KR20220054080A - SARS-CoV-2 스파이크 단백질에 특이적으로 결합하는 항체 및 이의 용도 - Google Patents

SARS-CoV-2 스파이크 단백질에 특이적으로 결합하는 항체 및 이의 용도 Download PDF

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Abstract

본 발명은 신종 코로나바이러스 SARS-CoV-2의 막 단백질 스파이크(spike)에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 이를 코딩하는 핵산, 상기 핵산을 포함하는 재조합 발현 벡터, 상기 벡터로 형질전환된 세포, 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 제조 방법, 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함하는 항체-약물 접합체(Antibody drug conjugate, ADC) 또는 다중특이적 항체(multispecific antibody), 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함하는 SARS-CoV-2 감염증의 예방 또는 치료용 약학 조성물, 진단용 조성물 또는 진단 키트를 제공한다. 본 발명에 따른 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 SARS-CoV-2 스파이크 단백질에 특이적으로 결합하며, 이에 따라 인간세포 표면의 수용체인 ACE2(angiotensin converting enzyme-2)와 SARS-CoV-2의 막 단백질 스파이크의 결합을 완전히 차단하므로, 신종 코로나바이러스 감염증의 예방, 치료 또는 진단에 유용하게 사용될 수 있다.

Description

SARS-CoV-2 스파이크 단백질에 특이적으로 결합하는 항체 및 이의 용도{ANTIBODY SPECIFICALLY BINDING TO SARS-CoV-2 SPIKE PROTEIN AND USES THEREOF}
본 발명은 신종 코로나바이러스 SARS-CoV-2의 막 단백질 스파이크(spike)에 특이적으로 결합하는 항체 및 이의 용도에 관한 것이다.
신종 코로나바이러스 감염증(COVID-19)은 2019년 12월 중국 우한에서 대규모로 발병한 호흡기 감염질환이다. 치명률은 약 5%로서 기존 SARS(약 9.6%)나 MERS(약 34.4%)보다는 약하나, 사람간 전염성이 매우 강하여 세계적으로 빠르게 확산됨으로써 2020년 3월 WHO에 의해 팬더믹(pandemic)이 선언되었다.
한편, SARS-CoV-2의 막 단백질 스파이크(spike)가 인간 세포막에 있는 특정 수용체인 ACE2(angiotensin converting enzyme-2)에 결합한 후, 코로나바이러스의 유전적 정보를 인간 세포에 주입한 다음, 세포 내에서 복사 및 재조립을 계속한다. 결과적으로, 코로나바이러스는 세포를 파괴시킨 후, 세포 외로 방출되며, 짧은 시간내에 심각한 인체 감염을 일으킨다는 점이 보고된 바 있다(Haibo Zhang et.al., Intensive Care Med., 46(4):586-590, 2020).
신종 코로나바이러스 감염증을 일으키는 바이러스인 SARS-CoV-2(또는 2019-nCoV)는 기존 SARS(SARS-CoV) 및 MERS(MERS-CoV)와 게놈 유전체의 상동성이 낮아 COVID-19의 치료용으로 기존의 치료제들을 사용할 수 없는 실정이다. 현재 SARS-CoV-2를 타겟하는 치료용 항체 중 임상단계를 진행 중인 것은 소수이며, 감염환자 유래의 항체를 발굴하거나 변이체에 적용 가능한 다양한 항체를 확보하는 것이 필요하다. 또한, 바이러스 변이성을 고려하여 서로 다른 에피토프(epitope)를 갖는 항체들을 병용 투여하는 것이 필요하다.
한편, COVID-19의 치료제로서 다른 용도로 개발된 기존 약물을 이용하는 약물 재창출의 경우, 에볼라바이러스의 치료제인 길리어드 사이언스사의 렘데시비르가 미국, 유럽, 일본에서 중증 환자 대상으로 승인되어 잠재적 치료제로 기대되나, 유효성 및 안전성 논란이 제기되고 있다. 또한, 에이즈(AIDS) 치료제인 로피나비르 및 리토나비르와 말라리아 치료제인 하이드록시클로로퀸 등은 효능이 거의 없는 것으로 보고되었다. 뿐만 아니라, 완치 환자의 혈장을 제제화하여 감염 환자에게 투입하는 혈장 치료제도 개발되고 있지만, 이는 생산 시 충분한 혈장 확보가 필요하므로 다수를 대상으로 이용하는 치료제로서는 적합하지 않다. 이러한 약물 재창출 치료제 및 혈장 치료제는 여러 가지 제한이 있고 효력 및 안전성의 확보가 미비하며 이들을 보완할 수 있는 항-SARS-CoV-2 항체 치료제의 개발이 요구되고 있다.
Haibo Zhang et.al., Intensive Care Med., 46(4):586-590, 2020
이에, 본 발명자들은 SARS-CoV-2를 직접 타겟하는 치료용 항체를 개발하기 위해 연구한 결과, SARS-CoV-2의 막 단백질 스파이크(spike)에 특이적으로 결합하는 항체들을 개발하였다. 또한, 상기 항체들이 인간 세포 수용체인 ACE2(angiotensin converting enzyme-2)와 SARS-CoV-2 스파이크의 결합을 완전히 차단함으로써 신종 코로나바이러스 감염증의 치료제로 이용될 수 있음을 확인하여 본 발명을 완성하였다.
상기 목적 달성을 위해, 본 발명의 일 측면은 SARS-CoV-2의 막 단백질 스파이크에 특이적으로 결합하여 신종 코로나바이러스 감염증에 대해 예방 또는 치료 효과를 나타낼 수 있는 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 제공한다.
구체적으로, 하기 군에서 선택되는 어느 하나의 CDR(complementarity determining region) 조합을 포함하는 SARS-CoV-2 스파이크 단백질에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 제공한다:
(1) 서열번호 1의 중쇄 CDR1, 서열번호 2의 중쇄 CDR2, 서열번호 3의 중쇄 CDR3, 서열번호 4의 경쇄 CDR1, 서열번호 5의 경쇄 CDR2, 서열번호 6의 경쇄 CDR3;
(2) 서열번호 7의 중쇄 CDR1, 서열번호 8의 중쇄 CDR2, 서열번호 9의 중쇄 CDR3, 서열번호 10의 경쇄 CDR1, 서열번호 11의 경쇄 CDR2, 서열번호 12의 경쇄 CDR3;
(3) 서열번호 13의 중쇄 CDR1, 서열번호 14의 중쇄 CDR2, 서열번호 15의 중쇄 CDR3, 서열번호 16의 경쇄 CDR1, 서열번호 17의 경쇄 CDR2, 서열번호 18의 경쇄 CDR3;
(4) 서열번호 19의 중쇄 CDR1, 서열번호 20의 중쇄 CDR2, 서열번호 21의 중쇄 CDR3, 서열번호 22의 경쇄 CDR1, 서열번호 23의 경쇄 CDR2, 서열번호 24의 경쇄 CDR3;
(5) 서열번호 25의 중쇄 CDR1, 서열번호 26의 중쇄 CDR2, 서열번호 27의 중쇄 CDR3, 서열번호 28의 경쇄 CDR1, 서열번호 29의 경쇄 CDR2, 서열번호 30의 경쇄 CDR3;
(6) 서열번호 31의 중쇄 CDR1, 서열번호 32의 중쇄 CDR2, 서열번호 33의 중쇄 CDR3, 서열번호 34의 경쇄 CDR1, 서열번호 35의 경쇄 CDR2, 서열번호 36의 경쇄 CDR3;
(7) 서열번호 37의 중쇄 CDR1, 서열번호 38의 중쇄 CDR2, 서열번호 39의 중쇄 CDR3, 서열번호 40의 경쇄 CDR1, 서열번호 41의 경쇄 CDR2, 서열번호 42의 경쇄 CDR3;
(8) 서열번호 43의 중쇄 CDR1, 서열번호 44의 중쇄 CDR2, 서열번호 45의 중쇄 CDR3, 서열번호 46의 경쇄 CDR1, 서열번호 47의 경쇄 CDR2, 서열번호 48의 경쇄 CDR3;
(9) 서열번호 49의 중쇄 CDR1, 서열번호 50의 중쇄 CDR2, 서열번호 51의 중쇄 CDR3, 서열번호 52의 경쇄 CDR1, 서열번호 53의 경쇄 CDR2, 서열번호 54의 경쇄 CDR3;
(10) 서열번호 55의 중쇄 CDR1, 서열번호 56의 중쇄 CDR2, 서열번호 57의 중쇄 CDR3, 서열번호 58의 경쇄 CDR1, 서열번호 59의 경쇄 CDR2, 서열번호 60의 경쇄 CDR3;
(11) 서열번호 61의 중쇄 CDR1, 서열번호 62의 중쇄 CDR2, 서열번호 63의 중쇄 CDR3, 서열번호 64의 경쇄 CDR1, 서열번호 65의 경쇄 CDR2, 서열번호 66의 경쇄 CDR3;
(12) 서열번호 67의 중쇄 CDR1, 서열번호 68의 중쇄 CDR2, 서열번호 69의 중쇄 CDR3, 서열번호 70의 경쇄 CDR1, 서열번호 71의 경쇄 CDR2, 서열번호 72의 경쇄 CDR3;
(13) 서열번호 73의 중쇄 CDR1, 서열번호 74의 중쇄 CDR2, 서열번호 75의 중쇄 CDR3, 서열번호 76의 경쇄 CDR1, 서열번호 77의 경쇄 CDR2, 서열번호 78의 경쇄 CDR3;
(14) 서열번호 79의 중쇄 CDR1, 서열번호 80의 중쇄 CDR2, 서열번호 81의 중쇄 CDR3, 서열번호 82의 경쇄 CDR1, 서열번호 83의 경쇄 CDR2, 서열번호 84의 경쇄 CDR3;
(15) 서열번호 85의 중쇄 CDR1, 서열번호 86의 중쇄 CDR2, 서열번호 87의 중쇄 CDR3, 서열번호 88의 경쇄 CDR1, 서열번호 89의 경쇄 CDR2, 서열번호 90의 경쇄 CDR3;
(16) 서열번호 1의 중쇄 CDR1, 서열번호 2의 중쇄 CDR2, 서열번호 3의 중쇄 CDR3, 서열번호 271의 경쇄 CDR1, 서열번호 272의 경쇄 CDR2, 서열번호 273의 경쇄 CDR3;
(17) 서열번호 7의 중쇄 CDR1, 서열번호 8의 중쇄 CDR2, 서열번호 9의 중쇄 CDR3, 서열번호 274의 경쇄 CDR1, 서열번호 275의 경쇄 CDR2, 서열번호 276의 경쇄 CDR3;
(18) 서열번호 13의 중쇄 CDR1, 서열번호 14의 중쇄 CDR2, 서열번호 15의 중쇄 CDR3, 서열번호 277의 경쇄 CDR1, 서열번호 278의 경쇄 CDR2, 서열번호 279의 경쇄 CDR3; 및
(19) 서열번호 25의 중쇄 CDR1, 서열번호 26의 중쇄 CDR2, 서열번호 27의 중쇄 CDR3, 서열번호 280의 경쇄 CDR1, 서열번호 281의 경쇄 CDR2, 서열번호 282의 경쇄 CDR3.
또한, 하기 군에서 선택되는 어느 하나의 가변영역(variable region) 조합을 포함하는 SARS-CoV-2 스파이크 단백질에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 제공한다:
(1) 서열번호 211의 중쇄 가변영역 및 서열번호 212의 경쇄 가변영역;
(2) 서열번호 213의 중쇄 가변영역 및 서열번호 214의 경쇄 가변영역;
(3) 서열번호 215의 중쇄 가변영역 및 서열번호 216의 경쇄 가변영역;
(4) 서열번호 217의 중쇄 가변영역 및 서열번호 218의 경쇄 가변영역;
(5) 서열번호 219의 중쇄 가변영역 및 서열번호 220의 경쇄 가변영역;
(6) 서열번호 221의 중쇄 가변영역 및 서열번호 222의 경쇄 가변영역;
(7) 서열번호 223의 중쇄 가변영역 및 서열번호 224의 경쇄 가변영역;
(8) 서열번호 225의 중쇄 가변영역 및 서열번호 226의 경쇄 가변영역;
(9) 서열번호 227의 중쇄 가변영역 및 서열번호 228의 경쇄 가변영역;
(10) 서열번호 229의 중쇄 가변영역 및 서열번호 230의 경쇄 가변영역;
(11) 서열번호 231의 중쇄 가변영역 및 서열번호 232의 경쇄 가변영역;
(12) 서열번호 233의 중쇄 가변영역 및 서열번호 234의 경쇄 가변영역;
(13) 서열번호 235의 중쇄 가변영역 및 서열번호 236의 경쇄 가변영역;
(14) 서열번호 237의 중쇄 가변영역 및 서열번호 238의 경쇄 가변영역;
(15) 서열번호 239의 중쇄 가변영역 및 서열번호 240의 경쇄 가변영역;
(16) 서열번호 211의 중쇄 가변영역 및 서열번호 299의 경쇄 가변영역;
(17) 서열번호 213의 중쇄 가변영역 및 서열번호 300의 경쇄 가변영역;
(18) 서열번호 215의 중쇄 가변영역 및 서열번호 301의 경쇄 가변영역; 및
(19) 서열번호 219의 중쇄 가변영역 및 서열번호 302의 경쇄 가변영역.
본 발명의 다른 측면은 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 코딩하는 핵산 및 이를 포함하는 재조합 발현 벡터를 제공한다.
본 발명의 또 다른 측면은 상기 벡터로 형질전환된 세포 및 이를 이용한 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 제조 방법을 제공한다.
본 발명의 또 다른 측면은 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편 및 약물을 포함하는 항체-약물 접합체(antibody-drug conjugate, ADC)를 제공한다.
본 발명의 또 다른 측면은 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함하는 다중특이적 항체(multispecific antibody)를 제공한다.
본 발명의 또 다른 측면은 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 상기 항체-약물 접합체 또는 다중특이적 항체를 포함하는 SARS-CoV-2 감염증의 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다.
본 발명의 또 다른 측면은 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함하는 SARS-CoV-2 감염증의 진단용 조성물을 제공한다.
본 발명의 또 다른 측면은 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함하는 SARS-CoV-2 스파이크 단백질의 검출 또는 정량용 키트를 제공한다.
본 발명에 따른 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 SARS-CoV-2 스파이크 단백질에 특이적으로 결합하여 인간세포 표면의 수용체인 ACE2(angiotensin converting enzyme-2)와 SARS-CoV-2 스파이크 단백질의 결합을 완전히 차단할 수 있으므로, 신종 코로나바이러스 감염증의 예방, 치료 또는 진단에 유용하게 사용될 수 있다.
도 1은 SARS-CoV-2 스파이크 단백질 발현 벡터의 모식도이다.
도 2는 정제된 SARS-CoV-2 스파이크 단백질들을 환원(reducing) 및 비환원(non-reducing) 조건에서 SDS-PAGE로 확인한 결과 및 SE-HPLC 수행 결과를 나타낸 것이다.
도 3은 SARS-CoV-2 스파이크 항원에 대한 결합능이 강한 모노 파지를 선별하기 위한 ELISA 수행 결과를 나타낸 것이다.
도 4는 SARS-CoV-2 스파이크 항원에 대한 최적화 항체의 결합능이 강한 모노 파지를 선별하기 위한 ELISA 수행 결과를 나타낸 것이다.
도 5a 내지 도 5d는 SARS-CoV-2 스파이크 단백질의 발현이 서로 다른 HEK293E 세포주를 이용하여 Ymax®-ABL(도 5a 및 도 5b)과 환자-면역 라이브러리(도 5c 및 도 5d) 유래 항-SARS-CoV-2 스파이크 항체의 항원에 대한 결합 특이성을 FACS로 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 6a 및 도 6b는 SARS-CoV 또는 SARS-CoV-2의 스파이크 S1-His 융합 단백질을 이용하여 Ymax®-ABL(도 6a)과 환자-면역 라이브러리(도 6b) 유래 항-SARS-CoV-2 스파이크 항체의 항원 결합 특이성을 ELISA로 측정하여 나타낸 결과이다.
도 7a 및 도 7b는 SARS-CoV-2 RBD-mFc 융합 단백질을 이용하여 Ymax®-ABL(도 7a)과 환자-면역 라이브러리(도 7b) 유래 항-SARS-CoV-2 스파이크 항체의 항원 결합력을 Octet QKe 분석 장비로 측정한 결과를 나타낸 것이다.
도 8a 및 도 8b는 대조군으로서 사용한 HEK293E 세포주(HEK293E/MocK) (도 8a) 및 SARS-CoV-2 스파이크 단백질의 발현이 서로 다른 HEK293E 세포주(HEK293E/CoV-2 스파이크(chimeric)) (도 8b)를 각각 이용하여 Ymax®-ABL 유래 항-SARS-CoV-2 스파이크 항체 변이체의 항원에 대한 결합 특이성을 FACS로 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 9는 SARS-CoV 또는 SARS-CoV-2의 스파이크 S1-His 융합 단백질을 이용하여 Ymax®-ABL 유래 항-SARS-CoV-2 스파이크 항체 변이체의 항원 결합 특이성을 ELISA로 측정한 결과를 나타낸 것이다.
도 10은 SARS-CoV-2 RBD-mFc 융합 단백질을 이용하여 Ymax®-ABL 유래 항-SARS-CoV-2 스파이크 항체 변이체의 항원 결합력을 Octet QKe 분석 장비로 측정한 결과를 나타낸 것이다.
도 11a 내지 도 11c는 SARS-CoV-2 RBD-His, SARS-CoV-2 RBD의 RBM을 SARS-CoV RBD의 RBM으로 치환한 돌연변이체(SARS-CoV-2_RBM_CoV-His) 또는 그 반대로 치환한 돌연변이체(SARS-CoV_RBM_CoV-2-His), SARS-CoV RBD-His 융합 단백질들을 이용하여 Ymax®-ABL과 환자-면역 라이브러리 유래 항-SARS-CoV-2 스파이크 항체(도 11a 및 도 11b)와 Ymax®-ABL 유래 항체 변이체(도 11c)의 항원 결합 영역(region)을 ELISA 분석을 통해 확인한 결과이다.
도 12a 및 도 12b는 ACE2와 결합하는 SARS-CoV-2 RBD의 RBM 영역 아미노산 서열을 SARS-CoV RBD의 RBM 서열을 참고하여 다른 아미노산으로 치환한 재조합 돌연변이 단백질들(SARS-CoV-2 RBD-His mutants; M2 내지 M10, 및 M12) (도 12a)을 사용하여, 항-SARS-CoV-2 스파이크 항체 및 변이체의 결합 특이성을 ELISA를 통해 측정하고 그룹화한 결과(도 12b)를 나타낸 것이다.
도 13a 내지 도 13d는 ACE2와 함께 SARS-CoV-2의 RBD(도 13a 및 도 13c) 또는 스파이크 S1(도 13b 및 도 13d)이 결합할 때, Ymax®-ABL(도 13a 및 도 13b)과 환자-면역 라이브러리(도 13c 및 도 13d) 유래 항-SARS-CoV-2 스파이크 항체가 농도 의존적으로 이들 결합을 경쟁적으로 저해하는지 ELISA를 통해 측정하고 확인한 결과이다.
도 14a 내지 도 14c는 재조합 SARS-CoV-2 RBD-mFc 단백질과 ACE2를 발현하는 HEK293E 세포를 이용하여 Ymax®-ABL과 환자-면역 라이브러리 유래 항-SARS-CoV-2 스파이크 항체(도 14a 및 도 14b)와 Ymax®-ABL 유래 항체 변이체(도 14c)가 농도 의존적으로 SARS-CoV-2 RBD/ACE2 결합을 저해하는 효과를 확인한 결과이다.
도 15a 및 도 15b는 재조합 SARS-CoV-2 RBD-hFc 단백질과 ACE2-GFP를 발현하는 HEK293E 세포를 이용하여 Ymax®-ABL(도 15a)과 환자-면역 라이브러리(도 15b) 유래 항-SARS-CoV-2 스파이크 항체가 세포 표면 ACE2와의 결합을 통한 SARS-CoV-2 RBD의 세포내 유입(internalization)을 농도 의존적으로 저해하는 효과를 확인한 결과이다.
도 16a 및 도 16b는 Ymax®-ABL(도 16a)과 환자-면역 라이브러리(도 16b) 유래 항-SARS-CoV-2 스파이크 항체가 Live SARS-CoV-2 바이러스에 대해 중화능을 갖는지 Vero 세포에서 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 17a 및 도 17b는 ACE2와 함께 SARS-CoV-2의 RBD(도 17a) 또는 스파이크 S1(도 17b)이 결합할 때, Ymax®-ABL 유래 항-SARS-CoV-2 스파이크 항체 변이체가 농도 의존적으로 이들 결합을 경쟁적으로 저해하는지 ELISA를 통해 측정하고 확인한 결과이다.
도 18은 재조합 SARS-CoV-2 RBD-hFc 단백질과 ACE2-GFP를 발현하는 HEK293E 세포를 이용하여 Ymax®-ABL 유래 항-SARS-CoV-2 스파이크 항체 변이체가 세포 표면 ACE2와의 결합을 통한 SARS-CoV-2 RBD의 세포내 유입(internalization)을 농도 의존적으로 저해하는 효과를 확인한 결과이다.
도 19a 및 도 19b는 Ymax®-ABL 유래 항-SARS-CoV-2 스파이크 항체 변이체가 Live SARS-CoV-2 바이러스에 대해 중화능을 갖는지 Vero 세포에서 확인한 결과를 나타낸 것이다.
달리 정의되지 않는 한, 본 명세서에서 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어들은 본 발명이 속하는 기술분야에서 숙련된 전문가에 의해서 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 일반적으로 본 명세서에서 사용된 명명법은 본 기술분야에서 잘 알려져 있고 통상적으로 사용되는 것이다.
이하, 본 발명에 대하여 상세히 설명하도록 한다.
SARS-CoV-2 스파이크(S) 단백질에 특이적으로 결합하는 항체
본 발명의 일측면은, SARS-CoV-2 스파이크(spike) 단백질에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 제공한다.
본 명세서에 사용된 용어 "SARS-CoV-2(severe acute respiratory syndrome coronavirus 2; 중증급성호흡기증후군 코로나바이러스 2)"는 신종 코로나바이러스 감염증(COVID-19)을 일으키는 원인 바이러스로서 2019-nCoV라고도 지칭되며, 중국, 미국, 아시아, 유럽 등 각지에서 발견된 돌연변이 등 모든 임의의 변이체를 총칭하는 개념이다.
본 명세서에 사용된 용어 "SARS-CoV-2 스파이크(S) 단백질(SARS-CoV-2 spike protein)"은 수용체 인식 및 세포막 융합 과정에서 핵심적인 역할을 하며, S1과 S2 두 개의 서브유닛으로 구성된다. S1 서브유닛은 숙주 수용체 안지오텐신-전환효소 2(angiotensin-converting enzyme 2, ACE2)를 인식하고 결합하는 수용체 결합 도메인(receptor-binding domain, RBD)을 포함하는 반면, S2 서브유닛은 두 개의 헵타드 반복 도메인(two-heptad repeat domain)을 통해 6개의 나선 다발(six-helical bundle)을 형성하여 바이러스 세포막 융합을 매개한다.
구체적으로, SARS-CoV-2 스파이크(S) 단백질의 크기는 180~200 kDa이며, 세포외 N-말단, 바이러스 막에 고정된 막 횡단(transmembrane; TM) 도메인 및 짧은 세포내 C-말단 세그먼트로 구성된다. 스파이크는 일반적으로 준안정(metastable), 사전융합(prefusion) 형태로 존재하며, 바이러스가 숙주 세포와 상호작용하면 S 단백질의 광범위한 구조적 재배열이 발생하여 바이러스가 숙주 세포막과 융합하게 된다. 스파이크는 다당류 분자로 코팅되어 그들을 위장하여 진입하는 동안 숙주 면역 체계의 감시를 피할 수 있는 것으로 알려져 있다.
또한, SARS-CoV-2 S의 총 길이는 1,273 aa이고, N-말단에 위치한 신호 펩타이드(아미노산 1-13), S1 서브유닛(14-685 잔기) 및 S2 서브유닛(686-1,273 잔기)으로 구성된다. S1 서브유닛에는 N-말단 도메인(14-305 잔기)과 수용체 결합 도메인(RBD, 319-541 잔기)이 있으며, S2 서브유닛은 융합 펩타이드(fusion peptide; FP)(788-806 잔기), 헵타펩타이드 반복 서열 1(heptapeptide repeat sequence 1; HR1)(912-984 잔기), HR2(1,163-1,213 잔기), TM 도메인(1,213-1,237 잔기) 및 세포질 도메인(1,237-1,273 잔기)으로 구성된다.
본 명세서에 사용된 용어 "SARS-CoV-2 스파이크(spike; S) 단백질에 특이적으로 결합하는 항체"는 인간세포 표면의 수용체인 ACE2(angiotensin converting enzyme-2)와 결합하여 감염 기전을 일으키는 SARS-CoV-2의 막 단백질 스파이크를 타겟으로 하는 항체를 의미한다. 상기 항체는 SARS-CoV-2의 인간 감염 기전과 밀접한 관련이 있는 SARS-CoV-2의 막 단백질 스파이크를 항원으로 인식하여 결합함으로써 SARS-CoV-2에 대한 중화 효능을 나타낸다. 한편, 본 발명에 있어서, 상기 항체는 항-SARS-COV-2의 스파이크 항체와 혼용된다.
상기 용어, "특이적으로 결합(specifically binding)" 또는 "특이적으로 인식(specifically recognizing)"은 당업자에게 통상적으로 알려진 의미와 동일한 것으로서, 항원 및 항체가 특이적으로 상호작용하여 항원-항체 복합체를 형성할 수 있으며, 또한 면역학적 반응을 하는 것을 의미할 수 있다.
본 발명에 따른 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 SARS-CoV-2의 막 단백질 스파이크의 아미노산 서열 또는 그 일부에 결합하는 것일 수 있다. 구체적으로, 상기 SARS-CoV-2의 스파이크 단백질의 아미노산 서열은 GenBank accession NO. QHD43416.1(서열번호 309)에 기재된 것일 수 있다. 또한, 상기 SARS-CoV-2의 스파이크 단백질을 코딩하는 서열로서 해당 유전자는 GenBank accession No. MN908947.3에 기재된 뉴클레오타이드 서열(서열번호 310)일 수 있다.
구체적으로, 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 ACE2와 결합하는 SARS-CoV-2 RBM(receptor binding motif)을 포함하는 부위에 특이적으로 결합하는 것일 수 있다. 예를 들어, 상기 서열번호 309로 표시되는 R319 내지 F541번째 아미노산 서열(서열번호 311), L425 내지 V510번째 아미노산 서열(서열번호 312), N437 내지 Y508번째 아미노산 서열(서열번호 313) 부위에 특이적으로 결합하는 것일 수 있다. 바람직하게는 서열번호 313의 서열에 특이적으로 결합하는 것일 수 있지만, 이에 한정되는 것은 아니다.
한편, 상기 스파이크 단백질은 통상의 기술분야에 알려진 어떠한 서열로 구성되는 폴리펩티드일 수 있다. 상기 폴리펩티드는 단백질의 기능에 영향을 미치지 않는 범위 내에서, 아미노산 잔기의 결실, 삽입, 치환 또는 이들의 조합에 의해서 상이한 서열을 가지는 아미노산의 변이체 또는 단편일 수 있다. 분자의 활성을 전체적으로 변경시키지 않는 단백질 또는 펩티드에서의 아미노산 치환은 당해 분야에 공지되어 있다. 가장 통상적으로 일어나는 치환은 아미노산 잔기 Ala/Ser, Val/Ile, Asp/Glu, Thr/Ser, Ala/Gly, Ala/Thr, Ser/Asn, Ala/Val, Ser/Gly, Thy/Phe, Ala/Pro, Lys/Arg, Asp/Asn, Leu/Ile, Leu/Val, Ala/Glu, Asp/Gly 간의 치환이다. 경우에 따라서는 인산화(phosphorylation), 황화(sulfation), 아크릴화(acrylation), 당화(glycosylation), 메틸화(methylation), 파네실화(farnesylation) 등으로 변형(modification) 될 수 있다.
본 발명에 따른 SARS-CoV-2 스파이크 단백질에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 이에 제한되지는 않으나, 서열번호 1, 7, 13, 19, 25, 31, 37, 43, 49, 55, 61, 67, 73, 79 및 85로 구성된 군에서 선택되는 중쇄(heavy chain) CDR1; 서열번호 2, 8, 14, 20, 26, 32, 38, 44, 50, 56, 62, 68, 74, 80 및 86으로 구성된 군에서 선택되는 중쇄 CDR2; 서열번호 3, 9, 15, 21, 27, 33, 39, 45, 51, 57, 63, 69, 75, 81 및 87로 구성된 군에서 선택되는 중쇄 CDR3를 포함하는 중쇄 가변영역; 및 서열번호 4, 10, 16, 22, 28, 34, 40, 46, 52, 58, 64, 70, 76, 82, 88, 271, 274, 277 및 280으로 구성된 군에서 선택되는 경쇄(light chain) CDR1; 서열번호 5, 11, 17, 23, 29, 35, 41, 47, 53, 59, 65, 71, 77, 83, 89, 272, 275, 278 및 281로 구성된 군에서 선택되는 경쇄 CDR2; 서열번호 6, 12, 18, 24, 30, 36, 42, 48, 54, 60, 66, 72, 78, 84, 90, 273, 276, 279 및 282로 구성된 군에서 선택되는 경쇄 CDR3를 포함하는 경쇄 가변영역을 포함할 수 있다.
