KR20080007425A - 항체 유도된 세포막 손상 - Google Patents

항체 유도된 세포막 손상 Download PDF

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니리마 엠. 배트
마르시아 엠. 비버
닐슨 엔. 에이치. 텡
마틴 이. 샌더스
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팔링겐, 인코포레이티드
더 보드 어브 트러스티스 어브 더 리랜드 스탠포드 주니어 유니버시티
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Abstract

본 발명은 세포막 손상, 세포 투과성화 및 세포 치사를 유도하는 조성물 및 방법을 제공한다. 조성물은 세포의 표면상에 존재하는 고도로 발현된 세포 표면 항원에 결합하는 다가 작용제를 포함한다. 바람직하게는, 세포 표면 항원은 세포의 세포골격과 연관되어 있다. 바람직한 다가 작용제는 IgM이며, 증진된 세포 손상 및 치사는 가교제를 첨가함으로써 제공된다. 생체내 아치사(sublethal) 농도에서, 세포 손상 항체는 세포를 투과 가능하게 하며 화학치료제에 대한 반응을 극적으로 증진시키는데, 화학치료제에 내성인 환자의 경우에도 그러하다.

Description

항체 유도된 세포막 손상{ANTIBODY INDUCED CELL MEMBRANE WOUNDING}
본 발명은 일반적으로, 세포 침투, 암 및 자가 면역 치료 등을 위한 조성물 및 방법에 관한 것이다.
세포막 손상은 세포의 원형질 막이 파괴된 것이며, 일반적으로 생존가능한 사건이다. 세포막 손상은 대동맥 또는 위장관의 내피 내막, 심근 또는 골격근의 피부 상피 또는 근세포와 같은 기계적 활동성의 포유동물 조직에서 흔히 일어나며, 또한 트리파노소마(trypanosomes)에 의한 세포의 침입 동안에도 나타난다. 실험용 셋팅에서, 세포 손상은 일반적으로 원형질막에 침투하는 마이크로니들(microneedle)을 사용하거나, 배양 접시를 스크래치하여 세포 일부를 절단하므로써와 같이 세포막을 인렬시키는 기계적 수단을 사용하여 유도된다.
상기 막에서 1㎛ 초과의 인렬과 같은 큰 파열에 대해, 막을 회복시키고, 세포 생존력을 유지시키기 위해 신속한 재봉합(resealing) 반응이 요구된다. 초기에 수동 과정인 것으로 여겨졌던 재봉합 과정은 에너지 및 칼슘 의존성 과정으로 막 인렬을 패치하는 칼슘 의존성 엑소사이토틱(exocytotic) 소포-소포 및 원형질막-소포 융합체를 형성시키는 것으로 인지되어 있다. 막 패치를 제공하기 위해 희생된 소포는 리소좀인 것으로 알려져 있다. 이에 따라 내부 리소좀 막은 파열 부위를 봉합하기 위해 세포 표면에 첨가된다[참조예: McNeil, P.L. (2002) J. Cell Sci. 115(5): 873; Togo, T., et al. (1999) J. Cell Sci. 112:719; McNeil, P.L., and R. A. Steinhardt (2003) Ann. Rev. Cell Dev. Biol. 19:697].
상기 회복 과정은 원형질막으로의 리소좀의 접근을 허용하도록 액틴(actin) 탈중합화를 필요로 하는 것으로 보인다. 또한, 미오신 및/또는 키네신 매개된 수축 과정이 리소좀을 인렬부 근처에 접근하도록 하는 것에 관여되는 것으로 사료된다. 또한, 후속되는 재봉합은 아마도 골지(Golgi)로부터 리소좀 생성의 증가로 인해 손상에 대한 초기 반응보다 보다 빠르게 일어난다. 따라서, 큰 파열의 재봉합은 손상 부위로의 리소좀의 접근을 용이하게 하고, 회복 과정에 관여하는 리소좀의 비축을 재성립시키는 기능성 액틴 및 골지 착물에 의존한다.
따라서, 세포막 손상 및 이어지는 회복 과정이 당해 공지되어 있기는 하지만, 예를 들어 세포를 활성제에 침투시키거나 악성 세포를 치사시키는 연구 방법 또는 치료 방법으로서 세포막 손상을 유도하는 것에 대해서는 교시하거나 암시하는 바가 없다. 또한, 세포막 손상을 유도하기 위해 세포 표면 항원에 결합하는 작용제의 사용 가능성이 제안되지 않았다. 결정적으로, 사람 또는 동물 환자에게서 질병 또는 장애를 치료하기 위해 항체를 사용하여 세포막 손상을 유도하는 것에 대해서는 암시하는 바가 없다.
발명의 요약
따라서, 본 발명의 주요 목적은 항체 유도된 세포막 손상을 이용하여 사람 또는 동물 환자의 질병 또는 장애를 치료하기 위한 방법 및 조성물을 제공하므로써 상기 언급된 당해의 요구를 해결하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 세포에 침투하고/하거나 세포를 치사시키는 다가 작용제를 이용하여 세포막 손상을 유도하는 개선된 조성물 및 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 항체 또는 다른 다가 작용제를 가교시켜 세포막 창 및/또는 세포 치사를 증진시키는 개선된 조성물 및 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 추가의 목적은 세포의 과증식 또는 과활성에 의해 매개된 사람 또는 동물 환자의 질병 및 장애를 치료하기 위한 개선된 조성물 및 방법을 제공하는 것이다.
따라서, 본 발명의 일 구체예에서는, 세포막 손상을 유도하기 위한 조성물로서, 세포 표면 상에 존재하는 고도로 발현된 세포 표면 항원에 결합하는 다가 작용제를 포함하는 조성물이 제공된다. 바람직하게는, 상기 세포 표면 항원은 세포의 세포골격과 결합된다.
추가의 일 구체예에서는, 세포 표면 상에 존재하는 고도로 발현된 세포 표면 항원에 결합하는 다가 작용제를 포함하는, 세포에 침투할 수 있는 조성물이 제공된다. 또 다른 일면에서, 세포를 세포 표면 상에 존재하는 고도로 발현된 세포 표면 항원에 결합하는 다가 작용제와 접촉시키는 것을 포함하는, 세포에 침투하는 방법이 제공된다.
또 다른 구체예에서, 세포막 손상은, 부분적으로 적어도 세포가 손상을 회복하지 못하거나 더 이상 손상을 회복시킬 수 없도록 세포에 지속적으로 손상을 입히 기에 충분한 양으로 다가 작용제를 공급하므로써 생존불가능하다.
따라서, 세포막 손상을 유도하기 위한 조성물은 또한 세포를 치사시키기 위한 조성물로서 작용할 수 있다. 추가로, 세포를 치사시키기 위한 조성물은 또한 세포를 치사시키는 방법에 유용하다. 바람직하게는, 세포는 악성이며, 예를 들어, 신경, 림프, 난소, 자궁경부, 자궁내막, 고환, 전립선, 신장, 결장, 췌장, 위, 장, 식도, 폐, 갑상선, 부신, 간, 뼈, 피부, 입, 목 등과 같은 신체 조직의 신생물과 관련된다. 추가의 구체예에서, 세포는 과활성이며, 세포의 과활성은 과활성 세포를 치사시키기 위한 본원에 기술되는 조성물 및 방법에 의해 치료될 수 있는 질병 또는 장애를 매개한다.
특정 구체예에서는, 세포의 과증식성에 의해 특정되는 질환을 앓고 있는 사람 환자를 치료하는 방법으로서, 과증식성 세포 표면 상의 고도로 발현된 세포 표면 수용체와 결합하는 다가 작용제를 투여하는 것을 포함하며, 상기 다가 작용제가 정상 세포에 대해 과증식성 세포를 우선적으로 치사시키는 데 효과적인 양으로 투여되는 방법이 제공된다. 바람직하게는, 과증식성 세포는 암 세포이다. 또 다른 구체예에서, 과증식성 세포는 성장인자, 시토카인, 바이러스 감염 등에 의한 과증식 질환으로 촉진된다.
바람직한 구체예에서, 과증식성 세포를 우선적으로 치사시키기에 효과적인 다가 작용제의 양은 적어도 과증식성 세포의 세포 표면 수용체를 포화시키기에 충분한 양이다. 보다 바람직한 구체예에서, 과증식성 세포를 우선적으로 치사시키기에 효과적인 다가 작용제의 양은 환자의 건강에 허용되는 범위내에서 정상 세포의 생존성을 유지시키면서 고도로 발현된 세포 표면 항원을 지닌 정상 세포의 세포 표면 수용체를 포화시키기에 충분한 양이다. 정상 세포에 대해 과증식성 세포를 우선적으로 치사시키는 것은 과증식성 세포의 생존성을 감소시키기에는 충분하지만 동일한 정도로 정상 세포의 생존성을 감소시키기에는 충분하지 않은 양의 다가 작용제를 제공하므로써 달성된다. 예를 들어, 세포막 손상 항체를 사용하므로써 신생 세포의 생존성이 정상 세포의 생존성과 비교하여, 심지어 신생 세포와 정상 세포 둘 모두가 각 표면상에서 동일한 세포 표면 항원을 발현시키는 경우에도, 적어도 10% 초과, 보다 바람직하게는 20% 초과, 더욱 더 바람직하게는 30% 이상인 정도로 감소될 수 있다.
따라서, 일 구체예에서는, 암세포를 암 세포에 대해 세포막 손상을 유도하는 세포독성 양의 항체와 접촉시키는 것을 포함하는, 암 세포를 치사시키는 방법이 제공된다. 세포막 손상 세포독성은 보체 매개된 세포독성 또는 세포 매개된 세포독성과는 상이하다. 추가의 구체예에서, 세포막 손상 항체는 세포막 손상 메카니즘 뿐만 아니라 보체 및/또는 세포 매개된 세포독성 메카니즘에 의한 암 세포에 대해 세포독성이다.
바람직하게는, 다가 작용제는 신생 세포와 같은 신속하게 분할되는 세포를 치사시키지만, 정상 세포는 치사시키지 않는 데 효과적인 양으로 투여된다. 또 다른 구체예에서, 다가 작용제는 과증식성 세포를 치사시키지만, 정상 운동성 또는 정상 부착성을 나타내는 세포는 치사시키지 않는 데 효과적인 양으로 투여된다.
특정 바람직한 구체예에서, 상기 방법은 과증식성 세포 표면 상의 고도로 발 현된 세포 표면 수용체와 결합하는 다가 작용제와 함께 세포독성 작용제를 투여하는 것을 추가로 포함한다. 세포독성 작용제는 화학치료제, 방사선 동위원소, 세포독성 항체, 면역컨쥬게이트, 리간드 컨쥬게이트, 면역억제제, 세포 성장 조절제 및/또는 억제제, 독소, 또는 이들의 혼합물일 수 있다.
추가의 구체예에서, 상기 방법은 세포막 손상 항체를 가교시키는 가교제를 투여하는 것을 추가로 포함한다. 바람직하게는, 가교제는 안티-카파 항체, 안티-람다 항체, 안티-무(mu) 항체 등과 같은 항체이다.
특정 구체예에서, 암 세포는 신생 B 세포이고, 세포막 손상 항체는 VH4-34 항체이다. 특정 구체예에서, 세포막 손상 항체는 VH4-34 항체이고, 가교제는 상기 B 세포 상의 세포 표면 항원으로의 VH4-34 항체의 결합을 억제하지 않는 안티-VH4-34 항체이다.
또 다른 구체예에서, 세포막 손상을 유도시키기 위한 방법으로서, 세포를 세포 표면 상에 존재하는 고도로 발현된 세포 표면 항원에 결합하는 다가 작용제와 접촉시키는 것을 포함하며, 상기 세포가 림프 세포인 방법이 제공된다. 특정 구체예에서, 다가 작용제는 항체이고, 림프 세포는 CDIM 에피토프를 발현시키는 B 세포이다. 바람직하게는, 항체는 정상 B 세포에 비해 과증식성 B 세포를 우선적으로 손상을 입히는 데 효과적인 양으로 투여된다. 추가의 구체예에서, 항체는 과증식성 B 세포에 손상을 입히지만 이들 세포를 치사시키지 않는 데 효과적인 양으로 투여된다.
특정 구체예에서, 상기 방법은 (1) 치료가 필요한 환자의 혈액을 채혈하여 환자의 혈액에서 과증식성 B 세포의 수를 측정하고, (2) 항체에 의한 손상에 대한 과증식성 B 세포 및 정상 B 세포의 감수성을 측정하고, (3) 환자의 증식성 B 세포에 우선적으로 손상을 입히고/거나 치사시키기에 충분한 양의 항체를 환자에 투여하는 것을 포함한다. 상기 방법은 목적하는 정도의 세포 손상 및/또는 치사를 달성하기 위해 환자에게 추가량의 항체를 적정하는 것을 추가로 포함한다.
추가의 구체예에서, 상기 방법은 (1) 치료가 필요한 환자의 혈액을 채혈하여 환자의 혈액에서 과증식성 B 세포의 수를 측정하고, (2) 항체에 의한 손상에 대한 과증식성 B 세포의 감수성을 측정하고, (3) 환자의 증식성 B 세포에 손상을 입히기에 충분한 양의 항체를 환자에 투여하는 것을 포함한다. 상기 방법은 환자의 증식성 B 세포의 수를 바람직하게 감소시키기 위해 유효량의 세포독성 작용제를 투여하는 것을 추가로 포함할 수 있다.
다른 구체예에서는, 세포막 손상을 유도하는 방법으로서, 세포를 세포 표면 상의 고도로 발현된 세포 표면 항원에 결합하는 다가 작용제와 접촉시키는 것을 포함하며, 세포는 고도로 발현된 세포 표면 항원을 발현시키는 임의의 세포일 수 있는 방법이 제공된다. 따라서, 세포는 림프 세포와는 상이한 세포 타입이거나, B 세포 이외의 세포 타입일 수 있다. 또 다른 구체예에서, 고도도 발현된 세포 표면 항원은 CDIM 에피토프가 아니다.
추가의 구체예에서, 세포막 손상을 유도하기 위한 조성물로서, 고도로 발현된 세포 표면 항원에 결합하는 다가 작용제를 포함하는 조성물이 제공되며, 여기에서 세포막 손상을 유도하기 위한 조성물은 가교제의 부재 하에서의 다가 작용제의 세포독성에 비해 다가 작용제의 세포독성을 증가시키는 가교제를 추가로 포함할 수 있다.
특정 구체예에서, 다가 작용제는, 항체, 바람직하게는 IgM이다. 추가의 특정 구체예에서, 가교제는 세포 표면에 결합된 IgM을 가교시키는, IgM에 결합하는 항체이다.
또 다른 구체예에서, 세포막 손상을 유도시키는 방법으로서, 세포를 세포 표면 상에 고도로 발현된 세포 표면 항원에 결합하는 다가 작용제와 접촉시키는 방법이 제공된다. 이 방법은 세포를, 가교제 부재하에서의 다가 작용제의 세포독성에 비해 다가 작용제의 세포독성을 증대시키는 가교제와 접촉시키는 것을 추가로 포함할 수 있다. 바람직한 구체예에서, 다가작용제는 항체, 바람직하게는 IgM 항체이고, 가교제는 항체, 바람직하게는 세포 표면에 결합된 항체를 가교시키는, IgM에 결합하는 항체이다. 바람직하게는, 세포는 B 세포이고, 항체는 B 세포 표면 상의 CDIM 에피토프에 대해 결합 특이성을 갖는 IgM이다. 바람직하게는, 항체는 안티-CDIM 항체이고, 가교제는 안티-CDIM 항체에 결합하여 B 세포 표면에 결합된 안티-CDIM 항체를 가교시킨다. 가교제는 바람직하게는 안티-카파 또는 안티-람다 항체 또는 안티-VH4-34 항체이다.
따라서, 필요로 하는 환자에게서 악성 B 세포의 골수를 제거하는 방법으로서, 골수 세포를 B 세포 표면 상의 CDIM 에피토프에 대해 특이적 결합을 갖는 항체와 접촉하는 것을 포함하는 방법이 제공된다. 이 방법은 상기 B 세포를 B 세포 표면 상의 CDIM 에피토프에 결합된 항체를 가교시키는 가교제와 접촉시켜 악성 B 세 포에 안티-CDIM 항체에 대한 증진된 세포독성을 제공하는 것을 추가로 포함할 수 있다. 바람직한 구체예에서, 이 방법은 세포를 악성 B 세포의 골수를 추가로 제거하기 위한 세포독성 작용제와 접촉시키는 것을 추가로 포함한다.
또 다른 구체예에서는, 과증식성 세포를 치사시키는 조성물로서, 세포 표면 상에 존재하는 고도로 발현된 세포 표면 항원에 결합하는 다가 작용제를 포함하며, 다가 작용제는 세포 표면에 결합된 가교된 다가 작용제를 제공하는 가교 수단을 포함하는 조성물이 제공된다. 가교된 다가 작용제는 상기 가교 수단의 부재 하에서의 다가 작용제와 비교하여 과증식성 세포의 치사를 증진시킨다.
또 다른 구체예에서는, 세포의 과증식성에 의해 특징되는 질환을 앓고 있는 포유 동물을 치료하기 위한 약제 조성물로서, 세포 표면 상에 존재하는 고도로 발현된 세포 표면 항원에 결합하는 다가 작용제를 포함하는 약제 조성물이 제공된다. 약제 조성물은 세포독성 작용제를 추가로 포함할 수 있다. 바람직하게는, 조성물은 다가 작용제의 세포독성을 증진시키는 가교 수단을 추가로 포함한다. 바람직하게는, 다가 작용제는 세포가 회복할 수 없는 세포막 손상을 유도시키므로써 과증식성 세포를 치사시킨다.
특정 구체예에서, 가교 수단은 세포 상의 고도로 발현된 세포 표면 항원에 결합하는 다가 작용제에 공유 결합된 단일작용성 가교제일 수 있다. 가교제는 세포 표면 상의 고도로 발현된 세포 표면 항원에 결합된 인접한 다가 작용제로 가교시키기 위해 가교제의 원위 말단에 가교 작용기, 예컨대, 석신이미드, 말레이미드 또는 티올 등을 포함할 수 있다. 바람직하게는, 다가 작용제는, 항체, 예를 들어, 천연 항체(IgM, IgG, IgA, IgD, IgE를 포함), 재조합 항체, 단일클론성 항체, 다클론성 항체, 키메라 항체, 합성 항체(예컨대, 4가 항체 또는 항체를 포함하는 융합 단백질); 항체 단편(예컨대, Fab2, scFv) 등이다. 바람직한 구체예에서, 항체는 IgM이다.
추가의 구체예에서, 가교 수단은 항체 결합하는 가교제일 수 있다. 바람직한 구체예에서, 가교 수단은 세포 표면 상의 고도로 발현된 세포 표면 항원에 결합된 인접 항체를 가교하는 안티-카파 또는 안티-람파 작용제이다.
또 다른 구체예에서, 가교 수단은 분자량이 약 100 내지 약 10,000달톤이고, 항체, 또는 항체의 일부, 예를 들어, Fab 또는 scFv와 같은 세포 표면 상의 고도로 발현된 세포 표면 항원에 특이적으로 결합하는 다수의 다가 작용제를 지닌, 친수성 중합체 또는 중합체의 네트워크일 수 있다.
고도로 발현된 세포 표면 항원에 결합하는 다가 작용제는 바람직하게는 높은 친화성으로 결합한다. 일반적으로, 높은 친화성 결합은 106M-1 이상이고, 바람직하게는 약 106 M-1 내지 약 108M-1이다.
추가의 구체예에서는, 세포의 과증식성에 의해 특징되는 질환을 앓고 있는 포유 동물을 치료하는 약제 조성물로서, 세포 표면 상에 존재하는 고도로 발현된 세포 표면 항원에 결합하는 다가 작용제를 포함하며, 다가 작용제는 세포 표면 상의 세포 표면 항원에 대해 다수의 결합 부위를 포함하는 약제 조성물이 제공된다. 바람직하게는, 다수의 결합 부위는 5개 이상이며, 보다 바람직하게는 약 5 내지 약 100개이다. 특정 구체예에서, 다수의 결합 부위는 약 5 내지 약 15, 약 15 내지 약 25, 또는 약 15 내지 약 50일 수 있다.
바람직하게는, 세포 표면 항원에 대해 다수의 결합 부위를 포함하는 다가 작용제는 다수의 결합 부위와 연관된 증식성 세포의 세포독성을 증진시킨다.
본 발명의 추가의 목적, 이점 및 신규 특징은 하기 설명에서 부분적으로 언급되며, 부분적으로는 하기 설명을 숙지한 당업자들에게 자명하게 되거나 본 발명의 실시에 의해 습득될 수 있다.
도면의 간단한 설명
도 1은 VH 4-34 암호화된 항체가 원발성 임파종 및 백혈병 B 세포와 결합함을 도시한 것이다.
도 2는 VH 4-34 암호화된 단일클론성 항체가 사람 B 세포주에 결합하여 치사시킴을 도시한 것이다.
도 3는 여포 임파종 세포에 대한 mAb 216의 가변적 세포 독성을 도시한 것이다.
도 4는 mAb 216 및빈크리스틴에 의한 B 세포의 치사가 시너지 효과로 나타남을 도시한 것이다.
도 5a는 세포 생존력 상실에 대한 시간 추이와 비교하여 mAb 216으로 처리된 B 세포 표면 상의 램프-1의 출현의 시간 추이를 도시한 것이다.
