KR20230076376A - 중증열성혈소판감소증후군 바이러스 Gc 항원에 특이적으로 결합하는 항체 및 이의 용도 - Google Patents
중증열성혈소판감소증후군 바이러스 Gc 항원에 특이적으로 결합하는 항체 및 이의 용도 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 중증열성혈소판감소증후군(Severe Fever with Thrombocytopenia Syndrome, SFTS)의 병원체인 중증열성혈소판감소증후군 바이러스(Severe Fever with Thrombocytopenia Syndrome Virus, SFTSV)를 효과적으로 검출 또는 진단하기 위해 사용되는 SFTSV의 Gc 항원에 특이적으로 결합하는 항체에 관한 것이다.
Description
본 발명은 중증열성혈소판감소증후군 바이러스 Gc 항원에 특이적으로 결합하는 항체 및 이의 용도에 관한 것이다.
중증열성혈소판감소증후군(Severe Fever with Thrombocytopenia Syndrome, SFTS)은 신종 진드기매개 감염병 질환으로, 주로 작은소참진드기(Haemaphysalis longicornis) 또는 참진드기류(Amblyomma testudinarium)에 의해 매개되는 중증열성혈소판감소증후군 바이러스(Severe Fever with Thrombocytopenia Syndrome Virus, SFTSV)에 의해 발생한다. SFTS는 2009년에 중국에서 최초로 보고되었고, 2012년 일본 및 한국에서도 질환 및 바이러스가 보고된 바 있다. SFTS의 주요 증상은 발열, 복통, 구역, 구토 혈소판 감소증 또는 백혈구 감소증 등이며, 중증인 경우 다발성 장기부전이 발생하여 사망에 이를 수도 있다. SFTS는 매년 중국, 일본 또는 한국에서 꾸준하게 발생하고 있으며, 이로 인한 치사율은 매우 높으며, 봄에서 여름 사이의 기간에 주로 발생한다. SFTSV의 야생숙주는 등줄쥐가 유력하고, 중국의 주요 발병지에서는 염소, 소, 개 또는 닭 등의 가축에서 혈청 항체가 높은 비율로 발견되어, 가축이 숙주 역할을 할 수도 있는 것으로 추정된다. 감염자의 체액을 매개로 하여 사람간 감염이 일어난 것이 보고된 바 있으나, 현재까지 SFTS를 효과적으로 치료할 수 있는 것으로 증명된 치료제 또는 예방법은 없다.
SFTS 바이러스의 정확한 작용 기전은 아직 알려지지 않았으나 바이러스가 포함된 플레보바이러스 속(Phlevovirus sp.)의 바이러스는 공통적인 수용체를 통해 세포내로 침투된다. SFTS 바이러스의 게놈 중 M 절편의 Gn/Gc 당단백질이 수용체와 결합하는 능력을 갖추고 있으며, 이 중 Gc의 경우 수용체와 융합하는 능력이 강하며 항원을 결정해주는 에피토프와 결합력이 좋다고 알려져 진단용 키트를 개발하는데 용이하게 사용되고 있다.
한국등록특허 제2039189호 및 한국등록특허 제2201391호는 중증열성혈소판감소증후군 바이러스의 외막 당단백질에 결합하는 항체 및 이의 용도에 관한 것으로, SFTSV의 외막 당단백질의 일종인 Gn 또는 Gc에 특이적으로 결합하는 항체 및 이를 포함하는 SFTS 진단, 예방 또는 치료용 조성물이 개시하고 있고, 한국등록특허 제1785290호는 중증열성혈소판감소증후군 바이러스 감염 진단용 단클론항체, 이를 생산하는 하이브리도마 및 이 단클론항체를 사용하는 중증열성혈소판감소증후군 바이러스 감염 진단방법을 개시하고 있다.
그러나, 본 발명의 특정 에피토프를 포함하는 중증 열성 혈소판 감소 증후군 바이러스 Gc 항원에 특이적으로 결합하는 항체 및 이의 용도에 관한 내용은 개시된 바 없다.
상기의 문제점을 해결하기 위해, 본 발명은 중증열성혈소판감소증후군 바이러스 Gc 항원에 특이적으로 결합하는 항체 및 이의 용도 제공을 목적으로 한다.
상기 과제를 해결하기 위하여, 본 발명은 서열번호 1 내지 10으로 이루어진 군에서 선택된 하나의 경쇄 CDR1; 서열번호 11 내지 20으로 이루어진 군에서 선택된 하나의 경쇄 CDR2; 및 서열번호 21 내지 30으로 이루어진 군에서 선택된 하나의 경쇄 CDR3를 포함하는 경쇄 가변영역과, 서열번호 31 내지 40으로 이루어진 군에서 선택된 하나의 중쇄 CDR1; 서열번호 41 내지 50으로 이루어진 군에서 선택된 하나의 중쇄 CDR2; 및 서열번호 51 내지 60으로 이루어진 군에서 선택된 하나의 중쇄 CDR3를 포함하는 경쇄 가변영역을 포함하는 중증열성혈소판감소증후군 바이러스 Gc 항원에 특이적으로 결합하는 항체를 제공한다.
구체적으로, 본 발명은 서열번호 1의 경쇄 CDR1; 서열번호 11의 경쇄 CDR2; 및 서열번호 21의 경쇄 CDR3를 포함하는 경쇄 가변영역과, 서열번호 31의 중쇄 CDR1; 서열번호 41의 중쇄 CDR2; 및 서열번호 51의 중쇄 CDR3를 포함하는 경쇄 가변영역을 포함하는 중증열성혈소판감소증후군 바이러스 Gc 항원에 특이적으로 결합하는 항체, 서열번호 2의 경쇄 CDR1; 서열번호 12의 경쇄 CDR2; 및 서열번호 22의 경쇄 CDR3를 포함하는 경쇄 가변영역과, 서열번호 32의 중쇄 CDR1; 서열번호 42의 중쇄 CDR2; 및 서열번호 52의 중쇄 CDR3를 포함하는 경쇄 가변영역을 포함하는 중증열성혈소판감소증후군 바이러스 Gc 항원에 특이적으로 결합하는 항체, 서열번호 3의 경쇄 CDR1; 서열번호 13의 경쇄 CDR2; 및 서열번호 23의 경쇄 CDR3를 포함하는 경쇄 가변영역과, 서열번호 33의 중쇄 CDR1; 서열번호 43의 중쇄 CDR2; 및 서열번호 53의 중쇄 CDR3를 포함하는 경쇄 가변영역을 포함하는 중증열성혈소판감소증후군 바이러스 Gc 항원에 특이적으로 결합하는 항체, 서열번호 4의 경쇄 CDR1; 서열번호 14의 경쇄 CDR2; 및 서열번호 24의 경쇄 CDR3를 포함하는 경쇄 가변영역과, 서열번호 34의 중쇄 CDR1; 서열번호 44의 중쇄 CDR2; 및 서열번호 54의 중쇄 CDR3를 포함하는 경쇄 가변영역을 포함하는 중증열성혈소판감소증후군 바이러스 Gc 항원에 특이적으로 결합하는 항체, 서열번호 5의 경쇄 CDR1; 서열번호 15의 경쇄 CDR2; 및 서열번호 25의 경쇄 CDR3를 포함하는 경쇄 가변영역과, 서열번호 35의 중쇄 CDR1; 서열번호 45의 중쇄 CDR2; 및 서열번호 55의 중쇄 CDR3를 포함하는 경쇄 가변영역을 포함하는 중증열성혈소판감소증후군 바이러스 Gc 항원에 특이적으로 결합하는 항체, 서열번호 6의 경쇄 CDR1; 서열번호 16의 경쇄 CDR2; 및 서열번호 26의 경쇄 CDR3를 포함하는 경쇄 가변영역과, 서열번호 36의 중쇄 CDR1; 서열번호 46의 중쇄 CDR2; 및 서열번호 56의 중쇄 CDR3를 포함하는 경쇄 가변영역을 포함하는 중증열성혈소판감소증후군 바이러스 Gc 항원에 특이적으로 결합하는 항체, 서열번호 7의 경쇄 CDR1; 서열번호 17의 경쇄 CDR2; 및 서열번호 27의 경쇄 CDR3를 포함하는 경쇄 가변영역과, 서열번호 37의 중쇄 CDR1; 서열번호 47의 중쇄 CDR2; 및 서열번호 57의 중쇄 CDR3를 포함하는 경쇄 가변영역을 포함하는 중증열성혈소판감소증후군 바이러스 Gc 항원에 특이적으로 결합하는 항체, 서열번호 8의 경쇄 CDR1; 서열번호 18의 경쇄 CDR2; 및 서열번호 28의 경쇄 CDR3를 포함하는 경쇄 가변영역과, 서열번호 38의 중쇄 CDR1; 서열번호 48의 중쇄 CDR2; 및 서열번호 58의 중쇄 CDR3를 포함하는 경쇄 가변영역을 포함하는 중증열성혈소판감소증후군 바이러스 Gc 항원에 특이적으로 결합하는 항체, 서열번호 9의 경쇄 CDR1; 서열번호 19의 경쇄 CDR2; 및 서열번호 29의 경쇄 CDR3를 포함하는 경쇄 가변영역과, 서열번호 39의 중쇄 CDR1; 서열번호 49의 중쇄 CDR2; 및 서열번호 59의 중쇄 CDR3를 포함하는 경쇄 가변영역을 포함하는 중증열성혈소판감소증후군 바이러스 Gc 항원에 특이적으로 결합하는 항체, 서열번호 10의 경쇄 CDR1; 서열번호 20의 경쇄 CDR2; 및 서열번호 30의 경쇄 CDR3를 포함하는 경쇄 가변영역과, 서열번호 40의 중쇄 CDR1; 서열번호 50의 중쇄 CDR2; 및 서열번호 60의 중쇄 CDR3를 포함하는 경쇄 가변영역을 포함하는 중증열성혈소판감소증후군 바이러스 Gc 항원에 특이적으로 결합하는 항체를 제공한다.
