada compreende a CDRL3 do ID. DE SEQ. N°: 186, a CDRL2 do ID. DE SEQ. N°: 173 e a CDRL1 do ID. DE SEQ. N°: 164 .
Em uma modalidade adicional, a primeira seqüência de aminoácidos da proteína de ligação de antígeno isolada compreende a CDRH3 do ID. DE SEQ. N° : 151, a CDRH2 do ID. DE SEQ. N° : 137 e a CDRH1 do ID. DE SEQ. N° : 124, e/ou a segunda seqüência de aminoácidos da proteína de ligação de antígeno isolada compreende a CDRL3 do ID. DE SEQ. N°: 182, a CDRL2 do ID. DE SEQ. N°: 173 e a CDRL1 do ID. DE SEQ. N°: 160 .
Em uma modalidade adicional, a primeira seqüência de aminoácidos da proteína de ligação de antígeno isolada compreende a CDRH3 do ID. DE SEQ. N° : 153, a CDRH2 do ID. DE SEQ. N° : 140 e a CDRH1 do ID. DE SEQ. N° : 131, e/ou a segunda seqüência de aminoácidos da proteína de ligação de antígeno isolada compreende a CDRL3 do ID. DE SEQ. N°: 185, a CDRL2 do ID. DE SEQ. N°: 173 e a CDRL1 do ID. DE SEQ. N°:
163 .
Em uma modalidade adicional, a primeira seqüência de aminoácidos da proteína de ligação de antígeno isolada compreende a CDRH3 do ID. DE SEQ. N° : 153, a CDRH2 do ID. DE SEQ. N° : 140 e a CDRH1 do ID. DE SEQ. N° : 125, e/ou a
147 segunda seqüência de aminoácidos da proteína de ligação de antígeno isolada compreende a CDRL3 do ID. DE SEQ. N°: 185, a CDRL2 do ID. DE SEQ. N°: 173 e a CDRL1 do ID. DE SEQ. N° : 163 .
Em uma modalidade adicional, a primeira seqüência de aminoácidos da proteína de ligação de antígeno isolada compreende a CDRH3 do ID. DE SEQ. N° : 14 9, a CDRH2 do ID. DE SEQ. N° : 135 e a CDRH1 do ID. DE SEQ. N° : 123, e/ou a segunda seqüência de aminoácidos da proteína de ligação de antígeno isolada compreende a CDRL3 do ID. DE SEQ. N°: 181, a CDRL2 do ID. DE SEQ. N°: 172 e a CDRL1 do ID. DE SEQ. N°: 159 .
Em uma modalidade adicional, a primeira seqüência de aminoácidos da proteína de ligação de antígeno isolada compreende a CDRH3 do ID. DE SEQ. N° : 149, a CDRH2 do ID. DE SEQ. N° : 135 e a CDRH1 do ID. DE SEQ. N° : 123, e/ou a segunda seqüência de aminoácidos da proteína de ligação de antígeno isolada compreende a CDRL3 do ID. DE SEQ. N°: 187, a CDRL2 do ID. DE SEQ. N°: 175 e a CDRL1 do ID. DE SEQ. N°: 165 .
Em uma modalidade adicional, a primeira seqüência de aminoácidos da proteína de ligação de antígeno isolada compreende a CDRH3 do ID. DE SEQ. N° : 145, a CDRH2 do ID. DE SEQ. N° : 132 e a CDRH1 do ID. DE SEQ. N° : 121, e/ou a segunda seqüência de aminoácidos da proteína de ligação de antígeno isolada compreende a CDRL3 do ID. DE SEQ. N°: 180, a CDRL2 do ID. DE SEQ. N°: 171 e a CDRL1 do ID. DE SEQ. N°: 158 .
Em uma modalidade adicional, a primeira seqüência de aminoácidos da proteína de ligação de antígeno isolada
148 compreende a CDRH3 do ID. DE SEQ. N° : 154, a CDRH2 do ID. DE SEQ. N°: 133 e a CDRH1 do ID. DE SEQ. N° : 126, e/ou a segunda seqüência de aminoácidos da proteína de ligação de antígeno isolada compreende a CDRL3 do ID. DE SEQ. N°: 191, a CDRL2 do ID. DE SEQ. N°: 171 e a CDRL1 do ID. DE SEQ. N°:
168 .
Em uma modalidade adicional, a primeira seqüência de aminoácidos da proteína de ligação de antígeno isolada compreende a CDRH3 do ID. DE SEQ. N° : 157, a CDRH2 do ID. DE SEQ. N° : 144 e a CDRH1 do ID. DE SEQ. N° : 130, e/ou a segunda seqüência de aminoácidos da proteína de ligação de antígeno isolada compreende a CDRL3 do ID. DE SEQ. N°: 192, a CDRL2 do ID. DE SEQ. N°: 177 e a CDRL1 do ID. DE SEQ. N°:
169 .
Em uma modalidade adicional, a primeira seqüência de aminoácidos da proteína de ligação de antígeno isolada compreende a CDRH3 do ID. DE SEQ. N° : 155, a CDRH2 do ID. DE SEQ. N° : 135 e a CDRH1 do ID. DE SEQ. N° : 127, e/ou a segunda seqüência de aminoácidos da proteína de ligação de antígeno isolada compreende a CDRL3 do ID. DE SEQ. N°: 193, a CDRL2 do ID. DE SEQ. N°: 178 e a CDRL1 do ID. DE SEQ. N°:
170 .
Em uma modalidade adicional, a primeira seqüência de aminoácidos da proteína de ligação de antígeno isolada compreende a CDRH3 do ID. DE SEQ. N° : 156, a CDRH2 do ID. DE SEQ. N° : 142 e a CDRH1 do ID. DE SEQ. N° : 129, e/ou a segunda seqüência de aminoácidos da proteína de ligação de antígeno isolada compreende a CDRL3 do ID. DE SEQ. N°: 194, a CDRL2 do ID. DE SEQ. N°: 173 e a CDRL1 do ID. DE SEQ. N°:
163.
149
Em uma modalidade adicional, a primeira seqüência de aminoácidos da proteína de ligação de antígeno isolada compreende a CDRH3 do ID. DE SEQ. N° : 156, a CDRH2 do ID. DE SEQ. N° : 141 e a CDRH1 do ID. DE SEQ. N° : 128, e/ou a segunda seqüência de aminoácidos da proteína de ligação de antígeno isolada compreende a CDRL3 do ID. DE SEQ. N°: 194, a CDRL2 do ID. DE SEQ. N°: 173 e a CDRL1 do ID. DE SEQ. N°: 163 .
Em uma modalidade adicional, a primeira seqüência de aminoácidos da proteína de ligação de antígeno isolada compreende a CDRH3 do ID. DE SEQ. N° : 156, a CDRH2 do ID. DE SEQ. N° : 143 e a CDRH1 do ID. DE SEQ. N° : 128, e/ou a segunda seqüência de aminoácidos da proteína de ligação de antígeno isolada compreende a CDRL3 do ID. DE SEQ. N°: 194, a CDRL2 do ID. DE SEQ. N° : 179 e a CDRL1 do ID. DE SEQ. N°: 163 .
Em uma modalidade adicional, a proteína de ligação de antígeno compreende pelo menos duas seqüências de CDRH de seqüências da cadeia pesada Hl, H2, H3, H4, H5, H6, H7, H8, H9, H10, Hll, H12, H13, H14, H15, H16, H17 ou H18, como mostrado na Tabela 4A. Novamente, em uma modalidade adicional, a proteína de ligação de antígeno compreende pelo menos duas seqüências de CDRL de seqüências da cadeia leve LI, L2, L3, L4, L5, L6, L7, L8, L9, LIO, Lil, L12, L13, L14, L15, L16, L17 ou L18, como mostrado na Tabela 4B. Ainda em uma modalidade adicional, a proteína de ligação de antígeno compreende pelo menos duas seqüências de CDRH de seqüências da cadeia pesada Hl, H2, H3, H4, H5, H6, H7, H8, H9, H10, Hll, H12, H13, H14, H15, H16, H17 ou H18 como mostrado na Tabela 4Ά, e pelo menos duas CDRLs de
150 seqüências da cadeia leve LI, L2, L3, L4, L5, L6 , L7, L8, L9, LIO, Lil, L12, L13, L14, L15, L16, L17 ou L18, como mostrado na Tabela 4B.
Ainda em outra modalidade, a proteína de ligação de antígeno compreende as seqüências de CDRH1, CDRH2 e CDRH3 de seqüências da cadeia pesada Hl, H2, H3, H4, H5, H6 , H7, H8, H9, H10, Hll, H12, H13, H14, H15, H16, H17 ou H18 como mostrado na Tabela 4A. Ainda em outra modalidade, a proteína de ligação de antígeno compreende as seqüências de CDRL1, CDRL2 e CDRL3 de seqüências da cadeia leve LI, L2, L3, L4, L5, L6, L7, L8, L9, LIO, Lil, L12, L13, L14, L15, L16, L17 ou L18, como mostrado na Tabela 4B.
Ainda em outra modalidade, a proteína de ligação de antígeno compreende todas as seis CDRs de LI e Hl, ou L2 e H2, ou L3 e H3, ou L3 e H4, ou L4 e H5, ou L5 e H6, ou L6 e H7, ou L7 e H8, ou L8 e H7, ou L9 e H9, ou L9 e H10, ou LIO e Hll, ou Lil e Hll, ou L12 e H12, ou L13 e H13, ou L14 e H14, ou L15 e H15, ou L16 e H16, ou L17 e H17, ou L18 e H18, como mostrado nas Tabelas 4A e 4B.
Tabela 4A - Seqüências da cadeia pesada.
REFERÊNCIA CADEIA PESADA (H#) N° DO ID. DE SEQ. DA PESADA TOTAL PESADA VARIÁVEL (VH#) N° DO ID. DE SEQ. DA PESADA VARIÁVEL N° DO ID. DE SEQ. DA CDRH1 N° DO ID. DE SEQ. DA CDRH2 N° DO ID. DE SEQ. DA CDRH3
17C3 Hl 30 VH1 66 122 133 146
22H5 H2 31 Vh2 67 122 133 147
151
16H7 H3 32 Vh3 68 122 133 148
24H11 H4 33 Vh4 69 122 134 148
18G1 H5 34 Vh5 70 124 136 150
17D8 H6 35 Vh6 71 124 138 152
26H11 H7 36 Vh7 72 124 139 152
12E4 H8 37 Vh8 73 124 137 151
12C11 H7 37 Vh8 73 124 137 151
21H2 H9 38 Vh9 74 131 140 153
21B4 H10 39 Vh10 75 125 140 153
18B11.1 Hll 40 Vh11 76 123 135 149
18B11.2 Hll 40 Vh11 77 123 135 149
2 0D4 H12 41 Vh12 78 121 132 145
46D11 H13 42 Vh13 79 126 133 154
40D2 H14 46 Vh14 80 130 144 157
39F7 H16 44 Vh16 82 129 142 156
39F11 H17 43 Vh17 83 128 141 156
37D3 H15 47 Vh15 81 127 135 155
3 9G5 H18 45 Vh18 84 128 143 156
Tabela 4B - seqüências da cadeia leve.
REFERÊNCIA CADEIA PESADA (L#) N° DO ID. DE SEQ. DA LEVE TOTAL LEVE VARIÁVEL (VH#) N° DO ID. DE SEQ. DA LEVE VARIÁVEL N° DO ID. DE SEQ. DA CDRL1 N° DO ID. DE SEQ. DA CDRL2 N° DO ID. DE SEQ. DA CDRL3
17C3 LI 48 VL1 85 167 176 190
22H5 L2 49 Vl2 86 167 176 189
152
16H7 L3 50 Vl3 87 166 176 188
24H11 L3 50 Vl3 87 166 176 188
18G1 L4 51 Vl4 88 161 174 183
17D8 L5 52 Vl5 89 162 173 184
26H11 L6 53 Vl6 90 162 173 186
12E4 L7 54 Vl7 91 164 173 186
12C11 L8 55 Vl8 92 160 173 182
21H2 L9 56 Vl9 93 163 173 185
21B4 L9 56 Vl9 93 163 173 185
18B11.1 LIO 57 VL10 94 159 172 181
18B11.2 Lll 58 VL11 95 165 175 187
2 0D4 L12 59 Vl12 96 158 171 180
46D11 L13 60 Vl13 97 168 171 191
4 0D2 L14 61 Vl14 98 169 177 192
39F7 L16 63 Vl16 100 163 173 194
37D3 L15 62 Vl15 99 170 178 193
39F11 L17 64 Vl17 101 163 173 194
3 9G5 L18 65 Vl18 102 163 179 194
Em um aspecto, as proteínas de ligação de antígeno isoladas que se ligam especificamente a (i) β-Klotho; (ii) FGFRlc, FGFR2C, FGFR3c ou FGFR4; ou (iii) um complexo que compreende β-Klotho e um de FGFRlc, FGFR2c, FGFR3c e FGFR4 aqui fornecidas podem ser um anticorpo monoclonal, um anticorpo policlonal, um anticorpo recombinante, um anticorpo humano, um anticorpo humanizado, um anticorpo quimérico, um anticorpo multiespecífico, ou um fragmento de anticorpo destes.
Em outra modalidade, o fragmento de anticorpo das proteínas de ligação de antígeno isoladas aqui fornecidas pode ser um fragmento Fab, um fragmento Fab', um F(ab')2
153 fragmento, um fragmento Fv, um diabody ou uma molécula de anticorpo de cadeia única.
Em uma modalidade adicional, uma proteína de ligação de antígeno isolada que se liga especificamente a (i) βKlotho; (ii) FGFRlc, FGFR2c, FGFR3C ou FGFR4; ou (iii) um complexo que compreende β-Klotho e um de FGFRlc, FGFR2c, FGFR3c e FGFR4 aqui fornecida é um anticorpo humano e pode ser do tipo IgGl, IgG2, IgG3 ou IgG4.
Em outra modalidade, uma proteína de ligação de antígeno isolada que se liga especificamente a (i) βKlotho; (ii) FGFRlc, FGFR2C, FGFR3c ou FGFR4; ou (iii) um complexo que compreende β-Klotho e um de FGFRlc, FGFR2c, FGFR3c e FGFR4 compreende um polipeptídeo da cadeia leve ou pesada como apresentado nas Tabelas 1A-1B. Em algumas modalidades, uma proteína de ligação de antígeno que se liga especificamente a (i) β-Klotho; (ii) FGFRlc, FGFR2c, FGFR3c ou FGFR4; ou (iii) um complexo que compreende βKlotho e um de FGFRlc, FGFR2C, FGFR3c e FGFR4 compreende um domínio variável leve ou variável pesado como, por exemplo, aqueles listados nas Tabelas 2A-2B. Ainda em outras modalidades, uma proteína de ligação de antígeno que se liga especificamente a (i) β-Klotho; (ii) FGFRlc, FGFR2c, FGFR3c ou FGFR4; ou (iii) um complexo que compreende βKlotho e um de FGFRlc, FGFR2c, FGFR3C e FGFR4 compreende uma, duas ou três CDRHs ou uma, duas ou três CDRLs como apresentadas nas Tabelas 3A-3B, 4A-4B e na Tabela 6C, infra. Essas proteínas de ligação de antígeno e, na verdade, qualquer uma das proteínas de ligação de antígeno aqui reveladas, podem ser PEGuiladas com uma ou mais moléculas de PEG, por exemplo, moléculas de PEG que possuem
154 um peso molecular selecionado do grupo que consiste em 5 K, 10 K, 20 K, 40 K, 50 K, 60 K, 80 K, 100 K ou mais do que 100 K.
Ainda em outro aspecto, qualquer proteína de ligação de antígeno que se liga especificamente a (i) β-Klotho;
(ii) FGFRlc, FGFR2C, FGFR3C ou FGFR4; ou (iii) um complexo que compreende β-Klotho e um de FGFRlc, FGFR2c, FGFR3c e FGFR4 aqui fornecida pode ser acoplada a um grupo de marcação e pode competir pela ligação à porção extracelular de (i) β-Klotho; (ii) FGFRlc, FGFR2c, FGFR3C ou FGFR4; ou (iii) um complexo que compreende β-Klotho e um de FGFRlc, FGFR2c, FGFR3c e FGFR4 com uma proteína de ligação de antígeno de uma das proteínas de ligação de antígeno isoladas aqui fornecidas. Em uma modalidade, a proteína de ligação de antígeno isolada aqui fornecida pode reduzir os níveis de glicemia, diminuir os níveis de triglicerídeos e colesterol, ou melhorar outros parâmetros glicêmicos e fatores de risco cardiovascular quando administrada a um paciente.
Como será observado, para qualquer proteína de ligação de antígeno que compreende mais de uma CDR fornecida nas Tabelas 3A-3B e 4A-4B, qualquer combinação de CDRs selecionadas independentemente das seqüências reveladas pode ser útil. Dessa forma, podem ser geradas proteínas de ligação de antígeno com uma, duas, três, quatro, cinco ou seis das CDRs selecionadas independentemente. No entanto, como será observado por aqueles habilitados na técnica, modalidades específicas geralmente utilizam combinações de CDRs que são não repetitivas, por exemplo, proteínas de
155 ligação de antígeno geralmente não são feitas com duas regiões CDRH2 etc.
Algumas das proteínas de ligação de antígeno que se ligam especificamente a (i) β-Klotho; (ii) FGFRlc, FGFR2c, FGFR3c ou FGFR4; ou (iii) um complexo que compreende βKlotho e um de FGFRlc, FGFR2c, FGFR3c e FGFR4 que são aqui fornecidas serão discutidas com mais detalhes abaixo.
Proteínas de ligação de antígeno e epitopos de ligação e domínios de ligação
Quando se diz que uma proteína de ligação de antígeno se liga a um epitopo em (i) β-Klotho; (ii) FGFRlc, FGFR2c, FGFR3c ou FGFR4; ou (iii) um complexo que compreende βKlotho e um de FGFRlc, FGFR2c, FGFR3C e FGFR4, ou ao domínio extracelular de β-Klotho, FGFRlc, FGFR2c, FGFR3c ou FGFR4, por exemplo, isso significa que a proteína de ligação de antígeno se liga especificamente a uma porção especificada de (i) β-Klotho; (ii) FGFRlc, FGFR2c, FGFR3c ou FGFR4; ou (iii) um complexo que compreende β-Klotho e um de FGFRlc, FGFR2c, FGFR3c e FGFR4. Em algumas modalidades, por exemplo, em certos casos em que a proteína de ligação de antígeno se liga apenas a FGFRlc ou β-Klotho, a proteína de ligação de antígeno pode se ligar especificamente a um polipeptídeo que consiste em resíduos especificados (por exemplo, um segmento especificado de β-Klotho, FGFRlc, FGFR2c, FGFR3c ou FGFR4, tais como aqueles resíduos revelados no Exemplo 14) . Em outras modalidades, por exemplo, em certos casos em que uma proteína de ligação de antígeno interage tanto com β-Klotho quanto com um ou mais de FGFRlc, FGFR2c, FGFR3c e FGFR4, a proteína de ligação de antígeno pode se ligar a resíduos, seqüências de resíduos,
156 ou regiões tanto em β-Klotho quanto em FGFRlc, FGFR2c, FGFR3c ou FGFR4, dependendo de qual receptor a proteína de ligação de antígeno reconhece. Ainda em outras modalidades, a proteína de ligação de antígeno se ligará a resíduos, seqüência ou resíduos ou regiões de um complexo que compreende β-Klotho e um de FGFRlc, FGFR2c, FGFR3c e FGFR4, por exemplo, FGFRlc.
Em qualquer uma das modalidades apresentadas anteriormente, uma proteína de ligação de antígeno desse tipo não precisa entrar em contato com cada resíduo de (i) β-Klotho; (ii) FGFRlc, FGFR2C, FGFR3c ou FGFR4; ou (iii) um complexo que compreende β-Klotho e um de FGFRlc, FGFR2c, FGFR3c e FGFR4, ou com o domínio extracelular das proteínas ou complexos citados; e nem cada substituição ou deleção única de aminoácido dentro de (i) β-Klotho; (ii) FGFRlc, FGFR2c, FGFR3C ou FGFR4; ou (iii) um complexo que compreende β-Klotho e um de FGFRlc, FGFR2c, FGFR3C e FGFR4, ou o domínio extracelular das proteínas ou complexos citados necessariamente precisa afetar significativamente a afinidade de ligação.
A especificidade de epitopo e o(s) domínio(s) de ligação de uma proteína de ligação de antígeno podem ser determinados por diversos métodos. Alguns métodos, por exemplo, podem usar porções truncadas de um antígeno. Outros métodos utilizam antígeno mutado em um ou mais resíduos específicos como, por exemplo, pelo emprego de uma abordagem do tipo varredura de alanina ou varredura de arginina ou pela geração e estudo de proteínas quiméricas nas quais vários domínios, regiões ou aminoácidos são trocados entre duas proteínas (por exemplo, formas de
157 camundongo e humanas de um ou mais dos antigenos ou proteinas-alvo), ou por ensaios de proteção de protease.
Proteínas de ligação de antígeno de competição
Em outro aspecto, são fornecidas proteínas de ligação de antígeno que competem com um dos anticorpos ou fragmentos funcionais exemplificados pela ligação a (i) βKlotho; (ii) FGFRlc, FGFR2c, FGFR3C ou FGFR4; ou (iii) um complexo que compreende β-Klotho e um de FGFRlc, FGFR2c, FGFR3c e FGFR4. Essas proteínas de ligação de antígeno também podem se ligar ao mesmo epitopo que uma das proteínas de ligação de antígeno aqui exemplificadas, ou um epitopo superposto. Espera-se que proteínas de ligação de antígeno e fragmentos que competem ou se ligam ao mesmo epitopo que as proteínas de ligação de antígeno exemplificadas exibam propriedades funcionais similares. As proteínas de ligação de antígeno e fragmentos exemplificados incluem aqueles com as cadeias pesadas e leves H1-H18 e L1-L18, domínios da região variável VL1Vl18 e Vh1-Vh18 e CDRs aqui fornecidas, incluindo aquelas nas Tabelas 1, 2, 3 e 4. Dessa forma, como um exemplo específico, as proteínas de ligação de antígeno que são fornecidas incluem aquelas que competem com um anticorpo que compreende:
(a) 1, 2, 3, 4, 5 ou todas as 6 das CDRs listadas para um anticorpo listado nas Tabelas 3A e 3B, e 4A e 4B, e Tabela 6C, infra;
(b) uma VH e uma VL selecionadas de VL1-VL18 e VH1-VH18 e listadas para um anticorpo listado nas Tabelas 2A e 2B;
ou
158 (c) duas cadeias leves e duas cadeias pesadas como especificado para um anticorpo listado nas Tabelas IA e 12B e Tabela 6A, infra.
Dessa forma, em uma modalidade, a presente revelação fornece proteínas de ligação de antígeno que competem pela ligação a (i) β-Klotho; (ii) FGFRlc, FGFR2c, FGFR3c ou FGFR4; ou (iii) um complexo que compreende β-Klotho e um de FGFRlc, FGFR2c, FGFR3c e FGFR4 com um anticorpo de referência, em que o anticorpo de referência compreende uma combinação de seqüências do domínio variável da cadeia leve e da cadeia pesada selecionadas do grupo que consiste em L1H1, L2H2, L3H3, L3H4, L4H5, L5H6, L6H7, L7H8, L8H8, L9H9, L9H10, L10H11, L11H11, L12H12, L13H13, L14H14, L15H15, L16H16, L17H17 ou L18H18. Em outra modalidade, a presente revelação fornece anticorpos humanos que competem pela ligação a (i) β-Klotho; (ii) FGFRlc, FGFR2c, FGFR3c ou FGFR4; ou (iii) um complexo que compreende β-Klotho e um de FGFRlc, FGFR2c, FGFR3c e FGFR4 com um anticorpo de referência, em que o anticorpo de referência é 17C3, 22H5, 16H7, 24H11, 18G1, 17D8, 26H11, 12E4, 12C11, 21H2, 21B4, 18B11.1, 18B11.2, 20D4, 46D11, 40D2, 37D3, 39F7, 39F1 ou 3 9G5 .
Em uma modalidade adicional, ê fornecido um anticorpo humano isolado que se liga a (i) β-Klotho; (ii) FGFRlc, FGFR2c, FGFR3C ou FGFR4; ou (iii) um complexo que compreende β-Klotho e um de FGFRlc, FGFR2c, FGFR3c e FGFR4 com substancialmente a mesma Kd que um anticorpo de referência; inicia a sinalização do tipo FGF21 em um ensaio de ELK-Luciferase in vitro no mesmo grau que um anticorpo de referência; reduz a glicemia; reduz os níveis séricos de
159 ( j* lipídéos; e/ou compete pela ligação com o referido J ” anticorpo de referência a (i) β-Klotho; (ii) FGFRlc, FGFR2c, FGFR3c ou FGFR4; ou (iii) um complexo que compreende β-Klotho e um de FGFRlc, FGFR2c, FGFR3c e FGFR4, em que o anticorpo de referência é selecionado do grupo que consiste em 17C3, 22H5, 16H7, 24H11, 18G1, 17D8, 26H11,
12E4, 12C11, 21H2, 21B4, 18B11.1, 18B11.2, 20D4, 46D11,
40D2, 37D3, 39F7, 39F1 ou 39G5.
A habilidade para competir com um anticorpo pode ser determinada com o uso de qualquer ensaio adequado, por exemplo, aquele descrito no Exemplo 8, no qual proteínas de ligação de antígeno 17C3, 22H5, 16H7, 24H11, 18G1, 17D8, 26H11, 12E4, 12C11, 21H2, 21B4, 18B11.1, 18B11.2, 20D4,
46D11, 40D2, 37D3, 39F7, 39F1 ou 39G5 podem ser usadas como o anticorpo de referência.
Anticorpos monoclonais
As proteínas de ligação de antígeno que são fornecidas incluem anticorpos monoclonais que se ligam a (i) β-Klotho; (ii) FGFRlc, FGFR2C, FGFR3c ou FGFR4; ou (iii) um complexo 20 que compreende β-Klotho e um de FGFRlc, FGFR2c, FGFR3c e FGFR4, e induzem sinalização do tipo FGF21 em vários graus. Anticorpos monoclonais podem ser produzidos usando qualquer metodologia conhecida na técnica, por exemplo, por imortalização de células esplênicas coletadas do animal 25 transgênico após término do esquema de imunização. As células esplênicas podem ser imortalizadas usando qualquer metodologia conhecida na técnica, por exemplo, por sua fusão com células de mieloma para produzir hibridomas. Células de mieloma para uso em procedimentos de fusão 30 produtores de hibridoma preferivelmente são não produtores
160 de anticorpo, possuem eficiência de fusão elevada e deficiências em enzimas que as tornam incapazes de crescer em certos meios seletivos que apóiam o crescimento apenas das células fundidas desejadas (hibridomas). Exemplos de linhagens de células adequadas para uso em fusões de camundongo incluem Sp-20, P3-X63/Ag8, P3-X63-Ag8.653, NSl/l.Ag 4 1, Sp210-Agl4, FO, NSO/U, MPC-11, MPC11-X45-GTG 1.7 e S194/5XXO Bul; exemplos de linhagens de células usadas em fusões de rato incluem R210.RCY3, Y3-Ag 1.2.3, IR983F e 4B210. Outras linhagens de células úteis para fusões de células são U-266, GM1500-GRG2, LICR-LON-HMy2 e UC729-6.
Em alguns casos, uma linhagem de célula de hibridoma é produzida por imunização de um animal (por exemplo, um animal transgênico que possui seqüências de imunoglobulina humana) com um imunógeno de FGFRlc, β-Klotho ou FGFRlc e/ou β-Klotho (por exemplo, um complexo solúvel que compreende os domínios extracelulares de FGFRlc, FGFR2c, FGFR3c ou FGFR4 e/ou β-Klotho, como mostrado nos Exemplos 2 e 3; membranas nas quais os domínios extracelulares de FGFRlc, FGFR2c, FGFR3c ou FGFR4 e/ou β-Klotho são expressos, como mostrado nos Exemplos 1 e 3; ou células inteiras que expressam FGFRlc e/ou β-Klotho, como mostrado nos Exemplos 1 e 3); coleta das células esplênicas do animal imunizado; fusão das células esplênicas coletadas a uma linhagem de célula de mieloma, gerando, dessa forma, células de hibridoma; estabelecimento de linhagens de células de hibridoma pelas células de hibridoma, e identificação de uma linhagem de célula de hibridoma que produz um anticorpo que se liga a (i) β-Klotho; (ii) FGFRlc, FGFR2c, FGFR3c ou
161 j FGFR4; ou (iii) um complexo que compreende β-Klotho e um de FGFRlc, FGFR2c, FGFR3c e FGFR4 (por exemplo, como descrito no Exemplo 4) e pode induzir sinalização do tipo FGF21 (por exemplo, como descrito nos Exemplos 5-7) . Essas linhagens de células de hibridoma, e os anticorpos monoclonais produzidos por elas, formam aspectos da presente revelação.
Anticorpos monoclonais secretados por uma linhagem de célula de hibridoma podem ser purificados usando qualquer metodologia conhecida na técnica. Hibridomas ou mAbs podem ainda ser avaliados para a identificação de mAbs com propriedades particulares, por exemplo, a habilidade para induzir sinalização do tipo FGF21. Exemplos dessas avaliações são aqui fornecidos.
Anticorpos quimérlcos e humanizados
Anticorpos quiméricos e humanizados baseados nas seqüências apresentadas anteriormente podem facilmente ser gerados. Um exemplo é um anticorpo quimérico, que é um anticorpo composto por segmentos de proteína de diferentes anticorpos que são unidos covalentemente para produzir 20 cadeias leves ou pesadas funcionais de imunoglobulina ou porções imunologicamente funcionais destas. Geralmente, uma
porção da cadeia pesada e/ou da cadeia leve é idêntica ou
homóloga a uma seqüência correspondente em anticorpos
derivados de uma espécie em particular ou que pertencem a
25 uma classe ou subclasse de anticorpo em particular,
enquanto o restante da(s) cadeia(s) é idêntico ou homólogo a uma seqüência correspondente em anticorpos derivados de outra espécie ou que pertencem a outra classe ou subclasse de anticorpo. Para métodos relacionados aos anticorpos 30 quiméricos, veja, por exemplo, Patente U.S. N° 4.816.567; e
162
Morrison e cols., 198 5, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81: 6.851-6.855, que são aqui incorporados por referência. 0 enxerto de CDR é descrito, por exemplo, nas Patentes U.S. N° 6.180.370, N° 5.693.762, N° 5.693.761, N° 5.585.089 e N° 5.530.101.
Geralmente, o objetivo da produção de um anticorpo quimérico é criar uma quimera na qual o número de aminoácidos do paciente/espécie receptora desejada é maximizado. Um exemplo é o anticorpo com CDR enxertada, em que o anticorpo compreende uma ou mais regiões determinantes de complementaridade (CDRs) de uma espécie em particular ou que pertencem a uma classe ou subclasse de anticorpo em particular, enquanto o restante da(s) cadeia(s) do anticorpo é idêntico ou homólogo a uma seqüência correspondente em anticorpos derivados de outra espécie ou que pertencem a outra classe ou subclasse de anticorpo. Para uso em humanos, a região variável ou CDRs selecionadas de um anticorpo de roedor freqüentemente são enxertadas em um anticorpo humano, substituindo as regiões variáveis ou CDRs de ocorrência natural do anticorpo humano.
Um tipo útil de anticorpo quimérico é um anticorpo humanizado. Geralmente, um anticorpo humanizado é produzido por um anticorpo monoclonal despertado inicialmente em um animal não humano. Certos resíduos de aminoácidos nesse anticorpo monoclonal, tipicamente de porções de não reconhecimento de antígeno do anticorpo, são modificadas para serem homólogas aos resíduos correspondentes em um anticorpo humano de isótipo correspondente. A humanização pode ser realizada, por
163 exemplo, com o uso de vários métodos por substituição de pelo menos uma porção de uma região variável de roedor com as regiões correspondentes de um anticorpo humano (veja, por exemplo, Patentes U.S. N° 5.585.089 e N° 5.693.762; Jones e cols., 1986, Nature 321: 522-525; Riechmann e cols., 1988, Nature 332: 323-27; Verhoeyen e cols., 1988, Science 239: 1.534-1.536).
Em um aspecto, as CDRs das regiões variáveis da cadeia leve e pesada dos anticorpos aqui fornecidos (por exemplo, nas Tabelas 3 e 4) são enxertadas em regiões framework (FRs) de anticorpos da mesma espécie filogenética ou de uma espécie filogenética diferente. Por exemplo, as CDRs das regiões variáveis da cadeia pesada e leve VH15 VH2, VH3, Vh4, Vh5, Vh6, Vh7, Vh8, Vh9 , VH10, VH11, VH12, VH13, VH14, Vh15, Vh16, Vh17 ou Vh18 e/ou VL1, VL2, VL3, VL4, VL5, VL6, Vl7, Vl8, Vl9, Vl10, Vl11, Vh12, Vl13, Vl14 , VL15, VL16, Vl17 ou Vl18 podem ser enxertadas em FRs humanas de consenso. Para criar FRs humanas de consenso, FRs de várias seqüências de aminoácidos da cadeia pesada ou da cadeia leve humana podem ser alinhadas para identificar uma seqüência de aminoácidos de consenso. Em outras modalidades, as FRs de uma cadeia pesada ou cadeia leve aqui revelada são substituídas com as FRs de uma cadeia pesada ou cadeia leve diferente. Em um aspecto, aminoácidos raros nas FRs das cadeias pesadas e leves de uma proteína de ligação de antígeno (por exemplo, um anticorpo) que se liga especificamente a (i) β-Klotho; (ii) FGFRlc, FGFR2c, FGFR3c ou FGFR4; ou (iii) um complexo que compreende βKlotho e um de FGFRlc, FGFR2c, FGFR3C e FGFR4 não são substituídos, enquanto o resto dos aminoácidos da FR são
164 substituídos. Um aminoácido raro é um aminoácido específico que está em uma posição na qual esse aminoácido particular não é encontrado normalmente em uma FR. Alternativamente, as regiões variáveis enxertadas de uma cadeia pesada ou leve podem ser usadas com uma região constante que é diferente da região constante daquela cadeia pesada ou leve em particular, como aqui revelada. Em outras modalidades, as regiões variáveis enxertadas são parte de um anticorpo Fv de cadeia única.
Em certas modalidades, regiões constantes de espécies diferentes da humana podem ser usadas juntamente com a região variável humana (ou regiões) para produzir anticorpos híbridos.
Anticorpos totalmente humanos
Anticorpos totalmente humanos também são fornecidos pela presente revelação. Estão disponíveis métodos para a produção de anticorpos totalmente humanos específicos para certo antígeno, sem expor os seres humanos ao antígeno (anticorpos totalmente humanos). Um meio específico fornecido para implementação da produção de anticorpos totalmente humanos é a humanização do sistema imune humoral do camundongo. A introdução de loci de imunoglobulina humana (Ig) em camundongos nos quais os genes endógenos de Ig foram inativados é um meio de produção de anticorpos monoclonais totalmente humanos (mAbs) em camundongos, um animal que pode ser imunizado com qualquer antígeno desejado. A utilização de anticorpos totalmente humanos pode minimizar as respostas imunogênicas e alérgicas que algumas vezes podem ser causadas pela
165 administração de mAbs de camundongos ou derivados de camundongos a seres humanos como agentes terapêuticos.
Anticorpos totalmente humanos podem ser produzidos por imunização de animais transgênicos (tipicamente camundongos) que são capazes de produzir um repertório de anticorpos humanos na ausência de produção endógena de imunoglobulina. Antígenos para essa finalidade tipicamente possuem seis ou mais aminoácidos contíguos e, opcionalmente, são conjugados a um veículo, por exemplo, um hapteno. Veja, por exemplo, Jakobovits e cols., (1993) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 90: 2.551-2.555; Jakobovits e cols., (1993) Nature 362: 255-258; e Bruggermann e cols., (1993) Year in Immunol. 7: 33. Em um exemplo de um método desse tipo, animais transgênicos são produzidos por incapacitação dos loci endógenos de imunoglobulina de camundongo que codificam as cadeias pesadas e leves de imunoglobulina de camundongo, e inserção no genoma do camundongo de grandes fragmentos de loci que contêm DNA do genoma humano que codificam proteínas das cadeias pesadas e leves humanas. Animais parcialmente modificados, que possuem menos do que o complemento total de loci de imunoglobulina humana, são então acasalados de forma cruzada para obter um animal que possui todas as modificações desejadas do sistema imune. Quando recebem a administração de um imunógeno, esses animais transgênicos produzem anticorpos que são imunoespecíficos para o imunógeno, mas possuem seqüências de aminoácidos humanas, e não murídeas, incluindo as regiões variáveis. Para mais detalhes desses métodos, veja, por exemplo, WO 96/33735 e WO 94/02602. Métodos adicionais relacionados aos
166 camundongos transgênicos para produção de anticorpos humanos são descritos nas Patentes U.S. N° 5.545.807, N° 6.713.610, N° 6.673.986, N° 6.162.963, N° 5.545.807, N° 6.300.129, N° 6.255.458, N° 5.877.397, N° 5.874.299 e N° 5.545.806; nas Publicações PCT WO 91/10741, WO 90/04036, e em EP 546073 BI e EP 546073 Al.
Os camundongos transgênicos descritos acima, aqui denominados camundongos HuMab, contêm um minilócus do gene de imunoglobulina humana que codifica seqüências não reorganizadas da cadeia pesada ( [μ, mu] e [γ, gama] ) e da leve [K, kappa] da imunoglobulina humana, juntamente com mutações direcionadas que inativam os loci endógenos da cadeia μ [mu] e K [kappa] (Lonberg e cols., 1994, Nature 368: 856-859). Conseqüentemente, os camundongos exibem expressão reduzida de IgM ou [k, kappa] de camundongo em resposta à imunização, e os transgenes da cadeia pesada e leve humanas introduzidos passam por mudança de classe e mutação somática para gerar anticorpos monoclonais de IgG humana [k, kappa] com afinidade elevada (Lonberg e cols., supra; Lonberg e Huszar, (1995) Intern. Rev. Immunol. 13 : 65-93; Harding e Lonberg, (1995) Ann. N.Y. Acad. Sci. 764: 536-546). A preparação de camundongos HuMab é descrita em detalhe em Taylor e cols., (1992) Nucleic Acids Research 20: 6.287-6.295; Chen e cols., (1993) International Immunology 5_: 647-656; Tuaillon e cols., (1994) J. Immunol. 152: 2.912-2.920; Lonberg e cols., (1994) Nature 368 : 856859; Lonberg, (1994) Handbook of Exp. Pharmacology 113: 49101; Taylor e cols., (1994) International Immunology 6_: 579-591; Lonberg e Huszar, (1995) Intern. Rev. Immunol. 13: 65-93; Harding e Lonberg, (1995) Ann. N.Y. Acad. Sci. 764:
167
536-546; Fishwild e cols., (1996) Nature Biotechnology 14: 845-851; as referências citadas anteriormente são aqui incorporadas por referência em sua totalidade para todas as finalidades. Veja ainda as Patentes U.S. N° 5.545.806, N° 5.569.825, N° 5.625.126, N° 5.633.425, N° 5.789.650, N° 5.877.397, N° 5.661.016, N° 5.814.318, N° 5.874.299, e N° 5.770.429; bem como a Patente U.S. N° 5.545.807; Publicações Internacionais Nos WO 93/1227; WO 92/22646; e WO 92/03918, cujas revelações são aqui incorporadas por referência em sua totalidade para todas as finalidades. As tecnologias utilizadas para a produção de anticorpos humanos nesses camundongos transgênicos são reveladas também em WO 98/24893, e Mendez e cols., (1997) Nature Genetics 15 : 146-156, que são aqui incorporados por referência. Por exemplo, as cepas de camundongos transgênicos HCo7 e HCol2 podem ser usadas para gerar proteínas de ligação de antígeno (por exemplo, anticorpos) que se ligam a (i) β-Klotho; (ii) FGFRlc, FGFR2c, FGFR3c ou FGFR4; ou (iii) um complexo que compreende β-Klotho e um de FGFRlc, FGFR2c, FGFR3c e FGFR4, e podem induzir sinalização do tipo FGF21. Mais detalhes em relação à produção de anticorpos humanos com o uso de camundongos transgênicos são fornecidos nos exemplos abaixo.
Usando tecnologia de hibridoma, mAbs humanos antígenoespecíficos com a especificidade desejada podem ser produzidos e selecionados pelos camundongos transgênicos, tais como aqueles descritos acima. Esses anticorpos podem ser clonados e expressos usando um vetor e uma célula hospedeira adequados, ou os anticorpos podem ser colhidos de células de hibridoma cultivadas.
168
Anticorpos totalmente humanos também podem ser derivados de bibliotecas de apresentação em fago (como revelado em Hoogenboom e cols., (1991) J. Mol. Biol. 227: 381; e Marks e cols., (1991) J. Mol. Biol. 222 : 581). Técnicas de apresentação em fago mimetizam a seleção imune por meio da apresentação de repertórios de anticorpos na superfície de bacteriófagos filamentosos, e seleção subseqüente de fago por sua ligação a um antígeno de escolha. Uma técnica desse tipo é descrita na Publicação PCT N° WO 99/10494 (aqui incorporada por referência), que descreve o isolamento de anticorpos agonistas de afinidade elevada e funcionais para receptores MPL e msk com o uso de uma abordagem desse tipo.
Proteínas de ligação de antígeno biespecíficas ou bifuncionais
Também são fornecidos anticorpos biespecíficos e bifuncionais que incluem uma ou mais CDRs ou uma ou mais regiões variáveis, como descritas acima. Um anticorpo biespecífico ou bifuncional em alguns casos pode ser um anticorpo híbrido artificial que possui dois pares diferentes de cadeia pesada/leve e dois sítios de ligação diferentes. Anticorpos biespecíficos podem ser produzidos por diversos métodos, incluindo, sem limitação, fusão de hibridomas ou ligação de fragmentos Fab' . Veja, por exemplo, Songsivilai e Lachmann, 1990, Clin. Exp. Immunol. 79: 315-321; Kostelny e cols., 1992, J. Immunol. 148: 1.547-1.553. Quando uma proteína de ligação de antígeno da presente revelação se liga (i) tanto a β-Klotho quanto a um ou mais de FGFRlc, FGFR2C, FGFR3C ou FGFR4; ou (ii) um complexo que compreende β-Klotho e um de FGFRlc, FGFR2c,
169
FGFR3c e FGFR4, a ligação pode levar à ativação de atividade do tipo FGF21, como medida pelos ensaios do tipo FGF21 funcionais e de sinalização descritos nos Exemplos 57; quando uma proteína de ligação de antígeno desse tipo é um anticorpo, ele é citado como um anticorpo agonista.
