KR20160119196A - IgA 다중-특이적 결합 분자 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 IgA 다중-특이적 결합 분자에 관한 것이다. 특히, 본 발명은 이중특이적을 비롯한 다중-특이적의, IgA 중쇄 서열을 포함하는 결합 분자, 그리고 이의 제조 방법 및 용도에 관한 것이다.

Description

IgA 다중-특이적 결합 분자{IgA MULTI-SPECIFIC BINDING MOLECULES}
관련 출원에 대한 교차 참조
본 출원은 2014년 2월 10일 자 출원의 미국 가출원 번호 제61/937,984호를 우선권으로 주장하고, 이의 내용은 본원에 그 전체가 참조로 편입된다.
서열목록
본 출원은 ASCII 형식으로 전자제출되고 그 전체가 본원에 참조로 편입되는 서열목록을 포함한다. 2015년 2월 10일에 생성된 상기 ASCII 사본은 IGM-0003PCT_SL.txt로 명명되며 크기가 73,879 바이트이다.
발명의 분야
본 발명은 IgA 다중-특이적 결합 분자에 관한 것이다. 특히, 본 발명은 이중-특이적을 비롯한 다중-특이적의, IgA 중쇄 서열을 포함하는 결합 분자, 그리고 이의 제조 방법 및 용도에 관한 것이다.
발명의 배경
인간화 항체의 출현 이후, Rituxan®(리툭시맙), Herceptin®(트라스투주맙) 및 Avastin®(베바시주맙)과 같은 항체의 치료적 사용이 종양학, 류마티스 관절염과 같은 염증 장애 및 여러 다른 적응증의 치료를 포함하는 의학 분야를 혁신했다. 미국에서, 30 가지 이상의 인간 항체 또는 인간화 항체가 임상 사용에 승인되었고, 600 가지 이상의 새로운 항체 또는 항체-유사 분자가 다양한 개발 단계에 있다. 일부 항체는 그 작용이 질환의 병리학적 과정의 일부인 혈관 내피 성장 인자(VEGF) 또는 종양 괴사 인자(TNF)와 같은 가용성 표적 분자에 대한 길항 기능을 가진다. 그 대신에, 항체는 암과 같은 특정 질환에서 병적세포에 결합하고, 이를 차단하고 및/또는 이의 파괴를 유도할 수 있다. 이들 치료용 항체의 주요 기능은 Fab 영역을 통한 결합 및 Fc 도메인(이는 또한 항체의 긴 순환 반감기를 매개함)을 통한 이펙터 기능의 보강이다. 소분자 약물과 비교하여 항체의 주요 장점 정 하나는, 이들의 정교한 특이성일 수 있다. 항체는 선택된 단백질 항원, 가령 종양유전자 산물을 매우 정확하게 표적화하여, 매우 유사한 동족체를 배제하면서, 양성의 안전성 프로파일을 가능하게 할 수 있다. 따라서, 항체는 특이성 단일 표적화 기능에 대하여 잘 특징화되어 있다.
기술분야가 진보함에 따라, 항체 기능은 창조적인 단백질 엔지니어링 수단, 가령 더 큰 친화성, 더 긴 반감기, 및/또는 더 우수한 조직 분포를 제공함, 또한 독성 페이로드 전달(예컨대 항체-약물 접합체)을 통한 세포 파괴에 주안점이 증가된 소형 및 대형 분자 기술의 조합을 통하여 향상되었다. 항체 기능 개선에 대한 다른 접근법은 하나의 IgG 분자가 둘의 항원에 결합하도록 하는 면역글로불린 G(IgG) 구조의 2가 결합을 이용한다. 실제로, 특정 적용에서, 비대칭 항체가 둘의 상이한 표적 항원에 동시에 결합함에 의하여 유용한 기능을 발휘할, 우수한 잠재력이 존재한다. 이러한 필요성을 해결하기 위하여, 둘의 상이한 항원에 결합할 수 있어, 자연에서 결코 나타나지 않았던 기능을 가능하게 하는 단일 분자를 산출하기 위하여 다양한 작제물이 제조되어 왔다. 이러한 이중-특이적 접근법의 예는 T- 및 B-세포에서 CD3 및 CD19 수용체에 각각 결합하는 "블리나투무맙"(MT103)이다. 암성 B-세포에 대한 세포독성 T 세포의 이러한 테더링은 B-세포 백혈병의 효과적인 치료를 가능하게 한다.
그러나, 이중특이적 항체의 작제, 발현 및 제조에는 상당한 기술적 어려움이 남아 있다. 비록 이중특이적 항체가 둘의 상이한 항원에 동시에 결합하는 능력으로 인하여 유망한 치료제로 간주되기는 하지만, 이들의 유용성은 안정성 및 제조 복잡성의 문제로 인하여 제한된다.
다양한 형태의 단백질 엔지니어링이 적절한 이중-특이적 IgG를 효율적으로 산출하기 위한 중쇄 및 경쇄의 쌍별 매칭과 더불어 이종 중쇄를 매칭시키기 위하여 사용되었다. 이밖에도, 쿼드로마(quadroma), 화학적 이종접합체, 선택된 이종이량체화 도메인을 사용하는 재조합 작제물 및 둘의 최소 항원-결합 부위로 이루어진 최소 크기의 재조합 작제물을 포함하는 다양한 이중특이적 항체 포맷이 사용되었다.
그러나, 이러한 모든 노력들이 어려움을 수반했다.
따라서, 이중특이적 치료용 항체의 개발을 지향하는 노력에도 불구하고, 이중- 및 다중특이적 항체의 더욱 효율적이고 유연한 제조를 유도하여, 그러한 치료법의 발견과 임상적 도입 간의 타임라인을 단축시키고 다중 특이성 및/또는 결합가를 가지는 새로운 유형의 항체 포맷의 설계 및 제조를 가능하게 할 수 있는 더욱 효율적인 플랫폼 개발의 필요성이 크다.
이는 박테리아 및 바이러스 감염을 비롯한 감염에 대한 신체의 최초 특이적 면역 방어에서의 IgA의 관련성, 그리고 점막면역체계의 체액성 부분에 대한 이합체형 IgA 항체의 기여의 관점에서, 특히 IgA 항체에 대하여 그러하다. 그러므로 이중- 및 다중-특이적 IgA 항체가 호흡기 바이러스 감염, 위장관의 다양한 박테리아 감염의 치료, 및 암의 면역요법에서 큰 잠재성을 가진다. 따라서, 호흡기 세포융합 바이러스(respiratory syncytial virus, RSV) 항원에 대한 이중특이적 IgA 항체가 폐의 RSV 감염에서 유용성을 발견하고, 인플루엔자 바이러스 항원에 대한 이중특이적 IgA 항체가 독감의 치료에 효과적이며, 클로스트리듐 디피실레(씨. 디피실레) 독소 A 및 B에 대한 이중특이적 IgA 항체가 병원 환자의 감염성 설사 대부분의 원인이 되는 씨. 디피실레 감염 치료에 유용하다.
발명의 요약
한 양태에서, 본 발명은 둘의 결합 유닛 및 최소 둘의 결합 특이성을 포함하는 다중-특이적 결합 분자에 관한 것이고, 여기서 결합 유닛 각각은 결합 표적으로의 결합 영역에 접합된 둘의 IgA 중쇄 불변 영역 서열을 포함한다.
한 구체예에서, 다중-특이적 결합 분자는 이중특이적이다. 특정한 한 구체예에서, 이중특이적 결합 분자에서 결합 유닛 각각은 단일특이적이고 (AA, BB), 각각 상이한 결합 표적(각각 A 및 B)에 결합한다. 또 다른 구체예에서, 이중특이적 결합 분자에서 둘의 결합 유닛 중 하나는 단일특이적이고 (AA) 다른 결합 유닛은 이중특이적이며, 여기서 이중특이적 결합 유닛의 결합 특이성 중 하나가 단일특이적 결합 유닛의 결합 특이성과 동일하다 (AB). 또 다른 구체예에서, 이중특이적 결합 분자에서 결합 유닛 각각은 이중특이적이고, 각각 동일한 둘의 결합 특이성을 가진다 (AB, AB). 또 다른 구체예에서, 이중특이적 결합 분자에서, 결합 유닛 각각은 이중특이적이고, 결합 분자는 셋의 결합 특이성을 가진다 (AB, AC). 또 다른 구체예에서, 이중특이적 결합 분자에서, 결합 유닛 각각은 이중특이적이고, 결합 분자는 넷의 결합 특이성을 가진다 (AB, CD).
특정한 한 구체예에서, 다중-특이적 결합 분자는 IgA 항체이고, 여기서 결합 영역 서열은 IgA 중쇄 가변 영역 서열을 포함한다.
또 다른 구체예에서, IgA 항체는, 각각 IgA 중쇄 가변 영역 서열에 융합된 IgA 중쇄 불변 영역 서열을 포함하고, 임의로 IgA J 영역을 추가로 포함하는 둘의 IgA 결합 유닛을 포함한다.
또 다른 구체예에서, IgA 중쇄 불변 영역 서열은 최소 하나의 CA3 도메인을 포함한다.
또 다른 구체예에서, 다중-특이적 결합 분자, 예컨대 이중특이적 IgA 항체는, 둘의 결합 유닛 중 최소 하나에서, 바람직하게는 둘의 결합 유닛 각각에서 IgA 중쇄 가변 영역 서열과 연합된 최소 하나의 IgA 경쇄 가변 영역 서열을 추가로 포함한다.
한 구체예에서, 둘의 결합 유닛 중 최소 하나가 이중특이적일 경우, 예컨대 놉-인투-홀 커플링(knobs-into-holes coupling) 및/또는 염 다리 커플링(salt bridges coupling)에 의하여, 가령 표 1 및 2에 제시되는 한 가지 이상의 변형에 의하여, 비대칭 계면이 둘의 상이한 IgA 중쇄 불변 영역 사이에 생성된다.
또 다른 구체예에서, 최소 하나의 경쇄 가변 영역을 포함하는 다중-특이적 (예컨대 이중특이적) IgA 항체에서, 경쇄 가변 영역 서열은 이의 매칭 중쇄 가변 영역에, 예컨대 크로스맵(CrossMab) 기술, 놉-인투-홀 커플링 및 염 다리 커플링 중 하나 이상을 이용하여 경쇄 및 중쇄 사이에 비대칭 계면을 생성하여 커플링된다.
본 발명의 모든 구체예에서, 다중-특이적 결합 분자는 독소 및/또는 화학요법제에 접합될 수 있고, 여기서 접합은 융합 및/또는 화학적 링커에 의한 것일 수 있다.
본 발명의 모든 구체예에서, 다중-특이적 IgA 항체는 키메라 또는 인간화 또는 인간 항체일 수 있다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 최소 약 70%의 본 발명의 다중-특이적 결합 분자를 포함하는 조성물에 관한 것이다.
또 다른 특정한 구체예에서, 본 발명은 결합 유닛 각각이 단일특이적이고 (AA, BB), 각각 상이한 결합 표적(각각 A 및 B)에 결합하는 이합체형 이중특이적 IgA 결합 분자에 관한 것이다. 또 다른 구체예에서, 둘의 결합 유닛 중 하나는 단일특이적이고 (AA) 다른 결합 유닛은 이중특이적이며, 여기서 이중특이적 결합 유닛의 결합 특이성 중 하나가 단일특이적 결합 유닛의 결합 특이성과 동일하다 (AB). 또 다른 구체예에서, 결합 유닛 각각은 이중특이적이고, 각각 동일한 둘의 결합 특이성을 가진다 (AB, AB). 또 다른 구체예에서, 결합 유닛 각각은 이중특이적이고, 결합 분자는 셋의 결합 특이성을 가진다 (AB, AC). 또 다른 구체예에서, 결합 유닛 각각은 이중특이적이고, 결합 분자는 넷의 결합 특이성을 가진다 (AB, CD). 모든 구체예에서, 결합 분자는 바람직하게는 이합체형 이중특이적 IgA (IgA1 또는 IgA2) 항체이고, 이는 바람직하게는 경쇄를 포함하고, 바람직하게는 J쇄를 포함한다.
특정한 한 구체예에서, 다중-특이적 결합 분자는 말단-대-말단 배열(end-to-end configuration)의 둘의 IgA 결합 유닛을 포함하고, 이들 각각은 IgA 중쇄 가변 영역 서열에 융합된 IgA 중쇄 불변 영역 서열을 포함하고, 임의로 IgA J 영역, 예컨대 SEQ ID NO: 3의 서열을 포함하는 J 영역을 추가로 포함한다.
모든 구체예에서, IgA 중쇄 불변 영역 서열은 바람직하게는 최소 하나의 CA3 도메인을 포함한다.
모든 구체예에서, 본원의 다중-특이적 결합 분자는 둘의 결합 유닛 중 최소 하나에서 IgA 중쇄 가변 영역 서열과 연합된 최소 하나의 IgA 경쇄 가변 영역 서열을 추가로 포함한다.
또 다른 구체예에서, 결합 유닛 중 최소 하나가 이중특이적이고, 여기서 비대칭 계면이 둘의 상이한 IgA 중쇄 불변 영역 사이에 생성된다. 모든 구체예에서, 비대칭 계면은 놉-인투-홀 커플링 및/또는 염 다리 커플링에 의하여, 가령 표 1 및 2에 제시된 한 가지 이상의 변형을 이용하여 생성될 수 있다.
모든 구체예에서, 다중-특이적 결합 분자에서 경쇄 가변 영역 서열은, 존재할 경우, 이의 매칭 중쇄 가변 영역에 경쇄 및 중쇄 사이의 비대칭 계면 생성에 의하여 커플링될 수 있다. 모든 구체예에서, 비대칭 계면은 크로스맵 기술, 놉-인투-홀 커플링 및/또는 염 다리 커플링에 의해 생성될 수 있다.
다양한 추가의 구체예에서, 다중-특이적 결합 분자는 독소 또는 화학요법제에 접합될 수 있고, 여기서 접합은, 예를 들어, 공유 결합에 의하여, 예컨대 융합에 의하여 또는 화학적 링커에 의하여 달성될 수 있다.
모든 구체예에서, 본 발명의 다중-특이적, 예컨대 이중특이적 IgA 항체는 키메라 또는 인간화 항체일 수 있다.
또 다른 구체예에서, 본 발명은 호흡기 세포융합 바이러스(RSV)의 여러 상이한 항원에 특이적으로 결합하는 다중-특이적 이합체형 IgA 항체에 관한 것이다. 항체는 바람직하게는 이중특이적이고, RSV F에 대한 둘의 결합 모이어티 및 RSV G에 대한 둘의 결합 모이어티를 포함한다. 특정한 한 구체예에서, RSV G에 대한 결합 모이어티는 SEQ ID NO: 10의 중쇄 가변 영역 서열 및 SEQ ID NO: 11의 경쇄 가변 영역을 포함한다. 또 다른 특정한 구체예에서, RSV F에 대한 결합 모이어티는 SEQ ID NO: 12의 중쇄 가변 영역 서열 및 SEQ ID NO: 13의 경쇄 가변 영역 서열을 포함한다.
또 다른 구체예에서, 본 발명은 여러 상이한 인플루엔자 A 바이러스 항원에 특이적으로 결합하는 다중-특이적 이합체형 IgA 항체에 관한 것이다. 항체는 바람직하게는 각각의 인플루엔자 A 바이러스 항원에 대한 둘의 결합 모이어티를 포함하는 이중특이적이다. 특정한 한 구체예에서, 제1 인플루엔자 A 바이러스 항원에 대한 결합 모이어티는 SEQ ID NO: 14의 중쇄 가변 영역 서열 및 SEQ ID NO: 15의 경쇄 가변 영역 서열을 포함한다. 또 다른 특정한 구체예에서, 제2 인플루엔자 A 바이러스 항원에 대한 결합 모이어티는 SEQ ID NO: 16의 제1 가변 영역 서열을 포함한다. 또 다른 특정한 구체예에서, 제2 인플루엔자 A 바이러스 항원에 대한 결합 모이어티는 SEQ ID NO: 17의 제2 가변 영역 서열을 포함한다.
또 다른 구체예에서, 본 발명은 클로스트리듐 디피실레 (씨. 디피실레)의 여러 상이한 항원에 특이적으로 결합하는 다중-특이적 이합체형 IgA 항체에 관한 것이다. 항체는 바람직하게는 이중특이적이다. 바람직한 한 구체예에서, 항체는 씨. 디피실레의 독소 A에 대한 둘의 결합 모이어티 및 독소 B에 대한 둘의 결합 모이어티를 포함한다. 특정한 한 구체예에서, 독소 A에 대한 결합 모이어티는 SEQ ID NO: 18의 중쇄 가변 영역 서열을 포함한다. 또 다른 특정한 구체예에서, 독소 A에 대한 결합 모이어티는 SEQ ID NO: 19의 경쇄 가변 영역 서열을 포함한다. 또 다른 특정한 구체예에서, 독소 B에 대한 결합 모이어티는 SEQ ID NO: 20의 제1 가변 영역 서열을 포함한다. 또 다른 특정한 구체예에서, 독소 B에 대한 결합 모이어티는 SEQ ID NO: 21의 제2 가변 영역 서열을 포함한다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 최소 약 70%의 본원의 임의의 다중-특이적 IgA 결합 분자를 포함하는 조성물에 관한 것이다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 유효량의 본원의 임의의 다중-특이적 IgA 결합 분자를 포함하는 약제학적 조성물에 관한 것이다. 다양한 구체예에서, 약제학적 조성물은 예를 들어, 씨. 디피실레 감염, 호흡기 바이러스 감염, 예컨대 인플루엔자 바이러스 감염 또는 호흡기 세포융합 바이러스 (RSV) 감염과 같은, 박테리아, 바이러스 및 진균 감염을 포함하는 미생물 감염의 치료를 위한 것일 수 있다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 박테리아, 바이러스 및 진균 감염을 포함하여, 구체적으로 상기 및 명세서 전반에 나열된 임의의 그리고 모든 감염을 포함하여 미생물 감염을 치료하기 위한, 치료 방법 및 약제학적 조성물의 제조를 위한 용도에 관한 것이다.
도 1은 IgA, 이합체형 IgA, 및 분비형 IgA(sIgA)의 개략적 구조를 나타낸다.
도 2A, 2B 및 2C는 IgG1 및 IgA1 및 IgA2 중쇄 불변 영역의 배열을 나타낸다. 인간 IgG1 중쇄 불변 영역 서열은 J00228 (Takahashi et al., Cell 29:671-679 (1982); SEQ ID NO: 22)로부터 얻고; 인간 IgA1 중쇄 불변 영역 서열 (UniProt P01876-IGHA1-HUMAN; SEQ ID NO: 1) 및 넘버링은 PDB 2QEJ (Ramsland et al., Proc Natl Acad Sci USA 104:15051-15056 (2007)) 및 IgA BUR (Putnam et al., J Biol Chem 254:2865-2874 (1979))로부터 얻으며; 인간 IgA2 중쇄 불변 영역 서열 넘버링은 UniProt P01877-IGHA2_HUMAN (SEQ ID NO: 2)에 상응한다.