본 발명의 일 예에서, 경쇄 가변영역은 서열번호 71 내지 80 중 어느 하나일 수 있고, 중쇄 가변영역은 81 내지 90 중 어느 하나를 포함하는 중증열성혈소판감소증후군 바이러스 Gc 항원에 특이적으로 결합하는 항체일 수 있다.
또한, 본 발명은 서열번호 1 내지 10으로 이루어진 군에서 선택된 하나의 경쇄 CDR1; 서열번호 11 내지 20으로 이루어진 군에서 선택된 하나의 경쇄 CDR2; 및 서열번호 21 내지 30으로 이루어진 군에서 선택된 하나의 경쇄 CDR3를 포함하는 경쇄 가변영역과, 서열번호 31 내지 40으로 이루어진 군에서 선택된 하나의 중쇄 CDR1; 서열번호 41 내지 50으로 이루어진 군에서 선택된 하나의 중쇄 CDR2; 및 서열번호 51 내지 60으로 이루어진 군에서 선택된 하나의 중쇄 CDR3를 포함하는 경쇄 가변영역을 포함하는 폴리펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산을 제공한다.
본 발명의 다른 예에서, 경쇄 가변영역은 서열번호 71 내지 80 중 어느 하나일 수 있고, 중쇄 가변영역은 81 내지 90 중 어느 하나를 포함하는 폴리펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 핵산을 포함하는 벡터를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 벡터를 포함하는 숙주 세포를 제공한다.
본 발명의 일 예에서, 상기 중증열성혈소판감소증후군 바이러스 Gc 항원에 특이적으로 결합하는 항체를 포함하는 중증열성혈소판감소증후군 바이러스 검출용 조성물을 제공한다.
본 발명의 다른 예에서, 상기 중증열성혈소판감소증후군 바이러스 Gc 항원에 특이적으로 결합하는 항체를 포함하는 중증열성혈소판감소증후군 바이러스 감염증 진단용 조성물을 제공한다.
상기 중증열성혈소판감소증후군 바이러스 감염증은 발열, 복통, 구역, 구토, 혈소판 감소증 또는 백혈구 감소증을 포함하는 것일 수 있다.
본 발명의 또 다른 예에서, 본 발명은 분리된 시료로부터 상기 중증열성혈소판감소증후군 바이러스 Gc 항원에 특이적으로 결합하는 항체를 이용하여 중증열성혈소판감소증후군 바이러스를 검출하는 방법을 제공한다.
상기 검출 또는 진단용 조성물은 사용설명서를 추가적으로 포함하는 검출 또는 진단 키트의 형태로 제공될 수 있다.
상기 검출 또는 진단용 조성물 또는 검출하는 방법에서, 시료는 분리된 혈액, 소변, 분변, 분리된 조직으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상일 수 있다.
본 발명은 중증열성혈소판감소증후군 바이러스 Gc 항원에 특이적으로 결합하는 항체 및 이의 용도에 관한 것으로, 본 발명의 항체는 중증열성혈소판감소증후군을 조기에 신속하게 진단하여 대응하고 분류함으로써 추가 확산을 방지하여 궁극적으로 발병률을 낮추고 나아가 국민의 안전과 경제 손실을 줄일 수 있는 기반을 마련하는데 유용하게 활용될 수 있다.
도 1은 파지디스플레이 라이브러리 패닝의 개략도를 나타낸 것이다. (A) 면역튜브 기반 선택, (B) 마그네틱 비드 기반 선택.
도 2는 Gc (ectodomain) 변이체에 대한 SDS-PAGE 분석 결과를 나타낸 것이다.
도 3은 파지디스플레이 라이브러리 패닝을 나타낸 것이다. (A) 패닝 라운드에 따른 파지 아웃풋 타이터 플롯(면역튜브-기반), (B) 파지 일루션 타이터 비율 플롯(면역튜브-기반), (C) 패닝 라운드에 따른 파지 아웃풋 타이터 플롯(마그네틱비드-기반), (B) 파지 일루션 타이터 비율 플롯(마그네틱비드-기반). 일루션 타이터 비율=(파지 아웃풋타이터(항원 Gc(엑토도메인) 변이체)÷스킴 밀크 콘트롤 아웃풀 타이터(항원 Gc(엑토도메인) 변이체 없음).
도 4는 단클론 파지 ELISA를 나타낸 것이다. 면역튜브 패닝의 3라운드 아웃풋(A) 및 4라운드 아웃풋(B)을 사용한 ELISA 스크리닝. 마그네틱비드 패닝의 2라운드 아웃풋(C) 및 3라운드 아웃풋(D)을 사용한 ELISA 스크리닝.
도 5는 선택된 특이적 항-Gc(엑토도메인) 변이체 Fab 클론(Kabat)의 아미노산 서열을 나타낸 것이다.
도 6은 특이적 항-Gc(엑토도메인) 변이체 Fab 클론의 선택빈도(%)를 나타낸 것이다.
도 7은 특이적 항-Gc(엑토도메인) 변이체 Fab 클론의 HCDR3 길이를 나타낸 것이다.
도 8은 용해서 ELISA 스크리닝을 나타낸 것이다. Gc(엑토도메인) 변이체에 결합하는 용해서 Fab(주변세포질 추출물에서)의 ELISA.
도 9는 정제된 항-Gc(엑토도메인) 변이체 Fab 클론의 SDS-PAGE 분석 결과를 나타낸 것이다. M, standard marker. R and NR, reducing (+2% β-mercaptoethanol) and non-reducing (without β-mercaptoethanol) condition, respectively.
도 10a-10d는 용해서 ELISA에 의한 친화도 결정 결과를 나타낸 것이다. 도 10a-10c는 정제된 Fab 클론의 연속 희석에 의한 ELISA 플롯(왼쪽), 및 이의 EC50 (nM) 및 ELISA 플롯으로부터 계산된 R2 값. 도 10d는 요약 테이블.
도 11은 VH 및 VL 유전자의 준비과정을 나타낸 것이다. (A) PCR 프라이머 및 프라이머로 VL 조합 PCR의 모식도.
도 12는 항-Gc(엑토도메인) 변이체 Fab의 IgG1 발현 벡터 구조를 나타낸 것이다. 경쇄 발현벡터(A) 및 중쇄 발현 벡터(B)의 구조.
도 13은 SFTSV Gc 항체의 발현 결과를 나타낸 것이다. PC: Rabbit antibody, NC: Negative control.
도 14는 SFTSV Gc 항체의 친화도 분석 결과를 나타낸 것이다.
도 15는 SFTSV Gc 항체의 대량 생산 및 정제 결과를 나타낸 것이다.
도 16은 SFTSV Gc 단백질의 ELISA assay 결과를 나타낸 것이다.
도 17은 SFTSV Gc 단백질의 SPR assay 결과를 나타낸 것이다.
도 18은 SFTSV Gc 항체의 SFTSV에 대한 중화능 평가 결과를 나타낸 것이다.
도 19는 SFTSV Gc 항체의 RVFV에 대한 교차반응 평가 결과를 나타낸 것이다.
도 2는 Gc (ectodomain) 변이체에 대한 SDS-PAGE 분석 결과를 나타낸 것이다.
도 3은 파지디스플레이 라이브러리 패닝을 나타낸 것이다. (A) 패닝 라운드에 따른 파지 아웃풋 타이터 플롯(면역튜브-기반), (B) 파지 일루션 타이터 비율 플롯(면역튜브-기반), (C) 패닝 라운드에 따른 파지 아웃풋 타이터 플롯(마그네틱비드-기반), (B) 파지 일루션 타이터 비율 플롯(마그네틱비드-기반). 일루션 타이터 비율=(파지 아웃풋타이터(항원 Gc(엑토도메인) 변이체)÷스킴 밀크 콘트롤 아웃풀 타이터(항원 Gc(엑토도메인) 변이체 없음).
