CN109071637B - 结合严重发热伴血小板减少综合征病毒的包膜糖蛋白的抗体及其用途 - Google Patents

结合严重发热伴血小板减少综合征病毒的包膜糖蛋白的抗体及其用途 Download PDF

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Abstract

本发明涉及特异性地结合严重发热伴血小板减少综合征病毒(SFTSV)(严重发热伴血小板减少综合征(SFTS)的病原体)的包膜糖蛋白、并且用于有效地检测或诊断SFTSV和治疗SFTS的抗体。

Description

结合严重发热伴血小板减少综合征病毒的包膜糖蛋白的抗体 及其用途
相关申请的交叉引用
本申请要求基于2016年3月23日提交的韩国专利申请第10-2016-0034727 号的优先权，并且在该申请的说明书和附图中所公开的全部内容通过引用并入本文。
技术领域
本发明涉及特异性地结合严重发热伴血小板减少综合征病毒(SFTSV)(严重发热伴血小板减少综合征(SFTS)的病原体)的包膜糖蛋白、并且用于检测或诊断SFTSV和治疗SFTS的抗体。
背景技术
严重发热伴血小板减少综合征(SFTS)是新型的螨类介导传染病，并且主要由长角血蜱(Haemaphysalis longicornis)或龟形花蜱(Amblyomma testudinarium) 介导的发热伴血小板减少综合征病毒(SFTSV)引起。2009年在中国首次报道了SFTS，2012年在日本和韩国报道了该疾病和病毒。SFTS的主要症状是发热、腹痛、恶心、呕吐、血小板减少或白细胞减少等，并且在严重的情况下，会发生多器官衰竭并导致死亡。SFTS每年都在中国、日本或韩国持续发生，由此引起的死亡率非常高，它主要发生在春季和夏季之间的时期。黑纹田鼠可能是 SFTSV的野生宿主，并且据推测家畜可以发挥宿主的作用，因为在中国的主要疫情地区，在家畜(例如山羊、牛、狗或鸡等)中发现高比例的血清抗体。据报道，从人到人的感染是通过介导感染者的体液而发生，但是到目前为止还没有批准的治疗剂或预防方法以有效地治疗SFTS。
存在确认血液中抗SFTSV抗体滴度以确认SFTS感染的方法。于是，抗 SFTSV抗体滴度主要用SFTSV的N蛋白抗体而测量。当SFTSV消亡时，抗体是所暴露的SFTSV内蛋白的抗体。因此，通过确认抗SFTSV抗体滴度的常规诊断具有局限性，即不能准确地发现存活的和积极活动的病毒的存在。作为诊断SFTS的另一种方法，用于检测源自人体的对象中SFTSV的RNA序列的方法已知具有高准确度，但是难以从对象分离出高品质的病毒RNA。
另一方面，国际专利公开第2015/053455号(WO2015/053455A1)公开了用于检测SFTSV抗体的方法，但具体地，它根本没有公开抗体结合SFTSV的哪个抗原和抗体的中和活性。
因此，通过弥补常规的酶免疫反应诊断方法的不准确病毒滴度测量方法(检测杀死的SFTSV蛋白的量)或常规的血液中低纯度病毒RNA分离方法的局限性，开发可以有效检测、分离或纯化SFTSV的抗体或方法是需要的。
发明内容
技术问题
本发明要解决的问题是提供可以有效检测或诊断SFTSV并治疗SFTS的抗体。另外，本发明要解决的另一个问题是提供特异性地结合SFTSV(特别是 SFTSV的包膜糖蛋白)的抗体。
技术方案
为了解决该技术问题，本发明提供了特异性地结合SFTSV(特别是其包膜糖蛋白)的新的抗体。此外，本发明提供了使用该抗体有效地检测、分离或纯化SFTSV的方法。此外，本发明提供了使用该抗体有效地预防或治疗SFTS的方法。
结果是，本发明人为克服SFTSV的常规诊断方法的局限性做了大量工作，他们发现了特异性地结合SFTSV的包膜糖蛋白(特别是Gc或Gn)的新的抗体，并发现使用该抗体可以有效地检测SFTSV，以完成本发明。
SFTSV是负单链RNA病毒，属于布尼亚病毒(Bunyaviridae)科白蛉病毒(phlebovirus)属。该病毒是直径为80nm至100nm的球状病毒，使用长角血蜱作为媒介。该病毒的基因组由大(L)片段、中(M)片段和小(S)片段组成，并且它们编码6种蛋白：RNA依赖的RNA聚合酶(RdRp)、糖蛋白前体(M)、糖蛋白N(Gn)、糖蛋白C(Gc)、核衣壳蛋白(NP)和非结构蛋白(NSs)。
在本发明中，“抗体”可以包括整个抗体和其任何抗原结合部分或单链。天然存在的“抗体”是至少包含通过二硫键相互连接的两条重链(H)和两条轻链 (L)的糖蛋白。每条重链由重链可变区(VH)和重链恒定区(CH)组成。重链恒定区由三个结构域CH1、CH2和CH3组成。每条轻链由轻链可变区(VL) 和轻链恒定区(CL)组成。轻链恒定区由一个结构域CL组成。VH区和VL区可以进一步细分为高变区(称为互补决定区(CDR))，该高变区散布有更保守的区域(称为框架区(FR))。每个VH和VL从氨基末端到羧基末端由按以下顺序排列的三个CDR和四个FR组成：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、 FR4。重链和轻链的可变区含有与抗原相互作用的结合结构域。
本发明提供了特异性地结合SFTSV的包膜糖蛋白(特别是SFTSV的包膜糖蛋白Gc或Gn)的抗体。优选地，抗体可以包含如下的特定氨基酸序列或由它们组成。另外，在重链和轻链的恒定区中明显的某些修饰在具有相同或相似结合特异性的范围内包括在本发明的范围内。此外，由于这些抗体中的每一种都可以结合SFTSV的包膜糖蛋白，因此通过混合和匹配VH、VL、全长轻链序列和全长重链序列(氨基酸序列和编码该氨基酸序列的核苷酸序列)可以产生结合SFTSV的其他包膜糖蛋白的本发明的抗体。
在一个示例中，结合Gc包膜糖蛋白的本发明的抗体克隆(Ab1至Ab5)的氨基酸序列示于下表1至下表8中。
结合Gc包膜糖蛋白的轻链和重链的氨基酸序列
[表1]
Figure BDA0001810690720000041
结合Gc包膜糖蛋白的抗体的轻链框架区1或重链框架区1(LFR1或HFR1) 的氨基酸序列
[表2]
SEQ ID NO 抗体和位点 序列
11 Ab1的LFR1 ELTLTQSPATLSLSPGETATLSC
12 Ab2的LFR1 ELVVTQPPSVSGAPGQRVTISC
13 Ab3的LFR1 ELELTQPPSVSGAPGQRVTISC
14 Ab4的LFR1 ELVLTQPPSASGTPGQRVTISC
15 Ab5的LFR1 ELVVTQEPSLTVPPGGTVTLTC
16 Ab1的HFR1 QVQLVQSGPEVKKPGSSVKVSCKAS
17 Ab2的HFR1 EVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCAAS
18 Ab3的HFR1 QVQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVS
19 Ab4的HFR1 EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAAS
