ES2633810T3

ES2633810T3 - Proteínas de unión a antígeno humanas que se unen a beta-Klotho, receptores de FGF y complejos de los mismos

Info

Publication number: ES2633810T3
Application number: ES10788204.5T
Authority: ES
Inventors: Shaw-Fen Sylvia Hu; Ian Foltz; Chadwick Terence King; Yang Li; Taruna Arora
Original assignee: Amgen Inc
Current assignee: Amgen Inc
Priority date: 2009-12-07
Filing date: 2010-12-03
Publication date: 2017-09-25
Anticipated expiration: 2030-12-03
Also published as: US9493577B2; US9284378B2; TW201805308A; CN102858802A; US20160145351A1; JP2016105704A; CA2782420C; DK2711375T3; MY191950A; IL220048A0; CY1119000T1; HUE034727T2; KR101865974B1; US20200216546A1; BR112012013876A2; JP2020054376A; JP6931590B2; MX341148B; ZA201204145B; UY39124A

Abstract

Anticuerpo aislado o fragmento del mismo que puede unirse a un complejo que comprende ß-Klotho y FGFR1c e induce senalizacion mediada por FGF21 y comprende las siguientes CDR: a) CDRH1: SEQ ID NO: 122; b) CDRH2: SEQ ID NO: 133; c) CDRH3: SEQ ID NO: 148; d) CDRL1: SEQ ID NO: 166; e) CDRL2: SEQ ID NO: 176; y f) CDRL3: SEQ ID NO: 188; para su uso en terapia.

Description

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DESCRIPCIÓN

Proteínas de unión a antígeno humanas que se unen a beta-Klotho, receptores de FGF y complejos de los mismos

Campo de la invención

La presente divulgación se refiere a moléculas de ácido nucleico que codifican para proteínas de unión a antígeno

5 que se unen a (i) β-Klotho; (ii) FGFR1c, FGFR2c, FGFR3c o FGFR4; o (iii) un complejo que comprende β-Klotho y uno de FGFR1c, FGFR2c, FGFR3c y FGFR4. La presente divulgación también proporciona proteínas de unión a antígeno que se unen a (i) β-Klotho; (ii) FGFR1c, FGFR2c, FGFR3c o FGFR4; o (iii) un complejo que comprende β-Klotho y uno de FGFR1c, FGFR2c, FGFR3c y FGFR4, incluyendo proteínas de unión a antígeno que inducen señalización de tipo FGF21, así como a composiciones farmacéuticas que comprenden proteínas de unión a

10 antígeno que se unen a (i) β-Klotho; (ii) FGFR1c, FGFR2c, FGFR3c o FGFR4; o (iii) un complejo que comprende β-Klotho y uno de FGFR1c, FGFR2c, FGFR3c y FGFR4, incluyendo proteínas de unión a antígeno que inducen señalización de tipo FGF21, y a métodos para tratar trastornos metabólicos usando tales ácidos nucleicos, polipéptidos o composiciones farmacéuticas. También se proporcionan métodos de diagnóstico que usan las proteínas de unión a antígeno.

15 Antecedentes

El factor de crecimiento de fibroblastos 21 (FGF21) es un polipéptido secretado que pertenece a una subfamilia de factores de crecimiento de fibroblastos (FGF) que incluye FGF19, FGF21 y FGF23 (Itoh et al., (2004) Trend Genet. 20:563-69). FGF21 es un FGF atípico en el sentido de que es independiente de heparina y funciona como una hormona en la regulación del metabolismo de glucosa, lípidos y energía.

20 Se expresa altamente en hígado y páncreas y es el único elemento de la familia de FGF que se expresa principalmente en el hígado. Los ratones transgénicos que sobreexpresan FGF21 muestran fenotipos metabólicos de tasa de crecimiento lenta, bajos niveles de triglicéridos y glucosa en plasma, y una ausencia de diabetes tipo 2 asociada a la edad, hiperplasia de islotes y obesidad. La administración farmacológica de proteína FGF21 recombinante en modelos de roedores y primates da como resultado niveles normalizados de glucosa en plasma,

25 niveles reducidos de triglicéridos y colesterol, y tolerancia a la glucosa y sensibilidad a la insulina mejoradas. Además, FGF21 reduce el peso corporal y la grasa corporal aumentando el gasto energético, la actividad física y la tasa metabólica. La investigación experimental proporciona soporte para la administración farmacológica de FGF21 para el tratamiento de diabetes tipo 2, obesidad, dislipidemia, y otros estados y trastornos metabólicos en seres humanos.

30 FGF21 es una hormona endocrina derivada del hígado que estimula la captación de glucosa en homeostasis de lípidos y adipocitos a través de la activación de su receptor. Curiosamente, además del receptor de FGF canónico, el receptor de FGF21 también comprende β-Klotho asociado a la membrana como cofactor esencial. La activación del receptor de FGF21 conduce a múltiples efectos sobre una variedad de parámetros metabólicos.

En mamíferos, los FGF median su acción a través de un conjunto de cuatro receptores de FGF, FGFR1 - 4, que a su

35 vez se expresan en múltiples variantes cortadas y empalmadas, por ejemplo, FGFR1c, FGFR2c, FGFR3c y FGFR4. Cada receptor de FGF contiene un dominio tirosina cinasa intracelular que se activa tras la unión al ligando, conduciendo a rutas de señalización posteriores que implican MAPK (Erk1/2), RAF1, AKT1 y STAT. (Kharitonenkov et al., (2008) BioDrugs 22:37-44). Varios informes sugirieron que las variantes de corte y empalme del indicador “c” de FGFR1-3 presentan afinidad específica por β-Klotho y podrían actuar como receptor endógeno para FGF21

40 (Kurosu et al., (2007) J. Biol. Chem. 282:26687-26695); Ogawa et al., (2007) Proc. Natl. Acad. Sci. EEUU 104:74327437); Kharitonenkov et al., (2008) J. Cell Physiol. 215:1-7). En el hígado, que expresa abundantemente tanto β-Klotho como FGFR4, FGF21 no induce la fosforilación de MAPK aunque sí la unión fuerte de FGF21 al complejo βKlotho-FGFR4. En células 3T3-L1 y en tejido adiposo blanco, FGFR1 es, con mucho, el receptor más abundante, y por tanto es lo más probable que los receptores funcionales principales de FGF21 en este tejido sean los

45 complejos β-Klotho/FGFR1c.

La presente divulgación proporciona una proteína de unión a antígeno humana (o humanizada), tal como un anticuerpo monoclonal, que induce señalización de tipo FGF21, por ejemplo, un anticuerpo agonista que imita la función de FGF21. Un anticuerpo de este tipo es una molécula con actividad y selectividad de tipo FGF21 pero con características terapéuticamente deseables añadidas típicas para un anticuerpo tal como estabilidad de proteína,

50 falta de inmunogenicidad, facilidad de producción y semivida larga in vivo.

El documento WO2008/123625 da a conocer una sustancia que puede potenciar o inhibir β-klotho o la actividad de β-klotho como agente para regular la actividad de FGF21 a través del receptor de FGF y que contiene la sustancia como principio activo.

Sumario

55 La presente invención proporciona las siguientes realizaciones: 1. Un anticuerpo aislado o fragmento del mismo que puede unirse a un complejo que comprende β-Klotho y FGFR1c e induce señalización mediada por FGF21 y comprende las siguientes CDR:

imagen2

a) CDRH1: SEQ ID NO: 122;

b) CDRH2: SEQ ID NO: 133;

5 c) CDRH3: SEQ ID NO: 148;

d) CDRL1: SEQ ID NO: 166;

e) CDRL2: SEQ ID NO: 176; y

f) CDRL3: SEQ ID NO: 188;

para su uso en terapia.

10 2. Un anticuerpo aislado o fragmento del mismo que puede unirse a un complejo que comprende β-Klotho y FGFR1c e induce señalización mediada por FGF21, en el que dicho anticuerpo aislado o fragmento del mismo comprende una secuencia de aminoácidos idéntica al 90% a la SEQ ID NO: 50 y comprende una secuencia de aminoácidos idéntica al 90% a la SEQ ID NO: 68 para su uso en terapia.

3. El anticuerpo aislado o fragmento del mismo para el uso de la realización 2, en el que dicho anticuerpo aislado o

15 fragmento del mismo comprende una secuencia de aminoácidos idéntica al 95% a la SEQ ID NO: 50 y comprende una secuencia de aminoácidos idéntica al 95% a la SEQ ID NO: 68.

4.: El anticuerpo aislado o fragmento del mismo para el uso de la realización 3, en el que dicho anticuerpo aislado o fragmento del mismo comprende las SEQ ID NO: 50 y SEQ ID NO: 68.

5.: Un anticuerpo aislado o fragmento del mismo que puede unirse a un complejo que comprende β-Klotho y FGFR1c

20 e induce señalización mediada por FGF21, en el que dicho anticuerpo aislado o fragmento del mismo comprende una secuencia de aminoácidos idéntica al 90% a la SEQ ID NO: 14 y comprende una secuencia de aminoácidos idéntica al 90% a la SEQ ID NO: 32 para su uso en terapia.

6. El anticuerpo aislado o fragmento del mismo para el uso de la realización 5, en el que dicho anticuerpo aislado o

fragmento del mismo comprende una secuencia de aminoácidos idéntica al 95% a la SEQ ID NO: 14 y comprende 25 una secuencia de aminoácidos idéntica al 95% a la SEQ ID NO: 32.

7. El anticuerpo aislado o fragmento del mismo para el uso de la realización 6, en el que dicho anticuerpo aislado o fragmento del mismo comprende una secuencia de aminoácidos idéntica al 98% a la SEQ ID NO: 14 y comprende una secuencia de aminoácidos idéntica al 98% a la SEQ ID NO: 32.

8. El anticuerpo aislado o fragmento del mismo para el uso de la realización 1, en el que dicho anticuerpo o 30 fragmento del mismo comprende las SEQ ID NO: 14 y SEQ ID NO: 32

9. El anticuerpo aislado o fragmento del mismo de cualquiera de las realizaciones 1-8 para su uso en el tratamiento de diabetes tipo 2, obesidad, dislipidemia, NASH, enfermedad cardiovascular o síndrome metabólico.

Breve descripción de los dibujos

La figura 1A-1B es una alineación que muestra la homología de secuencia entre FGFR1c humano (n.º de registro de

35 GenBank P11362; SEQ ID NO: 356) y FGFR1c murino (n.º de registro de GenBank NP_034336; SEQ ID NO: 357); se destacan diversas características, incluyendo el péptido señal, la secuencia transmembrana, la región de unión a heparina, y se proporciona una secuencia de consenso (SEQ ID NO: 358).

La figura 2a-2c es una alineación que muestra la homología de secuencia entre β-Klotho humano (n.º de registro de GenBank NP_783864; SEQ ID NO: 359) y β-Klotho murino (n.º de registro de GenBank NP_112457; SEQ ID NO:

40 360); se destacan diversas características, incluyendo la secuencia transmembrana y dos dominios glicosil hidrolasa, y se proporciona una secuencia de consenso (SEQ ID NO: 361).

La figura 3 es un perfil de citometría de flujo de células teñidas con FGF21-Alexa 647 que se usaron como inmunógeno para generar proteínas de unión a antígeno; la figura muestra el nivel de expresión de un FGF21R (un complejo que comprende FGFR1c y β-Klotho) y la unión a FGF21.

45 La figura 4 es una secuencia (SEQ ID NO: 362) que muestra una proteína de fusión Fc que se usó como inmunógeno para generar proteínas de unión a antígeno; el inmunógeno comprende el dominio extracelular (ECD) de FGFR1c humano fusionado a un Fc de IgG1 a través de un ligador Gly5 (SEQ ID NO: 379); el componente FGFR1c está en mayúsculas, el ligador está en cursiva y subrayado y el Fc está en letras minúsculas.

imagen3

La figura 5 es una secuencia (SEQ ID NO: 363) que muestra una proteína de fusión Fc que se usó como inmunógeno para generar proteínas de unión a antígeno; el inmunógeno comprende el dominio extracelular (ECD) de β-Klotho humano fusionado a un Fc de IgG1 a través de un ligador Gly5 (SEQ ID NO: 379); el componente β-Klotho está en mayúsculas, el ligador está en cursiva y subrayado y el Fc está en letras minúsculas.

5 La figura 6 es un gel de SDS PAGE que muestra el nivel de pureza alcanzado a partir de preparaciones de un complejo de receptor de FGF21 soluble que comprende FGFR1c ECD-Fc y β-Klotho ECD-Fc, que se empleó como inmunógeno para generar proteínas de unión a antígeno.

La figura 7 es una serie de gráficos generados a partir de un ensayo de indicador de ELK-luciferasa tal como se describe en el presente documento realizado sobre el clon de CHO recombinante 2E10, que demuestra la capacidad

10 de algunas de las proteínas de unión a antígeno para inducir señalización de tipo FGF21 en células CHO recombinantes que expresan un complejo de receptor de FGF21 que comprende FGFR1c y β-Klotho.

La figura 8 es una serie de gráficos generados a partir de un ensayo de fosforilación de ERK1/2 tal como se describe en el presente documento, que demuestra la capacidad de algunas de las proteínas de unión a antígeno para inducir señalización de tipo FGF21 en células L6 de rata. El eje X son las concentraciones de las proteínas de unión a

15 antígeno y el eje Y es el porcentaje de ERK1/2 fosforilado de ERK1/2 total.

La figura 9 es una serie de gráficos generados a partir de un ensayo de fosforilación de ERK1/2 tal como se describe en el presente documento, que demuestra que la señalización de tipo FGF21 mediada por proteínas de unión a antígeno en células L6 es específica de FGFR1c/β-Klotho.

La figura 10 es una serie de gráficos generados a partir de un ensayo de fosforilación de ERK tal como se describe

20 en el presente documento, que demuestra que algunas proteínas de unión a antígeno pueden inducir señalización de tipo FGF21 en células de adipocitos humanos.

La figura 11a es una serie de sensogramas de unión (unidades de respuesta frente al tiempo) que demuestran que algunas de las proteínas de unión a antígeno que inducen señalización mediada por FGF21 se unen a β-Klotho humano en dos sitios de unión diferentes pero parcialmente solapantes representados por 24H11 (grupo A) y 17D8

25 (grupo B), mientras que las proteínas de unión a antígeno que no inducen señalización mediada por FGF21 (2G10, 1A2) no se unen a estos sitios.

La figura 11b es una serie de sensogramas de unión (unidades de respuesta frente al tiempo) que demuestran un tercer sitio de unión en β-Klotho humano que se identificó para las proteínas de unión a antígeno del grupo C representado por 39F7.

30 La figura 12 es una serie de sensogramas de unión (unidades de respuesta frente al tiempo) que demuestran que algunas de las proteínas de unión a antígeno (12E4, 24H11, 17C3, 18B11) que inducen señalización mediada por FGF21 interfieren con la unión de β-Klotho a FGF21, mientras que otras proteínas de unión a antígeno (21H2, 17D8, 18G1) no lo hacen.

La figura 13 es una alineación de las regiones variables de algunas de las proteínas de unión a antígeno que se

35 generaron; se identifican las regiones de marco y CDR. La figura 13 da a conocer las SEQ ID NO: 364, 59, 365, 60, 366, 61, 367, 62, 368, 57, 369, 55, 51-52, 56, 56, 53-54, 63-65, 370, 58, 371, 50, 50, 49, 48, 372, 78, 373, 66-69, 79, 374, 76, 81, 375, 70, 73, 73, 71-72, 376, 83, 82, 84, 377, 80, 378, 75 y 74, respectivamente, en orden de aparición.

La figura 14 es un diagrama que representa gráficamente el diseño del estudio para un estudio de 68 días realizado en macacos cangrejeros obesos.

40 La figura 15 es un gráfico que representa los efectos del vehículo y de 16H7 sobre la ingesta de alimento a.m. de los macacos cangrejeros obesos estudiados.

La figura 16 son dos gráficos que representan los efectos del vehículo y de 16H7 sobre la ingesta de fruta y la ingesta de alimento p.m. de los macacos cangrejeros obesos estudiados.

La figura 17 es un gráfico que representa los efectos del vehículo y de 16H7 sobre el peso corporal de los macacos 45 cangrejeros obesos estudiados.

La figura 18 es un gráfico que muestra los efectos del vehículo y de 16H7 sobre el índice de masa corporal (IMC) de los macacos cangrejeros obesos estudiados.

La figura 19 es un gráfico que muestra los efectos del vehículo sobre el perímetro abdominal (AC) de los macacos cangrejeros obesos estudiados.

50 La figura 20 es un gráfico que muestra los efectos del vehículo y de 16H7 sobre el grosor del pliegue cutáneo (SFT) de los macacos cangrejeros obesos estudiados.

La figura 21 es un gráfico que muestra los efectos del vehículo y de 16H7 sobre los niveles de glucosa durante las pruebas de tolerancia a la glucosa de los macacos cangrejeros obesos estudiados.

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La figura 22 es un gráfico que muestra los efectos del vehículo y de 16H7 sobre los niveles de insulina en plasma durante las pruebas de tolerancia a la glucosa de los macacos cangrejeros obesos estudiados.

La figura 23 es un gráfico que muestra los efectos del vehículo y de 16H7 sobre los niveles de glucosa en plasma en 5 estado de ayuno de los macacos cangrejeros obesos estudiados.

La figura 24 es un gráfico que muestra los efectos del vehículo y de 16H7 sobre los niveles de insulina en plasma en estado de ayuno de los macacos cangrejeros obesos estudiados.

La figura 25 es un gráfico que muestra los efectos del vehículo y de 16H7 sobre los niveles de glucosa en plasma en estado alimentado de los macacos cangrejeros obesos estudiados.

10 La figura 26 es un gráfico que muestra los efectos del vehículo y de 16H7 sobre los niveles de insulina en plasma en estado alimentado de los macacos cangrejeros obesos estudiados.

La figura 27 es un gráfico que muestra los efectos del vehículo y de 16H7 sobre los niveles de triglicéridos en plasma en estado de ayuno de los macacos cangrejeros obesos estudiados.

La figura 28 es un gráfico que muestra los efectos del vehículo y de 16H7 sobre los niveles de triglicéridos en 15 plasma en estado alimentado de los macacos cangrejeros obesos estudiados.

La figura 29 es un esquema que representa quimeras de β-Klotho de ser humano-ratón que se construyeron y usaron para estudiar la unión de proteínas de unión a antígeno.

La figura 30 es un esquema que representa las quimeras de β-Klotho de ser humano-ratón que se construyeron y también incluye datos de unión cualitativos para FGF21, 16H7, 37D3 y 39F7.

20 La figura 31A-C es una serie de gráficos que representan datos de unión para ocho de las variantes 16H7 y 22H5 que se construyeron, así como para 22H5 y 16H7.

Las figuras 32A-C es una serie de gráficos que representan los resultados de ensayos ELISA que se usaron para demostrar que varias de las variantes 22H5 y 16H7 tienen capacidad de unión.

La figura 33 es un diagrama de barras que compara las tasas de disociación para varias variantes 22H5 y 17H7 que 25 se generaron.

La figura 34 son dos gráficos que representan curvas de unión para 39F11 cuando se titula con FGF21 y para FGF21 cuando se titula con 39F11; los gráficos demuestran un efecto aditivo.

La figura 35 son dos gráficos que representan curvas de unión para 16H7 cuando se titula con 39F11 y 39F11 cuando se titula con 16H7; los gráficos demuestran un efecto aditivo.

30 Descripción detallada

Los encabezamientos de sección usados en el presente documento son sólo para propósitos de organización y no deben interpretarse como limitativos de la materia descrita.

A menos que se defina de otro modo en el presente documento, los términos científicos y técnicos usados en relación con la presente solicitud tendrán los significados que entienden comúnmente los expertos habituales en la 35 técnica. Además, a menos que el contexto lo requiera, los términos singulares incluirán los plurales y los términos plurales incluirán el singular.

Generalmente, las nomenclaturas usadas en relación con, y técnicas de, cultivo celular y tisular, biología molecular, inmunología, microbiología, genética y química de proteínas y ácidos nucleicos e hibridización descritas en el presente documento son aquellas bien conocidas y comúnmente usadas en la técnica. Los métodos y las técnicas 40 de la presente solicitud, en general, se realizan según métodos convencionales bien conocidos en la técnica y tal como se describe en diversas referencias generales y más específicas que se citan y comentan a lo largo de toda la presente memoria descriptiva a menos que se indique lo contrario. Véanse, por ejemplo, Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3ª ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (2001), Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Associates (1992), y Harlow and Lane 45 Antibodies: A Laboratory Manual Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1990). Las reacciones enzimáticas y las técnicas de purificación se realizan según las especificaciones del fabricante, tal como se realiza comúnmente en la técnica o tal como se describe en el presente documento. La terminología usada en relación con, y los procedimientos de laboratorio y las técnicas de, química analítica, química orgánica de síntesis y química médica y farmacéutica descritas en el presente documento son aquellas bien conocidas y comúnmente

50 usadas en la técnica. Pueden usarse técnicas convencionales para síntesis químicas, análisis químicos, preparación, formulación y administración farmacéutica y tratamiento de pacientes.

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Debe entenderse que la presente divulgación no se limita a la metodología, los protocolos y los reactivos particulares, etc., descritos en el presente documento y como tales pueden variar. La terminología usada en el presente documento es sólo para el propósito de describir realizaciones particulares y no pretende limitar el alcance de la presente divulgación.

5 Excepto en los ejemplos operativos, o cuando se indique lo contrario, todos los números que expresan cantidades de componentes o condiciones de reacción usados en el presente documento deben entenderse como modificados en todos los casos mediante el término “aproximadamente”. El término “aproximadamente” cuando se usa en relación con porcentajes puede significar ±5%, por ejemplo, el 1%, el 2%, el 3% o el 4%.

I. Definiciones

10 Tal como se usa en el presente documento, los términos “un” y “una” significan “uno o más” a menos que se indique específicamente lo contrario.

Una “proteína de unión a antígeno” es una proteína que comprende una parte que se une a un antígeno o diana y, opcionalmente, una parte de armazón o entramado que permite a la parte de unión a antígeno adoptar una conformación que promueva la unión de la proteína de unión a antígeno al antígeno. Los ejemplos de proteínas de 15 unión a antígeno incluyen un anticuerpo humano, un anticuerpo humanizado; un anticuerpo quimérico; un anticuerpo recombinante; un anticuerpo de cadena sencilla; un diacuerpo; un triacuerpo; un tetracuerpo; un fragmento Fab; un fragmento F(ab’)2; un anticuerpo IgD; un anticuerpo IgE; un anticuerpo IgM; un anticuerpo IgG1; un anticuerpo IgG2; un anticuerpo IgG3 o un anticuerpo IgG4 y fragmentos de los mismos. La proteína de unión a antígeno puede comprender, por ejemplo, un armazón de proteína alternativo o un armazón artificial con CDR injertadas o derivados 20 de CDR. Tales armazones incluyen, pero no se limitan a, armazones derivados de anticuerpos que comprenden mutaciones introducidas, por ejemplo, para estabilizar la estructura tridimensional de la proteína de unión a antígeno así como armazones completamente sintéticos que comprenden, por ejemplo, un polímero biocompatible. Véase, por ejemplo, Korndorfer et al., 2003, Proteins: Structure, Function, and Bioinformatics, 53(1):121-129 (2003); Roque et al., Biotechnol. Prog. 20:639-654 (2004). Además, pueden usarse miméticos de anticuerpo peptídicos (“PAM”), así

25 como armazones basados en miméticos de anticuerpo utilizando componentes de fibronectina como armazón.

Una proteína de unión a antígeno puede tener, por ejemplo, la estructura de una inmunoglobulina que se produce de manera natural. Una “inmunoglobulina” es una molécula tetramérica. En una inmunoglobulina que se produce de manera natural, cada tetrámero se compone de dos pares idénticos de cadenas polipeptídicas, teniendo cada par una cadena “ligera” (aproximadamente 25 kDa) y una “pesada” (aproximadamente 50-70 kDa). La parte amino30 terminal de cada cadena incluye una región variable de aproximadamente 100 a 110 o más aminoácidos responsables principalmente del reconocimiento del antígeno. La parte carboxilo-terminal de cada cadena define una región constante responsable principalmente de la función efectora. Las cadenas ligeras humanas se clasifican como cadenas ligeras kappa y lambda. Las cadenas pesadas se clasifican como mu, delta, gamma, alfa o épsilon, y definen el isótopo del anticuerpo como IgM, IgD, IgG, IgA e IgE, respectivamente. Dentro de las cadenas ligeras y 35 pesadas, las regiones variable y constante están unidas por una región “J” de aproximadamente 12 o más aminoácidos, incluyendo la cadena pesada también una región “D” de aproximadamente 10 aminoácidos más. Véase generalmente, Fundamental Immunology cap. 7 (Paul, W., ed., 2ª ed. Raven Press, N.Y. (1989)) (incorporado por referencia en su totalidad para todos los propósitos). Las regiones variables de cada par de cadena ligera/pesada forman el sitio de unión del anticuerpo de manera que una inmunoglobulina intacta tiene dos sitios de

40 unión.

Las cadenas de inmunoglobulina que se producen de manera natural muestran la misma estructura general de las regiones de marco relativamente conservadas (FR) unidas mediante tres regiones hipervariables, también denominadas regiones determinantes de complementariedad o CDR. Desde el extremo N-terminal al extremo Cterminal, tanto las cadenas ligeras como las pesadas comprenden los dominios FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3,

45 CDR3 y FR4. La asignación de aminoácidos a cada dominio puede hacerse según las definiciones de Kabat et al. en Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5ª ed., Departamento de Salud y Servicios Humanos de EE.UU., PHS, NIH, publicación de los NIH n.º 91-3242, 1991. Según se desee, las CDR también pueden redefinirse según un esquema de nomenclatura alternativo, tal como el de Chothia (véase Chothia & Lesk, 1987, J. Mol. Biol. 196:901917; Chothia et al., 1989, Nature 342:878-883 o Honegger & Pluckthun, 2001, J. Mol. Biol. 309:657-670).

50 En el contexto de la presente divulgación una proteína de unión a antígeno se dice que “se une específicamente” o “se une selectivamente” a su antígeno diana cuando la constante de disociación (KD) es ≤10-8 M. El anticuerpo se une específicamente al antígeno con “alta afinidad” cuando la KD es ≤5x 10-9 M, y con “muy alta afinidad” cuando la KD es ≤5x 10-10 M. En una realización, los anticuerpos se unirán a FGFR1c, β-Klotho, tanto FGFR1c como β-Klotho o un complejo que comprende FGFR1c y β-Klotho, incluyendo FGFR1c humano, β-Klotho humano o tanto FGFR1c

55 humano como β-Klotho humano, con una KD de entre aproximadamente 10-7 M y 10-12 M, y en aún otra realización los anticuerpos se unirán con una KD ≤5x 10-9 .

Un “anticuerpo” se refiere a una inmunoglobulina intacta o a una parte de unión a antígeno de la misma que compite con el anticuerpo intacto por la unión específica, a menos que se especifique lo contrario. Las partes de unión a antígeno pueden producirse mediante técnicas de ADN recombinante o mediante escisión enzimática o química de anticuerpo intactos. Las partes de unión a antígeno incluyen, entre otros, Fab, Fab’, F(ab’)2, Fv, anticuerpos de dominio (dAb), fragmentos incluyendo regiones determinantes de complementariedad (CDR), anticuerpos de cadena sencilla (scFv), anticuerpos quiméricos, diacuerpos, triacuerpos, tetracuerpos, y polipéptidos que contienen al menos una parte de una inmunoglobulina que es suficiente para conferir unión a antígeno específica al polipéptido.

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5 Un fragmento Fab es un fragmento monovalente que tiene los dominios VL, VH, CL y CH1; un fragmento F(ab’)2 es un fragmento bivalente que tiene dos fragmentos Fab unidos mediante un puente disulfuro en la región de bisagra; un fragmento Fd tiene los dominios VH y CH1; un fragmento Fv tiene los dominios VL y VH de un único brazo de un anticuerpo; y un fragmento dAb tiene un dominio VH, un dominio VL, o un fragmento de unión a antígeno de un dominio VH o VL (patentes estadounidenses n.os 6.846.634, 6.696.245, solicitudes de patente estadounidense n.os

10 05/0202512, 04/0202995, 04/0038291, 04/0009507, 03/0039958, Ward et al., Nature 341:544-546 (1989)).

Un anticuerpo de cadena sencilla (scFv) es un anticuerpo en el que una región VL y una región VH se unen a través de un ligador (por ejemplo, una secuencia sintética de residuos de aminoácido) para formar una cadena de proteína continua en la que el ligador es suficientemente largo como para permitir que la cadena de proteína se pliegue sobre sí misma y forme un sitio de unión a antígeno monovalente (véase, por ejemplo, Bird et al., Science 242:423-26 15 (1988) y Huston et al., 1988, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-83 (1988)). Los diacuerpos son anticuerpos bivalentes que comprenden dos cadenas polipeptídicas, en los que cada cadena polipeptídica comprende dominios VH y VL unidos mediante un ligador que es demasiado corto para permitir el emparejamiento entre dos dominios en la misma cadena, permitiendo así que cada dominio se empareje con un dominio complementario en otra cadena polipeptídica (véase, por ejemplo, Holliger et al., 1993, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:6444-48 (1993), y Poljak et al., 20 Estructura 2:1121-23 (1994)). Si las dos cadenas polipeptídicas de un diacuerpo son idénticas, entonces un diacuerpo resultante de su emparejamiento tendrá dos sitios de unión a antígeno idénticos. Pueden usarse cadenas polipeptídicas que tienen secuencias diferentes para producir un diacuerpo con dos sitios de unión a antígeno diferentes. De manera similar, los tricuerpos y tetracuerpos son anticuerpos que comprenden tres y cuatro cadenas polipeptídicas, respectivamente, y que forman tres y cuatro sitios de unión a antígeno, respectivamente, que pueden

25 ser iguales o diferentes.

Las regiones determinantes de complementariedad (CDR) y las regiones de marco (FR) de un anticuerpo dado pueden identificarse usando el sistema descrito por Kabat et al. en Sequences of Proteins of Immunological Interst, 5ª ed., Departamento de Salud y Servicios Humanos de EE.UU., PHS, NIH, publicación de los NIH n.º 91-3242, 1991. Según se desee, las CDR también pueden redefinirse según un esquema de nomenclatura alternativo, tal 30 como el de Chothia (véase Chothia & Lesk, 1987, J. Mol. Biol. 196:901-917; Chothia et al., 1989, Nature 342:878883 o Honegger & Pluckthun, 2001, J. Mol. Biol. 309:657-670. Una o más CDR pueden incorporarse en una molécula o bien covalentemente o bien no covalentemente para convertirla en una proteína de unión a antígeno. Una proteína de unión a antígeno puede incorporar la(s) CDR como parte de una cadena polipeptídica mas grande, puede unir covalentemente la(s) CDR a otra cadena polipeptídica, o puede incorporar la(s) CDR no covalentemente.

35 Las CDR permiten que la proteína de unión a antígeno se una específicamente a un antígeno particular de interés.

Una proteína de unión a antígeno puede tener uno o más sitios de unión. Si hay más de un sitio de unión, los sitios de unión pueden ser idénticos entre sí o pueden ser diferentes. Por ejemplo, una inmunoglobulina humana que se produce de manera natural tiene normalmente dos sitios de unión idénticos, mientras que un anticuerpo “biespecífico” o “bifuncional” tiene dos sitios de unión diferentes.

40 El término “anticuerpo humano” incluye todos los anticuerpos que tienen una o más regiones variables y constantes derivadas de secuencias de inmunoglobulina humana. En una realización todos los dominios variables y constantes se derivan de secuencias de inmunoglobulina humana (un anticuerpo completamente humano). Estos anticuerpos pueden prepararse de una variedad de maneras, ejemplos de las cuales se describen a continuación, incluyendo a través de la inmunización con un antígeno de interés de un ratón que se modifica genéticamente para expresar

45 anticuerpos derivados de genes que codifican para cadena pesadas y/o ligeras humanas, tal como un ratón derivado de un sistema Xenomouse®, UltiMab™ o Velocimmune®. También pueden emplearse enfoques basados en fagos.

Un anticuerpo humanizado tiene una secuencia que difiere de la secuencia de un anticuerpo derivado de una especie no humana mediante una o más sustituciones, deleciones y/o adiciones de aminoácidos, de modo que el anticuerpo humanizado es menos probable que induzca una respuesta inmunitaria y/o induce una respuesta 50 inmunitaria menos intensa, en comparación con el anticuerpo de especie no humana, cuando se administra a un sujeto humano. En una realización, ciertos aminoácidos en las regiones de marco y dominios constantes de las cadenas pesadas y/o ligeras del anticuerpo de especie no humana se mutan para producir el anticuerpo humanizado. En otra realización, el/los dominio(s) constante(s) de un anticuerpo humano se fusionan al/a los dominio(s) variable(s) de una especie no humana. En otra realización, uno o más residuos de aminoácido en una o 55 más secuencias de CDR de un anticuerpo no humano se cambian para reducir la inmunogenicidad probable del anticuerpo no humano cuando se administra a un sujeto humano, en el que los residuos de aminoácido cambiados o bien no son críticos para la unión inmunoespecífica del anticuerpo a su antígeno, o bien los cambios en la secuencia de aminoácidos que se producen son cambios conservativos, de modo que la unión del anticuerpo humanizado al antígeno no es significativamente peor que la unión del anticuerpo no humano al antígeno. Pueden encontrarse 60 ejemplos de cómo producir anticuerpos humanizados en las patentes estadounidenses n.os 6.054.297, 5.886.152 y

5.877.293.

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El término “anticuerpo quimérico” se refiere a un anticuerpo que contiene una o más regiones de un anticuerpo y una

o más regiones de uno o más anticuerpos distintos.

El término “cadena ligera” incluye una cadena ligera de longitud completa y fragmentos de la misma que tienen una secuencia de región variable suficiente para conferir especificidad de unión. Una cadena ligera de longitud completa

5 incluye un dominio de región variable, VL, y un dominio de región constante, CL. El dominio de región variable de la cadena ligera está en el extremo amino-terminal del polipéptido. Las cadenas ligeras incluyen cadenas kappa (“κ”) y cadenas lambda (“λ”).

El término “cadena pesada” incluye una cadena pesada de longitud completa y fragmentos de la misma que tienen una secuencia de región variable suficiente para conferir especificidad de unión. Una cadena pesada de longitud

10 completa incluye un dominio de región variable, VH, y tres dominios de región constante, CH1, CH2 y CH3. El dominio VH está en el extremo amino-terminal del polipéptido, y los dominios CH están en el extremo carboxilo-terminal, siendo el CH3 el más cercano al extremo carboxilo-terminal del polipéptido. Las cadenas pesadas pueden ser de cualquier isótopo, incluyendo IgG (incluyendo los subtipos IgG1, IgG2, IgG3 y IgG4), IgA (incluyendo los subtipos IgA1 y IgA2), IgM e IgE.

15 El término “fragmento inmunológicamente funcional” (o simplemente “fragmento”) de una proteína de unión a antígeno, por ejemplo, una cadena de anticuerpo o inmunoglobulina (cadena pesada o ligera), tal como se usa en el presente documento, es una proteína de unión a antígeno que comprende una parte (independientemente de cómo se obtiene o sintetiza esa parte) de un anticuerpo que carece de al menos alguno de los aminoácidos presentes en una cadena de longitud completa pero que puede unirse específicamente a un antígeno. Tales fragmentos son

20 biológicamente activos porque se unen específicamente al antígeno diana y puede competir con otras proteínas de unión a antígeno, incluyendo anticuerpos intactos, por la unión específica a un epítopo dado. En un aspecto, un fragmento de este tipo conservará al menos una CDR presente en la cadena ligera o pesada de longitud completa, y en algunas realizaciones comprenderá una cadena pesada y/o cadena ligera única o una parte de la misma. Estos fragmentos biológicamente activos pueden producirse mediante técnicas de ADN recombinante, o pueden

25 producirse mediante escisión enzimática o química de proteínas de unión a antígeno, incluyendo anticuerpo intactos. Los fragmentos de inmunoglobulina inmunologicamente funcionales incluyen, pero no se limitan a, Fab, Fab’, F(ab’)2, Fv, anticuerpos de dominio y anticuerpos de cadena sencilla, y pueden derivarse de cualquier fuente de mamífero, incluyendo pero sin limitarse a ser humano, ratón, rata, camélido o conejo. Se contempla adicionalmente que una parte funcional de las proteínas de unión a antígeno dadas a conocer en el presente documento, por ejemplo, una o

30 más CDR, podrían unirse covalentemente a una segunda proteína o a una molécula pequeña para crear un agente terapéutico dirigido a una diana particular en el cuerpo, que presenta propiedades terapéuticas bifuncionales, o que tiene una semivida sérica prolongada.

Una región “Fc” contiene dos fragmentos de cadena pesada que comprenden los dominios CH2 y CH3 de un anticuerpo. Los dos fragmentos de cadena pesada se mantienen juntos mediante dos o más enlaces disulfuro y

35 mediante interacciones hidrófobas de los dominios CH3.

Un “fragmento Fab’” contiene una cadena ligera y una parte de una cadena pesada que contiene el dominio VH y el dominio CH1 y también la región entre los dominios CH1 y CH2, de modo que puede formarse un enlace disulfuro intercatenario entre las dos cadenas pesadas de dos fragmentos Fab’ para formar una molécula de F(ab’)2.

Un “fragmento F(ab’)2” contiene dos cadenas ligeras y dos cadenas pesadas que contienen una parte de la región

40 constante entre los dominios CH1 y CH2, de modo que se forma un enlace disulfuro intercatenario entre las dos cadenas pesadas. Un fragmento F(ab’)2 se compone así de dos fragmentos Fab que se mantienen juntos mediante un enlace disulfuro entre las dos las cadenas pesadas.

La “región Fv” comprende las regiones variables de tanto las cadenas pesadas como ligeras, pero carece de las regiones constantes.

45 Un “anticuerpo de dominio” es un fragmento de inmunoglobulina inmunologicamente funcional que contiene solo la región variable de una cadena pesada o la región variable de una cadena ligera. En algunos casos, dos o más regiones VH se unen covalentemente con un ligador peptídico para crear un anticuerpo de dominio bivalente. Las dos regiones VH de un anticuerpo de dominio bivalente pueden dirigirse a los mismos o a diferentes antígenos.

Un “hemicuerpo” es un constructo de inmunoglobulina inmunologicamente funcional que comprende una cadena

50 pesada completa, una cadena ligera completa y una segunda región Fc de cadena pesada emparejada con la región Fc de la cadena pesada completa. Puede emplearse un ligador, aunque no es necesario, para unir la región Fc de cadena pesada y la segunda región Fc de cadena pesada. En realizaciones particulares un hemicuerpo es una forma monovalente de una proteína de unión a antígeno dada a conocer en el presente documento. En otras realizaciones, pueden emplearse pares de residuos cargados para asociar una región Fc con la segunda región Fc.

55 La segunda región Fc de cadena pesada puede comprender, por ejemplo, SEQ ID NO:441 y puede unirse a la cadena ligera a través de un ligador (por ejemplo, SEQ ID NO:440). Una cadena pesada de hemicuerpo a modo de ejemplo comprende la secuencia SEQ ID NO:453.

Una “proteína de unión a antígeno bivalente” o “anticuerpo bivalente” comprende dos sitios de unión a antígeno. En algunos casos, los dos sitios de unión tienen las mismas especificidades de antígeno. Las proteínas de unión a antígeno bivalentes y los anticuerpos bivalentes pueden ser biespecíficos, tal como se describe en el presente documento.

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Una proteína de unión a antígeno multiespecífica” o “anticuerpo multiespecífico” es uno que se dirige a más de un 5 antígeno o epítopo.

Una proteína de unión a antígeno o anticuerpo “biespecífico”, “de doble especificidad” o “bifuncional” es una proteína de unión a antígeno o anticuerpo híbrido, respectivamente, que tiene dos sitios de unión a antígeno diferentes. Las proteínas de unión a antígeno y anticuerpos biespecíficos son una especie de proteína de unión a antígeno multiespecífica o anticuerpo multiespecífico y pueden producirse mediante una variedad de métodos incluyendo,

10 pero sin limitarse a, fusión de hibridomas o unión de fragmentos Fab’. Véanse, por ejemplo, Songsivilai y Lachmann, 1990, Clin. Exp. Immunol. 79:315-321; Kostelny et al., 1992, J. Immunol. 148:1547-1553. Los dos sitios de unión de una proteína de unión a antígeno o anticuerpo biespecífico se unirán a dos epítopos diferentes, que pueden residir en las mismas o diferentes dianas proteicas.

Los términos “señalización de tipo FGF21” e “induce señalización de tipo FGF21”, cuando se aplican a una proteína

15 de unión a antígeno de la presente divulgación, significan que la proteína de unión a antígeno imita, o modula, un efecto biológico in vivo inducido mediante la unión de (i) β-Klotho; (ii) FGFR1c, FGFR2c, FGFR3c o FGFR4; o (iii) un complejo que comprende β-Klotho y uno de FGFR1c, FGFR2c, FGFR3c y FGFR4 e induce una repuesta biológica que de otro modo resultaría de la unión de FGF21 a (i) β-Klotho; (ii) FGFR1c, FGFR2c, FGFR3c o FGFR4; o (iii) un complejo que comprende β-Klotho y uno de FGFR1c, FGFR2c, FGFR3c y FGFR4 in vivo. Al evaluar la unión y

20 especificidad de una proteína de unión a antígeno, por ejemplo, un anticuerpo o fragmento inmunológicamente funcional del mismo, un anticuerpo o fragmento se considera que induce una repuesta biológica cuando la respuesta es igual a o mayor del 5%, y preferiblemente igual a o mayor del 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90% o 95%, de la actividad de un patrón de FGF21 silvestre que comprende la forma madura de la SEQ ID NO:2 (es decir, la forma madura de la secuencia de FGF21 humana) y tiene las

25 siguientes propiedades: presenta un nivel de eficacia de igual a o más del 5% de un patrón de FGF21, con una CE50 de igual a o menor de 100 nM, por ejemplo, 90 nM, 80 nM, 70 nM, 60 nM, 50 nM, 40 nM, 30 nM, 20 nM o 10 nM en (1) el ensayo de luciferasa-célula indicadora mediado por el receptor de FGF21 recombinante del ejemplo 5;

(2) fosforilación de ERK en el ensayo celular mediado por el receptor de FGF21 recombinante del ejemplo 5; y (3) fosforilación de ERK en adipocitos humanos tal como se describe en el ejemplo 7. La “potencia” de una proteína de

30 unión a antígeno se define como que muestra una CE50 de igual a o menor de 100 nM, por ejemplo, 90 nM, 80 nM, 70 nM, 60 nM, 50 nM, 40 nM, 30 nM, 20 nM, 10 nM y preferiblemente menor de 10 nM de la proteína de unión a antígeno en los siguientes ensayos: (1) el ensayo de luciferasa-célula indicadora mediado por el receptor de FGF21 recombinante del ejemplo 5; (2) la fosforilación de ERK en el ensayo celular mediado por el receptor de FGF21 recombinante del ejemplo 5; y (3) fosforilación de ERK en adipocitos humanos tal como se describe en el ejemplo 7.

