KR20230038028A - 코로나바이러스 스파이크 단백질에 특이적인 항체 및 이의 용도 - Google Patents
코로나바이러스 스파이크 단백질에 특이적인 항체 및 이의 용도 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 코로나바이러스 스파이크 단백질에 특이적인 항체 및 이의 용도에 관한 것이다.
Description
본 발명은 코로나바이러스 스파이크(spike, S) 단백질에 특이적인 항체 및 이의 용도에 관한 것이다.
코로나바이러스감염증-19(coronavirus disease 2019, COVID-19)는 2019년 12월에 처음 보고된 사람 코로나바이러스(human coronavirus)인 SARS-CoV-2(severe acute respiratory syndrome coronavirus 2)에 감염되어 발생하는 중증급성호흡기 질환이다. 코로나바이러스는 1920년 후반에 닭에서 처음 발견된 뒤 개, 돼지, 조류 등의 동물을 거쳐 1965년에는 사람에서도 발견되었다. 사람 코로나바이러스는 감염자의 비말이 호흡기나 눈, 코, 입의 점막으로 침투될 때 전염되는 것으로 알려져 있으며, 계절에 따라 호흡기 감염증의 15-35%를 차지하며 대부분 감기와 같은 경미한 증상을 일으킨다. 하지만 치명적인 호흡기 질환을 일으킨 2003년에 발생한 사스(SARS)와 2012년 발생한 중동 호흡기 증후군(메르스, middle east respiratory syndrome, MERS) 역시 사람 코로나바이러스에 의한 감염성 질환으로 알려졌다. 특히, SARS-CoV-2 감염에 의한 COVID-19은 높은 치사율과 빠른 전파력에 의해 전세계로 확산되어 2020년 3월 세계보건기구(world health organization, WHO)에서 팬더믹(pandemic)으로 선언되었고, 일부 국가는 확진자가 다수 발생한 국가로부터의 입국을 통제하는 등 확산 방지에 총력을 기울이고 있다. 또한 SARS-CoV-2 변이 바이러스가 세계적으로 여러 지역에서 출몰하면서 COVID-19을 진단하고 통제하는 것이 더욱 어려운 상황이다.
이에, 본 발명자들은 코로나바이러스의 스파이크(spike, S) 단백질의 스파이크2(Spike2, S2)에 존재하는 결합 도메인(connector domain, CD)에 특이적으로 결합하는 항체를 개발하여 코로나바이러스 감염의 진단 뿐 아니라 예방 및 치료에도 사용될 수 있음을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 목적은 코로나바이러스 스파이크(spike, S) 단백질에 특이적으로 결합하는 항체 또는 상기 스파이크(S) 단백질에 특이적으로 결합하는 항원 결합 단편을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 상기 항체 또는 상기 항원 결합 단편을 코딩하는 폴리뉴클레오티드, 이를 포함하는 발현 벡터 및 이를 포함하는 숙주세포를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 항체 또는 상기 결합 단편을 포함하는 코로나바이러스 감염 진단용 조성물, 이를 포함하는 키트를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 항체 또는 상기 결합 단편을 이용하여, 생물학적 시료에 존재하는 코로나바이러스를 검출하는 단계를 포함하는, 코로나바이러스 감염 진단을 위한 정보제공방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 항체 또는 상기 결합 단편을 포함하는 코로나바이러스 감염질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 항체 또는 상기 결합 단편을 포함하는 코로나바이러스 감염 질환을 예방 또는 치료하는 방법을 제공하는 것이다.
이를 구체적으로 설명하면 다음과 같다. 한편, 본 출원에서 개시된 각각의 설명 및 실시 형태는 각각의 다른 설명 및 실시 형태에도 적용될 수 있다. 즉, 본 출원에서 개시된 다양한 요소들의 모든 조합이 본 출원의 범주에 속한다. 또한, 하기 기술된 구체적인 서술에 의하여 본 출원의 범주가 제한된다고 볼 수 없다. 또한, 본 명세서 전체에 걸쳐 다수의 논문 및 특허 문헌이 참조되고 그 인용이 표시되어 있다. 인용된 논문 및 특허 문헌의 개시 내용은 그 전체로서 본 명세서에 참조로 삽입되어 본 발명이 속하는 기술 분야의 수준 및 본 발명의 내용이 보다 명확하게 설명된다.
본 발명의 하나의 양태는 코로나바이러스 스파이크(S) 단백질에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 제공한다.
일 구현예로, 본 발명에서 제공하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 서열번호 17로 표시되는 서열을 항원결정부위(epitope)로 인식하는 것일 수 있다.
본 발명에서, 용어 "코로나바이러스"는 코로나바이러스과(Coronaviridae)에 속하며 구형의 외막을 가지는, 약 80-220 nm 크기의 양성 단일가닥 RNA 바이러스(positive-sense single-stranded RNA virus, ssRNA)를 지칭한다. 코로나바이러스는 가장 외각에 있는 스파이크(S) 단백질, 헤마글루티닌-에스터라제(hemagglutinin-esterase, HE) 단백질, 멤브레인(membrane, M) 단백질, 엔벨로프(envelope, E) 단백질 및 뉴클레오캡시드(nucleocapsid, NP) 단백질 등 5개의 구조 단백질을 포함하는 것으로 알려져 있다(Lai and Homes, 2001. Fields Virology).
일 구현예로, 상기 코로나바이러스는 SARS-CoV-2일 수 있고, 상기 코로나바이러스 스파이크(S) 단백질은 SARS-CoV-2의 스파이크(S) 단백질의 일부 도메인이 절단된 형태인 스파이크2(spike2, S2) 단백질일 수 있으나, 본 발명의 항체 또는 이의 항원 결합 단편이 특이적으로 결합할 수 있는 코로나바이러스는 제한 없이 포함된다.
본 발명의 용어, "SARS-CoV-2(사스-코로나바이러스-2)"는 호흡기 질환인 코로나바이러스감염증-19(COVID-19)를 야기하는 바이러스이다.
SARS-CoV-2는 양성 단일가닥 RNA 바이러스이다. SARS-CoV-2는 분류학적으로 SARS-CoV의 계통(strain)으로, 동물원성 감염증의 기원(zoonotic origins)을 가지며, 박쥐 코로나바이러스와 근접한 유전적 유사성을 갖는 것으로 간주된다. 상기 SARS-CoV-2는 주로 사람들 간의 긴밀한 접촉을 통해 및/또는 기침이나 재채기시 발생하는 비말을 통해 전파되며, 주로 바이러스 외각의 스파이크(S) 단백질이 인간세포 표면에 존재하는 수용체 안지오텐신 전환 효소 2(angiotensin converting enzyme 2, ACE2)에 결합하여 인간세포에 진입하는 것으로 알려져 있다.
SARS-CoV-2는 RNA 의존적 RNA 중합효소 (RNA-dependent RNA polymerase), 스파이크(S), 멤브레인(M), 엔벨로프(E) 및 뉴클레오캡시드(NP) 단백질 및/또는 상기 단백질을 코딩하는 유전자를 포함할 수 있다. SARS-CoV-2 구조 단백질 중 스파이크(S) 단백질은 바이러스 입자 표면에 존재하여 숙주세포 침입에 관여하고, S1과 S2로 나누어진다. S1 단백질은 숙주세포의 수용체와 상호작용하는데, S1 단백질 내 존재하는 수용체 결합 도메인(receptor-binding domain, RBD)는 숙주세포 표면에 존재하는 ACE2 수용체와 결합하는 핵심 부위로 알려져 있다. S2 단백질은 숙주세포 세포막과의 융합에 관여한다. 상기 구조에 대한 내용은 Cascella, M., Rajnik, M., Cuomo, A., Dulebohn, S. C., & Di Napoli, R. (2020). Features, Evaluation and Treatment Coronavirus (COVID-19). In StatPearls. Treasure Island (FL)에 상세히 기재되어 있다.
구체적으로, 본 발명에서 제공하는 항체 또는 이의 단편은 SARS-CoV-2의 스파이크(S) 단백질의 일부 도메인이 절단된 형태인 스파이크2(S2) 단백질에 특이적으로 결합하는 것일 수 있다.
그 예로, 본 발명에서 제공하는 항체 또는 이의 단편이 인식하는 항원결정부위(에피토프, epitope)는 SARS-CoV-2의 스파이크2(S2) 단백질에 존재하는 결합 도메인(CD)의 일부일 수 있다.
본 발명의 일 구현예에서는 코로나바이러스 스파이크(S) 단백질에 특이적으로 결합하는 항체를 개발하였으며, 개발한 항체 4A5가 SARS-CoV-2의 스파이크(S)가 절단된 형태인 스파이크2(S2) 단백질에 위치하는 결합 도메인(CD)의 일부인 서열번호 17을 항원결정부위로 인식하는 것을 확인하였다. 또한, 다른 항원결정부위를 인식하는 기존 상용화 항체 NBP2-90999에 비해 4A5가 월등한 반응성을 보이며, 4A5는 SARS-CoV-2의 스파이크(S) 단백질을 발현하는 바이러스의 감염을 억제하는 것을 확인하였다.
본 발명에서, 용어 "항체"는 면역학적으로 특정 항원과 반응성을 갖는 면역글로불린 분자를 포함하는, 항원을 특이적으로 인식하는 리간드 역할을 하는 단백질 분자를 의미하며, 다클론 항체, 단일클론 항체, 전체(whole) 항체 및 항체 단편을 모두 포함한다. 또한, 상기 용어는 키메라성 항체(예를 들면, 인간화 뮤린 항체) 및 이가(bivalent) 또는 이중특이성 분자(예를 들어, 이중특이성 항체), 디아바디, 트리아바디 및 테트라바디를 포함한다. 상기 용어는 추가로 FcRn(neonatal Fc receptor)에 대한 결합 기능을 보유한 단쇄 항체, 스캡, 항체 불변 영역의 유도체 및 단백질 스캐폴드에 기초한 인공 항체를 포함한다. 전체 항체는 2개의 전체 길이의 경쇄(light chain, LC) 및 2개의 전체 길이의 중쇄(heavy chain, HC)를 가지는 구조이며, 각각의 경쇄는 중쇄와 다이설파이드 결합으로 연결되어 있다. 상기 전체 항체는 IgA, IgD, IgE, IgM 및 IgG를 포함하며, IgG는 아형(subtype)으로, IgG1, IgG2, IgG3 및 IgG4를 포함한다. 일 구현예로, 본 발명에서 제공하는 항체는 IgG 항체일 수 있다.
상기 용어 "단편", "폴리펩타이드의 결합 단편" 및 "항체 단편"은 항체의 항원-결합 활성을 보유하는 본 발명의 항체의 임의의 단편을 지칭하는 것으로 호환적으로 사용된다. 예시적인 항체 단편은 단일 쇄 항체, Fd, Fab, Fab', F(ab')2, dsFv 또는 scFv를 포함하나 이에 한정되지 않는다. 상기 Fd는 Fab 단편에 포함되어 있는 중쇄 부분을 의미한다. 상기 Fab는 경쇄 및 중쇄의 가변 영역(variable region)과 경쇄의 불변 영역(framework region, FR) 및 중쇄의 첫 번째 불변 영역(CH1 도메인)을 가지는 구조로 1개의 항원 결합 부위를 가진다. Fab'는 중쇄 CH1 도메인의 C 말단에 하나 이상의 시스테인 잔기를 포함하는 힌지 영역(hinge region)을 가진다는 점에서 Fab와 차이가 있다. F(ab')2 항체는 Fab'의 힌지 영역의 시스테인 잔기가 디설파이드 결합을 이루면서 생성된다. Fv(variable fragment)는 중쇄 가변 부위 및 경쇄 가변 부위만을 가지고 있는 최소의 항체 조각을 의미한다. 이중디설파이드 Fv(dsFv)는 디설파이드 결합으로 중쇄 가변 부위와 경쇄 가변 부위가 연결되어 있고, 단쇄 Fv(scFv)는 일반적으로 펩타이드 링커를 통하여 중쇄의 가변 영역과 경쇄의 가변 영역이 공유 결합으로 연결되어 있다. 이러한 항체 단편은 단백질 가수분해 효소를 이용해서 얻을 수 있고(예를 들어, 전체 항체를 파파인으로 제한 절단하며 Fab를 얻을 수 있고 펩신으로 절단하면 F(ab')2 단편을 얻을 수 있다), 그 예로 유전자 재조합 기술을 통하여 제작할 수 있다.