20 Ab5的HFR1 QVQLVQSGGGLVQPGGSLRLSCSAS
结合Gc包膜糖蛋白的抗体的轻链互补决定区1或重链互补决定区1 (LCDR1或HCDR1)的氨基酸序列
[表3]
Figure BDA0001810690720000051
结合Gc包膜糖蛋白的抗体的轻链框架区2或重链框架区2(LFR2或HFR2) 的氨基酸序列
[表4]
SEQ ID NO 抗体和位点 序列
31 Ab1的LFR2 WYQQKPGLAPRLLIY
32 Ab2的LFR2 WYQQLPGTAPKLLIY
33 Ab3的LFR2 WYQQLPGTAPKLLrY
34 Ab4的LFR2 WYQQLPGTAPKLLIY
35 Ab5的LFR2 WFQQKPGQAPRTLIY
36 Ab1的HFR2 WVRQAPGQGLEWMG
37 Ab2的HFR2 WVRQAPGKGLEWVS
38 Ab3的HFR2 WIRQPPGKGLEWIG
39 Ab4的HFR2 WVRQAPGKGLEWVS
40 Ab5的HFR2 WVRQAPGKGLEYVS
结合Gc包膜糖蛋白的抗体的轻链互补决定区2或重链互补决定区2 (LCDR2或HCDR2)的氨基酸序列
[表5]
Figure BDA0001810690720000061
结合Gc包膜糖蛋白的抗体的轻链框架区3或重链框架区3(LFR3或HFR3) 的氨基酸序列
[表6]
SEQ ID NO 抗体和位点 序列
51 Ab1的LFR3 GIPDRFSGSGSGTDFTLTISRLAPEDSAVYYC
52 Ab2的LFR3 GVPDRFSGSKSGTSASLAITGLQADDEADYYC
53 Ab3的LFR3 GVPDRFSGSKSDTSASLAISGLRSEDEADYYC
54 Ab4的LFR3 GVPDRFSGSKSGTSASLAISGLQSEDEADYYC
55 Ab5的LFR3 WTPARFSGSLLGGKAALTLSGAQPEDDA-YYC
56 Ab1的HFR3 RVTITADESTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCA
57 Ab2的HFR3 RFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCA
58 Ab3的HFR3 RVTISVDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCA
59 Ab4的HFR3 RFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYY--
60 Ab5的HFR3 RFTISRDNSKNTLYLQMSSLRAEDTAVYYCV
结合Gc包膜糖蛋白的抗体的轻链互补决定区3或重链互补决定区3 (LCDR3或HCDR3)的氨基酸序列
[表7]
Figure BDA0001810690720000071
结合Gc包膜糖蛋白的抗体的轻链框架区4或重链框架区4(LFR4或HFR4) 的氨基酸序列
[表8]
SEQ ID NO 抗体和位点 序列
71 Ab1的LFR4 FGGGTKLEIK
72 Ab2的LFR4 FGGGTKLTVL
73 Ab3的LFR4 FGGGTKLTVL
74 Ab4的LFR4 FGTGTKVTVL
75 Ab5的LFR4 FGGGTKLTVL
76 Ab1的HFR4 QGTLVTVSS
77 Ab2的HFR4 QGTMVTVSS
78 Ab3的HFR4 QGTLVTVSS
79 Ab4的HFR4 QGTMVTVSS
80 Ab5的HFR4 QGTLVTVSS
在一些示例性实施方式中，特异性地结合SFTSV的包膜糖蛋白Gc的抗体可以包含轻链和重链，该轻链包含选自由SEQ ID NO 1、SEQ ID NO 2、SEQ ID NO 3、SEQ ID NO 4和SEQ ID NO 5组成的组的氨基酸序列中的任一种，该重链包含选自由SEQ ID NO6、SEQ IDNO7、SEQ ID NO 8、SEQ ID NO 9和SEQ ID NO 10组成的组的氨基酸序列中的任一种。由这些特定序列组成的抗体可以特异性地且有效地结合包膜糖蛋白Gc，因此可以非常有用地用于检测SFTSV。
在另一个示例性实施方式中，优选地，特异性地结合SFTSV的包膜糖蛋白 Gc的本发明的抗体可以提供为：包含轻链(包含SEQ ID NO 1的氨基酸序列) 和重链(包含SEQ IDNO 6的氨基酸)的抗体、包含轻链(包含SEQ ID NO 2 的氨基酸序列)和重链(包含SEQ IDNO 7的氨基酸)的抗体、包含轻链(包含SEQ ID NO3的氨基酸序列)和重链(包含SEQ ID NO8的氨基酸)的抗体、包含轻链(包含SEQ ID NO4的氨基酸序列)和重链(包含SEQ ID NO 9的氨基酸)的抗体、以及包含轻链(包含SEQ ID NO5的氨基酸序列)和重链(包含SEQ ID NO10的氨基酸)的抗体。
在另一个示例性实施方式中，特异性地结合SFTSV的包膜糖蛋白Gc的本发明的抗体可以包含轻链互补决定区1(LCDR1)(包含选自由SEQ ID NO 21、 SEQ ID NO 22、SEQ IDNO 23、SEQ ID NO 24和SEQ ID NO 25组成的组的氨基酸序列中的任一种)、轻链互补决定区2(LCDR2)(包含选自由SEQ ID NO 41、 SEQ ID NO 42、SEQ ID NO 43、SEQ ID NO 44和SEQ ID NO 45组成的组的氨基酸序列中的任一种)、轻链互补决定区3(LCDR3)(包含选自由SEQ ID NO 61、 SEQ ID NO 62、SEQ ID NO 63、SEQ ID NO 64和SEQ ID NO 65组成的组的氨基酸序列中的任一种)、重链互补决定区1(HCDR1)(包含选自由SEQ ID NO 26、 SEQ IDNO 27、SEQ ID NO 28、SEQ ID NO 29和SEQ ID NO 30组成的组的氨基酸序列中的任一种)、重链互补决定区2(HCDR2)(包含选自由SEQ ID NO 46、 SEQ ID NO 47、SEQ ID NO 48、SEQID NO 49和SEQ ID NO 50组成的组的氨基酸序列中的任一种)、以及重链互补决定区3(HCDR3)(包含选自由SEQ ID NO 66、SEQ ID NO 67、SEQ ID NO 68、SEQ ID NO 69和SEQ IDNO 70组成的组的氨基酸序列中的任一种)。