도 5b는 생존 가능 세포수와 비교하여 손상된 세포로부터의 ATP 방출의 시간 추이를 도시한 것이다.
도 6a는 칼슘이 함유되거나 비함유된 배지에서 2가지 VH4-34 항체로 처리된 세포의 생존성을 도시한다.
도 6b는 세포독성제로 처리된 세포의 생존성을 도시한다.
도 7은 항체가 가교된 경우 mAb의 부가적 세포독성을 도시한다.
도 8은 세포막 손상을 유도하는 항체의 투여량 의존성 세포독성을 도시한다.
도 9a 및 9b는 인간 환자에서 mAb216 및 빈크리스틴에 의한 처리의 효능을 도시한다.
I. 정의 및 개관
본 발명을 상세히 설명하기에 앞서, 별다른 언급이 없는 한 본 발명은 특정 완충제, 부형제, 화학치료제 등으로 제한되지 않는 것으로 이해되어야 하는데, 이는 이들이 달라질 수 있기 때문이다. 또한, 본 명세서에 사용된 용어는 특정 구체예를 설명하기 위한 것일 뿐이며, 본 발명의 범위를 제한하지 않는 것으로 이해되어야 한다.
청구의 범위를 포함하는 본 명세서에서 사용된 단수형 표현은 명백히 달리 언급되어 있지 않는 한 복수 형태를 포함한다는 것을 주목해야 한다. 따라서, 예를 들어, "화학치료제"라는 표현은 둘 이상의 화학치료제를 포함하고; "약제학적 부형제"라는 표현은 둘 이상의 약제학적 부형제를 포함한다.
수치의 범위가 제공되는 경우, 그러한 범위의 상한과 하한 사이의, 명백히 달리 언급되어 있지 않는 한은 하한의 소수점 첫째자리까지의 각각의 중간값, 및 지정된 범위내의 임의의 다른 지정된 값 또는 중간값이 본 발명내에 포함되는 것으로 이해된다. 이러한 보다 작은 범위의 상한 및 하한은 독립적으로 그러한 보다 작은 범위에 포함될 수 있고, 또한 지정된 범위내의 임의의 명확히 제외된 한도(limit)를 조건으로 하여 본 발명내에 포함된다. 지정된 범위가 한도 중 하나 또는 둘 모두를 포함하는 경우, 그러한 포함된 한도 중 어느 하나 또는 둘 모두를 제외하는 범위가 또한 본 발명에 포함된다.
본 명세서에 사용된 용어 "항-CDIM 항체" 및 "CDIM 결합 항체"는 B 세포상의 CDIM 에피토프에 특이적으로 결합하는 항체를 의미한다. 이들 용어는 본 명세서에서 상호교환적으로 사용된다.
"항-VH4-34 항체"란 용어는 VH4-34 유전자에 의해 엔코딩되는 항체인 VH4-34 항체의 가변 영역상에 존재하는 에피토프에 특이적으로 결합하는 항체를 의미하며, 그 자체가 VH4-34 항체의 소위 과가변 영역 또는 "상보성 결정 영역" ("CDR")의 배선(germline) 서열을 포함할 수 있다. 그러나, 에피토프는 비배선(nongermline) CDR과 같은 체세포 과돌연변이(hypermutation)에 의해 형성된 독특한 면역글로불린의 마커가 아니다. 바람직한 구체예에서, 에피토프는 항체의 프레임워크 영역에 존재하고, 바람직하게는 항체의 CDR을 포함하지 않는다. 또 다른 바람직한 구체예에서, 항-VH4-34 항체는 VH4-34 항체가 이의 항원에 특이적으로 결합하는 것을 간섭하지 않는다.
"9G4"란 용어는 VH4-34 Ab를 인식하는 것으로 밝혀진 래트 모노클로날 항체를 의미한다 (Stevenson, et al. Blood 68: 430 (1986)). mAb 9G4에 의해 확인된 VH4-34 에피토프는 입체형태 제한되며, 가변 중쇄의 프레임워크 1 영역 ("FR1")의 아미노산 23-25에 근접한 독특한 서열에 의존적이다. 9G4는 항-VH4-34 항체의 일종이다.
"항체"란 용어는 최광의로 사용되며, 온전한 천연 항체, 모노클로날 항체, 폴리클로날 항체, 둘 이상의 온전한 항체로부터 형성된 다중특이적 항체 (예를 들어, 이중특이적 항체), 4가 항체와 같은 합성 항체, 및 요망되는 생물학적 활성을 나타내는 한은 항체 단편을 포함한다. 인간 항체는 인간 이외의 종에서 생성된 항체를 포함한다. 또한, 항체란 용어는 예를 들어 캐멜리즈(Camelids)로부터 수득되거나 캐스터만(Casterman)의 미국 특허 제 6,765,087호 및 제 6,015,695호에 기재된 것들과 같은 단지 중쇄로부터 형성된 Ig 분자를 포함한다. 또한, 항체란 용어는 항체가 세포독성제 또는 세포 조절제와 융합되거나 화학적 커플링 (즉, 컨쥬게이션)된 것을 포함한다.
"항체 단편"은 온전한 항체의 일부, 바람직하게는 온전한 항체의 항원 결합 또는 가변 영역을 포함한다. 항체 단편의 예로는 Fab, Fab', F(ab')2, 및 Fv 단편; 디아보디(diabody); 선형 항체 (Zapata, et al. (1995) Protein Eng. 8(10),1057-1062) 단일-사슬 항체 분자; 및 항체 단편으로부터 형성된 다중특이적 항체가 있다.
본 명세서에 사용된 용어 "모노클로날 항체"는 실질적으로 균질한 항체의 집단으로부터 수득된 항체를 의미하는데, 즉, 집단을 구성하는 개개의 항체가 소량으로 존재할 수 있는 가능한 자연발생적 돌연변이를 제외하고는 동일하다. 모노클로날 항체는 고도로 특이적이며, 하나의 항원성 부위에 대해 유도된다. 또한, 전형적으로 다양한 결정기 (에피토프)에 대해 유도된 다양한 항체를 포함하는 통상적인 (폴리클로날) 항체 제제와 대조적으로, 각각의 모노클로날 항체는 항원상의 하나의 결정기에 대해 유도된다. 모노클로날 항체는 이들의 특이성 뿐만 아니라 다른 면역글로불린에 의해 오염되지 않는 하이브리도마 배양에 의해 합성된다는 점에서 유리하다. "모노클로날"이란 수식어는 항체의 실질적으로 균질한 집단으로부터 수득되는 항체의 특성을 나타내며, 임의의 특정 방법에 의해 항체를 생성시킬 필요가 있는 것으로 해석되지 않아야 한다. 예를 들어, 본 발명에 따라 사용되는 모노클로날 항체는 콜러(Kohler) 등의 문헌 [Nature 256, 495 (1975)]에 의해 최초로 기재된 하이브리도마 방법에 의해 제조되거나 재조합 DNA 방법 (참조: 미국 특허 제 4,816,567호)에 의해 제조될 수 있다. 또한, "모노클로날 항체"는 예를 들어 클락손(Clackson) 등의 문헌 [(1991) Nature, 352, 624-628] 및 막스(Marks) 등의 문헌 [(1991) J. Mol . Biol. 222, 581-597]에 기재된 기술을 이용하여 파지 항체 라이브러리로부터 단리될 수 있다.
본 명세서에서 모노클로날 항체는 중쇄 및/또는 경쇄의 일부가 특정 종(species)으로부터 유래되거나 특정 항체 강(class) 또는 아강(subclass)에 속하는 항체의 상응하는 서열과 동일하거나 이와 상동이고, 사슬(들)의 나머지가 또 다른 종으로부터 유래되거나 또 다른 항체 강 또는 아강에 속하는 항체의 상응하는 서열과 동일하거나 이와 상동인 "키메라" 항체 (면역글로불린) 뿐만 아니라, 요망되는 생물학적 활성을 나타내는 한은 이러한 항체의 단편을 포함한다 (미국 특허 제 4,816,567호; Morrison et al., (1984) Proc . Natl . Acad . Sci . USA, 81, 6851-6855).
비인간 (예를 들어, 뮤린) 항체의 "인간화된" 형태는 비인간 면역글로불린으로부터 유래된 최소 서열을 함유하는 키메라 면역글로불린, 면역글로불린 사슬 또는 이의 단편 (예를 들어, Fv, Fab, Fab', F(ab')2 또는 항체의 다른 항원-결합 서열)이다. 대개의 경우, 인간화된 항체는 수용자의 상보성 결정 영역 (CDR)으로부터의 잔기가 요망되는 특이성, 친화성 및 능력을 지닌 마우스, 래트 또는 래빗과 같은 비인간 종 (공여자(donor) 항체)의 CDR로부터의 잔기로 대체된 인간 면역글로불린 (수용자 항체)이다. 일부 경우, 인간 면역글로불린의 프레임워크 영역 (FR) 잔기가 상응하는 비인간 잔기로 대체된다. 또한, 인간화된 항체는 수용체 항체 또는 도입된 CDR 또는 프레임워크 서열에서도 발견되지 않는 잔기를 포함할 수 있다. 이러한 변형은 항체 성능을 추가로 가다듬고 최대화시키기 위해 이루어진다. 일반적으로, 인간화된 항체는 CDR의 전부 또는 실질적으로 전부가 비인간 면역글로불린의 CDR에 상응하고 FR의 전부 또는 실질적으로 전부가 인간 면역글로불린 서열의 FR인 하나 이상, 전형적으로 2개의 가변 도메인의 실질적으로 전부를 포함한다. 또한, 인간화된 항체는 최적으로 면역글로불린 불변 영역 (Fc), 전형적으로 인간 면역글로불린의 불변 영역의 일부 또는 전부를 포함한다. 상세한 사항에 대해서는 존스(Jones) 등의 문헌 [(1986) Nature 321, 522-525; Reichmann et al., (1988) Nature 332, 323-329] 및 프레스타(Presta)의 문헌 [(1992) Curr . Op. Struct . Biol. 2, 593-596]을 참조하라. 인간화된 항체는 항체의 항원-결합 영역이 짧은꼬리원숭이 (macaque monkey)를 관심있는 항원으로 면역화시킴으로써 생성된 항체로부터 유래된 프리마타이즈드TM (PRIMATIZEDTM) 항체를 포함한다.
"단일-사슬 Fv" 또는 "scFv" 항체 단편은 항체의 VH 및 VL 도메인을 포함하며, 여기서 이들 도메인은 하나의 폴리펩티드 사슬에 존재한다. 바람직하게는, Fv 폴리펩티드는 scFv가 항원 결합을 위한 요망되는 구조를 형성할 수 있게 하는 폴리펩티드 링커를 VH 및 VL 도메인 사이에 추가로 포함한다. scFv의 개관에 대해서는 문헌 [Pluckthun in The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 113, Rosenburg and Moore eds., Springer-Verlag, New York, pp. 269-315 (1994)]을 참조하라.
"디아보디(diabody)"란 용어는 2개의 항원-결합 부위를 지닌 작은 항체 단편을 의미하며, 이러한 단편은 동일한 폴리펩티드 사슬에서 경쇄 가변 도메인 (VL)에 연결된 중쇄 가변 도메인 (VH)을 포함한다 (VH--VL). 너무 짧아서 동일한 사슬상의 2개의 도메인 사이에 쌍을 형성할 수 없는 링커를 사용함으로써, 도메인은 또 다른 사슬상의 상보적 도메인과 쌍을 형성하게 되어, 2개의 항원-결합 부위를 생성시킨다. 디아보디는 예를 들어 EP 404,097; WO 93/11161; 및 홀링거(Hollinger) 등의 문헌 [(1993) Proc . Natl . Acad . Sci. USA 90, 6444-6448]에 더욱 상세히 설명되어 있다.
"단리된" 항체는 확인되고, 이의 천연 환경의 성분으로부터 분리되고/되거나 회수된 것이다. 이의 천연 환경의 오염 성분들은 항체의 진단적 또는 치료적 용도를 간섭하는 물질로서, 효소, 호르몬 및 다른 단백성 또는 비단백성 용질을 포함할 수 있다. 바람직한 구체예에서, 항체는 (1) 로우리(Lowry)법에 의해 측정하여 95 중량% 초과, 가장 바람직하게는 99 중량% 초과 범위로 정제되거나, (2) 스피닝 컵 서열분석기(spinning cup sequenator)를 사용하여 N-말단 또는 내부 아미노산 서열의 15개 이상의 잔기를 수득하기에 충분할 정도로 정제되거나, (3) 쿠마시에 블루 또는 바람직하게는 은 염색을 사용하는 환원 또는 비환원 조건하에서 SDS-PAGE에 의해 균질한 정도로 정제된다. 단리된 항체는 재조합 세포내의 원위치(in situ)에 존재하는 항체를 포함하는데, 이는 이러한 항체의 천연 환경의 하나 이상의 성분이 존재하지 않기 때문이다. 그러나, 통상적으로 단리된 항체는 하나 이상의 정제 단계에 의해 준비된다.
본 명세서에 사용된 "성장을 정지시키는" 작용제 또는 "성장 억제제"는 세포, 특히 필요에 따라 CD20 항원과 같은 B 세포 항원을 발현하는 신생물 세포 유형의 성장 또는 증식을 억제하는 화합물 또는 조성물을 의미한다. 따라서, 성장 억제제는 예를 들어 S기의 신생물 세포의 비율을 현저하게 감소시키는 작용제이다.
"암" 및 "암성"이란 용어는 전형적으로 조절되지 않은 세포 성장을 특징으로 하는 포유류의 생리적 상태를 의미하거나 이러한 상태를 나타낸다.
"CD20" 항원은 말초혈 또는 림프 기관으로부터의 90%를 초과하는 B 세포의 표면상에서 발견되는 35kDa의 당화되지 않은 인단백질이다. CD20은 초기 프레(pre)-B 세포 발생 동안 발현되고, 혈장 세포 분화때까지 남아있는다. CD20은 정상 B 세포 뿐만 아니라 악성 B 세포상에도 존재한다. 문헌상에 나타나 있는 CD20의 다른 명칭으로는 "B-림프구-제한 항원" 및 "Bp35"가 있다. CD20 항원은 예를 들어 클락(Clark) 등의 문헌 [PNAS (USA) 82:1766 (1985)]에 기재되어 있다.
"세포 손상"이란 용어는 정상적으로 막 불투과성인 추적자(tracer)의 세포질내로의 흡수에 의해 특징화되는 생존가능한 혈장 막 붕괴 사고를 의미한다. 세포 손상 붕괴는 전형적으로 약 1 내지 1000 ㎛2 사이의 범위이며, 이는 보체 매개 세포독성 또는 퍼포린(perforin)을 수반하는 막 붕괴 또는 그라미시딘(gramicidin) 또는 스태필로코쿠스 아우레우스(Staphylococcus aureus) 알파 독소와 같은 독소 또는 포어(pore) 형성제에 의해 형성된 커다란 포어 보다도 훨씬 큰 것이다. 세포 손상은 손상의 결과로서 나타나는 세포 복구 메커니즘, 즉, 손상을 복구하기 위한 리소좀 융합의 결과로서의 세포 표면상에서의 Lamp-1의 발현에 의해 검출된다.
"세포 손상 항체" 또는 "세포 막 손상 항체"란 용어는, 고도로 발현된 세포 표면 항원에 결합시에 정상적으로 막 불투과성인 추적자의 세포질내로의 흡수에 의해 특징화되는 생존가능한 혈장 막 붕괴 사고를 초래하는 항체를 의미한다. 세포 손상 항체는 손상의 결과서의 나타나는 세포 복구 메커니즘, 즉, 손상을 복구하기 위한 리소좀 융합의 결과로서의 세포 표면상에서의 Lamp-1의 발현을 유도한다.
"화학치료제"란 용어는 암 또는 세포의 과증식을 특징으로 하는 그 밖의 질환의 치료에 유용한 화합물을 의미한다.
본 명세서에 사용된 용어 "세포독성제" 및 "세포독소"는 세포의 성장을 억제 또는 정지시키거나, 세포의 기능을 억제 또는 정제시키고/거나 세포의 치사를 일으키는 물질을 의미한다. 이러한 용어는 하나 이상의 방사성 동위원소, 화학치료제, 면역억제제, 세포 성장 조절제 및/또는 억제제를 포함하도록 의도되며, 이는 소분자 치료제, 세포독성 항체, 및 독소, 예를 들어 세균, 진균, 식물 또는 동물 기원의 효소적으로 활성인 독소, 또는 이들의 단편일 수 있다. 또한, 이러한 용어는 표적 세포에 특이적으로 결합하기 위해 독소 또는 방사성 동위원소로 표지된 항체를 포함하는 면역컨쥬게이트(immunoconjugate) 뿐만 아니라 다른 리간드 컨쥬게이트, 예를 들어 방사성표지된 리간드 및 독소-표지된 리간드를 포함한다. 또한, 하나 이상의 세포독성제가 함께 사용될 수 있다.
"장애"는 본 명세서에 기재된 병용 요법에 의한 치료로부터 혜택을 받는 임의의 질환이다. 이는 포유류가 해당 장애에 걸리기 쉽게 만드는 병리학적 상태를 포함하는 만성 및 급성 장애 또는 질병을 포함한다. 본 발명에서 치료하고자 하는 장애의 비제한적 예로는 암, 혈액학적 악성종양, 백혈병 및 악성 림프종 및 자가면역 질병, 예를 들어 염증 장애 및 면역학적 장애가 있다.
"고도로 발현된 세포 표면 항원"이란 용어는 세포 당 104개 이상의 복사체로 존재하거나 ㎛2 당 25개 이상의 복사체의 밀도로 세포의 일부 또는 전부상에 존재하는 세포의 표면상에서 이용가능한 (즉, 결합을 나타내기 위해 세포 투과를 필요치 않음) 표면 항원을 의미한다. 세포 표면 항원은 세포 표면 발현된 분자, 예를 들어 수용체, 면역글로불린, 사이토카인, 당단백질 등을 포함한다.
"과증식" 및 "과증식성"이란 용어는 암성 또는 양성일 수 있는 세포 유형의 비정상적 성장을 의미한다. 일반적으로, 과증식성 세포는 그러한 세포 유형의 정상 세포에 의해 나타나는 세포 분열 속도 보다 약 10% 이상 높은 세포 분열 속도를 나타낸다. 과증식은 자가면역 질병을 매개하는 자가항체를 분비하는 B 세포의 폴리클로날 증식을 포함한다.
"면역컨쥬게이트"란 용어는 세포독성제에 컨쥬게이션된 항체를 의미하며, 이는 공유결합되거나 공유결합되지 않을 수 있다.
"정맥내 주입"이란 용어는 동물 또는 인간 환자의 정맥내로 작용제를 일정 시간, 일반적으로 약 15분을 초과하는 시간, 더욱 일반적으로 약 30분 내지 90분에 걸쳐 도입시키는 것을 의미한다.
"정맥내 볼루스(bolus)" 또는 "정맥내 푸시(push)"란 용어는 신체가 약 15분 이하, 일반적으로 5분 이하 이내에 약물을 수용하도록 동물 또는 인간의 정맥내로 약물을 투여하는 것을 의미한다.
"포유류"라는 용어는 인간, 가축 및 농업용 동물, 및 동물원, 스포츠용, 애완용 또는 야생 동물을 포함하는 임의의 포유류 종을 의미한다. 세포 표면 항원이 CDIM 항원인 경우, 혈구응집이 방지되어야 한다면 CDIM 항원은 포유류 종의 적혈구상에서 발현되지 않아야 한다. 바람직하게는, CDIM 항원은 주로 출생 후 B 세포 계통의 세포로 제한된다.
"리툭산®(RITUXAN®) 브랜드(brand)" 항-CD20 항체로서 언급되는 인간화된 항-CD20 항체는 CD20 항원에 대해 유도된 유전공학처리된 키메라 뮤린/인간 모노클로날 항체이다. 리툭시맵(Rituximab)은 1998년 4월 7일에 특허된 미국 특허 제 5,736,137호에서 "C2B8"로 일컬어지는 항체이다. C2B8 항체의 리툭산® 브랜드는 재발성 또는 불응성 저등급 또는 여포성 CD20 포지티브 B 세포 비호지킨 림프종을 지닌 환자의 치료를 위해 처방된다.
"특이적 결합"이란 용어는 106M-1 이상, 통상적으로 약 106M-1 내지 약 108M-1의 높은 결합 친화성을 지니는 특성을 의미한다.
"피하 투여"란 용어는 약물 저장소로부터의 비교적 느린 지속성 전달에 의해 동물 또는 인간 환자의 피부 아래에, 바람직하게는 피부와 하부 조직 사이의 주머니(pocket)내에 도입시키는 것을 의미한다. 주머니는 피부를 하부 조직으로부터 위쪽으로 집어올리거나 잡아올림으로써 생성될 수 있다.
"피하 볼루스"라는 용어는 동물 또는 인간 환자의 피부 바로 아래쪽에 약물을 투여하는 것을 의미하며, 여기서 볼루스 약물 전달은 바람직하게는 약 15분 미만, 더욱 바람직하게는 5분 미만, 가장 바람직하게는 60초 미만 이내에 이루어진다. 투여는 바람직하게는 피부와 하부 조직 사이의 주머니내에서 이루어진다.