보다 구체적으로, 상기 SARS-CoV-2 스파이크 단백질에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 이에 제한되지는 않으나, 하기 군에서 선택되는 어느 하나의 CDR(complementarity determining region) 조합을 포함하는 것일 수 있다:
(1) 서열번호 1의 중쇄 CDR1, 서열번호 2의 중쇄 CDR2, 서열번호 3의 중쇄 CDR3, 서열번호 4의 경쇄 CDR1, 서열번호 5의 경쇄 CDR2, 서열번호 6의 경쇄 CDR3;
(2) 서열번호 7의 중쇄 CDR1, 서열번호 8의 중쇄 CDR2, 서열번호 9의 중쇄 CDR3, 서열번호 10의 경쇄 CDR1, 서열번호 11의 경쇄 CDR2, 서열번호 12의 경쇄 CDR3;
(3) 서열번호 13의 중쇄 CDR1, 서열번호 14의 중쇄 CDR2, 서열번호 15의 중쇄 CDR3, 서열번호 16의 경쇄 CDR1, 서열번호 17의 경쇄 CDR2, 서열번호 18의 경쇄 CDR3;
(4) 서열번호 19의 중쇄 CDR1, 서열번호 20의 중쇄 CDR2, 서열번호 21의 중쇄 CDR3, 서열번호 22의 경쇄 CDR1, 서열번호 23의 경쇄 CDR2, 서열번호 24의 경쇄 CDR3;
(5) 서열번호 25의 중쇄 CDR1, 서열번호 26의 중쇄 CDR2, 서열번호 27의 중쇄 CDR3, 서열번호 28의 경쇄 CDR1, 서열번호 29의 경쇄 CDR2, 서열번호 30의 경쇄 CDR3;
(6) 서열번호 31의 중쇄 CDR1, 서열번호 32의 중쇄 CDR2, 서열번호 33의 중쇄 CDR3, 서열번호 34의 경쇄 CDR1, 서열번호 35의 경쇄 CDR2, 서열번호 36의 경쇄 CDR3;
(7) 서열번호 37의 중쇄 CDR1, 서열번호 38의 중쇄 CDR2, 서열번호 39의 중쇄 CDR3, 서열번호 40의 경쇄 CDR1, 서열번호 41의 경쇄 CDR2, 서열번호 42의 경쇄 CDR3;
(8) 서열번호 43의 중쇄 CDR1, 서열번호 44의 중쇄 CDR2, 서열번호 45의 중쇄 CDR3, 서열번호 46의 경쇄 CDR1, 서열번호 47의 경쇄 CDR2, 서열번호 48의 경쇄 CDR3;
(9) 서열번호 49의 중쇄 CDR1, 서열번호 50의 중쇄 CDR2, 서열번호 51의 중쇄 CDR3, 서열번호 52의 경쇄 CDR1, 서열번호 53의 경쇄 CDR2, 서열번호 54의 경쇄 CDR3;
(10) 서열번호 55의 중쇄 CDR1, 서열번호 56의 중쇄 CDR2, 서열번호 57의 중쇄 CDR3, 서열번호 58의 경쇄 CDR1, 서열번호 59의 경쇄 CDR2, 서열번호 60의 경쇄 CDR3;
(11) 서열번호 61의 중쇄 CDR1, 서열번호 62의 중쇄 CDR2, 서열번호 63의 중쇄 CDR3, 서열번호 64의 경쇄 CDR1, 서열번호 65의 경쇄 CDR2, 서열번호 66의 경쇄 CDR3;
(12) 서열번호 67의 중쇄 CDR1, 서열번호 68의 중쇄 CDR2, 서열번호 69의 중쇄 CDR3, 서열번호 70의 경쇄 CDR1, 서열번호 71의 경쇄 CDR2, 서열번호 72의 경쇄 CDR3;
(13) 서열번호 73의 중쇄 CDR1, 서열번호 74의 중쇄 CDR2, 서열번호 75의 중쇄 CDR3, 서열번호 76의 경쇄 CDR1, 서열번호 77의 경쇄 CDR2, 서열번호 78의 경쇄 CDR3;
(14) 서열번호 79의 중쇄 CDR1, 서열번호 80의 중쇄 CDR2, 서열번호 81의 중쇄 CDR3, 서열번호 82의 경쇄 CDR1, 서열번호 83의 경쇄 CDR2, 서열번호 84의 경쇄 CDR3;
(15) 서열번호 85의 중쇄 CDR1, 서열번호 86의 중쇄 CDR2, 서열번호 87의 중쇄 CDR3, 서열번호 88의 경쇄 CDR1, 서열번호 89의 경쇄 CDR2, 서열번호 90의 경쇄 CDR3;
(16) 서열번호 1의 중쇄 CDR1, 서열번호 2의 중쇄 CDR2, 서열번호 3의 중쇄 CDR3, 서열번호 271의 경쇄 CDR1, 서열번호 272의 경쇄 CDR2, 서열번호 273의 경쇄 CDR3;
(17) 서열번호 7의 중쇄 CDR1, 서열번호 8의 중쇄 CDR2, 서열번호 9의 중쇄 CDR3, 서열번호 274의 경쇄 CDR1, 서열번호 275의 경쇄 CDR2, 서열번호 276의 경쇄 CDR3;
(18) 서열번호 13의 중쇄 CDR1, 서열번호 14의 중쇄 CDR2, 서열번호 15의 중쇄 CDR3, 서열번호 277의 경쇄 CDR1, 서열번호 278의 경쇄 CDR2, 서열번호 279의 경쇄 CDR3; 및
(19) 서열번호 25의 중쇄 CDR1, 서열번호 26의 중쇄 CDR2, 서열번호 27의 중쇄 CDR3, 서열번호 280의 경쇄 CDR1, 서열번호 281의 경쇄 CDR2, 서열번호 282의 경쇄 CDR3.
본 발명에 따른 SARS-CoV-2 스파이크 단백질에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 이에 제한되지는 않으나, 서열번호 211, 213, 215, 217, 219, 221, 223, 225, 227, 229, 231, 233, 235, 237 및 239로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나의 중쇄 가변영역을 포함하는 것일 수 있다.
또한, 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 이에 제한되지는 않으나, 서열번호 212, 214, 216, 218, 220, 222, 224, 226, 228, 230, 232, 234, 236, 238, 240, 299, 300, 301 및 302로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나의 경쇄 가변영역을 포함하는 것일 수 있다.
보다 구체적으로, 상기 SARS-CoV-2 스파이크 단백질에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 이에 제한되지는 않으나, 하기 군에서 선택되는 어느 하나의 가변영역(variable region) 조합을 포함하는 것일 수 있다:
(1) 서열번호 211의 중쇄 가변영역 및 서열번호 212의 경쇄 가변영역;
(2) 서열번호 213의 중쇄 가변영역 및 서열번호 214의 경쇄 가변영역;
(3) 서열번호 215의 중쇄 가변영역 및 서열번호 216의 경쇄 가변영역;
(4) 서열번호 217의 중쇄 가변영역 및 서열번호 218의 경쇄 가변영역;
(5) 서열번호 219의 중쇄 가변영역 및 서열번호 220의 경쇄 가변영역;
(6) 서열번호 221의 중쇄 가변영역 및 서열번호 222의 경쇄 가변영역;
(7) 서열번호 223의 중쇄 가변영역 및 서열번호 224의 경쇄 가변영역;
(8) 서열번호 225의 중쇄 가변영역 및 서열번호 226의 경쇄 가변영역;
(9) 서열번호 227의 중쇄 가변영역 및 서열번호 228의 경쇄 가변영역;
(10) 서열번호 229의 중쇄 가변영역 및 서열번호 230의 경쇄 가변영역;
(11) 서열번호 231의 중쇄 가변영역 및 서열번호 232의 경쇄 가변영역;
(12) 서열번호 233의 중쇄 가변영역 및 서열번호 234의 경쇄 가변영역;
(13) 서열번호 235의 중쇄 가변영역 및 서열번호 236의 경쇄 가변영역;
(14) 서열번호 237의 중쇄 가변영역 및 서열번호 238의 경쇄 가변영역;
(15) 서열번호 239의 중쇄 가변영역 및 서열번호 240의 경쇄 가변영역;
(16) 서열번호 211의 중쇄 가변영역 및 서열번호 299의 경쇄 가변영역;
(17) 서열번호 213의 중쇄 가변영역 및 서열번호 300의 경쇄 가변영역;
(18) 서열번호 215의 중쇄 가변영역 및 서열번호 301의 경쇄 가변영역; 및
(19) 서열번호 219의 중쇄 가변영역 및 서열번호 302의 경쇄 가변영역.
상기 가변영역 조합을 포함하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 이에 제한되지는 않으나 각 해당 서열의 가변영역과 적어도 약 80% 상동성, 적어도 약 90% 상동성, 적어도 약 95% 상동성을 가질 수 있다.
본 명세서에 사용된 용어, "항체(antibody)"는 특정 항원, 예컨대 병원성 박테리아나 바이러스와 특이적으로 결합하여 이들을 중화시키는 기능을 수행하는 단백질로, 본 발명에서는 SARS-CoV-2의 스파이크 단백질에 특이적으로 결합하는 항체를 의미한다. 본 발명의 범위에는 SARS-COV-2의 스파이크에 특이적으로 결합하는 완전한 항체 형태뿐만 아니라, 상기 항체 분자의 항원 결합 단편도 포함된다.
완전한 항체는 2개의 전체 길이의 경쇄 및 2개의 전체 길이의 중쇄를 가지는 구조이며, 각각의 경쇄는 중쇄와 다이설파이드 결합으로 연결되어 있다. 중쇄 불변영역은 감마(γ), 뮤(μ), 알파(α), 델타(δ) 및 엡실론(ε) 타입을 가지고, 서브클래스로 감마1(γ1), 감마2(γ2), 감마3(γ3), 감마4(γ4), 알파1(α1) 및 알파2(α2)를 가진다. 경쇄의 불변영역은 카파(κ) 및 람다(λ) 타입을 가진다.
항체의 "항원 결합 단편" 또는 "항체 단편"이란 항원 결합 기능을 보유하고 있는 단편을 의미하며, Fab, F(ab'), F(ab')2 및 Fv 등의 형태일 수 있다. 항체 단편 중 Fab는 경쇄 및 중쇄의 가변영역과 경쇄의 불변영역 및 중쇄의 첫 번째 불변영역(CH1)을 가지는 구조로서 1개의 항원 결합 부위를 가진다. Fab'는 중쇄 CH1 도메인의 C-말단에 하나 이상의 시스테인 잔기를 포함하는 힌지 영역(hinge region)을 가진다는 점에서 Fab와 차이가 있다. F(ab')2 항체는 두 개의 Fab'의 힌지 영역의 시스테인 잔기가 디설파이드 결합을 이루면서 생성된다. Fv는 중쇄 가변영역 및 경쇄 가변영역만을 가지고 있는 최소의 항체 조각을 의미한다.
이중쇄 Fv(two-chain Fv)는 비공유 결합으로 중쇄 가변영역과 경쇄 가변영역이 연결되어 있고, 단쇄 Fv(single-chain Fv, scFv)는 일반적으로 펩타이드 링커를 통하여 중쇄의 가변영역과 경쇄의 가변영역이 공유결합으로 연결되거나 또는 C-말단에서 바로 연결되어 있어서 이중쇄 Fv와 같이 다이머(dimer)와 같은 구조를 이룰 수 있다. 이러한 항체 단편은 단백질 가수분해 효소를 이용해서 얻을 수 있고(예를 들어, 전체 항체를 파파인으로 제한 절단하면 Fab를 얻을 수 있고 펩신으로 절단하면 F(ab')2 단편을 얻을 수 있음), 유전자 재조합 기술을 통하여 제작할 수도 있다.
일 구현예에서, 본 발명에 따른 항체는 Fv 형태(예컨대, scFv)이거나, 완전한 항체 형태이다. 또한, 중쇄 불변영역은 감마(γ), 뮤(μ), 알파(α), 델타(δ) 또는 엡실론(ε) 중 어느 하나의 이소타입일 수 있다. 예를 들어, 불변영역은 감마1(IgG1), 감마 3(IgG3) 또는 감마 4(IgG4)이다. 경쇄 불변영역은 카파 또는 람다 형일 수 있다.
본 발명의 항체는 완전 인간 항체 서열로 이루어져 있다. 상기 "인간 항체"는 인간 면역글로불린으로부터 유래하는 분자로서 상보성 결정영역, 구조 영역을 포함한 항체를 구성하는 모든 아미노산 서열 전체가 인간의 면역글로불린으로 구성되어 있는 것을 의미한다. 필요에 따라, 본 발명의 항체는 당 분야에 알려진 방법에 따라 인간화 항체, 키메라 항체 등의 다양한 형태로 변형될 수 있다.
본 명세서에 사용된 바와 같은 "항체 가변 도메인"은 상보성 결정 영역(Complementarity Determining Region; CDR) 및 골격 영역(Framework Region; FR)의 아미노산 서열을 포함하는 항체 분자의 경쇄 및 중쇄 부분을 지칭한다. VH는 중쇄의 가변 도메인을 지칭하고, VL은 경쇄의 가변 도메인을 지칭한다.
본 명세서에 사용된 용어, "상보성 결정 영역"(CDR; 즉, CDR1, CDR2 및 CDR3)은 항원의 인식에 관여하는 고리모양의 부위로서 이 부위의 서열이 변함에 따라 항체의 항원에 대한 특이성이 결정된다. 상기 상보성 결정 영역은 항원 결합을 위해 필요한 영역으로서 항체 가변 도메인의 아미노산 잔기를 지칭한다. 각 가변 도메인은 전형적으로, CDR1, CDR2 및 CDR3으로서 확인된 3개의 CDR 영역을 갖는다.
구체적으로, 본 발명은 전술한 바와 같은 CDR 조합을 포함하는 항-SARS-COV-2의 스파이크 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 제공한다.
본 명세서에 사용된 용어, "골격 영역(framework region; FR)"은 CDR 잔기 이외의 가변 도메인 잔기로, 각 가변 도메인은 전형적으로, FR1, FR2, FR3 및 FR4로서 확인된 4개의 FR들을 가진다.
구체적으로, 본 발명의 SARS-CoV-2 스파이크 단백질에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 이에 제한되지는 않으나, 서열번호 91, 99, 107, 115, 123, 131, 139, 147, 155, 163, 171, 179, 187, 195 및 203으로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나의 중쇄 FR1; 서열번호 92, 100, 108, 116, 124, 132, 140, 148, 156, 164, 172, 180, 188, 196 및 204로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나의 중쇄 FR2; 서열번호 93, 101, 109, 117, 125, 133, 141, 149, 157, 165, 173, 181, 189, 197 및 205로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나의 중쇄 FR3; 서열번호 94, 102, 110, 118, 126, 134, 142, 150, 158, 166, 174, 182, 190, 198 및 206으로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나의 중쇄 FR4; 서열번호 95, 103, 111, 119, 127, 135, 143, 151, 159, 167, 175, 183, 191, 199, 207, 283, 287, 291 및 295로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나의 경쇄 FR1; 서열번호 96, 104, 112, 120, 128, 136, 144, 152, 160, 168, 176, 184, 192, 200, 208, 284, 288, 292 및 296으로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나의 경쇄 FR2; 서열번호 97, 105, 113, 121, 129, 137, 145, 153, 161, 169, 177, 185, 193, 201, 209, 285, 289, 293 및 297로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나의 경쇄 FR3; 및 서열번호 98, 106, 114, 122, 130, 138, 146, 154, 162, 170, 178, 186, 194, 202, 210, 286, 290, 294 및 298로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나의 경쇄 FR4를 포함할 수 있다.
보다 구체적으로, 본 발명의 SARS-CoV-2 스파이크 단백질에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 이에 제한되지는 않으나, 하기 군에서 선택되는 어느 하나의 FR 조합을 포함하는 것일 수 있다:
(1) 서열번호 91의 중쇄 FR1, 서열번호 92의 중쇄 FR2, 서열번호 93의 중쇄 FR3, 서열번호 94의 중쇄 FR4, 서열번호 95의 경쇄 FR1, 서열번호 96의 경쇄 FR2, 서열번호 97의 경쇄 FR3, 서열번호 98의 경쇄 FR4;
(2) 서열번호 99의 중쇄 FR1, 서열번호 100의 중쇄 FR2, 서열번호 101의 중쇄 FR3, 서열번호 102의 중쇄 FR4, 서열번호 103의 경쇄 FR1, 서열번호 104의 경쇄 FR2, 서열번호 105의 경쇄 FR3, 서열번호 106의 경쇄 FR4;
(3) 서열번호 107의 중쇄 FR1, 서열번호 108의 중쇄 FR2, 서열번호 109의 중쇄 FR3, 서열번호 110의 중쇄 FR4, 서열번호 111의 경쇄 FR1, 서열번호 112의 경쇄 FR2, 서열번호 113의 경쇄 FR3, 서열번호 114의 경쇄 FR4;
(4) 서열번호 115의 중쇄 FR1, 서열번호 116의 중쇄 FR2, 서열번호 117의 중쇄 FR3, 서열번호 118의 중쇄 FR4, 서열번호 119의 경쇄 FR1, 서열번호 120의 경쇄 FR2, 서열번호 121의 경쇄 FR3, 서열번호 122의 경쇄 FR4;
(5) 서열번호 123의 중쇄 FR1, 서열번호 124의 중쇄 FR2, 서열번호 125의 중쇄 FR3, 서열번호 126의 중쇄 FR4, 서열번호 127의 경쇄 FR1, 서열번호 128의 경쇄 FR2, 서열번호 129의 경쇄 FR3, 서열번호 130의 경쇄 FR4;
(6) 서열번호 131의 중쇄 FR1, 서열번호 132의 중쇄 FR2, 서열번호 133의 중쇄 FR3, 서열번호 134의 중쇄 FR4, 서열번호 135의 경쇄 FR1, 서열번호 136의 경쇄 FR2, 서열번호 137의 경쇄 FR3, 서열번호 138의 경쇄 FR4;
(7) 서열번호 139의 중쇄 FR1, 서열번호 140의 중쇄 FR2, 서열번호 141의 중쇄 FR3, 서열번호 142의 중쇄 FR4, 서열번호 143의 경쇄 FR1, 서열번호 144의 경쇄 FR2, 서열번호 145의 경쇄 FR3, 서열번호 146의 경쇄 FR4;
(8) 서열번호 147의 중쇄 FR1, 서열번호 148의 중쇄 FR2, 서열번호 149의 중쇄 FR3, 서열번호 150의 중쇄 FR4, 서열번호 151의 경쇄 FR1, 서열번호 152의 경쇄 FR2, 서열번호 153의 경쇄 FR3, 서열번호 154의 경쇄 FR4;
(9) 서열번호 155의 중쇄 FR1, 서열번호 156의 중쇄 FR2, 서열번호 157의 중쇄 FR3, 서열번호 158의 중쇄 FR4, 서열번호 159의 경쇄 FR1, 서열번호 160의 경쇄 FR2, 서열번호 161의 경쇄 FR3, 서열번호 162의 경쇄 FR4;
(10) 서열번호 163의 중쇄 FR1, 서열번호 164의 중쇄 FR2, 서열번호 165의 중쇄 FR3, 서열번호 166의 중쇄 FR4, 서열번호 167의 경쇄 FR1, 서열번호 168의 경쇄 FR2, 서열번호 169의 경쇄 FR3, 서열번호 170의 경쇄 FR4;
(11) 서열번호 171의 중쇄 FR1, 서열번호 172의 중쇄 FR2, 서열번호 173의 중쇄 FR3, 서열번호 174의 중쇄 FR4, 서열번호 175의 경쇄 FR1, 서열번호 176의 경쇄 FR2, 서열번호 177의 경쇄 FR3, 서열번호 178의 경쇄 FR4;
(12) 서열번호 179의 중쇄 FR1, 서열번호 180의 중쇄 FR2, 서열번호 181의 중쇄 FR3, 서열번호 182의 중쇄 FR4, 서열번호 183의 경쇄 FR1, 서열번호 184의 경쇄 FR2, 서열번호 185의 경쇄 FR3, 서열번호 186의 경쇄 FR4;
(13) 서열번호 187의 중쇄 FR1, 서열번호 188의 중쇄 FR2, 서열번호 189의 중쇄 FR3, 서열번호 190의 중쇄 FR4, 서열번호 191의 경쇄 FR1, 서열번호 192의 경쇄 FR2, 서열번호 193의 경쇄 FR3, 서열번호 194의 경쇄 FR4;
(14) 서열번호 195의 중쇄 FR1, 서열번호 196의 중쇄 FR2, 서열번호 197의 중쇄 FR3, 서열번호 198의 중쇄 FR4, 서열번호 199의 경쇄 FR1, 서열번호 200의 경쇄 FR2, 서열번호 201의 경쇄 FR3, 서열번호 202의 경쇄 FR4;
(15) 서열번호 203의 중쇄 FR1, 서열번호 204의 중쇄 FR2, 서열번호 205의 중쇄 FR3, 서열번호 206의 중쇄 FR4, 서열번호 207의 경쇄 FR1, 서열번호 208의 경쇄 FR2, 서열번호 209의 경쇄 FR3, 서열번호 210의 경쇄 FR4;
(16) 서열번호 91의 중쇄 FR1, 서열번호 92의 중쇄 FR2, 서열번호 93의 중쇄 FR3, 서열번호 94의 중쇄 FR4, 서열번호 283의 경쇄 FR1, 서열번호 284의 경쇄 FR2, 서열번호 285의 경쇄 FR3, 서열번호 286의 경쇄 FR4;
(17) 서열번호 99의 중쇄 FR1, 서열번호 100의 중쇄 FR2, 서열번호 101의 중쇄 FR3, 서열번호 102의 중쇄 FR4, 서열번호 287의 경쇄 FR1, 서열번호 288의 경쇄 FR2, 서열번호 289의 경쇄 FR3, 서열번호 290의 경쇄 FR4;
(18) 서열번호 107의 중쇄 FR1, 서열번호 108의 중쇄 FR2, 서열번호 109의 중쇄 FR3, 서열번호 110의 중쇄 FR4, 서열번호 291의 경쇄 FR1, 서열번호 292의 경쇄 FR2, 서열번호 293의 경쇄 FR3, 서열번호 294의 경쇄 FR4; 및
(19) 서열번호 123의 중쇄 FR1, 서열번호 124의 중쇄 FR2, 서열번호 125의 중쇄 FR3, 서열번호 126의 중쇄 FR4, 서열번호 295의 경쇄 FR1, 서열번호 296의 경쇄 FR2, 서열번호 297의 경쇄 FR3, 서열번호 298의 경쇄 FR4.
상기 골격 영역 조합을 포함하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 이에 제한되지는 않으나 각 해당 서열의 골격 영역과 적어도 약 80% 상동성, 적어도 약 90% 상동성, 적어도 약 95% 상동성을 가질 수 있다.
SARS-CoV-2 S 단백질에 특이적으로 결합하는 항체의 특징
본 발명의 일 실시예에 의하면, 본 발명자들은 파지 디스플레이 방법으로 나이브(naive) 인간 scFv 라이브러리(Ymax®-ABL로 칭함; (주)와이바이오로직스) 또는 Covid-19 확진 환자 유래 scFv 면역 라이브러리(Patient-Immune Library)를 바이오패닝하여 SARS-CoV-2 스파이크 단백질에 특이적으로 결합하는 항체를 제조하였다.
본 명세서에 사용된 용어, "파지 디스플레이"는 변이체 폴리펩티드를 파지, 예를 들어 섬유상 파지 입자의 표면 상에 외피 단백질의 적어도 일부와의 융합 단백질로서 디스플레이하는 기술이다. 파지 디스플레이의 유용성은 무작위화 단백질 변이체의 큰 라이브러리를 대상으로 하여, 표적 항원과 고친화도로 결합하는 서열을 신속하고도 효율적으로 분류할 수 있다는 사실에 있다. 펩티드 및 단백질 라이브러리를 파지 상에 디스플레이하는 것은 특이적 결합 특성을 지닌 폴리펩티드를 알아보기 위해 수 백만개의 폴리펩티드를 스크리닝하는데 사용되어 왔다.
파지 디스플레이 기술은 목적하는 특징을 지닌 항체를 제조하기 위한 통상적인 하이브리도마 및 재조합 방법에 비해 짧은 시간에 다양한 서열을 지닌 항체 라이브러리를 생성시킬 수 있는 장점이 있다. 또한, 면역이 전혀 요구되지 않기 때문에, 파지 항체 라이브러리는 독성이거나 항원성이 낮은 항원에 대해서도 항체를 생성시킬 수 있다. 파지 항체 라이브러리를 사용하여 신규한 치료적 항체를 생성 및 확인할 수도 있다.
파지 디스플레이 라이브러리로부터 고친화성 항체를 확인 및 분리할 수 있는 기술은 치료용 신규 항체 분리에 중요하다. 라이브러리로부터 고친화성 항체를 분리하는 것은 라이브러리의 크기, 세균성 세포 중에서의 생산 효율 및 라이브러리의 다양성에 좌우될 수 있다.
본 명세서에 사용된 용어, "scFv(single chain fragment variable)"는 유전자 재조합을 통해 항체의 가변영역만을 발현시켜 만든 단쇄항체를 말하며, 항체의 VH 영역과 VL 영역을 짧은 펩타이드 사슬로 연결한 단쇄 형태의 항체를 말한다.
본 명세서에 사용된 용어, "바이오패닝(biopanning)"은 파지의 외벽(coat)에 펩타이드를 발현(display)하는 파지 라이브러리로부터, 표적 분자(항체, 효소, 세포표면 수용체 등)과 결합하는 성질을 지닌 펩타이드를 표면에 발현하고 있는 파지만을 선택해 내는 과정을 일컫는다.
상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 특별히 이에 제한되지 않으나, 투여된 생체 내에서의 체류시간을 증진시키기 위하여, 당화(glycosylation) 및/또는 페길화(PEGylation)될 수 있다.
상기 당화 및/또는 페길화는 본 발명의 항체의 기능을 유지하는 한 당업계의 공지된 방법에 의해 다양한 당화 및/또는 페길화 패턴이 변형될 수 있고, 본 발명의 항체는 다양한 당화 및/또는 페길화 패턴이 변형된 변이 단일클론 항체(monoclonal antibody) 또는 이의 항원 결합 단편을 모두 포함한다.
본 발명의 일 실시예에서, 인간항체 라이브러리 Ymax®-ABL 유래 7종과 COVID-19 환자-면역 라이브러리 유래 8종으로 총 15종의 선도항체를 수득하고, 이를 최적화하여 최종 총 19종의 SARS-CoV-2 스파이크 단백질에 특이적으로 결합하는 항체를 확보하였다(실시예 2 및 실시예 3).
상기 항체는 SARS-CoV-2 S1 또는 RBD에 나노몰(nanomolar) 이하의 수준으로 높은 항원 결합력(K D )을 보이고, SARS-CoV-2 RBD와 ACE2의 결합을 저해하는 중화능을 확인한 세포 기반 중화능 평가에서도 IC50 값이 나노몰 수준으로 우수하며, soluble ACE2에 대해서도 중화능이 모두 월등함을 확인하였다. 또한, 상기 항체는 SARS-CoV-2 RBD의 세포내 유입(internalization)을 효과적으로 억제하고, ACE2와 결합하는 SARS-CoV-2 RBM(receptor binding motif)에 특이적으로 결합하여 바이러스와 직접 반응함에 의해 감염을 중화할 수 있는 효능이 우수한 항체임을 알 수 있었다(실시예 5 내지 실시예 9).
따라서, 본 발명의 항체는 SARS-CoV-2의 막 단백질 스파이크(S)와 ACE2의 결합을 완전히 차단할 수 있으므로, 신종 코로나바이러스 감염증에 대한 예방 및 치료 효과를 나타낼 수 있다.
본 발명에 따른 상기 항체는 이에 제한되지는 않으나, SARS-CoV-2 스파이크 단백질에 대해 1×10-8 M 내지 1×10-12　M, 또는 1×10-9 M 내지 1×10-11　M 범위 내의 결합 친화도(KD)를 나타낼 수 있다.
또한, 본 발명의 항-SARS-COV-2의 스파이크 항체 또는 이의 항원 결합 단편에는 본 발명에 따른 항-SARS-COV-2의 스파이크 항체 또는 이의 항원 결합 단편에서 보존적 치환을 통해 아미노산 서열의 일부가 치환된 항체 또는 이의 항원 결합 단편도 포함될 수 있다.
본 명세서에 사용된 용어, "보존적 치환"은 1개 이상의 아미노산을 해당 폴리펩티드의 생물학적 또는 생화학적 기능의 손실을 야기하지 않는 유사한 생화학적 특성을 갖는 아미노산으로 치환하는 것을 포함하는 폴리펩티드의 변형을 의미한다. "보존적 아미노산 치환"은 아미노산 잔기를 유사한 측쇄를 갖는 아미노산 잔기로 대체시키는 치환이다. 유사한 측쇄를 갖는 아미노산 잔기 부류는 해당 기술분야에 규정되어 있으며, 잘 알려져 있다. 이들 부류는 염기성 측쇄를 갖는 아미노산(예를 들어, 라이신, 아르기닌, 히스티딘), 산성 측쇄를 갖는 아미노산(예를 들어, 아스파르트산, 글루탐산), 대전되지 않은 극성 측쇄를 갖는 아미노산(예를 들어, 글리신, 아스파라진, 글루타민, 세린, 트레오닌, 티로신, 시스테인), 비-극성 측쇄를 갖는 아미노산(예를 들어, 알라닌, 발린, 류신, 이소류신, 프롤린, 페닐알라닌, 메티오닌, 트립토판), 베타-분지된 측쇄를 갖는 아미노산(예를 들어, 트레오닌, 발린, 이소류신) 및 방향족 측쇄를 갖는 아미노산(예를 들어, 티로신, 페닐알라닌, 트립토판, 히스티딘)이다. 본 발명의 항체는 상기와 같은 보존적 아미노산 치환을 가지더라도 여전히 활성을 보유할 수 있다.
