MX2007005320A

MX2007005320A - Herida de la membrana celular inducida por anticuerpo.

Info

Publication number: MX2007005320A
Application number: MX2007005320A
Authority: MX
Inventors: Neelima M Bhat; Marcia M Bieber; Nelson N H Teng; Martin E Sanders
Original assignee: Palingen Inc
Priority date: 2004-11-05
Filing date: 2005-11-04
Publication date: 2007-11-12
Also published as: WO2006052641A2; ZA200705020B; US20130164283A1; BRPI0517057A; DK1814913T3; AU2005304973A1; US9458241B2; EP1814913B1; CA2586285A1; CN101098889A; EP1814913A4; US20060153854A1; IL182892A0; JP2008519030A; KR20080007425A; WO2006052641A3; EP1814913A2; ES2551502T3; US8377435B2

Abstract

Se describen las composiciones y los metodos para inducir heridas en la membrana celular, la permeabilizacion de las celulas y muerte celular. La composicion comprende un agente polivalente que se enlaza a una antigeno de la superficie celular altamente expresado, presente sobre la superficie de una celula. Preferentemente, el antigeno de la superficie celular esta asociado con el citoesqueleto de la celula. Un agente polivalente preferido es una IgM, y la herida y la muerte celular mejoradas pueden ser proporcionadas por la adicion de un agente de reticulacion. A concentraciones subletales in vivo, los anticuerpos que hieren a la celula permeabilizan las celulas y aumentan dramaticamente la respuesta hacia los agentes quimioterapeuticos, incluso en pacientes resistentes a los agentes quimioterapeuticos.

Description

HERIDA DE LA MEMBRANA CELULAR INDUCIDA POR ANTICUERPO CAMPO DE LA INVENCIÓN La invención se refiere en general a las composiciones y métodos para permeabilizar las células, tratar el cáncer y los trastornos autoinmunes , y similares.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN La herida de la membrana celular es una perturbación de la membrana plasmática de las células, y es en general un evento al que se puede sobrevivir. La herida de la membrana celular es una ocurrencia común en tejidos de mamífero mecánicamente activos tales como el revestimiento endotelial de la aorta o el tracto gastrointestinal, los epitelios de la piel o los miocitos del músculo cardiaco o esquelético, y ha sido demostrado durante la invasión de células por tripanosomas . A nivel de laboratorio, la herida celular es típicamente inducida utilizando medios mecánicos para romper la membrana celular, tal como el uso de una microaguja para penetrar la membrana plasmática o mediante el rayado en una caja de cultivo para dividir una porción de una célula . Para perturbaciones grandes, tales como desgarres o rompimientos de más de 1 µm en la membrana, es requerida una respuesta de reselladura rápida, para reparar la membrana y Ref. : 181959 mantener la viabilidad celular. Aunque inicialmente este es un proceso pasivo, la reselladura es ahora reconocida como un proceso dependiente de energía y de calcio, que da como resultado las fusiones exocitóticas dependientes del calcio, vesícula-vesícula y membrana plasmática-vesícula, que parchan el desgarre membranal. Las vesículas sacrificadas para proporcionar el parche membranal son ahora conocidas como lisosomas. La membrana lisosomal interna es de este modo agregada a la superficie celular para sellar el sitio del rompimiento. Ver McNeil, P.L. (2002) J. Cell Sci . 115(5): 873; Togo, T. et al. (1999) J. Cell Sci . 112: 719; McNeil, P.L., y R.A. Steinhardt (2003) Ann . Rev. Cell Dev. Biol . 19: 697. El proceso de reparación parece requerir despolimerización de la actina con el fin de permitir el acceso de los lisosomas a la membrana plasmática. Además, los procesos contráctiles mediados por la miosina y/o la cinesina se piensa que están involucrados en llevar los lisosomas en proximidad del rompimiento. Además, se sabe que los eventos de reselladura subsiguientes ocurren más rápidamente que la respuesta inicial a la herida, presumiblemente por la producción incrementada de lisosomas provenientes del aparato de Golgi. De este modo la reselladura de las perturbaciones grandes es dependiente de la actina funcional y del complejo de Golgi para facilitar el acceso de los lisosomas al sitio de la herida, y para restablecer los almacenes de lisosomas para participar en el proceso de reparación. De este modo, aunque la herida de la membrana celular y la reparación subsiguiente es conocida en la técnica, no existe enseñanza o sugerencia de inducir herida de la membrana celular como una herramienta de investigación o un procedimiento terapéutico, por ejemplo, para permeabilizar las células a los agentes activos, o para matar las células malignas. Además, no ha sido sugerida todavía la posibilidad de utilizar un agente que se enlace a un antígeno de la superficie celular para inducir la herida de la membrana celular. Finalmente, no existe sugerencia de inducir herida de la membrana celular utilizando un anticuerpo para tratar una enfermedad o trastorno en un paciente humano o animal .

BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN En consecuencia, un objetivo primario de la invención es dirigirse a la necesidad anteriormente mencionada en la técnica al proporcionar métodos y composiciones utilizando la herida de la membrana celular inducida por anticuerpo, para tratar enfermedades o trastornos en pacientes humanos o animales. Otro objetivo más de la invención es proporcionar las composiciones y método mejorados para inducir la herida de la membrana celular utilizando agentes polivalentes para permeabilizar y/o matar las células. Otro objetivo más de la invención es proporcionar las composiciones y métodos mejorados para reticular un anticuerpo u otro agente polivalente para proporcionar herida de la membrana celular mejorada y/o muerte de las células. Un objetivo adicional de la invención es proporcionar las composiciones y métodos mejorados para tratar enfermedades y trastornos en pacientes humanos o animales, mediadas por la hiperproliferación y la hiperactividad celulares. En consecuencia, en una modalidad de la invención, se proporciona una composición para inducir la herida de la membrana celular, en donde la composición comprende un agente polivalente que se enlaza a un antígeno de la superficie celular altamente expresado, presente sobre la superficie de una célula. Preferentemente, el antígeno de la superficie celular está asociado con el citoesqueleto de la célula. En una modalidad adicional, es proporcionada una composición para permeabilizar una célula, que comprende un agente polivalente que se enlaza a un antígeno de la superficie celular altamente expresado, presente sobre la superficie de una célula. En otro aspecto más, se proporciona un método para la per eabilización de una célula, que comprende poner en contacto una célula con un agente polivalente que se enlaza a un antígeno de la superficie celular altamente expresado, presente sobre la superficie de la célula. En otra modalidad más, la herida de la membrana celular no es susceptible a la supervivencia, en parte al menos por la provisión del agente polivalente en una cantidad suficiente para continuar hiriendo la célula, tal que la célula falla en o no puede reparar más la herida. En consecuencia, la composición para inducir la herida de la membrana celular puede también funcionar como una composición para matar una célula. Además, la composición para matar una célula es también útil en un método para matar una célula. Preferentemente, la célula es maligna, y está asociada con un neoplasma de un tejido corporal tal, por ejemplo, el tejido nervioso, linfoide, ovárico, cervical, endometrial, testicular, prostático, renal, colónico, pancreático, estomacal, intestinal, esofágico, pulmonar, tiroide, adrenal, hepático, óseo, de la piel, bucal, de la garganta y similares. En una modalidad adicional, la célula es hiperactiva, y la hiperactividad de la célula es mediadora de una enfermedad o trastorno que puede ser tratado por las composiciones y métodos descritos en la presente para tratar la célula hiperactiva. En una modalidad particular, es proporcionado un método de tratamiento de un paciente humano que sufre de una condición caracterizada por una hiperproliferación de las células, que comprende administrar un agente polivalente que se enlaza a un receptor de la superficie celular, altamente expresado, sobre la superficie de las células hiperproliferativas, en donde el agente polivalente es administrado en una cantidad efectiva para matar preferentemente las células en hiperproliferación, con relación a las células normales. Preferentemente, las células hiperproliferativas son células cancerosas. En otra modalidad más, las células hiperproliferativas son estimuladas en una condición de hiperproliferación por factores de crecimiento, citocinas, infección viral y similares . En una modalidad preferida, la cantidad de agente polivalente efectivo para matar preferentemente las células hiperproliferativas es una cantidad que es al menos suficiente para saturar los receptores de la superficie celular de las células hiperproliferativas. En una modalidad más preferida, el agente polivalente efectivo para matar preferentemente las células hiperproliferativas es suficiente para saturar los receptores de la superficie celular de células normales procesando el antígeno de la superficie celular altamente expresado, al tiempo que mantiene la viabilidad de las células normales dentro de los intervalos aceptables para la salud del paciente. La muerte preferencial de las células hiperproliferativas con relación a las células normales es lograda en general al proporcionar una cantidad de agente polivalente suficientemente para reducir la viabilidad de las células hiperproliferativas mientras que no es suficiente para reducir la viabilidad de las células normales al mismo grado. Por ejemplo, utilizando un anticuerpo que hiere la membrana celular, la viabilidad de las células neoplásicas puede ser reducida por una cantidad que es al menos 10% mayor, más preferentemente 20% mayor, y aún más preferentemente, 30% mayor o más, con relación a la viabilidad de las células normales, aún cuando las células neoplásicas y las células normales expresen el mismo antígeno de la superficie celular sobre sus superficies respectivas. En consecuencia, en una modalidad, se proporciona un método para matar las células cancerosas, que comprende poner en contacto las células cancerosas con una cantidad citotóxica de un anticuerpo que induce la herida de la membrana celular a las células cancerosas. La citotoxicidad de la herida de la membrana celular es distinta de la citotoxicidad mediada por el complemento o la citotoxicidad mediada por las células. En una modalidad adicional, el anticuerpo de herida de la membrana celular es citotóxico para las células cancerosas por un mecanismo de herida de la membrana celular, así como un mecanismo de citotoxicidad mediado por el complemento y/o por las células. Preferentemente, el agente polivalente es administrado en una cantidad efectiva para matar rápidamente las células en división, tales como las células neoplásicas, pero no para matar las células normales. En otra modalidad más, el agente polivalente es administrado en una cantidad efectiva para matar las células hiperproliferativas, pero no para matar las células que muestran mortalidad normal o propiedades de adhesión normales. En ciertas modalidades preferidas, el método comprende además la administración de un agente citotóxico en combinación con el agente polivalente que se enlaza a un receptor altamente expresado de la superficie celular, sobre la superficie de las células hiperproliferativas. El agente citotóxico puede ser un agente quimioterapéutico, un isótopo radioactivo, un anticuerpo citotóxico, un inmunoconjugado, un conjugado de ligando, un inmunosupresor, un regulador del crecimiento celular y/o un inhibidor, una toxina, o mezclas de los mismos . En una modalidad adicional, el método comprende además administrar un agente de reticulación que proporciona la reticulación del anticuerpo de herida de la membrana celular. Preferentemente, el agente de reticulación es un anticuerpo, tal como un anticuerpo anti-kappa, un anticuerpo anti-lambda, un anticuerpo anti-mu o similares.