본 발명에서, 용어 "항원결정부위"는 "에피토프(epitope)"라고도 하며, 항체 또는 항체 단편이 항원에 특이적으로 결합하는 항원의 영역 또는 구역을 지칭한다.
일 구현예로, 본 발명에서 제공하는 항체는 단일클론 항체일 수 있다.
본 발명에서 용어, "단일클론 항체"는 실질적으로 동일한 항체 집단에서 수득한 단일 분자 조성의 항체 분자를 지칭하고, 이러한 단일클론 항체는 특정 항원결정부위에 대해 단일 결합 특이성 및 친화도를 나타낸다.
전형적으로, 면역글로불린은 중쇄 및 경쇄를 가지며 각각의 중쇄 및 경쇄는 불변 영역및 가변 영역을 포함한다. 경쇄 및 중쇄의 가변 영역은, 상보성 결정 영역(complementarity-determining region, CDR)이라 불리는 3개의 다변가능한 영역 및 4개의 구조 영역(FR)을 포함한다.
상기 CDR은 주로 항원의 항원결정부위에 결합하는 역할을 한다. 각각의 사슬의 CDR은 전형적으로 C-말단으로부터 시작하여 순차적으로 CDR1, CDR2, CDR3로 불리고, 또한 특정 CDR이 위치하고 있는 사슬에 의해서 식별된다. 상기 상보성 결정 영역은 비교적 보존적인, 불변 영역(FR)로 불리는 영역 사이에 배치되어 있다. 각각의 VH 및 VL은 세 개의 CDR 및 네 개의 FR로 이루어지며, 아미노-말단에서 카복시-말단까지 다음의 순서로 배열된다: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4. 중쇄 및 경쇄의 가변 영역은 항원과 상호작용하는 결합 도메인을 함유한다. 중쇄가변영역의 CDR은 HCDR1, HCDR2, HCDR3으로, 경쇄가변영역의 CDR은 LCDR1, LCDR2, LCDR3으로, 중쇄가변영역의 FR은 HFR1, HFR2, HFR3, HFR4로, 경쇄가변영역의 FR은 LFR1, LFR2, LFR3, LFR4로 지칭될 수 있다.
일 구현예로, 본 발명의 코로나바이러스 스파이크 단백질에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 결합 단편은, 서열번호 2의 HCDR1, 서열번호 4의 HCDR2, 및 서열번호 6의 HCDR3을 포함하는 중쇄가변영역; 및 서열번호 9의 LCDR1, 서열번호 11의 LCDR2, 및 서열번호 13의 LCDR3을 포함하는 경쇄가변영역을 포함하는 것일 수 있다.
전술한 구현예 중 어느 하나의 구현예로, 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 서열번호 1의 HFR(중쇄 FR)1, 서열번호 3의 HFR2, 서열번호 5의 HFR3, 및 서열번호 7의 HFR4를 포함하는 중쇄가변영역; 및 서열번호 8의 LFR(경쇄 FR)1, 서열번호 10의 LFR2, 서열번호 12의 LFR3, 및 서열번호 14의 LFR4를 포함하는 경쇄가변영역을 포함하는 것일 수 있다.
전술한 구현 예 중 어느 하나의 구현 예로, 상기 항체 또는 이의 결합 단편은 서열번호 15의 중쇄가변영역(VH) 및 서열번호 16의 경쇄가변영역(VL)을 포함하는 것일 수 있다.
본 발명의 일 구현예에서는 개발한 항체 4A5가 도 13(VH) 및 도 14(VL)에 나타낸 바와 같은 CDR 서열을 가지는 것을 확인하여 발명을 완성하였다.
본 발명에 있어서, 가변 영역의 CDR은 Kabat 등에 의해 고안된 시스템에 따라 통상적인 방법으로 결정되었으며(문헌[Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest(5th), National Institutes of Health, Bethesda, MD. (1991)] 참조) 본 발명에 사용된 CDR 넘버링은 Kabat 방법을 사용했지만, 이외에 IMGT 방법, Chothia 방법, AbM 방법 등 다른 방법에 따라 결정된 CDR을 포함하는 항체 역시 본 발명의 범위에 포함된다.
본 발명의 다른 하나의 양태는 본 발명에서 제공하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 제공한다.
본 발명의 항체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 통상적인 절차를 사용하여 쉽게 단리되고 서열분석 될 수 있다.
그 예로, 파지 주형 DNA로부터 당해 중쇄 및 경쇄 코딩 영역을 특이적으로 증폭시키도록 디자인된 올리고뉴클레오티드 프라이머를 사용할 수 있다. 상기 폴리뉴클레오티드가 단리되면, 이를 발현 벡터 내로 넣을 수 있고, 그 후 상기 발현 벡터를 적당한 숙주세포에 도입하여, 형질전환된 숙주세포(즉, 형질전환체)로부터 원하는 단일클론항체를 생산할 수 있다.
본 발명의 다른 하나의 양태는 본 발명에서 제공하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함하는 발현 벡터 및 상기 벡터가 도입된 숙주세포를 제공한다.
상기 항체에 대해서는 상기에서 설명한 바와 같다.
본 발명에서 제공하는 상기 항체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 벡터는 특별히 이에 제한되지 않으나, 포유류 세포(예를 들어, 사람, 원숭이, 토끼, 래트, 햄스터, 마우스 세포 등), 식물 세포, 효모 세포, 곤충 세포 또는 박테리아 세포(예를 들어, 대장균 등)를 포함하는 진핵 또는 원핵세포에서 상기 폴리뉴클레오티드를 복제 및/또는 발현할 수 있는 벡터가 될 수 있고, 구체적으로는 숙주세포에서 상기 뉴클레오티드가 발현될 수 있도록 적절한 프로모터에 작동가능하도록 연결되며, 적어도 하나의 선별 마커를 포함하는 벡터가 될 수 있다. 그 예로 파지, 플라스미드, 코스미드, 미니-염색체, 바이러스 또는 레트로바이러스벡터 등에 상기 폴리뉴클레오티드가 도입된 형태가 될 수 있다.
상기 항체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 벡터는 상기 항체의 중쇄 또는 경쇄를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 각각 포함하는 발현 벡터 또는 중쇄 또는 경쇄를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 모두 포함하는 발현 벡터일 수 있다.
본 발명에서 제공하는 상기 발현 벡터가 도입된 숙주세포는 특별히 이에 제한되지 않으나, 상기 발현 벡터가 도입되어 형질전환된 대장균, 스트렙토미세스, 살모넬라 티피뮤리움 등의 박테리아 세포; 효모 세포; 피치아 파스토리스 등의 균류세포; 드로조필라, 스포도프테라 Sf9 세포 등의 곤충 세포; CHO(중국 햄스터 난소 세포, chinese hamster ovary cells), SP2/0(마우스 골수종), 인간 림프아구(human lymphoblastoid), COS, NSO(마우스 골수종), 보우스 멜라노마(bowes melanoma) 세포, HT-1080, BHK(베이비 햄스터 신장세포, baby hamster kidney cells), HEK(인간배아신장세포, human embryonic kidney cells), PER.C6(인간망막세포) 등의 동물 세포; 또는 식물 세포가 될 수 있다.
본 발명에서 용어, "도입"은 상기 항체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터를 숙주세포에 전달하는 방법을 의미한다. 이와 같은 도입은 칼슘 포스페이트-DNA 공침전법, DEAE-덱스트란-매개 트랜스펙션법, 폴리브렌-매개 형질감염법, 전기충격법, 미세주사법, 리포좀 융합법, 리포펙타민 및 원형질체 융합법 등의 당 분야에 공지된 여러 방법에 의해 수행될 수 있다. 또한, 형질도입은 감염(infection)을 수단으로 하여 바이러스 입자를 사용하여 목적물을 세포 내로 전달시키는 것을 의미한다. 아울러, 유전자 봄바드먼트(bombardment) 등에 의해 벡터를 숙주세포 내로 도입할 수 있다. 본 발명에서 도입은 형질주입, 형질전환과 혼용되어 사용될 수 있다.
본 발명의 다른 하나의 양태는 본 발명에서 제공하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함하는, 코로나바이러스 감염 진단용 조성물을 제공한다.
본 발명의 다른 하나의 양태는 본 발명에서 제공하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함하는, 코로나바이러스 감염 진단용 키트를 제공한다.
본 발명의 다른 하나의 양태는 본 발명에서 제공하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편; 또는 이를 포함하는 감염 진단용 조성물; 또는 상기 조성물을 포함하는 키트를 이용하여, 코로나바이러스 감염 의심 개체로부터 분리된 생물학적 시료에 존재하는 코로나바이러스를 검출하는 단계를 포함하는, 코로나바이러스 감염 진단방법 또는 진단을 위한 정보제공방법을 제공한다.
본 발명에서 용어, "진단"은 특정 질병 또는 질환에 대한 개체의 감수성(susceptibility)을 판정하는 것, 개체가 특정 질병 또는 질환을 현재 가지고 있는지 여부를 판정하는 것 또는 치료 효능에 대한 정보를 제공하기 위해 개체의 상태를 모니터링 하는 것을 포함한다.
본 발명의 목적상, 상기 진단은 코로나바이러스 감염 질환의 발병 여부를 확인하는 것일 수 있다. 상기 "코로나바이러스 감염 질환"은 코로나바이러스가 숙주가 되는 생물체의 체내에 침입하는 감염에 의해 발병되는 질환을 의미한다. 구체적으로, 상기 코로나바이러스는 SARS-CoV-2(사스-코로나바이러스-2) 일 수 있다. 그 예로, 상기 코로나바이러스 감염 질환은 COVID-19일 수 있다.
본 발명의 코로나바이러스 감염 진단용 조성물은 본 발명의 항체 또는 이의 항원 결합 단편 이외의 다른 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함할 수 있다. 또한, 이 밖에 본 발명의 항체 또는 이의 항원 결합 단편과 항원의 결합 반응에 필요한 물질, 예를 들어 시약이 더 포함될 수 있다. 또한, 이 결합을 검출하는데 필요한 물질, 본 발명의 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 안정화를 위한 물질 등이 더 포함될 수 있다.
일 예로, 본 발명의 진단용 조성물에 포함되는 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 검출을 위해 표지 된 것일 수 있다. 분자 표식에 사용 가능한 다양한 방법들이 당업자에게 잘 알려져 있고, 본 발명의 범주 내에서 고려된다.
본 발명에서 사용될 수 있는 표식 종류의 예로는 효소, 방사성 동위원소, 콜로이드금속, 형광 화합물, 화학발광 화합물 및 생발광 화합물이 있다. 통상적으로 사용되는 표식들은 형광물질(가령, 플루레신, 로다민, 텍사스 레드 등), 효소(가령, 고추냉이 퍼옥시다아제, 베타-갈락토시다아제, 알칼리포스파타 아제), 방사성 동위원소(가령, 32P 또는 125I), 바이오틴, 디곡시게닌, 콜로이드 금속, 화학발광 또는 생발광 화합물(가령, 디옥세탄, 루미놀 또는 아크리디늄)을 포함한다. 효소 또는 바이오티닐기의 공유 결합법, 요오드화법, 인산화법, 바이오틴화법 등과 같은 표식 방법들 역시 잘 알려져 있다.
본 발명의 키트는, 본 발명의 항체 또는 이의 항원 결합 단편과 항원의 결합을 검출하는데 필요한 시약, 기구 등이 더 포함될 수 있다.
일 예로, 본 발명의 키트 용기에는 고체 담체가 포함될 수 있다. 본 발명의 항체는 고체 담체에 부착될 수 있고, 이와 같은 고체 담체는 다공성 또는 비다공성, 평면 또는 비평면일 수 있다.