도 2A는 중쇄 불변 영역 서열의 일부로서 인간 IgG1, IgA1 및 IgA2 Fc CG1/CA1 중쇄 불변 도메인의 배열을 나타낸다.
도 2B는 중쇄 불변 영역 서열의 일부로서 인간 IgG1, IgA1 및 IgA2 Fc CG2/CA2 중쇄 불변 도메인의 배열을 나타낸다.
도 2C는 중쇄 불변 영역 서열의 일부로서 인간 IgG1, IgA1 및 IgA2 Fc CG3/CA3 중쇄 불변 도메인의 배열을 나타낸다.
표 1은 놉-홀 및 전하 도입 위치에서 IgA CA3 도메인 계면 잔기를 나타낸다. 세트 #1, 놉, CA3 #1 돌연변이를 가지는 인간 IgA2의 서열이 SEQ ID NO: 4로 나타나고; 세트 #1, 홀, CA3 #2 돌연변이를 가지는 인간 IgA2의 서열이 SEQ ID NO: 5로 나타난다.
표2는 잠재적인 전하 스와프를 위한 IgA CA3 도메인 계면 잔기를 나타낸다.
표 3은 본원에서 참조되는 폴리펩타이드 서열을 나타낸다.
발명의 상세한 설명
I. 정의
본 발명을 더욱 상세히 설명하기 전에, 본 발명이 설명된 특정한 구체예에 제한되지 않으며, 그 자체로 물론 달라질 수 있음을 이해해야 한다. 본원에 사용된 용어는, 본 발명의 범위가 첨부된 청구범위에 의해서만 제한될 것이므로, 단지 특정한 구체예를 설명할 목적을 위한 것이며 한정하는 것으로 의도되지 않음을 또한 이해해야 한다.
값의 범위가 제공되는 경우, 문맥이 명백하게 달리 언급하지 않는 한 하한의 단위의 십분의 일까지, 상기 범위의 상한 및 하한 사이의 각각의 사이에 있는 값 및 상기 명시된 범위에서 임의의 다른 명시되거나 사이에 있는 값이 본 발명에 포함됨이 이해된다. 이러한 더 작은 범위의 상한 및 하한은, 명시된 범위에서 임의의 구체적으로 제외된 한계가 있는 본 발명 내에 포함되는 더 작은 범위에 독립적으로 포함될 수 있다.
달리 정의되지 않는 한, 본원에 사용된 기술 및 과학 용어는 본 발명이 속하는 분야에서 통상의 지식을 가진 자가 통상적으로 이해하는 것과 동일한 의미를 가진다. Singleton et al., Dictionary of Microbiology and Molecular Biology 2nd ed., J. Wiley & Sons (New York, NY 1994)이 당해 분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 본원에서 사용된 용어 중 다수에 대한 일반적 지침을 제공한다.
본원에 언급된 모든 간행물은 상기 간행물이 인용한 것과 관련된 방법 및/또는 물질을 개시하고 설명하기 위하여 본원에 참조로 명백하게 편입된다.
용어 "항원"은 항체에 결합하거나 세포 면역 반응을 촉발시킬 수 있는 엔터티 또는 이의 단편을 지칭한다. 면역원은 생물, 특히 동물, 더욱 구체적으로 인간을 포함하는 포유류에서 면역 반응을 이끌어낼 수 있는 항원을 지칭한다. 용어 항원은 항원결정인자 또는 에피토프로 알려진 영역을 포함한다.
본원에서 사용된 용어 "면역원(immunogenic)"은 항체의 생성을 이끌어내고, 및/또는 면역원의 항원에 지향된 T-세포 및/또는 다른 반응성 면역 세포를 활성화시키는 물질을 지칭한다.
면역 반응은 치료될 장애를 완화시키거나 경감시키기 위하여 투여된 본 발명의 면역원 조성물에 반응하여 개체가 충분한 항체, T-세포 및 다른 반응성 면역 세포를 생성할 경우 일어난다.
본원에 사용된 용어 면역원성(immunogenicity)은 수용자에게 투여 시 면역 반응(체액성 또는 세포성)을 이끌어내는 항원의 능력 측정치를 지칭한다. 본 발명은 대상 인간 키메라 또는 인간화 항체의 면역원성을 감소시키는 접근법에 관한 것이다.
용어 "항체"는 (면역글로불린 Fc 영역를 가지는 전장 항체를 포함하는) 단일클론 항체, 단일-쇄 분자, 및 항체 단편(예컨대, Fab, F(ab')2, 및 Fv)을 포함한다. 용어 "면역글로불린"(Ig)은 본원에서 "항체"와 상호교환적으로 사용된다. 기본 4-쇄 항체 단위는 둘의 동일한 경(L)쇄 및 둘의 동일한 중(H)쇄로 구성된 이종사합체형 당단백질이다.
IgG의 경우에, 4-쇄 단위는 일반적으로 약 150,000 달톤이다. 각각의 L쇄는 하나의 공유 다이설파이드 결합에 의하여 H쇄에 연결되는 한편, 둘의 H쇄는 H쇄 동형에 따라 하나 이상의 다이설파이드 결합에 의하여 서로 연결된다. 각각의 H쇄 및 L쇄는 또한 규칙적 간격의 사슬내 다이설파이드 다리를 가진다. 각각의 H쇄는 N-말단에서, 가변 도메인(VH)에 이어서 α쇄 및 γ쇄 각각에 대한 셋의 불변 도메인(CH) 및 μ 및 ε 동형에 대한 넷의 CH 도메인을 가진다. 각각의 L쇄는 N-말단에서, 가변 도메인(VL)에 이어서 이의 다른 말단부에 불변 도메인을 가진다. VL은 VH와 정렬되고 CL은 중쇄의 제1 불변 도메인(CH1)과 정렬된다. 특정 아미노산 잔기가 경쇄 및 중쇄 가변 도메인 사이에 계면을 형성하는 것으로 생각된다. VH 및 VL의 페어링(pairing)은 함께 단일 항원-결합 부위를 형성한다.
혈청 IgA는 단량체이지만 또한 중합될 수 있다. IgA는 이의 분비 형태에서, 꼬리조각을 포함할 수 있고 분비 성분에 의하여 연합될 수 있는, J쇄에 의하여 연결된 2-5의 기본 4-쇄 단위를 포함한다. 꼬리조각, 이합체형 IgA 및 분비 성분으로써 연합된 분비형 IgA(sIgA)의 구조가 도 1에 도해된다. IgA 항체는 "IgA"의 정의에 명백하게 포함되는 IgA1 및 IgA2 서브-클래스로 더욱 분류될 수 있다.
임의의 척추동물 족 유래의 L쇄는 불변 도메인의 아미노산 서열을 기준으로, 카파(κ) 및 람다(λ)로 지칭되는 두 가지의 명백히 구분되는 유형 중 하나에 할당될 수 있다.
도 2A-2C는 인간 IgG1 IgA1 및 IgA2 Fc CG1/CA1, CG2/CA2, 및 CG3/CA3 불변 도메인 각각의 배열을 나타낸다. 도면에서, 인간 IgG1 서열은 J00228 (Takahashi N., et al. Cell 29:671-679 (1982))로부터 얻고, IgG 서열은 PDB 1OQO의 PDB 1OQO 베타 스트랜드(s) 및 알파-헬릭스(h) 할당에 따라 넘버링된다. 인간 IgA 서열 및 넘버링은 PDB 2QEJ (Ramsland P.A., et al., Proc Natl Acad Sci USA 104:15051-15056 (2007) 및 IgA BUR (Putnam W.F., et al. J. Biol. Chem. 254:2865-2874 (1979))로부터 얻는다. 인간 IgG1 불변 영역 서열은 SEQ ID NO: 19에 할당되고; IgA1 불변 영역 서열은 SEQ ID NO: 1로 나타나고 인간 IgA2 불변 영역 서열은 SEQ ID NO: 2로 나타난다. 본 개시 전반에 걸쳐, 아미노산 위치는 이들 배열에 따라 넘버링된다.
여러 상이한 클래스의 항체의 구조 및 특성에 대한 추가의 세부사항에 대해서는, 예컨대, Basic and Clinical Immunology, 8th Edition, Daniel P. Stites, Abba I. Terr and Tristram G. Parslow (eds), Appleton & Lange, Norwalk, Conn., 1994, page 71 and Chapter 6을 참조하라.
달리 진술되지 않는 한, 용어 "항체"는 구체적으로, 자연적으로 발생하는 변이체를 포함하여, 천연 인간 및 비-인간 IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgE, IgA1, IgA2, IgD 및 IgM 항체를 포함한다.
용어 "IgA" 항체는 이합체 및 다합체 형태를 포함하여, 분비 성분을 가지는 및 가지지 않는, 모든 서브-클래스, 즉 IgA1 및 IgA2 항체를 구체적으로 포함하도록 본원에 사용된다. 두 서브-클래스 중 IgA2가 IgA1보다 더 안정한데, IgA2의 더 짧은 경첩 영역이 이를 특정한 박테리아 단백분해효소에 내성으로 만들기 때문이다. 이러한 더 짧은 경첩은 박테리아 표면 상의 항원에 대한 IgA2의 더 우수한 다가(multivalent) 결합을 용이하게 하는 강성이고 비-평면인 구조를 또한 설명한다. 본 발명의 목적을 위하여, IgA 항체는 IgA1 또는 IgA2일 수 있고, 바람직하게는 둘의 꼬리조각이 바람직하게는 J쇄에 의하여 연결된 이합체이다 (도 1, SEQ ID NO: 3 참조). 본 발명의 IgA 결합 분자에서, J쇄는 전장 천연 J쇄일 수 있지만, J쇄가 기능적으로 유지되는 한, 구체적으로 J쇄 단편을 포함하여, 치환, 삽입, 결실, 절단(truncation)과 같은 아미노산 변형을 또한 포함할 수 있다. 전장 천연 J-쇄의 포함이 본 발명의 목적에 바람직하다.
변형된 J쇄와 관련하여 용어 "기능적"은 J쇄가 천연 J쇄, 예컨대 천연 인간 J쇄의 주요 기능, 특히, IgA의 효율적인 중합(이합체화) 및 분비 성분(SC)/중합체형(p)IgR에 대한 그러한 중합체(이합체)의 결합을 가능하게 하는 능력을 보유함을 의미한다.
본원에 사용된 용어 "단일클론 항체"는 실질적으로 균질한 항체의 군집으로부터 획득된 항체, 즉, 소량으로 존재할 수 있는 자연적으로 발생한 가능한 돌연변이를 제외하고 동일한 군집을 포함하는 개별적인 항체를 지칭한다. 단일클론 항체는 고도로 특이성이고, 단일 항원 부위에 대하여 지향된다. 더욱이, 전형적으로 상이한 결정인자(에피토프)에 대하여 지향되는 상이한 항체를 포함하는 종래의 (다중클론) 항체 제제와 대조적으로, 각각의 단일클론 항체가 항원 상의 단일 결정인자에 대하여 지향된다. 수식어 "단일클론"은 실질적으로 균질한 항체의 군집으로부터 수득된 것과 같은 항체의 특징을 지시하고, 임의의 특정 방법에 의하여 항체의 제조를 요구하는 것으로 해석되어서는 안된다. 예를 들어, 본 발명에 따라 사용될 단일클론 항체는 Kohler et al. (1975) Nature 256:495에 최초로 기재된 하이브리도마 방법에 의하여 제조될 수 있거나, 재조합 DNA 방법에 의하여 제조될 수 있다 (예컨대, 미국 특허 제4,816,567호 참조). "단일클론 항체"는 또한, 예를 들어 Clackson et al. (1991) Nature 352:624-628 및 Marks et al. (1991) J. Mol. Biol. 222:581-597에 기재된 기술을 이용하여 파지 항체 라이브러리로부터 단리될 수 있다.
본원의 단일클론 항체는 구체적으로 "키메라" 항체(면역글로불린)를 포함하고, 여기서 이들이 원하는 생물학적 활성을 나타내는 한, 중쇄 및/또는 경쇄의 일부가 특정 종으로부터 유래하거나 특정한 항체 클래스 또는 서브클래스에 속하는 항체 중의 상응하는 서열과 동일하거나 상동성인 한편, 쇄(들)의 나머지는 또 다른 종으로부터 유도되거나 또 다른 항체 클래스 또는 서브클래스에 속하는 항체, 그리고 그러한 항체의 단편 중의 상응하는 서열과 동일하거나 상동성이다 (미국 특허 제4,816,567호; 및 Morrison et al. (1984) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:6851-6855).
비-인간(예컨대, 쥐) 항체의 "인간화" 형태는 비-인간 면역글로불린으로부터 유래한 최소 서열을 포함하는 항체이다. 대부분에 대해, 인간화 항체는 인간 면역글로불린(수여자 항체)이고 여기서 수여자의 초가변 영역 유래의 잔기는 원하는 특이성, 친화성, 및 능력을 가지는, 마우스, 래트, 토끼 또는 비인간 영장류와 같은 비-인간 종 (공여자 항체)의 초가변 영역 유래의 잔기로 대체된다. 일부 예에서, 인간 면역글로불린의 Fv 골격 영역(FR) 잔기가 또한 상응하는 비-인간 잔기에 의하여 대체된다. 더욱이, 인간화 항체는 수여자 항체 또는 공여자 항체에서 발견되지 않는 잔기를 포함할 수 있다. 이들 변형은 항체 성능을 더욱 개선하기 위하여 이루어진다. 일반적으로, 인간화 항체는 실질적으로 모든 최소 하나, 전형적으로 둘의 가변 도메인을 포함할 것이고, 여기서 모든 또는 실질적으로 모든 초가변 루프가 비-인간 면역글로불린의 루프에 상응하고 모든 또는 실질적으로 모든 FR 영역이 인간 면역글로불린 서열의 영역이다. 인간화 항체는 임의로 또한 면역글로불린 불변 영역(Fc)의 적어도 일부, 전형적으로 인간 면역글로불린의 적어도 일부를 포함할 것이다. 추가의 세부사항에 대해서는, Jones et al. (1986) Nature 321:522-525; Riechmann et al. (1988) Nature 332:323-329; 및 Presta (1992) Curr. Op. Struct. Biol. 2:593-596을 참조하라.
"종-의존성 항체"는 제1 포유류 종 유래 항원에 대하여 제2 포유류 종 유래 항원의 동족체에 대한 것보다 더 강한 결합 친화성을 가지는 항체이다. 보통, 종-의존성 항체는 인간 항원에 "특이적으로 결합"하지만 (즉 약 1 x 10-7 M 이하, 바람직하게는 약 1 x 10-8 M 이하 및 가장 바람직하게는 약 1 x 10-9 M 이하의 결합 친화성(Kd) 값을 가짐) 인간 항원에 대한 결합 친화성보다 최소 약 50 배, 또는 최소 약 500 배, 또는 최소 약 1000 배 더 약한 제2 비인간 포유류 종 유래 항원의 동족체에 대한 결합 친화성을 가진다. 종-의존성 항체는 위에 정의된 임의의 다양한 유형의 항체일 수 있지만, 바람직하게는 인간화 또는 인간 항체이다.
본원에 사용된, "항체 돌연변이체" 또는 "항체 변이체"는 기준 항체의 아미노산 잔기 중 하나 이상이 변형된 기준 항체의 아미노산 서열 변이체를 지칭한다. 기준 항체는, 예를 들어, 천연 항체 및 또한 천연 항체의 공지 변이체일 수 있다. 그러한 돌연변이체는 필연적으로 기준 항체와 100% 미만의 서열 동일성 또는 유사성을 가진다. 바람직한 한 구체예에서, 항체 돌연변이체는 기준 항체의 중쇄 또는 경쇄 가변 도메인의 아미노산 서열과 최소 75%, 더욱 바람직하게는 최소 80%, 더욱 바람직하게는 최소 85%, 더욱 바람직하게는 최소 90%, 가장 바람직하게는 최소 95% 아미노산 서열 동일성 또는 유사성을 가지는 아미노산 서열을 가질 것이다. 이 서열에 대한 동일성 또는 유사성은, 최대의 서열 동일성 퍼센트를 달성하기 위하여 서열을 정렬하고, 필요하다면, 갭을 도입한 후 기준 항체 잔기와 동일하거나 (즉 동일한 잔기) 유사한 (즉 통상적인 측쇄 특성에 기초하여 동일한 그룹의 아미노산 잔기) 후보 서열 중의 아미노산 잔기의 백분율로서 본원에 정의된다. N-말단, C-말단, 또는 내부 연장, 결실, 또는 가변 도메인의 항체 서열 외부로의 삽입 중 어느 것도 서열 동일성 또는 유사성에 영향을 미치는 것으로 해석되지 않아야 한다.
본원의 "단리된" 항체는 재조합 숙주 세포에서 천연 환경의 성분으로부터 동정되고 분리 및/또는 회수된 항체이다. 이의 천연 환경의 오염 성분은 항체에 대한 진단적 또는 치료적 사용에 간접하지 않을 물질이고, 효소, 호르몬, 및 다른 단백질성 또는 비단백질성 용질, 그리고 원하지 않는 제조 부산물을 포함할 수 있다. 따라서, 이중- 또는 다중-특이적 IgA 항체의 경우에 원하지 않는 부산물은 단일특이적 결합 유닛 (AB 결합 유닛을 포함하는 이중특이적 항체의 경우에 AA 및/또는 BB), 및 원하는 수의 서브유닛을 포함하지 않는 다합체를 포함한다. 바람직한 구체예에서, 이중- 또는 다중-특이적 항체는 (1) SDS-PAGE 또는 SEC-HPLC 방법으로 결정하여 95중량% 초과, 또는 98중량% 초과, 또는 99중량% 초과까지, (2) 아미노산 서열분석기를 사용하여 N-말단 또는 내부 아미노산 서열의 최소 15 잔기를 획득하기에 충분한 정도까지, 또는 (3) 쿠마시 블루 또는, 바람직하게는, 은 염색을 이용하여 환원 또는 비환원 조건하의 SDS-PAGE에 의한 균질성까지 정제될 것이다. 통상적으로, 단리된 이중특이적 결합 분자, 예컨대 항체는, 최소 하나의 정제 단계에 의하여 제조될 것이다.