도 4는 단클론 파지 ELISA를 나타낸 것이다. 면역튜브 패닝의 3라운드 아웃풋(A) 및 4라운드 아웃풋(B)을 사용한 ELISA 스크리닝. 마그네틱비드 패닝의 2라운드 아웃풋(C) 및 3라운드 아웃풋(D)을 사용한 ELISA 스크리닝.
도 5는 선택된 특이적 항-Gc(엑토도메인) 변이체 Fab 클론(Kabat)의 아미노산 서열을 나타낸 것이다.
도 6은 특이적 항-Gc(엑토도메인) 변이체 Fab 클론의 선택빈도(%)를 나타낸 것이다.
도 7은 특이적 항-Gc(엑토도메인) 변이체 Fab 클론의 HCDR3 길이를 나타낸 것이다.
도 8은 용해서 ELISA 스크리닝을 나타낸 것이다. Gc(엑토도메인) 변이체에 결합하는 용해서 Fab(주변세포질 추출물에서)의 ELISA.
도 9는 정제된 항-Gc(엑토도메인) 변이체 Fab 클론의 SDS-PAGE 분석 결과를 나타낸 것이다. M, standard marker. R and NR, reducing (+2% β-mercaptoethanol) and non-reducing (without β-mercaptoethanol) condition, respectively.
도 10a-10d는 용해서 ELISA에 의한 친화도 결정 결과를 나타낸 것이다. 도 10a-10c는 정제된 Fab 클론의 연속 희석에 의한 ELISA 플롯(왼쪽), 및 이의 EC50 (nM) 및 ELISA 플롯으로부터 계산된 R2 값. 도 10d는 요약 테이블.
도 11은 VH 및 VL 유전자의 준비과정을 나타낸 것이다. (A) PCR 프라이머 및 프라이머로 VL 조합 PCR의 모식도.
도 12는 항-Gc(엑토도메인) 변이체 Fab의 IgG1 발현 벡터 구조를 나타낸 것이다. 경쇄 발현벡터(A) 및 중쇄 발현 벡터(B)의 구조.
도 13은 SFTSV Gc 항체의 발현 결과를 나타낸 것이다. PC: Rabbit antibody, NC: Negative control.
도 14는 SFTSV Gc 항체의 친화도 분석 결과를 나타낸 것이다.
도 15는 SFTSV Gc 항체의 대량 생산 및 정제 결과를 나타낸 것이다.
도 16은 SFTSV Gc 단백질의 ELISA assay 결과를 나타낸 것이다.
도 17은 SFTSV Gc 단백질의 SPR assay 결과를 나타낸 것이다.
도 18은 SFTSV Gc 항체의 SFTSV에 대한 중화능 평가 결과를 나타낸 것이다.
도 19는 SFTSV Gc 항체의 RVFV에 대한 교차반응 평가 결과를 나타낸 것이다.
본 발명은 다양한 변환을 가할 수 있고 여러 가지 실시예를 가질 수 있는 바, 이하 특정 실시예들을 도면에 예시하고 상세한 설명에 상세하게 설명하고자 한다. 그러나, 이는 본 발명을 특정한 실시 형태에 대해 한정하려는 것이 아니며, 본 발명의 사상 및 기술 범위에 포함되는 모든 변환, 균등물 내지 대체물을 포함하는 것으로 이해되어야 한다. 본 발명을 설명함에 있어서 관련된 공지 기술에 대한 구체적인 설명이 본 발명의 요지를 흐릴 수 있다고 판단되는 경우 그 상세한 설명을 생략한다.
본 발명은 서열번호 1 내지 10으로 이루어진 군에서 선택된 하나의 경쇄 CDR1; 서열번호 11 내지 20으로 이루어진 군에서 선택된 하나의 경쇄 CDR2; 및 서열번호 21 내지 30으로 이루어진 군에서 선택된 하나의 경쇄 CDR3를 포함하는 경쇄 가변영역과, 서열번호 31 내지 40으로 이루어진 군에서 선택된 하나의 중쇄 CDR1; 서열번호 41 내지 50으로 이루어진 군에서 선택된 하나의 중쇄 CDR2; 및 서열번호 51 내지 60으로 이루어진 군에서 선택된 하나의 중쇄 CDR3를 포함하는 경쇄 가변영역을 포함하는 중증열성혈소판감소증후군 바이러스 Gc 항원에 특이적으로 결합하는 항체를 제공한다.
구체적으로, 본 발명은 서열번호 1의 경쇄 CDR1; 서열번호 11의 경쇄 CDR2; 및 서열번호 21의 경쇄 CDR3를 포함하는 경쇄 가변영역과, 서열번호 31의 중쇄 CDR1; 서열번호 41의 중쇄 CDR2; 및 서열번호 51의 중쇄 CDR3를 포함하는 경쇄 가변영역을 포함하는 중증열성혈소판감소증후군 바이러스 Gc 항원에 특이적으로 결합하는 항체, 서열번호 2의 경쇄 CDR1; 서열번호 12의 경쇄 CDR2; 및 서열번호 22의 경쇄 CDR3를 포함하는 경쇄 가변영역과, 서열번호 32의 중쇄 CDR1; 서열번호 42의 중쇄 CDR2; 및 서열번호 52의 중쇄 CDR3를 포함하는 경쇄 가변영역을 포함하는 중증열성혈소판감소증후군 바이러스 Gc 항원에 특이적으로 결합하는 항체, 서열번호 3의 경쇄 CDR1; 서열번호 13의 경쇄 CDR2; 및 서열번호 23의 경쇄 CDR3를 포함하는 경쇄 가변영역과, 서열번호 33의 중쇄 CDR1; 서열번호 43의 중쇄 CDR2; 및 서열번호 53의 중쇄 CDR3를 포함하는 경쇄 가변영역을 포함하는 중증열성혈소판감소증후군 바이러스 Gc 항원에 특이적으로 결합하는 항체, 서열번호 4의 경쇄 CDR1; 서열번호 14의 경쇄 CDR2; 및 서열번호 24의 경쇄 CDR3를 포함하는 경쇄 가변영역과, 서열번호 34의 중쇄 CDR1; 서열번호 44의 중쇄 CDR2; 및 서열번호 54의 중쇄 CDR3를 포함하는 경쇄 가변영역을 포함하는 중증열성혈소판감소증후군 바이러스 Gc 항원에 특이적으로 결합하는 항체, 서열번호 5의 경쇄 CDR1; 서열번호 15의 경쇄 CDR2; 및 서열번호 25의 경쇄 CDR3를 포함하는 경쇄 가변영역과, 서열번호 35의 중쇄 CDR1; 서열번호 45의 중쇄 CDR2; 및 서열번호 55의 중쇄 CDR3를 포함하는 경쇄 가변영역을 포함하는 중증열성혈소판감소증후군 바이러스 Gc 항원에 특이적으로 결합하는 항체, 서열번호 6의 경쇄 CDR1; 서열번호 16의 경쇄 CDR2; 및 서열번호 26의 경쇄 CDR3를 포함하는 경쇄 가변영역과, 서열번호 36의 중쇄 CDR1; 서열번호 46의 중쇄 CDR2; 및 서열번호 56의 중쇄 CDR3를 포함하는 경쇄 가변영역을 포함하는 중증열성혈소판감소증후군 바이러스 Gc 항원에 특이적으로 결합하는 항체, 서열번호 7의 경쇄 CDR1; 서열번호 17의 경쇄 CDR2; 및 서열번호 27의 경쇄 CDR3를 포함하는 경쇄 가변영역과, 서열번호 37의 중쇄 CDR1; 서열번호 47의 중쇄 CDR2; 및 서열번호 57의 중쇄 CDR3를 포함하는 경쇄 가변영역을 포함하는 중증열성혈소판감소증후군 바이러스 Gc 항원에 특이적으로 결합하는 항체, 서열번호 8의 경쇄 CDR1; 서열번호 18의 경쇄 CDR2; 및 서열번호 28의 경쇄 CDR3를 포함하는 경쇄 가변영역과, 서열번호 38의 중쇄 CDR1; 서열번호 48의 중쇄 CDR2; 및 서열번호 58의 중쇄 CDR3를 포함하는 경쇄 가변영역을 포함하는 중증열성혈소판감소증후군 바이러스 Gc 항원에 특이적으로 결합하는 항체, 서열번호 9의 경쇄 CDR1; 서열번호 19의 경쇄 CDR2; 및 서열번호 29의 경쇄 CDR3를 포함하는 경쇄 가변영역과, 서열번호 39의 중쇄 CDR1; 서열번호 49의 중쇄 CDR2; 및 서열번호 59의 중쇄 CDR3를 포함하는 경쇄 가변영역을 포함하는 중증열성혈소판감소증후군 바이러스 Gc 항원에 특이적으로 결합하는 항체, 서열번호 10의 경쇄 CDR1; 서열번호 20의 경쇄 CDR2; 및 서열번호 30의 경쇄 CDR3를 포함하는 경쇄 가변영역과, 서열번호 40의 중쇄 CDR1; 서열번호 50의 중쇄 CDR2; 및 서열번호 60의 중쇄 CDR3를 포함하는 경쇄 가변영역을 포함하는 중증열성혈소판감소증후군 바이러스 Gc 항원에 특이적으로 결합하는 항체를 제공한다.