En una modalidad particular, la célula cancerosa es una célula B neoplásica, y el anticuerpo de herida de la membrana celular es un anticuerpo VH4-34. En ciertas modalidades, el anticuerpo de herida de la membrana celular es un anticuerpo VH4-34 y el agente de reticulación es un anticuerpo anti-VH4-34 que no previene el enlace del anticuerpo VH4-34 al antígeno de la superficie celular sobre la célula B. En otra modalidad más, es proporcionado un método para inducir la herida de la membrana celular, que comprende poner en contacto una célula con un agente polivalente que se enlaza a un antígeno de la superficie celular altamente expresado, presente sobre la superficie de la célula, en donde la célula es una célula linfoide. En ciertas modalidades, el agente polivalente es un anticuerpo, y la célula linfoide es una célula B que expresa el epitopo CDIM. Preferentemente, el anticuerpo es administrado en una cantidad efectiva para herir preferentemente las células B hiperproliferativas con relación a las células B normales. En una modalidad adicional, el anticuerpo es administrado en una cantidad efectiva para herir las células B hiperproliferativas pero no para matarlas. En una modalidad particular, el método comprende (1) tomar una muestra de la sangre de un paciente en necesidad de tratamiento para determinar el número de células B hiperproliferativas en la sangre del paciente, (2) determinar la susceptibilidad de las células B hiperproliferativas y las células B normales a la herida por el anticuerpo, y (3) administrar una cantidad del anticuerpo al paciente, suficiente para herir y/o matar preferentemente las células B hiperproliferativas en el paciente. El método puede comprender además la titulación en cantidades adicionales del anticuerpo al paciente, para lograr la cantidad deseada de herida y/o muerte celular. En una modalidad adicional, el método comprende (1) tomar una muestra de la sangre del paciente en necesidad de tratamiento para determinar el número de células B hiperproliferativas en la sangre del paciente, (2) determinar la susceptibilidad de las células B hiperproliferativas a las heridas por el anticuerpo, y (3) administrar una cantidad del anticuerpo al paciente, suficiente para herir las células B hiperproliferativas en el paciente. El método puede comprender además administrar una cantidad efectiva de un agente citotóxico al paciente, para lograr una reducción deseada en el número de células B hiperproliferativas en el paciente . En otras modalidades, los métodos para inducir la herida de la membrana celular son proporcionados, comprendiendo el contacto de una célula con un agente polivalente que se enlaza a un antígeno de la superficie celular altamente expresado, sobre la superficie de la célula, en donde la célula puede ser cualquier célula que exprese un antígeno de la superficie celular altamente expresado. De este modo, la célula puede ser un tipo de célula diferente de una célula linfoide, o puede ser un tipo celular diferente de una célula B. En otra modalidad más, el antígeno de la superficie celular altamente expresado no es el epitopo CDIM. En una modalidad adicional, es proporcionada una composición para inducir la herida de la membrana celular, que comprende un agente polivalente que se enlaza a un antígeno altamente expresado de la superficie celular, en donde la composición para inducir la herida de la membrana celular puede comprender además un agente de reticulación que aumenta la citotoxicidad del agente polivalente con relación a la citotoxicidad del agente polivalente en ausencia del agente de reticulación. En una modalidad particular, el agente polivalente es un anticuerpo, preferentemente un IgM. En otra modalidad particular, el agente de reticulación es un anticuerpo que se enlaza a IgM, proporcionando reticulación de la IgM enlazada a la superficie de la célula. En otra modalidad más, es proporcionado un método para inducir la herida de la membrana celular, que comprende poner en contacto una célula con un agente polivalente que se enlaza a un antígeno de la superficie celular, altamente expresado, sobre la superficie de la célula. El método puede comprender además poner en contacto la célula con un agente de reticulación que aumenta la citotoxicidad del agente polivalente con relación a la citotoxicidad del agente polivalente en ausencia del agente de reticulación. En una modalidad preferida, el agente polivalente es un anticuerpo, preferentemente un anticuerpo IgM, y el agente de reticulación es un anticuerpo, preferentemente un anticuerpo que se enlaza a IgM, proporcionando la reticulación del anticuerpo enlazado a la superficie de la célula. Preferentemente, la célula es una célula B y el anticuerpo es un IgM con especificidad de enlace para un epitopo CDIM sobre la superficie de la célula B. Preferentemente, el anticuerpo es un anticuerpo anti-CDIM y el agente de reticulación se enlaza al anticuerpo CDIM, proporcionando la reticulación del anticuerpo anti-CDIM enlazado a la superficie de la célula B. El agente de reticulación es preferentemente un anticuerpo anti-kappa o anti-lambda o un anticuerpo anti-VH4-34. En consecuencia, se proporciona un método para purgar la médula ósea de células B malignas de un paciente en necesidad del mismo, que comprende poner en contacto las células de la médula ósea con un anticuerpo que tiene enlace específico para un epitopo CDIM sobre la superficie de las células B. El método puede comprender además poner en contacto las células B con un agente de reticulación que retícula el anticuerpo enlazado al epitopo CDIM sobre la superficie de las células B, con lo cual se proporciona una citotoxicidad mejorada para el anticuerpo anti-CDIM hacia las células B malignas. En una modalidad preferida, el método comprende además poner en contacto las células con un agente citotóxico para purgar adicionalmente la médula ósea de las células B malignas. En otra modalidad más, es proporcionar una composición para matar las células hiperproliferativas, que comprende un agente polivalente que se enlaza a un antígeno de la superficie celular altamente expresado, presente sobre la superficie de una célula, en donde el agente polivalente comprende el medio de reticulación que proporciona un agente polivalente reticulado, enlazado a la superficie de la célula. El agente polivalente reticulado proporciona una muerte aumentada de las células hiperproliferativas en comparación con el agente polivalente en ausencia del medio de reticulación. En otra modalidad más, se proporciona una composición farmacéutica para tratar a un mamífero que sufre de una condición caracterizada por hiperproliferación de las células, la composición farmacéutica comprende un agente polivalente que se enlaza a un antígeno de la superficie celular altamente expresado, presente sobre la superficie celular. La composición farmacéutica puede comprende además un agente citotóxico. Preferentemente, la composición comprende además el medio de reticulación que aumenta la citotoxicidad del agente polivalente. Preferentemente, el agente polivalente mata las células hiperproliferativas al inducir la herida de la membrana celular que la célula no puede reparar. En una modalidad particular, el medio de reticulación puede ser el agente de reticulación monofuncional covalentemente enlazado al agente polivalente que se enlaza al antígeno de la superficie celular altamente expresado sobre la célula. El agente de reticulación puede comprender un grupo funcional reticulador tal como una succinimida, maleimida o tiol o similares, en el extremo distal del agente de reticulación para reticularse con un agente polivalente adyacente enlazado al antígeno de la superficie celular altamente expresado, sobre la superficie de la célula. Preferentemente, el agente polivalente es un anticuerpo, tal como un anticuerpo natural, incluyendo IgM, IgG, IgA, IgD, IgE; un anticuerpo recombinante, un anticuerpo monoclonal, un anticuerpo policlonal, un anticuerpo quimérico, un anticuerpo sintético tal como un anticuerpo tetravalente o proteína de fusión que comprende un anticuerpo; un fragmento de anticuerpo tal como Fab2 , scFv y similares. En una modalidad preferida el anticuerpo es un igM. En una modalidad adicional, el medio de reticulación puede ser un agente de reticulación que se enlaza a un anticuerpo. En una modalidad preferida, el medio de reticulación es un agente anti-kappa o anti-lambda que retícula los anticuerpos adyacentes enlazados al antígeno de la superficie celular altamente expresado sobre la superficie de la célula. En otra modalidad más, el medio de reticulación puede ser un polímero hidrofílico o una red de polímeros, que tienen un peso molecular de aproximadamente 100 a aproximadamente 10,000 Daltones, que poseen una pluralidad de agentes polivalentes con enlace específico para el antígeno de la superficie celular altamente expresado sobre la superficie de la célula, tales como los anticuerpos, o porciones de anticuerpos, por ejemplo Fab o scFv. El agente polivalente que se enlaza al antígeno de la superficie celular altamente expresado se enlaza preferentemente con alta afinidad. Típicamente, el enlace de alta afinidad es al menos 106 M"1, y preferentemente está entre aproximadamente 106 M"1 y aproximadamente 108 M-1. En una modalidad adicional, es proporcionada una composición farmacéutica para tratar a un mamífero que sufre de una condición caracterizada por hiperproliferación de las células, que comprende un agente polivalente que se enlaza a un antígeno de la superficie celular altamente expresado sobre la superficie de una célula, en donde el agente polivalente comprende una pluralidad de sitios de enlace para el antígeno de la superficie celular, sobre la superficie de la célula. Preferentemente, la pluralidad de sitios de enlace es al menos cinco, y más preferentemente es de aproximadamente 5 hasta aproximadamente 100. En modalidades particulares, la pluralidad de sitios de enlace puede ser de aproximadamente 5 a aproximadamente 15, de aproximadamente 15 a aproximadamente 25, o de aproximadamente 15 a aproximadamente 50. Preferentemente, el agente polivalente que comprende una pluralidad de sitios de enlace para el antígeno de la superficie celular proporciona una citotoxicidad aumentada de las células hiperproliferativas, que está asociada con un número mayor de sitios de enlace. Los objetivos, ventajas y características novedosas adicionales de la invención serán descritos en parte en la descripción siguiente, y en parte se volverán aparentes para aquellos expertos en la técnica después del examen de lo siguiente, o puede ser aprendido por la práctica de la invención.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS La Figura 1 ilustra que los anticuerpos codificados por VH4-34 se enlazan a linfomas y leucemias de células B primarias . La Figura 2 ilustra que los anticuerpos monoclonales codificados por VH4-34 se enlazan y matan las líneas de células B humanas. La Figura 3 ilustra la variabilidad de la citotoxicidad del mAb 216 a células de linfoma folicular. La Figura 4 ilustra que la muerte de las células B por el mAb 216 y la vincristina es sinérgica. La Figura 5A ilustra el curso de tiempo de la aparición de Lamp-1 sobre la superficie de las células B tratadas con el mAb 216, en comparación con el curso de tiempo de la pérdida de la viabilidad celular. La Figura 5B ilustra el curso de tiempo de la liberación del ATP de las células dañadas, en comparación con el número de células viables. La Figura 6A ilustra la viabilidad de las células tratadas con dos anticuerpos VH4-34 en el medio con y sin calcio. La Figura 6B ilustra la viabilidad de las células tratadas con agentes citotóxicos. La Figura 7 ilustra la citotoxicidad adicional del mAb cuando el anticuerpo es reticulado. La Figura 8 ilustra la citotoxicidad dependiente de la dosis de un anticuerpo que induce herida de la membrana celular.