SARS-CoV-2 S 단백질에 특이적으로 결합하는 항체를 코딩하는 핵산
본 발명의 다른 측면은, 상기 SARS-CoV-2 스파이크 단백질에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 코딩하는 핵산을 제공한다.
본 명세서에서 사용되는 핵산은 세포, 세포 용해물(lysate) 중에 존재하거나, 또는 부분적으로 정제된 형태 또는 실질적으로 순수한 형태로 존재할 수도 있다. 핵산은 알칼리/SDS 처리, CsCl 밴드화(banding), 컬럼 크로마토그래피, 아가로스 겔 전기 영동 및 해당 기술분야에 잘 알려진 기타의 것을 포함하는 표준 기술에 의해 다른 세포 성분 또는 기타 오염 물질, 예를 들어 다른 세포의 핵산 또는 단백질로부터 정제되어 나올 경우 "단리"되거나 "실질적으로 순수하게 된" 것이다.
본 발명의 핵산은 예를 들어 DNA 또는 RNA일 수 있으며, 인트론 서열을 포함하거나 포함하지 않을 수 있다. 핵산에서 기본 구성단위인 뉴클레오타이드는 자연의 뉴클레오타이드 뿐만 아니라, 당 또는 염기 부위가 변형된 유사체(analogue)도 포함한다.
본 발명의 중쇄 및 경쇄 가변영역을 코딩하는 핵산의 서열은 변형될 수 있다. 상기 변형은 뉴클레오타이드의 추가, 결실, 또는 비보존적 치환 또는 보존적 치환을 포함한다.
본 발명에 있어서, 상기 항-SARS-COV-2의 스파이크 항체를 코딩하는 핵산은 이에 제한되지는 않으나, 하기 군에서 선택되는 어느 하나의 가변영역을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 조합을 포함하는 것일 수 있다:
(1) 서열번호 241의 중쇄 가변영역 및 서열번호 242의 경쇄 가변영역;
(2) 서열번호 243의 중쇄 가변영역 및 서열번호 244의 경쇄 가변영역;
(3) 서열번호 245의 중쇄 가변영역 및 서열번호 246의 경쇄 가변영역;
(4) 서열번호 247의 중쇄 가변영역 및 서열번호 248의 경쇄 가변영역;
(5) 서열번호 249의 중쇄 가변영역 및 서열번호 250의 경쇄 가변영역;
(6) 서열번호 251의 중쇄 가변영역 및 서열번호 252의 경쇄 가변영역;
(7) 서열번호 253의 중쇄 가변영역 및 서열번호 254의 경쇄 가변영역;
(8) 서열번호 255의 중쇄 가변영역 및 서열번호 256의 경쇄 가변영역;
(9) 서열번호 257의 중쇄 가변영역 및 서열번호 258의 경쇄 가변영역;
(10) 서열번호 259의 중쇄 가변영역 및 서열번호 260의 경쇄 가변영역;
(11) 서열번호 261의 중쇄 가변영역 및 서열번호 262의 경쇄 가변영역;
(12) 서열번호 263의 중쇄 가변영역 및 서열번호 264의 경쇄 가변영역;
(13) 서열번호 265의 중쇄 가변영역 및 서열번호 266의 경쇄 가변영역;
(14) 서열번호 267의 중쇄 가변영역 및 서열번호 268의 경쇄 가변영역;
(15) 서열번호 269의 중쇄 가변영역 및 서열번호 270의 경쇄 가변영역;
(16) 서열번호 241의 중쇄 가변영역 및 서열번호 303의 경쇄 가변영역;
(17) 서열번호 243의 중쇄 가변영역 및 서열번호 304의 경쇄 가변영역;
(18) 서열번호 245의 중쇄 가변영역 및 서열번호 305의 경쇄 가변영역; 및
(19) 서열번호 249의 중쇄 가변영역 및 서열번호 306의 경쇄 가변영역.
상기 항체 또는 이를 코딩하는 핵산 분자는 이에 제한되지는 않으나 서열번호에 기재된 각 해당 서열과 실질적인 동일성(substantial identity)을 나타내는 서열도 포함하는 것으로 해석된다. 상기의 실질적인 동일성은, 상기한 본 발명의 서열과 임의의 다른 서열을 최대한 대응되도록 배열하고, 당업계에서 통상적으로 이용되는 알고리즘을 이용하여 정렬된 서열을 분석한 경우에, 90% 이상의 상동성, 바람직하게는 95% 이상의 상동성, 더욱 바람직하게는 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 또는 99% 이상의 상동성을 나타내는 서열을 의미한다.
이러한 상동성은 당업계에 공지된 방법에 의한 서열 비교 및/또는 정렬(alignment)에 의해 결정될 수 있다. 예를 들어, 서열 비교 알고리즘(예: NCBI Basic Local Alignment Search Tool; BLAST), 수동 정렬, 육안 검사 등을 이용하여 본 발명의 핵산 또는 단백질의 서열 상동성을 결정할 수 있다.
SARS-CoV-2 S 단백질에 특이적으로 결합하는 항체 제조용 벡터
본 발명의 다른 측면은, 상기 SARS-CoV-2 스파이크 단백질에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 코딩하는 핵산을 포함하는 재조합 발현 벡터를 제공한다.
본 발명에 따른 항-SARS-COV-2의 스파이크 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 발현을 위하여, 부분적이거나 전장인 경쇄 및 중쇄를 코딩하는 DNA를 표준 분자 생물학 기술(예를 들어, PCR 증폭 또는 목적 항체를 발현하는 하이브리도마를 사용한 cDNA 클로닝)로 수득할 수 있으며, DNA가 전사 및 번역 제어 서열에 "작동되도록 연결"되어 발현 벡터 내로 삽입될 수 있다. 벡터 성분에는 일반적으로 다음 중의 하나 이상이 포함되지만, 그에 제한되지 않는다: 신호 서열, 복제 기점, 하나 이상의 마커 유전자, 증강인자 요소, 프로모터, 및 전사 종결 서열.
본 명세서에서 사용되는 용어, "벡터"는 숙주세포에서 목적 유전자를 발현시키기 위한 수단으로 플라스미드 벡터; 코즈미드 벡터; 박테리오파지 벡터, 아데노바이러스 벡터, 레트로바이러스 벡터 및 아데노-연관 바이러스벡터 같은 바이러스 벡터 등을 포함한다. 상기 벡터에서 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 코딩하는 핵산은 프로모터에 작동적으로 연결되어 있다.
본 명세서에 사용된 용어, "작동적으로 연결"은 벡터 내의 전사 및 번역 제어 서열이 항체 유전자의 전사 및 번역을 조절하는 의도된 기능을 하도록 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 코딩하는 유전자가 벡터 내로 라이게이션(ligation)된다는 것을 의미한다. 발현 벡터 및 발현 제어 서열은 사용되는 발현용 세포와 상용성이 있도록 선택된다. 항체의 경쇄 유전자 및 중쇄 유전자는 별개의 벡터 내로 삽입되거나, 두 유전자 모두 동일한 발현 벡터 내로 삽입된다. 항체 유전자는 표준 방법(예를 들어 항체 유전자 단편 및 벡터 상의 상보성 제한 효소 부위의 라이게이션, 또는 제한 효소 부위가 전혀 존재하지 않을 경우 블런트(blunt) 말단 라이게이션)으로 발현 벡터 내로 삽입된다.
경우에 따라서, 상기 재조합 발현 벡터는 형질전환된 세포로부터 항체 사슬의 분비를 용이하게 하는 신호 펩티드를 코딩하는 서열을 포함할 수 있다. 상기 항체 사슬 유전자 및 신호 펩티드-코딩 서열은 신호 펩티드가 항체 사슬의 아미노 말단에 결합되어 발현되도록 프레임에 맞게 벡터 내로 클로닝될 수 있다. 신호 펩티드는 면역글로불린 신호 펩티드 또는 이종성 신호 펩티드(즉, 면역글로불린 외 단백질 유래의 신호 펩티드)일 수 있다. 또한, 상기 재조합 발현 벡터는 형질전환된 세포에서 항체 사슬 유전자의 발현을 제어하는 조절서열을 포함할 수 있다. "조절서열"은 항체 사슬 유전자의 전사 또는 번역을 제어하는 프로모터, 인핸서 및 기타 발현 제어 요소(예를 들어, 폴리아데닐화 신호)를 포함할 수 있다. 통상의 기술자는 형질전환시킬 세포의 선택, 단백질의 발현 수준 등과 같은 인자에 따라 조절 서열을 달리 선택하여, 발현 벡터의 디자인이 달라질 수 있음을 인식할 수 있다.
본 발명의 벡터는 또한 벡터로부터 발현되는 항체의 정제를 용이하게 하기 위하여 항체 유전자에 융합시킬 다른 서열을 포함할 수 있다. 이 서열은 예를 들어, 글루타티온 S-트랜스퍼라제(Pharmacia, USA), 말토스 결합 단백질(NEB, USA), FLAG(IBI, USA), 6× His(hexahistidine; Quiagen, USA) 등의 유전자일 수 있다. 상기 벡터는 선택 표지로서 당업계에서 통상적으로 이용되는 항생제 내성 유전자를 포함하며, 이러한 유전자로는 예를 들어 암피실린, 겐타마이신, 카베니실린, 클로람페니콜, 스트렙토마이신, 카나마이신, 게네티신, 네오마이신 및 테트라사이클린에 대한 내성 유전자가 있다.
SARS-CoV-2 S 단백질에 특이적으로 결합하는 항체 제조용 벡터 도입 세포
본 발명의 또 다른 측면은, 상기 재조합 발현 벡터로 형질전환된 세포를 제공한다.
상기 형질전환 세포의 숙주세포로서, 원핵세포, 진핵세포, 포유동물, 식물, 곤충, 균류 또는 세포성 기원의 세포를 포함할 수 있지만 이에 한정되지 않는다. 상기 원핵세포의 일 예로는 대장균을 사용할 수 있다. 또한, 진핵세포의 일 예로는 효모를 사용할 수 있다. 또한, 상기 포유동물 세포로 CHO 세포, F2N 세포, CSO 세포, BHK 세포, 바우스(Bowes) 흑색종 세포, HeLa 세포, 911 세포, AT1080 세포, A549 세포, HEK 293 세포 또는 HEK293T 세포 등을 사용할 수 있으나, 이에 한정되지 않으며, 당업자에게 알려진 포유동물 숙주세포로 사용 가능한 세포는 모두 이용 가능하다.
본 발명에 따른 항-SARS-COV-2의 스파이크 항체를 발현시키기 위해 다양한 세포/벡터 조합이 이용될 수 있다. 구체적으로, 진핵 세포에 적합한 발현 벡터로는 SV40, 소 유두종바이러스, 아데노바이러스, 아데노-연관 바이러스(adeno-associated virus), 시토메갈로바이러스 및 레트로바이러스로부터 유래된 발현 벡터가 포함되나, 이들로 한정되는 것은 아니다. 세균 세포에 사용할 수 있는 발현 벡터로는 pET, pRSET, pBluescript, pGEX2T, pUC, col E1, pCR1, pBR322, pMB9 및 이들의 유도체와 같은 대장균(E. coli)-유래 세균성 플라스미드; RP4와 같이 보다 넓은 숙주 범위를 갖는 플라스미드; λgt10, λgt11, 및 NM989와 같은 다양한 파지 람다(phage lambda) 유도체 등의 파지 DNA; 및 M13과 필라멘트성 단일가닥 DNA 파지와 같은 기타 DNA 파지가 포함된다. 효모 세포에 유용한 발현 벡터는 YEp 플라스미드 및 그의 유도체이다. 곤충 세포에 유용한 벡터는 pVL941이다.
또한, 숙주세포로 재조합 발현 벡터를 도입하는 경우, CaCl2 침전법, CaCl2 침전법에 DMSO(dimethyl sulfoxide)라는 환원물질을 사용함으로써 효율을 높인 Hanahan 방법, 전기천공법(electroporation), 인산칼슘 침전법, 원형질 융합법, 실리콘 카바이드 섬유를 이용한 교반법, 아그로박테리아 매개된 형질전환법, PEG를 이용한 형질전환법, 덱스트란 설페이트, 리포펙타민 및 건조/억제 매개된 형질전환 방법 등이 사용될 수 있다.
숙주세포 내로 도입된 벡터는 숙주세포 내에서 발현될 수 있으며, 이러한 경우에는 다량의 본 발명의 항-SARS-COV-2의 스파이크 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 수득할 수 있다.
SARS-CoV-2 S 단백질에 특이적으로 결합하는 항체 제조 방법
본 발명의 또 다른 측면은, (i) 상기 형질전환된 세포를 배양하는 단계; 및 (ⅱ) 얻어진 세포 배양액으로부터 SARS-CoV-2 스파이크 단백질에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 회수하는 단계를 포함하는, SARS-CoV-2 스파이크 단백질에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 제조 방법을 제공한다.
상기 SARS-CoV-2 스파이크 단백질에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 발현할 수 있는 재조합 발현 벡터가 포유류 세포 내로 도입될 경우, 세포에서 항체가 발현되게 하기에 충분한 기간 동안, 또는 더 바람직하게는 세포가 배양되는 배양 배지 내로 항체가 분비되게 하기에 충분한 기간 동안 세포를 배양함으로써 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 제조할 수 있다.
상기 세포는 각종 배지에서 배양할 수 있으며, 배양 배지로는 시판용 배지를 제한 없이 사용할 수 있다. 당업자에게 공지되어 있는 기타 모든 필수 보충물이 적당한 농도로 포함될 수도 있다. 선별된 숙주세포에서 단백질 발현을 위해 적합한 배양 조건, 예를 들어 온도, pH 등이 이미 사용되고 있고, 이는 당업자에게 명백할 것이다.
경우에 따라서, 발현된 항체를 세포 배양액으로부터 분리하여 균일하게 정제할 수 있다. 상기 항체의 분리 또는 정제는 통상의 단백질 분리 및 정제 방법, 예를 들어 크로마토그래피에 의해 수행될 수 있다. 상기 크로마토그래피는 예를 들어, 프로틴 A 컬럼 또는 프로틴 G 컬럼을 사용하는 친화성 크로마토그래피, 이온 교환 크로마토그래피, 소수성 크로마토그래피, 또는 히드록실아파타이트 크로마토그래피를 포함할 수 있다. 상기 크로마토그래피 이외에, 추가로 여과, 초여과, 염석, 투석 등을 조합함으로써 항체를 분리, 정제할 수 있다.
SARS-CoV-2 S 단백질에 특이적으로 결합하는 항체 및 약물을 포함하는 ADC
본 발명의 또 다른 측면은, 상기 SARS-CoV-2 스파이크 단백질에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편 및 약물을 포함하는 항체-약물 접합체(antibody-drug conjugate, ADC)를 제공한다.
본 명세서에 사용된 용어, "항체-약물 접합체(Antibody-drug conjugate, ADC)"는 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편과 약물의 결합체를 의미하며, 타겟 세포로 약물을 전달하기 전까지 약물이 항체에 안정적으로 결합되어 있어야 하고, 타겟으로 전달된 후 약물은 항체로부터 유리되어야 한다. 본 발명에 있어서, 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편과 약물(항암제 등)은 서로 결합(예컨대, 공유결합, 펩타이드 결합 등)되어 접합체(conjugate) 또는 융합 단백질(약물이 단백질인 경우)의 형태로 사용될 수 있다.
상기 약물은 약리학적 효과를 나타내는 제제로 본 발명의 항체 또는 이의 항원 결합 단편에 결합될 수 있고, 산성조건에 의하여 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편과 분리될 수 있으며, 표적 세포에 대한 치료 효과를 나타내는 화합물을 의미한다. 상기 약물은 이에 제한되지는 않으나 항바이러스제일 수 있다.
상기 항바이러스제는 이에 제한되지는 않으나, 기존의 항바이러스제, 예컨대 에볼라바이러스치료제, HIV(인간면역결핍바이러스)치료제, C형간염치료제, 독감치료제 등일 수 있다. 구체적 약물의 일예로는 칼레트라(kaletra), 렘데시비르(remdesivir), 플라크닐(하이드록시클로로퀸), 레소친(클로로퀸) 등이 있다.
또한, 상기 약물은 코로나바이러스 치료제로 개발되고 있는 물질을 이용할 수 있다. 구체적으로, 상기 적용될 수 있는 약물로는 항바이러스제 이외의 당뇨병 치료제(예컨대, 다파글리플로진(dapagliflozin)), 류마티스 관절염 치료제(예컨대, 아나킨라(anakinra), 토실리주맙(tocilizumab), 사리루맵(sarilumab)), 혈액암 치료제(예컨대, 아칼라브루티닙(acalabrutinib), 다발골수종 치료제(예컨대, 셀리넥서(selinexor)) 등일 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다.
상기 항체-약물 접합체는 세포로 내재화될 수 있으며, SARS-CoV-2와 인간세포 표면 ACE2와의 결합을 저해시켜 SARS-CoV-2의 세포내 유입을 차단함에 의해 작용할 수 있다.
상기 접합체는 약물을 항체 또는 이의 항원 결합 단편과 결합시켜 공지된 방법으로 제작할 수 있다. 항체와 약물은 그들 자신이 가진 연결기 등을 통해 직접 결합할 수도 있고, 링커나 다른 물질을 통해 간접적으로 결합할 수도 있다. 약물이 항체로부터 절단되도록 하는 주요 기전에는 리소좀(히드라존, 아세탈 및 시스-아코니테이트-유사 아미드)의 산성 pH에서의 가수분해, 리소좀 효소(카텝신 및 기타 리소좀 효소)에 의한 펩타이드 절단 및 디설파이드의 환원이 포함된다. 이러한 다양한 절단 기전의 결과로서, 약물을 항체에 연결시키는 기전은 매우 다양하며 어떠한 적합한 링커라도 사용될 수 있다.
항체와 약물이 결합하기 위한 적절한 연결기는 당해 분야에 잘 알려져 있으며, 예를 들어 이황화기, 티오에테르기, 산분해성기, 광분해성기, 펩티다제 분해성기 및 에스테라아제 분해성기를 포함한다.
약물이 직접 결합될 경우 연결기(linking group)는 예로서는, SH기를 이용한 이황화결합이나 말레이미드를 매개로 하는 결합을 들 수 있다. 예를 들면, 항체 Fc영역의 분자 내 이황화결합과 약물의 이황화결합을 환원하여, 양자를 이황화결합으로 연결한다. 또한, 말레이미드를 통하는 방법 및 항체 내에 시스테인을 유전공학적으로 도입하는 방법도 있다.
항체와 약물을 다른 물질(링커)을 통해 간접적으로 결합시킬 수도 있다. 링커로는 항체, 약물 또는 모두와 반응하는 작용기를 1 또는 2종류 이상 가지는 것이 바람직하다. 작용기의 예로는 아미노기, 카르복실기, 머캡토기, 말레이미드기, 피리디닐기 등을 들 수 있다.
SARS-CoV-2 S 단백질에 특이적으로 결합하는 항체를 포함하는 다중특이적 항체
본 발명의 또 다른 측면은, 상기 SARS-CoV-2 스파이크 단백질에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함하는 다중특이적 항체(multispecific antibody)를 제공한다.
본 명세서에 사용된 용어, "다중특이적 항체(multispecific antibody)"는 이중특이 항체(bispecific antibody) 및 삼중특이 항체(trispecific antibody)를 포함하는 2개 이상의 항원을 표적으로 하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 의미한다. 예를 들어, 이중특이 항체는 항체의 2개의 암(arm) 중에서, 하나의 암(arm)은 본 발명에 따른 SARS-CoV-2 스파이크 단백질에 대한 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함하고, 나머지 다른 암(arm)은 SARS-CoV-2 스파이크 단백질 이외의 다른 항원을 포함하는 형태를 의미한다.
상기 다중특이적 항체는 유전공학 또는 임의의 방법에 의해 제조될 수 있는 형태이며, 이중특이적(Bi-specific) 항체, 삼중특이적(Tri-specific) 항체 또는 사중특이적(Tetra-specific) 항체를 포함할 수 있다.
다중특이적 항체는 본 발명에 따른 항-SARS-COV-2의 스파이크 항체가 면역효능세포-특이적 표적분자에 대한 결합능을 가지는 항체 또는 그 단편과 결합된 형태일 수 있다. 면역효능세포-특이적 표적 분자는 TCR/CD3, CD16(FcγRIIIa), CD44, CD56, CD69, CD64(FcγRI), CD89 및 CD11b/CD18(CR3)에서 선택되는 것이 바람직하지만, 이에 한정되는 것은 아니다.
다중특이적 항체는 본 발명에 따른 항-SARS-COV-2의 스파이크 항체가 면역을 자극하거나 저해시키는 사이토카인에 대한 결합능을 가지는 항체 또는 그 단편과 결합된 형태인 것이 바람직하다. 면역을 자극하거나 저해시키는 사이토카인은 예를 들면, IL-2, IL-6, IL-7, IFNα, GM-CSF, IL-10, 및 TGF-β에서 선택되는 것이 바람직하지만, 이에 한정되는 것은 아니다.
다중특이적 항체는 본 발명에 따른 항-SARS-COV-2의 스파이크 항체가 바이러스성 질환, 예컨대 독감, 헤르페스, B형 감염, C형 감염, 에이즈 등의 치료에 사용되고 있는 타겟, 예를 들면, CCR5 수용체, 뉴라미니다아제(neuraminidase), 헤마글루티닌(hemagglutinin), 인터페론류(예컨대, 인터페론 알파) 등에 대한 결합능을 가지는 항체 또는 그 단편과 결합된 형태인 것이 바람직하나, 이에 한정되는 것은 아니다.
다중특이적 항체에 속하는 항체들은 scFv 기반 항체, Fab 기반 항체 및 IgG 기반 항체 등으로 구분할 수 있다. 이중특이적 항체의 경우 두 개의 신호를 동시에 억제 또는 증폭시킬 수 있기 때문에 하나의 신호를 억제/증폭하는 경우보다 더욱 효과적일 수 있으며, 각각의 신호를 각각의 신호억제제로 처리했을 경우와 비교하면, 저용량 투약이 가능하며, 동일한 시간 및 공간에서의 두 개의 신호를 억제/증폭시킬 수 있다.
이중특이적 항체의 제조 방법은 널리 공지되어 있다. 전통적으로, 이중특이적 항체의 재조합 생산은 두 개의 중쇄가 상이한 특이성을 가지는 조건에서 두 개의 면역글로불린 중쇄/경쇄 쌍의 공동 발현을 근간으로 한다.
scFv를 기반으로 하는 이중특이적 항체의 경우, 상이한 scFv들의 VL과 VH를 각기 서로 조합하여 혼성 scFv를 이종이량체(heterodimer) 형태로 제조하여 디아바디(diabody)를 만들 수 있고, 상이한 scFv를 서로 연결해서 탠덤(tendem) ScFv를 제조할 수 있으며, Fab의 CH1과 CL을 각각의 scFv의 말단에 발현시켜 이종이량체성 미니항체(miniantibody)를 제조할 수 있고, Fc의 동종이량체성 도메인인 CH3 도메인의 일부 아미노산을 치환하여 'knob into hole' 형태의 이종이량체 구조로 변경시켜, 이들 변경된 CH3 도메인을 상이한 각각의 scFv 말단에 발현시킴으로써 이종이량체성 scFv 형태의 미니바디(minibody)를 제조할 수 있다.
Fab를 기반으로 하는 이중특이적 항체의 경우, 특정 항원에 대한 개별 Fab'를 이황화결합 또는 매개체를 이용해서 서로 조합하여 이종이량체성 Fab 형태로 제조할 수 있고, 특정 Fab의 중쇄 또는 경쇄의 말단에 상이한 항원에 대한 scFv를 발현시킴으로써 항원 결합가(valency)를 2개로 하거나, Fab과 scFv 사이에 경첩부위(hinge region)를 둠으로써 동종이량체 형태로 4개의 항원결합가를 가지도록 제조할 수 있다. 또한, Fab의 경쇄 말단과 중쇄 말단에 상이한 항원에 대한 scFv를 융합시킴으로써 항원에 대한 결합가를 3개로 만든 이중표적 바이바디(bibody) 및 Fab의 경쇄말단과 중쇄말단에 상이한 scFv를 각각 융합시킴으로써 항원에 대한 결합가를 3개로 가지도록 한 삼중표적 바이바디 형태로 제조할 수 있고, 상이한 Fab 3개를 화학적으로 접합시켜도 수득할 수 있다.
IgG를 기반으로 하는 이중특이적 항체의 경우, 마우스와 렛트 하이브리도마를 다시 교잡함으로써 하이브리드 하이브리도마, 일명 쿼드로마(quadromas)를 제조하여 이중특이적 항체를 생산하는 방법이 알려져 있다. 또한, 경쇄 부분은 공유하면서, 상이한 중쇄에 대해서 Fc의 CH3 동종이량체성 도메인의 일부 아미노산을 변형시켜 이종이량체 형태로 제작한 이른 바 'Holes and Knob' 형태로 이중특이적 항체를 제조할 수도 있다. 상이한 2종의 scFv를 IgG의 경쇄와 중쇄의 가변 도메인 대신 불변(constant) 도메인에 각각 융합 발현시켜 동종이량체 형태의 (scFv)4-IgG를 제조할 수도 있다.
SARS-CoV-2 S 단백질에 특이적으로 결합하는 항체를 포함하는 약학 조성물
본 발명의 또 다른 측면은, 상술한 SARS-CoV-2 스파이크 단백질에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 이를 포함하는 항체-약물 접합체 또는 다중특이적 항체를 포함하는 SARS-CoV-2 감염증의 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다.
상기 SARS-CoV-2 감염증은 SARS-COV-2의 스파이크 단백질의 발현 또는 과발현과 관련된 것일 수 있으며, SARS-CoV-2에 관한 것은 전술한 바와 같다.
본 명세서에 사용된 용어, "예방"은 본 발명에 따른 조성물의 투여로 SARS-CoV-2(severe acute respiratory syndrome coronavirus 2; 중증급성호흡기증후군 코로나바이러스 2)에 의해 유발되는 신종 코로나바이러스 감염증(COVID-19)을 억제시키거나 진행을 지연시키는 모든 행위를 의미하며, "치료"는 신종 코로나바이러스 감염증의 억제, 경감 또는 제거를 의미한다.
본 발명에 있어서, 상기 약학 조성물은 치료적 유효량의 항-SARS-COV-2의 스파이크 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 및 약학적으로 허용되는 첨가제를 포함하는 것을 특징으로 할 수 있다. "약학적으로 허용되는 담체"는 약물을 제제화하거나 또는 안정화시키는 것을 돕기 위해서 활성 성분에 추가될 수 있는 물질이고, 환자에게 유의한 독성 효과를 야기하지 않는다.
상기 첨가제는 환자를 자극하지 않고 투여 화합물의 생물학적 활성 및 특성을 저해하지 않는 담체 또는 희석제 등을 말한다. 액상 용액으로 제제화되는 조성물에 있어서 허용되는 약학적 담체로는, 멸균 및 생체에 적합한 것으로서, 식염수, 멸균수, 링거액, 완충 식염수, 알부민 주사용액, 덱스트로즈 용액, 말토덱스트린 용액, 글리세롤, 에탄올 및 이들의 혼합물을 사용할 수 있으며, 필요에 따라 항산화제, 완충액, 정균제 등 다른 통상의 첨가제를 첨가할 수 있다. 또한, 희석제, 분산제, 계면활성제, 결합제 및 윤활제를 부가적으로 첨가하여 수용액, 현탁액, 유탁액 등과 같은 주사용 제형, 환약, 캡슐, 과립 또는 정제로 제제화할 수 있다.
약학적으로 허용되는 담체는 멸균 주사가능한 용액제 또는 분산액제를 즉각 투여용(extemporaneous)으로 제조하기 위한 멸균 수용액 또는 분산액 및 멸균 분말을 포함한다. 조성물은 바람직하게는 비경구 주사용으로 제제화된다. 조성물은 용액제, 마이크로에멀젼제, 리포좀제, 또는 높은 약물 농도에 적합한 기타 주문된 제형으로 제제화될 수 있다. 담체는 예를 들어 물, 에탄올, 폴리올(예를 들어, 글리세롤, 프로필렌 글리콜 및 액체 폴리에틸렌 글리콜 등) 및 이것들의 적합한 혼합물을 함유하는 용매 또는 분산 매질일 수 있다. 일부 경우에, 조성물 중에 등장화제, 예를 들어 당, 폴리알콜, 예컨대 만니톨, 소르비톨 또는 염화나트륨을 포함시킬 수 있다. 각 제제는 약제학 분야에 잘 알려진 방법들을 이용하여 제조될 수 있다.