"피하 주입"이라는 용어는 약물 저장소로부터의 비교적 느린 지속성 전달에 의해 동물 또는 인간 환자의 피부 아래에, 바람직하게는 피부와 하부 조직 사이의 주머니내에 30분 이하, 또는 90분 이하를 포함하지만 이에 제한되지 않는 시간 동안 도입시키는 것을 의미한다. 임의로, 주입은 동물 또는 인간 환자의 피부 아래에 이식되는 약물 전달 펌프의 피하 이식에 의해 이루어질 수 있으며, 여기서 이러한 펌프는 소정의 시간, 예를 들어 30분, 90분 또는 치료 처방의 기간에 걸친 시간 동안 약물의 소정량을 전달한다.
"치료적 유효량"이란 용어는 성장 정지 효과를 나타내거나 세포 치사를 일으키는 활성 약물의 양을 의미하기 위해 사용된다. 특정 구체예에서, 치료적 유효량은 세포를 투과하거나, 증식 신호전달을 억제하거나, 세포 대사를 억제하거나, 아폽토시스 활성을 촉진하거나 세포 치사를 유도하는 특성을 지닌다. 특정 양태에서, 치료적 유효량은 예를 들어 질병 진행을 늦추는 데에 있어서 효과적인 것으로 밝혀진 표적 혈청 농도를 의미한다. 효능은 치료하고자 하는 질환에 따라 통상적으로 방식으로 측정될 수 있다. 예를 들어, 림프암의 경우, 효능은 질병 진행까지의 시간 (TTP)을 평가하거나 반응 속도 (RR)를 결정함으로서 측정될 수 있다.
본 발명에서 사용된 "치료하는," "치료" 및 "요법" 등의 용어는 질병 또는 장애의 하나 이상의 증상의 완화, 질병 또는 장애의 퇴행, 질병 또는 장애의 진행의 둔화 또는 정지를 포함하지만 이들에 제한되지 않는 임의의 임상적으로 바람직하거나 유리한 효과를 초래하는 질병 또는 장애에 대한 치료적 조치 뿐만 아니라 예방적 또는 억제적 조치를 포함하도록 의도된다. 따라서, 예를 들어, 치료란 용어는 질병 또는 장애의 증상의 개시 전 또는 개시 후에 약물을 투여하여 질병 또는 장애의 모든 징후를 예방하거나 제거하는 것을 포함한다. 또 다른 예로서, 이러한 용어는 질병의 증상을 제거하기 위해 질병의 임상 소견 후에 약물을 투여하는 것을 포함한다. 또한, 투여가 질병 또는 장애의 임상 파라미터, 예를 들어 조직 손상 정도 또는 전이량 또는 전이 정도에 영향을 미치는, 개시 후 및 임상 증상이 발생된 후의 약물의 투여는 치료가 질병의 개선을 초래하는 지의 여부와 관계없이 본 발명에서 "치료" 또는 "요법"을 포함한다.
II. 세포 막 손상 항체
VH4-34 항체 (가변 중쇄 영역)는 배선 유전자 (VH4.21)에 의해 엔코딩되는 53개의 확인된 인간 작용성 항체 배선 항체 중 하나이다 [Cook, G.P., et al., (1994) Nat. Genet. 7, 162-168]. VH4-34 항체에 대한 유전자는 모든 일배체형에 존재하며, 관련없는 개체로부터 단리된 배선 DNA에서 서열 변화는 보고된 바 없다 [Weng, N.P., et al., (1992) Eur . J. Immunol. 22,1075-1082; van der Maarel, S., et al., (1993) J. Immunol.150, 2858-2868]. VH4-34 유전자에 의해 엔코딩된 항체는 독특한 특성을 지니는 것으로 밝혀졌다. 적혈구 (RBC)의 "I" 또는 "i" 항원에 대해 유도된 모든 mAb는 VH4-34 유전자에 의해 엔코딩되고, 일반적으로 IgM 부류이며, 4℃에서 RBC를 응집시키므로 고전적으로 저온 응집소 (CA)로서 공지되어 있다 [Pascual, V., et al., (1991) J. Immunol. 146,4385-4391; Pascual, V., (1992) J. Immunol.149, 2337-2344; Silberstein, L.E., et al., (1991) Blood 78, 2372-2386]. CA에 의해 인식되는 리간드는 RBC의 단백질 및/또는 지질상에 존재하는 선형 또는 분지형 글리코컨쥬게이트이다. 신생아 및 제대혈 RBC는 선형 i 항원을 지닌다. 분지형 I 사슬은 출생 후 생성된다 [Pruzanski, W. et al., (1984) Clin. Immunol . Rev.3,131-168; Roelcke, D. (1989) Transfusion Med . Rev. 2,140-166]. 인간 B 세포상에서 인식되는 "i" 항원은 엔도-베타-갈락토시다아제 효소에 민감한 선형 락토사민 결정기이다. 독립적으로 유래된 VH4-34 항-B 세포/항-i mAb의 서열 분석 결과, 이들은 배선 형태로 존재하는 것으로 밝혀졌다 [Bhat N.M., et al., (1997) Clin . Exp . Immunol. 108, 151-159].
생체내에서, VH4-34 유전자 유래된 항체의 발현은 엄격하게 조절된다. 인간 B 세포의 4 내지 8%가 VH4-34 엔코딩된 항체를 발현하지만, VH4-34 유래된 항체의 혈청 수준은 정상 성인에서는 무시할 정도이다 [Stevenson F.K., et al., (1989) Br. J. Haematol.72, 9-15; Kraj P, et al., (1995) J. Immunol.154,6406-6420]. 순환성 VH4-34 유래된 항체의 증가는 바이러스 감염 (엡스타인 바르 (단핵구증), 인간 면역결핍 바이러스 및 C형 간염 바이러스), 마이코플라스마 뉴모니애 (Mycoplasma pneumoniae) 및 특정 자가면역 질병을 포함하는 선택적 병리 질환에서만 관찰된다 [참조: Bhat, N. M., et al. (2005) Human Antibodies 13, 63-68].
본 발명자들은 자가면역 장애에서 VH4-34 엔코딩된 항체 및 이들의 역할을 광범위하게 연구하였다. 종래의 연구는 특정 항-B 세포 VH4-34 항체가 B 세포에 대해 세포독성이고, 감소된 B 세포 증식을 유도한다는 것을 입증하였다 [Bhat, N. et al. (1997) Clin . Exp . Immunol. 108:151; Bhat, N., et al., (2001) Crit . Rev. Oncol . Hematol. 39, 59]. 세포독성은 보체와 무관하고, 고도로 온도 의존성인 것으로 밝혀졌고, 이는 4℃에서 처리되는 경우 보다 높은 세포 치사 및 세포 표면상에 수포 및 기공과 같은 혈장막 결함부의 형성을 초래한다. 혈장막 결함부는 C9 보체 성분 (~100 Å) 및 퍼포린 (~160 Å)과 같은 그 밖의 널리 공지된 기공 형성 단백질에 의해 형성된 기공 보다 현저하게 큰 것으로 밝혀졌다. 세포독성이 신규 메커니즘에 의해 매개될 수 있음이 암시되었다.
본 발명자들은 이러한 VH4-34 유전자 유래된 항체가 B 세포에서 세포막 손상을 유도할 수 있다는 의외의 놀라운 발견을 하였고, 이는 이미 보고된 항-CDIM 항체에 의해 치사되는 세포에서 관찰되는 커다란 혈장막 결함부와 구별되는 것이다 (Bhat, N. et al. (1997) Clin . Exp . Immunol. 108:151; Bhat, N., et al., (2001) Crit. Rev. Oncol . Hematol. 39, 59). 항체가 특정 조건하에서 세포에서 기공 및 막 결함부를 일으키지만, 준치사(sublethal) 농도에서 처리되는 경우, B 세포의 일부가 손상될 뿐이며, 이들은 일부 경우에 손상을 복구할 수 있다. 막 상해가 포유동물 유핵 세포가 직면하는 공통적 위협이지만, 항체가 막 손상의 직접적 원인일 수 있다는 사실은 신규한 것이다.
또한, 본 발명자들은 항체 유도된 세포막 손상이 임의의 다른 막 손상과 유사한 방식으로 복구됨을 입증하였다. 이러한 보체 비의존성 세포독성 항체로 처리된 세포는 막 손상을 수선하기 위한 혈장막과의 리소좀 융합을 이용하여 항체 유도된 세포막 손상을 복구하려고 하며, 이는 세포 표면상에 리소좀 막 단백질이 존재하게 한다. 또한, 세포가 손상을 복구할 수 없는 경우, 궁극적으로 치사되는 것으로 나타났다.
또한, 본 발명자들은 손상된 세포가 적어도 일시적으로 투과될 수 있어서, 추가의 세포 독성제의 작용에 더욱 민감해진다는 것을 발견하였고, 이는 인간 및 동물 질병 및 장애의 치료를 위한 향상된 효능을 지닌 신규 치료 옵션을 제공한다. 세포막 손상은 B 세포가 투과될 수 있게 하여 화학치료제와 같은 세포독성제의 진입을 가능하게 하고, 이로써 이러한 화학치료제에 대해 내성이거나 불투과성인 세포에서 또는 이들을 세포밖으로 능동 수송하는 세포에서 화학치료제의 효능을 증가시킨다.
CDIM 결합 항체에 의해 제공되는 세포 치사 및 손상의 메커니즘이 통상적인 세포독성 항체 (보체 또는 세포 매개성 치사)가 이용하는 세포독성 메커니즘과 상이하므로, CDIM 결합 항체를 통상적인 면역요법과 병용하면 특히 보체 고갈 또는 결핍과 같은 면역결핍 상태하에서 추가의 B 세포 항원과 결합하는 세포독성 항체에 의한 향상된 치사 효율을 제공할 수 있다.
또한, 세포 손상 항체의 작용은 가교제의 부재하에서의 항체의 세포독성에 비해 항체의 세포독성을 증강시키는 가교제의 첨가에 의해 향상될 수 있다. 이러한 결과는 예를 들어 마치스, 알. (Marches, R.) 등의 문헌 [(1995) Ther . Immunol. 2, 125]에 의해 보고된 과가교(hypercrosslinking)에 의해 유도된 아폽토시스와 구별될 수 있는데, 이러한 문헌은 IgM의 가교 및 그에 따른 신호전달이 과가교 후에 휴면 및 아폽토시스를 유도하고 유지시키는 데에 있어서 주요 인자일 수 있음을 나타낸다.
바람직한 구체예에서, 본 발명의 한 가지 양태에 따른 항체는 예를 들어 문헌 [Grillot-Courvalin, C., et al (1992) Eur . J. Immunol. 22, 1781-1788; Bhat, N.M., et al. (1993) J. Immunol. 151, 5011-5021; Siberstein, L.E., et al. (1996) Blood Cells, Molecules, and Diseases, 22, 126-138]에 기재되어 있고, 도 1 및 2에 도시된, 인간 B 세포상의 CDIM 에피토프와 결합하는 VH4-34 엔코딩된 모노클로날 항체이다. 이러한 항체는 도 3에 도시된 바와 같이 재발 여포성 림프종 환자로부터 수득된 B 세포에 대해 세포독성이다. 또한, 이러한 항체는 도 4에 도시된 바와 같이 B 세포주에 대해 세포독성이다. 바람직한 구체예에서, 이러한 mAb는 인간 항체를 분비하는 하이브리도마를 생성시키는 인간 림프종과 이종골수종 세포주의 융합에 의해 생성된다. 예를 들어, mAb 216은 VH4-34 유전자에 의해 엔코딩되는 인간 IgM이고, 이는 본 명세서에 기재된 CDIM 결합 VH4-34 항체의 바람직한 구체예이다. 또한, mAb 216은 바트(Bhat) 등의 미국 특허 제 5,593,676호 및 제 5,417,972호 및 EP 712 307 B1에 기재되어 있다.
CDIM 에피토프와 결합하는 추가의 VH4-34 유래된 항체로는 RT-2B, FS 12, A6(H4C5), Cal-4G, S20A2, FS 3, Gee, HT, Z2D2, Y2K가 있다. 이들 항체 중 몇몇은 염기성 아미노산 잔기가 풍부한 CDR3 서열, 및 CDR3의 순전하가 +2인 경우의 특히 강력한 결합을 특징으로 한다. 따라서, 순전하가 양의 값인 CDR, 특히 CDR3를 지니고 CDIM 에피토프에 대한 결합을 나타내는 임의의 항체가 본 발명 및 첨부된 청구의 범위에 속한다. 그러나, 당업자라면 CDIM 에피토프와 결합하고 B 세포에 대해 세포독성을 나타내는 임의의 항체가 본 명세서에 기재된 CDIM 결합 항체의 범위에 속한다는 것을 인식할 것이다.
III. 세포막 손상을 유도하기 위한 방법 및 조성물
따라서, 본 발명의 한 가지 구체예에서, 세포막 손상을 유도하기 위한 조성물이 제공되며, 이러한 조성물은 세포의 표면상에 존재하는 고도로 발현된 세포 표면 항원에 결합하는 다가 작용제를 포함한다. 바람직하게는, 세포 표면 항원은 세포의 세포골격과 결합되어 있다. 예를 들어, 세포 표면 항원은 세정제 추출에 의한 가용성 성분의 제거 후에 세포와 결합된 채로 남아있다. 세포막 손상은 리소좀 융합에 의해 복구되는 생존가능한 막 상해이고, 세포 표면상의 리조솜 단백질의 존재 또는 발현에 의해 검출될 수 있고, 세포가 적어도 일시적으로 투과될 수 있게 한다.
또 다른 구체예에서, 세포를 투과하는 조성물이 제공되며, 이러한 조성물은 세포의 표면상에 존재하는 고도로 발현된 세포 표면 항원에 결합하는 다가 작용제를 포함한다. 또 다른 양태에서, 세포를 투과하는 방법에 제공되며, 이러한 방법은 세포를 세포의 표면상에 존재하는 고도로 발현된 세포 표면 항원에 결합하는 다가 작용제와 접촉시키는 것을 포함한다.
다른 구체예에서, 세포막 손상을 유도하기 위한 방법이 제공되며, 이러한 방법은 세포를 세포 표면상의 고도로 발현된 세포 표면 항원에 결합하는 다가 작용제와 접촉시키는 것을 포함하고, 여기서 세포는 고도로 발현된 세포 표면 항원을 발현하는 임의의 세포일 수 있다. 따라서, 세포는 림프 세포와 상이한 세포 유형일 수 있거나, B 세포 이외의 세포 유형일 수 있다. 또 다른 구체예에서, 고도로 발현된 세포 표면 항원은 CDIM 에피토프가 아니다.
또한, 본 명세서에 기재된 방법 및 조성물은 세포의 과증식을 특징으로 하는 질병 또는 장애에 걸린 포유류의 치료를 위한 약제의 제조에 사용되는 세포막 손상 다가 작용제, 특히 세포막 손상 항체의 용도를 포함한다.
IV. 세포를 치사시키고/거나 이의 성장을 억제하기 위한 방법 및 조성물
또 다른 구체예에서, 세포막 손상은 적어도 부분적으로는 세포가 손상을 복구하지 못하거나 더 이상 복구할 수 없도록 세포를 계속 손상시키기에 충분한 양의 다가 작용제를 제공함으로써 생존불가능한 것이 된다. 치명적인 세포 손상은 막 복구가 효과적이지 않거나 유지될 수 없도록 세포의 표면상에 존재하는 고도로 발현된 세포 표면 항원의 수에 비해 충분히 과량의 다가 작용제를 제공함으로써 달성될 수 있다. 또한, 치명적인 세포 손상은 복구 메커니즘을 차단하거나 간섭하는 작용제, 예를 들어 항-액틴 작용제 또는 세포 표면 수용체와 세포의 하부 세포골격의 결합에 영향을 미치는 작용제를 제공함으로써 달성될 수 있다. 또한, 치명적인 세포 손상은 세포 부착 및/또는 운동에 영향을 미치거나 이를 간섭하는 작용제를 제공함으로써 달성될 수 있다.
따라서, 세포막 손상을 유도하기 위한 조성물은 또한 세포를 치사시키기 위한 조성물로서 기능할 수 있다. 또한, 세포를 치사시키기 위한 조성물은 세포를 치사시키기 위한 방법에서 유용하다. 바람직하게는, 세포는 악성이고, 예를 들어 신경, 림프, 난소, 경부, 내막, 고환, 전립선, 신장, 결장, 췌장, 위, 장, 식도, 폐, 갑상선, 부신, 간, 뼈, 피부, 입, 인후 등과 같은 신체 조직의 신생물과 관련되어 있다. 또 다른 구체예에서, 세포는 과활성이고, 세포의 과활성은 본 명세서에 기재된 과활성 세포를 치사시키기 위한 조성물 및 방법에 의해 치료될 수 있는 질병 또는 장애를 매개한다.
V. 추가의 세포독성제의 투여
본 발명자들은 이러한 세포막 손상 항체의 세포독성이 현저하고, 화학치료제, 방사성 동위원소, 세포독성 항체, 면역컨쥬게이트, 리간드 컨쥬게이트, 면역억제제, 세포 성장 조절제 및/또는 억제제, 독소, 또는 이들의 혼합물을 포함하는 세포독성제의 첨가에 의해 상승적으로 향상될 수 있다는 놀라운 발견을 하였다.
따라서, 특정한 바람직한 구체예에서, 본 발명의 방법은 과증식성 세포의 표면상의 고도로 발현된 세포 표면 수용체와 결합하는 다가 작용제와 함께 세포독성제를 투여하는 것을 추가로 포함한다. 세포독성제는 화학치료제, 방사성 동위원소, 세포독성 항체, 면역컨쥬게이트, 리간드 컨쥬게이트, 면역억제제, 세포 성장 조절제 및/또는 억제제, 독소 또는 이들의 혼합물일 수 있다.
또한, 세포막 손상은 세포가 투과성이 되게 하여 하전된 약물, 단백질 및 펩티드, 핵산, 유전자 요법제 또는 유전자 발현 조절제와 같은 정상적으로 불투과성인 작용제가 세포질에 접근할 수 있게 한다. 이러한 방식으로, 세포막 손상은 세포에서 예를 들어 세포 활성, 유전자 발현 또는 증식 신호전달에 대한 반응을 조절하기 위해 사용될 수 있고, 이는 실제로 세포를 치사시킬 필요없이 과증식성 세포 과활성 세포를 특징으로 하는 질병 또는 장애에 걸린 환자를 치료하기 위한 수단을 제공한다.
VI. 신생물 세포의 우선적 치사
특정 구체예에서, 세포의 과증식을 특징으로 하는 질환에 걸린 인간 환자를 치료하는 방법이 제공되며, 이러한 방법은 과증식성 세포의 표면상의 고도로 발현된 세포 표면 수용체와 결합하는 다가 작용제를 투여하는 것을 포함하고, 여기서 상기 다가 작용제는 정상 세포에 비해 과증식성 세포를 우선적으로 치사시키기에 유효한 양으로 투여된다. 바람직하게는, 과증식성 세포는 암세포이다. 또 다른 구체예에서, 과증식성 세포는 성장 인자, 사이토카인, 바이러스 감염 등에 의해 자극되어 과증식성 질환을 초래한다.
바람직한 구체예에서, 과증식된 세포를 우선적으로 죽이는데 효과적인 다가 작용제의 양은 적어도 과증식된 세포의 세포 표면 수용체를 포화시키기에 충분한 양이다. 보다 바람직한 구체예에서, 과증식된 세포를 우선적으로 죽이는데 효과적인 다가 작용제의 양은 환자의 건강을 위해 허용되는 범위내에서 정상 세포의 생존력을 유지하면서, 고도로 발현된 세포 표면 항원을 소유하는 정상 세포의 세포 표면 수용체를 포화시키기에 충분하다. 정상 세포에 비해 과증식된 세포의 우선적인 사멸은 일반적으로 과증식된 세포의 생존력을 감소시키기에 충분하나 정상 세포의 생존력을 동일한 정도로 감소시키기에 충분하지 않은 양의 다가 작용제를 제공함에 의해 달성된다. 예를 들어, 세포막 손상(wounding) 항체를 이용하여, 신생물 세포 및 정상 세포 둘 모두가 이들 각각의 표면상에 동일한 세포 표면 항원을 발현시킬 때 조차도, 신생물 세포의 생존력을 정상 세포의 생존력에 비해 적어도 10% 넘게, 보다 바람직하게는 20% 넘게, 및 심지어 보다 바람직하게는 30%를 넘는 양까지 감소시킬 수 있다.
따라서, 일 구체예에서, 암 세포를 암 세포에 세포막 손상을 유도하는 세포독성량의 항체와 접촉시키는 것을 포함하여, 암 세포를 치사시키는 방법을 제공한다. 세포막 손상 세포독성은 보체 매개된 세포독성 또는 세포 매개된 세포독성과는 별개이다. 추가의 구체예에서, 세포막 손상 항체는 세포막 손상 메커니즘 뿐만 아니라 보체 및/또는 세포 매개된 세포독성 메커니즘에 의해 암 세포에 대해 세포독성이다.
바람직하게는, 다가 작용제를 신생물 세포와 같은 과증식된 세포를 죽이는데 효과적이나 비신생물 세포를 죽이지 않는 양으로 투여한다. 또 다른 구체예에서, 다가 작용제를 과증식된 세포를 죽이는데 효과적이나, 정상적인 운동성 또는 정상적인 부착 특성을 나타내는 세포를 죽이지 않는 양으로 투여한다.