일 예로, 상기 키트는 고체 담체; 분석하고자 하는 검체를 수용하고 버퍼 투입부 및 검체 투입부를 구비하는 검체 패드; 상기 검체 패드에서 유입된 검체에 함유되어 있는 코로나바이러스와 특이적으로 결합하는 항체를 포함하는 컨쥬게이트 패드; 상기 검체에 코로나바이러스가 존재하는지 여부를 검출하는 신호검출부와 분석 물질의 존재 유무와 관계없이 검체가 흡수 패드로 이동하였는지 여부를 확인하는 대조부를 포함하는 신호 검출 패드; 및 신호 검출 반응이 종료된 검체를 흡수하는 흡수 패드를 포함하는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
일 예로, 본 발명의 키트는 ELISA(Enzyme-linked immunosorbent assay) 키트 형태일 수 있다. 본 발명의 용어 "ELISA"는 효소면역측정방법이라고도 하며, 항체에 효소를 결합시켜 항원-항체 복합체를 형성함으로써 이의 효소와 기질의 반응을 통해 흡광도를 이용하여 정량하는 방법이다. 상기 ELISA는 고체 지지체에 부착된 항원을 인지하는 표지 된 항체를 이용하는 직접적 ELISA, 고체 지지체에 부착된 항원을 인지하는 항체의 복합체에서 포획 항체를 인지하는 표지 된 이차 항체를 이용하는 간접적 ELISA, 고체 지지체에 부착된 항체와 항원의 복합체에서 항원을 인지하는 표지 된 또 다른 항체를 이용하는 직접적 샌드위치 ELISA, 고체 지지체에 부착된 항체와 항원의 복합체에서 항원을 인지하는 또 다른 항체와 반응시킨 후 이 항체를 인지하는 표지 된 2차 항체를 이용하는 간접적 샌드위치 ELISA 등을 포함한다.
본 발명의 항체 또는 이의 단편은 생물학적 시료와 접촉시켜, 반응을 확인하여 생물학적 시료 내 코로나바이러스 존재 여부를 검출하는 데 사용될 수 있다.
상기 생물학적 시료는 대상의 가래, 침, 혈액, 땀, 폐 세포, 폐 조직의 점액, 호흡기 조직 및 타액으로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나일 수 있으나, 이에 한정되지 않으며 당업자에게 알려진 통상적인 방법으로 준비가 가능하다.
일 예로, 본 발명의 코로나바이러스 감염 진단을 위한 정보제공방법은 (a) 본 발명에서 제공하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 생물학적 시료와 접촉시키는 단계; 및 (b) 상기 접촉으로 형성된, 본 발명의 항체 또는 이의 항원 결합 단편과 코로나바이러스 스파이크 단백질의 복합체를 검출하는 단계를 포함할 수 있다. 구체적으로, 상기 (b) 단계에서 항체 또는 이의 단편과 코로나바이러스 스파이크 단백질의 복합체는, SARS-CoV-2 스파이크 단백질의 결합 도메인(CD) 부위 결합체 일 수 있다.
본 발명에서 사용된 용어 "항원-항체 복합체"는 시료 중의 해당 단백질 항원과 이를 인지하는 항체의 결합물을 의미한다. 상기 항원-항체 복합체의 검출은 당업계에 공지된 바와 같은 방법, 예를 들어 분광학적, 광화학적, 생물화학적, 면역화학적, 전기적, 흡광적, 화학적 및 기타 방법을 이용하여 검출할 수 있으며, 구체적으로 비색법(colormetric method), 전기화학법(electrochemical method), 형광법(fluorimetric method), 발광법(luminometry), 입자계수법(particle counting method), 육안측정법(visual assessment) 및 섬광계수법(scintillation counting method)으로 이루어진 군에서 선택되는 임의의 방법으로 검출할 수 있으며, 웨스턴블랏(western blotting), ELISA, 방사선면역분석법(radioimmunoassay), 방사면역 확산법(radioimmunodiffusion), 오우크레로니(ouchterlony) 면역 확산법, 로케트(rocket) 면역전기영동, 조직면역 염색, 면역침전 분석법(immunoprecipitation assay), 보체 고정 분석법(complete fixation assay), 유세포 분석법(fluorescence-activated cell sorting, FACS), 단백질 칩(protein chip) 등의 방법을 사용할 수 있으나 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 다른 하나의 양태는 상기 항체 또는 이의 결합 단편을 포함하는 코로나바이러스 감염의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다. 구체적으로, 상기 코로나바이러스는 SARS-CoV-2 일 수 있다. 일 예로, 상기 조성물은 COVID-19의 예방 또는 치료를 위한 것일 수 있다.
본 발명에서 용어, "COVID-19"는 SARS-CoV-2에 감염되어 발생하는 질환을 말한다. 본 발명의 항체는 SARS-CoV-2에 대한 중화능 및 감염 억제능을 나타내므로, 이를 COVID-19의 예방 또는 치료에 사용할 수 있다.
본 발명에서 용어, "예방"이란 상기 조성물의 투여에 의해 코로나바이러스 감염의 발병을 억제하거나 지연시키는 모든 행위를 의미할 수 있으며, 상기 "치료"란 상기 조성물의 투여에 의해 코로나바이러스 감염에 의한 증세가 호전되거나 이롭게 변경되는 모든 행위를 의미할 수 있다.
상기 약학적 조성물은 약학적으로 허용가능한 담체를 추가로 포함할 수 있다.
본 발명에서 용어, "약학적으로 허용 가능한 담체"란 생물체를 자극하지 않고 투여 화합물의 생물학적 활성 및 특성을 저해하지 않는 담체 또는 희석제를 말한다. 액상 용액으로 제제화되는 조성물에 있어서 허용되는 약학적 담체로는, 멸균 및 생체에 적합한 것으로서, 식염수, 멸균수, 링거액, 완충 식염수, 알부민 주사용액, 덱스트로즈 용액, 말토 덱스트린 용액, 글리세롤, 에탄올 및 이들 성분 중 1 성분 이상을 혼합하여 사용할 수 있으며, 필요에 따라 항산화제, 완충액, 정균제 등 다른 통상의 첨가제를 첨가할 수 있다. 또한, 희석제, 분산제, 계면활성제, 결합제 및 윤활제를 부가적으로 첨가하여 수용액, 현탁액, 유탁액 등과 같은 주사용 제형, 환약, 캡슐, 과립 또는 정제로 제제화 할 수 있다.
상기 약학적 조성물은 경구 또는 비경구의 여러 가지 제형일 수 있다. 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다. 경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 하나 이상의 화합물에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 탄산칼슘, 수크로오스(sucrose) 또는 락토오스(lactose), 젤라틴 등을 섞어 조제된다. 또한 단순한 부형제 이외에 스테아린산 마그네슘, 탈크 등과 같은 윤활제들도 사용된다. 경구투여를 위한 액상제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순 희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조제제, 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁용제로는 프로필렌글리콜(propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테로 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로젤라틴 등이 사용될 수 있다.
상기 약학적 조성물은 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제, 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제, 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조제제 및 좌제으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나의 제형을 가질 수 있다.
상기 본 발명의 조성물은 약학적으로 유효한 양으로 투여한다.
본 발명에서 용어, "약학적으로 유효한 양"은 의학적 치료에 적용 가능한 합리적인 수혜/위험 비율로 질환을 치료하기에 충분한 양을 의미하며, 유효 용량 수준은 개체 종류 및 중증도, 연령, 성별, 암의 종류, 약물의 활성, 약물에 대한 민감도, 투여 시간, 투여 경로 및 배출 비율, 치료기간, 동시 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 결정될 수 있다. 본 발명의 조성물은 개별 치료제로 투여하거나 다른 치료제와 병용하여 투여될 수 있고 종래의 치료제와는 순차적 또는 동시에 투여될 수 있다. 그리고 단일 또는 다중 투여될 수 있다. 상기 요소를 모두 고려하여 부작용 없이 최소한의 양으로 최대 효과를 얻을 수 있는 양을 투여하는 것이 중요하며, 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다.
본 발명의 또 하나의 양태는 상기 항체를 이용하여 코로나바이러스 감염을 예방 또는 치료하는 방법을 제공한다.
구체적으로, 상기 코로나바이러스는 SARS-CoV-2 일 수 있다.
일 예로, 상기 방법은 상기 항체를 SARS-CoV-2 감염 의심 개체에 투여하는 단계를 포함하는 것일 수 있다.
상기 방법은 항체 및 약학적으로 허용 가능한 담체를 추가로 포함하는 약학적 조성물을 코로나바이러스가 감염되거나 감염된 개체에 투여하는 단계를 포함하는 방법일 수 있으며, 상기 약학적으로 허용 가능한 담체는 상기에서 설명한 바와 동일하다.
상기 개체는 소, 돼지, 양, 닭, 개, 인간 등을 포함하는 포유동물, 조류 등을 포함하며, 본 발명의 상기 조성물의 투여에 의해 코로나바이러스 감염이 치료되는 개체를 제한없이 포함한다. 이때, 상기 항체는 약학적으로 유효한 양으로 단일 또는 다중 투여될 수 있다. 이때, 항체는 액제, 산제, 에어로졸, 캡슐제, 장용피 정제 또는 캡슐제 또는 좌제의 형태로 투여할 수 있다. 투여 경로는 복강 내 투여, 정맥 내 투여, 근육 내 투여, 피하 내 투여, 내피 투여, 경구 투여, 국소 투여, 비 내 투여, 폐 내 투여, 직장 내 투여 등을 포함하지만, 이에 제한되지는 않는다.
상기 방법은 또한 코로나바이러스 감염질환의 예방 또는 치료, 구체적으로는 SARS-CoV-2의 감염질환 예방 또는 치료에 사용될 수 있다. 그 예로, COVID-19의 예방 또는 치료에 사용될 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다.
본 발명의 또 하나의 양태는 상기 항체를 코로나바이러스 감염의 예방 또는 치료를 위한 의약품의 제조에 사용하기 위한 용도이다. 상기 의약품은 SARS-CoV-2 감염질환, 예를 들어 COVID-19의 예방 또는 치료에 사용될 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다. 상기 항체 및 SARS-CoV-2 감염의 예방 또는 치료에 대해서는 앞서 설명한 바와 같다.
본 발명의 항체는 코로나바이러스 검출 및 진단에 유용하게 사용할 수 있을 뿐만 아니라, 코로나바이러스의 중화능을 가지는 바 코로나바이러스 감염질환의 예방 및 치료에도 유용하게 사용될 수 있다.
도 1은 베타프로락톤(betapropiolactone)으로 불활화된 SARS-CoV-2 접종을 통해 면역화시킨 마우스 유래 B세포 하이브리도마들이 생산하는 항체들의 SARS-CoV-2 스파이크2(S2) 항원에 대한 반응성을 ELISA로 확인한 결과이다. 면역화마우스의 림프절을 채취하여 B 림프구(lymphocyte)를 수집하고, 마우스 골수종(myeloma) 세포와 융합하여 B 세포 하이브리도마 세포군을 확보하였다. 각 하이브리도마에서 분비하는 항체들을 대상으로 S2 단백질에 대한 반응성을 ELISA로 확인하여 높은 반응성을 보인 항-Spike2 항체를 분비하는 B 세포 하이브리도마 10종을 선별하였고, 이들 하이브리도마 모세포를 순차 희석하는 서브클로닝(subcloning)을 3회 실시하여 최종적으로 1G1, 4A5 항-Spike2 항체를 선별하였다.
도 2는 항-Spike2 항체 1G1과 4A5가 카파경쇄를 가진 아형이 IgG2a 항체임을 확인한 결과이다. 마우스 항체 아형(IgG1, IgG2a, IgG2b, IgG3, IgA, IgM) 특이반응 항-마우스 포획항체가 코팅된 ELISA 플레이트에 1G1, 4A5 하이브리도마 배양액을 처리하고, 항-마우스-IgG+IgA+IgM-HRP(horseradish peroxidase) 항체로 프로빙한 후 기질용액 TMB(3, 3', 5, 5'-Tetramethyl-benzidine)를 이용하여 발색시켰으며 IgG2a와 카파경쇄부 포획항체를 가진 웰에서 두드러지게 발색되었다.