35 Se observa que no todas las proteínas de unión a antígeno de la presente divulgación inducen señalización mediada por FGF21, ni es deseable esta propiedad en todas las circunstancias. No obstante, las proteínas de unión a antígeno que no inducen señalización mediada por FGF21 forman aspectos de la presente divulgación y pueden ser útiles como reactivos de diagnóstico u otras aplicaciones.

Tal como se usa en el presente documento, el término “FGF21R” significa un complejo de receptor multimérico que

40 se conoce o se sospecha que forma in vivo FGF21. En diversas realizaciones, FGF21R comprende (i) un FGFR, por ejemplo, FGFR1c, FGFR2c, FGFR3c o FGFR4, y (ii) β-Klotho.

El término “polinucleótido” o “ácido nucleico” incluye tanto polímeros de nucleótidos monocatenarios como bicatenarios. Los nucleótidos que comprende el polinucleótido pueden ser ribonucleótidos o desoxirribonucleótidos o una forma modificada de cualquier tipo de nucleótido. Dichas modificaciones incluyen modificaciones de bases tales

45 como derivados de bromouridina e inosina, modificaciones de ribosa tales como 2’, 3’-didesoxirribosa, y modificaciones de unión internucleotídica tales como fosforotioato, fosforoditioato, fosforoselenoato, fosforodiselenoato, fosforoanilotioato, fosforaniladato y fosforoamidato.

El término “oligonucleótido” significa un polinucleótido que comprende 200 nucleótidos o menos. En algunas realizaciones, los oligonucleótidos tienen de 10 a 60 bases de longitud. En otras realizaciones, los oligonucleótidos 50 tienen de 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, o de 20 a 40 nucleótidos de longitud. Los oligonucleótidos pueden ser de monocatenarios o bicatenarios, por ejemplo, para su uso en la construcción de un gen mutante. Los oligonucleótidos pueden ser oligonuclótidos sentido y antisentido. Un oligonucleótido puede incluir un marcador, incluyendo un radiomarcador, un marcador fluorescente, un marcador de hapteno o antigénico, para ensayos de detección. Los oligonucleótidos pueden usarse, por ejemplo, como cebadores de PCR, cebadores de clonación o sondas de

55 hibridización.

Una “molécula de ácido nucleico aislada” significa un ADN o ARN de origen genómico, ARNm, ADNc o sintético o alguna combinación de los mismos que no está asociada con todo o una parte de un polinucleótido en el que el polinucleótido aislado se encuentra en la naturaleza, o está unido a un polinucleótido al que no está unido en la naturaleza. Para los propósitos de esta divulgación, se entiende que “una molécula de ácido nucleico que comprende” una secuencia de nucleótidos particular no abarca cromosomas intactos. Las moléculas de ácido nucleico aisladas “que comprenden” secuencias de ácido nucleico especificadas pueden incluir, además de las secuencias especificadas, secuencias codificantes de hasta diez o incluso hasta veinte proteínas distintas o partes de las mismas, o pueden incluir secuencias reguladoras operativamente unidas que controlan la expresión de la

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5 región codificante de las secuencias de ácido nucleico mencionadas y/o pueden incluir secuencias de vectores.

A menos que se especifique lo contrario, el extremo izquierdo de cualquier secuencia de polinucleótido monocatenaria comentada en el presente documento es el extremo 5’; el sentido hacia la izquierda de secuencias de polinucleótido bicatenarias se denomina sentido 5’. El sentido de adición de 5’ a 3’ de transcritos de ARN nacientes se denomina como sentido de transcripción; las regiones de secuencia en la hebra de ADN que tienen la

10 misma secuencia que el transcrito de ARN que están en 5’ con respecto al extremo 5’ del transcrito de ARN se denominan “secuencias en el sentido de 5’;” las regiones de secuencia en la hebra de ADN que tienen la misma secuencia que el transcrito de ARN que está en 3’ con respecto al extremo 3’ del transcrito de ARN se denominan “secuencias en el sentido de 3’”.

El término “secuencia de control” se refiere a una secuencia de polinucleótido que puede afectar a la expresión y

15 procesamiento de secuencias codificantes a las que está unida. La naturaleza de tales secuencias de control puede depender del organismo huésped. En realizaciones particulares, las secuencias de control para procariotas pueden incluir un promotor, un sitio de unión al ribosoma y una secuencia de terminación de la transcripción. Por ejemplo, las secuencias de control para eucariotas pueden incluir promotores que comprenden uno o una pluralidad de sitios de reconocimiento para factores de transcripción, secuencias potenciadoras de la transcripción y secuencia de

20 terminación de la transcripción. Las “secuencias de control” pueden incluir secuencias líder y/o secuencias de pareja de fusión.

El término “vector” significa cualquier molécula o entidad (por ejemplo, ácido nucleico, plásmido, bacteriófago o virus) usada para transferir información de codificación de proteínas al interior de una célula huésped.

El término “vector de expresión” o “constructo de expresión” se refiere a un vector que es adecuado para la

25 transformación de una célula huésped y contiene secuencias de ácido nucleico que dirigen y/o controlan (junto con la célula huésped) la expresión de una o más regiones codificantes heterólogas operativamente unidas a las mismas. Un constructo de expresión puede incluir, pero no se limita a, secuencias que afectan a o controlan la transcripción, traducción y, si están presentes intrones, afectan al corte y empalme de ARN de una región codificante operativamente unida a las mismas.

30 Tal como se usa en el presente documento, “operativamente unido” significa que los componentes a los que se aplica el término están en una relación que les permite llevar a cabo sus funciones inherentes en condiciones adecuadas. Por ejemplo, una secuencia de control en un vector que esta “operativamente unido” a una secuencia codificante de proteínas está ligada a la misma de modo que se logra la expresión de la secuencia codificante de proteínas en condiciones compatibles con la actividad transcripcional de las secuencias de control.

35 El término “célula huésped” significa una célula que se ha transformado, o que puede transformarse, con una secuencia de ácido nucleico y de ese modo expresar un gen de interés. El término incluye la descendencia de la célula parental, independientemente de que la descendencia sea idéntica en morfología o en composición genética a la célula madre original, siempre y cuando el gen de interés esté presente.

El término “transducción” significa la transferencia de genes de una bacteria a otra, habitualmente mediante un

40 bacteriófago. La “transducción” también se refiere a la adquisición y transferencia de secuencias celulares eucariotas mediante replicación de retrovirus de replicación defectuosa.

El término “transfección” significa la captación de ADN foráneo o exógeno por una célula, y una célula se ha “transfectado” cuando el ADN exógeno se ha introducido dentro de la membrana celular. Se conocen bien en la técnica varias técnicas de transfección y se dan a conocer en el presente documento. Véanse, por ejemplo, Graham

45 et al., (1973) Virology 52:456; Sambrook et al., (2001) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, citado anteriormente; Davis et al., (1986) Basic Methods in Molecular Biology, Elsevier; Chu et al., (1981) Gene 13:197. Tales técnicas pueden usarse para introducir uno o más restos de ADN exógeno en células huésped adecuadas.

El término “transformación” se refiere a un cambio en las características genéticas de una célula, y una célula se ha transformado cuando se ha modificado para contener ADN o ARN nuevo. Por ejemplo, una célula se transforma 50 cuando se modifica genéticamente con respecto a su estado nativo introduciendo nuevo material genético a través de transfección, transducción u otras técnicas. Después de la transfección o transducción, el ADN transformante puede recombinarse con el de la célula integrándose físicamente en un cromosoma de la célula o puede mantenerse transitoriamente como un elemento episomal sin replicarse o puede replicarse independientemente como un plásmido. Se considera que una célula se ha “transformado de manera estable” cuando el ADN transformante se

55 replica con la división de la célula.

Los términos “polipéptido” o “proteína” se usan de manera intercambiable en el presente documento para referirse a un polímero de residuos de aminoácido. Los términos también se aplican a polímeros de aminoácidos en los que uno o más residuos de aminoácido es un análogo o mimético de un aminoácido que se produce de manera natural

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correspondiente, así como a polímeros de aminoácidos que se producen de manera natural. Los términos también pueden abarcar polímeros de aminoácidos que se han modificado, por ejemplo, mediante la adición de residuos de hidratos de carbono para formar glicoproteínas, o se han fosforilado. Los polipéptidos y las proteínas pueden producirse mediante una célula no recombinante y que se produce de manera natural, o pueden producirse polipéptidos y proteínas mediante una célula recombinante o modificada por ingeniería genética. Los polipéptidos y las proteínas pueden comprender moléculas que tienen la secuencia de aminoácidos de una proteína nativa o moléculas que tienen deleciones de, adiciones a y/o sustituciones de uno o más aminoácidos de la secuencia nativa. Los términos “polipéptido” y “proteína” abarcan proteínas de unión a antígeno que se unen específica o selectivamente a (i) β-Klotho; (ii) FGFR1c, FGFR2c, FGFR3c o FGFR4; o (iii) un complejo que comprende β-Klotho y uno de FGFR1c, FGFR2c, FGFR3c y FGFR4 o secuencias que tienen deleciones de, adiciones a y/o sustituciones de uno o más aminoácidos de una proteína de unión a antígeno que se une específica o selectivamente a (i) β-Klotho; (ii) FGFR1c, FGFR2c, FGFR3c o FGFR4; o (iii) un complejo que comprende β-Klotho y uno de FGFR1c, FGFR2c, FGFR3c y FGFR4. El término “fragmento de polipéptido” se refiere a un polipéptido que tiene una deleción amino-terminal, una deleción carboxilo-terminal y/o una deleción interna en comparación con la proteína de longitud completa. Tales fragmentos también pueden contener aminoácidos modificados en comparación con la proteína de longitud completa. En determinadas realizaciones, los fragmentos tienen de aproximadamente cinco a 500 aminoácidos de longitud. Por ejemplo, los fragmentos pueden tener al menos 5, 6, 8, 10, 14, 20, 50, 70, 100, 110, 150, 200, 250, 300, 350, 400 ó 450 aminoácidos de longitud. Los fragmentos de polipéptido útiles incluyen fragmentos inmunológicamente funcionales de anticuerpos, incluyendo dominios de unión. En el caso de una proteína de unión a antígeno que se une a (i) β-Klotho; (ii) FGFR1c, FGFR2c, FGFR3c o FGFR4; o (iii) un complejo que comprende β-Klotho y uno de FGFR1c, FGFR2c, FGFR3c y FGFR4, los fragmentos útiles incluyen pero no se limitan a una región CDR, un dominio variable de una cadena pesada o ligera, una parte de una cadena de anticuerpo o simplemente su región variable incluyendo dos CDR, y similares.

El término “proteína aislada” hace referencia a que una proteína del sujeto (1) está libre de al menos algunas otras proteínas con las que normalmente se encontraría, (2) está esencialmente libre de otras proteínas de la misma fuente, por ejemplo, de la misma especie, (3) se expresa por una célula de una especie diferente, (4) se ha separado de al menos aproximadamente el 50 por ciento de los polinucleótidos, lípidos, hidratos de carbono u otros materiales con los que está asociada en la naturaleza, (5) está operativamente asociada (mediante interacción covalente o no covalente) con un polipéptido con el que no está asociada en la naturaleza o (6) no se produce en la naturaleza. Normalmente, una “proteína aislada” constituye al menos aproximadamente el 5%, al menos aproximadamente el 10%, al menos aproximadamente el 25% o al menos aproximadamente el 50% de una muestra dada. El ADN genómico, ADNc, ARNm u otro ARN, de origen sintético, o cualquier combinación de los mismos puede codificar para una proteína aislada de este tipo. Preferiblemente, la proteína aislada está sustancialmente libre de proteínas o polipéptidos u otros contaminantes que se encuentran en su entorno natural que interferirían con su uso terapéutico, de diagnóstico, profiláctico, de investigación u otros.

Una “variante” de un polipéptido (por ejemplo, una proteína de unión a antígeno o un anticuerpo) comprende una secuencia de aminoácidos en la que uno o más residuos de aminoácido se insertan en, se delecionan de y/o se sustituyen en la secuencia de aminoácidos en relación con otra secuencia de polipéptido. Las variantes incluyen proteínas de fusión.

Un “derivado” de un polipéptido es un polipéptido (por ejemplo, una proteína de unión a antígeno, o un anticuerpo) que se ha modificado químicamente de alguna manera distinta de variantes de inserción, deleción o sustitución, por ejemplo, mediante conjugación con otro resto químico.

El término “que se produce de manera natural” tal como se usa a lo largo de toda la memoria descriptiva en relación con materiales biológicos tales como polipéptidos, ácidos nucleicos, células huésped, y similares, se refiere a materiales que se encuentran en la naturaleza.

“Región de unión a antígeno” significa una proteína, o una parte de una proteína, que se une específicamente a un antígeno especificado, por ejemplo, FGFR1c, β-Klotho o tanto FGFR1c como β-Klotho. Por ejemplo, la parte de una proteína de unión a antígeno que contiene los residuos de aminoácido que interaccionan con un antígeno y confiere a la proteína de unión a antígeno su especificidad y afinidad por el antígeno se denomina “región de unión a antígeno”. Una región de unión a antígeno normalmente incluye una o más “regiones de unión complementaria” (“CDR”). Determinadas regiones de unión a antígeno también incluyen una o más “regiones de marco”. Una “CDR” es una secuencia de aminoácidos que contribuye a la especificidad y afinidad de unión al antígeno. Las “regiones de marco” pueden ayudar a mantener la conformación apropiada de las CDR para promover la unión entre la región de unión a antígeno y un antígeno.

En determinados aspectos, se proporcionan proteínas de unión a antígeno recombinantes que se unen a (i) β-Klotho; (ii) FGFR1c, FGFR2c, FGFR3c o FGFR4; o (iii) un complejo que comprende β-Klotho y uno de FGFR1c, FGFR2c, FGFR3c y FGFR4. En este contexto, una “proteína recombinante” es una proteína producida usando técnicas recombinantes, es decir, a través de la expresión de un ácido nucleico recombinante tal como se describe en el presente documento. Métodos y técnicas para la producción de proteínas recombinantes se conocen bien en la técnica.

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El término “competir” cuando se usa en el contexto de proteínas de unión a antígeno (por ejemplo, proteínas de unión a antígeno neutralizantes, anticuerpos neutralizantes, proteínas de unión a antígeno agonistas, anticuerpos agonistas y proteínas de unión que se unen a (i) β-Klotho; (ii) FGFR1c, FGFR2c, FGFR3c o FGFR4; o (iii) un complejo que comprende β-Klotho y uno de FGFR1c, FGFR2c, FGFR3c y FGFR4) que compiten por el mismo epítopo o sitio de unión en una diana, significa la competición entre proteínas de unión a antígeno tal como se determina mediante un ensayo en el que la proteína de unión a antígeno (por ejemplo, anticuerpo o fragmento inmunológicamente funcional del mismo) en estudio impide o inhibe la unión específica de una molécula de referencia (por ejemplo, un ligando de referencia o proteína de unión a antígeno de referencia, tal como un anticuerpo de referencia) a un antígeno común (por ejemplo, FGFR1c, FGFR2c, FGFR3c, FGFR4, β-Klotho o un fragmento del mismo). Pueden usarse numerosos tipos de ensayos de unión competitiva para determinar si una molécula de prueba compite con una molécula de referencia por la unión. Los ejemplos de ensayos que pueden emplearse incluyen radioinmunoensayo indirecto o directo en fase sólida (RIA), inmunoensayo enzimático indirecto o directo en fase sólida (EIA), ensayo de competición de tipo sándwich (véase, por ejemplo, Stahli et al., (1983) Methods in Enzymology 9:242-253); EIA de biotina-avidina directo en fase sólida (véase, por ejemplo, Kirkland et al., (1986) J. Immunol. 137:3614-3619) ensayo de marcado directo en fase sólida, ensayo de tipo sándwich de marcado directo en fase sólida (véase, por ejemplo, Harlow y Lane, (1988) Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press); RIA de marcador directo en fase sólida usando el marcador I-125 (véase, por ejemplo, Morel et al., (1988) Molec. Immunol. 25:7-15); EIA de biotina-avidina directo en fase sólida (véase, por ejemplo, Cheung, et al., (1990) Virology 176:546-552); y RIA de marcado directo (Moldenhauer et al., (1990) Scand. J. Immunol. 32:77-82). Normalmente, un ensayo de este tipo implica el uso de un antígeno purificado unido a una superficie sólida o células que portan cualquiera de una proteína de unión a antígeno de prueba no marcada o una proteína de unión a antígeno de referencia marcada. La inhibición competitiva se mide determinando la cantidad de marcador unido a la superficie sólida o células en presencia de la proteína de unión a antígeno de prueba. Habitualmente la proteína de unión a antígeno de prueba está presente en exceso. Las proteínas de unión a antígeno identificadas mediante el ensayo de competición (proteínas de unión a antígeno competidoras) incluyen proteínas de unión a antígeno que se unen al mismo epítopo que las proteínas de unión a antígeno de referencia y proteínas de unión a antígeno que se unen a un epítopo adyacente suficientemente próximo al epítopo al que se une la proteína de unión a antígeno de referencia como para que se produzca impedimento estérico. Se proporcionan detalles adicionales con respecto a métodos para determinar la unión competitiva en los ejemplos en el presente documento. Habitualmente, cuando una proteína de unión a antígeno competidora está presente en exceso, inhibirá la unión específica de una proteína de unión a antígeno de referencia a un antígeno común en al menos el 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70% o 75%. En algún caso, la unión se inhibe en al menos el 80%, 85%, 90%, 95% o 97% o más.

El término “antígeno” se refiere a una molécula o una parte de una molécula a la que puede unirse un agente de unión selectiva, tal como una proteína de unión a antígeno (incluyendo, por ejemplo, un anticuerpo o fragmento funcional inmunológico del mismo), y también puede usarse en un animal para producir anticuerpos que pueden unirse a ese antígeno. Un antígeno puede presentar uno o más epítopos que pueden interaccionar con diferentes proteínas de unión a antígeno, por ejemplo, anticuerpos.

El término “epítopo” significa los aminoácidos de una molécula diana que están en contacto con una proteína de unión a antígeno (por ejemplo, un anticuerpo) cuando la proteína de unión a antígeno se une a la molécula diana. El término incluye cualquier subconjunto de la lista completa de aminoácidos de la molécula diana que están en contacto cuando una proteína de unión a antígeno, tal como un anticuerpo, se une a la molécula diana. Un epítopo puede ser contiguo o no contiguo (por ejemplo, (i) en un polipéptido de cadena sencilla, residuos de aminoácido que no son contiguos entre sí en la secuencia de polipéptido pero a los que dentro del contexto de la molécula diana se une la proteína de unión a antígeno, o (ii) en un receptor multimérico que comprende dos o más componentes individuales, por ejemplo, (i) FGFR1c, FGFR2c, FGFR3c o FGFR4, y (ii) β-Klotho, residuos de aminoácido que están presentes en uno o más de los componentes individuales, pero a los que todavía se une la proteína de unión a antígeno). En determinadas realizaciones, los epítopos pueden ser miméticos en el sentido de que comprendeb una estructura tridimensional que es similar a un epítopo antigénico usado para generar la proteína de unión a antígeno, pero que no comprende ninguno o sólo alguno de los residuos de aminoácido encontrados en ese epítopo usado para generar la proteína de unión a antígeno. Lo más a menudo, los epítopos residen en proteínas, pero en algunos casos pueden residir en otras clases de moléculas, tales como ácidos nucleicos. Los determinantes epitópicos pueden incluir agrupaciones de superficie químicamente activas de moléculas tales como aminoácidos, cadenas laterales de azúcar, grupos fosforilo o sulfonilo, y pueden tener características estructurales tridimensionales específicas y/o características de carga específicas. Generalmente, las proteínas de unión a antígeno específicas para una molécula diana particular reconocerán preferentemente un epítopo en la molécula diana en una mezcla compleja de proteínas y/o macromoléculas.

El término “identidad” se refiere a una relación entre las secuencias de dos o más moléculas de polipéptido o dos o más moléculas de ácido nucleico, tal como se determina alineando y comparando las secuencias. “Porcentaje de identidad” significa el porcentaje de residuos idénticos entre los aminoácidos o nucleótidos en las moléculas comparadas y se calcula basándose en el tamaño de las más pequeñas de las moléculas que se comparan. Para estos cálculos, los huecos en alineaciones (si los hay) deben abordarse mediante un modelo matemático o programa informático particular (es decir, un “algoritmo”). Los métodos que pueden usarse para calcular la identidad de los ácidos nucleicos o polipéptidos alineados incluyen aquellos descritos en Computational Molecular Biology, 5 1991, Nueva York: M. Stockton Press; y Carillo et al., (1988) SIAM J. Applied Math. 48:1073.

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Al calcular el porcentaje de identidad, las secuencias que se comparan se alinean de una manera que proporcione la mayor coincidencia entre las secuencias. El programa informático usado para determinar el porcentaje de identidad es el paquete de programas GCG, que incluye GAP (Devereux et al., (1984) Nucl. Acid Res. 12:387; Genetics Computer Group, Universidad de Wisconsin, Madison, WI). El algoritmo informático GAP se usa para alinear los dos 10 polipéptidos o polinucleótidos para los que va a determinarse el porcentaje de identidad de secuencia. Las secuencias se alinean para lograr una coincidencia óptima de su aminoácido o nucleótido respectivo (el “tramo coincidente”, tal como se determina mediante el algoritmo). Se usan junto con el algoritmo una penalización por apertura de hueco (que se calcula como 3x la diagonal promedio, en el que la “diagonal promedio” es el promedio de la diagonal de la matriz de comparación que se usa; la “diagonal” es la puntuación o el número asignado a cada 15 coincidencia de aminoácidos perfecta mediante la matriz de comparación particular) y una penalización por extensión de hueco (que es habitualmente de 1/10 veces la penalización por apertura de hueco), así como una matriz de comparación tal como PAM 250 o BLOSUM 62. En determinadas realizaciones, el algoritmo también usa una matriz de comparación convencional (véase, Dayhoff et al., (1978) Atlas of Protein Sequence and Structure 5:345-352 para la matriz de comparación PAM 250; Henikoff et al., (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 89:10915

20 10919 para la matriz de comparación BLOSUM 62).

Los parámetros recomendados para determinar el porcentaje de identidad para polipéptidos o secuencias de nucleótidos usando el programa GAP son los siguientes:

Algoritmo: Needleman et al., 1970, J. Mol. Biol. 48:443-453;

Matriz de comparación: BLOSUM 62 de Henikoff et al., 1992, citado anteriormente;

25 Penalización por hueco: 12 (pero sin penalización para los huecos de los extremos)

Penalización por longitud del hueco: 4

Umbral de similitud: 0

Determinados esquemas de alineación para alinear dos secuencias de aminoácidos pueden dar como resultado la coincidencia de sólo una región corta de las dos secuencias, y esta pequeña región alineada puede tener una

30 identidad de secuencia muy alta aunque no haya una relación significativa entre las dos secuencias de longitud completa. Por consiguiente, el método de alineación seleccionado (por ejemplo, el programa GAP) puede ajustarse si se desea para dar como resultado una alineación que abarque al menos 50 aminoácidos contiguos del polipéptido diana.

Tal como se usa en el presente documento, “sustancialmente puro” significa que la especie descrita de molécula es

35 la especie predominante presente, es decir, en una base molar es más abundante que cualquier otra especie individual en la misma mezcla. En determinadas realizaciones, una molécula sustancialmente pura es una composición en la que la especie objeto comprende al menos el 50% (en una base molar) de todas las especies macromoleculares presentes. En otras realizaciones, una composición sustancialmente pura comprenderá al menos el 80%, 85%, 90%, 95% o 99% de todas las especies macromoleculares presentes en la composición. En otras

40 realizaciones, la especie objeto se purifica hasta la homogeneidad esencial en la que la especie contaminante no puede detectarse en la composición mediante métodos de detección convencionales y por tanto la composición consiste en una única especie macromolecular detectable.

Los términos “tratar” y “que trata” se refieren a cualquier indicio de éxito en el tratamiento o mejora de una lesión, patología o estado, incluyendo cualquier parámetro objetivo o subjetivo tal como reducción; remisión; disminución de 45 síntomas o hacer que la lesión, patología o estado sea más tolerable al paciente; ralentización o descenso de la tasa de degeneración; hacer que el punto final de degeneración sea menos debilitante; mejorar el bienestar físico o mental del paciente. El tratamiento o mejora de los síntomas puede basarse en parámetros objetivos o subjetivos; incluyendo los resultados de un examen físico, exámenes neuropsiquiátricos y/o una evaluación psiquiátrica. Por ejemplo, determinados métodos presentes en el presente documento pueden emplearse para tratar diabetes tipo 2,

50 obesidad y/o dislipidemia, o bien profilácticamente o bien como un tratamiento agudo, para disminuir los niveles de glucosa en plasma, para disminuir los niveles de triglicéridos circulantes, para disminuir los niveles de colesterol circulantes y/o mejorar un síntoma asociado con diabetes tipo 2, obesidad y dislipidemia.

Una “cantidad eficaz” es generalmente una cantidad suficiente para reducir la gravedad y/o frecuencia de los síntomas, eliminar los síntomas y/o la causa subyacente, prevenir la aparición de síntomas y/o de sus causas 55 subyacentes y/o mejorar o remediar el daño que resulta de o está asociado con diabetes, obesidad y dislipidemia. En algunas realizaciones, la cantidad eficaz es una cantidad terapéuticamente eficaz o una cantidad profilácticamente eficaz. Una “cantidad terapéuticamente eficaz” es una cantidad suficiente para remediar un estado patológico (por ejemplo, diabetes, obesidad o dislipidemia) o síntomas, particularmente un estado o síntomas asociados con el estado patológico, o de otro modo prevenir, dificultar, retardar o revertir la progresión del estado patológico o cualquier otro síntoma no deseado asociado con la enfermedad de cualquier manera que sea. Una “cantidad profilácticamente eficaz” es una cantidad de una composición farmacéutica que, cuando se administra a un 5 sujeto, tendrá el efecto profiláctico previsto, por ejemplo, prevenir o retrasar la aparición (o reaparición) de diabetes, obesidad o dislipidemia, o reducir la probabilidad de la aparición (o reaparición) de diabetes, obesidad o dislipidemia

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o síntomas asociados. El efecto terapéutico o profiláctico completo no se produce necesariamente mediante la administración de una dosis y puede producirse sólo después de la administración de una series de dosis. Por tanto, puede administrarse una cantidad terapéutica o profilácticamente eficaz en una o más administraciones.

10 “Aminoácido” adopta su significado normal en la técnica. Los 20 aminoácidos que se producen de manera natural y sus abreviaturas siguen el uso convencional. Véase, Inmunology-A Synthesis, 2ª edición, (E. S. Golub y D. R. Green, eds.), Sinauer Associates: Sunderland, Mass. (1991), incorporado en el presente documento por referencia para cualquier propósito. Los estereoisómeros (por ejemplo, D-aminoácidos) de los veinte aminoácidos convencionales, aminoácidos no naturales o que no se producen de manera natural tales como aminoácidos α-,α-disustituidos, N

15 alquilaminoácidos y otros aminoácidos no convencionales también pueden ser componentes adecuados para polipéptidos y se incluyen en el término “aminoácido”. Los ejemplos de aminoácidos no naturales (que pueden ser sustitutos para cualquier aminoácido que se produce de manera natural encontrado en cualquier secuencia dada a conocer en el presente documento, tal como se desea) incluyen: 4-hidroxiprolina, λ-carboxiglutamato, ε-N,N,Ntrimetil-lisina, ε-N-acetil-lisina, O-fosfoserina, N-acetilserina, N-formilmetionina, ε-metilhistidina, 5-hidroxilisina, σ-N

20 metilarginina, y otros aminoácidos e iminoácidos similares (por ejemplo, 4-hidroxiprolina). En la notación de polipéptidos usada en el presente documento, el sentido hacia la izquierda es el sentido amino-terminal y el sentido hacia la derecha es el sentido carboxilo-terminal, según la convención y el uso convencionales. Una lista no limitativa de ejemplos de aminoácidos que no se producen de manera natural que pueden insertarse en una secuencia de proteína de unión a antígeno o ser sustitutos para un residuo silvestre en una secuencia de unión a

25 antígeno incluyen β-aminoácidos, homoaminoácidos, aminoácidos cíclicos y aminoácidos con cadenas laterales derivadas. Los ejemplos incluyen (en forma L o forma F; abreviada entre paréntesis): citrulina (Cit), homocitrulina (hCit), Nα-metilcitrulina (NMeCit), Nα-metilhomocitrulina (Nα-MeHoCit), ornitina (Orn), Nα-metilornitina (Nα-MeOrn o NMeOrn), sarcosina (Sar), homolisina (hLys o hK), homoarginina (hArg o hR), homoglutamina (hQ), Nα-metilarginina (NMeR), Nα-metil-leucina (Nα-MeL o NMeL), N-metilhomolisina (NMeHoK), Nα-metilglutamina (NMeQ), norleucina

30 (Nle), norvalina (Nva), 1,2,3,4-tetrahidroisoquinolina (Tic), ácido octahidroindola-2-carboxílico (Oic), 3-(1naftil)alanina (1-Nal), 3-(2-napftil)alanina (2-Nal), 1,2,3,4-tetrahidroisoquinolina (Tic), 2-indanilglicina (IgI), parayodofenilalanina (pI-Phe), para-aminofenilalanina (4AmP o 4-Amino-Phe), 4-guanidinofenilalanina (Guf), glicil-lisina (abreviado “K(Nε-glicil)” o “K(glicil)” o “K(gly)”), nitrofenilalanina (nitrofe), aminofenilalanina (aminofe o Amino-Phe), bencilfenilalanina (bencilfe), ácido λ-carboxiglutámico (λ-carboxiglu), hidroxiprolina (hidroxipro), p-carboxil

35 fenilalanina (Cpa), ácido α-aminoadípico (Aad), Nα-metilvalina (NMeVal), N-α-metil-leucina (NMeLeu), Nαmetilnorleucina (NMeNle), ciclopentilglicina (Cpg), ciclohexilglicina (Chg), acetilarginina (acetilarg), ácido α, βdiaminopropionoico (Dpr), ácido α, λ-diaminobutírico (Dab), ácido diaminopropiónico (Dap), ciclohexilalanina (Cha), 4-metil-fenilalanina (MePhe), β, β-difenilalanina (BiPhA), ácido aminobutírico (Abu), 4-fenil-fenilalanina (o bifenilalanina; 4Bip), ácido α-amino-isobutírico (Aib), beta-alanina, ácido beta-aminopropiónico, N-etilglicina, N

40 etilaspargina, hidroxilisina, alo-hidroxilisina, isodesmosina, alo-isoleucina, N-metilglicina, N-metilisoleucina, Nmetilvalina, 4-hidroxiprolina (Hip), λ-carboxiglutamato, ε-N,N,N-trimetil-lisina, ε-N-acetil-lisina, O-fosfoserina, Nacetilserina, N-formilmetionina, 3-metilhistidina, 5-hidroxilisina, ω-metilarginina, ácido 4-amino-O-ftálico (4APA) y otros aminoácidos similares y formas derivadas de cualquier de los enumerados específicamente.

II. Visión general

45 Una propiedad única de las proteínas de unión a antígeno dadas a conocer en el presente documento es la naturaleza agonista de estas proteínas, específicamente la capacidad para imitar el efecto in vivo de FGF21 y para inducir señalización de tipo FGF21. Más notable y específicamente, algunas de las proteínas de unión a antígeno dadas a conocer en el presente documento inducen señalización de tipo FGF21 en varios ensayos basados en células in vitro, incluyendo el ensayo de indicador de ELK-luciferasa del ejemplo 5 en las siguientes condiciones: (1)

50 la unión a y actividad del receptor de FGF21 es dependiente de β-Klotho; (2) la actividad es selectiva para el complejo FGFR1c/β−Klotho; (3) la unión al FGFR1c/βKlotho desencadena rutas de señalización de tipo FGF21; y (4) la potencia (CE50) es comparable a un patrón de FGF21 silvestre que comprende la forma madura de la SEQ ID NO:2, tal como se mide en los siguientes ensayos basados en células: (1) el ensayo de luciferasa-célula indicadora mediado por el receptor de FGF21 recombinante del ejemplo 5; (2) la fosforilación de ERK en el ensayo celular

55 mediado por el receptor de FGF21 recombinante del ejemplo 5; y (3) fosforilación de ERK en adipocitos humanos tal como se describe en más detalle en el ejemplo 7. Las proteínas de unión a antígeno dadas a conocer, por tanto, se espera que muestren actividades in vivo que concuerdan con la función biológica natural de FGF21. Esta propiedad hace que las proteínas de unión a antígeno dadas a conocer sean productos terapéuticos viables para el tratamiento de enfermedades metabólicas tales como diabetes tipo 2, obesidad, dislipidemia, NASH, enfermedad cardiovascular,

60 síndrome metabólico y en general cualquier enfermedad o estado en el que es deseable imitar o aumentar los efectos in vivo de FGF21.

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En algunas realizaciones de la presente divulgación las proteínas de unión a antígeno proporcionadas pueden comprender polipéptidos en los que una o más regiones determinantes complementarias (CDR) pueden incrustarse y/o unirse. En tales proteínas de unión a antígeno, las CDR pueden incrustarse en una región de “marco”, que orienta la(s) CDR de modo que se logran las propiedades de unión a antígeno apropiadas de la(s) CDR. En general,

5 tales proteínas de unión a antígeno que se proporcionan pueden facilitar o potenciar la interacción entre FGFR1c y β-Klotho, y pueden inducir sustancialmente señalización de tipo FGF21.

Determinadas proteínas de unión a antígeno descritas en el presente documento son anticuerpos o se derivan de anticuerpos. En determinadas realizaciones, la estructura de polipéptido de las proteínas de unión a antígeno se basa en anticuerpos, incluyendo, pero sin limitarse a, anticuerpos monoclonales, anticuerpos biespecíficos,

10 minicuerpos, anticuerpos de dominio, anticuerpos sintéticos (a veces denominados en el presente documento “miméticos de anticuerpo”), anticuerpos quiméricos, anticuerpo humanizados, anticuerpos humanos, fusiones de anticuerpos (a veces denominados en el presente documento “conjugados de anticuerpos”), hemicuerpos y fragmentos de los mismos. Las diversas estructuras se describen adicionalmente a continuación en el presente documento.

15 Las proteínas de unión a antígeno proporcionadas en el presente documento se ha demostrado que se unen a (i) β-Klotho; (ii) FGFR1c, FGFR2c, FGFR3c o FGFR4; o (iii) un complejo que comprende β-Klotho y uno de FGFR1c, FGFR2c, FGFR3c y FGFR4, y particularmente a (i) β-Klotho humano; (ii) FGFR1c humano, FGFR2c humano, FGFR3c humano o FGFR4 humano; o (iii) un complejo que comprende β-Klotho humano y uno de FGFR1c humano, FGFR2c humano, FGFR3c humano y FGFR4 humano. Tal como se describe y se muestra en los ejemplos

20 presentados en el presente documento, basándose en los resultados de la inmunotransferencia de tipo Western, los anticuerpos anti-β-Klotho o anti-FGFR1c comercialmente disponibles se unen a β-Klotho o FGFR1c desnaturalizados mientras que la proteína de unión a antígeno (anticuerpos agonistas) no. A la inversa, las proteínas de unión a antígeno proporcionadas reconocen la estructura nativa de FGFR1c y β-Klotho en la superficie celular mientras que los anticuerpos comerciales no, basándose en los resultado de FACS proporcionados. Véase el ejemplo 9. Las

25 proteínas de unión a antígeno que se proporcionan, por lo tanto, imitan la actividad biológica natural in vivo de FGF21. Como consecuencia, las proteínas de unión a antígeno proporcionadas en el presente documento pueden activar la actividad de señalización de tipo FGF21. En particular, las proteínas de unión a antígeno dadas a conocer pueden tener una o más de las siguientes actividades in vivo: inducción de rutas de transducción de señales de tipo FGF21, reducción de los niveles de glucosa en sangre, reducción de los niveles de lípidos circulantes, mejora de

30 parámetros metabólicos y otros efectos fisiológicos inducidos in vivo mediante la formación del complejo ternario de FGFR1c, β-Klotho y FGF21, por ejemplo en condiciones tales como diabetes tipo 2, obesidad, dislipidemia, NASH, enfermedad cardiovascular y síndrome metabólico.

Las proteínas de unión a antígeno que se unen específicamente a (i) β-Klotho; (ii) FGFR1c, FGFR2c, FGFR3c o FGFR4; o (iii) un complejo que comprende β-Klotho y uno de FGFR1c, FGFR2c, FGFR3c y FGFR4 que se dan a

35 conocer en el presente documento tienen una variedad de utilidades. Algunas de las proteínas de unión a antígeno, por ejemplo, son útiles en ensayos de unión específica, en la purificación por afinidad de (i) β-Klotho; (ii) FGFR1c, FGFR2c, FGFR3c o FGFR4; o (iii) un complejo que comprende β-Klotho y uno de FGFR1c, FGFR2c, FGFR3c y FGFR4, incluyendo las formas humanas de estas proteínas dadas a conocer, y en ensayos de selección para identificar otros agonistas de actividad de señalización de tipo FGF21.

40 Las proteínas de unión a antígeno que se unen específicamente a (i) β-Klotho; (ii) FGFR1c, FGFR2c, FGFR3c o FGFR4; o (iii) un complejo que comprende β-Klotho y uno de FGFR1c, FGFR2c, FGFR3c y FGFR4 que se dan a conocer en el presente documento pueden usarse en una variedad de aplicaciones de tratamiento, tal como se explica en el presente documento. Por ejemplo, determinadas proteínas de unión a antígeno son útiles para tratar estados asociados con procesos de señalización de tipo FGF21 en un paciente, tal como reducir, aliviar o tratar

45 diabetes tipo 2, obesidad, dislipidemia, NASH, enfermedad cardiovascular y síndrome metabólico. Otros usos para las proteínas de unión a antígeno incluyen, por ejemplo, diagnóstico de enfermedades o estados asociados con β-Klotho, FGFR1c, FGFR2c, FGFR3c, FGFR4 o FGF21, y ensayos de examen para determinar la presencia o ausencia de estas moléculas. Algunas de las proteínas de unión a antígeno descritas en el presente documento pueden ser útiles en el tratamiento de estados, síntomas y/o la patología asociada con la disminución de la actividad

50 de señalización de tipo FGF21. Los estados a modo de ejemplo incluyen, pero no se limitan a, diabetes, obesidad, NASH y dislipidemia.

FGF21

Las proteínas de unión a antígeno dadas a conocer en el presente documento inducen señalización mediada por FGF21, tal como se define en el presente documento. In vivo, la forma madura de FGF21 es la forma activa de la

55 molécula. Se proporciona la secuencia de nucleótidos que codifica para FGF21 de longitud completa; los nucleótidos que codifican para la secuencia de señal están subrayados.

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Se proporciona la secuencia de aminoácidos de FGF21 de longitud completa; los aminoácidos que conforman la secuencia de señal están subrayados:

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FGFR1c

Las proteínas de unión a antígeno dadas a conocer en el presente documento se unen a FGFR1c, en particular FGFR1c humano, cuando está asocidado con β-Klotho. Se proporciona la secuencia de nucleótidos que codifica para FGFR1c humano (número de registro de GenBank NM_023110):

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Se proporciona la secuencia de aminoácidos de FGFR1c humano (número de registro de GenBank NP_075598):

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Las proteínas de unión a antígeno descritas en el presente documento se unen a la parte extracelular de FGFR1c. Un ejemplo de una región extracelular de FGFR1c es:

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Tal como se describe en el presente documento, las proteínas FGFR1c también pueden incluir fragmentos. Tal

5 como se usa en el presente documento, los términos se usan de manera intercambiable para significar un receptor, en particular y a menos que se especifique otra cosa, un receptor humano, que tras la asociación con β-Klotho y FGF21 induce actividad de señalización de tipo FGF21.

El término FGFR1c también incluye modificaciones postraduccionales de la secuencia de aminoácidos FGFR1c, por ejemplo, posibles sitios de glicosilación unida a N. Por tanto, las proteínas de unión a antígeno pueden unirse a o

10 generarse a partir de proteínas glicosiladas en una o más de las posiciones.

β-Klotho

Las proteínas de unión a antígeno dadas a conocer en el presente documento se unen a β-Klotho, en particular β-Klotho humano. Se proporciona la secuencia de nucleótidos que codifica para β-Klotho humano (número de registro de GenBank NM_175737):

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Se proporciona la secuencia de aminoácidos de β

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GenBank NP_783864):

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Las proteínas de unión a antígeno descritas en el presente documento se unen a la parte extracelular de β-Klotho. Un ejemplo de una región extracelular de β-Klotho es:

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La forma murina de β-Klotho y fragmentos y subsecuencias de la misma, pueden ser útiles en el estudio y/o construcción de las moléculas proporcionadas en el presente documento. Se proporciona la secuencia de nucleótidos que codifica para β-Klotho murino (número de registro de GenBank NM_031180):

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Se proporciona la secuencia de aminoácidos de β-Klotho murino de longitud completa (número de registro de GenBank NP_112457):

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Tal como se describe en el presente documento, las proteínas β-Klotho también pueden incluir fragmentos. Tal como se usa en el presente documento, los términos se usan de manera intercambiable queriendo decir un co-receptor, en particular y a menos que se especifique otra cosa, un co-receptor humano, que tras la asociación con FGFR1c y FGF21 induce actividad de señalización de tipo FGF21.

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El término β-Klotho también incluye modificaciones postraduccionales de la secuencia de aminoácidos de β-Klotho, por ejemplo, posibles sitios de glicosilación unida a N. Por tanto, las proteínas de unión a antígeno pueden unirse a o generarse a partir de proteínas glicosiladas en una o más de las posiciones.

Proteínas de unión a antígeno que se unen específicamente a uno o más de β-Klotho, FGFR1c, FGFR2c, FGFR3c, 5 FGFR4c

Se proporciona una variedad de agentes de unión selectiva útiles para la modulación de la señalización de tipo FGF21. Se ilustran, por ejemplo, proteínas de unión a antígeno que contienen un dominio de unión a antígeno (por ejemplo, anticuerpos de cadena sencilla, anticuerpos de dominio, hemicuerpos, immunoadhesiones y polipéptidos con una región de unión a antígeno) y se unen específicamente a FGFR1c, β-Klotho; o tanto FGFR1c como β

10 Klotho, en particular FGFR1c humano y β-Klotho humano. Algunos de los agentes, por ejemplo, son útiles imitando el efecto de señalización generado in vivo mediante la asociación de FGFR1c con β-Klotho y con FGF21, y por tanto pueden usarse para potenciar o modular una o más actividades asociadas con señalización de tipo FGF21.