실시예 10에서 논의되고, 도 8에 도시된 대로, 다가 작용제의 농도에 대한 세포 생존력의 의존성은 세포 유형간에 상당히 다양할 수 있다. 예를 들어, 실시예 10에서, 비장 세포는 약 5 ㎍/ml의 농도에서 약 65%의 생존력을 나타내었으나, Nalm-6 세포는 동일한 항체 농도에서 단지 약 42%의 생존력을 나타내었다. 이러한 양의 항체는 Nalm-6 세포 상에서 CDIM 에피토프의 전체 양에 대해 적어도 3배 초과를 제공하기에 충분하며, 비장 B 세포의 경우에 5배 초과에 더 근접하다. 약 10 ㎍/ml의 보다 높은 항체 농도에서, 비장 B 세포는 약 48%의 생존력을 나타낸 반면, Nalm-6 세포는 단지 약 30%의 생존력을 나타내었다. 따라서, B 세포주는 정상 B 림프구에 비해 CDIM 결합 항체를 이용한 치사에 대해 더 큰 감수성을 나타내었으며, 이는 신생물 B 세포가 정상 B 세포에 비해 mAb 216을 이용한 치사에 대해 보다 감수성을 지님을 시사한다.
이론에 얽매이길 원치 않으며, 빠르게 분열되는 세포내 막 소통의 정지는 손상을 입은 세포에서 세포 생존력을 유지하는데 요구되는 회복 메커니즘을 방해하거나 느리게 한다는 가설이 세워진다. 대안적으로, B 세포의 근원적인 세포골격을 지니는 특히 CDIM 에피토프와 관련하여, 증가된 감수성을 야기하는 신생물 B 세포 및 성숙 B 세포간의 추가적인 차이, 또는 부착 분자의 차별적인 발현 또는 활성, 및/또는 세포의 운동성을 들 수 있다.
또 다른 구체예에서, 세포를 세포의 표면상에 존재하는 고도로 발현된 세포 표면 항원과 결합하는 다가 작용제와 접촉시키는 것을 포함하여, 세포막 손상을 유도하는 방법이 제공되며, 이 때 세포는 림프계 세포이다. 특정 구체예에서, 다가 작용제는 항체이고, 림프계 세포는 CDIM 에피토프를 발현시키는 B 세포이다. 바람직하게는, 항체를 정상 B 세포에 비해 과증식된 B 세포를 우선적으로 손상 입히기에 효과적인 양으로 투여한다. 상세한 구체예에서, 상기 방법은 (1) 치료가 필요한 환자의 혈액을 샘플링하여 환자의 혈액 중 과증식된 B 세포의 수를 측정하는 단계, (2) 항체에 의한 손상에 대해 과증식된 B 세포 및 정상 B 세포의 감수성을 측정하는 단계, 및 (3) 환자에서 과증식된 B 세포를 우선적으로 손상 입히고/거나 치사시키기에 충분한 양의 항체를 환자에게 투여하는 단계를 포함한다. 상기 방법은 추가량의 항체를 환자에게 적정하여 요망되는 양의 세포 손상 및/또는 치사를 달성하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 상기 방법은 세포를 세포독성제와 접촉시키는 단계를 추가로 포함할 수 있다.
또 다른 구체예에서, 상기 방법은 (1) 치료가 필요한 환자의 혈액을 샘플링하여 환자의 혈액 중 과증식된 B 세포의 수를 측정하는 단계, (2) 항체에 의한 손상에 대해 과증식된 B 세포의 감수성을 측정하는 단계, 및 (3) 환자에서 과증식된 B 세포를 손상 입히기에 충분한 양의 항체를 환자에게 투여하는 단계를 포함한다. 상기 방법은 추가량의 항체를 환자에게 적정하여 요망되는 양의 세포 손상 및/또는 치사를 달성하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 상기 방법은 세포를 세포독성제와 접촉시키는 단계를 추가로 포함할 수 있다.
VII. 세포막 손상을 증가시키기 위한 방법 및 조성물
추가의 구체예에서, 고도로 발현된 세포 표면 항원과 결합하는 다가 작용제를 포함하는 세포막 손상을 유도하기 위한 조성물이 제공되고, 여기서 세포막 손상을 유도하기 위한 조성물은 가교제의 부재하에 일어나는 다가 작용제의 세포독성에 비해 다가 작용제의 세포독성을 증가시키는 가교제를 추가로 포함할 수 있다.
상세한 구체예에서, 다가 작용제는 항체이고, 바람직하게는 IgM이다. 또 다른 상세한 구체예에서, 가교제는 IgM과 결합하여, 세포의 표면에 결합된 IgM의 가교, 및 추가로 추가의 막 손상 및 세포독성을 제공하는 항체이다. 바람직한 구체예에서, 세포막 손상은 가교제에 의해 증가된다. 특정 바람직한 구체예에서, 증가는 약 25% 이상이고, 보다 바람직하게는 약 50% 이상이다.
또 다른 구체예에서, 세포를 세포의 표면상에서 고도로 발현된 세포 표면 항원과 결합하는 다가 작용제와 접촉시키는 것을 포함하여, 세포막 손상을 유도하는 방법을 제공하며, 이는 세포를 가교제의 부재하에 일어나는 다가 작용제의 세포독성에 비해 다가 작용제의 세포독성을 증가시키는 가교제와 접촉시키는 것을 추가로 포함한다. 바람직한 구체예에서, 다가 작용제는 IgM이고, 가교제는 IgM과 결합하여 세포의 표면에 결합된 IgM의 가교를 제공하는 항체이다. 바람직하게는, 세포가 B 세포이고, 항체가 B 세포의 표면상에서 CDIM 에피토프에 대한 결합 특이성을 지니는 IgM이다. 일 구체예에서, 항체는 VH4-34 항체이고, 가교제가 항-카파 항체, 항-람다 항체 또는 항-VH4-34 항체이다.
따라서, 골수 세포를 B 세포의 표면상에서 CDIM 에피토프에 대해 특이적 결합을 지니는 항체와 접촉시키는 것을 포함하여, 이를 필요로 하는 환자로부터 악성 B 세포의 골수를 퍼징(purging)하는 방법을 제공한다. 상기 방법은 B 세포를 B 세포 표면상에서 CDIM 에피토프에 결합된 항체를 가교시키는 가교제와 접촉시켜, 악성 B 세포에 대하여 항-CDIM 항체의 증가된 세포독성을 제공하는 것을 추가로 포함할 수 있다. 보다 바람직한 구체예에서, 상기 방법은 세포를 악성 B 세포의 골수를 추가로 퍼징시키는 세포독성제와 접촉시키는 것을 추가로 포함한다.
또 다른 구체예에서, 세포의 표면상에 존재하는 고도로 발현된 세포 표면 항원과 결합하는 다가 작용제를 포함하는 과증식된 세포를 죽이기 위한 조성물이 제공되며, 상기 다가 작용제는 세포의 표면에 결합된 가교된 다가 작용제를 제공하기 위한 가교 수단을 포함한다. 가교된 다가 작용제는 상기 가교 수단의 부재하에서의 다가 작용제에 비해 과증식된 세포의 증가된 치사를 제공한다.
또 다른 구체예에서, 세포의 표면상에 존재하는 고도로 발현된 세포 표면 항원에 결합하는 다가 작용제를 포함하는, 세포의 과증식을 특징으로 하는 질병에 걸린 포유동물을 치료하기 위한 조성물을 제공한다. 바람직하게는, 조성물이 다가 작용제의 세포독성을 증대시키는 가교 수단을 추가로 포함한다. 바람직하게는, 다가 작용제가 세포가 회복할 수 없는 세포막 손상을 유도함에 의해 과증식된 세포를 치사시킨다.
상세한 구체예에서, 가교 수단은 세포상에서 고도로 발현된 세포 표면 항원에 결합하는 다가 작용제에 공유적으로 결합된 작용기화된 작용제일 수 있고, 세포에 결합된 인접한 다가 작용제에 가교될 수 있다. 예를 들어, 모노-, 디- 및 트리-작용기성 가교제가 다가 작용제에 공유적으로 부착될 수 있다. 가교제는 세포의 표면 상에서 고도로 발현된 세포 표면 항원에 결합된 인접한 다가 작용제와 가교되는 가교제의 원위 말단에 말레이미드, 숙신이미드, 카르보디이미드, 또는 티올 등과 같은 작용기를 포함할 수 있다. 예를 들어, 본원에 참조로서 포함된 미국특허 출원 공개 제 2004/0121951호는 현재 기술된 조성물에 사용될 수 있는 가교제의 수많은 예를 기술하고 있다. 당업자는 조성물에 적용될 수 있는 가교 수단에 특별한 제한이 없음을 인식할 것이다. 가교제가 인접한 다가 작용제에 접촉하는 충분한 길이를 지니고, 인접한 다가 작용제에 결합하는는 충분한 반응성을 지니는 한 임의의 가교 수단을 이용할 수 있다.
바람직하게는, 다가 작용제가 항체이며, 예컨대 IgM, IgG, IgA, IgD, IgE를 포함하는 천연 항체; 재조합 항체 또는 키메라 항체; 모노클로날 항체; 폴리클로날 항체; 예를 들어 본원에 참조로서 포함된 WO 02/096948 호에 기술된 4가 항체와 같은 합성 항체, 또는 항체를 포함하는 융합 단백질; Fab2, scFv 등과 같은 항체 단편이 있다. 바람직한 구체예에서, 항체는 IgM이다.
추가의 구체예에서, 가교 수단은 항체에 결합되는 가교제일 수 있다. 바람직한 구체예에서, 가교 수단은 세포의 표면상에서 고도로 발현된 세포 표면 항원에 결합된 인접한 항체를 가교시키는 항-카파 또는 항-람다 또는 항-mu 작용제이다. 추가의 바람직한 구체예에서, 다가 작용제는 VH4-34 클래스 항체의 IgM 항체이고, 예컨대 mAb 216, RT-2B, FS 12, A6(H4C5), Cal-4G, S20A2, FS 3, Gee, HT, Z2D2 또는 Y2K가 있고, 가교제는 항체를 결합시키는 항-VH4-34 항체이다. 바람직하게는, 항-VH4-34 항체가 세포 표면 항원에 대한 VH4-34 항체의 결합을 억제하지 않는다. 상세한 구체예에서, 항-VH4-34 항체가 9G4이다.
또한 또 다른 구체예에서, 가교 수단은 약 100 내지 약 1,000,000 돌턴, 또는 보다 바람직하게는 약 1000 내지 약 250,000 돌턴의 분자량을 지니고, 세포의 표면상에서 고도로 발현된 세포 표면 항원에 대해 특이적 결합을 지니는 다수의 다가 작용제를 포함하는 친수성 중합체 또는 중합체의 네트워크일 수 있다. 친수성 중합체는 폴리펩티드 또는 탄수화물일 수 있다. 폴리펩티드는 (Ala)nLys (여기서, n은 예를 들어 2 내지 20일 수 있다)과 같이, 폴리펩티드 주쇄에 다가 작용제의 공유 부착을 촉진시키는 유리 아미노기를 포함하는 염기성 아미노산을 포함할 수 있다. 공유적으로 부착된 다가 작용제는 예를 들어 Fab', Fab2', 또는 완전한 IgM과 같은 항체 단편을 포함할 수 있다. 공유 부착은 임의의 적합한 부착 수단을 사용할 수 있으나 디숙신이미드 또는 디말레이미드 가교제와 같은 이작용기성 가교제를 이용하여 편리하게 제공될 수 있다.
고도로 발현된 세포 표면 항원에 결합된 다가 작용제는 바람직하게 특이적 결합을 나타내고, 즉 높은 친화력으로 결합된다. 통상적으로, 고 친화력 결합은 적어도 106M-1이고, 통상적으로 약 106M-1 내지 약 108M-1이다.
추가의 구체예에서, 세포의 표면상에 존재하는 고도로 발현된 세포 표면 항원에 결합하는 다가 작용제를 포함하는 세포의 과증식을 특징으로 하는 질병에 걸린 포유동물을 치료하기 위한 약제 조성물이 제공되며, 여기서 상기 다가 작용제는 세포의 표면상에 세포 표면 항원에 대한 다수의 결합 부위를 포함한다. 바람직하게는, 다수의 결합 부위가 5개 이상이고, 보다 바람직하게는 약 5개 내지 약 100개이다. 상세한 구체예에서, 다수의 결합 부위는 약 5개 내지 약 15개, 약 15개 내지 약 25개, 또는 약 15개 내지 약 50개, 또는 이를 초과할 수 있다.
바람직하게는, 세포 표면 항원에 대한 다수의 결합 부위를 포함하는 다가 작용제가 보다 많은 수의 결합 부위와 관련된 과증식된 세포의 증대된 세포독성을 제공한다.
VIII. 생체내 치료적 용도
세포 손상 항체 mAb216을 실시예 12에 상세하게 기술된 대로, 사람 환자에서 생체내 시험하였다. 환자(ALL로 진단된 성인)는 화학요법 약물(VCR/DNR/ASPR/프레드니손)의 표준 섭생으로는 치료가 어려웠고, 즉 화학요법 치료에 반응하여 모세포총수가 더 이상 감소하지 않았고, 환자들은 말기였다. 항체를 도 9a 및 도 9b에서 화살표로 나타낸 대로, 0일 및 7일에 1.25 mg/kg의 용량으로 두 환자에게 투여하였다. 환자의 체중, 복용량 및 대략의 혈청 부피 (30% 헤마토크릿으로 추정함)에 근거하여, 대략의 혈청 항체 농도는 혈청 1 ml에 대해 각각 26 ㎍ 및 25 ㎍이 되었다. 각 환자(환자 1 및 환자 2)에서의 모세포 총수는 mAb 216 + VCR 치료시 각각 약 125 x 106/ml 및 65 x 106/ml이었다. 약 106 세포/ml의 농도에서 수행된 시험관내 연구에 비해, 이러한 mAb 농도는 B 세포의 mAb 216 치사에 대해 시험관내에서 입증된 치사 역치 농도 보다 훨씬 낮은 농도인 약 0.2 ㎍/106 세포 및 0.38 ㎍/106 세포에 각각 상응한다.
VCR의 부재하에, 모세포 총수는 일시적으로 감소되었으며, 이 결과는 시험된 낮은 항체 농도에서의 mAb 216 매개된 세포 손상 때문이라기 보다 보체 매개된 세포 치사 때문인 듯 하다. 그러나, VCR과 조합시키는 경우, 도 9a 및 9b에서 입증된 대로, 모세포 총수의 급격한 감소가 관찰되었으며, 이는 상기 환자의 수명을 연장시켰다. 이러한 데이터는 백혈병 모세포의 급격히 증가된 세포 치사가 생체내에서 mAb 216 및 VCR의 상승적인 조합에 기인한 것임을 입증한다. 심지어 mAb 216의 매우 낮은 농도 (준치사)에서, 모세포가 mAb 216 처리에 의해 단지 손상을 입거나 투과된 경우에도, VCR 독성에 대한 세포의 감수성은 두드러지게 증가하였으며 처리 효능도 증가하였다. 따라서, 이러한 결과는 암 치료 효능에서의 현저한 진보를 나타낸다.
IX. 키트
본원에 기술된 다가 작용제, 특히 세포막 손상 항체를 치료가 필요한 환자에게 요구되는 다가 작용제의 용량 역치를 결정하기 위한 키트에 사용할 수 있다. 고도로 발현된 세포 표면 항원에 결합하는 다가 작용제의 충분한 양을 포함하여 결합 검정을 수행하거나 다가 작용제에 의해 유도된 세포 손상 및/또는 치사 정도를 결정하는 키트를 제공함으로써 포유동물에서 세포막 손상을 유도하는 다가 작용제의 용량을 결정할 수 있다. 추가의 구체예에서, 키트는 포유동물에서 세포막 손상 항체에 대한 용량 역치를 결정하기 위해 제공되며, 고도로 발현된 세포 표면 항원에 결합되는 세포막 손상 항체의 충분한 양을 포함하여 결합 검정을 수행하거나 다가 작용제에 의해 유도된 세포 손상 및/또는 치사 정도를 결정한다. 키트는 또한 세포독성제의 존재하에 다가 작용제에 대한 용량 역치를 결정하기 위해 가교제, 또는 세포독성제, 또는 이들의 조합물 및/또는 세포막 손상을 증가시키는 가교제를 포함할 수 있다. 통상적으로, 환자 자신의 세포 (예컨대, 혈구, 종양 세포 등)를 수득하여 키트내에 함유된 시약을 이용하여 시험함으로써 세포상에 발현된 세포 표면 항원의 수를 결정할 뿐만 아니라 소정량의 다가 작용제에 의해 제공된 손상 및/또는 치사 정도를 결정한다.
X. 과증식된 세포
과증식된 세포를 특징으로 하는 질병으로는 암, 자가면역 질병, 바이러스 감염 및 면역결핍이 있다. 암은 임의의 세포 유형 또는 조직의 암을 포함할 수 있다. 바람직한 암으로는 B 세포 기원의 암, 예컨대 림프종 및 백혈병이 있다.
자가면역 질병으로는 전신홍반루푸스, 류마티스관절염, 자가면역 림프세포증식질환, 다발성 경화증, 건선, 및 중증 근육무력증이 있으나, 또한 하시모토 갑상샘염, 루푸스 신장염, 피부근육염, 쇼그렌 증후군, 알츠하이머병, 사이덴햄(Sydenham's) 무도병, 류마티스 열, 다중샘 증후군, 수포 유사천포창, 당뇨병, 헤노크-스콘레인(Henoch-Schonlein) 자색반병, 스트렙토코커스 감염후 신장염, 결절 홍반, 타카야스(Takytasu's) 동맥염, 에디슨병, 크론병, 사르코이드증, 궤양결장염, 다형홍반, IgA 신장병증, 다발성 결절동맥염, 강직척추염, 굿패스쳐(Goodpasture's) 증후군, 혈전혈관염 유비테란스(ubiterans), 초기 담관성 간경화, 갑상샘항진증, 피부경화증, 만성 활동 간염, 다발근육염/피부근육염, 다발연골염, 보통천포창, 베그너(Wegener's) 육아종증, 사구체신염, 근육위축가쪽경화증, 척수매독, 거대세포 동맥염/다발근육통증, 악성빈혈, 급속진행 사구체신염, 섬유화 폐포염, 클래스 III 자가면역 질병, 예컨대 면역-매개된 저혈소판증, 예컨대 급성 특발혈소판감소자색반병 및 만성 특발혈소판감소자색반병 등을 포함할 수 있다.
바이러스 감염은 또한 다수의 세포 유형 및 조직에서 세포 과증식성 질병 및 질환을 야기할 수 있다. 과증식을 유도하는 바이러스 감염의 예로는 HTLV-1, HTLV-2를 포함하는 사람 면역결핍 바이러스(HIV) 감염, 엡스타인 바 바이러스(EBV) 감염, 사람 파필로마 바이러스(HPV) 감염 등이 있다.
XI. 추가의 세포독성제와의 조합
본 발명자들은 세포 손상 항체의 독성이 화학치료제, 방사성 동위원소, 세포독성 항체, 면역컨쥬게이트, 리간드 컨쥬게이트, 면역억제제, 세포 성장 조절제 및/또는 억제제, 독소 또는 이들의 혼합물을 포함하는 세포독성제를 첨가하여 현저하게 및 심지어 상승적으로 증가될 수 있다는 놀라운 발견을 하였다.
본 발명의 제형 및 방법에 이용될 수 있는 화학치료제로는 탁산, 콜치신, 빈카 알칼로이드, 에피포도필로톡신, 캄프토테신, 항생제, 백금 배위 착물, 알킬화제, 폴산 유사체, 피리미딘 유사체, 푸린 유사체 또는 토포이소머라제 억제제가 있다. 바람직한 토포이소머라제 억제제는 에피포도필로톡신이다. 바람직한 피리미딘 유사체는 카페시타빈, 5-플루오로우라실, 5-플루오로데옥시우리딘, 5-플루오로데옥시우리딘 모노포스페이트, 시토신 아라비노시드, 5-아자시티딘 또는 2',2'-디플루오로데옥시시티딘이다. 바람직한 푸린 유사체는 메르캅토푸린, 아자티오프렌, 티오구아닌, 펜토스타틴, 에리트로히드록시노닐아데닌, 클라드리빈, 비다라빈 및 플루다라빈 포스페이트이다. 폴산 유사체로는 메토트렉세이트, 랄티트렉시드, 로메트렉솔, 페르메프렉시드, 에다트렉세이트 및 페메트렉시드가 있다. 바람직한 에피포도필로톡신은 에토포시드 또는 테니포시드이다. 바람직한 캄프토테신은 이리노토칸, 토포테칸, 또는 캄프토테칸이다. 바람직하게는, 항생제가 닥티노마이신, 다우노루비신(다우노마이신, 다우녹솜), 독소루비신, 이다루비신, 에피루비신, 발루부신, 미토칸트론, 블레오마이신, 또는 미토마이신이다. 바람직한 백금 배위 착물은 시스플라틴, 카르보플라틴 또는 옥살리플라틴이다. 바람직하게는, 알킬화제가 메클로레타민, 시클로포스파미드, 이포스파미드, 멜팔란, 다카르바진, 테모졸로미드, 티오테파, 헥사메틸멜라민, 스트렙토조신, 카르무스틴, 부술판, 알트레타민 또는 클로르암부실이다.