용어 "특이적 결합" 또는 "특이적으로 결합하는" 또는 "에 대해 특이적인"은 특정 폴리펩타이드, 펩타이드, 또는 다른 표적(예컨대 당단백질 표적) 상의 표적 분자 (항원), 예컨대, 에피토프에 대한 항체의 결합을 지칭하고, 비특이적 상호작용(예컨대, 비특이적 상호작용은 소 혈청 알부민 또는 카제인에 대한 결합일 수 있음)과는 측정 가능하게 상이한 결합을 의미한다. 특이적 결합은, 예를 들어, 대조 분자에 대한 항체의 결합과 비교하여 표적 분자에 대한 항체의 결합을 결정하여 측정될 수 있다. 예를 들어, 특이적 결합은 표적, 예를 들어, 과잉의 비표지된 표적과 유사한 대조 분자와의 경쟁에 의하여 결정될 수 있다. 이 경우에, 특이적 결합은 프로브에 대한 표지된 표적의 결합이 과잉의 비표지된 표적에 의하여 경쟁적으로 억제되는 경우 나타난다. 특정 폴리펩타이드 표적 상의 특정한 폴리펩타이드 또는 에피토프에 대하여 본원에서 사용된 용어 "특이적 결합" 또는 "특이적으로 결합하는" 또는 "에 대하여 특이적인"은, 예를 들어, 최소 약 200 nM, 대안으로 최소 약 150 nM, 대안으로 최소 약 100 nM, 대안으로 최소 약 60 nM, 대안으로 최소 약 50 nM, 대안으로 최소 약 40 nM, 대안으로 최소 약 30 nM, 대안으로 최소 약 20 nM, 대안으로 최소 약 10 nM, 대안으로 최소 약 8 nM, 대안으로 최소 약 6 nM, 대안으로 최소 약 4 nM, 대안으로 최소 약 2 nM, 대안으로 최소 약 1 nM, 또는 이를 초과하는 표적에 대한 Kd를 가지는 분자에 의하여 나타날 수 있다. 특정 예에서, 용어 "특이성 결합"은 분자가 임의의 다른 폴리펩타이드 또는 폴리펩타이드 에피토프에 실질적으로 결합하지 않고 특정한 폴리펩타이드 상의 특정한 폴리펩타이드 또는 에피토프에 결합하는 경우의 결합을 지칭한다.
"결합 친화성"은 분자(예컨대, 항체)의 단일 결합 부위 및 이의 결합 파트너(예컨대, 항원) 간의 비공유 상호작용의 총합의 강도를 지칭한다. 달리 지시되지 않는 한, 본원에 사용된 "결합 친화성"은 결합쌍(예컨대, 항체 및 항원)의 구성원 간의 1:1 상호작용을 반영하는 고유 결합 친화성을 지칭한다. 분자 X의 이의 파트너 Y에 대한 친화성은 일반적으로 해리상수(Kd)로 나타낼 수 있다. 예를 들어, Kd는 약 200 nM, 150 nM, 100 nM, 60 nM, 50 nM, 40 nM, 30 nM, 20 nM, 10 nM, 8 nM, 6 nM, 4 nM, 2 nM, 1 nM, 또는 더 강할 수 있다. 친화성은 본원에 기재된 것을 포함하야 당해 분야에 공지인 통상적인 방법에 의하여 측정될 수 있다. 저-친화성 항체는 일반적으로 항원에 천천히 결합하고 쉽게 해리하는 경향이 있는 반면, 고-친화성 항체는 일반적으로 항원에 더 빠르게 결합하고 더 오래 결합된 채로 유지되는 경향이 있다. 결합 친화성을 측정하는 다양한 방법이 당해 분야에 공지이다.
본원에 사용된 "Kd" 또는 "Kd 값"은 항체 및 표적 쌍에 적절한 기법에 의하여, 예를 들어 약 10 반응 단위(response unit, RU)로 고정된 항원 CM5 칩과 함께 25ºC에서 BIAcore™-2000 또는 BIAcore™-3000 (BIAcore, Inc., Piscataway, N.J.)를 사용하는, 예를 들어 표면 플라스몬 공명 검사를 이용하여 측정된 해리 상수를 지칭한다.
용어 "접합체", "접합된" 및 "접합"은 임의의 그리고 모든 형태의 공유 또는 비-공유 결합을 지칭하고, 제한 없이, 직접 유전학적 또는 화학적 융합, 링커 또는 가교제를 통한 커플링, 및 비-공유 연합을 포함하고, 공유 결합이 바람직하다.
용어 "다중-특이적 IgA"는 본원에서 최광의의 의미로 둘 이상의 결합 특이성을 가지는 IgA 항체를 지칭하기 위하여 사용된다. 따라서, 용어 "다중-특이적"은 "이중특이적", 예컨대 이중특이적 항체 또는 이중특이적 결합 유닛을 포함하며, 이는 각각 상이한 항원에 결합하는 (AA, BB) 둘의 단일특이적 서브유닛, 또는 각각 둘의 상이한 항원에 결합하는 (AB, AB) 둘의 이중특이적 서브유닛을 포함하는 IgA 이합체를 포함한다.
용어 "결합 유닛"은 본원에서, 각각 최소 하나의 CA3 도메인을 포함하고, 각각 결합 표적, 예컨대 표적 항원에 대한 결합 영역 (항체 가변 영역)에 접합되는 한 쌍의 IgA 중쇄 불변 영역 폴리펩타이드를 포함하는 분자를 지칭하기 위하여 사용된다. 한 구체예에서, 본 발명의 이합체형 IgA 분자는 둘의 단일특이적 결합 유닛으로 이루어지고, 각각의 결합 유닛은 상이한 결합 표적에 대한 결합 특이성을 가진다 (AA, BB). 또 다른 구체예에서, 본 발명의 이합체형 IgA 분자에서 둘의 결합 유닛 중 최소 하나는 둘의 상이한 결합 특이성을 가진다 (즉 이중특이적, 예컨대 AA, A,B 또는 AA, BC이다). 또 다른 구체예에서, 둘의 결합 유닛 각각은 둘의 특이성을 가지고, 이는 동일할 수 있거나 (AB, AB) 상이할 수 있다 (AC, CD 또는 AB, AC, 예를 들어).
용어 "이중특이적 IgA 항체 결합 유닛"은 본원에서 최광의의 의미로 사용되고 구체적으로 최소 하나의 CA3 불변 도메인을 포함하고, 가변 도메인 서열(VH)에 융합된 한 쌍의 IgA 항체 중쇄 불변 영역 폴리펩타이드를 포괄하며, 각각의 가변 도메인 서열은 연합된 항체 경쇄 가변 도메인(VL) 서열을 포함하거나 포함하지 않으면서 상이한 표적에 결합한다. 한 구체예에서, 이중특이적 IgA 항체는, 각각 한 항원의 상이한 에피토프 또는 둘의 상이한 항원의 에피토프에 결합할 수 있는 둘의 VHVL 항원 결합 영역을 포함한다. 이중특이적 IgA 항체 결합 유닛은 단일 종으로부터의 전장일 수 있거나, 키메라화 또는 인간화될 수 있다.
"전장 IgA 항체 중쇄"는 N-말단에서 C-말단 방향으로 항체 중쇄 가변 도메인(VH), 항체 불변 중쇄 불변 도메인 1(CA1 또는 Cα1), 항체 불변 중쇄 불변 도메인 2(CA2 또는 Cα2), 및 항체 중쇄 불변 도메인 3(CA3 또는 Cα3)으로 이루어진 폴리펩타이드이다. 본 발명에 따른 이중- 또는 다중-특이적 전장 IgA 항체는 둘의 단량체(결합 유닛)를 포함하고, 이들 각각은 분비 성분을 포함하거나 포함하지 않으면서 단일- 또는 이중특이적일 수 있다. 따라서, 본 발명의 다중-특이적 IgA 항체는 결과적인 IgA 항체가 최소 둘의 결합 특이성을 가짐을 전제로 단일특이적 및 이중특이적 결합 유닛을 포함할 수 있다. 전장 항체의 중쇄 또는 경쇄의 C-말단은 중쇄 또는 경쇄의 C-말단의 최종 아미노산을 나타낸다. 전장 항체의 중쇄 또는 경쇄의 N-말단은 아미노산 중쇄 또는 경쇄의 N-말단의 최초 아미노산을 나타낸다.
본원에 사용된 용어 "결합가(valent)"는 항체 내의 특정 수의 결합 부위의 존재를 나타낸다. 이와 같이, 용어 "2가", "4가", 및 "6가"는 각각 둘의 결합 부위, 넷의 결합 부위, 및 여섯의 결합 부위의 존재를 나타낸다. 따라서, 본 발명에 따른 이중특이적 IgA 항체에서 각각의 결합 유닛이 2가일 경우, 이중특이적 IgA 항체는 4 결합가를 가질 것이다.
용어 "에피토프"는 항체에 특이적 결합이 가능한 임의의 분자 결정인자를 포함한다. 특정 구체예에서, 에피토프 결정인자는 분자의 화학적으로 활성인 표면 그룹핑, 가령 아미노산, 당 측쇄, 포스포릴, 또는 설폰일을 포함하고, 특정 구체예에서, 특이적 3차원 구조 특징, 및 또는 특이적 하전 특징을 가질 수 있다. 에피토프는 항체에 의하여 결합된 항원 영역이다. "결합 영역"은 결합 분자에 의하여 결합된 결합 표적 상의 영역이다.
"다중에피토프 특이성"은 동일하거나 상이한 표적(들) 상의 둘 이상의 상이한 에피토프에 특이적으로 결합하는 능력을 지칭한다. "단일특이적"은 하나의 에피토프만 결합하는 능력을 지칭한다. 한 구체예에 따르면 이중특이적 IgM 항체는 최소 10-7M, 또는 10-8 M 또는 더 우수한 친화성으로써 각각의 에피토프에 결합한다.
용어 "표적" 또는 "결합 표적"은 최광의의 의미로 사용되고 구체적으로 폴리펩타이드, 핵산, 탄수화물, 지질, 및 이들이 자연에 존재하는 것과 같은 생물학적 기능을 가지는 다른 분자를 포함한다. "표적"은, 예를 들어, 이중특이적 결합 유닛이 둘의 상이한 세포 유형, 동일한 세포 유형의 상이한 하위군집(예컨대 상이한 B-세포 군집) 또는 단일 세포 상의 둘의 상이한 엔터티를 표적화하는 세포일 수 있다.
본 발명의 항체의 "항원-결합 부위" 또는 "항원-결합 영역"은 전형적으로, 항원에 대한 결합 부위의 친화성에 다양한 정도로 기여하는 여섯의 상보성 결정 영역(complementarity determining region, CDR)을 포함한다. 셋의 중쇄 가변 도메인 CDR(CDRH1, CDRH2 및 CDRH3) 및 셋의 경쇄 가변 도메인 CDR(CDRL1, CDRL2 및 CDRL3)이 있다. CDR 및 골격 영역(framework region, FR)의 정도는 아미노산 서열의 컴파일링된 데이터베이스와 비교하여 결정되고, 여기서 상기 영역은 항체/항원 복합체로부터의 서열 및/또는 구조적 정보 중에서 가변성에 따라 정의되었다. 본 발명의 범위에는 더 적은 CDR(즉, 결합 특이성이 셋, 넷 또는 다섯의 CDR에 의하여 결정되는 경우)로 구성되는 기능성 항원 결합 부위가 또한 포함된다. 6 CDR의 완전한 세트 미만이 일부 결합 표적에 결합하기에 충분할 수 있다. 따라서, 일부 예에서, VH 또는 VL 도메인 단독의 CDR이 충분할 것이다. 더욱이, 특정 항체가 항원에 대한 비-CDR-연합 결합 부위를 가질 수 있다. 그러한 결합 부위는 구체적으로 본 발명의 정의에 포함된다.
본원에 사용된 용어 "계면"은 제2 IgA 중쇄 불변 영역 내의 하나 이상의 "접촉" 아미노산 잔기(또는 다른 비-아미노산 그룹)와 상호작용하는 제1 IgA 중쇄 불변 영역 내의 "접촉" 아미노산 잔기(또는 예를 들어, 탄수화물 그룹과 같은 다른 비-아미노산 그룹)를 포함하는 영역을 지칭하기 위하여 사용된다.
용어 "비대칭 계면"은 두 항체 쇄, 가령 제1 및 제2 IgA 중쇄 불변 영역 사이 및/또는 IgA 중쇄 불변 영역 및 이의 매칭 경쇄 사이에 형성된 (상기 정의된) 계면을 지칭하기 위하여 사용되고, 여기서 제1 및 제2 쇄 중의 접촉 잔기는 상보성 접촉 잔기를 포함하여 설계가 상이하다. 비대칭 계면은 놉/홀 상호작용 및/또는 염 다리 커플링(전하 스와핑) 및/또는 당해 분야에 공지인 다른 기술, 예를 들어, 이의 매칭 경쇄에 대한 α 중쇄 커플링을 위한 크로스맵 접근법에 의하여 생성될 수 있다.
"공동부(cavity)" 또는 "홀"은 제2 폴리펩타이드의 계면으로부터 함몰되어 제1 폴리펩타이드의 인접한 계면 상의 상응하는 돌출부("놉")를 수용하는 최소 하나의 아미노산 측쇄를 지칭한다. 공동부(홀)은 원래 계면에 존재할 수 있거나 합성적으로 (예컨대 계면을 인코딩하는 핵산 변경에 의하여) 도입될 수 있다. 보통, 제2 폴리펩타이드의 계면 인코딩 핵산이 공동부를 인코딩하도록 변경된다. 이를 달성하기 위하여, 제2 폴리펩타이드의 계면에서 최소 하나의 "원래" 아미노산 잔기 인코딩 핵산이 원래 아미노산 잔기보다 더 작은 측쇄 부피를 가지는 최소 하나의 "인입(import)" 아미노산 잔기를 인코딩하는 DNA로 대체된다. 하나 초과의 원래 및 상응하는 이입 잔기가 있을 수 있음이 이해될 것이다. 대체된 원래 잔기의 수에 대한 상한은 제2 폴리펩타이드의 계면 중의 잔기의 총수이다. 공동부 형성을 위한 바람직한 이입 잔기는 대개 자연적으로 발생하는 아미노산 잔기이고 바람직하게는 알라닌(A), 세린(S), 트레오닌(T), 발린(V) 및 글라이신(G)으로부터 선택된다. 가장 바람직한 아미노산 잔기는 세린, 알라닌 또는 트레오닌이고, 가장 바람직하게는 알라닌이다. 바람직한 구체예에서, 돌출부의 형성을 위한 원래 잔기, 가령 타이로신(Y), 아르지닌(R), 페닐알라닌(F) 또는 트립토판(W)은 큰 측쇄 부피를 가진다.
"원래" 아미노산 잔기는 원래 잔기보다 더 작거나 큰 측쇄 부피를 가질 수 있는 "인입" 잔기에 의하여 대체되는 것이다. 인입 아미노산 잔기는 자연적으로 발생하는 또는 비-자연적으로 발생하는 아미노산 잔기일 수 있지만, 바람직하게는 전자이다.
"비-자연적으로 발생하는" 아미노산 잔기는 유전부호에 의하여 인코딩되지 않지만, 폴리펩타이드 쇄에서 인접한 아미노산 잔기(들)에 공유적으로 결합할 수 있는 잔기를 의미한다. 비-자연적으로 발생하는 아미노산 잔기의 예는 노르류신, 오르니틴, 노르발린, 호모세린 및 예를 들어 Ellman et al., Meth. Enzym. 202:301-336 (1991)에 기재된 것과 같은 다른 아미노산 잔기 유사체이다. 그러한 비-자연적으로 발생하는 아미노산 잔기를 생성하기 위하여, 상기 Noren et al. Science 244: 182 (1989) and Ellman et al.의 절차가 이용될 수 있다. 간략하게, 이는 서프레서 tRNA를 비-자연적으로 발생하는 아미노산 잔기로써 화학적으로 활성화시킴에 이어서 RNA의 시험관내 전사 및 번역을 포함한다. 본 발명의 방법은, 특정 구체예에서, IgM 중쇄 중의 최소 하나의 원래 아미노산 잔기를 대체하는 것을 포함하지만, 하나 초과의 원래 잔기가 대체될 수 있다. 보통, 제1 또는 제2 폴리펩타이드의 계면에서 총수 미만의 잔기가, 대체된 원래 아미노산 잔기를 포함할 것이다. 대체를 위한 바람직한 원래 잔기는 "매장된다(buried)". "매장된"은 잔기가 본질적으로 용매에 접근 불가능함을 의미한다. 바람직한 인입 잔기는 다이설파이드 결합의 가능한 산화 또는 미스페어링(mispairing)을 방지하기 위하여 시스테인이 아니다.
돌출부는 공동부 내에 "위치 가능(positionable)"하고 이는 제1 폴리펩타이드 및 제2 폴리펩타이드의 계면 상의 각각의 돌출부 및 공동부의 공간적 위치 및 돌출부 및 공동부의 크기가, 계면에서 제1 및 제2 폴리펩타이드의 정상적 연합을 현저히 교란시키지 않고 돌출부가 공동부 내에 위치할 수 있도록 하는 것임을 의미한다. Tyr, Phe 및 Trp와 같은 돌출부가 전형적으로 계면의 축으로부터 수직으로 연장되지 않고 바람직한 형태를 가지기 때문에, 상응하는 공동부와의 돌출부 정렬은 X-선 결정법 또는 학자기 공명(NMR)에 의하여 획득된 것과 같은 3-차원 구조에 기초한 돌출부/공동부 쌍 모델링에 의존한다. 이는 분자 모델링 기술을 비롯한 당해 분야에서 널리 채택되는 기술을 이용하여 달성될 수 있다.
"원래 핵산"은 돌출부 또는 공동부를 인코딩하기 위하여 "변형"(즉 유전학적으로 엔지니어링되거나 돌연변이)될 수 있는 관심 폴리펩타이드 인코딩 핵산을 의미한다. 원래 또는 출발 핵산은 자연적으로 발생하는 핵산일 수 있거나 사전 변형을 거친 핵산(예컨대 인간화 항체 단편)을 포함할 수 있다. 핵산 "변형"은 원래 핵산이 관심 아미노산 잔기를 인코딩하는 최소 하나의 코돈 삽입, 결실 또는 대체에 의하여 돌연변이됨을 의미한다. 보통, 원래 잔기를 인코딩하는 코돈이 인입 잔기를 인코딩하는 코돈에 의하여 대체된다. 이러한 방식으로 DNA를 유전학적으로 변형시키는 기술은 Mutagenesis: a Practical Approach, M. J. McPherson, Ed., (IRL Press, Oxford, UK. (1991)에서 검토되었고, 예를 들어 부위-지정 돌연변이유발, 카세트 돌연변이유발 및 중합효소 연쇄 반응(polymerase chain reaction, PCR) 돌연변이유발을 포함한다.