도 3 내지 4는 발굴된 1G1, 4A5 항-Spike2 항체의 S2 항원 특이성을 확인한 결과이다. 도 3은 ELISA 방법으로 Sino Biological사가 생산/판매하여 코로나바이러스 관련 연구에 이용되고 있는 SARS-CoV-2 유래 스파이크1(S1), 스파이크2(S2), 뉴클레오캡시드(NP), 스파이크 단백질 내 수용체 결합 도메인(RBD) 항원 재조합 단백질이 각각 코팅된 웰에 Protein G 레진으로 정제한 2종의 항-Spike2 항체 1G1과 4A5를 첨가하고, 결합된 항체를 항-마우스 IgG-HRP(anti-mouse IgG-HRP, CST 사) 항체로 검출하였다. 도 4는 도3의 항원 단백질을 정제된 2종의 항-Spike2 항체 1G1과 4A5를 1차 항체로 처리한 웨스턴 블롯팅 결과로, 도 3의 결과에서 스파이크2(S2) 항원에 낮은 반응성을 보인 1G1 항체는 본 기법으로 특정항원에 반응하지 못하였고, 4A5 항체는 S2 항원만을 특이적으로 결합하였다.
도 5 내지 6은 4A5 항체가 도 3 내지 4에 기술한 정제된 재조합 항원 단백질뿐 만 아니라 세포내 발현 항원 단백질도 특이적으로 결합함을 확인한 결과이다. 도 5는 상업적으로 이용되는 SARS-CoV-2 Spike-10xHis/pCMV3 플라스미드를 인간신장상피세포(HEK293T)에 형질도입하여 발현시키고, 세포파쇄액을 환원성 12% SDS-PAGE에 전개시킨 후 PVDF(Polyvinylidene fluoride) 멤브레인에 이동시켜 4A5 항체로 특정단백질을 검출한 웨스턴 블롯 결과이다. 양성대조군 항체로 항-His 항체를 처리하여 Spike-His 단백질이 세포내에서 번역 후 변형(post-translational modification) 과정을 거쳐 예측된 분자량인 142.86 kDa 보다 큰 분자량으로 발현되었음을 확인하였고, 4A5 항체가 항-His 항체와 동일한 위치의 단백질과 결합함을 확인하였다. 도 6은 인간배아신장세포(HEK293T)에 SARS-CoV-2 스파이크(서열 1~1213 아미노산)/pGFP-N1 벡터를 형질도입하여 발현시키고, 세포 고정화 및 투과화(fixation & permeabilization) 후 4A5항체로 면역형광염색(immunofluorescence staining)을 실시하여 세포내 발현된 Spike-GFP 단백질에 항-마우스-IgG-로다민(Rhodamine)로 탐침 된 4A5 항체가 결합함을 확인 한 결과이다. 음성대조군으로 pGFP-N1 벡터를 형질도입하여 발현시킨 GFP 발현세포에는 4A5 항체가 결합하지 않는 반면, Spike-GFP가 발현된 세포에서는 GFP가 검출되는 동일 세포내 위치에 4A5 항체가 반응함을 확인하여 세포 내에서 발현하는 스파이크 단백질을 4A5가 특이적으로 검출할 수 있음을 검증하였다.
도 7은 도 5 내지 6의 세포내 항원에 대한 4A5 항체의 특이반응성을 이용하여 상업적으로 사용되는 SARS-CoV-2 Spike-His/pCMV3(Sino biological사)를 인간신장세포(HEK293T)에 형질도입하여 발현시킨 세포파쇄액을 4A5 항체와 혼합한 후 Protein G 레진으로 항체를 포획하여, 항체가 세포 내 발현된 항원을 검출함을 확인한 결과이다. 음성대조군으로 SARS-CoV-2 spike를 코딩하고 있지 않은 벡터(pCMV3: VC)를 형질도입한 세포파쇄액이 사용되었고, 4A5 항체의 음성대조항체로는 동일 아형(IgG2a) 항체를 동일 세포파쇄액과 혼합하여 비교하였다. SARS-CoV-2 면역화 마우스 유래 항체인 4A5에 의해 검출될 수 있는 비특이 결합 단백질을 배제하기 위해 일차 항체 처리 전 항- 래빗-IgG-HRP 항체를 처리하여 특이 단백질 밴드가 검출되지 않음을 먼저 확인하였고, 탐침자로 래빗-항-His 항체를 이용하여 발현된 Spike-His 단백질을 검출하였다. 그 결과, 4A5 항체의 면역침강능을 확인하였다.
도 8은 4A5 항체와 상업적으로 이용되는 항-Spike2 항체인 NBP2-90999 항체의Spike2(S2) 항원결합능을 비교한 ELISA결과이다. 상업적으로 이용되는 S2 항원 재조합 단백질(Sino Biological사)을 동량 코팅하고 20 nM 농도부터 순차 희석된 4A5 및 NBP2-90999 항체의 항원 결합 정도를 비선형 회귀 분석(non-linear regression)한 결과, 4A5 항체와 NBP2-90999 항체의 Spike2 항원에 대한 반수영향농도(EC50, effective concentration 50)가 각각 8.562 nM과 470.5 nM로 분석되었고, 이를 바탕으로 4A5 항체가 항원에 대한 결합력이 NBP2-90999 항체에 비교하여 약 55배 높음을 확인하였다.
도 9는 신규 항-Spike2 4A5 항체가 SARS-CoV-2 용해물을 검출할 수 있음을 보여주는 결과이다. 불활화한 SARS-CoV-2 용해물을 코팅항원으로 사용한 ELISA 분석으로, Spike2 재조합 단백질에 반응성을 보인 NBP2-90999 항-Spike2 항체가 실제 불활화한 SARS-CoV-2 용해물에는 반응성이 없는 반면, 신규 4A5 항체는 높은 반응성을 가진 것으로 확인되었다.
도 10은 항-SARS-CoV-2 Spike2 항체인 4A5 항체의 정교한 항원결정부위를 결정하기 위해 발현한 S2 절단변이 재조합 단백질들의 구성 부위를 표기한 모식도이다. 스파이크 단백질(서열 1~1273 아미노산)은 숙주세포 표면에 존재하는 ACE2 수용체와 결합하는 RBD(서열 319~541 아미노산)를 포함하는 스파이크1(S1, 서열 1~685 아미노산)과 스파이크2(S2, 서열 686~1273 아미노산)으로 구성되고, 각 부위별로 기능성 영역(FP, HR1, CH, CD 도메인 등)을 포함하고 있다. 이에 근거하여 항원결정부위 결정을 위한 S2 절단변이 단백질은 각 도메인 위치를 기준으로 설계하였으며, 총 11종의 재조합 단백질을 준비하였고 다음과 같이 명명하였다. S2p1, S2p2, S2p2-1, S2p2-1-1, S2p2-2, S2p2-3, S2p2-4, S2p3, S2p4, S2p5, S2p6. 각 재조합 단백질의 말단에는 His 아미노산이 10번 반복된 표지자(His)를 발현시켰다
도 11은 11종의 SARS-CoV-2 스파이크2(S2) 절단변이 재조합 단백질을 발현하고, 4A5 항체로 웨스턴 블롯팅하여 항원결정부위를 결정한 결과이다. S2 절단변이 단백질(S2p1, S2p2, S2p2-1, S2p2-1-1, S2p2-2, S2p2-3, S2p2-4, S2p3, S2p4, S2p5, S2p6) 발현 벡터(pET28a-S2p1 등)을 대장균에 형질도입 후 발현을 유도하고, 그 세포 파쇄액과 상업적으로 사용되는 S2 단백질(Sino Biological사)을 환원성 12% SDS-PAGE에 전개시킨 후 PVDF 멤브레인에 이동시키고 4A5 항체로 항원결정부위를 내포하고 있는 특정 S2 절단변이 단백질을 확인하였다. 이 결과를 바탕으로 Spike 단백질의 S2 서열 중 1109 내지 1133번째 아미노산(FYEPQIITTDNTFVSGNCDVVIGIV) 부위가 4A5 항체의 항원결정부위임을 확인하였다. 양성대조군으로 항-His 항체를 이용하여 재조합 단백질의 올바른 발현을 확인하였고, Spike 단백질의 1142~1158번째 아미노산 서열을 항원결정부위로 가지며 상업적으로 사용되는 항-S2 항체인 NBP2-90999(Novus사)를 항체양성대조군으로 이용하여 His-S2p2-1(686~1177 AA)과 His-S2p6(1042~1237 AA)에만 결합한 결과를 통해, 재조합 단백질들의 올바른 발현을 재확인하였다.
도 12는 SARS-CoV-2가 숙주세포의 막관통 프로테아제 세린2(transmembrane protease serine subtype 2, TMPRSS2)에 의한 스파이크(S) 단백질의 절단으로 스파이크2(S2) 부위가 세포 표면과 직접 접촉됨으로써 숙주세포 내로 침입하는 사실을 바탕으로, 항-S2 4A5 항체가 S2 항원에 결합하여 숙주세포 내로 유사 타입 렌티바이러스(SARS-CoV-2 spike pseudotype lentivirus-Luc.)가 침입하는 것을 억제시키는 현상을 확인한 결과이다. 루시퍼레이즈를 생산하는 SARS-CoV-2 스파이크 유사 타입 렌티바이러스(SARS-CoV-2 spike pseudotype lentivirus-Luc.)를 순차 희석한 4A5 항체와 혼합 반응시키고, 바이러스의 스파이크 단백질과 최초 접촉하는 숙주세포 수용체 단백질인 ACE2를 세포 표면에 과발현하는 인간배아신장세포(HEK293T/ACE2)에 처리한 후 발현된 루시퍼레이즈 활성을 측정하여 검증하였다. 비선형 회귀 분석(Non-linear Regression)한 결과, 4A5 항체의 반수저해농도(IC50, inhibitory concentration 50)가 22.57 nM 분석되었고, 음성대조군인 동일 아형 항체(IgG2a 단일클론 항체)는 감염억제력을 보이지 못하였다.
도 13 내지 14는 신규 4A5 항체의 중쇄변이영역(VH)와 경쇄변이영역(VL)의 상보성결정지역(CDR)을 분석한 결과이다. 4A5 항체 생성 B 세포 하이브리도마로부터 추출한 총 RNA(total RNA)에 대해 상보성 DNA(complementary DNA, cDNA)를 합성하고, 중쇄변이영역 상보성결정지역 프라이머와 경쇄변이영역 상보성결정지역 프라이머를 사용 중합효소연쇄반응(polymerase chain reaction, PCR)으로 증폭한 후 T-벡터에 접합(ligation)하여 재조합 플라스미드를 제조하였다. 재조합 플라스미드를 숙주세포에서 증폭시키고, 추출하여 상보성결정지역 해당 부위를 염기서열 분석하였다. 분석된 염기서열로부터 단백질서열을 확인하고, KaBat CDR 정의를 바탕으로 CDR 서열을 결정하였다.
도 2는 항-Spike2 항체 1G1과 4A5가 카파경쇄를 가진 아형이 IgG2a 항체임을 확인한 결과이다. 마우스 항체 아형(IgG1, IgG2a, IgG2b, IgG3, IgA, IgM) 특이반응 항-마우스 포획항체가 코팅된 ELISA 플레이트에 1G1, 4A5 하이브리도마 배양액을 처리하고, 항-마우스-IgG+IgA+IgM-HRP(horseradish peroxidase) 항체로 프로빙한 후 기질용액 TMB(3, 3', 5, 5'-Tetramethyl-benzidine)를 이용하여 발색시켰으며 IgG2a와 카파경쇄부 포획항체를 가진 웰에서 두드러지게 발색되었다.
도 3 내지 4는 발굴된 1G1, 4A5 항-Spike2 항체의 S2 항원 특이성을 확인한 결과이다. 도 3은 ELISA 방법으로 Sino Biological사가 생산/판매하여 코로나바이러스 관련 연구에 이용되고 있는 SARS-CoV-2 유래 스파이크1(S1), 스파이크2(S2), 뉴클레오캡시드(NP), 스파이크 단백질 내 수용체 결합 도메인(RBD) 항원 재조합 단백질이 각각 코팅된 웰에 Protein G 레진으로 정제한 2종의 항-Spike2 항체 1G1과 4A5를 첨가하고, 결합된 항체를 항-마우스 IgG-HRP(anti-mouse IgG-HRP, CST 사) 항체로 검출하였다. 도 4는 도3의 항원 단백질을 정제된 2종의 항-Spike2 항체 1G1과 4A5를 1차 항체로 처리한 웨스턴 블롯팅 결과로, 도 3의 결과에서 스파이크2(S2) 항원에 낮은 반응성을 보인 1G1 항체는 본 기법으로 특정항원에 반응하지 못하였고, 4A5 항체는 S2 항원만을 특이적으로 결합하였다.