화합요법제의 추가의 예로는 티오테파 및 시클로포스파미드 (시톡산™)와 같은 알킬화제;
부술판, 임프로술판 및 피포술판과 같은 알킬 설포네이트;
벤조도파, 카르보쿠온, 메투레도파, 및 우레도파와 같은 아지리딘;
알트레타민, 트리에틸렌멜라민, 트리에틸렌포스포르아미드, 트리에틸렌티오포스포르아미드 및 트리메틸올로멜라민을 포함하는 에틸렌이민 및 메틸아멜라민;
아세토게닌 (특히 불라타신 및 불라타시논);
캄프토테신 (합성 유사체 토포테칸 포함);
브리오스타틴; 칼리스타틴; CC-1065 (이의 아도젤레신, 카르젤레신 및 비젤레신 합성 유사체 포함);
크립토피신 (특히 크립토피신 1 및 크립토피신 8);
돌라스타틴; 두오카르마이신 (합성 유사체, KW-2189 및 CBI-TMI 포함);
엘레우테로빈; 판크라티스타틴; 사르코딕티인; 스폰기스타틴;
질소 무스타드, 예컨대 클로르암부실, 클로르나파진, 콜로포스파미드, 에스트라무스틴, 이포스파미드, 메틀로르에타민, 메틀로르에타민 옥사이드 히드로클로라이드, 멜팔란, 노벰비친, 페네스테린, 프레드니무스틴, 트로포스파미드, 우라실 무스타드;
니트로스우레아, 예컨대 카르무스틴, 클로로조토신, 포테무스틴, 로무스틴, 니무스틴, 라니무스틴;
항생제, 예컨대 에네디인 항생제 (예컨대, 칼리케아미신, 특히 칼리케아미신 감마1I 및 칼리케아미신 phiI1, 참조, 예컨대 문헌[Agnew (1994) Chem. Intl. Ed. Engl., 33, 183-186]; 다이네미신, 다이네미신 A 포함; 비스포스포네이트, 예컨대 클로드로네이트; 에스페르아미신; 뿐만 아니라 네오카르지노스타틴 발색단 및 관련 색소단백질 에네디인 항생 발색단), 아클라시노마이신, 악티노마이신, 오트라마이신, 아자세린, 블레오마이신, 칵티노마이신, 카라비신, 카르미노마이신, 카르지노필린, 크로모마이신, 닥티노마이신, 다우노루비신, 데토루비신, 6-디아조-5-옥소-L-노르류신, 독소루비신 (아드리아마이신™)(모르폴리노-독소루비신, 시아노모르폴리노-독소루비신, 2-피롤리노-독소루비신 및 데옥시독소루비신 포함), 에피루비신, 에소루비신, 이다루비신, 마르셀로마이신, 미토마이신, 에컨대 미토마이신 C, 미코페놀산, 노갈라마이신, 올리보마이신, 페플로마이신, 포트피로마이신, 푸로마이신, 퀄라마이신, 로도루비신, 스트렙토니그린, 스트렙토조신, 투베르시딘, 우베니멕스, 지노스타틴, 조루비신;
항-대사제, 예컨대 메토트렉세이트 및 5-플루오로우라실 (5-FU);
데노프테린, 메토트렉세이트, 프테로프테린, 트리메트렉세이트와 같은 폴산 유사체;
폴린산과 같은 폴산 재저제;
푸린 유사체, 예컨대 플루다라빈, 6-메르캅토푸린, 티아미프린, 티오구아닌;
피리미딘 유사체, 예컨대 안시타빈, 아자시티딘, 6-아자우리딘, 카르모푸르, 시타라빈, 디데옥시우리딘, 독시플루리딘, 에노시타빈, 플록수리딘;
안드로겐, 예컨대 칼우스테론, 드로모스타놀론 프로피오네이트, 에피티오스탄올, 메피티오스탄, 테스토락톤;
항-부신제, 예컨대 아미노글루테트이미드, 미토탄, 트릴로스탄;
아세글라톤; 알도포스파미드 글리코시드; 아미노레불린산; 에닐우라실; 암사크린; 베스트라부실; 비산트렌; 에다트락세이트; 데포파민; 데메콜신; 디아지쿠온; 엘포르니틴; 엘리프티늄 아세테이트; 에포틸론; 에토글루시드; 갈륨 니트레이트; 히드록시우레아; 렌티난; 로니다민; 마이탄시노이드, 예컨대 마이탄신 및 안사미토신; 미토구아존; 미토크산트론; 모피다몰; 니트라크린; 펜토스타틴; 페나메트; 피라루비신; 로소크산트론; 포토필린산; 2-에틸히드라지드; 프로카르바진; PSK®; 라족산; 리조신; 시조피란; 스피로게르마늄; 테누아존산; 트리아지쿠온; 2,2',2"-트리클로로트리에틸아민; 트리코테센 (특히 T-2 독소, 베라쿠린 A, 로리딘 A 및 안가이딘); 우레탄; 빈데신; 다카르바진; 만노무스틴; 미토브로니톨; 미토락톨; 피포브로만; 가시토신; 시토신, 아라비노시드 ("Ara-C");
시클로포스파미드; 티오테파; 탁소이드, 예컨대 파클리탁셀 (탁솔®, Bristol-Myers Squibb Oncology, Princeton, N.J.) 및 독세탁셀 (탁소테레®, Rhone-Poulenc Rorer, Antony, France); 클로르암부실; 겜시타빈 (겜자르™); 6-티오구아닌; 메르캅토푸린; 메토트렉세이트;
백금 유사체, 예컨대 시스플라틴 및 카르보플라틴;
빈블라스틴, 빈크리스틴; 비노렐빈 (나벨빈™);
에토포시드(VP-16); 이포스파미드; 미토크산트론; 노반트론; 테니포시드; 에다트렉세이트; 다우노마이신; 아미노프테린; 젤로다; 이반드로네이트; CPT-11;
토포이소머라제 억제제 RFS 2000; 디플루오로메틸오르니틴 (DMFO);
레티노이드, 예컨대 레틴산; 카페시타빈; 및 약제학적으로 허용되는 상기 중 임의의 염, 산, 또는 유도체가 있다.
미세관의 중합반응 또는 탈중합반응을 방해하는 작용제가 특히 바람직하다. 예시적인 작용제로는 콜치신, 빈카 알칼로이드, 예컨대 빈크리스틴, 빈블라스틴, 빈데신 또는 비노렐빈, 및 탁산, 예컨대 탁솔, 파클리탁셀 및 도세탁셀이 있다. 상기 작용제의 임의의 혼합물을 사용할 수도 있다.
추가로 바람직한 작용제는 항-액틴제이다. 바람직한 구체예에서, 항-액틴제는 자스플라키놀리드 또는 시토칼라신이고, 예를 들어 신생물 세포의 골수를 퍼징하기 위한 생체외 치료에 사용된다.
독소는 면역컨쥬게이트, 리간드 컨쥬게이트로서 투여되거나 항체와 공동 투여될 수 있다. 독소로는 슈도모나스(Pseudomonas) 외독소 A, 리신, 디프테리아 독소, 모모르딘, 억새풀 항바이러스 단백질, 스타필로코커스(Staphylococcal) 내독소 A, 겔로닌, 마이탄시노이드 (예컨대, 미국특허 제 6,441,163호에 기술됨) 등이 있으나, 이로 제한되지 않는다.
XII. 항체
본 발명에 유용한 세포 손상 세포는 임의의 고도로 발현된 세포 표면 항원에 대한 항체를 포함할 수 있다. 세포 표면 항원은 수용체, 면역글로불린, 시토킨, 당단백질 등과 같은 세포 표면 발현된 분자를 포함한다. 바람직한 세포 표면 항원은 세포골격과 관련된다.
바람직한 세포 손상 항체는 세포골격과 관련된 세포 표면 항원에 대한 항체를 포함하는데, 이러한 특징은 세포 손상을 증가시키는 것으로 보인다. 바람직한 세포 손상 항체는 VH4-34 유전자 엔코딩된 항체, 예를 들어 항-CDIM 항체를 포함한다. 상기 논의된 대로, "항체"라는 용어는 이의 가장 넓은 의미로 사용되며 Fc 부분을 포함하지 않는 항체 단편 (예컨대, 비-Fc 함유 항체)을 포함한다. 항체 및 항체 단편의 예는 Fab, Fab', F(ab')2, 및 Fv 단편; 디아보디(diabodies); 선형 항체 (Zapata 등, (1995) Protein Eng. 8(10), 1057-1062) 단쇄 항체 분자; 및 항체 단편으로부터 형성된 다중특이적 항체를 포함할 수 있다. "항체" 및 "항체 단편"이라는 용어는 이하 이들이 기술된 바와 같이 항체 결합 특성을 나타내는 개발된 작용제를 포함한다. 바람직하게는, 가교성 항체 결합이 세포 표면 항원에 대한 세포 손상 항체 또는 항체 단편의 결합을 방해하지 않는 한, 항체 및 항체 단편은 가교제, 예컨대 세포 손상 항체 또는 세포 손상 항체 단편의 일부에 대해 특이적 결합을 지니는 항체와 추가로 가교될 수 있다. 바람직한 구체예에서, 가교제는 세포에 결합된 세포 손상 항체와 결합하는 가교 항체이다. 바람직하게는, 가교 항체가 세포 손상 항체의 결합을 방해하지 않는다. 일 구체예에서, 세포 손상 항체는 Fc 부분을 포함하고, 가교제는 세포 손상 항체의 Fc 부분에 결합한다. 추가의 구체예에서, 가교제는, 만약 존재한다면, Fc 부분이 아닌 항체의 일부에 결합한다.
바람직한 구체예에서, 세포 손상 항체는 VH4-34 항체이고, 바람직하게는 항-CDIM 항체이다. 항-CDIM 항체는 세포를 손상 입히거나, 투과하거나, 죽이는데 사용될 수 있다. 상세한 구체예에서, 항-CDIM 항체는 항체 단편, 예컨대 Fab2'이고, 항-CDIM 항체에 대해 특이적 결합을 지니는 항체에 의해 가교될 수 있다 (예컨대, 9G4). 바람직하게는, 가교 항체가 세포상에서 CDIM 에피토프에 대한 항-CDIM 항체의 결합을 억제하지 않으며, 세포상에서 CDIM 에피토프에 결합된 항-CDIM 항체의 가교를 제공한다.
항-CDIM 항체는 세포, 예컨대 B-세포상에서 세포 표면 분자에 대해 특이적 결합을 지니는 추가의 세포독성 항체와 함꼐 사용될 수 있다. 항-CDIM 항체 및 추가의 세포독성 항체는 조합 치료 섭생으로 사용될 수 있다. 바람직한 구체예에서, 세포독성 항체는 B 세포상에서 임의의 세포 표면 분자에 대해 특이적 결합을 지닐 수 있다. 예를 들어, 세포독성 항체는 B 세포상의 세포 표면 분자, 예컨대 비제한적으로 CD11a, CD19, CD20, CD21, CD22, CD25, CD34, CD37, CD38, CD40, CD45, CD52, CD80, CD86, IL-4R, IL-6R, IL-8R, IL-13, IL-13R, α-4/β-1 인테그린 (VLA4), BLYS 수용체, 세포 표면 유전형 Ig, 종양 괴사 인자(TNF), 또는 이들의 혼합물에 대해 특이적 결합을 나타낼 수 있다. 예를 들어, CD11a에 대해 특이적 결합을 지니는 세포독성 항체는 예를 들어 에팔리주맵(RAPTIVA)일 수 있다. CD20에 대해 특이적 결합을 지니는 세포독성 항체는 리툭시맵(RITUXAN)일 수 있다. CD22에 대해 특이적 결합을 지니는 세포독성 항체는 예를 들어 에프라투주맵일 수 있다. CD25에 대해 특이적 결합을 지니는 세포독성 항체는 예를 들어 다클리주맵(ZENAPAX) 또는 바실릭시맵(SIMULECT)일 수 있다. CD52에 대한 항체로는, 예컨대 CAMPATH가 있다. α-4/β-1 인테그린 (VLA4)에 대한 항체로는, 예컨대 나탈리주맵이 있다. TNF에 대한 항체로는 예를 들어 인플릭시맵(REMICADE)이 있다.
따라서, 바람직한 구체예에서, B 세포 상에서 CDIM 에피토프에 대해 특이적 결합을 지니는 항체를 RITUXAN, ZENAPAX, REMICADE 또는 RAPTIVA, 예를 들어 이들의 조합물과의 병용된 면역치료 섭생으로 이용할 수 있다. 세포독성 항체를 예를 들어 방사성 동위원소 또는 독소를 포함하는 면역컨쥬게이트로서 이용할 수도 있다. 또한, 추가의 구체예에서, B 세포 상에서 CDIM 에피토프에 대해 특이적 결합을 지니는 항체, B 세포 상에서 세포 표면 분자에 대해 특이적 결합을 지니는 추가의 세포독성 항제, 및 하나 이상의 화학치료제를 포함하는 병용된 치료를 이용할 수 있다. 예를 들어, mAb 216을 리툭시맵, 토수티맵 또는 이브리투모맵과 같은 항CD20 항체와 함께, 에프라투주맵과 같은 항-CD22 항체와 함께, 또는 CAMPATH와 같은 항-CD52 항체와 함꼐 사용할 수 있었다. 병용 치료는 조합된 화학치료 및 면역치료 섭생으로 세포의 세포골격을 파괴하는 작용제, 예컨대 빈크리스틴과 같은 화학치료제를 추가로 포함할 수 있다.
XIII. 방사성 동위원소
치료학적으로 유용한 면역- 또는 리간드 컨쥬게이트를 제조하는데 사용되는 동위원소는 통상적으로 치료학적으로 효과적인 통로 길이를 갖는 고에너지 α-, γ-, 또는 β-입자를 생산한다. 이러한 방사성 핵종은 밀접하게 근접한 세포, 예를 들어 컨쥬게이트에 결합된 신생 세포를 사멸시킨다. 타겟화된 전달의 잇점은, 방사성 표지된 항체 또는 리간드가 대개 타겟화된 세포에 바로 근접하지 않은 세포에 대해 거의 또는 전혀 영향을 미치지 않것이다.
세포독성제로서 방사성 동위원소의 사용과 관련하여, 개질된 항체 또는 리간드는 (예를 들어 요오드화를 통해) 직접적으로 표지될 수 있거나 킬레이트제를 사용하여 표지될 수 있다. 각 방법에서, 항체 또는 리간드는 하나 이상의 방사성 핵종으로 표지된다. 특히 바람직한 킬레이트제는 1-이소티오시아마토벤질-3-메틸디오텔렌 트리아민펜타아세트산("MX-DTPA") 및 시클로헥실 디에틸렌트리아민 펜타아세트산("CHX-DTPA") 유도체를 포함한다. 다른 킬레이트제는 P-DOTA 및 EDTA 유도체를 포함한다. 특히 간접 표지를 위한 바람직한 방사성 핵종은 111In 및 90Y를 포함한다.
방사성 동위원소는 항체 또는 리간드 상의 특정 사이트, 예를 들어 항체의 Fc 부분 상에만 존재하는 N-연결된 당 잔부에 부착될 수 있다. 테크네튬-99m 표지된 항체 또는 리간드는 리간드 교환 공정에 의해 또는 배치 표지 공정에 의해 제조될 수 있다. 예를 들어, 항체는, 퍼테크네이트(TcO4)를 주석 이온 용액으로 환원시키고, 환원된 테크네튬을 세파덱스(Sephadex) 컬럼 상에서 킬레이트화시키고, 항체를 이러한 컬럼에 적용하므로써 표지될 수 있다. 배치 표지 기술은, 예를 들어 퍼테크네이트, SnCl2와 같은 환원제, 나트륨-칼륨 프탈레이트 용액과 같은 완충 용액, 및 항체를 인큐베이션함을 포함한다. 표지화를 위한 바람직한 방사성 핵종은 당업계에 널리 공지되어 있다. 표지화를 위한 대표적인 방사성 핵종으로는 티로신 잔부에 의해 공유적으로 부착된 131I가 있다. 본 발명에 따른 방사성 표지된 항체는 방사성 나트륨 또는 칼륨 요오드 및 화학적 산화제, 예를 들어 차아염소산염, 클로르아민 T 등, 또는 효소적 산화제, 예를 들어 락토퍼옥시다제, 글루코즈 옥시다제 및 글루코즈로 제조될 수 있다.
킬레이트제 및 킬레이트제 컨쥬게이트와 관련한 특허는 당업계에 공지되어 있다. 예를 들어, 갠소우(Gansow)의 미국특허번호 제4,831,175호는 다치환된 디에틸렌트리아민펜타아세트산 킬레이트 및 이를 함유한 단백질 컨쥬게이트 및 이들의 제조방법에 관한 것이다. 갠소우의 미국특허번호 제5,099,069호, 제5,246,692호, 제5,286,850호, 제5,434,287호 및 제5,124,471호는 또한 다치환된 DTPA 킬레이트에 관한 것이다. 이들 특허는 본원에 전문이 참고문헌으로 포함된다. 양립성 금속 킬레이트제의 다른 예로는 에틸렌디아민테트라아세트산(EDTA), 디에틸렌트리아민펜타아세트산(DPTA), 1,4,8,11-테트라아자테트라데칸, 1,4,8,11-테트라아자테트라데칸-1,4,8,11-테트라아세트산, 1-옥사-4,7,12,15-테트라아자헵타데칸, 4,7,12,15-테트라아세트산 등이 있다. 시클로헥실-DTPA 또는 CHX-DTPA가 특히 바람직하다. 아직 발견되지 않은 것을 포함하여 또다른 양립성 킬레이트제는 당업자에 의해 용이하게 식별될 수 있으며, 명확하게 본 발명의 범위 내에 존재한다. 부가적인 킬레이트제는 특허번호 제6,682,734호, 제6,399,061호 및 제5,843,439호에 기술된 특정 이작용성 킬레이트제를 포함하며, 바람직하게는 3가 금속에 대해 높은 친화력을 제공하고, 증가된 종양-대-비종양 비율, 감소된 뼈 흡수 및 타겟 사이트, 예를 들어 B-세포 임파종 종양 사이트에서 방사성 핵종의 보다 큰 생체내 머무름을 나타내는 것으로 선택된다. 그러나, 이들 모든 특성을 지니거나 지니지 않을 수 있는 다른 이작용성 킬레이트제는 당업계에 공지되어 있으며, 또한 종양 치료법에서 유익할 수 있다.
개질된 항체는 또한 진단 및 치료 목적을 위해 방사성 표지에 컨쥬게이트될 수 있다. 종양의 진단적 "이미지화"를 위한 방사성 표지된 치료학적 컨쥬게이트는 또한 환자에게 항체 및 세포독성제를 투여하기 전에 사용될 수 있다. 예를 들어, C2B8로 공지된 모노클론 항체 결합 인간 CD20 항원은 이작용성 킬레이트제, 예를 들어 MX-DTPA(디에틸렌트리아민펜타아세트산)을 사용하여 111In과 방사성 표지될 수 있으며, 이는 1-이소티오시아네이토벤질-3-메틸-DTPA와 1-메틸-3-이소티오시아네이토벤질-DTPA의 1:1 혼합물을 포함한다. 111In은 바람직한 진단 방사성 동위원소인데, 이는 검출가능한 독성없이 약 1 내지 약 10 mCi로 안전하게 투여될 수 있기 때문이며, 이미지화 데이타는 이후 90Y-표지된 항체 분포의 지표이다. 이미지화 연구를 위해 111In-표지된 항체 5 mCi의 통상적인 용량이 사용되며, 최적의 이미지화는 표지된 항체 또는 리간드를 투여한 후 다양한 시간에, 통상적으로 투여하고 3일 내지 6일 후에 결정될 수 있다[참조, Murray, J.(1985) Nuc. Med. 26, 3328 및 Carraguillo et al., (1985) J. Nuc. Med. 26, 67].
여러 방사성 동위원소가 사용될 수 있으며, 당업자는 여러 조건 하에서 가장 적절한 방사성 동위원소를 용이하게 결정할 수 있다. 예를 들어, 131I는 종종 타겟화된 면역치료를 위해 사용된다. 그러나, 131I의 임상적 유용성은 이의 짧은 반감기(8 일), 혈액 및 종양 또는 부위 모두에서 요오드화된 항체의 탈할로겐화에 대한 가능성, 및 요망되는 경우 종양의 크기에 따라 종양에 충분하게 국소화된 선량의 증착을 제공하지 않을 수 있는 이의 고에너지 γ 방출에 의해 제한될 수 있다. 부가적인 킬레이트제의 출현과 함께, 금속 킬레이트 기를 단백질에 부착시키고 다른 방사성 핵종, 예를 들어 111In 및 90Y를 사용하기 위한 부가적인 기회가 제공된다. 90Y는 방사성면역치료 적용에서 사용하기 위한 수개의 잇점을 제공한다. 예를 들어, 90Y에 대한 보다 긴 64 시간의 유용한 반감기는 종양 세포에 의해 항체를 축적하기에 충분히 길며, 131I와 달리 90Y는 100 내지 1,000 세포 직경의 조직 범위를 갖는, 이의 붕괴에서 감마선을 수반하지 않는 고에너지의 순수한 베타 방사체이다. 더욱이, 방사선을 관통시키는 최소량은 통원환자에 대한 90Y-표지된 항체의 투여를 허용한다. 부가적으로, 표지된 항체의 흡수는 세포 사멸에 대해 요구되지 않으며, 이온화선은 타겟 항원이 부족하여 인접한 종양 세포에 치명적일 것이다.