본 발명에 따른 약학 조성물의 투여량은 특별하게 한정되지는 않으나, 환자의 건강 상태 및 체중, 질환의 중증도, 약제의 종류, 투여경로 및 투여시간을 포함한 다양한 요인에 따라 변경될 수 있다. 본 발명에 따른 약학 조성물은 하루에 1회 또는 다회 용량으로 인간, 쥐(rat), 마우스(mouse), 가축, 등을 포함하는 포유동물 내로 전형적으로 허용된 경구 또는 비경구 경로의 다양한 경로를 통하여 투여될 수 있다. 구체적으로, 구강, 직장내, 국소, 정맥내, 복강내, 근육내, 동맥내, 경피, 비내, 흡입, 안구내, 폐내 또는 피내 경로를 통해 통상적인 방식으로 투여될 수 있지만, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에 따른 약학 조성물은 필요에 따라 볼루스로서 또는 연속 주입에 의해 환자에게 투여될 수 있다. 예를 들어, Fab 단편으로 대표되는 본 발명의 항-SARS-COV-2의 스파이크 항체의 항원 결합 단편의 볼루스 투여는 0.0025 내지 100 ㎎/kg 체중, 0.025 내지 0.25 ㎎/kg, 0.010 내지 0.10 ㎎/kg 또는 0.10 내지 0.50 ㎎/kg의 양일 수 있다. 연속 주입의 경우, Fab 단편으로 대표되는 본 발명의 항-SARS-COV-2의 스파이크 항체의 항원 결합 단편은 0.001 내지 100 ㎎/kg 체중/분, 0.0125 내지 1.25 ㎎/kg/분, 0.010 내지 0.75 ㎎/kg/분, 0.010 내지 1.0 ㎎/kg/분 또는 0.10 내지 0.50 ㎎/kg/분으로 1시간 내지 24시간, 1시간 내지 12시간, 2시간 내지 12시간, 6시간 내지 12시간, 2시간 내지 8시간, 또는 1시간 내지 2시간의 기간 동안 투여될 수 있다. 본 발명의 항-SARS-COV-2의 스파이크 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 투여하는 경우, 투여량은 약 1 내지 10 ㎎/kg 체중, 2 내지 8 ㎎/kg, 또는 5 내지 6 ㎎/kg일 수 있다. 전장 항-SARS-COV-2의 스파이크 항체는 전형적으로 30분 내지 35분의 기간 동안 지속되는 주입을 통해 투여한다. 투여 빈도는 상태의 중증도에 따라 달라진다. 빈도는 1주당 3회 내지 매 1주 또는 2주 마다 1회의 범위일 수 있다.
SARS-CoV-2 감염증의 예방 또는 치료 방법
본 발명은 또한 상기 항-SARS-COV-2의 스파이크 항체 또는 이의 항원 결합 단편 또는 상기 다중특이적 항체 또는 항체-약물 접합체의 치료적 유효량을 신종 코로나바이러스 감염증(COVID-19)의 예방 또는 치료를 필요로 하는 환자에게 투여하는 단계를 포함하는, 신종 코로나바이러스 감염증(COVID-19)의 예방 또는 치료 방법에 관한 것이다. 상기 예방 또는 치료 방법은 상기 투여 단계 이전에 상기 질병의 예방 또는 치료를 필요로 하는 환자를 확인하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.
경우에 따라서, 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 종래의 다른 항바이러스제와 병용함으로써 SARS-COV-2의 스파이크 단백질을 발현하는 세포를 효과적으로 표적화하고, 항바이러스 활성을 증가시킬 수 있다. 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 기존의 항바이러스제, 예컨대 에볼라바이러스치료제, HIV(인간면역결핍바이러스)치료제, C형간염치료제, 독감치료제 등일 수 있다. 구체적 약물의 일예로는 칼레트라(kaletra), 렘데시비르(remdesivir), 플라크닐(하이드록시클로로퀸), 레소친(클로로퀸) 등과 함께 사용될 수 있다. 또한, 상기 항바이러스제 이외에 신종 코로나바이러스 감염증(COVID-19)에 치료 효과가 있는 것으로 보고되고 있는 당뇨병 치료제(예컨대, 다파글리플로진(dapagliflozin)), 류마티스 관절염 치료제(예컨대, 아나킨라(anakinra), 토실리주맙(tocilizumab), 사리루맵(sarilumab)), 혈액암 치료제(예컨대, 아칼라브루티닙(acalabrutinib), 다발골수종 치료제(예컨대, 셀리넥서(selinexor)) 등과 함께 사용될 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다. 또한, 기타 항체, 예컨대 독감, 헤르페스, B형 감염, C형 감염, 에이즈 등의 치료에 사용되고 있는 타겟, 예를 들면, CCR5 수용체, 뉴라미니다아제(neuraminidase), 헤마글루티닌(hemagglutinin), 인터페론류(예컨대, 인터페론 알파) 등에 대한 결합능을 가지는 항체와 함께 사용될 수 있다.
본 발명에 따른 항-SARS-COV-2의 스파이크 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 및 이를 포함하는 약학 조성물은 기존의 항바이러스 치료제와 동시에 투여되거나, 순차적으로 투여될 수 있다.
SARS-CoV-2 S 단백질에 특이적으로 결합하는 항체를 포함하는 진단용 조성물 및 진단 방법
본 발명의 또 다른 측면은, 상술한 SARS-CoV-2 스파이크 단백질에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 이를 포함하는 항체-약물 접합체 또는 다중특이적 항체를 포함하는 SARS-CoV-2 감염증의 진단용 조성물을 제공한다.
또한, 상기 진단용 조성물을 이용한 신종 코로나바이러스 감염증(COVID-19)의 진단 방법을 제공한다.
본 발명의 진단용 조성물은 목적하는 질환의 진단에 사용되는 주된 수단을 의미하는 것으로, 본 발명의 목적에 따라 SARS-CoV-2를 진단하기 위한 물질들이 포함될 수 있다. 진단 방법은 항체 또는 항체 단편을 샘플과 접촉시키는 것을 포함할 수 있다. 상기 샘플은 객담, 콧구멍, 부비강(sinus caⅵty), 침샘, 폐, 간, 췌장, 신장, 귀, 눈, 태반, 소화관, 심장, 난소, 뇌하수체, 부신, 갑상선, 뇌 또는 피부로부터 취한 조직, 세포, 소변, 전혈, 혈청, 혈장, 분변, 세포 배양 상등액 또는 파열된 진핵세포일 수 있다.
본 발명에 따른 상기 항-SARS-COV-2의 스파이크 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 상기 항체-약물 접합체, 또는 상기 다중특이적 항체를 통해 시료에서의 SARS-COV-2의 스파이크 단백질 발현 수준을 측정함으로써 신종 코로나바이러스 감염증(COVID-19)을 진단할 수 있다. 발현 수준은 통상적인 면역분석 방법에 따라 측정할 수 있으며, 상기 SARS-COV-2의 스파이크 단백질에 대한 항체를 이용한 방사능면역분석, 방사능면역침전, 면역침전, 면역조직화학염색, ELISA(enzyme-linked immunosorbent assay), 캡처-ELISA, 억제 또는 경쟁 분석, 샌드위치 분석, 유세포 분석(flow cytometry), 면역형광염색 및 면역친화성 정제를 통해 측정할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 상기 면역분석 결과, 생물학적 시료에서의 SARS-COV-2의 스파이크 단백질 발현이 정상 생물학적 시료(예컨대, 비강, 구강, 혈액, 혈장 또는 혈청으로부터 채취한 시료)보다 높게 나오는 경우에는 신종 코로나바이러스 감염증(COVID-19)인 것으로 진단될 수 있다.
SARS-CoV-2 S 단백질에 특이적으로 결합하는 항체를 포함하는 키트
본 발명의 또 다른 측면은, 상술한 SARS-CoV-2 스파이크 단백질에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함하는 SARS-CoV-2 스파이크 단백질의 검출 또는 정량용 키트를 제공한다. 즉, 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함하는 SARS-CoV-2 감염증의 진단용 조성물 포함하는 진단용 키트를 제공한다.
본 발명에 따른 상기 키트는 당업자에게 알려진 종래의 제조방법에 의해 제조될 수 있으며, 버퍼, 안정화제, 불활성 단백질 등을 더 포함할 수 있다. 또한, 본 발명에 따른 항-SARS-COV-2의 스파이크 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 또는 이를 포함하는 항체-약물 접합체 또는 다중특이적 항체 및 검출가능한 시그널을 발생시키는 레이블(label)을 포함할 수 있다. 상기 레이블은 항체에 결합된 화학물질(예컨대, 바이오틴), 효소(알칼린 포스파타제, β-갈락토시다제, 호스 래디쉬 퍼옥시다제, 루시퍼라제 또는 사이토크롬 P450), 방사능물질(예컨대, C14, I125, P32 및 S35), 형광물질(예컨대, 플루오레신), 발광물질, 화학발광물질(chemiluminescent) 및 FRET(fluorescence resonance energy transfer)를 포함할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 이때 효소에 대한 기질은 효소로서 알칼린 포스파타아제가 이용되는 경우에는, 기질로서 브로모클로로인돌일 포스페이트(BCIP), 니트로 블루 테트라졸리움(NBT), 나프톨-AS-B1-포스페이트(naphthol-AS-B1-phosphate) 및 ECF(enhanced chemifluorescence)와 같은 발색반응 기질이 이용되고, 호스 래디쉬 퍼옥시다아제가 이용되는 경우에는 클로로나프톨, 아미노에틸카바졸, 디아미노벤지딘, D-루시페린, 루시게닌(비스-N-메틸아크리디늄 니트레이트), 레소루핀 벤질 에테르, 루미놀, 암플렉스 레드 시약(10-아세틸-3,7-디하이드록시페녹사진), HYR(p-phenylenediamine-HCl and pyrocatechol), TMB(tetramethylbenzidine), ABTS(2,2'-Azine-di[3-ethylbenzthiazoline sulfonate]), o-페닐렌디아민(OPD) 및 나프톨/파이로닌, 글루코스 옥시다아제와 t-NBT(nitroblue tetrazolium) 및 m-PMS(phenzaine methosulfate)과 같은 기질이 이용될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
시료와 항체가 반응함으로써 나타내는 시그널의 세기를 분석하여 신종 코로나바이러스 감염증(COVID-19)을 진단할 수 있다. 진단을 위해 사용되는 효소의 활성 측정 또는 시그널의 측정은 당업계에 공지된 다양한 방법에 따라 실시될 수 있으며, 이를 통해 SARS-COV-2의 스파이크 단백질 발현을 정성적 또는 정량적으로 분석할 수 있다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것은 아니다.
실시예 1. 항원 발현 및 정제
실시예 1.1. 항원 단백질 발현 벡터 제작
SARS-CoV-2-RBD를 클로닝하기 위해, SARS-CoV-2(2019-nCoV) 스파이크 S1 유전자 ORF cDNA(Sino biological, Cat: VG40591-CF) 및 세포외 도메인만을 얻기 위해 5'과 3'에 제한효소 Sfi I/Nhe I 사이트가 포함된 SARS-CoV-2-RBD에 대한 프라이머 쌍(표 1)을 이용하여 중합효소연쇄반응(polymerase chain reaction, PCR)을 실시하였다. 얻어진 PCR 산물과 N293F 벡터를 이용하여 SARS-CoV-2-RBD의 아미노-말단에 6×His 또는 인간 Fc(hFc)가 융합된 단백질을 각각 발현하는 발현 벡터들을 제작하였다(도 1).
명칭 5'→3' 서열 서열번호
SARS-CoV-2-RBD-F CGTGTTCAGCCTACCGAGAGC 307
SARS-CoV-2-RBD-R GAAGTTCACGCATTTGTTCTT 308
실시예 1.2. 항원 단백질의 발현 및 정제
형질감염(transfection)은 최적화된 조건에서 PEI(polyethylenimine; Aldrich, Cat. 408727)를 이용하여 수행하였다. 인간 HEK293F 세포를 ㎖당 5×105 개가 되도록 조정하여 배지(#Freestyle 293 AGT type; AG100009P1, Thermo.)에 접종하고 1×106 cells/㎖이 될 때까지 배양하였다. 상기 실시예 1.1.에서 얻은 각 발현 벡터와 PEI를 섞어 폴리플렉스(polyplex)를 형성하게 한 후, 상기 세포에 첨가하여 형질감염시킨 다음 발프로산(VPA, valproate, Sigma-P4543) 1 nM을 첨가한 후 6일 동안 더 배양하였다. 발현된 SARS-CoV-2-RBD를 protein A agarose 또는 Ni-NTA 비드를 사용하여 1차 정제하였고, 1차 정제된 단백질을 Superdex 200(1.5 ㎝×100 ㎝) 젤 여과 크로마토그래피를 이용하여 정제하였다. 정제된 단백질의 순도를 SDS-PAGE와 크기 배제 크로마토그래피(TSK-GEL G-3000 SWXL Size-exclusion chromatography(SEC) (Tosoh))를 이용하여 확인하였으며, 단백질의 순도는 95% 이상이었다(도 2). SARS-CoV-2-RBD가 기능을 유지하는지의 여부를 ACE2와의 상호작용(interaction)으로 확인하였다.
실시예 2. SARS-CoV-2 스파이크에 대한 인간 항체의 선별
실시예 2.1. 면역 라이브러리(Immune Library)의 제작
충남대학교 감염내과를 통해 20명의 Covid-19 확진 환자로부터 동의 하에 PBMC를 입수하였다. PBMC로부터 total RNA를 분리하고, 이를 이용하여 RT-PCR을 진행함으로써 cDNA를 제조하였다. 얻어진 cDNA를 면역 라이브러리 제작에 사용하였다. 중쇄 가변부와 경쇄 가변부를 증폭하기 위해 상기 cDNA로 PCR을 진행하였다. 염기서열 분석을 통해 중쇄 가변영역과 경쇄 가변영역의 다양성을 확인한 다음, scFv(중쇄 가변부와 경쇄 가변부의 연결)를 만들기 위해 다시 PCR을 진행하였다. 서열분석을 통해 중쇄 가변부와 경쇄 가변부의 연결이 잘 되었는지 확인하였다. 면역 라이브러리를 만들기 위해, 정제된 scFv를 파지 벡터(pYG100)에 삽입하여 전기천공 형질전환용 세포인 ElectroTen-Blue 세포(Agilent, Cat #200159)와 함께 2.50 kV, 1 pulse에서 전기 충격을 준 다음, 세포를 SOBCG 한천배지(2%(w/v) 박토트립톤, 1.0% (w/v) 박토-이스트, 0.05%(w/v) NaCl, 5 mM MgCl2, 10 mM 글루코스, 34 ㎍/㎖ 클로람페니콜, 15g 박토-아가)에 도말하여 37℃에서 16시간 동안 배양하였다. 다음날, 얻어진 라이브러리 콜로니의 염기서열을 확인하여 면역 라이브러리의 다양성을 확인하였다.
실시예 2.2. 바이오패닝
7.5×1010의 다양성을 가진 인간 scFv 라이브러리(Ymax®-ABL; (주)와이바이오로직스))와 상기 실시예 2.1.에서 제작한 면역 라이브러리를 대장균에 감염시킨 후, 얻어진 대장균을 30℃에서 16시간 배양하였다. 배양액을 원심 분리하여 상층액을 PEG(polyethylene glycol)로 농축한 다음, 이를 PBS(phosphate buffered saline) 완충용액에 녹여 인간 항체 라이브러리 파지를 준비하였다.
실시예 1에서 제조한 SARS-CoV-2-RBD-hFc와 SARS-CoV-2-RBD-His 단백질 항원 각 50 ㎍을 면역흡착튜브(Immunosorb tube)에 코팅한 후 블로킹(blocking)을 수행하였다. 이 면역흡착튜브에 상기와 같이 준비된 라이브러리 파지를 넣고 실온에서 2시간 반응시킨 다음, 1× PBST(PBS + tween-20)와 1× PBS로 세척한 후, 100 mM TAE와 Tris-HCl(pH7.5) 용액을 차례로 처리하여 항원에 특이적으로 결합한 scFv-파지들만을 용출(elution)시켰다. 용출된 파지를 다시 대장균에 감염시켜 증폭시키는 패닝과정을 통해 양성 파지의 풀(pool)을 얻고, 첫 번째 라운드의 패닝에서 증폭된 파지를 가지고 PBST 세척 단계에서 횟수만 늘리고, 나머지는 동일한 방법으로 2라운드와 3라운드 패닝을 수행하였다.
그 결과, 표 2와 같이 3라운드 패닝에서 항원에 결합한 파지 수가 input(항원과 반응시킬 때의 파지 수) 대비 output(항원과 결합시킨 뒤 세척 이후 용출했을 때의 파지 수)이 다소 증가였음을 확인하였다.
구체적으로, 표 2에 패닝에 따른 항체의 역가를 비교하여 나타내었다.
패닝 횟수 Input Output
1회 2.0×1013 3.6×107
2회 1.2×1013 7.0×107
3회 2.0×1013 2.0×109
실시예 2.3. 단일클론 선별
폴리 파지 ELISA를 통해 결합능이 큰 것으로 확인된 3라운드 패닝의 양성 파지 풀로부터 단일클론(monoclone)을 선별하였고, 이들을 96-딥 웰 플레이트(96-deep well plate)에서 키워 헬퍼 파지를 감염하여 배양한 다음, 상층액에 존재하는 모노 scFv-파지를 항원이 코팅된 면역-플레이트에 옮겨 direct ELISA를 수행하였다. 이때, SARS-CoV-2-RBD에 대한 모노 파지 ELISA와 비특이적 항원 대조군인 ITGA6-Fc 단백질에 대한 ELISA도 동시에 수행하여, 얻어진 양성 파지 클론이 SARS-CoV-2-RBD에 특이적인지도 확인하였다.
그 결과, 도 3에서와 같이, 모노 scFv-파지 클론들은 SARS-CoV-2-RBD에만 결합능이 강함을 확인하였다.
실시예 2.4. 단일클론의 염기서열 분석
결합능을 기준으로 최종 선별된 15종의 단일클론들에 대해 DNA 정제 키트(Qiagen, 독일)를 사용하여 파지미드(phagemid) DNA를 분리하여 DNA 염기서열을 분석하였다. 중쇄 CDR(Complementarity-determining regions) 및 경쇄 CDR의 아미노산 서열, 중쇄 FR(Framework) 및 경쇄 FR의 아미노산 서열을 각각 하기 표 3 및 표 4에 나타내었고, 중쇄 및 경쇄 가변영역의 아미노산 서열 및 이를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드 서열을 각각 하기 표 5 및 표 6에 나타내었다.
항체 CDR 서열 서열번호
SA3755 CDRH1 GFTFDDHT 1
CDRH2 ISWDGGST 2
CDRH3 TRDASRRPGDGGYDFDV 3
CDRL1 TGTVTRGHW 4
CDRL2 DTD 5
CDRL3 LLSYSDSRV 6
SA3779 CDRH1 GFTFSSYA 7
CDRH2 ISYDGSNK 8
CDRH3 ARRGHYYDSSGYLY 9
CDRL1 QRIATY 10
CDRL2 AAS 11
CDRL3 QQSYAIPYT 12
SA3827 CDRH1 GFTFSSYA 13
CDRH2 ISYDGSNK 14
CDRH3 ARRGHYYDSSGFLY 15
CDRL1 QSISTY 16
CDRL2 AAS 17
CDRL3 QQSYNTPRT 18
SA3830 CDRH1 GFNFDEYS 19
CDRH2 IKYNSNTI 20
CDRH3 ARDAMRGGDFDH 21
CDRL1 QSISDW 22
CDRL2 KAS 23
CDRL3 QQYYSTTWT 24
SA3838 CDRH1 GYIFTELS 25
CDRH2 FDPEEGKT 26
CDRH3 AKIGHLGDFWY 27
CDRL1 TSDIGSYDY 28
CDRL2 GVT 29
CDRL3 ATYTSSATYV 30
SA3856 CDRH1 GFTVTSAY 31
CDRH2 IYGGGST 32
CDRH3 TGPYPGRYDY 33
CDRL1 QDIRTS 34
CDRL2 DAS 35
CDRL3 QQYKTVPLT 36
SA3902 CDRH1 GYAFSYYH 37
CDRH2 INPGSGGT 38
CDRH3 AGSEQPHYYANGAYRV 39
CDRL1 QSISSY 40
CDRL2 EVS 41
CDRL3 QQYDT 42
SA4040 CDRH1 GYTFTGYY 43
CDRH2 INPNSGGT 44
CDRH3 ARDQAFSMVRGVTDY 45
CDRL1 SSDVGGYNY 46
CDRL2 EVT 47
CDRL3 SSYAGDNTWI 48
SA4043 CDRH1 VITVSSNY 49
CDRH2 IYPGGST 50
CDRH3 ARDLDIVGGMDV 51
CDRL1 QSISRW 52
CDRL2 AAS 53
CDRL3 QQYDSYPRT 54
SA4044 CDRH1 GFTVSSNY 55
CDRH2 IYSGGST 56
CDRH3 ARDLPQFDGFDY 57
CDRL1 NIGSKS 58
CDRL2 SDT 59
CDRL3 QVWDSTTDHVV 60
SA4050 CDRH1 GYTFTGYF 61
CDRH2 INPNSGGT 62
CDRH3 ARVPHLSGYYYEGVLGYFDY 63
CDRL1 SIDIGSYNF 64
CDRL2 DVS 65
CDRL3 SSYTSSSLWV 66
SA4053 CDRH1 GFTFSSYW 67
CDRH2 IKQDGSEK 68
CDRH3 ARDVGRGYCSSTSCYRFGGREDFFDY 69
CDRL1 FSNVGNNF 70
CDRL2 DNN 71
CDRL3 GTWDTSLSGVV 72
SA4055 CDRH1 VITVSSNY 73
CDRH2 IYPGGST 74
CDRH3 ARDLDIVGGMDV 75
CDRL1 SSDVGDYNL 76
CDRL2 DVS 77
CDRL3 SSYTSSTTVV 78
SA4056 CDRH1 VITVSSNY 79
CDRH2 IYPGGST 80
CDRH3 ARDLDIVGGMDV 81
CDRL1 QSISRW 82
CDRL2 AAS 83
CDRL3 QQYDSYPRT 84
SA4057 CDRH1 VITVSSNY 85
CDRH2 IYPGGST 86
CDRH3 ARDLDIVGGMDV 87
CDRL1 SSNIGAPHD 88
CDRL2 ANN 89
CDRL3 QSYDSSLRAYV 90
항체 FR 서열 서열번호
SA3755 FRH1 QMQLVESGGGVVQPGGSLRLSCAAS 91
FRH2 MHWVRQAPGKGLEWVSL 92
FRH3 YYADSVKGRFTISRDNSKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYC 93
FRH4 WGQGTQVTVSS 94
FRL1 QAVVTQEPSLTVSPGGTVTLTCGSS 95
FRL2 PYWFQQKPGQAPRTLIY 96
FRL3 NKHSWTPARFSGSLLGGKAALTLSGAQPEDEADYYC 97
FRL4 FGTGTKVTVL 98
SA3779 FRH1 QVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAAS 99
FRH2 MHWVRQAPGKGLEWVAV 100
FRH3 YYADSAKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYC 101
FRH4 WGHGTLITVSS 102
FRL1 DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRAS 103
FRL2 LHWYQQKPGRAPKLLIY 104
FRL3 SLQTGVPSRFSGSGSGTDFTLTINSLQPEDFATYYC 105
FRL4 FGQGTKLEIK 106
SA3827 FRH1 QVQLVESGGTLVQPGRSLRLSCAAS 107
FRH2 MHWVRQAPGKGLEWVAV 108
FRH3 YYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYC 109
FRH4 WGQGTLVTVSS 110
FRL1 DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRAS 111
FRL2 LSWYQQKPGKAPKLLIY 112
FRL3 NLQSGVPSRFSASGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYC 113
FRL4 FGQGTKVEIK 114
SA3830 FRH1 QVQLVESGGGLIQPGRSLSLSCAAS 115
FRH2 MHWVRQRPGKGLEWVSG 116
FRH3 LYADSVKGRFTVSRDNSKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYC 117
FRH4 WGQGTLITVSS 118
FRL1 DIQMTQSPSYLSASAGDRVTITCRAS 119
FRL2 LAWYQHKPGKAPKLLIY 120
FRL3 RLENGVPSRFRGSGSATDFTLTISSLQAEDVAVYYC 121
FRL4 FGQGTKVDIK 122
SA3838 FRH1 QVQLVESGAEVKKPGASVRVSCKIS 123
FRH2 IHWVRQAPGKGLEWMGG 124
FRH3 IYAQKFQGRVTMTEDTSTDTAYMELSSLRSEDTAVYYC 125
FRH4 WGQGTLITVSS 126
FRL1 QSALTQPASVSGSPGQSITISCTGT 127
FRL2 VSWYQQHPGKAPKLIIY 128
FRL3 RRPSGVSNRFSGSKSGNTASLTISRLLTEDEAEYYC 129
FRL4 FGTGTKVTVL 130
SA3856 FRH1 QMQLVESGGGLIQPGGSLRLSCAAS 131
FRH2 MSWVRQAPGKGLEWVSI 132
FRH3 YYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYC 133
FRH4 WGRGTLVTVSS 134
FRL1 DIQMTQSPSSLSASVGDRVIITCRAS 135
FRL2 LAWFQQRLGEAPRSLIY 136
FRL3 SLQNGVPSKFRGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYC 137
FRL4 FGGGTKVEIK 138
SA3902 FRH1 QVQLVQSGAEVRQPGASVKVSCKTS 139
FRH2 IHWVRQAPGQGLEWMGL 140
FRH3 NYAQKFQGRVTLTRDTSTSTVYMDLTGLRSEDTAVYYC 141
FRH4 WGQGTLVTVSS 142
FRL1 DIQMTQSPSTLSASVGDRVTITCRAS 143
FRL2 LNWYQQKPGKAPKLLIY 144
FRL3 TLESGVPSRFSGSRSGTEFTLTISSLQPDDFATYYC 145
FRL4 FGGGTKVEIK 146
SA4040 FRH1 EVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKAS 147
FRH2 MHWARQAPGQGLEWMGW 148
FRH3 NYAQKFQGRVTMTRDTSITTAYMELSRLTSDDTAVYYC 149
FRH4 WGQGTLVTVSS 150
FRL1 QSALTQPPSASGSPGQSVIISCTGS 151
FRL2 VAWYQQYPGAAPKLIIS 152
FRL3 KRPSGVPDRFSGSKSGNTASLTISGLQAEDEANYYC 153
FRL4 FGGGTKLTVL 154
SA4043 FRH1 QVQLQESGGGLVQPGGSLRLSCAAS 155
FRH2 MSWVRQAPGKGLEWVSV 156
FRH3 YYADSVKGRFTISRDKSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYC 157
FRH4 WGQGTTVTVSS 158
FRL1 DIQMTQSPSTLSASVGDRVTITCRAS 159
FRL2 LAWYQQKPGQAPKLLIY 160
FRL3 TLQSGVPSRFSGSGSGTEFTLTISSLQPDDFATYYC 161
FRL4 FGQGTKVDIK 162
SA4044 FRH1 EVQLVQSGGGLIQPGGSLRLSCAAS 163
FRH2 MSWVRQAPGKGLEWVSV 164
FRH3 YYADSVKGRFTISRDNSKNTLHLQMNSLRAEDTAVYYC 165
FRH4 WGQGTLVTVSS 166
FRL1 QSALTQPPSLSVAPGRTARITCGGN 167
FRL2 VNWYQHMPGQAPVLVIY 168
FRL3 DRPSGIPERVSGSKSGNTATLSISRVEAGDEADYYC 169
FRL4 FGGGTKLTVL 170
SA4050 FRH1 QVQLVESGAEVKKPGASVKVSCKAS 171
FRH2 IHWVRQAPGQGLEWMGW 172
FRH3 NYAQKFQGRVTMTRDTSISTAYMELSRLRSDDTAVYYC 173
FRH4 WGQGTLVTVSS 174
FRL1 QSALTQPASVSGSPGQSITISCTGT 175
FRL2 VSWYQRHPGKAPRLLIY 176
FRL3 DRPSGVSNRFSGSKSANTASLTISGLQAEDEADYYC 177
FRL4 FGGGTKLTVL 178
SA4053 FRH1 EVQLVQSGGGLVQPGGSLRLSCADS 179
FRH2 MSWVRQVPGKGLEWVAN 180
FRH3 YYVDSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYC 181
FRH4 WGQGTLVTVSS 182
FRL1 QLVLTQPPSVSAAPGQRVTISCSGS 183
FRL2 VSWYRHLPGTAPELLIY 184
FRL3 QRPSGIPDRFSASKSGTSATLAITGLHTGDEADYYC 185
FRL4 FGGGTKLTVL 186
SA4055 FRH1 EVQLVQSGGGLVQPGGSLRLSCAAS 187
FRH2 MSWVRQAPGKGLEWVSV 188
FRH3 YYADSVKGRFTISRDKSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYC 189
FRH4 WGQGTTVTVSS 190
FRL1 QSALTQPASVSGSPGQSITISCTGT 191
FRL2 VSWYQQHPGKAPKVMIY 192
FRL3 HRPSGVSNRFSGSKSGNTASLTISGLQAEDEADYYC 193
FRL4 FGGGTKLTVL 194
SA4056 FRH1 QVQLQESGGGLVQPGGSLRLSCAAS 195
FRH2 MSWVRQAPGKGLEWVSV 196
FRH3 YYADSVKGRFTISRDKSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYC 197
FRH4 WGQGTTVTVSS 198
FRL1 DIQMTQSPSTLSASVGDRVTITCRAS 199
FRL2 LAWYQQKPGQAPKLLIY 200
FRL3 TLQSGVPSRFSGSGSGTEFTLTISSLQPDDFATYYC 201
FRL4 FGQGTKVDIK 202
SA4057 FRH1 EVQLVQSGGGLVQPGGSLRLSCAAS 203
FRH2 MSWVRQAPGKGLEWVSV 204
FRH3 YYADSVKGRFTISRDKSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYC 205
FRH4 WGQGTTVTVSS 206
FRL1 QLVLTQPPSVSGAPGQRVTISCTGS 207
FRL2 VHWYQQLPGTAPRLLIY 208
FRL3 NRPSGVPDRFSGSKSGTSASLAITGLQDEDEADYYC 209
FRL4 FGTGTKVTVL 210
항체 가변영역 아미노산 서열 서열번호
SA3755 중쇄 QMQLVESGGGVVQPGGSLRLSCAAS GFTFDDHT MHWVRQAPGKGLEWVSL ISWDGGST YYADSVKGRFTISRDNSKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYC TRDASRRPGDGGYDFDV WGQGTQVTVSS 211
경쇄 QAVVTQEPSLTVSPGGTVTLTCGSS TGTVTRGHW PYWFQQKPGQAPRTLIY DTD NKHSWTPARFSGSLLGGKAALTLSGAQPEDEADYYC LLSYSDSRV FGTGTKVTVL 212
SA3779 중쇄 QVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAAS GFTFSSYA MHWVRQAPGKGLEWVAV ISYDGSNK YYADSAKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYC ARRGHYYDSSGYLY WGHGTLITVSS 213
경쇄 DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRAS QRIATY LHWYQQKPGRAPKLLIY AAS SLQTGVPSRFSGSGSGTDFTLTINSLQPEDFATYYC QQSYAIPYT FGQGTKLEIK 214