在另一个示例性实施方式中，特异性地结合SFTSV的包膜糖蛋白Gc的本发明的抗体可以提供为包含以下的抗体：SEQ ID NO 21的轻链互补决定区1 (LCDR1)、SEQ ID NO 41的轻链互补决定区2(LCDR2)、SEQ ID NO 61的轻链互补决定区3(LCDR3)、SEQ ID NO 26的重链互补决定区1(HCDR1)、SEQ ID NO 46的重链互补决定区2(HCDR2)、以及SEQ ID NO 66的重链互补决定区3(HCDR3)；包含以下的抗体：SEQ ID NO 22的轻链互补决定区1(LCDR1)、SEQ ID NO 42的轻链互补决定区2(LCDR2)、SEQ ID NO 62的轻链互补决定区3(LCDR3)、SEQID NO 27的重链互补决定区1(HCDR1)、SEQ ID NO 47 的重链互补决定区2(HCDR2)、以及SEQ ID NO 67的重链互补决定区3 (HCDR3)；包含以下的抗体：SEQ ID NO 23的轻链互补决定区1(LCDR1)、 SEQ ID NO 43的轻链互补决定区2(LCDR2)、SEQ ID NO 63的轻链互补决定区3(LCDR3)、SEQ ID NO 28的重链互补决定区1(HCDR1)、SEQ ID NO 48 的重链互补决定区2(HCDR2)、以及SEQ ID NO 68的重链互补决定区3 (HCDR3)；包含以下的抗体：SEQ ID NO24的轻链互补决定区1(LCDR1)、 SEQ ID NO 44的轻链互补决定区2(LCDR2)、SEQ ID NO 64的轻链互补决定区3(LCDR3)、SEQ ID NO 29的重链互补决定区1(HCDR1)、SEQ ID NO 49 的重链互补决定区2(HCDR2)、以及SEQ ID NO 69的重链互补决定区3 (HCDR3)；或包含以下的抗体：SEQ ID NO 25的轻链互补决定区1(LCDR1)、 SEQ ID NO 45的轻链互补决定区2(LCDR2)、SEQ ID NO 65的轻链互补决定区3(LCDR3)、SEQ ID NO 30的重链互补决定区1(HCDR1)、SEQ ID NO 50 的重链互补决定区2(HCDR2)、以及SEQ ID NO 70的重链互补决定区3 (HCDR3)。
在一个示例中，结合Gn包膜糖蛋白的本发明的抗体克隆(Ab6至Ab10) 的氨基酸序列示于下表9至下表16中。
结合Gn包膜糖蛋白的轻链和重链的氨基酸序列
[表9]
Figure BDA0001810690720000101
Figure BDA0001810690720000111
结合Gn包膜糖蛋白的抗体的轻链框架区1或重链框架区1(LF则或HFR1) 的氨基酸序列
[表10]
SEQ ID NO 抗体和位点 序列
91 Ab6的LFR1 ELALTQPPSVSVAPGKTAK1TC
92 Ab7的LFR1 ELVLTQPPSVSAAPGQKVTISC
93 Ab8的LFR1 ELALTQPPSVSVAPAMTAKITC
94 Ab9的LFR1 ELELTQPPSVSGTPGKRVSMSC
95 Ab10的LFR1 ELVMTQSPSSLSASVGDTVTITC
96 Ab6的HFR1 QVQLVQSGAEVKKPGESLKISCKGS
97 Ab7的HFR1 QVQLVQSGAEVKKPGESLKISCKGS
98 Ab8的HFR1 QVQLVQSGAEVKKPGESLKISCKGS
99 Ab9的HFR1 QVQLVQSGAEVKKPGESLKISCKGS
100 Ab10的HFRI EVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAAS
结合Gn包膜糖蛋白的抗体的轻链互补决定区1或重链互补决定区1 (LCDR1或HCDR1)的氨基酸序列
[表11]
Figure BDA0001810690720000121
结合Gn包膜糖蛋白的抗体的轻链框架区2或重链框架区2(LFR2或HFR2) 的氨基酸序列
[表12]
SEQ ID NO 抗体和位点 序列
111 Ab6的LFR2 WYQQTSGQAPVLVVY
112 Ab7的LFR2 WYQQLPGTAPKLLIY
113 Ab8的LFR2 WYQQTSGQAPVLVVY
114 Ab9的LFR2 WYQQLPGKAPKLFIY
115 Ab10的LFR2 WYHQTPGKAPKLLIS
116 Ab6的HFR2 WVRQMPGKGLEWM
117 Ab7的HFR2 WVRQMPGKGLEWM
118 Ab8的HFR2 WVRQMPGKGLEWM
119 Ab9的HFR2 WVRQLPGKGLEWM
120 Ab10的HFR2 WVRQAPGKGLEWV
结合Gn包膜糖蛋白的抗体的轻链互补决定区2或重链互补决定区2 (LCDR2或HCDR2)的氨基酸序列
[表13]
Figure BDA0001810690720000131
结合Gn包膜糖蛋白的抗体的轻链框架区3或重链框架区3(LFR3或HFR3) 的氨基酸序列
[表14]
SEQ ID NO 抗体和位点 序列
131 Ab6的LFR3 GIPERFSGANSGNTATLTISRVEAGDEADYYC
132 Ab7的LFR3 GIPDRFSGSKSGTSATLDITGLQTGDEADYYC
133 Ab8的LFR3 GIPERFSGANSGNTATLTISRVEAGDEADYYC
134 Ab9的LFR3 GVPDRVSGSKSGTSVSVAISGLQPEDEADYYC
135 Ab10的LFR3 GVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYC
136 Ab6的HFR3 QVTISADRSISTAYLQWSSLKASDTAMYYCA
137 Ab7的HFR3 QVTISADKSISTAYLQWSSLKASDTAMYYCA
138 Ab8的HFR3 QVTISADRSISTANLQWSSLKASDTALYYCA
139 Ab9的HFR3 QVTISADKSISTAYLQWSSLKASDTAMYYCA
140 Ab10的HFR3 RFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCA
结合Gn包膜糖蛋白的抗体的轻链互补决定区3或重链互补决定区3 (LCDR3或HCDR3)的氨基酸序列
[表15]
Figure BDA0001810690720000141
结合Gn包膜糖蛋白的抗体的轻链框架区4或重链框架区4(LFR4或HFR4) 的氨基酸序列
[表16]
SEQ ID NO 抗体和位点 序列
151 Ab6的LFR4 FGGGTKLTVL
152 Ab7的LFR4 FGSGTKLTVL
153 Ab8的LFR4 FGGGTKLTVL
154 Ab9的LFR4 FGGGTQLTVL
155 Ab10的LFR4 FGGGTKLEIK
156 Ab6的HFR4 QGTLVTVSS
157 Ab7的HFR4 QGTLVTVSS
158 Ab8的HFR4 QGTLVTVSS
159 Ab9的HFR4 QGTLVTVSS
160 Ab10的HFR4 QGTLVTVSS