본 발명의 일 예에서, 경쇄 가변영역은 서열번호 71 내지 80 중 어느 하나일 수 있고, 중쇄 가변영역은 81 내지 90 중 어느 하나를 포함하는 중증열성혈소판감소증후군 바이러스 Gc 항원에 특이적으로 결합하는 항체일 수 있다.
본 발명에서 "항체"는 면역계 내에서 항원의 자극에 의하여 만들어지는 물질을 의미하는 것으로서 그 종류는 특별히 제한되지 않는다. 또한 본 명세서에서 항체란 항원 결합능을 보유한 항체의 단편 예컨대, Fab, Fab', F(ab')2, Fv 및 Nanobody 등을 포함하나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에서 "중쇄(heavy chain)"는 항원의 특이성을 부여하기 위한 충분한 가변 영역 서열을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 가변 영역 도메인 VH 및 3개의 불변 영역 도메인을 포함하는 전체길이 중쇄 및 이의 단편을 모두 의미한다.
본 발명에서 "경쇄(light chain, VL; kappa light chain, Vk)"는 항원에 특이성을 부여하기 위한 충분한 가변영역 서열을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 가변영역 도메인 VL(Vk) 및 불변영역 도메인을 포함하는 전체길이 경쇄 및 이의 단편을 모두 의미한다.
본 발명에서 "상보성 결정 부위(complementarity-determining region, CDR)"는 항체의 중쇄 및 경쇄에서 고가변 영역(hypervariable region)의 아미노산 서열을 의미한다. 중쇄 및 경쇄에는 각각 3개의 CDR이 포함되어 있으며, CDR은 항체가 항원 또는 에피토프에 결합하는데 중요한 역할을 하는 접촉 잔기를 제공한다.
또한, 본 발명은 서열번호 1 내지 10으로 이루어진 군에서 선택된 하나의 경쇄 CDR1; 서열번호 11 내지 20으로 이루어진 군에서 선택된 하나의 경쇄 CDR2; 및 서열번호 21 내지 30으로 이루어진 군에서 선택된 하나의 경쇄 CDR3를 포함하는 경쇄 가변영역과, 서열번호 31 내지 40으로 이루어진 군에서 선택된 하나의 중쇄 CDR1; 서열번호 41 내지 50으로 이루어진 군에서 선택된 하나의 중쇄 CDR2; 및 서열번호 51 내지 60으로 이루어진 군에서 선택된 하나의 중쇄 CDR3를 포함하는 경쇄 가변영역을 포함하는 폴리펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산을 제공한다.
본 발명의 다른 예에서, 경쇄 가변영역은 서열번호 71 내지 80 중 어느 하나일 수 있고, 중쇄 가변영역은 81 내지 90 중 어느 하나를 포함하는 폴리펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 핵산을 포함하는 벡터를 제공한다.
본 발명에서 "벡터 (vector)"는 적합한 숙주 내에서 DNA를 발현시킬 수 있는 적합한 조절 서열에 작동가능하게 연결된 DNA 서열을 함유하는 DNA 제조물을 의미한다. 벡터는 플라스미드, 파지 입자, 또는 간단하게 잠재적 게놈 삽입물일 수 있다. 적당한 숙주로 형질전환되면, 벡터는 숙주 게놈과 무관하게 복제하고 기능할 수 있거나, 또는 일부 경우에 게놈 그 자체에 통합될 수 있다.
본 발명에서 "발현 벡터"는 통상 이종의 DNA의 단편이 삽입된 재조합 캐리어 (recombinant carrier)로서 일반적으로 이중 가닥의 DNA의 단편을 의미한다. 여기서, 이종 DNA는 숙주 세포에서 천연적으로 발견되지 않는 DNA인 이형 DNA를 의미한다. 발현 벡터는 일단 숙주 세포내에 있으면 숙주 염색체 DNA와 무관하게 복제할 수 있으며 벡터의 수 개의 카피 및 그의 삽입된 (이종) DNA가 생성될 수 있다.
본 발명에서 "프로모터"는 형질주입하고자 하는 유전자의 발현을 촉진시키는 것으로서 상기 프로모터에는 전사에 필요한 기본인자(Basal element)뿐만 아니라, 발현의 촉진 및 조절에 사용될 수 있는 인핸서(enhancer)가 더 포함될 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 벡터를 포함하는 숙주 세포를 제공한다.
본 발명의 항체를 보유하고 발현하는 숙주 세포는 원핵 또는 진핵 세포일 수 있다. 예를 들어, 상기 숙주 세포는 EColi, 바람직하게, Ecoli ER2738 HB2151, BL21 등일 수 있으며, 이들은 본 발명의 폴리뉴클레오티드를 클로닝하고 발현시키는데 유용할 수 있다. 또한, 다른 미생물 숙주로 바실러스, 예를 들어 바실러스 섭틸리스(Bacillus subtilis), 또는 다른 장내 박테리아, 예를 들어 살모넬라(Salmonella) 또는 세라티아(Serratia), 또는 다양한 슈도모나스(Pseudomonas) 종이 사용될 수 있다. 본 발명의 항체를 발현시키기 위해 다른 미생물, 들어 효모가 사용될 수 있으며, 바큘로바이러스 벡터와 조합된 곤충 세포가 또한 사용될 수 있다. 특히 대장균이나 효모를 이용한 미생물 발현 시스템은 배양기간이 짧고 비용이 적게 소요되며 외래단백질의 발현율이 높아 대량생산이 가능한 특징으로 인해 널리 이용되고 있다.
추가적으로, 포유동물 숙주 세포가 본 발명의 SFTSV 외막 당단백질 결합 폴리펩티드를 발현시키고 제조하는데 사용될 수 있다. 예를 들어, 내인성 면역글로불린 유전자를 발현하는 하이브리도마 세포주 또는 외인성 발현 벡터를 보유하는 포유동물 세포주 일 수 있다. 또한, 임의의 동물 또는 인간 세포로, 예를 들어, CHO 세포주, Cos 세포주, HeLa 세포, 골수종 세포주, HEK 세포주, 형질전환된 B-세포 및 하이브리도마를 포함한다. 또한, 면역글로불린을 분비할 수 있는 수많은 적합한 숙주 세포주가 사용될 수 있으며, 바람직하게는 HEK293, CHO 또는 CHO-DG44가 사용될 수 있다.
또한, 식물은 대규모 재조합 항체 생산에 유용한 가장 경제적인 시스템이다. 미생물처럼, 식물세포는 배양 및 유지 비용이 비싸지 않으나, 고등한 진핵세포이므로 인간세포에서 일어나는 해독 후 변형이 많이 일어날 수 있다. 식물세포는 또한 인간 병원균을 함유하지 않고 내독소를 생산하지 않으므로 본질적으로 안전하다. 식물세포는 면역 글로불린을 포함하여 복잡한 다중결합 단백질 및 당단백질을 합성할 수 있다. 전체 식물에 걸쳐 식물세포의 가장 중요한 이점은 특히 생산물이 배양 배지로 분비될 경우에, 생산물의 분리 및 정제 과정에 훨씬 단순하다는 것이다.
식물의 형질전환에 이용되는 "식물 세포"는 어떤 식물 세포도 된다. 식물 세포는 배양 세포, 배양 조직, 배양 기관 또는 전체 식물, 바람직하게는 배양 세포, 배양 조직 또는 배양 기관 및 더욱 바람직하게는 배양 세포의 어떤 형태도 된다.