도 5 내지 6은 4A5 항체가 도 3 내지 4에 기술한 정제된 재조합 항원 단백질뿐 만 아니라 세포내 발현 항원 단백질도 특이적으로 결합함을 확인한 결과이다. 도 5는 상업적으로 이용되는 SARS-CoV-2 Spike-10xHis/pCMV3 플라스미드를 인간신장상피세포(HEK293T)에 형질도입하여 발현시키고, 세포파쇄액을 환원성 12% SDS-PAGE에 전개시킨 후 PVDF(Polyvinylidene fluoride) 멤브레인에 이동시켜 4A5 항체로 특정단백질을 검출한 웨스턴 블롯 결과이다. 양성대조군 항체로 항-His 항체를 처리하여 Spike-His 단백질이 세포내에서 번역 후 변형(post-translational modification) 과정을 거쳐 예측된 분자량인 142.86 kDa 보다 큰 분자량으로 발현되었음을 확인하였고, 4A5 항체가 항-His 항체와 동일한 위치의 단백질과 결합함을 확인하였다. 도 6은 인간배아신장세포(HEK293T)에 SARS-CoV-2 스파이크(서열 1~1213 아미노산)/pGFP-N1 벡터를 형질도입하여 발현시키고, 세포 고정화 및 투과화(fixation & permeabilization) 후 4A5항체로 면역형광염색(immunofluorescence staining)을 실시하여 세포내 발현된 Spike-GFP 단백질에 항-마우스-IgG-로다민(Rhodamine)로 탐침 된 4A5 항체가 결합함을 확인 한 결과이다. 음성대조군으로 pGFP-N1 벡터를 형질도입하여 발현시킨 GFP 발현세포에는 4A5 항체가 결합하지 않는 반면, Spike-GFP가 발현된 세포에서는 GFP가 검출되는 동일 세포내 위치에 4A5 항체가 반응함을 확인하여 세포 내에서 발현하는 스파이크 단백질을 4A5가 특이적으로 검출할 수 있음을 검증하였다.
도 7은 도 5 내지 6의 세포내 항원에 대한 4A5 항체의 특이반응성을 이용하여 상업적으로 사용되는 SARS-CoV-2 Spike-His/pCMV3(Sino biological사)를 인간신장세포(HEK293T)에 형질도입하여 발현시킨 세포파쇄액을 4A5 항체와 혼합한 후 Protein G 레진으로 항체를 포획하여, 항체가 세포 내 발현된 항원을 검출함을 확인한 결과이다. 음성대조군으로 SARS-CoV-2 spike를 코딩하고 있지 않은 벡터(pCMV3: VC)를 형질도입한 세포파쇄액이 사용되었고, 4A5 항체의 음성대조항체로는 동일 아형(IgG2a) 항체를 동일 세포파쇄액과 혼합하여 비교하였다. SARS-CoV-2 면역화 마우스 유래 항체인 4A5에 의해 검출될 수 있는 비특이 결합 단백질을 배제하기 위해 일차 항체 처리 전 항- 래빗-IgG-HRP 항체를 처리하여 특이 단백질 밴드가 검출되지 않음을 먼저 확인하였고, 탐침자로 래빗-항-His 항체를 이용하여 발현된 Spike-His 단백질을 검출하였다. 그 결과, 4A5 항체의 면역침강능을 확인하였다.
도 8은 4A5 항체와 상업적으로 이용되는 항-Spike2 항체인 NBP2-90999 항체의Spike2(S2) 항원결합능을 비교한 ELISA결과이다. 상업적으로 이용되는 S2 항원 재조합 단백질(Sino Biological사)을 동량 코팅하고 20 nM 농도부터 순차 희석된 4A5 및 NBP2-90999 항체의 항원 결합 정도를 비선형 회귀 분석(non-linear regression)한 결과, 4A5 항체와 NBP2-90999 항체의 Spike2 항원에 대한 반수영향농도(EC50, effective concentration 50)가 각각 8.562 nM과 470.5 nM로 분석되었고, 이를 바탕으로 4A5 항체가 항원에 대한 결합력이 NBP2-90999 항체에 비교하여 약 55배 높음을 확인하였다.
도 9는 신규 항-Spike2 4A5 항체가 SARS-CoV-2 용해물을 검출할 수 있음을 보여주는 결과이다. 불활화한 SARS-CoV-2 용해물을 코팅항원으로 사용한 ELISA 분석으로, Spike2 재조합 단백질에 반응성을 보인 NBP2-90999 항-Spike2 항체가 실제 불활화한 SARS-CoV-2 용해물에는 반응성이 없는 반면, 신규 4A5 항체는 높은 반응성을 가진 것으로 확인되었다.
도 10은 항-SARS-CoV-2 Spike2 항체인 4A5 항체의 정교한 항원결정부위를 결정하기 위해 발현한 S2 절단변이 재조합 단백질들의 구성 부위를 표기한 모식도이다. 스파이크 단백질(서열 1~1273 아미노산)은 숙주세포 표면에 존재하는 ACE2 수용체와 결합하는 RBD(서열 319~541 아미노산)를 포함하는 스파이크1(S1, 서열 1~685 아미노산)과 스파이크2(S2, 서열 686~1273 아미노산)으로 구성되고, 각 부위별로 기능성 영역(FP, HR1, CH, CD 도메인 등)을 포함하고 있다. 이에 근거하여 항원결정부위 결정을 위한 S2 절단변이 단백질은 각 도메인 위치를 기준으로 설계하였으며, 총 11종의 재조합 단백질을 준비하였고 다음과 같이 명명하였다. S2p1, S2p2, S2p2-1, S2p2-1-1, S2p2-2, S2p2-3, S2p2-4, S2p3, S2p4, S2p5, S2p6. 각 재조합 단백질의 말단에는 His 아미노산이 10번 반복된 표지자(His)를 발현시켰다
도 11은 11종의 SARS-CoV-2 스파이크2(S2) 절단변이 재조합 단백질을 발현하고, 4A5 항체로 웨스턴 블롯팅하여 항원결정부위를 결정한 결과이다. S2 절단변이 단백질(S2p1, S2p2, S2p2-1, S2p2-1-1, S2p2-2, S2p2-3, S2p2-4, S2p3, S2p4, S2p5, S2p6) 발현 벡터(pET28a-S2p1 등)을 대장균에 형질도입 후 발현을 유도하고, 그 세포 파쇄액과 상업적으로 사용되는 S2 단백질(Sino Biological사)을 환원성 12% SDS-PAGE에 전개시킨 후 PVDF 멤브레인에 이동시키고 4A5 항체로 항원결정부위를 내포하고 있는 특정 S2 절단변이 단백질을 확인하였다. 이 결과를 바탕으로 Spike 단백질의 S2 서열 중 1109 내지 1133번째 아미노산(FYEPQIITTDNTFVSGNCDVVIGIV) 부위가 4A5 항체의 항원결정부위임을 확인하였다. 양성대조군으로 항-His 항체를 이용하여 재조합 단백질의 올바른 발현을 확인하였고, Spike 단백질의 1142~1158번째 아미노산 서열을 항원결정부위로 가지며 상업적으로 사용되는 항-S2 항체인 NBP2-90999(Novus사)를 항체양성대조군으로 이용하여 His-S2p2-1(686~1177 AA)과 His-S2p6(1042~1237 AA)에만 결합한 결과를 통해, 재조합 단백질들의 올바른 발현을 재확인하였다.
도 12는 SARS-CoV-2가 숙주세포의 막관통 프로테아제 세린2(transmembrane protease serine subtype 2, TMPRSS2)에 의한 스파이크(S) 단백질의 절단으로 스파이크2(S2) 부위가 세포 표면과 직접 접촉됨으로써 숙주세포 내로 침입하는 사실을 바탕으로, 항-S2 4A5 항체가 S2 항원에 결합하여 숙주세포 내로 유사 타입 렌티바이러스(SARS-CoV-2 spike pseudotype lentivirus-Luc.)가 침입하는 것을 억제시키는 현상을 확인한 결과이다. 루시퍼레이즈를 생산하는 SARS-CoV-2 스파이크 유사 타입 렌티바이러스(SARS-CoV-2 spike pseudotype lentivirus-Luc.)를 순차 희석한 4A5 항체와 혼합 반응시키고, 바이러스의 스파이크 단백질과 최초 접촉하는 숙주세포 수용체 단백질인 ACE2를 세포 표면에 과발현하는 인간배아신장세포(HEK293T/ACE2)에 처리한 후 발현된 루시퍼레이즈 활성을 측정하여 검증하였다. 비선형 회귀 분석(Non-linear Regression)한 결과, 4A5 항체의 반수저해농도(IC50, inhibitory concentration 50)가 22.57 nM 분석되었고, 음성대조군인 동일 아형 항체(IgG2a 단일클론 항체)는 감염억제력을 보이지 못하였다.
도 13 내지 14는 신규 4A5 항체의 중쇄변이영역(VH)와 경쇄변이영역(VL)의 상보성결정지역(CDR)을 분석한 결과이다. 4A5 항체 생성 B 세포 하이브리도마로부터 추출한 총 RNA(total RNA)에 대해 상보성 DNA(complementary DNA, cDNA)를 합성하고, 중쇄변이영역 상보성결정지역 프라이머와 경쇄변이영역 상보성결정지역 프라이머를 사용 중합효소연쇄반응(polymerase chain reaction, PCR)으로 증폭한 후 T-벡터에 접합(ligation)하여 재조합 플라스미드를 제조하였다. 재조합 플라스미드를 숙주세포에서 증폭시키고, 추출하여 상보성결정지역 해당 부위를 염기서열 분석하였다. 분석된 염기서열로부터 단백질서열을 확인하고, KaBat CDR 정의를 바탕으로 CDR 서열을 결정하였다.
이하 본 발명을 실시예 및 실험예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나 이들 실시예 및 실험예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예 및 실험예에 한정되는 것은 아니다.
실시예 1. 불활화 SARS-CoV-2 면역화 마우스 유래의 항-스파이크2(Spike2, S2) 항체의 Spike2(S2) 항원 반응성 확인
항-SARS-CoV-2 항체를 분비하는 하이브리도마를 생성하기 위해, 본 발명자는 항원으로서 베타프로락톤(betapropiolactone)으로 불활화시킨 SARS-CoV-2를 사용했다. 6주령의 암컷 BALB/c 마우스를 오리엔트바이오(경기도, 대한민국)에서 구입하여 무균시설에 사육했다. 불활화 SARS-CoV-2 (NMC-nCoV02, 2020년 2월 한국에서 COVID-19 환자로부터 확보한 분리주)를 마우스에 2주 간격으로 발바닥 주사로 TiterMax Gold 보조제(Sigma-Aldrich사)와 혼합하여 회당 10 μg의 바이러스를 총 3회 면역화 하였다. 최종 면역화 2주 후에, 면역세포를 림프절로부터 분리하고 Anti-SARS-CoV-2 항체를 생성하는 B 세포 하이브리도마를 제조하는데 사용하였다. 마우스 골수종세포인 Follicular (F0) 세포와의 융합은 일반적인 B 세포 하이브리도마 제조법 및 HAT (hypoxanthine-aminopterin-thymidine medium) 배지 선별법에 따라 수행하였다.
클론을 형성한 세포들만을 선별 배양하고, 선별된 479종의 초기 클론 세포배양액으로 SARS-CoV-2의 스카이프 단백질(서열 1~1273 아미노산) 중 스파이크2 부위 (S2, 서열 686~1273 아미노산) 재조합 단백질 항원에 대한 반응성을 확인하여 항-S2 단일클론 항체를 선별하였다(도 1). 이후 반응성이 확인된 B 세포 하이브리도마들을 배양하고, 3차에 걸친 제한희석법을 실시하면서 항체를 안정적으로 생산하는 단일클론 하이브리도마 세포를 선별하였으며, 최종적으로 1G1, 4A5 클론을 선별하였다.