En general, las proteínas de unión a antígeno que se ilustran normalmente comprenden una o más CDR tal como se describe en el presente documento (por ejemplo, 1, 2, 3, 4, 5 ó 6 CDR). Las proteínas de unión a antígeno pueden 15 expresarse de manera natural mediante clones, mientras que en otras realizaciones, la proteína de unión a antígeno puede comprender (a) una estructura de región de marco de polipéptido y (b) una o más CDR que se insertan en y/o se unen a la estructura de región de marco de polipéptido. En algunas de estas realizaciones una CDR forma un componente de una cadenas pesadas o ligeras expresadas mediante los clones descritos en el presente documento; en otras realizaciones una CDR puede insertarse en una región de marco en la que la CDR no se

20 expresa de manera natural. Una estructura de región de marco de polipéptido puede adoptar una variedad de formas diferentes. Por ejemplo, una estructura de región de marco de polipéptido puede ser, o comprender, las regiones de marco de un anticuerpo que se produce de manera natural, o fragmento o variante del mismo, o puede ser de naturaleza completamente sintética. Ejemplos de diversas estructuras de proteína de unión a antígeno se describen adicionalmente a continuación.

25 En algunas realizaciones en las que la proteína de unión a antígeno comprende (a) una estructura de región de marco de polipéptido y (b) una o más CDR que se insertan en y/o se unen a la estructura de región de marco de polipéptido, la estructura de región de marco de polipéptido de una proteína de unión a antígeno es un anticuerpo o se deriva de un anticuerpo, incluyendo, pero sin limitarse a, anticuerpos monoclonales, anticuerpos biespecíficos, minicuerpos, anticuerpos de dominio, anticuerpos sintéticos (a veces denominados en el presente documento

30 “miméticos de anticuerpo”), anticuerpos quiméricos, anticuerpo humanizados, fusiones de anticuerpos (a veces denominados “conjugados de anticuerpos”), y partes o fragmentos de cada uno, respectivamente. En algunos casos, la proteína de unión a antígeno es un fragmento inmunológico de un anticuerpo (por ejemplo, un Fab, un Fab’, un F(ab’)2 o un scFv).

Ciertas proteínas de unión a antígeno tal como se proporcionan en el presente documento se unen específicamente

35 a(i) β-Klotho; (ii) FGFR1c, FGFR2c, FGFR3c o FGFR4; o (iii) un complejo que comprende β-Klotho; y uno de FGFR1c, FGFR2c, FGFR3c y FGFR4, incluyendo las formas humanas de estas proteínas. En una realización, una proteína de unión a antígeno se une específicamente tanto a FGFR1c humano que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:5 como a β-Klotho humano que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:8 y en otra realización una proteína de unión a antígeno se une específicamente tanto a FGFR1c humano que

40 comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:5 como a β-Klotho humano que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:8 e induce señalización de tipo FGF21. Una proteína de unión a antígeno induce señalización de tipo FGF21.

Estructura de proteínas de unión a antígeno

Algunas de las proteínas de unión a antígeno que se unen específicamente a (i) β-Klotho; (ii) FGFR1c, FGFR2c,

45 FGFR3c o FGFR4; o (iii) un complejo que comprende β-Klotho y uno de FGFR1c, FGFR2c, FGFR3c y FGFR4, incluyendo las formas humanas de estas proteínas que se proporcionan en el presente documento tienen una estructura normalmente asociada con anticuerpos que se producen de manera natural. Las unidades estructurales de estos anticuerpos normalmente comprenden uno o más tetrámeros, cada uno compuesto de dos parejas idénticas de cadenas polipeptídicas, aunque algunas especies de mamíferos también producen anticuerpos que sólo

50 tienen una única cadena pesada. En un anticuerpo típico, cada par o pareja incluye una cadena “ligera” de longitud completa (en determinadas realizaciones, aproximadamente 25 kDa) y una cadena “pesada” de longitud completa (en determinadas realizaciones, aproximadamente 50-70 kDa). Cada cadena de inmunoglobulina individual se compone de varios “dominios de inmunoglobulina”, consistiendo cada uno en de aproximadamente 90 a 110 aminoácidos y expresando una patrón de plegado característico. Estos dominios son las unidades básicas de las

55 que se componen los polipéptidos de anticuerpo. La parte amino-terminal de cada cadena normalmente incluye un dominio variable que es responsable del reconocimiento del antígeno. La parte carboxilo-terminal está más conservada evolutivamente que el otro extremo de la cadena y se denomina “región constante” o “región C”. Las cadenas ligeras humanas generalmente se clasifican como cadenas ligeras kappa (“κ”) y lambda (“λ”), y cada una de estas contiene un dominio variable y un dominio constante. Las cadenas pesadas se clasifican normalmente

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como cadenas mu, delta, gamma, alfa o épsilon y estas definen el isótopo del anticuerpo como IgM, IgD, IgG, IgA e IgE, respectivamente. IgG tiene varios subtipos, incluyendo, pero sin limitarse a, IgG1, IgG2, IgG3 e IgG4. Los subtipos IgM incluyen IgM e IgM2. Los subtipos IgA incluyen IgA1 e IgA2. En seres humanos, los isotipos IgA e IgD contienen cuatro cadenas pesadas y cuatro cadenas ligeras; los isotipos IgG e IgE contienen dos cadenas pesadas 5 y dos cadenas ligeras; y el isotipo IgM contiene cinco cadenas pesadas y cinco cadenas ligeras. La región C de cadena pesada normalmente comprende uno o más dominios que pueden ser responsables de la función efectora. El número de dominios de región constante de cadena pesada dependerá del isotipo. Las cadenas pesadas de IgG, por ejemplo, contienen cada una tres dominios de región C conocidos como CH1, CH2 y CH3. Los anticuerpos que se proporcionan pueden tener cualquiera de estos isotipos y subtipos. En determinadas realizaciones, una proteína de 10 unión a antígeno que se une específicamente a uno o más de (i) β-Klotho; (ii) FGFR1c, FGFR2c, FGFR3c o FGFR4;

o (iii) un complejo que comprende β-Klotho; y uno de FGFR1c, FGFR2c, FGFR3c y FGFR4 es un anticuerpo del subtipo IgG1, IgG2 o IgG4.

En las cadenas ligeras y pesadas de longitud completa, las regiones variable y constante se unen mediante una región “J” de aproximadamente doce o más aminoácidos, incluyendo la cadena pesada también una región “D” de

15 aproximadamente diez aminoácidos más. Véase, por ejemplo, Fundamental Inmunology, 2ª ed., cap. 7 (Paul, W., ed.) 1989, Nueva York: Raven Press. Las regiones variables de cada par de cadena ligera/pesada forman normalmente el sitio de unión a antígeno.

Un ejemplo de un dominio constante pesado de IgG2 de un anticuerpo monoclonal a modo de ejemplo que se une específicamente a (i) β-Klotho; (ii) FGFR1c, FGFR2c, FGFR3c o FGFR4; o (iii) un complejo que comprende β-Klotho

20 y uno de FGFR1c, FGFR2c, FGFR3c y FGFR4 tiene la secuencia de aminoácidos:

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Un ejemplo de un dominio constante ligero kappa de un anticuerpo monoclonal a modo de ejemplo que se une a (i) β-Klotho; (ii) FGFR1c, FGFR2c, FGFR3c o FGFR4; o (iii) un complejo que comprende β-Klotho y uno de FGFR1c, FGFR2c, FGFR3c y FGFR4 tiene la secuencia de aminoácidos:

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Un ejemplo de un dominio constante ligero lambda de un anticuerpo monoclonal a modo de ejemplo que se une a (i) β-Klotho; (ii) FGFR1c, FGFR2c, FGFR3c o FGFR4; o (iii) un complejo que comprende β-Klotho y uno de FGFR1c, FGFR2c, FGFR3c y FGFR4 tiene la secuencia de aminoácidos:

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30 Las regiones variables de cadena de inmunoglobulinas generalmente muestran la misma estructura global, que comprende regiones de marco (FR) relativamente conservadas unidas mediante tres regiones hipervariables, más a menudo denominadas “regiones determinantes de complementariedad” o CDR. Las CDR de las dos cadenas de cada par de cadena pesada/cadena ligera mencionado anteriormente se alinean normalmente mediante las regiones de marco para formar una estructura que se une específicamente con un epítopo especifico en la proteína diana (por

35 ejemplo, (i) β-Klotho; (ii) FGFR1c, FGFR2c, FGFR3c o FGFR4; o (iii) un complejo que comprende β-Klotho y uno de FGFR1c, FGFR2c, FGFR3c y FGFR4). Desde N-terminal hasta C-terminal, regiones variables de cadena ligera o pesada que se producen de manera natural se adaptan ambas normalmente al siguiente orden de estos elementos: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3 y FR4. Se ha ideado un sistema de numeración para asignar números a aminoácidos que ocupan posiciones en cada uno de estos dominios. Este sistema de numeración se define en Kabat Sequences of Proteins de Immunological Interest (1987 y 1991, NIH, Bethesda, MD). Tal como se desea, las CDR también pueden redefinirse según un esquema de nomenclatura alternativo, tal como el de Chothia (véase Chothia & Lesk, 1987, J. Mol. Biol. 196:901-917; Chothia et al., 1989, Nature 342:878-883 o Honegger & Pluckthun,

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5 2001, J. Mol. Biol. 309:657-670.

Las diversas regiones variables de cadena pesada y cadena ligera de proteínas de unión a antígeno proporcionadas en el presente documento están representadas en la tabla 2. Cada una de estas regiones variables puede unirse a las regiones constantes de cadena pesada y ligera anteriores para formar una cadena pesada o ligera de anticuerpo completo, respectivamente. Además, cada una de las secuencias de cadena pesada y ligera así generadas puede

10 combinarse para formar una estructura de anticuerpo completa. Debe entenderse que las regiones variables de cadena pesada y cadena ligera proporcionadas en el presente documento también pueden unirse a otros dominios constantes que tienen diferentes secuencias que las secuencias modo de ejemplo enumeradas anteriormente.

Los ejemplos específicos de algunas de las cadenas ligeras y pesadas de longitud completa de los anticuerpos que se proporcionan y sus correspondientes secuencias de aminoácidos se resumen en las tablas 1A y 1B. La tabla 1A

15 muestra secuencias de cadena ligera a modo de ejemplo, y la tabla 1B muestra secuencias de cadena pesada a modo de ejemplo.

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De nuevo, cada una de las cadenas pesadas a modo de ejemplo (H1, H2, H3 etc.) citadas en la tabla 1B y 6A, a continuación, pueden combinarse con cualquiera de las cadenas ligeras a modo de ejemplo mostradas en la tabla 1A y 6A, a continuación, para formar un anticuerpo. Los ejemplos de tales combinaciones incluyen H1 combinado 5 con cualquiera de L1 a L18; H2 combinado con cualquiera de L1 a L18; H3 combinado con cualquiera de L1 a L18 y así sucesivamente. En algunos casos, los anticuerpos incluyen al menos una cadena pesada y una cadena ligera de las citadas en las tablas 1A y 1B y 6A, a continuación; los ejemplos particulares de cadenas ligeras y cadenas pesadas incluyen L1 con H1, L2 con H2, L3 con H3, L4 con H4, L5 con H5, L6 con H6, L7 con H7, L8 con H8, L9 con H9, L10 con H10, L11 con H11, L12 con H12, L13 con H13, L14 con H14, L15 con H15, L16 con H16, L17 con H17, 10 y L18 con H18. Además de las proteínas de unión a antígeno que comprenden una cadena pesada y ligera del mismo clon, una cadena pesada de un primer clon puede emparejarse con una cadena ligera de un segundo clon (por ejemplo, una cadena pesada de 46D11 emparejada con una cadena ligera de 16H7 o una cadena pesada de 16H7 emparejada con una cadena ligera de 46D11). En general, tales emparejamientos pueden incluir VL . En otros casos, los anticuerpos contienen dos cadenas ligeras idénticas y dos cadenas pesadas idénticas. Como ejemplo, un anticuerpo o fragmento inmunológicamente funcional puede incluir dos cadenas pesadas H1 y dos cadenas ligeras L1, o dos cadenas pesadas H2 y dos cadenas ligeras L2 o dos cadenas pesadas H3 y dos cadenas ligeras L31 y otras combinaciones similares de pares de cadenas ligeras y

20 pares de las cadenas pesadas tal como se enumera en las tablas 1A y 1B y 6A, a continuación.

En otro aspecto de la presente divulgación, se proporcionan “hemicuerpos”. Un hemicuerpo es una proteína de unión a antígeno monovalente que comprende (i) una cadena ligera intacta, y (ii) una cadena pesada fusionada con una región Fc (por ejemplo, una región Fc de IgG2 de SEQ ID NO: 441), opcionalmente a través de un ligador. El ligador puede ser un ligador (G4S)x en el que “x” es un número entero distinto de cero (por ejemplo, (G4S)8; SEQ ID

25 NO: 440). Pueden construirse hemicuerpos usando los componentes de cadena pesada y ligera proporcionados. Los ejemplos específicos de hemicuerpos se dan a conocer en el ejemplo 14.

Otras proteínas de unión a antígeno que se proporcionan son variantes de anticuerpos formadas por combinación de las cadenas pesadas y ligeras mostradas en las tablas 1A y 1B y 6A, a continuación y comprenden cadenas ligeras y/o pesadas que cada una tiene al menos el 70%, el 75%, el 80%, el 85%, el 90%, el 95%, el 96%, el 97%, el 98% o

30 el 99% de identidad con las secuencias de aminoácidos de estas cadenas. En algunos casos, tales anticuerpos incluyen al menos una cadena pesada y una cadena ligera, mientras que en otros casos las formas variantes contienen dos cadenas ligeras idénticas y dos cadenas pesadas idénticas.

Dominios variables de proteínas de unión a antígeno

También se proporcionan proteínas de unión a antígeno que contienen una región variable de cadena pesada de

35 anticuerpos seleccionada del grupo que consiste en VH1, VH2, VH3, VH4, VH5, VH6, VH7, VH8, VH9, VH10, VH11, VH12, VH13, VH14, VH15, VH16, VH17 y VH18 tal como se muestra en la tabla 2B y/o una región variable de cadena ligera de anticuerpos seleccionada del grupo que consiste en VL1, VL2, VL3, VL4, VL5, VL6, VL7, VL8, VL9, VL10, VL11, VL12, VL13, VL14, VL15, VL16, VL17 y VL18 tal como se muestra en la tabla 2A, y fragmentos inmunológicamente funcionales, derivados, muteínas y variantes de estas regiones variables de cadena ligera y cadena pesada.

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Tabla 2A - Cadenas ligeras variables (VL) de anticuerpos a modo de ejemplo

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Tabla 2B -Cadenas pesadas variables (VH) de anticuerpos a modo de ejemplo

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Tabla 2C -Secuencia codificadora para cadenas ligeras variables (VL) de anticuerpos

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Tabla 2D - Secuencia de codificadora para cadenas pesadas variables (VL) de anticuerpos

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Las realizaciones de la invención se definen en las reivindicaciones.

Cada una de las regiones variables de cadena pesada citadas en la tabla 2B puede combinarse con cualquiera de las regiones variables de cadena ligera mostradas en la tabla 2A para formar una proteína de unión a antígeno. Los

5 ejemplos de tales combinaciones incluyen VH1 combinado con cualquiera de VL1, VL2, VL3, VL4, VL5, VL6, VL7, V 8, VL9, VL10, VL11, VL12, VL13, VL14, VL15, VL16, VL17 o VL18; VH2 combinado con cualquiera de VL1, VL2, VL3, VL4, VL5, VL6, VL7, VL8, VL9, VL10, VL11, VL12, VL13, VL14, VL15, VL16, VL17 o VL18; VH3 combinado con cualquiera de VL1, VL2, VL3, VL4, VL5, VL6, VL7, VL8, VL9, VL10, VL11, VL12, VL13, VL14, VL15, VL16, VL17 o VL18; y así sucesivamente.

10 En algunos casos, la proteína de unión a antígeno incluye al menos una región variable de cadena pesada y/o una región variable de cadena ligera de las citadas en las tablas 2A y 2B. En algunos casos, la proteína de unión a antígeno incluye al menos dos regiones variables de cadena pesada y/o regiones variables de cadena ligera diferentes de las citadas en la tabla 2B. Un ejemplo de una proteína de unión a antígeno de este tipo comprende (a) un VH1, y (b) uno de VH2, VH3, VH4, VH5, VH6, VH7, VH8, VH9, VH10, VH11, VH12, VH13, VH14, VH15, VH16, VH17 o

15 VH18. Otro ejemplo comprende (a) un VH2, y (b) uno de VH1, VH3, VH4, VH5, VH6, VH7, VH8, VH9, VH10, VH11, VH12, VH13, VH14, VH15, VH16, VH17 o VH18. De nuevo otro ejemplo comprende (a) un VH3, y (b) uno de VH1, VH2, VH4, VH5, VH6, VH7, VH8, VH9, VH10, VH11, VH12, VH13, VH14, VH15 VH16, VH17 o VH18, etc.

De nuevo otro ejemplo de una proteína de unión a antígeno de este tipo comprende (a) un VL1, y (b) uno de VL2, VL3, VL4, VL5, VL6, VL7, VL8, VL9, VL10, VL11, VL12, VL13, VL14, VL15, VL16, VL17, o VL18. De nuevo otro ejemplo de 20 una proteína de unión a antígeno de este tipo comprende (a) un VL2, y (b) uno de VL1, VL3, VL4, VL5, VL6, VL7, VL8, VL9, VL10, VL11 o VL12. De nuevo otro ejemplo de una proteína de unión a antígeno de este tipo comprende (a) un VL3, y (b) uno de VL1, VL2, VL4, VL5, VL6, VL7, VL8, VL9, VL10, VL11, VL12, VL13, VL14, VL15, VL16, VL17, o VL18, etc.

Las diversas combinaciones de regiones variables de cadena pesada pueden combinarse con cualquiera de las diversas combinaciones de regiones variables de cadena ligera.

25 En otras realizaciones, una proteína de unión a antígeno comprende dos regiones variables de cadena ligera idénticas y/o dos regiones variables de cadena pesada idénticas. Como ejemplo, la proteína de unión a antígeno puede ser un anticuerpo o fragmento inmunológicamente funcional del mismo que incluye dos regiones variables de cadena ligera y dos regiones variables de cadena pesada en combinaciones de pares de regiones variables de cadena ligera y pares de regiones variables de cadena pesada tal como se cita en las tablas 2A y 2B.

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Algunas proteínas de unión a antígeno que se proporcionan comprenden un dominio variable de cadena pesada que

5 comprende una secuencia de aminoácidos que difiere de la secuencia de un dominio variable de cadena pesada seleccionado de VH1, VH2, VH3, VH4, VH5, VH6, VH H8, VH9, VH10, VH11, VH12, VH13, VH14, VH15, VH16, VH17 y VH18 en sólo 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 ó 15 residuos de aminoácido, en los que cada una de tales diferencias de secuencia es independientemente o bien una deleción o bien una inserción o bien una sustitución de un aminoácido, con las deleciones, inserciones y/o sustituciones dando como resultado no más de 15 cambios de

10 aminoácidos en relación con las secuencias de dominio variable anteriores. La región variable de cadena pesada en algunas proteínas de unión a antígeno comprende una secuencia de aminoácidos tal como se define en las reivindicaciones.

Determinadas proteínas de unión a antígeno comprenden un dominio variable de cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos que difiere de la secuencia de un dominio variable de cadena ligera seleccionado de VL1, 15 VL2, VL3, VL4, VL5, VL6, VL7, VL8, VL9, VL10, VL11, VL12, VL13, VL14, VL15, VL16, VL17 y VL18 en sólo 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 ó 15 residuos de aminoácido, en los que cada una de tales diferencias de secuencia es independientemente o bien una deleción o bien una inserción o bien una sustitución de un aminoácido, con las deleciones, inserciones y/o sustituciones dando como resultado no más de 15 cambios de aminoácidos en relación con las secuencias de dominio variable anteriores. La región variable de cadena ligera en algunas proteínas de

20 unión a antígeno comprende una secuencia de aminoácidos tal como se define en las reivindicaciones.

En casos adicionales, las proteínas de unión a antígeno comprenden los siguientes emparejamientos de dominios variables de cadena ligera y cadena pesada: VL1 con VH1, VL2 con VH2, VL2 con VH3, VL3 con VH4, VL4 con VH5, VL5 con VH6, VL6 con VH7, VL7 con VH8, VL8 con VH8, VL9 con VH9, VL9 con VH10, VL10 con VH11, VL11 con VH11, VL12 con VH12, VL13 con VH13, VL14 con VH14, VL15 con VH15, VL16 con VH16, VL17 con VH17 y VL18 con VH18. En

25 algunos casos, las proteínas de unión a antígeno en los emparejamientos anteriores pueden comprender secuencias de aminoácidos que tienen el 70%, el 75%, el 80%, el 85%, el 90%, el 95%, el 96%, el 97%, el 98% o el 99% de identidad de secuencia con los dominios variables especificados. Las realizaciones de la invención se definen en las reivindicaciones.

Aún otras proteínas de unión a antígeno, por ejemplo, anticuerpos o fragmentos inmunológicamente funcionales,

30 incluyen formas variantes de una cadena pesada variante y una cadena ligera variante tal como se acaba de describir.

CDR de proteínas de unión a antígeno

En diversas realizaciones, las proteínas de unión a antígeno dadas a conocer en el presente documento pueden comprender polipéptidos en los que una o más CDR se injertan, insertan y/o unen. Una proteína de unión a antígeno 35 puede tener 1, 2, 3, 4, 5 ó 6 CDR. Una proteína de unión a antígeno por tanto puede tener, por ejemplo, una CDR1 de cadena pesada (“CDRH1”) y/o una CDR2 de cadena pesada(“CDRH2”) y/o una CDR3 de cadena pesada (“CDRH3”) y/o una CDR1 de cadena ligera (“CDRL1”) y/o una CDR2 de cadena ligera (“CDRL2”) y/o una CDR3 de cadena ligera (“CDRL3”). Algunas proteínas de unión a antígeno incluyen tanto una CDRH3 como una CDRL3. Las CDR de cadena pesada y ligera específicas se identifican en las tablas 3A y 3B, respectivamente y en la tabla 6C, a

40 continuación.

Las regiones determinantes de complementariedad (CDR) y regiones de marco (FR) de un anticuerpo dado pueden identificarse usando el sistema descrito en Kabat et al., en Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5ª Ed., Departamento de Salud y Servicios Humanos de EE.UU., PHS, NIH, NIH, publicación n.º 91-3242, 1991. Tal como se desea, las CDR también pueden redefinirse según un esquema de nomenclatura alternativo, tal como el de

45 Chothia (véase Chothia & Lesk, 1987, J. Mol. Biol. 196:901-917; Chothia et al., 1989, Nature 342:878-883 o Honegger & Pluckthun, 2001, J. Mol. Biol. 309:657-670). Determinados anticuerpos que se dan a conocer en el presente documento comprenden una o más secuencias de aminoácidos que son idénticas o tienen una identidad de secuencia sustancial con las secuencias de aminoácidos de una o más de las CDR presentadas en la tabla 3A (CDRH) y tabla 3B (CDRL) y tabla 6C, a continuación.

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Tabla 3A - Secuencias de CDRH a modo de ejemplo

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Tabla 3B - Secuencias de CDRL a modo de ejemplo

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Tabla 3C – Secuencias codificantes para CDRH

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Tabla 3D – Secuencias codificantes para CDRL

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Se ha descrito la estructura y propiedades de CDR dentro de un anticuerpo que se produce de manera natural, anteriormente. En resumen, en un anticuerpo tradicional, las CDR están incrustadas dentro de una región de marco en la región variable de cadena pesada y ligera en la que constituyen las regiones responsables de la unión y reconocimiento del antígeno. Una región variable comprende al menos tres CDR de cadena pesada o ligera, véase, anteriormente (Kabat et al., 1991, Sequences of Proteins of Immunological Interest, Public Health Service N.I.H., Betesda, MD; véase también Chothia y Lesk, 1987, J. Mol. Biol. 196:901-917; Chothia et al., 1989, Nature 342: 877883), dentro de una región de marco (denominadas regiones de marco 1-4, FR1, FR2, FR3, y FR4, por Kabat et al., 1991; véase también Chothia y Lesk, 1987, anteriormente). Las CDR proporcionadas en el presente documento, sin embargo, no solo pueden usarse para definir el dominio de unión a antígeno de una estructura de anticuerpo tradicional, sino que pueden incrustarse en una variedad de otras estructuras de polipéptido, tal como se describe en el presente documento.

Las CDR ilustradas son (a) una CDRH seleccionada del grupo que consiste en (i) una CDRH1 seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 121-131; (ii) una CDRH2 seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 132-144; (iii) una CDRH3 seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 145-157; y (iv) una CDRH de (i), (ii) y

(iii): que contiene una o más sustituciones, deleciones o inserciones de aminoácidos de no más de cinco, cuatro, tres, dos o un aminoácidos; (B) una CDRL seleccionada del grupo que consiste en (i) una CDRL1 seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 158-170; (ii) una CDRL2 seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 171-179;

(iii): una CDRL3 seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 180-194; y (iv) una CDRL de (i), (ii) y (iii) que contiene una o más sustituciones, deleciones o inserciones de aminoácidos de no más de 1, 2, 3, 4, ó 5 aminoácidos.

Una proteína de unión a antígeno comprende 1, 2, 3, 4, 5, ó 6 formas variantes de las CDR citadas en las tablas 3A y 3B y la tabla 6C, a continuación, cada una teniendo al menos el 80%, el 85%, el 90%, el 95%, el 96%, el 97%, el 98%, el o 99% de identidad de secuencia con una secuencia citada en las tablas 3A y 3B y la tabla 6C, a continuación. Algunas proteínas de unión a antígeno comprenden 1, 2, 3, 4, 5, ó 6 de las CDR citadas en las tablas 3A y 3B y la tabla 6C, a continuación, cada una difiriendo en no más de 1, 2, 3, 4 ó 5 aminoácidos de las CDR citadas en estas tablas.

Una proteína de unión a antígeno incluye las siguientes asociaciones de CDRL1, CDRL2 y CDRL3: SEQ ID NO: 167, 176 y 190; SEQ ID NO: 167, 176 y 189, SEQ ID NO: 166, 176 y 188; SEQ ID NO: 166, 176 y 188; SEQ ID NO: 161, 174 y 183; SEQ ID NO: 162, 173 y 184; SEQ ID NO: 162, 173 y 186; SEQ ID NO: 164, 173 y 186; SEQ ID NO: 160, 173 y 182; SEQ ID NO: 163, 173 y 185; SEQ ID NO: 163, 173 y 185; SEQ ID NO: 159, 172 y 181; SEQ ID NO: 165, 175 y 187; SEQ ID NO: 158, 171 y 180; SEQ ID NO: 168, 171 y 191; SEQ ID NO: 169, 177 y 192; SEQ ID NO: 170, 178 y 193; SEQ ID NO: 163, 173 y 194; SEQ ID NO: 163, 173 y 194; y SEQ ID NO: 163, 179 y 194.

Una proteína de unión a antígeno incluye las siguientes asociaciones de CDRH1, CDRH2 y CDRH3: SEQ ID NO: 122, 133 y 146; SEQ ID NO: 122, 133 y 147; SEQ ID NO: 122, 133 y 148; SEQ ID NO: 122, 134, and148; SEQ ID NO: 124, 136 y 150; SEQ ID NO: 124, 138 y 152; SEQ ID NO: 124, 139 y 152; SEQ ID NO: 124, 137 y 151; SEQ ID NO: 124, 137 y 151; SEQ ID NO: 131, 140 y 153; SEQ ID NO: 125, 140 y 153; SEQ ID NO: 123, 135 y 149; SEQ ID NO: 123, 135 y 149; SEQ ID NO: 121, 132 y 145; SEQ ID NO: 126, 133 y 154; SEQ ID NO: 130, 144 y 157; SEQ ID NO: 127, 135 y 155; SEQ ID NO: 129, 142 y 156; SEQ ID NO: 128, 141 y 156; y SEQ ID NO: 128, 143 y 156.

Una proteína de unión a antígeno incluye las siguientes asociaciones de CDRL1, CDRL2 y CDRL3 con CDRH1, CDRH2 y CDRH3: SEQ ID NO: 167, 176 y 190; SEQ ID NO: 167, 176 y 189, SEQ ID NO: 166, 176 y 188; SEQ ID NO: 166, 176 y 188; SEQ ID NO: 161, 174 y 183; SEQ ID NO: 162, 173 y 184; SEQ ID NO: 162, 173 y 186; SEQ ID NO: 164, 173 y 186; SEQ ID NO: 160, 173 y 182; SEQ ID NO: 163, 173 y 185; SEQ ID NO: 163, 173 y 185; SEQ ID NO: 159, 172 y 181; SEQ ID NO: 165, 175 y 187; SEQ ID NO: 158, 171 y 180; SEQ ID NO: 168, 171 y 191; SEQ ID NO: 169, 177 y 192; SEQ ID NO: 170, 178 y 193; SEQ ID NO: 163, 173 y 194; SEQ ID NO: 163, 173 y 194; SEQ ID NO: 163, 179 y 194 con SEQ ID NO: 122, 133 y 146; SEQ ID NO: 122, 133 y 147; SEQ ID NO: 122, 133 y 148; SEQ ID NO: 122, 134, y 148; SEQ ID NO: 124, 136 y 150; SEQ ID NO: 124, 138 y 152; SEQ ID NO: 124, 139 y 152; SEQ ID NO: 124, 137 y 151; SEQ ID NO: 124, 137 y 151; SEQ ID NO: 131, 140 y 153; SEQ ID NO: 125, 140 y 153; SEQ ID NO: 123, 135 y 149; SEQ ID NO: 123, 135 y 149; SEQ ID NO: 121, 132 y 145; SEQ ID NO: 126, 133 y 154; SEQ ID NO: 130, 144 y 157; SEQ ID NO: 127, 135 y 155; SEQ ID NO: 129, 142 y 156; SEQ ID NO: 128, 141 y 156; y SEQ ID NO: 128, 143 y 156.

imagen83

Secuencias de consenso

En todavía otro aspecto, las CDR dadas a conocer en el presente documento incluyen secuencias de consenso derivadas de grupos de anticuerpos monoclonales relacionados. Tal como se describe en el presente documento, una “secuencia de consenso” se refiere a secuencias de aminoácidos que tienen aminoácidos comunes

5 conservados entre varias secuencias y aminoácidos variables que varían dentro de una secuencia de aminoácidos dada. La secuencia de consenso CDR proporcionada incluye CDR correspondientes a cada una de CDRH1, CDRH2, CDRH3, CDRL1, CDRL2 y CDRL3.

Las secuencias de consensos se determinaron usando análisis convencionales de las CDR correspondientes a la VH y VL de los anticuerpos dados a conocer, algunos de los cuales se unen específicamente a (i) β-Klotho; (ii) FGFR1c,

10 FGFR2c, FGFR3c o FGFR4; o (iii) un complejo que comprende β-Klotho y uno de FGFR1c, FGFR2c, FGFR3c y FGFR4. Las secuencias de consenso se determinaron manteniendo las CDR contiguas dentro de la misma secuencia correspondiente a una VH o VL.

CDR3 de cadena ligera

Grupo 1

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Grupo 2

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Grupo 3

imagen86

20 Grupo 4

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Grupo 5

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Grupo 6

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Grupo 7

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en elqueX1 es G, S o N yX2 es S, To N. Grupo 8

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en elqueX3 es C, Yo S, X4 es S o G, X5 es So A, X6 esPo F yX7 es L oestá ausente. CDR2 de cadena ligera Grupo 1

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Grupo 2

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Grupo 3

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10 Grupo 4

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Grupo 5

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en elqueX27 es N o D. 15 Grupo 6

imagen97

en elqueX8 es A o TyX28 esS o F. CDR1 de cadena ligera Grupo 1

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Grupo 2

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Grupo 3

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Grupo 4

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Grupo 5

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en elqueX9 es A o S, X10 esV o F, X11 esD o S, X12 es Go S, X13 es S, No TyX14 es S o Y. Grupo 6

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en elqueX15 es E oQ. Grupo 7

imagen104

en elqueX29 es Yo H, X30 esYo S, X31 es F o Y, X32 es To N yX33 es Yo F. 15 CDR3 pesada

Grupo 1

imagen105

Grupo 2

imagen106

20 Grupo 3

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Grupo 4 Grupo 5

imagen108

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Grupo 6

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Grupo 7

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Grupo 8

imagen113

en el que X34 es I, V o S, X16 es L o V, X17 es L, T o V, X18 es L, V, G o T, X19 es A, G o está ausente y X20 es Y, C o 10 D.

Grupo 9

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en elqueX21 es Io M, X22 es A o V yX23 es H o Y. 15 CDR2 pesada

Grupo 1

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Grupo 2

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20 en el que X42 es T o está ausente. Grupo 3

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en elqueX24 es S oN. Grupo 4 en elqueX25 es G o A yX26 es H, Yo N. Grupo 5

imagen118

imagen119

en elqueX35 es D oI yX36 esA o G. Grupo 6

imagen120

en elqueX37 es N o R,X38 esYo T yX41 es Yo N. CDR1 pesada

10 Grupo 1

imagen121

Grupo 2

imagen122

Grupo 3

imagen123

Grupo 4

imagen124

Grupo 5

imagen125

20 Grupo 6

imagen126

en elqueX39 es S oN. Grupo 7

imagen127

en elqueX40 es S oN.

En algunos casos una proteína de unión a antígeno comprende al menos una CDR1, CDR2 o CDR3 de cadena pesada, que tiene una de las secuencias de consenso anteriores. En algunos casos, una proteína de unión a antígeno comprende al menos una CDR1, CDR2 o CDR3 de cadena pesada, que tiene una de las secuencias de consenso anteriores. En otros casos, la proteína de unión a antígeno comprende al menos dos CDR de cadena pesada según las secuencias de consenso anteriores, y/o al menos dos CDR de cadena ligera según las secuencias de consenso anteriores. En todavía otros casos, la proteína de unión a antígeno comprende al menos tres CDR de cadena pesada según las secuencias de consenso anteriores y/o al menos tres CDR de cadena ligera según las secuencias de consenso anteriores.

Ilustración de proteínas de unión a antígeno a modo de ejemplo

Una proteína de unión a antígeno aislada que comprende (a) una o más regiones determinantes complementarias de cadena pesada (CDRH) seleccionadas del grupo que consiste en: (i) una CDRH1 seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 121-131; (ii) una CDRH2 seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 132-,1,44;

(iii) una CDRH3 seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 145-157; y (iv) una CDRH de (i), (ii) y (iii) que contiene una o más sustituciones, deleciones o inserciones de aminoácidos de no más de 1, 2, 3, 4, ó 5 aminoácidos; (b) una o más regiones determinantes complementarias de cadena ligera (CDRL) seleccionada del grupo que consiste en: (i) una CDRL1 seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 158-170; (ii) una CDRL2 seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 171-179; (iii) una CDRL3 seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 180-194; y (iv) una CDRL de (i), (ii) y (iii) que contiene una o más sustituciones, deleciones o inserciones de aminoácidos de no más de cinco, cuatro, tres, cuatro, dos o un aminoácidos; o (c) una o más CDRH de cadena pesada de (a) y una o más CDRL de cadena ligera de (b).

Las CDRH tienen al menos el 70%, el 75%, el 80%, el 85%, el 90%, el 95%, el 96%, el 97%, el 98% o el 99% de identidad de secuencia con una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 121-157 y/o las CDRL tienen al menos el 70%, el 75%, el 80%, el 85%, el 90%, el 95%, el 96%, el 97%, el 98% o el 99% de identidad de secuencia con una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID N0:158-194. La VH se selecciona del grupo que consiste en SEQ ID NO: 121-157 y/o la VL se selecciona del grupo que consiste en SEQ ID NO: 158-194.

Una proteína de unión a antígeno aislada que comprende (a) una o más cadenas pesadas variables (VH) seleccionada del grupo que consiste en: (i) SEQ ID NO: 121-157; y (ii) una VH de (i) que contiene una o más sustituciones, deleciones o inserciones de aminoácidos de no más del cinco, cuatro, tres, cuatro, dos o un aminoácidos; (b) una o más cadenas ligeras variables (VL) seleccionada del grupo que consiste en: (i) SEQ ID NO: 158-194, y (ii) una VL de (i) que contiene una o más sustituciones, deleciones o inserciones de aminoácidos de no más del cinco, cuatro, tres, cuatro, dos o un aminoácidos; o (c) una o más cadenas pesadas variables de (a) y una o más cadenas ligeras variables de (b).

La cadena pesada variable (VH) tiene al menos el 70%, el 75%, el 80%, el 85%, el 90%, el 95%, el 96%, el 97%, el 98% o el 99% de identidad de secuencia con una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 121-157 y/o la cadena ligera variable (VL) tiene al menos el 70%, el 75%, el 80%, el 85%, el 90%, el 95%, el 96%, el 97%, el 98% o el 99% de identidad de secuencia con una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 158-194.

También se ilustra una proteína de unión a antígeno que se une específicamente a un epítopo que comprende uno o más residuos de aminoácido de FGFR1c, FGRF2c, FGFR3c y FGFR4.

También se ilustra una proteína de unión a antígeno que se une específicamente a un epítopo que comprende uno o más residuos de aminoácido de β-Klotho.

También se ilustra una proteína de unión a antígeno aislada que se une específicamente a un epítopo que comprende uno o más residuos de aminoácido de tanto β-Klotho como uno o más residuos de aminoácido de FGFR1c, FGFR2c, FGFR3c o FGFR4.

La proteína de unión a antígeno aislada descrita anteriormente en el presente documento comprende una primera secuencia de aminoácidos que comprende al menos una de las secuencias de consenso CDRH dadas a conocer en el presente documento y una segunda secuencia de aminoácidos que comprende al menos una de las secuencias de consenso CDRL dadas a conocer en el presente documento.

La primera secuencia de aminoácidos comprende al menos dos de las secuencias de consenso CDRH y/o la segunda secuencia de aminoácidos comprende al menos dos de las secuencias de consenso CDRL. En determinadas realizaciones, la primera y la segunda secuencia de aminoácidos están unidas covalentemente entre sí.

imagen128

La primera secuencia de aminoácidos de la proteína de unión a antígeno aislada comprende la CDRH3 de SEQ ID NO: 146, la CDRH2 de SEQ ID NO: 133 y la CDRH1 de SEQ ID NO: 122 y/o la segunda secuencia de aminoácidos de la proteína de unión a antígeno aislada comprende la CDRL3 de SEQ ID NO: 19, la CDRL2 de SEQ ID NO: 176 y la CDRL1 de SEQ ID NO: 167.

La primera secuencia de aminoácidos de la proteína de unión a antígeno aislada comprende la CDRH3 de SEQ ID NO: 147, la CDRH2 de SEQ ID NO: 133 y la CDRH1 de SEQ ID NO: 122 y/o la segunda secuencia de aminoácidos de la proteína de unión a antígeno aislada comprende la CDRL3 de SEQ ID NO: 189, la CDRL2 de SEQ ID NO: 176 y la CDRL1 de SEQ ID NO: 167.

La primera secuencia de aminoácidos de la proteína de unión a antígeno aislada comprende la CDRH3 de SEQ ID NO: 148, la CDRH2 de SEQ ID NO: 133 y la CDRH1 de SEQ ID NO: 122 y/o la segunda secuencia de aminoácidos de la proteína de unión a antígeno aislada comprende la CDRL3 de SEQ ID NO: 188, la CDRL2 de SEQ ID NO: 176 y la CDRL1 de SEQ ID NO: 166.

La primera secuencia de aminoácidos de la proteína de unión a antígeno aislada comprende la CDRH3 de SEQ ID NO: 148, la CDRH2 de SEQ ID NO: 134 y la CDRH1 de SEQ ID NO: 122 y/o la segunda secuencia de aminoácidos de la proteína de unión a antígeno aislada comprende la CDRL3 de SEQ ID NO: 188, la CDRL2 de SEQ ID NO: 176 y la CDRL1 de SEQ ID NO: 166.

La primera secuencia de aminoácidos de la proteína de unión a antígeno aislada comprende la CDRH3 de SEQ ID NO: 150, la CDRH2 de SEQ ID NO: 136 y la CDRH1 de SEQ ID NO: 124 y/o la segunda secuencia de aminoácidos de la proteína de unión a antígeno aislada comprende la CDRL3 de SEQ ID NO: 183, la CDRL2 de SEQ ID NO: 174 y la CDRL1 de SEQ ID NO: 161.

La primera secuencia de aminoácidos de la proteína de unión a antígeno aislada comprende la CDRH3 de SEQ ID NO: 152, la CDRH2 de SEQ ID NO: 138 y la CDRH1 de SEQ ID NO: 124 y/o la segunda secuencia de aminoácidos de la proteína de unión a antígeno aislada comprende la CDRL3 de SEQ ID NO: 184, la CDRL2 de SEQ ID NO: 173 y la CDRL1 de SEQ ID NO: 162.

La primera secuencia de aminoácidos de la proteína de unión a antígeno aislada comprende la CDRH3 de SEQ ID NO: 152, la CDRH2 de SEQ ID NO: 139 y la CDRH1 de SEQ ID NO: 124 y/o la segunda secuencia de aminoácidos de la proteína de unión a antígeno aislada comprende la CDRL3 de SEQ ID NO: 186, la CDRL2 de SEQ ID NO: 173 y la CDRL1 de SEQ ID NO: 162.

La primera secuencia de aminoácidos de la proteína de unión a antígeno aislada comprende la CDRH3 de SEQ ID NO: 151, la CDRH2 de SEQ ID NO: 137 y la CDRH1 de SEQ ID NO: 124 y/o la segunda secuencia de aminoácidos de la proteína de unión a antígeno aislada comprende la CDRL3 de SEQ ID NO: 186, la CDRL2 de SEQ ID NO: 173 y la CDRL1 de SEQ ID NO: 164.

La primera secuencia de aminoácidos de la proteína de unión a antígeno aislada comprende la CDRH3 de SEQ ID NO: 151, la CDRH2 de SEQ ID NO: 137 y la CDRH1 de SEQ ID NO: 124 y/o la segunda secuencia de aminoácidos de la proteína de unión a antígeno aislada comprende la CDRL3 de SEQ ID NO: 182, la CDRL2 de SEQ ID NO: 173 y la CDRL1 de SEQ ID NO: 160.

La primera secuencia de aminoácidos de la proteína de unión a antígeno aislada comprende la CDRH3 de SEQ ID NO: 153, la CDRH2 de SEQ ID NO: 140 y la CDRH1 de SEQ ID NO: 131 y/o la segunda secuencia de aminoácidos de la proteína de unión a antígeno aislada comprende la CDRL3 de SEQ ID NO: 185, la CDRL2 de SEQ ID NO: 173 y la CDRL1 de SEQ ID NO: 163.