Várias outras formas
Algumas das proteínas de ligação de antígeno que se ligam especificamente a (i) β-Klotho; (ii) FGFRlc, FGFR2c, FGFR3c ou FGFR4; ou (iii) um complexo que compreende βKlotho e um de FGFRlc, FGFR2c, FGFR3c e FGFR4 que são fornecidas na presente revelação incluem formas variantes das proteínas de ligação de antígeno aqui reveladas (por exemplo, aquelas que possuem as seqüências listadas nas Tabelas 1-4).
Em várias modalidades, as proteínas de ligação de antígeno aqui reveladas podem compreender um ou mais aminoácidos de ocorrência não natural. Por exemplo, algumas das proteínas de ligação de antígeno possuem uma ou mais substituições de aminoácidos de ocorrência não natural em uma ou mais das cadeias pesadas ou leves, regiões variáveis ou CDRs listadas nas Tabelas 1-4. Exemplos de aminoácidos de ocorrência não natural (que podem substituir qualquer um dos aminoácidos de ocorrência natural encontrados em qualquer seqüência aqui revelada, como desejado) incluem: 4-hidroxiprolina, γ-carboxiglutamato, ε-Ν,Ν,Νtrimetillisina, ε-Ν-acetillisina, O-fosfosserina, Nacetilserina, N-formilmetionina, 3-metilhistidina, 5hidroxilisina, σ-Ν-metilarginina, e outros aminoácidos e iminoácidos similares (por exemplo, 4-hidroxiprolina). Na anotação de polipeptídeos aqui usada, a direção da esquerda
170 é a direção do terminal amino e a direção da direita é a direção do terminal carboxil, de acordo com uso e convenção-padrão. Uma lista não limitante de exemplos de aminoácidos de ocorrência não natural que podem ser inseridos em uma seqüência de proteína de ligação de antígeno ou para substituir um resíduo do tipo selvagem em uma seqüência de ligação de antígeno inclui β-aminoácidos, homoaminoácidos, aminoácidos cíclicos e aminoácidos com cadeias laterais derivatizadas. Exemplos incluem (na forma L ou na forma D; abreviada entre parênteses): citrulina (Cit), homocitrulina (hCit), Να-metilcitrulina (NMeCit), Na-metilhomocitrulina (Na-MeHoCit), ornitina (Orn), NaMetilornitina (Να-MeOrn ou NMeOrn), sarcosina (Sar), homolisina (hLys ou hK) , homoarginina (hArg ou hR) , homoglutamina (hQ) , Ncx-metilarginina (NMeR) , Nametilleucina (Na-MeL ou NMeL), N-metilhomolisina (NMeHoK), Να-metilglutamina (NMeQ), norleucina (Nle), norvalina (Nva), 1,2,3,4-tetrahidroisoquinolina (Tie), ácido octahidroindol-2-carboxílico (Oic), 3-(1-naftil)alanina (1Nal) , 3-(2-naftil)alanina (2-Nal), 1,2,3,4tetrahidroisoquinolina (Tie), 2-indanilglicina (Igl), paraiodofenilalanina (pl-Phe), para-aminofenilalanina (4AmP ou 4-Amino-Phe), 4-guanidino fenilalanina (Guf), glicillisina (abreviado K (Νε-glicil) ou K(glicil) ou K(gly)), nitrofenilalanina (nitrophe), aminofenilalanina (aminophe ou Amino-Phe), benzilfenilalanina (benzilphe), ácido γcarboxiglutâmico (γ-carboxiglu), hidroxiprolina (hidroxipro), p-carboxil-fenilalanina (Cpa), ácido aaminoadípico (Aad), Να-metil valina (NMeVal), N-a-metil leucina (NMeLeu) , Ncx-metilnorleucina (NMeNle) ,
171 ciclopentilglicina (Cpg), ciclohexilglicina (Chg), acetilarginina (acetilarg), ácido a,β-diaminopropionóico (Dpr) , ácido a, γ-diaminobutirico (Dab), ácido diaminopropiônico (Dap), ciclohexilalanina (Cha), 4-metilfenilalanina (MePhe), β,β-difenil-alanina (BiPhA), ácido aminobutirico (Abu), 4-fenil-fenilalanina (ou bifenilalanina; 4Bip), ácido α-amino-isobutirico (Aib), beta-alanina, ácido beta-aminopropiônico, ácido piperidínico, ácido aminocaprióico, ácido aminoheptanóico, ácido aminopimélico, desmosina, ácido diaminopimélico, Netilglicina, N-etilaspargina, hidroxilisina,alohidroxilisina, isodesmosina, alo-isoleucina, Nmetilglicina, N-metilisoleucina, N-metilvalina,4hidroxiprolina (Hyp), γ-carboxiglutamato, ε-Ν,Ν,Νtrimetillisina, ε-Ν-acetillisina, O-fosfosserina, Nacetilserina, N-formilmetionina, 3-metilhistidina,5hidroxilisina, G5-metilarginina, ácido 4-amino-0-ftálico (4APA), e outros aminoácidos similares, e formas derivatizadas de qualquer um daqueles especificamente listados.
Adicionalmente, as proteínas de ligação de antígeno podem ter uma ou mais substituições conservadoras de aminoácidos em uma ou mais das cadeias pesadas ou leves, regiões variáveis ou CDRs listadas nas Tabelas 1-4. Os aminoácidos de ocorrência natural podem ser divididos em classes com base em propriedades comuns da cadeia lateral:
1) hidrofóbicos: norleucina, Met, Ala, Vai, Leu, Ile;
2) hidrofílicos neutros: Cys, Ser, Thr, Asn, Gin;
3) ácidos: Asp, Glu;
4) básicos: His, Lys, Arg;
172
5) resíduos que influenciam a orientação da cadeia: Gly, Pro; e
6) aromáticos: Trp, Tyr, Phe.
Substituições conservadoras de aminoácidos podem envolver a troca de um membro de uma dessas classes com outro membro da mesma classe. Substituições conservadoras de aminoácidos podem englobar resíduos de aminoácidos de ocorrência não natural, que são tipicamente incorporados por síntese química de peptídeos, e não por síntese em sistemas biológicos. Veja a Tabela 5, infra. Estes incluem peptidomiméticos e outras formas reversas ou invertidas de porções de aminoácido. Substituições não conservadoras podem envolver a troca de um membro de uma das classes acima por um membro de outra classe. Esses resíduos substituídos podem ser introduzidos em regiões do anticorpo que são homólogas aos anticorpos humanos, ou nas regiões não homólogas da molécula.
Na produção dessas alterações, de acordo com certas modalidades, o índice hidropático de aminoácidos pode ser considerado. 0 perfil hidropático de uma proteína é calculado atribuindo-se a cada aminoácido um valor numérico (índice de hidropatia) e depois ponderando-se repetitivamente esses valores ao longo da cadeia peptídica. A cada aminoácido foi atribuído um índice hidropático com base em sua hidrofobicidade e características de carga. Estes são: isoleucina (+4,5); valina (+4,2); leucina (+3,8); fenilalanina (+2,8); cisteína/cistina (+2,5); metionina (+1,9); alanina (+1,8); glicina (-0,4); treonina (-0,7); serina (-0,8); triptofano (-0,9); tirosina (-1,3); prolina (-1,6); histidina (-3,2); glutamato (-3,5);
173 glutamina (-3,5); aspartato (-3,5); asparagina (-3,5); lisina (-3,9); e arginina (-4,5).
A importância do perfil hidropático na conferência de função biológica interativa em uma proteína é compreendida na técnica (veja, por exemplo, Kyte e cols., 1982, J. Mol. Biol. 157: 105-131). Sabe-se que certos aminoácidos podem substituir outros aminoácidos que possuem um índice ou escore hidropático similar e ainda reter uma atividade biológica similar. Na realização de alterações com base no índice hidropático, em certas modalidades, a substituição de aminoácidos cujos índices hidropáticos estão dentro de ± 2 está incluída. Em alguns aspectos, aquelas que estão dentro de ± 1 estão incluídas e, em outros aspectos, aquelas dentro de ± 0,5 estão incluídas.
Também é compreendido na técnica que a substituição de aminoácidos semelhantes pode ser feita efetivamente com base na hidrofilia, particularmente quando a proteína ou o peptídeo biologicamente funcional assim criado se destina a uso em modalidades imunológicas, como no presente caso. Em certas modalidades, a maior hidrofilia local média de uma proteína, como determinado pela hidrofilia de seus aminoácidos adjacentes, está correlacionada com sua imunogenicidade e ligação de antígeno ou imunogenicidade, ou seja, com uma propriedade biológica da proteína.
Os seguintes valores de hidrofilia foram atribuídos a esses resíduos de aminoácidos: arginina (+3,0); lisina (+3,0); aspartato (+3,0 ± 1); glutamato (+3,0 ± 1); serina (+0,3); asparagina (+0,2); glutamina (+0,2); glicina (0); treonina (-0,4); prolina (-0,5 ± 1); alanina (-0,5); histidina (-0,5); cisteína (-1,0); metionina (-1,3); valina
174 (-1,5); leucina (-1,8); isoleucina (-1,8); tirosina (-2,3); fenilalanina (-2,5) e triptofano (-3,4). Na realização de alterações com base em valores de hidrofilia similares, em certas modalidades, a substituição de aminoácidos cujos valores de hidrofilia estão dentro de ± 2 está incluída, em outras modalidades, aqueles que estão dentro de ± 1 estão incluídos e, ainda em outras modalidades, aqueles que estão dentro de ± 0,5 estão incluídos. Em alguns casos, também é possível identificar epitopos de seqüências de aminoácidos 10 primárias com base na hidrofilia. Essas regiões também são denominadas regiões epitópicas centrais.
Substituições conservadoras de aminoácidos exemplares são mostradas na Tabela 5.
Tabela 5 - Substituições conservadoras de aminoácidos.
Resíduo original Substituições exemplares
Ala Ser
Arg Lys
Asn Gin, His
Asp Glu
Cys Ser
Gin Asn
Glu Asp
Gly Pro
His Asn, Gin
Ile Leu, Vai
Leu Ile, Vai
Lys Arg, Gin, Glu
Met Leu, Ile
Phe Met, Leu, Tyr
Ser Thr
175
Thr Ser
Trp Tyr
Tyr Trp, Phe
Val Ile, Leu
Aqueles habilitados na técnica serão capazes de determinar variantes de polipeptídeos adequadas como aqui apresentadas com o uso de técnicas bem conhecidas associadas às informações aqui fornecidas. Aqueles habilitados na técnica podem identificar áreas adequadas da molécula que podem ser alteradas sem destruir a atividade por direcionamento a regiões que supostamente não são importantes para a atividade. Aqueles habilitados na técnica também serão capazes de identificar resíduos e porções das moléculas que estão conservadas entre polipeptídeos similares. Em modalidades adicionais, até mesmo áreas que podem ser importantes para a atividade biológica ou para a estrutura podem estar sujeitas às substituições conservadoras de aminoácidos, sem destruição da atividade biológica ou sem afetar adversamente a estrutura do polipeptídeo.
Adicionalmente, aqueles habilitados na técnica podem revisar estudos de estrutura-função que identificam resíduos em polipeptídeos similares que são importantes para a atividade ou estrutura. À luz dessa comparação, pode-se prever a importância de resíduos de aminoácidos em uma proteína que correspondem aos resíduos de aminoácidos importantes para atividade ou estrutura em proteínas similares. Aqueles habilitados na técnica podem optar por substituições de aminoácidos quimicamente similares para esses resíduos de aminoácidos presumivelmente importantes.
176
Aqueles habilitados na técnica também podem analisar a estrutura tridimensional e a seqüência de aminoácidos em relação àquela estrutura em polipeptídeos similares. À luz dessa informação, aqueles habilitados na técnica podem 5 prever o alinhamento de resíduos de aminoácidos de um anticorpo com relação à sua estrutura tridimensional. Aqueles habilitados na técnica podem escolher não fazer mudanças radicais em resíduos de aminoácidos que presumivelmente estão na superfície da proteína, na medida 10 em que esses resíduos podem estar envolvidos em interações importantes com outras moléculas. Além disso, aqueles habilitados na técnica podem gerar variantes de teste contendo uma única substituição de aminoácido em cada resíduo de aminoácido desejado. Essas variantes podem então 15 ser avaliadas com o uso de ensaios para sinalização do tipo
FGF21 (veja os Exemplos aqui fornecidos), gerando, dessa forma, informações em relação a quais aminoácidos podem ser alterados e quais não devem ser alterados. Em outras palavras, com base nas informações reunidas desses 20 experimentos de rotina, aqueles habilitados na técnica podem facilmente determinar as posições de aminoácidos onde substituições adicionais devem ser evitadas, isoladamente ou em combinação com outras mutações.
Diversas publicações científicas se dedicaram à 25 previsão da estrutura secundária. Veja Moult, (1996) Curr.
Op. in Biotech. Ί_· 422-427; Chou e cols., (1974) Biochem. 13: 222-245; Chou e cols., (1974) Biochemistry 113: 211222; Chou e cols., (1978) Adv. Enzymol. Relat. Areas Mol. Biol. 47 : 45-148; Chou e cols., (1979) Ann. Rev. Biochem.
47: 251-276; e Chou e cols., (1979) Biophys. J. 26: 367177
384. Além disso, programas de computador estão disponíveis atualmente para ajudar com a previsão da estrutura secundária. Um método de prever a estrutura secundária se baseia na modelagem de homologia. Por exemplo, dois 5 polipeptídeos ou proteínas que possuem uma identidade de seqüência maior do que 30% ou uma similaridade maior do que 40% podem ter topologias estruturais similares. O crescimento da base de dados estrutural de proteínas (PDB) forneceu uma previsibilidade aumentada da estrutura 10 secundária, incluindo o número potencial de dobras dentro da estrutura de um polipeptídeo ou de uma proteína. Veja Holm e cols., (1999) Nucl. Acid. Res. 27 : 244-247. Foi sugerido (Brenner e cols., (1997) Curr. Op. Struct. Biol.
Ί_·. 369-376) que há um número limitado de dobras em certo 15 polipeptídeo ou proteína e que, uma vez que um número crítico de estruturas tenha sido resolvido, a previsão estrutural se tornará dramaticamente mais precisa.
Métodos adicionais de previsão da estrutura secundária incluem threading (Jones, (1997) Curr. Opin. Struct.
Biol. Ί_: 377-387; Sippl e cols., (1996) Structure 4: 1519), análise de perfil (Bowie e cols., (1991) Science 253 : 164-170; Gribskov e cols., (1990) Meth. Enzym. 183 : 146-159; Gribskov e cols., (1987) Proc. Nat. Acad. Sci. 84: 4.355-4.358) e ligação evolutiva (veja, Holm, (1999) 25 supra; e Brenner, (1997) supra) .
Em algumas modalidades, são feitas substituições de aminoácidos que: (1) reduzem a suscetibilidade à proteólise, (2) reduzem a suscetibilidade à oxidação, (3) alteram a afinidade de ligação para formação de complexos 30 protéicos, (4) alteram as afinidades de ligação de ligante
178 ou antígeno e/ou (4) conferem ou modificam outras propriedades físico-químicas ou funcionais nesses polipeptídeos. Por exemplo, substituições de aminoácidos únicas ou múltiplas (em certas modalidades, substituições conservadoras de aminoácidos) podem ser feitas na seqüência de ocorrência natural. Podem ser feitas substituições naquela porção do anticorpo que se situa fora do(s) domínio(s) que forma contatos intermoleculares. Nessas modalidades, podem ser usadas substituições conservadoras de aminoácidos que não alteram substancialmente as características estruturais da seqüência-parente (por exemplo, uma ou mais trocas de aminoácidos que não rompem a estrutura secundária que caracteriza a proteína de ligação de antígeno parente ou nativa). Exemplos de estruturas secundárias e terciárias de polipeptídeo reconhecidos na técnica são descritos em Proteins, Structures and Molecular Principles (Creighton, Ed.), 1984, W.H. Nova York: Freeman e Company; Introduction to Protein Structure (Branden e Tooze, eds.), 1991, Nova York: Garland Publishing; e Thornton e cols., (1991) Nature 3 54 : 105, que são, todos, aqui incorporados por referência.
Variantes de anticorpo preferidas adicionais incluem variantes cisteína nas quais um ou mais resíduos de cisterna na seqüência de aminoácidos parente ou nativa são deletados ou substituídos com outro aminoácido (por exemplo, serina). Variantes de cisteína são úteis, inter alia, quando anticorpos devem ser redobrados em uma conformação biologicamente ativa. Variantes de cisteína podem ter menos resíduos de cisteína do que o anticorpo nativo, e tipicamente possuem um número par para minimizar
179 interações que resultam de cisteínas não pareadas.
As cadeias pesadas e leves, domínios de regiões variáveis e CDRs que são revelados podem ser usados para preparar polipeptídeos que contêm uma região de ligação de antígeno que pode se ligar especificamente a (i) β-Klotho; (ii) FGFRlc, FGFR2c, FGFR3c ou FGFR4; ou (iii) um complexo que compreende β-Klotho e um de FGFRlc, FGFR2c, FGFR3c e FGFR4, e pode induzir sinalização do tipo FGF21. Por exemplo, uma ou mais das CDRs listadas nas Tabelas 3 e 4 podem ser incorporadas em uma molécula (por exemplo, um polipeptídeo) covalentemente ou não covalentemente para fazer uma imunoadesão. Uma imunoadesão pode incorporar uma(s) CDR(s) como parte de uma cadeia polipeptídica maior, pode ligar covalentemente uma(s) CDR(s) a outra cadeia polipeptídica, ou pode incorporar uma(s) CDR(s) não covalentemente. A(s) CDR(s) permite que a imunoadesão se ligue especificamente a um antígeno de interesse em particular (por exemplo, (i) β-Klotho; (ii) FGFRlc, FGFR2c, FGFR3c ou FGFR4; ou (iii) um complexo que compreende βKlotho e um de FGFRlc, FGFR2c, FGFR3c e FGFR4 ou um epitopo neles).
As cadeias pesadas e leves, domínios de regiões variáveis e CDRs que são revelados podem ser usados para preparar polipeptídeos que contêm uma região de ligação de antígeno que pode se ligar especificamente a (i) β-Klotho; (ii) FGFRlc, FGFR2c, FGFR3C ou FGFR4; ou (iii) um complexo que compreende β-Klotho e um de FGFRlc, FGFR2c, FGFR3c e FGFR4, e pode induzir sinalização do tipo FGF21. Por exemplo, uma ou mais das CDRs listadas nas Tabelas 3 e 4 podem ser incorporadas em uma molécula (por exemplo, um
180 polipeptídeo) que é estruturalmente similar a uma metade de anticorpo que compreende a cadeia pesada, a cadeia leve de uma proteína de ligação de antígeno pareadas com um fragmento Fc, de tal forma que a região de ligação de antígeno seja monovalente (como um fragmento Fab), mas com uma porção Fc dimérica.
Também são fornecidos miméticos (por exemplo, miméticos de peptídeo ou peptidomiméticos) com base nos domínios da região variável e CDRs que são aqui descritos. Esses análogos podem ser peptídeos, não peptídeos ou combinações de regiões de peptídeo e não peptídeo; Fauchere, 1986, Adv. Drug Res. 15:29; Veber e Freidinger, 1985, TINS página 392; e Evans e cols., 1987, J. Med. Chem. 30: 1.22 9, que são aqui incorporados por referência para qualquer finalidade. Miméticos de peptídeo que são estruturalmente similares aos peptídeos terapeuticamente úteis podem ser usados para produzir um efeito terapêutico ou profilático similar. Esses compostos frequentemente são desenvolvidos com o auxílio de modelagem molecular computadorizada. Geralmente, peptidomiméticos são proteínas que são estruturalmente similares a um anticorpo que exibe uma atividade biológica desejada, por exemplo, a habilidade para se ligar especificamente a (i) β-Klotho; (ii) FGFRlc, FGFR2C, FGFR3c ou FGFR4; ou (iii) um complexo que compreende β-Klotho e um de FGFRlc, FGFR2c, FGFR3c e FGFR4, mas possuem uma ou mais ligações peptídicas opcionalmente substituídas por uma ligação selecionada de: -CH2NH-, CH2S-, -CH2-CH2-, -CH-CH-(cis e trans), -COCH2-, -CH(OH)CH2e -CH2SO-, por métodos bem conhecidos na técnica. A substituição sistemática de um ou mais aminoácidos de uma
181 seqüência de consenso com um D-aminoácido do mesmo tipo (por exemplo, D-lisina no lugar de L-lisina) pode ser usada em certas modalidades para gerar proteínas mais estáveis. Além disso, peptídeos restritos que compreendem uma seqüência de consenso ou uma variação da seqüência de consenso substancialmente idêntica podem ser gerados por métodos conhecidos na técnica (Rizo e Gierasch, 1992, Ann. Rev. Biochem. 61: 387, aqui incorporado por referência), por exemplo, por adição de resíduos de cisteína internos capazes de formar pontes dissulfeto intramoleculares que ciclizam o peptídeo.
Também são fornecidos derivados das proteínas de ligação de antígeno que se ligam especificamente a (i) βKlotho; (ii) FGFRlc, FGFR2C, FGFR3C ou FGFR4; ou (iii) um complexo que compreende β-Klotho e um de FGFRlc, FGFR2c, FGFR3c e FGFR4 que são aqui descritas. As proteínas de ligação de antígeno derivatizadas podem compreender qualquer molécula ou substância que transmita uma propriedade desejada ao anticorpo ou fragmento, por exemplo, meia-vida aumentada em um uso particular. A proteína de ligação de antígeno derivatizada pode compreender, por exemplo, uma porção (ou marcação) detectável (por exemplo, uma molécula radioativa, colorimétrica, antigênica ou enzimática, um glóbulo detectável (como, por exemplo, um glóbulo magnético ou eletrodenso (por exemplo, ouro) ) , ou uma molécula que se liga a outra molécula (por exemplo, biotina ou estreptavidina), uma porção terapêutica ou diagnostica (por exemplo, uma porção radioativa, citotóxica ou farmaceuticamente ativa), ou uma molécula que aumenta a
182 adequabilidade da proteína de ligação de antígeno para um uso em particular (por exemplo, administração a um indivíduo, por exemplo, um indivíduo humano, ou outros usos in vivo ou in vitro) . Exemplos de moléculas que podem ser usadas para derivatizar uma proteína de ligação de antígeno incluem albumina (por exemplo, albumina sérica humana) e polietileno glicol (PEG). Derivados ligados à albumina e PEGuilados de proteínas de ligação de antígeno podem ser preparados com o uso de metodologias bem conhecidas na técnica. Certas proteínas de ligação de antígeno incluem um polipeptídeo de cadeia única PEGuilado, como aqui descrito. Em uma modalidade, a proteína de ligação de antígeno é conjugada ou de algum outro modo ligada à transtiretina (TTR) ou uma variante de TTR. A variante de TTR ou TTR pode ser modicada quimicamente com, por exemplo, uma substância química selecionada do grupo que consiste em dextrana, poli(n-vinil pirrolidona), polietileno glicóis, homopolímeros de propropileno glicol, copolímeros de óxido de polipropileno/óxido de etileno, polióis polioxietilados e álcoois polivinílicos.
Outros derivados incluem conjugados covalentes ou agregativos das proteínas de ligação de antígeno que se ligam especificamente a (i) β-Klotho; (ii) FGFRlc, FGFR2c, FGFR3c ou FGFR4; ou (iii) um complexo que compreende βKlotho e um de FGFRlc, FGFR2c, FGFR3c e FGFR4 que são aqui reveladas com outras proteínas ou polipeptídeos, por exemplo, por expressão de proteínas de fusão recombinantes que compreendem polipeptídeos heterólogos fundidos ao terminal N ou terminal C de uma proteína de ligação de antígeno que induz sinalização do tipo FGF21. Por exemplo,
183 o peptídeo conjugado pode ser um polipeptídeo sinalizador heterólogo (ou líder), por exemplo, o líder de alfa-fator de levedura, ou um peptídeo como, por exemplo, um tag de epitopo. Uma proteína de fusão que contém uma proteína de ligação de antígeno da presente revelação pode compreender peptídeos adicionados para facilitar a purificação ou identificação de uma proteína de ligação de antígeno que se liga especificamente a (i) β-Klotho; (ii) FGFRlc, FGFR2c, FGFR3c ou FGFR4; ou (iii) um complexo que compreende βKlotho e um de FGFRlc, FGFR2c, FGFR3c e FGFR4 (por exemplo, um tag poliHis) e que pode induzir sinalização do tipo FGF21. Uma proteína de ligação de antígeno que se liga especificamente a (i) β-Klotho; (ii) FGFRlc, FGFR2c, FGFR3c ou FGFR4; ou (iii) um complexo que compreende β-Klotho e um de FGFRlc, FGFR2c, FGFR3c e FGFR4 também pode ser ligada ao peptídeo FLAG, como descrito em Hopp e cols., 1988, Bio/Technology 6: 1.204; e Patente U.S. N° 5.011.912. O peptídeo FLAG é altamente antigênico e fornece um epitopo ligado reversivelmente a um anticorpo monoclonal específico (mAb), permitindo ensaio rápido e purificação fácil da proteína recombinante expressa. Reagentes úteis para a preparação de proteínas de fusão nas quais o peptídeo FLAG está fundido a certo polipeptídeo estão disponíveis comercialmente (Sigma, St. Louis, MO).
Multímeros que compreendem uma ou mais proteínas de ligação de antígeno que se ligam especificamente a (i) βKlotho; (ii) FGFRlc, FGFR2c, FGFR3c ou FGFR4; ou (iii) um complexo que compreende β-Klotho e um de FGFRlc, FGFR2c, FGFR3c e FGFR4 formam outro aspecto da presente revelação. Multímeros podem assumir a forma de dímeros, trímeros ou
184 multímeros maiores ligados covalentemente ou não covalentemente. Multímeros que compreendem duas ou mais proteínas de ligação de antígeno que se ligam a (i) βKlotho; (ii) FGFRlc, FGFR2c, FGFR3C ou FGFR4; ou (iii) um complexo que compreende β-Klotho e um de FGFRlc, FGFR2c, FGFR3c e FGFR4 e que podem induzir sinalização do tipo FGF21 são contemplados para uso como substâncias terapêuticas, diagnosticas e também para outros usos, com um exemplo de um multímero desse tipo sendo um homodímero. Outros multímeros exemplares incluem heterodímeros, homotrímeros, heterotrímeros, homotetrâmeros, heterotetrâmeros etc.
Uma modalidade é dirigida aos multímeros que compreendem múltiplas proteínas de ligação de antígeno que se ligam especificamente a (i) β-Klotho; (ii) FGFRlc, FGFR2c, FGFR3c ou FGFR4; ou (iii) um complexo que compreende β-Klotho e um de FGFRlc, FGFR2c, FGFR3c e FGFR4 unidas por meio de interações covalentes ou não covalentes entre porções peptídicas fundidas a uma proteína de ligação de antígeno que se liga especificamente a (i) β-Klotho; (ii) FGFRlc, FGFR2C, FGFR3c ou FGFR4; ou (iii) um complexo que compreende β-Klotho e um de FGFRlc, FGFR2c, FGFR3c e FGFR4. Esses peptídeos podem ser vinculadores peptídicos (espaçadores), ou peptídeos que possuem a propriedade de promover multimerização. Zíperes de leucina e certos polipeptídeos derivados de anticorpos estão entre os peptídeos que podem promover multimerização de proteínas de ligação de antígeno a eles anexadas, como aqui descrito com mais detalhe.
Em modalidades particulares, os multímeros compreendem
185 de duas a quatro proteínas de ligação de antígeno que se ligam a (i) β-Klotho; (ii) FGFRlc, FGFR2c, FGFR3C ou FGFR4; ou (iii) um complexo que compreende β-Klotho e um de FGFRlc, FGFR2c, FGFR3c e FGFR4. A proteína de ligação de antígeno porções do multímero pode estar em qualquer uma das formas descritas acima, por exemplo, variantes ou fragmentos. De preferência, os multímeros compreendem proteínas de ligação de antígeno que possuem a habilidade para se ligar especificamente a (i) β-Klotho; (ii) FGFRlc, FGFR2c, FGFR3c ou FGFR4; ou (iii) um complexo que compreende β-Klotho e um de FGFRlc, FGFR2c, FGFR3c e FGFR4.
Em uma modalidade, um oligômero é preparado usando polipeptídeos derivados de imunoglobulinas. A preparação de proteínas de fusão que compreendem certos polipeptídeos heterólogos fundidos a várias porções de polipeptídeos derivados de anticorpo (incluindo o domínio Fc) foi descrita, por exemplo, por Ashkenazi e cols., (1991) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 88: 10.53 5; Byrn e cols., (1990) Nature 344: 677; e Hollenbaugh e cols., 1992 Construction of Immunoglobulin Fusion Proteins, em Current Protocols in Immunology, Suplemento 4, páginas 10.19.1-10.19.11.
Uma modalidade compreende um dímero que compreende duas proteínas de fusão criadas por fusão de uma proteína de ligação de antígeno que se liga especificamente a (i) βKlotho; (ii) FGFRlc, FGFR2c, FGFR3C ou FGFR4; ou (iii) um complexo que compreende β-Klotho e um de FGFRlc, FGFR2c, FGFR3c e FGFR4 à região Fc de um anticorpo. O dímero pode ser feito, por exemplo, por inserção de uma fusão gênica que codifica a proteína de fusão em um vetor de expressão apropriado, que expressa a fusão gênica em células
186 hospedeiras transformadas com o vetor de expressão recombinante, e que permite que a proteína de fusão expressa seja montada de forma semelhante a moléculas de anticorpo, em que ligações dissulfeto intercadeias se formam entre as porções Fc para gerar o dímero.
O termo polipeptídeo Fc, como aqui usado, inclui formas nativas e de muteína de polipeptídeos derivados da região Fc de um anticorpo. Formas truncadas desses polipeptídeos que contêm a região de dobradiça que promove dimerização também estão incluídas. Proteínas de fusão que compreendem porções Fc (e oligômeros formados a partir delas) oferecem a vantagem de fácil purificação por cromatografia por afinidade em relação às colunas de Proteína A ou Proteína G.
Um polipeptídeo Fc adequado, descrito no Pedido PCT WO 93/10151 e Patentes U.S. Nos 5.426.048 e N° 5.262.522, é um polipeptídeo de única cadeia que se estende da região de dobradiça do terminal N até o terminal C nativo da região Fc de um anticorpo humano IgGl. Outro polipeptídeo Fc útil é a muteína Fc descrita na Patente U.S. N° 5.457.035 e em Baum e cols., (1994) EMBO J. 13: 3.992-4001. A seqüência de aminoácidos dessa muteína é idêntica àquela da seqüência de Fc nativa apresentada em WO 93/10151, exceto que o aminoácido 19 foi alterado de Leu para Ala, o aminoácido 20 foi alterado de Leu para Glu e o aminoácido 22 foi alterado de Gly para Ala. A muteína exibe afinidade reduzida por receptores de Fc.
Em outras modalidades, a porção variável das cadeias pesadas e/ou leves de uma proteína de ligação de antígeno como aquela aqui revelada podem substituir a porção
187 variável de uma cadeia pesada e/ou leve de anticorpo.
Alternativamente, o oligômero é uma proteína de fusão que compreende múltiplas proteínas de ligação de antígeno que se ligam especificamente a (i) β-Klotho; (ii) FGFRlc, FGFR2C, FGFR3C ou FGFR4; ou (iii) um complexo que compreende β-Klotho e um de FGFRlc, FGFR2c, FGFR3c e FGFR4, com ou sem vinculadores peptídicos (peptídeos espaçadores). Entre os vinculadores peptídicos adequados estão aqueles descritos nas Patentes U.S. Nos 4.751.180 e N° 4.935.233.
Outro método para preparação de derivados oligoméricos que compreendem aquelas proteínas de ligação de antígeno que se ligam especificamente a (i) β-Klotho; (ii) FGFRlc, FGFR2c, FGFR3C ou FGFR4; ou (iii) um complexo que compreende β-Klotho e um de FGFRlc, FGFR2c, FGFR3c e FGFR4 envolve o uso de um zíper de leucina. Domínios de zíper de leucina são peptídeos que promovem a oligomerização das proteínas nas quais são encontrados. Os zíperes de leucina foram originalmente identificados em várias proteínas de ligação de DNA (Landschulz e cols., (1988) Science 240:1759), e desde então foram encontrados em diversas proteínas diferentes. Entre os zíperes de leucina conhecidos, estão peptídeos de ocorrência natural e derivados destes que dimerizam ou trimerizam. Exemplos de domínios de zíper de leucina adequados à produção de proteínas oligoméricas solúveis são descritos no Pedido PCT WO 94/10308, e o zíper de leucina derivado da tensoativo proteína tensoativa do pulmão D (SPD) descrito em Hoppe e cols., (1994) FEBS Letters 344: 191, aqui incorporado por referência. 0 uso de um zíper de leucina modificado que permite a trimerização estável de uma proteína heteróloga a
188 ele fundida é descrito em Fanslow e cols., (1994) Semin. Immunol. 6: 267-278. Em uma abordagem, proteínas de fusão recombinantes que compreendem uma proteína de ligação de antígeno fragmento ou derivado que se liga especificamente a (i) β-Klotho; (ii) FGFRlc, FGFR2c, FGFR3c ou FGFR4; ou (iii) um complexo que compreende β-Klotho e um de FGFRlc, FGFR2c, FGFR3c e FGFR4 fundida a um peptídeo do zíper de leucina são expressas em células hospedeiras adequadas, e os fragmentos ou derivados da proteína de ligação de antígeno oligomérica solúvel que se formam são recuperados do sobrenadante de cultura.
Em certas modalidades, a proteína de ligação de antígeno possui uma KD (afinidade de ligação de equilíbrio) de menos do que 1 pM, 10 pM, 100 pM, 1 nM, 2 nM, 5 nM, 10 nM, 25 nM ou 50 nM.
Em outro aspecto, a presente revelação fornece uma proteína de ligação de antígeno que possui uma meia-vida de pelo menos um dia in vitro ou in vivo (por exemplo, quando administrada a um indivíduo humano). Em uma modalidade, a proteína de ligação de antígeno possui uma meia-vida de pelo menos três dias. Em outra modalidade, o anticorpo ou porção deste possui uma meia-vida de quatro dias ou mais. Em outra modalidade, o anticorpo ou porção deste possui uma meia-vida de oito dias ou mais. Em outra modalidade, o anticorpo ou porção deste possui uma meia-vida de dez dias ou mais. Em outra modalidade, o anticorpo ou porção deste possui uma meia-vida de onze dias ou mais. Em outra modalidade, o anticorpo ou porção deste possui uma meiavida de quinze dias ou mais. Em outra modalidade, o anticorpo ou porção de ligação de antígeno deste é
189 derivatizado ou modificado de tal forma que ele possua uma meia-vida mais longa, quando comparado com o anticorpo não derivatizado ou não modificado. Em outra modalidade, uma proteína de ligação de antígeno que se liga especificamente a (i) β-Klotho; (ii) FGFRlc, FGFR2C, FGFR3C ou FGFR4; ou (iii) um complexo que compreende β-Klotho e um de FGFRlc, FGFR2c, FGFR3c e FGFR4 contém mutações pontuais para aumentar a meia-vida sérica, por exemplo, como descrito em WO 00/09560, publicado em 24 de fevereiro de 2000, incorporado por referência.
Glicosilação
Uma proteína de ligação de antígeno que se liga especificamente a (i) β-Klotho; (ii) FGFRlc, FGFR2c, FGFR3c ou FGFR4; ou (iii) um complexo que compreende β-Klotho e um de FGFRlc, FGFR2C, FGFR3C e FGFR4 pode ter um padrão de glicosilação que é diferente ou alterado em relação àquele encontrado na espécie nativa. Como é conhecido na técnica, os padrões de glicosilação podem depender tanto da seqüência da proteína (por exemplo, da presença ou ausência de resíduos de aminoácidos de glicosilação particulares, discutidos abaixo) quanto da célula hospedeira ou organismo no qual a proteína é produzida. Sistemas de expressão particulares serão discutidos abaixo.
A glicosilação de polipeptídeos é tipicamente ligada ao N ou ligada ao 0. Ligada ao N se refere a adesão da porção de carboidrato à cadeia lateral de um resíduo de asparagina. As seqüências tripeptídicas asparagina-X-serina e asparagina-X-treonina, em que X é qualquer aminoácido, exceto prolina, são as seqüências de reconhecimento para adesão enzimática da porção de carboidrato à cadeia lateral
190 de asparagina. Dessa forma, a presença de uma dessas seqüências tripeptídicas em um polipeptídeo cria um sítio de glicosilação potencial. Glicosilação ligada ao O se refere à adesão de um dos açúcares N-acetilgalactosamina, galactose ou xilose, a um hidroxiaminoácido, mais comumente serina ou treonina, embora 5-hidroxiprolina ou 5hidroxilisina também possam ser usadas.
A adição de sítios de glicosilação à proteína de ligação de antígeno é convenientemente obtida por alteração 10 da seqüência de aminoácidos de forma que ela contenha uma ou mais das seqüências tripeptídicas descritas acima (para sítios de glicosilação ligados ao N) . A alteração também pode ser feita pela adição, ou substituição, de um ou mais resíduos de serina ou treonina à seqüência de partida (para 15 sítios de glicosilação ligados ao O). Para facilitar, a seqüência de aminoácidos da proteína de ligação de antígeno pode ser alterada por meio de alterações no nível de DNA, particularmente por mutação do DNA que codifica o polipeptídeo-alvo em bases pré-selecionadas de tal forma
2 0 que sejam gerados códons que serão traduzidos nos
aminoácidos desej ados.
Outro meio para aumentar o número de porções de
carboidrato na proteína de ligação de antígeno é por
acoplamento químico ou enzimático de glicosídeos à
proteína. Esses procedimentos são vantajosos, na medida em que não necessitam da produção da proteína em uma célula hospedeira que possui capacidades de glicosilação para glicosilação ligada ao N e ao 0. Dependendo do modo de acoplamento usado, o açúcar (ou açúcares) pode ser anexado 30 (a) à arginina e histidina, (b) aos grupos carboxil livres,
191 (c) aos grupos sulfidrila livres, tais como aqueles de cisteína, (d) aos grupos hidroxil livres, tais como aqueles de serina, treonina ou hidroxiprolina, (e) aos resíduos aromáticos, tais como aqueles de fenilalanina, tirosina ou triptofano, ou (f) ao grupo amida de glutamina. Esses métodos são descritos em WO 87/05330 e em Aplin e Wriston, (1981) CRC Crit. Rev. Biochem. , páginas 259-306.
A remoção de porções de carboidrato presentes na proteína de ligação de antígeno de partida pode ser obtida química ou enzimaticamente. A desglicosilação química requer a exposição da proteína ao composto ácido trifluormetanossulfônico, ou a um composto equivalente. Esse tratamento resulta na divagem da maioria ou de todos os açúcares, exceto o açúcar de ligação (Nacetilglucosamina ou N-acetilgalactosamina), deixando o polipeptídeo intacto. A desglicosilação química é descrita por Hakimuddin e cols., (1987) Arch. Biochem. Biophys. 259: 52 e por Edge e cols., (1981) Anal. Biochem. 118:131. A divagem enzimática de porções de carboidrato em polipeptídeos pode ser obtida pelo uso de diversas endo- e exo-glicosidases, como descrito por Thotakura e cols., (1987) Meth. Enzymol. 138: 350. A glicosilação em sítios de glicosilação potenciais pode ser evitada pelo uso do composto tunicamicina, como descrito por Duskin e cols., (1982) J. Biol. Chem. 257: 3.105. A tunicamicina bloqueia a formação de ligações proteína-N-glicosídeo.
Dessa forma, aspectos da presente revelação incluem variantes de glicosilação de proteínas de ligação de antígeno que se ligam especificamente a (i) β-Klotho; (ii) FGFRlc, FGFR2c, FGFR3c ou FGFR4; ou (iii) um complexo que
192 compreende β-Klotho e um de FGFRlc, FGFR2c, FGFR3c e FGFR4, em que o número e/ou tipo de sítio (s) de glicosilação foi alterado, comparada com as seqüências de aminoácidos do polipeptídeo-parente. Em certas modalidades, variantes da proteína de anticorpo compreendem um número maior ou menor de sítios de glicosilação ligados ao N do que o anticorpo nativo. Um sítio de glicosilação ligado ao N é caracterizado pela seqüência: Asn-X-Ser ou Asn-X-Thr, em que o resíduo de aminoácido designado X pode ser qualquer resíduo de aminoácido, exceto prolina. A substituição de resíduos de aminoácidos para criar essa seqüência fornece um novo sítio potencial para a adição de uma cadeia de carboidrato ligada ao N. Alternativamente, substituições que eliminam ou alteram essa seqüência evitarão a adição de uma cadeia de carboidrato ligada ao N presente no polipeptídeo nativo. Por exemplo, a glicosilação pode ser reduzida pela deleção de uma Asn ou por substituição da Asn com um aminoácido diferente. Em outras modalidades, um ou mais novos sítios ligados ao N são criados. Anticorpos tipicamente possuem um sítio de glicosilação ligado ao N na região Fc.
Marcadores e grupos efetores
Em algumas modalidades, uma proteína de ligação de antígeno que se liga especificamente a (i) β-Klotho; (ii) FGFRlc, FGFR2c, FGFR3c ou FGFR4; ou (iii) um complexo que compreende β-Klotho e um de FGFRlc, FGFR2c, FGFR3c e FGFR4 compreende um ou mais marcadores. 0 termo grupo de marcação ou marcador significa qualquer marcador detectável. Exemplos de grupos de marcação adequados incluem, sem limitação, os seguintes: radioisotopes ou
193 radionuclídeos (por exemplo, 3H, 14C, 15N, 35S, 90Y, 99Tc, 1:L1In, 125I, 131I) , grupos fluorescentes (por exemplo, FITC, rodamina, fósforos lantanídeos), grupos enzimáticos (por exemplo, peroxidase de raiz-forte, β-galactosidase, luciferase, fosfatase alcalina), grupos quimioluminescentes, grupos de biotinil ou epitopos polipeptídicos predeterminados reconhecidos por um repórter secundário (por exemplo, seqüências de par de zíperes de leucina, sítios de ligação para anticorpos secundários, domínios de ligação de meta, tags de epitopo). Em algumas modalidades, o grupo de marcação é acoplado à proteína de ligação de antígeno por meio de braços espaçadores de vários comprimentos para reduzir o impedimento estérico potencial. Vários métodos para a marcação de proteínas são conhecidos na técnica e podem ser usados, se considerados adequados.