돌출부 또는 공동부는 합성 수단에 의하여, 예컨대 재조합 기술, 시험관내 펩타이드 합성, 앞서 기재된 비-자연적으로 발생하는 아미노산 잔기 도입 기술, 펩타이드의 효소적 또는 화학적 커플링 또는 이들 기술의 일부 조합에 의하여 제1 또는 제2 폴리펩타이드의 계면에 "도입"될 수 있다. 따라서, "도입되는" 돌출부 또는 공동부는 "비-자연적으로 발생하는" 또는 "비-천연"이며, 이는 자연에 또는 원래 폴리펩타이드에 존재하지 않음을 의미한다 (예컨대 인간화 단일클론 항체).
바람직하게는 돌출부를 형성하기 위한 인입 아미노산 잔기가 상대적으로 작은 수의 "회전이성질체(rotamer)" (예컨대 약 3-6)를 가진다. "회전이성질체"는 아미노산 측쇄의 에너지 선호적 형태이다. 다양한 아미노산 잔기에 대한 회전이성질체의 수가 Ponders and Richards, J. Mol. Biol. 193: 775-791 (1987)에서 검토된다.
본원에 사용된 용어 "숙주 세포"는 본 발명에 따른 항체를 생성하도록 엔지니어링될 수 있는 임의의 종류의 세포 시스템을 나타낸다. 한 구체예에서 중국 햄스터 난소(Chinese hamster ovary, CHO) 세포가 숙주 세포로서 사용된다.
본원에 사용된 표현 "세포", "세포주" 및 "세포 배양물"은 상호교환적으로 사용되고 그러한 모든 명칭은 자손을 포함한다. 따라서, 단어 "형질전환체" 및 "형질전환 세포"는 1차 대상 세포 및 전환 횟수에 관계 없이 그로부터 유도된 배양물을 포함한다. 의도적 또는 우연적 돌연변이로 인하여 모든 자손이 DNA 함량에 있어 정확하게 동일하지 않을 수 있음이 또한 이해된다. 원래의 형질전환 세포 내에서에 대하여 스크리닝된 것과 동일한 기능 또는 생물학적 활성을 가지는 변이체 자손이 포함된다.
핵산은 또 다른 핵산 서열과 기능적 관계로 배치된 경우 "작동 가능하게 연결된다(operably linked)". 예를 들어, 전서열 또는 분비 리더에 대한 DNA는 이것이 폴리펩타이드의 분비에 참여하는 전단백질로서 발현되는 경우 폴리펩타이드에 대한 DNA에 작동 가능하게 연결되고; 프로모터 또는 인핸서는 이것에 서열의 전사에 영향을 미치는 경우 코딩 서열에 작동 가능하게 연결되고; 또는 리보솜 결합 부위는 이것이 번역을 촉진하도록 위치되는 경우 코딩 서열에 작동 가능하게 연결된다. 일반적으로, "작동 가능하게 연결된"은 연결된 DNA 서열이 인접하고 있음, 그리고 분비 리더의 경우에, 인접하고 해독틀(reading frame)에 있음을 의미한다. 그러나, 인핸서는 인접하고 있을 필요가 없다. 연결은 편리한 제한 부위에서 결찰(ligation)에 의하여 달성된다. 그러한 부위가 존재하지 않는 경우, 합성 올리고뉴클레오타이드 어댑터 또는 링커가 통상적인 실시에 따라 사용된다.
용어 "유효량"은 본원에서 대상, 가령 인간 환자의 표적 질환 치료에 유효한 약물 또는 약물 조합의 양을 지칭하기 위하여 사용된다. 유효량의 약물은 표적 질환의 중증도 및/또는 지속기간을 개선 및/또는 감소시킬 수 있고, 부분 관해(partial response, PR) 또는 완전 관해(complete response, CR)를 일으킬 수 있다.
상세한 설명
대부분의 포유류의 점막 분비물에 존재하는 주요 클래스의 항체로서 면역글로불린 A(IgA)는 흡입 및 섭취된 병원체에 의한 침입에 대한 핵심적인 첫 번째 방어선을 대표한다. IgA는 또한 여러 종의 혈청에서 상당한 농도로 발견되며, 여기서 이는 점막 표면을 돌파한 병원체 제거를 매개하는 두 번째 방어선으로서 기능한다. IgA, FcαR의 Fc 영역에 특이적인 수용체는, IgA 이펙터 기능의 핵심 매개체이다.
인간 IgA는 두 가지 서브클래스, IgA1 및 IgA2를 발생시키는 두 가지 상이한 IgA 중쇄 불변 영역(Cα) 유전자를 가질 수 있다. IgA1과 IgA2 간의 주요 차이점은 둘의 Fab 팔(arm) 및 Fc 영역 간에 놓인 경첩 영역에 있다. IgA1은 중복된 아미노산 스트레치의 삽입으로 인하여 확장된 경첩 영역을 가지고, 이는 IgA2에 부재한다. 인간 IgA1 중쇄 불변 영역의 서열은 SEQ ID NO: 1로 나타난다. 인간 IgA2 중쇄 불변 영역의 서열은 SEQ ID NO: 2로 나타난다.
IgA는 이합체를 형성하는 능력을 가지고, 여기서 각각 둘의 중쇄 및 경쇄를 포함하는 둘의 단량체 단위가 다이설파이드 다리 및 J(연결)쇄의 포함에 의하여 안정화되는 말단-대-말단 배치로 배열된다. 천연 인간 J쇄의 서열은 SEQ ID NO: 3으로 나타난다. 점막 부위에서 국소적으로 생성되는 이합체형 IgA는 상피세포 경계를 가로질러 나와 중합체형 면역글로불린 수용체(pIgR)과의 상호작용에 의하여 분비물로 수송된다. 이 과정 동안 pIgR은 분열되고, 분비 성분(secretory component, SC)으로 지칭되는 주요 단편이 IgA 이합체에 공유적으로 부착된다.
본 발명의 다중-특이적 IgA 분자는 IgA 항체의 이합체 형태에 기초하고, 여기서 두 쌍의 IgA 중쇄 서열이 연합된 경쇄 서열과 함께 또는 이것이 없이 존재할 수 있다. 바람직한 한 구체예에서, 본원의 IgA 결합 분자는 이중특이적이고, J쇄를 포함하여 둘의 IgA (IgA1 또는 IgA2) 이합체로 구성된다.
본 발명의 다중-특이적 IgA 항체는 분자가 전체로서 최소 둘의 결합 특이성을 가지는 한 단일- 및 이중특이적 결합 유닛을 포함할 수 있다.
따라서, 한 구체예에서, 본원의 IgA 항체는 이중특이적이고, 각각 상이한 결합 표적에 대한 결합 특이성을 가지는 둘의 단일특이적 결합 유닛 (AA, BB)으로 이루어진다.
또 다른 구체예에서, 본원의 IgA 항체는 둘의 이중특이적 결합 유닛을 포함하고, 각각의 결합 유닛은 동일한 둘의 결합 표적(AB, AB)에 결합하여 이중특이적 IgA 항체를 형성한다.
또 다른 구체예에서, 본 발명의 IgA 항체에 존재하는 한 결합 유닛은 단일특이적(AA)인 반면 다른 결합 유닛은 이중특이적(BC)이고, 결과적으로 IgA 항체가 셋의 (A, B, C) 결합 특이성을 가진다.
상이한 구체예에서, 각각의 결합 유닛이 이중특이적이지만, 한 특이성이 중복되어 (예컨대 AB, AC), 결과적으로 IgA 항체가 셋의 (A, B, C) 결합 특이성을 가진다.
또 다른 구체예에서, 각각의 결합 유닛은 상이한 결합 특이성을 가지는 이중특이적이다 (AB, CD). 따라서, IgA 분자는 넷의 (A, B, C, D) 결합 특이성을 가진다.
본원의 IgA 결합 분자의 결합 유닛은 최소 하나의 CA3 (Cα3) 도메인을 포함하고 CA2 (Cα2) 도메인을 추가로 포함할 수 있다.
한 구체예에서, 본 발명의 다중-특이적 IgA 항체는 완전한 IgA 중(α)쇄 불변 도메인을 포함하며, 두 중쇄 사이에 비대칭 계면을 생성하기 위한 하나 이상의 변형을 가진다.
또 다른 구체예에서, 본 발명의 다중-특이적 IgA 항체는 완전한 천연 J쇄를 포함한다. J쇄는 이것이 IgA의 중합을 촉진하고 중합체 중 이의 존재가 SC/pIgR에 대한 중합체의 친화성에 필요한 것으로 생각되기 때문에 SIgA의 생성에서 핵심 단백질이다. 본원의 다중-특이적 IgA 항체는, 단편 또는 변형된 J쇄가, 특히 IgA의 효율적인 중합 및 분비 성분(SC)/중합체형 (p)IgR에 대한 그러한 중합체의 결합을 가능하게 하는 천연 J쇄의 기능을 보유하는 한, J쇄 단편, 또는 달리 변형된 J쇄를 포함할 수 있다. J쇄의 구조-기능 관계의 추가적 세부사항에 대해서는, 예컨대 Johansen et al., 2001; J. Immunol. 167(9):5185-5192를 참조하라.
두 가지 상이한 α 중쇄를 가지는 IgA 분자(즉 결합 유닛 중 최소 하나가 이중특이적인 경우)를 생성하기 위하여, 두 가지의 상이한 결합 특이성을 가지는 둘의 매칭 α 중쇄를 서로 커플링하기 위한 해결책을 발견해야 한다. 게다가, 경쇄가 결합 영역 형성에 필요할 경우, 각각의 중쇄를 이의 매칭 경쇄와 커플링하여 원하는 결합 특이성을 제공하기 위한 해결책을 발견해야 한다.
커플링은 특정 잔기 사이의 염 다리 쌍 전하 스위칭(전화 스와프 또는 전하 역전으로도 지칭됨)에 의하여 및/또는 둘의 쇄 사이에 놉-홀 상호작용을 발생시켜 달성될 수 있다. 중쇄는 또한 크로스맵 기술을 이용하여 이들의 매칭 경쇄와 짝지어질 수 있다. 최적의 결과를 성취하기 위하여 여러 상이한 접근법이 또한 조합될 수 있다.
1. 놉-인투-홀 기술(Knobs-into-Holes Technique)
본 발명의 오- 또는 육합체형 이중특이적 결합 분자의 수율을 개선하기 위하여, IgA 중쇄 불변 영역, 예컨대 Cα3 도메인이, 예컨대 WO 96/027011, Ridgway, J., B., et al., Protein Eng 9 (1996) 617-621; and Merchant, A. M., et al., Nat Biotechnol 16 (1998) 677-681에서 몇 가지 예로써 상세하게 설명되는 "놉-인투-홀" 기술에 의하여 변형될 수 있다. 이 방법에서 둘의 IgA 중쇄 불변 도메인의 상호작용 표면은 상이한 결합 특이성을 가지는 두 중쇄의 및/또는 중쇄 및 이의 매칭 경쇄 간의 이종이량체화를 증가시키기 위하여 변형된다. 두 중쇄 도메인 각각은 "놉"일 수 있는 한편, 다른 것은 "홀"이다. 다이설파이드 다리의 도입은 이종이합체를 안정화시키고 (Merchant, A. M., et al., Nature Biotech 16 (1998) 677-681; Atwell, S., et al., J. Mol. Biol. 270 (1997) 26-35) 수율을 증가시킨다. 유사하게, 매칭 중쇄 및 경쇄는 이 기술에 의하여 서로 커플링될 수 있다 (Zhu, Z.; Presta, L.G.; Zapata, G.; Carter, P. Remodeling domain interfaces to enhance heterodimer formation. Prot. Sci. 6:781-788 (1997)).
이러한 접근법을 따라, 이중특이적 IgA 항체 내의 다른 중쇄의 상응하는 도메인의 원래 계면을 만나는 한 중쇄의 Cα (예컨대 Cα3) 도메인의 원래 계면 내에서, 아미노산 잔기가 더 큰 측쇄 부피를 가지는 아미노산 잔기로 대체될 수 있고, 이에 의하여 다른 IgA 중쇄 불변 영역 중의 상응하는 도메인의 계면 내의 공동부에 위치 가능한 계면 내 돌출부가 생성된다. 유사하게, 제2 IgA 중쇄는 제1 IgA 중쇄의 불변 영역에서 상응하는 도메인과의 계면 내의 아미노산 잔기를 더 작은 측쇄 부피를 가지는 아미노산 잔기로 대체하여 변형될 수 있고, 이에 의하여 두 중쇄 영역 사이의 계면 내에 홀(공동부)이 생성된다.
놉-홀 위치에서의 인간 IgA Cα3 도메인 계면 잔기가 표 1에 나타난다. 표는 도 4에 나타나는 Cα3 서열의 지시된 위치에서의 천연 잔기뿐만 아니라, 도 4에 나타나는 넘버링에 따라, 놉-홀 쌍을 생성하기 위하여 이용될 수 있는 잠재적인 돌연변이를 식별하게 한다. 따라서, 예를 들어, Cα3 도메인에서 위치 352의 천연 류신(L) 잔기가 메티오닌(M)으로 돌연변이될 수 있거나, 위치 368의 천연 트레오닌 (T) 잔기가 트립토판(W)으로 돌연변이되어 놉을 생성할 수 있으며, 여기서 놉 돌연변이는 아미노산 위치 352, 368, 및 414에 대하여 나열된 홀의 임의의 조합과 조합될 수 있다.
세트 #1-6의 나열된 놉-홀 돌연변이가 표 1에 제시된 다양한 조합으로 사용될 수 있음이 강조된다. 더욱이, 나열된 돌연변이는 다른 놉-홀 및/또는 전하 스와프 및/또는 전하 도입 돌연변이, 가령 표 2에 나열된 전하 스와핑 돌연변이와 조합될 수 있다. 따라서, 본원에서 하기 논의되는 바와 같이, 표 1에 제시된 놉-홀 돌연변이 중 하나 이상이 표 2에 나열된 전하 스와프 돌연변이 중 하나 이상과 조합될 수 있다. 따라서, 표 1의 임의의 세트를 선택하고 이를 표 2의 임의의 세트와 임의의 순서 또는 조합으로 혼합할 수 있다.
2. 염 다리 쌍 전하 스위칭 (전하 스와핑 )
반대 전하는 서로 끌어당기고 유사 전하는 서로 반발한다. 아미노산 분자의 전하는 pH 의존성이고 pK 값을 특징으로 할 수 있는데, pK 값은 유리 아미노산의 알파 아미노 그룹(N), 알파 카복시 그룹(C) 및 측쇄에 대하여 결정된다. 아미노산이 단백질 또는 펩타이드의 일부일 경우, 국소 환경이 측쇄의 pKa를 변화시킬 수 있다.
아미노산 분자의 전하 특성은 또한 등전점(isoelectric point, pI)을 특징으로 할 수 있고, 이는 분자의 전체 전하가 중성인 pH이다. 아미노산은 이들의 측쇄가 서로 상이하기 때문에, pI는 측쇄의 pK 차이를 반영한다.
대부분의 아미노산(20 중 15)은 6에 가까운 pI를 가지고 따라서 이들은 중성 전체 전하를 가지는 것으로 간주된다. Asp 및 Glu는 음으로 하전되어 있고, His, Lys, Arg는 양으로 하전되어 있다.
전하 스와핑 또는 전하 도입 돌연변이를 위한 위치 및 아미노산 잔기가 표 2에 나열된다. 상기 논의된 바와 같이, 이들 돌연변이 중 하나 이상, 또는 돌연변이의 세트가, 하나 이상의 놉-홀 돌연변이 세트와 조합하여 둘의 상이한 IgA 중쇄 간의 및/또는 IgA 중쇄와 이의 매칭 경쇄 간의 원하는 비대칭 계면을 제공할 수 있다.
바람직하게는, 둘의 상이한 IgA 중쇄 불변 영역 간의 비대칭 계면이 하나의 IgA 중쇄에서 최대 8, 예를 들어, 1-8, 또는 1-7, 또는 1-6, 또는 1-5, 또는 1-4, 또는 1-3, 또는 1-2 돌연변이, 또는 둘의 IgA 중쇄에서 2-10, 또는 2-9, 또는 2-8, 또는 2-7, 또는 2-6, 또는 2-5, 또는 2-4, 또는 2-3 조합 돌연변이에 의하여 생성된다.
3. 크로스맵 기술( CrossMab technique)
상기 논의된 바와 같이, 놉-인투-홀 기술 또는 전하 스와핑은 항체 중쇄의 이종이량체화를 가능하게 한다. 경쇄 및 이들의 종족 중쇄의 올바른 연합은 이중특이적 항체 결합 유닛의 절반의 항원 결합 단편(Fab) 내 중쇄 및 경쇄 도메인의 교환에 의하여 달성될 수 있다. 크로스오버는 완전한 VH-CH 및 VL-CL 도메인의 크로스오버로서, 단지 IgA 항체의 이중특이적 결합 유닛의 절반 내의 VH 및 VL 도메인 또는 CA 및 CL 도메인의 크로스오버로서 일어날 수 있다. 이러한 "크로스오버"는 항원-결합 친화성을 유지하지만 경쇄 미스페어링이 더 이상 일어날 수 없도록 두 팔을 상이하게 만든다. IgG 항체의 맥락에서, 추가의 세부사항에 대해서는, 예를 들어, Schaeffer et al., (2011) Proc Natl Acad Sci USA 108(27): 11187-11192를 참조하라.
4. 다중-특이적 IgA 결합 분자의 제조
(놉-인투-홀, 전하 스와프 및/또는 크로스맵 기술에 따라) 원하는 돌연변이를 가지는, 이중특이적 IgA 항체 결합 유닛의 중쇄의 코딩 서열은 적절한 뉴클레오타이드 변화를 항체 DNA에 도입하여, 또는 뉴클레오타이드 합성에 의하여 생성될 수 있다. 항체는 이후 재조합 수단에 의하여 제조될 수 있다.
재조합 제조 방법이 종래 기술에서 공지이고 원핵 및 진핵 세포에서의 단백질 발현과 함께 차후의 항체 단리 및 약제학적으로 허용되는 순도까지의 정제를 포함한다. 숙주 세포에서의 항체 발현을 위하여, 각각의 변형된 중쇄, 및 임의로 경쇄를 인코딩하는 핵산이, 표준 방법에 의하여 발현 벡터에 삽입된다. 발현은 CHO 세포, NS0 세포, SP2/0 세포, HEK293 세포, COS 세포, PER.C6 세포, 효모, 또는 이. 콜라이 세포와 같은 적절한 원핵 또는 진핵 숙주 세포에서 수행되고, 항체는 세포(상청액 또는 용해 후 세포)로부터 회수된다. 일반적인 항체의 재조합 방법이, 예를 들어, Makrides, S. C., Protein Expr. Purif. 17 (1999) 183-202; Geisse, S., et al., Protein Expr. Purif. 8 (1996) 271-282; Kaufman, R. J., Mol. Biotechnol. 16 (2000) 151-161; Werner, R. G., Drug Res. 48 (1998) 870-880의 리뷰 논문에 기재된다.