Las Figuras 9A y 9B ilustran la eficacia del tratamiento con el mAb216 y vincristina en pacientes humanos.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN I. Definiciones y panorama general Antes de que se describa la presente invención con detalle, se debe entender que a no ser que se indique de otro modo, esta invención no está limitada a los amortiguadores, excipientes, agentes quimioterapéuticos o similares, particulares, ya que éstos pueden variar. Se debe entender también que la terminología utilizada en la presente es para fines de describir las modalidades particulares únicamente y no se pretende que limite el alcance de la presente invención . Se debe notar que como se utiliza en la presente y en las reivindicaciones, las formas singulares "un, uno, una", "y" y "el, la" incluyen los referentes plurales a no ser que el contexto lo dicte claramente de otro modo. De este modo, por ejemplo, la referencia a "un agente quimioterapéutico" incluye dos o más agentes quimioterapéuticos; la referencia a "un excipiente farmacéutico" incluye dos o más excipientes farmacéuticos, y así sucesivamente. Donde es proporcionado un intervalo de valores, se debe entender que cada valor que interviene, al décimo de la unidad del límite inferior a no ser que el contexto lo dicte claramente de otro modo, entre el límite superior e inferior de ese intervalo, y cualquier otro valor establecido o que interviene en ese intervalo establecido, es abarcado dentro de la invención. Los límites superior e inferior de estos intervalos más pequeños pueden ser independientemente incluidos los intervalos más pequeños, y son también abarcados dentro de la invención, sujeto a cualquier límite específicamente excluido en el intervalo establecido. Donde el intervalo establecido incluye uno o ambos de los límites, los intervalos que excluyen uno o ambos de esos límites incluidos son también incluidos en la invención. Los términos "anticuerpo anti-CDMI" y "anticuerpo que se enlaza a CDIM" como se utilizan en la presente, se refieren a un anticuerpo que tiene enlace específico para los epitopos de CDIM sobre una célula B. Estos términos serán utilizados aquí intercambiablemente. El término "anticuerpo anti-VH4-34" se refiere a un anticuerpo que se enlaza específicamente a un epitopo presente sobre la región variable de un anticuerpo codificado por el gen VH4-34, un anticuerpo VH4-34, y como tal puede incluir la secuencia de línea germinal de las regiones denominadas hipervariables o "regiones de determinación de la complementariedad" ("CDRs") del anticuerpo VH4-34. No obstante, el epitopo no es un marcador de una inmunoglobulina única formada por la hipermutación somática tal como una CDR de línea no germinal. En una modalidad preferida, el epitopo está presente en la región estructural del anticuerpo, y preferentemente no incluye la CDR del anticuerpo. En una modalidad preferida adicional, el anticuerpo anti-VH4-34 no interfiere con el enlace específico del anticuerpo VH4-34 a su antígeno. El término "9G4" se refiere a un anticuerpo monoclonal de rata que ha mostrado que reconoce VH4-34 Ab (Stevenson, et al. Blood 68: 430 (1986)). El epitopo VH4-34 identificado por el mAb 9G4 está restringido en conformación y es dependiente sobre una secuencia única cercana a los aminoácidos 23-25 en la región estructural 1 ("FRl") de la cadena pesada variable. 9G4 es una especie del anticuerpo anti-VH4-34. El término "anticuerpo" es utilizado en el sentido más amplio y cubre específicamente los anticuerpos naturales intactos, anticuerpos monoclonales, anticuerpos policlonales, anticuerpos multiespecíficos (por ejemplo, anticuerpos biespecíficos) formados a partir de al menos dos anticuerpos intactos, anticuerpos sintéticos tales como los anticuerpos tetravalentes, y fragmentos de anticuerpos, siempre y cuando éstos muestren la actividad biológica deseada. Los anticuerpos humanos incluyen anticuerpos elaborados en especies no humanas. El término anticuerpo también abarca las moléculas de Ig formadas únicamente a partir de cadenas pesadas, tales como aquellas obtenidas de Camélidos, y descritas en las Patentes de los Estados Unidos Nos. 6,765,087 y 6,015,695 a Casterman, por ejemplo. El término anticuerpo también abarca la fusión o el acoplamiento químico (por ejemplo, conjugación) de los anticuerpos con agentes reguladores de las células o citotóxicos. "Fragmentos de anticuerpo" comprenden una porción de un anticuerpo intacto, preferentemente la región variable o de enlace al antígeno del anticuerpo intacto. Los ejemplos de fragmentos de anticuerpo incluyen los fragmentos Fab, Fab', F(ab')2, y Fv; los diacuerpos; anticuerpos lineales (Zapata et al. (1995) Protein Eng. 8(10), 1057-1062) moléculas de anticuerpo de cadena simple; y anticuerpos multiespecíficos formados a partir de los fragmentos de anticuerpo . El término "anticuerpo monoclonal" como se utiliza en la presente, se refiere a un anticuerpo obtenido a partir de una población de anticuerpos sustancialmente homogéneos, por ejemplo, los anticuerpos individuales que comprenden la población son idénticos, excepto por las posibles mutaciones de origen natural que pueden estar presentes en cantidades menores . Los anticuerpos monoclonales son altamente específicos, siendo dirigidos contra un sitio antigénico único. Además, en contraste a las preparaciones de anticuerpo convencionales (policlonales) que incluyen típicamente anticuerpos diferentes dirigidos contra los determinantes diferentes (epitopos), cada anticuerpo monoclonal está dirigido contra un determinante simple sobre el antígeno. Además de su especificidad, los anticuerpos monoclonales son ventajosos ya que éstos son sintetizados por cultivos de hibridomas, no contaminados por otras inmunoglobulinas. El modificador "monoclonal" indica el carácter del anticuerpo que es obtenido a partir de una población sustancialmente homogénea de anticuerpos, y no debe ser considerado como que requiere producción del anticuerpo por algún método particular. Por ejemplo, los anticuerpos monoclonales que van a ser utilizados de acuerdo con la presente invención pueden ser elaborados mediante el método de hibridoma primeramente descrito por Kohier et al., Nature 256, 495 (1975), o pueden ser elaborados mediante métodos de ADN (ácido desoxirribonucleico) recombinante (ver, por ejemplo, Patente de los Estados Unidos No. 4,816,567) . Los "anticuerpos monoclonales" pueden también ser aislados a partir de bibliotecas de anticuerpos fagos utilizando las técnicas descritas en Clackson et al. (1991) Nature, 352, 624-628 y Marks et al., (1991) J. Mol . Biol . 222, 581-597, por ejemplo. Los anticuerpos monoclonales específicamente en la presente incluyen los anticuerpos "quiméricos" (inmunoglobulinas) en los cuales una porción de la cadena pesada y/o ligera es idéntica con u homologa a las secuencias correspondientes en anticuerpos derivados de una especie particular o que pertenece a una clase o subclase de anticuerpo particular, mientras que el resto de la o las cadenas son idénticas con u homologas a las secuencias correspondientes en anticuerpos derivados de otra especie o que pertenecen a otra clase o subclase de anticuerpo, así como los fragmentos de tales anticuerpos, siempre y cuando estos muestren la actividad biológica deseada (Patente de los Estados Unidos No. 4,816,567; Morrison et al., (1984) Proc . Na ti . Acad . Sci . EUA, 81, 6851-6855). Las formas "humanizadas" de anticuerpos no humanos (por ejemplo, murinos) son inmunoglobulinas quiméricas, cadenas de inmunoglobulina o fragmentos de las mismas (tales como Fv, Fab, Fab', F(ab')2 u otras secuencias de anticuerpos, que se enlazan al antígeno) que contienen la secuencia mínima derivada de la inmunoglobulina no humana. Para la mayor parte, los anticuerpos humanizados son inmunoglobulinas humanas (anticuerpo del recipiente) en el cual los residuos provenientes de una región de determinación de la complementariedad (CDR) del recipiente son reemplazadas por residuos provenientes de una CDR de una especie no humana (anticuerpo donador) tal como ratón, rata o conejo que tiene la especificidad, afinidad y capacidad deseadas. En algunos casos, los residuos de la región estructural (FR) de la inmunoglobulina humana son reemplazados por residuos no humanos correspondientes. Además, los anticuerpos humanizados pueden comprender residuos que no son encontrados ni en el anticuerpo recipiente ni en la CDR importada o las secuencias estructurales. Estas modificaciones son realizadas para refinar adicionalmente y elevar al máximo el funcionamiento del anticuerpo. En general, el anticuerpo humanizado comprenderá sustancialmente todo de al menos uno, y típicamente dos, dominios variables, en los cuales todas o sustancialmente todas las CDRs corresponden a aquellas de la inmunoglobulina no humana, y todas o sustancialmente todas las FRs son aquellas de una secuencia de inmunoglobulina humana. El anticuerpo humanizado comprenderá también óptimamente al menos una porción de una región constante de inmunoglobulina (Fc) , típicamente aquella de una inmunoglobulina humana. Para detalles adicionales ver Jones et al., (1986) Na ture 321, 522-525; Reichmann et al., (1988) Nature 332, 323-329; y Presta (1992) Curr . Op . Struct . Biol . 2, 593-596. El anticuerpo humanizado incluye un anticuerpo PRIMATIZEDMR en donde la región de enlace al antígeno del anticuerpo es derivada de un anticuerpo producido mediante la inmunización de monos macacos con el antígeno de interés. Los fragmentos de anticuerpo "Fv de cadena simple" o "scFv" comprenden los dominios VH y VL del anticuerpo, en donde estos dominios están presentes en una cadena polipeptídica simple. Preferentemente, el polipéptido de Fv comprende además un ligador polipeptídico entre los dominios de VH y VL que hace posible que el scFv forme la estructura deseada para el enlace al antígeno. Para una revisión de scFv ver Pluckthun en The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, Vol. 113, Rosenburg y Moore Eds., Springer-Verlag, Nueva York, p. 269-315 (1994) . El término "diacuerpos" se refiere a fragmentos de anticuerpo pequeños con dos sitios de enlace al antígeno, cuyos fragmentos comprenden un dominio variable de cadena pesada (VH) conectado a un dominio variable de cadena ligera (VL) en la misma cadena polipeptídica (VH-VL) . Mediante el uso de un ligador que es demasiado corto para permitir el apareamiento entre los dos dominios sobre la misma cadena, los dominios son forzados a aparearse con los dominios complementarios de otra cadena y crear dos sitios de enlace al antígeno. Los diacuerpos son descritos más completamente en, por ejemplo, la Patente Europea EP-404,097; 093/11161; y Hollinger et al. (1993) Proc . Nati . Acad . Sci . EUA 90, 6444-6448. Un anticuerpo "aislado" es uno que ha sido identificado y separado y/o recuperado de un componente de su ambiente natural . Los componentes contaminantes de su ambiente natural son materiales que podrían interferir con los usos diagnósticos o terapéuticos para el anticuerpo, y pueden incluir enzimas, hormonas y otros solutos proteicos o no proteicos. En modalidades preferidas, el anticuerpo será purificado (1) a más de 95% en peso del anticuerpo como es determinado por el método de Lowry, y lo más preferentemente más de 99% en peso, (2) a un grado suficiente para obtener al menos 15 residuos de la secuencia de aminoácidos N-terminal o interna mediante el uso de un secuenciador de copa giratoria, o (3) hasta la homogeneidad mediante SDS-PAGE bajo condiciones reductoras o no reductoras utilizando azul de Coomassie o, preferentemente, tinción con plata. El anticuerpo aislado incluye un anticuerpo in si tu dentro de las células recombinantes ya que al menos un componente del ambiente natural del anticuerpo no estará presente. Ordinariamente, no obstante, el anticuerpo aislado será preparado por al menos un paso de purificación. Un agente que "detiene el crecimiento de" o un "agente inhibitorio de crecimiento" como se utiliza en la presente, se refiere a un compuesto o composición que inhibe el crecimiento o proliferación de una célula, especialmente un tipo de célula neoplásica que expresa un antígeno de célula B tal como el antígeno CD20 como se requiera. De este modo, el agente inhibitorio del crecimiento es uno que por ejemplo reduce significativamente el porcentaje de células neoplásicas en la fase S.