SA3827 중쇄 QVQLVESGGTLVQPGRSLRLSCAAS GFTFSSYA MHWVRQAPGKGLEWVAV ISYDGSNK YYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYC ARRGHYYDSSGFLY WGQGTLVTVSS 215
경쇄 DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRAS QSISTY LSWYQQKPGKAPKLLIY AAS NLQSGVPSRFSASGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYC QQSYNTPRT FGQGTKVEIK 216
SA3830 중쇄 QVQLVESGGGLIQPGRSLSLSCAAS GFNFDEYS MHWVRQRPGKGLEWVSG IKYNSNTI LYADSVKGRFTVSRDNSKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYC ARDAMRGGDFDH WGQGTLITVSS 217
경쇄 DIQMTQSPSYLSASAGDRVTITCRAS QSISDW LAWYQHKPGKAPKLLIY KAS RLENGVPSRFRGSGSATDFTLTISSLQAEDVAVYYC QQYYSTTWT FGQGTKVDIK 218
SA3838 중쇄 QVQLVESGAEVKKPGASVRVSCKIS GYIFTELS IHWVRQAPGKGLEWMGG FDPEEGKT IYAQKFQGRVTMTEDTSTDTAYMELSSLRSEDTAVYYC AKIGHLGDFWY WGQGTLITVSS 219
경쇄 QSALTQPASVSGSPGQSITISCTGT TSDIGSYDY VSWYQQHPGKAPKLIIY GVT RRPSGVSNRFSGSKSGNTASLTISRLLTEDEAEYYC ATYTSSATYV FGTGTKVTVL 220
SA3856 중쇄 QMQLVESGGGLIQPGGSLRLSCAAS GFTVTSAY MSWVRQAPGKGLEWVSI IYGGGST YYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYC TGPYPGRYDY WGRGTLVTVSS 221
경쇄 DIQMTQSPSSLSASVGDRVIITCRAS QDIRTS LAWFQQRLGEAPRSLIY DAS SLQNGVPSKFRGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYC QQYKTVPLT FGGGTKVEIK 222
SA3902 중쇄 QVQLVQSGAEVRQPGASVKVSCKTS GYAFSYYH IHWVRQAPGQGLEWMGL INPGSGGT NYAQKFQGRVTLTRDTSTSTVYMDLTGLRSEDTAVYYC AGSEQPHYYANGAYRV WGQGTLVTVSS 223
경쇄 DIQMTQSPSTLSASVGDRVTITCRAS QSISSY LNWYQQKPGKAPKLLIY EVS TLESGVPSRFSGSRSGTEFTLTISSLQPDDFATYYC QQYDT FGGGTKVEIK 224
SA4040 중쇄 EVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKAS GYTFTGYY MHWARQAPGQGLEWMGW INPNSGGT NYAQKFQGRVTMTRDTSITTAYMELSRLTSDDTAVYYC ARDQAFSMVRGVTDY WGQGTLVTVSS 225
경쇄 QSALTQPPSASGSPGQSVIISCTGS SSDVGGYNY VAWYQQYPGAAPKLIIS EVT KRPSGVPDRFSGSKSGNTASLTISGLQAEDEANYYC SSYAGDNTWI FGGGTKLTVL 226
SA4043 중쇄 QVQLQESGGGLVQPGGSLRLSCAAS VITVSSNY MSWVRQAPGKGLEWVSV IYPGGST YYADSVKGRFTISRDKSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYC ARDLDIVGGMDV WGQGTTVTVSS 227
경쇄 DIQMTQSPSTLSASVGDRVTITCRAS QSISRW LAWYQQKPGQAPKLLIY AAS TLQSGVPSRFSGSGSGTEFTLTISSLQPDDFATYYC QQYDSYPRT FGQGTKVDIK 228
SA4044 중쇄 EVQLVQSGGGLIQPGGSLRLSCAAS GFTVSSNY MSWVRQAPGKGLEWVSV IYSGGST YYADSVKGRFTISRDNSKNTLHLQMNSLRAEDTAVYYC ARDLPQFDGFDY WGQGTLVTVSS 229
경쇄 QSALTQPPSLSVAPGRTARITCGGN NIGSKS VNWYQHMPGQAPVLVIY SDT DRPSGIPERVSGSKSGNTATLSISRVEAGDEADYYC QVWDSTTDHVV FGGGTKLTVL 230
SA4050 중쇄 QVQLVESGAEVKKPGASVKVSCKAS GYTFTGYF IHWVRQAPGQGLEWMGW INPNSGGT NYAQKFQGRVTMTRDTSISTAYMELSRLRSDDTAVYYC ARVPHLSGYYYEGVLGYFDY WGQGTLVTVSS 231
경쇄 QSALTQPASVSGSPGQSITISCTGT SIDIGSYNF VSWYQRHPGKAPRLLIY DVS DRPSGVSNRFSGSKSANTASLTISGLQAEDEADYYC SSYTSSSLWV FGGGTKLTVL 232
SA4053 중쇄 EVQLVQSGGGLVQPGGSLRLSCADS GFTFSSYW MSWVRQVPGKGLEWVAN IKQDGSEK YYVDSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYC ARDVGRGYCSSTSCYRFGGREDFFDY WGQGTLVTVSS 233
경쇄 QLVLTQPPSVSAAPGQRVTISCSGS FSNVGNNF VSWYRHLPGTAPELLIY DNN QRPSGIPDRFSASKSGTSATLAITGLHTGDEADYYC GTWDTSLSGVV FGGGTKLTVL 234
SA4055 중쇄 EVQLVQSGGGLVQPGGSLRLSCAAS VITVSSNY MSWVRQAPGKGLEWVSV IYPGGST YYADSVKGRFTISRDKSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYC ARDLDIVGGMDV WGQGTTVTVSS 235
경쇄 QSALTQPASVSGSPGQSITISCTGT SSDVGDYNL VSWYQQHPGKAPKVMIY DVS HRPSGVSNRFSGSKSGNTASLTISGLQAEDEADYYC SSYTSSTTVV FGGGTKLTVL 236
SA4056 중쇄 QVQLQESGGGLVQPGGSLRLSCAAS VITVSSNY MSWVRQAPGKGLEWVSV IYPGGST YYADSVKGRFTISRDKSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYC ARDLDIVGGMDV WGQGTTVTVSS 237
경쇄 DIQMTQSPSTLSASVGDRVTITCRAS QSISRW LAWYQQKPGQAPKLLIY AAS TLQSGVPSRFSGSGSGTEFTLTISSLQPDDFATYYC QQYDSYPRT FGQGTKVDIK 238
SA4057 중쇄 EVQLVQSGGGLVQPGGSLRLSCAAS VITVSSNY MSWVRQAPGKGLEWVSV IYPGGST YYADSVKGRFTISRDKSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYC ARDLDIVGGMDV WGQGTTVTVSS 239
경쇄 QLVLTQPPSVSGAPGQRVTISCTGS SSNIGAPHD VHWYQQLPGTAPRLLIY ANN NRPSGVPDRFSGSKSGTSASLAITGLQDEDEADYYC QSYDSSLRAYV FGTGTKVTVL 240
항체 가변영역 뉴클레오타이드 서열 서열번호
SA3755 중쇄 CAGATGCAGCTGGTAGAGTCTGGGGGAGGTGTGGTACAGCCTGGGGGGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCACCTTTGATGATCATACCATGCACTGGGTCCGCCAAGCTCCGGGGAAGGGTCTGGAGTGGGTCTCTCTTATTAGTTGGGATGGTGGTAGCACATACTATGCAGACTCTGTGAAGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGACAACAGCAAAAACTCCCTGTATCTGCAAATGAACAGTCTGAGAGCCGAGGACACGGCCGTGTATTACTGTACGAGAGATGCTTCACGACGGCCCGGGGATGGTGGCTATGATTTTGACGTCTGGGGCCAGGGAACTCAGGTCACCGTCTCCTCA 241
경쇄 CAGGCTGTGGTGACTCAGGAGCCCTCACTGACTGTGTCCCCAGGAGGGACAGTCACTCTCACCTGTGGCTCCAGCACTGGAACTGTCACCAGAGGTCATTGGCCCTACTGGTTCCAGCAGAAGCCTGGCCAAGCCCCCAGGACACTGATTTATGATACAGACAACAAACACTCCTGGACACCTGCCCGGTTCTCAGGCTCCCTCCTTGGGGGCAAAGCTGCCCTGACGCTTTCGGGTGCGCAGCCTGAGGATGAGGCTGACTATTACTGCTTGCTCTCCTATAGTGATTCCCGGGTCTTCGGAACTGGGACCAAGGTCACCGTCCTA 242
SA3779 중쇄 CAGGTGCAGCTGGTGGAGTCTGGGGGAGGCGTGGTCCAGCCTGGGAGGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCACCTTCAGTAGTTATGCTATGCACTGGGTCCGCCAGGCCCCAGGCAAGGGGCTGGAGTGGGTGGCAGTTATATCATATGATGGAAGTAATAAATACTACGCAGACTCCGCGAAGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGACAATTCCAAGAACACGTTGTATCTGCAAATGAACAGTCTGAGAGCCGAGGACACGGCCGTGTATTACTGTGCGAGGCGTGGACATTATTATGATAGTAGTGGTTATTTGTATTGGGGCCACGGAACCCTGATCACCGTCTCCTCA 243
경쇄 GACATCCAGATGACCCAGTCTCCATCCTCCCTGTCTGCATCTGTAGGAGACAGAGTCACCATCACTTGCCGGGCAAGTCAGAGAATTGCCACCTATTTACATTGGTATCAGCAGAAACCAGGGAGAGCCCCTAAGCTCCTGATCTATGCTGCATCCAGTTTGCAAACTGGGGTCCCATCAAGGTTCAGTGGCAGTGGATCTGGGACAGATTTCACTCTCACCATCAACAGTCTGCAACCTGAAGATTTTGCGACTTACTACTGTCAACAGAGTTACGCTATCCCGTACACTTTTGGCCAGGGGACCAAGCTGGAGATCAAA 244
SA3827 중쇄 CAGGTGCAGCTGGTGGAGTCTGGGGGAACCTTGGTGCAGCCAGGGCGGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCACCTTCAGTAGCTATGCTATGCACTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGCAAGGGGCTGGAGTGGGTGGCAGTTATATCATATGATGGAAGTAATAAATACTACGCAGACTCCGTGAAGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGACAATTCCAAGAACACGCTGTATCTGCAAATGAACAGTCTGAGAGCCGAGGACACGGCCGTGTATTACTGTGCGAGGCGTGGGCATTACTATGATAGTAGTGGTTTTTTATATTGGGGCCAGGGAACCCTGGTCACCGTCTCCTCA 245
경쇄 GACATCCAGATGACCCAGTCTCCATCCTCCCTGTCTGCATCTGTCGGAGACAGAGTCACCATCACTTGCCGGGCAAGTCAGAGCATTAGCACCTATTTAAGTTGGTATCAGCAGAAACCAGGGAAAGCCCCTAAACTCCTGATTTATGCTGCATCCAATTTGCAAAGTGGGGTCCCATCAAGGTTCAGTGCCAGTGGATCTGGGACAGATTTCACTCTCACCATCAGCAGTCTGCAACCTGAAGATTTTGCCACTTACTACTGTCAACAGAGTTACAATACCCCTCGCACTTTTGGCCAAGGGACCAAGGTGGAGATCAAA 246
SA3830 중쇄 CAGGTGCAGCTGGTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGATACAGCCTGGCAGGTCCCTGAGCCTCTCGTGTGCAGCCTCTGGATTCAATTTTGATGAGTATTCCATGCACTGGGTCCGACAACGTCCAGGGAAGGGCCTGGAGTGGGTCTCAGGTATAAAGTACAACAGTAATACCATCCTCTATGCGGACTCTGTGAAGGGCCGCTTCACCGTCTCCCGAGACAACAGCAAAAACTCCCTGTATCTGCAAATGAACAGTCTGAGAGCCGAGGACACGGCCGTGTATTACTGTGCGAGAGATGCAATGAGGGGGGGCGATTTTGACCACTGGGGCCAGGGAACCCTGATCACCGTCTCCTCA 247
경쇄 GACATCCAGATGACCCAGTCTCCATCCTACCTGTCTGCATCTGCAGGAGACAGAGTCACCATCACTTGCCGGGCCAGTCAGAGTATTAGTGACTGGTTGGCCTGGTATCAGCATAAACCAGGAAAAGCCCCTAAGCTCCTCATTTATAAGGCCTCTCGTTTAGAAAATGGGGTCCCATCAAGGTTCCGGGGCAGTGGATCTGCGACAGACTTTACTCTCACCATCAGCAGCCTGCAGGCTGAAGATGTGGCAGTTTATTACTGTCAGCAATATTATAGTACTACGTGGACGTTCGGCCAAGGGACCAAGGTGGATATCAAA 248
SA3838
 중쇄 CAGGTGCAGCTGGTAGAGTCTGGGGCTGAGGTGAAGAAGCCTGGGGCCTCAGTGAGGGTCTCCTGCAAGATTTCCGGATACATCTTCACTGAATTATCCATACACTGGGTGCGACAGGCTCCTGGAAAGGGGCTTGAGTGGATGGGAGGTTTTGATCCTGAAGAAGGTAAAACAATCTACGCACAGAAGTTCCAGGGCAGAGTCACCATGACCGAGGACACATCTACAGACACAGCCTACATGGAGCTGAGCAGCCTGAGATCTGAGGACACGGCCGTGTATTACTGTGCGAAAATCGGCCACCTGGGGGATTTTTGGTACTGGGGCCAGGGAACCCTGATCACCGTCTCCTCA 249
경쇄 CAGTCTGCCCTGACTCAGCCTGCTTCCGTGTCTGGGTCTCCTGGCCAGTCGATCACCATCTCCTGCACTGGAACCACCAGTGACATTGGTTCTTATGACTATGTCTCCTGGTATCAACAACACCCAGGCAAGGCCCCCAAACTCATCATTTATGGTGTCACTAGGCGGCCCTCGGGGGTTTCTAATCGCTTCTCTGGCTCCAAGTCTGGCAACACGGCCTCCCTGACCATCTCTAGGCTCCTGACTGAAGACGAGGCTGAGTATTACTGCGCCACATATACAAGCAGTGCCACTTATGTCTTCGGAACTGGGACCAAGGTCACCGTCCTA 250
SA3856 중쇄 CAGATGCAGCTGGTGGAGTCTGGAGGAGGCTTGATCCAGCCGGGGGGGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGGTTCACCGTCACCAGCGCCTACATGAGCTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGGCTGGAGTGGGTCTCAATTATTTATGGTGGTGGTAGCACATACTATGCAGACTCCGTGAAGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGACAATTCCAAGAACACGCTGTATCTTCAAATGAACAGTCTGAGAGCCGAGGACACGGCCGTGTATTACTGTACGGGTCCCTATCCCGGCCGCTATGACTACTGGGGCCGGGGAACCCTGGTCACCGTCTCCTCA 251
경쇄 GACATCCAGATGACCCAGTCTCCATCCTCACTGTCTGCATCTGTAGGAGACAGAGTCATTATCACTTGTCGGGCGAGTCAGGACATTAGAACTTCTTTGGCCTGGTTTCAGCAGAGATTAGGGGAAGCCCCTAGGTCCCTCATCTATGATGCATCCAGTTTGCAGAATGGGGTCCCATCAAAGTTCCGCGGCAGTGGATCTGGGACAGATTTCACTCTCACCATCAGCAGCCTGCAGCCTGAAGATTTTGCAACTTATTACTGCCAACAATATAAAACTGTGCCGCTCACTTTCGGCGGAGGGACCAAGGTGGAGATCAAA 252
SA3902 중쇄 CAGGTGCAGCTGGTGCAGTCTGGAGCTGAGGTGAGGCAGCCTGGGGCCTCAGTGAAAGTTTCCTGCAAGACATCTGGATACGCCTTCTCCTACTACCATATACACTGGGTGCGACAGGCCCCTGGACAAGGGCTTGAGTGGATGGGATTAATCAACCCTGGTAGTGGTGGCACAAACTACGCACAGAAGTTCCAGGGCAGAGTCACCTTGACCAGGGACACGTCCACGAGCACAGTCTACATGGACCTAACCGGCCTGAGATCTGAGGACACGGCCGTGTATTACTGTGCGGGTTCTGAGCAACCTCACTACTATGCAAATGGTGCTTACCGAGTCTGGGGTCAGGGAACCCTGGTCACCGTCTCCTCA 253
경쇄 GACATCCAGATGACCCAGTCTCCTTCCACCCTGTCTGCATCTGTAGGAGACAGAGTCACCATCACTTGCCGGGCAAGTCAGAGCATTAGCAGCTATTTAAATTGGTATCAACAGAAACCAGGGAAAGCCCCTAAACTCCTGATCTATGAGGTTTCTACTTTGGAAAGTGGGGTCCCATCAAGGTTCAGCGGCAGTAGATCTGGGACAGAATTCACTCTCACCATCAGCAGCCTGCAGCCTGATGATTTTGCAACTTATTACTGCCAACAGTATGATACTTTCGGCGGAGGGACCAAGGTGGAAATCAAA 254
SA4040 중쇄 GAGGTGCAGCTGGTGCAGTCTGGGGCTGAGGTGAAGAAGCCTGGGGCTTCAGTGAAGGTCTCTTGCAAGGCTTCTGGATACACCTTCACCGGCTACTATATGCACTGGGCGCGACAGGCCCCTGGACAAGGGCTTGAGTGGATGGGATGGATCAACCCTAACAGTGGTGGCACAAACTATGCACAGAAGTTTCAGGGCAGGGTCACCATGACCAGGGACACGTCCATCACCACAGCCTACATGGAGCTGAGCAGGCTGACATCTGACGACACGGCCGTATATTACTGTGCGAGAGATCAGGCCTTTTCTATGGTTCGGGGAGTCACCGACTACTGGGGCCAGGGAACCCTGGTCACCGTCTCGTCAGGGAGTGCATCCGCCCCAACCCTT 255
경쇄 CAGTCTGCCCTGACTCAGCCTCCCTCCGCGTCCGGGTCTCCTGGACAGTCAGTCATCATCTCCTGCACTGGAAGCAGCAGTGACGTGGGTGGTTATAACTATGTCGCCTGGTACCAACAATACCCAGGCGCAGCCCCCAAACTCATCATTTCTGAGGTCACTAAGCGGCCCTCAGGGGTCCCTGATCGCTTCTCTGGCTCCAAGTCTGGCAACACGGCCTCTCTGACCATCTCTGGGCTCCAGGCTGAGGATGAGGCTAATTATTACTGCAGCTCATATGCTGGAGACAACACTTGGATCTTCGGCGGAGGGACCAAGCTGACCGTCCTA 256
SA4043 중쇄 CAGGTGCAGCTGCAGGAGTCGGGGGGAGGCTTGGTCCAGCCTGGGGGGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGTAATCACCGTCAGTAGCAACTACATGAGCTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGGCTGGAGTGGGTCTCAGTTATTTATCCCGGAGGTAGCACATATTACGCAGACTCCGTGAAGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGACAAGTCCAAGAACACGCTGTATCTTCAAATGAACAGCCTGAGAGCTGAGGACACGGCTGTGTATTACTGTGCGAGAGATCTTGACATCGTGGGGGGTATGGACGTCTGGGGCCAAGGGACCACGGTCACCGTCTCCTCAGCCTCCACCAAGGGCCCATCGGTC 257
경쇄 GACATCCAGATGACCCAGTCTCCTTCCACCCTGTCTGCATCTGTAGGAGACAGAGTCACCATCACTTGCCGGGCCAGTCAGAGTATCAGTAGGTGGTTGGCCTGGTATCAGCAGAAACCAGGCCAAGCCCCTAAGCTCCTGATCTATGCTGCATCCACTTTACAAAGTGGGGTCCCATCAAGGTTCAGCGGCAGTGGGTCTGGGACAGAATTCACTCTCACCATCAGCAGCCTGCAGCCTGATGATTTTGCAACTTATTACTGCCAACAATATGATAGTTATCCAAGGACGTTCGGCCAAGGGACCAAGGTGGATATCAAA 258
SA4044 중쇄 GAGGTGCAGCTGGTGCAGTCTGGAGGAGGCTTGATCCAGCCTGGGGGGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGGTTCACCGTCAGTAGCAACTACATGAGCTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGGCTGGAGTGGGTCTCAGTTATTTATAGCGGTGGTAGCACATACTACGCAGACTCCGTGAAGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGACAATTCCAAGAACACGCTGCATCTTCAAATGAACAGCCTGAGAGCCGAGGACACGGCCGTGTATTACTGTGCGAGAGACCTTCCCCAGTTCGATGGGTTTGACTACTGGGGCCAGGGAACCCTGGTCACCGTCTCCTCAGGGAGTGCATCCGCCCCAACCCTT 259
경쇄 CAGTCTGCCCTGACTCAGCCTCCCTCACTGTCCGTGGCCCCAGGAAGGACGGCCAGGATTACCTGTGGAGGAAACAACATTGGAAGTAAAAGTGTTAACTGGTACCAGCACATGCCAGGCCAGGCCCCTGTTTTGGTCATCTATTCTGATACCGACCGGCCCTCAGGGATCCCTGAGCGAGTCTCTGGCTCCAAGTCTGGGAACACGGCCACCCTGAGCATCAGCAGGGTCGAAGCCGGGGATGAGGCCGACTATTACTGTCAGGTGTGGGATAGTACTACTGATCATGTGGTCTTCGGCGGAGGGACCAAGCTGACCGTCCTA 260
SA4050 중쇄 CAGGTGCAGCTGGTGGAGTCTGGGGCTGAGGTGAAGAAGCCTGGGGCCTCAGTGAAGGTCTCCTGCAAGGCTTCTGGATACACCTTCACCGGCTACTTTATCCACTGGGTGCGACAGGCCCCTGGACAAGGGCTTGAGTGGATGGGATGGATCAACCCTAACAGTGGTGGCACAAACTATGCACAGAAGTTTCAGGGCAGGGTCACCATGACCAGGGACACGTCCATCAGCACAGCCTACATGGAGCTGAGCAGGCTGAGATCTGACGACACGGCCGTGTATTACTGTGCGAGAGTACCTCATCTTAGTGGTTATTACTACGAAGGAGTATTGGGGTACTTTGACTACTGGGGCCAGGGAACCCTGGTCACCGTCTCCTCAGGGAGTGCATCCGCCCCAACCCTT 261
경쇄 CAGTCTGCCCTGACTCAGCCTGCCTCCGTGTCTGGGTCTCCTGGACAGTCGATCACCATCTCCTGCACTGGAACCAGCATTGATATTGGAAGTTATAATTTTGTCTCCTGGTACCAGCGACATCCAGGCAAAGCCCCCCGACTCCTCATTTATGATGTCAGTGATCGGCCCTCAGGGGTCTCTAATCGCTTCTCCGGCTCCAAGTCCGCCAACACGGCCTCCCTGACCATCTCTGGGCTCCAGGCTGAGGACGAGGCTGATTATTATTGCAGCTCATATACAAGCAGCAGTCTTTGGGTGTTCGGCGGAGGGACCAAGCTGACCGTCCTA 262
SA4053 중쇄 GAGGTGCAGCTGGTGCAGTCTGGGGGAGGCTTGGTCCAGCCTGGGGGGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCAGACTCTGGATTCACCTTTAGTAGCTATTGGATGAGCTGGGTCCGCCAGGTTCCAGGGAAGGGGCTGGAGTGGGTGGCCAACATAAAGCAAGATGGAAGTGAGAAATACTATGTGGACTCTGTGAAGGGCCGATTCACCATCTCCAGGGACAACGCCAAGAACTCACTATATCTGCAAATGAACAGCCTGAGAGCCGAGGACACGGCCGTGTATTACTGTGCGAGAGACGTGGGTAGGGGATATTGTAGTAGTACCAGCTGCTATCGCTTCGGGGGAAGGGAGGATTTCTTTGACTACTGGGGCCAGGGAACCCTGGTCACCGTCTCCTCAGCCTCCACCAAGGGCCCATCGGTC 263
경쇄 CAGCTCGTGCTGACTCAGCCGCCCTCCGTGTCTGCGGCCCCCGGACAGAGGGTCACCATCTCCTGCTCTGGAAGCTTCTCCAACGTTGGAAATAATTTTGTCTCGTGGTACCGGCACCTCCCGGGAACAGCCCCCGAACTCCTCATTTATGACAATAATCAGCGACCCTCAGGGATTCCTGACCGATTCTCTGCCTCCAAGTCTGGCACGTCAGCCACCCTGGCCATCACCGGACTCCACACTGGGGACGAGGCCGATTATTACTGCGGAACATGGGATACCAGCCTGAGTGGTGTGGTTTTCGGCGGAGGGACCAAGCTGACCGTCCTA 264
SA4055 중쇄 GAGGTGCAGCTGGTGCAGTCTGGGGGAGGCTTGGTCCAGCCTGGGGGGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGTAATCACCGTCAGTAGCAACTACATGAGCTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGGCTGGAGTGGGTCTCAGTTATTTATCCCGGAGGTAGCACATATTACGCAGACTCCGTGAAGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGACAAGTCCAAGAACACGCTGTATCTTCAAATGAACAGCCTGAGAGCTGAGGACACGGCTGTGTATTACTGTGCGAGAGATCTTGACATCGTGGGGGGTATGGACGTCTGGGGCCAAGGGACCACGGTCACCGTCTCCTCAGCCTCCACCAAGGGCCCATCGGTC 265
경쇄 CAGTCTGCCCTGACTCAGCCCGCCTCCGTGTCTGGGTCTCCTGGACAGTCGATCACCATCTCCTGCACTGGAACCAGCAGTGACGTTGGTGATTATAACTTGGTCTCCTGGTACCAACAACACCCAGGCAAAGCCCCCAAAGTCATGATTTATGATGTCAGTCATCGGCCCTCAGGGGTTTCTAATCGCTTCTCTGGCTCCAAGTCTGGCAACACGGCCTCCCTGACCATCTCTGGGCTCCAGGCTGAGGACGAGGCTGATTATTATTGCAGCTCATATACAAGCAGCACTACTGTGGTATTCGGCGGAGGGACCAAGCTGACCGTCCTA 266
SA4056 중쇄 CAGGTGCAGCTGCAGGAGTCGGGGGGAGGCTTGGTCCAGCCTGGGGGGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGTAATCACCGTCAGTAGCAACTACATGAGCTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGGCTGGAGTGGGTCTCAGTTATTTATCCCGGAGGTAGCACATATTACGCAGACTCCGTGAAGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGACAAGTCCAAGAACACGCTGTATCTTCAAATGAACAGCCTGAGAGCTGAGGACACGGCTGTGTATTACTGTGCGAGAGATCTTGACATCGTGGGGGGTATGGACGTCTGGGGCCAAGGGACCACGGTCACCGTCTCCTCAGCCTCCACCAAGGGCCCATCGGTC 267
경쇄 GACATCCAGATGACCCAGTCTCCTTCCACCCTGTCTGCATCTGTAGGAGACAGAGTCACCATCACTTGCCGGGCCAGTCAGAGTATCAGTAGGTGGTTGGCCTGGTATCAGCAGAAACCAGGCCAAGCCCCTAAGCTCCTGATCTATGCTGCATCCACTTTACAAAGTGGGGTCCCATCAAGGTTCAGCGGCAGTGGGTCTGGGACAGAATTCACTCTCACCATCAGCAGCCTGCAGCCTGATGATTTTGCAACTTATTACTGCCAACAATATGATAGTTATCCAAGGACGTTCGGCCAAGGGACCAAGGTGGATATCAAA 268
SA4057 중쇄 GAGGTGCAGCTGGTGCAGTCTGGGGGAGGCTTGGTCCAGCCTGGGGGGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGTAATCACCGTCAGTAGCAACTACATGAGCTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGGCTGGAGTGGGTCTCAGTTATTTATCCCGGAGGTAGCACATATTACGCAGACTCCGTGAAGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGACAAGTCCAAGAACACGCTGTATCTTCAAATGAACAGCCTGAGAGCTGAGGACACGGCTGTGTATTACTGTGCGAGAGATCTTGACATCGTGGGGGGTATGGACGTCTGGGGCCAAGGGACCACGGTCACCGTCTCCTCAGCCTCCACCAAGGGCCCATCGGTC 269
경쇄 CAGCTCGTGCTGACTCAGCCGCCCTCAGTGTCTGGGGCCCCAGGGCAGAGGGTCACCATCTCCTGCACCGGGAGCAGCTCCAACATCGGGGCACCTCATGATGTACACTGGTACCAGCAACTTCCAGGAACAGCCCCCAGACTCCTCATCTATGCTAACAACAATCGGCCCTCAGGGGTCCCTGACCGCTTCTCTGGCTCCAAGTCTGGCACCTCAGCCTCCCTGGCCATCACTGGGCTCCAGGATGAGGATGAGGCTGATTATTACTGCCAGTCCTATGACAGTAGCCTGCGTGCTTATGTGTTCGGAACTGGGACTAAGGTCACCGTCCTA 270
실시예 3. SARS-CoV-2 스파이크 인간 단일클론 항체의 최적화
실시예 3.1. 항체 최적화를 위한 라이브러리 제작
LC 셔플링(light chain shuffling; LS) 라이브러리를 제작하기 위해, 모항체(SA3755, SA3779, SA3827, 및 SA3838)의 LC 유전자를 BstX I으로 절단한 다음 벡터로 사용하고, Ymax®-ABL((주)와이바이오로직스)을 BstX I으로 절단하여 인서트로 사용하였다. 리가제로 라이게이션 후, 전기천공 형질전환용 세포를 이용하여 형질 전환을 수행하였다. 사각 접시(square plate)에 형질전환된 세포를 모아 항체 라이브러리를 제조한 결과, 약 1×107의 다양성을 갖는 라이브러리를 얻었고, 염기 서열 분석 결과 HC의 서열은 모두 같으며 LC의 서열이 서로 다른 것을 확인하였다.