이중특이적 항체는, 예를 들어, 단백질 A-SEPHAROSE®, 하이드록시아파타이트 크로마토그래피, 겔 전기영동, 투석, 또는 친화성 크로마토그래피와 같은 종래의 면역글로불린 정제 절차에 의하여 배양 배지로부터 적합하게 분리된다.
본 발명의 방법은, 원하는 오합체형 또는 육합체형 구조 대신, 제조 공정의 다양한 부산물, 가령 이중특이적 결합 유닛의 단일특이적 항체, 항체 단편, 단량체, 이합체, 삼합체, 및/또는 사합체와 조합으로, 주요 성분으로서, 이중특이적 IgA 결합 분자, 가령 이중특이적 IgA 항체를 포함하는 조성물을 야기할 것이다. 생성된 조성물은 일반적으로 최소 약 70%, 또는 최소 약 75%, 또는 최소 약 80%, 또는 최소 약 85%, 또는 최소 약 90%, 또는 최소 약 92%, 또는 최소 약 95%의 원하는 오- 또는 육합체형 이중특이적 결합 분자, 예컨대 항체를 함유할 것이고, 이는 최소 약 90%, 또는 최소 약 95%, 또는 최소 약 98%, 또는 최소 약 99%, 또는 최소 약 99.5%, 또는 최소 약 99.9%의 순도를 가지는 생성물을 산출하기 위하여 당해 분야에 공지인 방법에 의하여 더욱 정제될 것이다.
다중-특이적 IgA 항체 및 다른 다중-특이적, 가령 이중특이적의 결합 분자가 유사한 방식으로 제조될 수 있다.
5. 다중-특이적 IgA 결합 분자의 적용
다중-특이적, 가령 이중특이적 IgA 결합 분자, 예컨대 본 발명의 항체는 광범한 치료 및 진단 적용성을 가진다.
IgA는 신체의 체액성 면역체계의 다량 성분을 구성하고 점막 표면에서 보호 기능을 하여, 점막 면역의 유지에 중요한 역할을 한다. 이합체 및 더 고급 소중합체 형태의 IgA는 세포막을 가로질러 효율적으로 수송되고 외분비물에 방출되며 여기서 IgA가 감염에 대한 첫 번째 특이성 면역 방어를 형성한다. IgA는 직접 살해, 응집, 상피 부착 및 침입 억제, 효소 및 독소의 비활성화, 옵소닌화, 및 보체 활성화를 포함하는 다양한 메커니즘에 의하여 박테리아 감염에 맞서는 것으로 나타났다. 분비물 중의 IgA는 또한 점막 표면을 표적으로 하는 바이러스 질환에 대하여 보호한다. 추가의 세부사항에 대해서는, 예컨대 Mostow, K.E., Annu . Rev. Immunol. 1994, 12:63-84를 참조하라.
따라서, 본 발명의 다중-특이적 IgA 항체는 미생물, 예컨대 박테리아, 바이러스 또는 진균 감염의 치료에 유례없이 적합하다.
미생물 감염의 예는, 제한 없이, 박테리아 감염, 예컨대 클로스트리듐 디피실레 (씨. 디피실레) 감염 또는 다제내성 에스.아우레우스 감염, 진균 감염, 예컨대 칸디다 알비칸스 또는 아스페르길루스 종에 의한 감염을 포함한다. 바이러스 감염의 예는, 제한 없이, 호흡기 바이러스에 의한 감염, 예컨대 인플루엔자 바이러스 감염 (플루), 호흡기 세포융합 바이러스 (RSV)에 의한 감염을 포함한다.
본 발명의 다중-특이적 IgA 결합 분자, 가령 다중-특이적 IgA 항체, 예컨대 이합체형 이중특이적 IgA 항체가 바리셀라-조스터 바이러스, 아데노바이러스, 인간 면역결핍 바이러스, 인간 메타뉴모바이러스, 웨스트 나일 바이러스, 중증 급성 호흡기 증후군(SARS)을 야기하는 바이러스 등에 의한 감염을 치료하기 위하여 추가적으로 사용될 수 있다. 본 발명의 다중-특이적 IgA 결합 분자, 가령 다중-특이적 IgA 항체, 예컨대 이합체형 이중특이적 IgA 항체가 또한 바실루스 안트라시스 , 클로스트리듐 보툴리눔 독소, 클로스트리듐 퍼프린젠스 엡실론 톡신 예르시니아 페스티스 , 프란시셀라 툴라리엔시스 , 콕시엘 버네티 , 브루셀라 종, 스타필로코쿠스 엔테로톡신 B와 같은 추가적인 박테리아의 균주를 치료하기 위하여 사용될 수 있다.
바람직한 한 구체예에서, 본 발명의 다중-특이적 IgA 결합 분자, 가령 다중-특이적 IgA 항체, 예컨대 이합체형 이중특이적 IgA 항체가 클로스트리듐 디피실레 감염의 치료를 위하여 사용된다. 클로스트리듐 디피실레는 보통 인간 장내 마이크로바이옴(microbiome)의 부차적 성분인 그람 양성 박테리아를 형성하는 포자이다. 그러나, 항생제 치료를 받는 고령자, 영유아 또는 면역 억제 개체에서, 씨. 디피실레가 전격성이 되어 중증 설사, 결장염 및 사망을 유발할 수 있다. 씨. 디피실레 감염의 관리는 초기 항생제의 중단 및 메트로니다졸, 반코마이신 또는 피닥소마이신을 사용한 치료를 포함한다. 흔히 초기 치료가 성공적이지만, 환자가 30% 비율로 치료에 대한 불완전한 반응 또는 감염의 재발을 겪는다. 따라서, 더욱 효과적인 치료 양식에 대한 필요성이 크다.
씨. 디피실레의 발병기전은 주로 장내 생물체에 의하여 분비되는 두 가지 독소: 독소 A 및 독소 B로 인한 것이다. 독소들은 구조가 유사하고 양자 모두 세포골격 구조 유지에 요구되는 결정적인 GTPase 탈글리코실화에 의하여 세포 원형화, 탈락 및 세포 사멸을 야기한다. 단일클론 항체가 독소 A 및 독소 B를 강력하게 중화하는 것으로 확인되었고 이들 항체는 동물 모델 및 인간 임상시험 모두에서 씨. 디피실레 감염의 치료에 유망하게 나타났다. 동물 연구에서, 독소 A 또는 독소 B를 중화하는 개별적인 단일클론 항체는 씨. 디피실레 독소 매개 독성을 억제할 수 없는 반면, 두 항체의 칵테일은 상당한 보호를 제공한다. 독소 A 및 독소 B를 특이적으로 표적화하는 이중특이적 IgA 항체는 IgA의 고유한 특성으로 인하여 상당한 추가적 이점을 제공할 것이다.
또 다른 바람직한 구체예에서, 본 발명의 다중-특이적 IgA 결합 분자, 가령 다중-특이적 IgA 항체, 예컨대 이합체형 이중특이적 IgA 항체가 인간 호흡기 세포융합 바이러스(RSV) 감염의 치료에 사용된다. RSV는 중증 하기도 질환을 야기하는 편재하는 호흡기 바이러스이고 영유아 및 노인에 있어서 폐렴 및 기관지염의 주요 원인이다. 호흡기 세포융합 바이러스 (RSV) 바이리온의 표면 상의 두 가지 주요 당단백질인, 부착 당단백질(G) 및 융합 당단백질(F)이 감염의 초기 단계를 제어한다. G는 기도의 섬모세포를 표적으로 하고, F는 바이리온 막을 표적 세포막과 융합시킨다. 단백질 F에 대한 항체는, 예를 들어, 미국 특허 제5,824,307호 및 제6,818,216호에 기재된다. 단백질 G에 대한 항체는, 예를 들어, 미국 특허 제7,736,648호에 기재된다. 본 발명의 이중특이적 IgA 이합체는 폐에 효과적으로 전달되는 능력을 포함하여 IgA의 고유한 특성으로 인하여 상당한 추가적 이점을 제공한다.
또 다른 바람직한 구체예에서, 본 발명의 다중-특이적 IgA 결합 분자, 가령 다중-특이적 IgA 항체, 예컨대 이합체형 이중특이적 IgA 항체가 인플루엔자 바이러스에 의하여 야기되는 감염의 치료를 위하여 사용된다. 인플루엔자 감염("인플루엔자" 또는 "플루"로도 지칭됨)은 인간 및 가축의 가장 흔한 질환 중 하나이다. 세 유형의 인플루엔자 바이러스(A, B 및 C 형)가 질환을 초래한다. 인플루엔자 바이러스 표면 당단백질 헤마글루티닌(HA) 및 뉴라미니데이즈(NA)는 광범한 항원 변동성을 나타내고, 인플루엔자 아형 분류 기준이다. HA는 바이리온 외피의 표면에 나타나고, 세포로의 바이러스 진입에 연관된다. HA는 최초에 약 560 아미노산의 단일 폴리펩타이드 사슬(HA0)로서 합성되며, 이는 차후 단백질분해 분열되어 둘의 서브유닛, HA1 및 HA2를 형성하는 막관통 단백질이다. 서브유닛은 다이설파이드 결합을 통하여 연결된 채로 유지되며, 단백질은 감염된 세포 및 바이리온의 표면에 동종삼합체로서 나타난다. RA Lamb, RM Krug, Orthomyxoviridae: the viruses and their replication. (DM Knipe, PM Howley, DE Griffin (Eds.) et al., Fields Virology, 4th edn., Lippincott Williams & Wilkins, 2001, pgs. 1487 - 1531 참조). HA1은 Ha의 구상 헤드 영역을 형성하고, HA 아형 중 항원 변동성의 대부분을 담당한다. HA1은 숙주 세포 상의 바이러스 수용체와 상호작용한다. HA2는 바이러스 스파이크의 섬유상 줄기를 형성하고, 바이리온 외피와 숙주 세포막 사이의 융합에 연관된 것으로 생각된다. 줄기 영역이 다양한 상이한 HA 아형 중에서 더욱 보존된다. (예컨대, Wilson et al., Nature, 289:366-373, 1981; Skehel et al., Ann. Rev. Biochem., 69:531-569, 2000 참조).
인간에게 퍼지는 인플루엔자 바이러스의 항원 변동성은 매해 달라지므로, 해당 해에 가장 우세한 아형의 예측에 기초하여 제조된 계절성 백신으로써 해마다 백신접봉이 필요하다. 불행히도, 예측이 항상 정확한 것은 아니다. 더구나, 인플루엔자 바이러스의 유행성 균주는 주기적으로 동물 병원소로부터 인간으로 도약한다. 그러한 유행성 균주, 예컨대, H5N1은 주의 깊은 제어 없이 중증 질환 전파를 야기할 수 있다. 따라서 인플루엔자 바이러스 질환 및 전파를 제어하기 위한 추가적인 요법에 대한 필요성이 당해 분야에 여전히 존재한다.
대안의 접근법으로서, 인플루엔자 감염을 예방하거나 바이러스 중화를 통하여 존재하는 감염을 치료할 수 있는 항체-기초 요법이 개발 중이다. 인플루엔자 바이러스 감염에 대하여 보호하는 대부분의 중화 항체의 주요 표적은 HA의 구상 헤드 영역이지만, 이 영역의 항원 변동성이 도전과제를 제기한다. 최근에, 인플루엔자 A 및 B 바이러스의 HA의 보존된 줄기 영역을 인식하는 광범하게 교차-중화시키는 항체가 비록 임상시험에서의 효능이 입증되지 않았기는 하지만 동정되었다. (예컨대, WO2008/028946, WO 2010/130636, 및 US20140120113A1 참조). IgA 골격의 다중클론 혼합물이 인플루엔자 바이러스에 대하여 향상된 중화 역가를 가지는 것으로 나타났다 (He, W. et al., J. Virol. Doi: 10. 1128/JVI.03099-14, 2015년 1월 14일 온라인 게시된 승인 원고).
본 발명의 이중특이적 및 다중-특이적 IgA 결합 분자, 가령 다중- 또는 이중특이적 이합체형 항체는 다양한 인플루엔자 바이러스 및 인플루엔자 바이러스 아형 상의 여러 상이한 항원들을 표적화하도록 설계되어, 플루의 관리를 위한 효과적인 도구를 제공할 수 있다.
본 발명의 다중-특이적 IgA 결합 분자, 가령 IgA 항체는 여러 추가적인 광범위의 적용성을 가진다.
한 구체예에서, 본원의 다중-특이적 IgA 결합 분자, 예컨대 항체는 동일한 가용성 표적, 가령, 예를 들어, VEGF, TNFα, 또는 IL6 상의 둘 이상의 부위에 결합한다. 목적은, 예를 들어, 단백질 상의 다중 부위 길항 및/또는 주어진 표적에 대한 항원항체결합력 증가일 수 있다.
또 다른 구체예에서, 본원의 다중-특이적 IgA 결합 분자, 예컨대 항체는 동일한 세포 표면 (수용체) 표적, 가령 EGFR 또는 HER2 (ErbB2) 상의 둘 이상의 부위에 결합한다. 따라서, 예를 들어, 이중특이적 결합 분자는 HER2 분자 상의 4D5 및 2C4 에피토프 양자 모두를 표적화할 수 있다. 이러한 접근법은 생체역가(bio-potency) 및/또는 주어진 표적에 대한 항원항체결합력을 증가시킬 수 있다.
또 다른 구체예에서, 본 발명의 다중-특이적 IgA 결합 분자, 예컨대 항체는 둘 이상의 상이한 가용성 표적(구상 단백질 또는 펩타이드), 예컨대 TNFα 및 IL6, VEGFα 및 Ang2, 또는 둘의 사이토킨에 결합한다. 이러한 접근법은 더욱 완전한 특정 경로의 차단; 소위 "사이토킨 폭풍"의 차단을 야기하거나 효소 및 이의 기질, 예컨대 인자 IXa 및 인자 X를 배위시킬 수 있다.
또 다른 구체예에서, 본원의 다중-특이적 IgA 결합 분자, 예컨대 항체는 하나 이상의 가용성 표적 및 하나 이상의 세포 표면 수용체 표적, 가령 혈관형성 인자 및 신생혈관 특이적 수용체에 결합할 수 있다. 이러한 접근법의 목적은 또한 특정 부위 또는 조직에서의 증가된 전달 및 차단일 수 있다.
또 다른 구체예에서, 본원의 다중-특이적 IgA 결합 분자, 예컨대 항체는 예를 들어 HER2(ErbB2) 및 HER3(ErbB3)와 같은, 둘 이상의 상이한 세포 표면 수용체 표적에 결합하도록 설계된다. 이는 특이성 및 선택성 향상 및/또는 주어진 경로의 더욱 완전한 차단을 야기할 수 있다.
본 발명의 다중-특이적 IgA 결합 분자, 예컨대 항체는 또한 하나의 가용성 표적 또는 세포 표면 수용체 표적 및 예를 들어, TNFα 및 혈청 알부민, 또는 VEGF 및 혈청 알부민과 같은 긴 체류시간 표적에 결합하도록 설계될 수 있다. 이들 분자는 알부민 특이성이 없는 결합 분자보다 더 긴 순환 반감기를 가질 것으로 예상된다.
또 다른 구체예에서, 본원의 다중-특이적 IgA 결합 분자, 예컨대 항체는 하나 이상의 가용성 표적 및 예를 들어, VEGFα 및 하이알루론산과 같은 하나 이상의 매트릭스 단백질 또는 기질에 결합할 수 있다. 결과적인 이중특이적 결합 분자는 유용성, 예를 들어, 안내 공간에서의 증가된 체류시간으로 인하여 안구 병태, 가령 연령-관련 황반 변성(AMD)의 항-혈관형성 요법에서 유용성을 발견할 수 있다.
이중특이적 IgA 결합 분자, 예컨대 하나의 가용성 또는 수용체 표적에 더하여 수송체 수용체(즉 트랜스페린 수용체)에 결합하는 항체, 예컨대 항-트랜스페린 특이성과 조합된 교모세포종에서 발견되는 항-EGFRvIII(엑손 III가 결실된 돌연변이체 형태)가 혈관 뇌 장벽을 가로지르는 항체 전달에서 유용성을 발견할 수 있다.
다른 다중-특이적 IgA 결합 분자, 예컨대 항체는 두 가지 이상의 상이한 세포 유형, 가령 B 및 T 세포에 결합할 수 있다. 그러한 항체는, 예를 들어 B 및/또는 T 세포 관련 질환 또는 병태, 가령 류마티스 관절염(RA) 또는 비호지킨 림프종에서 유용성을 발견할 수 있다.
모든 구체예에서, 이합체형 이중특이적 IgA 항체의 사용이 바람직하다.
표적 항원와 연합된, 임의의 그리고 모든 위에 언급된 및 관련된 병태의 치료를 위한 유효량의 다중-특이적 IgA-결합 분자, 가령 다중-특이적 IgA 항체, 예컨대 이중특이적 이합체형 IgA 항체를 포함하는 약제학적 조성물은 그러한 병태의 치료 방법 및 용도와 함께 명백하게 본 발명의 범위 내에 있다.
6. 조성물, 약제학적 조성물, 및 치료 방법
한 양태에서, 본 발명은 정제된 본원의 다중-특이적 IgA 항체를 포함하는 조성물에 관한 것이다. 조성물은 일반적으로 최소 약 80%, 또는 최소 약 85%, 또는 최소 약 90%, 또는 최소 약 92%, 또는 최소 약 95%, 또는 최소 약 98%, 또는 최소 약 99%의 원하는 이중특이적 IgA 결합 분자, 예컨대 항체를 포함할 것이다. 조성물은 이중특이적 결합 분자, 예컨대 항체가 최소 하나의 약제학적으로 허용되는 담체와 혼합되는 약제학적 조성물일 수 있다.
다양한 구체예에서, 본 발명의 약제학적 조성물은 상기 나열된 병태 또는 질환의 치료를 위한 본 발명의 유효량의 다중-특이적 IgA 결합 분자, 가령 다중-특이적 IgA 항체, 예컨대 이합체형 이중특이적 IgA 항체를 포함한다. 모든 구체예에서, 이합체형 이중특이적 IgA 항체의 사용이 바람직하다.