La primera secuencia de aminoácidos de la proteína de unión a antígeno aislada comprende la CDRH3 de SEQ ID NO: 153, la CDRH2 de SEQ ID NO: 140 y la CDRH1 de SEQ ID NO: 125 y/o la segunda secuencia de aminoácidos de la proteína de unión a antígeno aislada comprende la CDRL3 de SEQ ID NO: 185, la CDRL2 de SEQ ID NO: 173 y la CDRL1 de SEQ ID NO: 163.

La primera secuencia de aminoácidos de la proteína de unión a antígeno aislada comprende la CDRH3 de SEQ ID NO: 149, la CDRH2 de SEQ ID NO: 135 y la CDRH1 de SEQ ID NO: 123 y/o la segunda secuencia de aminoácidos de la proteína de unión a antígeno aislada comprende la CDRL3 de SEQ ID NO: 181, la CDRL2 de SEQ ID NO: 172 y la CDRL1 de SEQ ID NO: 159.

La primera secuencia de aminoácidos de la proteína de unión a antígeno aislada comprende la CDRH3 de SEQ ID NO: 149, la CDRH2 de SEQ ID NO: 135 y la CDRH1 de SEQ ID NO: 123 y/o la segunda secuencia de aminoácidos de la proteína de unión a antígeno aislada comprende la CDRL3 de SEQ ID NO: 187, la CDRL2 de SEQ ID NO: 175 y la CDRL1 de SEQ ID NO: 165.

imagen129

La primera secuencia de aminoácidos de la proteína de unión a antígeno aislada comprende la CDRH3 de SEQ ID NO: 145, la CDRH2 de SEQ ID NO: 132 y la CDRH1 de SEQ ID NO: 121 y/o la segunda secuencia de aminoácidos de la proteína de unión a antígeno aislada comprende la CDRL3 de SEQ ID NO: 180, la CDRL2 de SEQ ID NO: 171 y la CDRL1 de SEQ ID NO: 158.

La primera secuencia de aminoácidos de la proteína de unión a antígeno aislada comprende la CDRH3 de SEQ ID NO: 154, la CDRH2 de SEQ ID NO: 133 y la CDRH1 de SEQ ID NO: 126 y/o la segunda secuencia de aminoácidos de la proteína de unión a antígeno aislada comprende la CDRL3 de SEQ ID NO: 191, la CDRL2 de SEQ ID NO: 171 y la CDRL1 de SEQ ID NO: 168.

La primera secuencia de aminoácidos de la proteína de unión a antígeno aislada comprende la CDRH3 de SEQ ID NO: 157, la CDRH2 de SEQ ID NO: 144 y la CDRH1 de SEQ ID NO: 130 y/o la segunda secuencia de aminoácidos de la proteína de unión a antígeno aislada comprende la CDRL3 de SEQ ID NO: 192, la CDRL2 de SEQ ID NO: 177 y la CDRL1 de SEQ ID NO: 169.

La primera secuencia de aminoácidos de la proteína de unión a antígeno aislada comprende la CDRH3 de SEQ ID NO: 155, la CDRH2 de SEQ ID NO: 135 y la CDRH1 de SEQ ID NO: 127 y/o la segunda secuencia de aminoácidos de la proteína de unión a antígeno aislada comprende la CDRL3 de SEQ ID NO: 193, la CDRL2 de SEQ ID NO: 1178 y la CDRL1 de SEQ ID NO: 170.

La primera secuencia de aminoácidos de la proteína de unión a antígeno aislada comprende la CDRH3 de SEQ ID NO: 156, la CDRH2 de SEQ ID NO: 142 y la CDRH1 de SEQ ID NO: 129 y/o la segunda secuencia de aminoácidos de la proteína de unión a antígeno aislada comprende la CDRL3 de SEQ ID NO: 194, la CDRL2 de SEQ ID NO: 173 y la CDRL1 de SEQ ID NO: 163.

La primera secuencia de aminoácidos de la proteína de unión a antígeno aislada comprende la CDRH3 de SEQ ID NO: 156, la CDRH2 de SEQ ID NO: 141 y la CDRH1 de SEQ ID NO: 128 y/o la segunda secuencia de aminoácidos de la proteína de unión a antígeno aislada comprende la CDRL3 de SEQ ID NO: 194, la CDRL2 de SEQ ID NO: 173 y la CDRL1 de SEQ ID NO: 163.

La primera secuencia de aminoácidos de la proteína de unión a antígeno aislada comprende la CDRH3 de SEQ ID NO: 156, la CDRH2 de SEQ ID NO: 143 y la CDRH1 de SEQ ID NO: 128 y/o la segunda secuencia de aminoácidos de la proteína de unión a antígeno aislada comprende la CDRL3 de SEQ ID NO: 194, la CDRL2 de SEQ ID NO: 179 y la CDRL1 de SEQ ID NO: 163.

La proteína de unión a antígeno comprende al menos dos secuencias CDRH de las secuencias de cadena pesada H1, H2, H3, H4, H5, H6, H7, H8, H9, H10, H11, H12, H13, H14, H15, H16, H17 o H18, tal como se muestra en la tabla 4A. En de nuevo una realización adicional, la proteína de unión a antígeno comprende al menos dos secuencias CDRL de las secuencias de cadena ligera L1, L2, L3, L4, L5, L6, L7, L8, L9, L10, L11, L12, L13, L14, L15, L16, L17 o L18, tal como se muestra en la tabla 4B. En todavía una realización adicional, la proteína de unión a antígeno comprende al menos dos secuencias CDRH de las secuencias de cadena pesada H1, H2, H3, H4, H5, H6, H7, H8, H9, H10, H11, H12, H13, H14, H15, H16, H17 o H18 tal como se muestra en la tabla 4A, y al menos dos CDRL de las secuencias de cadena ligera L1, L2, L3, L4, L5, L6, L7, L8, L9, L10, L11, L12, L13, L14, L15, L16, L17

: o L18 tal como se muestra en la tabla 4B.

La proteína de unión a antígeno comprende las secuencias CDRH1, CDRH2 y CDRH3 de las secuencias de cadena pesada H1, H2, H3, H4, H5, H6, H7, H8, H9, H10, H11, H12, H13, H14, H15, H16, H17 o H18 tal como se muestra en la tabla 4A. En aún otra realización, la proteína de unión a antígeno comprende las secuencias CDRL1, CDRL2 y CDRL3 de las secuencias de cadena ligera L1, L2, L3, L4, L5, L6, L7, L8, L9, L10, L11, L12, L13, L14, L15, L16, L17

: o L18 tal como se muestra en la tabla 4B.

La proteína de unión aantígeno comprende las seis CDR de L1 yH1 o L2 yH2 o L3 yH3 oL3 yH4 o L4 y H5 o L5 y H6 o L6 y H7 o L7 y H8 o L8 y H7 o L9 y H9 o L9 y H10 o L10 y H11 o L11 y H11 o L12 y H12 o L13 y H13 o L14 y H14 o L15 y H15 o L16 y H16 o L17 y H17 o L18 y H18, tal como se muestra en las tablas 4A y 4B. 16H7 es el anticuerpo preferido de la invención.

Tabla 4A-Secuencias de cadena pesada Tabla 4B-Secuencias de cadena ligera

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Las proteínas de unión a antígeno aisladas que se unen específicamente a (i) β-Klotho; (ii) FGFR1c, FGFR2c, FGFR3c o FGFR4; o (iii) un complejo que comprende β-Klotho y uno de FGFR1c, FGFR2c, FGFR3c y FGFR4 proporcionadas en el presente documento pueden ser un anticuerpo monoclonal, un anticuerpo policlonal, un anticuerpo recombinante, un anticuerpo humano, un anticuerpo humanizado, un anticuerpo quimérico, un anticuerpo multiespecífico o un fragmento de anticuerpo de los mismos.

El fragmento de anticuerpo de las proteínas de unión a antígeno aisladas proporcionadas en el presente documento pueden ser un fragmento Fab, un fragmento Fab’, un fragmento F(ab’)2, un fragmento Fv, un diacuerpo o una molécula de anticuerpo de cadena única.

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Una proteína de unión a antígeno aislada que se une específicamente a (i) β-Klotho; (ii) FGFR1c, FGFR2c, FGFR3c

: o FGFR4; o (iii) un complejo que comprende β-Klotho y uno de FGFR1.c, FGFR2c, FGFR3c y FGFR4 proporcionada en el presente documento es un anticuerpo humano y puede ser del tipo IgG1, IgG2, IgG3 o IgG4.

: o FGFR4; o (iii) un complejo que comprende β-Klotho y uno de FGFR1c, FGFR2c, FGFR3c y FGFR4 comprende un polipéptido de cadena ligera o pesada tal como se expone en las tablas 1A-1B. En algunas realizaciones, una proteína de unión a antígeno que se une específicamente a (i) β-Klotho; (ii) FGFR1c, FGFR2c, FGFR3c o FGFR4; o

(iii): un complejo que comprende β-Klotho y uno de FGFR1c, FGFR2c, FGFR3c y FGFR4 comprende un dominio ligero variable o pesado variable tal como los citados en las tablas 2A-2B. En todavía otras realizaciones, una proteína de unión a antígeno que se une específicamente a (i) β-Klotho; (ii) FGFR1c, FGFR2c, FGFR3c o FGFR4; o

(iii): un complejo que comprende β-Klotho y uno de FGFR1c, FGFR2c, FGFR3c y FGFR4 comprende una, dos o tres CDRH o una, dos o tres CDRL tal como se expone en las tablas 3A-3B, 4A-4B y la tabla 6C, a continuación. Tales proteínas de unión a antígeno y, de hecho, cualquiera de las proteínas de unión a antígeno dadas a conocer en el presente documento, pueden pegilarse con una o más moléculas de PEG, por ejemplo, moléculas de PEG que tienen un peso molecular seleccionado del grupo que consiste en 5K, 10K, 20K, 40K, 50K, 60K, 80K, 100K o mayor de 100K.

Cualquier proteína de unión a antígeno que se une específicamente a (i) β-Klotho; (ii) FGFR1c, FGFR2c, FGFR3c o FGFR4; o (iii) un complejo que comprende β-Klotho y uno de FGFR1c, FGFR2c, FGFR3c y FGFR4 proporcionada en el presente documento puede acoplarse a un grupo de marcaje y puede competir por la unión a la parte extracelular de (i) β-Klotho; (ii) FGFR1c, FGFR2c, FGFR3c o FGFR4; o (iii) un complejo que comprende β-Klotho y uno de FGFR1c, FGFR2c, FGFR3c y FGFR4 con una proteína de unión a antígeno de uno de las proteínas de unión a antígeno aisladas proporcionadas en el presente documento. La proteína de unión a antígeno aislada ilustrada en el presente documento puede reducir niveles de glucemia, disminuir los niveles de triglicéridos y colesterol o mejorar otros parámetros glucémicos y factores de riesgo cardiovascular cuando se administra a un paciente.

Tal como se apreciará, para cualquier proteína de unión a antígeno que comprende más de una CDR proporcionada en las tablas 3A-3B, y 4A-4B, puede ser útil cualquier combinación de CDR independientemente seleccionada de las secuencias representadas. Por tanto, pueden generarse proteínas de unión a antígeno con una, dos, tres, cuatro, cinco o seis de CDR independientemente seleccionadas. Sin embargo, tal como se apreciará por los expertos en la técnica, realizaciones específicas usan, en general, combinaciones de CDR que no son repetitivas, por ejemplo, proteínas de unión a antígeno que, en general, no se preparan con dos regiones CDRH2, etc.

Algunas de las proteínas de unión a antígeno que se unen específicamente a (i) β-Klotho; (ii) FGFR1c, FGFR2c, FGFR3c o FGFR4; o (iii) un complejo que comprende β-Klotho y uno de FGFR1c, FGFR2c, FGFR3c y FGFR4 que se proporcionan en el presente documento se discuten con más detalle a continuación.

Proteínas de unión a antígeno y epítopos de unión y dominios de unión

Cuando se dice que una proteína de unión a antígeno se une a un epítopo en (i) β-Klotho; (ii) FGFR1c, FGFR2c, FGFR3c o FGFR4; o (iii) un complejo que comprende β-Klotho y uno de FGFR1c, FGFR2c, FGFR3c y FGFR4, o el dominio extracelular de β-Klotho. FGFR1c, FGFR2c, FGFR3c o FGFR4, por ejemplo, lo que significa es que la proteína de unión a antígeno se une específicamente a una parte especificada de (i) β-Klotho; (ii) FGFR1c, FGFR2c, FGFR3c o FGFR4; o (iii) un complejo que comprende β-Klotho y uno de FGFR1c, FGFR2c, FGFR3c y FGFR4. En algunas realizaciones, por ejemplo, en determinados casos en los que la proteína de unión a antígeno se une solo a FGFR1c o β-Klotho, la proteína de unión a antígeno puede unirse específicamente a un polipéptido que consiste en residuos especificados (por ejemplo, un segmento especificado de -Klotho, FGFR1c, FGFR2c, FGFR3c o FGFR4, tal como aquellos residuos dados a conocer en el ejemplo 14). Por ejemplo, en determinados casos en los que una proteína de unión a antígeno interactúa tanto con β-Klotho como con uno o más de FGFR1c, FGFR2c, FGFR3c y FGFR4, la proteína de unión a antígeno puede unirse a residuos, secuencias de residuos o regiones tanto en β-Klotho como en FGFR1c, FGFR2c, FGFR3c o FGFR4, dependiendo del receptor que reconozca la proteína de unión a antígeno. La proteína de unión a antígeno se unirá a residuos, secuencia o residuos o regiones de un complejo que comprenden β-Klotho, y uno de FGFR1c, FGFR2c, FGFR3c y FGFR4, por ejemplo FGFR1c.

En cualquiera de las realizaciones anteriores, una proteína de unión a antígeno de este tipo no necesita estar en contacto con cada residuo de (i) β-Klotho; (ii) FGFR1c, FGFR2c, FGFR3c o FGFR4; o (iii) un complejo que comprende β-Klotho y uno de FGFR1c, FGFR2c, FGFR3c y FGFR4, o el dominio extracelular de las proteínas o complejos citados. Tampoco todas las sustituciones o deleciones de aminoácidos individuales dentro de (i) β-Klotho;

(ii) FGFR1c, FGFR2c, FGFR3c o FGFR4; o (iii) un complejo que comprende β-Klotho; y uno de FGFR1c, FGFR2c, FGFR3c y FGFR4, o el dominio extracelular de las proteínas o complejos citados, afectan necesariamente de manera significativa a la afinidad de unión.

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La especificidad del epítopo y el/los dominio(s) de unión de una proteína de unión a antígeno pueden determinarse mediante una variedad de métodos. Algunos métodos, por ejemplo, pueden usar partes truncadas de un antígeno. Otros métodos utilizan antígeno mutado en uno o más residuos específicos, tales como empleando una exploración con alanina o un enfoque de tipo exploración con arginina o mediante la generación y estudio de proteínas quiméricas en las que diversos dominios, regiones o aminoácidos se intercambian entre dos proteínas (por ejemplo, formas de ratón y humanas de uno o más de los antígenos o proteínas diana), o mediante ensayos de protección de proteasa.

Proteínas de unión a antígeno competidoras

En otro aspecto, se ilustran las proteínas de unión a antígeno que compiten con uno de los anticuerpos o fragmentos funcionales ejemplificados por la unión a (i) β-Klotho; (ii) FGFR1c, FGFR2c, FGFR3c o FGFR4; o (iii) un complejo que comprende β-Klotho; y uno de FGFR1c, FGFR2c, FGFR3c y FGFR4. Tales proteínas de unión a antígeno también pueden unirse al mismo epítopo que una de las proteínas de unión a antígeno ejemplificada en el presente documento o un epítopo solapante. Las proteínas de unión a antígeno y fragmentos que compiten con o se unen al mismo epítopo que las proteínas de unión a antígeno ejemplificadas muestren propiedades funcionales similares. Las proteínas de unión a antígeno y fragmentos ejemplificados incluyen aquellos con las cadenas pesadas y ligeras H1-H18 y L1-L18, dominio de las regiones variables VL1-VL18 y VH1-VH18 y las CDR proporcionadas en el presente documento, incluyendo las de las tablas 1, 2, 3, y 4. Por tanto, como ejemplo específico, las proteínas de unión a antígeno que se proporcionan incluyen aquellas que compiten con un anticuerpo que comprende:

(a): 1, 2, 3, 4, 5 o las 6 de las CDR citadas para un anticuerpo citado en las tablas 3A y 3B, y 4A y 4B y la tabla 6C, a continuación;

(b): una VH y una VL seleccionadas de VL1-V18 y VH1-VH18 y citadas para un anticuerpo citado en las tablas 2A y 2B; o

(c): dos cadenas ligeras y dos cadenas pesadas tal como se especifica para un anticuerpo citado en las tablas 1A y 12B y la tabla 6A, a continuación.

Por tanto, la presente divulgación ilustra proteínas de unión a antígeno que compiten por la unión a (i) β-Klotho; (ii) FGFR1c, FGFR2c, FGFR3c o FGFR4; o (iii) un complejo que comprende β-Klotho; y uno de FGFR1c, FGFR2c, FGFR3c y FGFR4 con un anticuerpo de referencia, en el que el anticuerpo de referencia comprende una combinación de secuencias de dominio variable de cadena ligera y cadena pesada seleccionada del grupo que consiste en L1H1, L2H2, L3H3, L3H4, L4H5, L5H6, L6H7, L7H8, L8H8, L9H9, L9H10, L10H11, L11H11, L12H12, L13H13, L14H14, L15H15, L16H16, L17H17 o L18H18. En otra realización, la presente divulgación proporciona anticuerpos humanos que compiten por la unión a (i) β-Klotho; (ii) FGFR1c, FGFR2c, FGFR3c o FGFR4; o (iii) un complejo que comprende β-Klotho y uno de FGFR1c, FGFR2c, FGFR3c y FGFR4 con un anticuerpo de referencia, en el que le anticuerpo de referencia es 17C3, 22H5, 16H7, 24H11, 18G1, 17D8, 26H11, 12E4, 12C11, 21H2, 21B4, 18B11.1, 18B11.2, 20D4, 46D11, 40D2, 37D3, 39F7, 39F1 o 39G5.

Se ilustra un anticuerpo humano aislado que se une a (i) β-Klotho; (ii) FGFR1c, FGFR2c, FGFR3c o FGFR4; o (iii) un complejo que comprende β-Klotho y uno de FGFR1c, FGFR2c, FGFR3c y FGFR4 con sustancialmente la misma Kd que un anticuerpo de referencia; inicia la señalización de tipo FGF21 en un ensayo de ELK-luciferasa in vitro al mismo grado que un anticuerpo de referencia; disminuye la glucemia; disminuye los niveles de lípidos séricos; y/o compite por la unión con dicho anticuerpo de referencia a (i) β-Klotho; (ii) FGFR1c, FGFR2c, FGFR3c o FGFR4; o

(iii) un complejo que comprende β-Klotho; y uno de FGFR1c, FGFR2c, FGFR3c y FGFR4, en el que el anticuerpo de referencia se selecciona del grupo que consiste en 17C3, 22H5, 16H7, 24H11, 18G1, 17D8, 26H11, 12E4, 12C11, 21H2, 21B4, 18B11.1, 18B11.2, 20D4, 46D11, 40D2, 37D3, 39F7, 39F1 o 39G5.

La capacidad para competir con un anticuerpo puede determinarse usando cualquier ensayo adecuado, tal como el que se describe en el ejemplo 8, en el que las proteínas de unión a antígeno 17C3, 22H5, 16H7, 24H11, 18G1, 17D8, 26H11, 12E4, 12C11, 21H2, 21B4, 18B11.1, 18B11.2, 20D4, 46D11, 40D2, 37D3, 39F7, 39F1 o 39G5 pueden usarse como anticuerpo de referencia.

Anticuerpos monoclonales

Las proteínas de unión a antígeno que se proporcionan incluyen anticuerpos monoclonales que se unen a (i) β-Klotho; (ii) FGFR1c, FGFR2c, FGFR3c o FGFR4; o (iii) un complejo que comprende β-Klotho y uno de FGFR1c, FGFR2c, FGFR3c y FGFR4, e induce la señalización de tipo FGF21 en diversos grados. Los anticuerpos monoclonales pueden producirse usando cualquier técnica conocida en la técnica, por ejemplo, inmortalizando células del bazo recogidas del animal transgénico tras la finalización del programa de inmunización. Las células del bazo pueden inmortalizarse usando cualquier técnica conocida en la técnica, por ejemplo, fusionándolas con células de mieloma para producir hibridomas. Las células de mieloma para su uso en procedimientos de fusión que producen hibridomas son preferiblemente no productores de anticuerpos, tienen alta eficacia de fusión y deficiencias de enzimas que las hacen incapaces de crecer en determinados medios selectivos que respaldan el crecimiento de sólo las células fusionadas deseadas (hibridomas). Los ejemplos de líneas celulares adecuadas para su uso en fusiones de ratón incluyen Sp-20, P3-X63/Ag8, P3-X63-Ag8.653, NSl/1.Ag 4 1, Sp210-Ag14, FO, NSO/U, MPC-11, MPC11-X45-GTG 1.7 y S194/5XXO Bul; los ejemplos de líneas celulares usadas en fusiones de rata incluyen R210.RCY3, Y3-Ag 1.2.3, IR983F y 4B210. Otras líneas celulares útiles para fusiones celulares son U-266, GM1500-GRG2, LICRLON-HMy2 y UC729-6.

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En algunos casos, se produce una línea celular de hibridoma inmunizando a un animal (por ejemplo, un animal transgénico que tiene secuencias de inmunoglobulina humana) con un FGFR1c, β-Klotho o FGFR1c y/o inmunógeno de β-Klotho (por ejemplo, un complejo soluble que comprende los dominios extracelulares de FGFR1c, FGFR2c, FGFR3c o FGFR4 y/o -Klotho tal como se muestra en los ejemplos 2 y 3; membranas en las que se expresan los dominios extracelulares de FGFR1c, FGFR2c, FGFR3c o FGFR4 y/o β- Klotho, tal como se muestra en los ejemplos 1 y 3; o células completas que expresan FGFR1c y/o β-Klotho, tal como se muestra en los ejemplos 1 y 3); recolección de células del bazo del animal inmunizado; fusionando las células del bazo recogidas con una línea celular de mieloma, generando de ese modo células de hibridoma; estableciendo líneas celulares de hibridoma a partir de las células de hibridoma e identificando una línea celular de hibridoma que produce un anticuerpo que se une a (i) β-Klotho; (ii) FGFR1c, FGFR2c, FGFR3c o FGFR4; o (iii) un complejo que comprende β-Klotho y uno de FGFR1c, FGFR2c, FGFR3c y FGFR4 (por ejemplo, tal como se describe en el ejemplo 4) y puede inducir la señalización de tipo FGF21 (por ejemplo, tal como se describe en los ejemplos 5-7). Tales líneas celulares de hibridoma, y los anticuerpos monoclonales producidos por las mismas, forman aspectos de la presente divulgación.

Pueden purificarse anticuerpos monoclonales secretados por una línea celular de hibridoma usando cualquier técnica conocida en la técnica. Los hibridomas o Acm pueden seleccionarse adicionalmente para identificar Acm con propiedades particulares, tales como la capacidad para inducir señalización de tipo FGF21. Se proporcionan ejemplos de tales selecciones en el presente documento.

Anticuerpos quiméricos y humanizados

Pueden generarse fácilmente anticuerpos quiméricos y humanizados basados en las secuencias anteriores. Un ejemplo es un anticuerpo quimérico, que es un anticuerpo compuesto de segmentos de proteínas de anticuerpos diferentes que se unen covalentemente para producir cadenas ligeras o pesadas de inmunoglobulina funcional o partes inmunológicamente funcionales de las mismas. Generalmente, una parte de la cadena pesada y/o cadena ligera es idéntica con u homóloga a una secuencia correspondiente en anticuerpos derivados de una especie particular o que pertenece a una clase o subclase de anticuerpo particular, mientras que el resto de la(s) cadena(s) es/son idéntica(s) con u homóloga(s) a una secuencia correspondiente en anticuerpos derivados de otra especie o que pertenecen a otra clase o subclase de anticuerpo. Para métodos relacionados con anticuerpos quiméricos, véase, por ejemplo, la patente estadounidense n.º 4.816.567; y Morrison et al., 1985, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:6851-6855. Se describe el injerto de CDR, por ejemplo, en la patente estadounidense n.º 6.180.370, n.º 5.693.762,n. º 5.693.761, n.º 5.585.089 y n.º 5.530.101.

Generalmente, el objetivo de producir un anticuerpo quimérico es crear una quimera en la que se maximice el número de aminoácidos del paciente/especie recipiente pretendidos. Un ejemplo es el anticuerpo “injertado con CDR”, en el que el anticuerpo comprende una o más regiones determinantes de complementariedad (CDR) a partir de una especie particular o que pertenece a una clase o subclase de anticuerpo particular, mientras que el resto de la(s) cadena(s) de anticuerpos es/son idéntica(s) con u homóloga a una secuencia correspondiente en anticuerpos derivados de otras especies o que pertenecen a otra clase o subclase de anticuerpo. Para su uso en humanos, la región variable o CDR seleccionadas de un anticuerpo de roedor a menudo se injertan en un anticuerpo humano, reemplazando las regiones variables que se producen de manera natural o CDR del anticuerpo humano.

Un tipo de anticuerpo quimérico útil es un anticuerpo “humanizado”. Generalmente, un anticuerpo humanizado se produce a partir de un anticuerpo monoclonal producido inicialmente en un animal no humano. Determinados residuos de aminoácido en este anticuerpo monoclonal, normalmente de partes de reconocimiento de no antígenos del anticuerpo, se modifican para ser homólogos a los residuos correspondientes en un anticuerpo humano de isotipo correspondiente. La humanización puede realizarse, por ejemplo, usando diversos métodos sustituyendo al menos una parte de una región variable de roedor para las regiones correspondientes de un anticuerpo humano (véase, por ejemplo, la patente estadounidense n.º 5.585.089 y n.º 5.693.762; Jones et al., 1986, Nature 321:522525; Riechmann et al., 1988, Nature 332:323-27; Verhoeyen et al., 1988, Science 239:1534-1536).

En un aspecto, las CDR de las regiones variables de cadena ligera y pesada de los anticuerpos proporcionados en el presente documento (por ejemplo, en las tablas 3 y 4) se injertan en regiones de marco (FR) a partir de anticuerpos de la misma o una especie filogenética diferente. Por ejemplo, las CDR de las regiones variables de cadena pesada y ligera VH1, VH2, VH3, VH4, VH5, VH6, VH7, VH8, VH9, VH10, VH11, VH12, VH13, VH14, VH15, VH H17 o VH18 y/o VL1, VL2, VL3, VL4, VL5, VL6, VL7, VL8, VL9, VL10, VL11, VH12, VL13, VL14, VL15, VL16, VL17 o VL18 pueden injertarse en FR humanas de consenso. Para crear FR humanas de consenso, las FR de varias secuencias de aminoácidos de cadena pesada o cadena ligera humanas pueden alinearse para identificar una secuencia de aminoácidos de consenso. En otras realizaciones, las FR de una cadena pesada o cadena ligera dadas a conocer en el presente documento se sustituyen con las FR de una cadena pesada o cadena ligera diferente. En un aspecto, no se sustituyen los aminoácidos poco comunes en las FR de las cadenas pesadas y ligeras de una proteína de unión a antígeno (por ejemplo, un anticuerpo) que se une específicamente a (i) β-Klotho; (ii) FGFR1c, FGFR2c, FGFR3c o FGFR4; o (iii) un complejo que comprende β-Klotho y uno de FGFR1c, FGFR2c, FGFR3c y FGFR4, mientras que se sustituyen el resto de los aminoácidos de FR. Un “aminoácido poco común” es un aminoácido específico que está en una posición en la que este aminoácido particular no se encuentra habitualmente en una FR. Alternativamente, pueden usarse las regiones variables injertadas de una cadena pesada o ligera con una región constante que es diferente de la región constante de esa cadena pesada o ligera particular tal como se da a conocer en el presente documento. En otras realizaciones, las regiones variables injertadas son parte de un anticuerpo de Fv de cadena única.

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En determinadas realizaciones, las regiones constantes de las especies distintas de la humana pueden usarse junto con la(s) región(es) variable(s) humana(s) para producir anticuerpos híbridos.

Anticuerpos completamente humanos

También se proporcionan anticuerpos completamente humanos mediante la presente divulgación. Los métodos están disponibles para producir anticuerpos completamente humanos específicos para un antígeno dado sin exponer seres humanos al antígeno (“anticuerpos completamente humanos”). Un medio específico proporcionado para implementar la producción de anticuerpos completamente humanos es la “humanización” del sistema inmune humoral del ratón. La introducción de loci de inmunoglobulina (Ig) humana en ratones en los que se han inactivado los genes de Ig endógenos es un medio para producir anticuerpos completamente humanos monoclonales (Acm) en ratón, un animal que puede inmunizarse con cualquier antígeno deseable. Usando anticuerpos completamente humanos pueden minimizarse las respuestas inmunógena y alérgica que pueden provocarse a veces administrando Acm de ratón o derivado de ratón a humanos como agentes terapéuticos.

Pueden producirse anticuerpos completamente humanos inmunizando animales transgénicos (normalmente ratones) que pueden producir un repertorio de anticuerpos humanos en ausencia de producción de inmunoglobulina endógena. Los antígenos para este fin tienen normalmente seis o más aminoácidos contiguos, y se conjugan opcionalmente con un portador, tal como un hapteno. Véase, por ejemplo, Jakobovits et al., (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:2551-2555; Jakobovits et al., (1993) Nature 362:255-258; y Bruggermann et al., (1993) Year in Immunol.

7:33. En un ejemplo de un método de este tipo, se producen animales transgénicos incapacitando los loci de inmunoglobulina de ratón endógenos que codifican para las cadenas de inmunoglobulina pesada y ligera de ratón e insertando en el genoma de ratón grandes fragmentos de loci que contiene ADN de genoma humano que codifica para proteínas de cadena pesada y ligera humanas. Los animales parcialmente modificados, que tienen menos que el complemento completo de loci de inmunoglobulina humana, se cruzan luego para obtener un animal que tenga todas las modificaciones del sistema inmune deseadas. Cuando se administra un inmunógeno, estos animales transgénicos producen anticuerpos que son inmunoespecíficos para el inmunógeno pero tienen secuencias de aminoácidos murinos en lugar de humanos, incluyendo las regiones variables. Para más detalle de tales métodos, véase, por ejemplo, WO96/33735 y WO94/02602. Métodos adicionales relacionados con ratones transgénicos para producir anticuerpos humanos se describen en la patente estadounidense n.º 5.545.807; n.º 6.713.610; n.º 6.673.986; n.º 6.162.963; n.º 5.545.807; n.º 6.300.129; n.º 6.255.458; n.º 5.877.397; n.º 5.874.299 y n.º 5.545.806; en las publicaciones PCT WO91/1074 WO90/04036 y en EP 546073B1 y EP 546073A1.

Los ratones transgénicos descritos anteriormente, denominados en el presente documento como ratones “HuMab”, contienen un minilocus de gen de inmunoglobulina humana que codifica secuencias de inmunoglobulina de cadena pesada ([µ, mu] y λ, gamma]) y ligera [κ, kappa] ligera humanas no reordenadas, junto con mutaciones dirigidas que inactivan los loci de cadena µ [mu] y κ [kappa] endógenos (Lonberg et al., 1994, Nature 368:856-859). Por consiguiente, los ratones muestran expresión reducida de IgM o [κ, kappa] de ratón y en respuesta a la inmunización y los transgenes de cadena pesada y ligera humanos introducidos sufren conmutación de clase y mutación somática para generar anticuerpos monoclonales de IgG humana [κ, kappa] de alta afinidad (Lonberg et al., anteriormente.; Lonberg y Huszar, (1995) Intern. Rev. Immunol. 13: 65-93; Harding y Lonberg, (1995) Ann. N.Y Acad. Sci. 764:536546). La preparación de ratones HuMab se describe en detalle en Taylor et al., (1992) Nucleics Acids Research 20:6287-6295; Chen et al., (1993) International Immunology 5:647-656; Tuaillon et al., (1994) J. Immunol. 152:29122920; Lonberg et al., (1994) Nature 368:856-859; Lonberg, (1994) Handbook of Exp. Pharmacology 113:49-101; Taylor et al., (1994) International Immunology 6:579-591; Lonberg y Huszar, (1995) Intern. Rev. Immunol. 13:65-93; Harding y Lonberg, (1995) Ann. N.Y Acad. Sci. 764:536-546; Fishwild et al., (1996) Nature Biotechnology 14:845

851. Véase, además la patente estadounidense n.º 5.545.806; n.º 5.569.825; n.º 5.625.126; n.º 5.633.425; n.º 5.789.650; n.º 5.877.397; n.º 5.661.016; n.º 5.814.318; n.º 5.874.299; y n.º 5.770.429; así como la patente estadounidense n.º 5.545.807; las publicaciones internacionales n.os WO 93/1227; WO 92/22646; y WO 92/03918. Las tecnologías utilizadas para producir anticuerpos humanos en estos ratones transgénicos se dan a conocer también en el documento WO 98/24893, y Mendez et al., (1997) Nature Genetics 15:146-15 6. Por ejemplo, las cepas de ratones transgénicos HCo7 y HCo12 pueden usarse para generar proteínas de unión a antígeno (por ejemplo, anticuerpos) que se unen a (i) β-Klotho; (ii) FGFR1c, FGFR2c, FGFR3c o FGFR4; o (iii) un complejo que comprende β-Klotho y uno de FGFR1c, FGFR2c, FGFR3c y FGFR4 y puede inducir señalización de tipo FGF21. Se proporcionan más detalles con respecto a la producción de anticuerpos humanos usando ratones transgénicos en los ejemplos a continuación.

Usando tecnología de hibridomas, pueden producirse Acm humanos específicos de antígeno con la especificidad deseada y seleccionarse de ratones transgénicos tales como los descritos anteriormente. Tales anticuerpos pueden clonarse y expresarse usando un vector y célula huésped adecuados o los anticuerpos pueden recogerse de células de hibridoma cultivadas.

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Los anticuerpos completamente humanos también pueden derivarse de bibliotecas de presentación en fago (tal como se da a conocer en Hoogenboom et al., (1991) J. Mol. Biol. 227:381; y Marks et al., (1991) J. Mol. Biol. 222:581). Las técnicas de presentación en fago imitan la selección inmune a través de la presentación de repertorios de anticuerpos en la superficie de bacteriófago filamentoso y la posterior selección de fago por su unión a un antígeno de elección. Una de tales técnicas se describe en la publicación PCT n.º WO 99/10494, que describe el aislamiento de anticuerpos agonistas funcionales y de alta afinidad para los receptores MPL y msk usando un enfoque de este tipo.

Proteínas de unión a antígeno biespecíficas o bifuncionales

También se proporcionan anticuerpos biespecíficos y bifuncionales que incluyen una o más CDR o una o más regiones variables tal como se describe anteriormente. Un anticuerpo biespecífico o bifuncional en algunos casos puede ser un anticuerpo híbrido artificial que tiene dos pares de cadena pesada/ligera diferentes y dos sitios de unión diferentes. Pueden producirse anticuerpos biespecíficos mediante una variedad de métodos incluyendo, pero sin limitarse a, fusión de hibridomas o unión de fragmentos de Fab’. Véase, por ejemplo, Songsivilai y Lachmann, 1990, Clin. Exp. Immunol. 79:315-321; Kostelny et al., 1992, J. Immunol. 148:1547-1553. Cuando una proteína de unión a antígeno de la presente divulgación se une a (i) tanto β-Klotho como uno o más de FGFR1c, FGFR2c, FGFR3c o FGFR4; o (ii) un complejo que comprende β-Klotho y uno de FGFR1c, FGFR2c, FGFR3c y FGFR4, la unión puede conducir a la activación de actividad de tipo FGF21 tal como se mide mediante los ensayos funcionales y de señalización de tipo FGF21 descritos en los ejemplos 5-7; cuando una proteína de unión a antígeno de este tipo es un anticuerpo se denomina anticuerpo agonista.

Diversas otras formas

Algunas de las proteínas de unión a antígeno que se unen específicamente a (i) β-Klotho; (ii) FGFR1c, FGFR2c, FGFR3c o FGFR4; o (iii) un complejo que comprende β-Klotho y uno de FGFR1c, FGFR2c, FGFR3c y FGFR4 que se proporcionan en la presente divulgación incluyen formas variantes de las proteínas de unión a antígeno dadas a conocer en el presente documento (por ejemplo, aquellas que tienen las secuencias citadas en las tablas 1-4).

En diversas realizaciones, las proteínas de unión a antígeno dadas a conocer en el presente documento pueden comprender uno o más aminoácidos que no se producen de manera natural. Por ejemplo, algunas de las proteínas de unión a antígeno tienen una o más sustituciones de aminoácido que no se producen de manera natural en una o más de las cadena pesadas o ligeras, regiones variables o CDR citadas en las tablas 1-4. Los ejemplos de aminoácidos no naturales (que pueden sustituirse por cualquier aminoácido que se produce de manera natural encontrado en cualquier secuencia dada a conocer en el presente documento, según se desee) incluyen: 4hidroxiprolina, γ-carboxiglutamato, ε-N,N,N-trimetil lisina, ε-N-acetil lisina, O-fosfoserina, N-acetilserina, Nformilmetionina, ε-metilhistidina, 5-hidroxilisina, σ-N-metilarginina, y otros aminoácidos e iminoácidos similares (por ejemplo, 4-hidroxiprolina). En la notación de polipéptidos usada en el presente documento, la dirección de la izquierda es la dirección amino-terminal y la dirección de la derecha es la dirección carboxi-terminal, según la convención y el uso convencionales. Una lista no limitativa de ejemplos de aminoácidos que no se producen de manera natural que pueden insertarse en una secuencia de proteína de unión a antígeno o sustituirse por un residuo natural en una secuencia de unión a antígeno incluyen β-aminoácidos, homoaminoácidos, aminoácidos cíclicos y aminoácidos con cadenas laterales derivadas. Los ejemplos incluyen (en la forma L o forma F; abreviada como entre paréntesis): citrulina (Cit), homocitrulina (hCit), Nα-metilcitrulina (NMeCit), Nα-metilhomocitrulina (Nα-MeHoCit), ornitina (Orn), Nα-Metilornitina (Nα-MeOrn o NMeOrn), sarcosina (Sar), homolisina (hLys o hK), homoarginina (hArg

o hR), homoglutamina (hQ), Nα-metilarginina (NMeR), N -metilleucina (Nα-MeL o NMeL), N-metilhomolisina (NMeHoK), Nα-metilglutamina (NMeQ), norleucina (Nle), norvalina (Nva), 1,2,3,4-tetrahidroisoquinolina (Tic), ácido octahidroindola-2-carboxílico (Oic), 3-(1-naftil)alanina (1-Nal), 3-(2-nafftil)alanina (2-Nal), 1,2,3,4tetrahidroisoquinolina (Tic), 2-indanilglicina (IgI), para-yodofenilalanina (pI-Phe), para-aminofenilalanina (4AmP o 4Amino-Phe), 4-guanidino fenilalanina (Guf), glicilisina (abreviado “K(Nε-glicil)” o “K(glicil)” o “K(gly)”), nitrofenilalanina (nitrophe), aminofenilalanina (aminofe o Amino-Phe), bencilfenilalanina (bencilfe), ácido γ-carboxiglutámico (γcarboxiglu), hidroxiprolina (hidroxipro), p-carboxil-fenilalanina (Cpa), ácido α-aminoadípico (Aad), Nα-metil valina (NMeVal), N-α-metil leucina (NMeLeu), Nα-metilnorleucina (NMeNle), ciclopentilglicina (Cpg), ciclohexilglicina (Chg), acetilarginina (acetilarg), ácido α, β-diaminopropiónoico (Dpr), ácido α,γ-diaminobutírico (Dab), ácido diaminopropiónico (Dap), ciclohexilalanina (Cha), 4-metil-fenilalanina (MePhe), β,β-difenilalanina (BiPhA), ácido aminobutírico (Abu), 4-fenil-fenilalanina (o bifenilalanina; 4Bip), ácido α-amino-isobutírico (Aib), beta-alanina, ácido beta-aminopropiónico, N-etilglicina, N-etilaspargina, hidroxilisina, alo-hidroxilisina, isodesmosina, alo-isoleucina, Nmetilglicina, N-metilisoleucina, N-metilvalina, 4-hidroxiprolina (Hip), γ-carboxiglutamato, ε-N,N,N-trimetil lisina, ε-Nacetil lisina, O-fosfoserina, N-acetilserina, N-formilmetionina, 3-metilhistidina, 5-hidroxilisina, ω-metilarginina, ácido 4amino-O-ftálico (4APA) y otros aminoácidos similares y formas derivadas de cualquiera de aquellos específicamente citados.

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Adicionalmente, las proteínas de unión a antígeno pueden tener una o más sustituciones de aminoácidos conservativas en una o más de las cadenas pesadas o ligeras, regiones variables o CDR citadas en las tablas 1-4. Los aminoácidos que se producen de manera natural pueden dividirse en clases basadas en propiedades de cadena lateral comunes:

1) hidrófobo: norleucina, Met, Ala, Val, Leu, Ile;

2) hidrófilo neutral: Cys, Ser, Thr, Asn, Gln;

3) ácido: Asp, Glu;

4) básico: His, Lys, Arg;

5) residuos que influyen en la orientación de la cadena: Gly, Pro; y

6) aromático: Trp, Tyr, Phe.

Las sustituciones de aminoácidos conservativas pueden implicar el intercambio de un elemento de una de estas clases con otro elemento de la misma clase. Las sustituciones de aminoácidos conservativas pueden abarcar residuos de aminoácidos que no se producen de manera natural, que se incorporan normalmente mediante síntesis de péptidos química en lugar de mediante síntesis en sistemas biológicos. Véase la tabla 5, a continuación. Estos incluyen peptidomiméticos y otras formas inversas o invertidas de restos de aminoácidos.

Las sustituciones no conservativas pueden implicar el intercambio de un elemento de una de las clases anteriores por un elemento de otra clase. Tales residuos sustituidos pueden introducirse en regiones del anticuerpo que son homólogas a anticuerpos humanos o en las regiones no homólogas de la molécula.

Al realizar tales cambios, según determinadas realizaciones, puede considerarse el índice hidropático de aminoácidos. El perfil hidropático de una proteína se calcula asignando a cada aminoácido un valor numérico (“índice hidropático”) y luego promediando repetitivamente estos valores a lo largo de la cadena peptídica. A cada aminoácido se le ha asignado un índice hidropático basándose en sus características de hidrofobicidad y carga. Son: isoleucina (+4,5); valina (+4,2); leucina (+3,8); fenilalanina (+2,8); cisteína/cistina (+2,5); metionina (+1,9); alanina (+1,8); glicina (-0,4); treonina (-0,7); serina (-0,8); triptófano (-0,9); tirosina (-1,3); prolina (-1,6); histidina (-3,2); glutamato (-3,5); glutamina (-3,5); aspartato (-3,5); asparagina (-3,5); lisina (-3,9); y arginina (-4,5).