Los términos "cáncer" y "cancerosos" se refieren a o describen la condición fisiológica en mamíferos, que está típicamente caracterizada por crecimiento celular no regulado. El antígeno "CD20" es una fosfoproteína no glucosilada de 35 kDa, encontrada sobre la superficie de más de 90% de las células B provenientes de sangre periférica o de órganos linfoides. CD20 es expresado durante el desarrollo temprano de las células pre-B y permanece hasta la diferenciación de las células plasmáticas. CD20 está presente sobre las células B normales así como las células B malignas. Otros nombres para CD20 en la literatura incluyen "antígeno restringido a linfocitos B" y "Bp35". El antígeno CD20 es descrito en Clark et al. PNAS (EUA) 82: 1766 (1985), por ejemplo. El término "herida celular" se refiere a un evento de perturbación de la membrana plasmática, al que se puede sobrevivir, marcado por la captación dentro del citosol de un rastreador normalmente impermeable a la membrana. Las perturbaciones de herida celular típicamente están en el intervalo de entre aproximadamente 1 y 1000 µm2 , y de este modo son muchos más grandes que las perturbaciones de membrana que acompañan la citotoxicidad mediada por el complemento, o la perforina, o incluso poros grandes formados por las toxinas o agentes formadores de poros, tales como la gramicidina o la toxina alfa de Staphylococcus aureus . La herida celular es detectada por el mecanismo de reparación celular manifestado como resultado de la herida, a saber la expresión de Lamp-1 sobre la superficie celular como resultado de la fusión lisosomal para reparar la herida. El término "agente de herida celular" o "anticuerpo de herida de la membrana celular" se refiere a un anticuerpo, que después del enlace a un antígeno de la superficie celular altamente expresado, provoca un evento de perturbación de la membrana plasmática, al que se puede sobrevivir, marcado por la captación dentro del citosol de un rastreador normalmente impermeable a la membrana. Los anticuerpos de herida celular promueven el mecanismo de reparación celular manifestado como resultado de la herida, a saber la expresión de Lamp-1 sobre la superficie celular como resultado de la fusión lisosomal para reparar la herida. El término "agente quimioterapéutico" se refiere a un compuesto químico útil en el tratamiento del cáncer u otra condición caracterizada por una hiperproliferación de las células. Los términos "agente citotóxico" y "citotoxina" como se utiliza en la presente, se refieren a una sustancia que inhibe o define el crecimiento de, o inhibe o previene la función de las células, y/o provoca muerte de las células. El término está destinado a incluir uno o más isótopos radioactivos, agentes quimioterapéuticos, inmunosupresores, reguladores del crecimiento celular y/o inhibidores del mismo, que pueden ser agentes terapéuticos de molécula pequeña, anticuerpos citotóxicos, y toxinas tales como las toxinas enzimáticamente activas de origen bacteriano, fúngico, vegetal o animal, o fragmentos de las mismas. El término también incluye los inmunoconjugados que comprenden anticuerpos marcados con toxinas o isótopos radioactivos para el enlace específico a una célula objetivo, así como otros conjugados del ligando, tales como ligandos radiomarcados, y ligandos marcados con toxinas. Además, pueden ser utilizados uno o más agentes citotóxicos en combinación. Un "trastorno" es cualquier condición que pudiera beneficiarse del tratamiento con la terapia en combinación descrita en la presente. Éste incluye los trastornos crónicos y agudos o las enfermedades que incluyen aquellas condiciones patológicas que predisponen al mamífero al trastorno en cuestión. Los ejemplos no limitantes de trastornos que van a ser tratados en la presente incluyen cáncer, malignidades hematológicas, leucemias y malignidades linfoides, y enfermedades autoinmunes tales como trastornos inflamatorios e inmunológicos. El término "antígeno de la superficie celular altamente expresado" se refiere a un antígeno de superficie accesible sobre la superficie de la célula (por ejemplo, aquel que no requiere la permeación de la célula para mostrar enlace) que está presente en al menos 104 copias por célula, y que está presente sobre al menos una porción de la célula a una densidad de al menos 25 copias/µm2. Los antígenos de la superficie celular incluyen moléculas expresadas por la superficie de la célula tales como receptores, inmunoglobulinas, citocinas, glucoproteínas, etc. Los términos "hiperproliferación" e "hiperproliferante" se refieren al crecimiento anormal de un tipo celular, que puede ser canceroso o benigno. En general, las células hiperproliferativas muestran una velocidad de división celular que es al menos aproximadamente 10% mayor que la velocidad de división celular exhibida por células normales de ese tipo celular. La hiperproliferación incluye la expansión policlonal de las células B que secretan autoanticuerpos que son mediadores de las enfermedades autoinmunes . El término "inmunoconjugados" se refiere a los anticuerpos conjugados a los agentes citotóxicos, los cuales pueden ser covalente o no covalentemente asociados. El término "infusión intravenosa" se refiere a la introducción de un agente dentro de la vena de un animal o paciente humano en un periodo de tiempo, en general mayor de aproximadamente 15 minutos, y más en general entre aproximadamente 30 a 90 minutos.

El término "bolo intravenoso" o "empuje intravenoso" se refiere a la administración de un fármaco dentro de una vena de un animal o humano tal que el cuerpo recibe el fármaco en aproximadamente 15 minutos o menos, en general en 5 minutos o menos. El término "mamífero" para fines de tratamiento se refiere a cualquier especie de mamífero, incluyendo humanos, animales domésticos y de granja, y animales de zoológico, deportivos, de mascota o silvestres. Cuando el antígeno de la superficie celular es el antígeno CDIM, la expresión del antígeno CDIM no debe ser expresada sobre eritrocitos de la especie de mamífero si va a ser evitada la hemaglutinación. Preferentemente, el antígeno CDIM está predominantemente restringido a las células de la línea celular B después del nacimiento. El anticuerpo anti-CD20 humanizado referido como de la marca "RITUXAN®" el anticuerpo anti-CD20 es un anticuerpo monoclonal quimérico murino/humano, manipulado por ingeniería genética, dirigido contra el antígeno CD20. El rituximab es el anticuerpo llamado "C2B8" en la Patente de los Estados Unidos No. 5,736,137 expedida el 7 de abril de 1998. La marca RITUXAN® del anticuerpo C2B8 es indicada para el tratamiento de pacientes con linfoma no Hodgkin de células B, de recidiva o refractario de grado bajo o folicular, positivo a CD20.