在一个示例性实施方式中，特异性地结合SFTSV的包膜糖蛋白Gn的本发明的抗体可以包含轻链和重链，该轻链包含选自由SEQ ID NO81、SEQ ID NO 82、 SEQ ID NO83、SEQID NO 84和SEQ ID NO 85组成的组的氨基酸序列中的任一种，该重链包含选自由SEQ IDNO 86、SEQ ID NO 87、SEQ ID NO 88、SEQ ID NO 89和SEQ ID NO 90组成的组的氨基酸序列中的任一种。由这些特定序列组成的抗体可以特异性地且有效地结合包膜糖蛋白Gn，因此可以非常有用地用于检测SFTSV。
在另一个示例性实施方式中，优选地，特异性地结合SFTSV的包膜糖蛋白 Gn的本发明的抗体可以提供为：包含轻链(包含SEQ ID NO 81的氨基酸序列) 和重链(包含SEQ IDNO 86的氨基酸)的抗体、包含轻链(包含SEQ ID NO 82 的氨基酸序列)和重链(包含SEQ IDNO 87的氨基酸)的抗体、包含轻链(包含SEQ ID NO 83的氨基酸序列)和重链(包含SEQ IDNO 88的氨基酸)的抗体、包含轻链(包含SEQ ID NO 84的氨基酸序列)和重链(包含SEQ IDNO 89 的氨基酸)的抗体、以及包含轻链(包含SEQ ID NO 85的氨基酸序列)和重链 (包含SEQ ID NO 90的氨基酸)的抗体。
在另一个示例性实施方式中，特异性地结合SFTSV的包膜糖蛋白Gn的本发明的抗体可以包含轻链互补决定区1(LCDR1)(包含选自由SEQ ID NO 101、 SEQ ID NO 102、SEQID NO 103、SEQ ID NO 104和SEQ ID NO 105组成的组的氨基酸序列中的任一种)、轻链互补决定区2(LCDR2)(包含选自由SEQ ID NO 121、SEQ ID NO 122、SEQ ID NO 123、SEQ IDNO 124和SEQ ID NO 125组成的组的氨基酸序列中的任一种)、轻链互补决定区3(LCDR3)(包含选自由SEQ ID NO 141、SEQ ID NO 142、SEQ ID NO 143、SEQ ID NO 144和SEQ ID NO145 组成的组的氨基酸序列中的任一种)、重链互补决定区1(HCDR1)(包含选自由SEQ IDNO 106、SEQ ID NO 107、SEQ ID NO 108、SEQ ID NO 109和SEQ ID NO 110组成的组的氨基酸序列中的任一种)、重链互补决定区2(HCDR2)(包含选自由SEQ ID NO 126、SEQ ID NO127、SEQ ID NO 128、SEQ ID NO 129 和SEQ ID NO 130组成的组的氨基酸序列中的任一种)、以及重链互补决定区3 (HCDR3)(包含选自由SEQ ID NO 146、SEQ ID NO 147、SEQ IDNO 148、 SEQ ID NO 149和SEQ ID NO 150组成的组的氨基酸序列中的任一种)。
在另一个示例性实施方式中，特异性地结合SFTSV的包膜糖蛋白Gn的本发明的抗体可以提供为包含以下的抗体：SEQ ID NO 101的轻链互补决定区1 (LCDR1)、SEQ ID NO121的轻链互补决定区2(LCDR2)、SEQ ID NO 141 的轻链互补决定区3(LCDR3)、SEQ ID NO106的重链互补决定区1(HCDR1)、 SEQ ID NO 126的重链互补决定区2(HCDR2)、以及SEQ IDNO 146的重链互补决定区3(HCDR3)；包含以下的抗体：SEQ ID NO 102的轻链互补决定区1(LCDR1)、SEQ ID NO 122的轻链互补决定区2(LCDR2)、SEQ ID NO 142 的轻链互补决定区3(LCDR3)、SEQ ID NO 107的重链互补决定区1(HCDR1)、 SEQ ID NO 127的重链互补决定区2(HCDR2)、以及SEQ ID NO 147的重链互补决定区3(HCDR3)；包含以下的抗体：SEQ ID NO103的轻链互补决定区1 (LCDR1)、SEQ ID NO 123的轻链互补决定区2(LCDR2)、SEQ ID NO143 的轻链互补决定区3(LCDR3)、SEQ ID NO 108的重链互补决定区1(HCDR1)、 SEQ ID NO128的重链互补决定区2(HCDR2)、以及SEQ ID NO 148的重链互补决定区3(HCDR3)；包含以下的抗体：SEQ ID NO 104的轻链互补决定区1 (LCDR1)、SEQ ID NO 124的轻链互补决定区2(LCDR2)、SEQ ID NO 144 的轻链互补决定区3(LCDR3)、SEQ ID NO 109的重链互补决定区1(HCDR1)、 SEQ ID NO 129的重链互补决定区2(HCDR2)、以及SEQ ID NO 149的重链互补决定区3(HCDR3)；或包含以下的抗体：SEQ ID NO 105的轻链互补决定区 1(LCDR1)、SEQ IDNO 125的轻链互补决定区2(LCDR2)、SEQ ID NO 145 的轻链互补决定区3(LCDR3)、SEQ IDNO 110的重链互补决定区1(HCDR1)、 SEQ ID NO 130的重链互补决定区2(HCDR2)、以及SEQID NO 150的重链互补决定区3(HCDR3)。
在一个示例性实施方式中，本发明的抗体可以包括含有氨基酸的抗体，该氨基酸是包含上表1或表9中所描述的重链和轻链的抗体的同系物。此外，本发明的抗体可以包含轻链可变区和重链可变区，该轻链可变区包含LCDR1、 LCDR2和LCDR3序列，该重链可变区包含HCDR1、HCDR2和HCDR3序列，并且这些CDR序列中的至少一者可以具有本文所公开的抗体或基于其保守修饰的特定氨基酸序列。另外，本发明的抗体可以是具有结合SFTSV的包膜糖蛋白 Gc或Gn的抗体的功能特性的抗体，并且可以是结合与包含在表1或表9中所公开的重链和轻链的抗体相同表位的抗体。此外，本发明的抗体可以使用本文提出的具有一种或多种轻链或抗体序列的抗体作为工程化经修饰的抗体的原料而制备，并且包含来自起始抗体的具有部分修饰特性的所有抗体。
在本发明中，抗体可以包含对轻链或重链中的框架区的修饰，以改善抗体的性质。此外，对于SFTSV的包膜糖蛋白，抗体可以具有至少1×107M-1、1×108M-1、 1×109M-1、1×1010M-1或1×1011M-1的亲和常数(KA)。
另外，本发明的抗体可以是特异性地结合SFTSV包膜糖蛋白的完整人抗体。与嵌合抗体等相比，当施用到人对象中时，这可以具有进一步降低的抗原性。当使用可变区或全长链人种系免疫球蛋白基因从系统收集时，人抗体可以包含重链可变区或轻链可变区、或全长重链或全长轻链(是特定种系序列的产物或源自特定种系序列)。此外，本发明的抗体可以是具有抗原性的去免疫抗体。
另外，在本发明中，抗原可以是双特异性抗体或多特异性抗体。本发明的抗体或其抗原结合片段可以是结合两种或多种不同结合位点或靶分子的双特异性分子。