90Y-표지된 항체의 효과적인 단일치료 용량(예를 들어, 치료학적 유효량)은 약 5 내지 약 75 mCi, 더욱 바람직하게는 약 10 내지 약 40 mCi이다. 131I-표지된 항체의 효과적인 단일치료 비골수 제거 용량은 약 5 내지 약 70 mCi, 더욱 바람직하게는 약 5 내지 약 40 mCi이다. 131I-표지된 항체의 효과적인 단일치료 제거 용량(예를 들어, 자가조직의 골수 이식을 요구할 수 있음)은 약 30 내지 약 600 mCi, 더욱 바람직하게는 약 50 내지 약 500 mCi 미만이다. 항체 또는 리간드가 무린(murine) 항체와 같은 외래 단백질과 비교하여 보다 긴 순환 반감기를 갖는 경우, 131I-표지된 항체의 효과적인 단일치료 비골수 제거 용량은 약 5 내지 약 40 mCi, 더욱 바람직하게는 30 mCi 미만이다. 방사성 동위원소 표지, 예를 들어 111In 표지를 위한 이미지화 용량은 통상적으로 약 5 mCi 미만이다.
131I 및 90Y가 임상에서 광범위하게 사용되는 동안, 다른 방사성 동위원소는 당업계에 공지되어 있으며, 유사한 목적을 위해 사용될 수 있다. 또다른 방사성 동위원소가 이미지화를 위해 사용된다. 예를 들어, 사용될 수 있는 추가 방사성 동위원소는 131I, 125I, 123I, 90Y, 111In, 105Rh, 153Sm, 166Ho, 177Lu, 및 188Re 및 186R, 32P, 57Co, 64Cu, 67Cu, 77Ga, 81Rb, 81Kr, 87Sr, 113In, 127Cs, 129Cs, 132I, 197Hg, 213Pb, 216Bi, 117Lu, 212Pb, 212Bi, 47Sc, 105Rh, 109Pd, 199Au, 225Ac, 211At 및 213Bi를 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 이와 관련하여, 알파, 감마 및 베타 방사체는 본 발명의 양태로서 모두 고려된다. 추가로, 당업자는 과도한 실험없이 선택적인 치료 과정과 양립하는 방사성 핵종을 결정할 수 있는 것으로 제안되었다. 마지막으로, 임상적 진단법에서 이미 사용되는 부가적인 방사성 핵종은 125I, 123I, 99Tc, 43K, 52Fe, 67Ga, 68Ga 및 111In을 포함한다. 항체는 또한 예를 들어 문헌[Peitersz et al.(1987) Immunol. Cell Biol. 65, 111-125]에 기술된 바와 같이, 타겟화된 면역치료법에서 잠재적인 용도를 위한 다양한 방사성 핵종으로 표지된다. 이들 방사성 동위원소로는 188Re, 186Re, 199Au 및 67Cu를 포함한다. 미국특허번호 제5,460,785호는 이러한 방사성 동위원소와 관련한 정보를 제공하며, 이는 본원에 참고문헌으로 포함된다.
XIV. 세포성장 조절제 및/또는 억제제
세포성장 조절제 및/또는 억제제는 소분자 치료제, 예를 들어 호르몬 또는 비호르몬 제제, 키나제 억제제, 프로테아좀 억제제, 유전제 치료제 또는 유전자 발현 개질제를 포함한다.
비호르몬 제제는 특히 호르몬 악화, 구체적으로 여성의 에스트로겐 작용이 수반되는 자가면역 질환의 치료에서 유용할 수 있다. 비호르몬제는 종양에서 호르몬 작용을 조절하거나 억제하도록 작용하는 것으로, 예로서, 탐목시펜(Nolvadex™를 포함), 랄록시펜, 드롤록시펜, 4-히드록시탐목시펜, 트리옥시펜, 케옥시펜, LY117018, 오나프리스톤 및 토레미펜(Fareston™)를 포함하는 항-에스트로겐 및 선택적 에스트로겐 수용체 조절제(SERMs); 부신선에서 에스트로겐 생성을 조절하는 방향화효소를 억제하는 방향화효소 억제제, 예를 들어 4(5)-이미다졸, 아미노글루테티미드, 메게스트롤 아세테이트(Megace™), 엑세메스탄, 포르메스탄, 파드라졸, 보로졸(Rivisor™), 레트로졸(Femara™), 및 아나스트로졸(Arimidex™); 항-안드로겐, 예를 들어, 플루타미드, 닐루타미드, 비칼루타미드, 루프롤리드 및 고세렐린; 및 임의의 상기의 약제학적으로 허용되는 염, 산 또는 유도체가 있다. 안드로겐 호르몬은 자가면역 질환의 치료에서 특히 유용할 수 있으며, 대표적인 안드로겐 호르몬으로는 디히드로에피안드로스테론(DHEA)이 있다. 선택적 안드로겐 수용체 조절제(SARMs)는 예를 들어, 허친손(Hutchinson)의 미국특허번호 제6,645,974호에 기술된 화합물, 예를 들어 안드로스탄 및 안드로스텐 카르복사미드를 포함한다.
키나제 억제제는 널리 공지된 것이며, 특히 바람직한 키나제 억제제는 bcr/abl 티로신 키나제 억제제, 예를 들어 짐메르만(Zimmermann)의 미국특허번호 제5,521,184호에 기술된 바와 같은 이마티닙(imatinib(Gleevec)) 및 이와 관련된 화합물을 포함한다. 부가적인 티로신 키나제 억제제는 Lyn 키나제의 활성 및 이의 전사에서 수반되는 신호 착물을 차단하는 제제, 예를 들어, Lyn 키나제의 활성을 차단하는 siRNAs를 포함할 수 있다. 또다른 부가적인 키나제 억제제는 비-호치킨 임파종에 대해 유도되는 세포사멸을 나타내는 문헌[Ben-Bassat, H. et al.(2002) J. Pharmacol. Exp. Ther. 303, 163]에 기술된 AGL 2592와 같은 화합물; DNA 결합 및 NF-카파 B-유래된 유전자 발현을 차단함을 나타낸 문헌[Mahon, TM and O'Neill, LA(1995) J. Biol. Chem. 270, 28557]에 기술된 헤르비마이신 A; 탕(Tang)의 미국특허번호 제6,680,335호에 기술된 것과 같은 인돌리논 화합물; 허스트(Hirst)의 미국특허번호 제6,660,744호에 기술된 것과 같은 피라졸로피리미딘 유도체 등을 포함한다. 프로테아좀 억제제는 아담스(Adams)의 미국특허번호 제6,083,903호에 기술된 붕산 에스테르를 포함한다. 바람직한 프로테아좀 억제제로는 보르테조미브(Bortezomib(Velcade))이 있다.
유전자 치료제 및 유전자 발현 개질제는 안티센스 핵산 서열, 간섭 핵산 서열 등을 포함한다. 유전자 치료제 및 유전자 발현 개질제는 면역컨쥬게이트로서 또는 별도로 투여되는 세포독성 제제로서 사용될 수 있다. 특히 유용한 유전자 치료제 및 유전자 발현 개질제는 프로-세포사멸 경로에서 포함된 단백질을 엔코딩하는 제제, 프로-세포사멸 경로의 억제제를 차단하는 제제, 또는 증식 신호를 차단하는 제제를 포함하며, 이들 모두는 비제어된 성장 및 과증식에 기여할 수 있다. 예를 들어, 유전자 발현 개질제는 NF-kB 경로를 억제하도록 작용하는 안티센스 또는 siRNA를 포함할 수 있으며, 이에 의해 이러한 경로가 비정상적으로 활성화될 때 존재하는 비정상적 증식을 억제한다.
안티센스 DNA 올리고뉴클레오티드는 통상적으로 타겟 서열에 대해 상보적인 서열, 대개 메신저 RNA(mRNA) 또는 mRNA 전구체로 이루어져 있다. mRNA는 작용기에서 유전자 정보를 함유하거나, 안티센스 올리고뉴클레오티드의 센스, 배열 및 결합은 의도된 mRNA를 비활성화시키고, 단백질로의 이의 번역을 방지한다. 이러한 안티센스 분자는, 단백질이 특정 RNA로부터 번역되고, RNA의 서열이 알려지자 마자, 상보적인 왓슨-크릭 염기 쌍을 통해 결합하는 안티센스 분자가 디자인될 수 있음을 나타내는 생화학적 실험을 기초로 하여 결정된다. 이러한 안티센스 분자는 통상적으로 10 내지 30개의 염기쌍, 더욱 바람직하게는 10 내지 25개의 염기쌍, 및 가장 바람직하게는 15 내지 20개의 염기쌍을 함유한다. 안티센스 올리고뉴클레오티드는 개선된 저항을 위해 뉴클레아제 가수분해로 개질될 수 있으며, 이러한 유사체는 WO 97/07784에 기술된 포스포로티오에이트, 메틸포스포네이트, 포스포로셀레노에이트, 포스포디에스테르 및 p-에폭시 올리고뉴클레오티드를 포함한다.
유전자 치료제는 또한 리보자임, DNA자임, 촉매 RNA, 또는 작은 간섭 RNA(siRNA)일 수 있다. RNA 간섭은 통상적으로 약 30개 미만의 염기 쌍의 짧은 RNA를 사용하며, 이는 상술된 바와 같이 상보적인 염기 쌍을 통해 작용한다. siRNA는 선형 또는 환형일 수 있다.
상술된 바와 같이, Lyn 키나제의 활성 및 전사에서 포함되는 신호 착물을 차단하는 제제 및 개질제가 유리할 것이다. 특정 구체예에서, Lyn 키나제를 차단하는 siRNA, 예를 들어 문헌[Ptasznik, A et al., (2004) Nat. Med. 10, 1187]에서 보고된 siRNA는 면역컨쥬게이트로서 또는 별도로 투여되는 세포독성제로서 항-CDIM 결합 항체와 함께 투여될 수 있다.
XV. 약제학적 제형 및 투여 모드
항체, 및 세포독성제는 당업계에 공지된 임의의 방법 및 약제학적으로 허용되는 부형제에 의해 제형화될 수 있다. 통상적으로, 항체는 임의적인 부형제 및 안정화제와 함께 염수에 제공된다. 화학치료제는 제형 방법 및 부형제에서 광범위하게 변경할 수 있으며, 이러한 정보는 예를 들어 문헌[Remingston's Pharmaceutical Sciences(Arthur Osol, Editor)]에서 이용가능하다.
본원에 기재된 방법 및 조성물이 생체내, 생체외 및 시험관내 적용에 사용될 수 있는 것으로 여겨진다.
본 발명의 조성물은 여러 상이한 수단에 의해 환자에게 투여될 수 있다. 투여 수단은 의도된 적용에 따라 변형할 수 있다. 당업자가 인식하는 바와 같이, 조성물의 투여는 다양한 방식, 예를 들어 피부, 안구 및 직장을 포함하나 이에 제한되지 않는 국소 투여를 통해; 경피, 예를 들어 설하, 협측, 직장, 질 또는 요도내를 통해; 구강, 예를 들어 위 또는 십이지장; 신체 공동 또는 도관으로의 비경구 주사, 예를 들어 복막내, 정맥내, 림프구내, 종양내, 근육내, 세포간, 동맥내, 피하, 병소내, 안구내, 활액내, 관절내; 흡입, 예를 들어 누불라이저를 사용한 폐 또는 비강 흡입을 통해 수행될 수 있다. 다가 작용제가 항체인 조성물 및 방법은 대개 비경구적으로 투여된다.
본 발명이 이의 바람직한 특정 구체예와 연결하여 기술되는 한, 상기 설명 및 하기 실시예는 본 발명의 범위를 기술하지만 이를 제한하는 것으로 의도되지 않는 것으로 이해될 것이다. 본 발명의 실행은 달리 지시하지 않는 한, 당업계내에 존재하는 유기화학, 중합 화학, 생화학 등의 통상적인 기술을 이용할 것이다. 본 발명의 범위내의 다른 양태, 잇점 및 변형은 본 발명이 속하는 당업자에게 자명할 것이다. 이러한 기술은 문헌에 전부 설명되어 있다.
본원의 앞뒤 모두에 언급된 모든 특허, 특허출원 및 문헌은 참고문헌으로 포함된다.
하기 실시예에서, 사용되는 숫자(예를 들어, 양, 온도 등)과 관련한 정확성을 확보하기 위해 노력하였으나, 몇몇 실험 오차 및 편차가 고려될 것이다. 달리 지시하지 않는 한, 온도는 ℃이며, 압력은 대기압 또는 이에 근접한 것이다.
약어:
ALL : 급성 림프성 백혈병
ASPR : 아스파라기나제
BCR : B-세포 수용체
BFA : 브레펠딘 A
DNR : 다우노루비신
FITC : 플루오레세인 이소티오시아네이트
IM : 전염성 단핵증
mAb : 모노클로날 항체
PI : 프로피듐 요오드
RBC : 적혈구
SLE : 전신 홍반성 난창
VCR : 빈트리스틴
WBC : 백혈구
실시예 1
mAb 216은 B 세포막을 손상시키고, 리소좀에 의한 재밀봉 반응을 야기시킨다
막 손상에 대한 실재 반응은 손상된 부위에서 내부 리소좀막의 첨가에 의해 빠르게 재밀봉된다. 램프-1(Lamp-1)은 혈장막 상에 대개 존재하지 않는 풍부한 리소좀 막 글리코단백질이다[Granger, B.L., et al. (1990) J. Biol. Chem. 265, 12036; McNeil, P. L. (2002) J. Cell Sci. 115, 873]. 리소좀을 유도하여 혈장막과 융합시키고, 램프-1의 리소좀내 NH2-말단 도메인은 세포 표면 상에 노출되게 된다. 이러한 융합 사건을 간 세포를 램프-1의 구경 에피토프로 지시되는 mAbs로 표면 염색시키므로써 모니터링될 수 있다[Reddy, A., et al. (2001) Cell 106, 157; Rodriguez, A., et al. (1997) J. Cell. Biol. 137, 93; Martinez, I., et al. (2000) J. Cell. Biol. 148, 1411]. 따라서, 세포 표면 상에 램프-1의 존재는 막 분열 후에 재밀봉하는 막의 표시이다[McNeil, P.L., and R.A.Steinhardt (2003) Ann. Rev. Cell Dev. Biol. 19, 697].
VH4-34 엔코팅된 mAb 216이 세포를 손상시키고 이에 따라 빠른 회복 및 재밀봉 반응을 초래하는지의 여부를 시험하기 위해, mAb 216으로 처리된 인간 B 세포주를 리소좀-특이적 단백질 램프-1의 세포 표면 상의 빠른 외형에 대해 검정하였다.
세포 및 시약
인간 프리-B 세포주 Nalm-6(Hurwitz, R., et al. (1979) Int. J. Cancer 23, 174), Reh(Rosenfield, C., A. et al. (1977) Nature 267 841), 및 성숙한 B-세포주 OCI-Ly8(Tweeddale, M.E., et al. (1987) Blood 69, 1307)을 열 비활성화된 10% FCS를 갖는 이스코브 매질(Iscove's medium) 중 대수증식기에서 유지시켰다. B 세포주를 ATCC로부터 수득하였다. VH4-34 엔코팅된 mAbs, mAb 216(Bhat, N.M., et al. (1993) J. Immunol. 151, 5011), Z2D2(Bhat, N.M., et al. (2000) Scand. J. Immunol. 51, 134), Y2K, 및 VH3 패밀리의 맴버로부터 유래된 동형-매칭된 대조군 mAb, MS2B6(Glasky, M.S., et al. (1992) Hum. Antibod. Hybridomas 3, 114)을 실험실에서 제조하고, 물로 2번 침전시키므로써 혈청 유리 융합세포 상청액으로부터 정제하였다. 필요한 경우 Centriprep 농축기(Amnicon, Dancers, MA) 상에서 MAbs를 농축하였다. 폴리아크릴아미드 겔 전기영동에 의해 체크된 IgM mAbs의 순도는 90 내지 95%였다. 정제된 IgMs의 농도를 표준물질로서 인간 IgM(카탈로그 번호 31146, Pierce Biochemicals, Rockford, IL)을 사용한 샌드위치 ELISA로 결정하였다. MS2B6이외에, Pierce IgM을 또한 동형 대조군으로서 사용하였다. 모든 mAbs는 멸균-여과되고 나트륨 아지드 부재였다.
PI 염색 및 전방 산란기를 이용한 세포 생존력 검정
혈장막의 보존을, 프로피듐 요오드(PI, Sigma, St. Louis, MO)를 배제하는 세포의 능력으로 평가하였다. PI 도입 수준을 스탠포드의 FACS 설비에서 VersatermPro 및 FlowJo 소프트웨어로 연결된 FACScan(Becton-Dickinson, San Jose CA) 상에서 유세포 분석에 의해 정량화하였다. 전방 산란기 신호에 의해 측정된 정상 크기를 갖는 PI-네가티브 세포는 생존 세포인 것으로 간주되었다.
간단히 말해서, 세포를 각 실험에서 특정화된 바와 같이 처리하고 3% FCS 및 10 ㎍s/ml의 PI를 갖는 PBS에 재현탁시켰다. Ca-부재 매질에서 독성을 평가하는 실험에서, 세포를 칼슘을 갖거나 이를 갖지 않은 적절한 매질에 재현탁하고, 여기에 10 ㎍s/ml의 PI를 첨가하였다. 이전 연구는 mAb 216-매개된 독성이 보다 낮은 온도에서 현저하게 나타남을 기술한 것이기 때문에(Bhat, N.M., et al. (1996) Clin. Exp. Immunol. 105, 183), 37℃에서 모든 매질 및 세포를 유지시키고, 실온에서 원심분리하는데 주의한다.
ATP 감소 및 방출 검정
세포내 및 방출된 ATP를 바이오발광 검정키트(카탈로그 번호 A-22066, Molecular Probes)를 이용하여 제조자의 설명서에 따라 측정하였다. 1 nM 내지 1 μM의 표준 ATP 희석물을 포지티브 대조군으로서 시험하였다. 세포를 각 실험에서 특정된 바와 같이 상이한 매질에서 다양한 농도의 mAb 216에 노출시켰다. 10 ㎕의 반응 상청액을 DTT, 루시페린 및 루시페라제를 함유한 90 ㎕의 표준 반응 용액에 첨가하였다. 보조기질로서 ATP의 존재하에 광발생을 MicroWin 2000, 버젼 4.2 소프트웨어(Mikroteck Laborsysteme, Gmbh)와 연결된 발광계(Lumimark Microplate Reader, Bio-Rad)로 즉시 측정하였다. 이러한 검정은 ATP의 펨토몰 양으로 검출할 수 있다. 세포내 ATP 함량을 평가하기 위하여, 세포를 실온에서 10 분동안 1% NP-10로 용해시키고, 10 ㎕의 용해물을 상술된 바와 같이 시험하였다.
램프-1 발현 연구
표면 램프-1 발현을 에피-형광, 유세포 분석 및 공초점 현미경으로 연구하였다. 인간 램프-1의 에포토프에 대한 항체(CD107a 클론 H4A3) 및 램프-1-에 대한 동종 대조군, 마우스 IgG1k를 PharMingen으로부터 수득하였다. 항체 모두를 2차 FITC-컨쥬게이트된 염소 F(ab)2 안티-마우스 IgG(Pierce Biochemicals)로 검출하였다. 세포(5×105)를 37℃에서 각 실험 중 특정된 시간 동안에 mAb 216 또는 인간 IgM 대조군(mAb MS2B6 또는 Pierce IgM)의 여러 농도에 노출시켰다. 이후 세포를 실온에서 20 분 동안 2% 사전-가온된 파라포름알데히드로 고정시키고, 사전-가온된 매질로 2회 세척하고, 안티-램프-1 또는 동종 대조군으로 15 분 동안 염색하였다. 세포를 이후 염색 매질(3% FCS 및 0.2% 나트륨 아지드를 갖는 PBS)로 2회 세척하고, 추가 15 분 동안 안티-램프-1-에 대한 2차 항체와 함께 인큐베이션하였다. 2회 세척한 후, 세포를 염색 매질에 재현탁시키고 유세포 분석, 면역형광 또는 공초점 현미경으로 분석하였다.
공초점 이미지화를 스탠포드의 Cell Sciences Imaging Facility에서 MultiProbe 2010 레이저 공초점 현미경(Molecular Dynamics, Sunnycale, CA) 상에서 수행하였다. MultiProbe는 488, 568 및 647의 여기 선을 갖는 Ar/Kr 혼합 가스 레이저를 사용하고, Nikon Diaphot 200 도립현미경 상에 놓여졌다. 488 nm의 여기 파장과 관련하여, 방출된 광을 510 LP 빔스플리터를 통과시키고, 510 장통과 필터로 수집하였다. Nikon 60X(NA1.4) 플라나포 대물렌즈를 사용하였다. 에피-형광 이미지화를 Axiovision 3.1 소프트웨어(Carl Zeiss)와 연결된 AxioCam HRc 카메라(Carl Zeiss) 및 Opti-Quip 전력공급원(Model 1200, Highland Mills, New York)이 장착된 Axioplan 2 현미경(Carl Zeiss, Inc., GmbH)에서 수행하였다. 유세포 분석을 FACScan에서 수행하였다.