O termo grupo efetor significa qualquer grupo acoplado a uma proteína de ligação de antígeno que se liga especificamente a um (i) β-Klotho; (ii) FGFRlc, FGFR2c, FGFR3c ou FGFR4; ou (iii) um complexo que compreende βKlotho e um de FGFRlc, FGFR2c, FGFR3c e FGFR4 que atua como um agente citotóxico. Exemplos para grupos efetores adequados são radioisótopos ou radionuclídeos (por exemplo, 3H, 14C, 15N, 35S, 90Y, 99Tc, 1:L1In, 125I, 131I) . Outros grupos adequados incluem toxinas, grupos terapêuticos ou grupos quimioterápicos. Exemplos de grupos adequados incluem caliqueamicina, auristatinas, geldanamicina e cantansin. Em algumas modalidades, o grupo efetor é acoplado à proteína de ligação de antígeno por meio de braços espaçadores de vários comprimentos para reduzir o impedimento estérico
194 potencial.
Em geral, marcadores são classificados em diversas classes, dependendo do ensaio no qual devem ser detectados: a) marcadores isotópicos, que podem ser isótopos radioativos ou pesados; b) marcadores magnéticos (por exemplo, partículas magnéticas); c) porções redox ativas; d) corantes ópticos; grupos enzimáticos (por exemplo, peroxidase de raiz-forte, β-galactosidase, luciferase, fosfatase alcalina); e) grupos biotinilados; e f) epitopos polipeptídicos predeterminados reconhecidos por um repórter secundário (por exemplo, seqüências de par zíperes de leucina, sítios de ligação para anticorpos secundários, domínios de ligação de metal, tags de epitopo etc.). Em algumas modalidades, o grupo de marcação é acoplado à proteína de ligação de antígeno por meio de braços espaçadores de vários comprimentos para reduzir o impedimento estérico potencial. Vários métodos para a marcação de proteínas são conhecidos na técnica.
Marcadores específicos incluem corantes ópticos, incluindo, sem limitação, cromóforos, fósforos e fluoróforos, com o último sendo específico em muitos casos. Fluoróforos podem ser fluoróforos de pequena molécula, ou fluoróforos proteináceos.
O termo marcador fluorescente significa qualquer molécula que possa ser detectada por meio de suas propriedades fluorescentes inerentes. Marcadores fluorescentes adequados incluem, sem limitação, fluoresceína, rodamina, tetrametilrodamina, eosina, eritrosina, cumarina, metil-cumarinas, pireno, verde Malaquita, estilbeno, Vermelho Lúcifer, Azul Cascade,
195
Vermelho Texas, IAEDANS, EDANS, BODIPY FL, LC Red 640, Cy 5, Cy 5.5, LC Vermelho 705, Verde Oregon, os corantes Alexa-Flúor (Alexa Flúor 350, Alexa Flúor 430, Alexa Flúor 488, Alexa Flúor 546, Alexa Flúor 568, Alexa Flúor 594, Alexa Flúor 633, Alexa Flúor 647, Alexa Flúor 660, Alexa Flúor 680), Azul Cascade, Amarelo Cascade e R-ficoeritrina (PE) (Molecular Probes, Eugene, OR), FITC, Rodamina e Vermelho Texas (Pierce, Rockford, IL), Cy 5, Cy 5.5, Cy 7 (Amersham Life Science, Pittsburgh, PA) . Corantes ópticos adequados, incluindo fluoróforos, são descritos em MOLECULAR PROBES HANDBOOK por Richard P. Haugland, aqui expressamente incorporado por referência.
Marcadores fluorescentes proteináceos adequados também incluem, sem limitação, proteína fluorescente verde, incluindo uma espécie de Renilla, Ptilosarcus ou Aequorea de GFP (Chalfie e cols., (1994) Science 263: 802-805), EGFP (Clontech Labs., Inc., Número de Acesso no Genbank U55762), proteína fluorescente azul (BFP, Quantum Biotechnologies, Inc., Quebec, Canadá; Stauber, (1998) Biotechniques 24 : 462-471; Heim e cols., (1996) Curr. Biol. 6: 178-182), proteína fluorescente amarela intensificada (EYFP, Clontech Labs., Inc.), luciferase (Ichiki e cols., (1993) J. Immunol. 150: 5.408-5.417), β-galactosidase (Nolan e cols., (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 85: 2.603-2.607) e Renilla (WO 92/15673, WO 95/07463, WO 98/14605, WO 98/26277, WO 99/49019, Patentes U.S. N° 5292658, N° 5418155, N° 5683888, N° 5741668, N° 5777079, N° 5804387, N° 5874304, N° 5876995, N° 5925558) .
Preparação de proteínas de ligação de antígeno
Os anticorpos não humanos que são fornecidos podem
196 ser, por exemplo, derivados de qualquer animal produtor de anticorpos, por exemplo, camundongo, rato, coelho, cabra, macaco, ou primata não humano (como, por exemplo, macaco (por exemplo, Cynomolgus ou macaco Rhesus) ou símio (por exemplo, chimpanzés) ) . Os anticorpos não humanos podem ser usados, por exemplo, em cultura de célula in vitro e em aplicações à base de cultura de célula, ou qualquer outra aplicação em que uma resposta imune ao anticorpo não ocorre ou é insignificante, pode ser evitada, não é uma preocupação, ou é desejada. Em certas modalidades, os anticorpos podem ser produzidos por imunização com βKlotho, FGFRlc, FGFR2c, FGFR3c ou FGFR4 de comprimento total (Exemplo 1), com o domínio extracelular de β-Klotho, FGFRlc, FGFR2C, FGFR3c ou FGFR4 (Exemplo 2), ou dois de βKlotho, FGFRlc, FGFR2c, FGFR3c e FGFR4 (Exemplo 1) , com células inteiras que expressam FGFRlc, β-Klotho ou tanto FGFRlc quanto β-Klotho (Exemplo 1 e 3) , com membranas preparadas a partir de células que expressam FGFRlc, βKlotho ou tanto FGFRlc quanto β-Klotho (Exemplo 1 e 3), com proteínas de fusão, por exemplo, fusões de Fc que compreendem FGFRlc, β-Klotho ou FGFRlc e β-Klotho (ou domínios extracelulares destes) fundidos a Fc (Exemplo 2 e 3), e outros métodos conhecidos na técnica, por exemplo, como descrito nos Exemplos aqui apresentados. Alternativamente, certos anticorpos não humanos podem ser despertados por imunização com aminoácidos que são segmentos de um ou mais de β-Klotho, FGFRlc, FGFR2c, FGFR3c ou FGFR4 que formam parte do epitopo ao qual certos anticorpos aqui fornecidos se ligam. Os anticorpos podem ser policlonais, monoclonais, ou podem ser sintetizados em
197 células hospedeiras por expressão de DNA recombinante.
Anticorpos totalmente humanos podem ser preparados como descrito acima por imunização de animais transgênicos que contêm loci de imunoglobulina humana ou por seleção de uma biblioteca de apresentação em fago que expressa um repertório de anticorpos humanos.
Os anticorpos monoclonais (mAbs) podem ser produzidos por diversas técnicas, incluindo metodologia convencional de anticorpo monoclonal, por exemplo, a técnica-padrão de hibridização de célula somática de Kohler e Milstein, (1975) Nature 256: 495. Alternativamente, outras técnicas para a produção de anticorpos monoclonais podem ser empregadas, por exemplo, a transformação viral ou oncogênica de linfócitos B. Um sistema animal adequado para preparação de hibridomas é o sistema murídeo, que é um procedimento bem estabelecido. Protocolos de imunização e técnicas para o isolamento de esplenócitos imunizados para fusão são conhecidos na técnica. Para esses procedimentos, células B de camundongos imunizados são fundidas com um parceiro de fusão imortalizado adequado, por exemplo, uma linhagem de célula de mieloma murídea. Se desejado, ratos ou outros mamíferos podem ser imunizados ao invés de camundongos, e células B desses animais podem ser fundidas com a linhagem de célula de mieloma murídea para formar hibridomas. Alternativamente, pode ser usada uma linhagem de célula de mieloma de outra fonte que não camundongo. Procedimentos de fusão para a produção de hibridomas também são bem conhecidos. A tecnologia SLAM também pode ser empregada na produção de anticorpos.
Os anticorpos de cadeia única que são fornecidos podem
198 ser formados por ligação de fragmentos do domínio variável da cadeia pesada e leve (região Fv) por meio de uma ponte de aminoácido (vinculador peptídico curto), resultando em uma cadeia polipeptídica única. Esses Fvs de cadeia única (scFvs) podem ser preparados por fusão de DNA que codifica um vinculador peptídico entre DNAs que codificam os dois polipeptídeos do domínio variável (VL e VH) . Os polipeptídeos resultantes podem se dobrar de volta sobre eles mesmos para formar monômeros de ligação de antígeno, ou podem formar multímeros (por exemplo, dímeros, trímeros, ou tetrâmeros), dependendo do comprimento de um vinculador flexível entre os dois domínios variáveis (Kortt e cols., (1997) Prot. Eng. 10: 423; Kortt e cols., (2001) Biomol. Eng. 18: 95-108) . Por combinação de diferentes polipeptídeos que compreendem VL e VH, pode-se formar scFvs multiméricos que se ligam a epitopos diferentes (Kriangkum e cols., (2001) Biomol. Eng. 18: 31-40). Técnicas desenvolvidas para a produção de anticorpos de cadeia única incluem aquelas descritas na Patente U.S. N° 4.946.778; Bird, (1988) Science 242:423; Huston e cols., (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 85: 5.879; Ward e cols., (1989) Nature 334: 544, de Graaf e cols., (2002) Methods Mol. Biol. 178: 379-387. Anticorpos de cadeia única derivados de anticorpos aqui fornecidos incluem, sem limitação, scFvs que compreendem combinações do domínio variável das regiões variáveis da cadeia pesada e leve reveladas na Tabela 2, ou combinações de domínios variáveis de cadeia leve e pesada que incluem CDRs reveladas nas Tabelas 3 e 4.
Anticorpos aqui fornecidos que são de uma subclasse podem ser alterados para anticorpos de uma subclasse
199 diferente usando métodos de mudança de subclasse. Dessa forma, anticorpos IgG podem ser derivados de um anticorpo IgM, por exemplo, e vice-versa. Essas técnicas permitem a preparação de novos anticorpos que possuem as propriedades de ligação de antígeno de certo anticorpo (o anticorpoparente), mas também exibem propriedades biológicas associadas a um isótipo ou subclasse de anticorpo diferente daquele do anticorpo-parente. Técnicas de DNA recombinante podem ser empregadas. O DNA clonado que codifica polipeptídeos particulares do anticorpo pode ser empregado nesses procedimentos, por exemplo, DNA que codifica o domínio constante de um anticorpo do isótipo desejado. Veja, por exemplo, Lantto e cols., (2002) Methods Mol. Biol. 178: 303-316.
Consequentemente, os anticorpos que são fornecidos incluem aqueles que compreendem, por exemplo, as combinações de domínio variável descritas, supra, que possuem um isótipo desejado (por exemplo, IgA, IgGl, IgG2, IgG3, IgG4, IgE e IgD), bem como fragmentos Fab ou F(ab')2 destes. Além disso, se uma IgG4 é desejada, pode ser desejado introduzir uma mutação pontual (CPSCP—»CPPCP (IDS. DE SEQ. Nos 380-381, respectivamente, em ordem de ocorrência)) na região de dobradiça, como descrito em Bloom e cols., (1997) Protein Science 6: 407, aqui incorporado por referência) para aliviar a tendência para formar ligações dissulfeto intracadeia H que podem levar à heterogeneidade nos anticorpos IgG4.
Além disso, técnicas para a derivação de anticorpos que possuem propriedades diferentes (ou seja, afinidades variáveis pelo antígeno ao qual se ligam) também são
200 conhecidas. Uma dessas técnicas, denominada embaralhamento (shuffling) de cadeias, envolve a apresentação de repertório do gene do domínio variável de imunoglobulina na superfície de bacteriófago filamentoso, freqüentemente denominada apresentação em fago. O embaralhamento de cadeias tem sido usado para preparar anticorpos com afinidade elevada ao hapteno 2-feniloxazol-5-ona, como descrito por Marks e cols., (1992) BioTechnology 10: 779.
Foram feitas modificações conservadoras às regiões variáveis da cadeia pesada e leve descritas na Tabela 2, ou nas CDRs descritas nas Tabelas 3A e 3B, 4A e 4B e Tabela 6C, infra (e modificações correspondentes nos ácidos nucléicos codificadores) para produzir uma proteína de ligação de antígeno que possui características funcionais e bioquímicas. Métodos para a obtenção dessas modificações são descritos acima.
Proteínas de ligação de antígeno que se ligam
especificamente a um ou mais de (i) β-Klotho; (ii) FGFRlc,
FGFR2C, FGFR3C ou FGFR4; ou (iii) um complexo que
compreende β-Klotho e um de FGFRlc, FGFR2C, FGFR3C e FGFR4
podem ainda ser modificadas de várias formas. Por exemplo, caso elas se destinem a fins terapêuticos, elas podem ser conjugadas ao polietileno glicol (PEGuiladas) para prolongar a meia-vida sérica ou para aumentar a liberação de proteína. Alternativamente, a região V dos anticorpos em questão ou fragmentos destes pode ser fundida à região Fc de uma molécula de anticorpo diferente. A região Fc usada para essa finalidade pode ser modificada de modo a não se ligar ao complemento reduzindo, dessa forma, a probabilidade de induzir lise da célula no paciente quando
201 a proteína de fusão é usada como um agente terapêutico. Além disso, os anticorpos em questão ou fragmentos funcionais destes podem ser conjugadas à albumina sérica humana para aumentar a meia-vida sérica do anticorpo ou fragmento deste. Outro parceiro de fusão útil para as proteínas de ligação de antígeno ou fragmentos destes é a transtiretina (TTR). TTR possui a capacidade de formar um tetrâmero e, dessa forma, uma proteína de fusão anticorpoTTR pode formar um anticorpo multivalente que pode aumentar sua avidez de ligação.
Alternativamente, modificações substanciais nas características funcionais e/ou bioquímicas das proteínas de ligação de antígeno aqui descritas podem ser obtidas por criação de substituições na seqüência de aminoácidos das cadeias pesadas e leves que diferem significativamente em seu efeito sobre a manutenção: (a) da estrutura do arcabouço molecular na área da substituição, por exemplo, como uma conformação de lâmina ou helicoidal, (b) da carga ou hidrofobicidade da molécula no local-alvo, ou (c) da robustez da cadeia lateral. Uma substituição conservadora de aminoácido pode envolver uma substituição de um resíduo de aminoácido nativo com um resíduo não nativo que possui pouco ou nenhum efeito sobre a polaridade ou carga do resíduo de aminoácido naquela posição. Veja a Tabela 5, supra. Além disso, qualquer resíduo nativo no polipeptídeo pode ser substituído com alanina, como foi previamente descrito para mutagênese por varredura de alanina.
Substituições de aminoácido (sejam elas conservadoras ou não conservadoras) dos anticorpos em questão podem ser implementadas por aqueles habilitados na técnica por
202 aplicação de técnicas de rotina. Substituições de aminoácidos podem ser usadas para identificar resíduos importantes dos anticorpos aqui fornecidos, ou para aumentar ou diminuir a afinidade desses anticorpos por um ou mais de (i) β-Klotho; (ii) FGFRlc, FGFR2c, FGFR3C ou FGFR4; ou (iii) um complexo que compreende β-Klotho e um de FGFRlc, FGFR2c, FGFR3c e FGFR4 , ou para modificação da afinidade de ligação de outras proteínas de ligação de antígeno aqui descritas.
Métodos de expressão de proteínas de ligação de antígeno
Sistemas e construções de expressão na forma de plasmídeos, vetores de expressão, cassetes de transcrição ou expressão que compreendem pelo menos um polinucleotideo como descrito acima também são aqui fornecidos, bem como células hospedeiras que compreendem esses sistemas ou construções de expressão.
As proteínas de ligação de antígeno aqui fornecidas podem ser preparadas por diversas técnicas convencionais. Por exemplo, proteínas de ligação de antígeno que se ligam especificamente a (i) 13-10 Klotho; (ii) FGFRlc, FGFR2c, FGFR3c ou FGFR4; ou (iii) um complexo que compreende βKlotho e um de FGFRlc, FGFR2c, FGFR3c e FGFR4 podem ser produzidas por sistemas de expressão recombinante, usando qualquer metodologia conhecida na técnica. Veja, por exemplo, Monoclonal Antibodies, Hybridomas: A New Dimension in Biological Analyses, Kennet e cols, (eds.) Plenum Press, Nova York (1980); e Antibodies: A Laboratory Manual, Harlow e Lane (eds.), Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1988).
203
As proteínas de ligação de antígeno podem ser expressas em linhagens de células de hibridoma (por exemplo, em anticorpos particulares podem ser expressas em hibridomas) ou em linhagens de células que não hibridomas. Construções de expressão que codificam os anticorpos podem ser usadas para transformar uma célula hospedeira mamífera, de inseto ou microbiana. A transformação pode ser realizada com o uso de qualquer método conhecido para introdução de polinucleotídeos em uma célula hospedeira incluindo, por exemplo, embalagem do polinucleotideo em um vírus ou bacteriófago e transdução de uma célula hospedeira com a construção por procedimentos de transfecção conhecidos na técnica, como exemplificado pelas Patentes U.S. N° 4.399.216; N° 4.912.040; N° 4.740.461; N° 4.959.455. 0 procedimento de transformação ótimo usado dependerá de qual tipo de célula hospedeira está sendo transformado. Métodos para introdução de polinucleotídeos heterólogos em células mamíferas são bem conhecidos na técnica e incluem, sem limitação, transfecção mediada por dextrana, precipitação de fosfato de cálcio, transfecção mediada por polibreno, fusão de protoplasto, eletroporação, encapsulação do(s) polinucleotídeo(s) em lipossomos, mistura de ácido nucléico com lipídeos carregados positivamente e microinjeção direta do DNA nos núcleos.
Construções de expressão recombinante tipicamente compreendem uma molécula de ácido nucléico que codifica um polipeptídeo que compreende um ou mais dos seguintes: uma ou mais CDRs aqui fornecidas; uma região constante da cadeia leve; uma região variável da cadeia leve; uma região constante da cadeia pesada (por exemplo, CH1, CH2 e/ou CH3);
204 e/ou outra porção do arcabouço de uma proteína de ligação de antígeno. Essas seqüências de ácidos nucléicos são inseridas em um vetor de expressão apropriado usando técnicas de ligação padronizadas. Em uma modalidade, a região constante da cadeia pesada ou leve é anexada ao terminal C da região variável da cadeia pesada ou leve
anti-β-Klotho, -FGFRlc, -FGFR2C, -FGFR3C, -FGFR4 ou β-
Klotho e FGFRlc-específica e é ligada em um vetor de
expressão. 0 vetor é tipicamente selecionado para ser
funcional na célula hospedeira particular empregada (ou
seja, o vetor é compatível com o maquinário da célula hospedeira, permitindo que ocorra a amplificação e/ou expressão do gene). Em algumas modalidades, são usados vetores que empregam ensaios de complementação proteínafragmento usando repórteres de proteína, por exemplo, diidrofolato redutase (veja, por exemplo, Patente U.S. N° 6.270.964, que é aqui incorporada por referência). Vetores de expressão adequados podem ser adquiridos, por exemplo, de Invitrogen Life Technologies ou BD Biosciences (anteriormente Clontech). Outros vetores úteis para clonagem e expressão dos anticorpos e fragmentos incluem aqueles descritos em Bianchi e McGrew, (2003) Biotech. Biotechnol. Bioeng. 84: 439-44, que é aqui incorporado por referência. Vetores de expressão adequados adicionais são discutidos, por exemplo, em Methods Enzymol. , vol. 185 (D. V. Goeddel, ed.), 1990, Nova York: Academic Press.
Tipicamente, os vetores de expressão usados em qualquer uma das células hospedeiras conterão seqüências para manutenção de plasmídeo e para clonagem e expressão de seqüências de nucleotídeos exógenas. Essas seqüências,
205 coletivamente denominadas seqüências flanqueadoras, em certas modalidades tipicamente incluirão uma ou mais das seguintes seqüências de nucleotídeos: um promotor, uma ou mais seqüências intensificadoras, uma origem de replicação, uma seqüência de terminação da transcrição, uma complete seqüência de íntron contendo um sítio de splice doador e aceptor, uma seqüência que codifica uma seqüência-líder para secreção de polipeptídeo, um sítio de ligação de ribossomo, uma seqüência de poliadenilação, uma região polivinculadora para inserção do ácido nucléico que codifica o polipeptídeo a ser expresso, e um elemento marcador selecionável. Cada uma dessas seqüências será discutida abaixo.
Opcionalmente, o vetor pode conter uma seqüência codificadora de tag, ou seja, uma molécula de oligonucleotídeo localizada na extremidade 5' ou 3' de uma seqüência codificadora da proteína de ligação de antígeno; a seqüência de oligonucleotídeo codifica poliHis (como, por exemplo, hexaHis (ID. DE SEQ. N° : 382)), ou outro tag como, por exemplo, FLAG, HA (hemaglutinina do vírus influenza), ou myc, para o qual existem anticorpos disponíveis comercialmente. Esse tag é tipicamente fundido ao polipeptídeo mediante expressão do polipeptídeo, e pode servir como um meio para purificação por afinidade ou detecção da proteína de ligação de antígeno pela célula hospedeira. A purificação por afinidade pode ser obtida, por exemplo, por cromatograf ia em coluna com o uso de anticorpos contra o tag como uma matriz de afinidade. Opcionalmente, o tag pode subseqüentemente ser removido da proteína de ligação de antígeno purificada por vários meios
206 como, por exemplo, pelo uso de certas peptidases para clivagem.
Seqüências flanqueadoras podem ser homólogas (ou seja, da mesma espécie e/ou cepa que a célula hospedeira), heteróloga (ou seja, de uma espécie diferente da espécie ou cepa de célula hospedeira), híbridas (ou seja, uma combinação de seqüências flanqueadoras de mais de uma fonte), sintéticas ou nativas. Dessa forma, a fonte de uma seqüência flanqueadora pode ser qualquer organismo procariótico ou eucariótico, qualquer organismo vertebrado ou invertebrado, ou qualquer planta, desde que a seqüência flanqueadora seja funcional, e possa ser ativada, pelo maquinário da célula hospedeira.
Seqüências flanqueadoras úteis nos vetores podem ser obtidas por qualquer um de vários métodos bem conhecidos na técnica. Tipicamente, seqüências flanqueadoras úteis nesse pedido terão sido previamente identificadas por mapeamento e/ou por digestão por endonuclease de restrição e podem, dessa forma, ser isoladas da fonte de tecido adequada com o uso de endonucleases de restrição apropriadas. Em alguns casos, a seqüência de nucleotídeos total de uma seqüência flanqueadora pode ser conhecida. Aqui, a seqüência flanqueadora pode ser sintetizada com o uso dos métodos aqui descritos para síntese ou clonagem de ácido nucléico.
Se toda ou somente uma porção da seqüência flanqueadora é conhecida, ela pode ser obtida usando reação em cadeia de polimerase (PCR) e/ou por triagem de uma biblioteca genômica com uma sonda adequada como, por exemplo, um fragmento de seqüência de oligonucleotídeo e/ou flanqueadora da mesma ou de outra espécie. Quando a
207 seqüência flanqueadora não é conhecida, um fragmento de DNA contendo uma seqüência flanqueadora pode ser isolado de um pedaço de DNA maior que pode conter, por exemplo, uma seqüência codificadora ou até mesmo outro gene ou genes. O isolamento pode ser obtido por digestão com endonuclease de restrição para produzir o fragmento de DNA adequado, seguida por isolamento usando purificação em gel de agarose, cromatografia em coluna Qiagen® (Chatsworth, CA), ou outros métodos conhecidos por aqueles habilitados na técnica. A seleção de enzimas adequadas para atingir esse objetivo será facilmente evidente para aqueles habilitados na técnica.
Uma origem de replicação é tipicamente uma parte daqueles vetores de expressão procarióticos adquiridos comercialmente, e a origem auxilia na amplificação do vetor em uma célula hospedeira. Se o vetor de escolha não contém um sítio de origem de replicação, um pode ser sintetizado quimicamente com base em uma seqüência conhecida, e ligado no vetor. Por exemplo, a origem de replicação do plasmídeo pBR322 (New England Biolabs, Beverly, MA) é adequada para a maioria das bactérias gram-negativas, e várias origens virais (por exemplo, SV40, polioma, adenovirus, virus da estomatite vesicular (VSV) ou papilomavírus como, por exemplo, HPV ou BPV) são úteis para a clonagem de vetores em células mamíferas. Geralmente, o componente de origem de replicação não é necessário para vetores de expressão mamíferos (por exemplo, a origem de SV40 é freqüentemente usada apenas porque também contém o promotor precoce do vírus).
Uma seqüência de terminação da transcrição está
208 tipicamente localizada 3' à extremidade de uma região codificadora de polipeptídeo e serve para terminar a transcrição. Normalmente, uma seqüência de terminação da transcrição em células procarióticas é um fragmento rico em G-C, seguido por uma seqüência poli-T. Embora a seqüência seja facilmente clonada a partir de uma biblioteca ou até mesmo adquirida comercialmente como parte de um vetor, ela também pode ser facilmente sintetizada com o uso de métodos para síntese de ácido nucléico, tais como aqueles aqui descritos.
Um gene de marcador selecionável codifica uma proteína necessária à sobrevida e crescimento de uma célula hospedeira desenvolvida em um meio de cultura seletivo. Genes marcadores de seleção típicos codificam proteínas que: (a) conferem resistência a antibióticos ou outras toxinas, por exemplo, ampicilina, tetraciclina ou canamicina para células hospedeiras procarióticas; (b) complementam deficiências auxotróficas da célula; ou (c) suprem nutrientes cruciais nãos disponíveis por meios complexos ou definidos. Marcadores selecionáveis específicos são o gene de resistência à canamicina, o gene de resistência à ampicilina e o gene de resistência à tetraciclina. Vantajosamente, um gene de resistência à neomicina também pode ser usado para seleção em células hospedeiras tanto procarióticas quanto eucarióticas.
Outros genes selecionáveis podem ser usados para amplificar o gene que será expresso. A amplificação é o processo perlo qual genes que são necessários para produção de uma proteína crucial para o crescimento ou sobrevida da célula são reiterados em tandem dentro dos cromossomos de
209 gerações sucessivas de células recombinantes. Exemplos de marcadores selecionáveis adequados para células mamíferas incluem genes de diidrofolato redutase (DHFR) e genes sem promotor de timidina quinase. Os transformantes de célula mamífera são colocados sob pressão de seleção, em que apenas os transformantes são exclusivamente adaptados para sobreviver em virtude do gene selecionável presente no vetor. A pressão de seleção é imposta por cultivo das células transformadas sob condições nas quais a concentração do agente de seleção no meio é sucessivamente aumentada levando, dessa forma, à amplificação tanto do gene selecionável quanto do DNA que codifica outro gene, por exemplo, uma proteína de ligação de antígeno que se liga a (i) β-Klotho; (ii) FGFRlc, FGFR2c, FGFR3c ou FGFR4; ou (iii) um complexo que compreende β-Klotho e um de FGFRlc, FGFR2c, FGFR3c e FGFR4. Como resultado, quantidades aumentadas de um polipeptídeo como, por exemplo, uma proteína de ligação de antígeno, são sintetizadas pelo DNA amplificado.
Um sítio de ligação de ribossomo é normalmente necessário à iniciação da tradução de mRNA e é caracterizado por uma seqüência de Shine-Dalgarno (procariotas) ou uma seqüência de Kozak (eucariotas). 0 elemento está tipicamente localizado 3' ao promotor e 5' à seqüência codificadora do polipeptídeo a ser expresso.
Em alguns casos, por exemplo, quando a glicosilação é desejada em um sistema de expressão de célula hospedeira eucariótica, pode-se manipular as várias pré- ou próseqüências para aumentar a glicosilação ou o rendimento. Por exemplo, pode-se alterar o sítio de divagem de
210 peptidase de um peptideo sinalizador em particular, ou adicionar pró-seqüências, que também podem afetar a glicosilação. O produto de proteína final pode ter, na posição -1 (em relação ao primeiro aminoácido da proteína madura), um ou mais aminoácidos adicionais que incidem na expressão, que podem não ter sido totalmente removidos. Por exemplo, o produto de proteína final pode ter um ou dois resíduos de aminoácidos encontrados no sítio de divagem de peptidase, anexados ao terminal amino. Alternativamente, o uso de alguns sítios de divagem de enzima pode resultar em uma forma ligeiramente truncada do polipeptídeo desejado, se a enzima corta em uma área desse tipo dentro do polipeptídeo maduro.
A expressão e clonagem tipicamente conterão um promotor que é reconhecido pelo organismo hospedeiro e, operacionalmente, ligado à molécula que codifica uma proteína de ligação de antígeno que se liga especificamente a (i) β-Klotho; (ii) FGFRlc, FGFR2C, FGFR3c ou FGFR4; ou (iii) um complexo que compreende β-Klotho e um de FGFRlc, FGFR2c, FGFR3c e FGFR4. Promotores são seqüências não transcritas localizadas upstream (ou seja, 5') do códon de início de um gene estrutural (geralmente dentro de cerca de 100 a 1.000 bp) que controlam a transcrição do gene estrutural. Promotores são convencionalmente agrupados em uma de duas classes: promotores indutíveis e promotores constitutivos. Promotores indutíveis iniciam níveis aumentados de transcrição por DNA sob seu controle em resposta a alguma alteração nas condições de cultura, por exemplo, a presença ou ausência de um nutriente ou uma alteração na temperatura. Promotores constitutivos, por
211 outro lado, transcrevem uniformemente um gene para o qual estão ligados operacionalmente, ou seja, com pouco ou nenhum controle sobre a expressão do gene. Um número grande de promotores, reconhecidos por diversas células hospedeiras potenciais, é bem conhecido. Um promotor adequado é ligado operacionalmente ao DNA que codifica a cadeia pesada ou cadeia leve que compreende uma proteína de ligação de antígeno por remoção do promotor do DNA da fonte por digestão por enzima de restrição e inserção da seqüência promotora desejada no vetor.
Promotores adequados para uso com hospedeiros de levedura também são bem conhecidos na técnica. Intensificadores de levedura são vantajosamente usados com promotores de levedura. Promotores adequados para uso com células hospedeiras mamíferas são bem conhecidos e incluem, sem limitação, aqueles obtidos dos genomas de vírus como, por exemplo, vírus do polioma, vírus da bouba aviária, adenovirus (como, por exemplo, Adenovirus 2) , vírus do papiloma bovino, vírus do sarcoma aviário, citomegalovírus, retrovirus, vírus da hepatite B e Vírus Símio 40 (SV40). Outros promotores mamíferos adequados incluem promotores mamíferos heterólogos, por exemplo, promotores de choque térmico e o promotor de actina.
Promotores adicionais que podem ser de interesse incluem, sem limitação: promotor precoce de SV40 (Benoist e Chambon, (1981) Nature 290: 304-310); promotor de CMV (Thomsen e cols., (1984) Proc. Natl. Acad. U.S.A. 81: 659663); o promotor contido na repetição terminal longa 3' do vírus do sarcoma de Rous (Yamamoto e cols., (1980) Cell 22: 787-797); promotor de timidina quinase do herpes (Wagner e
212 cols., (1981) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 78 : 1.4441.445); seqüências promotoras e reguladoras do gene de metalotionina (Prinster e cols., (1982) Nature 296: 39-42); e promotores procarióticos como, por exemplo, o promotor de beta-lactamase (Villa-Kamaroff e cols., (1978) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 75 : 3.727-3.731); ou o promotor tac (DeBoer e cols., (1983) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 80: 21-25). Também de interesse são as seguintes regiões de controle da transcrição animais, que exibem especificidade de tecido e foram utilizadas em animais transgênicos: a região de controle do gene de elastase I que está ativa em células acinares pancreáticas (Swift e cols., (1984) Cell 38: 639-646; Omitz e cols., (1986) Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol. 50 : 399-409; MacDonald, (1987) Hepatology Ί_·. 425-515); a região de controle do gene de insulina que está ativa em células-beta pancreáticas (Hanahan, (1985) Nature 315: 115-122) ; a região de controle do gene de imunoglobulina que está ativa em células linfóides (Grosschedl e cols., (1984) Cell 38 : 647-658; Adames e cols., (1985) Nature 318: 533-538; Alexander e cols., (1987) Mol. Cell. Biol. Ί_·. 1.436-1.444); a região de controle do virus do tumor mamário de camundongo que está
ativa em células testiculares, da mama, linfóides e
mastócitos (Leder e cols ., (1986) Cell 45 : 485-495); a
região de controle do gene de albumina que está ativa no
fígado (Pinkert e cols., (1987) Genes and Devel. 1^: 26 8276); a região de controle do gene de alfa-feto-proteina que está ativa no fígado (Krumlauf e cols., (1985) Mol.
Cell. Biol. 5: 1.639-1.648; Hammer e cols., (1987) Science 253:53-58); a região de controle do gene de alfa 1
213 antitripsina que está ativa no fígado (Kelsey e cols., (1987) Genes and Devei. 1: 161-171); a região de controle do gene de beta-globina que está ativa em células mielóides (Mogram e cols., (1985) Nature 315: 338-340; Kollias e cols., (1986) Cell 46 : 89-94); a região de controle do gene de proteína básica de mielina de que está ativa em células de oligodendrócitos no cérebro (Readhead e cols., (1987) Cell 48 : 703-712) ; a região de controle do gene de cadeia leve-2 de miosina de que está ativa no músculo esquelético (Sani, (1985) Nature 314: 283-286) ; e a região de controle do gene de do hormônio de liberação gonadotrópico que está ativa no hipotálamo (Mason e cols., (1986) Science 234: 1.372-1.378) .
Uma seqüência intensificadora pode ser inserida no vetor para aumentar a transcrição do DNA que codifica cadeia leve ou cadeia pesada que compreende uma proteína de ligação de antígeno que se liga especificamente a (i) βKlotho; (ii) FGFRlc, FGFR2C, FGFR3c ou FGFR4; ou (iii) um complexo que compreende β-Klotho e um de FGFRlc, FGFR2c, FGFR3c e FGFR4 por eucariotas superiores, por exemplo, uma proteína de ligação de antígeno humana que se liga especificamente a (i) β-Klotho; (ii) FGFRlc, FGFR2c, FGFR3c ou FGFR4; ou (iii) um complexo que compreende β-Klotho e um de FGFRlc, FGFR2c, FGFR3c e FGFR4. Intensificadores são elementos de DNA de atuação cis, normalmente com cerca de 10-300 bp de comprimento, que atuam no promotor para aumentar a transcrição. Intensificadores são relativamente orientação e posição-independentes, tendo sido encontrados em posições tanto 5' quanto 3' em relação à unidade de transcrição. Várias seqüências intensificadoras disponíveis
214 por genes mamíferos são conhecidas (por exemplo, globina, elastase, albumina, alfa-feto-proteína e insulina). Tipicamente, no entanto, é usado um intensificador de um vírus. 0 intensificador de SV40, o intensificador do promotor precoce de citomegalovírus, o intensificador de polioma e intensificadores de adenovirus conhecidos na técnica são elementos de intensificação exemplares para a ativação de promotores eucarióticos. Embora um intensificador possa ser posicionado no vetor 5' ou 3' em relação a uma seqüência codificadora, ele está tipicamente localizado em um sítio 5' do promotor. Uma seqüência que codifica uma seqüência sinalizadora nativa ou heteróloga apropriada (seqüência-líder ou peptídeo sinalizador) pode ser incorporada em um vetor de expressão, para promover a secreção extracelular do anticorpo. A escolha do peptídeo sinalizador ou líder dependa do tipo de células hospedeiras nas quais o anticorpo deve ser produzido, e uma seqüência sinalizadora heteróloga pode substituir a seqüência sinalizadora nativa. Exemplos de peptídeos sinalizadores que são funcionais em células hospedeiras mamíferas incluem os seguintes: a seqüência sinalizadora para interleucina-7 (IL-7) descrita na Patente U.S. N° 4.965.195; a seqüência sinalizadora para o receptor de interleucina-2 descrita em Cosman e cols., (1984) Nature 312:768; o peptídeo sinalizador do receptor de interleucina-4 descrito na Patente EP N° 0367 566; o peptídeo sinalizador do tipo I do receptor de interleucina-1 descrito na Patente U.S. N° 4.968.607; o peptídeo sinalizador do tipo II do receptor de interleucina-1 descrito na Patente EP N° 0 460 846.
Os vetores de expressão que são fornecidos podem ser
215 construídos a partir de um vetor de partida como, por exemplo, um vetor disponível comercialmente. Esses vetores podem conter, mas não necessariamente, todas as sequências flanqueadoras desejadas. Quando uma ou mais das sequências flanqueadoras aqui descritas já não estão presentes no vetor, elas podem ser obtidas individualmente e ligadas no vetor. Métodos usados para obtenção de cada uma das seqüências flanqueadoras são bem conhecidos por aqueles habilitados na técnica.
Após o vetor ter sido construído e uma molécula de ácido nucléico que codifica uma cadeia leve, uma cadeia pesada, ou uma cadeia leve e uma cadeia pesada que compreende uma proteína de ligação de antígeno que se liga especificamente a (i) β-Klotho; (ii) FGFRlc, FGFR2c, FGFR3c ou FGFR4; ou (iii) um complexo que compreende β-Klotho e um de FGFRlc, FGFR2c, FGFR3c e FGFR4 ter sido inserida no sítio adequado do vetor, o vetor completado pode ser inserido em uma célula hospedeira adequada para amplificação e/ou expressão do polipeptídeo. A transformação de um vetor de expressão para uma proteína de ligação de antígeno em uma célula hospedeira selecionada pode ser obtida por métodos bem conhecidos, incluindo transfecção, infecção, co-precipitação de fosfato de cálcio, eletroporação, microinjeção, lipofecção, transfecção mediada por DEAE-dextrana, ou outras técnicas conhecidas. 0 método selecionado será, em parte, função do tipo de célula hospedeira a ser usada. Esses métodos e outros métodos adequados são bem conhecidos por aqueles habilitados na técnica, e são apresentados, por exemplo, em Sambrook e cols., (2001), supra.
216
Uma célula hospedeira, quando cultivada sob condições apropriadas, sintetiza uma proteína de ligação de antígeno que pode ser subseqüentemente coletada do meio de cultura (se a célula hospedeira a secreta no meio) ou diretamente da célula hospedeira que a produz (se não é secretada) . A seleção de uma célula hospedeira apropriada dependerá de vários fatores, por exemplo, dos níveis de expressão desejados, das modificações do polipeptídeo que são desejáveis ou necessárias para a atividade (como, por exemplo, glicosilação ou fosforilação) e da facilidade de dobragem em uma molécula biologicamente ativa.
Linhagens de células de mamíferos disponíveis como hospedeiros para expressão são bem conhecidas na técnica e incluem, sem limitação, linhagens de células imortalizadas disponíveis pelo American Type Culture Collection (ATCC), incluindo, sem limitação, células de ovário de hamster chinês (CHO), células HeLa, células de rim de filhote de hamster (BHK), células de rim de macaco (COS), células de carcinoma hepatocelular humano (por exemplo, HepG2), e várias outras linhagens de células. Em certas modalidades, as linhagens de células podem ser selecionadas através da determinação de quais linhagens de células possuem níveis de expressão elevados e produzem constitutivamente proteínas de ligação de antígeno com propriedades de ligação desejáveis (por exemplo, a habilidade para se ligar a (i) β-Klotho; (ii) FGFRlc, FGFR2C, FGFR3C OU FGFR4; ou (iii) um complexo que compreende β-Klotho e um de FGFRlc, FGFR2c, FGFR3c e FGFR4). Em outra modalidade, uma linhagem de célula da linhagem de células B que não faz seu próprio anticorpo, mas possui uma capacidade para fazer e secretar
217 um anticorpo heterólogo, pode ser selecionada. A habilidade para induzir sinalização do tipo FGF21 também pode formar um critério de seleção.
Usos de proteínas de ligação de antígeno para fins diagnósticos e terapêuticos
As proteínas de ligação de antígeno aqui reveladas são úteis para detecção de (i) β-Klotho; (ii) FGFRlc, FGFR2c, FGFR3c ou FGFR4; ou (iii) um complexo que compreende βKlotho e um de FGFRlc, FGFR2c, FGFR3c e FGFR4 em amostras biológicas e identificação de células ou tecidos que produzem um ou mais de (i) β-Klotho; (ii) FGFRlc, FGFR2c, FGFR3c ou FGFR4; ou (iii) um complexo que compreende βKlotho e um de FGFRlc, FGFR2c, FGFR3c e FGFR4. Por exemplo, as proteínas de ligação de antígeno aqui reveladas podem ser usadas em ensaios diagnósticos, por exemplo, ensaios de ligação para detectar e/ou quantificar (i) β-Klotho; (ii) FGFRlc, FGFR2C, FGFR3C ou FGFR4; ou (iii) um complexo que compreende β-Klotho e um de FGFRlc, FGFR2c, FGFR3c e FGFR4 expressos em um tecido ou célula. As proteínas de ligação de antígeno que se ligam especificamente a (i) β-Klotho; (ii) FGFRlc, FGFR2C, FGFR3c ou FGFR4; ou (iii) um complexo que compreende β-Klotho e um de FGFRlc, FGFR2c, FGFR3c e FGFR4 podem ser usadas no tratamento de doenças relacionadas à sinalização do tipo FGF21 em um paciente que dele necessita, por exemplo, diabetes tipo 2, obesidade, dislipidemia, NASH, doença cardiovascular e síndrome metabólica. Por formação de um complexo de sinalização que compreende uma proteína de ligação de antígeno, e (i) βKlotho; (ii) FGFRlc, FGFR2C, FGFR3C ou FGFR4; ou (iii) um complexo que compreende β-Klotho e um de FGFRlc, FGFR2c,
218 ,-¼
FGFR3c e FGFR4, a atividade de FGF21 natural in vivo, que se associa a FGFRlc, FGFR2c, FGFR3C, FGFR4 e β-Klotho in vivo para iniciar a sinalização, pode ser mimetizada e/ou aumentada, levando aos efeitos terapêuticos.