在一些示例性实施方式中，本发明的抗体可以是特异性地结合SFTSV的包膜糖蛋白的单克隆抗体。例如，本发明的抗体可以是特异性地结合SFTSV的包膜糖蛋白的人单克隆抗体或人源化单克隆抗体或嵌合抗体，并且本发明的抗体可以包含人重链恒定区和人轻链恒定区。另外，本发明的抗体可以是单链抗体，本发明的抗体可以是Fab片段，并且可以是scFv(单链可变片段)，并且可以是 IgG同种型。优选地，本发明的抗体可以是scFv。
在本发明中，单克隆抗体可以通过常规的单克隆抗体方法而产生，通过将合成的抗体基因插入用于抗体表达的载体(优选pcDNA、pCI、pCMV或pCEP4) 来表达和纯化该合成的抗体基因。另外，可以使用B淋巴细胞的病毒转化或致癌转化，并且可以基于使用鼠系统制备的鼠单克隆抗体的序列而制备。例如，使用标准分子生物学技术，从鼠杂交瘤获得编码重链免疫球蛋白和轻链免疫球蛋白的DNA，并且可以包含非鼠免疫球蛋白序列。
在一些示例性实施方式中，本发明提供了包含框架的抗体，在该框架中氨基酸被来自每个人VH种系序列或VL种系序列的抗体框架或其抗原结合片段取代。
在另一个示例性实施方式中，本发明提供了包含编码包含轻链的多肽和包含重链的多肽的核苷酸序列的核酸，该轻链包含选自由SEQ ID NO 1、SEQ ID NO 2、SEQ ID NO 3、SEQ ID NO 4和SEQ ID NO 5组成的组的氨基酸序列中的任一种，该重链包含选自由SEQ IDNO 6、SEQ ID NO 7、SEQ ID NO 8、SEQ ID NO 9和SEQ ID NO 10组成的组的氨基酸序列中的任一种。在一个实施方式中，核酸可以是选自由SEQ ID NO 161、SEQ ID NO 162、SEQ IDNO 163、SEQ ID NO 164、SEQ ID NO 165、SEQ ID NO 166、SEQ ID NO 167、SEQ ID NO 168、SEQ ID NO 169和SEQ ID NO 170组成的组的核酸序列中的任一种，并且这显示在下表17中(粗体部分是轻链可变区(VL)，下划线部分是重链可变区(VH))。
[表17]
Figure BDA0001810690720000191
Figure BDA0001810690720000201
Figure BDA0001810690720000211
Figure BDA0001810690720000221
Figure BDA0001810690720000231
在另一个示例性实施方式中，在保持SFTSV的包膜糖蛋白的抗体特异性的范围内，本发明的抗体可以包含与上表1至表16所公开的氨基酸序列中的任一种具有至少90％、至少95％、至少97％、至少98％或至少99％的序列同源性的氨基酸序列。另外，可以表达本发明抗体的核酸可以包含与上表17所公开的核酸序列中的任一种具有至少90％、至少95％、至少97％、至少98％或至少99％的序列同源性的核酸。
此外，本发明提供了包含该核酸的载体和宿主细胞。本发明的载体可以包含编码结合SFTSV的包膜糖蛋白Gc的抗体的氨基酸序列的核酸，或包含编码结合Gn的抗体的氨基酸的核酸。另外，通过包含所有两种核酸，本发明的载体可以表达双特异性抗体。
在一个示例性实施方式中，本发明提供(1)编码本发明的抗体的重链的第一重组DNA片段，和(2)编码本发明的抗体的轻链的第二重组DNA片段。在另一个示例性实施方式中，本发明提供了宿主细胞，该宿主细胞包含分别编码本发明的重链和轻链的重组DNA片段。在一些示例性实施方式中，抗体或其抗原结合片段是人单克隆抗体或其抗原结合片段。
为了表达编码结合SFTSV的包膜糖蛋白的本发明的抗体的多核苷酸，可以使用各种表达载体。为了在哺乳动物宿主细胞中产生抗体，可以使用基于病毒的表达载体或非病毒的表达载体。例如，可以使用载体(例如pcDNA、pCI、pCMV 或pCEP4等)和宿主细胞(例如HEK293、CHO或CHO-DG44等)。
具有和表达本发明的抗体的宿主细胞可以是原核细胞或真核细胞。例如，宿主细胞可以是大肠杆菌(E.Coli)，优选大肠杆菌ER2738、HB2151、BL21等，并且它们可以用于克隆和表达本发明的多核苷酸。另外，作为其他微生物宿主，可以使用芽孢杆菌(Bacillus)(例如枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis))或其他肠道细菌(例如沙门氏菌(Salmonella)或沙雷氏菌(Serratia))、或各种假单胞菌 (Pseudomonas)属。为了表达本发明的抗体，可以使用其他微生物(例如酵母)，也可以使用与杆状病毒载体结合的昆虫细胞。
在一些优选的示例性实施方式中，哺乳动物宿主细胞可以用于表达和制备结合SFTSV包膜糖蛋白的本发明的多肽。例如，它可以是表达内源免疫球蛋白基因的杂交瘤细胞系或具有外源表达载体的哺乳动物细胞系。此外，它可以包括例如CHO细胞系、Cos细胞系、HeLa细胞、骨髓瘤细胞系、HEK细胞系、转化的B细胞和杂交瘤，如任何动物细胞或人细胞。另外，可以使用许多可以分泌免疫球蛋白的合适的宿主细胞系，并且优选地，可以使用HEK293、CHO 或CHO-DG44。
此外，本发明提供用于诊断SFTSV的组合物，该组合物包含一种或多种结合SFTSV包膜糖蛋白的分子(例如，结合Gc或Gn的抗体或其抗原结合片段)。本发明的诊断用组合物可以有效地用于SFTSV的检测、分离或纯化。此外，该组合物还可以包含一种或多种适用于诊断SFTSV的其他试剂。另外，本发明提供了使用本发明的抗体诊断SFTSV的方法。该方法可以用于SFTSV的定量或定性检测或诊断。具体地，诊断方法可以包括诊断检查，以确定SFTSV的包膜糖蛋白和/或核酸的表达以及来自生物样品(例如血液、血清、细胞或组织)或患有SFTS或有发展SFTS风险的对象的SFTSV包膜糖蛋白的功能。在本发明中，检测包括定量分析和/或定性分析，并且包括检测存在和不存在以及检测病毒滴度，并且该方法在本领域中是已知的，并且本领域技术人员可以选择合适的方法进行本发明。
在本发明中，SFTSV的诊断的检测或诊断可以通过检测抗原-抗体复合物的放射免疫测定、蛋白质印迹、ELISA(酶联免疫吸附测定)或免疫荧光测定等检测。在本发明中，抗原可以用标记物(例如放射性物质、酶或荧光物质等)标记。
在一个实施方式中，本发明的诊断方法可以使用其中结合SFTSV的包膜糖蛋白的抗体与磁珠缀合的复合物。具体地，使用其中特异性结合SFTSV的包膜糖蛋白Gc或Gn的抗体与磁珠组合的复合物，该方法可以更有效地检测、分离或纯化SFTSV。结合SFTSV包膜糖蛋白的抗体-磁珠复合物与使用抗体性质的对象中存在的SFTSV组合，并且当磁珠被磁力拉动时，对象中的病毒和其他物质分离，从而有效地纯化病毒。由于去除了杂质，以该方式纯化的病毒对于RNA 分离是相对有用的，并且通过该方式，可以获得高品质的纯化结果数据。另外，对于附着在磁珠上的病毒，可以使用其他抗体进行免疫化学反应，通过该方法，可以迅速确认对象中存在的SFTSV。诊断方法的示意图示于图4中。
此外，本发明提供了用于诊断SFTSV的试剂盒，该试剂盒包含结合SFTSV 的包膜糖蛋白的抗体。试剂盒可以包含任一种或多种上述抗体和用于检测抗原- 抗体复合物的试剂。作为用于检测抗原-抗体复合物的试剂，可以使用用于放射免疫测定、ELISA(酶联免疫吸附测定)或免疫荧光测定等的试剂。