La importancia del perfil hidropático para conferir función biológica interactiva a una proteína se entiende en la técnica (véase, por ejemplo, Kyte et al., 1982, J. Mol. Biol. 157:105-131). Se sabe que determinados aminoácidos pueden sustituirse por otros aminoácidos que tienen un índice o puntuación hidropática similar y todavía conservan una actividad biológica similar. Al realizar cambios basados en el índice hidropático, en determinadas realizaciones, se incluye la sustitución de aminoácidos cuyos índices hidropáticos están dentro de ±2. En algunos aspectos, se incluyen aquellos que están dentro de ±1 y en otros aspectos, se incluyen aquellos que están dentro de ±0,5.

También se entiende en la técnica que la sustitución de aminoácidos similares puede producirse eficazmente basándose en la hidrofilicidad, particularmente cuando la proteína o péptido biológicamente funcional creado de ese modo está destinado para su uso en realizaciones inmunológicas, como en el caso presente. En determinadas realizaciones, la mayor hidrofilicidad promedio local de una proteína, tal como se rige por la hidrofilicidad de sus aminoácidos adyacentes, se correlaciona con su inmunogenicidad y unión a antígeno o inmunogenicidad, es decir, con una propiedad biológica de la proteína.

Los siguientes valores de hidrofilicidad se han asignado a estos residuos de aminoácidos: arginina (+3,0); lisina (+3,0); aspartato (+3,061); glutamato (+3,0±1); serina (+0,3); asparagina (+0,2); glutamina (+0,2); glicina (0); treonina (-0,4); prolina (-0,5±1); alanina (-0,5); histidina (-0,5); cisteína (-1,0); metionina (-1,3); valina (-1,5); leucina (-1,8); isoleucina (-1,8); tirosina (-2,3); fenilalanina (-2,5) y triptófano (-3,4). Al realizar cambios basados en valores de hidrofilicidad similares, en determinadas realizaciones, se incluye la sustitución de aminoácidos cuyos valores de hidrofilicidad están dentro de ±2, en otras realizaciones, se incluyen aquellos que están dentro de ±1 y en todavía otras realizaciones, se incluyen aquellos que están dentro de ±0,5. En algunos casos, también pueden identificarse epítopos de las secuencias de aminoácidos primarias basándose en la hidrofilicidad. Estas regiones también se denominan “regiones de núcleo epitópicas.”

Se exponen sustituciones de aminoácidos conservativas a modo de ejemplo en la tabla 5.

Tabla 5

Sustituciones de aminoácidos conservativas 5

Residuo original: Sustituciones a modo de ejemplo

Ala: Ser

Arg: Lys

Asn: Gln, His

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Asp: Glu

Cys: Ser

Gln: Asn

Glu: Asp

Gly: Pro

His: Asn, Gln

Ile: Leu, Val

Leu: Ile, Val

Lys: Arg, Gln, Glu

Met: Leu, Ile

Phe: Met, Leu, Tyr

Ser: Thr

Thr: Ser

Trp: Tyr

Tyr: Trp, Phe

Val: Ile, Leu

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Un experto en la técnica podrá determinar variantes adecuadas de polipéptidos tal como se expone en el presente documento usando técnicas bien conocidas acopladas con la información proporcionada en el presente documento. Un experto en la técnica puede identificar aéreas adecuadas de la molécula que pueden cambiarse sin destruir la actividad dirigiéndose a regiones que no se cree que sean importantes para la actividad. El experto en la técnica también podrá identificar residuos y partes de las moléculas que se conservan entre polipéptidos similares. En realizaciones adicionales, incluso áreas que pueden ser importantes para la actividad biológica o para la estructura pueden someterse a sustituciones de aminoácidos conservativas sin destruir la actividad biológica o sin afectar negativamente a la estructura de polipéptido.

Adicionalmente, un experto en la técnica puede revisar estudios de estructura-función que identifican residuos en polipéptidos similares que son importantes para la actividad o estructura. En vista de una comparación de este tipo, puede predecirse la importancia de los residuos de aminoácidos en una proteína que corresponden a residuos de aminoácidos importantes para la actividad o estructura en proteínas similares. Un experto en la técnica puede optar por sustituciones de aminoácidos químicamente similares para tales residuos de aminoácidos importantes predichos.

Un experto en la técnica también puede analizar la estructura tridimensional y secuencia de aminoácidos en relación con esa estructura en polipéptidos similares. En vista de tal información, un experto en la técnica puede predecir la alineación de residuos de aminoácidos de un anticuerpo con respecto a su estructura tridimensional. Un experto en la técnica puede elegir no realizar cambios radicales en los residuos de aminoácidos que se prevé que estén en la superficie de la proteína, puesto que tales residuos pueden estar implicados en interacciones importantes con otras moléculas. Además, un experto en la técnica puede generar variantes de prueba que contienen una única sustitución de aminoácido en cada residuo de aminoácido deseado. Estas variantes pueden seleccionarse luego usando ensayos para la señalización de tipo FGF21, (véanse los ejemplos proporcionados en el presente documento) proporcionando así información con respecto a qué aminoácidos pueden cambiarse y cuáles no deben cambiarse. En otras palabras, basándose en la información obtenida a partir de tales experimentos de rutina, un experto en la técnica puede determinar fácilmente las posiciones de aminoácidos en las que se deben evitar sustituciones adicionales o bien solas o bien en combinación con otras mutaciones.

Varias publicaciones científicas se han dedicado a la predicción de la estructura secundaria. Véase, Moult, (1996) Curr. Op. in Biotech. 7:422-427; Chou et al., (1974) Biochem. 13:222-245; Chou et al., (1974) Biochemistry 113:211222; Chou et al., (1978) Adv. Enzymol. Relat. Areas Mol. Biol. 47:45-148; Chou et al., (1979) Ann. Rev. Biochem. 47:251-276; y Chou et al., (1979) Biophys. J. 26:367-384. Además, actualmente se dispone de programas informáticos para ayudar a predecir la estructura secundaria. Un método para predecir la estructura secundaria se basa en el modelado de homología. Por ejemplo, dos polipéptidos o proteínas que tienen una identidad de secuencia de mayor del 30% o similitud mayor del 40% pueden tener topologías estructurales similares. El crecimiento de la base de datos estructural de proteínas (PDB) ha proporcionado una predictibilidad potenciada de la estructura secundaria, incluyendo el número potencial de pliegues dentro de una estructura de polipéptido o proteína. Véase, Holm et al., (1999) Nucl. Acid. Res. 27:244-247. Se ha sugerido (Brenner et al., (1997) Curr. Op. Struct. Biol. 7:369-376) que existe un número limitado de pliegues en un polipéptido o proteína dado y una vez que se ha resuelto un número crítico de estructuras, la predicción estructural se volverá drásticamente más precisa.

Los métodos adicionales para predecir la estructura secundaria incluyen “enhebrado” (Jones, (1997) Curr. Opin. Struct. Biol. 7:377-387; Sippl et ad., (1996) Structure 4:15-19), “análisis del perfil” (Bowie et al et al., (1990) Met. Enzym. 183:146-159; Gribskov et al., (1987) Proc. Nat. Acad. Sci. 84:43554358), y “enlace evolutivo” (véase, Holm, (1999) citado anteriormente; y Brenner, (1997) citado anteriormente).

En algunas realizaciones, se producen sustituciones de aminoácidos que: (1) reducen la susceptibilidad a la proteólisis, (2) reducen la susceptibilidad a la oxidación, (3) alteran la afinidad de unión para formar complejos proteicos, (4) alteran las afinidades de unión al ligando o antígeno y/o (4) confieren o modifican otras propiedades fisicoquímicas o funcionales en tales polipéptidos. Por ejemplo, pueden producirse sustituciones de aminoácidos únicas o múltiples (en determinadas realizaciones, sustituciones de aminoácidos conservativas) en la secuencia que se produce de manera natural. Las sustituciones pueden producirse en la parte del anticuerpo que está fuera del/de los dominio(s) que forman contactos intermoleculares). En tales realizaciones, pueden usarse sustituciones de aminoácidos conservativas que no cambian sustancialmente las características estructurales de la secuencia madre (por ejemplo, uno o más aminoácidos de reemplazo que no alteran la estructura secundaria que caracteriza la proteína de unión a antígeno madre o nativa). Ejemplos de estructuras secundarias y terciarias de polipéptidos reconocidas en la técnica se describen en Proteins, Structures and Molecular Principles (Creighton, Ed.), 1984, W.

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H. Nueva York: Freeman y Company; Introduction to Protein Structure (Branden y Tooze, eds.), 1991, Nueva York: Garland Publishing; y Thornton et al., (1991) Nature 354:105.

Las variantes de anticuerpo preferidas adicionales incluyen variantes de cisteína en las que uno o más residuos de cisteína en la secuencia de aminoácidos madre o nativa se eliminan de o sustituyen con otro aminoácido (por ejemplo, serina). Las variantes de cisteína son útiles, entre otros, cuando los anticuerpos deben replegarse en una conformación biológicamente activa. Las variantes de cisteína pueden tener menos residuos de cisteína que el anticuerpo nativo y normalmente tiene un número par para minimizar las interacciones resultantes de cisteínas no emparejadas.

Las cadenas pesadas y ligeras, dominios de regiones variables y CDR que se dan a conocer pueden usarse para preparar polipéptidos que contienen una región de unión a antígeno que puede unirse específicamente a (i) β-Klotho;

(ii): FGFR1c, FGFR2c, FGFR3c o FGFR4; o (iii) un complejo que comprende ββ-Klotho; (ii) FGFR1c, FGFR2c, FGFR3c o FGFR4; o (iii) un complejo que comprende β-Klotho; y uno de FGFR1c, FGFR2c, FGFR3c y FGFR4 o un epítopo del mismo).

(ii): FGFR1c, FGFR2c, FGFR3c o FGFR4; o (iii) un complejo que comprende β-Klotho y uno de FGFR1c, FGFR2c, FGFR3c y FGFR4 y puede inducir señalización de tipo FGF21. Por ejemplo, una o más de las CDR citadas en las tablas 3 y 4 pueden incorporarse en una molécula (por ejemplo, un polipéptido) que es estructuralmente similar a un “medio” anticuerpo que comprende la cadena pesada, la cadena ligera de una proteína de unión a antígeno emparejada con un fragmento de Fc de modo que la región de unión a antígeno es monovalente (como un fragmento de Fab) pero con un resto de Fc dimérico.

También se proporcionan miméticos (por ejemplo, “miméticos de péptido” o “peptidomiméticos”) basados en los dominios de regiones variables y CDR que se describen en el presente documento. Estos análogos pueden ser peptídicos, no peptídicos o combinaciones de regiones peptídicas y no peptídicas. Fauchere, 1986, Adv. Drug Res. 15:29; Veber y Freidinger, 1985, TINS p. 392; y Evans et al., 1987, J. Med. Chem. 30:1229. Pueden usarse miméticos de péptido que son estructuralmente similares a los péptidos terapéuticamente útiles para producir un efecto terapéutico o profiláctico similar. Tales compuestos se desarrollan a menudo con el adyuvante de modelado molecular informatizado. Generalmente, los peptidomiméticos son proteínas que son estructuralmente similares a un anticuerpo que presenta una actividad biológica deseada, tal como en el presente documento la capacidad de unirse específicamente a (i) β-Klotho; (ii) FGFR1c, FGFR2c, FGFR3c o FGFR4; o (iii) un complejo que comprende β-Klotho y uno de FGFR1c, FGFR2c, FGFR3c y FGFR4, pero tienen uno o más enlaces peptídicos opcionalmente sustituidos por un enlace seleccionado de: -CH2NH-, -CH2S-, -CH2-CH2-, -CHCH-(cis y trans), -COCH2-, -CH(OH)CH2-, y -CH2SO-, mediante métodos bien conocidos en la técnica. Puede usarse la sustitución sistemática de uno o más aminoácidos de una secuencia de consenso con un D-aminoácido del mismo tipo (por ejemplo, D-lisina en lugar de L-lisina) en determinadas realizaciones para generar proteínas más estables. Además, pueden generarse péptidos restringidos que comprenden una secuencia de consenso o una variación de secuencia de consenso sustancialmente idéntica mediante métodos conocidos en la técnica (Rizo y Gierasch, 1992, Ann. Rev. Biochem. 61:387), por ejemplo, añadiendo residuos de cisteína internos que pueden formar puentes disulfuro intramoleculares que ciclan el péptido.

También se proporcionan los derivados de las proteínas de unión a antígeno que se unen específicamente a (i) β-Klotho; (ii) FGFR1c, FGFR2c, FGFR3c o FGFR4; o (iii) un complejo que comprende β-Klotho y uno de FGFR1c, FGFR2c, FGFR3c y FGFR4 que se describen en el presente documento. Las proteínas de unión a antígeno derivadas pueden comprender cualquier molécula o sustancia que confiere una propiedad deseada al anticuerpo o fragmento, tal como una semivida aumentada en un uso particular. La proteína de unión a antígeno derivada puede comprender, por ejemplo, un resto detectable (o marcaje) (por ejemplo, una molécula radioactiva, colorimétrica, antigénica o enzimática, una perla detectable (tal como una perla magnética o electrodensa (por ejemplo, oro)), o una molécula que se une a otra molécula (por ejemplo, biotina o estreptavidina)), un resto terapéutico o de diagnóstico (por ejemplo, un resto radioactivo, citotóxico o farmacéuticamente activo) o una molécula que aumenta la idoneidad de la proteína de unión a antígeno para un uso particular (por ejemplo, administración a un sujeto, tal como un sujeto humano u otros usos in vivo o in vitro). Los ejemplos de moléculas que pueden usarse para derivar una proteína de unión a antígeno incluyen albúmina (por ejemplo, albúmina sérica humana) y polietileneglicol (PEG). Los derivados unidos a albúmina y pegilados de proteínas de unión a antígeno pueden prepararse usando técnicas bien conocidas en la técnica. Determinadas proteínas de unión a antígeno incluyen un polipéptido de cadena sencilla pegilado tal como se describe en el presente documento. En una realización, la proteína de unión a antígeno está conjugada o unida de otro modo a transtiretina (TTR) o un variante de TTR. La TTR o variante de TTR puede modificarse químicamente con, por ejemplo, un producto químico seleccionado del grupo que consiste en dextrano, poli(n-vinilpirrolidona), polietileneglicoles, homopolímeros de propropilenglicol, copolímeros de óxido de polipropileno /óxido de etileno, polioles polioxietilados y alcoholes polivinílicos.

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Otros derivados incluyen conjugados covalentes y agregativos de las proteínas de unión a antígeno que se unen específicamente a (i) β-Klotho; (ii) FGFR1c, FGFR2c, FGFR3c o FGFR4; o (iii) un complejo que comprende β-Klotho; y uno de FGFR1c, FGFR2c, FGFR3c y FGFR4 que se dan a conocer en el presente documento con otras proteínas

o polipéptidos, tales como por expresión de proteínas recombinantes de fusión que comprenden polipéptidos heterólogos fusionados al extremo N-terminal o extremo C-terminal de una proteína de unión a antígeno que induce señalización de tipo FGF21. Por ejemplo, el péptido conjugado puede ser un polipéptido (o líder) de señal heterólogo, por ejemplo, el líder de factor alfa de levadura o un péptido tal como un marcador de epítopo. Una proteína de fusión que contiene una proteína de unión a antígeno de la presente divulgación puede comprender péptidos añadidos para facilitar la purificación o identificación de una proteína de unión a antígeno que se une específicamente a (i) β-Klotho; (ii) FGFR1c, FGFR2c, FGFR3c o FGFR4; o (iii) un complejo que comprende ββ-Klotho; (ii) FGFR1c, FGFR2c, FGFR3c o FGFR4; o (iii) un complejo que comprende β-Klotho y uno de FGFR1c, FGFR2c, FGFR3c y FGFR4 también puede unirse al péptido FLAG tal como se describe en Hopp et al., 1988, Bio/Technology 6:1204; y la patente estadounidense n.º 5.011.912. El péptido FLAG es altamente antigénico y proporciona un epítopo reversiblemente unido mediante un anticuerpo monoclonal específico (Acm), que permite un ensayo rápido y una purificación fácil de la proteína recombinante expresada. Los reactivos útiles para preparar proteínas de fusión en las que el péptido FLAG se fusiona a un polipéptido dado están disponible comercialmente (Sigma, St. Louis, MO).

Los multímeros que comprenden una o más proteínas de unión a antígeno que se unen específicamente a (i) β-Klotho; (ii) FGFR1c, FGFR2c, FGFR3c o FGFR4; o (iii) un complejo que comprende β-Klotho y uno de FGFR1c, FGFR2c, FGFR3c y FGFR4 forman otro aspecto de la presente divulgación. Los multímeros pueden adoptar la forma de dímeros, trímeros o multímeros mayores unidos covalentemente o unidos no covalentemente. Se contemplan multímeros que comprenden dos o más proteínas de unión a antígeno que se unen a (i) β-Klotho; (ii) FGFR1c, FGFR2c, FGFR3c o FGFR4; o (iii) un complejo que comprende β-Klotho y uno de FGFR1c, FGFR2c, FGFR3c y FGFR4 y que puede inducir señalización de tipo FGF21 para su uso como agentes terapéuticos, agentes de diagnóstico y también para otros usos, siendo un ejemplo de un multímero de este tipo un homodímero. Otros multímeros a modo de ejemplo incluyen heterodímeros, homotrímeros, heterotrímeros, homotetrámeros, heterotetrámeros, etc.

Una realización está dirigida a los multímeros que comprenden múltiples proteínas de unión a antígeno que se unen específicamente a (i) β-Klotho; (ii) FGFR1c, FGFR2c, FGFR3c o FGFR4; o (iii) un complejo que comprende β-Klotho y uno de FGFR1c, FGFR2c, FGFR3c y FGFR4 unido a través de interacciones covalentes o no covalentes entre restos de péptidos fusionados a una proteína de unión a antígeno que se une específicamente a (i) β-Klotho; (ii) FGFR1c, FGFR2c, FGFR3c o FGFR4; o (iii) un complejo que comprende β-Klotho y uno de FGFR1c, FGFR2c, FGFR3c y FGFR4. Tales péptidos pueden ser ligadores peptídicos (espaciadores) o que tienen la propiedad de promover la multimerización. Las cremalleras de leucina y determinados derivados de polipéptidos de anticuerpos están entre los péptidos que pueden promover la multimerización de proteínas de unión a antígeno unidas a los mismos, tal como se describe con más detalle en el presente documento.

En realizaciones particulares, los multímeros comprenden desde dos hasta cuatro proteínas de unión a antígeno que se unen a (i) β- Klotho; (ii) FGFR1c, FGFR2c, FGFR3c o FGFR4; o (iii) un complejo que comprende β-Klotho y uno de FGFR1c, FGFR2c, FGFR3c y FGFR4. Los restos de proteína de unión a antígeno del multímero pueden estar en cualquiera de las formas descritas anteriormente, por ejemplo, variantes o fragmentos. Preferiblemente, los multímeros comprenden proteínas de unión a antígeno que tienen la capacidad de unirse específicamente a (i) β-Klotho; (ii) FGFR1c, FGFR2c, FGFR3c o FGFR4; o (iii) un complejo que comprende β-Klotho y uno de FGFR1c, FGFR2c, FGFR3c y FGFR4.

En una realización, se prepara un oligómero usando derivados de polipéptidos de inmunoglobulinas. Se ha descrito la preparación de proteínas de fusión que comprende determinados polipéptidos heterólogos fusionados a diversas partes de polipéptidos derivados de anticuerpos (incluyendo el dominio Fc), por ejemplo, por Ashkenazi et al., (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:10535; Byrn et al., (1990) Nature 344:677; y Hollenbaugh et al., 1992 “Construction of Immunoglobulin Fusion Proteins”, en Current Protocols in Immunology, supl. 4, páginas 10.19.1-10.19.11.

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Una realización comprende un dímero que comprende dos proteínas de fusión creadas fusionando una proteína de unión a antígeno que se une específicamente a (i) β-Klotho; (ii) FGFR1c, FGFR2c, FGFR3c o FGFR4; o (iii) un complejo que comprende β-Klotho y uno de FGFR1c, FGFR2c, FGFR3c y FGFR4 a la región Fc de un anticuerpo. El dímero puede producirse, por ejemplo, insertando una fusión de genes que codifican para la proteína de fusión en un vector de expresión apropiado, expresando la fusión de genes en células huésped transformadas con el vector de expresión recombinante y permitiendo que la proteína de fusión expresada se ensamble como las moléculas de anticuerpo, después de lo cual se forman enlaces disulfuro intercatenarios entre los restos de Fc para producir el dímero.

El término “polipéptido de Fc” tal como se usa en el presente documento incluye formas nativas y muteínas de derivados de polipéptidos de la región Fc de un anticuerpo. También se incluyen las formas truncadas de tales polipéptidos que contienen la región bisagra que promueve la dimerización. Las proteínas de fusión que comprenden restos de Fc (y oligómeros formados a partir de ellos) ofrecen la ventaja de una purificación fácil mediante cromatografía de afinidad sobre las columnas de proteína A o proteína G.

Un polipéptido de Fc adecuado, descrito en la solicitud PCT WO 93/10151 y la patente estadounidense n.º 5.426.048 y n.º 5.262.522, es un polipéptido de cadena sencilla que se extiende desde la región de bisagra N-terminal hasta el extremo C-terminal nativo de la región Fc de un anticuerpo IgG1 humano. Otro polipéptido de Fc útil es la muteína de Fc descrita en la patente estadounidense n.º 5.457.035, y en Baum et al., (1994) EMBO J. 13:3992-4001. La secuencia de aminoácidos de esta muteína es idéntica a la de la secuencia de Fc nativa presentada en el documento WO 93/10151, excepto porque el aminoácido 19 se ha cambiado de Leu a Ala, el aminoácido 20 se ha cambiado de Leu a Glu y el aminoácido 22 se ha cambiado de Gly a Ala. La muteína presenta afinidad reducida por receptores de Fc.

En otras realizaciones, la parte variable de las cadenas pesadas o ligeras de una proteína de unión a antígeno tal como se da a conocer en el presente documento puede ser un sustituto para la parte variable de una cadena pesada y/o ligera de anticuerpo.

Alternativamente, el oligómero es una proteína de fusión que comprende múltiples proteínas de unión a antígeno que se unen específicamente a (i) β-Klotho; (ii) FGFR1c, FGFR2c, FGFR3c o FGFR4; o (iii) un complejo que comprende β

4.751.180 y n.º 4.935.233.

Otro método para preparar derivados oligoméricos que comprenden las proteínas de unión a antígeno que se unen específicamente a (i) β-Klotho; (ii) FGFR1c, FGFR2c, FGFR3c o FGFR4; o (iii) un complejo que comprende β-Klotho y uno de FGFR1c, FGFR2c, FGFR3c y FGFR4 implica el uso de una cremallera de leucinas. Los dominios de cremallera de leucinas son péptidos que promueven la oligomerización de las proteínas en las que se encuentran. Las cremalleras de leucinas se identificaron originalmente en varias proteínas de unión a ADN (Landschulz et al., (1988) Science 240:1759), y se han encontrado desde entonces en una variedad de proteínas diferentes. Entre las cremalleras de leucinas conocidas están péptidos que se producen de manera natural y derivados de los mismos que se dimerizan o trimerizan. Se describen ejemplos de dominios de cremallera de leucinas adecuados para producir proteínas oligoméricas solubles en la solicitud PCT WO 94/10308, y la cremallera de leucinas derivada de proteína tensioactiva de pulmón D (SPD) descrita en Hoppe et al., (1994) FEBS Letters 344:191. El uso de una cremallera de leucinas modificada que permite la trimerización estable de una proteína heteróloga fusionada a la misma se describe en Fanslow et al., (1994) Semin. Immunol. 6:267-278. En un enfoque, se expresan proteínas de fusión recombinantes que comprenden un fragmento o derivado de proteína de unión a antígeno que se une específicamente a (i) β-Klotho; (ii) FGFR1c, FGFR2c, FGFR3c o FGFR4; o (iii) un complejo que comprende β-Klotho y uno de FGFR1c, FGFR2c, FGFR3c y FGFR4 fusionado a un péptido de cremallera de leucinas en células huésped adecuadas, y los fragmentos o derivados de proteína de unión a antígeno oligomérica soluble que se forman se recuperan del sobrenadante de cultivo.

En determinadas realizaciones, la proteína de unión a antígeno tiene una KD (afinidad de unión en equilibrio) de menos de 1 pM, 10 pM, 100 pM, 1 nM, 2 nM, 5 nM, 10 nM, 25 nMo 50 nM.

En otro aspecto la presente divulgación proporciona una proteína de unión a antígeno que tiene una semivida de al menos un día in vitro o in vivo (por ejemplo, cuando se administra a un sujeto humano). En una realización, la proteína de unión a antígeno tiene una semivida de al menos tres días. En otra realización, el anticuerpo o parte del mismo tiene una semivida de cuatro días o más. En otra realización, el anticuerpo o parte del mismo tiene una semivida de ocho días o más. En otra realización, el anticuerpo o parte del mismo tiene una semivida de diez días o más. En otra realización, el anticuerpo o parte del mismo tiene una semivida de once días o más. En otra realización, el anticuerpo o parte del mismo tiene una semivida de quince días o más. En otra realización, el anticuerpo o parte de unión a antígeno del mismo se derivatiza o modifica de modo que tiene una semivida más larga en comparación con el anticuerpo no derivatizado o no modificado. En otra realización, una proteína de unión a antígeno que se une específicamente a (i) β-Klotho; (ii) FGFR1c, FGFR2c, FGFR3c o FGFR4; o (iii) un complejo que comprende β-Klotho y uno de FGFR1c, FGFR2c, FGFR3c y FGFR4 contiene mutaciones puntuales para aumentar la semivida sérica, tal como se describe en el documento WO 00/09560, publicado el 24 de febrero del 2000.

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Glicosilación

Una proteína de unión a antígeno que se une específicamente a (i) β-Klotho; (ii) FGFR1c, FGFR2c, FGFR3c o FGFR4; o (iii) un complejo que comprende β-Klotho y uno de FGFR1c, FGFR2c, FGFR3c y FGFR4 puede tener un patrón de glicosilación que es diferente o está alterado con respecto al encontrado en la especie nativa. Tal como se conoce en la técnica, los patrones de glicosilación pueden depender de tanto la secuencia de la proteína (por ejemplo, la presencia o ausencia de residuos de aminoácidos de glicosilación particulares, comentado a continuación), o del organismo o la célula huésped en el que se produce la proteína. Se comentan a continuación sistemas de expresión particulares.

La glicosilación de polipéptidos está normalmente o bien unida a N o bien unida a O. Unida a N se refiere a la unión del resto de hidrato de carbono la cadena lateral de un residuo de asparagina. Las secuencias de tripéptido asparagina-X-serina y asparagina-X-treonina, en las que X es cualquier aminoácido excepto prolina, son las secuencias de reconocimiento para la unión enzimática del resto de hidrato de carbono a la cadena lateral de asparagina. Por tanto, la presencia de cualquiera de estas secuencias de tripéptido en un polipéptido crea un posible sitio de glicosilación. La glicosilación unión a O se refiere a la unión de uno de los azúcares N-acetilgalactosamina, galactosa o xilosa a un hidroxiaminoácido, lo más comúnmente serina o treonina, aunque también puede usare 5hidroxiprolina o 5-hidroxilisina.

La adición de sitios de glicosilación a la proteína de unión a antígeno se logra convenientemente alterando la secuencia de aminoácidos de modo que contenga una o más de las secuencias de tripéptido descritas anteriormente (para sitios de glicosilación unida a N). La alteración también puede hacerse mediante la adición de, o sustitución con, uno o más residuos de serina o treonina en la secuencia de partida (para sitios de glicosilación unida a O). Por facilidad, la secuencia de aminoácidos de la proteína de unión a antígeno puede alterarse a través de cambios al nivel del ADN, particularmente mutando el ADN que codifica para el polipéptido diana en bases preseleccionadas de modo que se generan codones que se traducirán en los aminoácidos deseados.

Otro medio de aumentar el número de restos de hidratos de carbono sobre la proteína de unión a antígeno es mediante acoplamiento químico o enzimático de glicósidos a la proteína. Estos procedimientos son ventajosos porque no requieren la producción de la proteína en una célula huésped que tiene capacidades de glicosilación para glicosilación unida a N y O. Dependiendo del modo de acoplamiento usado, el/los azúcar(es) puede(n) unirse a (a) arginina y histidina, (b) grupos carboxilo libres, (c) grupos sulfhidrilo libres tales como los de cisteína, (d) grupos hidroxilo libres tales como los de serina, treonina o hidroxiprolina, (e) residuos aromáticos tales como los de fenilalanina, tirosina o triptófano, o (f) el grupo amida de glutamina. Estos métodos se describen en el documento WO 87/05330 y en Aplin y Wriston, (1981) CRC Crit. Rev. Biochem., págs. 259-306.

La eliminación de restos de hidrato de carbono presentes sobre la proteína de unión a antígeno de partida puede lograrse química o enzimáticamente. La desglicosilación química requiere la exposición de la proteína al compuesto ácido trifluorometanosulfónico o un compuesto equivalente. Este tratamiento da como resultado la escisión de la mayoría o todos los azúcares excepto el azúcar de unión (N-acetilglucosamina o N-acetilgalactosamina), mientras que deja el polipéptido intacto. La desglicosilación química se describe por Hakimuddin et al., (1987) Arch. Biochem. Biophys. 259:52 y por Edge et al., (1981) Anal. Biochem. 118:131. Escisión enzimática de restos de hidrato de carbono sobre polipéptidos puede lograrse mediante el uso de una variedad de endo y exo-glicosidasas tal como se describe por Thotakura ., (1987) Met. Enzymol. 138:350. Puede prevenirse la glicosilación en posibles sitios de glicosilación mediante el uso del compuesto tunicamicina tal como se describe por Duskin et al., (1982) J. Biol. Chem. 257:3105. La tunicamicina bloquea la formación de enlaces proteína-N-glicósido.

Por tanto, los aspectos de la presente divulgación incluyen variantes de glicosilación de proteínas de unión a antígeno que se unen específicamente a (i) β-Klotho; (ii) FGFR1c, FGFR2c, FGFR3c o FGFR4; o (iii) un complejo que comprende β-Klotho y uno de FGFR1c, FGFR2c, FGFR3c y FGFR4 en las que el número y/o tipo de sitio(s) de glicosilación se ha alterado en comparación con las secuencias de aminoácidos del polipéptido parental. En determinadas realizaciones, variantes de proteína de anticuerpo comprenden un mayor o menor número de sitios de glicosilación unida a N que el anticuerpo nativo. Un sitio de glicosilación unida a N se caracteriza por la secuencia: Asn-X-Ser o Asn-X-Thr, en la que el residuo de aminoácido designado como X puede ser cualquier residuo de aminoácido excepto prolina. La sustitución de residuos de aminoácidos para crear esta secuencia proporciona un posible nuevo sitio para la adición de una cadena de hidrato de carbono unida a N. Alternativamente, sustituciones que eliminan o alteran esta secuencia impedirán la adición de una cadena de hidrato de carbono unida a N presente en el polipéptido nativo. Por ejemplo, la glicosilación puede reducirse mediante la deleción de una Asn o sustituyendo la Asn por un aminoácido diferente. En otras realizaciones, se crean uno o más nuevos sitios unidos a

N. Los anticuerpos tienen normalmente un sitio de glicosilación unida a N en la región Fc.

Marcadores y grupos efectores

En algunas realizaciones, una proteína de unión a antígeno que se une específicamente a (i) β-Klotho; (ii) FGFR1c, FGFR2c, FGFR3c o FGFR4; o (iii) un complejo que comprende β-Klotho y uno de FGFR1c, FGFR2c, FGFR3c y FGFR4 comprende uno o más marcadores. El término “grupo de marcaje” o “marcador” significa cualquier marcador detectable. Los ejemplos de grupos de marcaje adecuados incluyen, pero no se limitan a, los siguientes: radioisótopos o radionúclidos (por ejemplo, 3H, 14C, 15N, 35S, 90Y, 99Tc, 111In, 125I, 131I), grupos fluorescentes (por ejemplo, FITC, rodamina, fósforos de lantánido), grupos enzimáticos (por ejemplo, peroxidasa del rábano, βgalactosidasa, luciferasa, fosfatasa alcalina), grupos quimioluminiscentes, grupos biotinilo o epítopos polipeptídicos predeterminados reconocidos por un indicador secundario (por ejemplo, secuencias de pares de cremalleras de leucinas, sitios de unión para anticuerpos secundarios, dominios de unión a metal, etiquetas de epítopo). En algunas realizaciones, el grupo de marcaje se acopla a la proteína de unión a antígeno por medio de brazos espaciadores de diversas longitudes para reducir el posible impedimento estérico. Se conocen en la técnica diversos métodos para el marcaje de proteínas y pueden usarse tal como se considere adecuado.

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El término “grupo efector” significa cualquier grupo acoplado a una proteína de unión a antígeno que se une específicamente a (i) β-Klotho; (ii) FGFR1c, FGFR2c, FGFR3c o FGFR4; o (iii) un complejo que comprende β-Klotho y uno de FGFR1c, FGFR2c, FGFR3c y FGFR4 que actúa como agente citotóxico. Ejemplos de grupos efectores adecuados son radioisótopos o radionúclidos (por ejemplo, 3H, 14C, 15N, 35S, 90Y, 99Tc, 111In, 125I, 131I). Otros grupos adecuados incluyen toxinas, grupos terapéuticos o grupos quimioterápicos. Los ejemplos de grupos adecuados incluyen caliqueamicina, auristatinas, geldanamicina y cantansina. En algunas realizaciones, el grupo efector se acopla a la proteína de unión a antígeno por medio de brazos espaciadores de diversas longitudes para reducir el posible impedimento estérico.

En general, los marcadores se encuentran dentro de una variedad de clases, dependiendo del ensayo en el que van a detectarse: a) marcadores isotópicos, que pueden ser isótopos radiactivos o pesados; b) marcadores magnéticos (por ejemplo, partículas magnéticas); c) restos activos redox; d) tintes ópticos; grupos enzimáticos (por ejemplo peroxidasa del rábano, β-galactosidasa, luciferasa, fosfatasa alcalina); e) grupos biotinilados; y f) epítopos polipeptídicos predeterminados reconocidos por un indicador secundario (por ejemplo, secuencias de pares de cremalleras de leucinas, sitios de unión para anticuerpos secundarios, dominios de unión a metal, etiquetas de epítopo, etc.). En algunas realizaciones, el grupo de marcaje se acopla a la proteína de unión a antígeno por medio de brazos espaciadores de diversas longitudes para reducir el posible impedimento estérico. Se conocen en la técnica diversos métodos para el marcaje proteínas.

Los marcadores específicos incluyen tintes ópticos, incluyendo, pero sin limitarse a, cromóforos, fósforos y fluoróforos, siendo estos últimos específicos en muchos casos. Los fluoróforos pueden ser o bien fluoros de “molécula pequeña”, o bien fluores proteináceos.

Por “marcador fluorescente” quiere decirse cualquier molécula que pueda detectarse por medio de sus propiedades fluorescentes inherentes. Los marcadores fluorescentes adecuados incluyen, pero no se limitan a, fluoresceína, rodamina, tetrametilrodamina, eosina, eritrosina, cumarina, metil-cumarinas, pireno, verde malaquita, estilbeno, Lucifer Yellow, Cascade Blue, Texas Red, IAEDANS, EDANS, BODIPY FL, LC Red 640, Cy 5, Cy 5.5, LC Red 705, Oregon green, los tintes Alexa-Fluor (Alexa Fluor 350, Alexa Fluor 430, Alexa Fluor 488, Alexa Fluor 546, Alexa Fluor 568, Alexa Fluor 594, Alexa Fluor 633, Alexa Fluor 647, Alexa Fluor 660, Alexa Fluor 680), Cascade Blue, Cascade Yellow y R-ficoeritrina (PE) (Molecular Probes, Eugene, OR), FITC, rodamina y Texas Red (Pierce, Rockford, IL), Cy5, Cy5.5, Cy7 (Amersham Life Science, Pittsburgh, PA). Se describen tintes ópticos adecuados, incluyendo fluoróforos, en MOLECULAR PROBES HANDBOOK por Richard P. Haugland.

Los marcadores fluorescentes proteináceos adecuados también incluyen, pero no se limitan a, proteína fluorescente verde, incluyendo una especie de Renilla, Ptilosarcus o Aequorea de GFP (Chalfie et al., (1994) Science 263:802805), EGFP (Clontech Labs., Inc., número de registro de Genbank U55762), proteína fluorescente azul (BFP, Quantum Biotechnologies, Inc., Quebec, Canadá; Stauber, (1998) Biotechniques 24:462-471; Heim et al., (1996) Curr. Biol. 6:178-182), proteína fluorescente amarilla potenciada (EYFP, Clontech Labs., Inc.), luciferasa (Ichiki et al., (1993) J. Immunol. 150:5408-5417), β-galactosidasa (Nolan et al 2607) y Renilla (documentos WO92/15673, WO95/07463, WO98/14605, WO98/26277, WO99/49019, patentes estadounidenses n.º 5292658, n.º 5418155, n.º 5683888, n.º 5741668, n.º 5777079, n.º 5804387, n.º 5874304, n.º 5876995, n.º 5925558).

Preparación de proteínas de unión a antígeno

Los anticuerpos no humanos que se proporcionan pueden derivarse, por ejemplo, de cualquier animal que produzca anticuerpos, tal como ratón, rata, conejo, cabra, asno, o primate no humano (tal como mono (por ejemplo, macaco cangrejero o mono rhesus) o simio (por ejemplo, chimpancé)). Pueden usarse anticuerpos no humanos, por ejemplo, en aplicaciones basadas en cultivo celular y cultivo celular in vitro, o cualquier otra aplicación en la que no se produce una respuesta inmunitaria al anticuerpo o es insignificante, puede prevenirse, no es un problema o se desea. En determinadas realizaciones, los anticuerpos pueden producirse inmunizando con β-Klotho, FGFR1c, FGFR2c, FGFR3c o FGFR4 de longitud completa (ejemplo 1), con el dominio extracelular de β-Klotho, FGFR1c, FGFR2c, FGFR3c o FGFR4 (ejemplo 2), o dos de β-Klotho, FGFR1c, FGFR2c, FGFR3c y FGFR4 (ejemplo 1), expresando las células completas FGFR1c, β-Klotho o tanto FGFR1c como β-Klotho (ejemplo 1 y 3), con membranas preparadas a partir de células que expresan FGFR1c, β-Klotho o tanto FGFR1c como (3-Klotho (ejemplo 1 y 3), con proteínas de fusión, por ejemplo, fusiones de Fc que comprenden FGFR1c, β-Klotho o FGFR1c y β-Klotho (o dominios extracelulares de los mismos) fusionados a Fc (ejemplo 2 y 3), y otros métodos conocidos en la técnica, por ejemplo, tal como se describe en los ejemplos presentados en el presente documento. Alternativamente, los determinados anticuerpos no humanos pueden generarse inmunizando con aminoácidos que son segmentos de uno o más de β-Klotho, FGFR1c, FGFR2c, FGFR3c o FGFR4 que forman parte del epítopo al que determinados anticuerpos proporcionados en el presente documento se unen. Los anticuerpos pueden ser policlonales, monoclonales, o pueden sintetizarse en células huésped expresando ADN recombinante.

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Pueden prepararse anticuerpos completamente humanos tal como se describió anteriormente inmunizando animales transgénicos que contienen locus de inmunoglobulina humana o seleccionando una biblioteca de presentación en fago que expresa un repertorio de anticuerpos humanos.

Los anticuerpos monoclonales (AcM) pueden producirse mediante una variedad de técnicas, incluyendo metodología de anticuerpos monoclonales convencional, por ejemplo, la técnica de hibridación de células somáticas convencional de Kohler y Milstein, (1975) Nature 256:495. Alternativamente, pueden emplearse otras técnicas para producir anticuerpos monoclonales, por ejemplo, la transformación viral u oncogénica de linfocitos B. Un sistema animal adecuado para preparar hibridomas es el sistema murino, que es un procedimiento muy bien establecido. Se conocen en la técnica protocolos de inmunización y técnicas para el aislamiento de esplenocitos inmunizados. Para tales procedimientos, se fusionan células B de ratones inmunizados con una pareja de fusión inmortalizada adecuada, tal como una línea celular de mieloma murino. Si se desea, pueden inmunizarse ratas u otros mamíferos además en lugar de ratones y pueden fusionarse células B de tales animales con la línea celular de mieloma murino para formar hibridomas. Alternativamente, puede usarse una línea celular de mieloma de una fuente distinta de ratón. También se conocen bien procedimientos de fusión para preparar hibridomas. También puede emplearse la tecnología SLAM en la producción de anticuerpos.

Los anticuerpos de cadena sencilla que se proporcionan pueden formarse uniendo fragmentos de dominio variable de cadena pesada y ligera (región Fv) por medio de un puente de aminoácidos (ligador peptídico corto), dando como resultado una única cadena polipeptídica. Tales Fv de cadena sencilla (scFv) pueden prepararse fusionando ADN que codifica para un ligador peptídico entre ADN que codifican para los dos polipéptidos de dominio variable (VL y VH). Los polipéptidos resultantes pueden plegarse sobre sí mismos para formar monómeros de unión a antígeno, o pueden formar multímeros (por ejemplo, dímeros, trímeros o tetrámeros), dependiendo de la longitud de un ligador flexible entre los dos dominios variables (Kortt et al., (1997) Prot. Eng. 10:423; Kortt et al., (2001) Biomol. Eng. 18:95-108). Combinando diferentes polipéptidos que comprenden VL y VH, pueden formarse scFv multiméricos que se unen a epítopos diferentes (Kriangkum ., (2001) Biomol. Eng. 18:31-40). Las técnicas desarrolladas para la producción de anticuerpos de cadena sencilla incluyen las descritas en la patente estadounidense n.º 4.946.778; Bird, (1988) Science 242:423; Huston et al., (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 85:5879; Ward et al., (1989) Nature 334:544, de Graaf et al., (2002) Methods Mol Biol. 178:379-387. Los anticuerpos de cadena sencilla derivados de anticuerpos proporcionados en el presente documento incluyen, pero no se limitan a, scFv que comprenden las combinaciones de dominio variable de las regiones variables de cadena pesada y ligera representadas en la tabla 2,

o combinaciones de dominios variables de cadena pesada y ligera que incluyen las CDR representadas en las tablas 3 y 4.