Indicações
Uma doença ou condição associada com FGF21 humano inclui qualquer doença ou condição cujo surgimento em um paciente é causado, pelo menos em parte, pela indução de sinalização do tipo FGF21, que é iniciada in vivo pela formação de um complexo que compreende FGFRlc, FGFR2c, FGFR3c ou FGFR4 e β-Klotho e FGF21. A gravidade da doença ou condição também pode ser diminuída pela indução de sinalização do tipo FGF21. Exemplos de doenças e condições que podem ser tratadas com as proteínas de ligação de antígeno incluem diabetes tipo 2, obesidade, dislipidemia, NASH, doença cardiovascular e síndrome metabólica.
As proteínas de ligação de antígeno aqui descritas podem ser usadas para tratar diabetes tipo 2, obesidade, dislipidemia, NASH, doença cardiovascular e síndrome metabólica, ou podem ser empregadas como um tratamento profilático administrado, por exemplo, diariamente, semanalmente, a cada duas semanas, mensalmente, bimensalmente, bianualmente etc. para evitar ou reduzir a frequência e/ou gravidade dos sintomas, por exemplo, níveis elevados de glicemia, níveis elevados de triglicerídeos e colesterol fornecendo, dessa forma, um perfil de fator de risco glicêmico e cardiovascular aprimorado.
Métodos diagnósticos
As proteínas de ligação de antígeno aqui descritas podem ser usadas para fins diagnósticos para detectar,
219 diagnosticar ou monitorar doenças e/ou condições associadas a FGFRlc, FGFR2c, FGFR3c, FGFR4, β-Klotho, FGF21 ou combinações destes. Também são fornecidos métodos para a detecção da presença de (i) β-Klotho; (ii) FGFRlc, FGFR2c, FGFR3c ou FGFR4; ou (iii) um complexo que compreende βKlotho e um de FGFRlc, FGFR2c, FGFR3c e FGFR4 em uma amostra usando métodos imuno-histológicos clássicos conhecidos por aqueles habilitados na técnica (por exemplo, Tijssen, 1993, Practice and Theory of Enzyme Immunoassays, Vol. 15 (Eds R.H. Burdon e P.H. van Knippenberg, Elsevier, Amsterdam); Zola, (1987) Monoclonal Antibodies: A Manual of Techniques, páginas 147-158 (CRC Press, Inc.); Jalkanen e cols., (1985) J. Cell. Biol. 101: 976-985; Jalkanen e cols., (1987) J. Cell. Biol. 105: 3.087-3.096). A detecção de (i) β-Klotho; (ii) FGFRlc, FGFR2c, FGFR3C ou FGFR4; ou (iii) de um complexo que compreende β-Klotho e urn de FGFRlc, FGFR2C, FGFR3C e FGFR4 pode ser realizada in vivo ou in vitro.
As aplicações diagnosticas aqui fornecidas incluem o uso das proteínas de ligação de antígeno para detectar a expressão de (i) β-Klotho; (ii) FGFRlc, FGFR2c, FGFR3c ou FGFR4; ou (iii) de um complexo que compreende β-Klotho e um de FGFRlc, FGFR2c, FGFR3c e FGFR4 e/ou a ligação a (i) βKlotho; (ii) FGFRlc, FGFR2C, FGFR3C ou FGFR4; ou (iii) um complexo que compreende β-Klotho e um de FGFRlc, FGFR2c, FGFR3c e FGFR4. Exemplos de métodos úteis na detecção da presença de (i) β-Klotho; (ii) FGFRlc, FGFR2c, FGFR3c ou FGFR4; ou (iii) um complexo que compreende β-Klotho e um de FGFRlc, FGFR2c, FGFR3c e FGFR4 incluem imunoensaios, por exemplo, o ensaio imunoabsorvente ligado à enzima (ELISA) e
220 o radioimunoensaio (RIA).
Para aplicações diagnosticas, a proteína de ligação de antígeno tipicamente será marcada com um grupo de marcação detectável. Grupos de marcação adequados incluem, sem 5 limitação, os seguintes: radioisótopos ou radionuclídeos (por exemplo, 3H, 14C, 15N, 35S, 90Y, 99Tc, ^In, 125I, 131I) grupos fluorescentes (por exemplo, FITC, rodamina, lantanídeos fósforos), grupos enzimáticos (por exemplo, peroxidase de raiz-forte, β-galactosidase, luciferase, fosfatase alcalina), grupos quimioluminescentes, grupos de biotinil ou epitopos de polipeptídeo predeterminados reconhecidos por um repórter secundário (por exemplo, seqüências de par de zíperes de leucina, sítios de ligação para anticorpos secundários, domínios de ligação de metal, 15 tags de epitopo) . Em algumas modalidades, o grupo de marcação é acoplado à proteína de ligação de antígeno por meio de braços espaçadores de vários comprimentos para reduzir o impedimento estérico potencial. Vários métodos para marcação de proteínas são conhecidos na técnica e 20 podem ser usados.
Em outro aspecto, uma proteína de ligação de antígeno pode ser usada para identificar uma célula ou células que expressam (i) β-Klotho; (ii) FGFRlc, FGFR2c, FGFR3c ou FGFR4; ou (iii) um complexo que compreende β-Klotho e um de 25 FGFRlc, FGFR2c, FGFR3c e FGFR4. Em uma modalidade específica, a proteína de ligação de antígeno é marcada com um grupo de marcação e a ligação da proteína de ligação de antígeno marcada a (i) β-Klotho; (ii) FGFRlc, FGFR2c, FGFR3c ou FGFR4; ou (iii) um complexo que compreende β30 Klotho e um de FGFRlc, FGFR2c, FGFR3c e FGFR4 é detectada.
221
Em uma modalidade específica adicional, a ligação da proteína de ligação de antígeno a (i) β-Klotho; (ii) FGFRlc, FGFR2c, FGFR3c ou FGFR4; ou (iii) um complexo que compreende β-Klotho e um de FGFRlc, FGFR2c, FGFR3c e FGFR4 é detectada in vivo. Em uma modalidade específica adicional, a proteína de ligação de antígeno é isolada e medida com o uso de metodologias conhecidas na técnica. Veja, por exemplo, Harlow e Lane, (1988) Antibodies: A Laboratory Manual, Nova York: Cold Spring Harbor (ed. 1991 e suplementos periódicos); John E. Coligan, ed. , (1993) Current Protocols In Immunology, Nova York: John Wiley & Sons .
Outro aspecto permite a detecção da presença de uma molécula de teste que compete pela ligação a (i) β-Klotho;
(ii) FGFRlc, FGFR2C, FGFR3c ou FGFR4; ou (iii) um complexo que compreende β-Klotho e um de FGFRlc, FGFR2c, FGFR3c e FGFR4 com as proteínas de ligação de antígeno fornecidas, como aqui reveladas. Um exemplo de um ensaio desse tipo envolvería a detecção da quantidade de proteína de ligação de antígeno livre em uma solução que contém uma quantidade de um ou mais de (i) β-Klotho; (ii) FGFRlc, FGFR2c, FGFR3c ou FGFR4; ou (iii) um complexo que compreende β-Klotho e um de FGFRlc, FGFR2c, FGFR3c e FGFR4 na presença ou ausência da molécula de teste. Um aumento na quantidade de proteína de ligação de antígeno livre (ou seja, da proteína de ligação de antígeno não ligada a (i) β-Klotho; (ii) FGFRlc, FGFR2c, FGFR3C ou FGFR4; ou (iii) um complexo que compreende β-Klotho e um de FGFRlc, FGFR2c, FGFR3c e FGFR4) indicaria que a molécula de teste é capaz de competir pela ligação a (i) β-Klotho; (ii) FGFRlc, FGFR2C, FGFR3C ou
222
FGFR4; ou (iii) um complexo que compreende β-Klotho e um de FGFRlc, FGFR2c, FGFR3c e FGFR4 com a proteína de ligação de antígeno. Em uma modalidade, a proteína de ligação de antígeno é marcada com um grupo de marcação. Alternativamente, a molécula de teste é marcada e a quantidade de molécula de teste livre é monitorada na presença e ausência de uma proteína de ligação de antígeno.
Métodos de tratamento: formulações farmacêuticas e vias de administração
Também são fornecidos métodos de utilização das proteínas de ligação de antígeno. Em alguns métodos, uma proteína de ligação de antígeno é fornecida a um paciente. A proteína de ligação de antígeno induz sinalização do tipo FGF21.
Também são fornecidas composições farmacêuticas que compreendem uma quantidade terapeuticamente eficaz de uma ou várias das proteínas de ligação de antígeno e um diluente, veículo, solubilizante, emulsificante, conservante e/ou adjuvante farmaceuticamente aceitável. Além disso, são incluídos métodos de tratamento de um paciente por administração dessa composição farmacêutica. O termo paciente inclui pacientes humanos.
Materiais de formulação adequados são atóxicos para os receptores nas dosagens e concentrações empregadas. Em modalidades específicas, são fornecidas composições farmacêuticas que compreendem uma quantidade terapeuticamente eficaz de proteínas de ligação de antígeno humanas que se ligam especificamente a (i) β-Klotho; (ii) FGFRlc, FGFR2C, FGFR3c ou FGFR4; ou (iii) um complexo que compreende β-Klotho e um de FGFRlc, FGFR2c, FGFR3c e FGFR4.
223
Em certas modalidades, materiais de formulação aceitáveis preferivelmente são atóxicos para os receptores nas dosagens e concentrações empregadas. Em certas modalidades, a composição farmacêutica pode conter materiais de formulação para modificação, manutenção ou conservação, por exemplo, do pH, osmolaridade, viscosidade, clareza, cor, isotonicidade, odor, esterilidade, estabilidade, taxa de dissolução ou liberação, adsorção ou penetração da composição. Nessas modalidades, materiais de formulação adequados incluem, sem limitação, aminoácidos (como, por exemplo, glicina, glutamina, asparagina, arginina ou lisina); antimicrobianos; antioxidantes (como, por exemplo, ácido ascórbico, sulfito de sódio ou hidrogenossulfito de sódio); tampões (como, por exemplo, borato, bicarbonate, Tris-HCl, citratos, fosfatos ou outros ácidos orgânicos); agentes de volume (como, por exemplo, manitol ou glicina); agentes quelantes (como, por exemplo, etilenodiamina ácido tetra-acético (EDTA)); agentes de formação de complexo (como, por exemplo, cafeína, polivinilpirrolidona, beta-ciclodextrina ou hidroxipropilbeta-ciclodextrina); enchimentos; monossacarídeos; dissacarídeos; e outros carboidratos (como, por exemplo, glicose, manose ou dextrinas); proteínas (como, por exemplo, albumina sérica, gelatina ou imunoglobulinas); agentes corantes, flavorizantes e diluentes; agentes emulsificantes; polímeros hidrofílicos (como, por exemplo, polivinilpirrolidona); polipeptídeos de baixo peso molecular; contra-íons formadores de sal (como, por exemplo, sódio); conservantes (como, por exemplo, cloreto de benzalcônio, ácido benzóico, ácido salicílico,
224 timerosal, álcool fenetílico, metilparabeno, propilparabeno, clorexidina, ácido sórbico ou peróxido de hidrogênio); solventes (como, por exemplo, glicerina, propileno glicol ou polietileno glicol); álcoois de açúcar (como, por exemplo, manitol ou sorbitol); agentes de suspensão; tensoativos ou agentes umidificantes (como, por exemplo, Plurônicos, PEG, ésteres de sorbitano, polissorbatos como, por exemplo, polissorbato 20, polissorbato, Triton, trometamina, lecitina, colesterol, tiloxapal); agentes de aumento da estabilidade (como, por exemplo, sacarose ou sorbitol); agentes de aumento da tonicidade (como, por exemplo, haletos de metal alcalino, preferivelmente cloreto de sódio ou potássio, manitol sorbitol); veículos de liberação; diluentes; excipientes e/ou adjuvantes farmacêuticos. Veja Remington's Pharmaceutical Sciences, 18a Edição, (A.R. Gennaro, ed.), 1990, Mack Publishing Company.
Em certas modalidades, a composição farmacêutica ótima será determinada por aqueles habilitados na técnica, dependendo, por exemplo, da via de administração desejada, do formato de liberação e da dosagem desejada. Veja, por exemplo, Remington's Pharmaceutical Sciences, supra. Em certas modalidades, essas composições podem influenciar o estado físico, a estabilidade, a taxa de liberação in vivo e a taxa de depuração in vivo das proteínas de ligação de antígeno reveladas. Em certas modalidades, o veículo ou transportador primário em uma composição farmacêutica pode ter natureza aquosa ou não aquosa. Por exemplo, um veículo ou transportador adequado pode ser água para injeção, solução de soro fisiológico ou líquido cerebrospinal
225 artificial, possivelmente suplementado com outros materiais common em composições para administração parenteral. Solução salina tamponada neutra ou solução salina misturada com albumina sérica são veículos exemplares adicionais. Em modalidades específicas, as composições farmacêuticas compreendem tampão Tris com pH de cerca de 7,0-8,5, ou tampão de acetato com pH de cerca de 4,0-5,5, e podem ainda incluir sorbitol ou um substituto adequado. Em certas modalidades, composições que compreendem proteínas de ligação de antígeno que se ligam especificamente a (i) βKlotho; (ii) FGFRlc, FGFR2c, FGFR3C ou FGFR4; ou (iii) um complexo que compreende β-Klotho e um de FGFRlc, FGFR2c, FGFR3c e FGFR4 podem ser preparadas para armazenamento por mistura da composição selecionada que possui o grau desejado de pureza com agentes de formulação opcionais (Remington's Pharmaceutical Sciences, supra) na forma de um bolo liofilizado ou de uma solução aquosa. Além disso, em certas modalidades, a proteína de ligação de antígeno que se liga a (i) β-Klotho; (ii) FGFRlc, FGFR2c, FGFR3c ou FGFR4; ou (iii) um complexo que compreende β-Klotho e um de FGFRlc, FGFR2c, FGFR3c e FGFR4 pode ser formulada como um liofilizado com o uso de excipientes apropriados como, por exemplo, sacarose.
As composições farmacêuticas podem ser selecionadas para liberação parenteral. Alternativamente, as composições podem ser selecionadas para inalação ou para liberação através do trato digestivo, por exemplo, oralmente. A preparação dessas composições farmaceuticamente aceitáveis está dentro dos conhecimentos da técnica.
Os componentes da formulação estão presentes
226 preferivelmente em concentrações que são aceitáveis ao local de administração. Em certas modalidades, são usados tampões para manter a composição em pH fisiológico ou em um pH ligeiramente menor, tipicamente dentro de uma faixa de pH de cerca de 5 até cerca de 8.
Quando a administração parenteral é contemplada, as composições terapêuticas podem ser fornecidas na forma de uma solução aquosa parenteralmente aceitável, livre de pirogênio, que compreende a proteína de ligação de antígeno desejada em um veículo farmaceuticamente aceitável. Um veículo particularmente adequado à injeção parenteral é água destilada estéril na qual a proteína de ligação de antígeno é formulada como uma solução isotônica estéril, adequadamente conservada. Em certas modalidades, a preparação pode envolver a formulação da molécula desejada com um agente, por exemplo, microesferas injetáveis, partículas bioerosíveis, compostos poliméricos (como, por exemplo, ácido polilático ou ácido poliglicólico), glóbulos ou lipossomos, que pode fornecer liberação controlada ou sustentada do produto que pode ser liberado por meio de injeção de depósito. Em certas modalidades, ácido hialurônico também pode ser usado, que pode ter o efeito de promover a duração sustentada na circulação. Em certas modalidades, a liberação implantável de dispositivos farmacológicos pode ser usada para introduzir a proteína de ligação de antígeno desejada.
Certas composições farmacêuticas são formuladas para inalação. Em algumas modalidades, proteínas de ligação de antígeno que se ligam a (i) β-Klotho; (ii) FGFRlc, FGFR2c, FGFR3c ou FGFR4; ou (iii) um complexo que compreende β
227
Klotho e um de FGFRlc, FGFR2c, FGFR3C e FGFR4 são formuladas como um pó seco inalável. Em modalidades específicas, as soluções para inalação da proteína de ligação de antígeno também podem ser formuladas com um propelente para liberação em aerossol. Em certas modalidades, as soluções podem ser nebulizadas. A administração pulmonar e métodos de formulação são, portanto, ainda descritos no Pedido de Patente Internacional N° PCT/US94/001875, que é incorporado por referência e descreve a liberação pulmonar de proteínas quimicamente modificadas. Algumas formulações podem ser administradas oralmente. Proteínas de ligação de antígeno que se ligam especificamente a (i) β-Klotho; (ii) FGFRlc, FGFR2C, FGFR3c ou FGFR4; ou (iii) um complexo que compreende β-Klotho e um de FGFRlc, FGFR2c, FGFR3c e FGFR4 que são administradas dessa forma podem ser formuladas com ou sem veículos normalmente usados na composição de formas de dosagem solidas como, por exemplo, comprimidos e cápsulas. Em certas modalidades, uma cápsula pode ser projetada para liberar a porção ativa da formulação no ponto no trato gastrintestinal quando a biodisponibilidade foi maximizada e a degradação pré-sistêmica for minimizada. Agentes adicionais podem ser incluídos para facilitar a absorção de uma proteína de ligação de antígeno. Diluentes, flavorizantes, ceras com ponto de fusão baixo, óleos vegetais, lubrificantes, agentes de suspensão, agentes de desintegração de comprimidos e aglutinantes também podem ser empregados.
Algumas composições farmacêuticas compreendem uma quantidade eficaz de uma ou diversas proteínas de ligação
228 de antígeno humanas que se ligam especificamente a (i) βKlotho; (ii) FGFRlc, FGFR2C, FGFR3C ou FGFR4; ou (iii) um complexo que compreende β-Klotho e um de FGFRlc, FGFR2c, FGFR3c e FGFR4 em uma mistura com excipientes atóxicos que são adequados à fabricação de comprimidos. Por dissolução dos comprimidos em água estéril, ou em outro veículo apropriado, podem ser preparadas soluções em forma de dose unitária. Excipientes adequados incluem, sem limitação, diluentes inertes, por exemplo, carbonato de cálcio, carbonato ou bicarbonato de sódio, lactose ou fosfato de cálcio; ou agentes aglutinantes, por exemplo, amido, gelatina, ou acácia; ou agentes lubrificantes como, por exemplo, estearato de magnésio, ácido esteárico ou talco.
Composições farmacêuticas adicionais serão evidentes para aqueles habilitados na técnica, incluindo formulações que envolvem proteínas de ligação de antígeno que se ligam especificamente a (i) β-Klotho; (ii) FGFRlc, FGFR2c, FGFR3c ou FGFR4; ou (iii) um complexo que compreende β-Klotho e um de FGFRlc, FGFR2c, FGFR3c e FGFR4 em formulações de liberação sustentada ou controlada. Técnicas para formulação de vários outros meios de liberação sustentada ou controlada, por exemplo, veículos de lipossomo, micropartículas bioerosíveis ou glóbulos porosos e injeções de depósito, também são conhecidas por aqueles habilitados na técnica. Veja, por exemplo, Pedido de Patente Internacional N° PCT/US93/00829, que é incorporado por referência e descreve a liberação controlada de micropartículas poliméricas porosas para liberação de composições farmacêuticas. Preparações de liberação sustentada podem incluir matrizes poliméricas
229 semipermeáveis na forma de artigos moldados, por exemplo, películas ou microcápsulas. Matrizes de liberação sustentada podem incluir poliésteres, hidrogéis, polilactidas (como revelado na Patente U.S. N° 3.773.919 e na Publicação de Pedido de Patente Européia N° EP 058481, cada uma aqui incorporada por referência) , copolímeros de ácido L-glutâmico e gama etil-L-glutamato (Sidman e cols., 1983, Biopolymers 2: 547-556), poli (2-hidroxietilmetacrilato) (Langer e cols., 1981, J. Biomed. Mater. Res. 15: 167-277 e Langer, 1982, Chem. Tech. 12 : 98-105), etileno vinil acetato (Langer e cols., 1981, supra) ou ácido poli-D(-)-3-hidroxibutírico (Publicação de Pedido de Patente Européia N° EP 133.988). Composições de liberação sustentada também podem incluir lipossomos que podem ser preparados por qualquer um de vários métodos conhecidos na técnica. Veja, por exemplo, Eppstein e cols., 1985, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 82 : 3.688-3.692; Publicação de Pedido de Patente Européia Nos EP 036.676; EP 088.046 e EP 143.949, aqui incorporados por referência.
As composições farmacêuticas usadas para administração in vivo são tipicamente fornecidas como preparações estéreis. A esterilização pode ser obtida por filtração através de membranas de filtração estéril. Quando a composição é liofilizada, a esterilização usando esse método pode ser efetuada antes ou depois de liofilização e reconstituição. Composições para administração parenteral podem ser armazenadas em forma liofilizada ou em uma solução. As composições parenterais geralmente são colocadas em um recipiente que possui uma entrada de acesso estéril, por exemplo, uma bolsa ou frasco de solução
230 intravenosa que possui uma tampa perfurável por uma agulha de injeção hipodérmica.
Em certas modalidades, células que expressam uma proteína recombinante de ligação de antígeno como aqui revelada são encapsuladas para liberação (veja, Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. (2002) 43 : 3.292-3.298 e Proc. Natl. Acad. Sciences USA (2006) 103: 3.896-3.901).
Em certas formulações, uma proteína de ligação de antígeno possui uma concentração de pelo menos 10 mg/ml, 20 mg/ml, 30 mg/ml, 40 mg/ml, 50 mg/ml, 60 mg/ml, 70 mg/ml, 80 mg/ml, 90 mg/ml, 100 mg/ ml ou 150 mg/ml. Algumas formulações contêm um tampão, sacarose e polissorbato. Um exemplo de uma formulação é uma que contém 50-100 mg/ml de proteína de ligação de antígeno, 5-20 mM de acetato de sódio, 5-10% p/v de sacarose e 0,002-0,008% p/v de polissorbato. Certas formulações, por exemplo, contêm 65-75 mg/ml de uma proteína de ligação de antígeno em 9-11 mM de tampão de acetato de sódio, 8-10% p/v de sacarose e 0,0050,006% p/v de polissorbato. O pH de algumas dessas formulações está na faixa de 4,5-6. Outras formulações possuem um pH de 5,0-5,5 (por exemplo, pH de 5,0, 5,2 ou 5,4) .
Após a composição farmacêutica ter sido formulada, ela pode ser armazenada em frascos estéreis como uma solução, suspensão, gel, emulsão, sólido, cristal ou com um pó desidratado ou liofilizado. Essas formulações podem ser armazenadas em uma forma pronta para uso ou em uma forma (por exemplo, liofilizada) que é reconstituída antes da administração. Kits para a produção de uma unidade de administração de dose única também são fornecidos. Certos
231 kits contêm um primeiro recipiente que possui uma proteína seca e um segundo recipiente que possui uma formulação aquosa. Em certas modalidades, são fornecidos kits que contêm seringas pré-preenchidas com uma única ou com múltiplas câmaras (por exemplo, seringas líquidas e lioseringas). A quantidade terapeuticamente eficaz de uma composição farmacêutica que contém proteína de ligação de antígeno a ser empregada dependerá, por exemplo, do contexto e dos objetivos terapêuticos. Aqueles habilitados na técnica observarão que os níveis de dosagem apropriados para tratamento irão variar, dependendo, em parte, da molécula liberada, da indicação para a qual a proteína de ligação de antígeno está sendo usada, da via de administração e do tamanho (peso corporal, superfície corpórea ou tamanho do órgão) e/ou condição (da idade e saúde geral) do paciente. Em certas modalidades, o médico pode titular a dosagem e modificar a via de administração para obter o efeito terapêutico ótimo.
Uma dosagem típica pode variar de cerca de 1 pg/kg até
cerca de 3 0 mg/kg ou mais , dependendo dos fatores
mencionados acima. Em modalidades específicas, a dosagem
pode variar de 10 pg/kg até cerca de 30 mg/kg,
opcionalmente de 0,1 mg/kg até cerca de 30 mg/kg,
alternativamente de 0, 3 mg/kg até cerca de 20 mg/kg. Em
algumas aplicações, a dosagem é de 0,5 mg/kg a 20 mg/kg. Em alguns casos, uma proteína de ligação de antígeno é dosada a 0,3 mg/kg, 0,5 mg/kg, 1 mg/kg, 3 mg/kg, 10 mg/kg ou 20 mg/kg. A posologia de dosagem em alguns regimes de tratamento está em uma dose de 0,3 mg/kg por semana, 0,5 mg/kg por semana, 1 mg/kg por semana, 3 mg/kg por semana,
232 mg/kg por semana ou 20 mg/kg por semana.
Ά frequência de dosagem dependerá dos parâmetros farmacocinéticos da proteína de ligação de antígeno em particular na formulação usada. Tipicamente, um médico administra a composição até que seja alcançada uma dosagem que obtenha o efeito desejado. A composição pode, portanto, ser administrada como uma dose única, ou como duas ou mais doses (que podem, não necessariamente, conter a mesma quantidade da molécula desejada) ao longo de tempo, ou como uma infusão contínua por meio de um dispositivo de implantação ou cateter. Dosagens apropriadas podem ser verificadas por meio do uso de dados apropriados de doseresposta. Em certas modalidades, as proteínas de ligação de antígeno podem ser administradas aos pacientes ao longo de um período de tempo estendido. A administração crônica de uma proteína de ligação de antígeno minimiza a resposta imune ou alérgica adversa comumente associada às proteínas de ligação de antígeno que não são totalmente humanas, por exemplo, um anticorpo despertado contra um antígeno humano em um animal não humano, por exemplo, um anticorpo não totalmente humano ou anticorpo não humano produzido em uma espécie não humana.
A via de administração da composição farmacêutica é de acordo com métodos conhecidos, por exemplo, oralmente, por meio de injeção pela via intravenosa, intraperitoneal, intracerebral (intraparenquimatosa), intracerebroventricular, intramuscular, intra-ocular, intra-arterial, intraportal ou intralesional; por sistemas de liberação sustentada ou por dispositivos de implantação. Em certas modalidades, as composições podem ser
233 administradas por injeção em bolo ou continuamente por infusão, ou por dispositivo de implantação.
A composição também pode ser administrada localmente por meio de implantação de uma membrana, esponja ou outro material apropriado sobre o qual a molécula desejada foi absorvida ou encapsulada. Em certas modalidades, quando um dispositivo de implantação é usado, o dispositivo pode ser implantado em qualquer tecido ou órgão adequado, e a liberação da molécula desejada pode ocorre por meio de difusão, bolo por tempo controlado ou administração contínua.
Também pode ser desejável usar composições farmacêuticas de proteína de ligação de antígeno ex vivo. Nesses casos, células, tecidos ou órgãos que foram removidos do paciente são expostos às composições farmacêuticas de proteína de ligação de antígeno e depois as células, tecidos e/ou órgãos são subsequentemente implantados de volta no paciente.
Em particular, proteínas de ligação de antígeno que se ligam especificamente a (i) β-Klotho; (ii) FGFRlc, FGFR2c, FGFR3c ou FGFR4; ou (iii) um complexo que compreende βKlotho e um de FGFRlc, FGFR2c, FGFR3c e FGFR4 podem ser liberadas por implantação de certas células que foram modificadas geneticamente, usando métodos como aqueles aqui descritos, para expressar e secretar o polipeptídeo. Em certas modalidades, essas células podem ser células animais ou humanas, e podem ser autólogas, heterólogas ou xenogênicas. Em certas modalidades, as células podem ser imortalizadas.Em outras modalidades, a fim de diminuir a probabilidade de uma resposta imunológica, as células podem
234 ser encapsuladas para evitar a infiltração de tecidos circundantes. Em modalidades adicionais, os materiais de encapsulação são tipicamente anexos ou membranas poliméricas biocompatíveis, semipermeáveis, que permitem a liberação do produto(s) de proteína, mas evitam a destruição das células pelo sistema imune do paciente ou por outros fatores prejudiciais dos tecidos circundantes.
Terapias combinadas
Em outro aspecto, a presente revelação fornece um método de tratamento um indivíduo para diabetes com uma proteína de ligação de antígeno terapêutica da presente revelação, por exemplo, os anticorpos terapêuticos totalmente humanos aqui descritos, junto com um ou mais outros tratamentos. Em uma modalidade, uma terapia combinada desse tipo obtém um efeito aditivo ou sinérgico. As proteínas de ligação de antígeno podem ser administradas em combinação com um ou mais dos tratamentos para diabetes tipo 2 ou obesidade atualmente disponíveis. Esses tratamentos para diabetes incluem biguanida (metaformin) e sulfoniluréias (como, por exemplo, gliburida, glipizida). Tratamentos adicionais dirigidos à manutenção da homeostasia de glicose incluem agonistas de PPAR gama (pioglitazona, rosiglitazona); glinidas (meglitinida, repaglinida e nateglinida); inibidores de DPP-4 (Januvia® e Onglyza®) e inibidores da alfa-glicosidase (acarbose, voglibose).
Tratamentos combinados adicionais para diabetes incluem tratamentos injetáveis como, por exemplo, insulina e miméticos de incretina (Byetta®, Exenatide®), outros análogos de GLP-1 (peptídeo glucagon-like) como, por
235 exemplo, liraglutida, outros agonistas de GLP-1R e Symlin® (pranlintida).
Tratamentos combinados adicionais destinados à perda de peso incluem Meridia® e Xenical®.
EXEMPLOS
Os exemplos seguintes, incluindo os experimentos realizados e os resultados obtidos, são fornecidos apenas para fins ilustrativos, e não devem ser considerados como limitantes.
EXEMPLO 1
PREPARAÇÃO DE CÉLULAS QUE SUPEREXPRESSAM FGFRlc PARA USO COMO UM ANTÍGENO
Seqüências de ácido nucléico que codificam o polipeptídeo de FGFRlc humano de comprimento total (ID. DE SEQ. N° : 4; Figuras 1A-1B) e uma seqüência separada que codifica o polipeptídeo de β-Klotho humano de comprimento total (ID. DE SEQ. N°: 7; Figuras 2A-2C) foram subclonadas em vetores de expressão de célula de mamífero adequados (por exemplo, pcDNA3.1 Zeo, pcDNA3.1 Hyg (Invitrogen, Carlsbad, CA) ou pDSR«20. O vetor pDSR«20 contém promotor/intensificador precoce de SV40 para expressão do gene de interesse e um cassete de expressão de DHFR de camundongo para seleção em células hospedeiras CHO DHFR (-) como, por exemplo, AM1 CHO (um derivado de DG44, CHO DHFR (-) ) ·
Células AM-1 CHO foram semeadas a 1,5 x 106 células por placa de 100 mm. Após 24 horas, as células foram cotransfectadas com DNAs linearizados de pDSRa20/huFGFRlc e pDSR«20/h^-Klotho com FuGeneô (Roche Applied Science). As células transfectadas foram tripsinizadas 2 dias após a
236 transfecção e semeadas em meio de crescimento seletivo CHO DHFR contendo FBS dialisado 10% e sem suplemento de hipoxantina/timidina. Após 2 semanas, as colônias transfectadas resultantes foram tripsinizadas e reunidas em pool.
Células HEK293T foram transfectadas com o huFGFRlc e hup-Klotho de comprimento total em vetor à base de série pcDNA3.1 ou pTT14 (um vetor de expressão desenvolvido por Durocher, NRCC, com promotor de CMV e ori de EBV, similar ao pTT5 e um marcador de seleção de puromicina) e selecionadas com os fármacos correspondentes após procedimento similar ao para a transfecção e seleção de CHO.
Os pools de células transf ectadas AM1 CHO ou 293T com FGF21R (ou seja, FGFRlc e pKlotho) foram classificadas repetidamente usando FGF21 marcado com Alexa 647. Como um reagente de coloração da superfície celular, FGF21 foi marcado com Alexa 647-NHS de acordo com o método recomendado pelo fabricante (Molecular Probes, Inc. Cat A 2006) . O FGF21 marcado com Alexa 647 mostrou coloração específica das células que expressam o receptor de FGF21R e não das células parentais não transfectadas (Figura 3) . Células com expressão elevada foram coletadas ao final da classificação final, expandidas e congeladas em frascos. As células AM-l/huFGF21R foram preparadas para imunização e as células 293T/huFGF21R foram usadas para titulação de soros de camundongos por FACS após imunização e em avaliações de ligação dos sobrenadantes de hibridoma por FMAT (veja Exemplo 4).
EXEMPLO 2
237
PREPARAÇÃO DE UM COMPLEXO DE FGFRlc/β-KLOTHO SOLÚVEL PARA USO COMO ANTÍGENO
Construções de receptor de FGF21 solúvel foram geradas em vetores de expressão pTT14 ou pcDNA3.1. A construção de ECD-Fc de FGFRlc (ID. DE SEQ. N°: 362, Figura 4) compreende o domínio extracelular do terminal N de FGFRlc (resíduos de aminoácidos #1-374; ID. DE SEQ. N° : 5) fundido ao Fc (ID. DE SEQ. N° : 384) . A construção de ECD-Fc de β-Klotho (ID. DE SEQ. N° : 363, Figura 5) compreende o domínio extracelular do terminal N de β-Klotho (resíduos de aminoácidos #1-996; ID. DE SEQ. N° : 8) fundido ao Fc (ID. DE SEQ. N°: 384).
Células HEK293 (293F, Invitrogen) foram transfectadas com ECD-Fc/pTT5 de huFGFRlc, ECD-Fc/pTT14-puro de ΙιηβKlotho e dGFP/pcDNA3.1-Neo e selecionadas na presença dos fármacos correspondentes, seguido por separação por FACS repetida com base na expressão de dGFP. As células foram desenvolvidas em meio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) isento de soro suplementado com aminoácidos não essenciais em HyperFlasks (Corning) por 4 dias e meios condicionados (CM), e coletadas para purificação.
O CM de 293 foi concentrado 6 vezes e aplicado à Proteína A FF equilibrada em PBS. A proteína foi eluída com tampão de eluição Ag/Ab Pierce Gentle. O pool de Proteína A foi dialisado contra 20 mM de Tris-HCl, pH 7, 10 mM de NaCl e aplicado ao SP HP em pH 7,0. O ECD-Fc de FGFRlc estava presente no fluxo (FT) e o heterodimero foi eluido com gradiente linear de 0-0,4 M de NaCl, 20 mM de Tris-HCl pH 7,0. O seqüenciamento de aminoácidos do terminal N verificou que o FGF21R solúvel purificado é um heterodimero
238 composto por uma proporção (1:1) de ECD-Fc de FGFRlc e ECDFc de β-Klotho. O FGF21R-FC solúvel purificado (Figura 6) foi usado como o antígeno para imunização.
EXEMPLO 3
PREPARAÇÃO DE ANTICORPOS MONOCLONAIS
Foram feitas imunizações usando uma ou mais formas adequadas do antígeno do receptor de FGF21, incluindo: (1) receptor ligado à célula de transfectantes de CHO que expressam FGFRlc e β-Klotho humanos de comprimento total na superfície celular, obtidos por transfecção de células CHO com cDNA que codifica um polipeptídeo de FGFRlc humano de comprimento total do ID. DE SEQ. N°: 4 (veja também Figuras la-b) e cDNA que codifica um polipeptídeo de β-Klotho humano do ID. DE SEQ. N° : 7 (veja também Figuras 2a-c); (2) extrato de membrana das células mencionadas anteriormente que expressam o complexo do receptor de FGF21R; ou (3) receptor de FGF21R solúvel que pode ser obtido por coexpressão do domínio extracelular do terminal N (ECD) de FGFRlc (ID. DE SEQ. N° : 5; veja também Figura 4) e o domínio extracelular do terminal N (ECD) de β-Klotho (ID. DE SEQ. N° : 8; veja também Figura 5) ou (4) combinações destes.
Uma quantidade adequada de imunógeno (ou seja, 10 pg/camundongo de FGF21R solúvel ou 3-4 x 106 células/camundongo de células CHO transfectadas estavelmente ou 150 pg/camundongo de membranas de FGF21R purificadas preparadas por células CHO que expressam estavelmente FGF21R) foi usada para imunização inicial em XenoMouse™ de acordo com os métodos revelados no Pedido de Patente U.S. N° de Série 08/759.620, depositado em 3 de
239 dezembro de 1996 e no Pedidos de Patente Internacional Nos WO 98/24893 e WO 00/76310, cujas revelações são aqui incorporadas por referência. Após a imunização inicial, imunizações de reforço subseqüentes de imunógeno (5 pg/camundongo de FGF21R solúvel ou 1,7 x 10s células transfectadas com FGF21R/camundongo ou 75 pg de membranas de FGF21R purificadas) foram administradas em uma posologia e pela duração necessária para induzir uma titulação antiFGF21R adequada nos camundongos. As titulações foram determinadas por um método adequado, por exemplo, por imunoensaio de enzima, separação de células ativada por fluorescência (FACS), ou por outros métodos (incluindo combinações de imunoensaios de enzima e FACS).
Animais que exibem titulações adequadas foram identificados, e foram obtidos linfócitos dos linfonodos de drenagem e, se necessário, reunidos em pool para cada coorte. Os linfócitos foram dissociados de tecido linfóide por trituração em um meio adequado (por exemplo, meio de Eagle modificado por Dulbecco; DMEM; obtido por Invitrogen, Carlsbad, CA) para liberar as células dos tecidos, e suspensos em DMEM. Células B foram selecionadas e/ou expandidas usando métodos-padrão, e fundidas a um parceiro de fusão adequado, por exemplo, células não secretoras de mieloma P3X63Ag8.653 (American Type Culture Collection CRL 1580; Kearney e cols., J. Immunol. 123, 1979, 1.5481.550), usando técnicas que eram conhecidas na técnica.
Em um método de fusão adequado, linfócitos foram misturados com células parceiras de fusão em uma proporção de 1:4. A mistura de células foi gentilmente peletizada por centrifugação a 400 x g por 4 minutos, o sobrenadante
240 decantado, e a mistura de células gentilmente misturada (por exemplo, utilizando uma pipeta de 1 ml) . A fusão foi induzida com PEG/DMSO (polietileno glicol/sulfóxido de dimetila; obtido de Sigma-Aldrich, St. Louis MO; 1 ml por milhão de linfócitos). PEG/DMSO foi lentamente adicionado com agitação suave ao longo de um minuto, seguido por um minuto de misturação. IDMEM (DMEM sem glutamina; 2 ml por milhão de células B) foi então adicionado ao longo de 2 minutos com agitação suave, seguida por IDMEM adicional (8 ml por milhão de células B) que foi acrescentado ao longo de 3 minutos.
As células fundidas foram peletizadas (400 x g por 6 minutos) e ressuspensas em 20 ml de meio de seleção (por exemplo, DMEM contendo Azaserina e Hipoxantina [HA] e outros materiais suplementares, como necessário) por milhão de células B. As células foram incubadas por 20-30 minutos a 37°C e depois ressuspensas em 200 ml de meio de seleção e cultivadas por três a quatro dias em frascos T175 antes de plaqueamento em 96 poços.
As células foram distribuídas em placas de 96 poços usando técnicas-padrão para maximizar a clonalidade das colônias resultantes. Após vários dias de cultura, os sobrenadantes foram coletados e submetidos aos ensaios de avaliação, como detalhado nos exemplos abaixo, incluindo confirmação da ligação ao receptor de FGF21 humano, especificidade e/ou reatividade cruzada entre espécies. As células positivas foram ainda selecionadas e submetidas a técnicas-padrão de clonagem e subclonagem. As linhagens clonais foram expandidas in vitro, e os anticorpos humanos secretados obtidos para análise.
241
Dessa forma, camundongos foram imunizados com células ou membranas que expressam células de FGF21R de comprimento total, ou domínio extracelular de FGF21R solúvel, com uma faixa de 11-17 imunizações ao longo de um período de aproximadamente um mês a três meses e meio. Várias linhagens de células que secretam anticorpos específicos para FGF21R foram obtidas, e os anticorpos foi adicionalmente caracterizados. Suas seqüências são aqui apresentadas e na Listagem de Seqüências, e os resultados de vários testes com o uso desses anticorpos são fornecidos.
EXEMPLO 4
SELEÇÃO DE ANTICORPOS DE LIGAÇÃO POR FMAT
Após 14 dias de cultura, os sobrenadantes de hibridoma foram avaliados quanto aos anticorpos monoclonais específicos para FGF21R pela tecnologia de ensaio microvolumétrico fluorimétrico (FMAT) por avaliação contra a linhagem de células CHO AMl/huFGF21R ou células HEK293 recombinantes que foram transfectadas com FGF21R humano e contra-avaliação contra células CHO ou HEK293 parentais. Resumidamente, as células em meio Freestyle (Invitrogen) foram semeadas em placas de 384 poços FMAT em um volume de 50 μΐ/poço em uma densidade de 4.000 células/poço para os transfectantes estáveis, e em uma densidade de 16.000 células/poço para as células parentais, e as células foram incubadas de um dia para o outro a 37°C. Vinte e cinco μΐ/poço de sobrenadante foram então adicionados, e as placas foram incubadas por aproximadamente uma hora a 4°C, e depois 10 μΐ/poço de anticorpo secundário anti-IgG humana-Cy5 foram adicionados em uma concentração de 2,8
242 pg/ml (400 ng/ml de concentração final) . As placas foram então incubadas por uma hora a 4°C, e a fluorescência foi lida usando um sistema de detecção celular FMAT System (Applied Biosystems).
No total, mais de 3.000 sobrenadantes de hibridoma foram identificados como se ligando às células que expressam o receptor de FGF21, mas não às células parentais pelo método de FMAT. Esses sobrenadantes foram então testados nos ensaios funcionais de FGF21, como descrito abaixo.
EXEMPLO 5
SELEÇÃO DE ANTICORPOS QUE INDUZEM SINALIZAÇÃO DO TIPO FGF21
Foram feitos experimentos para identificar anticorpos
funcionais que mimetizam atividade de FGF21 do tipo
selvagem (por exemplo, a habilidade para induzir
sinalização do tipo FGF21) usando um ensaio-repórter de
FGF21 adequado. O ensaio-repórter de FGF21 revelado mede a ativação de sinalização de FGFR por meio de uma leitura da via de MAPK. β-Klotho é um co-receptor para sinalização de FGF21 e, embora se acredite que não tenha nenhuma capacidade de sinalização inerente em função de seu domínio citoplasmático muito curto, ele é necessário para FGF21 para induzir sinalização por meio de FGFRs.