例如，为了检测免疫反应，可以以夹心的形式直接或间接标记检测试剂。在直接标记方法的情况下，用于测定的血清样品等可以用荧光标记物(例如Cy3 或Cy5)标记。在夹心法的情况下，可以在将未标记的血清样品与预先附着检测试剂的阵列组合之后，通过将靶蛋白与标记的检测抗体组合而进行检测。在夹心法的情况下，由于可以提高灵敏度和特异性，因此可以以pg/mL的水平检测。除此之外，可以使用放射性物质、显色物质、磁性颗粒或致密电子颗粒等用作标记物质。共聚焦显微镜可以用于荧光强度，例如，可以从Affymetrix，Inc.或 Agilent Technologies，Inc等获得。
本发明的试剂盒还可以包含结合分析法所需的一种或多种其他组分，例如，还可以包含结合缓冲液、样品制备所需的试剂、血液收集用注射器或阴性对照和/或阳性对照。根据分析方面，可以提供可以包含各种检测试剂的本发明的试剂盒用于ELISA分析、膜载体酶标记(dip stick)快速试剂盒分析、微阵列、基因扩增或免疫测定等，并且可以根据分析方面可以挑选适当的检测试剂。
此外，本发明提供了药物组合物，该药物组合物包含结合SFTSV包膜糖蛋白的本发明的抗体。优选地，药物组合物可以用于预防或治疗SFTS。通过中和 SFTSV和阻断病毒的增殖，本发明的抗体可以有效地预防或治疗SFTS。
在本发明中，组合物还可以含有一种或多种类型的适于治疗或预防SFTSV 相关疾病的其它试剂。可以用于药物组合物的载体可以增强组合物的效果，或稳定组合物，或使组合物的制备容易。药学上可接受的载体可以包含生理上可接受的溶剂、分散介质、包衣剂、抗细菌剂、抗真菌剂、等渗剂或吸收延迟剂等。
在本发明中，药物组合物可以通过本领域已知的各种方法施用，并且施用途径和/或方法可以根据所期望的结果而变化。药物组合物可以通过施用方法(例如静脉内、肌肉内、腹膜内或皮下等)而施用。根据施用途径，活性化合物(抗体)可以用保护化合物免受酸的作用和其他会使化合物失活的天然条件的作用的材料包被。
在本发明中，组合物可以是无菌液体。为了保持适当的流动性，例如，可以使用包衣材料(例如卵磷脂或表面活性剂)。此外，该组合物可以包含等渗剂 (例如糖、多元醇、甘露醇、山梨糖醇和氯化钠等)或吸收延迟剂(单硬脂酸铝或明胶等)。
在本发明中，药物组合物可以根据本领域已知并且通常进行的方法制备，并且优选地，可以在GMP条件下制备。药物组合物可以包含治疗有效(effective) 剂量或有效(efficacious)剂量的结合SFTSV包膜糖蛋白的抗体。此外，药物组合物中活性成分的剂量水平可以足以实现治疗效果而对患者无毒。
在本发明中，可以滴定治疗剂量以优化安全性和功效。当全身施用本发明的抗体时，剂量的范围可以是每1kg宿主体重约0.0001mg至100mg、更通常是0.01mg至15mg。示例性治疗方法需要全身施用每两周一次、或每个月一次、或每三个月至六个月一次。在一些全身施用的方法中，剂量是，并且在一些方法中，可以调节剂量以在一些全身施用方法中达到1μg/mL至1000μg/mL的血清抗体浓度，并且在一些方法中达到25μg/mL至500μg/mL。另外，当需要较低频率的施用时，抗体可以通过延时释放剂施用。剂量和频率可以根据患者中抗体的半衰期而不同。在预防目的中，可以以相对不频繁的间隔长时间地施用相对低的剂量。
此外，本发明提供了使用该药物组合物预防或治疗SFTS的方法。该预防或治疗方法可以包括施用包含治疗有效量的本发明的抗体的组合物。“治疗有效量”表示对于预防或治疗SFTS病有效的本发明的抗体的量或包含该抗体的组合物的量。
此外，本发明提供了结合SFTSV包膜糖蛋白的抗体在制备用于诊断SFTSV 的组合物中的用途。为了制备用于诊断的组合物，本发明的抗体或包含该抗体的组合物可以包含其他组分(例如可接受的载体等)。
此外，本发明提供了结合SFTSV包膜糖蛋白的抗体的用途。特异性地结合 SFTSV的本发明的抗体可以用于SFTSV诊断，并且可以用作确定SFTSV的包膜糖蛋白和/或核酸的表达以及来自患有SFTS或有发展SFTS的风险的对象的蛋白质的功能的诊断用途。另外，本发明的抗体可以用于预防或治疗由有发展SFTS 的风险或患有SFTS的人的SFTSV产生的SFTS。
有利效果
本发明的抗体可以特异性地结合SFTSV的包膜糖蛋白Gc或Gn，因此使用本发明的抗体可以有效地检测或诊断SFTSV并且可以治疗SFTS。
附图说明
图1显示抗体克隆Ab1至Ab10的氨基酸序列。
图2显示针对SFTSV包膜糖蛋白Gc和Gn纯化的scFv片段抗体的ELISA 分析结果。这些数据显示3次重复样品的平均±S.D。
图3是(A)免疫荧光分析结果和(B)SFTSV感染的荧光强度测量。在免疫荧光分析结果中，显示SFTSV感染的Vero细胞与结合Gn的抗体反应，并且显示Ab10剂量依赖性地抑制病毒感染。与MAb 4-5相比，Ab10在抑制病毒侵染方面显著优异。
图4是显示使用抗体-磁珠复合物检测SFTSV的方法的示意图。
具体实施方式
在下文中，将详细描述示例等以便于理解本发明。然而，根据本发明的示例可以修改为各种其他形式，并且本发明的范围不应该被解释为限于以下示例。本发明的示例提供为向本领域技术人员更完整地描述本发明。
实施例1：制备细胞
来自非洲绿猴的肾的Vero细胞购自韩国细胞系库，并在37℃下、在5％的二氧化碳环境下，用补充有2％的热灭活的胎牛血清(Gibco)和青霉素-链霉素 (Gibco)的洛斯维帕克纪念研究所(RPMI)-1640培养基(Welgene)培养。
实施例2：制备病毒株
本实验中使用的SFTS病毒是从在首尔国立大学医院住院并于2012年死亡的63岁女性患者的血清样品中分离的KF358691[Kim KH，Yi J，Kim G，Choi SJ， Jun KI，Kim NH，等人.Severe fever with thrombocytopenia syndrome，South Korea， 2012.Emerginginfectious diseases.2013；19(11):1892-4.]。将分离的病毒接种到单层Vero细胞中，在37℃下、在5％的二氧化碳环境下培养。病毒在Vero细胞中增殖，所有实验均在病毒培养的第三次病毒传代中进行。使用Reed-Muench方法，在Vero细胞中滴定50％的组织培养感染剂量(TCID50)。
实施例3：重组SFTS病毒糖蛋白和单链可变片段抗体融合蛋白的制备
先前已报告在本实验中使用的SFTS病毒糖蛋白的氨基酸序列[Kim KH，Yi J，KimG，Choi SJ，Jun KI，Kim NH，等人.Severe fever with thrombocytopenia syndrome，South Korea，2012.Emerging infectious diseases.2013；19(11):1892-4.]。为了获得编码SFTS病毒糖蛋白的DNA链，合成了对应于SEQ ID NO 171的 SFTS病毒糖蛋白的氨基酸序列的人源密码子优化的DNA序列(GenBank登记号：AGT98506、Gn糖蛋白的氨基酸20至452、Gc糖蛋白的氨基酸563至1035) (GenScript)。