실시예 3.2. 항체 최적화를 위한 바이오패닝
상기 실시예 1에서 제조한 SARS-CoV-2-RBD-hFc 단백질 항원 50 ㎍을 면역흡착튜브에 코팅한 후 블로킹을 수행하였다. 상기 실시예 3.1.에서 얻은 1×107의 다양성을 가진 LS 셔플링 인간 scFv 라이브러리를 대장균에 감염시킨 후, 대장균을 30℃에서 16 시간 배양하였다. 배양액을 원심 분리하여 상층액을 PEG로 농축한 다음, 이를 PBS 완충용액에 녹여 인간 항체 라이브러리를 준비하였다. 면역흡착튜브에 라이브러리 파지를 넣은 후, 실온에서 2시간 반응시킨 다음, 1× PBS/T와 1× PBS로 세척한 후 항원에 특이적으로 결합한 scFv-파지들만 용출시켰다. 용출된 파지를 다시 대장균에 감염시켜 증폭시키는 패닝 과정을 통해 양성 파지의 풀(pool)을 얻고, 첫 번째 라운드의 패닝(panning)에서 증폭된 파지를 가지고 PBST 세척 단계의 횟수를 늘린 것을 제외하고는 동일한 방법으로 2라운드 패닝을 수행하였다.
그 결과, 표 7과 같이 2라운드 패닝에서 항원에 결합한 파지 수가 input(항원과 반응시킬 때의 파지 수) 대비 output(항원과 결합시킨 뒤 세척 이후 용출했을 때의 파지 수)이 다소 증가였음을 확인하였다.
구체적으로, 표 7에 패닝에 따른 항체의 역가를 비교하여 나타내었다.
샘플 패닝 횟수 input output
SA3755 1회 2.0×1012 2.0×107
2회 1.1×1011 2.6×107
SA3779 1회 5.0×1012 3.2×107
2회 5.8×1011 1.0×108
SA3827 1회 9.0×1012 1.0×108
2회 3.4×1011 3.1×106
SA3838 1회 3.0×1012 1.0×108
2회 1.8×1011 4.0×106
실시예 3.3. 단일클론 선별
폴리 파지 ELISA를 통해 결합능이 큰 것으로 확인된 2라운드 패닝의 양성 파지 풀로부터 단일클론들을 선별하였고, 이들을 이용하여 실시예 2.3.과 동일한 방식으로 direct ELISA를 실시하고 SARS-CoV-2-RBD에 대한 특이성을 확인하였다. 그 결과, 도 4에서와 같이 모노 scFv-파지 클론들은 SARS-CoV-2-RBD에만 결합능이 강함을 확인하였다.
실시예 3.4. 단일클론의 염기서열 분석
선별된 4종의 단일클론들에 대해 DNA 정제 키트(Qiagen, 독일)를 사용하여 파지미드(phagemid) DNA를 분리하여 DNA 염기서열을 분석하였다. LC 셔플링(shuffling)에 의한 항체 최적화를 진행했기 때문에 중쇄의 서열은 모항체와 같다. 따라서 경쇄 CDR의 아미노산 서열, 경쇄 FR의 아미노산 서열을 각각 하기 표 8 및 표 9에 나타내었고, 경쇄 가변영역의 아미노산 서열 및 이를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드 서열을 각각 하기 표 10 및 표 11에 나타내었다.
항체 CDR 서열 서열번호
(SA3755AM)
SA4079		 CDRL1 TGTVTRGHW 271
CDRL2 DTD 272
CDRL3 LLSYSDSRV 273
(SA3779AM)
SA4086		 CDRL1 QSISTY 274
CDRL2 AAS 275
CDRL3 QQSYNTPRT 276
(SA3827AM)
SA4114		 CDRL1 QSIDNY 277
CDRL2 AAS 278
CDRL3 QQSYSIPRT 279
(SA3838AM)
SA4118		 CDRL1 TSDIGSYDY 280
CDRL2 GVT 281
CDRL3 SSCTRSSTYV 282
항체 FR 서열 서열번호
(SA3755AM)
SA4079		 FRL1 QAVVTQEPSLTVSPGGTATLTCGSS 283
FRL2 PYWFQQKPGQAPRTLIY 284
FRL3 TKHSWTPARFSGSLLGGKAALTLSGAQPEDEADYYC 285
FRL4 FGTGTKVTVL 286
(SA3779AM)
SA4086		 FRL1 DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRAS 287
FRL2 LSWYQQKPGKAPKLLIY 288
FRL3 NLQSGVPSRFSASGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYC 289
FRL4 FGQGTKVEIK 290
(SA3827AM)
SA4114		 FRL1 DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRAG 291
FRL2 LNWYQQKPGKAPKLLIY 292
FRL3 TLHSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPDDFATYYC 293
FRL4 FGQGTKLEIK 294
(SA3838AM)
SA4118		 FRL1 QSALTQPASVSGSPGQSITISCTGT 295
FRL2 VSWYQQHPGKAPKLIIY 296
FRL3 RRPSGVSNRFSGSKSGNTASLTISGLQAEDEANYYC 297
FRL4 FGTGTKVTVL 298
항체 가변영역 아미노산 서열 서열번호
(SA3755AM)
SA4079		 경쇄 QAVVTQEPSLTVSPGGTATLTCGSS TGTVTRGHW PYWFQQKPGQAPRTLIY DTD TKHSWTPARFSGSLLGGKAALTLSGAQPEDEADYYC LLSYSDSRV FGTGTKVTVL 299
(SA3779AM)
SA4086		 경쇄 DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRAS QSISTY LSWYQQKPGKAPKLLIY AAS NLQSGVPSRFSASGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYC QQSYNTPRT FGQGTKVEIK 300
(SA3827AM)
SA4114		 경쇄 DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRAG QSIDNY LNWYQQKPGKAPKLLIY AAS TLHSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPDDFATYYC QQSYSIPRT FGQGTKLEIK 301
(SA3838AM)
SA4118		 경쇄 QSALTQPASVSGSPGQSITISCTGT TSDIGSYDY VSWYQQHPGKAPKLIIY GVT RRPSGVSNRFSGSKSGNTASLTISGLQAEDEANYYC SSCTRSSTYV FGTGTKVTVL 302
항체 가변영역 뉴클레오타이드 서열 서열번호
(SA3755AM)
SA4079		 경쇄 CAGGCTGTGGTGACTCAGGAGCCCTCACTGACTGTGTCCCCAGGAGGGACAGCCACTCTCACCTGTGGCTCCAGCACTGGAACTGTCACCAGAGGTCATTGGCCCTACTGGTTCCAGCAGAAGCCTGGCCAAGCCCCCAGGACACTGATTTATGATACAGACACCAAACACTCCTGGACACCTGCCCGGTTCTCAGGCTCCCTCCTTGGGGGCAAAGCTGCCCTGACGCTTTCGGGTGCGCAGCCTGAGGATGAGGCTGACTATTACTGCTTGCTCTCCTATAGTGATTCCCGGGTCTTCGGAACTGGGACCAAGGTCACCGTCCTA 303
(SA3779AM)
SA4086		 경쇄 GACATCCAGATGACCCAGTCTCCATCCTCCCTGTCTGCATCTGTCGGAGACAGAGTCACCATCACTTGCCGGGCAAGTCAGAGCATTAGCACCTATTTAAGTTGGTATCAGCAGAAACCAGGGAAAGCCCCTAAACTCCTGATTTATGCTGCATCCAATTTGCAAAGTGGGGTCCCATCAAGGTTCAGTGCCAGTGGATCTGGGACAGATTTCACTCTCACCATCAGCAGTCTGCAACCTGAAGATTTTGCCACTTACTACTGTCAACAGAGTTACAATACCCCTCGCACTTTTGGCCAAGGGACCAAGGTGGAGATCAAA 304
(SA3827AM)
SA4114		 경쇄 GACATCCAGATGACCCAGTCTCCATCCTCCCTGTCTGCATCTGTAGGGGACAGAGTCACCATCACTTGTCGGGCAGGCCAGAGCATTGACAACTATTTAAATTGGTATCAGCAGAAACCAGGGAAAGCCCCTAAGCTCCTGATCTATGCTGCATCCACTTTGCACAGTGGGGTCCCATCAAGGTTCAGTGGCAGTGGATCTGGGACAGATTTCACTCTCACCATCAGTAGTCTGCAGCCTGACGATTTTGCAACTTACTACTGTCAACAGAGTTACAGTATCCCTCGAACTTTTGGCCAGGGGACCAAGCTGGAAATCAAA 305
(SA3838AM)
SA4118		 경쇄 CAGTCTGCCCTGACTCAGCCTGCCTCCGTGTCTGGGTCTCCTGGACAGTCGATCACCATCTCCTGCACTGGAACCACCAGTGACATTGGTTCTTATGACTATGTCTCCTGGTATCAACAACACCCAGGCAAGGCCCCCAAACTCATCATTTATGGTGTCACTAGGCGGCCCTCGGGGGTTTCTAATCGCTTCTCTGGCTCCAAGTCTGGCAACACGGCCTCCCTGACCATCTCTGGGCTCCAGGCTGAGGACGAGGCTAATTATTACTGCAGCTCATGTACACGCAGCAGCACTTATGTCTTCGGAACTGGGACCAAGGTCACCGTCCTA 306
실시예 4. SARS-CoV-2 스파이크 인간 단일클론 항체의 생산
실시예 4.1. scFv 형태를 IgG 형태로 전환(conversion)
실시예 2에서 선별된 단일클론 파지 항체를 scFv 형태에서 IgG 형태로 전환하기 위해, 중쇄 가변 영역의 염기서열을 제한효소 SfiI/NheI 사이트를 이용하여 pNATVH((주)와이바이오로직스)에 클로닝하여 N293F HC 벡터를 제조하였고, 경쇄 가변 영역의 염기서열을 제한 효소 SfiI/BsiWI 사이트를 이용하여 pNATVL((주)와이바이오로직스)에 클로닝하여 N293F LC 벡터를 제조하였다.
실시예 4.2. 인간 단일클론 항체의 생산
N293F HC와 N293F LC 벡터를 HEK293F 세포에 동시 형질감염(co-transfection)시키고, 배양 7일차에 배양액을 수거하여 8,000 rpm에서 30분간 원심 분리하여 세포 잔해를 제거해 주었다. 이후 0.22 ㎛ 공극 크기의 보틀 탑 필터 (bottle top filter: Steritop-GP Filter Unit. #SCGPS01RE, Millipore)를 이용하여 여과하였다. 정제를 수행하기 위하여 빈 칼럼(#BR731-1550, Bio-rad)에 4 ㎖의 단백질 A 세파로스 레진 슬러리(KANEKA KanCapATM, Cat. No. KKC20170403_01)를 넣은 후 100 ㎖의 DPBS(#LB001-02)로 레진을 패킹 및 세척하였다. 패킹된 레진에 여과된 배양액을 로딩(loading)하고 1분당 1 ㎖의 속도로 흘려 주었다(#EP-1 Econo pump, Bio-Rad). 150 ㎖의 DPBS로 세척한 후, 10 ㎖의 0.1 M 글라이신(glycine)-HCl(pH 3.3)로 용출하였다. 용출액에 1 M Tris-HCl(pH 9.0)을 10% 첨가하여 pH를 중화시키고, Amicon Ultra-10(#UFC901096, Millipore)를 이용하여 DPBS로 버퍼를 바꾸어 주었다. 이 과정을 약 3회 실시한 후 1 ㎖ 정도로 농축되었을 때 멈추고, Nano-drop으로 농도를 측정하였다.
실시예 5. SARS-CoV-2 스파이크 인간 단일클론 항체의 특이성
실시예 5.1. SARS-CoV-2 스파이크에 대한 항체의 결합 특이성
SARS-CoV-2 스파이크 인간 단일클론 항체의 항원 특이성은 HEK293E 세포에 SARS-CoV-2 스파이크를 과발현한 세포 풀을 사용하여 항체의 결합 정도를 유세포 분석기(flow cytometer)로 분석하여 확인하였다.
SARS-CoV-2 스파이크를 과발현하는 형질전환 세포 풀은 SARS-CoV-2 스파이크 세포외 영역(아미노산 서열 M1-P1213, UniProt#P0DTC2)과 EpCAM(epithelial cell adhesion molecule)의 막 횡단부터 세포내 영역(아미노산 서열 A266-A314, UniProt#P16422)을 연결한 키메라(chimeric) 서열을 포함하고 있는 pcDNA3.1 플라스미드를 HEK293E에 형질감염 시킨 후, 200 ㎎/㎖의 Zeocin(#R25001, thermo Fisher Scientific)이 들어있는 선택적 배양 배지에서 선별과정을 수행하였다. 선별과정 후, 세포 표면에서 SARS-CoV-2 스파이크의 발현은 SARS-CoV-2 스파이크도 인식하는 SARS-CoV 스파이크 항체(#40150-T62-CoV2, Sino Biological)를 이용하여 FACS(fluorescence activated cell sorting) 분석을 통해 확인하고 분리하여 사용하였다.
SARS-CoV-2 스파이크 인간 단일클론 항체들의 세포 결합을 확인하기 위해 세포는 각 시료당 3×105 개로 준비하여 2 ㎎/㎖의 항체와 4℃에서 30분간 반응시켰다. 그 후 세포들은 2% FBS(fetal bovine serum)가 포함된 PBS로 3회 세척하고, FITC(fluorescein isothiocyanate) 형광물질이 결합된 항-인간 IgG 항체(#FI-3000, Vectorlabs)를 사용하여 4℃에서 30분간 암반응 후, 동일한 세척 과정을 거쳤다. 이후 0.2 ㎖의 2% FBS가 든 PBS로 현탁시킨 후, 유세포 분석기인 CytoFLEX(Beckman coulter, USA)를 사용하여 분석하였다.
그 결과, SARS-CoV-2 스파이크 인간 단일클론 항체들은 SARS-CoV-2 스파이크 과발현 HEK293E 세포(HEK293E/CoV-2 스파이크(chimeric))에는 잘 결합하였으나(도 5b 및 도 5d), HEK293E 세포(HEK293E/Mock)에는 결합하지 않았다(도 5a 및 도 5c). 이 결과는 Ymax®-ABL 유래 7종(도 5a 및 도 5b)과 환자-면역 라이브러리(patient-immune library) 유래 8종(도 5c 및 도 5d) 항체들은 HEK293E에 비특이성이 없으며, HEK293E에 발현된 SARS-CoV-2 스파이크 단백질에 특이적으로 결합하는 항체들임을 의미한다.
실시예 5.2. SARS-CoV-2 스파이크 S1에 대한 항체의 결합 특이성
SARS-CoV-2 스파이크 인간 단일클론 항체가 SARS-CoV-2 스파이크 S1(아미노산 서열 V16-R685, UniProt#P0DTC2) 뿐만 아니라 SARS-CoV 스파이크 S1(아미노산 서열 S14-R667, UniProt#P59594)에도 결합 특이성이 있는지 확인하기 위해 각 단백질의 카복시-말단에 His-tag이 융합된 재조합 단백질들을 사용하여 ELISA(enzyme-linked immunosorbent assay) 분석을 통해 확인하였다.
SARS-CoV 스파이크 S1-His(#40150-V08B1, Sino Biological) 또는 SARS-CoV-2 스파이크 S1-His 단백질을 웰 당 200 ng의 농도로 면역-96 마이크로웰 플레이트(immuno-96 microwell plate)에 분주하고 4℃에서 밤새 표면 고정시킨 후, 200 ㎕의 4% 탈지분유가 포함된 PBS-T를 모든 웰에 넣어 37℃에서 1시간 동안 반응시킴으로써 비특이적인 단백질 결합을 차단하였다.
이후 50 nM의 SARS-CoV-2 스파이크 인간 단일클론 항체 15종을 각 웰에 넣어 37℃에서 1시간 동안 반응시키고, 200 ㎕의 PBS-T로 3회 세척한 뒤에 HRP(horseradish peroxidase)가 결합되어 있는 염소 항-인간 IgG 항체(#ab97225, Abcam)를 1:4,000으로 희석하여 넣고 37℃에서 1시간 반응시켰다. PBS-T로 다시 3회 세척 후, 100 ㎕의 TMB 완충용액(#T0440, Sigma)을 넣어 빛이 없는 조건에서 반응시킨 후, 50 ㎕의 2.5M 황산(H2SO4)으로 반응을 중단시킨 다음 분광 광도계(spectraMax M5 spectrophotometer, Molecular Devices, 미국)를 이용하여 450 ㎚에서 흡광도를 측정하였다. 측정 값들은 GraphPad Prism 8(GraphPad Software, Inc., 미국)를 이용하여 분석하였다.
그 결과, Ymax®-ABL 유래 7종(도 6a)과 환자-면역 라이브러리 유래 8종(도 6b)의 SARS-CoV-2 스파이크 인간 단일클론 항체들은 SARS-CoV 스파이크 S1에 결합하지 않았고, 특이적으로 SARS-CoV-2 스파이크 S1에 결합하는 것을 보였다(도 6a 및 도 6b).
실시예 5.3. SARS-CoV-2 스파이크 인간 단일클론 항체의 항원 친화도(affinity) 확인
SARS-CoV-2 스파이크 인간 단일클론 항체의 항원에 대한 결합 친화도는 SARS-CoV-2 RBD(아미노산 서열 R319-F541, UniProt#P0DTC2)의 카복시-말단에 마우스 Fc(mFc)-tag이 융합된 재조합 단백질인 SARS-CoV-2 RBD-mFc 항원을 사용하여 Octet　QKe(Fortebio Inc., 미국) 분석 장비를 통해 측정하였다.
Octet　QKe를 이용한 항원 항체간 친화도 측정을 위해 AHC(anti-human Fc capture: #18-5060, Fortebio Inc.) 또는 AMC(anti-mouse Fc capture: #18-5088, Fortebio Inc.) 바이오센서를 완충액(#18-1042, Fortebio Inc.)에 10분간 안정화시킨 후에 항원 또는 항체를 고정하고, 고정되지 않은 항원 또는 항체는 완충액으로 5분간 세척하였다. 96-웰 플레이트(#655209, Greiner Bio-One, USA)에 결합을 원하는 항체 또는 항원을 농도별(0.94 nM~60 nM)로 준비하여 5분간 결합(association) 반응을 수행하고, 이어서 5분간 해리(dissociation) 반응을 수행하였다. 모든 실험은 30℃, 1,000 rpm 조건에서 수행하였고, 시간에 따른 결합과 해리 과정 중의 센서그램(sensorgram) 데이터를 수집하여 Octet 데이터 분석 소프트웨어 9.0에 따라 1:1 글로벌 바인딩 피팅 모델(global binding fitting model)을 적용하여 평형 해리상수(equilibrium dissociation constant, KD)를 구하였다.
그 결과, SARS-CoV-2 스파이크 인간 단일클론 항체, Ymax®-ABL 유래 7종(도 7a)과 환자-면역 라이브러리 유래 8종(도 7b)의 항체는 SARS-CoV-2 RBD에 대한 항원 친화도(KD)가 0.0284 nM~1.06 nM로 우수하였고, 각 항체들의 값은 표 12와 같다.
구체적으로, 표 12에 Octet 분석에 의한 항-SARS-CoV-2 스파이크 단일클론 항체의 항원 친화도를 정리하여 나타내었다.
항체 라이브러리 항체 SARS-CoV-2 RBD-mFc
KD(M) Ka(1/Ms) Kdis(1/s)
Ymax®-ABL
(A)		 SA3755 1.06×10-9 3.99×105 4.24×10-4
SA3779 1.05×10-9 2.13×105 2.23×10-4
SA3827 4.52×10-10 3.83×105 1.73×10-4
SA3830 7.82×10-10 8.97×105 7.02×10-4
SA3838 1.79×10-10 1.57×105 2.81×10-4
SA3856 8.88×10-11 4.84×105 4.30×10-5
SA3902 3.28×10-10 2.47×105 8.12×10-5
환자 면역
라이브러리
(B)		 SA4040 3.84×10-10 4.71×105 1.81×10-4
SA4043 1.40×10-10 4.50×105 6.32×10-4
SA4044 5.06×10-11 3.75×105 1.90×10-4
SA4050 9.29×10-11 5.03×105 4.67×10-5
SA4053 6.89×10-10 3.16×105 2.18×10-4
SA4055 6.10×10-11 3.87×105 2.36×10-5
SA4056 9.07×10-11 4.77×105 4.32×10-5
SA4057 2.84×10-11 1.75×105 4.96×10-6
KD(M), 친화상수(Affinity constant); Ka(1/Ms), 결합률(association rate); Kdis(1/s), 해리율(dissociation rate)
실시예 6. SARS-CoV-2 스파이크 인간 단일클론 항체 변이체의 특성
실시예 6.1. SARS-CoV-2 스파이크에 대한 항체 변이체의 결합 특이성
SARS-CoV-2 스파이크 인간 단일클론 항체 SA3755, SA3779, SA3827 및 SA3838를 친화도 성숙(affinity maturation, AM)시킨 각각의 변이체인 SA4079, SA4086, SA4114 및 SA4118의 항원 특이성은 실시예 5.1.과 같이 HEK293E 세포에 SARS-CoV-2 스파이크를 과발현한 세포 풀을 사용하여 항체의 결합 정도를 유세포 분석기(flow cytometer)로 분석하여 확인하였다.
그 결과, SARS-CoV-2 스파이크 인간 단일클론 항체 변이체들은 SARS-CoV-2 스파이크 과발현(over-expression) HEK293E 세포(HEK293E/CoV-2 스파이크(chimeric))에 모항체와 비교하여 유사 또는 우수한 결합을 보였고(도 8b), HEK293E 세포(HEK293E/Mock)에는 결합하지 않았다(도 8a). 이 결과는 SARS-CoV-2 스파이크 인간 단일클론 항체 변이체들(SA4079, SA4086, SA4114, SA4118)이 HEK293E에 비특이성이 없으며, HEK293E에 발현된 SARS-CoV-2 스파이크 단백질에 특이적으로 결합하는 항체들임을 의미한다.
실시예 6.2. SARS-CoV-2 스파이크 S1에 대한 항체 변이체의 결합 특이성
SARS-CoV-2 스파이크 인간 단일클론 항체 변이체가 SARS-CoV-2 스파이크 S1에 대해 결합 특이성이 유지되는지 실시예 5.2.와 같이 ELISA 분석을 통해 SARS-CoV 스파이크 S1과 비교하여 확인하였다.
그 결과, SARS-CoV-2 스파이크 인간 단일클론 항체 변이체들(SA4079, SA4086, SA4114, SA4118)은 각각 모항체와 같이 SARS-CoV 스파이크 S1에 결합하지 않았고, 특이적으로 SARS-CoV-2 스파이크 S1에 결합하였다(도 9).
실시예 6.3. SARS-CoV-2 스파이크 인간 단일클론 항체의 항원 친화도(affinity) 확인
SARS-CoV-2 스파이크 인간 단일클론 항체 변이체들의 항원에 대한 결합 친화도는 실시예 5.3.과 같이 카복시-말단에 마우스 Fc(mFc)-tag이 융합된 재조합 단백질인 SARS-CoV-2 RBD-mFc 항원을 사용하여 Octet　QKe(Fortebio Inc., 미국) 분석 장비를 통해 측정하였다.
그 결과, SARS-CoV-2 스파이크 인간 단일클론 항체 변이체들(SA4079, SA4086, SA4114, SA4118)은 SARS-CoV-2 RBD에 대한 항원 친화도(KD)가 0.0899 nM~0.157 nM로 우수하였고, 각각 모항체의 항원 친화도(표 12)에 비교하여 증가함을 보였다(도 10 및 표 13).
구체적으로, 표 13에 Octet 분석에 의한 항-SARS-CoV-2 스파이크 단일클론 항체 변이체의 항원 친화도를 정리하여 나타내었다.
친화도 성숙
(Affinity maturation, AM)		 항체 SARS-CoV-2 RBD-mFc
KD(M) Ka(1/Ms) Kdis(1/s)
SA3755AM SA4079 1.54×10-10 3.73×105 5.73×10-5
SA3779AM SA4086 1.06×10-10 4.71×105 4.99×10-5
SA3827AM SA4114 8.99×10-11 4.33×105 3.89×10-5
SA3838AM SA4118 2.96×10-11 6.95×105 2.05×10-5
KD(M), 친화상수(Affinity constant); Ka(1/Ms), 결합률(association rate); Kdis(1/s), 해리율(dissociation rate)
실시예 7. SARS-CoV-2 스파이크 인간 단일클론 항체 및 변이체의 항원 결합부위(epitope) 결정
실시예 7.1. SARS-CoV-2 스파이크 항체의 항원 결합 영역 확인
SARS-CoV-2 스파이크 인간 단일클론 항체 및 변이체의 항원 결합 부위(epitope)를 확인하기 위해 먼저 ACE2와 결합하는 SARS-CoV-2 RBD의 RBM 영역에 항체가 결합하는지 여부를 확인하였다. 항체의 SARS-CoV-2 RBM 영역 결합 여부는 표 14와 도 12a와 같이 SARS-CoV-2의 RBD내 RBM 아미노산 영역을 SARS-CoV RBD(아미노산 서열 R306-F527, UniProt#P59594)의 RBM으로 치환한 돌연변이체(SARS-CoV-2_RBM_CoV) 또는 그 반대로 치환한 돌연변이체(SARS-CoV_RBM_CoV-2), SARS-CoV-2 RBD, SARS-CoV RBD의 카복시-말단에 His-tag이 융합된 재조합 융합 단백질들인 SARS-CoV-2_RBM_CoV-His, SARS-CoV_RBM_CoV-2-His, SARAS-CoV-2 RBD-His, SARS-CoV RBD-His(#40150-V08B2, Sino Biological) 항원들을 사용하여 실시예 5.2.와 같이 ELISA 분석으로 확인하였다.
그 결과, Ymax®-ABL 유래 7종(도 11a)과 환자-면역 라이브러리 유래 8종(도 11b)의 SARS-CoV-2 RBD 인간 단일클론 항체들과 Ymax®-ABL 유래 4종을 최적화한 SA4079, SA4086, SA4114, SA4118 항체 변이체들(도 11c)은 항원 SARS-CoV-2 RBD와 SARS-CoV_RBM_CoV-2에 결합하고, SARS-CoV-2_RBM_CoV 또는 SARS-CoV RBD에는 결합하지 않았다. 이 결과는 SARS-CoV-2 스파이크 인간 단일클론 항체 및 변이체들이 ACE2와 결합하는 SARS-CoV-2 RBD의 RBM 영역에 특이적으로 결합한다는 것을 의미하며, 이부분에 에피토프를 갖는 항체들임을 알 수 있다.
구체적으로, 표 14에 SARS-CoV-2 또는 SARS-CoV의 RBD 돌연변이 서열을 나타내었다.
재조합 단백질 아미노산 잔기 또는 서열 영역의 치환
SARS-CoV-2 RBD-His R319-F541 wild type(WT)(UniProt#P0DTC2)
SARS-CoV-2 RBD-M2-His F486A, N487A, Y489A
SARS-CoV-2 RBD-M3-His T500A, N501A, G502A, Y505A
SARS-CoV-2 RBD-M4-His S438T, N439R, L441I
SARS-CoV-2 RBD-M5-His S443A, K444T, V445S, G446T
SARS-CoV-2 RBD-M6-His L452K, L455Y, F456L
SARS-CoV-2 RBD-M7-His K458H, S459G, N460K, K462R
SARS-CoV-2 RBD-M8-His T470N, E471V, I472P, Y473F, Q474S
SARS-CoV-2 RBD-M9-His A475P, G476D, S477G, T478K
SARS-CoV-2 RBD-M10-His N481T, G482P, V483Δ, E484P, G485A, F486L
SARS-CoV-2 RBD-M12-His Q498Y, P499T, N501T
SARS-CoV-2_RBM_CoV-His SARS-CoV RBD M417-T487 서열 영역으로 SARS-CoV-2 RBD T430-N501 서열 영역을 치환
SARS-CoV_RBM_CoV-2-His SARS-CoV-2 RBD T430-N501 서열 영역으로 SARS-CoV RBD M417-T487 서열 영역을 치환
SARS-CoV RBD-His R306-F527 wild type(WT)(UniProt#P59594)
실시예 7.2. SARS-CoV-2 스파이크 인간 단일클론 항체의 항원에 대한 결합부위(epitope) 확인
SARS-CoV-2 스파이크 인간 단일클론 항체 및 변이체의 항원에 대한 결합부위(epitope) 확인은 ACE2와 결합하는 SARS-CoV-2 RBD의 RBM 아미노산 서열을 표 14와 도 12a(gray box)와 같이 SARS-CoV RBD의 RBM 서열을 참고하여 특정 또는 불특정하게 다른 아미노산으로 치환하고 His-tag을 카복시-말단에 융합한 10종(M2~M10, M12)의 재조합 SARS-CoV-2 RBD 돌연변이체와 SARS-CoV-2 RBD 야생형(wild-type, WT)을 이용하여 ELISA 분석으로 확인하였다.