Exemplo 5.1
Ensaio-repórter de ELK-luciferase
Foram realizados ensaios de ELK-luciferase usando um sistema de células renais 293T ou de células CHO humanas recombinantes. Especificamente, as células hospedeiras foram modificadas geneticamente para superexpressar construções-repórteres de β-Klotho e luciferase. As
243 construções-repórteres contêm seqüências que codificam GAL4-ELK1 e 5xUAS-Luc, um repórter de luciferase conduzido por um promotor que contém cinco cópias em tandem do sítio de ligação de Gal4 . A ativação do complexo do receptor de FGF21 nessas linhagens-repórteres de células recombinantes induz transdução de sinal intracelular que, por sua vez, leva à fosforilação de ERK e ELK. A atividade de luciferase é regulada pelo nível de ELK fosforilada, e é usada para monitorar e quantificar indiretamente a atividade de FGF21.
Em um exemplo, células CHO foram transfectadas seqüencialmente usando o reagente de transfecção Lipofectamina 2000 (Invitrogen) de acordo com o protocolo do fabricante com as construções de receptor que expressam β-Klotho, FGFRlc e os plasmídeos repórteres: 5xGal4Luciferase (promotor de TK mínimo com sítios de ligação de 5xGal4 upstream de luciferase) e Gal4-ELK1. Gal4-ELK1 se liga aos sítios de ligação de Gal4 e ativa a transcrição quando é fosforilada por ERK. A transcrição de Luciferase e, dessa forma, a atividade enzimática correspondente nesse contexto, é regulada pelo nível de ELK1 fosforilada, e é usada para monitorar e quantificar indiretamente a atividade de FGF21.
O clone 2E10 foi selecionado como a linhagem de células-repórteres de luciferase FGF21 com base na janela de ensaio ótima de 10-20 vezes, com FGF21 nativo exibindo uma EC5o na faixa de um único nM.
Para o ensaio, as células-repórteres de ELK-luciferase foram plaqueadas em placas de ensaio de 96 poços, e privadas de soro de um dia para o outro. FGF21 ou amostras de teste foram adicionadas por 6 horas a 37°C. Permitiu-se,
244 então, que as placas resfriassem até a temperatura ambiente e a atividade de luciferase nos lisados de células foi medida com Bright-Glo (Promega).
Exemplo 5.2
Ensaio de fosforilação de ERK
Uma linhagem de célula hospedeira alternativa, especificamente L6 (uma linhagem de célula mioblástica de rato) foi desenvolvida e aplicada para identificar anticorpos com atividade de sinalização do tipo FGF21. A linhagem de célula L6 de rato é uma linhagem de célula hospedeira desejável para o ensaio de atividade, pois sabidamente expressar níveis mínimos de receptores de FGF endógenos. As células L6 não respondem ao FGF21, até mesmo quando transfectadas com vetor de expressão de β-Klotho e, portanto, fornece um nível de fundo mais limpo (Kurosu e cols., (2007) J. Biol. Chem. 282, 26.687-26.695).
Células L6 foram mantidas em meio de Eagle modificado por Dulbecco suplementado com soro bovino fetal 10% e penicilina/estreptomicina. As células foram transfectadas com plasmídeos que expressam β-Klotho e FGFR individual usando o reagente de transfecção Lipofectamina 2000 (Invitrogen) de acordo com o protocolo do fabricante.
A análise da sinalização de FGF em células L6 foi realizada como descrito na literatura (Kurosu e cols., (2007) J. Biol. Chem. 282, 26.687-26.695). Culturas de células foram coletadas 10 min após o tratamento de FGF21 ou moléculas de teste e congeladas subitamente em nitrogênio líquido, homogeneizadas no tampão de lise e submetidas à análise western blot usando um anticorpo antifosfo-p44/42 MAP quinase (ERK1/2) e um anticorpo anti-ERK
245 (Cell Signaling). O percentual de proteína ERK fosforilada versus ERK total foi determinado dessa forma.
Além disso, o ensaio de proliferação baseado em células BaF3 de camundongo fator-dependente usado freqüentemente para receptores de citocina também pode ser desenvolvido e aplicado.
Entres os sobrenadantes de hibridoma testados no ensaio-repórter de ELK-luciferase de FGF21 humano baseado em células CHO (clone 2E10), mais de 30 foram identificados como positivos (> 5% da atividade de FGF21) quando comparados com 20 nN de FGF21 como o controle positivo. Anticorpos foram então purificados dos meios condicionados das culturas de hibridoma desses positivos e testados novamente no ensaio-repórter de ELK-luciferase baseado em células CHO. A Figura 7 mostrou os anticorpos representativos no ensaio de potência de dose-resposta com EC50 estimada de menos do que 1 pg/ml (ou 6,7 nM) . As atividades foram confirmadas no ensaio de fosforilação de ERK1/2 baseado em células L6 (Figura 8) com EC50 de menos do que 10 nM, o que é consistente com o ensaio de ELKlucif erase na linhagem de células CHO 2E10 estáveis.
EXEMPLO 6
INDUÇÃO DE SINALIZAÇÃO DO TIPO FGF21 É ESPECÍFICA PARA O COMPLEXO DE FGFRlc/pKLOTHO
Foi relatado que FGF21 sinaliza através de múltiplos complexos receptores, incluindo FGFRlc, 2c, 3c e 4, quando pareado com β-Klotho. A seletividade dos anticorpos agonistas de FGF21 foi testada nas células mieloblásticas L6 de rato transf ectadas com vetores que expressam os respectivos FGFRs e pKlotho. Os resultados mostrados na
246
Figura 9 demonstram que a atividade era mediada seletiva e exclusivamente por meio de FGFRlc, e não por meio de FGFR2c, 3c ou 4 quando eles estavam pareados com β-Klotho, pois nenhuma atividade foi detectada nos últimos receptores até 100 nM dos anticorpos agonistas. Essa seletividade única sugere fortemente que a ação desses anticorpos é βKlotho-dependente, embora deva envolver especificamente o componente de FGFRlc do complexo de sinalização.
EXEMPLO 7
ATIVIDADE EM ADIPÓCITOS PRIMÁRIOS HUMANOS
FGF21 estimula a captação de glicose e a lipólise em adipócitos cultivados, e os adipócitos são considerados como sendo mais fisiologicamente relevantes do que o sistema de célula repórter recombinante. Foi demonstrado que um painel dos anticorpos exibe atividade de fosforilação de Erk similar ao FGF21 no ensaio de adipócito humano (Figura 10) com EC50 estimada de menos do que 10 nM.
EXEMPLO 8
LIGAÇÃO COMPETITIVA E LIGAÇÃO DE EPITOPO
Para comparar a similaridade dos sítios de ligação dos anticorpos no receptor de FGF21, uma série de experimentos de ligação competitiva foi deita e medidos por Biacore. Em um exemplo (e como mostrado na Figura 11), dois anticorpos agonistas do receptor de FGF21 representativos (24H11 e 17D8) e anticorpos de ligação a um receptor de FGF21 não funcional (1A2.1) foram imobilizados na superfície do chip sensor. Complexo de ECD-Fc de FGFRlc/β-Klotho solúvel humano ou β-Klotho foi então capturado nas superfícies do anticorpo imobilizado. Finalmente, vários dos anticorpos do receptor de FGF21 de teste foram injetados individualmente
247 sobre o receptor de FGF21 ou β-Klotho solúvel humano capturado. Se o anticorpo injetado reconhece um sítio de ligação distinto em relação àquele reconhecido pelo anticorpo imobilizado, um segundo evento de ligação será observado. Se os anticorpos reconhecem um sítio de ligação muito similar, não será mais observada ligação.
Como mostrado na Figura 11A, há dois sítios de ligação distintos, embora parcialmente superpostos, para os anticorpos agonistas testados. Um sítio é coberto por 24H11, 21H2, 18B11.1 e 17C3 (Grupo A) e o outro sítio coberto por 17D8, 12E4 e 18G1 (Grupo B). Os dois anticorpos não funcionais, 2G10 e 1A2, se ligam a sítios diferentes entre eles e são distintos dos dois sítios cobertos pelos anticorpos agonistas nos Grupos A e B. Outros anticorpos funcionais que se ligam ao epitopo do Grupo A incluíam 20D4, 22H5, 16H7, 40D2 e 46D11. Foi demonstrado por esse método que dois outros anticorpos funcionais, 26H11 e 37D3, se ligam ao mesmo sítio coberto pelos anticorpos do Grupo B. Além disso, um terceiro sítio de ligação para anticorpos funcionais foi identificado para 39F11, 39F7 e 39G5 (grupo C) , que pareciam ser distintos dos sítios de ligação dos Grupos A e B (Figura 11B).
Outra análise Biacore foi realizada com FGF21 biotinilado imobilizado no chip sensor. Dez nM de β-Klotho solúvel foram então passados sobre o chip isoladamente ou misturados com os anticorpos de teste individuais a 100 nM. A Figura 12 mostrou que vários anticorpos agonistas no Grupo A (24H11, 18B11, 17C3) e o anticorpo 12E4 (do Grupo B) competiam significativamente com FGF21 na ligação ao βKlotho solúvel, enquanto os anticorpos não funcionais 2G10
248 e 1A2 e vários outros anticorpos funcionais não mostraram ligação competitiva com FGF21.
A Figura 11C resume os resultados de ligação obtidos.
EXEMPLO 9 RECONHECIMENTO DE ESTRUTURAS NATIVAS E DESNATURADAS
A habilidade de proteínas de ligação de antígeno reveladas para reconhecer estruturas desnaturadas e nativas foi investigada. O procedimento e os resultados foram os seguintes.
Exemplo 9.1
Anticorpos agonistas do receptor de FGF21 não reconhecem estruturas desnaturadas, como demonstrado por FACS
Lisados de células de células CHO que expressam estavelmente receptor de FGF21 (FGFRlc e β-Klotho) ou células CHO parentais foram diluídas com tampão de amostra sem beta-mercaptoetanol (condições não redutoras). Vinte μΐ de lisado de células foram carregados por raia em raias adjacentes separadas com uma raia de marcador de peso molecular em géis de SDS-PAGE 4-20%. Após eletroforese, os géis foram blotados em filtros de nitrocelulose de 0,2 μ. Os blots foram tratados com solução salina tamponada com Tris/Triton-X (TBST) mais leite desnatado 5% (tampão de bloqueio) por 30 minutos. Os blots foram então cortados ao longo das raias de marcador de peso molecular. As tiras foram então sondadas com anticorpos agonistas do receptor de FGF21 (12C3, 26H11, 12E4, 21H2, 18B11 ou 20D4), e antiβ-Klotho murídeo ou anti-huFGFRl de camundongo comercial de cabra (R&D Diagnostics) em TBST/leite 5%. Os blots foram incubados com os anticorpos por uma hora em temperatura
249 ambiente, seguido por três lavagens com TBST + leite 1%. Os blots foram então sondados com anticorpos secundários antiIgG humana ou de cabra-HRP por 2 0 min. Os blots receberam três lavagens de 15 min com TBST, seguidas por tratamento com reagente de desenvolvimento Pierce Supersignal West Dura (1 min) e exposição ao filme de raios-X Kodak Biomax.
Os anticorpos comerciais anti-β-Klotho e anti-FGFRl detectaram as proteínas receptoras correspondentes no SDSPAGE, indicando que eles se ligam às proteínas receptoras desnaturadas. Em contraste, nenhum dos anticorpos agonistas do receptor de FGF21 testados detectou a espécie de proteína correspondente, sugerindo que eles se ligam ao epitopo conformacional nativo distinto dos anticorpos comerciais que se ligam às seqüências desnaturadas.
Exemplo 9.2
Anticorpos agonistas do receptor de FGF21 se ligam à estrutura nativa do receptor, como demonstrado por FACS
Um ensaio de ligação por FACS foi realizado com vários anticorpos de FGFRlc e β-Klotho disponíveis comercialmente, e com vários dos anticorpos agonistas do receptor de FGF21 revelados. Os experimentos foram feitos da seguinte forma.
Células CHO que expressam estavelmente o receptor de FGF21 foram tratadas com anti-huFGFRl de camundongo R&D Systems, anti-mu β-Klotho de cabra ou anticorpos do receptor de FGF21 24H11, 17C3, 17D8, 18G1 ou 2G10 (1 pg por 1 x 106 células em 100 pl de PBS/BSA 0,5%) . As células foram incubadas com os anticorpos a 4°C, seguido por duas lavagens com PBS/BSA. As células foram então tratadas com anticorpos secundários marcados com FITC a 4°C, seguido por duas lavagens. As células foram ressuspensas em 1 ml de
250
PBS/BSA e a ligação do anticorpo foi analisada usando um a instrumento de FACS Calibur.
Consistentes com os resultados de western blot, todos os anticorpos agonistas do receptor de FGF21 testara se ligam bem ao receptor de FGF21 da superfície celular em FACS, enquanto os anticorpos anti-p-Klotho ou anti-FGFRl comerciais não o fizeram. Essa observação confirmou ainda que os anticorpos agonistas do receptor de FGF21 reconhecem a estrutura nativa, enquanto os anticorpos comerciais para os componentes do receptor não o fazem.
EXEMPLO 10
VARREDURA DE ARGININA
Como descrito acima, foram criadas e caracterizadas proteínas de ligação de antígeno que se ligam ao FGF21R humano, por exemplo, FGFRlc, β-Klotho ou tanto FGFRlc quanto β-Klotho. Para determinar os determinantes neutralizantes em FGFRlc e/ou β-Klotho humano que essas várias proteínas de ligação de antígeno se ligaram, podem ser construídas diversas proteínas mutantes de FGFRlc e/ou β-Klotho que possuem substituições de arginina em resíduos de aminoácidos selecionados de FGFRlc e/ou β-Klotho humano. A varredura de arginina é um método reconhecido na técnica de avaliação de onde anticorpos, ou outras proteínas, se ligam a outra proteína; veja, por exemplo, Nanevicz e cols., (1995) J. Biol. Chem., 270:37, 21.619-21.625 e Zupnick e cols., (2006) J. Biol. Chem., 281:29, 20.46420.473. Em geral, a cadeia lateral de arginina é carregada positivamente e relativamente volumosa quando comparada com outros aminoácidos, o que pode romper a ligação de anticorpo a uma região do antígeno onde a mutação é
251 introduzida. A varredura de arginina é um método que determina se um resíduo é parte de um determinante neutralizante e/ou um epitopo.
Vários aminoácidos distribuídos pelos domínios extracelulares de FGFRlc e/ou β-Klotho humano podem ser selecionados para mutação em arginina. A seleção pode ser direcionada aos aminoácidos carregados ou polares para maximizar a possibilidade do resíduo estar na superfície e reduzir a probabilidade da mutação resultar em proteína dobrada erroneamente. Usando técnicas-padrão conhecidas na técnica, oligonucleotídeos senso e anti-senso que contêm os resíduos mutados podem ser projetados com base em critérios fornecidos pelo kit do protocolo Stratagene Quickchange® II (Stratagene/Agilent, Santa Clara, CA). Pode ser realizada mutagênese das seqüências de FGFRlc e/ou β-Klotho do tipo selvagem (WT) usando um kit Quickchange® II (Stratagene). Podem ser projetadas construções quiméricas para codificar um tag de FLAG-histidina (seis histidinas (ID. DE SEQ. N° : 382)) no terminal carbóxi do domínio extracelular para facilitar a purificação por meio do tag poliHis. A análise multiplex usando a estação de trabalho e o software BioPlex (BioRad, Hercules, CA) pode ser realizada para determinar determinantes neutralizantes em FGFRlc e/ou βKlotho humano por análise da ligação diferencial de mAbs de FGFRlc e/ou β-Klotho humano exemplares aos mutantes de arginina versus proteínas de FGFRlc e/ou β-Klotho do tipo selvagem. Qualquer número de códigos de glóbulos de glóbulos revestidos com pentaHis (penta-His revelados como ID. DE SEQ. N° : 383) (Qiagen, Valencia, CA; veja wwwl.qiagen.com) pode ser usado para capturar proteína com
252 tag de histidina. Os códigos de glóbulos podem permitir a multiplexação de mutantes de arginina de FGFRlc e/ou βKlotho e FGFRlc e/ou β-Klotho humano do tipo selvagem.
Para preparar os glóbulos, 100 μΐ de sobrenadantes de FGFRlc e/ou β-Klotho do tipo selvagem e mutante de arginina de FGFRlc e/ou β-Klotho de cultura de expressão transitória são ligados a glóbulos revestidos com penta-His (pentaHis revelado como ID. DE SEQ. N° : 383) de um dia para o outro a 4°C ou 2 horas em temperatura ambiente com agitação vigorosa. Os glóbulos são então lavados como pelo protocolo do fabricante e o conjunto de glóbulos reunido em pool e divididos em alíquotas em 2 ou 3 colunas de uma placa de filtro de 96 poços (Millipore, Bellerica, MA, produto #MSBVN1250) para pontos de ensaio em duplicata ou triplicata, respectivamente. Cem μΐ de anticorpos antiFGFRlc e/ou anti-β-Klotho em diluições de 4 vezes são adicionados aos poços, incubados por 1 hora em temperatura ambiente, e lavados. Cem μΐ de uma diluição de 1:100 de anti-Fc de IgG humana conjugado à PE (Jackson Labs., Bar Harbor, ME, produto #109-116-170) são adicionados a cada poço, incubados por 1 hora em temperatura ambiente e lavados. Os glóbulos são ressuspensos em BSA 1%, agitados por 3 minutos, e lidos em uma estação de trabalho Bio-Plex. A ligação do anticorpo ao mutante de arginina da proteína de FGFRlc e/ou β-Klotho é comparada à ligação do anticorpo ao FGFRlc e/ou β-Klotho humano do tipo selvagem do mesmo pool. Uma titulação de anticorpo ao longo de uma escala de aproximadamente um log pode ser realizada. A intensidade de fluorescência mediana (MFI) de mutante de arginina de proteínas de FGFRlc e/ou β-Klotho pode ser representada
253 graficamente como uma percentual do sinal máximo de FGFRlc e/ou β-Klotho do tipo selvagem humano. Esses mutantes para os quais o sinal de todos os anticorpos estão abaixo de um valor de corte, por exemplo, 30% de FGFRlc e/ou β-Klotho do tipo selvagem, podem ser considerados de uma concentração de proteína muito baixa no glóbulo em conseqüência da baixa expressão na cultura transitória ou possivelmente dobragem errônea, e podem ser excluídos da análise. Mutações (ou seja, substituições de arginina) que aumentam a EC50 para o mAb de FGFRlc e/ou β-Klotho por um valor de corte, por exemplo, 3 vezes ou mais (como calculado, por exemplo, por GraphPad Prism®) podem ser consideradas como tendo afetado negativamente a ligação do mAb de FGFRlc e/ou β-Klotho. Por meio desses métodos, determinantes neutralizantes e epitopos para vários anticorpos de FGFRlc e/ou β-Klotho são elucidados.
EXEMPLO 11
CONSTRUÇÃO DE RECEPTORES QUIMÉRICOS
Em outro método de determinação dos determinantes de ativação em FGFRlc e/ou β-Klotho humano aos quais essas várias proteínas de ligação de antígeno se ligam, podem ser construídas e testadas proteínas quiméricas de FGFRlc e/ou β-Klotho específicas entre espécies humanas e de camundongo, expressas em células 293 ou CHO transitórias ou estáveis, como descrito anteriormente. Por exemplo, um receptor de FGF21 quimérico pode ser construído, que compreende FGFRlc, FGFR2C, FGFR3C ou FGFR4 humano nativo, em um FGFRlc de exemplo, pareado com β-Klotho quimérico humano/de camundongo no qual regiões ou seqüências selecionadas no β-Klotho humano são sistematicamente
254 substituídas pelos resíduos de camundongos específicos correspondentes (veja, por exemplo, a Figura 2A-2C). Similarmente, β-Klotho humano nativo pareado com FGFRlc, FGFR2c, FGFR3c ou FGFR4 quimérico humano/de camundongo, em um FGFRlc de exemplo, em que regiões ou seqüências selecionadas no FGFRlc humano são sistematicamente substituídas pelos resíduos de camundongos específicos correspondentes (veja, por exemplo, os alinhamentos das Figuras 1A-1B). As seqüências cruciais envolvidas na ligação e/ou atividade das proteínas de ligação de antígeno podem ser derivadas por meio do ensaio de ligação ou medidas de atividade descritos nos Exemplos prévios 4, 5, 6 e 7 com base nos receptores de FGF21 quiméricos.
Exemplo 11.1
Construção de quimeras específicas
Quimeras de β-Klotho humano-de camundongos foram construídas usando a metodologia descrita no Exemplo 14. Uma representação esquemática das quimeras construídas é apresentada na Figura 29; resumidamente, as quimeras geradas eram compostas (do terminal N para o C) por uma fusão de uma seqüência de β-Klotho humano fundida a uma seqüência de β-Klotho murídeo fundida a uma seqüência de βKlotho humano. β-Klotho humano (ID. DE SEQ. N° : 8) foi usado como um arcabouço no qual regiões de β-Klotho murídeo (seqüência de comprimento total mostrada no ID. DE SEQ. N°: 468) foram inseridas. As regiões de β-Klotho murídeo que foram inseridas foram as seguintes:
Resíduos murídeos 82P-520P
255
PKNFSWGVGTGAFQVEGSWKTDGRGPSIWDRYVYSHLRGVNGTDRSTDSYIFLEKDLL ALDFLGVSFYQFSrSWPRLFPNGTVAAVNAQGLRYYRALLDSLVLRNlEPTVTLYHWDLP LTLQEEYGGWKNATMlDLFNDYATYCFQTFGDRVKYWnHNPYLVAWHGFGTGMHA PGEKGNLTAVYTVGHNLIKAHSKVWHNYDKNFRPHQKGWLSITLGSHWIEPNRTDNM EDVINCQHSMSSVLGWFANP1HGDGDYPEFMKTGAMIPEFSEAEKEEVRGTADFFAFSF GPNNFRPSNTVVKMGQNVSLNLRQVLNWÍKLEYDDPQ1L1SENGWFTDSYIKTEDTTAIY MMKNFLNQVLQAIKFDEIRVFGYTAWTLLDGFEWQDAYTTRRGLFYVDFNSEQKERKP KSSAHYYKQIIQDNGFPLKESTPDMKGRFP (ID. DE SEQ. N°: 470)
Resíduos murideos 506F-1043S
FPLKESTPDMKGRFPCDFSWGVTESVLKPEFTVSSPQFTDPHLYVWNVTGFJRLLYRVEG VRLKTRPSQCTDYVSIKKRVEMLAKMKVTHYQFALDWTSILPTGNLSKVNRQVLRYYR CWSEGLKLGVFPMVTLYHPTHSHLGLPLPLLSSGGWLNMNTAKAFQDYAELCFRELG
DLVKLWITINEPNRLSDMYNRTSNDTYRAAHNLM1AHAQVWHLYDRQYRPVQHGAVS LSLHCDWAEPANPFVDSHWKAAERFLQFE1AWFADPLFKTGDYPSVMKEY1ASKNQRG LSSSVLPRFTAKESRLVKGTVDFYALNHFTTRFVIHKQLNTNRSVADRDVQFLQDITRLS SPSRLAVTPWGVRKLLAWIRRNYRDRDIYÍTANGIDDLALEDDQIRKYYLEKYVQEALK
AYL1DKVKIKGYYAFKLTEEKSKPRFGFFTSDFRAKSSVQFYSKLISSSGLPAENRSPACG QPAEDTDCTICSFLVEKKPLIFFGCCF1STLAVLLSJTVFHHQKRRKLFQKARNLQNIPLKK GHSRVFS (ID. DE SEQ. N°: 471)
Resíduos murideos 1M-193L
MKTGCAAGSPGNEWIFFSSDERNTRSRKTMSNRALQRSAVLSAFVLLRAVTGFSGDGK AlWDKKQYVSPVNPSQLFLYDTFPKNFSWGVGrGAFQVEGSWKTDGRGPSIWDRYVYS HLRGVNGTDRSTDSYIFLEKDLLALDFLGVSFYQFSlSWPRLFPNGTVAAVNAQGLRYY RALLDSLVLRN1EPIVTL (ID. DE SEQ. N°: 472)
Resíduos murideos 82P-302S
PKNFSWGVGTGAFQVEGSWKTDGRGPSJWDRYVYSHLRGVNGTDRSTDSYIFLEKDLL ALDFLGVSFYQFSISWPRLFPNGTVAAVNAQGLRYYRALLDSLVLRNIEPIVTLYHWDLP LTLQEEYGG WKNATMIDLFN DYAT YCTQTFGDRVKY W1TIHNP Y LVAWHGFGTGMHA PGEKGNLTAVYTVGHNL1KAHSKVWHNYDKNFRPHQKGWLS1TEGS (ID. DE SEQ. N°: 473)
Resíduos murideos 194Y-416G
YHWDLPLTLQEEYGGWKNATMIDLFNDYATYCFQTFGDRVKYWIT1HNPYLVAWHGF GTGMHAPGEKGNLTAVYTVGHNLIKAHSKVWHNYDKNFRPHQKGWLSITLGSHWIEP NRTDNMEDVrNCQHSMSSVLGWFANPIHGDGDYPEFMKTGAMIPEFSEAEKEEVRGTA DFFAFSFGPNNFRPSNTVVKMGQNVSLNLRQVLNWIKLEYDDPQILISENG (ID. DE SEQ. N°: 474)
Resíduos murideos 302S-506F
256
S H W1EPN RTDNM ED VINCQHSMSS VLGWFANPIHGDGD YPEFMKTGAMIPEFSEAEKEE VRGTADFFAFSFGPNNFRPSNTVVKMGQNVSLNI.RQVLNWTKEEYDDPQlLlSENGWFr DSYIKTED'ITAIYMMKNFLNQVLQAIKFDEIRVFGY I’AW 1 LLDGFEWQDAY ΓΊ RRGLFY VDFNSEQKERKPKSSAHYYKQIIQDNGF (ID. DESEQ. N°: 475)
Resíduos murideos 416G-519P
GWFTDSYIKTEDTTAIYMMKNFLNQVLQAJKFDEIRVFGYTAWTLLDGFEWQDAYTTR RGLFYVDFNSEQKERKPKSSAHYYKQIIQDNGFPLKESTPDMKGRF (ID. DE SEQ. N°: 476)
PLKESTPDMK.GRFPCDFSWGVTESVLKPEFTVSSPQFTDPHLYVWNVTGNRLLYRVEGV RLKTRPSQCTDY VS1 KKRVEMLAKMKVrHYQFALD WTSILPTGNLSKVNRQ VLR YYRC VVSEGLKLG (ID. DE SEQ. N°: 477)
Resíduos murideos 520P-735A
PCDFSWGVTESVI.KPEFTVSSPQFTDPFILYVWNVTGNRI.LYRVEGVRI.KTRPSQCTDY VSTKKRVEMLAKMKVTHYQFALDWTSILPTGNLSKVNRQVLRYYRCVVSEGLK1.GVFP MVTLYHPTHSUI.GLPLPLLSSGGWLNMNTAKAFQDYAEJ.CFRELGDLVKLWITÍNF.PNR LSDMYNRTSNDTYRAAHNLMIAHAQVWHLYDRQYRPVQHGA (ID. DE SEQ. N°: 478)
Resíduos murideos 632G-849Q
GVFPMVrLYHPrHSFlLGLPLPLLSSGGWLNMNlAKAFQDYAELCFRELGDLVKLWrnN EPNRLSDMYNRTSNDTYRAAHNLMIAHAQVWHLYDRQYRPVQHGAVSLSLHCDWAE PANTFVDSHWKAAERFLQFEIAWFADPLFKTGDYPSVMKEYIASKNQRGLSSSVLPRFT AKESRLVKGTVDFYALNHFTTRFVIHKQLNTNRSVADRDVQFLQ (ID. DE SEQ. N°: 479)
Resíduos murideos 735A-963S
AVSI.SI.IICDWAEPANPFVDSHWKAAERFLQFEIAWFADPI.FKTGDYPSVMKEYIASKN QRGl.SSSVLPRFTAKESRLVKGTVDFYALNHFTTRFVÍHKQLNIKRSVADRDVQFLQDJ 1’ RLSSPSRLAVTPWGVRKLLAW1RRNYRDRD1YITANGIDDLALEDDQ1RKYYLEKYVQE ALKAYLIDKVKIKGYYAFKLTEEKSKPRFGFFTSDFRAKSSVQFYSKLJSSS (ID. DE SEQ. N°: 480)
Resíduos murideos 1M-81F
MKTGCAAGSPGNEWIFFSSDERNTRSRKTMSNRALQRSAVLSArVLLRAVTGFSGDGK AIWDKKQYVSPVNPSQLFLYDTF (ID. DE SEQ. N°: 481)
257
Resíduos murídeos 82P-193L
PKNFSWGVGTGAFQVEGSVVKTDGRGPSiWDRYVYSIlLRGVNGTDRSTDSYIFLEKDLL
ALDFLGVSFYQFSISWPRLFPNGTVAAVNAQGLRYYRALLDSLVLRNIEPIVTL (ID. DE SEQ. N°: 482)
As quimeras geradas usando as seqüências de β-Klotho murídeo compreendiam os seguintes componentes:
258
Resíduos do terminal C de βKlotho humano 523-1.044 194-1.044 303-1.044 419-1.044 509-1.044 522-1.044 635-1.044
Resíduos de β-Klotho de camundongo 82-520 506-1.043 1-193 82-302 194-416 302-506 416-519 507-632
Resíduos do terminal N de βKlotho humano 00 1-507 00 1 1-193 1-301 1-417 1-508
N° DO ID. DE SEQ. da construção
Identificador da construção huBeta_Klotho (1-81, 523-1.044) (muBetaKLOTHO 82-520) huBeta_Klotho (1-507) (muBetaKLOTHO S06F-1045S) huBeta_Klotho (194-1.044) (muBetaKLOTHO 1-L193) huBeta_Klotho (1-81, 303- 1.044) (muBetaKLOTHO 82P-302S) huBeta_Klotho (1-193, 419- 1.044) (muBetaKLOTHO Y194-416G) huBeta_Klotho (1-301, 509- 1.044) (muBetaKLOTHO S302-F506) huBeta_Klotho (1-417, 522- 1.044) (muBetaKLOTHO G416-F519) huBeta_Klotho (1-507, 635-
259
Resíduos do terminal C de βKlotho humano 738-1.044 852-1.044 967-1.044 82-1.044 194-1.044
Resíduos de β-Klotho de camundongo 520-735 632-849 735-963 CO 1 82-193
Resíduos do terminal N de βKlotho humano 1-521 1-633 1-736 00 1
N° DO ID. DE SEQ. da construção
Identificador da construção 1.044) (muBeta KLOTHO F06-G632) huBeta_Klotho (1-521, 738- 1.044) (muBeta KLOTHO 520P-735A) huBeta_Klotho (1-633, 852- 1.044) (muBeta KLOTHO 632G-849Q) huBeta_Klotho (1-736, 967- 1.044) (muBeta KLOTHO 735A-963S) huBeta_Klotho (82-1.044) (muBeta KLOTHO 1-81F) huBeta_Klotho (1-81,194- 1.044) (muBeta KLOTHO 82P-193L)
260
As quimeras geradas compreendiam as seguintes seqüências de aminoácidos:
(i) huBeta_Klotho (1-81, 523-1.044) (muBetaKLOTHO 82-
520)
MKPGCAAGSPGNEWIFFSTDElTTRYRNTMSNGGLQRSViLSALILLRAV TGFSGDGRAIWSKNPNFTPVNESQLFLYDTFPKNFSWGVGTGAFQVEGSW KTDGRGPSIWDRYVYSHLRGVNGTDRSTDSYIFLEKDLLALDFLGVSFYQ FSISWPRLFPNGTVAAVNAQGLRYYRALLDSLVLRNIEPIVTLYHWDLPL TLQEEYGGWKNATMIDLFNDYATYCFQTFGDRVKYWITIHNPYLVAWHGF GTGMHAPGEKGNLTAWTVGHNLIKAHSKVWHNYDKNFRPHQKGWLSrrL GSHWIEPNRTDNMEDVINCQHSMSSVLGWFANPIHGDGDYPEFMKTGAM1 PEFSEAEKEEVRGTADFFAFSFGPNNFRPSNTVVKMGQNVSLNLRQVLNW IKLEYDDPQILISENGWFTDSYIKTEDTTAIYMMKNFLNQVLQAIKFDET RVFGYTAWTLLDGFEWQDAYTTRRGLFYVDFNSEQKERKPKSSAHYYKQI rQDNGFPLKESTPDMKGRFPCDFSWGVTESVLKPESVASSPQFSDPHLYV WNATGNRLLHRVEGVRLKTRPAQCTDFVNIKKQLEMLARMKVTHYRFALD WASVLPTGNLSAVNRQALRYYRCVVSEGLKLGISAMVTLYYPTHAHLGLP EPLLHADGWLNPSTAEAFQAYAGLCFQELGDLVKLWlTINEPNRLSDiYN RSGNDTYGAAHNLLVAHALAWRLYDQQFRPSQRGAVSLSLHADWAEPANP YADSHWRAAERFLQFEJAWFAEPLFKTGDYPAAMREYIASKHRRGLSSSA LPRLTEAERRLLKGTVDFCALNHFTTRFVMHEQLAGSRYDSDRDIQFLQD ITRLSSPI’RLAVIPWGVRKLLRWVRRNYGDMDIYITASGIDDQALEDDRL RKYYLGKYLQEVLKAYLIDKVRIKGYYAFKI.AEEKSKPRFGFFTSDFKAK SSlQFYNKVlSSRGFPFENSSSRCSQTQENTECrVCLFLVQKKPLIFLGC CFFSTLVLLLSIAJFQRQKRRKFWKAKNLQHIPLKKGKRWS (ID. DE SEQ. N°: 455) (ii) huBeta_Klotho (1-507) (muBetaKLOTHO S06F-1.045S)
MKPGCAAGSPGNEWIFFSTDEITTRYRNTMSNGGLQRSVILSALILLRAV
TGFSGDGRAIWSKNPNFTPVNESQLFLYDTFPKNFFWGIGTGALQVEGSW
KKDGKGPSIWDHFIHTHLKNVSSTNGSSDSYIFLEKDLSALDFIGVSFYQ FSlSWPRLFPDGr/TVANAKGLQYYSTLLDALVLRNIEPTVTLYHWDLPL ALQEKYGGWKNDTIIDIFNDY ATYCFQMFGDRVKY WIT1HN PY L V A WHGY GTGMHAPGEKGNLAAVYTVGHNLIKAHSKVWHNYNTHFRPHQKGWLSrTL GSFIWIEPNRSENTMDIFKCQQSMVSVLGWFANPIHGDGDYPEGMRKKLFS VI.PIFSEAEKHEMRGTADFFAFSFGPNNFKPLNTMAKMGQNVSLNLREAL NW1KLEYNNPRILIAENGWFTDSRVKTEDTTATYMMKNFLSQVLQAIRLD EiRVFGYTAWSLLDGFEWQDAYTIRRGLFYVDFNSKQKERKPKSSAHYYK
QllRENGFPLKESTPDMKGRFPCDFSWGVTESVLKPEFTVSSPQFTDPHL YVWNVTGNRLLYRVEGVRLKTRPSQCTDYVSIKKRVEMLAKMKVTHYQFA LDWTSILPTGNLSKVNRQVLRYYRCVVSEGLKLGVFPMVTLYHPTFISHLG .ΕΡΕΡΕΕ880αψΕΝΜ'ΝΤΑΚΑ.Ρ9ΟΥΑΕΕΕΕΚΕΕ00ΕνΚΕ'ΨΙΤΙΝΕΡΝΚΕ8ΟΜ YNRTSNDTYRAAFrNLMIAHAQVWHLYDRQYRPVQHGAVSLSLHCDWAEPA
261
NPFVDSHWKAAERFLQFEIAWFADPLFKTGDYPSVMKEYIASKNQRGLSS SVLPRFTAKESRLVKGTVDFYALNHFTrRFVIHKQLNTNRSVADRDVQFL QDITRLSSPSRLAVTPWGVRKLLAWIRRNYRDRDIYITANGJDDLALEDD QÍRKYYLEKYVQEALKAYL1DKVKIKGYYAFKLTEEKSKPRFGFFTSDFR AKSSVQFYSKLISSSGLPAENRSPAGGQPAEDTDCTICSFLVEKXPLIFF GCCF1STLAVLLS1TVFHHQKRRKFQKARNLQN1PLKKGHSRVFS (ID. DE SEQ. N°: 456) (iii) huBeta_Klotho (194-1.044) (muBetaKLOTHOl-L193) MKTGCAAGSPGNEWIFFSSDERNTRSRKTMSNRALQRSAVLSAFVLLRAV TGFSGDGKAIWDKKQYVSPVNPSQLFLYDTFPKNFSWGVGTGAFQVEGSW KTDGRGPSIWDRYVYSHLRGVNGTDRSTDSY1FLEKDLLALDFLGVSFYQ FS1SWPRLFPNGTVAAVNAQGLRYYRALLDSLVLRN1EPIVTLYHWDLPL ALQEKYGGWKNDTIIDIFNDYATYCFQMFGDRVKYWmHNPYLVAWHGY GTGMHAPGEKGNLAAWTVGHNLIKAHSKVWHNYNTHFRPHQKGWLSITL GSHWIEPNRSENTMD1FKCQQSMVSVLGWFANP1HGDGDYPEGMRKKLFS VLPIFSEAEKHEMRGTADFFAFSFGPNNFKPLNTMAKMGQNVSLNLREAL NWIKLEYNNPRILIAENGWFTDSRVKTEDTTAIYMMKNFLSQVLQAIRLD E1RVFGYTAWSLLDGFEWQDAYTIRRGLFYVDFNSKQKERKPKSSAHYYK Q11RENGFSLKESTPDVQGQFPCDFSWGVTESVLKPESVASSPQFSDPHL YVWNATGNRXLHRVEGVRLKTRPAQCTDFVNIKKQLEMLARMKVTHYRFA LD WAS VLFTGNLSAVN RQALRY YRCVVSEGLKLGISAMVTLYYPTHAHLG LPEPLLHADGWLNPSTAEAFQAYAGLCFQELGDLVKLWITINEPNRLSDI YNRSGNDTYGAAHNLLVAHALAWRLYDQQFRPSQRGAVSLSLHADWAEPA NPYADSHWRAAERFLQFEIAWFAEPLFKTGDYPAAMREYIASKHRRGLSS SALPRLTEAERRLLKGTVDFCALNHFrj’RFVMHEQLAGSRYDSDRDlQFL QDFFRLSSPTRLA VIP WGVRKLLR WVRRN Y GDMD1Y1TASGÍDDQAL EDD RLRKYYLGKYLQEVLKAYL1DKVR1KGYYAFKLAEEKSKPRFGFFTSDFK AKSSrQFYNKVlSSRGFPFENSSSRCSQTQENTECTVCLFLVQKKPLIFL GCCFFSTLVLLLSIAIFQRQKRRKFWAKNLQHIPLKKGKRVVS (ID. DE SEQ. N°: 457) (iv) huBeta_Klotho (1-81, 303-1.044) (muBetaKLOTHO