본 발명의 약제학적 조성물은 당해 분야에 공지인 다양한 방법에 의하여 투여될 수 있다. 당해 분야에서 통상의 지식을 가진 자가 이해할 것과 같이, 투여 경로 및/또는 방식은 표적 질환 또는 병태 및 원하는 결과에 따라 달라질 것이다. 본 발명의 화합물을 특정 투여 경로에 의하여 투여하기 위하여, 화합물을 이의 불활성화를 방지하기 위한 물질로 피복하거나 이와 함께 병용투여할 필요가 있을 수 있다. 예를 들어, 화합물은 적절한 담체, 예를 들어, 리포솜, 또는 희석제 중에서 대상에게 투여될 수 있다. 약제학적으로 허용되는 희석제는 식염수 및 수성 완충 용액을 포함한다. 약제학적 담체는 멸균 주사 용액 또는 분산액의 즉각적인 제조를 위한 멸균 수용액 또는 분산액 및 멸균 분말을 포함한다. 약제학적으로 활성인 그러한 매질 및 제제의 사용은 당해 분야에 공지이다.
조성물은 또한 보존제, 습윤제, 유화제 및/또는 분산제와 같은 보조제를 함유할 수 있다. 미생물 존재의 방지는 멸균 과정 및 다양한 항박테리아제 및 항진균제, 예를 들어, 파라벤, 클로로부탄올, 페놀, 소르브산 등의 포함 양자에 의하여 확보될 수 있다. 당, 소듐 클로라이드 등과 같은 등장화제를 조성물에 포함시키는 것이 또한 바람직할 수 있다. 추가로, 주사 가능한 약제학적 형태의 장기 흡수는 알루미늄 모노스테아레이트 및 젤라틴과 같은 흡수를 지연시키는 제제의 포함에 의하여 일어날 수 있다.
본 발명의 약제학적 조성물 중의 활성 성분의 실제 용량 수준은 환자에 대한 독성 없이 특정한 환자, 조성물, 및 투여 방식에 대하여 원하는 치료 반응을 달성하기에 유효한 활성 성분의 양을 얻도록 달라질 수 있다. 선택된 용량 수준은 사용되는 본 발명의 특정 조성물의 활성, 투여 경로, 투여 시간, 사용되고 있는 특정 조성물의 배설률, 치료 기간, 사용되는 특정 조성물과 조합으로 사용되는 다른 약물, 화합물 및/또는 물질, 연령, 성별, 체중, 병태, 일반 건강 및 치료받고 있는 환자의 이전 병력, 및 의학 분야에서 공지인 유사한 인자를 포함하여 다양한 약동학적 인자에 의존할 것이다.
조성물은 멸균성이고 조성물을 주사기에 의하여 전달 가능한 정도까지 유동성이어야 한다. 물 이외에도, 담체는 바람직하게는 등장성 완충 식염수이다.
본원에 언급된 모든 간행물은 상기 간행물이 인용한 것과 관련된 방법 및/또는 물질을 개시하고 설명하기 위하여 본원에 그 전체가 참조로 명백하게 편입된다. 본원에 인용된 간행물은 본 출원의 출원일에 앞선 개시에 대하여 인용된다. 여기서 어느 것도 더 빠른 우선일의 발명이 상기 간행물을 앞서는 것으로 발명자가 허여받지 않는다는 허가로서 간주되지 않아야 한다. 추가로 실제 공개일은 나타난 것과 상이할 수 있고 독립적인 증명을 필요로 할 수 있다.
하기 실시예, 서열목록 및 도면은 본 발명의 이해를 돕기 위하여 제공되고, 본 발명의 진정한 범위는 첨부된 청구항에 제시된다. 본 발명의 사상으로부터 벗어나지 않고 제시된 절차에 변경이 이루어질 수 있음이 이해된다.
실시예 1
1. 설계된 돌연변이를 가지는 DNA 작제물의 생성
a. 물질 및 방법:설계된 돌연변이를 가지는 DNA 작제물 생성
b. DNA 작제물 합성
설계된 돌연변이를 가지는 모든 DNA 작제물은 상업적 판매자(Genescript)에 의하여 합성되며, 각각의 발현 벡터로 서브클로닝하기 위한 양 말단의 적합성(compatible) 제한 부위를 가진다.
c. 발현 벡터 작제
합성된 DNA 작제물을 1 μg/ml로 Tris-EDTA 버퍼에 재현탁한다. DNA(1 μg)는 효소 분해를 거치고 합성된 유전자는 전기영동에 의하여 캐리어 플라스미드 DNA로부터 분리된다. 분해된 DNA는 표준 분자 생물학 기술에 의하여 사전분해된 플라스미드 DNA(α쇄에 대하여 pFUSEss-CHIg-hA1; 카파쇄에 대하여 pFUSE2ss-CLIg-hk, Invivogen)에 연결된다. 연결된 DNA는 컴피턴트 박테리아로 형질전환되고 다수의 선택적 항생제와 함께 LB 플레이트에 도말된다. 여러 박테리아 콜로니를 고르고 표준 분자 생물학 기술로 DNA 표본을 제조한다. 제조된 DNA를 서열분석으로 확인한다. 설계된 DNA 서열과 100% 매칭의 DNA 서열을 가지는 박테리아 클론만을 플라스미드 DNA 표본 및 차후 세포 형질감염을 위하여 사용한다.
d. 상이한 크기의 α쇄
두 가지 상이한 알파쇄(A 및 B)가 함께 커플링될 수 있을 것임을 입증하기 위하여, 별개의 분자량 및 리간드 특이성을 가지는 두 가지 상이한 알파쇄를 작제한다.
e. A쇄는 인간 알파쇄의 CA1과 융합된 키메라 OKT3(항-CD3) VH 영역에 대한 전장 α쇄로 구성된다:
QVQLQQSGAELARPGASVKMSCKASGYTFTRYTMHWVKQRPGQGLEWIGYINPSRGYTNYNQKFKDKATLTTDKSSSTAYMQLSSLTSEDSAVYYCARYYDDHYCLDYWGQGTTLTVSSASPTSPKVFPLSLCSTQPDGNVVIACLVQGFFPQEPLSVTWSESGQGVTARNFPPSQDASGDLYTTSSQLTLPATQCLAGKSVTCHVKHYTNPSQDVTVPCPVPSTPPTPSPSTPPTPSPSCCHPRLSLHRPALEDLLLGSEANLTCTLTGLRDASGVTFTWTPSSGKSAVQGPPERDLCGCYSVSSVLPGCAEPWNHGKTFTCTAAYPESKTPLTATLSKSGNTFRPEVHLLPPPSEELALNELVTLTCLARGFSPKDVLVRWLQGSQELPREKYLTWASRQEPSQGTTTFAVTSILRVAAEDWKKGDTFSCMVGHEALPLAFTQKTIDRLAGKPTHVNVSVVMAEVDGTCY
(SEQ ID NO:23)
A쇄는 약 55kD의 분자량을 가지고 CD3의 가용성 엡실론쇄(10977-H08H, Sino Biological), 또는 T 세포에 결합할 수 있다.
f. B쇄는 인간 α쇄의 (Gly4Ser)-경첩-CA2-CA3와 융합된 cMyc 태그를 가진다:
GEQKLISEEDLGGGGSTPPTPSPSTPPTPSPSCCHPRLSLHRPALEDLLLGSEANLTCTLTGLRDASGVTFTWTPSSGKSAVQGPPERDLCGCYSVSSVLPGCAEPWNHGKTFTCTAAYPESKTPLTATLSKSGNTFRPEVHLLPPPSEELALNELVTLTCLARGFSPKDVLVRWLQGSQELPREKYLTWASRQEPSQGTTTFAVTSILRVAAEDWKKGDTFSCMVGHEALPLAFTQKTIDRLAGKPTHVNVSVVMAEVDGTCY
(SEQ ID NO:24)
B쇄는 약 28kD의 분자량을 가지고 항-myc 단일클론 항체 9E4 또는 다른 항-myc 항체에 결합할 수 있다.
g. 대안의 B쇄는 인간 알파쇄의 경첩-CA2와 융합된 CrossMabVH -CL (VH+CL) 리툭시맙(항-CD20)에 대한 전장 α쇄를 가진다:
QVQLQQPGAELVKPGASVKMSCKASGYTFTSYNMHWVKQTPGRGLEWIGAIYPGNGDTSYNQKFKGKATLTADKSSSTAYMQLSSLTSEDSAVYYCARSTYYGGDWYFNVWGAGTTVTVSASVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGECPVPSTPPTPSPSTPPTPSPSCCHPRLSLHRPALEDLLLGSEANLTCTLTGLRDASGVTFTWTPSSGKSAVQGPPERDLCGCYSVSSVLPGCAEPWNHGKTFTCTAAYPESKTPLTATLSKSGNTFRPEVHLLPPPSEELALNELVTLTCLARGFSPKDVLVRWLQGSQELPREKYLTWASRQEPSQGTTTFAVTSILRVAAEDWKKGDTFSCMVGHEALPLAFTQKTIDRLAGKPTHVNVSVVMAEVDGTCY
(SEQ ID NO:25)
B쇄는 약 55kD의 분자량을 가지고 CD20 양성 B 세포에 결합할 수 있다.
h. 상이한 경쇄 커플링
i. 천연 키메라 OKT3 카파쇄
QIVLTQSPAIMSASPGEKVTMTCSASSSVSYMNWYQQKSGTSPKRWIYDTSKLASGVPAHFRGSGSGTSYSLTISGMEAEDAATYYCQQWSSNPFTFGSGTKLEINRAVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
(SEQ ID NO:26)
j. 리툭시맙에 대한 CrossMabVL -CH1
QIVLSQSPAILSASPGEKVTMTCRASSSVSYIHWFQQKPGSSPKPWIYATSNLASGVPVRFSGSGSGTSYSLTISRVEAEDAATYYCQQWTSNPPTFGGGTKLEIKSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSC
(SEQ ID NO:27)
경쇄는 약 25kD의 분자량을 가진다.
k. 상이한 발현 벡터에 대한 상이한 선택 마커
상이한 선택 마커가 동시-형질감염을 위하여 사용된 상이한 발현 벡터에서 사용된다. IgA 생성과 관련된 모든 필요한 발현 벡터를 적합화하기 위하여 다중 약물을 세포의 선택에 사용한다. 특정 DNA를 이들 벡터에 클로닝하기 위하여 표준 분자 생물학 기술을 이용한다.
l. 알파쇄는 제오신 선택을 사용한다 (ant-zn-1, Invivogen). 제오신을 100 μg/ml의 농도로 사용한다. Sh bsr 유전자를 포함하는 플라스미드로 형질감염시킨 후, 안정한 형질감염체를 선택하기 위하여 세포를 100 μg/ml의 제오신을 포함하는 Opti-CHO 배지에서 항온처리한다.
m. 카파쇄는 블라스티시딘 S 선택을 사용한다 (ant-bl-1, Invivogen). 블라스티시딘 S를 10㎍/ml의 농도로 사용한다. bsr 유전자를 포함하는 플라스미드로 형질감염시킨 후, 안정한 형질감염체를 선택하기 위하여 세포를 10 μg/ml의 블라스티시딘 S를 포함하는 Opti-CHO 배지에서 항온처리한다.
n. 단백질 발현, 정제 및 특징분석
o. 형질감염
p. 동등한 몰비 또는 가변 몰비(5 내지 10 배 차이)의 여러 상이한 발현 벡터를 가령 293 세포 또는 CHO 세포와 같은 포유류 세포에 동시-형질감염시켜 IgA를 제조한다. 발현 벡터에 대한 DNA를 PEI와 혼합한 다음 CHO-S 세포에 첨가한다. CHO-S 세포를 사용한 PEI 형질감염은 확립된 기술에 따라 수행된다("Biotechnology and Bioengineering, Vol 87, 553-545" 참조).
q. 단백질 정제
r. Jacalin-Agarose (Catalog # gel-jac-5, Invivogen)
형질감염된 CHO-S 세포 상청액으로부터 얻은 IgA 단백질을 제조업자의 프로토콜에 따라 친화성 Jacalin-Agarose에 의하여 정제한다.
s. Capto-L (Catalog 17-5478-01, GE Healthcare)
CHO-S 세포 상청액 중의, 카파쇄를 포함하는 형질감염된 IgA 단백질을 제조업자의 프로토콜에 따라 Capto-L 친화성 매트릭스에 의하여 정제한다.
t. 겔 전기영동
u. 비환원 SDS PAGE
v. 비환원 SDS PAGE는 천연 IgA 및 이의 엔지니어링된 형태를 크기에 따라 분리한다. 동종이합체형 중쇄(AA)와 이들의 경쇄로 구성된 IgA가 대략 160 kDa 분자량의 단백질 띠를 생성한다. 예를 들어 cMyc-tagged-IgA-Fc를 가지는 더 짧은 버전의 동종이합체형 중쇄(BB)로 구성된 동종이합체형 IgA가 현저하게 더 작은 분자량의 단백질 띠를 생성한다. 이종이합체형 중쇄(AB)로 구성된 IgA가 BB보다 크고 AA보다 작은 분자량을 가지는 다중 단백질을 생성한다.
w. 겔에 로딩하기 전에 25℃에서 30 분 동안 NuPage LDS 샘플 버퍼(Life Technologies)를 IgA 단백질 샘플에 첨가한다. NativePage Novex 3-12% 비스-트리스 겔(Life Technologies)을 Novex 트리스-아세테이트 SDS 러닝 버퍼(Life Technologies)와 함께 사용한다. 염료 전방이 겔의 바닥에 도달할 때까지 겔을 전개시킨다.
x. 환원 SDS-PAGE
y. NuPage LDS 샘플 버퍼(Life Technologies) 및 NuPage 환원제 디티오트레이톨(Life Technologies)을 IgA 단백질 샘플에 첨가하고 NuPage Novex 4-12% 비스-트리스 겔(Life Technologies, cat# NP0322)에서 로딩하기 전에 80℃까지 10 분 동안 가열한다. 겔 전기영동을 위하여 NuPage MES SDS 러닝 버퍼(Life Technologies, cat# NP0002)를 사용한다. 염료 전방이 겔의 바닥에 도달할 때까지 겔을 전개시킨다.
z. 전기영동이 완료된 후, 장치로부터 겔을 제거하고 Colloidal Blue Staining(Life Technologies, manual #LC6025)를 사용하여 겔을 염색한다
aa. 겔 밴드 정량
단백질 겔을 건조한 다음, 이미지 스캐너를 사용하여 디지털화한다. 겔 이미지를 이미지 J 프로그램으로 가공하고, 특정 밴드 내 단백질의 양이 겔 정량 기능을 이용하여 결정될 수 있다
bb. 이중-특이적 제제 중의 다양한 mAbs를 동정/정량하기 위한 질량분석.
cc. 시차 주사 열량계법(DSC)을 이용한 안정성 분석
dd. 이중특이적 기능 분석
ee. 두 리간드에 대한 ELISA 분석
OKT3(A쇄) 및 cMyc 펩타이드(B쇄)를 가지는 IgA를 가용성 CD3엡실론 단백질 포획 및 항-cMyc (9E10) 검출을 포함하는 ELISA 분석에 의하여 검사한다. 가용성 CD3엡실론 단백질을 150 mM NaHCO3 중의 2 mg/ml로 ELISA 플레이트에 코팅하고 이어서 PBS 중의 3% BSA로 차단한다. 형질감염된 IgA-OKT3-cMyc를 포함하는 상청액(100 μl)을 차단된 ELISA 플레이트에 4 시간 동안 25℃에서 첨가한다. PBS로 세척한 후, 9E10 항체를 실온에서 2 시간 동안 ELISA 플레이트에 첨가한다. 항-마우스 IgG-HRP를 PBS로 세척한 후 첨가한다. 이중특이적 IgA의 존재는 HRP 기질을 첨가한 후 OD 450에서 판독하여 검출된다.
ff. 표적 결합의 FACS 분석
항체를 T 세포주(Peer, 양성 세포주) 및 B 세포주(Daudi, 음성 대조 세포주)에 결합시켜, T 세포에 결합하는 IgA-OKT3-cMyc를 확인한다. 세척 후, 로다민-표지된 9E10을 세포 현탁액에 첨가한다. CD3 항원 존재 또는 부재에서 양성 및 음성 대조된 세포 양자의 MFI에 의하여 세포 표적 결합을 검출한다.
gg. 이중특이적 결합에 대한 형광 현미경법 검사
각각의 세포 유형에 대하여 두 가지 상이한 생체 염료에 의하여 사전-표지된 CD3-양성 세포 및 CD20-음성 세포의 두 집단을 함께 규합하는 능력에 의하여 설계된 CD3xCD20 이중특이적 IgA의 이중특이적 결합을 입증한다. 예를 들어:
hh. CD3-양성 세포주(Jurkat)에 대하여 표지하는 녹색 형광 사이토졸 생체 염료(CellTrace™ Calcein Green AM)
ii. 적색 형광 사이토졸 생체 염료(CellTrace™ Calcein Red-Orange, AM) 표지된 CD20-양성 B-세포 세포주(Daudi)
실시예 2
폐로의 이중특이적 이합체형 IgA 이동(trafficking)
폐에 전달될 이중특이적, 이합체형 IgA의 능력이 다양한 방법에 의하여 조사될 수 있다. 예를 들어, 3-4 주령 암컷 BALB/c 마우스의 그룹에게 최대 50 mg/kg의 용량으로 PBS 중의 인간 IgG1/카파 또는 이합체형 IgA/카파를 IV 주사한다. 대안으로, 인간 또는 마우스 항-CD20 항체를 사용할 수 있다. 주사 후 4 hr에, 혈액 샘플을 수집하고 혈장에 대하여 가공한다. 희생 직전에, 마우스를 마취하고 방혈시킨다. 경부 림프절을 제거한 후, 기관을 노출시키고 상부 기관 및 비강을 200 μL의 PBS로 세척하여 코세척 샘플을 수집한다. 카테터를 기관에 삽입하고 폐를 1 mL PBS로 세 번 세척하여 기관지 폐포세척액(Bronchoalveolar lavage, BAL) 샘플을 수집한다 (총 3 mL, 원심분리에 의하여 맑아짐). 수집 후 단백분해효소 억제제 페닐메틸설폰일 플루오라이드를 모든 샘플에 1 mM의 농도로 첨가하고, 모든 샘플을 분석 시까지 -20℃ 이하에 보관한다.