식물 세포에서 발현 벡터의 바람직한 예는 아그로박테리움 투머파시엔스와 같은 적당한 숙주에 존재할 때 그 자체의 일부, 소위 T-DNA영역을 식물 세포로 전이시킬 수 있는 Ti-플라스미드 벡터이다. 다른 유형의 Ti-플라스미드 벡터(EP 0 116 718 B1호 참조)는 현재 식물 세포, 또는 잡종 DNA를 식물의 게놈 내에 적당하게 삽입시키는 새로운 식물이 생산될 수 있는 원형질체로 잡종 DNA 서열을 전이시키는데 이용되고 있다. Ti-플라스미드 벡터의 특히 바람직한 형태는 EP 0 120 516 B1호 및 미국 특허 제4,940,838호에 청구된 바와 같은 소위 바이너리(binary) 벡터이다. 본 발명에 따른 유전자를 식물 숙주에 도입시키는데 이용될 수 있는 다른 적합한 벡터는 이중 가닥 식물 바이러스(예를 들면, CaMV) 및 단일 가닥 바이러스, 게미니 바이러스 등으로부터 유래될 수 있는 것과 같은 바이러스 벡터, 예를 들면 비완전성 식물 바이러스 벡터로부터 선택될 수 있다. 그러한 벡터의 사용은 특히 식물 숙주를 적당하게 형질전환 하는 것이 어려울 때 유리할 수 있다.
단백질 발현숙주로 이용되는 대장균은 발현율이 높고 배양기간이 짧으며 비용이 적게 소요되는 장점이 있으나 발현된 단백질의 회수과정에서 세포를 균질화해야 하고, 단백질 과발현시 불용성의 inclusion body를 형성하여 단백질의 활성이 상실되어 이것을 이용하기 위해 단백질을 refolding시켜야 하는 문제점이 있었다.
반면, 효모 발현 시스템은 고발현성, 짧은 배양시간과 더불어, 대장균과는 달리 번역 후 수식과정이 있으므로 단백질이 안정화되고, 용해성이 우수한 활성형 단백질이 생성이 가능하다. 특히, 효모 시스템은 신호 펩타이드를 이용하여 발현된 단백질이 배지 내 분비되기 때문에 원하는 단백질을 얻기 위해 세포를 균질화시키는 과정이 불필요하여 실험 절차가 단축되고 시간과 경비 면에서도 효과를 가져온다. 특히 인체에 안전하다고 알려진 GRAS(generally regarded as safe) 균주로써, 효모발현시스템을 이용한 항체생산 시 혈청배지를 사용하지 않아도 되고, 비싼 동물세포배양기 대신 미생물 발효조를 이용할 수 있으며, 동물세포대비 단백질 발현양도 비교적 높은 편이다. 동물세포 대신 효모를 이용한 항체생산 시 균체 성장속도 및 단백질 발현양 증가로 인한 생산성 향상, 값비싼 배지 및 동물세포배양기 미사용으로 인한 생산비 감축 및 혈청배지 미사용으로 인한 안전성 및 안정성 향상 등의 장점이 있다.
본 발명의 일 예에서, 상기 중증열성혈소판감소증후군 바이러스 Gc 항원에 특이적으로 결합하는 항체를 포함하는 중증열성혈소판감소증후군 바이러스 검출용 조성물을 제공한다.
본 발명의 다른 예에서, 상기 중증열성혈소판감소증후군 바이러스 Gc 항원에 특이적으로 결합하는 항체를 포함하는 중증열성혈소판감소증후군 바이러스 감염증 진단용 조성물을 제공한다.
상기 중증열성혈소판감소증후군 바이러스 감염증은 발열, 복통, 구역, 구토, 혈소판 감소증 또는 백혈구 감소증을 포함하는 것일 수 있다.
상기 조성물은 SFTSV를 진단하기에 적합한 1종 이상의 다른 제제를 추가로 함유할 수 있다. 또한, 본 발명은 본 발명의 항체를 사용하여 SFTSV를 진단하는 방법을 제공한다. 상기 방법은 SFTSV의 정량적 또는 정성적 검출 또는 진단하는데 사용될 수 있다. 구체적으로, 상기 진단 방법은 생물학적 샘플(예를 들어, 혈액, 혈청, 세포 또는 조직)로부터 또는 SFTS를 앓고 있거나 발생할 위험이 있는 대상으로부터 SFTSV의 외막 당단백질 및/또는 핵산 발현 및 SFTSV의 외막 당단백질 기능을 결정하는 진단 검정을 포함할 수 있다. 본 발명에 있어서, 검출은 정량 및/또는 정성 분석을 포함하는 것으로, 존재, 부존재의 검출 및 바이러스 양(titer)의 검출을 포함하는 것으로 이러한 방법은 당업계에 공지되어 있으며, 당업자라면 본원의 실시를 위해 적절한 방법을 선택할 수 있다.
본 발명의 또 다른 예에서, 본 발명은 분리된 시료로부터 상기 중증열성혈소판감소증후군 바이러스 Gc 항원에 특이적으로 결합하는 항체를 이용하여 중증열성혈소판감소증후군 바이러스를 검출하는 방법을 제공한다.
본 발명에 있어서, SFTSV의 진단의 검출 또는 진단은 항원-항체의 복합체를 검출하는 방사상면역분석, 웨스턴블랏, ELISA(Enzyme linked immunosorbent assay) 또는 면역형광분석 등을 통해 검출될 수 있다. 본 발명에 있어서, 항원은 방사능 물질, 효소 또는 형광물질 등의 표지로 표지될 수 있다.
상기 검출 또는 진단용 조성물은 사용설명서를 추가적으로 포함하는 검출 또는 진단 키트의 형태로 제공될 수 있다. 상기 키트는 상기 언급된 항체의 어느 하나 이상 및 항원-항체 복합체 검출용 시약을 포함할 수 있다. 상기 항원-항체 복합체 검출용 시약은 방사상면역분석, ELISA (Enzyme linked immunosorbent assay) 또는 면역형광분석 등에 사용되는 시약이 사용될 수 있다.
예를 들어, 상기 면역 반응의 검출을 위해 검출시약은 검출을 위해 직접적 또는 샌드위치 형태로 간접적으로 표지될 수 있다. 직접적 표지방법의 경우, 어레이 등에 사용되는 혈청 시료는 Cy3 또는 Cy5와 같은 형광 표지로 표지될 수 있다. 샌드위치 방식의 경우, 표지되지 않은 혈청 시료를 먼저 검출시약이 부착된 어레이와 반응시켜 결합시킨 후, 표적 단백질을 표지된 검출 항체와 결합시켜 검출할 수 있다. 샌드위치 방식의 경우, 민감도와 특이성을 높일 수 있어, pg/mL 수준까지 검출이 가능하다. 그 외 방사능 물질, 발색물질, 자기성입자 또는 고밀도 전자입자 등이 표지물질로 사용될 수 있다. 형광 광도는 스캐닝 콘포칼 현미경이 사용될 수 있으며, 예를 들어 Affymetrix, Inc 또는 Agilent Technologies, Inc 등에서 입수할 수 있다.
본 발명의 키트는 추가로 결합분석에 필요한 하나 이상의 부가 성분을 포함할 수 있으며, 예를 들면 결합 버퍼, 시료 준비에 필요한 시약, 혈액채취용 주사기 또는 음성 및/또는 양성대조군을 추가로 포함할 수 있다. 상기 다양한 검출시약을 포함할 수 있는 본원의 키트는 분석양태에 따라 ELISA 분석용, 딥스틱 래피드 키트(dip stick rapid kit) 분석용, 마이크로어레이용, 유전자증폭용, 또는 면역분석용 등으로 제공될 수 있으며, 분석 양태에 맞추어 적절한 검출시약을 선별할 수 있다.
상기 검출 또는 진단용 조성물 또는 검출하는 방법에서, 시료는 분리된 혈액, 소변, 분변, 분리된 조직으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상일 수 있다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 보다 상세히 설명한다. 다만, 하기의 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것으로서 본 발명의 범위가 하기의 실시예에 한정되는 것은 아니다.
<실시예1> SFTSV Gc (ectodomain) 변이체에 대한 Fab 항체 선별
SFTSV Gc (ectodomain) 변이체에 결합하는 항체 선별은 파지디스플레이 기술을 이용한 바이오패닝을 통해 수행되었다. 바이오패닝에서 Immunotube에 항원을 고정하는 방식의 경우, 정제된 Gc (ectodomain) 변이체가 부착된 immunotube에 인간 합성 Fab phage display 라아브러리를 섞어주고 PBS-T (0.05% Tween-20 in PBS)와 같은 washing buffer로 non-specific phage binder를 제거한 뒤, Gc (ectodomain) 변이체에 결합하는 phage 들을 용출해낸다. 용출된 phage는 다시 증폭시켜 다음 라운드 패닝에 이용된다(도 1A). Magnetic bead에 항원을 고정하는 방식의 경우, 정제된 Gc (ectodomain) 변이체가 conjugation 된 magnetic bead에 인간 합성 Fab phage display 라이브러리를 섞어주며 그 뒤의 과정은 immunotube 고정 방식과 유사하다(도 1B). 앞서 언급한 방식으로 패닝을 여러번 반복하면 Gc (ectodomain) 변이체 특이적인 phage enrichment가 나타나고, 이어서 monoclonal phage ELISA 및 서열 분석을 통해 Gc (ectodomain) 변이체에 결합하는 단일 클론을 확보할 수 있다.