실시예 2. 선별된 항-SARS-COV-2 스파이크2(Sike2, S2)
항체의 아형 결정
항-SARS-COV-2 S2 항원 특이반응성으로 선별된 1G1, 4A5 단클론항체의 아형을 마우스 항체 아형 키트(isotyping Kit; Pierce사)를 이용하여 결정하였다. 마우스 항체 아형(IgG1, IgG2a, IgG2b, IgG3, IgA, IgM) 특이반응 항-마우스 포획항체가 코팅된 ELISA 플레이트에 1G1, 4A5 하이브리도마 배양액을 TBS(Tris-buffered saline)에 1/50 희석하여 웰 당 50 μl를 처리하고, 동시에 항-마우스-IgG+IgA+IgM-HRP 항체를 처리하여 1시간 동안 반응을 유도한 후 TMB(3, 3', 5, 5'-Tetramethyl-benzidine)를 이용한 발색 반응을 수행하였다.
그 결과, 2 종의 항- SARS-COV-2 S2 항체는 모두 kappa 타입의 경쇄를 포함하는 Ig2a 타입의 아형으로 확인되었다(도 2).
실시예 3. SARS-CoV-2 유래 항원에 대한 항-SARS-COV-2 스파이크2(Spike2, S2) 항체의 반응성 확인
발굴된 항-SARS-COV-2 S2 항체의 항원 특이 반응성을 ELISA 및 웨스턴 블롯 방식으로 확인하였다.
구체적으로, SARS-CoV-2항원을 재조합 단백질로 발현한 S1(Spike 단백질 서열 1~687 아미노산), S2(Spike 단백질 서열 686~1273 아미노산), NP(nucleocapsid 단백질 서열 1~419 아미노산), RBD (Spike 단백질 서열 319~541 아미노산) 재조합 단백질(Sino Biological사)을 96-웰 Maxisorp ELISA 플레이트의 각 웰에 100 ng씩 100 μl의 TBS, pH 7.4 용액에 희석 후 첨가하여 4℃에서 16시간 동안 코팅하였다. 코팅 후, 잉여 항원을 제거하고 TBST 버퍼에 5% 스킴 밀크(skim milk)를 녹인 블로킹버퍼를 각 웰 당 300 μl씩 첨가하여 실온에서 2시간 동안 블로킹하였다. 블로킹 후 1G1과 4A5항체를 블로킹버퍼에 1 μg/mL 농도로 희석하여 웰 당 100 μl씩 1차 항체로 처리하였다. 반응 후 잉여 항체들은 TBST로 4회 세척하여 제거하였다. 2차 항체로는 항-마우스 IgG-HRP(anti-mouse IgG-HRP, CST사)를 블로킹 용액에 1/2500의 비율로 희석하여 100 μl 처리하고 37℃에서 90분 동안 반응시켰다. 반응 후에는 다시 TBST로 4회 세척하고, TMB 용액을 100 μl씩 첨가하여 HRP 반응을 진행시킨 후 450 nm에서 흡광도를 측정하여 선별된 1G1, 4A5 항체의 항원 특이성을 확인하였다.
그 결과, 1G1 및 4A5 항체는 모두 S1, NP, RBD 항원에 비해 S2 항원에 대한 높은 특이성을 보였다. 하지만, S2 항원에 반응은 4A5 항체가 매우 높은 수준을 유지하는 반면, 1G1 항체의 경우 S2 항원에 친화성을 보이긴 하나 결합력이 크지 않았다(도 3).
또 다른 방식으로는 S1, S2, NP, RBD 재조합 단백질에 대한 반응성을 웨스턴블럿팅으로 확인하였다. 구체적으로는 S1, S2, NP, RBD 재조합 단백질 10 ng씩을 환원성 12% SDS-PAGE 조건에서 전개하고, PVDF 멤브레인으로 이동시켰다. 단백질이 이동된 멤브레인은 5% (w/v) 스킴 밀크(skim milk)를 포함하는 TBS 용액에 담가 블로킹한 후, 2종의 정제 항체인 1G1, 4A5를 0.5 μg/ml의 농도로 블로킹 용액에 희석하여 1차 항체를 처리하였다. 1차 항체 처리 후 TBST(0.1%(v/v) tween-20 포함하는 TBS)로 충분히 세척하고 2차 항체로 항-마우스 IgGAM-HRP를 처리한 후 증강화학발광(Enhanced Chemi-Luminescence: ECL)법으로 항체반응 단백질 밴드를 확인하였다.
그 결과, 4A5 항체는 59.37 kDa의 분자량을 갖는 S2 항원 밴드를 검출할 수 있었으며, S1을 포함한 다른 항원들에 대해서는 반응하지 않았다. 이에 비해 1G1 항체는 해당 조건에선 S2 항원과 반응성이 확인되지 않았으며, 이는 앞선 ELISA실험에서 확인한 바와 같이 S2항원에 대한 낮은 친화력 때문인 것으로 추정하였다(도 4). 이에 항-S2 항체 확인을 위한 후속 실험은 4A5 항체에 대해서만 실시하였다.
실시예 4. 세포 발현 SARS-CoV-2 스파이크(Spike, S) 항원에 대한 항-스파이크2(Spike2, S2) 항체 4A5 반응특이성 확인
항-S2 항체 4A5의 세포 발현 SARS-CoV2 Spike 단백질에 대한 반응 특이성 확인을 위해서 웨스턴 블롯 및 형광염색을 실시하였다.
구체적으로, Spike-10xHis 발현벡터를 PEI(polyethylenimine)를 이용하여 인간 신장 상피세포(HEK293T)에 형질도입하였다. 72시간 후에 세포를 수집하여 RIPA 버퍼[PBS containing 1.0 % (v/v) NP40, 0.1% Sodium Dodecyl Sulfate, 0.5% Sodium Deoxycholate, protease inhibitor cocktail(Roche사)]에 녹여 단백질 분석 시료로 사용하였다. 세포 파쇄액의 단백질 정량은 Bradford 방법으로 실시하였다. 준비된 단백질 시료는 20 μg씩 환원성 12% SDS-PAGE 조건에서 전개하였고, PVDF 멤브레인으로 이동시켰다. 단백질이 이동된 멤브레인은 5% (w/v) 스킴 밀크(skim milk)를 포함하는 TBS 용액에 담가 블로킹한 후, 정제한 항-S2 항체 4A5(0.5 μg/mL) 혹은 마우스 항-6xHis 항체(1:5000, Qiagen사)를 블로킹 용액에 희석하여 1차 항체로 처리하였다. 1차 항체 처리 후 TBST(0.1%(v/v) tween-20 포함하는 TBS)로 충분히 세척하고 2차 항체로 항-마우스 IgG-HRP를 처리한 후 증강화학발광(enhanced chemi-luminescence, ECL)법으로 항체반응 단백질 밴드를 확인하였다.
그 결과, 세포 파쇄액에 포함된 세포 유래 단백질들에 대한 비특이반응 없이 세포 내에서 번역 후 변형 과정을 거쳐 예측된 분자량인 142.86 kDa 보다 큰 분자량으로, Spike-10xHis 단백질을 항-6xHis 항체 결합밴드와 동일한 위치에서 4A5 항-S2 항체 결합 밴드가 확인되었다(도5).
또한, 형광면역염색법의 실시를 위해 Spike 항원(1-1213)-GFP 발현벡터를 PEI를 이용하여 인간 신장상피 세포(HEK293T)에 형질도입하였다. 72시간 후에 고정화 및 투과화(fixation & permeabilization) 시키고 세포면역염색을 실시하였다(도6).
구체적으로, 6-웰 플레이트를 이용하여 1x105 개의 Spike 항원(1-1213)-GFP 발현 인간배아신장세포(HEK293T)들을 커버슬라이드 위에 배양하고, PBS로 1회 세척한 후, 2% paraformaldehyde를 포함하는 PBS 용액에 실온에서 20 분간 처리하여 고정화 시키고, 0.1% Triton X-100과 0.1% (w/v) BSA(bovine serum albumin)을 포함하는 PBS로 실온에서 20 분간 처리하여 투과화시켰다. 반응 후에는 0.1 % (w/v) BSA(bovine serum albumin) 및 0.1% (w/v) 사포닌(saponin)을 포함하는 PBS 세척 용액으로 2회 세척하고, 1% (w/v) BSA를 포함하는 PBS 블로킹 용액을 실온에서 30분간 처리한 후 5 μg/ml 농도의 4A5 항-S2 항체를 실온에서 1시간 동안 처리하였다. 반응 후, 다시 세척을 3회 실시하고 항-마우스 Igs-로다민(anti-mouse Igs-Rhodamine, Abcam사) 용액으로 실온에서 1시간 동안 반응시켰다. 다시 3회 세포 세척을 진행하고, 핵을 염색하기 위해 DAPI(4',6-diamidino-2-phenylindole)를 포함하는 50 μl의 마운팅액 (Vectashield 사)을 이용해 슬라이드 글라스 위에 항체로 염색된 커버슬라이드를 고정화 시킨 후 형광현미경으로 4A5항체의 세포 내 발현하는 spike 항원에 대한 반응성을 확인하였다.
그 결과, 항-Spikie2(S2) 항체 4A5가 세포 유래 단백질들에 대한 비특이반응 없이 세포 내에서 발현하는 Spike-GFP 재조합 항원에만 반응함을 확인하였다(도6).
실시예 5. 세포 내에서 발현하는 SARS-CoV-2 스파이크(Spike, S) 항원에 대한 항-스파이크2(Spike2, S2) 항체 4A5의 면역침강능 확인
실시예 4의 세포 내에서 발현하는 바이러스 항원에 대한 4A5 항체의 특이반응성을 확인하고 4A5 항체의 스파이크(S) 항원에 대한 면역침강능을 검증하였다.
구체적으로, Spike-10xHis(S-His) 발현 벡터를 PEI를 이용하여 인간배아신장세포(HEK293T)에 형질도입하여 발현을 유도하고, 72시간 후에 세포를 수집하여 RIPA 버퍼[PBS containing 1.0% (v/v) NP40, 0.1% Sodium Dodecyl Sulfate, 0.5% Sodium Deoxycholate, protease inhibitor cocktail(Roche사)]에 녹여 면역침강 단백질 분석 시료로 사용하였다. 세포 파쇄액을 Bradford 방법으로 정량하였고, 800 ug의 단백질 시료를 5 μg의 4A5 항체 혹은 동일 아형(IgG2a)의 대조군 항체와 혼합하여 4℃에서 16시간 동안 잘 섞어주면서 항원-항체 결합을 유도하였다. 항원에 결합된 항체는 Protein G 레진(Santa cruz 사)으로 4℃에서 4시간 포획하였다. 포획반응 후 레진을 RIPA 버퍼로 충분히 세척하고 40 ul의 SDS-PAGE 샘플버퍼를 첨가하고 100℃에서 가열하여 항원을 포함하는 면역침강 단백질 시료를 준비하였다. 단백질 시료를 환원성 12% SDS-PAGE 조건에서 전개하고, PVDF 멤브레인에 이동시킨 후 먼저, 항-래빗-IgG-HRP (anti-rabbit-IgG-HRP)로 웨스턴 블롯하여 비특이 검출 단백질 밴드가 존재하지 않음을 확인한 후 래빗 항-6xHis 항체(Rabbit anti-6xHis-mAb, Sigma-Aldrich사)를 1차 항체로 처리하였다. 1차 항체 처리 후 TBST(0.1%(v/v) tween-20 포함하는 TBS)로 충분히 세척하고 2차 항체로 항-래빗 IgG-HRP를 처리한 후 증강화학발광(ECL)법으로 면역침강 단백질 밴드를 확인하였다.
그 결과, 4A5 항체를 이용한 면역침강시료에서만 Spike-10xHis 단백질이 래빗 항-6xHis 항체에 의해 검출됨을 확인하여, 4A5 항체의 항원면역침강능을 확인하였다(도 7).