각각의 샘플 중의 테스트 항체의 농도를 ELISA에 의하여 검사한다. 간략하게, 마우스 Ig와 교차흡수된 염소 다중클론 항-인간 카파 경쇄 항체를 96-웰 ELISA 플레이트의 웰에 밤새 4C에서 코팅한 다음 미반응 부위를 3% 소 혈청 알부민 함유 PBS로 차단한다. 대안으로, 플레이트를 인간 CD20의 가용성 형태로 코팅할 수 있다. 세척 후, 연속 희석한 테스트 샘플 및 표준을 플레이트에 도포하고 1 hr 동안 37C에서 항온처리한다. 이후 플레이트를 0.05% Tween 20 함유 PBS로 세척하고 마우스 Ig에 대하여 교차흡수된 알칼리성 인산분해효소-접합된 경쇄-특이적 염소 항-인간 IgG 또는 IgA와 함께 항온처리한다. 마우스 테스트 항체에 대하여, 고정된 CD20이 포획에 사용될 것이고, 알칼리성 인산분해효소-접합된 중쇄-특이적 염소 항-마우스 IgG 또는 IgA가 검출에 사용될 것이다. 플레이트를 p-니트로페닐 포스페이트로 현상하고 405 nm의 광학 밀도(OD)에서 판독한다. IgA 및 IgG 표준 곡선으로부터 얻은 결과에 기초하여, 각각의 샘플 중의 테스트 항체의 농도를 계산한다.
실시예 3
RSV F 및 G 항원에 대한 이중특이적 이합체형 IgA 항체
인간 호흡기 세포융합 바이러스(RSV)는 중증 하기도 질환을 야기하는 편재하는 호흡기 바이러스이고 영유아 및 노인에 있어서 폐렴 및 기관지염의 주요 원인이다. 호흡기 세포융합 바이러스 (RSV) 바이리온의 표면 상의 두 가지 주요 당단백질인, 부착 당단백질(G) 및 융합 당단백질(F)이 감염의 초기 단계를 제어한다. G는 기도의 섬모세포를 표적으로 하고, F는 바이리온 막을 표적 세포막과 융합시킨다.
본 실시예에 따르면, RSV F 단백질에 결합할 수 있는 서열을 가지는 한 중쇄 및 경쇄 조합 및 RSV G 단백질에 결합할 수 있는 서열을 가지는 또 다른 중쇄 및 경쇄 조합으로 이루어진 고유한 이합체형 IgA 분자가 엔지니어링된다. 실시예 1에 기재된 기술을 이용한 이들 항체의 발현이, RSV F에 대한 둘의 결합 모이어티 및 RSV G에 대한 둘의 결합 모이어티를 가지는 단일 IgA 분자를 야기할 것이다.
표 1에 나열된 세트 #1, 놉, CA3 #1 돌연변이(굵게 강조됨)를 포함하는 이중특이적 인간 항-RSV IgA2 항체의 RSV G-결합 모이어티의 중쇄 가변 영역 서열이, SEQ ID NO: 10으로 나타난다. RSV G 단백질-결합 모이어티의 인간 카파 경쇄 가변 영역 서열이 SEQ ID NO: 11로 나타난다.
세트 #1, 홀, CA3 #2, CA1 돌연변이를 포함하는, 엔지니어링된 IgA2 항체 중쇄(SEQ ID NO: 8)에 융합된 이중특이적 항체의 항-RSV F 단백질-결합 모이어티의 가변 경쇄 영역 서열의 크로스맵 버전이 SEQ ID NO: 12로 나타난다. 엔지니어링된 카파 불변 경쇄 도메인(SEQ ID NO: 9)에 융합된 항-RSV F 단백질-결합 모이어티의 가변 중쇄 영역 서열의 크로스맵 버전이 SEQ ID NO: 13으로 나타난다.
RSV G 및 RSV F 항원에 대한 결합 특이성을 가지는 이중특이적 항-RSV IgA 항체의 결합이, 특이적 항원 및 이중특이적 항체의 성질에 따라 시약이 변성됨을 제외하고, 본질적으로 실시예 1.ee에 기재된 바와 같이 평가된다. 예를 들어, F-단백질 및 G-단백질에 결합하는 RSV 이중특이적 IgA 항체를 평가하기 위한 ELISA에서, RSV F-단백질(또는 이의 적절한 단편)이 고정되고 ELISA 포획에 사용되는 한편 바이오틴화 가용성 RSV G-단백질(또는 이의 적절한 단편)이 검출에 사용된다. 대안으로, 포획을 위하여 G-단백질을 사용할 수 있고 검출을 위하여 가용성 바이오틴화 F-단백질을 사용할 수 있다. 이중특이적 IgA의 존재는 Avidin-HRP 및 기질을 첨가한 후 OD 450nm에서 판독하여 검출된다.
RSV의 배양 및 시험관내 RSV 바이러스 중화 검사가 다양한 표준 기술, 가령 US7736648에 기재된 것을 이용하여 수행될 수 있다. 간략하게, HEp2 세포를 12-웰 플레이트에 2 x 105 세포/웰로 도말한다. 다음 날, 항체의 연속 희석물을 배지에서 생성한다. 대략 200 PFU/웰의 RSV를 토끼 보체 혈청의 존재에서 항체에 첨가하고 실온에서 한 시간 동안 항온처리한다. 이후 항체-바이러스 혼합물을 HEp2 세포에 200 uL/웰로 첨가하고 감염되도록 2 hr 동안 실온에서 항온처리한다. 이러한 감염 기간 이후, 배지를 제거하고 1% 메틸 셀룰로스를 함유하는 배지를 모든 웰에 첨가한다. 플레이트를 35 도씨에서 6 일 동안 항온처리하고, 그 후, 플라크 수 결정을 위하여 세포를 다음과 같이 고정하고 염색한다: 메틸 셀룰로스를 세포층으로부터 흡인하고, 세포를 100% 메탄올 중에서 30 min 동안 실온에서 고정한다. 이후 플레이트를 PBS 중의 5% 밀크로 3회 세척한다. 1차 항체를 1:500 희석으로 (염소 항-RSV 다중클론 항체 (Chemicon Cat#AB1128)) PBS+5% 우유 단백질에 1 hr 동안 첨가한다. 플레이트를 PBS 중의 5% 우유로 3회 다시 세척한다. 이후 2차 항체를 1:500 희석으로 PBS 중의 5% 우유 단백질에 (과산화효소 접합된 ImmunoPure 토끼 항-염소 항체 IgG (H+L)) (Thermo Scientific, Cat#31402)) 1 hr 동안 첨가한다. 플레이트를 1x PBS로 3회 세척한다. 플라크를 웰당 200 uL 1-단계 클로로나프톨 기질(Pierce, Cat#34012)을 10 min 동안 첨가하여 시각화한다. 플레이트를 물로 헹구고 공기 건조되도록 한다. 플라크를 각각의 웰에서 수동 검사로 계수한다.
생체내 RSV 중화 연구를 다양한 표준 기술, 가령 Collarini et al 2009 (J. Immunol. 183_6338-6345)에 기재된 마우스 예방 연구를 이용하여 수행할 수 있다. 간략하게, 암컷 BALB/c 마우스, 6-8 주령의 그룹에게, 최대 50 mg/kg의 용량으로 테스트될 항체(이중특이적 IgA 항체 그리고 양성 및 음성 대조군)를 주사한다. 24시간 후(예방 모델), 마우스를 106 PFU의 RSV Long 균주 바이러스로 비강내 감염시킨다. 대안으로, 항체가 바이러스 시험감염(치료 모델) 후 최대 수일 투여될 수 있다. 5 일 후, 동물을 희생시키고 이들의 폐를 잘라낸다. 바이러스 부하를 (i) 폐조직 그램당 PFU, 또는 (ii) Trizol 추출 키트(Invitrogen)를 사용한 폐조직으로부터의 RNA 추출 이후의 정량적 PCR에 의하여 5일 째에 정량화한다. 바이러스 N-유전자 복제수는 조직 샘플의 액틴 mRNA 함량의 퍼센트로서 표현된다. 대조 동물은 임의의 항-RSV mAb를 받지 않거나 비-면역 동형 대조 mAb를 받는다.
실시예 4
인플루엔자 항원에 대한 이중특이적 이합체형 IgA 항체
인플루엔자 감염("인플루엔자" 또는 "플루"로도 지칭됨)은 인간 및 가축의 가장 흔한 질환 중 하나이다. 세 유형의 인플루엔자 바이러스(A, B 및 C 형)가 질환을 초래한다. 인플루엔자 바이러스 표면 당단백질 헤마글루티닌(HA) 및 뉴라미니데이즈(NA)는 광범한 항원 변동성을 나타내고, 인플루엔자 아형 분류 기준이다. HA는 바이리온 외피의 표면에 나타나고, 세포로의 바이러스 진입에 연관된다. HA는 최초에 약 560 아미노산의 단일 폴리펩타이드 사슬(HA0)로서 합성되며, 이는 차후 단백질분해 분열되어 둘의 서브유닛, HA1 및 HA2를 형성하는 막관통 단백질이다. 서브유닛은 다이설파이드 결합을 통하여 연결된 채로 유지되며, 단백질은 감염된 세포 및 바이리온의 표면에 동종삼합체로서 나타난다. RA Lamb, RM Krug, Orthomyxoviridae: the viruses and their replication. (DM Knipe, PM Howley, DE Griffin (Eds.) et al., Fields Virology, 4th edn., Lippincott Williams & Wilkins, 2001, pgs. 1487 - 1531 참조). HA1은 Ha의 구상 헤드 영역을 형성하고, HA 아형 중 항원 변동성의 대부분을 담당한다. HA1은 숙주 세포 상의 바이러스 수용체와 상호작용한다. HA2는 바이러스 스파이크의 섬유상 줄기를 형성하고, 바이리온 외피와 숙주 세포막 사이의 융합에 연관된 것으로 생각된다.
본 실시예에 따르면, 인플루엔자 A 바이러스의 HA 서브유닛 상의 두 가지 상이한 항원에 결합할 수 있는 서열을 가지는 하나의 중쇄 및 경쇄 조합으로 이루어진 이합체형 IgA 분자가 엔지니어링된다. 실시예 1에 기재된 기술을 이용한 이들 항체의 발현이, 각각의 HA 에피토프에 대하여 둘의 결합 모이어티를 가지는 단일 IgA 분자를 야기할 것이다. 대안으로, HA 및 NA 상의 에피토프에 지향된 이중특이적 IgA 항체가 작제될 수 있다.
표 1에 나열된 세트 #1, 놉, CA3 #1 돌연변이(굵게 강조됨)를 포함하는 이중특이적 인간 항-인플루엔자 IgA 항체의 제1 HA 결합 모이어티의 중쇄 가변 영역 서열이, SEQ ID NO: 14로 나타난다. 중쇄 가변 영역과 연합된 인간 카파 경쇄 가변 영역 서열이 SEQ ID NO: 15로 나타난다.
세트 #1, 홀, CA3 #2, CA1 돌연변이를 포함하는, 엔지니어링된 IgA2 항체 중쇄(SEQ ID NO: 8)에 융합된 이중특이적 항체의 제2 HA 결합 모이어티의 가변 경쇄 영역 서열의 크로스맵 버전이 SEQ ID NO: 16으로 나타난다. 엔지니어링된 카파 불변 경쇄 도메인(SEQ ID NO: 9)에 융합된 제2 HA 결합 모이어티의 가변 중쇄 영역 서열의 크로스맵 버전이 SEQ ID NO: 17로 나타난다.
두 항원에 대한 이중특이적 항-인플루엔자 IgA 항체의 결합이, 특이적 항원 및 이중특이적 성질에 따라 시약이 변성됨을 제외하고, 본질적으로 실시예 1에 기재된 바와 같이 평가된다. 예를 들어, HA 및 NA에 결합하는 플루 이중특이적 IgA를 평가하기 위한 ELISA에서, 하나의 플루 단백질 또는 펩티다이드가 고정되고 ELISA 포획에 사용되는 한편 상이한 플루 단백질 또는 펩티다이드가 바이오틴화되고 검출에 사용된다. 이중특이적 IgA의 존재는 Avidin-HRP 및 기질을 첨가한 후 OD 450nm에서 판독하여 검출된다.
플루 바이러스의 배양 및 시험관내 플루 바이러스 중화 검사가 다양한 표준 기술, 가령 Throsby et al. 2008 (PLoS One 3,e3942)에 기재된 것을 이용하여 수행될 수 있다. 간략하게, MDCK 세포를 10 % 소태아혈청(FCS) 및 1% 페니실린-스트렙토마이신(PS)이 보충된 최소 필수영양 배지(MEM)에 37ºC에서 유지시킨다. 실험 당일에, 96-웰 포맷 내의 MDCK 세포를 PBS로 두 번 세척하고 1% FCS, 1% PS 및 1 mg/ml TPCK 트립신이 보충된 MEM에서 항온처리한다 (비-H5 바이러스에 대하여). 2-배 연속 희석된 항체를 동등한 부피의 바이러스 접종물과 혼합하고, 이어서 37ºC에서 2 시간 항온처리한다. 항온처리 후, 혼합물(~ 100 TCID50)을 합류하는 MDCK 단일층에 첨가한다. 세포병변효과(cytopathic effect, CPE)의 검사 전에 세포를 72 시간 동안 배양한다. CPE를 양성 대조군(바이러스-접종 세포) 및 음성 대조군(모의-접종 세포)과 비교한다. 개별적인 웰 내의 CPE 부재가 보호로 정의된다.
생체내 보호 연구를 다양한 표준 기술, 가령 Throsby et al. 2008 (PLoS One 3,e3942)에 기재된 것을 이용하여 수행할 수 있다. 간략하게, 암컷 BALB/c 마우스, 7 주령의 그룹에게, 최대 50 mg/kg의 용량으로 테스트될 항체(이중특이적 IgA 항체 그리고 양성 및 음성 대조군)를 IP 주사한다 (예방 모델). 24 시간 후, 마우스에게 치사용량의 바이러스(전형적으로 10x 내지 25x LD50)로 비강내 접종한 후 21 일 동안 관찰한다. 대안으로, 항체가 바이러스 시험감염(치료 모델) 후 최대 수일 투여될 수 있다. 생존하는 그대로, 임상징후를 점수화 체계(0=임상징후 없음; 1=거친 외피; 2=거친 외피, 덜 반응성, 취급 동안 수동적임; 3=거친 외피, 웅크림, 호흡 곤란, 취급 동안 수동적임; 4=거친 외피, 웅크림, 호흡 곤란, 비반응성)로써 점수를 매기고 기록한다. 체중이 또한 모니터링될 수 있다. 대조 동물은 전형적으로 시험감염 후 12 내지 15 일 이내에 사망한다.
실시예 5
클로스트리듐 디피실레 독소 A 및 B에 대한 이중특이적 이합체형 IgA 항체
앞서 기재한 바와 같이, 클로스트리듐 디피실레는 보통 인간 장내 마이크로바이옴의 부차적 성분인 그람 양성 박테리아를 형성하는 포자이다. 그러나, 항생제 치료를 받는 고령자, 영유아 또는 면역 억제 개체에서, 씨. 디피실레가 전격성이 되어 중증 설사, 결장염 및 사망을 유발할 수 있다. 씨. 디피실레 감염의 관리는 초기 항생제의 중단 및 메트로니다졸, 반코마이신 또는 피닥소마이신을 사용한 치료를 포함한다. 흔히 초기 치료가 성공적이지만, 환자가 30% 비율로 치료에 대한 불완전한 반응 또는 감염의 재발을 겪는다. 따라서, 더욱 효과적인 치료 양식에 대한 필요성이 크다.
본 실시예에 따르면, 씨. 디피실레 독소 A에 결합하고 이를 중화시킬 수 있는 서열을 가지는 하나의 중쇄 및 경쇄 조합 및 독소 B에 결합하여 이를 중화시키도록 설계된 제2 중쇄 및 경쇄 조합으로 이루어진 고유한 이합체형 IgA 분자가 엔지니어링된다. 본원에 기재된 기술을 이용하는 (실시예 1 참조) 이들 항체의 발현은 독소 A에 대한 둘의 결합 모이어티 및 독소 B에 대한 둘의 결합 모이어티를 가지는 단일 IgA 분자를 생성할 것이고 이는 전신 투여시 씨. 디피실레 감염의 장 부위에 효과적으로 이동할 수 있다. 그러한 고유한 IgA 분자는 씨. 디피실레 재발성 감염의 치료에 대한 개선된 용량 반응을 가질 것이거나 생명을 위협하는 씨. 디피실레 질환을 가지는 대상의 초기 치료의 유효도를 개선할 것이다.
표 1에 나열된 세트 #1, 놉, CA3 #1 돌연변이(굵게 강조됨)를 포함하는 이중특이적 인간 항-씨. 디피실레 항체의 독소 A 결합 모이어티의 중쇄 가변 영역 서열이 SEQ ID NO: 18로 나타난다. 중쇄 가변 영역과 연합된 인간 카파 경쇄 가변 영역 서열이 SEQ ID NO: 19로 나타난다.
세트 #1, 홀, CA3 #2, CA1 돌연변이를 포함하는, 엔지니어링된 IgA2 항체 중쇄(SEQ ID NO: 8)에 융합된 이중특이적 항체의 독소 B 결합 모이어티의 가변 경쇄 영역 서열의 크로스맵 버전이 SEQ ID NO: 20으로 나타난다. 엔지니어링된 카파 불변 경쇄 도메인(SEQ ID NO: 9)에 융합된 독소 B 결합 모이어티의 가변 중쇄 영역 서열의 크로스맵 버전이 SEQ ID NO: 21로 나타난다.
두 항원에 대한 이중특이적 항-씨. 디피실레 IgA 항체의 결합이, 특이적 항원 및 이중특이적 성질에 따라 시약이 변성됨을 제외하고, 본질적으로 실시예 1.ee에 기재된 바와 같이 평가된다. 예를 들어, 씨. 디피실레 독소-A 및 독소-B에 결합하는 이중특이적 IgA를 평가하기 위한 ELISA에서, 독소-A(또는 이의 적절한 단편)가 고정되고 ELISA 포획에 사용되는 한편 바이오틴화 독소-B(또는 이의 적절한 단편)가 검출에 사용된다. 대안으로, 포획을 위하여 독소-B를 사용할 수 있고 검출을 위하여 가용성 바이오틴화 독소-B를 사용할 수 있다. 이중특이적 IgA의 존재는 Avidin-HRP 및 기질을 첨가한 후 OD 450nm에서 판독하여 검출된다.