<실시예2> SFTSV Gc (ectodomain) 변이체에 대한 SDS-PAGE 분석 결과
SFTSV Gc (ectodomain) 변이체에 대한 바이오패닝을 수행하기에 앞서, Gc (ectodomain) 변이체의 size exclusion chromatography를 통한 2차 정제 및 peptide mapping을 수행하였다. 2차 정제 후 수도 높은 Gc (ectodomain) 변이체를 확보하였고(도 2), peptide mappin을 통해 SDS-PAGE 상에서 나타나는 두 개의 밴드는 모두 Gc (ectodomain) 변이체 서열을 가지고 있음을 확인하였다.
<실시예3> 인간 합성 Fab phage display 항체라이브러리 패닝
SFTSV Gc (ectodomain) 변이체에 결합하는 항체를 선별하기 위해, 인간 합성 Fab phage display를 이용하여 신약센터에서 구축한 파지 패닝 프로토콜에 따라 정제된 Gc (ectodomain) 변이체에 대한 파지 패닝을 수행하였다. 패닝은 항원을 고정하는 방식(도 3A, 3B; immunotube coating, 3C, 3D; magnetic bead conjugation)에 따라 두 가지 방법으로 수행하였다. 항원 단백질이 고정되지 않은 skim milk control 패닝도 병행하여 각각의 output titer를 매 라운드마다 비교함으로써 elution titer ratio (i.e., output titer divided by control output titer)를 통해 phage의 enrichment를 모니터링하였다(도 3B, 3D). Immunotube를 이용한 패닝의 경우, 3, 4 라운드에서 항원 Gc (ectodomain) 변이체에 대해 control 대비 8~10배 차이를 보이는 것으로 항원 Gc (ectodomain) 변이체에 대한 phage가 enrichment 되는 것을 확인할 수 있었다(도 3B). Magnetic beads를 이용한 패닝의 경우, 2 라운드에서 항원 Gc (ectodomain) 변이체에 대해 control 대비 1.5 배 이상의 차이를 보이나 3, 4 라운드에서는 큰 차이가 나타나지 않는 것으로 보였다(도 3D).
<실시예4> Phage ELISA screening
파지 패닝에서 얻은 파지들 가운데 항원 Gc (ectodomain) 변이체에 특이적으로 결합하는 클론을 선별하기 위해, immunotube를 이용한 패닝의 경우, 3 라운드에서 얻은 94개와 4 라운드에서 얻은 94 개의 클론들을 상대로 monoclonal 파지 ELISA 를 수행하였으며, 그 결과 항원 Gc (ectodomain) 변이체에 대한 흡광 (A450nm) cut-off 를 각각 0.5 이상으로 정하여 선별하였을 때 3 라운드에서 66개, 4 라운드에서 76개의 클론들이 ELISA에 양성인 것으로 확인되었다(도 4A, 4B). Magnetic beads를 이용한 패닝의 경우, 3 라운드에서 얻은 94개와 4 라운드에서 얻은 94 개의 클론들을 상대로 monoclonal 파지 ELISA를 수행하였으며, 그 결과 항원 Gc (ectodomain) 변이체에 대해 흡광 (A450nm) cut-off를 각각 0.5 이상으로 정하여 선별하였을 때 3 라운드에서 19개, 4 라운드에서 11 개의 클론이 ELISA에 양성인 것으로 확인되었다(도 4C, 4D).
<실시예5> 항원 Gc (ectodomain) 변이체에 대한 unique Fab 클론의 서열 분석
Monoclonal 파지 ELISA 에서 양성반응을 보인 항원 Gc (ectodomain) 변이체에 대한 172 종의 Fab 클론들(도 4)을 sequencing 한 다음 Kabat numbering을 통해 아미노산 서열을 alignment하여 grouping한 결과, 총 31종의 항원 Gc (ectodomain) 변이체에 대한 unique anti-Gc (ectodomain) 변이체 Fab 클론이 얻어졌다(도 5).
항원 Gc (ectodomain) 변이체에 대해 얻어진 Fab의 선별 빈도를 보면, 클론 Gc-3-1F3(#15)가 18.2%로 가장 많은 빈도로 선별되었고, 나머지 30종의 클론들은 0.6~14.9% 범위로 선별되었다(도 6).
항원 Gc (ectodomain) 변이체에 대해 얻어진 Fab의 heavy chain CDR3(HCDR3)의 길이를 보면, HCDR3가 14개의 잔기를 갖는 클론들이 61.3%로 major 하게 선별되었고, HCDR3가 8개, 9개, 10개, 12개, 13개, 15개, 16개의 잔기를 갖는 클론들이 3.2~12.9% 범위로 minor하게 선별되었다(도 7).
<실시예6> Soluble ELISA screening
항원 Gc (ectodomain) 변이체에 대해 얻어진 총 31 종의 Fab 클론들은 soluble ELISA screening (crude periplasmic extract 이용)을 통해 친화도를 비교 분석하였다. 이를 통해 periplasmic extract에 존재하는 Fab 양(도 8B, OD450) 대비 Gc (ectodomain) 변이체에 친화도(도 8A, OD450)가 높은 10종(#5, #12, #13, #14, #15, #21, #24, #25, #26, #29)의 클론들을 선별하였다(표1, 표2).
| No. | ID | CDR1Vk | CDR2Vk | CDR3Vk |
| 5 | Gc-3-1C8 | RASQTISNYLN(서열번호1) | AASRLQS(서열번호1) | QQSYSFPWT(서열번호21) |
| 12 | Gc-3-1E3 | RASQDISSYLN(서열번호2) | AASRLQS(서열번호12) | QQSYSFPWT(서열번호22) |
| 13 | Gc-3-1E8 | RASQSISNWLN(서열번호3) | AASRLQS(서열번호13) | QQSYSYPWT(서열번호23) |
| 14 | Gc-3-1E12 | RASQSISNYLN(서열번호4) | ATSSLQS(서열번호14) | QQTYSFPWT(서열번호24) |
| 15 | Gc-3-1F3 | RASQSISNYLN(서열번호5) | AASRLQS(서열번호15) | QQSYSFPWT(서열번호25) |
| 21 | Gc-4-1C8 | RASQTISNYLN(서열번호6) | AASTLQS(서열번호16) | QQSYSFPWT(서열번호26) |
| 24 | Gc-b3-1H4 | RASQSISNYLN(서열번호7) | ATSRLQS(서열번호17) | QQSYSYPWT(서열번호27) |
| 25 | Gc-b3-1E4 | RASQSIRSYLN(서열번호8) | GASSLQS(서열번호18) | QQSYSFPYT(서열번호28) |
| 26 | Gc-b3-1H7 | RASQSISNYLN(서열번호9) | AASRLQS(서열번호19) | QQSYTFPRT(서열번호29) |
| 29 | Gc-b3-1E2 | RASQSISNYLN(서열번호10) | ATSRLQS(서열번호20) | QQSYSFPWT(서열번호30) |
*Vk: kappa light chain
| No. | ID | CDR1VH | CDR2VH | CDR3VH |
| 5 | Gc-3-1C8 | SYAMS(서열번호31) | AISSSGSSIYYADSVKG (서열번호41) |
DYVWGGGSLYWFDY(서열번호51) |
| 12 | Gc-3-1E3 | SYAMH(서열번호32) | RISSSGSSTYYADSVKG (서열번호42) |
DGASWSGTTFDY(서열번호52) |
| 13 | Gc-3-1E8 | SYEMH(서열번호33) | GISSSGSTKHYADSVKG (서열번호43) |
LSWSVYAFDI(서열번호53) |
| 14 | Gc-3-1E12 | DYAMH(서열번호34) | GISSSGGSTFYADSVKG (서열번호44) |
WEWGYQERKWAFDL(서열번호54) |
| 15 | Gc-3-1F3 | SYAMH(서열번호35) | AISSSGGNTYYADSVKG (서열번호45) |
SFYSYSWEQEWFDV(서열번호55) |
| 21 | Gc-4-1C8 | DYAMN(서열번호36) | SISSSGSSTYYADSVKG (서열번호46) |
VKWRQSTSEYFDY(서열번호56) |
| 24 | Gc-b3-1H4 | SYAMH(서열번호37) | GISSSGSYTNYADSVKG (서열번호47) |
SYYQYSWVEEWFDY(서열번호57) |
| 25 | Gc-b3-1E4 | DYAMS(서열번호38) | RISSSGSTTYYADSVKG (서열번호48) |
LQGRGFDH(서열번호58) |
| 26 | Gc-b3-1H7 | SYAMS(서열번호39) | AISSSGSTKYYADSVKG (서열번호49) |
WHYAYQYEYEFFDY(서열번호59) |
| 29 | Gc-b3-1E2 | NYAMN(서열번호40) | AISGSGSSTYYADSVKG (서열번호50) |
QFYVGQWLSGWFDV(서열번호60) |
*VH: Heavy chain
<실시예7> 항원 Gc (ectodomain) 변이체에 대한 unique Fab 클론의 대장균 발현 및 정제
항원 Gc (ectodomain) 변이체에 대한 10 종의 unique anti-Gc (ectodomain) 변이체 Fab 클론은 E. coli 발현벡터(pKFAB)에 클로닝 하였다. 이후 TB media 1200 mL에서 0.5 mM IPTG를 통해 발현을 유도하고 30℃에서 overnight 배양한 다음, periplasmic extraction 을 통해 soluble 단백질을 확보하였다. Strep Tag II column을 이용한 affinity chromatography를 통해 정제를 진행하였으며, 총 10종의 anti-Gc (ectodomain) 변이체 Fab 클론이 정제되었다(도 9). Gc-b31H7 클론의 경우 단백질 yield가 매우 낮아 IgG 형태로 confirm 실험이 필요하다.