그 결과, SARS-CoV-2 스파이크 항체들은 SARS-CoV-2 RBD의 WT과 충분히 결합하는 조건에서 각 재조합 돌연변이체에 결합하지 않거나 매우 낮아지는 항체들이 존재하였으며, 결합하지 않거나 매우 낮아지는 부위(dark gray box)에 대해 그룹화한 결과 도 12b와 같이 9그룹(G1~G9)으로 분류되었다. 결과에서 SARS-CoV-2 스파이크 인간 단일클론 항체 및 변이체들이 재조합 SARS-CoV-2 RBD 돌연변이체들에 결합하지 않거나 매우 낮아진 부위(dark gray box)가 실제 항체들의 항원 결합 부위인 에피토프(epitope)임을 가리킨다. 15종 SARS-CoV-2 스파이크 인간 단일클론 항체들과 4종 항체 변이체들의 각 그룹별 에피토프 서열 부분은 표 14와 도 12의 돌연변이 서열 부분에 해당하는 SARS-CoV-2 RBD의 WT 서열이다.
세부적으로 대개의 항체들(SA4053, SA4055, SA4050, SA3779, SA4086(SA3779AM), SA3902, SA3838, SA4118(SA3838AM), SA3827, SA4114(SA3827AM), SA4040, SA4043, SA4056, SA4057, SA3830, SA3856, SA4044)은 M2, M8, M9, M10 부위 전체 또는 부분을 포함하거나 외적으로 다른 부분에 추가적인 에피토프를 갖는 항체들이었다. 또한, 특징적으로 SA3755, SA4079(SA3755AM), SA4053은 M5에, SA4053, SA3830, SA3856은 M6에, SA4044는 M7에, SA4053은 M12 부위에 에피토프를 갖거나 이를 포함하는 항체들이었다.
실시예 8. SARS-CoV-2 스파이크 인간 단일클론 항체의 중화능 평가
실시예 8.1. 경쟁 효소면역분석법에 의한 SARS-CoV-2 스파이크 인간 단일클론 항체의 중화능 확인
SARS-CoV-2 스파이크 인간 단일클론 항체가 ACE2/SARS-CoV-2 RBD 복합체 또는 ACE2/SARS-CoV-2 스파이크 S1 복합체 형성을 억제할 수 있는지 확인하기 위해, 1.94 nM의 SARS-CoV-2 RBD-mFc 또는 200 nM의 SARS-CoV-2 스파이크 S1-mFc 단백질에 항체들을 500 nM에서부터 1/3 희석 배수로 연속적으로 희석하였다. 그 후, 37℃에서 30분간 반응(pre-incubation) 시킨 후, 항원-항체 혼합물을 ACE2(UniProt#Q9BYF1) 카복시-말단에 His-tag이 융합된 재조합 단백질인 ACE2-His가 한 웰 당 200 ng으로 코팅된 면역-96 마이크로웰 플레이트(immune-96 microwell plate)에 첨가하여 37℃에서 1시간 동안 반응시켰다.
이후 200 ㎕의 PBS-T로 3회 세척한 뒤에 HRP(horseradish peroxidase)가 결합되어 있는 토끼 항 마우스 IgG 항체(Rabbit anti-Mouse IgG-HPR antibody, Cell signaling)를 1:2,000으로 희석하여 넣고 37℃에서 1시간 반응시켰다. PBS-T로 다시 3회 세척 후, 100 ㎕의 TMB 완충용액을 넣어 빛이 없는 조건에서 1분 30초 간 반응시킨 후, 50 ㎕의 2.5 M 황산(H2SO4)으로 반응을 중단시킨 다음, 분광 광도계(spectraMax M5 spectrophotometer, Molecular Devices, 미국)를 이용하여 450 ㎚에서 흡광도를 측정하였다. 측정 결과는 GraphPad Prism 8(GraphPad Software, Inc., 미국)를 이용하여 분석하였다.
SARS-CoV-2 스파이크 인간 단일클론 항체의 ACE2/SARS-CoV-2 RBD 또는 ACE2/SARS-CoV-2 스파이크 S1 결합을 저해하는 능력은 SARS-CoV-2 RBD-mFc 또는 SARS-CoV-2 스파이크 S1-mFc의 결합력 감소로 알 수 있고, 그 저해 정도는 항체에 의한 최대 억제의 50%에 이르는데 필요한 시료의 양(IC50)으로 나타낼 수 있다. 실험 결과에서 SARS-CoV-2 스파이크 인간 단일클론 항체들은 농도 의존적으로 ACE2와 SARS-CoV-2 RBD 또는 SARS-CoV-2 스파이크 S1 결합을 효과적으로 저해함을 확인하였다(도 13a 내지 도 13d).
Ymax®-ABL 유래 7종(도 13a 및 도 13b)과 환자-면역 라이브러리 유래 8종(도 13c 및 도 13d) 항체들의 SARS-CoV-2 RBD에 대한 IC50 값은 각각 0.91 nM~25.08 nM와 0.14 nM~58.27 nM(도 13a 및 도 13c), SARS-CoV-2 스파이크 S1에 대해서는 각각 0.61 nM~4.06 nM와 1.43 nM~22 nM였으며(도 13b 및 도 13d), 대조로 넣어준 수용성 ACE2에 우월한 특성을 보였다. 각 항체들의 IC50 값은 표 15와 같다.
구체적으로, 표 15에 경쟁 효소면역분석법에 의한 항-SARS-CoV-2 스파이크 단일클론 항체의 중화능 확인 결과를 정리하여 나타내었다.
항체 라이브러리 코팅(Coating) ACE2-His
바인더(Binder) SARS-CoV-2 RBD-mFc SARS-CoV-2 스파이크 S1-mFc
항체 IC50(nM) R-squared IC50(nM) R-squared
Ymax®-ABL
(A, B)		 hIgG - - - -
SA3755 7.736 0.9954 4.061 0.9984
SA3779 11.25 0.9808 4.031 0.9971
SA3827 0.9136 0.9985 0.6097 0.9922
SA3830 10.23 0.9648 1.856 0.9928
SA3838 2.196 0.9922 1.202 0.9947
SA3856 25.08 0.984 2.114 0.9838
SA3902 12.42 0.9925 3.853 0.9981
ACE2 276.3 0.9806 75.26 0.9928
환자 면역
라이브러리
(C, D)		 hIgG - - - -
SA3755* 23.14 0.9966 8.269 0.9803
SA4040 25.28 0.99 3.096 0.9855
SA4043 1.756 0.9991 1.425 0.9584
SA4044 58.27 0.9924 13.64 0.9881
SA4050 3.144 0.9865 1.454 0.9638
SA4053 40.6 0.9428 22 0.9914
SA4055 0.1439 0.973 1.876 0.9423
SA4056 1.858 0.9987 1.398 0.9561
SA4057 4.809 0.9993 2.631 0.9897
SA3755*: Ymax®-ABL 유래 내부참조물질(internal reference)
실시예 8.2. 세포기반 경쟁 분석법에 의한 SARS-CoV-2 스파이크 인간 단일클론 항체의 중화능 확인
인간 ACE2를 과발현하는 형질전환 세포 풀은 인간 ACE2를 포함하고 있는 pcDNA3.1 플라스미드를 HEK293E에 형질감염 시킨 후, 200 ㎎/㎖의 Zeocin(#R25001, thermo Fisher Scientific)이 들어있는 선택적 배양 배지에서 선별과정을 수행하였다. 선별과정 후 세포 풀은 염소 항-인간 ACE2 항체(#AF933, R&D system)를 이용한 FACS 분석을 통해 발현 상태를 확인하여 분리하였고, SARS-CoV-2 스파이크 인간 단일클론 항체에 의한 SARS-CoV-2 RBD와 ACE2 결합 억제 중화능 확인을 위해 사용되었다.
SARS-CoV-2 스파이크 인간 단일클론 항체가 SARS-CoV-2 RBD와 ACE2 결합을 억제할 수 있는지 확인하기 위해, 제조한 인간 ACE2 과발현 HEK293E 세포(HEK293E/ACE2)를 각각 시료당 3×105개로 준비하고, 20 nM(1 ㎍/㎖)의 SARS-CoV-2 RBD-mFc 단백질에 SARS-CoV-2 스파이크 인간 단일클론 항체 또는 대조로 수용체인 ACE2-His를 500 nM에서부터 1/5 희석 배수로 연속적으로 희석하여 4℃에서 30분간 반응(pre-incubation) 시켰다.
그 후, 항원-항체 혼합물을 준비한 세포와 4℃에서 30분간 반응시켰다. 그 후, 세포는 2% FBS가 포함된 PBS로 3회 세척하고, SARS-CoV-2 RBD-mFc를 검출할 수 있는 FITC(fluorescein isothiocyanate) 형광물질이 결합된 항-마우스 IgG 항체(#FI-2000, Vectorlabs)를 사용하여 4℃에서 30분간 암반응 후, 동일한 세척 과정을 거쳤다. 이후 0.2 ㎖의 2% FBS가 든 PBS로 현탁시킨 후, 유세포 분석기인 CytoFLEX(Beckman coulter, USA)을 사용하여 분석하였다.
SARS-CoV-2 스파이크 인간 단일클론 항체의 SARS-CoV-2 RBD와 ACE2 결합을 저해하는 중화능은 ACE2 발현세포에 결합하는 SARS-CoV-2 RBD-mFc의 결합력 감소로 알 수 있고, 그 저해 정도는 항체에 의한 최대 억제의 50%에 이르는데 필요한 시료의 양(IC50)으로 나타낼 수 있다. SARS-CoV-2 RBD-mFc의 결합 정도를 확인하는 MFI(mean fluorescence intensity) 값들과 GraphPad Prism 8 소프트웨어(GraphPad Software, Inc., 미국)를 이용하여 분석한 결과, SARS-CoV-2 스파이크 인간 단일클론 항체들은 농도 의존적으로 SARS-CoV-2 RBD와 ACE2 결합을 저해함을 확인하였다(도 14a 및 도 14b). Ymax®-ABL 유래 7종(도 14a)과 환자-면역 라이브러리 유래 8종(도 14b) 항체들의 SARS-CoV-2 RBD에 대한 IC50 값은 각각 1.75 nM~3.8 nM와 1.69 nM~4.13 nM로서 모두 나노몰 수준으로 우수하였으며, 대조로 처리한 SARS-CoV-2 RBD 수용체인 ACE2에 비교하여 우월함을 확인하였다. 각 항체들의 IC50 값은 표 16과 같다.
구체적으로, 표 16에 세포기반 경쟁분석법에 의한 항-SARS-CoV-2 스파이크 단일클론 항체의 중화능 확인 결과를 정리하여 나타내었다.
항체 라이브러리 세포 HEK293E/ACE2
바인더(Binder) SARS-CoV-2 RBD-mFc
항체 IC50(nM) R-squared
Ymax®-ABL
(A)		 hIgG - -
SA3755 3.797 0.9783
SA3779 2.839 0.9859
SA3827 2.737 0.984
SA3830 2.569 0.9878
SA3838 3.384 0.9785
SA3856 2.67 0.9822
SA3902 1.745 0.9739
ACE2 28.71 0.9925
환자 면역
라이브러리
(B)		 hIgG - -
SA3755* 2.259 0.9956
SA4040 1.589 0.9884
SA4043 1.687 0.9966
SA4044 2.208 0.9994
SA4050 2.933 0.9937
SA4053 2.208 0.998
SA4055 2.905 0.9761
SA4056 2.194 0.9966
SA4057 4.128 0.9935
ACE2 16.42 0.9236
SA3755*: Ymax®-ABL 유래 내부참조물질(internal reference)
실시예 8.3. 세포내 유입 억제 분석법에 의한 SARS-CoV-2 스파이크 단일클론 항체의 중화능 확인
SARS-CoV-2 RBD가 세포 표면에 존재하는 ACE2와 결합하여 세포내로 유입(internalization)될 때, SARS-CoV-2 스파이크 인간 단일클론 항체가 이를 저해할 수 있는지 확인하기 위하여 카복시 말단에 녹색형광단백질(green fluorescent protein, GFP)를 융합하여 재조합한 ACE2를 과발현하는 HEK293E 세포(HEK293E/ACE2-GFP)와 인간 Fc(hFc)가 융합된 재조합 SARS-CoV-2 RBD-hFc 항원을 사용하여 Incucyte® internalization 시험법을 수행하였고, 항원의 세포 내 위치를 확인하기 위하여 Incucyte® live-cell analysis system을 이용하여 분석하였다.
96-웰 세포 배양 마이크로 플레이트(#CT-3595, Corning)에 세포를 웰 당 2×104개로 50 ㎕에 시딩(seeding)하여 18~24시간 동안 배양하였다. SARS-CoV-2 RBD-hFC 항원의 Fc 부분을 Incucyte® Human FabFluor-pH Red Antibody Labeling Reagent를 이용하여 1:2 몰비(molar ratio)로 37℃에서 15분간 암반응시키고, 이를 형광물질로 표지한 후, 2 mM에서부터 1/5 희석 배수로 연속적으로 희석한 SARS-CoV-2 스파이크 인간 단일클론 항체와 혼합하여 3분간 반응시킨 뒤 세포에 처리하였다. Incucyte® Human FabFluor-pH Red Antibody Labeling Reagent가 접합된 SARS-CoV-2 RBD-hFc는 세포 표면 ACE2와 결합하여 세포내로 유입(internalization)되고 세포내 낮은 pH 조건에서 적색(red) 형광을 발광하여 세포내 유입 유무 및 정도를 확인 가능하다. 세포는 IncuCyte ZOOM HD/2CLR System(Essen Biosciences, 미국)를 이용하여 15분~30분 간격으로 24시간 반복하여 현시(phase), 녹색(green), 적색(red) 3가지 채널을 모두 이미징하고, 'Total Red Object Area(㎛2/well)'로 분석하였다.
SARS-CoV-2 스파이크 인간 단일클론 항체가 ACE2를 통한 SARS-CoV-2 RBD의 세포 내 유입을 저해하는지는 세포내에서 SARS-CoV-2 RBD 항원의 적색 형광물질 감소로 알 수 있으며, 그 저해 정도는 항체에 의한 최대 억제의 50%에 이르는데 필요한 시료의 양(IC50)으로 나타낼 수 있고, GraphPad Prism 8 소프트웨어를 이용하여 분석하였다.
그 결과, SARS-CoV-2 스파이크 인간 단일클론 항체는 농도 의존적으로 ACE2와의 결합을 통한 SARS-CoV-2 RBD의 세포내 유입을 효과적으로 저해함을 확인하였다(도 15a 및 도 15b). Ymax®-ABL 유래 7종(도 15a)과 환자-면역 라이브러리 유래 8종(도 15b) 항체들의 SARS-CoV-2 RBD에 대한 IC50 값은 각각 11.92 nM~40.02 nM와 12.78 nM~62.72 nM였으며, 각 항체들의 IC50 값은 표 17과 같다.
구체적으로, 표 17에 세포내 유입 억제 분석법에 의한 항-SARS-CoV-2 스파이크 단일클론 항체의 중화능 확인 결과를 정리하여 나타내었다.
항체 라이브러리 세포 HEK293E/ACE2-GFP
바인더(Binder) SARS-CoV-2 RBD-hFc
항체 IC50(nM) R-squared
Ymax®-ABL
(A)		 hIgG - -
SA3755 40.02 0.9701
SA3779 18.93 0.9758
SA3827 12.86 0.9386
SA3830 13.53 0.9785
SA3838 36.08 0.9853
SA3856 11.92 0.9464
SA3902 14.89 0.9799
환자 면역
라이브러리
(B)		 hIgG - -
SA4040 30.84 0.9669
SA4043 12.78 0.9793
SA4044 39.17 0.9922
SA4050 36.92 0.9462
SA4053 62.72 0.9868
SA4055 37.1 0.9646
SA4056 28.11 0.977
SA4057 28.14 0.9763
실시예 8.4. SARS-CoV-2 바이러스를 사용한 미세중화분석법에 의한 SARS-CoV-2 스파이크 단일클론 항체의 중화능 확인
SARS-CoV-2 바이러스에 대한 항체 중화능은 아프리카 초록원숭이 신장 세포(Africa green monkey kidney cell line)인 Vero 세포와 함께 미세중화분석법(microneutralization assay)를 통해 확인하였다.
96-웰 세포 배양 마이크로 플레이트에 Vero 세포를 웰 당 2.5×104개로 12~18시간 동안 배양하여 준비하고, SARS-CoV-2 인간 단일클론 항체를 500 nM에서부터 1/4 희석 배수로 연속적으로 희석하여 10,000 PFU의 SARS-CoV-2 바이러스와 1시간 반응시킨 후, 준비한 세포에 웰 당 5,000 PFU로 48 시간 동안 감염시켰다. 그 후 세포는 PBS로 1회 세척하고 4℃에서 4% 파라포름아마이드(paraformamide)로 고정한 다음 PBS로 세척 후, 0.05% 크리스탈 바이올렛(crystal violet)/메탄올(methanol) 용액을 각 웰에 넣어 항체 중화능에 의해 바이러스에 대한 감염세포 병변(cytopathic effect, CPE)을 보이지 않는 세포들을 염색하였다. 얻어진 이미지는 NIH(National Institute of Health)　ImageJ 프로그램을 이용하여 영역 세기(area intensity)를 구하고, % 생존율(viability)/억제율(inhibition)을 계산하여 GrapPad Prism 5 소프트웨어를 통해 SARS-CoV-2 바이러스에 대한 항체 중화능 IC50 값을 계산하였다.
그 결과, SARS-CoV-2 스파이크 인간 단일클론 항체는 농도 의존적으로 Live SARS-CoV-2 바이러스에 대한 감염을 효과적으로 저해함을 확인하였다(도 16a 및 도 16b). Ymax®-ABL 유래 7종(도 16a)과 환자-면역 라이브러리 유래 8종(도 16b) 항체들의 SARS-CoV-2 바이러스에 대한 IC50 값은 각각 8.736 nM~231 nM와 0.7102 nM~346 nM였으며, 각 항체들의 IC50 값은 표 18과 같다.
구체적으로, 표 18에 미세중화 분석법에 의한 항-SARS-CoV-2 스파이크 단일클론 항체의 중화능 확인 결과를 정리하여 나타내었다.
항체 라이브러리 바이러스 SARS-CoV-2
항체 IC50(nM) R-squared
Ymax®-ABL
(A)		 hIgG - -
SA3755 8.736 0.9698
SA3779 56.77 0.9682
SA3827 8.918 0.9695
SA3830 231 0.8659
SA3838 9.399 0.9097
SA3856 136.7 0.9226
SA3902 37.32 0.9746
환자 면역
라이브러리
(B)		 SA4040 8.139 0.8982
SA4043 12.46 0.9764
SA4044 80.48 0.8398
SA4050 0.7102 0.9651
SA4053 346 0.6546
SA4055 7.004 0.9686
SA4056 11.26 0.9691
SA4057 37.52 0.8789
실시예 9. SARS-CoV-2 스파이크 인간 단일클론 항체 변이체의 중화능 평가
실시예 9.1. 경쟁 효소면역분석법에 의한 SARS-CoV-2 스파이크 인간 단일클론 항체 변이체의 중화능 확인
SARS-CoV-2 스파이크 인간 단일클론 항체 변이체들이 ACE2와 결합하는 SARS-CoV-2 RBD 또는 SARS-CoV-2 스파이크 S1 결합을 저해할 수 있는지 확인하기 위해 실시예 8.1.과 같은 방법으로 경쟁 효소면역분석법을 수행하였다.
실험 결과로서, SARS-CoV-2 스파이크 인간 단일클론 항체 변이체들(SA4079, SA4086, SA4114, SA4118)은 농도 의존적으로 ACE2와 SARS-CoV-2 RBD 또는 SARS-CoV-2 스파이크 S1 결합을 저해함을 확인하였으며, 각각의 모항체와 유사 또는 우월한 중화 효능을 보였다(도 17a 및 도 17b). SARS-CoV-2 스파이크 인간 단일클론 항체 변이체들의 SARS-CoV-2 RBD에 대한 IC50 값은 0.7086 nM~3.625 nM(도 17a), SARS-CoV-2 스파이크 S1에 대해서는 1.194 nM~2.711 nM 사이였으며(도 17b), 각 모항체와 비교한 항체 변이체들의 IC50 값은 표 19와 같다.
구체적으로, 표 19에 경쟁 효소면역분석법에 의한 항-SARS-CoV-2 스파이크 단일클론 항체 변이체의 중화능 확인 결과를 정리하여 나타내었다.
친화도 성숙
(Affinity maturation, AM)		 코팅(Coating) ACE2-His
바인더(Binder) SARS-CoV-2 RBD-mFc(A) SARS-CoV-2 스파이크 S1-mFc(B)
항체 IC50(nM) R-squared IC50(nM) R-squared
hIgG - - - -
Parent SA3755 5.707 0.9740 4.667 0.9979
SA3755AM SA4079 3.625 0.9879 2.711 0.9882
Parent SA3779 7.956 0.9465 3.594 0.9977
SA3779AM SA4086 1.236 0.9797 1.281 0.9809
Parent SA3827 0.3210 0.9969 0.9004 0.9807
SA3827AM SA4114 0.3642 0.9980 1.194 0.9693
Parent SA3838 1.616 0.9982 2.247 0.9944
SA3838AM SA4118 0.7086 0.9965 2.276 0.9878
실시예 9.2. 세포기반 경쟁 분석법에 의한 SARS-CoV-2 스파이크 인간 단일클론 항체 변이체의 중화능 확인
SARS-CoV-2 스파이크 인간 단일클론 항체 변이체가 SARS-CoV-2 RBD와 ACE2 결합을 억제할 수 있는지 확인하기 위해, 실시예 8.2.와 같이 인간 ACE2 과발현 HEK293E 세포(HEK293E/ACE2)와 SARS-CoV-2 RBD-mFc 단백질을 이용한 세포기반 경쟁 분석법을 수행하고 분석하였다.
그 결과, SARS-CoV-2 스파이크 인간 단일클론 항체 변이체들(SA4079, SA4086, SA4114, SA4118)은 농도 의존적으로 SARS-CoV-2 RBD와 ACE2 결합을 저해하였으며, 각각 모항체와 비교에서 유사 또는 우월한 중화능을 보였다(도 14c). 각 항체 변이체들의 SARS-CoV-2 RBD에 대한 IC50 값은 2.346 nM~1.705 nM 사이로 모두 나노몰 수준으로 우수하였으며, 대조로 처리한 SARS-CoV-2 RBD 수용체인 ACE2에 비교하여 매우 우월함을 확인하였다. 각 모항체와 비교한 항체 변이체들의 IC50 값은 표 20과 같다.
구체적으로, 표 20에 세포기반 경쟁분석법에 의한 항-SARS-CoV-2 스파이크 단일클론 항체 변이체의 중화능 확인 결과를 정리하여 나타내었다.
친화도 성숙
(Affinity maturation, AM)		 세포 HEK293E/ACE2
바인더(Binder) SARS-CoV-2 RBD-mFc
항체 IC50(nM) R-squared
hIgG - -
Parent SA3755 3.094 0.9943
SA3755AM SA4079 2.346 0.9925
Parent SA3779 2.646 0.9955
SA3779AM SA4086 2.471 0.9923
Parent SA3827 2.712 0.9898
SA3827AM SA4114 2.394 0.9896
Parent SA3838 2.989 0.9923
SA3838AM SA4118 2.705 0.9931
ACE2 52.05 0.9935
실시예 9.3. 세포내 유입 억제 분석법에 의한 SARS-CoV-2 스파이크 단일클론 항체 변이체의 중화능 확인
SARS-CoV-2 RBD가 세포 표면에 존재하는 ACE2와 결합하여 세포내로 유입(internalization)될 때, SARS-CoV-2 스파이크 인간 단일클론 항체 변이체가 각 모항체와 같이 이를 저해할 수 있는지 확인하기 위하여 실시예 8.3.과 같이 재조합한 ACE2-GFP를 과발현하는 HEK293E 세포(HEK293E/ACE2-GFP)와 SARS-CoV-2 RBD-hFc 항원을 이용한 Incucyte® internalization 시험법을 수행하였다.
그 결과, SARS-CoV-2 스파이크 인간 단일클론 항체 변이체들(SA4079, SA4086, SA4114, SA4118)은 각 모항체와 같이 농도 의존적으로 ACE2와의 결합을 통한 SARS-CoV-2 RBD의 세포내 유입을 효과적으로 저해함을 확인하였다(도 18). 항체 변이체들의 SARS-CoV-2 RBD에 대한 IC50 값은 24.06 nM~39.97 nM 사이였으며, 각 모항체와 비교한 항체 변이체들의 IC50 값은 표 21과 같다.
구체적으로, 표 21에 세포내 유입 억제 분석법에 의한 항-SARS-CoV-2 스파이크 단일클론 항체 변이체의 중화능 확인 결과를 정리하여 나타내었다.
친화도 성숙
(Affinity maturation, AM)		 세포 HEK293E/ACE2-GFP
바인더(Binder) SARS-CoV-2 RBD-hFc
항체 IC50(nM) R-squared
hIgG - -
Parent SA3755 35.8 0.9905
SA3755AM SA4079 39.97 0.982
Parent SA3779 27.34 0.9904
SA3779AM SA4086 27.19 0.9796
Parent SA3827 18.28 0.9897
SA3827AM SA4114 24.06 0.9832
Parent SA3838 42.83 0.9804
SA3838AM SA4118 31.41 0.9803
실시예 9.4. SARS-CoV-2 바이러스를 사용한 미세중화분석법에 의한 SARS-CoV-2 스파이크 인간 단일클론 항체 변이체의 중화능 확인
SARS-CoV-2 스파이크 인간 단일클론 항체 변이체가 각 모항체와 같이 SARS-CoV-2 바이러스에 대한 중화능을 갖는지 확인하기 위하여 실시예 8.4.와 같이 Live SARS-CoV-2 바이러스를 Vero 세포에 72 시간동안 감염 시킨 후 미세중화 분석법(microneutralization assay)을 수행하여 확인하였다.
그 결과, SARS-CoV-2 스파이크 인간 단일클론 항체 4종(SA3755, SA3779, SA3827, SA3838)을 최적화하여 선별한 항체 변이체들(SA4079, SA4086, SA4114, SA4118)은 각 모항체와 같이 농도 의존적으로 SARS-CoV-2 바이러스의 감염을 효과적으로 중화함을 확인하였다(도 19a 및 도 19b). 항체 변이체들의 SARS-CoV-2 바이러스에 대한 IC50 값은 2.741 nM~12.83 nM 사이였으며, 각 모항체와 비교한 항체 변이체들의 IC50 값은 표 22와 같다.
구체적으로, 표 22에 미세중화 분석법에 의한 항-SARS-CoV-2 스파이크 단일클론 항체 변이체의 중화능 확인 결과를 정리하여 나타내었다.
친화도 성숙
(Affinity maturation, AM)		 바이러스 SARS-CoV-2
항체 IC50(nM) R-squared
- hIgG - -
- SA4055* 3.224 0.9591
Parent SA3755 5.115 0.9575
SA3755AM SA4079 2.741 0.9712
Parent SA3779 45.57 0.9521
SA3779AM SA4086 12.45 0.9314
- hIgG - -
- SA4055* 4.511 0.9393
Parent SA3827 7.936 0.9240
SA3827AM SA4114 12.830 0.9382
Parent SA3838 13.510 0.9736
SA3838AM SA4118 8.289 0.9189
SA4055*: 내부참조물질(internal reference)
이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.