결과 및 결론
미처리된 세포 상의 램프-1 발현은 실험내내 5% 내지 50% 정도로 낮은 정도로 변화되었다. 이러한 변화는 B 세포주의 표준 실험실 조작으로 인해 발생한 것이다. 램프-1 발현의 베이스라인 수준이 50%인 실험에서, 동종 대조군 처리된 세포는 50% 포지티브 남았으며, mAb 216 처리된 세포는 100% 램프-1 포지티브였다. 세포주 상에서 램프-1 염색을 5회 반복하여 재생산성을 확보하였다. 결과는 베이스라인 램프-1- 발현이 5%인 실험으로부터 논의되었다.
1 분 동안 mAb 216에 노출된 Nalm-6 세포는 램프-1 염색의 급격한 증가를 나타내었지만, 동형 대조군에 노출된 세포 또는 처리되지 않은 세포는 이들의 램프-1 발현을 증가시키지 않는다. 램프-1 노출은 또한 FACS 및 에피-형광에 의해 다른 B 세포주, OCI-Ly8 (성숙기-B) 및 Reh에서 관찰되었다(데이타는 나타내지 않음). 세포막의 보존을 PI 섭취에 의해 각 샘플에 대해 동시에 평가하였다. 세포는 216 노출 후에 1 분에 PI 네가티브가 잔류하였다.
램프-1 염색 및 PI 섭취를 또한 mAb 216 노출 후 상이한 시점에서 측정하였다. 램프-1 노출은 30초 동안 Ab 노출에서 관찰된 가장 밝은 염색을 갖는 빠른 사건이었으며, 이는 다음 5 분에서 점진적으로 떨어졌다(도 5a). 세포는 이러한 시간 동안에 PI-네가티브가 잔류하였다. PI 섭취는 mAb 216에 5분 노출 후에 나타났으며, 20 분에, PI 섭취에 의해 명시된 바와 같이 10 내지 25%의 세포는 투과성 막이 되었다.
ATP 방출에 의해 측정된 막 붕괴는 또한 유사한 시간 경로를 나타내었다. 도 5b에 나타낸 바와 같이, ATP는 상청액에서 2분, 램프-1이 세포막 상에 검출되는 시점에서 검출되지 않았다. 그러나, 15 분 및 1 시간에 ATP 방출은 증가하며, 이는 막 손상이 재밀봉되지 않음을 나타내는 것이다. mAb 216-처리 후 2 및 24 시간에, 측정된 ATP가 감소되는데, 이는 방출된 ATP를 퇴화시키는 세포 용해 및 괴사의 결과일 수 있다. 세포 펠렛 중 ATP 함량을 평가할 때, 바이오발광 검정은 세포 증식 및 세포독성의 측정이다. mAb 216의 세포독성 효과는 1시간이내의 노출에서 명확하게 되었다.
이들 결과는 mAb 216 매개된 막 손상이 기계적 또는 물리적 손상에 의한 손상 후에 세포 생존력을 회복하는 동일한 메카니즘에 의해 복구됨을 나타내며, 이는 mAb 216 처리가 임의의 다른 큰 막 붕괴와 유사한 세포 손상 사건에서 초래됨을 나타내는 것이다. 이전에는 항체에 의한 세포 손상은 관찰되지 않았다. mAb 216에 의한 막 손상은, 내부막이 지질 이중층에 빠르게 첨가됨에 따라 초기에 재밀봉되었으나, mAb 216에 대한 노출 시간이 증가함에 따라, 재밀봉에 대한 시도는 실패하였으며 막은 PI 및 ATP 모두에 대해 투과성을 갖았다. mAb 216 이외에, 다른 안티-B-세포 VH-34 엔코팅된 IgM mAbs는 유사한 막 손상을 매개하며, 리소좀에 의한 유사한 재밀봉 반응을 야기하였다.
실시예 2
mAb 216 유도된 막 손상의 복구는 작용성 액틴에 의존적이다
문헌 [McNeil, P. ((2002) J. Cell Sci. 115, 873)] 및 그 밖의 문헌에 기재된 바와 같이, 막 손상 복구는 액틴 의존 과정과 연루되어 있다. mAb 216에 의해서 유도된 막 손상의 복구가 액틴 의존 복구 메카니즘을 이용하는지를 시험하기 위해서, 세포를 액틴 중합에 영향을 미치는 제제로 처리하고, mAb 216에 의해서 유도된 막 손상의 복구에 대한 효과를 평가하였다. 세포를 액틴 중합에 반대 효과를 지니는 사이토칼라신(cytochalasin) 또는 자스플라키놀리드(jasplakinolide)로 처리하였다. 사이토칼라신은 액틴을 단량체로 탈중합시키는 반면, 자스플라키놀리드, 즉, 해면류(marine sponge)로부터 얻은 시클릭 펩티드는 액틴을 이의 필라멘트성 형태로 고정시킨다. 두 처리 모두 액틴-기재 세포골격 활성을 방해한다.
방법:
사이토칼라신을 시그마(Sigma)로부터 얻었고, 자스플라키놀리드를 몰레큘러 프로브(Molecular Probes)(Eugene, OR)로부터 얻었다. 카스파제 억제제(Caspase inhibitor), Ac-IETD-CHO 및 Ac-DEVD-CHO를 mAb 216으로 처리하기 전에 자스플라키놀리드(3μgs/ml), 사이토칼라신 (5 μgs/ml), 또는 카스파제 억제제(10 μM)로 37℃에서 2 시간 동안 처리하였다. 동일한 양의 DMSO를 함유하는 대조 샘플을 대등하게 형성시켰다. 이어서 세포를 25μg의 mAb 216 또는 대조 Ab에 노출시키고 유세포 분석기(flow cytometry)로 분석하였다.
결과:
사이토칼라신 또는 자스플라키놀리드 및 mAb 216으로 처리된 세포는 감소된 생존성(생존 세포 백분율)을 나타내며, 그에 의해서 mAb 216에 대한 민감성이 증가되어, 시너지 효과를 입증하였으며, 복구 과정에서의 작용성 액틴에 대한 요구를 나타냈다. 사이토칼라신 또는 자스플라키놀리드 및 대조 항체로 처리된 세포는 생성존성에서 감소를 나타내지 않는다. 한 가지 대표적인 실험으로부터의 데이터가 도 6b에 도시되어 있다. 유사한 결과를 3 가지의 다른 실험으로부터 얻었다.
세포를 카스파제 억제제 Ac-IETD-CHO 및 Ac-DEVD-CHO와 함께 인큐베이션하면, 세포 생존성이 변경되지 않아서, 세포 치사의 메카니즘이 아포프토시스에 의하지 않음을 나타낸다.
이러한 결과는 추가로 이들 항체에 대한 노출에 의해서 야기된 항체 유도된 세포막 손상의 메카니즘을 지지한다.
실시예 3
mAb 216 유도된 막 손상의 복구는 칼슘에 의존한다
리소좀(lysosome)의 엑소사이토시스(exocytosis)가 칼슘 의존 현상인 것으로 공지되어 있기 때문에[문헌: Miyake, K., and P. L. McNeil (1995) J. Cell Biol . 131, 1737; Bi, G. Q., et al. (1995) J Cell Biol. 131, 1747], mAb 216에 의한 막의 손상 및 손상의 복구를 무칼슘 및 정상 칼슘 조건에서 시험하였다. 50, 25 및 12.5 ng/ml 농도의 두 VH4-34 엔코팅된 mAbs, mAb 216 및 50ng/ml의 Y2K로 처리되는 경우의 Nalm-6 세포의 세포 생존성을 칼슘이 있는 및 없는 매질의 존재하에 시험하였다. 도 6a에 나타낸 바와 같이, 세포 생존성은 칼슘의 부재하에 현저하게 감소하여, 칼슘이 손상 복구에 필수적임을 나타내고 있다. 대조 항체로 처리된 세포 또는 항체로 처리되지 않은 세포는 칼슘의 존재 또는 부재에서 세포 생존성에 어떠한 변화를 나타내지 않았다. 그 밖의 B 세포주, OCI-Ly8 및 Reh는 또한 무칼슘 조건에서 세포독성에 있어서 유사한 증가를 나타냈다(도면으로 도시되지 않음).
실시예 4
mAb 216 유도된 막 손상의 복구는 작용성 골지에 의존한다
브레펠딘 A(BFA)로 처리하면 골지-연관된 코트 단백질의 분비, 소포체내로의 골지 막의 재분배 및 골지 장치로부터의 분비의 차단을 유도하는 것으로 공지되어 있다[문헌: Klausner, R. D., (1992) J. Cell Biol. 116, 1071]. 새롭게 형성된 리소좀은 BFA 처리된 세포에서 생성되지 않아서 손상 복구에서 이들의 요건을 시험하는 조건을 제공한다. 따라서, mAb 216 세포에 의해서 유도된 막 손상의 복구에서 보조하는 새롭게 형성된 리소좀의 능력은 BFA로 세포를 처리함으로써 시험되었다.
방법:
브레펠딘-A(Brefeldin-A)를 시그마로부터 얻었다. Nalm-6 세포(1 X 106 세포/ml)를 mAb 216으로 처리하기 전에 37℃에서 2 시간 동안 BFA(25 μg/ml)로 처리하였다. 동일한 양의 DMSO를 함유하는 대조 샘플을 대등하게 제조하였다. 이어서 세포를 25 μg의 mAb 216 또는 대조 Ab에 노출시키고 유세포 분석기로 분석하였다.
결과:
도 6b에 도시된 바와 같이, 세포 생존율(생존 세포 백분율)은 BFA와 mAb 216의 조합에 의해서 감소하여, 생존율에 대한 시너지 효과를 입증하고 있다. BFA는 대조 항체로 처리된 세포의 생존에 효과가 없었다. 이러한 결과는 막 복구가 BFA에 의해서 차단되어서, 새롭게 생성된 리소좀이 막 복구 및 계속된 생존 및 mAb 216 손상 B-세포주의 인테그러티에 필요함을 제시하고 있다. 따라서, 이러한 결과는 또한 mAb 216이 B 세포에 막 손상을 유도하며 세포가 리소좀 융합을 이용하는 손상을 플라즈마 막으로 패치하는 것을 시도함을 입증하고 있다. 추가의 리소좀의 생성이 BFA에 의해서 억제되는 경우, 복구 과정은 세포 생존을 유지할 만큼 충분하지 않을 수 있다.
실시예 5
빈크리스틴에 의한 시너지 B 세포 치사
증진된 세포 치사는 B 세포주에 대해서 유도된 세포 독성 검사에서 mAb 216이 화학치료제, 특히 빈크리스틴과 병용되는 경우에 입증되었다. 상이한 유전자형 및 표현형의 ALL 아세포로부터 유도되는 세 가지의 세포주, 즉, Nalm 6, REH, 및 SUPB 15를 mAb 216 단독과 함께 또는 빈크리스틴(VCR)과 조합으로 37℃에서 48시간 동안 인큐베이션하였다.
도 4 및 하기 표 1에 기재된 바와 같이, 이들 결과는 낮은 빈크리스틴 농도(0.2ng/ml)에서 빈크리스틴 단독에 의한 처리에 기인한 세포 사망은 발생되지 않음을 나타내고 있다. 그러나, 빈크리스틴이 mAb 216과 조합되는 경우, 사망한 B 세포의 백분율은 2배 이상이어서, 시너지 상호작용을 입증하고 있다. B-프로제니터 림프아세포 단독 및 화학치료제와 함께하는 경우의 mAb 216의 세포독성은 이러한 항체를 어린이 ALL에서의 추가의 면역치료 연구를 위한 유망한 시약이 되게 한다.
실시예 6
화학치료제에 의한 B 세포주에 대한 mAb 216의 증진된 세포독성
단일의 화학치료제와 함께 mAb 216의 시험관내 세포독성을 시험하였다. 상이한 유전형 및 표현형의 ALL 아세포로부터 유도되는 세 가지의 세포주, Nalm 6, REH 및 SUPB15를 mAb 216 단독 또는 빈크리스틴(VCR), 다우노루비신(DNR), 또는 L-아스파라기나제(ASPR)과 함께 인큐베이션하였다. mAb 216과 함께 사용되는 경우의 모든 화학치료제는 단일의 화학치료제 또는 mAb 216 단독에 의해서 나타내는 세포독성도 보다 더 큰 세포독성도를 유도하였다. 그러나, 빈크리스틴을 mAb 216과 조합하면 가장 효능적이어서, 빈크리스틴 또는 mAb 216 단독에 의해서 유도된 세포 치사량에 비해서 시너지 효과를 나타내는 크기의 세포독성을 나타냈다. 이러한 결과는 하기 표 1에 기재되어 있다. 이들 결과는 화학치료제의 존재하에 mAb 216의 증진된 세포독성을 입증하고 있는데, 이는 적어도 부분적으로는 mAb 216 처리가 B 세포의 투과화를 유도하고 또한 다르게는 불투성 화학치료제가 세포 내부에 접근되게 하기 때문이다.
표 1
화학치료제와 함께 mAb 216의 시험관내 세포독성
Figure 112007041093750-PCT00001
실시예 7
B 림프구상의 mAb 216 수용체의 밀도
mAb 216이 B 림프구상에서 결합하는 표면 수용체의 밀도를 이하 간략하게 기재된 바와 같은 표준 방법으로 측정하였다. pre-B 세포주 Nalm-6 및 사람 비장 B 림프구를 이용하였다. 요약하면, mAb 216은 형광 이소티오시아네이트(FITC, Molecular Probes, Inc.)에 컨쥬게이션되며, 컨쥬게이트된 순수한 항체의 흡광도가 280nm 및 492nm에서 측정되어 형광체 대 단백질(FTP)의 비를 측정하였다. 216 분자당 FITC의 양은 표준식을 사용함으로써 계산하였다.
세포를 컨쥬게이트된 항체의 농도를 증가시키면서 인큐베이션하고, 표지된 세포를 유세포 분석기로 분석하였다. 포화에 도달하는데 요구된 항체의 양을 기록하였다. 형광/단백질(F/P) 비를 이용하여, 세포 표면상의 수용체 분자를 계산하였다: Nalm-6 세포는 세포당 약 2 x106 수용체의 밀도로 수용체를 발현하는 것으로 밝혀졌으며, 비장 B 세포는 세포 표면상에 세포당 약 1.34 x 106의 밀도로 수용체를 발현하는 것으로 밝혀졌다. 이들 밀도는 T 세포 상의 CD8의 발현에 대해서 관찰된 바와 유사하다. Nalm-6 세포주의 세포는 비장 B 세포의 크기보다 약 1 과 1/2 배 더 크다.
참조
1. Siiman, O and Burshteyn, A. (2000) "Cell surface receptor-antibody association constants and enumeration of receptor sites for monoclonal antibodies," Cytometry 40(4), 316-26.
2. http://www.drmr.com/abcon/FITC.html. FITC conjugation of antibodies.
3. http://www.cyto.purdue.edu/hmarchiv/1995/0979.htm. Antigen density.
4. http://iacf.bsd.uchicago.edu/FlowHome/Protocols/abconjugate.htm. Antibody conjugation.
실시예 8
mAb 216에 대한 에피토프는 세포골격과 연관되어 있다
세포 표면 수용체는 특정의 리간드 결합후에, 레시틴에 의한 가교 후에 또는 채워지지 않은 상태(unoccupied state)에서 세포골격 구조와 연관되어 유지될 수 있다. 수용체와 세포골격 사이의 연관은 비이온성 세정제 NP-40에 의해서 용해되지 않으며 불용성 세포골격 매트릭스와 연과되어 유지되는 수용체의 비를 검사함으로써 조사될 수 있다. B 세포의 CDIM 에피토프가 세포골격과 연과되어 있는지를 측정하기 위해서, B 세포의 불용성 세포골격 매트릭스와 결합하는 mAb 216의 공동 편재(co-localization)를 이하 기재된 바와 같이 형광 및 방사성 표지된 항체를 이용하여 조사하였다.
방법:
Nalm-6 세포를 4℃에서 비오티닐화된 mAb 216, 또는 FITC 컨쥬게이트된 항-CD71 또는 FITC 컨쥬게이트된 항-CD19로 표지시켰다. FITC-표지된 세포를 2회 세척하고, 0.5% NP-40을 함유하는 추출 완충액중에 재현탁시켰다. 비오티닐화된 mAb 216으로 표지된 세포를 2회 세척하고, 아비딘-FITC로 염색하고, 다시 세척하고, 0.5% NP-40을 함유하는 추출 완충액에 재현탁시켰다. NP-40 처리는 세정제 가용성 막 단백질의 세포를 스트리핑시켜서, 세포골격 매트릭스와 온전한 핵을 남긴다. 온전하게 스트리핑된 세포를 FACS 또는 형광현미경으로 분석하였다.
방사성 동위원소 125I와 직접적으로 컨쥬게이션된 mAb 216을 pre-B 세포주 Nalm-6(1 x 106 세포)와 함께 4℃에서 15분 동안 인큐베이션하였다. 여러 회 세척한 후에, 세포를 기계적으로 균질화시키거나, 막 단백질을 0.5% NP-40을 사용하여 가용화시켰다. 물질을 이어서 6000 x g에서 15분 동안 원심분리하고, 125I-mAb 216의 분포를 침강물(주로 핵 및 그와 연관된 세포골격으로 구성됨)과 상등물(주로 세포막과 세포질로 구성됨)에서 측정하였다.
결과:
FITC 컨쥬게이션된 항체에 기인한 Nalm-6 세포상의 막 연관된 항원 CD71 및 CD19와 결합하는 항체의 형광은 NP-40 완충액에 대한 노출 후에 사라졌다. 그러나, B 세포 리간드에 결합된 mAb 216의 형광세기는 세정제 처리후에 변화되지 않았다.
또한, 대부분의 125I-mAb 216(80-85%)는 침강후에 핵/세포골격 분획과 연관되는 것으로 밝혀졌다. 아주 약간의 mAb 216이 세포질 분획에서 발견되었으며, 이러한 분획은 대부분의 막 결합된 단백질이 분별되는 것으로 공지되어 있다.
이들 데이터는 항-CDIM 항체, mAb 216이 B 세포의 세포골격과 연관되는 에피토프에 결합함을 입증하고 있다.
실시예 9
mAb 216의 세포독성은 가교에 의해 향상된다
PI 염색 및 생존성 평가 (생존 세포 %)를 이용하여 존재하는 mAb 216의 양에 따른 Nalm-6 세포에 대한 mAb 216의 시험관내 세포독성을 평가하였다. 가교제 (2차 mAb, 예를 들어 항-인간 람다)의 존재 및 부재하에 NaLM-6 세포에서 50% 및 80% 생존성을 달성하는 데에 필요한 mAb 216의 양은 표 1에 제시되며, 이는 세포내로의 PI 진입에 의해 측정되는, 지시된 세포독성의 수준을 달성하는 데에 필요한 나노그램 항체로 표현되어 있다.
이러한 결과는 세포 생존성이 가교제 (여기서는 IgM에 결합하는 2차 항체)의 첨가에 의해 또한 영향을 받음을 나타낸다. 하기 나타난 바와 같이, 가교제의 첨가는 가교 항체의 존재하에서 단지 절반의 항체가 20% 세포 치사 (80% 생존성)를 달성하는 데에 필요하고, 단지 60% 만큼의 항체가 50% 세포 치사 (50% 생존성)를 달성하는 데에 필요할 정도로 mAb 216의 세포독성을 향상시킨다. 가교제는 항체-세포 표면 수용체 복합체에 추가의 강성을 제공하여 세포 손상 및/또는 치사를 향상시키는 것으로 여겨진다.
표 1. 가교의 존재 및 부재하에서 mAb 216의 ED50 및 ED80 값
2차 Ab 의 존재
ED50 ED80
실험 #1 697.644 257.944
실험 #2 647.524 214.164
2차 Ab 의 부재
실험 #1 1036.346 576.345
실시예 10
mAb 216의 세포독성은 가교에 의해 향상되지만, 리툭산(Rituxan)의 세포독성은 가교에 의해 향상되지 않는다
OCI-Ly8 세포에 대한 mAb 216 및 C2B8 (RITUXAN®)의 시험관내 세포독성을 mAb 216 및 C2B8로 처리된 세포의 PI 염색 및 생존성 평가 (생존 세포 %)를 이용하여 평가하였다. OCI-Ly8 세포 (5 x 105개 세포/ml)를 보체 및 이펙터 세포의 부재하에서 15㎍의 각각의 항체로 37℃에서 밤새 처리하였다. 2차 항체 (5㎍)를 적절한 샘플 (항-IgG 및 항-IgM)에 첨가하였다. 세포를 세척하고, PI를 함유하는 염색 배지에 재현탁시키고, 팩스캔(Facscan)으로 분석하였다. 세포를 항상 37℃에서 유지시켰다.
결과
각각의 샘플 중의 생존 세포 (PI 네거티브)가 도 7에 도시되어 있다. 도 7에 도시된 바와 같이, 항체로 처리되지 않은 세포 (대조표준) 및 C2B8, 항-IgG, 항-IgM 및 C2B8 + 항-IgG 항체로 처리된 세포의 생존성은 유사하였는데, 이는 이들 처리 중 어느 것도 보체 또는 이펙터 세포의 부재하에서 현저한 세포독성을 초래하지 않았음을 나타낸다. 2차 항체 부재하의 mAb 216 처리는 약 65%의 생존성을 나타냈다. 2차 항체의 존재하에서, mAb 216 + 항-IgM의 병용은 단지 약 20%의 생존성을 나타냈다.