<실시예8> 친화도 분석
정제된 anti-Gc (ectodomain) 변이체 Fab (10종) 항체 단백질을 이용한 soluble ELISA를 통해 항원 Gc (ectodomain) 변이체에 결합하는 각 클론들의 affinity를 비교 분석하였으며, 항원 Gc (ectodomain) 변이체에 결합하는 5 클론의 모든 R2 값이 (R2>0.99) 신뢰범위 안에 들었다. 항원 Gc (ectodomain) 변이체에 대한 3 클론(Gc-3-1E12, Gc-3-1E3, Gc-b3-1E2)은 6 nM (Gc-3-1E12) ~ 89 nM (Gc-b3-1E2) range 의 비교적 높은 affinity를 보였다(도 10). 그리고 나머지 2종(Gc-4-1C8, Gc-b3-1E4)의 anti-Gc (ectodomain) 변이체 Fab 클론들은 157 nM (Gc-4-1C8)~ 822 nM (Gc-b3-1E4) range의 affinity로 Gc (ectodomain) 변이체에 결합하는 것으로 나타났다. 1종(Gc-3-1E8)은 non-specific binder로 확인되었다. 나머지 3 클론(Gc-b3-1H4, Gc-b3-1H7, Gc-3-1F3, Gc-3-1C8)은 항원 Gc (ectodomain) 변이체에 약하게 결합하거나 결합하지 않았다.
<실시예9> IgG conversion
총 10종의 클론(Gc-3-1E12, Gc-3-1E3, Gc-b3-1E2, Gc-4-1C8, Gc-b3-1E4, Gc-b3-1H4, Gc-b3-1H7, Gc-3-1F3, Gc-3-1C8, Gc-3-1E8)을 IgG1 conversion하였다. 간단히 기술하면, 10종의 anti-Gc (ectodomain) 변이체 Fab 유전자의 VH, VL 유전자 및 template LC vector를 정해진 primers (도 11)를 사용하여 PCR을 통해 증폭하였으며, 정제된 VL과 template LC vector를 assemble 시켜 정제한 후, overlapping PCR을 통해 light chain fragment (VL insert)를 증폭하였다. VH와 VL insert 유전자를 각각 SfiI/NheI과 SfiI/EcoRI 제한효소로 절단하고 light chain (pCDNA3.3-Herceptin) 및 heavy chain (pOpti-Vec-Herceptin) 발현 벡터의 SfiI/EcoRI과 SfiI/NheI cloning site로 각각 ligation 하고, DNA ligates의 대장균 형질전환을 통해 각각에 대한 대장균 클론을 확보하였으며, 각 클론들의 DNA sequencing을 통해 클로닝된 VH 및 VL 유전자의 서열을 분석한 결과, 총 10 종의 anti-Gc (ectodomain) 변이체 Fab 클론에 대한 IgG1 발현벡터가 성공적으로 제작되었음을 확인하였다(도 12).
<결론>
인간 합성 Fab phage display 항체 라이브러리를 이용하여 정제된 항원 Gc (ectodomain) 변이체에 대한 바이오패닝을 수행한 결과, 총 31 종의 unique anti-Gc (ectodomain) 변이체 Fab 클론을 선별하였다. 이 중 Gc (ectodomain) 변이체에 대해 친화도가 높은 10종의 unique anti-Gc (ectodomain) 변이체 Fab 클론을 최종적으로 선별하였다.
항원 Gc (ectodomain) 변이체에 대한 10 종의 unique anti-Gc (ectodomain) 변이체 Fab 클론을 대장균에서 발현시켜 affinity chromatography를 통해 정제를 진행하였다. 정제된 총 10종의 anti-Gc (ectodomain) 변이체 Fab 항체 단백질을 이용한 soluble ELISA를 통해 얻어진 EC50 (nM)를 이용하여 Fab 클론들의 affinity를 비교 분석하였다. 각 클론들의 affinity를 비교 분석한 결과, 항원 Gc (ectodomain) 변이체에 대한 3 클론(Gc-3-1E12, Gc-3-1E3, Gc-b3-1E2)은 6 nM (Gc-3-1E12) ~ 89 nM (Gc-b3-1E2) range의 비교적 높은 affinity를 보였다. 그리고 나머지 2종(Gc-4-1C8, Gc-b3-1E4)의 anti-Gc (ectodomain) 변이체 Fab 클론들은 157 nM (Gc-4-1C8) ~ 822 nM (Gc-b3-1E4) range의 affinity로 Gc (ectodomain) 변이체에 결합하는 것으로 나타났다. 1종(Gc-3-1E8)은 non-specific binder로 확인되었다. 나머지 3 클론(Gc-b3-1H4, Gc-b3-1H7, Gc-3-1F3, Gc-3-1C8)은 항원 Gc (ectodomain) 변이체에 약하게 결합하거나 결합하지 않았다. 항원 Gc (ectodomain) 변이체에 대한 10종(gc-3-1E12, Gc-3-1E3, Gc-b3-1E2, Gc-4-1C8, Gc-4-1C8, Gc-b3-1E4, Gc-b3-1H4, Gc-b3-1H7, Gc-3-1F3, Gc-3-1C8, Gc-3-1E8)의 anti-Gc (ectodomain) 변이체 Fab을 클로닝을 통해 IgG1 발현벡터 제작을 진행하였고, DNA sequencing을 통해 성공적으로 제작되었음을 확인하였다.
<실시예10> IgG 형태의 단백질 발현 및 친화도 분석
위의 방식대로 클로닝 된 Gc 항체 각 10종을 HEK293T 세포에 1 ㎍씩 co-transfection하여 3일동안 배양하였고, 배양후 상층액을 거둬 Western blot을 통해 IgG 형태의 발현을 확인하였다.
10종의 항체 모두 heavy, light chain이 분비되어 발현됨을 확인하였다(도 13).
| No. | ID | 경쇄 서열 |
| 5 | Gc-3-1C8 (서열번호 61) |
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| No. | ID | 중쇄 서열 |
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SFTSV Fab 친화도 결과와 달리, IgG로 변환 후 ELISA 결과에서 #13, #25를 제외한 8종의 항체들이 Gc에 잘 결합됨을 확인하였다(도 14).
<실시예11> 항체 대량 생산 및 정제
확인된 10종의 항체를 대량으로 발현 및 정제하기 위해 HEK293T 세포주에 heavy, light을 10 ㎍ : 15 ㎍의 비율로 co-transfection하고 3일후 배양액으로부터 protein A resin column을 이용하여 정제하였다(도 15).
<실시예12> SFTSV Gc 단백질 ELISA assay
MaxiSorpTM flat-bottom 96-well plate (Nunc, 44-2404-01)에 정제된 Gc 항원 단백질을 100 ng/100 ㎕로 PBS에 희석하여 4℃, overnight 후 실험한 결과, 10종 모두 SFTSV Gc 항원 단백질에 결합함을 확인하였다. Kd값으로 보면, #5, #13, #15 항체가 우수한 결합력을 보였다(도 16).
<실시예13> SFTSV Gc 단백질 SPR (Surface plasmon resonance) assay
ELISA assay를 통하여 우수한 결합력을 확인한 #5, #12, #13, #14, #15, #26 항체 6종에 대하여 BIAcore T200 (GE Healthcare)을 사용하여 SFTSV Gc 단백질 결합력을 측정하였다. Anti-His antibody가 고정된 CM5 chip 표면에 SFTSV Gc-His 단백질을 injection 하였다. 6종의 항체는 HBS-EP+ running buffer에 순차적으로 희석하여 30 ㎕/min 유속으로 4분 동안 injection하고, 5분 동안 dissociation하였다. 각 cycle 마다 10 mM Glycine (pH1.5) 30 ㎕/min의 유속으로 30초간 regeneration을 수행하였다. Sensogram은 BIAevaluation software (Biacore)에서 1:1 binding model을 적용하여 분석하였다(도 17). 항체 6종 모두 우수한 항원 결합력을 보였다.