Los anticuerpos proporcionados en el presente documento que son de una subclase pueden cambiarse a anticuerpos de una subclase diferente usando métodos de cambio de subclase. Por tanto, pueden derivarse anticuerpos IgG de anticuerpo IgM, por ejemplo, y viceversa. Tales técnicas permiten la preparación de nuevos anticuerpos que presentan las propiedades de unión a antígeno de un anticuerpo dado (el anticuerpo parental), pero también muestran propiedades biológicas asociadas con un isotipo o subclase de anticuerpo diferente de la del anticuerpo parental. Pueden emplearse técnicas de ADN recombinante. Puede emplearse ADN clonado que codifica para polipéptidos de anticuerpo particulares en tales procedimientos, por ejemplo, ADN que codifica para el dominio constante de un anticuerpo del isotipo deseado. Véase, por ejemplo, Lantto et al., (2002) Methods Mol. Biol. 178:303-316.

Por consiguiente, los anticuerpos que se proporcionan incluyen los que comprenden, por ejemplo, las combinaciones de dominios variables descritas anteriormente, que tienen un isotipo deseado (por ejemplo, IgA, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgE e IgD) así como fragmentos Fab o F(ab’)2 de los mismos. Además, si se desea una IgG4, puede desearse también introducir una mutación puntual (CPSCP->CPPCP (SEQ ID NO 380-381, respectivamente, en orden de aparición)) en la región de bisagra tal como se describe en Bloom et al., (1997) Protein Science 6:407) para aliviar una tendencia a formar enlaces disulfuro dentro de la cadena H en los anticuerpos IgG4s.

Además, también se conocen técnicas para derivar anticuerpos que tienen diferentes propiedades (es decir, afinidades variables por el antígeno al que se unen). Una técnica de este tipo, denominada intercambio de cadenas, implica presentar repertorios de genes de dominios variables de inmunoglobulina en la superficie de un bacteriófago filamentoso, a menudo denominada presentación en fago. Se ha usado el intercambio de cadenas para preparar anticuerpos de alta afinidad frente al hapteno 2-feniloxazol-5-ona, tal como se describe por Marks et al., (1992) Biotechnology 10:779.

Pueden producirse modificaciones conservativas en las regiones variables de cadena pesada y ligera descritas en la tabla 2, o las CDR descritas en las tablas 3A y 3B, 4A y 4B, y la tabla 6C, a continuación (y modificaciones correspondientes en los ácidos nucleicos codificantes) para producir una proteína de unión a antígeno que tiene características funcionales y bioquímicas. Se describieron anteriormente métodos para lograr tales modificaciones.

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Proteínas de unión a antígeno que se une específicamente a uno o más de (i) β-Klotho; (ii) FGFR1c, FGFR2c, FGFR3c o FGFR4; o (iii) un complejo que comprende β-Klotho y uno de FGFR1c, FGFR2c, FGFR3c y FGFR4 pueden modificarse además de diversos modos. Por ejemplo, si van a usarse para fines terapéuticos, pueden conjugarse con polietileneglicol (pegilarse) para prolongar la semivida sérica o para potenciar el suministro de proteínas. Alternativamente, la región V de los anticuerpos sujeto o fragmentos de los mismos pueden fusionarse con la región Fc de una molécula de anticuerpo diferente. La región Fc usada para este propósito puede modificarse de modo que no se una al complemento, reduciendo así la probabilidad de inducir lisis celular en el paciente cuando se usa la proteína de fusión como agente terapéutico. Además, los anticuerpos sujeto o fragmentos funcionales de los mismos pueden conjugarse con albumina sérica humana para potenciar la semivida sérica del anticuerpo o fragmento del mismo. Otra pareja de fusión útil para las proteínas de unión a antígeno o fragmentos de las mismas es transtiretina (TTR). TTR tiene la capacidad de formar un tetrámero, por tanto una proteína de fusión de anticuerpo-TTR puede formar un anticuerpo multivalente que puede aumentar su avidez de unión.

Alternativamente, pueden lograrse modificaciones sustanciales en las características funcionales y/o bioquímicas de las proteínas de unión a antígeno descritas en el presente documento creando sustituciones en la secuencia de aminoácidos de las cadenas pesadas y ligeras que difieren significativamente en su efecto sobre el mantenimiento de (a) la estructura del esqueleto molecular en la zona de la sustitución, por ejemplo, como una conformación de lámina o hélice, (b) la carga o hidrofobicidad de la molécula en el sitio diana o (c) el volumen la cadena lateral. Una “sustitución de aminoácidos conservativa” puede implicar una sustitución de un residuo de aminoácido nativo por un residuo no nativo que tiene poco o ningún efecto sobre la polaridad o la carga del residuo de aminoácido en esa posición. Véase la tabla 5, anteriormente. Además, cualquier residuo nativo en el polipéptido también puede sustituirse por alanina, tal como se ha descrito anteriormente para la mutagénesis de exploración con alanina.

Los expertos en la técnica pueden implementar sustituciones de aminoácidos (ya sean conservativas o no conservativas) de los anticuerpos sujeto aplicando técnicas de rutina. Pueden usarse sustituciones de aminoácidos para identificar residuos importantes de los anticuerpos proporcionados en el presente documento, o para aumentar

: o disminuir la afinidad de estos anticuerpos por uno o más de (i) β-Klotho; (ii) FGFR1c, FGFR2c, FGFR3c o FGFR4;

: o (iii) un complejo que comprende β-Klotho y uno de FGFR1c, FGFR2c, FGFR3c y FGFR4 o para modificar la afinidad de unión de otras proteínas de unión a antígeno descritas en el presente documento.

Métodos de expresión de proteínas de unión a antígeno

También se proporcionan en el presente documento sistemas y constructos de expresión en forma de plásmidos, vectores de expresión, casetes de transcripción o expresión que comprenden al menos un polinucleótido tal como se describió anteriormente, así como células huésped que comprenden tales sistemas o constructos de expresión.

Las proteínas de unión a antígeno proporcionadas en el presente documento pueden prepararse mediante cualquiera de varias técnicas convencionales. Por ejemplo, pueden producirse proteínas de unión a antígeno que se unen específicamente a (i) -Klotho; (ii) FGFR1c, FGFR2c, FGFR3c o FGFR4; o (iii) un complejo que comprende β-Klotho y uno de FGFR1c, FGFR2c, FGFR3c y FGFR4 mediante sistemas de expresión recombinante, usando cualquier técnica conocida en la técnica. Véase, por ejemplo, Monoclonal Antibodies, Hybridomas: A New Dimension in Biological Analyses, Kennet et al. (eds.) Plenum Press, Nueva York (1980); y Antibodies: A Laboratory Manual, Harlow and Lane (eds.), Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1988).

Pueden expresarse proteínas de unión a antígeno en líneas celulares de hibridoma (por ejemplo, en anticuerpos particulares pueden expresarse en hibridomas) o en líneas celulares distintas de hibridomas. Pueden usarse constructos de expresión que codifican para los anticuerpos para transformar una célula huésped de mamífero, insecto o microbiana. La transformación puede realizarse usando cualquier método conocido para introducir polinucleótidos en una célula huésped, incluyendo, por ejemplo empaquetamiento del polinucleótido en un virus o bacteriófago y transducción de una célula huésped con el constructo mediante procedimientos de transfección conocidos en la técnica, tal como se ejemplifica mediante la patente estadounidense n.º 4.399.216; n.º 4.912.040; n.º 4.740.461; n.º 4.959.455. El procedimiento de transformación óptimo usado dependerá de qué tipo de célula huésped está transformándose. Se conocen bien en la técnica métodos para la introducción de polinucleótidos heterólogos en células de mamífero e incluyen, pero no se limitan a, transfección mediada por dextrano, precipitación con fosfato de calcio, transfección mediada por polibreno, fusión de protoplastos, electroporación, encapsulación del/de los polinucleótido(s) en liposomas, mezclado del ácido nucleico con lípidos cargados positivamente y microinyección directa del ADN en núcleos.

Los constructos de expresión recombinante comprenden normalmente una molécula de ácido nucleico que codifica para un polipéptido que comprende uno o más de los siguientes: una o más CDR proporcionadas en el presente documento; una región constante de cadena ligera; una región variable de cadena ligera; una región constante de cadena pesada (por ejemplo, CH1, CH2 y/o CH3); y/u otra parte de armazón de una proteína de unión a antígeno. Estas secuencias de ácido nucleico se insertan en un vector de expresión apropiado usando técnicas de ligación convencionales. En una realización, la región constante de cadena pesada o ligera se adjunta al extremo C-terminal de la región variable de cadena pesada o ligera específica de anti-β-Klotho, FGFR1c, FGFR2c, FGFR3c, FGFR4 o β-Klotho y FGFR1c y se liga en un vector de expresión. El vector se selecciona normalmente para que sea funcional en la célula huésped particular empleada (es decir, el vector es compatible con la maquinaria de la célula huésped, permitiendo que se produzca la amplificación y/o expresión del gen). En algunas realizaciones, se usan vectores que emplean ensayos de complementación de proteína-fragmento usando indicadores de proteína, tales como dihidrofolato reductasa (véase, por ejemplo, la patente estadounidense n.º 6.270.964). Pueden adquirirse vectores de expresión adecuados, por ejemplo, de Invitrogen Life Technologies o BD Biosciences (anteriormente “Clontech”). Otros vectores útiles para clonar y expresar los anticuerpos y fragmentos incluyen los descritos en Bianchi y McGrew, (2003) Biotech. Biotechnol. Bioeng. 84:439-44. Se comentan vectores de expresión adecuados adicionales, por ejemplo, en Methods Enzymol., vol. 185 (D. V. Goeddel, ed.), 1990, Nueva York: Academic Press.

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Normalmente, los vectores de expresión usados en cualquiera de las células huésped contendrán secuencias para el mantenimiento del plásmido y para la clonación y expresión de secuencias de nucleótidos exógenas. Tales secuencias, denominadas colectivamente “secuencias flanqueantes” en determinadas realizaciones, incluirán normalmente una o más de las siguientes secuencias de nucleótidos: un promotor, una o más secuencias potenciadoras, un origen de replicación, una secuencia de terminación de la transcripción, una secuencia de intrones completa que contiene un sitio donador y aceptor de corte y empalma, una secuencia que codifica para una secuencia líder para la secreción del polipéptido, un sitio de unión al ribosoma, una secuencia de poliadenilación, una región de poliligador para insertar el ácido nucleico que codifica para el polipéptido que va a expresarse y un elemento de marcador seleccionable. Cada una de estas secuencias se comenta a continuación.

Opcionalmente, el vector puede contener una secuencia que codifica para una “etiqueta”, es decir, una molécula de oligonucleótido ubicada en el extremo 3’ o 5’ de una secuencia que codifica para proteína de unión a antígeno; la secuencia de oligonucleótido codifica para poliHis (tal como hexaHis (SEQ ID NO: 382)), u otra “etiqueta” tal como FLAG, HA (hemaglutinina de virus influenza) o myc, para las que existen anticuerpos comercialmente disponibles. Esta etiqueta se fusiona normalmente con el polipéptido tras la expresión del polipéptido, y puede servir como medio para la purificación por afinidad o detección de la proteína de unión a antígeno a partir de la célula huésped. La purificación por afinidad puede lograrse, por ejemplo, mediante cromatografía en columna usando anticuerpos contra la etiqueta como una matriz de afinidad. Opcionalmente, la etiqueta puede retirarse posteriormente de la proteína de unión a antígeno purificada mediante diversos medios tales como usando determinadas peptidasas para la escisión.

Las secuencias flanqueantes pueden ser homólogas (es decir, de la misma especie y/o cepa que la célula huésped), heterólogas (es decir, de una especie distinta de la especie o cepa de célula huésped), híbridas (es decir, una combinación de secuencias flanqueantes de más de una fuente), sintéticas o nativas. Como tales, la fuente de una secuencia flanqueante puede ser cualquier organismo procariota o eucariota, cualquier organismo vertebrado o invertebrado, o cualquier planta, siempre que la secuencia flanqueante sea funcional en, y pueda activarse mediante, la maquinaria de la célula huésped.

Pueden obtenerse secuencias flanqueantes útiles en los vectores mediante cualquiera de varios métodos bien conocidos en la técnica. Normalmente, se habrán identificado anteriormente secuencias flanqueantes útiles en el presente documento mediante mapeo y/o mediante digestión con endonucleasas de restricción y por tanto pueden aislarse de la fuente de tejido apropiada usando las endonucleasas de restricción apropiadas. En algunos casos, puede conocerse la secuencia de nucleótidos completa de una secuencia flanqueante. En este caso, la secuencia flanqueante puede sintetizarse usando los métodos descritos en el presente documento para la síntesis o clonación de ácidos nucleicos.

Ya se conozca toda o sólo una parte de la secuencia flanqueante, puede obtenerse usando reacción en cadena de la polimerasa (PCR) y/o examinando una biblioteca genómica con una sonda adecuada tal como un oligonucleótido y/o fragmento de secuencia flanqueante de la misma u otra especie. Si la secuencia flanqueante no se conoce, puede aislarse un fragmento de ADN que contiene una secuencia flanqueante de un trozo más grande de ADN que puede contener, por ejemplo, una secuencia codificante o incluso otro gen o genes. El aislamiento puede lograrse mediante digestión con endonucleasas de restricción para producir el fragmento de ADN apropiado seguido por aislamiento usando purificación en gel de agarosa, cromatografía en columna Qiagen® (Chatsworth, CA) u otros métodos conocidos por el experto en la técnica. La selección de enzimas adecuadas para lograr este fin resultará fácilmente evidente para un experto habitual en la técnica.

Un origen de replicación es normalmente una parte de los vectores de expresión procariotas adquiridos comercialmente, y el origen ayuda en la amplificación del vector en una célula huésped. Si el vector de elección no contiene un sitio de origen de replicación, puede sintetizarse uno químicamente basándose en una secuencia conocida, y ligarse en el vector. Por ejemplo, el origen de replicación del plásmido pBR322 (New England Biolabs, Beverly, MA) es adecuado para la mayoría de las bacterias Gram-negativas, y diversos orígenes virales (por ejemplo, SV40, polioma, adenovirus, virus de la estomatitis (VEV), o virus del papiloma tales VPH o VPB) son útiles para clonar vectores en células de mamífero. Generalmente, el componente de origen de replicación no es necesario para vectores de expresión de mamífero (por ejemplo, el origen de SV40 se usa a menudo sólo porque también contiene el promotor temprano del virus).

Normalmente está ubicada una secuencia de terminación de la transcripción en 3’ con respecto al extremo de una región que codifica para un polipéptido y sirve para terminar la transcripción. Habitualmente, una secuencia de terminación de la transcripción en células procariotas es un fragmento rico en G-C seguido por una secuencia de poli-T. Aunque la secuencia se clona fácilmente de una biblioteca o incluso se adquiere comercialmente como parte de un vector, también puede sintetizarse fácilmente usando métodos para la síntesis de ácidos nucleicos tales como los descritos en el presente documento.

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Un gen de marcador seleccionable codifica para una proteína necesaria para la supervivencia y el crecimiento de una célula huésped hecha crecer en un medio de cultivo selectivo. Los genes de marcadores de selección típicos codifican para proteínas que (a) confieren resistencia a antibióticos u otras toxinas, por ejemplo, ampicilina, tetraciclina o kanamicina para células huésped procariotas; (b) complementan deficiencias auxótrofas de la célula; o

(c) suministran nutrientes críticos no disponibles a partir de medios complejos o definidos. Marcadores seleccionables específicos son el gen de resistencia a kanamicina, el gen de resistencia a ampicilina y el gen de resistencia a tetraciclina. Ventajosamente, también puede usarse un gen de resistencia a neomicina para la selección en células huésped tanto procariotas como eucariotas.

Pueden usarse otros genes seleccionables para amplificar el gen que se expresará. La amplificación es el proceso en el que genes que se requieren para la producción de una proteína crítica para el crecimiento o la supervivencia celular se reiteran en tándem dentro de los cromosomas de generaciones sucesivas de células recombinantes. Los ejemplos de marcadores seleccionables adecuados para células de mamífero incluyen dihidrofolato reductasa (DHFR) y genes de timidina cinasa sin promotor. Se colocan transformantes de células de mamífero bajo presión de selección en la que sólo los transformantes están adaptados de manera única para sobrevivir en virtud del gen seleccionable presente en el vector. Se impone presión de selección cultivando las células transformadas en condiciones en las que la concentración de agente de selección en el medio aumenta sucesivamente, conduciendo de ese modo a la amplificación de tanto el gen seleccionable como el ADN que codifica para otro gen, tal como una proteína de unión a antígeno que se une a (i) β-Klotho; (ii) FGFR1c, FGFR2c, FGFR3c o FGFR4; o (iii) un complejo que comprende β-Klotho y uno de FGFR1c, FGFR2c, FGFR3c y FGFR4. Como resultado, se sintetizan cantidades aumentadas de un polipéptido tal como una proteína de unión a antígeno a partir del ADN amplificado.

Habitualmente es necesario un sitio de unión al ribosoma para el inicio de la traducción de ARNm y se caracteriza por una secuencia de Shine-Dalgarno (procariotas) o una secuencia de Kozak (eucariotas). El elemento está ubicado normalmente en 3’ con respecto al promotor y en 5’ con respecto a la secuencia codificante del polipéptido que va a expresarse.

En algunos casos, tales como cuando se desea glicosilación en un sistema de expresión de célula huésped eucariota, pueden manipularse las diversas pre- o pro-secuencias para mejorar la glicosilación o el rendimiento. Por ejemplo, puede alterarse el sitio de escisión de peptidasa de un péptido señal particular, o añadirse prosecuencias, lo que también puede afectar a la glicosilación. El producto de proteína final puede tener, en la posición -1 (en relación con el primer aminoácido de la proteína madura), uno o más aminoácidos adicionales que afectan a la expresión, que pueden no haberse eliminado totalmente. Por ejemplo, el producto de proteína final puede tener uno

o dos residuos de aminoácidos que se encuentran en el sitio de escisión de peptidasa, unidos al extremo aminoterminal. Alternativamente, el uso de algunos sitios de escisión enzimática puede dar como resultado una forma ligeramente truncada del polipéptido deseado, si la enzima corta en tal zona dentro del polipéptido maduro.

La expresión y clonación contendrán normalmente un promotor que reconoce el organismo huésped y está operativamente unido a la molécula que codifica para una proteína de unión a antígeno que se une específicamente a (i) β-Klotho; (ii) FGFR1c, FGFR2c, FGFR3c o FGFR4; o (iii) un complejo que comprende β-Klotho y uno de FGFR1c, FGFR2c, FGFR3c y FGFR4. Los promotores son secuencias no transcritas ubicadas en el sentido de 5’ (es decir, en 5’) con respecto al codón de iniciación de un gen estructural (generalmente dentro de aproximadamente 100 a 1000 pb) que controlan la transcripción del gen estructural. Los promotores se agrupan convencionalmente en uno de dos clases: promotores inducibles y promotores constitutivos. Los promotores inducibles inician niveles aumentados de transcripción a partir del ADN bajo su control en respuesta a algún cambio en las condiciones de cultivo, tal como la presencia o ausencia de un nutriente o un cambio de temperatura. Los promotores constitutivos, por otro lado, transcriben de manera uniforme un gen con el que están operativamente unidos, es decir, con poco o ningún control sobre la expresión génica. Se conocen bien un gran número de promotores, reconocidos por una variedad de posibles células huésped. Un promotor adecuado se une operativamente al ADN que codifica para cadena pesada o cadena ligera que comprende una proteína de unión a antígeno eliminando el promotor del ADN fuente mediante digestión con enzimas de restricción e insertando la secuencia de promotor deseado en el vector.

También se conocen bien en la técnica promotores adecuados para su uso con huéspedes de levadura. Se usan ventajosamente potenciadores de levadura con promotores de levadura. Se conocen bien promotores adecuados para su uso con células huésped de mamífero e incluyen, pero no se limitan a, los obtenidos de los genomas de virus tales como virus de polioma, virus de la viruela aviar, adenovirus (tal como adenovirus 2), virus del papiloma bovino, virus del sarcoma aviar, citomegalovirus, retrovirus, virus de la hepatitis B y virus de simio 40 (SV40). Otros promotores de mamífero adecuados incluyen promotores de mamífero heterólogos, por ejemplo, promotores de choque térmico y el promotor de actina.

Los promotores adicionales que pueden ser de interés incluyen, pero no se limitan a: promotor temprano de SV40 (Benoist y Chambon, (1981) Nature 290:304-310); promotor de CMV (Thornsen et al., (1984) Proc. Natl. Acad.

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U.S.A.: 81:659-663); el promotor contenido en la repetición terminal larga en 3’ del virus del sarcoma de Rous (Yamamoto et al., (1980) Cell 22:787-797); promotor de timidina cinasa de herpes (Wagner et al., (1981) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 78:1444-1445); secuencias promotoras y reguladoras del gen de metalotionina (Prinster et al., (1982) Nature 296:39-42); y promotores procariotas tal como el promotor de beta-lactamasa (Villa-Kamaroff et al., (1978) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 75:3727-3731); o el promotor tac (DeBoer et al., (1983) Proc. Natl. Acad. Sci.

U.S.A.: 80:21-25). También son de interés las siguientes regiones de control de la transcripción de animales, que muestran especificidad de tejido y se han utilizado en animales transgénicos: la región de control del gen de elastasa I que es activa en células acinares pancreáticas (Swift et al., (1984) Cell 38:639-646; Ornitz ., (1986) Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol. 50:399-409; MacDonald, (1987) Hepatodogy 7:425-515); la región de control del gen de insulina que es activa en células beta pancreáticas (Hanahan, (1985) Nature 315:115-122); la región de control del gen de inmunoglobulina que es activa en células linfoides (Grosschedl et al., (1984) Cell 38:647-658; Adames et al., (1985) Nature 318:533-538; Alexander et al., (1987) Mol. Cell. Biol. 7:1436-1444); la región de control del virus de tumor mamario de ratón que es activa en testículos, mama, tejido linfoide y mastocitos (Leder et al., (1986) Cell 45:485-495); la región de control del gen de albúmina que es activa en hígado (Pinkert et al., (1987) Genes and Devel. 1:268-276); la región de control del gen de alfa-feto-proteína que es activa en hígado (Krumlauf et al., (1985) Mol. Cell. Biol. 5:1639-1648; Hammer et al., (1987) Science 253:53-58); la región de control del gen de alfa1antitripsina que es activa en hígado (Kelsey et al., (1987) Genes and Devel. 1:161-171); la región de control del gen de la beta-globina que es activa en células mieloides (Mogram et al., (1985) Nature 315:338-340; Kollias et al., (1986) Cell 46:89-94); la región de control del gen de proteína básica de la mielina que es activa en células de oligodendrocitos en el cerebro (Readhead et al., (1987) Cell 48:703-712); la región de control del gen de cadena ligera-2 de miosina que es activa en músculo esquelético (Sani, (1985) Nature 314:283-286); y la región de control del gen hormona liberadora gonadotrópica que es activa en el hipotálamo (Mason et al., (1986) Science 234:13721378).

Puede insertarse una secuencia potenciadora en el vector para aumentar la transcripción de ADN que codifica para cadena ligera o cadena pesada que comprende una proteína de unión a antígeno que se une específicamente a (i) β-Klotho; (ii) FGFR1c, FGFR2c, FGFR3c o FGFR4; o (iii) un complejo que comprende β-Klotho y uno de FGFR1c, FGFR2c, FGFR3c y FGFR4 por eucariotas superiores, por ejemplo, una proteína de unión a antígeno humana que se une específicamente a (i) β-Klotho; (ii) FGFR1c, FGFR2c, FGFR3c o FGFR4; o (iii) un complejo que comprende β-Klotho y uno de FGFR1c, FGFR2c, FGFR3c y FGFR4. Los potenciadores son elementos de ADN de actuación en cis, habitualmente de aproximadamente 10-300 pb de longitud, que actúan sobre el promotor para aumentar la transcripción. Los potenciadores son relativamente independientes de orientación y posición, habiéndose encontrado en posiciones tanto en 5’ como en 3’ con respecto a la unidad de transcripción. Se conocen varias secuencias potenciadoras disponibles de genes de mamífero (por ejemplo, globina, elastasa, albúmina, alfa-fetoproteína e insulina). Normalmente, sin embargo, se usa un potenciador de un virus. El potenciador de SV40, el potenciador del promotor temprano de citomegalovirus, el potenciador de polioma y potenciadores de adenovirus conocidos en la técnica son elementos potenciadores a modo de ejemplo para la activación de promotores eucariotas. Aunque puede situarse un potenciador en el vector o bien en 5’ o bien en 3’ con respecto a una secuencia codificante, se ubica normalmente en un sitio en 5’ con respecto al promotor. Puede incorporarse una secuencia que codifica para una secuencia señal nativa o heteróloga apropiada (secuencia líder o péptido señal) en un vector de expresión, para promover la secreción extracelular del anticuerpo. La elección del péptido señal o líder depende del tipo de células huésped en las que va a producirse el anticuerpo, y una secuencia señal heteróloga puede reemplazar a la secuencia señal nativa. Los ejemplos de péptidos señal que son funcionales en células huésped de mamífero incluyen los siguientes: la secuencia de señal para interleucina-7 (IL-7) descrita en la patente estadounidense n.º 4.965.195; la secuencia de señal para receptor de interleucina-2 descrita en Cosman et al., (1984) Nature 312:768; el péptido señal de receptor de interleucina-4 descrito en la patente EP n.º 0367 566; el péptido señal de receptor de interleucina-1 de tipo I descrito en la patente estadounidense n.º 4.968.607; el péptido señal de receptor de interleucina-1 de tipo II descrito en la patente EP n.º 0 460 846.

Los vectores de expresión que se proporcionan pueden construirse a partir de un vector de partida tal como un vector comercialmente disponible. Tales vectores pueden contener, pero no necesariamente, todas las secuencias flanqueantes deseadas. Cuando una o más de las secuencias flanqueantes descritas en el presente documento ya no están presentes en el vector, pueden obtenerse individualmente y ligarse en el vector. Un experto en la técnica conoce bien métodos usados para obtener cada una de las secuencias flanqueantes.

Tras haberse construido el vector y haberse insertado una molécula de ácido nucleico que codifica para cadena ligera, una cadena pesada, o una cadena ligera y una cadena pesada que comprende una proteína de unión a antígeno que se une específicamente a (i) β-Klotho; (ii) FGFR1c, FGFR2c, FGFR3c o FGFR4; o (iii) un complejo que comprende β-Klotho y uno de FGFR1c, FGFR2c, FGFR3c y FGFR4 en el sitio apropiado del vector, el vector contemplado puede insertarse en una célula huésped adecuada para la amplificación y/o expresión del polipéptido. La transformación de un vector de expresión para una proteína de unión a antígeno en una célula huésped seleccionada puede lograrse mediante métodos bien conocidos incluyendo transfección, infección, coprecipitación con fosfato de calcio, electroporación, microinyección, lipofección, transfección mediada por DEAE-dextrano, u otras técnicas conocidas. El método seleccionado será en parte una función del tipo de célula huésped que va a usarse. Estos métodos y otros métodos adecuados los conoce bien el experto en la técnica, y se exponen, por ejemplo, en Sambrook et al., (2001), citado anteriormente.

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Una célula huésped, cuando se cultiva en condiciones apropiadas, sintetiza una proteína de unión a antígeno que puede recogerse posteriormente del medio de cultivo (si la célula huésped lo secreta al medio) o directamente de la célula huésped que la produce (si no se secreta). La selección de una célula huésped apropiada dependerá de varios factores, tales como niveles de expresión deseados, modificaciones de polipéptido que son deseables o necesarias para la actividad (tales como glicosilación o fosforilación) y facilidad de plegamiento para dar una molécula biológicamente activa.

Se conocen bien en la técnica líneas celulares de mamífero disponibles como huéspedes para la expresión e incluyen, pero no se limitan a, líneas celulares inmortalizadas disponibles de la Colección Americana de Cultivos Tipo (ATCC), incluyendo pero sin limitarse a células de ovario de hámster chino (CHO), células HeLa, células de riñón de cría de hámster (BHK), células de riñón de mono (COS), células de carcinoma hepatocelular humano (por ejemplo, Hep G2), y varias otras líneas celulares. En determinadas realizaciones, las líneas celulares pueden seleccionarse a través de la determinación de qué líneas celulares tienen altos niveles de expresión y producen de manera constitutiva proteínas de unión a antígeno con propiedades de unión deseables (por ejemplo, la capacidad para unirse a (i) β-Klotho; (ii) FGFR1c, FGFR2c, FGFR3c o FGFR4; o (iii) un complejo que comprende β-Klotho y uno de FGFR1c, FGFR2c, FGFR3c y FGFR4). En otra realización, puede seleccionarse una línea celular del linaje de células B que no produce su propio anticuerpo pero que tiene la capacidad de producir y secretar un anticuerpo heterólogo. La capacidad para inducir señalización de tipo FGF21 también puede formar un criterio de selección.

Usos de proteínas de unión a antígeno para fines de diagnóstico y terapéuticos

Las proteínas de unión a antígeno dadas a conocer en el presente documento son útiles para la detección de (i) β-Klotho; (ii) FGFR1c, FGFR2c, FGFR3c o FGFR4; o (iii) un complejo que comprende β-Klotho y uno de FGFR1c, FGFR2c, FGFR3c y FGFR4 en muestras biológicas e identificación de células o tejidos que producen uno o más de

(i) β-Klotho; (ii) FGFR1c, FGFR2c, FGFR3c o FGFR4; o (iii) un complejo que comprende β-Klotho y uno de FGFR1c, FGFR2c, FGFR3c y FGFR4. Por ejemplo, las proteínas de unión a antígeno dadas a conocer en el presente documento pueden usarse en ensayos de diagnóstico, por ejemplo, ensayos de unión para detectar y/o cuantificar (i) -Klotho; (ii) FGFR1c, FGFR2c, FGFR3c o FGFR4; o (iii) un complejo que comprende β-Klotho y uno de FGFR1c, FGFR2c, FGFR3c y FGFR4 expresados en un tejido o célula. Las proteínas de unión a antígeno que se unen específicamente a (i) β-Klotho; (ii) FGFR1c, FGFR2c, FGFR3c o FGFR4; o (iii) un complejo que comprende β-Klotho y uno de FGFR1c, FGFR2c, FGFR3c y FGFR4 pueden usarse en el tratamiento de enfermedades relacionadas con la señalización de tipo FGF21 en un paciente que lo necesita, tales como diabetes tipo 2, obesidad, dislipidemia, NASH, enfermedad cardiovascular y síndrome metabólico. Formando un complejo de señalización que comprende una proteína de unión a antígeno, y (i) β-Klotho; (ii) FGFR1c, FGFR2c, FGFR3c o FGFR4; o (iii) un complejo que comprende β-Klotho y uno de FGFR1c, FGFR2c, FGFR3c y FGFR4, puede imitarse y/o potenciarse la actividad in vivo natural de FGF21, que se asocia con FGFR1c, FGFR2c, FGFR3c, FGFR4 y β-Klotho in vivo para iniciar la señalización, conduciendo a efectos terapéuticos.

Indicaciones

Una enfermedad o estado asociado con FGF21 humano incluye cualquier enfermedad o estado cuya aparición en un paciente está provocada, al menos en parte, por la inducción de señalización de tipo FGF21, que se inicia in vivo mediante la formación de un complejo que comprende FGFR1c, FGFR2c, FGFR3c o FGFR4 y β-Klotho y FGF21. La intensidad de la enfermedad o estado también puede reducirse mediante la inducción de señalización de tipo FGF21. Los ejemplos de enfermedades y estados que pueden tratarse con las proteínas de unión a antígeno incluyen diabetes tipo 2, obesidad, dislipidemia, NASH, enfermedad cardiovascular y síndrome metabólico.

Las proteínas de unión a antígeno descritas en el presente documento pueden usarse para tratar diabetes tipo 2, obesidad, dislipidemia, NASH, enfermedad cardiovascular y síndrome metabólico, o pueden emplearse como tratamiento profiláctico administrado, por ejemplo, cada día, cada semana, cada dos semanas, cada mes, cada dos meses, cada dos años, etc., para prevenir o reducir la frecuencia y/o intensidad de síntomas, por ejemplo, niveles de glucosa en plasma elevados, niveles de triglicéridos y colesterol elevados, proporcionando así un perfil de factores de riesgo glucémico y cardiovascular mejorado.

Métodos de diagnóstico

Las proteínas de unión a antígeno descritas en el presente documento pueden usarse con fines de diagnóstico para detectar, diagnosticar o monitorizar enfermedades y/o estados asociados con FGFR1c, FGFR2c, FGFR3c, FGFR4, β-Klotho, FGF21 o combinaciones de los mismos. También se proporcionan métodos para la detección de la presencia de (i) β-Klotho; (ii) FGFR1c, FGFR2c, FGFR3c o FGFR4; o (iii) un complejo que comprende β-Klotho y uno de FGFR1c, FGFR2c, FGFR3c y FGFR4 en una muestra usando métodos inmunohistológicos clásicos conocidos por los expertos en la técnica (por ejemplo, Tijssen, 1993, Practice and Theory of Enzyme Immunoassays, Vol 15 (Eds R.H. Burdon and P.H. van Knippenberg, Elsevier, Ámsterdam); Zola, (1987) Monoclonal Antibodies: A Manual of Tehcniques, págs. 147-158 (CRC Press, Inc.); Jalkanen et al., (1985) J. Cell. Biol. 101:976-985; Jalkanen et al., (1987) J. Cell Biol. 105:3087-3096). La detección de (i) β-Klotho; (ii) FGFR1c, FGFR2c, FGFR3c o FGFR4; o (iii) un complejo que comprende -Klotho y uno de FGFR1c, FGFR2c, FGFR3c y FGFR4 puede realizarse in vivo o in vitro.

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Las aplicaciones de diagnóstico proporcionadas en el presente documento incluyen el uso de las proteínas de unión a antígeno para la detección de la expresión de (i) β-Klotho; (ii) FGFR1c, FGFR2c, FGFR3c o FGFR4; o (iii) un complejo que comprende β-Klotho y uno de FGFR1c, FGFR2c, FGFR3c y FGFR4 y/o unión a (i) β-Klotho; (ii) FGFR1c, FGFR2c, FGFR3c o FGFR4; o (iii) un complejo que comprende β-Klotho y uno de FGFR1c, FGFR2c, FGFR3c y FGFR4. Los ejemplos de métodos útiles en la detección de la presencia de (i) β-Klotho; (ii) FGFR1c, FGFR2c, FGFR3c o FGFR4; o (iii) un complejo que comprende β-Klotho y uno de FGFR1c, FGFR2c, FGFR3c y FGFR4 incluyen inmunoensayos, tales como el ensayo de inmunoabsorción ligado a enzimas (ELISA) y el radioinmunoensayo (RIA).

Para aplicaciones de diagnóstico, la proteína de unión a antígeno se marcará normalmente con un grupo de marcaje detectable. Los grupos de marcaje adecuados incluyen, pero no se limitan a, los siguientes: radioisótopos o radionúclidos (por ejemplo, 3H, 14C, 15N, 35S, 90Y, 99Tc, 111In, 125I, 131I), grupos fluorescentes (por ejemplo, FITC, rodamina, fósforos de lantánidos), grupos enzimáticos (por ejemplo, peroxidasa del rábano, β-galactosidasa, luciferasa, fosfatasa alcalina), grupos quimioluminiscentes, grupos biotinilo, o epítopos polipeptídicos predeterminados reconocidos por un indicador secundario (por ejemplo, secuencias de pares de cremalleras de leucinas, sitios de unión para anticuerpos secundarios, dominios de unión a metal, etiquetas de epítopo). En algunas realizaciones, el grupo de marcaje se acopla a la proteína de unión a antígeno a través de brazos espaciadores de diversas longitudes para reducir el posible impedimento estérico. En la técnica se conocen diversos métodos para marcar proteínas y pueden usarse.

En otro aspecto, pueden usarse una proteína de unión a antígeno para identificar una célula o células que expresan

(i) β-Klotho; (ii) FGFR1c, FGFR2c, FGFR3c o FGFR4; o (iii) un complejo que comprende β-Klotho y uno de FGFR1c, FGFR2c, FGFR3c y FGFR4. En una realización específica, la proteína de unión a antígeno se marca con un grupo de marcaje y se detecta la unión de la proteína de unión a antígeno marcada a (i) β-Klotho; (ii) FGFR1c, FGFR2c, FGFR3c o FGFR4; o (iii) un complejo que comprende β-Klotho y uno de FGFR1c, FGFR2c, FGFR3c y FGFR4. En una realización específica adicional, la unión de la proteína de unión a antígeno a (i) β-Klotho; (ii) FGFR1c, FGFR2c, FGFR3c o FGFR4; o (iii) un complejo que comprende β- Klotho y uno de FGFR1c, FGFR2c, FGFR3c y FGFR4 se detecta in vivo. En una realización específica adicional, la proteína de unión a antígeno se aísla y se mide usando técnicas conocidas en la técnica. Véase, por ejemplo, Harlow y Lane, (1988) Antibodies: A Laboratory Manual, New York: Cold Spring Harbor (ed. 1991 y suplementos periódicos); John E. Coligan, ed., (1993) Current Protocols In Immunology, New York: John Wiley & Sons.

Otro aspecto proporciona la detección de la presencia de una molécula de prueba que compite por la unión a (i) β-Klotho; (ii) FGFR1c, FGFR2c, FGFR3c o FGFR4; o (iii) un complejo que comprende β-Klotho y uno de FGFR1c, FGFR2c, FGFR3c y FGFR4 con las proteínas de unión a antígeno proporcionadas, tal como se da a conocer en el presente documento. Un ejemplo de un ensayo de este tipo puede implicar la detección de la cantidad de proteína de unión a antígeno libre en una disolución que contiene una cantidad de uno o más de (i) β-Klotho; (ii) FGFR1c, FGFR2c, FGFR3c o FGFR4; o (iii) un complejo que comprende β-Klotho y uno de FGFR1c, FGFR2c, FGFR3c y FGFR4 en presencia o ausencia de la molécula de prueba. Un aumento en la cantidad de proteína de unión a antígeno libre (es decir, la proteína de unión a antígeno no unida a (i) β-Klotho; (ii) FGFR1c, FGFR2c, FGFR3c o FGFR4; o (iii) un complejo que comprende β-Klotho y uno de FGFR1c, FGFR2c, FGFR3c y FGFR4) indicará que la molécula de prueba puede competir por la unión a (i) β-Klotho; (ii) FGFR1c, FGFR2c, FGFR3c o FGFR4; o (iii) un complejo que comprende β-Klotho; y uno de FGFR1c, FGFR2c, FGFR3c y FGFR4 con la proteína de unión a antígeno. En una realización, la proteína de unión a antígeno se marca con un grupo de marcaje. Alternativamente, la molécula de prueba se marca y la cantidad de molécula de prueba libre se monitoriza en presencia y ausencia de una proteína de unión a antígeno.

Formulaciones farmacéuticas y vías de administración

También se ilustran métodos de usar las proteínas de unión a antígeno. En algunos métodos, se proporciona una proteína de unión a antígeno a un paciente. La proteína de unión a antígeno induce señalización de tipo FGF21.

También se proporcionan composiciones farmacéuticas que comprenden una cantidad terapéuticamente eficaz de una o una pluralidad de las proteínas de unión a antígeno y un diluyente, portador, solubilizador, emulsionante, conservante y/o adyuvante farmacéuticamente aceptable. Además, se ilustran métodos de tratamiento de un paciente administrando tal composición farmacéutica. El término “paciente” incluye pacientes humanos.

Los materiales de formulación aceptables no son tóxicos para los receptores a las dosificaciones y concentraciones empleadas. En realizaciones específicas, se proporcionan composiciones farmacéuticas que comprenden una cantidad terapéuticamente eficaz de proteínas de unión a antígeno humanas que se unen específicamente a (i) -Klotho; (ii) FGFR1c, FGFR2c, FGFR3c o FGFR4; o (iii) un complejo que comprende β-Klotho y uno de FGFR1c, FGFR2c, FGFR3c y FGFR4.

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En determinadas realizaciones, preferiblemente los materiales de formulación aceptables no son tóxicos para los receptores a las dosificaciones y concentraciones empleadas. En determinadas realizaciones, la composición farmacéutica puede contener materiales de formulación para modificar, mantener o conservar, por ejemplo, el pH, osmolaridad, viscosidad, claridad, color, isotonicidad, olor, esterilidad, estabilidad, tasa de disolución o liberación, adsorción o penetración de la composición. En tales realizaciones, los materiales de formulación adecuados incluyen, pero no se limitan a, aminoácidos (tales como glicina, glutamina, asparagina, arginina o lisina); agentes antimicrobianos; antioxidantes (tal como ácido ascórbico, sulfito de sodio o hidrogenosulfito de sodio); tampones (tales como borato, bicarbonato, Tris-HCl, citratos, fosfatos u otros ácidos orgánicos); agentes de carga (tales como manitol o glicina); agentes quelantes (tales como ácido etilendiamina-tetraacético (EDTA)); agentes complejantes (tales como cafeína, polivinilpirrolidona, beta-ciclodextrina o hidroxipropil-beta-ciclodextrina); cargas; monosacáridos; disacáridos; y otros carbohidratos (tales como glucosa, manosa o dextrinas); proteínas (tales como albúmina sérica, gelatina o inmunoglobulinas); agentes colorantes, saborizantes y diluyentes; agentes emulsionantes; polímeros hidrófilos (tales como polivinilpirrolidona); polipéptidos de bajo peso molecular; contraiones formadores de sales (tales como sodio); conservantes (tales como cloruro de benzalconio, ácido benzoico, ácido salicílico, timerosal, alcohol fenetílico, metilparabeno, propilparabeno, clorhexidina, ácido sórbico o peróxido de hidrógeno); disolventes (tales como glicerina, propilenglicol o polietilenglicol); alcoholes de azúcares (tales como manitol o sorbitol); agentes de suspensión; tensioactivos o agentes humectantes (tales como Pluronics, PEG, ésteres de sorbitano, polisorbatos tales como polisorbato 20, polisorbato, Triton, trometamina, lecitina, colesterol, tiloxapal); agentes potenciadores de la estabilidad (tales como sacarosa o sorbitol); agentes potenciadores de la tonicidad (tales como haluros de metales alcalinos, preferiblemente cloruro de sodio o potasio, manitol, sorbitol); vehículos de administración; diluyentes; excipientes y/o adyuvantes farmacéuticos. Véase, Remington’s Pharmaceutical Sciences, 18ª edición, (A.R. Gennaro, ed.), 1990, Mack Publishing Company.