<110> Y-Biologics Inc. <120> ANTIBODY SPECIFICALLY BINDING TO SARS-CoV-2 SPIKE PROTEIN AND USES THEREOF <130> SPD20-122-YBL <160> 313 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> SA3755-CDRH1 <400> 1 Gly Phe Thr Phe Asp Asp His Thr 1 5 <210> 2 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> SA3755-CDRH2 <400> 2 Ile Ser Trp Asp Gly Gly Ser Thr 1 5 <210> 3 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> SA3755-CDRH3 <400> 3 Thr Arg Asp Ala Ser Arg Arg Pro Gly Asp Gly Gly Tyr Asp Phe Asp 1 5 10 15 Val <210> 4 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> SA3755-CDRL1 <400> 4 Thr Gly Thr Val Thr Arg Gly His Trp 1 5 <210> 5 <211> 3 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> SA3755-CDRL2 <400> 5 Asp Thr Asp 1 <210> 6 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> SA3755-CDRL3 <400> 6 Leu Leu Ser Tyr Ser Asp Ser Arg Val 1 5 <210> 7 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> SA3779-CDRH1 <400> 7 Gly 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240 cagcctgagg atgaggctga ctattactgc ttgctctcct atagtgattc ccgggtcttc 300 ggaactggga ccaaggtcac cgtccta 327 <210> 243 <211> 363 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SA3779-HC nucleotide sequence <400> 243 caggtgcagc tggtggagtc tgggggaggc gtggtccagc ctgggaggtc cctgagactc 60 tcctgtgcag cctctggatt caccttcagt agttatgcta tgcactgggt ccgccaggcc 120 ccaggcaagg ggctggagtg ggtggcagtt atatcatatg atggaagtaa taaatactac 180 gcagactccg cgaagggccg attcaccatc tccagagaca attccaagaa cacgttgtat 240 ctgcaaatga acagtctgag agccgaggac acggccgtgt attactgtgc gaggcgtgga 300 cattattatg atagtagtgg ttatttgtat tggggccacg gaaccctgat caccgtctcc 360 tca 363 <210> 244 <211> 321 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SA3779-LC nucleotide sequence <400> 244 gacatccaga tgacccagtc tccatcctcc ctgtctgcat ctgtaggaga cagagtcacc 60 atcacttgcc gggcaagtca gagaattgcc acctatttac attggtatca gcagaaacca 120 gggagagccc ctaagctcct gatctatgct gcatccagtt tgcaaactgg ggtcccatca 180 aggttcagtg gcagtggatc tgggacagat 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aggttccggg gcagtggatc tgcgacagac tttactctca ccatcagcag cctgcaggct 240 gaagatgtgg cagtttatta ctgtcagcaa tattatagta ctacgtggac gttcggccaa 300 gggaccaagg tggatatcaa a 321 <210> 249 <211> 354 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SA3838-HC nucleotide sequence <400> 249 caggtgcagc tggtagagtc tggggctgag gtgaagaagc ctggggcctc agtgagggtc 60 tcctgcaaga tttccggata catcttcact gaattatcca tacactgggt gcgacaggct 120 cctggaaagg ggcttgagtg gatgggaggt tttgatcctg aagaaggtaa aacaatctac 180 gcacagaagt tccagggcag agtcaccatg accgaggaca catctacaga cacagcctac 240 atggagctga gcagcctgag atctgaggac acggccgtgt attactgtgc gaaaatcggc 300 cacctggggg atttttggta ctggggccag ggaaccctga tcaccgtctc ctca 354 <210> 250 <211> 330 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SA3838-LC nucleotide sequence <400> 250 cagtctgccc tgactcagcc tgcttccgtg tctgggtctc ctggccagtc gatcaccatc 60 tcctgcactg gaaccaccag tgacattggt tcttatgact atgtctcctg gtatcaacaa 120 cacccaggca aggcccccaa actcatcatt tatggtgtca ctaggcggcc ctcgggggtt 180 tctaatcgct tctctggctc caagtctggc aacacggcct ccctgaccat ctctaggctc 240 ctgactgaag acgaggctga gtattactgc gccacatata caagcagtgc cacttatgtc 300 ttcggaactg ggaccaaggt caccgtccta 330 <210> 251 <211> 348 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SA3856-HC nucleotide sequence <400> 251 cagatgcagc tggtggagtc tggaggaggc ttgatccagc cgggggggtc cctgagactc 60 tcctgtgcag cctctgggtt caccgtcacc agcgcctaca tgagctgggt ccgccaggct 120 ccagggaagg ggctggagtg ggtctcaatt atttatggtg gtggtagcac atactatgca 180 gactccgtga agggccgatt caccatctcc agagacaatt ccaagaacac gctgtatctt 240 caaatgaaca gtctgagagc cgaggacacg gccgtgtatt actgtacggg tccctatccc 300 ggccgctatg actactgggg ccggggaacc ctggtcaccg tctcctca 348 <210> 252 <211> 321 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SA3856-LC nucleotide sequence <400> 252 gacatccaga tgacccagtc tccatcctca ctgtctgcat ctgtaggaga cagagtcatt 60 atcacttgtc gggcgagtca ggacattaga acttctttgg cctggtttca gcagagatta 120 ggggaagccc ctaggtccct catctatgat gcatccagtt tgcagaatgg ggtcccatca 180 aagttccgcg gcagtggatc tgggacagat ttcactctca ccatcagcag cctgcagcct 240 gaagattttg caacttatta ctgccaacaa tataaaactg tgccgctcac tttcggcgga 300 gggaccaagg tggagatcaa a 321 <210> 253 <211> 369 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SA3902-HC nucleotide sequence <400> 253 caggtgcagc tggtgcagtc tggagctgag gtgaggcagc ctggggcctc agtgaaagtt 60 tcctgcaaga catctggata cgccttctcc tactaccata tacactgggt gcgacaggcc 120 cctggacaag ggcttgagtg gatgggatta atcaaccctg gtagtggtgg cacaaactac 180 gcacagaagt tccagggcag agtcaccttg accagggaca cgtccacgag cacagtctac 240 atggacctaa ccggcctgag atctgaggac acggccgtgt attactgtgc gggttctgag 300 caacctcact actatgcaaa tggtgcttac cgagtctggg gtcagggaac cctggtcacc 360 gtctcctca 369 <210> 254 <211> 309 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SA3902-LC nucleotide sequence <400> 254 gacatccaga tgacccagtc tccttccacc ctgtctgcat ctgtaggaga cagagtcacc 60 atcacttgcc gggcaagtca gagcattagc agctatttaa attggtatca acagaaacca 120 gggaaagccc ctaaactcct gatctatgag gtttctactt tggaaagtgg ggtcccatca 180 aggttcagcg gcagtagatc tgggacagaa ttcactctca ccatcagcag cctgcagcct 240 gatgattttg caacttatta ctgccaacag tatgatactt tcggcggagg gaccaaggtg 300 gaaatcaaa 309 <210> 255 <211> 390 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SA4040-HC nucleotide sequence <400> 255 gaggtgcagc tggtgcagtc tggggctgag gtgaagaagc ctggggcttc agtgaaggtc 60 tcttgcaagg cttctggata caccttcacc ggctactata tgcactgggc gcgacaggcc 120 cctggacaag ggcttgagtg gatgggatgg atcaacccta acagtggtgg cacaaactat 180 gcacagaagt ttcagggcag ggtcaccatg accagggaca cgtccatcac cacagcctac 240 atggagctga gcaggctgac atctgacgac acggccgtat attactgtgc gagagatcag 300 gccttttcta tggttcgggg agtcaccgac tactggggcc agggaaccct ggtcaccgtc 360 tcgtcaggga gtgcatccgc cccaaccctt 390 <210> 256 <211> 330 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SA4040-LC nucleotide sequence <400> 256 cagtctgccc tgactcagcc tccctccgcg tccgggtctc ctggacagtc agtcatcatc 60 tcctgcactg gaagcagcag tgacgtgggt ggttataact atgtcgcctg gtaccaacaa 120 tacccaggcg cagcccccaa actcatcatt tctgaggtca ctaagcggcc ctcaggggtc 180 cctgatcgct tctctggctc caagtctggc aacacggcct ctctgaccat ctctgggctc 240 caggctgagg atgaggctaa ttattactgc agctcatatg ctggagacaa cacttggatc 300 ttcggcggag ggaccaagct gaccgtccta 330 <210> 257 <211> 378 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SA4043-HC nucleotide sequence <400> 257 caggtgcagc tgcaggagtc ggggggaggc ttggtccagc ctggggggtc cctgagactc 60 tcctgtgcag cctctgtaat caccgtcagt agcaactaca tgagctgggt ccgccaggct 120 ccagggaagg ggctggagtg ggtctcagtt atttatcccg gaggtagcac atattacgca 180 gactccgtga agggccgatt caccatctcc agagacaagt ccaagaacac gctgtatctt 240 caaatgaaca gcctgagagc tgaggacacg gctgtgtatt actgtgcgag agatcttgac 300 atcgtggggg gtatggacgt ctggggccaa gggaccacgg tcaccgtctc ctcagcctcc 360 accaagggcc catcggtc 378 <210> 258 <211> 321 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SA4043-LC nucleotide sequence <400> 258 gacatccaga tgacccagtc tccttccacc ctgtctgcat ctgtaggaga cagagtcacc 60 atcacttgcc gggccagtca gagtatcagt aggtggttgg cctggtatca gcagaaacca 120 ggccaagccc ctaagctcct gatctatgct gcatccactt tacaaagtgg ggtcccatca 180 aggttcagcg gcagtgggtc tgggacagaa ttcactctca ccatcagcag cctgcagcct 240 gatgattttg caacttatta ctgccaacaa tatgatagtt atccaaggac gttcggccaa 300 gggaccaagg tggatatcaa a 321 <210> 259 <211> 378 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SA4044-HC nucleotide sequence <400> 259 gaggtgcagc tggtgcagtc tggaggaggc ttgatccagc ctggggggtc cctgagactc 60 tcctgtgcag cctctgggtt caccgtcagt agcaactaca tgagctgggt ccgccaggct 120 ccagggaagg ggctggagtg ggtctcagtt atttatagcg gtggtagcac atactacgca 180 gactccgtga agggccgatt caccatctcc agagacaatt ccaagaacac gctgcatctt 240 caaatgaaca gcctgagagc cgaggacacg gccgtgtatt actgtgcgag agaccttccc 300 cagttcgatg ggtttgacta ctggggccag ggaaccctgg tcaccgtctc ctcagggagt 360 gcatccgccc caaccctt 378 <210> 260 <211> 324 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SA4044-LC nucleotide sequence <400> 260 cagtctgccc tgactcagcc tccctcactg tccgtggccc caggaaggac ggccaggatt 60 acctgtggag gaaacaacat tggaagtaaa agtgttaact ggtaccagca catgccaggc 120 caggcccctg ttttggtcat ctattctgat accgaccggc cctcagggat ccctgagcga 180 gtctctggct ccaagtctgg gaacacggcc accctgagca tcagcagggt cgaagccggg 240 gatgaggccg actattactg tcaggtgtgg gatagtacta ctgatcatgt ggtcttcggc 300 ggagggacca agctgaccgt ccta 324 <210> 261 <211> 405 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SA4050-HC nucleotide sequence <400> 261 caggtgcagc tggtggagtc tggggctgag gtgaagaagc ctggggcctc agtgaaggtc 60 tcctgcaagg cttctggata caccttcacc ggctacttta tccactgggt gcgacaggcc 120 cctggacaag ggcttgagtg gatgggatgg atcaacccta acagtggtgg cacaaactat 180 gcacagaagt ttcagggcag ggtcaccatg accagggaca cgtccatcag cacagcctac 240 atggagctga gcaggctgag atctgacgac acggccgtgt attactgtgc gagagtacct 300 catcttagtg gttattacta cgaaggagta ttggggtact ttgactactg gggccaggga 360 accctggtca ccgtctcctc agggagtgca tccgccccaa ccctt 405 <210> 262 <211> 330 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 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cctccaccaa gggcccatcg 420 gtc 423 <210> 264 <211> 330 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SA4053-LC nucleotide sequence <400> 264 cagctcgtgc tgactcagcc gccctccgtg tctgcggccc ccggacagag ggtcaccatc 60 tcctgctctg gaagcttctc caacgttgga aataattttg tctcgtggta ccggcacctc 120 ccgggaacag cccccgaact cctcatttat gacaataatc agcgaccctc agggattcct 180 gaccgattct ctgcctccaa gtctggcacg tcagccaccc tggccatcac cggactccac 240 actggggacg aggccgatta ttactgcgga acatgggata ccagcctgag tggtgtggtt 300 ttcggcggag ggaccaagct gaccgtccta 330 <210> 265 <211> 378 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SA4055-HC nucleotide sequence <400> 265 gaggtgcagc tggtgcagtc tgggggaggc ttggtccagc ctggggggtc cctgagactc 60 tcctgtgcag cctctgtaat caccgtcagt agcaactaca tgagctgggt ccgccaggct 120 ccagggaagg ggctggagtg ggtctcagtt atttatcccg gaggtagcac atattacgca 180 gactccgtga agggccgatt caccatctcc agagacaagt ccaagaacac gctgtatctt 240 caaatgaaca gcctgagagc tgaggacacg gctgtgtatt actgtgcgag agatcttgac 300 atcgtggggg gtatggacgt ctggggccaa gggaccacgg tcaccgtctc ctcagcctcc 360 accaagggcc catcggtc 378 <210> 266 <211> 330 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SA4055-LC nucleotide sequence <400> 266 cagtctgccc tgactcagcc cgcctccgtg tctgggtctc ctggacagtc gatcaccatc 60 tcctgcactg gaaccagcag tgacgttggt gattataact tggtctcctg gtaccaacaa 120 cacccaggca aagcccccaa agtcatgatt tatgatgtca gtcatcggcc ctcaggggtt 180 tctaatcgct tctctggctc caagtctggc aacacggcct ccctgaccat ctctgggctc 240 caggctgagg acgaggctga ttattattgc agctcatata caagcagcac tactgtggta 300 ttcggcggag ggaccaagct gaccgtccta 330 <210> 267 <211> 378 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SA4056-HC nucleotide sequence <400> 267 caggtgcagc tgcaggagtc ggggggaggc ttggtccagc ctggggggtc cctgagactc 60 tcctgtgcag cctctgtaat caccgtcagt agcaactaca tgagctgggt ccgccaggct 120 ccagggaagg ggctggagtg ggtctcagtt atttatcccg gaggtagcac atattacgca 180 gactccgtga agggccgatt caccatctcc agagacaagt ccaagaacac gctgtatctt 240 caaatgaaca gcctgagagc tgaggacacg gctgtgtatt actgtgcgag agatcttgac 300 atcgtggggg gtatggacgt ctggggccaa gggaccacgg tcaccgtctc ctcagcctcc 360 accaagggcc catcggtc 378 <210> 268 <211> 321 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SA4056-LC nucleotide sequence <400> 268 gacatccaga tgacccagtc tccttccacc ctgtctgcat ctgtaggaga cagagtcacc 60 atcacttgcc gggccagtca gagtatcagt aggtggttgg cctggtatca gcagaaacca 120 ggccaagccc ctaagctcct gatctatgct gcatccactt tacaaagtgg ggtcccatca 180 aggttcagcg gcagtgggtc tgggacagaa ttcactctca ccatcagcag cctgcagcct 240 gatgattttg caacttatta ctgccaacaa tatgatagtt atccaaggac gttcggccaa 300 gggaccaagg tggatatcaa a 321 <210> 269 <211> 378 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SA4057-HC nucleotide sequence <400> 269 gaggtgcagc tggtgcagtc tgggggaggc ttggtccagc ctggggggtc cctgagactc 60 tcctgtgcag cctctgtaat caccgtcagt agcaactaca tgagctgggt ccgccaggct 120 ccagggaagg ggctggagtg ggtctcagtt atttatcccg gaggtagcac atattacgca 180 gactccgtga agggccgatt caccatctcc agagacaagt ccaagaacac gctgtatctt 240 caaatgaaca gcctgagagc tgaggacacg gctgtgtatt actgtgcgag agatcttgac 300 atcgtggggg gtatggacgt ctggggccaa gggaccacgg tcaccgtctc ctcagcctcc 360 accaagggcc catcggtc 378 <210> 270 <211> 333 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SA4057-LC nucleotide sequence <400> 270 cagctcgtgc tgactcagcc gccctcagtg tctggggccc cagggcagag ggtcaccatc 60 tcctgcaccg ggagcagctc caacatcggg gcacctcatg atgtacactg gtaccagcaa 120 cttccaggaa cagcccccag actcctcatc tatgctaaca acaatcggcc ctcaggggtc 180 cctgaccgct tctctggctc caagtctggc acctcagcct ccctggccat cactgggctc 240 caggatgagg atgaggctga ttattactgc cagtcctatg acagtagcct gcgtgcttat 300 gtgttcggaa ctgggactaa ggtcaccgtc cta 333 <210> 271 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> SA4079 (SA3755AM)-CDRL1 <400> 271 Thr Gly Thr Val Thr Arg Gly His Trp 1 5 <210> 272 <211> 3 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> SA4079 (SA3755AM)-CDRL2 <400> 272 Asp Thr Asp 1 <210> 273 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> SA4079 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ttgacaaagt tgaggctgaa gtgcaaattg ataggttgat cacaggcaga 3000 cttcaaagtt tgcagacata tgtgactcaa caattaatta gagctgcaga aatcagagct 3060 tctgctaatc ttgctgctac taaaatgtca gagtgtgtac ttggacaatc aaaaagagtt 3120 gatttttgtg gaaagggcta tcatcttatg tccttccctc agtcagcacc tcatggtgta 3180 gtcttcttgc atgtgactta tgtccctgca caagaaaaga acttcacaac tgctcctgcc 3240 atttgtcatg atggaaaagc acactttcct cgtgaaggtg tctttgtttc aaatggcaca 3300 cactggtttg taacacaaag gaatttttat gaaccacaaa tcattactac agacaacaca 3360 tttgtgtctg gtaactgtga tgttgtaata ggaattgtca acaacacagt ttatgatcct 3420 ttgcaacctg aattagactc attcaaggag gagttagata aatattttaa gaatcataca 3480 tcaccagatg ttgatttagg tgacatctct ggcattaatg cttcagttgt aaacattcaa 3540 aaagaaattg accgcctcaa tgaggttgcc aagaatttaa atgaatctct catcgatctc 3600 caagaacttg gaaagtatga gcagtatata aaatggccat ggtacatttg gctaggtttt 3660 atagctggct tgattgccat agtaatggtg acaattatgc tttgctgtat gaccagttgc 3720 tgtagttgtc tcaagggctg ttgttcttgt ggatcctgct gcaaatttga tgaagacgac 3780 tctgagccag 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Val Gly Tyr Gln Pro Tyr Arg Val 180 185 190 Val Val Leu Ser Phe Glu Leu Leu His Ala Pro Ala Thr Val Cys Gly 195 200 205 Pro Lys Lys Ser Thr Asn Leu Val Lys Asn Lys Cys Val Asn Phe 210 215 220 <210> 312 <211> 86 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> SARS-CoV-2_L425-V510 <400> 312 Leu Pro Asp Asp Phe Thr Gly Cys Val Ile Ala Trp Asn Ser Asn Asn 1 5 10 15 Leu Asp Ser Lys Val Gly Gly Asn Tyr Asn Tyr Leu Tyr Arg Leu Phe 20 25 30 Arg Lys Ser Asn Leu Lys Pro Phe Glu Arg Asp Ile Ser Thr Glu Ile 35 40 45 Tyr Gln Ala Gly Ser Thr Pro Cys Asn Gly Val Glu Gly Phe Asn Cys 50 55 60 Tyr Phe Pro Leu Gln Ser Tyr Gly Phe Gln Pro Thr Asn Gly Val Gly 65 70 75 80 Tyr Gln Pro Tyr Arg Val 85 <210> 313 <211> 72 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> SARS-CoV-2_N437-Y508 <400> 313 Asn Ser Asn Asn Leu Asp Ser Lys Val Gly Gly Asn Tyr Asn Tyr Leu 1 5 10 15 Tyr Arg Leu Phe Arg Lys Ser Asn Leu Lys Pro Phe Glu Arg Asp Ile 20 25 30 Ser Thr Glu Ile Tyr Gln Ala Gly Ser Thr Pro Cys Asn Gly Val Glu 35 40 45 Gly Phe Asn Cys Tyr Phe Pro Leu Gln Ser Tyr Gly Phe Gln Pro Thr 50 55 60 Asn Gly Val Gly Tyr Gln Pro Tyr 65 70

Claims (14)

  1. 서열번호 1, 7, 13, 19, 25, 31, 37, 43, 49, 55, 61, 67, 73, 79 및 85로 구성된 군에서 선택되는 중쇄(heavy chain) CDR1;
    서열번호 2, 8, 14, 20, 26, 32, 38, 44, 50, 56, 62, 68, 74, 80 및 86으로 구성된 군에서 선택되는 중쇄 CDR2;
    서열번호 3, 9, 15, 21, 27, 33, 39, 45, 51, 57, 63, 69, 75, 81 및 87로 구성된 군에서 선택되는 중쇄 CDR3를 포함하는 중쇄 가변영역; 및
    서열번호 4, 10, 16, 22, 28, 34, 40, 46, 52, 58, 64, 70, 76, 82, 88, 271, 274, 277 및 280으로 구성된 군에서 선택되는 경쇄(light chain) CDR1;
    서열번호 5, 11, 17, 23, 29, 35, 41, 47, 53, 59, 65, 71, 77, 83, 89, 272, 275, 278 및 281로 구성된 군에서 선택되는 경쇄 CDR2;
    서열번호 6, 12, 18, 24, 30, 36, 42, 48, 54, 60, 66, 72, 78, 84, 90, 273, 276, 279 및 282로 구성된 군에서 선택되는 경쇄 CDR3를 포함하는 경쇄 가변영역을 포함하는,
    SARS-CoV-2 스파이크(spike) 단백질에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  2. 제1항에 있어서,
    하기 군에서 선택되는 어느 하나의 CDR 조합을 포함하는, SARS-CoV-2 스파이크 단백질에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편:
    (1) 서열번호 1의 중쇄 CDR1, 서열번호 2의 중쇄 CDR2, 서열번호 3의 중쇄 CDR3, 서열번호 4의 경쇄 CDR1, 서열번호 5의 경쇄 CDR2, 서열번호 6의 경쇄 CDR3;
    (2) 서열번호 7의 중쇄 CDR1, 서열번호 8의 중쇄 CDR2, 서열번호 9의 중쇄 CDR3, 서열번호 10의 경쇄 CDR1, 서열번호 11의 경쇄 CDR2, 서열번호 12의 경쇄 CDR3;
    (3) 서열번호 13의 중쇄 CDR1, 서열번호 14의 중쇄 CDR2, 서열번호 15의 중쇄 CDR3, 서열번호 16의 경쇄 CDR1, 서열번호 17의 경쇄 CDR2, 서열번호 18의 경쇄 CDR3;
    (4) 서열번호 19의 중쇄 CDR1, 서열번호 20의 중쇄 CDR2, 서열번호 21의 중쇄 CDR3, 서열번호 22의 경쇄 CDR1, 서열번호 23의 경쇄 CDR2, 서열번호 24의 경쇄 CDR3;
    (5) 서열번호 25의 중쇄 CDR1, 서열번호 26의 중쇄 CDR2, 서열번호 27의 중쇄 CDR3, 서열번호 28의 경쇄 CDR1, 서열번호 29의 경쇄 CDR2, 서열번호 30의 경쇄 CDR3;
    (6) 서열번호 31의 중쇄 CDR1, 서열번호 32의 중쇄 CDR2, 서열번호 33의 중쇄 CDR3, 서열번호 34의 경쇄 CDR1, 서열번호 35의 경쇄 CDR2, 서열번호 36의 경쇄 CDR3;
    (7) 서열번호 37의 중쇄 CDR1, 서열번호 38의 중쇄 CDR2, 서열번호 39의 중쇄 CDR3, 서열번호 40의 경쇄 CDR1, 서열번호 41의 경쇄 CDR2, 서열번호 42의 경쇄 CDR3;
    (8) 서열번호 43의 중쇄 CDR1, 서열번호 44의 중쇄 CDR2, 서열번호 45의 중쇄 CDR3, 서열번호 46의 경쇄 CDR1, 서열번호 47의 경쇄 CDR2, 서열번호 48의 경쇄 CDR3;
    (9) 서열번호 49의 중쇄 CDR1, 서열번호 50의 중쇄 CDR2, 서열번호 51의 중쇄 CDR3, 서열번호 52의 경쇄 CDR1, 서열번호 53의 경쇄 CDR2, 서열번호 54의 경쇄 CDR3;
    (10) 서열번호 55의 중쇄 CDR1, 서열번호 56의 중쇄 CDR2, 서열번호 57의 중쇄 CDR3, 서열번호 58의 경쇄 CDR1, 서열번호 59의 경쇄 CDR2, 서열번호 60의 경쇄 CDR3;
    (11) 서열번호 61의 중쇄 CDR1, 서열번호 62의 중쇄 CDR2, 서열번호 63의 중쇄 CDR3, 서열번호 64의 경쇄 CDR1, 서열번호 65의 경쇄 CDR2, 서열번호 66의 경쇄 CDR3;
    (12) 서열번호 67의 중쇄 CDR1, 서열번호 68의 중쇄 CDR2, 서열번호 69의 중쇄 CDR3, 서열번호 70의 경쇄 CDR1, 서열번호 71의 경쇄 CDR2, 서열번호 72의 경쇄 CDR3;
    (13) 서열번호 73의 중쇄 CDR1, 서열번호 74의 중쇄 CDR2, 서열번호 75의 중쇄 CDR3, 서열번호 76의 경쇄 CDR1, 서열번호 77의 경쇄 CDR2, 서열번호 78의 경쇄 CDR3;
    (14) 서열번호 79의 중쇄 CDR1, 서열번호 80의 중쇄 CDR2, 서열번호 81의 중쇄 CDR3, 서열번호 82의 경쇄 CDR1, 서열번호 83의 경쇄 CDR2, 서열번호 84의 경쇄 CDR3;
    (15) 서열번호 85의 중쇄 CDR1, 서열번호 86의 중쇄 CDR2, 서열번호 87의 중쇄 CDR3, 서열번호 88의 경쇄 CDR1, 서열번호 89의 경쇄 CDR2, 서열번호 90의 경쇄 CDR3;
    (16) 서열번호 1의 중쇄 CDR1, 서열번호 2의 중쇄 CDR2, 서열번호 3의 중쇄 CDR3, 서열번호 271의 경쇄 CDR1, 서열번호 272의 경쇄 CDR2, 서열번호 273의 경쇄 CDR3;
    (17) 서열번호 7의 중쇄 CDR1, 서열번호 8의 중쇄 CDR2, 서열번호 9의 중쇄 CDR3, 서열번호 274의 경쇄 CDR1, 서열번호 275의 경쇄 CDR2, 서열번호 276의 경쇄 CDR3;
    (18) 서열번호 13의 중쇄 CDR1, 서열번호 14의 중쇄 CDR2, 서열번호 15의 중쇄 CDR3, 서열번호 277의 경쇄 CDR1, 서열번호 278의 경쇄 CDR2, 서열번호 279의 경쇄 CDR3; 및
    (19) 서열번호 25의 중쇄 CDR1, 서열번호 26의 중쇄 CDR2, 서열번호 27의 중쇄 CDR3, 서열번호 280의 경쇄 CDR1, 서열번호 281의 경쇄 CDR2, 서열번호 282의 경쇄 CDR3.
  3. 제1항에 있어서,
    서열번호 211, 213, 215, 217, 219, 221, 223, 225, 227, 229, 231, 233, 235, 237 및 239로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나의 중쇄 가변영역을 포함하는, SARS-CoV-2 스파이크 단백질에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  4. 제1항에 있어서,
    서열번호 212, 214, 216, 218, 220, 222, 224, 226, 228, 230, 232, 234, 236, 238, 240, 299, 300, 301 및 302로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나의 경쇄 가변영역을 포함하는 SARS-CoV-2 스파이크 단백질에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  5. 제1항에 있어서,
    하기 군에서 선택되는 어느 하나의 가변영역 조합을 포함하는, SARS-CoV-2 스파이크 단백질에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편:
    (1) 서열번호 211의 중쇄 가변영역 및 서열번호 212의 경쇄 가변영역;
    (2) 서열번호 213의 중쇄 가변영역 및 서열번호 214의 경쇄 가변영역;
    (3) 서열번호 215의 중쇄 가변영역 및 서열번호 216의 경쇄 가변영역;
    (4) 서열번호 217의 중쇄 가변영역 및 서열번호 218의 경쇄 가변영역;
    (5) 서열번호 219의 중쇄 가변영역 및 서열번호 220의 경쇄 가변영역;
    (6) 서열번호 221의 중쇄 가변영역 및 서열번호 222의 경쇄 가변영역;
    (7) 서열번호 223의 중쇄 가변영역 및 서열번호 224의 경쇄 가변영역;
    (8) 서열번호 225의 중쇄 가변영역 및 서열번호 226의 경쇄 가변영역;
    (9) 서열번호 227의 중쇄 가변영역 및 서열번호 228의 경쇄 가변영역;
    (10) 서열번호 229의 중쇄 가변영역 및 서열번호 230의 경쇄 가변영역;
    (11) 서열번호 231의 중쇄 가변영역 및 서열번호 232의 경쇄 가변영역;
    (12) 서열번호 233의 중쇄 가변영역 및 서열번호 234의 경쇄 가변영역;
    (13) 서열번호 235의 중쇄 가변영역 및 서열번호 236의 경쇄 가변영역;
    (14) 서열번호 237의 중쇄 가변영역 및 서열번호 238의 경쇄 가변영역;
    (15) 서열번호 239의 중쇄 가변영역 및 서열번호 240의 경쇄 가변영역;
    (16) 서열번호 211의 중쇄 가변영역 및 서열번호 299의 경쇄 가변영역;
    (17) 서열번호 213의 중쇄 가변영역 및 서열번호 300의 경쇄 가변영역;
    (18) 서열번호 215의 중쇄 가변영역 및 서열번호 301의 경쇄 가변영역; 및
    (19) 서열번호 219의 중쇄 가변영역 및 서열번호 302의 경쇄 가변영역.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항의 SARS-CoV-2 스파이크 단백질에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 코딩하는 핵산.
  7. 제6항에 따른 핵산을 포함하는 재조합 발현 벡터.
  8. 제7항에 따른 재조합 발현 벡터로 형질전환된 세포.
  9. (i) 제8항에 따른 세포를 배양하는 단계; 및 (ⅱ) 얻어진 세포 배양액으로부터 SARS-CoV-2 스파이크 단백질에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 회수하는 단계를 포함하는, SARS-CoV-2 스파이크 단백질에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 제조 방법.
  10. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항의 항체 또는 이의 항원 결합 단편 및 약물을 포함하는 항체-약물 접합체(antibody-drug conjugate, ADC).
  11. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항의 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함하는 다중특이적 항체(multispecific antibody).
  12. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항의 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 제10항의 항체-약물 접합체 또는 제11항의 다중특이적 항체를 포함하는 SARS-CoV-2 감염증의 예방 또는 치료용 약학 조성물.
  13. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항의 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함하는 SARS-CoV-2 감염증의 진단용 조성물.
  14. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항의 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함하는 SARS-CoV-2 스파이크 단백질의 검출 또는 정량용 키트.
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