El término "enlace específico" se refiere a la propiedad de tener una alta afinidad de enlace de al menos 106 M_1, y usualmente entre aproximadamente 106 M"1 y aproximadamente 108 M"1. El término "administración subcutánea" se refiere a la introducción de un agente bajo la piel de un animal o paciente humano, preferentemente dentro de una bolsa dentro de la piel y el tejido subyacente, mediante distribución sostenida, relativamente lenta a partir de un receptáculo del fármaco. La bolsa puede ser creada mediante la pinchadura o jalón de la piel hacia arriba y lejos del tejido subyacente. El término "bolo subcutáneo" se refiere a la administración del fármaco por debajo de la piel de un animal o paciente humano, donde la distribución del fármaco en bolo es preferentemente menor de aproximadamente 15 minutos, más preferentemente menor de 5 minutos, y lo más preferentemente de 60 segundos. La administración es preferentemente dentro de una bolsa entre la piel y el tejido subyacente. El término "infusión subcutánea" se refiere a la introducción de un fármaco bajo la piel de un animal o paciente humano, preferentemente dentro de una bolsa de entre la piel y el tejido subyacente, mediante la distribución sostenida, relativamente lenta de un receptáculo del fármaco por un periodo de tiempo que incluye, pero no está limitado a, 30 minutos o menos, o 90 minutos o menos. Opcionalmente, la infusión puede ser realizada mediante implantación subcutánea de una bomba de distribución de fármaco implantada bajo la piel del animal o el paciente humano, en donde la bomba distribuye una cantidad predeterminada del fármaco por un periodo predeterminado de tiempo, tal como 30 minutos, 90 minutos, o un periodo de tiempo que abarca la longitud del régimen de tratamiento. El término "cantidad terapéuticamente efectiva" es utilizado para referirse a una cantidad de un agente activo que tiene un efecto de detención del crecimiento o provoca la muerte de la célula. En ciertas modalidades, la cantidad terapéuticamente efectiva tiene la propiedad de permeabilizar las células, inhibir la señalización proliferativa, inhibir el metabolismo celular, promover la actividad apoptótica, o inducir la muerte celular. En aspectos particulares, la cantidad terapéuticamente efectiva se refiere a una concentración en suero objetivo que ha mostrado que es efectiva en, por ejemplo, el retardo de la progresión de la enfermedad. La eficacia puede ser medida de manera convencional, dependiendo de la condición que va a ser tratada. Por ejemplo, en cánceres linfoides, la eficacia puede ser medida mediante la evaluación del tiempo hasta la progresión de la enfermedad (TTP) , o la determinación de las velocidades de respuesta (RR) . Los términos "tratar", "tratamiento" y "terapia" y similares , como se utilizan dentro del contexto de la presente invención, se entiende que incluyen medidas terapéuticas así como profilácticas o supresoras para una enfermedad o trastorno que conduce a cualquier efecto clínicamente deseable o benéfico , incluyendo pero no limitado al alivio de uno o más síntomas , a la regresión, retardo o cese de la progresión de la enfermedad o trastorno . De este modo , por ej emplo , el término tratamiento incluye la administración de un agente antes de o después del inicio de un síntoma de una enfermedad o trastorno , con lo cual se previene o se eliminan todos los signos de la enfermedad o el trastorno. Como otro ejenplo más, el término incluye la administración de un agente después de la manifestación clínica de la enfermedad, para combatir los síntomas de la enfermedad. Además, la administración de un agente después del inicio y después de que los síntomas clínicos se han desarrollado, donde la administración afecta los parámetros clínicos de la enfermedad o el trastorno, tales como el grado de daño al tejido o la cantidad o grado de metástasis, ya sea que el tratamiento conduzca o no al mejoramiento de la enfermedad, comprende el "tratamiento" o "terapia" dentro del contexto de la invención.

II . Anticuerpos que hieren la membrana celular Los anticuerpos VH4-34 ( región pesada variable) son uno de los 53 anticuerpos de línea germinal de anticuerpo funcional humano , identificados , codificados por los genes de línea germinal (VH4.21). Cook, G.P., et al., (1994), Nat . Genet . 1 , 162-168. El gen para los anticuerpos VH4-34 está presente en todos los haplotipos y no ha sido reportada ninguna variación en la secuencia en el AD? de línea germinal aislado de individuos no relacionados. Weng, ?.P., et al., (1992) Eur . J. Inmuno 1 . 22; 1075-1082; van der Maarel, S., et al. (1993) J. Immunol . 150, 2858-2868. Los anticuerpos codificados por el gen VH4-34 han mostrado que poseen propiedades únicas . Todos los mAbs dirigidos contra los antígenos "I" o "i" de las células sanguíneas rojas (RBCs) son codificados por el gen VH4-34, son en general de la clase IgM, y son clásicamente descritos como aglutininas frías (CAs) debido a que aglutinan las RBCs a 4°C. Pascual, V., et al., (1991) J. Immunol . 146, 4385-4391; Pascual, V. (1992) J. Immunol . 149, 2337-2344; Silberstein, L.E., et al., (1991) Blood 78, 2372-2386. Los ligandos reconocidos por las CAs son glucoconjugados lineales o ramificados presentes sobre las proteínas y/o los lípidos de las RBCs. Las RBC de sangre de neonato de cordón umbilical poseen el antígeno i lineal. La cadena I ramificada es generada después del nacimiento. Pruzanski, W. et al. (1984) Clin . Inmuno 1 . Rev. 3, 131-168; Roelcke, D. (1989) Transfusión Med. Rev. 2 , 140-166. El antígeno "i" reconocido sobre las células B humanas es un determinante de lactosamina lineal que es sensible a la enzima endo-beta-galactosidasa . El análisis secuencial de los mAbs anti-célula B/anti-i de VH4-34, independientemente derivados, ha mostrado que éstos están en la configuración de línea germinal. Bhat N.M. et al. (1997) Clin . Exp . Inmuno 1 . 108, 151-159. In vivo, la expresión de los anticuerpos derivados del gen VH4-34, está estrictamente regulada. Aunque 4-8% de las células B humanas expresan el anticuerpo codificado por VH4-34, los niveles en suero de los anticuerpos derivados de VH4-34 son despreciables en adultos normales. Stevenson F.K., et al. (1989) Br . J. Haematol . 72, 9-15; Kraj P. et al., (1995) ". Immunol . 154, 6406-6420. El incremento en la circulación de los anticuerpos derivados de VH4-34 es observado únicamente en condiciones patológicas selectivas incluyendo infecciones virales (Epstein Barr (mononucleósis) , virus de inmunodeficiencia humana y virus de la hepatitis C) , Mycoplasma pneumoniae y ciertas enfermedades autoinmunes . Ver también Bhat, N.M. et al. (2005) Human Antibodies 13, 63-68. Los presentes inventores han estudiado extensamente los anticuerpos codificados por VH4-34 y su papel en trastornos autoinmunes. Estudios previos demostraron que ciertos anticuerpos de VH4-34 anti-células B, son citotóxicos para las células B y conducen a proliferación disminuida de las células B, Bhat, N. et al. (1997) Clin . Exp . Inmuno 1 . 108: 151; Bhat, N. et al. (2001) Crit. .Rev. Oncol . Hematol . 39, 59. Se mostró que la citotoxicidad es independiente del complemento, y es altamente dependiente de la temperatura, dando como resultado mayor muerte celular y la formación de defectos en la membrana plasmática tales como vejigas y poros sobre la superficie celular, cuando se tratan a 4°C. Se mostró que los defectos en la membrana plasmática son significativamente más grandes que los poros formados por otras proteínas formadoras de poro, bien conocidas, tales como el componente del componente C9 (aproximadamente 100 D) y la perforina (aproximadamente 160 D) . Se sugirió que la citotoxicidad puede ser mediada por un novedoso mecanismo. Los presentes inventores han realizado el descubrimiento sorprendente e inesperado de que estos anticuerpos derivados del gen VH4-34 pueden inducir la herida de la membrana celular en células B, que es distinta de los defectos grandes de la membrana plasmática observados en células muertas por los anticuerpos anti-CDIM previamente reportados (Bhat, N. et al. (1997) Clin . Exp . Inmuno 1 . 108: 151; Bhat, N. et al. (2001) Crit. Rev. Oncol . Hematol . 39, 59). Aunque el anticuerpo provoca poros y defectos en la membrana en células bajo ciertas condiciones, cuando se trata a concentraciones subletales, algunas de las células B son meramente heridas, y son capaces de reparar la herida en algunos casos . Aunque el daño a la membrana es una amenaza común enfrentada por las células nucleadas de los mamíferos, el hecho de que un anticuerpo pudiera ser la causa directa del daño a la membrana, es novedoso. Además, los presentes inventores han demostrado que la herida de la membrana celular inducida por el anticuerpo es reparada de una manera similar a cualquier otra herida membranal . Las células tratadas con estos anticuerpos citotóxicos independientes del complemento, intentan reparar la herida de la membrana celular inducida por el anticuerpo, utilizando la fusión lisosomal con la membrana plasmática para parchar la herida de la membrana, dando como resultado la aparición de proteínas de la membrana lisosomal sobre la superficie celular. Se ha demostrado también que cuando las células son incapaces de reparar el daño, al final da como resultado la muerte. Además, los presentes inventores han descubierto que las células heridas son permeabilizadas, al menos transitoriamente, y se vuelven más susceptibles a la acción de agentes citotóxicos adicionales, proporcionando nuevas opciones de tratamiento que tienen eficacia mejorada para el tratamiento de enfermedades y trastornos humanos y animales. La herida de la membrana celular da como resultado la permeabilización de las células B y permite la entrada de agentes citotóxicos tales como agentes quimioterapéuticos, incrementando de este modo la eficacia de los agentes quimioterapéuticos , incluso en células que son resistentes o impermeables a tales agentes, o en células que las transportan activamente fuera de la célula. Debido a que el mecanismo de la muerte celular y la herida proporcionada por los anticuerpos que se enlazan a CDIM es diferente del mecanismo citotóxico utilizado por los anticuerpos citotóxicos convencionales (muerte mediada por el complemento o por las células) , la combinación de los anticuerpos que se enlazan a CDIM, con las inmunoterapias convencionales, pueden proporcionar una eficiencia mejorada de muerte por anticuerpos citotóxicos que se enlazan a antígenos adicionales de las células B, especialmente bajo condiciones de inmunodeficiencias tales como agotamiento o deficiencia del complemento. Además, la acción de los anticuerpos de herida celular puede ser aumentada por la adición de un agente de reticulación que aumenta la citotoxicidad de los anticuerpos con relación a la citotoxicidad de los anticuerpos en ausencia del agente de reticulación. Esta observación es distinguible de la apoptosis inducida por la hiperreticulación, por ejemplo, reportada por Marches, R. et al. (1995) Ther . Immunol . 2 , 125, estableciendo que la reticulación de la IgM y la señalización resultante puede ser un factor mayor en la inducción y mantenimiento de la inactividad y la apoptosis después de la hiperreticulación.