82P-302S)
MKPGCAAGSPGNFAVIFFSTDEITTRYRNTMSNOGLQRSVILSAI.ILLRAV TGFSGDGRAIWSKNPNFTPVNESQLFLYDTFPKNFSWGVGTGAFQVEGSW KTDGRGPSJ WDR Y VYSHLRGVNGTDRSTDSYJFLEKDLLALDFLGVSFYQ FSISWPRLFPNGTVAAVNAQGLRYYRALLDSLVLRNIEPIVTLYHWDLPL TLQEEYGGWKNATMIDLFNDYATYCFQTFGDRVKYWlTfflNPYLVAWHGF GTGMHAPGEKGNLTAVYTVGHNLIKAHSKVWHNYDKNFRPHQKGWLSITL GSHWIEPNRSENTMDIFKCQQSMVSVLGWFANPIHGDGDYPEGMRKKLFS VLPIFSEAEKHEMRGTADFFAFSFGPNNFKPLNTMAKMGQNVSLNLREAL NWIKLEYNNPRILIAENGWFTDSRVKTEDTTAIYMMKNFLSQVLQAIRLD EIRVFGYTAWSLLDGFEWQDAYTIRRGLFYVDFNSKQKERKPKSSAHYYK qiirengfslkestpdvqgqfpcdfswgvtesvlkpesvasspqfsdphl
262
YVWNATGNRLLHRVEGVRLKTRPAQCTDFVNIKKQLEMLARMKVTHYRFA LDWASVLPTGNLSAVNRQALRYYRCVVSEGLKLGISAMVTLYYPTHAHLG LPEPLLHADGWLNPSTAEAFQAYAGLCFQELGDLVKL\MT[NEPNRLSDI YNRSGNDTYGAAHNLLVAHALAWLYDQQFRPSQRGAVSLSLHADWAEPA NPYADSHWRAAERFLQFEIAWFAEPLFKTGDYPAAMREYIASKHRRGLSS SALPRLTEAERRLLKGTVDFCALNHFTTRFVMHEQLAGSRYDSDRD1QFL QDITRLSSPTRLAVIPWGVRKLLRWVRRNYGDMDIYITASGIDDQALEDD RLRKYYLGKYLQEVLKAYLÍDKVRIKGYYAFKLAEEKSKPRFGFFTSDFK AKSSIQFYNKV1SSRGFPFENSSSRCSQTQENTECTVCLFEVQKKPLIFL GCCFFSTLVLLLSIAIFQRQKRRKFWKAKN LQH1PLKKGKRWS (ID. DE SEQ. N°: 458) (v) huBeta_Klotho (1-193, 419-1.044) (muBetaKLOTHO
Y194-416G)
MKPGCAAGSPGNEWIFFSTDEITTRYRNTMSNGGLQRSVILSAULLRAV TGFSGDGRAIWSKNPNFTPVNESQLFLYDTFPKNFFWGIGTGALQVEGSW KKDGKGPSlWDHFIIlTIlLKNVSSrNGSSDSYlFLEKDLSAEDFIGVSFYQ FSIS WPRLFPDGIVTV ANAKGLQYYSTLLDA L VLRNIE PIVTL Y H W D L P L TLQEEYGG.W^ATMIDLpNDYATYCFQTFGDRVKYWrnHNpYLVAWHGF GTGMHAPGEKFiNLTAVYTVGIINLIKAHSKVWHNYDKNFRPHQKGWLSlTL. GSHWIEPNRTDNMEDVINCQHSMSSVLGWFANPIHGDGDYPEFMKTGAMI PEFSEAEKEEVRGTADFFAFSFGPNNFRPSNTVVKMGQNVSLNLRQVLNW IKLEYDDPQlIJSENGWFTDSRVKTEDTTAIYMMKNFLSQVLQAIRLDEr RVFGYTAWSLLDGFEWQDAYTÍRRGLFYVDFNSKQKERKPKSSAHYYKQI TRENGFSLKESTPDVQGQFPCDFSWGVTESVLKPESVASSPQFSDPHLYV WNATGNRLLHRVEGVRLKTRPAQCTDFVNIKKQLEMLARMKVTHYRFALD WASVLPTGNLSAVNRQALRYYRCVVSEGLKLG1SAMVTLYYPTHAHLGLP EPLI-HADGWLNPSTAEAFQAYAGLCFQELGDLVKI.WITINEPNRLSDIYN rsgndtygaahnllvahalawrlydqqfrpsqrgavslslhadwaepanp YADSHWRAAERFLQFE1AWFAEPLFKTGDYPAAMREY1ASKHRRGLSSSA LPRLTEAERRLLKGTVDFCALNHFTTRFVMHEQLAGSRYDSDRDIQFLQD ITRLSSPTRLAVIPWGVRKLLRWVRRNYGDMDIYJTASGIDDQALEDDRL· RKYYLGKYLQEVLKAYLIDKVRIKGYYAFKLAEEKSKPRFGFFTSDFKAK SS1QFYNKV1SSRGFPFENSSSRCSQTQENTECTVCLFLVQKKPL1FLGC CFFSTLVLLLSIAIFQRQKRRKFWKAKNLQHTPLKKGKRVVS (ID. DE SEQ. N°: 459) (vi) huBeta_Klotho (1-301, 509-1.044) (muBetaKLOTHO
S302-F506)
MKPGCAAGSPGNEWIFFSTDEITTRYRNTMSNGGLQRSVILSALILLRAV TGFSGDGRA1WSKNPNFTPVNESQLFLYDTFPKNFFWGIGTGALQVEGSW KKDGKGPSIWDHFIHTHLKNVSSTNGSSDSY1FLEK.DLSALDFIGVSFYQ FS1SWPRLFPDGIV TVANAKGLQY YSTLLDALVLRNIEPIVTLYHWDLPL ALQEKYGGWKNDTIlDIFNDYATYCFQMFGDRVKYWmHNPYLVAWHGY
263
GTGMHAPGEKGNLAAVYTVGHNLIKAHSKVWHNYNTHFRPHQKGWLSITL GSHWIEPNRTDNMEDVINCQHSMSSVLGWFANPIHGDGDYPEFMKTGAMI PEFSEAEKEEVRGTADFFAFSFGPNNFRPSNTWKMGQNVSLNLRQVLNW IKLEYDDPQILISENGWFTDSYIKTEDTTAIYMMKNFLNQVLQAIKFDEl RVFGYTAWTLLDGFEWQDAYTTRRG LFY VDFNSEQKERKPKSSAHYYKQ1 IQDNGFSLKESTPDVQGQFPCDFSWGVTESVLKPESVASSPQFSDPHLYV WNATGNRLLHRVEGVRLK'I’RPAQCTDFVNIKKQLEMLARMKVTHYRFALD WAS VLPTGN LS A VN RQ ALRYYRCVVSEGLKLGIS A M VTLYYPTHAHLGLP EPLLIIADGWLNPSTAEAFQAYAGLCFQELGDLVKLW1TINEPNRLSDIYN RSGNDTYGAAHNLLVAHALAWRLYDQQFRPSQRGAVSLSLHADWAEPANP YADSHWRAAERFLQFE1AWFAEPLFKTGDYPAAMREY1ASKHRRGLSSSA LPRLTEA ERRLLKGTVDFCA LN HFTTRF VM H EQ LAGSR YDSDRDIQFLQD ITRLSSPTRLAVIPWGVRKLLRWVRRNYGDMDIYITASGIDDQALEDDRL RKYYLGKYLQEVLKAYLIDKVRIKGYYAFKLLAEEKSKPRFGFFTSDFKAK SSIQFYNKVISSRGFPFENSSSRCSQTQENTECTVCLFLVQKKPLIFLGC C'FFSTLAIJISIAIFQRQKRRKFWKAKNEQll IPI.KKGKRVVS (ID. DE SEQ. N°: 460) (vii) huBeta_Klotho (1-417, 522-1.044) (muBetaKLOTHO G416-F519)
MKPGCAAGSPGNEWIFFSTDEITTRYRNTMSNGGLQRSVILSALILLRAV TGFSGDGRAIWSKNPNFTPVNESQLFLYDTFPKNFFWGIGTGALQVEGSW KKDGKGPSIWDHFIHTHLKNVSSTNGSSDSYIFLEKDLSALDFIGVSFYQ FS1SWPRLFPDG1VTVANAKGLQYYSTLLDALVLRN1EPIVTLYHWDLPL ALQEK.YGGWKNDTnDIFNDYATYCFQMFGDRVKYWrriHNPYLVAWHGY GTGMHAPGEKGNLAAVYTVGHNLIKAHSKVWHNYNTHFRPHQKGWLSÍTL GSHW1EPNRSENTMD1FKCQQSMVSVLGWFANP1HGDGDYPEGMRKKLFS VLPIFSEAEKHEMRGTADFFAFSFGPNNFKPLNTMAKMGQNVSLNLREAL NWIKLEYNNPRILIAENGWFTDSYIKTEDTTAIYMMKNFLNQVLQAIKFD EIRVFGYTAWTLLDGFE WQDAYTTRRGLFY VDFN SEQKERKPKSS A HY YK QIIQDNGFPLKESTPDMKGRFPCDFSWGVTESVLKPESVASSPQFSDPHL YVWNATGNRLLHRVEGVRLKTRPAQCTDFVNIKKQLEMLARMKVTHYRFA LDWASVLPTGNLSAWRQALRYYRCWSEGLKLGISAMVTLYYPTHAHLG LPEPLLHADGWLNPSTAEAFQAYAGLCFQELGDLVKLWT1NEPNRLSDI YNRSGNDn'GAAHNLLVAHALAWRLYDQQFRPSQRGAVSLSLHADWAEPA NPYADSHWRAAERFLQFELAWFAEPLFKTGDYPAAMREYIASKHRRGLSS SALPRLTEAERRLLKGTVDFCALNHFTrRFVMHEQLAGSRYDSDRDIQFL QDΓΓRLSSPTRLAVlPWGVRKLL·RWVRRNYGDMDlYIΐASGIDDQALEDD RLRKYYLGKYLQEVLKAYLIDKVRIKGYYAFKLAEEKSKPRFGFFTSDFK AKSSIQFYNKVISSRGFPFENSSSRCSQTQENTECTVCLHWQKKPLIFL GCCFFSTLVLLLSIAIFQRQKRRKFWKAKNLQinPLKKGKRVVS (ID. DE SEQ. N°: 461) (viii) huBeta_Klotho (1-507, 635-1.044) (muBeta KLOTHO
F06-G632)
264
MKPGCAAGSPGNEWJFFSTDEmRYRNTMSNGGLQRSVJLSALTLLRAV TGFSGDGRAIWSKNPNFTPVNESQLFLYDTFPKNFFWGIGTGALQVEGSW KKDGKGPSIWDHFIHTHLKNVSSTNGSSDSYIFLEKDLSALDFIGVSFYQ FSISWPRLFPDGIVTVANAKGLQYYSTLLDALVLRNIEPJVTLYHWDLPL ALQEKYGGWKNDTODIFNDYATYCFQMFGDRVKYWmHNPYLVAWHGY GTGMHAPGEKGNLAAVYTVGHNL1KAHSKVWHNYNTHFRPHQKGWLSITL GSHWIEPNRSENTMD1FKCQQSMVSVLGWFANP1HGDGDYPEGMRKFLLFS VLPIFSEAEKIIEMRGTADFFAFSFGPNNFKPLNTMAKMGQNVSLNLREAl. NWIKLEWNPRILLAENGWFTDSRVKTEDTTAIYMMKNFLSQVLQAIRLD E1RVFGYTAWSLLDGFEWQDAYTIRRGLFYVDFNSKQKERKPKSSAHYYK QIIRENGFPI.KESTPDMKGRFPCDFSWGVTESVLKPEFTVSSPQFTDPIIL YVWNVTGNRI.IARVEGVRLKTRPSQCTDYVSIKKRVEMEAKMKVTHYQFA lOWTSILPTGNLSKVNRQVLRYYRCVVSEGLKLGlSAMVTLYYPTHAHLG LPEPLLHADGWLNPSTAEAFQAYAGLCFQELGDLVKLWlTfNEPNRLSDI YNRSGNDTYGAAHNLLVAFIALAWRI.YDQQFRPSQRGAVSLSLHADWAEP/X NPYADSHWRAAERFLQFEÍAWFAEPLFK.TGDYPAAMREY1ASKHRRGLSS SALPRLTEAERRLLKGTVDFCALNHFTTRFVMHEQLAGSRYDSDRDIQFL QD1TRLSSPTRLAV IP WGVRKLLLR WVRRN Y GDMD1YITASGIDDQ ALEDD RLRKYYLGkYLQEVLKAYLIDKVRlKGYYAFKLAEEKSKPRFGFFTSDFK AKSS1QFYNKVISSRGFPFENSSSRCSQTQENTECTVCLFLVQKKPL1FL GCCFFSTLVLLLSIAIFQRQKRRKFWKAKNLQHIPLKKGKRVVS (ID. DE SEQ. N°: 462) (ix) huBeta_Klotho (1-521, 738-1.044) (muBeta KLOTHO
520P-735A)
MKPGCAAGSPGNEWIFFSTDEnTRYRNTMSNGGLQRSVILSALTLLRAV TGFSGDGRAIWSKNPNFTPVNESQLFLYDTFPKNFFWGIGTGALQVEGSW KKDGKGPSIWDHFIHTHLKNVSSTNGSSDSYIFLEKDLSALDFIGVSFYQ FSISWPRLFPDGIVTVANAKGLQYYSTLLDALVLRNIEPIVTLYHWDLPL ALQEKYGGWKNDT1ID1FNDYATYCFQMFGDRVKYWITIHNPYLVAWHGY GTGMHAPGEKGNLAAVYTVGHNL1KAHSKVWHNYNTHFRPHQKGWLSITL GSHWlEPNRSEWMDiFKCQQSMVSVEGWFANPinGDGDYPEGMRKKLFS VLPIFSEAEKHEMRGTADFFAFSFGPNNFKPLNTMAKMGQNVSLNLREAL NWIKLEYNNPRILIAENG WFTDSRVKTEDTTAIYM M KN FLSQVLQAIRLD EIRVFGYTAWSIJ.DGFEWQDAYTIRRGLFYVDFNSKQKERKPKSSAHYYK QIIRENGFSLKESTPDVQGQFPCDFSWGVTESVLKPEFTVSSPQFTDPFIL YVWNVTGNRLLYRVEGVRLKTRPSQCTDYVSIKKRVEM1.AIGMKVTHYQFA IOWTSILPTGNESKVNRQVLRYYRCWSEGLKLGVFPMVTLYHPTHSHLG [,PEPI,[.SSGGW1.NMNTAKAFQDYAELCFRELGDI.VKLWITINEPNR1.SDM YNRTSNDTYRAAHNLMIAHAQVWHLYDRQYRPVQHGAVSLSLHADWAEPA NPYADSHWRAAERFLQFEIAWFAEPLFKTGDYPAAMREY1ASKHRRGLSS SALPRLTEAERRLLKGTVDFCALNHFrrRFVMHEQLAGSRYDSDRDlQFL QDrrRLSSPIRLAVIPWGVRKLLRWVRRNYGDMDIYITASGlDDQ ALEDD RLRKYYLGKYLQEVLKAYLlDKVRIKGYYAFKLAEEKSKPRFGFFrSDFK AkSSIQFYNKVISSRGFPFENSSSRCSQTQENTECTVCLFLVQKKPLIFL GCCFFSTLVLLLSIAIFQRQKRRKFWKAKNLQinPLKKGKRVVS
265 (ID. DE SEQ. N°: 463) (x) huBeta_Klotho (1-633, 852-1.044) (muBeta KLOTHO
632G-849Q)
MKPGCAAGSPGNEW1FFSTDEITTRYRNTMSNGGLQRSVILSALILLRAV TGFSGDGRAIWSKNPNFTPVNESQLFLYDTFPKNFFWGIGTGALQVEGSW KKDGKGPSIWDFIFIHTHLKNVSSTNGSSDSYII'LEKDL.SAI.DFIGVSFYQ FSl·SWPRLFPDGlVTVANAKGLQYYSTLLDALVLRNlEPlVTLYHWDLPL ALQEKYGGWKNDTIIDIFNDYATYCFQMFGDRVKYWITIHNPYLVAWHGY GTGMHAPGEKGNLAAVYTVGHNLIKAHSKVWHNYNTHFRPHQKGWLSITL GSHWIEPNRSENTMDIFKCQQSMVSVLGWFANP1HGDGDYPÊGMRKKLFS VLPIFSEAEKHEMRGTADFFAFSFGPNNFICPLNTMAKMGQNVSLNLREAL NWIKLEYNNPRILIAENGWFTDSRVKTEDTTA1YMMKNFLSQVLQAIRLD EIRVFGYTAWSLLDGFEWQDAYTIRRGLFYVDFNSKQKERKPKSSAHYYK QIIRENGFSLKESTPDVQGQFPCDFSWGVTESVLKPESVASSPQFSDPUL YVWNATGNRLLHRVEGVRLKTRPAQCTDFVNIKKQLEMLARMKVTHYRFA LDWASVLPTG.NLSAVNRQALRYYRCVVSEGLKLGVFPMVTLYHPTHS.HLG LPLELLSSGGWLNMNTAKAFQDYAELCFRELGDLVKLW1TINEPNRLSDM YNRTSNDTYRAAHNLMIAHAQVWHLYDRQYRPVQHGAVSLSLHCDWAEPA NPFVDSFIWKAAERFLQFEIAWFADPLFKTGDYPSVMKEYIASKNQRGLSS SVLPRFrAKESRLVKGTVDFYALNHFTl'RFVIHKQLNTNRSVADRDVQFL QD1TRLSSPTRLAVIPWGVRKLLRWVRRNYGDMD1YITASG1DDQALEDD RLRKYYLGKYLQEVLKAYLIDKVRJKGYYAFKLAEEKSKPRFGFFTSDFK AKSSIQFYNKVISSRGFPFENSSSRCSQTQENTECTVCLFLVQKKPLIFL GCCFFSTLVLLLSIAIFQRQKRRKFWKAKNLQHIPLKKGKRVVS (ID. DE SEQ. N°: 464) (xi) huBeta_Klotho (1-736, 967-1.044) (muBeta KLOTHO 735A-963S)
MKPGCAAGSPGNEWIFFSTDErn’RYRNTMSNGGLQRSVILSALILLRAV
TGFSGDGRAIWSKNPNFTPVNESQLFLYDTFPKNFFWGIGTGALQVEGSW KKDGKGPSIWDHFIHTHLKNVSSTNGSSDSYJFLEKDLSALDF1GVSFYQ FSISWPRLFPDGIVTVANAKGLQWSTLLDALVLRNfEPTVTLYHWDLPL ALQEKYGGWKNDniDIFNDYATYCFQMFGDRVKYWrnHNPYLVAWHGY GTGMHAPGEKGNLAAVYTVGHNLIKAHSKVWHNYNTHFRPHQKGWLS1TL GSHW1EPNRSENTMD1FKCQQSMVSVLGWFANP1HGDGDYPEGMRKKLFS VLPIFSEAEKHEMRGTADFFAFSFGPNNFKPLNTMAKMGQNTVSLNLREAL nwikleynnpriliaengwftdsrvktedttaiymmknflsqvlqairld E1RVFG ΥΤΛ WSI, I .DGFE WQDAYTIRRGLFYVDFN S KQKERKPKSS ΑΗΥ Y K QIIRENGFSLKESTPDVQGQFPCDFSWGVTESVLKPESVASSPQFSDPFTL yvwnatgnrllhrvegvrlktrpaqctdfvnikkqlemlarmkvthyrfa ldwasvlptgnlsavnrqalryyrcvvseglklgisamvtlyypthahlg lpepllhadgwlnpstaeafqayaglcfqelgdlvklwitinepnrlsdi ynrsgndtygaahnllvabalawrlydqqfrpsqrgavslslhcdwaepa npfvdshwkaaerflqfeiawfadplfktgdypsvmkeyiasknqrglss SVLPRFTAK£SRLVKGTVDFYALNFlFTrRFVliIKQLNTNRSVADRDVQFL
266
QDITRLSSPSRLA VTPWG VRKLLA W1RRNY RDRDIY1TANGIDDLA LE DD QIRKYYLEKYVQEALKAYL1DKVK1KGYYAFKLTEEKSKPRFGFFTSDFR AKSSVQFYSKLISSSGFPFENSSSRCSQTQENTECTVCLFLVQKKPLIFL GCCFFSTLVLLLSIATFQRQKRRKFWKAKNLQHIPLKKGKRVVS (ID. DE SEQ. N°: 465) (xii) huBeta_Klotho (82-1.044) (muBeta KLOTHO 1-81F)
MKTGCAAGSPGNEWIFFSSDERNTRSRKTMSNRALQRSAVLSAFVl.LRAV TGFSGDGKAfWDKKQYVSPVNPSQLFLYDTFPKNFFWGIGTGALQVEGSW KKDGKGPSJ WDH FIHTH L KN VSSTNGSSDSY1FLEKDLSALDFIG VSFYQ PSISWPRLFPDGIVTVANAKGLQYYSTLLDALVLRNJEPIVTLYHWDLPL ALQEKYGGWKNDTIIDIFNDYATYCFQMFGDRVKYWITIHNPYLVAWHGY GTGMHAPGEKGNLAAX^YTVGHNLIKAHSKVWHNYNTHFRPHQKGWLSITL GSHWLEPNRSENTMDIFKCQQSMVSVLGWFANP1HGDGDYPEGMRKKLFS VLPIFSEAEKÍ1EMRGTADFFAFSFGPNNFKPLNTMAKMGQNVSLNLREAL NWIKLEYWPRILIAENGWFTDSRVKTEDTTAFYMMKNFLSQVLQAIRLD EIRVFGYTAWSLLDGFEWQDAYTIRRGLFYVDFNSKQKERKPKSSAHYYK QIIRENGFSLKESTPDVQGQFPCDFSWGVTESVLKPESVASSPQFSDPHL YVWNATGNRLLHRVEGVRLKTRPAQCTDFVNJKKQLEMLARMKVTHYRFA LDWASVLPTGNLSAVNRQALRYYRCWSEGLKLGISAMVTLYYPTHAHLG LPEPLLHADGWLNPSTAEAFQAYAGLCFQELGDLVKLWITINEPNRLSDI YNRSGNDTYGAAHNLLVAHALAWRLYDQQFRPSQRGAVSLSLHADWAEPA NPYADSHWRAAERFLQFEIAWFAEPLFKTGDYPAAMREYIASKHRRGLSS SALPRLTEAERRLLKGTVDFCALNHFITRFVMHEQLAGSRYDSDRDIQFL QDITRLSSPTRLAVIPWGVRKLLRWVRRNYGDMDIYITASGIDDQALEDD RLRKYYLGKYLQEVLKAYLIDKVRJKGYYAFKLAEEKSKPRFGFFTSDFK AKSSIQFYNKVISSRGFPFENSSSRCSQTQENTECTVCLFLVQKKI’LIFL GCCFFSTLVLLLSlAIFQRQKRRKLFWkAKNLQHIPLKKGKRVVS (ID. DE SEQ. N°: 466) (xiii) huBeta_Klotho (1-81, 194-1.044) (muBeta KLOTHO 82P-193L)
MKPGCAAGSPGNEWIFFSTDEITTRYRNTMSNGGLQRSVILSALTLLRAY^ TGFSGDGRAIWSKNPNFTPVNESQLFLYDTFPKNFSWGVGTGAFQVEGSW KTDGRGPSIWDRYVYSHLRGVNGTDRSTDSYIFLEKDLLALDFLGVSFYQ FSISWPRLFPNGTVAAVNAQGLRYYRALLDSLVLRNIEPIVTLYHWDLPL ALQEKYGG WKNDT1IDIFNDYATYCFQ MFGDRVKY WITIH N PYLV A WHGY gtgmhapgekgnlaavytvghnlikahskvwhnynthfrphqkgwlsitl GSHW1EPNRSENTMD1FKCQQSMVSVLGWFANP1HGDGDYPEGMRKKLFS VLPIFSEAEKHEMRGTADFFAFSFGPNNFKPLNTMAKMGQNVSLNLREAL NW1KLEYNNPR1LIAENGWFTDSRVKTEDTTA1YMMKNFLSQVLQA1RLD EIRVFGYTAWSLÍ.OGFEWQDAYTJRRGLFYVDFNSKQKERKPKSSAHYYK QIIRENGFSLKESTPDVQGQFPCDFSWGVTESVLKPESVASSPQFSDPHL YVWNATGNRLLHRVEGVRLKTRPAQCTDFVNIKKQLEMLARMKVTHYRFA
267
LDWASVLPTGNLSAVNRQALRYYRCVVSEGLKL.GISAMVTLYYPTHAHLG LPEPLLHADGWLNPSTAEAFQAYAGLCFQELGDLVKLWITINEPNRLSDI YNRSGNDTYGAAHNLLV AH ALA WR LYDQQFRPSQRG A VS LSLHADWAEPA NPYADSHWRAAERFLQFEIAWFAEPLFKTGDYPAAMREYIASKBRRGLSS SALPRLTEAERRLLKGTVDFCALNHFTTRFVMHEQLAGSRYDSDRDIQFL QDITRLSSIGRLAVIIÃVG WKLL.RW VRRNYGDMDIYITASGIDDQALEDD RLRKYYLGKYLQEVLKAYLIDKVRIKGYYAFKLAEEKSKPRFGFFTSDFK AKSSIQFYNKVISSRGFPFENSSSRCSQTQENTECTVCLFLVQKKPLIFL GCCFFSTLVLLLSIAIFQRQKRRKFWKAKNLQHTPLKKGKRVVS (ID. DE SEQ. N°: 467)
Várias proteínas de ligação de antígeno aqui fornecidas, bem como FGF21 humano, foram testadas quanto à habilidade para ativar as quimeras em células L6. A Figura 30 correlaciona os resultados observados com cada molécula testada.
Esses dados indicam que, enquanto FGF21 humano foi capaz de ativar FGFRlc combinado com todas as quimeras de β-Klotho humano/de camundongo (o sinal +indica atividade no receptor) , as substituições de seqüências de camundongo em β-Klotho humano afetaram as atividades de 16H7, 37D3 e 39F7. Veja a Figura 30. Esses resultados sugerem que as seqüências de β-Klotho 1-81, 302-522 e 849-1.044 são importantes para as atividades de proteínas de ligação de antígeno agonistas e podem representar um epitopo importante para sua função.
EXEMPLO 12
ANÁLISE DE PROTEÇÃO DE PROTEASE
Regiões do receptor de FGF21 humano ligadas pelas proteínas de ligação de antígeno que se ligam ao receptor de FGF21 humano, por exemplo, FGFRlc, β-Klotho ou complexo de FGFRlc e β-Klotho, podem ser identificadas por fragmentação do receptor de FGF21 humano em peptídeos com proteases específicas, por exemplo, AspN, Lys-C,
268 quimotripsina ou tripsina. A seqüência dos peptideos do receptor de FGF21 humano resultante (ou seja, fragmentos peptídicos que tanto contêm dissulfeto quanto não contêm dissulfeto de porções de FGFRlc e β-Klotho) pode então ser determinada. Em um exemplo, formas solúveis de um receptor de FGF21 humano, por exemplo, um complexo que compreende o heterodímero de ECD-Fc de FGFRlc e ECD-Fc de β-Klotho aqui descrito, podem ser digeridas com AspN (que cliva após resíduos de ácido aspártico e alguns de ácido glutâmico na extremidade amino) por incubação de cerca de 100 pg de receptor de FGF21 solúvel a 1,0 mg/ml em 0,1 M de fosfato de sódio (pH 6,5) por 20 horas a 37°C com 2 pg de AspN.
Um perfil peptídico da digestão por AspN pode então ser gerado em cromatografia por HPLC, enquanto se espera que uma digestão de controle com uma quantidade similar de anticorpo seja essencialmente resistente à AspN endoprotease. Um ensaio de proteção de protease pode então ser realizado para determinar a digestão proteolítica do receptor de FGF21 humano na presença das proteínas de ligação de antígeno. O princípio geral desse ensaio é que a ligação de uma proteína de ligação de antígeno ao receptor de FGF21 pode resultar em proteção de certos sítios de divagem de protease específicos e essa informação pode ser usada para determinar a região ou porção do receptor de FGF21 onde a proteína de ligação de antígeno se liga.
Resumidamente, a digestão de peptídeo por ser submetida ao mapeamento do peptídeo por HPLC; os picos individuais são coletados, e os peptídeos são identificados e mapeados por análises de LC-MS por ionização de eletrospray on-line (ESI-LC-MS) e/ou por seqüenciamento do
269 terminal N. Podem ser realizadas análises por HPLC para esses estudos usando uma coluna C18 de fase reversa de orifício estreito (Agilent Technologies) para análise offline e utilização de uma coluna C18 capilar de fase reversa 5 (o grupo de separação) para LC-MS. 0 mapeamento de peptídeos por HPLC pode ser realizado com um gradiente linear de ácido trifluoracético 0,05% (fase móvel A) até acetonitrila 90% em ácido trifluoracético 0,05%. Podem ser desenvolvidas colunas em uma taxa de fluxo desejada para 10 HPLC de orifício estreito para análises de LC-MS off-line ou on-line, e para HPLC capilar para análises de LC-MS online .
Podem ser feitas análises de seqüência por LC-MS/MS on-line e por seqüenciamento de Edman on os picos de 15 peptídeo recuperados por HPLC. análises de ESI LC-MS online da digestão do peptídeo podem ser realizadas para determinar a massa e seqüência precisas dos peptídeos que são separados por HPLC. As identidades de peptídeos selecionados presentes nos picos de peptídeo da digestão de 20 protease podem, assim, ser determinadas.
EXEMPLO 13
ESTUDO EM MACACO CYNOMOLGUS
Uma construção que codifica a proteína de ligação de antígeno aqui designada 16H7 foi gerada usando a 25 metodologia revelada nos Exemplos 1-3. 16H7 foi expressa, purificada e caracterizada como descrito nos Exemplos 1-5 e foi estudada in vivo em macacos Cynomolgus obesos. 16H7 é um anticorpo IgGl totalmente humano e é descrita pelas seqüências fornecidas nas Tabelas 1-4, supra.
0 Exemplo 13.1
270
Design do estudo estudo foi realizado em macacos Cynomolgus obesos.
Os macacos tinham 8-19 anos de idade. Seus pesos corporais variaram de 7-14 kg e o BMI variou de 36-74 kg/m2. Os macacos foram aclimatados por 6 semanas antes da iniciação da administração de composto. Durante o período de aclimação, os macacos foram familiarizados com procedimentos relacionados ao estudo, incluindo contenção em cadeiras, injeção subcutânea (PBS, 0,1 ml/kg), engorda oral (água, 10 ml/kg) e retirada de sangue para amostras não-OGTT e OGTT. Após 4 semanas de treinamento, OGTT e parâmetros plasmáticos metabólicos basais foram medidos. Vinte macacos foram selecionados e randomizados em dois grupos de tratamento para obter níveis basais similares de peso corporal, perfis de glicose OGTT e glicemia e níveis de triglicerídeos.
estudo foi realizado de forma cega. Veículo (n = 10) , 16H7 (n = 10) . 0 composto foi dado em semanas alternadas (5 mg/kg) . Na semana em que animais não eram injetados com 16H7, eles recebiam, em vez disso, injeção de veículo. Após 2 injeções de 16H7, os animais foram monitorados durante mais 6 semanas para eliminação do composto e recuperação dos tratamentos. A ingesta de ração, o peso corporal, bioquímica clínica e OGTT foram monitorados ao longo do estudo. A ingesta de ração foi medida em cada refeição. 0 peso corporal foi medido semanalmente. Amostras de sangue foram coletadas em dias diferentes em estado em jejum ou prandial para medir os níveis de glicose, insulina e triglicerídeos. OGTTs foram feitos a cada duas semanas após o início do estudo. 0 dia
271 em que se inicia o tratamento é designado 0 e ο planejamento detalhado do estudo é mostrado na Figura 14.
Os resultados apresentados nesse Exemplo representam dados coletados ao longo dos 68 dias do estudo.
Exemplo 13.2
Efeito de 16H7 sobre a ingesta de ração
Os animais foram alimentados duas vezes ao dia, com cada animal recebendo 120 g de ração formulada estabelecida durante o período de aclimação. A ração restante era removida e pesada após cada refeição para calcular a ingesta de ração. Os períodos de alimentação eram das 8 horas da manhã até 8:30 horas da manhã (± 3 0 minutos) e depois de 4:30 horas da tarde até 5:00 horas da tarde (± 30 minutos). Frutas (150 g) foram fornecidas a cada animal às 11:30 horas da manhã até 12:30 horas da tarde (± 3 0 minutos) todos os dias.
Comparada com veículo, 16H7 reduziu a ingesta de ração nos macacos. O efeito diminuiu e a ingesta de ração retornou próxima aos níveis basais ou de controle após cerca de 21 dias de tratamento. 16H7 não teve um efeito significante sobre a ingesta de ração pela manhã (Figura 15) e reduziu apenas modestamente a ingesta de ração na refeição da tarde durante o tratamento (Figura 16) . Um aumento na ingesta de ração pela manhã foi observado após o 49° dia (Figura 15). Por todo o estudo (e até mesmo durante o período de aclimação), a ingestão de frutas pareceu menor no grupo de 16H7, comparado com o grupo de veículo. No geral, 16H7 mostrou um efeito significante sobre a inibição da ingesta de ração.
Exemplo 13.3
272
Efeito de 16H7 sobre o peso corporal
O peso corporal foi monitorado semanalmente ao longo do estudo. Ao longo dos tratamentos de 4 semanas, o peso corporal de animais tratados com veículo permaneceu constante, enquanto o peso corporal de animais tratados com 16H7 diminuiu progressivamente. 0 peso corporal não retornou ao nível de base ao final do período de eliminação de 6 semanas (Figura 17).
Exemplo 13.4
Efeito de 16H7 sobre o índice de massa corporal (BMI), circunferência abdominal (AC) e espessura da prega de pele (SFT)
BMI, AC e SFT foram monitorados semanalmente ao longo do estudo, tanto pré- quanto pós-administração de composto de teste quando o peso corporal era medido. BMI é definido como o peso corporal do indivíduo dividido pelo quadrado de sua altura. SFT é a espessura de uma camada dupla de pele e a gordura abaixo dela é medida com um compasso. BMI, SFT e AC são relativamente medições relativamente precisas, simples e baratas da composição corporal, particularmente indicativas de gordura subcutânea. Animais tratados com veículo mostraram BMI, SFT e AC relativamente estáveis ao longo do estudo. Animais tratados com 16H7 mostraram níveis diminuídos de BMI, AC e SFT ao longo o período do estudo de 4 semanas, sugerindo que o composto de 16H7 resultou em redução da massa de gordura. Os resultados são mostrados nas Figuras 18-20, respectivamente. Esses parâmetros medidos não retornaram aos valores basais ao final do período de eliminação de 6 semanas.
Exemplo 13.5
273
Efeito de 16H7 sobre o teste de tolerância à glicose oral (OGTT)
OGTTs foram efetuados antes e depois do início dos tratamentos. Antes das injeções de 16H7, os valores basais para os níveis de glicose e insulina foram medidos ao longo do OGTT (Figuras 21 e 22, respectivamente) e não foram estatisticamente significativamente diferentes entre os grupos de veículo e de 16H7. OGTTs pós-dose foram realizados a cada duas semanas durante o período de tratamento e após 3 semanas do período de eliminação. 16H7 aumentou ligeiramente a tolerância à glicose após 4 semanas de tratamento e 3 semanas de período de eliminação. O modelo animal usado não é glicose-intolerante, o que explica os efeitos modestos observados (Figura 21) . Os níveis de insulina estavam estatisticamente significativamente diminuídos em animais tratados com 16H7 (significância observada no tempo 0 durante o OGTT realizado após 2 semanas de tratamento, no tempo 0 e 15 minutos durante o OGTT realizado após 4 semanas de tratamento e no tempo 0 e 60 minutos durante o OGTT realizado após 2 semanas de tratamento) (Figura 22).
Exemplo 13.6
Efeito de 16H7 sobre a glicemia de jejum e prandial e sobre os níveis de insulina
O sangue foi coletado de animais em jejum de um dia para o outro ou em condições prandiais após a alimentação da manhã. Nas condições de jejum, a retirada de sangue foi realizada semanalmente 5 dias após cada injeção. Nas condições prandiais, a retirada de sangue foi realizada nos 2°, 11°, 16°, 25° e 46° dias após a primeira injeção. 16H7
274 não reduziu os níveis de glicemia de jejum ou prandiais (Figuras 23 e 25) . Nenhuma hipoglicemia foi observada em nenhum dos macacos tratados com 16H7. 16H7, no entanto, resultou em uma diminuição estatisticamente significante nos níveis plasmáticos de jejum e prandiais de insulina (Figuras 24 e 26).
Exemplo 13.7
Efeito de 16H7 sobre os níveis de triglicerídeos
Foram feitas medições das mesmas amostras coletadas para as medições de glicose e insulina. Os níveis de triglicerídeos foram significativamente reduzidos em animais tratados com 16H7 quando medidos em condições de jejum ou prandiais (Figuras 27 e 28).
Exemplo 13·8
Conclusões
Em um estudo realizado em macacos Cynomolgus machos obesos, animais tratados com 16H7 mostraram parâmetros metabólicos melhorados. 0 peso corporal foi reduzido e a composição corporal foi melhorada. A redução de curto prazo da ingesta de ração foi observada e o efeito diminuiu e a ingesta de ração recuperada aos níveis basais ou de controle com 21 dias no estudo. Os níveis de jejum insulina e de triglicerídeos também foram reduzidos por 16H7. Os níveis de insulina medidos durante OGTT também foram melhorados.
EXEMPLO 14
FORMAS VARIANTES DE PROTEÍNAS DE LIGAÇÃO DE ANTÍGENO 16H7 E 22H5
As proteínas de ligação de antígeno 16H7 e 22H5, que são aqui descritas nas Tabelas 1-4, foram mutadas para
275 transmitir propriedades diferentes à molécula, por exemplo, alterações na solubilidade, pl, carga global, imunogenicidade em humanos e em modelos animais, estabilidade etc. As mutações eram compostas por adições, deleções ou substituições na cadeia leve (designada LC , ID. DE SEQ. N° : 14) ou na cadeia pesada (designada HC , ID. DE SEQ. N° : 32) da molécula. As mutações pontuais únicas reveladas foram feitas individualmente ou duas ou mais mutações foram combinadas.
Exemplos de mutações e combinações de mutações que foram introduzidas nas seqüências da cadeia pesada e leve de 16H7 incluem as seguintes:
I83K (na cadeia pesada de 16H7) (ID. DE SEQ. N°: 396)
E16Q (na cadeia pesada de 16H7) + V24F (na cadeia pesada de 16H7) + I83T (na cadeia pesada de 16H7) + S100I (na cadeia pesada de 16H7) + T119L (na cadeia pesada de 16H7) (ID. DE SEQ. N° : 395) D109S (na cadeia pesada de 16H7) (ID. DE SEQ. N°: 401)
Deleção de Y107 (na cadeia pesada de 16H7) (ID. DE SEQ. N°: 400)
Inserção de um resíduo Y no lado do terminal N de Y107 (na cadeia pesada de 16H7) (ID. DE SEQ. N°: 405)
D88R + P89A + V90E (na cadeia pesada de 16H7) (ID. DE
SEQ. N°: 398)
D4 9Y (na cadeia leve de 16H7) (ID . DE SEQ. N° : 386)
D4 9A (na cadeia leve de 16H7) (ID . DE SEQ. N° : 387)
D91A (na cadeia leve de 16H7) (ID . DE SEQ. N° : 388)
D4 9A (na cadeia leve de 16H7) + D91A (na cadeia leve
de 16H7) (ID. DE SEQ. N° : 389)
Q16K (na cadeia leve de 16H7) (ID . DE SEQ. N° : 385)
276
Exemplos de mutações e combinações de mutações que foram introduzidas nas seqüências da cadeia pesada e leve de 22H5 incluem as seguintes:
N92Q (na cadeia leve de 22H5) (ID. DE SEQ. N°: 402)
S94A (na cadeia leve de 22H5) (ID. DE SEQ. N° : 403)
C109S (na cadeia pesada de 22H5) (ID. DE SEQ. N°: 404)
Resumidamente, as proteínas de ligação de antígeno geradas compreendiam os seguintes pares de cadeias pesadas e leves de 16H7:
(i) cadeia leve de 16H7 (ID. DE SEQ. N° : 14) pareada
com uma cadeia pesada de 16H7 que compreende I83K (ID. DE
SEQ. N° : 396) ;
(ii) cadeia leve de 16H7 (ID. DE SEQ. N°: 14) pareada
com uma cadeia pesada de 16ΗΊ i que compreende E16Q , V24F,
I83T, S100I, T119L (ID. DE SEQ . N° : : 3 95) ;
(iii) cadeia leve de 16H7 (ID. . DE SEQ. N°: : 14) pareada
com uma cadeia pesada de 16H7 que compreende D109S (ID. DE
SEQ. N° : 401) ;
(iv ) cadeia leve de 16H7 (ID. DE SEQ. N°: 14) pareada
com uma cadeia pesada de 16H7 que compreende a deleção de
Y107 (ID . DE SEQ. N°: 4 00) ;
(v) cadeia leve de 16H7 (ID. DE SEQ. N° : 14) pareada
com uma cadeia pesada de 16H7 que compreende a i inserção de
um resíduo Y no lado do terminal N de Y107 (ID. DE SEQ. N°: 405) ;
(vi) cadeia leve de 16H7 (ID. DE SEQ. N° : 14) pareada com uma cadeia pesada de 16H7 que compreende D88R, P89A, V90E (ID. DE SEQ. N°: 398);
(vii) cadeia pesada de 16H7 (ID. DE SEQ. N° : 32) pareada com uma cadeia leve de 16H7 que compreende D49Y
277 (ID. DE SEQ. N°: 386);
(viii) cadeia pesada de 16H7 (ID. DE SEQ. N° : 32) pareada com uma cadeia leve de 16H7 que compreende D4 9A (LC) (ID. DE SEQ. N°: 387);
(xi) cadeia pesada de 16H7 (ID. DE SEQ. N° : 32) pareada com uma cadeia leve de 16H7 que compreende D91A (ID. DE SEQ. N°: 388) ;
(ix) cadeia pesada de 16H7 (ID. DE SEQ. N°: 32) pareada com uma cadeia leve de 16H7 que compreende D4 9A, D91A (ID. DE SEQ. N°: 389);
(x) cadeia pesada de 16H7 (ID. DE SEQ. N°: 32) pareada com uma cadeia leve de 16H7 que compreende Q16K (LC) (ID. DE SEQ. N°: 3 85) ;
e os seguintes pares de seqüências da cadeia pesada e leve de 22H5:
(xi) cadeia pesada de 22H5 (ID. DE SEQ. N° : 31) pareada com uma cadeia leve de 22H5 que compreende N92Q (LC) (ID. DE SEQ. N°: 402);
(xii) cadeia pesada de 22H5 (ID. DE SEQ. N° : 31) pareada com uma cadeia leve de 22H5 que compreende S94A
(LC) (ID. DE SEQ. N°: 403);
(xiii) 22H5 cadeia leve (ID. DE SEQ. N° : 13) pareada
com uma cadeia pesada de 22H5 que compreende C109S (HC)
(ID. DE SEQ. N°: 4 04) ;
(xiv) 22H5 cadeia leve (ID. DE SEQ. N° : 13) pareada
com uma cadeia pesada de 22H5 que compreende uma inserção
de um resíduo de tirosina na posição 107 (ID. DE SEQ. N° : 405) .