为了过表达与人免疫球蛋白G1(IgG1)Fc区融合的重组SFTS病毒糖蛋白 Gc和Gn(Gc-Fc、Gn-Fc)或与人Ig k-链恒定区融合的重组SFTS病毒糖蛋白 Gc和Gn(Gc-Ck、Gn-Ck)，根据以下所公开的方法制备编码SFTS糖蛋白的基因：[Park S，Lee DH，Park JG，Lee YT，Chung J.A sensitive enzyme immunoassay for measuring cotinine in passivesmokers.Clinica chimica acta；international journal of clinicalchemistry.2010；411(17-18):1238-42.]、[Lee Y，Kim H，Chung J.An antibody reactiveto the Gly63-Lys68epitope of NT-proBNP exhibits O-glycosylation-independentbinding.Experimental&molecular medicine.2014； 46:e114.]。
首先，将通过扩增人Ig k链的合成恒定区(UniProtKB/Swiss-Prot：P01834.1) 或通过使用来自人骨髓来源的cDNA文库(Clontech Laboratories)的2种引物 (5’-GAGCCCAAATCTTGTGACAAAACTCAC-3’和 5’-GGATCCTCATTTACCCGGGGACAGGGAG-3’)来扩增人IgG1的Fc区而得到的DNA序列修饰为位于待添加的基因序列的DNA 3’侧。将待添加的基因序列克隆到经修饰的pCEP4载体(Invitrogen)中，以通过SfiI限制酶使得基因添加。
使用编码每个克隆的scFv的DNA以单链可变片段-人IgG1 Fc区融合蛋白 (scFv-Fc)的形式产生抗体克隆。然后，使用聚乙烯亚胺(Polysciences)将载体转染到HEK293F细胞(Invitrogen)中，并将转染的细胞在含有100U/L青霉素-链霉素的FreeStyleTM 293表达培养基中培养。使用A/KappaSelect柱和AKTA 纯化色谱系统(GE Healthcare)通过亲和层析纯化过表达的重组SFTS病毒糖蛋白融合蛋白。
实施例4：抗体文库构建和生物淘选
使用Ficoll-Paque溶液(GE Healthcare)收集从SFTS恢复的患者的外周血单核细胞。使用TRIzol试剂(Invitrogen)分离总RNA，并使用具有oligo(dT) 引物的SuperScriptIII第一链cDNA合成试剂盒从总RNA合成cDNA。使用该 cDNA，使用pComb3XSS噬菌粒载体构建人单链可变片段(scFv)的噬菌体展示文库。另外，为了从文库中选择scFv克隆，如[Barbas CF，Burton DR，Scott JK，Silverman GJ.Phage display:a laboratory manual:CSHL Press；2004.]中所公开的，进行4轮生物淘选。使用3μg重组SFTS病毒糖蛋白Gc或Gn人IgG1 Fc 区融合蛋白(Gc-Fc、Gn-Fc)根据制造商用于每轮生物淘选的说明涂覆5x106磁性Dynabeads M-270环氧树脂珠(Invitrogen)。然后将与蛋白质结合的珠用于生物淘选程序。
实施例5：筛选针对SFTS病毒的单链可变片段抗体
为了选择结合SFTS病毒糖蛋白的单个抗体克隆，从最后一轮生物淘选中选择噬菌体克隆，并制备用于噬菌体酶免疫测定的scFv展示噬菌体。在4℃下，微量滴定板(Corning)各孔用100ng重组Gc、Gn人Ig k链恒定区融合蛋白(Gc-Ck、 Gn-Ck)包被，过夜。将该孔用在100μl的PBS中的3％(重量/体积)BSA在 37℃下封闭1小时，并用含有噬菌体的50μl培养上清液在37℃下培养2小时，并用在150μl的PBS中的0.05％(体积/体积)Tween20洗涤三次。然后，向各孔中加入50ml在封闭缓冲液(1:5000)中蒸馏的辣根过氧化物酶(HRP)结合的抗-M13抗体，然后将板在37℃下培养1小时。在用150μl的0.05％PBST洗涤后，向各孔中加入50μl的2,2-联氮基-双-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸(ABTS) 底物溶液(Pierce)，并在室温下培养30分钟。然后使用酶标仪(Labsystems) 在405nm处测量每个孔的吸光度。
实施例6：中和分析
将SFTS病毒特异性scFv-Fc融合抗体(100μl/ml)连续稀释至0.01μl/ml，每次减少为1/10。将各浓度的scFv在等体积的100TCID50SFTS病毒(品系 KF358691)中混合，并在37℃下培养1小时。然后，将病毒-抗体混合物转移到 8孔共聚焦显微镜室中的单层Vero细胞中，并在37℃下培养1小时。在除去病毒-抗体混合物后，将样品在含有2％FBS和抗生素的RPMI-1640培养基中在37℃下、在5％的二氧化碳环境下培养。8孔共聚焦显微镜室中的Vero细胞用于免疫荧光测定(IFA)。所有实验进行三次，通过与作为阳性对照的MAb 4-5[XilingGuo 等人.A human antibody neutralizing SFTS virus，an emerging hemorrhagicfever virus，2013.Clin.Vaccine Immunol.2013；20(9):1426-32).]和作为阴性对照的抗新城鸡瘟病毒(NDV)抗体比较而测量相对中和效果。
实施例7：免疫荧光分析(IFA)和荧光强度测量
使用免疫荧光试验(IFA)测量相对中和效果。将用或不用具有或不具有 Ab10、MAb4-5(阳性对照)、抗NDV(阴性对照)的病毒-抗体混合物处理的细胞培养2天。将细胞用磷酸盐缓冲盐水(PBS)中的4％多聚甲醛固定1小时。在用1％胎牛血清(BSA)中0.1％的tritonX-100封闭并穿透载玻片后，将它们与抗SFTS病毒糖蛋白Gn克隆Ab6抗体(5μl/ml)在4℃下一起培养，过夜。将细胞洗涤并在室温下用异硫氰酸荧光素(FITC)结合的抗人IgG(Pierce)培养1小时。使用4’,6-二脒基-2-苯基吲哚二盐酸盐(DAPI)对细胞核染色。用共聚焦显微镜(Leica，美国伊利诺伊州布法罗格罗夫)试验样品。使用计算机辅助的Leica应用套件高级荧光(LAS AF)测量荧光信号强度。使用x10/0.3透镜在每个载玻片的5个区域中拍摄显微镜照片，并使用3个中值分析。用405nm 蓝色二极管激光器设置DAPI信号，用氩离子激光器调节Alexa 488。
实施例8：产生针对SFTS病毒的scFv抗体