En una modalidad preferida, los anticuerpos de acuerdo a un aspecto de la invención son anticuerpos monoclonales codificados por VH4-34 que se enlazan al epitopo de CDIM sobre las células B humanas, tal como se describe en Grillot-Courvalin, C. et al. (1992) Eur . J. Immunol . 22, 1781-1788; Bhat, N. M. et al. (1993) J. Inmuno 1 . 151, 5011-5021; Silberstein, L.E., et al. (1996) Blood Cells, Molecules and Diseases, 22, 126-138, y como se ilustra en las Figuras 1 y 2. Estos anticuerpos son citotóxicos para las células B obtenidas de pacientes con linfoma folicular en recaída, como se ilustra en la Figura 3. Además, los anticuerpos son citotóxicos para las líneas de células B, como se muestra en la Figura 4. En una modalidad preferida, estos mAbs son producidos por la fusión de los linfocitos humanos y una línea celular de heteromieloma, que produce un hibridoma que secreta anticuerpo humano. Por ejemplo, el mAb 216 es una IgM humana codificada por el gen VH4-34, y es una modalidad preferida de los anticuerpos de VH4-34 que se enlazan a CDIM, descritos en la presente. El mAb 216 es además descrito en las Patentes de los Estados Unidos Nos. 5,593,676 y 5,417,972 y la Patente Europea EP-712,307 Bl a Bhat et al. Los anticuerpos derivados de VH4-34 adicionales que se enlazan al epitopo de CDIM incluyen RT-2B, FS 12, A6(H4C5), Cal-4G, S20A2, FS 3, Gee, HT, Z2D2, Y2K. Algunos de estos anticuerpos son caracterizados por una secuencia de CDR3 rica en residuos de aminoácidos básicos, y por el enlace particularmente fuerte cuando la carga neta del CDR3 es de +2. En consecuencia, cualquier anticuerpo que posea una CDR positiva en ésta, particularmente CDR3 , y que muestre enlace al epitopo de CDIM, es abarcado dentro del alcance de la invención y como se reclama en las reivindicaciones anexas. No obstante, será apreciado por una persona de experiencia en la técnica que cualquier anticuerpo que se enlace al epitopo de CDIM que muestre citotoxicidad para una célula B es abarcada dentro del alcance de los anticuerpos que se enlazan a CDIM, descritos en la presente.

III. Métodos y composiciones para inducir la herida de la membrana celular En consecuencia, en una modalidad de la invención, se proporciona una composición para inducir la herida de la membrana celular, en donde la composición comprende un agente polivalente que se enlaza a un antígeno de la superficie celular, altamente expresado presente sobre la superficie de una célula. Preferentemente, el antígeno de la superficie celular está asociado con el citoesqueleto de la célula. Por ejemplo, el antígeno de la superficie celular permanece asociado con la célula después de la eliminación de los componentes solubles mediante extracción con detergente. La herida de la membrana celular es un daño a la membrana al que se puede sobrevivir, reparado por la fusión lisosomal, detectable por la aparición o expresión de proteínas lisosomales sobre la superficie de la célula, y da como resultado la permeabilización al menos transitoria de la célula. En una modalidad adicional, es proporcionada una composición para permeabilizar una célula, que comprende un agente polivalente que se enlaza a un antígeno de la superficie celular altamente expresado, presente sobre la superficie de una célula. En otro aspecto más, se proporciona un método para permeabilizar una célula, que comprende poner en contacto una célula con un agente polivalente que se enlaza a un antígeno de la superficie celular altamente expresado, presente sobre la superficie de la célula. En otras modalidades, se proporcionan los métodos para inducir el sanado de la membrana celular, que comprende poner en contacto una célula con un agente polivalente que se enlaza a un antígeno de la superficie celular altamente expresado, sobre la superficie de la célula, en donde la célula puede ser cualquier célula que exprese un antígeno de la superficie celular altamente expresado. De este modo, la célula puede ser un tipo de célula diferente de una célula linfoide, puede ser un tipo celular diferente de una célula B. En otra modalidad más, el antígeno de la superficie celular altamente expresado no es el epitopo de CDIM. Los métodos y composiciones descritos en la presente también abarcan el uso de un agente polivalente que hiere la membrana celular, particularmente un anticuerpo que hiere la membrana celular, en la fabricación de un medicamento para el tratamiento de un mamífero que sufre de una enfermedad o trastorno caracterizado por una hiperproliferación de las células.

IV. Métodos y composiciones para matar y/o inhibir el crecimiento de las células En otra modalidad más, la herida a la membrana celular no es sobrevivirle, en parte al menos por la provisión del agente polivalente en una cantidad suficiente para continuar hiriendo la célula, tal que la célula desfallece o ya no pueda reparar más la herida. La herida celular que es letal puede ser lograda por la provisión del agente polivalente en una cantidad en exceso suficiente con relación al número de antígenos de la superficie celular altamente expresados, presentes sobre la superficie de la célula, tal que la reparación de la membrana no es efectiva o no puede ser mantenida. La herida celular que es letal puede también ser lograda por la provisión de un agente que bloquea o interfiere con el mecanismo de reparación, tal como un agente anti-actina o agente que afecta la asociación del receptor de la superficie celular con el citoesqueleto subyacente de la célula. La herida celular que es letal puede también ser lograda por la provisión de un agente que afecta o interfiere con la adhesión y/o motilidad celular. En consecuencia, la composición para inducir la herida a la membrana celular puede también funcionar como una composición para matar una célula. Además, la composición para matar una célula es también útil en un método para matar una célula. Preferentemente, la célula es maligna, y está asociada con un neoplasma de un tejido corporal tal, por ejemplo, el tejido nervioso, linfoide, ovárico, cervical, endometrial, testicular, prostático, renal, colónico, pancreático, estomacal, intestinal, esofágico, pulmonar, tiroideo, adrenal, hepático, óseo, dérmico, bucal, de la garganta y similares. En una modalidad adicional, la célula es hiperactiva, y la hiperactividad de la célula es mediadora de una enfermedad o trastorno que puede ser tratado por las composiciones y métodos descritos en la presente para matar la célula hiperactiva.

V. Administración de agentes citotóxicos adicionales Los presentes inventores han realizado el descubrimiento sorprendente de que la toxicidad de estos anticuerpos que hieren la membrana celular puede ser marcadamente e incluso sinérgicamente aumentada por la adición de un agente citotóxico, incluyendo agentes quimioterapéuticos, isótopos radioactivos, anticuerpos citotóxicos, inmunoconjugados, conjugados de ligando, inmunosupresores, reguladores y/o inhibidores del crecimiento celular, toxinas o mezclas de los mismos. En consecuencia, en ciertas modalidades preferidas, el método comprende además administrar un agente citotóxico en combinación con el agente polivalente que se enlaza a un receptor de la superficie celular altamente expresado, sobre la superficie de las células hiperproliferantes . El agente citotóxico puede ser un agente quimioterapéutico, un isótopo radioactivo, o un anticuerpo citotóxico, un inmunoconjugado, un conjugado del ligando, un inmunosupresor, un regulador y/o inhibidor del crecimiento celular, una toxina o mezcla de los mismos . Además, la herida a la membrana celular puede ser utilizada para permeabilizar las células para permitir el acceso al citosol para agentes normalmente impermeantes, tales como los fármacos cargados, proteínas y péptidos, ácidos nucleicos, agentes de terapia génica, o modificadores de la expresión del gen. De esta manera, la herida a la membrana celular puede ser utilizada para modificar las actividades celulares, la expresión del gen, o la respuesta a la señalización proliferativa, por ejemplo, en una célula, y proporciona un medio para tratar a un paciente que sufre de una enfermedad o trastorno caracterizado por hiperproliferación de las células o por células hiperactivas, sin tener efectivamente que matar las células.

VI. Muerte preferencial de las células neoplásicas En modalidades particulares, se proporciona un método de tratamiento de un paciente humano que sufre de una condición caracterizada por hiperproliferación de las células, que comprende administrar un agente polivalente que se enlaza a un receptor de la superficie celular altamente expresado, sobre la superficie de las células hiperproliferantes, en donde el agente polivalente es administrado en una cantidad efectiva para matar preferentemente las células hiperproliferativas con relación a las células normales. Preferentemente, las células hiperproliferativas son células cancerosas. En otra modalidad más, las células hiperproliferativas son estimuladas en una condición de hiperproliferación por factores de crecimiento, citocinas, infección viral y similares . En una modalidad preferida, la cantidad del agente polivalente, efectiva para matar preferentemente las células en hiperproliferación, es una cantidad que es al menos suficiente para saturar los receptores de la superficie celular de las células hiperproliferativas. En una modalidad más preferida, la cantidad del agente polivalente efectiva para matar preferentemente las células hiperproliferativas es suficiente para saturar los receptores de la superficie celular de células normales que poseen el antígeno de la superficie celular altamente expresado, al tiempo que mantienen la viabilidad de las células normales dentro de intervalos aceptables para la salud del paciente. La muerte preferencial de las células hiperproliferativas con relación a las células normales es lograda en general por la provisión de una cantidad del agente polivalente, suficiente para reducir la viabilidad de las células hiperproliferativas mientras que no es suficiente para reducir la viabilidad de las células normales al mismo grado. Por ejemplo, utilizando un anticuerpo que hiere la membrana celular, la viabilidad de las células neoplásicas puede ser reducida por una cantidad que es al menos diez por ciento mayor, más preferentemente veinte por ciento mayor, y aún más preferentemente, treinta por ciento mayor o más, con relación a la viabilidad de las células normales, aún cuando las células neoplásicas y las células normales expresen el mismo antígeno de superficie sobre sus superficies respectivas. En consecuencia, en una modalidad, se proporciona un método para matar las células cancerosas, que comprende poner en contacto las células cancerosas con una cantidad citotóxica de un anticuerpo que induce heridas en la membrana celular a las células cancerosas. La citotoxicidad que hiere la membrana celular es distinta de la citotoxicidad mediada por el complemento, o la citotoxicidad mediada por las células. En una modalidad adicional, el anticuerpo que hiere la membrana celular es citotóxico para las células cancerosas por un mecanismo que hiere la membrana celular, así como un mecanismo de citotoxicidad mediado por el complemento y/o por las células. Preferentemente, el agente polivalente es administrado en una cantidad efectiva para matar las células hiperproliferativas, tales como las células neoplásicas, pero no para matar las células no neoplásicas. En otra modalidad más, el agente polivalente es administrado en una cantidad efectiva para matar las células hiperproliferativas, pero no para matar las células que muestran motilidad normal o propiedades de adhesión normales. Como se discute en el Ejemplo 10, y como se muestra en la Figura 8, la dependencia de la viabilidad celular sobre la concentración del agente polivalente puede variar significativamente entre los tipos celulares. Por ejemplo, en el Ejemplo 10, a una concentración de aproximadamente 5 µg/ml del anticuerpo, las células B esplénicas mostraron una viabilidad de aproximadamente 65%, mientras que las células Nalm- 6 a la misma concentración del anticuerpo mostraron una viabilidad únicamente de aproximadamente 42%. Esta cantidad de anticuerpos es suficiente para proporcionar al menos un exceso de tres veces a la cantidad total de los epitopos de CDIM sobre las células Nalm-6, y es más cercana a un exceso de cinco veces para las células B esplénicas. A una concentración más alta del anticuerpo, aproximadamente 10 µg/ml, las células B esplénicas mostraron una viabilidad de aproximadamente 48%, mientras que las células Nalm-6 mostraron una viabilidad únicamente de aproximadamente 30%. De este modo, las líneas de células B mostraron mayor susceptibilidad a la muerte con el anticuerpo que se enlaza a CDIM que los linfocitos B normales, sugiriendo que las células B neoplásicas fueron más susceptibles a la muerte con el mAb 216 que las células B normales. Sin desear estar comprometido por la teoría, se lanza la hipótesis de que el cese del tráfico membranal dentro de las células que se dividen rápidamente, interfiere con o retarda el mecanismo de reparación requerido para mantener la viabilidad celular en las células heridas. Alternativamente, pueden existir diferencias adicionales entre las células B neoplásicas y las células B maduras que provocan la susceptibilidad incrementada, particularmente en la asociación del epitopo de CDIM con el citoesqueleto subyacente de la célula B, o la expresión o actividad diferenciales de las moléculas de adhesión, y/o la motilidad de las células . En otra modalidad más, se proporciona un método para inducir la herida de la membrana celular, que comprende poner en contacto una célula con un agente polivalente que se enlaza a un antígeno de la superficie celular altamente expresado presente sobre la superficie de la célula, en donde la célula es una célula linfoide. En ciertas modalidades, el agente polivalente es un anticuerpo, y la célula linfoide es una célula B que expresa el epitopo CDIM. Preferentemente, el anticuerpo es administrado en una cantidad efectiva para herir preferentemente las células B hiperproliferativas con relación a las células B normales. En una modalidad particular, el método comprende (1) la toma de muestra de la sangre de un paciente en necesidad de tratamiento para determinar el número de células B hiperproliferativas en la sangre del paciente, (2) determinar la susceptibilidad de las células B hiperproliferativas y las células B normales a las heridas por el anticuerpo, y (3) administrar una cantidad del anticuerpo al paciente, suficiente para herir preferentemente y/o matar las células B hiperproliferativas en el paciente. El método puede comprender además la titulación en cantidades adicionales del anticuerpo al paciente, para lograr la cantidad deseada de herida y/o muerte celular. El método puede además comprender poner en contacto las células con un agente citotóxico. En una modalidad adicional, el método comprende (1) tomar una muestra de la sangre de un paciente en necesidad de tratamiento para determinar el número de células B hiperproliferativas en la sangre del paciente, (2) determinar la susceptibilidad de las células B hiperproliferativas a la herida por el anticuerpo, y (3) administrar una cantidad del anticuerpo al paciente, suficiente para herir las células B hiperproliferativas en el paciente. El método puede comprender además la titulación en cantidades adicionales del anticuerpo al paciente, para lograr la cantidad deseada de herida y/o muerte celular. El método puede comprender además la puesta en contacto de las células con un agente citotóxico.