시험관내 씨. 디피실레 독소-A 및 독소-B 독소 중화 검사는 다양한 표준 기술, 가령 Babcock et al. 2006 (Infect. Immun. 74, 6339-6347)에 기재된 것을 이용하여 수행될 수 있다. 간략하게, IMR-90 폐 섬유아세포를 다양한 농도의 독소-A 또는 독소-B의 존재에서 항온처리 시, 세포가 모이고 세포 배양접시에 대한 부착성을 상실한다. 이러한 세포병변효과(CPE)를 세포의 시각적 검사로 결정하고 시각적 검사의 결과에 기초하여 CPE 점수 0-4를 결정한다. 중화를 테스트하기 위하여, IMR-90 세포를 96-웰 마이크로타이터 플레이트에서 웰당 1 x 105 세포로 접종하고 37℃에서 12 h 동안 5% CO2로 항온처리한다. 독소 A(6 ng/ml) 또는 독소 B(20 pg/ml)를 다양한 농도의 항체와 함께 1 h 동안 항온처리하고, 세포 배양에 첨가하고, 항온처리를 37℃에서 18 h 동안 계속한다. 이후 세포병변효과를 현미경으로 결정하고 0 (0% 원형화된 세포), 1 (25% 원형화된 세포), 2 (50% 원형화된 세포), 3 (75% 원형화된 세포), 또는 4 (100% 원형화된 세포)로 점수를 매기고 결과를 CPE 대 항체 용량으로 플로팅한다. 적정 곡선으로부터, 항체에 대한 IC50를 계산할 수 있다.
씨. 디피실레의 배양 및 생체내 씨. 디피실레 독소-A 및 독소-B 중화 검사는 다양한 표준 기술, 가령 Babcock et al. 2006 (Infect. Immun. 74, 6339-6347)에 기재된 햄스터 보호 모델을 이용하여 수행될 수 있다. 씨. 디피실레-유발 치사성에 대한 보호를 위하여, 시리아 골든 햄스터(70 내지 80 g)의 그룹에게 네 가지 총 용량의 항체가 복강내로 (이중특이적 IgA 항체 그리고 양성 및 음성 대조군) 씨. 디피실레 포자의 투여 이전 3일부터 시작하여 4 일 동안 주어진다. 클린다마이신(10 mg/kg)을 씨. 디피실레 포자 시험감염 이전 24 h에 복강내 투여한 다음, 햄스터를 표준 소형 동물 공급 바늘을 이용하여 구위식으로 140 B1 포자로 시험감염시킨다. 대조 동물은 전형적으로 시험감염 후 72 hrs 이내에 사망한다.
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Cys Pro Val Pro Ser 210 215 220 Thr Pro Pro Thr Pro Ser Pro Ser Thr Pro Pro Thr Pro Ser Pro Ser 225 230 235 240 Cys Cys His Pro Arg Leu Ser Leu His Arg Pro Ala Leu Glu Asp Leu 245 250 255 Leu Leu Gly Ser Glu Ala Asn Leu Thr Cys Thr Leu Thr Gly Leu Arg 260 265 270 Asp Ala Ser Gly Val Thr Phe Thr Trp Thr Pro Ser Ser Gly Lys Ser 275 280 285 Ala Val Gln Gly Pro Pro Glu Arg Asp Leu Cys Gly Cys Tyr Ser Val 290 295 300 Ser Ser Val Leu Pro Gly Cys Ala Glu Pro Trp Asn His Gly Lys Thr 305 310 315 320 Phe Thr Cys Thr Ala Ala Tyr Pro Glu Ser Lys Thr Pro Leu Thr Ala 325 330 335 Thr Leu Ser Lys Ser Gly Asn Thr Phe Arg Pro Glu Val His Leu Leu 340 345 350 Pro Pro Pro Ser Glu Glu Leu Ala Leu Asn Glu Leu Val Thr Leu Thr 355 360 365 Cys Leu Ala Arg Gly Phe Ser Pro Lys Asp Val Leu Val Arg Trp Leu 370 375 380 Gln Gly Ser Gln Glu Leu Pro Arg Glu Lys Tyr Leu Thr Trp Ala Ser 385 390 395 400 Arg Gln Glu Pro Ser Gln Gly Thr Thr Thr Phe Ala Val Thr Ser Ile 405 410 415 Leu Arg Val Ala Ala Glu Asp Trp Lys Lys Gly Asp Thr Phe Ser Cys 420 425 430 Met Val Gly His Glu Ala Leu Pro Leu Ala Phe Thr Gln Lys Thr Ile 435 440 445 Asp Arg Leu Ala Gly Lys Pro Thr His Val Asn Val Ser Val Val Met 450 455 460 Ala Glu Val Asp Gly Thr Cys Tyr 465 470 <210> 24 <211> 264 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide" <400> 24 Gly Glu Gln Lys Leu Ile Ser Glu Glu Asp Leu Gly Gly Gly Gly Ser 1 5 10 15 Thr Pro Pro Thr Pro Ser Pro Ser Thr Pro Pro Thr Pro Ser Pro Ser 20 25 30 Cys Cys His Pro Arg Leu Ser Leu His Arg Pro Ala Leu Glu Asp Leu 35 40 45 Leu Leu Gly Ser Glu Ala Asn Leu Thr Cys Thr Leu Thr Gly Leu Arg 50 55 60 Asp Ala Ser Gly Val Thr Phe Thr Trp Thr Pro Ser Ser Gly Lys Ser 65 70 75 80 Ala Val Gln Gly Pro Pro Glu Arg Asp Leu Cys Gly Cys Tyr Ser Val 85 90 95 Ser Ser Val Leu Pro Gly Cys Ala Glu Pro Trp Asn His Gly Lys Thr 100 105 110 Phe Thr Cys Thr Ala Ala Tyr Pro Glu Ser Lys Thr Pro Leu Thr Ala 115 120 125 Thr Leu Ser Lys Ser Gly Asn Thr Phe Arg Pro Glu Val His Leu Leu 130 135 140 Pro Pro Pro Ser Glu Glu Leu Ala Leu Asn Glu Leu Val Thr Leu Thr 145 150 155 160 Cys Leu Ala Arg Gly Phe Ser Pro Lys Asp Val Leu Val Arg Trp Leu 165 170 175 Gln Gly Ser Gln Glu Leu Pro Arg Glu Lys Tyr Leu Thr Trp Ala Ser 180 185 190 Arg Gln Glu Pro Ser Gln Gly Thr Thr Thr Phe Ala Val Thr Ser Ile 195 200 205 Leu Arg Val Ala Ala Glu Asp Trp Lys Lys Gly Asp Thr Phe Ser Cys 210 215 220 Met Val Gly His Glu Ala Leu Pro Leu Ala Phe Thr Gln Lys Thr Ile 225 230 235 240 Asp Arg Leu Ala Gly Lys Pro Thr His Val Asn Val Ser Val Val Met 245 250 255 Ala Glu Val Asp Gly Thr Cys Tyr 260 <210> 25 <211> 479 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide" <400> 25 Gln Val Gln Leu Gln Gln Pro Gly Ala Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr 20 25 30 Asn Met His Trp Val Lys Gln Thr Pro Gly Arg Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 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Claims (76)

  1. 둘의 결합 유닛 및 최소 둘의 결합 특이성을 포함하는 다중-특이적 결합 분자에 있어서, 상기 결합 유닛 각각은 결합 표적으로의 결합 영역에 접합된 둘의 IgA 중쇄 불변 영역 서열을 포함하는 다중-특이적 결합 분자.
  2. 제1항에 있어서, 이중특이적인 다중-특이적 결합 분자.
  3. 제2항에 있어서, 상기 결합 유닛 각각은 단일특이적이고 (AA, BB), 각각 상이한 결합 표적(각각 A 및 B)에 결합하는 다중-특이적 결합 분자.
  4. 제2항에 있어서, 상기 둘의 결합 유닛 중 하나는 단일특이적이고 (AA) 다른 결합 유닛은 이중특이적이며, 이중특이적 결합 유닛의 결합 특이성 중 하나는 단일특이적 결합 유닛의 결합 특이성과 동일한 (AB) 다중-특이적 결합 분자.
  5. 제2항에 있어서, 상기 결합 유닛 각각은 이중특이적이고, 각각 동일한 둘의 결합 특이성을 가지는 (AB, AB) 다중-특이적 결합 분자.
  6. 제1항에 있어서, 상기 결합 유닛 각각은 이중특이적이고, 결합 분자는 셋의 결합 특이성을 가지는 (AB, AC) 다중-특이적 결합 분자.
  7. 제1항에 있어서, 상기 결합 유닛 각각은 이중특이적이고, 결합 분자는 넷의 결합 특이성을 가지는 (AB, CD) 다중-특이적 결합 분자.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, IgA 항체이고, 상기 결합 영역 서열은 IgA 중쇄 가변 영역 서열을 포함하는 다중-특이적 결합 분자.
  9. 제8항에 있어서, IgA1인 다중-특이적 결합 분자.
  10. 제9항에 있어서, SEQ ID NO: 1의 중쇄 불변 영역 서열을 포함하는 다중-특이적 결합 분자.
  11. 제8항에 있어서, IgA2인 다중-특이적 결합 분자.
  12. 제11항에 있어서, SEQ ID NO: 2의 중쇄 불변 영역 서열을 포함하는 다중-특이적 결합 분자.
  13. 제8항에 있어서, 말단-대-말단 배열의 둘의 IgA 결합 유닛을 포함하고, 이들 각각은 IgA 중쇄 가변 영역 서열에 융합된 IgA 중쇄 불변 영역 서열을 포함하는 다중-특이적 결합 분자
  14. 제9항에 있어서, IgA J 영역을 추가로 포함하는 다중-특이적 결합 분자
  15. 제14항에 있어서, 상기 J 영역은 SEQ ID NO: 3의 서열을 포함하는 다중-특이적 결합 분자.
  16. 제8항에 있어서, 상기 IgA 중쇄 불변 영역 서열은 최소 하나의 CA3 도메인을 포함하는 다중-특이적 결합 분자.
  17. 제16항에 있어서, 둘의 결합 유닛 중 최소 하나에서 IgA 중쇄 가변 영역 서열과 연합된 최소 하나의 IgA 경쇄 가변 영역 서열을 추가로 포함하는 다중-특이적 결합 분자.
  18. 제16항에 있어서, 둘의 결합 유닛 각각에서 IgA 중쇄 가변 영역 서열과 연합된 IgA 경쇄 가변 영역 서열을 포함하는 다중-특이적 결합 분자.
  19. 제16항에 있어서, 둘의 결합 유닛 중 최소 하나는 이중특이적이고, 비대칭 계면이 둘의 상이한 IgA 중쇄 불변 영역 사이에 생성되는 다중-특이적 결합 분자.
  20. 제19항에 있어서, 비대칭 계면은 놉-인투-홀 커플링 및/또는 염 다리 커플링에 의하여 생성되는 다중-특이적 결합 분자.
  21. 제20항에 있어서, 비대칭 계면은 표 1 및 2에 제시된 하나 이상의 변형에 의하여 생성되는 다중-특이적 결합 분자.
  22. 제17항 또는 제18항에 있어서, 상기 경쇄 가변 영역 서열은 경쇄 및 중쇄 사이의 비대칭 계면 생성에 의하여 이의 매칭 중쇄 가변 영역에 커플링되는 다중-특이적 결합 분자.
  23. 제22항에 있어서, 비대칭 계면은 크로스맵 기술, 놉-인투-홀 커플링 및/또는 염 다리 커플링에 의하여 생성되는 다중-특이적 결합 분자.
  24. 제1항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서, 독소에 접합되는 다중-특이적 결합 분자.
  25. 제1항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서, 화학요법제에 접합되는 다중-특이적 결합 분자.
  26. 제24항 또는 제25항에 있어서, 접합은 융합에 의한 것인 다중-특이적 결합 분자.
  27. 제24항 또는 제25항에 있어서, 접합은 화학적 링커에 의한 것인 다중-특이적 결합 분자.
  28. 제8항 내지 제27항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 IgA 항체는 키메라 또는 인간화 항체인 다중-특이적 결합 분자.
  29. 호흡기 세포융합 바이러스(RSV)의 여러 상이한 항원에 특이적으로 결합하는 다중-특이적 이합체형 IgA 항체.
  30. 제29항에 있어서, 이중특이적인 다중-특이적 이합체형 IgA 항체.
  31. 제30항에 있어서, RSV F에 대한 둘의 결합 모이어티 및 RSV G에 대한 둘의 결합 모이어티를 포함하는 다중-특이적 이합체형 IgA 항체.
  32. 제31항에 있어서, RSV G에 대한 결합 모이어티는 SEQ ID NO: 10의 중쇄 가변 영역 서열 및 SEQ ID NO: 11의 경쇄 가변 영역을 포함하는 다중-특이적 이합체형 IgA 항체.
  33. 제31항 또는 제32항에 있어서, RSV F에 대한 결합 모이어티는 SEQ ID NO: 12의 중쇄 가변 영역 서열 및 SEQ ID NO: 13의 경쇄 가변 영역 서열을 포함하는 다중-특이적 이합체형 IgA 항체.
  34. 상이한 인플루엔자 A 바이러스 항원에 특이적으로 결합하는 다중-특이적 이합체형 IgA 항체.
  35. 제34항에 있어서, 각각의 인플루엔자 A 바이러스 항원에 대한 둘의 결합 모이어티를 포함하는 이중특이적인 다중-특이적 이합체형 IgA 항체.
  36. 제35항에 있어서, 제1 인플루엔자 A 바이러스 항원에 대한 결합 모이어티는 SEQ ID NO: 14의 중쇄 가변 영역 서열 및 SEQ ID NO: 15의 경쇄 가변 영역 서열을 포함하는 다중-특이적 이합체형 IgA 항체.
  37. 제35항 또는 제36항에 있어서, 제2 인플루엔자 A 바이러스 항원에 대한 결합 모이어티는 SEQ ID NO: 16의 제1 가변 영역 서열을 포함하는 다중-특이적 이합체형 IgA 항체.
  38. 제35항 내지 제37항 중 어느 한 항에 있어서, 제2 인플루엔자 A 바이러스 항원에 대한 결합 모이어티는 SEQ ID NO: 17의 제2 가변 영역 서열을 포함하는 다중-특이적 이합체형 IgA 항체.
  39. 클로스트리듐 디피실레(씨. 디피실레)의 상이한 항원에 특이적으로 결합하는 다중-특이적 이합체형 IgA 항체.
  40. 제39항에 있어서, 이중특이적인 다중-특이적 이합체형 IgA 항체.
  41. 제40항에 있어서, 씨. 디피실레의 독소 A에 대한 둘의 결합 모이어티 및 독소 B에 대한 둘의 결합 모이어티를 포함하는 다중-특이적 이합체형 IgA 항체.
  42. 제41항에 있어서, 독소 A에 대한 결합 모이어티는 SEQ ID NO: 18의 중쇄 가변 영역 서열을 포함하는 다중-특이적 이합체형 IgA 항체.
  43. 제42항에 있어서, 독소 A에 대한 결합 모이어티는 SEQ ID NO: 19의 경쇄 가변 영역 서열을 포함하는 다중-특이적 이합체형 IgA 항체.
  44. 제42항 또는 제43항에 있어서, 독소 B에 대한 결합 모이어티는 SEQ ID NO: 20의 제1 가변 영역 서열을 포함하는 다중-특이적 이합체형 IgA 항체.
  45. 제42항 내지 제44항 중 어느 한 항에 있어서, 독소 B에 대한 결합 모이어티는 SEQ ID NO: 21의 제2 가변 영역 서열을 포함하는 다중-특이적 이합체형 IgA 항체.
  46. 최소 약 70%의 제1항 내지 제45항 중 어느 한 항의 다중-특이적 IgA 결합 분자를 포함하는 조성물.
  47. 유효량의 제1항 내지 제45항 중 어느 한 항의 다중-특이적 IgA 결합 분자를 약제학적으로 허용되는 담체와 혼합으로 포함하는 약제학적 조성물.
  48. 제47항에 있어서, 미생물 감염의 치료를 위한 약제학적 조성물.
  49. 제48항에 있어서, 상기 미생물 감염은 박테리아 감염인 약제학적 조성물.
  50. 제49항에 있어서, 박테리아 감염은 씨. 디피실레 감염인 약제학적 조성물.
  51. 제47항에 있어서, 바이러스 감염의 치료를 위한 약제학적 조성물.
  52. 제51항에 있어서, 바이러스 감염은 호흡기 바이러스 감염인 약제학적 조성물.
  53. 제52항에 있어서, 호흡기 바이러스 감염은 인플루엔자 바이러스 감염인 약제학적 조성물.
  54. 제52항에 있어서, 호흡기 바이러스 감염은 호흡기 세포융합 바이러스(RSV) 감염인 약제학적 조성물.
  55. 제1항 내지 제27항 중 어느 한 항의 유효량의 다중-특이적 IgA 결합 분자 투여를 포함하는, 대상의 미생물 감염 치료 방법.
  56. 제55항에 있어서, 대상은 인간 환자인 방법.
  57. 제56항에 있어서, 다중-특이적 IgA 결합 분자는 IgA 항체인 방법.
  58. 제57항에 있어서, IgA 항체는 이합체형 이중특이적 IgA 항체인 방법.
  59. 제57항 또는 제58항에 있어서, 상기 IgA 항체는 인간화 또는 키메라 항체인 방법.
  60. 제55항 내지 제59항 중 어느 한 항에 있어서, 미생물 감염은 박테리아 감염인 방법.
  61. 제60항에 있어서, 박테리아 감염은 디피실레 감염인 방법.
  62. 제55항 내지 제59항 중 어느 한 항에 있어서, 미생물 감염은 바이러스 감염인 방법.
  63. 제62항에 있어서, 바이러스 감염은 호흡기 바이러스 감염인 방법.
  64. 제63항에 있어서, 호흡기 바이러스 감염은 인플루엔자 바이러스 감염인 방법.
  65. 제63항에 있어서, 호흡기 바이러스 감염은 호흡기 세포융합 바이러스(RSV) 감염인 방법.
  66. 대상의 미생물 감염 치료를 위한 의약 제조에서 제1항 내지 제27항 중 어느 한 항의 유효량의 다중-특이적 IgA 결합 분자의 용도.
  67. 제66항에 있어서, 대상은 인간 환자인 용도.
  68. 제67항에 있어서, 다중-특이적 IgA 결합 분자는 IgA 항체인 용도.
  69. 제68항에 있어서, IgA 항체는 이합체형 이중특이적 IgA 항체인 용도.
  70. 제68항 또는 제69항에 있어서, 상기 IgA 항체는 인간화 또는 키메라 항체인 용도.
  71. 제66항 내지 제70항 중 어느 한 항에 있어서, 미생물 감염은 박테리아 감염인 용도.
  72. 제71항에 있어서, 박테리아 감염은 디피실레 감염인 용도.
  73. 제66항 내지 제70항 중 어느 한 항에 있어서, 미생물 감염은 바이러스 감염인 용도.
  74. 제73항에 있어서, 바이러스 감염은 호흡기 바이러스 감염인 용도.
  75. 제74항에 있어서, 호흡기 바이러스 감염은 인플루엔자 바이러스 감염인 용도.
  76. 제73항에 있어서, 호흡기 바이러스 감염은 호흡기 세포융합 바이러스(RSV) 감염인 용도.
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