실시예 6. 항-스파이크2(Spike2, S2) 항체 4A5 의 Spike2(S2) 항원 결합능
현재까지 보고된 SARS-CoV-2 S2 단백질의 항체들은 다음과 같은 서열을 항원결정부위로 가지고 있다; MA5-35946(S2 서열 1029-1192 아미노산), PA5-112048(S2 서열 C-말단부 20개 아미노산), NBP2-90999(S2 서열 1142~1158 아미노산). 이에 4A5 단클론 항체와 상용 항-S2 항체인 NBP2-90999 항체의 S2 항원결합능을 비교하였다.
구체적으로, 96-웰 Maxisorp ELISA 플레이트의 각 웰에 100 ng의 S2 단백질(Sino Biological 사)을 웰 당 100 μl의 TBS, pH 7.4 용액에 희석 후 첨가하여 4℃에서 16시간 코팅하였다. 코팅 후, 잉여 항원을 제거하고 TBST 버퍼에 5% 스킴 밀크(skim milk)를 녹인 블로킹버퍼를 각 웰 당 300 μl씩 첨가하여 실온에서 2시간 동안 블로킹하였다. 블로킹 후 2종의 항-S2 항체 4A5와 NBP2-90999항체를 블로킹 버퍼에 20 nM부터 순차 희석한 용액을 웰 당 100 μl씩 1차 항체로 처리하였다. 반응 후 잉여 항체들은 TBST로 4회 세척하였다. 2차 항체로는 항-마우스 IgG-HRP(anti-mouse IgG-HRP, CST사)를 블로킹 용액에 1/2500의 비율로 희석하여 100 ul 처리하고 37℃에서 90분 동안 반응시켰다. 반응 후에는 다시 TBST로 4회 세척하고, TMB 용액을 100 μl씩 첨가하여 HRP 반응을 진행시킨 후 450 nm에서 흡광도를 측정하여 4A5 항체와 NBP2-90999 항체의 항원 결합능을 비교하였다.
그 결과, 4A5 항체의 EC50(effective concentration)값은 8.562 pM이었고, NBP2-90999 항체의 EC50값은 470.5 pM로 확인되었고, 새롭게 발굴된 4A5 항체가 NBP2-90999 항체보다 약 55배 높은 S2 항원 결합능을 보였다(도8).
실시예 7. 항-스파이크2(Spike2, S2) 4A5 단일클론 항체를 이용한 SARS-CoV-2 바이러스 진단
신규 항-S2 4A5 항체가 실제 SARS-CoV-2 바이러스를 검출하는데 사용할 수 있는지 확인하기 위해, 불활화한 SARS-CoV-2 용해물을 이용하여 확인하였다. 불활화 SARS-CoV-2 용해물(Native Antigen사)을 웰 당 500 ng으로 하여 4℃에서 16시간 동안 부착한 후, 4A5 항체와 NBP2-90999 항체를 3 μg/mL의 농도부터 순차희석하여 1차 항체로 처리하였다. 반응 후 잉여 항체들은 TBST로 4회 세척하였다. 2차 항체로는 항-마우스 IgG-HRP(anti-mouse IgG-HRP, CST사)를 블로킹 용액에 1/1000의 비율로 희석하여 웰 당 100 μl 처리하고 37℃에서 90분 동안 반응시켰다. 반응 후에는 다시 TBST로 4회 세척하고, TMB 용액을 웰 당 100 μl씩 첨가하여 HRP 반응을 진행시킨 후 450 nm에서 흡광도를 측정한 결과, 4A5 항체만이 SARS-CoV-2 용해물에 결합하는 것을 확인하였다(도 9).
이러한 결과를 통해, 신규 4A5 항체를 SARS-CoV-2 용해물을 진단하는데 사용할 수 있음을 확인하였다.
실시예 8. SARS-CoV-2의 스파이크(Spike, S) 단백질에서 항-스파이크2(Spike 2, S2) 항체 4A5의 항체결합부위 결정(Epitope Mapping)
SARS-CoV-2의 구조 단백질 중 하나인 스파이크(S) 단백질은 1273개의 아미노산으로 구성되어 있으며, 감염과정에서 숙주세포의 세포막에 존재하는 ACE2와 결합하는 RBD(S 서열 319~541 아미노산) 부위를 포함하는 스파이크1(S1, 서열 1~685 아미노산)과 스파이크2(S2, 서열 686~1273 아미노산)으로 구성되어 있다. 4A5 항체는 실시예 3의 결과로 구조단백질인 스파이크의 S2 부위에 특이적으로 결합함을 확인하였고, 이를 바탕으로 4A5 항체의 보다 정교한 항원결정부위를 결정하였다.
구체적으로 11종의 다양한 아미노산 길이의 S2 도메인 절편 변이체 재조합 단백질을 제조하였다. 도10은 발현된 S2 재조합단백질들이(S2p1, S2p2, S2p2-1, S2p2-1-1, S2p2-2, S2p2-3, S2p2-4, S2p3, S2p4, S2p5, S2p6) 갖는 아미노산 서열 부위를 나타낸다. 이를 위해 표1에 표기된 각각의 특이 프라이머들과 pfu DNA 중합효소(Biofact사)를 이용하여 SARS-CoV-2Spike Gene ORF cDNA clone expression plasmid, C-His tag(Sino Biological사) 10 ng을 주형으로 PCR 반응을 진행하였다. 확보된 유전자와 pET28a(+) 벡터(Novagen사)를 제한효소(NdeI/XhoI 혹은 NheI/XhoI)로 37℃에서 15 시간 처리한 후, 절단된 유전자와 벡터를 일정비율로 혼합하여 라이게이즈(Roche사)를 첨가한 후 16℃에서 16 시간 동안 접합반응을 진행하였다. 접합반응 혼합물은 DH5α에 형질전환시키고 카나마이신 항생제를 포함한 LB제한배지 플레이트에 도말하여 37℃에서 15 시간 배양하였다. 플레이트에 자란 콜로니를 선택하여 LB제한액체배지에 배양하여 증폭된 재조합 플라스미드를 분리하였으며, 분리된 플라스미드의 염기서열을 확인한 후 T7 SHuffle(DE3, NEB 사) 균주에 다시 형질전환하여 S2 절편 재조합 단백질들을 발현시켰다. 단백질은 IPTG 첨가로 발현이 유도되었고, IPTG 첨가 후 25℃에서 16시간 배양한 세포들을 초음파 분쇄한 상등액으로부터 확보하였다. 각각의 상등액을 환원성 12% SDS-PAGE 조건에서 전개하고 PVDF 멤브레인에 이동시킨 후 마우스 항-6xHis 항체(Mouse anti-6xHis-mAb, Qiagen사)와 4A5 항-S2 항체 또는 상용 항-S2 항체(NBP2-90999, Novus 사)를 1차 항체로 처리하였다. 1차 항체 처리 후 TBST(0.1%(v/v) tween-20 포함하는 TBS)로 충분히 세척하고 2차 항체로 항-마우스 IgG-HRP를 처리한 후 증강화학발광(ECL)법으로 검출 단백질 밴드를 확인하였다.
| 프라이머 | 서열 | |||
| 1 | S2 F | 5' | agctcagCATATGTCTGTGGCAAGCCAGAGCAT | 3' |
| 2 | S2p1 R | 5' | ataCTCGAGttaCATACAACACAGCATTATGGTC | 3' |
| 3 | S2p2 R | 5' | ataCTCGAGttaTTCATATTTGCCCAGTTCTTGG | 3' |
| 4 | S2p2-1 R | 5' | ataCTCGAGttaCACCACAGAGGCATTGATGC | 3' |
| 5 | S2p2-2 R | 5' | ataCTCGAGttaTTCAGGTTGGAGTGGGTCATA | 3' |
| 6 | S2p2-2-1 R | 5' | ataCTCGAGttaCACAATGCCAATCACCACATCA | 3' |
| 7 | S2p2-3 R | 5' | ataCTCGAGttaGTTCCTCTGGGTCACAAACC | 3' |
| 8 | S2p2-4 R | 5' | ataCTCGAGttaGAAGTTCTTCTCCTGGGCAG | 3' |
| 9 | S2p3 R | 5' | ataCTCGAGttaGTCCACCCTCTTGCTTTGTC | 3' |
| 10 | S2p4 R | 5' | ataCTCGAGttaGTCTCCATATTGCTTGATGAAG | 3' |
| 11 | S2p5 R | 5' | ataCTCGAGttaGTCAGGCAGAATCTGGCTGA | 3' |
| 12 | S2p6 F | 5' | ctagaGCTAGCATGTTCTGTGGCAAGGGCTACCA | 3' |
| 13 | S2p6 R | 5' | ataCTCGAGttaTTCATATTTGCCCAGTTCTTGG | 3' |
| 14 | IgG2a 중쇄 F | 5' | cttccggaattcSARGTNMAGCTGSAGSAGTCWGG | 3' |
| 15 | IgG2a 중쇄 R | 5' | ggaagatctCTTGACCAGGCATCCTAGAGT | 3' |
| 16 | 카파 경쇄 F | 5' | gggagctcGAYATTGTGMTSACMCARWCTMCA | 3' |
| 17 | 카파 경쇄 R | 5' | ggtgcatgcGGATACAGTTGGTGCAGCATC | 3' |
그 결과, 4A5 항체는 S2-His(Sino Biological사)와 재조합 발현 단백질 His-S2p1(서열 686~1237), His-S2p2(서열 686~1207), His-S2p2-1(서열 686~1177), S2p2-2(서열 686~1144), His-S2p2-2-1(서열 686~1133), His-S2p6(서열 1042~1237)에 결합하였다. 이러한 결과로 SARS-CoV-2 스파이크 단백질의 아미노산 서열 중 1109~1133 아미노산(FYEPQIITTDNTFVSGNCDVVIGIV, 25개 아미노산) 부위를 4A5 항체의 항원결정부위로 결정하였다(도 11).
또한 실시예 6과 7에서 4A5 항체와 사용된 상용화 항체 NBP2-90999 항체를 비교 실험하였다. NBP2-90999 항체는 His-S2p2-1(서열 686~1177 아미노산), His-S2p6(서열 1042~1237 아미노산) 재조합 단백질에 결합하는 것이 확인되어 보고된 항체 결합부위를 재확인하였다(도 11).
실시예 9. 항-스파이크2(Spike2, S2) 4A5 항체의 유사(Pseudo)-SARS-CoV-2 중화능
SARS-CoV-2의 구조단백질인 스파이크는 SARS-CoV-2 입자 표면에 존재한다. 스파이크 단백질은 숙주세포 수용체인 ACE2와의 직접 접촉을 매개하는 수용체 결합 도메인(RBD) 및 막관통 프로테아제 세린2(TMPRSS2)에 의한 단백질 분해로 절단되는 스파이크1(S1)과 스파이크2(S2) 단백질로 이루어진다. TMPRSS2는 원형질막 표면에서 스파이크 단백질을 분해하여 SARS-CoV-2 입자로부터 S1을 잘라내고 숙주세포의 세포막과 2차 접촉하여 융합되는 S2를 노출시킴으로써 숙주세포 내부로 바이러스의 침입을 촉진한다. S2 단백질 부위 중 노출되어 숙주의 세포막과 직접 접촉되는 S2 단백질에 존재하는 결합 도메인(CD)은 서열 1076~1141 아미노산으로 실시예 8의 결과로 확인한 4A5항체의 항원 결정부위(서열 1109~1133 아미노산)를 포함하고 있다. 이와 같은 사실을 바탕으로 항-S2 4A5 항체가 SARS-CoV-2 입자의 S2 부위에 결합하여 숙주세포 침입을 억제할 수 있는지 확인하기 위해, SARS-CoV-2 스파이크 유사타입 렌티바이러스(SARS-CoV-2 spike pseudotype lentivirus-Luc.)를 이용하였다. SARS-CoV-2 스파이크 유사타입 렌티바이러스는 SARS-CoV-2 스파이크 유전자와 생물발광(bioluminescence)을 일으키는 산화효소인 루시퍼레이즈(luciferase) 유전자를 코딩하고 있고, 숙주세포 내 침입 시 발현하는 루시퍼레이즈 발광값을 측정하여 숙주세포 침입 정도를 분석할 수 있다.