将人scFv文库用于重组SFTS病毒糖蛋白的生物淘选。在4轮淘选后，通过酶联免疫吸附测定分析(ELISA)筛选抗体克隆。结果表明，10个克隆(Gc 的Ab1至Ab5和Gn的Ab6至Ab10)通过ELISA识别SFTS病毒。ELISA分析结果示于图2中，图1显示了每个抗体克隆的氨基酸序列。
实施例9：针对SFTS病毒的抗体的中和活性
针对SFTS病毒的纯化的scFv-hFc抗体的中和活性在Vero细胞中试验。在实验的10个克隆(Ab1至Ab10)中，Ab10表现出最强的中和活性。将Ab10 scFv-hFc抗体(100μl/ml)稀释至1/10并滴定100TCID50SFTS病毒(KF358691 品系)。SFTSV感染的免疫荧光分析结果和荧光强度测量结果示于图3中。
在免疫荧光分析(IFA)中，用Ab10(100μl/ml)处理的细胞表现出最小的病毒感染，并且其中和活性是剂量依赖性的。换句话说，待处理的MAb 10的量越多，SFTS病毒感染的细胞数越少。与MAb 4-5(阳性对照)相比，Ab10显示出显著高的中和活性。阴性对照抗体根本不表现出中和活性。
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Claims (16)

1.一种特异性地结合严重发热伴血小板减少综合征病毒的包膜糖蛋白Gc的抗体，其中，所述抗体包含：
a）SEQ ID No: 21的LCDR1、SEQ ID No: 41的LCDR2、SEQ ID No: 61的LCDR3、SEQ IDNo: 26的HCDR1、SEQ ID No: 46的HCDR2和SEQ ID No: 66的HCDR3；
b）SEQ ID No: 22的LCDR1、SEQ ID No: 42的LCDR2、SEQ ID No: 62的LCDR3、SEQ IDNo: 27的HCDR1、SEQ ID No:47的HCDR2和SEQ ID No:67的HCDR3；
c）SEQ ID No: 23的LCDR1、SEQ ID No: 43的LCDR2、SEQ ID No: 63的LCDR3、SEQ IDNo: 28的HCDR1、SEQ ID No:48的HCDR2和SEQ ID No:68的HCDR3；
d）SEQ ID No: 24的LCDR1、SEQ ID No: 44的LCDR2、SEQ ID No: 64的LCDR3、SEQ IDNo: 29的HCDR1、SEQ ID No:49的HCDR2和SEQ ID No:69的HCDR3；或者
e）SEQ ID No: 25的LCDR1、SEQ ID No: 45的LCDR2、SEQ ID No: 65的LCDR3、SEQ IDNo: 30的HCDR1、SEQ ID No:50的HCDR2和SEQ ID No:70的HCDR3。
2.根据权利要求1所述的抗体，其中，所述抗体包含：
a）包含SEQ ID No: 1的氨基酸序列的轻链和包含SEQ ID No: 6的氨基酸序列的重链；
b）包含SEQ ID No: 2的氨基酸序列的轻链和包含SEQ ID No: 7的氨基酸序列的重链；
c）包含SEQ ID No: 3的氨基酸序列的轻链和包含SEQ ID No: 8的氨基酸序列的重链；
d）包含SEQ ID No: 4的氨基酸序列的轻链和包含SEQ ID No: 9的氨基酸序列的重链；或者
e）包含SEQ ID No: 5的氨基酸序列的轻链和包含SEQ ID No: 10的氨基酸序列的重链。
3.一种特异性地结合严重发热伴血小板减少综合征病毒的包膜糖蛋白Gn的抗体，其中，所述抗体包含：
a）SEQ ID No: 101的LCDR1、SEQ ID No: 121的LCDR2、SEQ ID No: 141的LCDR3、SEQID No: 106的HCDR1、SEQ ID No: 126的HCDR2和SEQ ID No: 146的HCDR3；
b）SEQ ID No: 102的LCDR1、SEQ ID No: 122的LCDR2、SEQ ID No: 142的LCDR3、SEQID No: 107的HCDR1、SEQ ID No: 127的HCDR2和SEQ ID No: 147的HCDR3；
c）SEQ ID No: 103的LCDR1、SEQ ID No: 123的LCDR2、SEQ ID No: 143的LCDR3、SEQID No: 108的HCDR1、SEQ ID No: 128的HCDR2和SEQ ID No: 148的HCDR3；
d）SEQ ID No: 104的LCDR1、SEQ ID No: 124的LCDR2、SEQ ID No: 144的LCDR3、SEQID No: 109的HCDR1、SEQ ID No: 129的HCDR2和SEQ ID No: 149的HCDR3；或者
e）SEQ ID No: 105的LCDR1、SEQ ID No: 125的LCDR2、SEQ ID No: 145的LCDR3、SEQID No: 110的HCDR1、SEQ ID No: 130的HCDR2和SEQ ID No: 150的HCDR3。
4.根据权利要求3所述的抗体，其中，所述抗体包含
a）包含SEQ ID No: 81的氨基酸序列的轻链和包含SEQ ID No: 86的氨基酸序列的重链；
b）包含SEQ ID No: 82的氨基酸序列的轻链和包含SEQ ID No: 87的氨基酸序列的重链；
c）包含SEQ ID No: 83的氨基酸序列的轻链和包含SEQ ID No: 88的氨基酸序列的重链；
d）包含SEQ ID No: 84的氨基酸序列的轻链和包含SEQ ID No: 89的氨基酸序列的重链；或者
e）包含SEQ ID No: 85的氨基酸序列的轻链和包含SEQ ID No: 90的氨基酸序列的重链。
5.一种核酸，所述核酸包含编码权利要求2所述的抗体的核苷酸序列。
6.一种核酸，所述核酸包含编码权利要求4所述的抗体的核苷酸序列。
7.一种载体，所述载体包含权利要求5所述的核酸、权利要求6所述的核酸、或者权利要求5所述的核酸和权利要求6所述的核酸两者。
8.一种宿主细胞，所述宿主细胞包含权利要求7所述的载体。
9.一种用于诊断或检测SFTSV的组合物，所述组合物包含权利要求1或3所述的抗体。
10.一种用于诊断或检测SFTSV的试剂盒，所述试剂盒包含权利要求1或3所述的抗体。
11.权利要求1或3所述的抗体用于制备用于诊断或检测来自生物样品的SFTSV的药剂的用途。
12.根据权利要求11所述的用途，其中，权利要求1或3所述的抗体与磁珠在复合物中相结合。
13.一种药物组合物，所述药物组合物包含权利要求1或3所述的抗体。
14.权利要求1或3所述的抗体用于制备用于预防或治疗SFTS的药剂的用途。
15.权利要求1或3所述的抗体用于制备用于诊断、预防或治疗SFTSV的药剂的用途。
16.权利要求1或3所述的抗体用于制备用于诊断SFTSV的组合物的用途。
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