이러한 결과는 과가교제인 항-IgM의 존재하에서 일어나는 추가의 가교으로 인해 mAb (5량체 구조에 의해 항원과 가교하는 능력을 지닌 IgM)의 세포독성이 현저하게 향상됨을 나타낸다.
실시예 11
비장 B 세포 및 B 세포주에 대한 mAb 216의 투여량 의존성 세포독성
Nalm-6 세포 또는 비장 B 세포의 세포 현탁액 (ml 당 5 x 105개 세포에서)내로의 항체의 역가측정은 B 세포에 대한 mAb 216의 투여량 의존성 세포독성을 나타낸다. 도 8에 도시된 바와 같이, FITC 컨쥬게이션된 항체의 양이 증가함에 따라, 팩스캔을 사용하여 검출된 형광의 양은 모든 세포 수용체 부위가 항체로 포화될 때까지 급격히 증가한다. 둘 모두의 세포 유형의 결합 곡선은 유사한 것으로 여겨지는데, 이는 거의 동일한 항체 농도에서 포화됨을 나타낸다. 그러나, mAb 농도에 따른 세포 생존성의 의존은 세포 유형 간에 현저히 달라진다. 예를 들어, 약 5 ㎍/ml 항체에서, 비장 B 세포는 약 65%의 생존성을 나타낸다. 대조적으로, 동일한 항체 농도에서 Nalm-6 세포는 단지 약 42%의 생존성을 나타낸다. 이러한 항체량은 Nalm-6 세포상의 CDIM 에피토프의 전체량에 대해 3배 이상의 과량을 제공하기에 충분하며, 이는 비장 B 세포에 대해 5배 과량에 근접한다. 약 10 ㎍/ml 항체에서, 비장 B 세포는 약 48%의 생존성을 나타내는 반면, Nalm-6 세포는 단지 약 30%의 생존성을 나타낸다. 따라서, B 세포주는 성숙 B 림프구 보다 CDIM 결합 항체에 의한 치사에 대해 보다 큰 민감성을 나타내며, 이는 신생물 B 세포가 성숙 B 세포 보다 mAb 216에 의한 치사에 보다 민감함을 제시한다.
실시예 12
임상 실험에서 ALL에 걸린 환자에서 mAb 216의 효능
인간 mAb 216의 이러한 I상 투여량 증가 실험을 I상 실험의 범위내에서 mAb 216의 항종양 활성을 예비적으로 규정하고 재발성 또는 굴절성 ALL을 지닌 환자에서 mAb 216의 생물학적 활성을 평가하기 위해 재발성 또는 불응성 B-전구체 ALL을 지닌 성인에서 수행하였다. 환자를 다중약물 처리 프로그램의 일부로서 빈크리스틴으로 미리 수 차례 처리하였지만, 빈크리스틴에 의한 처리에 대해서는 불응성이었는데, 즉, 빈크리스틴 처리는 백혈병 모세포 총수 (leukemic blast count)를 감소시키는 데에 효과적이지 않았다.
항체 투여: 0일째 및 7일째
최초 mAb 216 주입 시점에서의 초기 투여 속도는 최초 30분 동안 25mg/시간 이었다. 독성 또는 주입 관련 사고가 일어나지 않는 경우, 투여 속도를 1.25 mg/kg의 전체 투여량에 대해 최대 200 mg/시간으로 증가시켰다 (30분 간격으로 25 mg/시간 만큼 증가).
질병 평가 및 약동학
요법에 대한 초기 반응을 두 번째 항체 주입을 수행하기 7일전에 수행하였다. 환자는 빈크리스틴과 함께 두 번째 항체 투여량을 투여받았다.
화학요법
빈크리스틴을 #2 항체 투여를 개시하기 7일 전에 1.5 mg/m2/IVP 투여의 투여량으로 투여하였다.
결과
mAb 216 단독으로 처리된 환자는 항체 주입 후에 WBC의 감소를 나타냈다. 빈크리스틴과 mAb 216을 병용하여 후속 처리된 환자는 WBC의 보다 급격한 감소를 나타냈다. 이러한 데이터는 도 9a 및 9b에 그래프로 도시되어 있다. 화살표는 빈크리스틴의 존재 및 부재하의 mAb 216의 투여 일수를 나타낸다.
환자 2는 말초혈 및 골수에서 90-95% 모세포(blast)를 지니며, 상승하는 WBC 총수를 나타냈다. 1.25 mg/kg mAb 216 단독에 의한 처리는 WBC 총수의 일시적 감소를 초래하였고, 7일째까지 WBC 총수는 ㎕ 당 105개 WBC를 초과하는 양으로 다시 상승하였다. 1.5 mg/m2/IVP 투여에서의 빈크리스틴과 병용된 1.25 mg/kg mAb 216에 의한 처리는 WBC의 급격한 감소를 초래하였다. 결과는 도 9a에 도시되어 있다.
환자 3은 말초혈 및 골수에서 90-98% 모세포를 지니며, 약 40,000개 WBC/㎕의 WBC 총수를 나타냈다. 1.25 mg/kg mAb 216 단독에 의한 처리는 WBC 총수의 일시적 감소를 초래하였고, 7일째까지 WBC 총수는 다시 상승하였다. 1.5 mg/m2/IVP 투여에서의 빈크리스틴과 병용된 1.25 mg/kg mAb 216에 의한 처리는 또 다시 WBC의 급격한 감소를 초래하였다. 결과는 도 9b에 도시되어 있다.
이러한 데이터는 화학치료제를 mAb 216과 병용하면 ALL에 걸린 인간 환자에서 놀라운 상승적 효능을 초래함을 보여준다. WBC는 항체의 준치사 농도에서도 mAb 216에 의한 처리로 인해 화학치료제에 의한 처리에 대해 보다 민감해져서, 추가의 화학치료제에 의한 처리의 효능을 향상시키는 것으로 나타났다.

Claims (86)

  1. 세포막 손상을 유도하는 조성물로서, 세포의 표면상에 존재하는 고도로 발현된 세포 표면 항원에 결합하는 다가 작용제를 포함하며, 상기 세포 표면 항원이 세포의 세포골격과 연관되는 조성물.
  2. 제 1항에 있어서, 다가 작용제가 항체인 조성물.
  3. 제 2항에 있어서, 항체가 IgM인 조성물.
  4. 제 1항에 있어서, 세포 표면 항원이 B 세포의 표면상에 존재하는 CDIM 에피토프인 조성물.
  5. 제 1항에 있어서, 세포의 표면상에 존재하는 고도로 발현된 세포 표면 항원에 결합하는 다가 작용제의 가교를 제공하는 가교제를 추가로 포함하는 조성물.
  6. 제 5항에 있어서, 가교제가 항체인 조성물.
  7. 림프구에서 세포막 손상을 증가시키는 조성물로서, 림프구상의 고도로 발현된 세포 표면 항원에 결합하는 다가 작용제를 포함하며, 가교제의 부재하에 다가 작용제의 세포막 손상에 비해서 다가 작용제의 세포막 손상을 증가시키는 가교제를 추가로 포함하는 조성물.
  8. 제 7항에 있어서, 다가 작용제가 항체인 조성물.
  9. 제 8항에 있어서, 항체가 IgM인 조성물.
  10. 제 7항에 있어서, 세포 표면 항원이 B 세포의 표면상에 존재하는 CDIM 에피토프인 조성물.
  11. 제 7항에 있어서, 가교제가 항체인 조성물.
  12. 세포를 치사시키는 조성물로서, 세포의 표면상에 존재하는 고도로 발현된 세포 표면 항원에 결합하는 다가 작용제를 포함하며, 다가 작용제의 가교를 제공하는 가교제를 추가로 포함하는 조성물.
  13. 제 12항에 있어서, 다가 작용제가 VH4-34 항체인 조성물.
  14. 제 12항에 있어서, 가교제가 항-카파 제제, 항-람다 제제, 또는 항-VH-34 항체인 조성물.
  15. 제 12항에 있어서, 세포독성제를 추가로 포함하는 조성물.
  16. 제 12항에 있어서, 세포가 악성 세포인 조성물.
  17. 제 16항에 있어서, 악성 세포가 신경, 림프, 난소, 자궁경부, 자궁내막, 고환, 전립선, 신장, 결장, 췌장, 위, 장, 식도, 폐, 갑상선, 부신, 간, 뼈, 피부, 입, 또는 목으로부터 선택된 신체 조직의 신생물과 연관되는 조성물.
  18. 세포를 투과 가능하게 하는 조성물로서, 세포의 표면상에 존재하는 고도로 발현된 세포 표면 항원에 결합하는 다가 작용제를 포함하는 조성물.
  19. 제 18항에 있어서, 세포가 B 세포인 조성물.
  20. 제 17항에 있어서, 다가 작용제가 항체인 조성물.
  21. 제 18항에 있어서, 항체가 IgM인 조성물.
  22. 제 18항에 있어서, 세포 표면 항원이 CDIM 에피토프인 조성물.
  23. 제 17항에 있어서, 항체가 VH4-34 항체인 조성물.
  24. 제 18항에 있어서, 가교제가 항-카파 제제, 항-람다 제제, 또는 항-VH4-34 항체인 조성물.
  25. B 세포에서 세포막 손상을 유도하는 조성물로서, B 세포의 표면의 세포 표면 항원에 결합하는 다가 VH4-34 항체를 포함하는 조성물.
  26. 제 25항에 있어서, B 세포의 표면상의 세포 표면 항원에 결합된 VH4-34 항체를 가교하는 가교제를 추가로 포함하는 조성물.
  27. 제 26항에 있어서, VH4-34 항체를 가교시키는 가교제가 항-VH4-34 항체인 조성물.
  28. 세포의 과증식이 특징인 병태를 앓고 있는 포유동물을 치료하는 약제학적 조성물로서, 세포의 표면상에 존재하는 고도로 발현된 세포 표면 항원에 결합하는 다가 작용제를 포함하며, 이러한 다가 작용제가 세포막 손상을 유도하는 약제학적 조성물.
  29. 제 28항에 있어서, 세포 독성제를 추가로 포함하는 약제학적 조성물.
  30. 제 28항에 있어서, 세포의 과증식이 B 세포의 과증식인 약제학적 조성물.
  31. 제 30항에 있어서, B 세포의 과증식이 특징인 병태가 림프암, 바이러스 감염증, 면역결핍, 또는 자가면역 질환인 약제학적 조성물.
  32. 제 31항에 있어서, 바이러스 감염증이 사람 면역결핍 바이러스 또는 단핵구증인 약제학적 조성물.
  33. 제 31항에 있어서, 면역결핍이 이식 후 림프증식 질환, 또는 면역결핍증후군인 약제학적 조성물.
  34. 제 29항에 있어서, 세포독성제가 화학치료제, 방사성활성 동위원소, 세포독성 항체, 면역컨쥬게이트, 리간드 컨쥬게이트, 면역억제제, 세포 성장 조절제 및/또는 억제제, 독소, 또는 이의 혼합물인 약제학적 조성물.
  35. 제 28항에 있어서, 다가 작용제의 가교를 제공하는 가교제를 추가로 포함하는 약제학적 조성물.
  36. 세포막 손상 항체에 의해서 유도된 세포막 손상을 증가시키는 조성물로서, 고도로 발현된 세포 표면 항원에 결합하는 다가 항체, 다가 항체의 세포독성을 증가시키는 가교 수단을 포함하며, 상기 가교 수단이 가교 수단의 부재하에 다가 항체의 세포독성에 비해서 다가 항체의 세포독성을 증가시키는 조성물.
  37. 제 36항에 있어서, 다가 항체가 IgM인 조성물.
  38. 제 36항에 있어서, 가교 수단이 항-카파, 항-람다, 또는 항-mu 항체, 또는 세포 표면상의 고도로 발현된 세포 표면 항원에 결합된 인접한 다가 항체를 가교시키는 다가 항체상에서 발현된 에피토프에 대해 특이적인 항체인 조성물.
  39. 세포의 과증식이 특징인 병태를 앓고 있는 포유동물을 치료하는 약제학적 조성물로서, 세포의 표면상에 존재하는 고도로 발현된 세포 표면 항원에 결합하는 다가 작용제를 포함하며, 상기 다가 작용제가 세포 표면상의 세포 표면 항원에 대한 다수의 결합부위를 포함하는 약제학적 조성물.
  40. 제 39항에 있어서, 다수의 결합 부위가 5개 이상인 약제학적 조성물.
  41. 제 39항에 있어서, 다수의 결합 부위가 약 5 내지 약 100개인 약제학적 조성물.
  42. 제 39항에 있어서, 다수의 결합 부위가 약 15 내지 약 50개인 약제학적 조성물.
  43. 세포의 과증식이 특징인 병태를 앓고 있는 포유동물을 치료하는 방법으로서, 과증식 세포의 표면상에서 고도로 발현된 세포 표면 수용체에 결합하는 다가 작용제를 투여함을 포함하며, 상기 다가 작용제가 정상 세포에 비해서 과증식성 세포를 우선적으로 치사시키는데 효과적인 양으로 투여되는 방법.
  44. 제 43항에 있어서, 포유동물이 사람인 방법.
  45. 제 44항에 있어서, 포유동물이 비사람 포유동물인 방법.
  46. 제 43항에 있어서, 과증식성 세포가 암세포인 방법.
  47. 제 46항에 있어서, 과증식성 세포가 성장 인자, 시토킨, 또는 바이러스성 감염증에 의해서 과증식성 상태로 자극되는 방법.
  48. 제 43항에 있어서, 다가 작용제가 세포막 손상 항체인 방법.
  49. 제 46항에 있어서, 암세포의 생존성이 정상 세포의 생존성에 비해서 약 10% 이상 더 큰 양으로 감소될 수 있는 방법.
  50. 암세포를 치사시키는 방법으로서, 암세포의 표면상에 고도로 발현된 세포 표면 항원에 결합하고 암세포에서 세포막 손상을 유도하는 세포막 손상 항체의 세포독성 양을 암세포와 접촉시킴을 포함하는 방법.
  51. 제 50항에 있어서, 세포막 손상 항체가 암세포를 우선적으로 치사시키지만 정상세포는 치사시키지 않기에 효과적인 양으로 투여되는 방법.
  52. 제 50항에 있어서, 세포 독성제를 세포막 손상 항체와 함께 투여함을 포함하는 방법.
  53. 제 52항에 있어서, 세포 독성제가 화학치료제, 방사성활성 동위원소, 세포독성 항체, 면역컨쥬게이트, 리간드 컨쥬게이트, 면역억제제, 세포 성장 조절제 및/또는 억제제, 독소, 또는 이의 혼합물인 방법.
  54. 제 50항에 있어서, 암세포의 표면상에서 고도로 발현된 세포 표면 항원에 결합하는 세포막 손상 항체의 가교를 제공하는 가교제를 투여함을 추가로 포함하는 방법.
  55. 제 54항에 있어서, 가교제가 항체인 방법.
  56. 제 50항에 있어서, 암세포가 신생물 B 세포인 방법.
  57. 제 50항에 있어서, 세포막 손상 항체가 VH4-34 항체인 방법.
  58. 제 55항에 있어서, 항체가 항-VH4-34 항체인 방법.
  59. 사람 환자의 림프 세포에서 세포막 손상을 유도하는 방법으로서, 림프 세포의 표면상에서 고도로 발현된 세포 표면 항원에 결합하는 다가 작용제를 세포와 접촉시킴을 포함하는 방법.
  60. 제 59항에 있어서, 다가 작용제가 항체인 방법.
  61. 제 59항에 있어서, 림프 세포가 CDIM 에피토프를 발현하는 B 세포인 방법.
  62. 제 59항에 있어서, 항체가 정상 B 세포에 비해서 과증식성 B 세포를 우선적으로 손상시키기에 효과적인 양으로 환자에게 투여되는 방법.
  63. 제 59항에 있어서, 항체가 과증식성 B 세포를 치사시키기에는 효과적이지 않 지만 과증식성 B 세포를 손상시키기에는 효과적인 양으로 환자에게 투여되는 방법.
  64. 제 62항에 있어서, (1) 환자의 혈액중의 과증식성 B 세포의 수를 측정하기 위해서 치료를 필요로 하는 환자의 혈액을 샘플링하고, (2) 항체에 의한 손상에 대해서 과증식성 B 세포 및 정상 B 세포의 민감성을 측정하고, (3) 환자의 과증식성 B 세포를 우선적으로 손상시키고/거나 치사시키기에 충분한 양의 항체를 환자에게 투여함을 포함하는 방법.
  65. 제 64항에 있어서, 세포 손상 및/또는 치사의 요구된 양을 달성하기 위해서 환자에 대해서 추가량의 항체로 적정함을 추가로 포함하는 방법.
  66. 제 63항에 있어서, (1) 환자의 혈액중의 과증식성 B 세포의 수를 측정하기 위해서 치료를 필요로 하는 환자의 혈액을 샘플링하고, (2) 항체에 의한 손상에 대한 과증식성 B 세포의 민감성을 측정하고, (3) 환자내의 과증식성 B 세포를 손상시키기에 충분한 양의 항체를 환자에게 투여함을 포함하는 방법.
  67. 제 59항에 있어서, 환자에게 유효량의 세포 독성제를 투여함을 추가로 포함하는 방법.
  68. 세포막 손상을 유도하는 방법으로서, 세포 표면상에서 고도로 발현된 세포 표면 항원에 결합하는 다가 작용제를 세포와 접촉시킴을 포함하는 방법.
  69. 제 68항에 있어서, 가교제의 부재하의 다가 작용제의 세포 독성에 비해서 다가 작용제의 세포 독성을 증가시키는 가교제를 세포와 접촉시킴을 추가로 포함하는 방법.
  70. 제 69항에 있어서, 다가 작용제가 항체이며, 가교제가 항체에 결합하는 항체이어서 세포 표면에 결합된 항체의 가교를 제공하는 방법.
  71. 제 68항에 있어서, 세포가 B 세포이고, 항체가 항-CDIM 항체인 방법.
  72. 제 68항에 있어서, 항-CDIM 항체가 IgM인 방법.
  73. 제 72항에 있어서, 항-CDIM 항체에 결합하는 가교제를 추가로 포함하는 방법.
  74. 제 73항에 있어서, 항-CDIM 항체에 결합하는 가교제가 항-카파 또는 항-람다 항체 또는 항-VH4-34 항체인 방법.
  75. 세포를 투과 가능하게 하는 방법으로서, 세포의 표면상에 존재하는 고도로 발현된 세포 표면 항원에 결합하는 다가 작용제를 세포와 접촉시킴을 포함하는 방법.
  76. B 세포의 과증식이 특징인 병태를 앓고 있는 사람 환자를 치료하는 방법으로서, 상기 B 세포를 (1) B 세포 상의 CDIM 에피토프에 대해서 특이적으로 결합하는 세포 독성량의 항체, 및 (2) B 세포상의 CDIM 에피토프에 대해 특이적으로 결합하는 항체를 가교시키는 가교제와 접촉시킴을 포함하는 방법.
  77. 제 76항에 있어서, B 세포를 세포독성제와 접촉시킴을 추가로 포함하는 방법.
  78. 제 76항에 있어서, B 세포의 과증식이 특징인 병태가 림프암, 바이러스 감염증, 면역결핍 또는 자가면역질환인 방법.
  79. 제 78항에 있어서, 바이러스 감염증이 HIV, EBV 또는 HPV에 의해서 야기되는 방법.
  80. 제 78항에 있어서, 면역결핍이 이식후 림프증식성 질환, 또는 면역결핍증후군인 방법.
  81. 악성 B 세포의 골수를 퍼징하는 것을 필요로 하는 환자에게서 악성 B 세포의 골수를 퍼징하는 방법으로서, B 세포의 표면상의 CDIM 에피토프에 대해서 특이적으로 결합하는 항체와 골수 세포를 접촉시킴을 포함하고, B 세포 표면상의 CDIM 에피토프에 결합된 항체를 가교시키는 가교제를 B 세포와 접촉시켜서 악성 B 세포에 대해서 항-CDIM 항체에 대한 증진된 세포독성을 제공함을 추가로 포함하는 방법.
  82. 제 81항에 있어서, 세포를 세포독성제와 접촉시켜 악성 B 세포의 골수를 추가로 퍼징함을 추가로 포함하는 방법.
  83. 포유동물에서 세포막 손상을 유도하는 다가 작용제에 대한 한계 용량을 측정하는 키트로서, 고도로 발현된 세포 표면 항원에 결합하는 결합시험 수행에 충분한 양의 다가 작용제를 포함하는 키트.
  84. 포유동물에서 세포막 손상을 유도하는 한계 용량을 측정하는 키트로서, 고도로 발현된 세포 표면 항원에 결합하는 결합시험 수행에 충분한 양의 세포 손상 항체, 가교제, 또는 세포 독성제, 또는 이의 조합물을 포함하는 키트.
  85. 세포의 과증식이 특징인 질환 또는 질병을 앓고 있는 포유동물의 치료에서 세포막 손상 다가 작용제의 용도.
  86. 세포의 과증식이 특징인 질환 또는 질병을 앓고 있는 포유동물의 치료를 위한 약물의 제조에서 세포막 손상 항체의 용도.
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