En determinadas realizaciones, la composición farmacéutica óptima la determinará un experto en la técnica dependiendo, por ejemplo, de la vía de administración prevista, formato de administración y dosificación deseada. Véase, por ejemplo, Remington’s Pharmaceutical Sciences, citado anteriormente. En determinadas realizaciones, tales composiciones pueden influir en el estado físico, estabilidad, tasa de liberación in vivo y tasa de aclaramiento in vivo de las proteínas de unión a antígeno dadas a conocer. En determinadas realizaciones, el vehículo o portador primario en una composición farmacéutica puede ser de naturaleza o bien acuosa o bien no acuosa. Por ejemplo, un vehículo o portador adecuado puede ser agua para inyección, solución salina fisiológica o líquido cefalorraquídeo artificial, posiblemente complementado con otros materiales comunes en composiciones para administración parenteral. Solución salina tamponada neutra o solución salina mezclada con albúmina sérica son vehículos a modo de ejemplo adicionales. En realizaciones específicas, las composiciones farmacéuticas comprenden tampón Tris de aproximadamente pH 7,0-8,5, o tampón acetato de aproximadamente pH 4,0-5,5, y pueden incluir además sorbitol o un sustituto adecuado. En determinadas realizaciones, composiciones que comprenden proteínas de unión a antígeno que se unen específicamente a (i) β-Klotho; (ii) FGFR1c, FGFR2c, FGFR3c o FGFR4; o (iii) un complejo que comprende β-Klotho y uno de FGFR1c, FGFR2c, FGFR3c y FGFR4 pueden prepararse para su almacenamiento mezclando la composición seleccionada que tiene el grado deseado de pureza con agentes de formulación opcionales (Remington’s Pharmaceutical Sciences, citado anteriormente) en forma de una torta liofilizada o una disolución acuosa. Además, en determinadas realizaciones, proteínas de unión a antígeno que se unen a (i) β- Klotho; (ii) FGFR1c, FGFR2c, FGFR3c o FGFR4; o (iii) un complejo que comprende β-Klotho y uno de FGFR1c, FGFR2c, FGFR3c y FGFR4 pueden formularse como liofilizado usando excipientes apropiados tales como sacarosa.

Las composiciones farmacéuticas pueden seleccionarse para administración parenteral. Alternativamente, las composiciones pueden seleccionarse para inhalación o para administración a través del tracto digestivo, tal como por vía oral. La preparación de tales composiciones farmacéuticamente aceptables está dentro de la experiencia de la técnica.

Los componentes de formulación están presentes preferiblemente en concentraciones que son aceptables para el sitio de administración. En determinadas realizaciones, se usan tampones para mantener la composición a pH fisiológico o a un pH ligeramente inferior, normalmente dentro de un intervalo de pH de desde aproximadamente 5 hasta aproximadamente 8.

Cuando se contempla la administración parenteral, las composiciones terapéuticas pueden proporcionarse en forma de una solución acuosa libre de pirógenos, aceptable desde el punto de vista parenteral, que comprende la proteína de unión a antígeno deseada en un vehículo farmacéuticamente aceptable. Un vehículo particularmente adecuado para inyección parenteral es agua destilada estéril en la que se formula la proteína de unión a antígeno como disolución estéril, isotónica, con conservantes apropiados. En determinadas realizaciones, la preparación puede implicar la formulación de la molécula deseada con un agente, tal como microesferas inyectables, partículas bioerosionables, compuestos poliméricos (tales como poli(ácido láctico) o poli(ácido glicólico)), perlas o liposomas, que pueden proporcionar liberación controlada o sostenida del producto que puede administrarse mediante inyección de depósito. En determinadas realizaciones, también puede usarse ácido hialurónico, que puede tener el efecto de fomentar la duración sostenida en la circulación. En determinadas realizaciones, pueden usarse dispositivos de administración de fármacos implantables para introducir la proteína de unión a antígeno deseada.

Determinadas composiciones farmacéuticas se formulan para su inhalación. En algunas realizaciones, proteínas de unión a antígeno que se unen a (i) β-Klotho; (ii) FGFR1c, FGFR2c, FGFR3c o FGFR4; o (iii) un complejo que comprende β-Klotho y uno de FGFR1c, FGFR2c, FGFR3c y FGFR4 se formulan como un polvo seco inhalable. En realizaciones específicas, también pueden formularse disoluciones de proteína de unión a antígeno inhalación con un propelente para administración por aerosol. En determinadas realizaciones, pueden nebulizarse disoluciones. Por tanto, métodos de formulación y administración pulmonar se describen adicionalmente en la solicitud de patente internacional WO 94/020069, que describe la administración pulmonar de proteínas químicamente modificadas. Algunas formulaciones pueden administrarse por vía oral. Proteínas de unión a antígeno que se unen específicamente a (i) β-Klotho; (ii) FGFR1c, FGFR2c, FGFR3c o FGFR4; o (iii) un complejo que comprende β-Klotho y uno de FGFR1c, FGFR2c, FGFR3c y FGFR4 que se administran de esta manera pueden formularse con o sin portadores habitualmente usados en la composición de formas de dosificación sólidas tales como comprimidos y cápsulas. En determinadas realizaciones, puede diseñarse una cápsula para liberar la parte activa de la formulación en el punto en el tracto gastrointestinal en el que se maximiza la biodisponibilidad y se minimiza la degradación presistémica. Pueden incluirse agentes adicionales para facilitar la absorción de una proteína de unión a antígeno. También pueden emplearse diluyentes, saborizantes, ceras de bajo punto de fusión, aceites vegetales, lubricantes, agentes de suspensión, agentes de disgregación de comprimidos y aglutinantes.

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Algunas composiciones farmacéuticas comprenden una cantidad eficaz de una o una pluralidad de proteínas de unión a antígeno humanas que se unen específicamente a (i) β-Klotho; (ii) FGFR1c, FGFR2c, FGFR3c o FGFR4; o

(iii) un complejo que comprende β-Klotho y uno de FGFR1c, FGFR2c, FGFR3c y FGFR4 en una mezcla con excipientes no tóxicos que son adecuados para la fabricación de comprimidos. Al disolver los comprimidos en agua estéril, u otro vehículo apropiado, pueden prepararse disoluciones en forma de dosis unitaria. Los excipientes adecuados incluyen, pero no se limitan a, diluyentes inertes, tales como carbonato de calcio, carbonato o bicarbonato de sodio, lactosa o fosfato de calcio; o agentes aglutinantes, tales como almidón, gelatina o goma arábiga; o agentes lubricantes tales como estearato de magnesio, ácido esteárico o talco.

Composiciones farmacéuticas adicionales resultarán evidentes para los expertos en la técnica, incluyendo formulaciones que implican proteínas de unión a antígeno que se unen específicamente a (i) ββ-Klotho y uno de FGFR1c, FGFR2c, FGFR3c y FGFR4 en formulaciones de administración sostenida o controlada. Los expertos en la técnica también conocen técnicas para formular una variedad de otros medios de administración sostenida o controlada, tales como portadores de liposomas, micropartículas bioerosionables o perlas porosas e inyecciones de depósito. Véase, por ejemplo, la solicitud de patente internacional WO 93/015722, que describe la liberación controlada de micropartículas poliméricas porosas para la administración de composiciones farmacéuticas. Las preparaciones de liberación sostenida pueden incluir matrices de polímero semipermeables en forma de artículos conformados, por ejemplo, películas o microcápsulas. Las matrices de liberación sostenida pueden incluir poliésteres, hidrogeles, polilactidas (tal como se da a conocer en la patente estadounidense n.º 3.773.919 y la publicación de solicitud de patente europea n.º EP 058481), copolímeros de ácido L-glutámico y gamma-etil-L-glutamato (Sidman et al., 1983, Biopolymers 2:547-556), poli(metacrilato de 2- hidroxietilo) (Langer et al., 1981, J. Biomed. Mater. Res. 15:167-277 y Langer, 1982, Chem. Tech. 12:98-105), etileno-acetato de vinilo (Langer et al., 1981, supra) o poli-(ácido D(-)-3hidroxibutírico) (publicación de solicitud de patente europea n.º EP 133.988). Las composiciones de liberación sostenida también pueden incluir liposomas que pueden prepararse mediante cualquiera de varios métodos conocidos en la técnica. Véase, por ejemplo, Eppstein et al., 1985, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 82:3688-3692; publicaciones de solicitud de patente europea n.os EP 036.676; EP 088.046 y EP 143.949,

Las composiciones farmacéuticas usadas para la administración in vivo se proporcionan normalmente como preparaciones estériles. La esterilización puede lograrse mediante filtración a través de membranas de esterilización por filtración. Cuando se liofiliza la composición, la esterilización usando este método puede realizarse o bien antes

o bien después de la liofilización y reconstitución. Las composiciones para administración parenteral pueden almacenarse en forma liofilizada o en una disolución. Las composiciones parenterales se colocan generalmente en un recipiente que tiene un orificio de acceso estéril, por ejemplo, una bolsa o vial para disolución intravenosa que tiene un tapón que puede perforarse mediante una aguja de inyección hipodérmica.

En determinadas realizaciones, se encapsulan células que expresan una proteína recombinante de unión a antígeno tal como se da a conocer en el presente documento para su administración (véase Invest. Ophthalmol Vis Sci (2002) 43:3292-3298 y Proc. Natl. Acad. Sciences USA (2006) 103:3896-3901).

En determinadas formulaciones, una proteína de unión a antígeno tiene una concentración de al menos 10 mg/ml, 20 mg/ml, 30 mg/ml, 40 mg/ml, 50 mg/ml, 60 mg/ml, 70 mg/ml, 80 mg/ml, 90 mg/ml, 100 mg/ ml o 150 mg/ml. Algunas formulaciones contienen un tampón, sacarosa y polisorbato. Un ejemplo de una formulación es una que contiene 50-100 mg/ml de proteína de unión a antígeno, acetato de sodio 5-20 mM, sacarosa al 5-10% p/v, y polisorbato al 0,002 - 0,008% p/v. Determinadas formulaciones, por ejemplo, contienen 65-75 mg/ml de una proteína de unión a antígeno en tampón acetato de sodio 9-11 mM, sacarosa al 8-10% p/v, y polisorbato al 0,005-0,006% p/v. el pH de determinadas de tales formulaciones está en el intervalo de 4,5-6. Otras formulaciones tienen un pH de 5,05,5 (por ejemplo, pH de 5,0, 5,2 ó 5,4).

Una vez formulada la composición farmacéutica, puede almacenarse en viales estériles como disolución, suspensión, gel, emulsión, sólido, cristal o como un polvo deshidratado o liofilizado. Tales formulaciones pueden almacenarse o bien en una forma lista para usarse o bien en una forma (por ejemplo, liofilizada) que se reconstituye antes de la administración. También se proporcionan kits para producir una unidad de administración de una única dosis. Determinados kits contienen un primer recipiente que tiene una proteína seca y un segundo recipiente que tiene una formulación acuosa. En determinadas realizaciones, se proporcionan kits que contienen jeringas precargadas de una única y de múltiples cámaras (por ejemplo, jeringas para líquidos y liojeringas). La cantidad terapéuticamente eficaz de una composición farmacéutica que contiene proteína de unión a antígeno que va a emplearse dependerá, por ejemplo, del contexto terapéutico y los objetivos. Un experto en la técnica apreciará que los niveles de dosificación apropiados para el tratamiento variarán dependiendo, en parte, de la molécula administrada, la indicación para la que está usándose la proteína de unión a antígeno, la vía de administración, y el tamaño (peso corporal, superficie corporal y tamaño de órgano) y/o estado (la edad y salud general) del paciente. En determinadas realizaciones, el médico puede ajustar la dosificación y modificar la vía de administración para obtener el efecto terapéutico óptimo.

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Una dosificación típica puede oscilar entre aproximadamente 1 µg/kg y aproximadamente 30 mg/kg o más, dependiendo de los factores mencionados anteriormente. En realizaciones específicas, la dosificación puede oscilar entre 10 µg/kg y aproximadamente 30 mg/kg, opcionalmente entre 0,1 mg/kg y aproximadamente 30 mg/kg, alternativamente entre 0,3 mg/kg y aproximadamente 20 mg/kg. En algunas aplicaciones, la dosificación es de desde 0,5 mg/kg hasta 20 mg/kg. En algunos casos, una proteína de unión a antígeno se administra a 0,3 mg/kg, 0,5 mg/kg, 1 mg/kg, 3 mg/kg, 10 mg/kg o 20 mg/kg. El calendario de dosificación en algunos regímenes de tratamiento es a una dosis de 0,3 mg/kg qW (una vez por semana), 0,5mg/kg qW, 1 mg/kg qW, 3 mg/kg qW, 10 mg/kg qW o 20 mg/kg qW.

La frecuencia de dosificación dependerá de los parámetros farmacocinéticos de la proteína de unión a antígeno particular en la formulación usada. Normalmente, un médico administra la composición hasta que se alcanza una dosificación que logra el efecto deseado. Por tanto, la composición puede administrarse como una única dosis, o como dos o más dosis (que pueden contener, pero no es necesario, la misma cantidad de la molécula deseada) a lo largo del tiempo o como una infusión continua a través de un dispositivo de implantación o catéter. Las dosificaciones apropiadas pueden determinarse mediante el uso de datos de respuesta a la dosis apropiados. En determinadas realizaciones, las proteínas de unión a antígeno pueden administrarse a pacientes a lo largo de un periodo de tiempo prolongado. La administración crónica de una proteína de unión a antígeno minimiza la respuesta alérgica o inmunitaria adversa comúnmente asociada con proteínas de unión a antígeno que no son totalmente humanas, por ejemplo un anticuerpo producido contra un antígeno humano en un animal no humano, por ejemplo, un anticuerpo que no es totalmente humano o anticuerpo no humano producido en una especie no humana.

La vía de administración de la composición farmacéutica es de acuerdo con métodos conocidos, por ejemplo, por vía oral, mediante inyección por vías intravenosa, intraperitoneal, intracerebral (intra-parenquimatosa), intracerebroventricular, intramuscular, intraocular, intraarterial, intraportal o intralesional; mediante sistemas de liberación sostenida o mediante dispositivos de implantación. En determinadas realizaciones, las composiciones pueden administrarse mediante inyección en bolo o de manera continua mediante infusión, o mediante dispositivo de implantación.

La composición también puede administrarse de manera local mediante implantación de una membrana, esponja u otro material apropiado en el cual se ha absorbido o encapsulado la molécula deseada. En determinadas realizaciones, en las que se usa un dispositivo de implantación, el dispositivo puede implantarse en cualquier tejido u órgano adecuado, y la administración de la molécula deseada puede realizarse mediante difusión, bolo de liberación controlada o administración continua.

También puede ser deseable usar composiciones farmacéuticas de proteína de unión a antígeno ex vivo. En tales casos, se exponen células, tejidos u órganos que se han extraído del paciente a composiciones farmacéuticas de proteína de unión a antígeno tras lo cual se implantan posteriormente las células, tejidos y/u órganos de vuelta en el paciente.

En particular, proteínas de unión a antígeno que se unen específicamente a (i) β-Klotho; (ii) FGFR1c, FGFR2c, FGFR3c o FGFR4; o (iii) un complejo que comprende β-Klotho y uno de FGFR1c, FGFR2c, FGFR3c y FGFR4 pueden administrarse implantando determinadas células que se han modificado mediante ingeniería genética, usando métodos tales como los descritos en el presente documento, para expresar y secretar el polipéptido. En determinadas realizaciones, tales células pueden ser células de animales o humanas, y pueden ser autólogas, heterólogas o xenogénicas. En determinadas realizaciones, las células pueden inmortalizarse. En otras realizaciones, con el fin de disminuir la probabilidad de respuesta inmunológica, las células pueden encapsularse para evitar la infiltración de tejidos circundantes. En realizaciones adicionales, los materiales de encapsulación son normalmente recintos o membranas poliméricos, biocompatibles, semipermeables, que permiten la liberación del/de los producto(s) de proteína pero previenen la destrucción de las células por el sistema inmunitario del paciente o por otros factores perjudiciales de los tejidos circundantes.

Terapias de combinación En otro aspecto, la presente divulgación ilustra un método de tratamiento de un sujeto para la diabetes con una proteína de unión a antígeno terapéutica de la presente divulgación, tal como los anticuerpos terapéuticos totalmente humanos descritos en el presente documento, junto con uno o más de otros tratamientos. En una realización, una terapia de combinación de este tipo logra un efecto aditivo o sinérgico. Las proteínas de unión a antígeno pueden administrarse en combinación con uno o más de los tratamientos para diabetes tipo 2 u obesidad actualmente disponibles. Estos tratamientos para diabetes incluyen biguanida (metformina) y sulfonilureas (tales como gliburida, glipizida). Los tratamientos adicionales dirigidos a mantener homeostasis de la glucosa incluyen agonistas de PPAR gamma (pioglitazona, rosiglitazona); glinidas (meglitinida, repaglinida y nateglinida); inhibidores de DPP-4 (Januvia® y Onglyza®) e inhibidores de alfa-glucosidasa (acarbosa, voglibosa).

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Los tratamientos de combinación adicionales para diabetes incluyen tratamientos inyectables tales como insulina y miméticos de incretina (Byetta®, Exenatide®), otros análogos de GLP-1 (péptido similar a glucagón) tales como liraglutida, otros agonistas de GLP-1R y Symlin® (pramlintida).

Los tratamientos de combinación adicionales dirigidos a la pérdida de peso incluyen Meridia® y Xenical®.

Ejemplos

Los siguientes ejemplos, incluyendo los experimentos llevados a cabo y los resultados logrados, se proporcionan únicamente para fines ilustrativos y no deben interpretarse como limitativos.

Ejemplo 1

Preparación de FGFR1c sobre células de expresión para su uso como antígeno

Se subclonaron secuencias de ácido nucleico que codifican para el polipéptido de FGFR1c humano de longitud completa (SEQ ID NO: 4; figuras 1A-1B) y una secuencia separada que codifica para el polipéptido de β-Klotho humano de longitud completa (SEQ ID NO: 7; figuras 2A-2C) en vectores de expresión de células de mamífero adecuados (por ejemplo, pADNc3.1 Zeo, pADNc3.1 Hyg (Invitrogen, Carlsbad, CA) o pDSRα20. El vector de pDSRα20 contiene el promotor/potenciador temprano de SV40 para expresar el gen de interés y un casete de expresión de DHFR de ratón para la selección en células huésped de DHFR (-) de CHO tales como AM1 CHO (un derivado de DG44, CHO DHFR (-)).

Se sembraron células AM-1 CHO a 1,5 x106 células por plato de 100 mm. Tras 24 horas, se cotransfectaron las células con ADN linearizados de pDSRα20/huFGFR1c y pDSRα20/huβ-Klotho con FuGene6 (Roche Applied Science). Se tripsinaron las células transfectadas 2 días tras la transfección y se sembraron en medio de crecimiento selectivo de CHO DHFR que contenía FBS dializado al 10% y sin complemento de hipoxantina/timidina. Tras 2 semanas, se tripsinaron y combinaron las colonias transfectadas resultantes.

Se transfectaron células HEK293T con el huFGFR1c y huβ-Klotho de longitud completa en un vector basado en series de pADNc3.1 o pTT14 (un vector de expresión desarrollado por Durocher, NRCC, con promotor de CMV y EBV ori, similar a pTT5 y un marcador de selección de puromicina) y seleccionado con los fármacos correspondientes siguiendo un procedimiento similar como para la transfección y selección de CHO.

Se clasificaron las combinaciones de células AM1 CHO o 293T transfectadas con FGF21R (es decir, FGFR1c y Klotho) repetidamente usando FGF21 marcado con Alexa 647. Como reactivo de tinción de la superficie celular, se marcó FGF21 con Alexa 647-NHS siguiendo el método recomendado por el fabricante (Molecular Probes, Inc. Cat A 2006). El FGF21 marcado con Alexa 647 mostró tinción específica de células que expresan el receptor de FGF21R y no las células parentales no transfectadas (figura 3). Se recogieron células de alta expresión al final de la última clasificación, se expandieron y se congelaron en viales. Se prepararon las células AM-1/huFGF21R para inmunización y se usaron las células 293T/huFGF21R para titular sueros de ratón mediante FACS tras la inmunización y en pantallas de unión de los sobrenadantes de hibridomas mediante FMAT (véase el ejemplo 4).

Ejemplo 2

Preparación de un complejo de FGFR1c/β-Klotho soluble para su uso como antígeno

Se generaron constructos del receptor de FGF21 solubles en vectores de expresión de pTT14 o pADNc3.1. El constructo de FGFR1c ECD-Fc(SEQ ID NO: 362, figura 4) comprende el dominio extracelular N-terminal de FGFR1c (residuos de aminoácido n.º 1-374; SEQ ID NO: 5) fusionado a Fc (SEQ ID NO: 384). El constructo de β-Klotho ECD-Fc (SEQ ID NO: 363, figura 5) comprende el dominio extracelular N-terminal de β-Klotho (residuos de aminoácido n.º 1-996; SEQ ID NO: 8) fusionado a Fc (SEQ ID NO: 384).

Se transfectaron células HEK293 (293F, Invitrogen) con huFGFR1c ECD-Fc/pTT5, huβ-Klotho ECD-Fc/pTT14-puro y dGFP/pADNc3.1-Neo y se seleccionaron en presencia de los fármacos correspondientes seguido por clasificación por FACS repetida basándose en la expresión de dGFP. Se hicieron crecer las células en medio de Eagle modificado por Dulbecco libre de suero (DMEM) complementado con aminoácidos no esenciales en HyperFlasks (Corning) durante 4 días y medios condicionados (CM) cosechados para purificación.

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Se concentró el CM 293 6 veces y se aplicó a la proteína A FF equilibrada en PBS. Se eluyó la proteína con tampones de elución Pierce Gentle Ag/Ab. Se dializó la combinación de proteína A frente a Tris-HCl 20 mM, pH 7, NaCl 10 mM y se aplicó a SP HP a pH 7,0. El FGFR1c ECD-Fc estaba presente en el flujo a través (FT) y se eluyó el heterodímero con un gradiente lineal de NaCl 0-0,4 M, Tris-HCl 20 mM pH 7,0. La secuenciación de aminoácidos de extremo N-terminal verificó que el FGF21R soluble purificado era un heterodímero compuesto de (1:1) razón de FGFR1c ECD-Fc y β-Klotho ECD-Fc. Se usó el FGF21R-FC soluble purificado (figura 6) como antígeno para la inmunización.

Ejemplo 3

Preparación de anticuerpos monoclonales

Se llevaron a cabo inmunizaciones usando una o más formas adecuadas del antígeno del receptor de FGF21, incluyendo: (1) receptor unido a células de transfectantes de CHO que expresan FGFR1c y β-Klotho humanos de longitud completa en la superficie de la célula, obtenido transfectando células de CHO con ADNc que codifica para un polipéptido de FGFR1c de longitud completa humano de SEQ ID NO: 4 (véase también las figuras 1a-b) y ADNc que codifica para un polipéptido de β-Klotho humano de SEQ ID NO: 7 (véase también las figuras 2a-c); (2) extracto de membranas de las células mencionadas que expresan el complejo del receptor de FGF21R; o (3) receptor de FGF21R soluble que puede obtenerse coexpresando el dominio extracelular N-terminal (ECD) de FGFR1c (SEQ ID NO: 5; véase también la figura 4) y el dominio extracelular N-terminal (ECD) de β-Klotho (SEQ ID NO: 8; véase también la figura 5) o (4) combinaciones de los mismos.

Se usó una cantidad adecuada de inmunógeno (es decir, 10 µg/ratón de FGF21R soluble o 3-4x106 células/ratón de de células de CHO transfectadas de manera estable o 150 µg/ratón de membranas de FGF21R purificadas preparadas a partir de células de CHO que expresan de manera estable FGF21R) para la inmunización inicial en XenoMouse™ según los métodos dados a conocer en las solicitudes de patente internacional n.os WO 98/24893 y WO 00/7631 0. Siguiendo la inmunización inicial, se administraron inmunizaciones de refuerzo posteriores de inmunógeno (5 mg/ratón de FGF21R soluble o 1,7x106 de FGF21R células transfectadas/ratón o 75 µg de membranas de FGF21R purificadas) según una programación y durante la duración necesaria para inducir un título anti-FGF21R adecuado en los ratones. Se determinaron los títulos mediante un método adecuado, por ejemplo, mediante inmunoensayo enzimático, clasificación de células activadas por fluorescencia (FACS), o mediante otros métodos (incluyendo combinaciones de enzima inmunoensayos y FACS).

Se identificaron los animales que presentaban títulos adecuados, y se obtuvieron linfocitos a partir del drenaje de los ganglios linfáticos y, si es necesario, se combinaron para cada cohorte. Se disociaron linfocitos del tejido linfoide moliendo en un medio adecuado (por ejemplo, medio de Eagle modificado por Dulbecco; DMEM; que puede obtenerse de Invitrogen, Carlsbad, CA) para liberar las células de los tejidos, y se suspendieron en DMEM. Se seleccionaron y/o expandieron células B usando métodos convencionales y se fusionaron con un componente de fusión adecuado, por ejemplo, células P3X63Ag8.653 de mieloma no secretoras (American Type Culture Collection CRL 1580; Kearney , J. Immunol. 123, 1979, 1548-1550), usando técnicas que se conocían en la técnica.

En un método de fusión adecuado, se mezclaron linfocitos con células de componente de fusión a una razón de 1:4. Se sedimentó cuidadosamente la mezcla celular mediante centrifugación a 400 x g durante 4 minutos, se decantó el sobrenadante, y se mezcló cuidadosamente la mezcla celular (por ejemplo, usando una pipeta de 1 ml). Se indujo la fusión con PEG/DMSO (polietilenglicol/dimetilsulfóxido; obtenido de Sigma-Aldrich, St. Louis MO; 1 ml por millón de linfocitos). Se añadió PEG/DMSO lentamente con agitación cuidadosa durante un minuto seguido por un minuto de mezclado. Entonces se añadió IDMEM (DMEM sin glutamina; 2 ml por millón de células B), durante 2 minutos con agitación cuidadosa, seguido por IDMEM adicional (8 ml por millón de células B) que se añadió durante 3 minutos.

Se sedimentaron las células fusionadas (400 x g 6 minutos) y se resuspendieron en 20 ml de medios de selección (por ejemplo, DMEM que contenía azaserina e hipoxantina [HA] y otros materiales complementarios según fuera necesario) por millón de células B. Se incubaron las células durante 20-30 minutos a 37ºC y entonces se resuspendieron en 200 ml de medios de selección y se cultivaron durante de tres a cuatro días en matraces T175 antes de la siembra en placas de 96 pocillos.

Se distribuyeron las células en placas de 96 pocillos usando las técnicas convencionales para maximizar la capacidad de clonación de las colonias resultantes. Tras varios días de cultivo, se recogieron los sobrenadantes se sometieron a ensayos de selección tal como se detalla en los ejemplos a continuación, incluyendo confirmación de unión al receptor de FGF21 humano, especificidad y/o reactividad cruzada de especies. Se seleccionaron además células positivas y se sometieron a técnicas de clonación y subclonación convencionales. Se expandieron las líneas clónicas in vitro, y los anticuerpos humanos secretados obtenidos para el análisis.

De esta manera, se inmunizaron los ratones con o bien células o bien membranas que expresaban células FGF21R de longitud completa o dominio extracelular soluble de FGF21R, con un intervalo de 11-17 inmunizaciones durante un periodo de aproximadamente uno a tres meses y medio. Se obtuvieron varias líneas celulares que secretaban anticuerpos específicos de FGF21R, y se caracterizaron adicionalmente los anticuerpos. Las secuencias de los mismos se presentan en el presente documento y en la lista de secuencias, y se proporcionan los resultados de diversas pruebas usando estos anticuerpos.

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Ejemplo 4

Selección de anticuerpos de unión mediante FMAT

Tras 14 días de cultivo, se examinaron sobrenadantes de hibridoma para determinar anticuerpos monoclonales específicos de FGF21R mediante tecnología de ensayo fluorométrico de microvolumen (FMAT) examinando o bien frente a la línea celular CHO AM1/huFGF21R o bien células HEK293 recombinantes que se transfectaron con FGF21R humano y contraexaminando frente a células de CHO o HEK293 parentales. En resumen, se sembraron las células en medios Freestyle (Invitrogen) en placas para FMAT de 384 pocillos en un volumen de 50 µl/pocillo a una densidad de 4.000 células/pocillo para los transfectantes estables y a una densidad de 16.000 células/pocillo para las células parentales y se incubaron las células durante la noche a 37ºC. Entonces se añadieron 10 µl/pocillo de sobrenadante y se incubaron las placas durante aproximadamente una hora a 4ºC, después de lo cual se añadieron 10 µl/pocillo de anticuerpo secundario de IgG-Cy5 anti-humano a una concentración de 2,8 µg/ml (concentración final 400 ng/ml). Entonces se incubaron las placas durante una hora a 4ºC, y se leyó la fluorescencia usando un sistema de detección celular de FMAT (Applied Biosystems).

En total, se identificaron más de 3.000 sobrenadantes de hibridoma como que se unían a las células que expresaban el receptor de FGF21 pero no a células parentales mediante el método de FMAT. Entonces estos sobrenadantes se sometieron a prueba en los ensayos funcionales de FGF21 tal como se describe a continuación.

Ejemplo 5

Selección de anticuerpos que inducen señalización de tipo FGF21

Se realizaron experimentos para identificar anticuerpos funcionales que imitan la actividad silvestre de FGF21 (por ejemplo, la capacidad para inducir señalización de tipo FGF21) usando un ensayo indicador de FGF21 adecuado. El ensayo indicador de FGF21 dado a conocer mide la activación de la señalización de FGFR mediante una lectura de la ruta de MAPK. β-Klotho es un correceptor para la señalización de FGF21 y aunque se cree que no tiene ninguna capacidad de señalización inherente debido a su dominio citoplásmico muy corto, se requiere por FGF21 para inducir señalización a través de FGFR.

Ejemplo 5.1

Ensayo indicador de ELK-luciferasa

Se realizaron ensayos de ELK-luciferasa usando un sistema de células de CHO o células de riñón 293T humanas recombinantes. Específicamente, se modificaron las células huésped mediante ingeniería genética para sobreexpresar constructos indicadores de β-Klotho y luciferasa. Los constructos indicadores contienen secuencias que codifican para GAL4-ELK1 y 5xUAS-Luc, un indicador de luciferasa impulsado por un promotor que contiene cinco copias en tándem del sitio de unión de Gal4. La activación del complejo del receptor de FGF21 en estas líneas celulares indicadoras recombinantes induce traducción intracelular de la señal, que a su vez conduce a la fosforilación de ERK y ELK. La actividad de luciferasa está regulada por el nivel de ELK fosforilado y se usa para monitorizar y cuantificar indirectamente la actividad de FGF21.

En un ejemplo, se transfectaron células de CHO secuencialmente usando el reactivo de transfección Lipofectamine 2000 (Invitrogen) según el protocolo del fabricante con los constructos del receptor que expresan β-Klotho, FGFR1c y los plásmidos indicadores: 5x Gal4-Luciferasa (promotor de TK mínimo con sitios de unión de 5xGal4 en dirección 5’ de luciferasa) y Gal4-ELK1. Gal4-ELK1 se une a los sitios de unión de Gal4 y activa la transcripción cuando se fosforila por ERK. La transcripción de luciferasa, y por tanto, la actividad enzimática correspondiente en este contexto está regulada por el nivel de ELK1 fosforilado, y se usa para monitorizar y cuantificar indirectamente la actividad de FGF21.

Se seleccionó el clon 2E10 línea celular indicadora con luciferasa de FGF21 basándose en la ventana de ensayo óptima de 10-20 veces con FGF21 nativo que muestra una CE50 en el único intervalo nM.

Para el ensayo, se pusieron en placa células indicadoras de ELK-luciferasa en placas de ensayo de 96 pocillos, y se les privó de suero durante la noche. Se añadieron muestras de prueba o FGF21 durante 6 horas a 37 grados. Entonces se permitió que las placas se enfriaran hasta temperatura ambiente y se midió la actividad de luciferasa en los lisados celulares con Bright-Glo (Promega).

Ejemplo 5.2

Ensayo de fosforilación de ERK

Se desarrollaron líneas de células huésped alternativas específicamente L6 (una línea celular mioblástica de rata) y se aplicaron para identificar anticuerpos con actividad de señalización de tipo FGF21. La línea celular L6 de rata es una línea de células huésped deseable para el ensayo de actividad porque se sabe que expresa niveles mínimos de receptores de FGF endógenos. Las células L6 no responden a FGF21 incluso cuando se transfectan con un vector de expresión de β-Klotho y, por tanto, proporcionan un fondo más limpio. (Kurosu et al., (2007) J. Biol. Chem. 282, 26687-26695).

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Se mantuvieron las células L6 en medio de Eagle modificado con Dulbecco complementado con suero bovino fetal al 10% y penicilina/estreptomicina. Se transfectaron células con plásmidos que expresaban βKlotho y FGFR individual usando el reactivo de transfección Lipofectamine 2000 (Invitrogen) según el protocolo del fabricante.

Se realizó análisis de la señalización de FGF en células L6 tal como se describe en la bibliografía (Kurosu et al., (2007) J. Biol. Chem. 282, 26687-26695). Se recogieron cultivos celulares 10 min después del tratamiento de FGF21

o moléculas de prueba y se congelaron instantáneamente en nitrógeno líquido, se homogeneizaron en el tampón de lisis y se sometieron a análisis de transferencia de tipo Western usando un anticuerpo anti-fosfop44/ 42 MAP quinasa (ERK1/2) y un anticuerpo anti-ERK (señalización celular). Se determinó el porcentaje de ERK fosforilado frente a proteína de ERK total de esta manera.

Además, también puede desarrollarse y aplicarse el ensayo de proliferación basado en células BaF3 de ratón dependientes del factor frecuentemente usado para receptores de citocina.

Entre los sobrenadantes de hibridomas sometidos a prueba en el ensayo indicador de ELK-luciferasa de FGF21 humano basado en células de CHO, se identificaron más de 30 como positivas (>5% de la actividad de FGF21) cuando se compara con FGF21 20 nM como control positivo. Entonces se purificaron los anticuerpos de los medios condicionados de los cultivos de hibridoma de estos positivos y se sometieron de nuevo a prueba en el ensayo indicador de ELK-luciferasa basado en células de CHO. La (figura 7) mostró los anticuerpos representativos en el ensayo de potencia sensible a la dosis con CE50 estimada menor de 1 µg/ml (o 6,7 nM). Se confirmaron las actividades en el ensayo de fosforilación de ERK1/2 basado en células L6 (figura 8) con CE50 menor de 10 nM que es coherente con el ensayo de ELK-luciferasa en la línea celular estable de CHO 2E10.

Ejemplo 6

La inducción de señalización de tipo FGF21 es específica para el complejo de FGFR1c/βKlotho

Se ha notificado que FGF21 señaliza a través de múltiples complejos de receptor incluyendo FGFR1c, 2c, 3c y 4 cuando se empareja con β-Klotho. Se sometió a prueba la selectividad de los anticuerpos agonistas de FGF21 en las células L6 mioblásticas de rata transfectadas con vectores que expresan los FGFR y ββ-Klotho porque no se detectó actividad en los últimos receptores hasta 100 nM de los anticuerpos agonistas. Esta selectividad única sugiere fuertemente que la acción de estos anticuerpos es dependiente de β-Klotho pero debe implicar también específicamente el componente FGFR1c del complejo de señalización.

Ejemplo 7

Actividad en adipocitos humanos primarios

FGF21 estimula la captación de glucosa y la lipólisis en adipocitos cultivados y se consideran que los adipocitos son más fisiológicamente relevantes que el sistema de células indicadoras recombinantes.

Se mostró que un panel de los anticuerpos presentaba actividad de fosforilación de Erk similar a FGF21 en el ensayo de adipocitos humanos (figura 10) con CE50 estimada menor de 10 nM.

Ejemplo 8

Unión de competición y clasificación de epítopos

Para comparar la similitud de los sitios de unión de los anticuerpos en el receptor de FGF21, se realizó una serie de experimentos de unión de competición y se midió mediante Biacore. En un ejemplo (y tal como se muestra en la figura 11), se inmovilizaron dos anticuerpos del receptor de FGF21 agonistas representativos (24H11 y 17D8) y un anticuerpo de unión al receptor de FGF21 no funcional (1A2.1) en la superficie del chip del sensor. Se capturó entonces el complejo de FGFR1c/β-Klotho ECD-Fc humano soluble o β-Klotho en las superficies del anticuerpo inmovilizado. Finalmente, se inyectaron varios de los anticuerpos del receptor de FGF21 de prueba individualmente sobre el receptor de FGF21 humano soluble o β-Klotho. Si el anticuerpo inyectado reconoce un sitio de unión distinto con respecto al reconocido por el anticuerpo inmovilizado, se observará un segundo evento de unión. Si los anticuerpos reconocen un sitio de unión muy similar, no se observará más unión.

Tal como se muestra en la (figura 11A), hay dos sitios de unión distintos pero parcialmente solapantes para los anticuerpos agonistas sometidos a prueba. Un sitio está cubierto por 24H11, 21H2, 18B11.1 y 17C3 (grupo A) y el otro sitio está cubierto por 17D8, 12E4 y 18G1 (grupo B). Los dos anticuerpo no funcionales 2G10 y 1A2, se unen a diferentes sitios entres sí y son distintos de los dos sitios cubiertos por los anticuerpos agonistas en el grupo A y B. Otros anticuerpos funcionales que se unen al epítopo del grupo incluyeron 20D4, 22H5, 16H7, 40D2 y 46D11. Se mostraron otros dos anticuerpos funcionales 26H11 y 37D3 por este método para unir el mismo sitio cubierto por los anticuerpos del grupo B. Además, se identificó un tercer sitio de unión para anticuerpos funcionales para 39F11, 39F7 y 39G5 (grupo C) que parecían ser distintos de los sitios de unión del grupo A y B (figura 11B).

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Se llevó a cabo otro análisis Biacore con FGF21 biotinilado inmovilizado en el chip del sensor. Entonces se hizo pasar β-Klotho soluble 10 nM sobre el chip solo o mezclado con los anticuerpos de prueba individuales a 100 nM. La (figura 12) mostró que varios anticuerpos agonistas en el grupo A (24H11, 18B11, 17C3) y el anticuerpo 12E4 (del grupo B) competían significativamente con FGF21 en la unión a β-Klotho soluble mientras que los anticuerpos no funcionales 2G10 y 1A2 y otros tantos anticuerpos funcionales no mostraron unión de competición con FGF21.

La figura 11C resume los resultados de clasificación obtenidos.

Ejemplo 9

Reconocimiento de estructuras nativas y desnaturalizadas

Se investigó la capacidad de las proteínas de unión a antígeno dadas a conocer para reconocer estructuras desnaturalizadas y nativas. El procedimiento y los resultados fueron tal como sigue a continuación.

Ejemplo 9.1

Los anticuerpos agonistas del receptor FGF21 no reconocen estructuras desnaturalizadas, tal como se muestra mediante FACS

Se diluyeron lisados celulares de células de CHO que expresan de manera estable el receptor de FGF21 (FGFR1c y β-Klotho) o células parentales de CHO con tampón de muestra sin beta-mercaptoetanol (condiciones no reductoras). Se cargaron 20 µl de lisado celular por carril en carriles adyacentes separados con un carril marcador de peso molecular en geles de SDS-PAGE al 4-20%. Tras la electroforesis, se transfirieron los geles en filtros de nitrocelulosa de 0,2 µ. Se trataron las transferencias con solución salina tamponada con Tris/Triton-X (TBST) más el 5% de leche desnatada (tampón de bloqueo) durante 30 minutos. Entonces se cortaron las transferencias a lo largo de los carriles marcadores de peso molecular. Entonces se sondaron las bandas con anticuerpos agonistas del receptor de FGF21 (12C3, 26H11, 12E4, 21H2, 18B11, o 20D4) y βklotho de cabra anti-murino comercial o antihuFGFR1 de ratón (R&D Diagnostics) en TBST/el 5% de leche. Se incubaron las transferencias con los anticuerpos durante una hora a temperatura ambiente, seguido por tres lavados con TBST + el 1% de leche. Entonces se sondaron las transferencias con anticuerpos secundarios IgG-HRP anti-humano o anti-cabra durante 20 min. A las transferencias se les dio tres lavados de 15 min con TBST seguido por tratamiento con reactivo de desarrollo Pierce Supersignal West Dura (1 min) y exposición a película de rayos X Biomax de Kodak.

Los anticuerpos anti-β-Klotho y anti-FGFR1 comerciales detectaron las proteínas receptoras correspondientes en SDS-PAGE indicando que se unen a proteínas receptoras desnaturalizadas. En cambio, ninguno de los anticuerpos agonistas del receptor de FGF21 sometidos a prueba detectó las especies proteicas correspondientes sugiriendo que se unen al epítopo conformacional nativo distinto de los anticuerpos comerciales que se unen a las secuencias desnaturalizadas.

Ejemplo 9.2

Los anticuerpos agonistas del receptor FGF21 se unen a la estructura receptora nativa, tal como se muestra mediante FACS

Se realizó un ensayo de unión de FACS con varios anticuerpos -Klotho y FGFR1c comercialmente disponibles, y varios de los anticuerpos agonistas del receptor de FGF21 dados a conocer. Se realizaron experimentos tal como sigue a continuación

Se trataron células de CHO que expresaban de manera estable el receptor de FGF21 con anticuerpos antihuFGFR1 de ratón, anti-mu β-Klotho de cabra de R&D Systems o anticuerpos del receptor de FGF21 24H11, 17C3, 17D8, 18G1, o 2G10 (1 µg por 1x106 células en 100 µl de PBS/BSA al 0,5%). Se incubaron las células con los anticuerpos a 4ºC seguido por dos lavados con PBS/BSA. Entonces se trataron las células con anticuerpos secundarios marcados con FITC a 4ºC seguido por dos lavados. Se resuspendieron las células en 1 ml de PBS/BSA y se analizó la unión al anticuerpo usando un instrumentos FACS Calibur.

De manera coherente con los resultados de transferencia de tipo Western, todos los anticuerpos agonistas del receptor de FGF21 sometidos a prueba se unen al receptor de FGF21 de la superficie celular en FACS mientras que los anticuerpos anti-β-Klotho o anti-FGFR1 comerciales no lo hicieron. Esta observación confirmó además que los anticuerpos agonistas del receptor de FGF21 reconocen la estructura nativa mientras que los anticuerpos comerciales para los componentes del receptor no.

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Ejemplo 10

Exploración con arginina

Tal como se describe anteriormente, se crearon y caracterizaron proteínas de unión a antígeno que se unen a FGF21R humano, por ejemplo, FGFR1c, β-Klotho o tanto FGFR1c como β-Klotho. Para determinar los determinantes neutralizantes en FGFR1c y/o β-Klotho humanos a lo que diversas de estas proteínas de unión a antígeno se unen, pueden construirse varias proteínas de FGFR1c y/o β-Klotho mutantes que tienen sustituciones de arginina en residuos de aminoácido seleccionados de FGFR1c y/o β-Klotho humano. El exploración con arginina es un método reconocido en la técnica de evaluar dónde los anticuerpos, u otras proteínas, se unen a otra proteína, véase, por ejemplo, Nanevicz et al., (1995) J. Biol. Chem., 270:37, 21619-21625 y Zupnick et al., (2006) J. Biod. Chem., 281:29, 20464-20473. En general, la cadena lateral de arginina está cargada positivamente y es relativamente voluminosa en comparación con otros aminoácidos, que pueden alterar la unión del anticuerpo a una región del antígeno donde se introduce la mutación. El exploración con arginina es un método que determina si un residuo es parte de un determinante neutralizante y/o un epítopo.