구체적으로, 96웰 세포배양 플레이트에SARS-CoV-2 스파이크 유사타입 렌티바이러스와 웰 당 10 μg부터 13.7 ng까지 순차 희석된 4A5 항체를 혼합하고 37℃에서 1시간 반응시킨 후, 각 웰에 ACE2를 과발현시킨 인간배아신장세포(HEK293T/ACE2, Creative Diagnostics사) 4x104개를 주입하고 2일간 배양하여 감염된 SARS-CoV-2 스파이크 유사타입 렌티바이러스가 발현하는 루시퍼레이즈의 활성측정으로 4A5 항체의 바이러스 중화능을 간접 측정하였다. 감염유도 배양 2일 후 96웰 세포배양 플레이트의 배양액 200 μl 중 100 μl를 제거하고 100 μl의 루시퍼레이즈 기질(One-Glo, Promega사)을 첨가한 후 3분간 효소/기질 반응을 유도하고, 발광정도(luminescence)를 측정하여 4A5 항체의 바이러스 감염 중화능을 확인하였다. 이때 4A5 항체와 동일 아형을 가진 IgG2a 항체를 음성대조군으로 사용하였다.
그 결과, 항체 4A5는 수용체인 ACE2와의 최초 접촉을 매개하는 SARS-CoV-2 스파이크(S) 단백질의 수용체 결합 도메인(RBD)에 직접 결합하지 않음에도 불구하고 숙주세포막과 2차 접촉하는 S2의 결합 도메인(CD)에 결합하여, SARS-CoV-2 스파이크 유사타입 렌티바이러스의 세포 내 침입을 일정부분(IC값: 22.57 nM) 억제함을 확인하였다(도 12).
실시예 10. 항-스파이크2(Spike2, S2) 4A5 항체의 상보성 결정부위(CDR)의 분석
4A5 항체가 SARS-CoV-2의 S2 부위를 특이하게 인지함을 확인한 후 4A5 항체의 항원인지 특이성에 대한 정보를 확보하기 위해 해당 항체의 상보성 결정부위(CDR) 서열을 분석하였다.
구체적으로, 4A5 항체 생성 세포를 106개 정도 수집하여 RNA 추출키트(Nanohelix사)를 이용하여 총 RNA(total RNA)를 추출하였다. 상보성 DNA 합성(cDNA synthesis) 키트(Promega사)를 이용하여 총 RNA 5 μg으로부터 cDNA를 합성하였고, 합성된 cDNA 1 μg과 표1의 마우스 중쇄영역 프라이머들과 마우스 경쇄영역 프라이머들을 이용한 PCR을 수행하여 마우스 중쇄와 경쇄의 CDR 포함부위를 증폭하였다. 증폭된 DNA를 TOPcloner Blunt kit(Enzynomics사)를 사용하여 pTOP Blunt V2 벡터와 접합(ligation)하였다. 재조합 플라스미드는 E. coli DH5α에 형질전환(transformation)하였고 앰피실린(ampicillin)을 포함한 LB제한배지 플레이트에 도말하여 37℃에서 15시간 배양하였다. 플레이트에 형성된 콜로니들 하나씩 LB 액체제한배지에서 12시간 이상 배양하고 플라스미드를 추출하여, 해당 염기서열을 분석하였다.
분석된 염기서열로부터 단백질서열을 결정하였고, 이를 Kabat CDR 정의를 기준으로 분석하여 4A5 항체의 CDR을 결정하였다 (도 13, 14).
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<170> KoPatentIn 3.0
<210> 1
<211> 30
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 4A5_HFR1
<400> 1
Gln Val Lys Leu Glu Gln Ser Gly Pro Gly Ile Leu Gln Pro Ser Gln
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ser Phe Ser Gly Phe Ser Leu Ser
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<213> Artificial Sequence
<220>
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Thr Ser Gly Met Gly Val Ser
1 5
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Trp Ile Arg Gln Ser Ser Gly Lys Gly Leu Glu Trp Leu Thr
1 5 10
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<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 4A5_HCDR2
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His Ile Tyr Trp Asp Asp Asp Lys Arg Tyr Asn Pro Ser Leu Lys Ser
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<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
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<400> 5
Arg Leu Thr Ile Ser Lys Asp Thr Ser Arg Asn Gln Val Phe Leu Lys
1 5 10 15
Ile Thr Ser Val Asp Thr Ala Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys Ala Arg
20 25 30
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<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 4A5_HCDR3
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Arg Arg Met Ile Thr Gly Leu Tyr Tyr Ala Met Asp Tyr
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<213> Artificial Sequence
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<223> 4A5_HFR4
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Trp Gly Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser Ala Lys Thr Thr Ala
1 5 10 15
Pro Ser Val Tyr Pro Leu Ala Pro Val Cys Gly Asp Thr Thr Gly Ser
20 25 30
Ser Val Thr Leu Gly Cys Leu Val Lys
35 40
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<213> Artificial Sequence
<220>
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Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Thr Leu Ser Leu Pro Val Ser Phe Gly
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Asp Gln Val Ser Ile Ser Cys
20
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<213> Artificial Sequence
<220>
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<213> Artificial Sequence
<220>
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<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 4A5_LFR3
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Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr
1 5 10 15
Leu Lys Ile Ser Thr Ile Lys Pro Glu Asp Leu Gly Met Tyr Tyr Cys
20 25 30
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<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 4A5_LCDR3
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Leu Gln Gly Thr His Gln Pro Trp Thr
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<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 4A5_LFR4
<400> 14
Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Ala Asp Ala Ala Pro
1 5 10 15
Thr Val Ser
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<211> 153
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 4A5_VH
<400> 15
Gln Val Lys Leu Glu Gln Ser Gly Pro Gly Ile Leu Gln Pro Ser Gln
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ser Phe Ser Gly Phe Ser Leu Ser Thr Ser
20 25 30
Gly Met Gly Val Ser Trp Ile Arg Gln Ser Ser Gly Lys Gly Leu Glu
35 40 45
Trp Leu Thr His Ile Tyr Trp Asp Asp Asp Lys Arg Tyr Asn Pro Ser
50 55 60
Leu Lys Ser Arg Leu Thr Ile Ser Lys Asp Thr Ser Arg Asn Gln Val
65 70 75 80
Phe Leu Lys Ile Thr Ser Val Asp Thr Ala Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr
85 90 95
Cys Ala Arg Arg Arg Met Ile Thr Gly Leu Tyr Tyr Ala Met Asp Tyr
100 105 110
Trp Gly Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser Ala Lys Thr Thr Ala
115 120 125
Pro Ser Val Tyr Pro Leu Ala Pro Val Cys Gly Asp Thr Thr Gly Ser
130 135 140
Ser Val Thr Leu Gly Cys Leu Val Lys
145 150
<210> 16
<211> 121
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 4A5_VL
<400> 16
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Thr Leu Ser Leu Pro Val Ser Phe Gly
1 5 10 15
Asp Gln Val Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Ala Asn Ser
20 25 30
Tyr Gly Ile Thr Tyr Leu Ser Trp Tyr Leu His Lys Pro Gly Gln Ser
35 40 45
Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Gly Ile Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro
50 55 60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile
65 70 75 80
Ser Thr Ile Lys Pro Glu Asp Leu Gly Met Tyr Tyr Cys Leu Gln Gly
85 90 95
Thr His Gln Pro Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105 110
Arg Ala Asp Ala Ala Pro Thr Val Ser
115 120
<210> 17
<211> 25
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 4A5 epitope
<400> 17
Phe Tyr Glu Pro Gln Ile Ile Thr Thr Asp Asn Thr Phe Val Ser Gly
1 5 10 15
Asn Cys Asp Val Val Ile Gly Ile Val
20 25
<210> 18
<211> 33
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer_S2 F
<400> 18
agctcagcat atgtctgtgg caagccagag cat 33
<210> 19
<211> 34
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer_S2p2 R
<400> 19
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<211> 34
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer_S2p2-1 R
<400> 20
atactcgagt tattcatatt tgcccagttc ttgg 34
<210> 21
<211> 32
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<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer_S2p2-1 R
<400> 21
atactcgagt tacaccacag aggcattgat gc 32
<210> 22
<211> 33
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
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atactcgagt tattcaggtt ggagtgggtc ata 33
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer_S2p2-2-1 R
<400> 23
atactcgagt tacacaatgc caatcaccac atca 34
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<211> 32
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer_S2p2-3 R
<400> 24
atactcgagt tagttcctct gggtcacaaa cc 32
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<211> 32
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<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer_S2p2-4 R
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atactcgagt tagaagttct tctcctgggc ag 32
<210> 26
<211> 32
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer_S2p3 R
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atactcgagt tagtccaccc tcttgctttg tc 32
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<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer_S2p4 R
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atactcgagt tagtctccat attgcttgat gaag 34
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<211> 32
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer_S2p5 R
<400> 28
atactcgagt tagtcaggca gaatctggct ga 32
<210> 29
<211> 34
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer_S2p6 F
<400> 29
ctagagctag catgttctgt ggcaagggct acca 34
<210> 30
<211> 34
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer_S2p6 R
<400> 30
atactcgagt tattcatatt tgcccagttc ttgg 34
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer_IgG2a heavy chain F
<400> 31
cttccggaat tcsargtnma gctgsagsag tcwgg 35
<210> 32
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer_IgG2a heavy chain R
<400> 32
ggaagatctc ttgaccaggc atcctagagt 30
<210> 33
<211> 32
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer_kappa light chain F
<400> 33
gggagctcga yattgtgmts acmcarwctm ca 32
<210> 34
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer_kappa light chain R
<400> 34
ggtgcatgcg gatacagttg gtgcagcatc 30
Claims (12)
- 서열번호 17을 항원결정부위(epitope)로 인식하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
- 제1항에 있어서, 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편은
서열번호 2의 HCDR1,
서열번호 4의 HCDR2, 및
서열번호 6의 HCDR3을 포함하는 중쇄가변영역; 및
서열번호 9의 LCDR1,
서열번호 11의 LCDR2, 및
서열번호 13의 LCDR3을 포함하는 경쇄가변영역을 포함하는, 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
- 제2항에 있어서, 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편은
서열번호 1의 HFR(중쇄 FR)1,
서열번호 3의 HFR2,
서열번호 5의 HFR3, 및
서열번호 7의 HFR4를 포함하는 중쇄가변영역; 및
서열번호 8의 LFR(경쇄 FR)1,
서열번호 10의 LFR2,
서열번호 12의 LFR3, 및
서열번호 14의 LFR4를 포함하는 경쇄가변영역을 포함하는 것인, 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
- 제3항에 있어서, 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편은
서열번호 15의 중쇄가변영역 및 서열번호 16의 경쇄가변영역을 포함하는 것인, 항체 또는 이의 항원 결합단편.
- 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 코로나바이러스는 SARS-CoV-2인, 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
- 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항의 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 코딩하는 폴리뉴클레오티드.
- 제6항의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 벡터.
- 제7항의 발현벡터를 포함하는 숙주세포.
- 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항의 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함하는, 코로나바이러스 감염 진단용 조성물.
- 제9항의 조성물을 포함하는, 코로나바이러스 감염 진단용 키트.
- 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항의 항체 또는 이의 항원 결합 단편; 또는 이를 포함하는 감염 진단용 조성물; 또는 상기 조성물을 포함하는 키트를 이용하여, 코로나바이러스 감염 의심 개체로부터 분리된 생물학적 시료에 존재하는 코로나바이러스를 검출하는 단계를 포함하는, 코로나바이러스 감염 진단을 위한 정보제공방법.
- 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항의 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함하는 코로나바이러스 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
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Citations (2)
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- 2021-09-10 KR KR1020210121263A patent/KR20230038028A/ko not_active Application Discontinuation
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| KR102245849B1 (ko) | 2020-09-04 | 2021-04-28 | 주식회사 에이아이더뉴트리진 | 코로나바이러스 검출용 조성물 및 이의 검출용 키트 |
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