<실시예14> SFTSV Gc 항체 중화능 실험(FRNT, focus reduction neutralization test)
24 well plate에 Vero E6 세포를 seeding 한 후, 그 다음날 항체와 바이러스를 배지에 희석 후 바이러스와 항체를 1:1로 반응시키고 세포에 감염시켰다.
SFTS Gc 특이 항체들은 바이러스에 대한 중화능이 없었다(도 18).
<실시예15> Phlevovirus 속의 Rift Valley Fever Virus (RVFV)에 대한 Gc 항체의 교차반응 평가 (ELISA assay)
Nickel coated plates (Thermo, #15442) 에 정제된 RVFV 항원 단백질을 100 ng/100 ㎕로 PBS에 희석하여 4℃, overnight 후 실험하였다.
결과, SFTSV Gc 항원에만 결합하고 RVFV Gc에는 결합하지 않으므로 특이도 있음을 확인하였다(도 19).
이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시 양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.
<110> KCDC
<120> Antibody for binding severe fever thrombocytopenia syndrome virus
Gc antigen and uses thereof
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<170> KoPatentIn 3.0
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Claims (12)
- 서열번호 1의 경쇄 CDR1; 서열번호 11의 경쇄 CDR2; 및 서열번호 21의 경쇄 CDR3를 포함하는 경쇄 가변영역과,
서열번호 31의 중쇄 CDR1; 서열번호 41의 중쇄 CDR2; 및 서열번호 51의 중쇄 CDR3를 포함하는 경쇄 가변영역을 포함하는 중증열성혈소판감소증후군 바이러스 Gc 항원에 특이적으로 결합하는 항체 - 서열번호 2의 경쇄 CDR1; 서열번호 12의 경쇄 CDR2; 및 서열번호 22의 경쇄 CDR3를 포함하는 경쇄 가변영역과,
서열번호 32의 중쇄 CDR1; 서열번호 42의 중쇄 CDR2; 및 서열번호 52의 중쇄 CDR3를 포함하는 경쇄 가변영역을 포함하는 중증열성혈소판감소증후군 바이러스 Gc 항원에 특이적으로 결합하는 항체 - 서열번호 3의 경쇄 CDR1; 서열번호 13의 경쇄 CDR2; 및 서열번호 23의 경쇄 CDR3를 포함하는 경쇄 가변영역과,
서열번호 33의 중쇄 CDR1; 서열번호 43의 중쇄 CDR2; 및 서열번호 53의 중쇄 CDR3를 포함하는 경쇄 가변영역을 포함하는 중증열성혈소판감소증후군 바이러스 Gc 항원에 특이적으로 결합하는 항체 - 서열번호 4의 경쇄 CDR1; 서열번호 14의 경쇄 CDR2; 및 서열번호 24의 경쇄 CDR3를 포함하는 경쇄 가변영역과,
서열번호 34의 중쇄 CDR1; 서열번호 44의 중쇄 CDR2; 및 서열번호 54의 중쇄 CDR3를 포함하는 경쇄 가변영역을 포함하는 중증열성혈소판감소증후군 바이러스 Gc 항원에 특이적으로 결합하는 항체 - 서열번호 5의 경쇄 CDR1; 서열번호 15의 경쇄 CDR2; 및 서열번호 25의 경쇄 CDR3를 포함하는 경쇄 가변영역과,
서열번호 35의 중쇄 CDR1; 서열번호 45의 중쇄 CDR2; 및 서열번호 55의 중쇄 CDR3를 포함하는 경쇄 가변영역을 포함하는 중증열성혈소판감소증후군 바이러스 Gc 항원에 특이적으로 결합하는 항체 - 서열번호 6의 경쇄 CDR1; 서열번호 16의 경쇄 CDR2; 및 서열번호 26의 경쇄 CDR3를 포함하는 경쇄 가변영역과,
서열번호 36의 중쇄 CDR1; 서열번호 46의 중쇄 CDR2; 및 서열번호 56의 중쇄 CDR3를 포함하는 경쇄 가변영역을 포함하는 중증열성혈소판감소증후군 바이러스 Gc 항원에 특이적으로 결합하는 항체 - 서열번호 7의 경쇄 CDR1; 서열번호 17의 경쇄 CDR2; 및 서열번호 27의 경쇄 CDR3를 포함하는 경쇄 가변영역과,
서열번호 37의 중쇄 CDR1; 서열번호 47의 중쇄 CDR2; 및 서열번호 57의 중쇄 CDR3를 포함하는 경쇄 가변영역을 포함하는 중증열성혈소판감소증후군 바이러스 Gc 항원에 특이적으로 결합하는 항체 - 서열번호 8의 경쇄 CDR1; 서열번호 18의 경쇄 CDR2; 및 서열번호 28의 경쇄 CDR3를 포함하는 경쇄 가변영역과,
서열번호 38의 중쇄 CDR1; 서열번호 48의 중쇄 CDR2; 및 서열번호 58의 중쇄 CDR3를 포함하는 경쇄 가변영역을 포함하는 중증열성혈소판감소증후군 바이러스 Gc 항원에 특이적으로 결합하는 항체 - 서열번호 9의 경쇄 CDR1; 서열번호 19의 경쇄 CDR2; 및 서열번호 29의 경쇄 CDR3를 포함하는 경쇄 가변영역과,
서열번호 39의 중쇄 CDR1; 서열번호 49의 중쇄 CDR2; 및 서열번호 59의 중쇄 CDR3를 포함하는 경쇄 가변영역을 포함하는 중증열성혈소판감소증후군 바이러스 Gc 항원에 특이적으로 결합하는 항체 - 서열번호 10의 경쇄 CDR1; 서열번호 20의 경쇄 CDR2; 및 서열번호 30의 경쇄 CDR3를 포함하는 경쇄 가변영역과,
서열번호 40의 중쇄 CDR1; 서열번호 50의 중쇄 CDR2; 및 서열번호 60의 중쇄 CDR3를 포함하는 경쇄 가변영역을 포함하는 중증열성혈소판감소증후군 바이러스 Gc 항원에 특이적으로 결합하는 항체 - 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항의 중증열성혈소판감소증후군 바이러스 Gc 항원에 특이적으로 결합하는 항체를 포함하는 중증열성혈소판감소증후군 바이러스 검출용 조성물
- 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항의 중증열성혈소판감소증후군 바이러스 Gc 항원에 특이적으로 결합하는 항체를 포함하는 중증열성혈소판감소증후군 바이러스 감염증 진단용 조성물
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|---|---|---|---|
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| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| KR1020210163224A KR20230076376A (ko) | 2021-11-24 | 2021-11-24 | 중증열성혈소판감소증후군 바이러스 Gc 항원에 특이적으로 결합하는 항체 및 이의 용도 |
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| Publication Number | Publication Date |
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| KR20230076376A true KR20230076376A (ko) | 2023-05-31 |
Family
ID=86543605
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| KR1020210163224A KR20230076376A (ko) | 2021-11-24 | 2021-11-24 | 중증열성혈소판감소증후군 바이러스 Gc 항원에 특이적으로 결합하는 항체 및 이의 용도 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| KR (1) | KR20230076376A (ko) |
Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR101785290B1 (ko) | 2014-11-05 | 2017-10-18 | 대한민국 | 중증 열성 혈소판 감소 증후군 바이러스 감염 진단용 단클론항체, 이를 생산하는 하이브리도마 및 이 단클론항체를 사용하는 중증 열성 혈소판 감소 증후군 바이러스 감염 진단방법 |
| KR102039189B1 (ko) | 2016-03-23 | 2019-11-01 | 서울대학교산학협력단 | 중증열성혈소판감소증후군 바이러스의 외막 당단백질에 결합하는 항체 및 이의 용도 |
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2021
- 2021-11-24 KR KR1020210163224A patent/KR20230076376A/ko unknown
Patent Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR101785290B1 (ko) | 2014-11-05 | 2017-10-18 | 대한민국 | 중증 열성 혈소판 감소 증후군 바이러스 감염 진단용 단클론항체, 이를 생산하는 하이브리도마 및 이 단클론항체를 사용하는 중증 열성 혈소판 감소 증후군 바이러스 감염 진단방법 |
| KR102039189B1 (ko) | 2016-03-23 | 2019-11-01 | 서울대학교산학협력단 | 중증열성혈소판감소증후군 바이러스의 외막 당단백질에 결합하는 항체 및 이의 용도 |
| KR102201391B1 (ko) | 2016-03-23 | 2021-01-11 | 서울대학교산학협력단 | 중증열성혈소판감소증후군 바이러스의 외막 당단백질에 결합하는 항체 및 이의 용도 |
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