As seqüências de aminoácidos para as variantes da cadeia leve geradas são mostradas na Tabela 6:
278
Tabela 6A - Seqüências de aminoácidos de variantes de 16H7 e 22H5
aa
H O
Q g LP k0
00 00
Q ot co co
H
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ω
279
Μ ο Q S Q Oi Η Μ ω 387 385
Seqüência de aminoácidos da cadeia variante TECS SYVLTQPPSVSVAPGQTARITCGGNNIGSESVHWY QQKPGQAPVLWYADSDRPSGIPERFSGSNSGNTA TLTISRVEAGDEADYYCQVWDGNSDHWFGGGTKL TVLGQPKANPTVTLFPPSSEELQANKATLVCLISD FYPGAVTVAWKADGSPVKAGVETTKPSKQSNNKYA ASSYLSLTPEQWKSHRSYSCQVTHEGSTVEKTVAP TECS SYVLTQPPSVSVAPGKTARITCGGNNIGSESVHWY QQKPGQAPVLVVYDDSDRPSGIPERFSGSNSGNTA TLT IS RVEAGDEAD YYCQVWDGNSDHWFGGGTKL TVLGQPKANPTVTLFPPSSEELQANKATLVCLISD FYPGAVTVAWKADGSPVKAGVETTKPSKQSNNKYA ASSYLSLTPEQWKSHRSYSCQVTHEGSTVEKTVAP
N° DO ID. DE SEQ. da seqüência pareada 32 32
Pareada com H3 H3
Variação σι Q O
Seqüência central Cadeia leve de 16H7 Cadeia leve de 16H7
280
κ Q K Q Ò Η W ω CD 00 388
Seqüência de aminoácidos da cadeia variante TECS SYVLTQPPSVSVAPGQTARITCGGNNIGSESVHWY QQKPGQAPVLWYYDSDRPSGIPERFSGSNSGNTA TLTISRVEAGDEADYYCQVWDGNSDHWFGGGTKL TVLGQPKANPTVTLFPPSSEELQANKATLVCLISD FYPGAVTVAWKADGSPVKAGVETTKPSKQSNNKYA ASSYLSLTPEQWKSHRSYSCQVTHEGSTVEKTVAP TECS SYVLTQPPSVSVAPGQTARITCGGNNIGSESVHWY QQKPGQAPVLWYDDSDRPSGIPERFSGSNSGNTA TLTISRVEAGDEADYYCQVWAGNSDHWFGGGTKL TVLGQ PKANPTVTLFPPS SEELQANKATLVCLISD FYPGAVTVAWKADGSPVKAGVETTKPSKQSNNKYA ASSYLSLTPEQWKSHRSYSCQVTHEGSTVEKTVAP
N° DO ID. DE SEQ. da seqüência pareada CN m 32
Pareada com m tn H3
Variação 05 + Q D91A
Seqüência central Cadeia leve de 16H7 Cadeia leve de 16H7
281
ID. DE SEQ. N°: LO 00 co 386
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N° DO ID. DE SEQ. da seqüência pareada CN CO 32
Pareada com CO K H3
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Seqüência central Cadeia leve de 16H7 Cadeia leve de 16H7
282
ID. DE SEQ. N°: i__________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________ σι 00 co 385
Seqüência de aminoácidos da cadeia variante TECS SYVLTQPPSVSVAPGQTARITCGGNNIGSESVHWY QQKPGQAPVLWYADSDRPSGIPERFSGSNSGNTA TLTISRVEAGDEADYYCQVWAGNSDHWFGGGTKL TVLGQPKANPTVTLFPPSSEELQANKATLVCLISD FYPGAVTVAWKADGS PVKAGVETTKPS KQSNNKYA ASSYLSLTPEQWKSHRSYSCQVTHEGSTVEKTVAP TECS SYVLTQPPSVSVAPGKTARITCGGNNIGSESVHWY QQKPGQAPVLWYDDSDRPSGIPERFSGSNSGNTA TLTISRVEAGDEADYYCQVWDGNSDHWFGGGTKL TVLGQPKANPTVTLFPPSSEELQANKATLVCLISD FYPGAVTVAWKADGS PVKAGVETTKPS KQSNNKYA ASSYLSLTPEQWKSHRSYSCQVTHEGSTVEKTVAP
N° DO ID. DE SEQ. da seqüência pareada CN CO 32
Pareada com ! co H3
Variação H σι Q + σ Q <0 O
Seqüência central Cadeia leve de 16H7 Cadeia leve de 16H7
283
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Seqüência de aminoácidos da cadeia variante TECS SYVLTQPPSVSVAPGQTARITCGGNNIGSESVHWY QQKPGQAPVLWYYDSDRPSGIPERFSGSNSGNTA TLTISRVEAGDEADYYCQVWDGNSDHWFGGGTKL TVLGQPKANPTVTLFPPSSEELQANKATLVCLISD FYPGAVTVAWKADGSPVKAGVETTKPSKQSNNKYA ASSYLSLTPEQWKSHRSYSCQVTHEGSTVEKTVAP TECS QVTLKESGPVLVKPTETLTLTCTFSGFSLNNARMG VSWIRQPPGKALEWLAHIFSNDEKSYSTSLKSRLT IS KDTS KS Q WLIMTNMDPVDTAT YYCARSWTGG YYYDGMDVWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPCSR STSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVH TFPAVLQSSGLYSLSSWTVPSSNFGTQTYTCNVD
N° DO ID. DE SEQ. da seqüência pareada CN ro 14
Pareada com co L3
Variação ΟΪ ’φ Q V24F
Seqüência central Cadeia leve de 16H7 Cadeia pesada de 16H7
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ID. DE SEQ. N°: LT) 00 CO 386
Seqüência de aminoácidos da cadeia variante QQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK SYVLTQPPSVSVAPGKTARITCGGNNIGSESVHWY QQKPGQAPVLWYDDSDRPSGIPERFSGSNSGNTA TLTIS RVEAGDEAD YYCQVWDGNSDHWFGGGTKL TVLGQPKANPTVTLFPPSSEELQANKATLVCLISD FYPGAVTVAWKADGSPVKAGVETTKPSKQSNNKYA ASSYLSLTPEQWKSHRSYSCQVTHEGSTVEKTVAP TECS SYVLTQPPSVSVAPGQTARITCGGNNIGSESVHWY QQKPGQAPVLWYYDSDRPSGIPERFSGSNSGNTA TLT ISRVEAGDEAD YYCQVWDGNSDHWFGGGTKL TVLGQPKANPTVTLFPPSSEELQANKATLVCLISD FYPGAVTVAWKADGSPVKAGVETTKPSKQSNNKYA ASSYLSLTPEQWKSHRSYSCQVTHEGSTVEKTVAP
N° DO ID. DE SEQ. da seqüência pareada σι co 32
Pareada com co K H3
Variação ex D4 9Y
Seqüência central Cadeia leve de 16H7 Cadeia leve de 16H7
297
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299
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Seqüência de aminoácidos da cadeia variante QVTLKESGPVLVKPTETLTLTCTVSGFSLNNARMG VSWIRQPPGKALEWLAHIFSNDEKSYSTSLKSRLT ISKDTSKSQWLIMTNMRAEDTATYYCARSWTGG YYYDGMDVWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPCSR STSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVH TFPAVLQSSGLYSLSSWTVPSSNFGTQTYTCNVD HKPSNTKVDKTVERKCCVECPPCPAPPVAGPSVFL FPPKPKDTLMISRTPEVTCWVDVSHEDPEVQFNW YVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTFRWSVLTWHQD WLNGKEYKCKVSNKGLPAPIEKTISKTKGQPREPQ VYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWE SNGQPENNYKTTPPMLDSDGSFFLYSKLTVDKSRW QQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK SYVLTQPPSVSVAPGKTARITCGGNNIGSESVHWY
N° DO ID. DE SEQ. da seqüência pareada 32
Pareada com m H3
Variação D88R + P89A + V90E LO O
Seqüência central Cadeia pesada de 16H7 Cadeia
300
ID. DE SEQ. N°: k£> 00 CO 399
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301
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304
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309
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311
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Φ CQ ο 1<0
U <0 -Η <0 <0 $4 4J β Φ Ο
312
ID. DE SEQ. N°:
Seqüência de aminoácidos da cadeia variante HTFPAVLQSSGLYSLSSWTVPSSNFGTQTYTCNV DHKPSNTKVDKTVERKCCVECPPCPAPPVAGPSVF LFPPKPKDTLMISRTPEVTCVWDVSHEDPEVQFN WYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTFRWSVLTWHQ DWLNGKEYKCKVSNKGLPAPIEKTISKTKGQPREP QVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEW ESNGQPENNYKTTPPMLDSDGSFFLYSKLTVDKSR WQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
N° DO ID. DE SEQ. da seqüência pareada
Pareada com
Variação
Seqüência central
313
Tabela 6B
Seq. central Variação Seqüência de ácidos nucléicos ID. DE SEQ. N°:
Cadeia leve de 16H7 Q16K TCCTATGTGCTGACTCAGCCACCCTCGGTGT CAGTGGCCCCAGGAAAGACGGCCAGGATT ACCTGTGGGGGAAACAACATTGGAAGTGA aagtgtgcactggtaccagcagaagccagg ccaggcccctgtgctggtcgtcfatgatga tagcgaccggccctcagggatccctgagcg attctctggctccaactctgggaacacggc caccctgaccatcagcagggtcgaagccgg ggatgaggccgactattactgtcaggtgtg ggatggtaatagtgaccatgtggtattcgg cggagggaccaagctgaccgtcctaggtca gcccaaggccaaccccactgtcactctgtt cccgccctcctctgaggagctccaagccaa caaggccacactagtgtgtctgatcagtga cttctacccgggagctgtgacagtggcctg gaaggcagatggcagccccgtcaaggcgg gagtggagaccaccaaaccctccaaacag agcaacaacaagtacgcggccagcagcta cctgagcctgacgcccgagcagtggaagtc ccacagaagctacagctgccaggtcacgca tgaagggagcaccgtggagaagacagtgg CCCCTACAGAATGTTCA 406
314
Seq. central Variação Seqüência de ácidos nucléicos ID. DE SEQ. N°:
Cadeia leve de 16H7 D4 9Y TCCTATGTGCTGACTCAGCCACCCTCGGTGT CAGTGGCCCCAGGACAGACGGCCAGGATTA CCTGTGGGGGAAACAACATTGGAAGTGAA agtgtgcactggtaccagcagaagccaggc CAGGCCCCTGTGCTGGTCGTCTATTATGAT agcgaccggccctcagggatccctgagcga TTCTCTGGCTCCAACTCTGGGAACACGGCC ACCCTGACCATCAGCAGGGTCGAAGCCGGG GATGAGGCCGACTATTACTGTCAGGTGTGG GATGGTAATAGTGACCATGTGGTATTCGOC GGAGGGACCAAGCTGACCGTCCTAGGTCAG CCCAAGGCCAACCCCACTGTCACTCTGTTC CCGCCCTCCTCTGAGGAGCTCCAAGCCAAC AAGGCCACACTAGTGTGTCTGATCAGTGAC TTCTACCCGGGAGCTGTGACAGTGGCCTGG AAGGCAGATGGCAGCCCCGTCAAGGCGGG AGTGGAGACCACCAAACCCTCCAAACAGA GCAACAACAAGTACGCGGCCAGCAGCTACC TGAGCCTGACGCCCGAGCAGTGGAAGTCCC ACAGAAGCTACAGCTGCCAGGTCACGCATG AAGGGAGCACCGTGGAGAAGACAGTGGCC CCTACAGAATGTTCA 407
315
Seq. central Variação Seqüência de ácidos nucléicos ID. DE SEQ. N°:
Cadeia leve de 16H7 D4 9A TCCTATGTGCTGACTCAGCCACCCTCGGTGT CAGTGGCCCCAGGAÇAGACGGCCAGGATTA CCTGTGGGGGAAACAACATTGGAAGTGAA AGTGTGCACTGGTACCAGCAGAAGCCAGGC CAGGCCCCTGTGCTGGTCGTCTATGCTGAT AGCGACCGGCCCTCAGGGATCCCTGAGCGA TTCTCTGGCTCCAACTCTGGGAACACGGCC ACCCTGACCATCAGCAGGGTCGAAGCCGGG GATGAGGCCGACTATTACTGTCAGGTGTGG GATGGTAATAGTGACCATGTGGTATTCGGC GGAGGGACCAAGCTGACCGTCCTAGGTCAG CCCAAGGCCAACCCCACTGTCACTCTGTTC CCGCCCTCCTCTGAGGAGCTCCAAGCCAAC AAGGCCACACTAGTGTGTCTGATCAGTGAC TTCTACCCGGGAGCTGTGACAGTGGCCTGG AAGGCAGATGGCAGCCCCGTCAAGGCGGG AGTGGAGACCACCAAACCCTCCAAACAGA GCAACAACAAGTACGCGGCCAGCAGCTACC TGAGCCTGACGCCCGAGCAGTGGAAGTCCC ACAGAAGCTACAGCTGCCAGGTCACGCATG AAGGGAGCACCGTGGAGAAGACAGTGGCC CCTACAGAATGTTCA 408
316
Seq. central Variação Seqüência de ácidos nuclélcos ID. DE SEQ. N°:
Cadeia leve de 16H7 D91A tcctatgtgctgactcagccaccgtcggtgt CAGTGGCCCCAGGACAGACGGCCAGGATTA CCTGTGGGGGAAACAACATTGGAAGTGAA AGTGTGCACTGGTACCAGCAGAAGCCAGGC CAGGCCCCTGTGCTGGTCGTCTATfíATGAT AGCGACCGGCCCTCAGGGATCCCrGAGCGA TTCTCTGGCTCCAACTCTGGGAACACGGCC ACCCTGACCATCAGCAGGGTCGAAGCCGGG GATGAGGCCGACTATTACTGTCAGGTGTGG GCTGGTAATAGTGACCATGTGGTATTCGGC GGAGGGACCAAGCTGACCGTCCTAGGTCAG CCCAAGGCCAACCCCACTGTCACTCTGTrC CCGCCCTCCTCTGAGGAGCTCCAAGC'CAAC AAGGCCACACTAGTGTGTCTGATCAGTGAC TTCTACCCGGGAGCTGTGACAGTGGCCTGG AAGGCAGATGGCAGCCCCGTCAAGGCGGG AGTGGAGACCACCAAACCCTCCAAACAGA GCAACAACAAGTACGCGGCCAGCAGCTACC TGAGÇCTGACGCCCGAGCAGTGGAAGTCCC ACAGAAGCTACAGCTGCCAGGTCACGCATG AAGGGAGCACCGTGGAGAAGACAGTGGCC CCTACAGAATGTTCA 409
317
Seq. central Variação Seqüência de ácidos nucléicos ID. DE SEQ. N°:
Cadeia leve de 16H7 D4 9A + D91A TCCTATGTGCTGACTCAGCCACCCTCGGTGT CAGTGGCCCCAGGACAGACGGCCAGGATTA CCTGTGGGGGAAACAACATFGGAAGTGAA AGTGTGCACTGGTACCAGCAGAAGCCAGGC CAGGCCCCTGTGCTGGTCGTCTATGCTGAT AGCGACCGGCCCTCAGGGATCCCTGAGCGA TTCTCTGGCTCC^CTCTGGGAACACGGCC ACCCTGACCATCAGCAGGGTCGAAGCCGGG GATGAGGCCGACTATTACTGTCAGGTGTGG GCTGGTAATAGTGACCATGTGGTATTCGGC GGAGGGACCAAGCTGACCGTCCTAGGTCAG CCCAAGGCCAACCCCACTGTCACTCTGTTC CCGCCCTCCTCTGAGGAGCTCCAAGCCAAC AAGGCCACACTAGTGTGTCTGATCAGTGAC TTCTACCCGGGAGCTGTGACAGTGGCCTGG AAGGCAGATGGCAGCCCCGTCAAGGCGGG AGTGGAGACCACCAAACCCTCCAAACAGA GCAACAACAAGTACGCGGCCAGCAGCTACC TGAGCCTGACGCCCGAGCAGTGGAAGTCCC ACAGAAGCTACAGGTGCCAGGTCACGCATG AAGGGAGCACCGTGGAGAAGAGAGTGGCC CCTACAGAATGTTCA 410
318
Seq. central Variação Seqüência de ácidos nucléicos ID. DE SEQ. N°:
Cadeia CAGGTCACCTTGAAGGAGTCTGGTCCTGTG CTGGTGAAACCCACAGAGACCCTCACGCTG ACCTGCACCrTC TCI GGGTTCTC ACTCAACA ATGCTAGAATGGGTGTGAGCTGGATCCGTC AGCCCCCAGGGAAGGCCCTGGAGTGGCTTG CACACATTTTTTCGAATGACGAAAAATCCT ACAGCACATCTCTGAAGAGCAGGCTCACCA TCTCCAAGGACACCTCCAAAAGCCAGGTGG TCCTAATTATGACCAACATGGACCCTGTGG ACACAGCCACATATTACTGTGCACGGTCAG TAGTAACTGGCGGCTACTACTACGACGGTA TGGACGTCTGGGGCCAAGGGACCAÇGGTCA CCGTCTCTAGTGCCTCCACCAAGGGCCCAT CGGTCTTCCCCCTGGCGCCCTGCTCCAGGA GCACCTCCGAGAGCACAGCGGCCCTGGGCT GCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGG TGACGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCTCTGA CCAGCGGCGTGCACACCTTCCCAGCTGTCC TACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCA GCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAACTTCG GCACCCAGACCTACACCTGCAACGTAGATC ACAAGCCGAGCAACACCAAGGTGGACAAG ACAGTTGAGCGCAAATGTTGTGTCGAGTGC CCACCGTGCCCAGCACCACCTGTGGCAGGA CCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCA AGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTG AGGTCACGTGCGTGGTGGTGGACGTGAGCC ACGAAGACCCCGAGGTCCAGTTCAACTGGT ACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCA AGACAAAGCCACGGGAGGAGCAGTTCAAC
pesada de 16H7 V24F AGCACGTTCCGTGTGGTCAGCGTCCTCACC GTTGTGCACCAGGACTGGCTGAACGGCAAG GAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGGC CTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCC AAAACCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACA GGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGAGGA GATGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTG CCTGGTCAAAGGCTTCTACCCCAGCGACAT CGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGC CGGAGAACAACTACAAGACCACACCTCCCA TGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTA CAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGT GGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCG TGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACA CGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTA AA 411
319
Seq. central Variação Seqüência de ácidos nucléicos ID. DE SEQ. N°:
Cadeia pesada de 16H7 I83T CAGGTCACCTTGAAGGAGTCTGGTCCTGTG ctggtgaaacccacagagaccctcacgctG ACCIOCACXGTGTCTGGGTrCTCACTCAAC aatgctagaatgggtgtgagctggatccgt CAGCCCCCAGGGAAGGCCCTGGAGTGGCTT gcacacattttttcgaatgacgaaaaatcc tacagcàcatctctgaagagcaggctcacc atctccaaggacacctccaaaagccaggtg gtcctaaccatgacca ac atggaccctgtg gacacagccacatattactgtgcacggtca gtagtaactggcggctactactacgacggt atggacgtctggggccaagggaccacggtc accgtctctagtgcctccaccaagggccca tcggtcttccccctggcgccctgctccagga gcacctccgagagcacagcggccctgggct gcctggtcaaggactacttccccgaaccgg tgacggtgtcgtggaactcaggcgctctga CCAGCGGCGTGCACACCTTCCCAGCTGTCC TACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCA GCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAACTTCG GCACCCAGACCTACACCTGCAACGTAGATC ACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAG ACAGTTGAGCGCAAATGTTGTGTCGAGTGC CCACCGTGCCCAGCACCACCTGTGGCAGGA CCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCA AGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTG AGGTCACGTGCGTGGTGGTGGACGTGAGCC ACGAAGACCCCGAGGTCCAGTTCAACTGGT ACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCA AGACAAAGCCACGGGAGGAGCAGTTCAAC AGCACGTTCCGTGTGGTCAGCGTCCTCACC GTTGTGCACCAGGACTGGCTGAACGGCAAG gagtacaagtgcaaggtctccaacaaaggc CTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCC aaaaccaaagggcagccccgagaaccaca ggtgtacaccctocccccatcccgggagga gatgaccaagaaccaggtcagcctgacctg cctggtcaaaggcttctaccccagcgacat cgccgtggagtgggagagcaatgggcagc CGGAGAACAACTACAAGACCACACCTCCCA TGCTGGACrCCGACGGCTCCTTCrrCCTCTA CAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGT ggcagcaggggaaçgtcttctcatgctccg TGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACA cgcagaagagcctctccctgtctccgggta AA.; 412
320
Seq. central Variação Seqüência de ácidos nucléicos ID. DE SEQ. N°:
Cadeia pesada de 16H7 V24F + I83T CAGGTCACCTTGAAGGAGTCTGGTCCTGTG CTGGTGAAACCCACAGAGACCCTCACGCTG ACCTGCACCTTÇTCTGGGTTCTCACTCAACA ATGCTAGAATGGGTGTGAGCTGGATCCGTC AGCCCCCAGGGAAGGCCCTGGAGTGGCTTG CACACATTTTTTCGAATGACGAAAAATCCT ACAGCACATCTCTGAAGAGCAGGCTCACCA tctccaaggacacctccaaaagccaggtgg TCCTAACCATGACCAACATGGACCCTGTGG ACACAGCCACATATTACTGTGCACGGTCAG TAGTAACTGGCGGCTACTACTACGACGGTA TGGACGTCTGGGGCCAAGGGACCACGGTCA CCGTCTCTAGTGCCTCCACCAAGGGCCCAT CGGTCTTCCCCCTGGCGCCCTGCTCCAGGA GCACCTCCGAGAGCACAGCGGCCCTGGGCT GCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGG TGACGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCTCTGA CCAGCGGCGTGCACACCTTCCCAGCTGTCC TACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCA GCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAACTTCG GCACCCAGACCTACACCTGCAACGTAGATC ACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAG ACAGTTGAGCGCAAATGTTGTGTCGAGTGC CCACCGTGCCCAGCACCACCTGTGGCAGGA CCGTCAGTCTTCCTCTTGCCGCCAAAACCCA AGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTG AGGTCACGTGCGTGGTGGTGGACGTGAGCC ACGAAGACCCCGAGGTCCAGTTCAACTGGT ACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCA AGACAAAGCCACGGGAGGAGCAGTTCAAC AGCACGTTCCGTGTGGTCAGCGTCCTCACC GTTGTGCACCAGGACTGGCTGAACGGCAAG GAGl'ACAAGTGCAAGGTCl'CCAACAAAGGC CTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCC AAAACCAAAGGGCAGCCCCGAGAAÇCACA GGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGAGGA GATGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTG CCTGGTCAAAGGCTTCTACCCCAGCGACAT CGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGC CGGAGAACAACTACAAGACCACACCTCCCA TGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTA CAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGT GGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCG TGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACA cgcagaagagcctctccctgtctccgggta AA 413
321
Seq. central Variação Seqüência de ácidos nucléicos ID. DE SEQ. N°:
Cadeia pesada de 16H7 E16Q + V24F + I83T CAGGTCACCTTGAAGGAGTCTGGTCCTGTG CTGGTGAAACCCACAÇAGACCCTCACGCTG ACCTGCACCTTCTCTGGGTTCTCACTCAACA ÀTGCTAGAATGGGTGTGAGCTGGATCCGTC AGCCCCCAGGGAAGGCCCTGGAGTGGCTTG CÀCáCAITTTTTCGAATGACGAAAAATCCT ACAGCAC'ATCTCTGAAGAGCAGGCTCACCA TCTCCAAGGACACCTCCAAAAGCCAGGTGG TCCTAACCATGACCAACATGGACCCTGTGG ACACAGCCACATAITACTGTGCACGGTÇAG TAGTAACTGGCGGCTACTACTACGACGGTA TGGACOTCTGGGGCCAAGGGACCAÇGGTCA CCGTCTCTAGTGCCTCCACCAAGGGCCCAT CGGTCTTCCCCCTGGCGCCCTGCTCCAGGA GCACCTCCGAGAGCACAGCGGCCCTGGGCT GCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGG TGACGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCTCTGA CCAGCGGCGTGCACACCTTCCCAGCTGTCC TACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCA GCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAACTTCG GCACCCAGACCTACACCTGCAACGTAGATC ACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAG acagttgagcgcaaatgttgtgtcgagtgc CCACCGTGCCCAGCACCACCTGTGGCAGGA CCGTCAGTCTTCCTCTrCCCCCCAAAACCCA AGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTG AGGTeACGTGCGTGGTGGTGGACGTGAGCC ACGAAGACCCCGAGGTCCAGTTCAACTGGT ACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCA AGACAAAGCCACGGGAGGAGCAGTTCAAC AGCAGGTTCCGTGTGGTCAGCGTCCTCACC GTTGTGCACCAGGACTGGCTGAACGGCAAG GAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGGC CTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCC AAAACCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACA GGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGAGGA GATGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTG CCTGGTCAAAGGCTTCTACCCCAGCGACAT CGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGC CGGAGAACAACTACAAGACCACACCTCCCA TGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTA CAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGT GGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCG TGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACA CGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTA AA 414
322
Seq. central Variação Seqüência de ácidos nucléicos ID. DE SEQ. N°:
Cadeia pesada de 16H7 E16Q + V24F + I83T + T119L CAGGTCACCTTGAAGGAGTCTGGTCCTGTG CTGGTGAAACCCACAÇAGACCCTCACGCTG ACCTGCACCTTCTCTGGGTTCTCACTCAACA ATGCTAGAATGGGTGTGAGCTGGATCCGTC AGCCCCCAGGGAAGGCCCTGGAGTGGCTTG C ACAC ATTTTTTCGAATG ACGA AAAATCCT ACAGCACATCTCTGAAGAGCAGGCTCACCA TCTCCAAGGACACCTCCAAAAGCCAGGTGG TCCTAACCATGACCAACATGGACCCTGTGG ACACAGCCACATATTACTGTGCACGGTCAG tagtaactggcggctactactacgacggta TGGACGTCTGGGGCCAAGGGACCÇTCGTCA ccgtctctagtgcctccaccaagggcccat cggtcttccccctggcgccctgctccagga gcacctccgagagcacagcggccctgggct gcctggtcaaggactacttccccgaaccgg tgacggtgtcgtggaactcaggcgctctga ccagcggcgtgcacaccttcccágctgtcc tacagtcctcaggactctactccctcagca gcgtggtgaccgtgccctccagcaacttcg gcacccagacctacacctgcaacgtagatc acaagcccagcaacaccaaggtggacaag acagttgagcgcaaatgttgtgtcgagtgc ccaccgtgcccagcaccacctgtggcagga ccgtcagtcttcctcttccccccaaaaccca aggacaccctcatgatctcccggacccctg aggtcacgtgcgtggtggtggacgtgagcc acgaagaccccgaggtccagttcaactggt acgtggacggcgtggaggtgcataatgcca agacaaagccacgggaggagcagttcaac agcacgttccgtgtggtcagcgtcctcacc gttgtgcagcaggactggctgaacggcaag GAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGGC CTCCCAGCGCCCATCGAGAAAACCATCTCC aaaaccaaagggcagccccgagaaccaca GGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGAGGA GATGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTG CCTGGTCAAAGGCTTCTACCCCAGCGACAT cgccgtggagtgggagagcaatgggcagc cggagaacaactacaagaccacacctccca TGCTGGACTCCGACGGCTCCnTCTTCCTCTA CAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGT GGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCG TGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACA CGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTA A A 415
323
Seq. central Variação Seqüência de ácidos nucléicos ID. DE SEQ. N°:
Cadeia pesada de 16H7 E16Q + V24F + I83T + S100I + T119L CAGGTCACCTTGAAGGAGTCTGGTCCTGTG CTGGTGAAACCCACACAGACCCTCACGCTG ACCTGCACCTTCTCTGGGTTCTCACTCAACA ATGCTAGAATGGGTGTGAGCTGGATCCGTC AGCCCCGAGGGAAGGCCCTGGAGTGGCTTG CACACATTTTTTCGAATGACGAAAAATCCT ACAGCACATCTCTGAAGAGCAGGCTCACCA TCTCCAAGGACACCTCCAAAAGCCAGGTGG TCCTAACCATGACCAACATGGACCCTGTGG ACACAGCCACATATTACTGTGCACGGATCG TAGTAACTGGCGGCTACTACTACGACGGTA TGGACGTCTGGGGCCAAGGGACCCTGGTCA CCGTCTCTAGTGCCTCCACCAAGGGCCCAT CGGTCTTCCCCCTGGCGCCCTGCTCCAGGA GCACCTCCGAGAGCACAGCGGCCCTGGGCT GCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGG TGACGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCTCTGA CCAGCGGCGTGCACACCTTCCCAGCTGTCC TACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCA GCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAACTTCG GCACCCAGACCTACACCTGCAACGTAGATC ACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAG ACAGTTGAGCGCAAATGTTGTGTCGAGTGC CCACCGTGCCCAGCACCACCTGTGGCAGGA CCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCA AGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTG AGGTCACGTGCGTGGTGGTGG ACGTGAGCC ACGAAGACCCCGAGGTCCAGTTCAACTGGT ACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCA AGACAAAGCCACGGGAGGAGCAGTTCAAC AGCACGTTCCGTGTGGTCAGCGTCCTCACC GTrGTGCAGCAGGACTGGCTGAACGGCAAG GAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGGC CTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCC AAAACCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACA GGTGTACACCCrGCCCCCATCCCGGGAGGA GATGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTG CCTGGTCAAAGGCTTCTACCCCAGCGACAT CGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGC CGGAGAACAACTACAAGACCACACCTCCCA TGCTGGACl'CCGACGGCTCCn’CTTCCTCTA CAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGT GGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCG TGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACA CGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTA AA 416
324
Seq. central Variação Seqüência de ácidos nucléicos ID. DE SEQ. N°:
Cadeia pesada de 16H7 I83K CAGGTCACCTTGAAGGAGTCTGGTCCTGTG CTGGTGAAACCCACAGAGACCCTCACGCTG ACCTGCACCGTGTCTGGGTTCTCACTCAAC AATGCTAGAATGGGTGTGAGCTGGATCCGT CAGCCCCCAGGGAAGGCCCTGGAGTGGCTT GCACACATTTTTTCGAATGACGAAAAATCC TACAGCACATCTCTGAAGAGCAGGCTCACC ATCTCCAAGGACACCTCCAAAAGCCAGGTG GTCCTAAAGATGACCAACATGGACCCTGTG GACACAGCCACATATTACTGTGCACGGTCA GTAGTAACTGGCGGCTACTACTACGACGGT ATGGACGTCTGGGGCCAAGGGACCACfiGTC ACCGTCTCTAGTGCCTCCACCAAGGGCCCA TCGGTCTTCCCCCTGGCGCCCTGCTCCAGGA GCACCTCCGAGAGCACAGCGGCCCTGGGCT GCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGG TGACGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCTCTGA CCAGCGGCGTGCACACCTTCCCAGCTGTCC TACAGTCCTCAGGACl’CTACTCCCTCAGCA GCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAACTTCG GCACCCAGACCTACACCTGCAACGTAGATC ACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAG ACAGTTGAGCGCAAATGTTGTGTCGAGTGC CCAÇCGTGCCCAGCACCACCTGTGGCAGGA CCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCA AGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTG AGGTCACGTGCGTGGTGGTGGACGTGAGCC ACGAAGACCCCGAGGTCCAGTTCAACTGGT ACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCA AGACAAAGCCACGGGAGGAGCAGTTCAAC AGCACGTTCCGTGTGGTCAGCGTCCTCACC GTTGTGCACCAGGACTGGCTGAACGGCAAG GAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGGC CTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCC AAAACCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACA GGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGAGGA GATGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTG CCTGGTCAAAGGCrrCTACCCCAGCGACAT CGÇCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGC CGGAGAACAACTACAAGACCACACCTCCCA TGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTA CAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGT GGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCG TGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACA CGCAGAAGAGCCrCTCCCTGTCTCCGGGTA AA 417
325
Seq. central Variação Seqüência de ácidos nucléicos ID. DE SEQ. N°:
Cadeia pesada de 16H7 S100I CAGGTCACCTTGAAGGAGTCTGGTCCTGTG CTGGTGAAACCCACAGAGÀCCCTCACGCTG ACCTGCACCGTGTCTGGGTTCTCACTCAAC AATGCTAGAATGGGTGTGAGCTGGATCCGT CAGCCCCCAGGGAAGGCCCTGGAGTGGCTT GCACACATTTTTTCGAATGACGAAAAATCC TACAGCACATCTCTGAAGAGCAGGCTCACC ATCTCCAAGGACACCrCCAAAAGCCAGGTG GTCCT AATT ATG ACC AAC ATGG ACCCTGTG GACACAGCCACATATTACTGTGCACGGATC GTAGTAACTGGCGGCTACTACTACGACGGT ATGGACGTCTGGGGCCAAGGGACCACGGTC ACCGTCTCTAGTGCCTCCACCAAGGGCCCA TCGGTCTTCCCCCTGGCGCCCTGCTCCAGGA GCACCTCCGAGAGCACAGCGGCCCTGGGCT GCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGG TGACGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCTCTGA CCAGCGGCGTGCACACCTTCCCAGCTGTCC TACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCA GCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAACTTCG GCACCCAGACCTACACCTGCAACGTAGATC ACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAG ACAGTTGAGCGCAAATGTTGTGTCGAGTGC CCACCGTGCCCAGCACCACCTGTGGCAGGA CCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCA AGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTG AGGTCACGTGCGTGGTGGTGGACGTGAGCC ACGAAGACCCCGAGGTCCAGTTCAACTGGT ACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCA AGACAAAGCCACGGGAGGAGCAGTTCAAC AGCACGTTCCGTGTGGTCAGCGTCCTCACC GTTGTGCACCAGGACTGGCTGAACGGCAAG GAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGGC CTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCC AAAACCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACA GGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGAGGA GATGACCAAGAACCAGGTCAGÇCTGACCTG cctggtcaaaggcttctaccccagcgacat CGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGC cggagaacaactacaagaccacacctccca tgctggactccgacggctccttcttcctcta cagcaagctcaccgtggacaagagcaggt ggçagcaggggaacgtcttctcatgctccg tgatgcatgaggctctgcacaaccactaca CGCAGAAGAGCCrCTCCCTGTCTCCGGGTA ΑΑ 418
326
Seq. central Variação Seqüência de ácidos nucléicos ID. DE SEQ. N°:
Cadeia pesada de 16H7 D88R + P8 9A + V90E CAGGTCACCTTGAAGGAGTCTGGTCCTGTG CTGGTGAAACCCACAGAGACCCTCACGCTG ACCTGCACCGTGTCTGGGTTCrCACTCAAC AATGCTAGAATGGGTGTGAGCTGGATCCGT CAGCCCCCAGGGAAGGCCCTGGAGTGGCTT GCACACATTTTTTCGAATGACGAAAAATCC TACAGCACATCTCTGAAGAGCAGGCTCACC ATCTCCAAGGACACCTCCAAAAGCCAGGTG GTCCTAATTATGACCAACATGAGAGCTGAG GACACAGCCACATATTACTGTGCACGGTCA GTAGTAACTGGCGGCTACTACTACGACGGT ATGGACGTCTGGGGCCAAGGGACCACGGTC ACCGTCTCTAGTGCCTCCACCAAGGGCCCA TCGGTCTTCCCCCTGGCGCCCTGCTCCAGGA GCACCTCCGAGAGCACAGCGGCCCTGGGCT GCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGG TGACGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCTCTGA CCAGCGGCGTGCACACCTTCCCAGCTGTCC TACAGTCCTCAGOACTCTACTCCCTCAGCA GCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAACTTCG GCACCCAGACCTACACCTGCAACGTAGATC ACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAG ACAGTTGAGCGCAAATGTTGTGTCGAGTGC CCACCGTGCCCAGCACCACCTGTGGCAGGA CCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCA AGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTG AGGTCACGTGCGTGGTGGTGGACGTGAGCC ACGAAGACCCCGAGGTCCAGTTCAACTGGT ACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGC'CA AGACAAAGCCACGGGAGGAGCAGTTCAAC AGCACGTTCCGTGTGGTCAGCGTCCTCACC GTTGTGCACCAGGACTGGCTGAACGGCAAG GAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGGC CTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCC AAAACCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACA GGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGAGGA GATGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTG CCTGGTCAAAGGCTTCTACCCCAGCGACAT CGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGC CGGAGAACAACTACAAGACCÀCACCTCCCA TGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTA CAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGT GGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCG TGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACA CGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTA AA 419
327
Seq. central Variação Seqüência de ácidos nucléicos ID. DE SEQ. N°:
Cadeia pesada de 16H7 D88R + P8 9A + V90E + S100I CAGGTCACCTTGAAGGAGTCTGGTCCTGTG CTGGTGAAACCCACAOAGACCCTCACGCTG ACCTGCACCGTGTCTGGGTTCTCACTCAAC AATGCTAGAATGGGTGTGAGCTGGATCCGT CAGCCCCCAGGGAAGGCCCTGGAGTGGCTT GCACACATTTTTTCGAATGACGAAAAATCC TACAGCACATCTCTGAAGAGCAGGCTCACC ATCTCCAAGGACACCTCCAAAAGCCAGGTG GTCCTAATTATGACCAACATGAGAGCTGAG GACACAGCCACATATTACTGTGCACGGATÇ GTAGTAACTGGCGGCTACTACTACGACGGT ATGGACGTCTGGGGCCAAGGGACCACGGTC ACCGTCTCTAGTGCCTCCACCAAGGGCCCA TCGGTCTTCCCCCTGGCGCCCTGCTCCAGGA GCACCTCCGAGAGCACAGCGGCCCTGGGCT GCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGG TGACGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCTCTGA CCAGCGGCGTGCACACCTTCCCAGCTGTCC TACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCA GCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAACTTCG GCACCCAGACCTACACCTGCAACGTAGATC ACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAG ACAGTTGAGCGCAAATGTTGTGTCGAGTGC CCAÇCGTGCCCAGCACCACCTGTGGCAGGA CCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCA AGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTG AGGTCACGTGCGTGGTGGTGGACGTGAGCC ACGAAGACCCCGAGGTCCAGTTCAACTGGT ACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCA agacaaagccacgggaggagcagttcaac AGCACGITCCGTGTGGTCAGCGTCCTCACC GTTGTGCACCAGGACTGGCTGAACGGCAAG GAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGGC CTCCCAGCCCCCATCGAGAA A ACC ATCTCC AAAÁCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACA GGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGAGGA GATGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTG CCTGGTCAAAGGCTTCTACCCCAGCGACAT CGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGC CGGAGAACAACTACAAGACCACACCTCCCA TGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTA CAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGT GGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCG TGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACA CGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTA AA 420
328
Seq. central Variação Seqüência de ácidos nucléicos ID. DE SEQ. N°:
Cadeia pesada de 16H7 Deleção de Y107 CAGGTCACCTTGAAGGAGTCTGGTCCTGTG CTGGTGAAACCCACAGAGACCCTCACGCTG ACCTGCACCGTGTCTGGGTTCTCACTCAAC aatgctagaatgggtgtgagctggatccgt CAGCCCCCAGGGAAGGCCCTGGAGTGGCTT GC AC AC A Him CG AATGACG A AAAATCC TACAGCACATCTCTGAAGAGCAGGCTCACC ATCTCCAAGGACACCTCCAAAAGCCAGGTG GTCCIAATTATGACCAACATGGACCCTGTG GAÇACAGCCACATATTACTGTGCACGGTÇA GTAGTAACTGGCGGCTACITACGACGGTATG GACGTCTGGGGCCAAGGGACCAÇGGTCACC GTCTCTAGTGCCTCCACCAAGGGCCCATCG GTCTTCCCCCTGGCGCCCTGCTCCAGGAGC ACCTCCGAGAGCACAGCGGCCCTGGGCTGC CTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTG ACGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCTCTGACC AGCGGCGTGCACACCTTCCCAGCTGTCCTA CAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGC GTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAACTTCGGC ACCCAGACCTACACCTGCAACGTAGATCAC AAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAC AGTTGAGCGCAAATGTTGTGTCGAGTGCCC ACCGTGCCCAGCACCACCTGTGGCAGGACC GTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAG GACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAG GTCACGTGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCAC GAAGACCCCGAGGTCCAGTTCAACTGGTAC GTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAG ACAAAGCCACGGGAGGAGCAGTTCAACAG CACGTTCCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTT GTGCACCAGGACTGGCTGAACGGCAAGGA GTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGGCCT CCCAGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAA AACCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGG TGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGAGGAGA TGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCC TGGTCAAAGGCTrCTACCCCAGCGACATCG CCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCG GAGAACAACTACAAGACCACACCTCCCATG CTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACA GCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGG CAGCAGGGGAACGTCTrCTCATGCTCCGTG ATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACG CAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTAAA 421
329
Seq. central Variação Seqüência de ácidos nucléicos ID. DE SEQ. N°:
Cadeia pesada de 16H7 D109S CAGGTCACCTTGAAGGAGTCTGGTCCTGTG CTGGTGAAACCCACAGAGACCCTCACGCTG ACCTGCACCGTGTCTGGGTTCTCACTCAAC AATGCTAGAATGGGTGTGAGCTGGATCCGT CAGCCCCCAGGGAAGGCCCTGGAGTGGCTT GCACACATTTTTTCGAATGACGAAAAATCC TACAGCACATCTCTGAAGAGCAGGCTCACC ATCTCCAAGGACACCTCCAAAAGCCAGGTG GTCCTAATTATGACCAACATGGACCCTGTG GACACAGCCACATATTACTGTGCACGGTCA GTAGTAACTGGCGGCTACTACTACAGCGGT ATGGACGTCTGGGGCCAAGGGACCAÇGGTC ACCGTCTCTAGTGCCTCCACCAAGGGCCCA TCGGTCTTCCCCCTGGCGCCCTGCTCCAGGA GCACCTCCGAGAGCACAGCGGCCCTGGGCT GCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGG TGACGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCTCTGA CCAGCGGCGTGCACACCTTCCCAGCTGTCC TACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCA GCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAACTTCG GCACCCAGACCTACACCTGCAACGTAGATC ACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAG ACAGTTGAGCGCAAATGTTGTGTCGAGTGC CCACCGTGCCCAGCACCACCTGTGGCAGGA CCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCA aggacaCcctcatgatctcccggacccctg aggtcaCgtgcgtggtggtggacgtgagcc acgaagaccccgaggtccagttcaactggt acgtggacggcgtggaggtgcataatgcca agacaaagccacgggaggagcagttcaac agcacgttccgtgtggtcagcgtcctcacc gttgtgcaccaggactggctgaacggcaag oagtacaagtgcaaggtctccaacaaaggc ctcccagcccccatcgagaaaaccatctcc aaaaccaaagggcagccccgagaaccaca ggtgtacaccctgcccccatcccgggagga gatgaccaagaaccaggtcagcctgacctg Cctggtcaaaggcttctaccccagcgacat cgccgtggagtgggagagcaatgggcagc cggagaacaactacaagaccacacctccca tgctggactccgacggctccttcttcctcta cagcaagctcaccgtggacaagagcaggt ggcagcaggggaacgtcttctcatgçtccg tgatgcatgaggctctgcacaaccactaca cgcagaagagcctctccctgtçtccgggta AA 422