VII. Métodos y composiciones para aumentar la herida de la membrana celular En una modalidad adicional, se proporciona una composición para inducir la herida de la membrana celular, que comprende un agente polivalente que se enlaza a un antígeno de la superficie celular altamente expresado, en donde la composición para inducir la herida de la membrana celular puede comprender además un agente de reticulación que aumenta la citotoxicidad del agente polivalente con relación a la citotoxicidad del agente polivalente en ausencia del agente de reticulación. En una modalidad particular, el agente polivalente es un anticuerpo, preferentemente un IgM. En otra modalidad particular, el agente de reticulación es un anticuerpo que se enlaza a IgM, proporcionando la reticulación de la IgM enlazada a la superficie de la célula, y proporcionando además herida membranal y citotoxicidad adicionales. En una modalidad preferida, la herida de la membrana celular es aumentada por el agente de reticulación. En ciertas modalidades preferidas, el aumento es al menos de aproximadamente 25%, y más preferentemente es de aproximadamente 50% o más. En otra modalidad más, se proporciona un método para inducir la herida de la membrana celular, que comprende poner en contacto una célula con un agente polivalente que se enlaza a un antígeno de la superficie celular altamente expresado, sobre la superficie de la célula, y que comprende además poner en contacto la célula con un agente de reticulación que aumenta la citotoxicidad del agente polivalente con relación a la citotoxicidad del agente polivalente en ausencia del agente de reticulación. En una modalidad preferida, el agente polivalente es una IgM, y el agente de reticulación es un anticuerpo que se enlaza a la IgM, proporcionando reticulación de la IgM enlazada a la superficie de la célula. Preferentemente, la célula es una célula B y el anticuerpo es una IgM con especificidad de enlace para un epitopo de CDIM sobre la superficie de la célula B. En una modalidad, el anticuerpo es un anticuerpo de VH4-34 y el agente de reticulación es un anticuerpo anti-kappa, anticuerpo anti-lambda o anticuerpo anti-VH4-34. En consecuencia, se proporciona un método para purgar la médula ósea de células B malignas de un paciente en necesidad de las mismas, que comprende poner en contacto las células de la médula ósea con un anticuerpo que tiene enlace específico para un epitopo de CDIM sobre la superficie de las células B. El método puede comprender además poner en contacto las células B con un agente de reticulación que retícula el anticuerpo enlazado al epitopo de CDIM sobre la superficie de las células B, con lo cual se proporciona una citotoxicidad aumentada para el anticuerpo anti-CDIM hacia las células B malignas. En una modalidad más preferida, el método comprende además poner en contacto las células con un agente citotóxico para purgar además la médula ósea de las células B malignas. En otra modalidad más, es proporcionada una composición para matar las células hiperproliferativas, que comprende un agente polivalente que se enlaza a un antígeno de la superficie celular altamente expresado, presente sobre la superficie de una célula, en donde el agente polivalente comprende el medio de reticulación que proporciona un agente polivalente reticulado enlazado a la superficie de la célula. El agente polivalente reticulado proporciona una muerte aumentada de las células hiperproliferativas en comparación con el agente polivalente en ausencia de los medios de reticulación . En otra modalidad más, se proporciona una composición farmacéutica para tratar un mamífero que sufre de una condición caracterizada por hiperproliferación de las células, dicha composición farmacéutica comprende un agente polivalente que se enlaza a un antígeno de la superficie celular altamente expresado, presente sobre la superficie de una célula. Preferentemente, la composición comprende además los medios de reticulación que aumentan la citotoxicidad del agente polivalente. Preferentemente, el agente polivalente mata las células hiperproliferativas al inducir herida de la membrana celular que la célula no puede reparar. En una modalidad particular, el medio de reticulación puede ser un agente funcionalizado, covalentemente enlazado al agente polivalente que se enlaza al antígeno de la superficie celular altamente expresado, sobre la célula, y capaz de reticularse con un agente polivalente adyacente enlazado a la célula. Por ejemplo, un agente de reticulación mono-, di- o tri-funcional debe ser covalentemente enlazado al agente polivalente. El agente de reticulación puede comprender un grupo funcional tal como una maleimida, succinimida, carbodiimida o tiol, etc. en el extremo distal del agente de reticulación para reticularse con un agente polivalente adyacente enlazado al antígeno de la superficie celular altamente expresado, sobre la superficie de la célula. Por ejemplo, la Publicación de Solicitud de Patente de los Estados Unidos No. 2004/0121951 incorporada por referencia en la presente, describe numerosos ejemplos de agentes de reticulación que pueden ser utilizados en las composiciones actualmente descritas. Una persona experta en la técnica reconocerá que no existe limitación particular para los medios de reticulación que pueden ser empleados en la composición. Cualquier medio de reticulación puede ser utilizado siempre y cuando el agente de reticulación tenga suficiente longitud para hacer contacto con un agente polivalente adyacente, y suficiente reactividad para enlazarse al agente polivalente adyacente. Preferentemente, el agente polivalente es un anticuerpo, tal como un anticuerpo natural, incluyendo IgM, IgG, IgA, IgD, IgE; un anticuerpo recombinante o un anticuerpo quimérico; un anticuerpo monoclonal; un anticuerpo policlonal; un anticuerpo sintético tal como un anticuerpo tetravalente, por ejemplo, como se describe en WO02/ 096948, incorporado por referencia en la presente, o la proteína de fusión que comprende un anticuerpo; un fragmento de anticuerpo tal como Fab2 , scFv o similares. En una modalidad preferida, el anticuerpo es una IgM. En una modalidad adicional, el medio de reticulación puede ser un agente de reticulación que se enlaza a un anticuerpo. En una modalidad preferida, el medio de reticulación es un agente anti-kappa, anti-lambda o anti-mu que se retícula a los anticuerpos adyacentes enlazados al antígeno de la superficie celular altamente expresado, sobre la superficie de la célula. En una modalidad preferida adicional, el agente polivalente es un anticuerpo Igm de la clase VH4-34 de los anticuerpos, tales como mAb 216, RT-2B, FS 12, A6(H4C5), Cal-4G, S20A2, FS 3, Gee, HT, Z2D2 o Y2K, y el agente de reticulación es un anticuerpo que se enlaza al anticuerpo anti-VH4-34. Preferentemente, el anticuerpo anti-VH4-34 no previene el enlace del anticuerpo VH4-34 al antígeno de la superficie celular. En una modalidad particular, el anticuerpo anti-VH4-34 es 9G4. En otra modalidad más, el medio de reticulación puede ser un polímero hidrofílico o una red de polímeros que tienen un peso molecular de aproximadamente 100 a aproximadamente 1,000,000 de Daltones, o más preferentemente, de aproximadamente 1000 a aproximadamente 250,000 Daltones, poseyendo una pluralidad de agentes polivalentes con enlace específico para el antígeno de la superficie celular altamente expresado, sobre la superficie de la célula. El polímero hidrofílico puede ser un polipéptido o un carbohidrato. Los polipéptidos pueden comprender aminoácidos básicos que poseen grupos amino libres para facilitar el enlace covalente del agente polivalente a la cadena principal del polipéptido, tales como (Ala)nLys, donde n puede ser de 2 a 20, por ejemplo. El agente polivalente covalentemente enlazado puede incluir fragmentos de anticuerpo, tales como Fab', Fab2 ' , o IgM intacta, por ejemplo. El enlace covalente puede ser convenientemente proporcionado utilizando agentes de reticulación disfuncionales, tales como agentes de reticulación de disuccinimida o dimaleimida, aunque pueden ser utilizados cualesquiera otros medios adecuados de enlace. El agente polivalente que se enlaza al antígeno de la superficie celular altamente expresado muestra preferentemente enlace específico, por ejemplo, éste se enlaza con alta afinidad. Típicamente, el enlace de alta afinidad es al menos 106 M"1, y típicamente está entre aproximadamente 106 M"1 y aproximadamente 108 M"1. En una modalidad adicional, es proporcionada una composición farmacéutica para tratar a un mamífero que sufre de una condición caracterizada por hiperproliferación de las células, que comprende un agente polivalente que se enlaza a un antígeno de la superficie celular altamente expresado presente sobre la superficie de una célula, en donde el agente polivalente comprende una pluralidad de sitios de enlace para el antígeno de la superficie celular sobre la superficie de la célula. Preferentemente, la pluralidad de sitios de enlace es al menos cinco, y más preferentemente es de aproximadamente 5 a aproximadamente 100. En modalidades particulares, la pluralidad de sitios de enlace puede ser de aproximadamente 5 a aproximadamente 15, de aproximadamente 15 a aproximadamente 25, o de aproximadamente 15 a aproximadamente 50, o más. Preferentemente, el agente polivalente que comprende una pluralidad de sitios de enlace para el antígeno de la superficie celular, proporciona una citotoxicidad aumentada de las células hiperproliferativas, que está asociada con un mayor número de sitios de enlace.