Pueden seleccionarse diversos aminoácidos distribuidos en la totalidad de los dominios extracelulares de FGFR1c y/o β-Klotho humanos para mutación a arginina. La selección puede estar sesgada hacia los aminoácidos cargados

o polares para maximizar la posibilidad de que el residuo esté en la superficie y reducir la probabilidad de que la mutación dé como resultado una proteína plegada erróneamente. Usando las técnicas convencionales conocidas en la técnica, pueden diseñarse oligonucleótidos sentido y antisentido que contienen los residuos mutados basándose en los criterios proporcionados por el kit de protocolo Stratagene Quickchange® II (Stratagene/Agilent, Santa Clara, CA). Puede realizarse mutagénesis de las secuencias de FGFR1c y/o β-Klotho silvestres (WT) usando un kit a Quickchange® II (Stratagene). Pueden diseñarse constructos quiméricos mediante ingeniería genética para codificar una etiqueta de FLAG-histidina (seis histidinas (SEQ ID NO: 382)) en el extremo carboxilo del dominio extracelular para facilitar la purificación mediante la etiqueta de poli-His.

Pueden realizarse análisis de múltiplex usando la estación de trabajo Bio-Plex y el software (BioRad, Hercules, CA) para determinar determinantes neutralizantes en FGFR1c y/o β-Klotho humanos analizando la unión diferencial de mAc de FGFR1c y/o β-Klotho a modo de ejemplo a mutantes de arginina frente a FGFR1c silvestre y/o proteínas de β-Klotho. Puede usarse cualquier código de perlas de perlas recubiertas con penta-His (“penta-His” dado a conocer como SEQ ID NO: 383) (Qiagen, Valencia, CA; véase www1.qiagen.com) para capturar proteína marcada con histidina. Los códigos de perlas pueden permitir la multiplexión de mutantes de arginina de FGFR1c y/o β-Klotho y FGFR1c y/o -Klotho humanos silvestres.

Para preparar las perlas, se unen 100 µl de sobrenadantes mutantes de arginina de FGFR1c y/o β-Klotho y FGFR1c y/o β-Klotho silvestres del cultivo de expresión transitorio a perlas recubiertas con penta-His (“penta-His” dado a conocer como SEQ ID NO: 383) durante la noche a 4ºC o 2 horas a temperatura ambiente con agitación vigorosa. Entonces se lavan las perlas según el protocolo del fabricante y el conjunto de perlas se combina y se toman alícuotas en 2 ó 3 columnas de un placa de filtro de 96 pocillos (Millipore, Bellerica, MA, n.º de producto MSBVN1250) para puntos de ensayo duplicados o triplicados, respectivamente. Se añaden 100 µl de anticuerpos anti-FGFR1c y/o anti-β-Klotho en diluciones de 4 veces a los pocillos, se incuban durante 1 hora a temperatura ambiente, y se lavan. Se añaden 100 µl de una dilución 1:100 de Fc de IgG anti-humano conjugado con PE (Jackson Labs., Bar Harbor, ME, n.º de producto 109-116-170) a cada pocillo, se incubaron durante 1 hora a temperatura ambiente y se lavaron. Se resuspenden las perlas en BSA al 1%, se agitaron durante 3 minutos y se leyeron en la estación de trabajo Bio-Plex. Se compara la unión del anticuerpo a la proteína mutante de arginina de FGFR1c y/o β-Klotho con unión del anticuerpo al FGFR1c humano y/o β-Klotho silvestre de la misma combinación. Puede realizarse una titulación de anticuerpo sobre una escala de aproximadamente 5 log. Puede representarse gráficamente la intensidad de fluorescencia mediana (MFI) de proteínas mutantes de arginina de FGFR1c y/o β-Klotho como porcentaje de la señal máxima de FGFR1c y/o β-Klotho humanos silvestres. Esos mutantes para los que la señal de todos los anticuerpos está por debajo de un valor de corte, por ejemplo, puede considerarse el 30% de FGFR1c y/o β-Klotho silvestre que es o bien una concentración de proteínas demasiado baja en la perla debido a la mala expresión en el cultivo transitorio o bien posiblemente plegada erróneamente y puede excluirse del análisis. Las mutaciones (es decir, sustituciones de arginina) que aumentan la CE50 para el mAc de FGFR1c y/o β-Klotho por un valor de corte, por ejemplo, 3 veces o superior (tal como se calcula mediante, por ejemplo, GraphPad Prism®) pueden considerarse que han afectado negativamente a la unión de Acm de FGFR1c y/o β-Klotho. A lo largo de estos métodos, se elucidan determinantes neutralizantes y epítopos para diversos anticuerpos de FGFR1c y/o β-Klotho.

Ejemplo 11

Construcción de receptores quiméricos

En otro método para determinar los determinantes de activación en FGFR1c y/o β-Klotho humano que estas diversas proteínas de unión a antígeno unen, pueden construirse proteínas de FGFR1c y/o β-Klotho quiméricas específicas entre especies humanas y de ratón, expresadas en células de CHO o 293 estables o transitorias tal

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como se describió anteriormente y se sometieron a prueba. Por ejemplo, puede construirse un receptor de FGF21 quimérico que comprende FGFR1c, FGFR2C, FGFR3c o FGFR4 humanos nativos, en un ejemplo FGFR1c, emparejado con β-Klotho humano/de ratón quimérico en el que regiones o secuencias seleccionadas en el β-Klotho humano se reemplazan sistemáticamente por los residuos específicos de ratón correspondientes (véase, por 5 ejemplo, la figura 2A-2C). De manera similar, β-Klotho humano nativo emparejado con FGFR1c, FGFR2c, FGFR3c o FGFR4, en un ejemplo FGFR1c humanos/de ratón quiméricos en los que se reemplazan sistemáticamente regiones

o secuencias seleccionadas en el FGFR1c humano por los residuos específicos de ratón correspondientes (véase, por ejemplo, las alineaciones de las figuras 1A-1B). Las secuencias críticas implicadas en la unión y/o actividad de las proteínas de unión a antígeno pueden derivarse a través del ensayo de unión o mediciones de actividad

10 descritos en los ejemplos previos 4, 5, 6 y 7 basados en los receptores de FGF21 quiméricos.

Ejemplo 11.1

Construcción de quimeras específicas

Se construyeron quimeras de β-Klotho de humano-ratón usando la metodología descrita en el ejemplo 14. Se presenta un esquema de las quimeras construidas en la figura 29; en resumen, las quimeras generadas

15 comprendían (del extremo N a C) una fusión de una secuencia de β-Klotho humano fusionada a una secuencia de β-Klotho murino fusionada a una secuencia de β-Klotho humano. Se usó β-Klotho humano (SEQ ID NO: 8) como región de marco en la que se insertaron regiones de β-Klotho murino (secuencia de longitud completa mostrada en SEQ ID NO: 468). Las regiones de β

Residuos murinos 82P-520P

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Residuos murinos 506F-1043S

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Residuos murinos 1M-193L

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25 Residuos murinos 82P-302S Residuos murinos 194Y-416G

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Residuos murinos 302S-506F

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Residuos murinos 416G-519P

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Residuos murinos 507P-632G

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10 Residuos murinos 520P-735A

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Residuos murinos 632G-849Q

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Residuos murinos 735A-963S

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Residuos murinos 1M-81F

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Residuos murinos 82P-193L Las quimeras generadas usando las secuencias de β-Klotho murino comprendían los siguientes componentes:

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Identificador del constructo: Constructo SEQ ID NO Residuos de β-Klotho humano Nterminales Residuos de β-Klotho de ratón Residuos de β-Klotho humano Cterminales

huBeta_Klotho(1-81, 523-1044)(muBetaKLOTHO 82-520): 1-81 82-520 523-1044

huBeta_Klotho(1-507)(muBetaKLOTHO 506F-1045S): 1-507 506-1043

huBeta_Klotho(194-1044)(muBetaKLOTHO 1-L193): 1-193 194-1044

huBeta_Klotho(1-81, 303-1044)(muBetaKLOTHO 82P-302S): 1-81 82-302 303-1044

huBeta_Klotho(1-193, 419-1044)(muBetaKLOTHO Y194-416G): 1-193 194-416 419-1044

huBeta_Klotho(1-301, 509-1044)(muBetaKLOTHO S302-F506): 1-301 302-506 509-1044

huBeta_Klotho(1-417, 522-1044)(muBetaKLOTHO G416-F519): 1-417 416-519 522-1044

huBeta_Klotho(1-507, 635-1044)(muBeta KLOTHO F06-G632): 1-508 507-632 635-1044

huBeta_Klotho(1-521, 738-1044)(muBeta KLOTHO 520P-735A): 1-521 520-735 738-1044

huBeta_Klotho(1-633, 852-1044)(muBeta KLOTHO 632G-849Q): 1-633 632-849 852-1044

huBeta_Klotho(1-736, 967-1044)(muBeta KLOTHO 735A-963S): 1-736 735-963 967-1044

huBeta_Klotho(82-1044)(muBeta KLOTHO 1-81F): 1-81 82-1044

huBeta_Klotho(1-81, 194-1044)(muBeta KLOTHO 82P-193L): 1-81 82-193 194-1044

Las quimeras generadas comprendían las siguientes secuencias de aminoácidos:

(i) huBeta_Klotho(1-81, 523-1044)(muBetaKLOTHO 82-520)

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(ii) huBeta_Klotho(1-507)(muBetaKLOTHO 506F-1045S)

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(iii) huBeta_Klotho(194-1044)(muBetaKLOTHO 1-L193)

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(iv) huBeta_Klotho(1-81, 303-1044)(muBetaKLOTHO 82P-302S)

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(v) huBeta_Klotho(1-193, 419-1044)(muBetaKLOTHO Y194-416G)

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(vi) huBeta_Klotho(1-301, 509-1044)(muBetaKLOTHO S302-F506)

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(vii) huBeta_Klotho(1-417, 522-1044)(muBetaKLOTHO G416-F519)

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(viii) huBeta_Klotho(1-507, 635-1044)(muBeta KLOTHO F06-G632)

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(ix): huBeta_Klotho(1-521, 738-1044)(muBeta KLOTHO 520P-735A)

(x) huBeta Klotho(1-633, 852-1044)(muBeta KLOTHO 632G-849Q)

(xi): huBeta_Klotho(1-736, 967-1044)(muBeta KLOTHO 735A-963S)

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(xii) huBeta_Klotho(82-1044)(muBeta KLOTHO 1-81F)

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(xiii) huBeta_Klotho(1-81, 194-1044)(muBeta KLOTHO 82P-193L)

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Se sometieron a prueba diversas proteínas de unión a antígeno proporcionadas en el presente documento, así como FGF21 humano, para determinar la capacidad para activar las quimeras en células L6. La figura 30 se correlaciona con los resultados observados con cada molécula sometida a prueba.

Estos datos indican que mientras que FGF21 humano era capaz de activar FGFR1c en combinación con todas las quimeras de β-Klotho humano/de ratón (el signo “+”indica actividad en el receptor), las sustituciones de secuencias de ratón en β-Klotho humano afectaron a las actividades de 16H7, 37D3 y 39F7. Véase la figura 30. Estos resultados sugieren que las secuencias de β-Klotho 1-81, 302-522 y 849-1044 son importantes para las actividades de proteínas de unión a antígeno agonistas y pueden representar un epítopo importante para su función.

Ejemplo 12

Análisis de protección de proteasa

Pueden identificarse regiones del receptor de FGF21 humano unido por las proteínas de unión a antígeno que unen receptor de FGF21 humano, por ejemplo, complejo de FGFR1c, β-Klotho o FGFR1c y β-Klotho fragmentando el receptor de FGF21 humano en péptidos con proteasas específicas por ejemplo, AspN, Lys-C, quimotripsina o tripsina. Puede entonces determinarse la secuencia de los péptidos del receptor de FGF21 humano resultantes (es decir, tanto fragmentos peptídicos que contienen disulfuro como no disulfuro de partes de FGFR1c y β-Klotho). En un ejemplo, pueden digerirse formas solubles de un receptor de FGF21 humano, por ejemplo, un complejo que comprende el heterodímero de FGFR1c ECD-Fc y β-Klotho ECD-Fc descrito en el presente documento con AspN (que escinden después de residuos de ácido aspártico y algo de ácido glutámico en el extremo amino) incubando aproximadamente 100 µg de receptor de FGF21 soluble a 1,0 mg/ml en fosfato de sodio 0,1 M (pH 6,5) durante 20 h a 37ºC con 2 µg de AspN.

Entonces puede generarse un perfil peptídico de los digestos de AspN en cromatografía de HPLC mientras que se espera que una digestión de control con una cantidad similar de anticuerpo sea esencialmente resistente a AspN endoproteasa. Entonces puede realizarse un ensayo de protección de proteasa para determinar la digestión proteolítica del receptor de FGF21 humano en presencia de las proteínas de unión a antígeno. El principio general de este ensayo es que la unión de una proteína de unión a antígeno al receptor de FGF21 puede dar como resultado protección de determinados sitios de escisión de proteasa específicos y esta información puede usarse para determinar la región o parte de receptor de FGF21 en el que la proteína de unión a antígeno se une.

En resumen, los digestos peptídicos pueden someterse a mapeo peptídico por HPLC; se recogen los picos individuales y se identifican y mapean los péptidos mediante análisis de ionización por elestrospray CL-EM (ESI-CL-EM) en línea y/o mediante secuenciación N-terminal. Pueden realizarse análisis por HPLC para estos estudios usando una columna C18 de fase inversa de diámetro estrecho (Agilent Technologies) para análisis no en línea y usando una columna C18 de fase inversa capilar (The Separation Group) para CL-EM. Puede realizarse mapeo peptídico por HPLC con un gradiente lineal de desde el 0,05% de ácido trifluoroacético (fase móvil A) hasta el 90% de acetonitrilo en el 0,05% de ácido trifluoroacético. Pueden desarrollarse las columnas a una velocidad de flujo deseable para HPLC de diámetro estrecho para análisis de CL-EM en línea o no en línea y para HPLC capilar para análisis de CL-EM en línea.

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Pueden llevarse a cabo análisis de secuencia mediante CL-EM/EM en línea y mediante secuenciación de Edman en los picos peptídicos recuperados a partir de HPLC. Pueden realizarse análisis de ESI CL-EM en línea del digesto peptídico para determinar la masa y secuencia precisas de los péptidos que se separan mediante HPLC. Las identidades de péptidos seleccionados presentes en los picos peptídicos de la digestión de proteasa pueden, por tanto, determinarse.

Ejemplo 13

Estudio en macaco cangrejero

Se generó un constructo que codifica para la proteína de unión a antígeno designada en el presente documento como 16H7 usando la metodología dada a conocer en los ejemplos 1-3. Se expresó, purificó y caracterizó 16H7 tal como se describe en los ejemplos 1-5 y se estudió in vivo en macacos cangrejeros obesos. 16H7 es un anticuerpo de IgG1 totalmente humano y se describe por las secuencias proporcionadas en las tablas 1-4, anteriormente.

Ejemplo 13.1

Diseño del estudio

Se llevó a cabo el estudio en macacos cangrejeros obesos. Los macacos tenían 8-19 años de edad. Sus pesos corporales oscilaban entre 7-14 kg y su IMC oscilaba entre 36-74 kg/m2. Se aclimataron los macacos durante 6 semanas antes del inicio de la administración del compuesto. Durante el periodo de aclimatación, se familiarizaron los macacos con procedimientos relacionados con el estudio, incluyendo restricción en silla, inyección subcutánea (PBS, 0,1 ml/kg), alimentación forzada (agua, 10 ml/kg), y análisis de sangre para muestras de PTGO y no PTGO. Tras 4 semanas de entrenamiento, se midieron la PTGO inicial y los parámetros metabólicos plasmáticos. Se seleccionaron 20 macacos y se aleatorizaron en dos grupos de tratamiento para lograr niveles iniciales similares de peso corporal, perfiles de PTGO de glucosa y niveles de glucosa en plasma y triglicéridos.

Se llevó a cabo el estudio de forma ciega. Vehículo (n=10), 16H7 (n=10). Se administró el compuesto cada dos semanas (5 mg/kg). En la semana en la que no se inyectó a los animales con 16H7, recibieron en su lugar inyección de vehículo. Tras 2 inyecciones de 16H7, se monitorizaron los animales durante 6 semanas adicionales para realizar el período de reposo farmacológico del compuesto y la recuperación de los tratamientos. Se monitorizaron la ingesta de alimentos, el peso corporal, la química clínica y la PTGO en la totalidad del estudio. Se midió la ingesta de alimentos en cada comida. Se midió el peso corporal semanalmente. Se recogieron muestras de sangre en días diferentes en estado de ayunas o alimentado para medir los niveles de glucosa, insulina y triglicéridos. Se llevaron a cabo PTGO cada dos semanas tras el inicio del estudio. El día de inicio del tratamiento se designa como 0 y se muestra el plan de estudio detallado en la figura 14.

Los resultados presentados en este ejemplo representan datos recogidos en la totalidad de los 68 días del estudio.

Ejemplo 13.2

Efecto de 16H7 sobre la ingesta de alimentos

Se alimentaron los animales dos veces al día, recibiendo cada animal 120 g de alimentos formulados establecidos durante el periodo de aclimatación. Se retiraron los alimentos restantes y se pesaron después de cada comida para calcular la ingesta de alimentos. Los tiempos de alimentación fueron desde las 8:00 a.m. hasta las 8:30 a.m. (±30 minutos) y luego desde las 4:30 p.m. hasta las 5:00 p.m. (±30 minutos). Se proporcionó fruta (150 g) a cada animal a de 11:30 a 12:30 p.m. (±30 minutos) cada día.

En comparación con el vehículo, 16H7 redujo la ingesta de alimentos en los macacos. El efecto disminuyó y la ingesta de alimentos volvió a ser próxima a los niveles de control o iniciales tras aproximadamente 21 días de tratamiento. 16H7 no tuvo un efecto significativo sobre la ingesta de alimentos a.m. (figura 15) y sólo redujo modestamente la ingesta de alimentos en la comida p.m. durante el tratamiento (figura 16). Se observó un aumento en la ingesta de alimentos a.m. tras el día 49 (figura 15). En la totalidad del estudio (e incluso durante el periodo de aclimatación), la ingesta de fruta parecía menor en el grupo con 16H7 en comparación con el grupo con vehículo. En general, 16H7 mostró un efecto significativo sobre la inhibición de la ingesta de alimentos.

Ejemplo 13.3

Efecto de 16H7 sobre el peso corporal

Se monitorizó el peso corporal semanalmente en la totalidad del estudio. Durante el curso de los tratamientos de 4 semanas, el peso corporal de los animales tratados con vehículo permaneció constante mientras que el peso corporal de los animales tratados con 16H7 disminuyó progresivamente. El peso corporal no volvió al nivel inicial hacia el final del periodo de reposo farmacológico de 6 semanas (figura 17).

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Ejemplo 13.4

Efecto de 16H7 sobre el índice de masa corporal (IMC), perímetro abdominal (AC) y grosor del pliegue cutáneo (SFT)

Se monitorizaron el IMC, el AC y el SFT semanalmente en la totalidad del estudio, tanto antes como después de la administración del compuesto de prueba cuando se tomó el peso corporal. Se define IMC como el peso corporal de un individuo dividido entre el cuadrado de su estatura. SFT es el grosor de una capa doble de piel y la grasa por debajo según se mide con un plicómetro. El IMC, el SFT y el AC son mediciones relativamente exactas, simples y económicas de la composición corporal, particularmente indicadoras de grasa subcutánea. Los animales tratados con vehículo mostraron IMC, SFT y AC relativamente estables en la totalidad del estudio. Los animales tratados con 16H7 mostraron niveles disminuidos de IMC, AC y SFT durante el curso del estudio de 4 semanas, sugiriendo que el compuesto 16H7 dio como resultado reducción de masa grasa. Se muestran los resultados en las figuras 18-20, respectivamente. Estos parámetros medidos no volvieron a los valores iniciales al final del periodo de reposo farmacológico de 6 semanas.

Ejemplo 13.5

Efecto de 16H7 sobre la prueba de tolerancia a la glucosa oral (PTGO)

Se llevaron a cabo PTGO antes y después del inicio de los tratamientos. Antes de las inyecciones de 16H7, se midieron los valores iniciales para los niveles de glucosa e insulina en la totalidad de la PTGO (figuras 21 y 22, respectivamente) y no fueron diferentes significativamente de manera estadística entres los grupos con vehículo y con 116H7. Se realizaron PTGO tras la dosis cada dos semanas durante el periodo de tratamiento y después de 3 semanas de periodo de reposo farmacológico. 16H7 mejoró ligeramente la tolerancia a la glucosa después de 4 semanas de tratamiento y 3 semanas de periodo de reposo farmacológico. El modelo de animal usado no es intolerante a la glucosa lo que explica los modestos efectos observados (figura 21). Los niveles de insulina disminuyeron significativamente de manera estadística en animales tratados con 16H7 (significancia observada en el punto de tiempo 0 durante la PTGO realizada tras 2 semanas de tratamiento, en el punto de tiempo de 0 y 15 minutos durante la PTGO realizada tras 4 semanas de tratamiento y en el punto de tiempo de 0 y 60 minutos durante la PTGO realizada tras 2 semanas de tratamiento) (figura 22).

Ejemplo 13.6

Efecto de 16H7 sobre los niveles de glucosa e insulina en estado de ayunas y alimentado

Se recogió sangre de animales que ayunaron durante la noche o en condiciones alimentadas tras la alimentación a.m.. En las condiciones de ayuno, se llevaron a cabo análisis de sangre semanalmente 5 días tras cada inyección. En las condiciones alimentadas, se llevaron a cabo análisis de sangre en los días 2, 11, 16, 25 y 46 tras la primera inyección. 16H7 no redujo los niveles de glucosa en estado de ayunas o alimentado (figuras 23 y 25). Se observó hipoglucemia en ninguno de los macacos tratados con 16H7. 16H7 dio, sin embargo, como resultado una disminución estadísticamente significativa en los niveles de insulina en ayunas y en estado alimentado (figuras 24 y 26).

Ejemplo 13.7

Efecto de 16H7 sobre los niveles de triglicéridos

Se realizaron mediciones de las mismas muestras recogidas para mediciones de glucosa e insulina. Los niveles de triglicéridos estaban significativamente reducidos en animales tratados con 16H7 cuando se midieron en condiciones de estado de ayunas o alimentado (figuras 27 y 28).

Ejemplo 13.8

Conclusiones

En un estudio llevado a cabo en macacos cangrejeros obesos machos, los animales tratados con 16H7 mostraron parámetros metabólicos mejorados. Se redujo el peso corporal y se mejoró la composición corporal. Se observó reducción de la ingesta de alimentos a corto plazo y disminuyó el efecto y se recuperó la ingesta de alimentos con respecto a los niveles de control o iniciales a los 21 días en el estudio. También se redujeron los niveles de triglicéridos e insulina en estado de ayunas mediante 16H7. También se mejoraron los niveles de insulina durante PTGO.

Ejemplo 14

Formas variantes de proteínas de unión a antígeno 16H7* y 22H5 Se mutaron proteínas de unión a antígeno 16H7 y 22H5, que se describen en el presente documento en las tablas 14, para conferir propiedades diferentes a la molécula, tal como cambios en la solubilidad, pI, carga global, inmunogenicidad en modelos de animales y humanos, estabilidad, etc. Las mutaciones comprendieron adiciones, deleciones o sustituciones en o bien la cadena ligera (designada “LC”, SEQ ID NO: 14) o bien la cadena pesada (designada “HC”, SEQ ID NO: 32) de la molécula. Las mutaciones puntuales dadas a conocer se realizaron individualmente o se combinaron dos o más mutaciones.

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* Anticuerpo preferido de la invención

Los ejemplos de mutaciones y combinaciones de mutaciones que se introdujeron en las secuencias de cadena pesada y ligera de 16H7 incluyen los siguientes: I83K (en la cadena pesada de 16H7) (SEQ ID NO: 396) E16Q (en la cadena pesada de 16H7) + V24F (en la cadena pesada de 16H7) + I83T (en la cadena pesada de

16H7)+ S100I (en la cadena pesada de 16H7)+ T119L (en la cadena pesada de 16H7) (SEQ ID NO: 395) D109S (en la cadena pesada de 16H7) (SEQ ID NO: 401) Deleción de Y107 (en la cadena pesada de 16H7) (SEQ ID NO: 400) Inserción de un residuo Y en el lado N-terminal de Y107 (en la cadena pesada de 16H7) (SEQ ID NO: 405) D88R+ P89A+ V90E (en la cadena pesada de 16H7) (SEQ ID NO: 398) D49Y (en la cadena ligera de 16H7) (SEQ ID NO: 386) D49A (en la cadena ligera de 16H7) (SEQ ID NO: 387) D91A (en la cadena ligera de 16H7) (SEQ ID NO: 388) D49A (en la cadena ligera de 16H7)+ D91A (en la cadena ligera de 16H7) (SEQ ID NO: 389) Q16K (en la cadena ligera de 16H7) (SEQ ID NO: 385) Los ejemplos de mutaciones y combinaciones de mutaciones que se introdujeron en las secuencias de cadenas

pesada y ligera de 22H5 incluyen los siguientes: N92Q (en la cadena ligera de 22H5) (SEQ ID NO: 402) S94A (en la cadena ligera de 22H5) (SEQ ID NO: 403) C109S (en la cadena pesada de 22H5) (SEQ ID NO: 404) En resumen, las proteínas de unión a antígeno generadas comprendían los siguientes pares de cadenas pesada y

ligera de 16H7:

(i): cadena ligera de 16H7 (SEQ ID NO: 14) emparejada con una cadena pesada de 16H7 que comprende I83K (SEQ ID NO: 396);

(ii): cadena ligera de 16H7 (SEQ ID NO: 14) emparejada con una cadena pesada de 16H7 que comprende E16Q, V24F, I83T, S100I, T119L (SEQ ID NO: 395);

(iii) cadena ligera de 16H7 (SEQ ID NO: 14) emparejada con una cadena pesada de 16H7 que comprende D109S (SEQ ID NO: 401);

(iv): cadena ligera de 16H7 (SEQ ID NO: 14) emparejada con una cadena pesada de 16H7 que comprende la deleción de Y107 (SEQ ID NO: 400);

(v): cadena ligera de 16H7 (SEQ ID NO: 14) emparejada con una cadena pesada de 16H7 que comprende la inserción de un residuo Y en el lado N-terminal de Y107 (SEQ ID NO: 405);

(vi): cadena ligera de 16H7 (SEQ ID NO: 14) emparejada con una cadena pesada de 16H7 que comprende D88R, P89A, V90E, (SEQ ID NO: 398);

(vii) cadena pesada de 16H7 (SEQ ID NO: 32) emparejada con una cadena ligera de 16H7 que comprende D49Y (SEQ ID NO: 386);

(viii) cadena pesada de 16H7 (SEQ ID NO: 32) emparejada con una cadena ligera de 16H7 que comprende D49A (LC) (SEQ ID NO: 387);

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(xi): cadena pesada de 16H7 (SEQ ID NO: 32) emparejada con una cadena ligera de 16H7 que comprende D91A (SEQ ID NO: 388);

(ix): cadena pesada de 16H7 (SEQ ID NO: 32) emparejada con una cadena ligera de 16H7 que comprende D49A, D91A (SEQ ID NO: 389);

5 (x) cadena pesada de 16H7 (SEQ ID NO: 32) emparejada con una cadena ligera de 16H7 que comprende Q16K (LC) (SEQ ID NO: 385);

y los siguientes pares de secuencias de cadena pesada y ligera de 22H5:

(xi) cadena pesada de 22H5 (SEQ ID NO: 31) emparejado con un cadena ligera de 22H5 que comprende N92Q (LC) (SEQ ID NO: 402);

10 (xii) cadena pesada de 22H5 (SEQ ID NO: 31) emparejado con un cadena ligera de 22H5 que comprende S94A (LC) (SEQ ID NO: 403);

(xiii) cadena ligera de 22H5 (SEQ ID NO: 13) emparejada con una cadena pesada de 22H5 que comprende C109S (HC) (SEQ ID NO: 404);

(xiv) cadena ligera de 22H5 (SEQ ID NO: 13) emparejada con una cadena pesada de 22H5 que comprende una 15 inserción de un residuo de tirosina en la posición 107 (SEQ ID NO: 405).

Las secuencias de aminoácidos para las variantes de cadena ligera generadas se muestran en la tabla 6:

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Adicionalmente, se generó y estudió un “hemicuerpo”. Esta estructura comprendía la cadena ligera de 16H7 (L3; SEQ ID NO: 50), que se emparejó con una forma diseñada mediante ingeniería genética de la cadena pesada de 16H7; la cadena pesada diseñada mediante ingeniería genética comprendía la cadena pesada de 16H7 (SEQ ID NO: 32) unida mediante un ligador (G4S)8 (SEQ ID NO: 440) a una secuencia de Fc de IgG2 (SEQ ID NO: 441), que se emparejó con la secuencia de Fc de la cadena pesada de 16H7. Las partes de los componentes del hemicuerpo tienen las siguientes secuencias:

cadena pesada de 16H7

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10 Ligador

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GGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGS (SEQ ID NO: 440)

Fc de IgG2

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La cadena pesada de hemicuerpo completa tenía la secuencia de aminoácidos mostrada a continuación:

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que está codificada por la siguiente secuencia:

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Ejemplo 14.1

ELISA de unión a β-Klotho para anticuerpos diseñados mediante ingeniería genética

Las formas diseñadas mediante ingeniería genética de 16H7 y 22H5 se sometieron a prueba para determinar la unión de β-Klotho usando un ensayo de ELISA. Las condiciones para el ELISA fueron las siguientes.

Se incubaron placas Maxisorp recubiertas con estreptavidina con β-Klotho 2 µg/ml durante la noche a 4 grados. Se añadieron anticuerpos en diluciones en series de 3 veces empezando a 1 µM durante 1 hora a temperatura ambiente. Se usó Fc antihumano de HRP conjugada como anticuerpo detector. Se desarrolló la señal con Lumiglo y se leyó en Envision.

Se muestran los resultados del ensayo de ELISA en la figura 32A-32C e indican que la mayoría de variantes de 16H7 se unieron a β-Klotho humano excepto un mutante que portaba la inserción de tirosina en la posición 107.

Ejemplo 14.2

Variantes diseñadas mediante ingeniería genética de 16H7 y 22H5 se unen a la estructura receptora nativa, tal como se muestra mediante FACS

Se realizó un ensayo de unión mediante FACS con varias de las formas diseñadas mediante ingeniería genética de 16H7 y 22H5. Se realizaron los experimentos tal como sigue a continuación.

Se trataron células de CHO que expresan de manera estable el receptor de FGF21 con anticuerpo original 16H7 y 22H5 y también con variantes diseñadas mediante ingeniería genética de los (1 µg por 1x106 células en 100 µl de PBS/BSA al 0,5%). Se incubaron las células con los anticuerpos a 4ºC seguido por dos lavados con PBS/BSA. Entonces se trataron las células con anticuerpos secundarios marcados con FITC a 4ºC seguido por dos lavados. Se resuspendieron las células en 1 ml de PBS/BSA y se analizó la unión del anticuerpo usando un instrumento FACS Calibur.

De manera coherente con los resultados de ELISA, la mayoría de las variantes diseñadas mediante ingeniería genética de anticuerpos agonistas del receptor de FGF21 sometidas a prueba se unen bien al receptor de FGF21 de la superficie celular en FACS. Esta observación confirmó además que el diseño mediante ingeniería genética guiado de anticuerpos agonistas del receptor de FGF21 mantiene la unión a la estructura nativa. En un mutante, en el que se diseñó CDR3 mediante ingeniería genética para incluir una tirosina en la posición Y107, se observó una pérdida completa de unión al receptor de la superficie celular, que es similar a los resultados de ELISA. Esta observación señala el papel del bucle de CDR3 en la unión a una conformación nativa.

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FGF21 estimula la captación de glucosa y lipólisis en adipocitos cultivados y, por tanto, los adipocitos se considera a menudo que son un ensayo fisiológicamente relevante. Se mostró que un panel de las variantes diseñadas mediante ingeniería genética de 16H7 y 22H5 presenta actividad de fosforilación de ERK similar a FGF21 en el ensayo de adipocitos humanos con una CE50 estimada menor de 10 nM, tal como se muestra en la tabla 7.

Tabla 7

Actividad de variantes en ensayo de adipocitos humanos

Secuencia central: SEQ ID NO de cadena variante Variante CE50 (nM)

cadena pesada de 16H7: 391 I83T 0,73

cadena pesada de 16H7: 393 E16Q+V24F+I83T 0,38

cadena pesada de 16H7: 398 D88R+P89A+V90E 0,35

cadena pesada de 16H7: 394 E16Q+V24F+I83T+T119L 0,36

16H7 (WT): 0,53

cadena ligera de 22H5: 403 S94A 1,98

cadena ligera de 22H5: 402 N92Q 3,33

cadena pesada de 16H7: 400 Deleción de Y107 1,04

cadena pesada de 16H7: 396 I83K 0,39

cadena pesada de 16H7: 397 S100I 0,17

cadena pesada de 16H7: 401 D109S 0,31

cadena pesada de 16H7: 399 D88R+P89A+V90E+S100I 0,14

cadena pesada de 16H7: 395 E16Q+V24F+I83T+S100I+T119L 0,24

cadena pesada de 16H7: 405 Inserción de Y107 0,51

cadena pesada de 16H7: 390 V24F 0,75

cadena pesada de 16H7: 392 V24F+I83T 0,37

cadena ligera de 16H7: 386 D49Y 0,60

cadena ligera de 16H7: 387 D49A 0,63

cadena ligera de 16H7: 389 D49A, D91A 1,4

cadena ligera de 16H7: 388 D91A 1,3

cadena ligera de 16H7: 385 Q16K 0,11

22H5 (WT): 2,27

10 Ejemplo 14.4 Experimentos de unión Biacore y medición de tasas de disociación

Se sometió a prueba la unión de variantes de 16H7 y 22H5 a β-Klotho humano usando ensayos Biacore. En resumen, se inmovilizó anticuerpo de ratón anti-His (Qiagen, Valencia, CA) en un chip CM5 usando reactivos de acoplamiento de amina (General Electronics, Piscataway, NJ). Se capturó β-Klotho recombinante humano marcado

15 con His en la segunda célula de flujo a ~100 RU. Se usó la primera célula de flujo como control de fondo. Se diluyeron Acm 100 nM en PBS más BSA 0,1 mg/ml, P20 al 0,005% y se inyectaron sobre el β-Klotho capturado en la superficie de anticuerpo anti-His. Para la medición cinética, se inyectaron Acm 0,78~100 nM diluidos en PBS más BSA 0,1 mg/ml, P20 al 0,005% sobre la superficie de β-Klotho.

Las variantes sometidas a prueba se resumen en la tabla 8:

20 Tabla 8

Variantes estudiadas en experimentos de unión y tasa de disociación

Número de constructo: Proteína de unión a antígeno central Identificador/variación de cadena pesada Identificador/variación de cadena ligera SEQ ID NO de cadena pesada SEQ ID NO de cadena ligera

22H5: H2 L2 31 13

n.º 1, P60881.3: 16H7 I83T L3 391 14

n.º 2, P60880.3: 16H7 E16Q+V24F+I83T L3 393 14

n.º 3, P60890.3: 16H7 D88R+P89A+V90E L3 398 14

n.º 4, P60878.3: 16H7 E16Q+V24F+I83T+T119L L3 394 14

n.º 5, 16H7 WT: 16H7 H3 L3 32 14

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n.º 6, P60898.3: 22H5 H2 S94A 31 403

n.º 7, P60897.3: 22H5 H2 N92Q 31 402

n.º 8, P60886.3: 16H7 Deleción de Y107 L3 400 14

n.º 9, P60885.3: 16H7 I83K L3 396 14

n.º 10, P60884.3: 16H7 S100I L3 397 14

n.º 11, P60883.3: 16H7 D109S L3 401 14

n.º 12, P60879.3: 16H7 D88R+P89A+V90E+S100I L3 399 14

n.º 13, P60882.3: 16H7 Cadena pesada de hemicuerpo L3 453 14

n.º 14, P60891.3: 16H7 E16Q+V24F+I83T+S100I+ T119L L3 395 14

n.º 15, P60889.3: 16H7 Inserción de Y107 L3 405 14

n.º 16, P60888.3: 16H7 V24F L3 390 14

n.º 17, P60887.3: 16H7 V24F+I83T L3 392 14

n.º 18, P60894.3: 16H7 H3 D49Y 32 386

n.º 19, P60895.3: 16H7 H3 D49A 32 387

n.º 20, P60893.3: 16H7 H3 D49A+D91A 32 389

n.º 21, P60892.3: 16H7 H3 D91A 32 388

n.º 22, P60896.3: 16H7 H3 Q16K 32 385

n.º 23, P60899.2: 22H5 C109S L2 404 13

Entre los mAc sometidos a prueba diseñados mediante ingeniería genética, la mayoría de ellos mostró una unión estrecha a β-Klotho humano, excepto el n.º 15 que no mostró unión. La tabla 9 a continuación muestra Acm 100 nM que se unen a β-Klotho capturado anti-His. La figura 33 muestra la comparación con respecto a la tasa de disociación.

Tabla 9

Unión a β-Klotho

Muestra: koff (1/s)

n.º 20, P60893.3: 1.9E-04

n.º 11, P60883.3: 2.6E-04

n.º 23, P60899.2: 3.0E-04

22H5: 3.1E-04

n.º 18, P60894.3: 3.1E-04

n.º 6, P60898.3: 3.5E-04

n.º 13, P60882.3: 4.4E-04

n.º 7, P60897.3: 5.2E-04

n.º 8, P60886.3: 5.3E-04

Ejemplo 15

10 Combinaciones de proteínas de unión a antígeno muestran un efecto aditivo

Se seleccionaron proteínas de unión a antígeno que representaban diferentes casillas de unión (figura 11a y b) y se sometieron a prueba en ensayos indicadores en pares para determinar si el par de moléculas se comportaría de modo aditivo. Se ejecutaron los ensayos tal como sigue a continuación.

En el día uno, se sembró el clon AM-1/D FGFR1c+β-Klotho Luc en una placa de 96 pocillos a 20K células/pocillo en

15 medio de DMEM + FBS al 10%. Se incubó la placa durante la noche. Al día siguiente, se reemplazó el medio con medio de ensayo (DMEM + FBS al 0,2%) y se incubó durante la noche. A partir de una disolución madre de trabajo del anticuerpo (1 mg/ml en PBS), se preparó cada anticuerpo en el estudio a una dilución de 2 µg/ml en medio de ensayo. Se combinaron 100 µl de cada anticuerpo que iba a someterse a prueba en una placa con fondo en forma de U. Se retiró el medio de ensayo de las células, y se transfirieron 50 µl de las mezclas de anticuerpo a las células.

20 Se incubaron las mezclas de anticuerpo en las células durante 5 h. Por último, volvió a leerse cada muestra con reactivo de luciferasa SteadyGlo (50 l/pocillo), según las especificaciones del fabricante.

La tabla 10 a continuación es un resumen de la actividad (% de actividad de FGF21 del ensayo indicador) observada a partir del estudio; la tabla 11 expresa las actividades observadas con respecto a las casillas.

Tabla 10

25 Actividad de combinación del anticuerpo (%)

Iso: 6 5 4 3 2 1

Claims

imagen1

REIVINDICACIONES

1. Anticuerpo aislado o fragmento del mismo que puede unirse a un complejo que comprende β-Klotho y FGFR1c e induce señalización mediada por FGF21 y comprende las siguientes CDR:

a) CDRH1: SEQ ID NO: 122;

5 b) CDRH2: SEQ ID NO: 133;

c) CDRH3: SEQ ID NO: 148;

d) CDRL1: SEQ ID NO: 166;

e) CDRL2: SEQ ID NO: 176; y

f) CDRL3: SEQ ID NO: 188;

10 para su uso en terapia.
2. Anticuerpo aislado o fragmento del mismo que puede unirse a un complejo que comprende β-Klotho y FGFR1c e induce señalización mediada por FGF21, en el que dicho anticuerpo aislado o fragmento del mismo comprende una secuencia de aminoácidos idéntica al 90% a la SEQ ID NO: 50 y comprende una secuencia de aminoácidos idéntica al 90% a la SEQ ID NO: 68 para su uso en terapia.

15 3. Anticuerpo aislado o fragmento del mismo para el uso según la reivindicación 2, en el que dicho anticuerpo aislado o fragmento del mismo comprende una secuencia de aminoácidos idéntica al 95% a la SEQ ID NO: 50 y comprende una secuencia de aminoácidos idéntica al 95% a la SEQ ID NO: 68.
4. Anticuerpo aislado o fragmento del mismo para el uso según la reivindicación 3, en el que dicho anticuerpo aislado o fragmento del mismo comprende las SEQ ID NO: 50 y SEQ ID NO: 68.

20 5. Anticuerpo aislado o fragmento del mismo que puede unirse a un complejo que comprende β-Klotho y FGFR1c e induce señalización mediada por FGF21, en el que dicho anticuerpo aislado o fragmento del mismo comprende una secuencia de aminoácidos idéntica al 90% a la SEQ ID NO: 14 y comprende una secuencia de aminoácidos idéntica al 90% a la SEQ ID NO: 32 para su uso en terapia.
6. Anticuerpo aislado o fragmento del mismo para el uso según la reivindicación 5, en el que dicho anticuerpo

25 aislado o fragmento del mismo comprende una secuencia de aminoácidos idéntica al 95% a la SEQ ID NO: 14 y comprende una secuencia de aminoácidos idéntica al 95% a la SEQ ID NO: 32.
7. Anticuerpo aislado o fragmento del mismo para el uso según la reivindicación 6, en el que dicho anticuerpo aislado o fragmento del mismo comprende una secuencia de aminoácidos idéntica al 98% a la SEQ ID NO: 14 y comprende una secuencia de aminoácidos idéntica al 98% a la SEQ ID NO: 32.

30 8. Anticuerpo aislado o fragmento del mismo para el uso según la reivindicación 1, en el que dicho anticuerpo

o fragmento del mismo comprende las SEQ ID NO: 14 y SEQ ID NO: 32.
9. Anticuerpo aislado o fragmento del mismo según cualquiera de las reivindicaciones 1-8 para su uso en el tratamiento de diabetes tipo 2, obesidad, dislipidemia, NASH, enfermedad cardiovascular o síndrome metabólico.

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