330
Seq. central Variação Seqüência de ácidos nucléicos ID. DE SEQ. N°:
Cadeia leve de 22H5 N92Q TCCTATGTGCTGACTCAGCCACCCTCGGTGT CAGTGGCCCCAGGACAGACGGCCAGGATTA cctgtgggggaaacaacattggaagtcaaa GTGTGCACTGGTACCAGCAGAAGCCAGGCC AGGCCCCTGTCCTGGTCGTCTATGATGATA GCGACCGGCCCTCAGGGATCCCTGAGCGAT TCTCTGGTTCCAACTCTGGGAACACGGCCA CCCTGACCATCAGCAGGGTCGAAGCCGGGG ATGAGGCCGACTATTACTGTCAGGTGTGGG ATCAGACTAGTGATCATGTGGTATTCGGCG GGGGGACCAAGCTGACCGTCCTAGGTCAGC CCAAGGCCAACCCCACTGTCACTCTGTTCC CGCCCTCCTCTGAGGAGCTCCAAGCCAACA AGGCCACACTAGTGTGTCTGATCAGTGACT TCTACCCGGGAGCTGTGACAGTGGCCTGGA AGGCAGATGGCAGCCCCGTCAAGGCGGGA GTGGAGACCACCAAACCCTCCAAACAGAGC AACAACAAGTACGCGGCCAGCAGCTACCTG AGCCTGACGCCCGAGCAGTGGAAGTCCCAC AGAAGCTACAGCTGCCAGGTCACGCATGAA GGGAGCACCGTGGAGAAGACAGTGGCCCC TACAGAATGTTCA 423
Cadeia leve de 22H5 S94A TCCTATGTGCTGACTCAGCCACCCTCGGTGT CAGTGGCCCCAGGACAGACGGCCAGGATTA CCTGTGGGGGAAACAACATTGGAAGTCAAA GTGTGCACTGGTACCAGCAGAAGCCAGGCC AGGCCCCTGTCCTGGTCGTCTATGATGATA GCGACCGGCCCTCAGGGATCCCTGAGCGAT TCTCTGGTTCCAACTCTGGGAACACGGCCA CCCTGACCATCAGCAGGGTCGAAGCCGGGG ATGAGGCCGACTATTACTGTCAGGTGTGGG ATAATACTGCTGATCATGTGGTAITCGGCG GGGGGACCAAGCTGACCGTCCTAGGTCAGC CCAAGGCCAACCCCACTGTCACTCTGTTCC CGCCCTCCTCTGAGGAGCTCCAAGCCAACA AGGCCACACTAGTGTGTCTGATCAGTGACT TCTACCCGGGAGCTGTGACAGTGGCCTGGA AGGCAGATGGCAGCCCCGTCAAGGCGGGA GTGGAGACCACCAAACCCTCCAAACAGAGC AACAACAAGTACGCGGCCAGCAGCTACCTG AGCCTGACGCCCGAGCAGTGGAAGTCCCAC AGAAGCTACAGCTGCCAGGTCACGCATGAA GGGAGCACCGTGGAGAAGACAGTGGCCCC lACAGAATGriCA 424
331
Seq. central Variação Seqüência de ácidos nucléicos ID. DE SEQ. N°:
Cadeia pesada de 22H5 C109S CAGGTCACCTTGAAGGAGTCTGGTCCTGTG CTGGTGAAACCCACAGAGACCCTCACGCTG ACCTGCACCGTGTCTGGGTTCTCACTCAGC AATGCTAGAATGGGTGTGAGCTGGATCCGT CAGCCCCCAGGGAAGGCCCTGGAGTGGCTT GCACACATTTTTTCGAATGACGAAAAATCC TACAGCACATCTCTGAAGAGCAGGCTCACC ATCTCCAAGGACACCTCCAAAAGCCAGGTG GTCCTTACCATGACCAACATGGACCCTGTG GACACAGCCACATATTACTGTGCACGGATA TTATTAGTGGGAGCTTACTACTACAGCGGT ATGGACGTCTGGGGCCAAGGGACCACGGTC ACCGTCTCTAGTGCCTCCACCAAGGGCCCA TCGGTCTTCCCCCTGGCGCCCTGCTCCAGGA GCÁCCTCCGAGAGCACAGCGGCCCTGGGCT GCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGG TGACGGTGTCGTGGAÂCTCAGGCGCTCTGA CCAGCGGCGTGCACACCTTCCCAGCTGTCC TACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCA GCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAACTTCG GCACCCAGACCTACACCTGCAACGTAGATC ACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAG ACAGTTGAGCGCAAATGTTGTGTCGAGTGC CCACCGTGCCCAGCACCACCTGTGGCAGGA CCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCA AGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTG AGGTCACGTGCGTGGTGGTGGACGTGAGCC ACGAAGACCCCGAGGTCCAGTTCAACTGGT ACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCA AGACAAAGCÇACGGGAGGAGCAGTTCAAC AGCACGTTCCGTGTGGTCAGCGTCCTCACC GTTGTGCACCAGGACTGGCTGAACGGCAAG GAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGGC CTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCC AAAACCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACA GGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGAGGA GATGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTG CCTGGTCAAAGGCTTCTACCCCAGCGACAT CGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGC CGGAGAACAACTACAAGACCACACCTCCCA TGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTA CAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGT GGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCG TGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACA CGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTA AA. 425
332
Seq. central Variação Seqüência de ácidos nucléicos ID. DE SEQ. N°:
Cadeia pesada de 22H5 Inserção de Y107 CAGGTCACCTTGAAGGAGTCTGGTCCTGTG CTGGTGAAACCCACAGAGACCCTCACGCTG ACCTGCACCGTGTCTGGGTTCTCACTCAAC AATGCTAGAATGGGTGTGAGCTGGATCCGT CAGCCCCCAGGGAAGGCCCTGGAGTGGCTT GCACACATTTTTTCGAATGACGAAAAATCC TACAGCACATCTCTGAAGAGCAGGCTCACC ATCTCCAAGGACACCTCCAAAAGCCÀGGTG GTCCTAATTATGACCAACATGGACCCTGTG GACACAGCCACATATTACTGTGCACGGTÇA GTAOTAACTGGCGGCTACTATTACTACGAC GGTATGGACGTCTGGGGCCAAGGGACCACG GTCACCGTCTCTAGTGCCTCCACCAAGGGC CCATCGGTCTTCCCCCTGGCGCCCTGCTCCA GGAGCACCTCCGAGAGCACAGCGGCCCTGG GCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAAC CGGTGACGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCTC TGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCAGCTG TCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAG CAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAACTT CGGCACCCAGACCTACACCTGCAACGTAGA TCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACA AGACAGTTGAGCGCAAATGTTGTGTCGAGT GCCCACCGTGCCCAGCACCACCTGTGGCAG GACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACC CAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCC TGAGGTCACGTGCGTGGTGGTGGACGTGAG CCACGAAGACCCCGAGGTCCAGTTCAACTG GTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGC CAAGACAAAGCCACGGGAGGAGCAGTTCA ACAGCACGTTCCGTGTGGTCAGCGTCCTCA CCGTTGTGCACCAGGACTGGCTGAACGGCA AGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAA GGCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCATC TCCAAAACCAAAGGGCAGCCCCGAGAACC ACAGGTGTACAGCCTGCCCCCATCCCGGGA GGAGATGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGA CCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTACCCCAGCG ACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGG CAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACACCT CCCATGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCC TCTACAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCA GGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCT CCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACT ACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGG GTAAA 426
333
N° DO ID. DE SEQ. DA CDR3 00 00 00 00 00 00 429 430 148 148
CDR3 i Μ Q co a ·> Si I o QVWDGNSDH W ÍU Q co Si 5 CX QVWAGNSDH W a Q co § £ r CX SWTGGYYY DGMDV SWTGGYYY DGMDV
N° DO ID. DE SEQ. DA CDR2 co 427 428 kO 427 CO CO 133
CDR2 DDSDRPS YDSDRPS ADSDRPS DDSDRPS ADSDRPS HIFSNDEKSY STSLKS HIFSNDEKSY STSLKS
N° DO ID. DE SEQ. DA CDR1 kO 166 166 166 kü kO 122 122
CDR1 GGNNIGSES VH GGNNIGSES VH co W co i g 0 0 GGNNIGSES VH GGNNIGSES VH NARMGVS NARMGVS
Localização da mutação a Cu CDR2 CDR2 CDR3 CDR2 , CDR3 a & a Cm
Variação Q16K >H σ Q D49A D91A + . 3 3 rH σ> σ Q Q V24F I83T
Seqüência central Cadeia leve de 16H7 Cadeia leve de 16H7 Cadeia leve de 16H7 Cadeia leve de 16H7 Cadeia leve de 16H7 Cadeia pesada de 16H7 Cadeia pesada de 16H7
334
N° DO ID. DE SEQ. DA CDR3 148 148 148 431 148
CDR3 SWTGGYYY DGMDV SWTGGYYY DGMDV SWTGGYYY DGMDV IWTGGYYY DGMDV SWTGGYYY
N° DO ID. DE SEQ. DA CDR2 133 133 133 133 133
CDR2 HIFSNDEKSY STSLKS HIFSNDEKSY STSLKS HIFSNDEKSY STSLKS HIFSNDEKSY STSLKS HIFSNDEKSY
N° DO ID. DE SEQ. DA CDR1 122 122 122 122 122
CDR1 NARMGVS NARMGVS NARMGVS NARMGVS NARMGVS
Localização da mutação FW FW FW FW, CDR3 FW
Variação V24F + I83T E16Q + V24F + I83T E16Q + V24F + I83T + T119L + + + + Q O Q Η θ 2 co Fl H CN CO □ w > H ω H I83K
Seqüência central Cadeia pesada de 16H7 Cadeia pesada de 16H7 Cadeia pesada de 16H7 Cadeia pesada de 16H7 Cadeia pesada
335
N° DO ID. DE SEQ. DA CDR3 432 148 433 434 435 436
CDR3 DGMDV IWTGGYYY DGMDV SWTGGYYY DGMDV IWTGGYYY DGMDV SWTGGYYD GMDV SWTGGYYY SGMDV QVWDQTSDH
N° DO ID. DE SEQ. DA CDR2 133 133 133 CO 133 kD
CDR2 STSLKS HIFSNDEKSY STSLKS HIFSNDEKSY STSLKS HIFSNDEKSY STSLKS HIFSNDEKSY STSLKS HIFSNDEKSY STSLKS DDSDRPS
N° DO ID. DE SEQ. DA CDR1 122 122 122 122 122 <0
CDR1 NARMGVS NARMGVS NARMGVS NARMGVS NARMGVS GGNNIGSQS
Localização da mutação CDR3 3 X FW, CDR3 CDR3 CDR3 CDR3
Variação S100I D88R + P89A + V90E D88R + P89A + V90E + S100I Deleção de Y107 D109S N92Q
Seqüência central de 16H7 Cadeia pesada de 16H7 Cadeia pesada de 16H7 Cadeia pesada de 16H7 Cadeia pesada de 16H7 Cadeia pesada de 16H7 Cadeia leve
336
N° DO ID. DE SEQ. DA CDR3 437 438 439
CDR3 & QVWDNTADH W ILLVGAYYY SGMDV SWTGGYYY YDGMDV
N° DO ID. DE SEQ. DA CDR2 133 133
CDR2 DDSDRPS HIFSNDEKSY STSLKS HIFSNDEKSY STSLKS
N° DO ID. DE SEQ. DA CDR1 167 122 122
CDR1 _ ΗΛ GGNNIGSQS VH NARMGVS NARMGVS
Localização da mutação CDR3 CDR3 CDR3
Variação cn ra C109S Inserção de Y107
Seqüência central de 22H5 Cadeia leve de 22H5 Cadeia pesada de 22H5 Cadeia pesada de 16H7
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340
N° DO ID. DE SEQ. DA CDR3 221 446 221
CDR3 GACGGTATG GACGTC TCAGTAGTA ACTGGCGGC TACTACTAC GACGGTATG GACGTC ATCGTAGTA ACTGGCGGC TACTACTAC GACGGTATG GACGTC TCAGTAGTA ACTGGCGGC TACTACTAC
N° DO ID. DE SEQ. DA CDR2 206 206 206
CDR2 AGCACATCTC TGAAGAGC CACATTTTTT CGAATGACGA AAAATCCTAC AGCACATCTC TGAAGAGC H < O 0 Eh 0 < Eh CD Eh U Eh 0 0 Eh < 0 Eh < Eh 0 0 < 0 Eh Eh Eh U u 3 3 0 0 < 0 3 0 Eh 0 O 3 < CACATTTTTT CGAATGACGA AAAATCCTAC
N° DO ID. DE SEQ. DA CDR1 196 196 196
CDR1 AATGCTAGA ATGGGTGTG AGO AATGCTAGA ATGGGTGTG AGC AATGCTAGA ATGGGTGTG AGC
Localização da mutação FW FW, CR3 £
Variação E16Q + V24F + I83T + T119L + + + + ft O ft Eh 5 2 co 2 ft ft <M 00 2 Γ W > H ω I83K
Seqüência central Cadeia pesada de 16H7 Cadeia pesada de 16H7 Cadeia pesada de 16H7
341
N° DO ID. DE SEQ. DA CDR3 <0 221 VO
0 CJ 0 CD 0 0 CD CJ 0
H Eh CD Eh Eh CD H H CD
C r_i 2 CD Eh C_i 0 CD Eh C_1 2 CD Eh
Eh O 01 Eh CJ 0 Fh 0 0
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W 0 0 CD H CD 0 CD H CD CD CD H
0 01 H 0 01 H 0 0 CJ H 0
kJ Eh 0 kJ 0 0 kJ H 0
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342
N° DO ID. DE SEQ. DA CDR3 447 448 σι
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343
N° DO ID. DE SEQ. DA CDR3 450 451 452
CDR3 GTGGTA CAGGTGTGG GATAATACT GCTGATCAT GTGGTA ATATTATTA GTGGGAGCT TACTACTAC AGCGGTATG GACGTC TCAGTAGTA ACTGGCGGC TACTATTAC TACGACGGT ATGGACGTC
N° DO ID. DE SEQ. DA CDR2 249 206 206
CDR2 I GATGATAGCG ACCGGCCCTC A Eh < U U Eh 0 < Eh 0 Eh 0 Eh 0 0 Eh < 0 Η < Eh 0 U < 0 Eh Eh Eh 0 U < < 0 o < 0 < 0 Eh O 0 < < CACATTTTTT CGAATGACGA AAAATCCTAC AGCACATCTC TGAAGAGC
N° DO ID. DE SEQ. DA CDR1 240 196 196
CDR1 0 GGGGGAAAC AACATTGGA AGGTGTGCA C AATGCTAGA ATGGGTGTG AGC AATGCTAGA ATGGGTGTG AGC ________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________1
Localização da mutação CDR3 CDR3 CDR3
Variação cn co C109S Inserção de Y107
Seqüência central Cadeia leve de 22H5 Cadeia pesada de 22H5 Cadeia pesada de 16H7
344
Adicionalmente, um hemibody foi gerado e estudado. Essa estrutura era composta pela cadeia leve de 16H7 (L3; ID. DE SEQ. N° : 50) , que foi pareada com uma forma modificada geneticamente da cadeia pesada de 16H7; a cadeia pesada modificada geneticamente era composta pela cadeia pesada de 16H7 (ID. DE SEQ. N° : 32) unida por meio de um vinculador (G4S)8 (ID. DE SEQ. N° : 440) a uma seqüência de Fc de IgG2 (ID. DE SEQ. N°: 441), que pareava com a seqüência de Fc da cadeia pesada de 16H7. As partes componentes do hemibody possuem as seguintes seqüências:
Cadeia pesada de 16H7:
MDMRVPAQLLGLLLLWLRGARCQVTLKESGPVLVKPTETLTLTCTVSGFSLNNARMGV SWIRQPPGKALEWLAHIFSNDEKSYSTSLKSRLTISKDTSKSQVVLIMTNMDPVDTATYY CARSWTGGYYYDGMDVWGQGTTVTVSSASTfCGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVK DYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSNFGTQTYTCNVDHKP SNTKVDKTVERKSSVECPPCPAPPVAGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHED PEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTFRWSVLTWHQDWLNGKEYKCKVSNKG LPAPIEKTISKTKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQP ENNYKTTPPMLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGlSfVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSP (ID. DE SEQ. N°: 32)
Vinculador:
GGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGS (ID. DE SEQ. N°: 440)
Fc de IgG2:
ERKSSVECPPCPAPPVAGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVQFNWYV DGVEVHNAKTKPREEQFNSTFRWSVLTVVHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPAPTEKTIS KTKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNVKTTPP MLDSDGSFFLYSKL.TVDKSRWQQGNVFSCSVMHEAI.HNHYTQKSLStSPGK (ID. DE SEQ. N°: 441)
A cadeia pesada total do hemibody tinha a seqüência de aminoácidos mostrada abaixo:
345 mdmrvpaqllgllllwlrgarcqvtlkesgpvlvkptetltltctvsgfslnnarmgv SW1RQPPGKALEWLAH1FSNDEKSYSTSLKSRLT1SKDTSKSQVVL1MTCMDPVDTATYY CARSVVTGGYYYDGMDVWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSÊSTAALGCLVK DYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSNFGTQTYTCNVDHKP SNTKVDKTVERKSSVECPPCPAPPVAGPSVFLFPPKPKjDTLMISRTPEVTCVVVDVSHED PEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTFRVVSVIYVVHQDWI.NGKEYKCKVSNKG LPAPIEKTISKTKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQP ENNYKTTPPMLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALEINHYTQKSLSLSP GGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSERKSSVECPPCPAPPV AGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREE QFNSTFRWSVLTVVHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPAPIEKTISKTKGQPREPQVYTLPP SREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPMLDSDGSFFLYSKLTV DKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK (ID. DE SEQ. N°: 453) que é codificada pela seguintes seqüência:
ATGGACATGAGGGTGCCCGCTCAGCTCCTGGGGCTCCTGCTGCTGTGGCTGAGAGGT GCGCGCTGTCAGGTCACCTTGAAGGAGTCTGGTCCTGTGCTGGTGAAACCCACAGAG ACCCTCACGCTGACCTGCACCGTGTCTGGGTTCTCACTCAACAATGCTAGAATGGGT GTGAGCTGGATCCGTCAGCCCCCAGGGAAGGCCCTGGAGTGGCrTGCACACATTTTT TCGAATGACGAAAAATCCTACAGCACATCTCTGAAGAGCAGGCTCACCATCTCCAA ggacacctccaaaagccaggtggtcctaattatgaccaacatggaccctgtggaca cagcx'acatattactgtgcacggtcagtagtaactggc:ggctactactacgaCggta tggacgtctggggccaagggaccacggtcaccgtctctagtgccagcaccaagggc ccctccgtgttccctctggccccctgcagcagaagcaccagcgagagcacagccgcc CTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAGCCCGTGACCGTGTCnTGGAACAGC ggagccctgaccagcggcgtgcacacctttccagccgtgctgcagagcagcggcct GTACAGCCTGAGCAGCGTGGTCACCGTGCCCAGCAGCAACTTCGGCACCCAGACCT acagctgtaacgtggaccacaagcccagcaacaccaaggtggacaagacagtgga GCGGAAGTCCAGCGTGGAGTGCCCTCCTTGTCCTGCCCCTCCTGTGGCCGGACCTAG cgtgttcctgttccccccaaagcccaaggacaccctgatgatcagccggacccgcga AGTGACCTGCGTGGTGGTGGACGTGTCCCACGAGGACCCCGAGGTGCAGTTCAATT ggtacgtggacggggtggaggtgcacaacgccaagaccaagccccgggaggaaca GTTCAACAGCACCTrCCGGGTGGTGTCCGTCCTCACCGTGGTGCACCAGGACTGGCT gaacggcaaagagtacaagtgcaaggtctccaacaagggcctgcctgcccccatcg AGAAAACCATCAGCAAGACCAAGGGCCAGCCTCGGGAGCCTCAGGTGTACÂCCCTG
346
CCCCCCAGCCGGGAGGAAATGACCAAGAACCAGGTGTCCCTGACCTGCCTCGTGAA GGGCTTCTACCCCAGCGATATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAACGGCCAGCCCGAGA ACAACTACAAGACCACCCCCCCCATGCTGGACAGCGACGGCAGCTTCTTCCTGTACT CCAAACTGACCGTGGACAAGAGCCGGTGGCAGCAGGGCAACGTGTTCAGCTGTAGC GTGATGCACGAGGCCCTGCACAACCACTACACCCAGAAGTCCCTGAGCCTGTCTCCT ggcggaggcggaggatctggcggcggaggaagtggagggggcggatctggtggtg GAGGCAGCGGCGGAGGTGGAAGTGGCGGTGGAGGATCCGGTGGAGGCGGCTCAGG tggcggcggaagcgagagaaagtcctgcgtggagtgtccaccatgccctgctccac cagtggctggcccttccgtctttctctttccacctaaacctaaggatacactcatgat ctccagaactccagaggtcacatgtgtggtcgtcgatgtcagtcatgaggatcctga agtccagtttaactggtatgtggatggcgtcgaagtccataatgctaagacaaaacc tcgcgaagaacagtttaactccacctttagagtcgtgagcgtgctgacagtcgtcca tcaggattggctcaatgggaaagaatacaaatgtaaagtctctaacaaaggactgc ccgctcctatcgaaaagaccatctccaaaacaaaggggcagcccagagagccccag gtctacacactcccaccgtccagagaagagatgacaaaaaatcaggtgtcactcac ctgtctggtcaaggggttttacccctccgacattgccgtggaatgggaatccaatgg gcagcctgaaaacaattataagagtacacctcctatgctcgactctgatgggagttt CTTrCTCTACTCTAAACTCACAGTGGATAAGTCTAGATGGCAGCAGGGGAATGTCTT TTCCTGCTCCGTCATGCATGAAGCTCTCCACAATCATTATACACAGAAGTCTTTGTCC CTGTCCCCCGGCAAG (ID. DE SEQ. N°: 454)
Exemplo 14.1
ELISA de ligação de β-Klotho para anticorpos modificados geneticamente
As formas modificadas geneticamente de 16H7 e 22H5 foram testadas para ligação de β-Klotho usando um ensaio ELISA. As condições para ELISA foram as seguintes.
Placas Maxisorp revestidas com estreptavidina foram incubadas com 2 pg/ml de β-Klotho de um dia para o outro a 4 °C. Anticorpos foram adicionados em diluições seriais de 3 vezes partindo de 1 μΜ por 1 hora em temperatura ambiente. Anti-Fc conjugado à HRP humano foi usado como o anticorpo detector. O sinal foi desenvolvido com Lumiglo e lido em
347
Envision.
Os resultados do ensaio ELISA são mostrados na Figura 32A-32C e indicam que a maioria das variantes de 16H7 se ligou a β-Klotho humano, exceto para um mutante que carrega a inserção de tirosina na posição 107.
Exemplo 14.2
Variantes modificadas geneticamente de 16H7 e 22H5 se ligam à estrutura nativa do receptor, como demonstrado por FACS
Um ensaio de ligação por FACS foi realizado com várias das formas modificadas geneticamente de 16H7 e 22H5. Os experimentos foram feitos da forma a seguir.
Células CHO que expressam estavelmente o receptor de FGF21 foram tratadas com anticorpo-parente 16H7 e 22H5 e também com variantes modificadas geneticamente delas (1 pg por 1 x 106 células em 100 μΐ de PBS/BSA 0,5%) . As células foram incubadas com os anticorpos a 4°C, seguido por duas lavagens com PBS/BSA. As células foram então tratadas com anticorpos secundários marcados com FITC a 4°C, seguido por duas lavagens. As células foram ressuspensas em 1 ml de PBS/BSA e a ligação de anticorpo foi analisada usando um instrumento de FACS Calibur.
Consistentes com os resultados do ELISA, a maioria das variantes modificadas geneticamente de anticorpos agonistas do receptor de FGF21 testadas se liga bem ao receptor de FGF21 da superfície celular em FACS. Essa observação confirmou ainda que a modificação guiada geneticamente de anticorpos agonistas do receptor de FGF21 mantém a ligação à estrutura nativa. Em um mutante, no qual CDR3 foi modificada geneticamente para incluir uma tirosina na
348 posição Y107, foi observada uma perda completa da ligação à superfície celular receptor, que é similar aos resultados do ELISA. Essa observação ressalta o papel da alça de CDR3 na ligação à conformação nativa.
Exemplo 14.3
Atividade de variantes de 16H7 e 22H5 em adipócitos humanos primários
FGF21 estimula a captação de glicose e lipólise em adipócitos cultivados e, portanto, adipócitos são 10 freqüentemente considerados como sendo um ensaio fisiologicamente relevante. Foi demonstrado que um painel das variantes modificadas geneticamente de 16H7 e 22H5 exibe atividade de fosforilação de Erk similar ao FGF21 no ensaio de adipócito humano com uma EC50 estimada de menos 15 do que 10 nM, como mostrado na Tabela 7.
Tabela 7 - Atividade de variantes no ensaio de adipócitos humanos
Seqüência central N° DO ID. DE SEQ. da cadeia variante Variante EC50 (nM)
Cadeia pesada de 16H7 391 I83T 0,73
Cadeia pesada de 16H7 393 E16Q + V24F + I83T 0,38
Cadeia pesada de 16H7 398 D88R + P89A + V90E 0,35
Cadeia pesada de 16H7 394 E16Q + V24F + I83T + T119L 0,36
16H7 (WT) 0,53
Cadeia leve 403 S94A 1,98
349
Seqüência central N° DO ID. DE SEQ. da cadeia variante Variante EC50 (nM)
de 22H5
Cadeia leve de 22H5 402 N92Q 3,33
Cadeia pesada de 16H7 400 Deleção de Y107 1,04
Cadeia pesada de 16H7 396 I83K 0,39
Cadeia pesada de 16H7 397 S100I 0,17
Cadeia pesada de 16H7 401 D109S 0,31
Cadeia pesada de 16H7 399 D88R + P89A + V90E + S100I 0,14
Cadeia pesada de 16H7 395 E16Q + V24F + I83T + S100I + T119L 0,24
Cadeia pesada de 22H5 405 Inserção de Y107 0,51
Cadeia pesada de 16H7 390 V24F 0,75
Cadeia pesada de 16H7 392 V24F + I83T 0,37
Cadeia leve de 16H7 386 D49Y 0,60
Cadeia leve de 16H7 387 D4 9A 0,63
Cadeia leve de 16H7 389 D49A, D91A 1,4
350
Seqüência central N° DO ID. DE SEQ. da cadeia variante Variante EC50 (nM)
Cadeia leve de 16H7 388 D91A 1,3
Cadeia leve de 16H7 385 Q16K 0,11
22H5 (WT) 2,27
Exemplo 14.4
Experimentos de ligação Biacore e medida off-rate
A ligação de variantes 16H7 e 22H5 ao β-Klotho humano foi testada usando ensaios Biacore. Resumidamente, anticorpo anti-His de camundongo (Qiagen, Valencia, CA) foi imobilizado em um chip CM5 usando reagentes de acoplamento de amina (General Electronics, Piscataway, NJ) . β-Klotho humano recombinante com tag de His foi capturado na segunda célula de fluxo a aproximadamente 100 RU. A primeira célula 10 de fluxo foi usada como um controle de fundo. Cem nM de mAbs foram diluídos em PBS mais 0,1 mg/ml de BSA, P20 0,005%, e injetados sobre o β-Klotho capturado na superfície do anticorpo anti-His. Para medida cinética, 0,78-100 nM de mAbs diluídos em PBS mais 0,1 mg/ml de BSA, 15 P20 0,005%, foram injetados sobre a superfície de β-Klotho.
As variantes testadas estão resumidas na Tabela 8:
351
Tabela 8 - Variantes estudadas em experimentos de ligação e off-rate.
N° DO ID DE SEQ. da cadeia leve CO H 14 14 H 403 402 H 14
N° DO ID DE SEQ. da cadeia pesada CO 391 393 398 394 32 rd CO rd CO 400 σ CO 397 401 399
Identificador /variação da cadeia leve oq ft L3 L3 L3 L3 L3 3 σ w ο CN CTl 3 L3 L3 L3 CO hl L3
Identificador/variação da cadeia pesada ft I83T E16Q + V24F + I83T D88R + P89A + V90E E16Q + V24F + I83T + T119L H3 H2 H2 Deleção de Y107 I83K S100I D109S D88R + P89A + V90E + S100I
Proteína de ligação de antígeno central 16H7 16H7 16H7 16H7 16H7 22H5 22H5 16H7 16H7 16H7 16H7 16H7
Número da construção 22H5 #1, P60881.3 #2, P60880.3 #3, P60890.3 #4, P60878.3 #5, 16H7 WT #6, P60898.3 #7, P60897.3 #8, P60886.3 m LD oo oo o <0 ft #10, P60884.3 #11, P60883.3 #12, P60879.3
352
N° DO ID DE SEQ. da cadeia leve H H H kO 00 CO 387 389 00 00 CO 385 CO
N° DO ID DE SEQ. da cadeia pesada 453 395 405 O ΟΪ CO 392 32 32 32 32 32 404
Identificador /variação da cadeia leve ! L3 CO i-q L3 CO h-q L3 (Ti Q Q ΟΊ Q + CTi Q σ Q ft CO O L2
Identificador/variação da cadeia pesada Cadeia pesada do hemibody E16Q + V24F + I83T + S100I + T119L Inserção de Y107 ft «tf 0 > V24F + I83T H3 H3 H3 H3 H3 C109S
Proteína de ligação de antígeno central 16H7 16H7 L 16H7 kO 16H7 16H7 16H7 16H7 16H7 16H7 22H5
Número da construção #13, P60882.3 #14, P60891.3 #15, P60889.3 CO 00 00 00 o k£) cu kO #17, P60887.3 #18, P60894.3 #19, P60895.3 #20, P60893.3 #21, P60892.3 #22, P60896.3 #23, P60899.2
353
Entre os mAbs modificados geneticamente testados, a maioria deles mostrou ligação íntima ao β-Klotho humano, exceto #15 que mostrou ausência de ligação. Ά Tabela 9 abaixo mostra a ligação de 100 nM de mAbs ao β-Klotho capturado em anti-His. A Figura 33 mostra a comparação com off-rate.
Tabela 9 - Ligação ao β-Klotho
Amostra koff (1/s)
#20, P60893.3 1,9E-04
#11, P60883.3 2,6E-04
#23, P60899.2 3,0E-04
22H5 3,1E-04
#18, P60894.3 3,1E-04
#6, P60898.3 3,5E-04
#13, P60882.3 4,4E-04
#7, P60897.3 5,2E-04
#8, P60886.3 5,3E-04
EXEMPLO 15
Combinações de proteínas de ligação de antígeno mostram um efeito aditivo
Proteínas de ligação de antígeno que representam diferentes compartimentos (bins) de ligação (Figuras 11a e b) foram selecionadas e testadas em ensaios-repórter em pares para determinar se o par de moléculas se comportaria de forma aditiva. Os ensaios foram executados da forma seguinte.
No primeiro dia, o clone AM-l/D FGFRlc+β-Klotho Luc foi semeado em uma placa de 96 poços a 20 K células/poço em meio de DMEM + 10% FBS. A placa foi incubada de um dia para o outro. NO dia seguinte, o meio foi substituído com meio
354 de ensaio (DMEM + FBS 0,2%) e incubado de um dia para o outro. De um estoque de trabalho de anticorpo (1 mg/ml em PBS), cada anticorpo sob estudo foi preparado em uma diluição de 2 pg/ml em meio de ensaio. Cem μΐ de cada 5 anticorpo a ser testado foram combinados em uma placa com fundo em U . 0 meio de ensaio foi removido das células, e μΐ das misturas de anticorpo foram transferidos para as células. As misturas de anticorpo foram incubadas nas células por 5 horas. Por último, cada amostra foi lida com reagente de Luciferase SteadyGlo (50 μΐ/poço), de acordo com as especificações do fabricante.
A Tabela 10 abaixo é um resumo da atividade (% de atividade de FGF21 pelo ensaio-repórter) observada pelo estudo; a Tabela 11 expressa as atividades observadas com 15 relação aos compartimentos.
Tabela 10 - Atividade da combinação de anticorpos (%)
Iso 6 5 4 3 2 1
IgG2k 2G10 16H7 12E4.1 20D4.1 39F7 26H11.1
Iso IgG2k ND -1,1 23,5 25,4 12,5 9,2 17,9
1 26H11.1 17,9 19,1 36,7 21,4 28,3 20,7
2 39F7 9,2 9,1 37,0 30,8 21,4
3 20D4.1 12,5 13,5 19,4 32,0
4 12E4.1 25,4 28,8 41,5
5 16H7 23,5 27,8
6 2G10 -1,1
355
Figure BR112012013876B1_D0043
356
Surpreendentemente, vários pares de moléculas mostraram um efeito aditivo. Como mostrado nas Figuras 34 e 35, respectivamente, 39F11 e FGF21 mostraram um efeito aditivo quando medido no ensaio-repórter do Exemplo 5, como o fizeram 16H7 e 39H11.
Resumindo os dados desse conjunto de experimentos, foi observado que em proteínas de ligação de antígeno do mesmo compartimento de ligação, por exemplo, 16H7 quando pareadas com 20D4 (ambos do Grupo A) , a atividade somada não era aditiva. Isso também foi observado quando 12E4 foi pareada com 26H11 (ambos do Grupo B). Adicionalmente, proteínas de ligação de antígeno pareadas de compartimentos não superpostos mostraram atividades aditivas, por exemplo, 16H7 (Grupo A) pareada com 26H11 ou 12E4 (Grupo B) , ou pareada com 39F7 (Grupo C) . Além disso, as proteínas de ligação de antígeno 26H11 e 12E4 (Grupo B) mostraram efeito aditivo quando combinadas com Abs do Grupo A, mas não do Grupo C, sugerindo que pode haver alguma superposição entre os sítios de ligação do Grupo B e Grupo C e/ou que as conformações de ativação induzidas pelas proteínas de ligação de antígeno do Grupo B e Grupo C não são mutualmente compatíveis. Finalmente, como esperado, quando uma proteína de ligação de antígeno funcional é pareada com uma proteína de ligação de antígeno não funcional (por exemplo, 2G10) que se liga a um sítio de ligação distinto e não superposto do Grupo A, B ou C, não há efeito sobre a atividade da proteína de ligação de antígeno funcional do Grupo A, B ou C.
Coletivamente, esses dados sugerem que as proteínas de ligação de antígeno reveladas podem ser co-administradas
357 para aumentar o efeito que certa proteína de ligação de antígeno pode fornecer por ela própria.
Cada referência aqui citada é incorporada por referência em sua totalidade em todos os seus ensinamentos 5 e para todas as finalidades.
A presente revelação não tem seu escopo limitado pelas modalidades específicas aqui descritas, que servem apenas como ilustrações de aspectos individuais da revelação, e métodos e componentes funcionalmente equivalentes formam 10 aspectos da revelação. Na verdade, várias modificações da revelação, além daquelas aqui mostradas e descritas, ficarão evidentes para aqueles habilitados na técnica a partir da descrição apresentada anteriormente e dos desenhos que a acompanham. Essas modificações visam ser 15 incluídas dentro do escopo das reivindicações em anexo.

Claims (5)

  1. REIVINDICAÇÕES
    1. Anticorpo isolado, scFv ou Fab, caracterizado por ser capaz de se ligar a um complexo que compreende β-Klotho e FGFR1c e compreender os seguintes CDRs:
    (a) CDRH1: SEQ ID NO: 122, CDRH2: SEQ ID NO: 133,
    CDRH3: SEQ ID NO: 148, CDRL1:
    NO: 176, e CDRL3: SEQ ID NO:
    (b) CDRH1: SEQ IDNO:
    CDRH3: SEQ ID NO: 146, CDRL1:
    NO: 176, e CDRL3: SEQ ID NO:
    (c) CDRH1: SEQ IDNO:
    CDRH3: SEQ ID NO: 147, CDRL1:
    NO: 176, e CDRL3: SEQ ID NO:
    (d) CDRH1: SEQ IDNO:
    CDRH3: SEQ ID NO: 148, CDRL1:
    NO: 176, e CDRL3: SEQ ID NO:
    (e) CDRH1: SEQ IDNO:
    CDRH3: SEQ ID NO: 150, CDRL1:
    NO: 174, e CDRL3: SEQ ID NO:
    (f) CDRH1: SEQ IDNO:
    CDRH3: SEQ ID NO: 152, CDRL1:
    NO: 173, e CDRL3: SEQ ID NO:
    (g) CDRH1: SEQ IDNO:
    CDRH3: SEQ ID NO: 152, CDRL1:
    NO: 173, e CDRL3: SEQ ID NO:
    (h) CDRH1: SEQ IDNO:
    CDRH3: SEQ ID NO: 151, CDRL1:
    NO: 173, e CDRL3: SEQ ID NO:
    (i) CDRH1: SEQ IDNO:
    CDRH3: SEQ ID NO: 153, CDRL1:
    SEQ ID NO: 166, CDRL2: SEQ ID 188;
    122, CDRH2: SEQ ID NO:133,
    SEQ ID NO: 167, CDRL2: SEQ ID 190;
    122, CDRH2: SEQ ID NO:133,
    SEQ ID NO: 167, CDRL2: SEQ ID 189;
    122, CDRH2: SEQ ID NO:134,
    SEQ ID NO: 166, CDRL2: SEQ ID 188;
    124, CDRH2: SEQ ID NO:136,
    SEQ ID NO: 161, CDRL2: SEQ ID 183;
    124, CDRH2: SEQ ID NO:138,
    SEQ ID NO: 162, CDRL2: SEQ ID 184;
    124, CDRH2: SEQ ID NO:139,
    SEQ ID NO: 162, CDRL2: SEQ ID 186;
    124, CDRH2: SEQ ID NO:137,
    SEQ ID NO: 164, CDRL2: SEQ ID 186;
    131, CDRH2: SEQ ID NO:140,
    SEQ ID NO: 163, CDRL2: SEQ ID
    Petição 870190097789, de 30/09/2019, pág. 8/13
  2. 2/4
    NO: 173, e CDRL3: SEQ ID NO:
    (j) CDRH1: SEQ IDNO:
    CDRH3: SEQ ID NO: 149, CDRL1:
    NO: 172, e CDRL3: SEQ ID NO:
    (k) CDRH1: SEQ IDNO:
    CDRH3: SEQ ID NO: 145, CDRL1:
    NO: 171, e CDRL3: SEQ ID NO:
    (l) CDRH1: SEQ IDNO:
    CDRH3: SEQ ID NO: 154, CDRL1:
    NO: 171, e CDRL3: SEQ ID NO:
    (m) CDRH1: SEQ IDNO:
    CDRH3: SEQ ID NO: 157, CDRL1:
    NO: 177, e CDRL3: SEQ ID NO:
    (n) CDRH1: SEQ IDNO:
    CDRH3: SEQ ID NO: 156, CDRL1:
    NO: 173, e CDRL3: SEQ ID NO:
    (o) CDRH1: SEQ IDNO:
    CDRH3: SEQ ID NO: 156, CDRL1:
    NO: 173, e CDRL3: SEQ ID NO:
    (p) CDRH1: SEQ IDNO:
    CDRH3: SEQ ID NO: 155, CDRL1:
    NO: 178, e CDRL3: SEQ ID NO:
    (q) CDRH1: SEQ IDNO:
    CDRH3: SEQ ID NO: 156, CDRL1:
    NO: 179, e CDRL3: SEQ ID NO:
    2. Anticorpo isolado, ser capaz de se ligar a um complexo que compreende
    185;
    123, CDRH2: SEQ ID NO:135,
    SEQ ID NO: 159, CDRL2: SEQ ID 181;
    121, CDRH2: SEQ ID NO:132,
    SEQ ID NO: 158, CDRL2: SEQ ID 180;
    126, CDRH2: SEQ ID NO:133,
    SEQ ID NO: 168, CDRL2: SEQ ID 191;
    130, CDRH2: SEQ ID NO:144,
    SEQ ID NO: 169, CDRL2: SEQ ID 192;
    129, CDRH2: SEQ ID NO:142,
    SEQ ID NO: 163, CDRL2: SEQ ID 194;
    128, CDRH2: SEQ ID NO:141,
    SEQ ID NO: 163, CDRL2: SEQ ID 194;
    127, CDRH2: SEQ ID NO:135,
    SEQ ID NO: 170, CDRL2: SEQ ID 193; ou
    128, CDRH2: SEQ ID NO:143,
    SEQ ID NO: 163, CDRL2: SEQ ID 194.
    scFv ou Fab, caracterizado por β-Klotho e FGFR1c, em que o referido anticorpo isolado, scFv ou Fab compreende (a) SEQ ID NO: 50 e SEQ ID NO: 68,
    Petição 870190097789, de 30/09/2019, pág. 9/13
  3. 3/4
    (b) SEQ ID NO: 48 e SEQ ID NO: 66, (c) SEQ ID NO: 49 e SEQ ID NO: 67, (d) SEQ ID NO: 50 e SEQ ID NO: 69, (e) SEQ ID NO: 51 e SEQ ID NO: 70, 5 (f) SEQ ID NO: 52 e SEQ ID NO: 71, (g) SEQ ID NO: 53 e SEQ ID NO: 72, (h) SEQ ID NO: 54 e SEQ ID NO: 73, (i) SEQ ID NO: 56 e SEQ ID NO: 74, (j) SEQ ID NO: 57 e SEQ ID NO: 76, 10 (k) SEQ ID NO: 59 e SEQ ID NO: 78, (l) SEQ ID NO: 60 e SEQ ID NO: 79, (m) SEQ ID NO: 61 e SEQ ID NO: 80, (n) SEQ ID NO: 62 e SEQ ID NO: 81, (o) SEQ ID NO: 63 e SEQ ID NO: 82, 15 (p) SEQ ID NO: 64 e SEQ ID NO: 83, ou (q) SEQ ID NO: 65 e SEQ ID NO: 84.
    3. Anticorpo isolado, scFv ou Fab, caracterizado por ser capaz de se ligar a um complexo que compreende β-Klotho e FGFR1c, em que o referido anticorpo, scFv ou Fab compreende
    20 (a) SEQ ID NO: 14 e SEQ ID NO: 32 (b) SEQ ID NO: 12 e SEQ ID NO: 30 (c) SEQ ID NO: 13 e SEQ ID NO: 31 (d) SEQ ID NO: 14 e SEQ ID NO: 33 (e) SEQ ID NO: 15 e SEQ ID NO: 34 25 (f) SEQ ID NO: 16 e SEQ ID NO: 35 (g) SEQ ID NO: 17 e SEQ ID NO: 36 (h) SEQ ID NO: 18 e SEQ ID NO: 37 (i) SEQ ID NO: 20 e SEQ ID NO: 38 (j) SEQ ID NO: 21 e SEQ ID NO: 40 30 (k) SEQ ID NO: 23 e SEQ ID NO: 41
    Petição 870190097789, de 30/09/2019, pág. 10/13
  4. 4/4
    (l) SEQ ID NO: 24 e SEQ ID NO: 42, (m) SEQ ID NO: 25 e SEQ ID NO: 46, (n) SEQ ID NO: 26 e SEQ ID NO: 47, (o) SEQ ID NO: 27 e SEQ ID NO: 44, p) SEQ ID NO: 28 e SEQ ID NO: 43, ou (q) SEQ ID NO: 29 e SEQ ID NO: 45.
    4. Anticorpo isolado, scFv ou Fab, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pela proteína de ligação de antígeno ser um anticorpo humano, um anticorpo humanizado, um anticorpo quimérico, um anticorpo monoclonal, um anticorpo recombinante, um fragmento de anticorpo de ligação de antígeno, um anticorpo de cadeia única, um diabody, um triabody, um tetrabody, um fragmento Fab, um fragmento F(fab')2, um anticorpo de domínio, um anticorpo IgD, um anticorpo IgE, um anticorpo IgM, um anticorpo IgG1, um anticorpo IgG2, um anticorpo IgG3, um anticorpo IgG4 ou um anticorpo IgG4 que possuí pelo menos uma mutação na região de dobradiça.
  5. 5. Composição farmacêutica, caracterizada por compreender o anticorpo isolado, scFv ou Fab, conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 4, em mistura com um veículo farmaceuticamente aceitável.
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