VIII . Usos terapéuticos in vivo El anticuerpo mAb 216 que hiere las células fue probado en pacientes humanos in vivo, como se describe con detalle en el Ejemplo 12. Los pacientes (adultos diagnosticados con ALL) fueron resistentes al tratamiento con el régimen estándar de fármacos quimioterapéuticos (VCR/DNR/ASPR/prednisona) , por ejemplo, las cuentas de blastos ya no disminuyeron en respuesta al tratamiento quimioterapéutico, y los pacientes eran terminales. El anticuerpo fue administrado en una dosis de 1.25 mg/kg a dos pacientes en el día 0 y 7, como es indicado por las flechas en las Figuras 9A y 9B. Las concentraciones aproximadas del anticuerpo en suero fueron de 26 µg/ml y 25 µg/ml de suero, respectivamente, con base en el peso del paciente, la dosis y el volumen sérico aproximado (asumiendo un hematocrito de 30%) . Las cuentas de blastos en cada paciente (Paciente 1 y Paciente 2) fueron aproximadamente 125 x 106/ml y 65xl06/ml, respectivamente, al tiempo del tratamiento con el mAb 216 + VCR. Con relación a los estudios in vi tro realizados a concentraciones de aproximadamente 106 células/ml, estas concentraciones del mAb corresponden aproximadamente a 0.2 µg/106 células y 0.38 µg/106 células, respectivamente, concentraciones que están muy por debajo de las concentraciones de umbral letales demostradas in vi tro para el mAb 216 que mata las células B. En ausencia de VCR, las cuentas de blastos disminuyeron transitoriamente, un resultado probablemente debido más a la muerte de las células mediada por el complemento que a la herida celular mediada por el mAb 216 a la baja concentración de anticuerpo probada. No obstante, en combinación con la VCR, fue observada una disminución dramática en las cuentas de células blastos, como se demuestra en las Figuras 9A y 9B, y dio como resultado extensión de la vida para estos pacientes. Estos datos demuestran la muerte celular dramáticamente aumentada de los blastos leucémicos debido a la combinación sinérgica del mAb 216 y VCR in vivo . Incluso a concentraciones muy bajas (subletales) del mAb 216, donde los blastos fueron meramente heridos o permeabilizados por el tratamiento con el mAb 216, la susceptibilidad de las células a la toxicidad por VCR fue notablemente aumentada y la eficacia del tratamiento fue aumentada. En consecuencia, estos resultados representan un avance significativo en la eficacia terapéutica para el cáncer .

IX. Equipos Los agentes polivalentes descritos en la presente, en particular, los anticuerpos que hieren la membrana celular, pueden ser utilizados en equipos para determinar el umbral de dosis para un agente polivalente, necesaria en un paciente que requiere tratamiento. La dosis del agente polivalente que induce la herida de la membrana celular en un mamífero, puede ser determinada al proporcionar un equipo que comprende una cantidad suficiente del agente polivalente que se enlaza a un antígeno de la superficie celular altamente expresado, para realizar los ensayos de enlace o para determinar la cantidad de herida celular y/o muerte inducida por el agente polivalente. En una modalidad adicional, es proporcionado un kit para determinar el umbral de dosis para un anticuerpos que hiere la membrana celular, en un mamífero, que comprende una cantidad suficiente de un anticuerpo que hiere la célula, que se enlaza a un antígeno de la superficie celular altamente expresado, para realizar los ensayos de enlace, o para determinar la cantidad de herida celular y/o muerte celular inducida por el agente polivalente. Los equipos pueden también comprender un agente de reticulación, o un agente citotóxico, o combinaciones de los mismos, para determinar el umbral de dosis al agente polivalente en presencia de agentes citotóxicos y/o un agente de reticulación que aumenta la herida de la membrana celular. Típicamente, las células propias del paciente (por ejemplo, células sanguíneas, células tumorales, etc.) son obtenidas y probadas utilizando los reactivos contenidos dentro de los equipos, para determinar el número de antígenos de la superficie celular expresados sobre las células, así como para determinar la cantidad de herida y/o muerte celular proporcionada por una cantidad predeterminada del agente polivalente .

X. Células hiperproliferativas Las condiciones caracterizadas por hiperproliferación de las células incluyen cánceres, enfermedades autoinmunes, infección viral e inmunodeficiencia. Los cánceres pueden incluir cánceres de cualquier tipo o tejido. Los cánceres preferidos incluyen cánceres de origen de células B, tales como linfomas y leucemias . Las enfermedades autoinmunes incluyen lupus eritematoso sistémico, artritis reumatoide, enfermedad hiperproliferativa autoinmune, esclerosis múltiple, psoriasis y miastenia gravis, pero pueden también incluir tiroidismo de Hashimoto, nefritis por lupus, dermatomiositis, síndrome de Sjogren, Enfermedad de Alzheimer, corea de Sydenham, nefritis por lupus, fiebre reumática, síndromes poliglandulares, pemfigoide buloso, diabetes mellitus, púrpura de Henoch-Schonlein, nefritis post-estreptocócica, eritema nodoso, arteritis de Takayasu, enfermedad de Addison, enfermedad de Crohn, sarcoidosis, colitis ulcerativa, eritema multiforme, nefropatía por IgA, poliarteritis nodosa, espondilitis anquilosante, síndrome de Goodpasture, tromboangitis ubiterans, cirrosis biliar primaria, tirotoxicosis, esclerodermia, hepatitis activa crónica, polimiositis/dermatomiositis, policondritis, pémfigo vulgar, granulomatosis de Wegener, nefropatía membranosa, esclerosis lateral amiotrófica, tabes dorsalis, arteritis de células gigantes/polimialgia, anemia perniciosa, glomerulonefritis rápidamente progresiva, alveolitis fibrosante, enfermedades autoinmunes de la Clase III tales como trombocitopenias mediadas por el sistema inmune, tales como la púrpura trombocitopénica idiopática aguda y púrpura trombocitopénica idiopática crónica, y similares. La infección viral puede también provocar condiciones hiperproliferativas celulares y trastornos en numerosos tipos de células y tejidos. Los ejemplos de infecciones virales que inducen la hiperproliferación incluyen la infección por el virus de inmunodeficiencia humana (VIH por sus siglas en ingles), incluyendo HTLV-1, HTLV-2, infección por el virus de Epstein Barr (EBV) , infección por el virus del papiloma humano (HPV) , y similares .

XI. Combinaciones con agentes citotóxicos adicionales Los presentes inventores han realizado el descubrimiento sorprendente de que la toxicidad de los anticuerpos que hieren las células puede ser notablemente o incluso sinérgicamente aumentada por la adición de un agente citotóxico, incluyendo agentes quimioterapéuticos, isótopos radioactivos, anticuerpos citotóxicos, inmunoconjugados, conjugados al ligando, inmunosupresores, reguladores del crecimiento celular y/o inhibidores del crecimiento celular, toxinas o mezclas de los mismos. Los agentes quimioterapéuticos que pueden ser utilizados en las formulaciones y métodos de la invención incluyen taxanos, colchicina, alcaloides de vinca per vinca, epipodofilotoxinas, camptotecinas, antibióticos, complejos de coordinación de platino, agentes alquilantes, análogos de ácido fólico, análogos de pirimidina, análogos de purina, o inhibidores de topoisomerasa. Un inhibidor de topoisomerasa preferido es una epipodofilotoxina. Los análogos de pirimidina preferida incluyen capecitabina, 5-fluorouracilo, 5-fluorodesoxiuridina, monofosfato de 5-fluorodesoxiuridina, arabinósido de citosina, 5-azacitidina, o 2 ',2'-difluorodesoxicitidina. Los análogos de purina preferidos incluyen mercaptopurina, azatiopreno, tioguanina, pentostatina, eritrohidroxinoniladenina, cladribina, vidarabina y fosfato de fludarabina. Los análogos de ácido fólico incluyen metotrexato, raltitrexed, lometrexol, permefrexed, edatrexato y pemetrexed. Una epipodofilotoxina preferida es el etopósido o tenipósido. Una camptotecina preferida es irinotocan, topotecan o camtotecan. Preferentemente, el antibiótico es dactinomicina, daunorrubicina (daunomicina, daunoxoma) , doxorrubicina, idarrubicina, epirrubicina, valrubicina, mitoxantrona, bleomicina, o mitomicina. Un complejo de coordinación de platino preferido es cisplatino, carboplatino u oxaliplatino. Preferentemente, el agente alquilante es mecloretamina, ciclofosfamida, ifosfamida, melfalan, dacarbazina, temozolomida, tiotepa, hexametilmelamina, estreptozocina, carmustina, busulfan, altretamina o clorambucilo.

Los ejemplos adicionales de agentes quimioterapéuticos incluyen agentes alquilantes tales como tiotepa y ciclofosfamida (CITOXAN^) ; sulfonatos de alquilo tales como busulfan, improsulfan y piposulfan; aziridinas tales como benzodopa, carboquona, meturedopa y uredopa; etileniminas y metilamelaminas incluyendo altretamina, trietilenmelamina, trietilenfosforamida, trietilentiofosforamida y trimetilolomelamina; acetogeninas (especialmente bulatacina y bulatacinona) ; ca ptotecinas (incluyendo el análogo sintético topotecan) ; briostatina; calistatina; CC-1065 (incluyendo sus análogos sintéticos de adozelesina, carzelesina y bizelesina) ; criptoficinas (particularmente criptoficina 1 y criptoficina 8); dolastatina; duocarmicina (incluyendo los análogos sintéticos, KW-2189 y CBI-TMI); eleuterobina; pancratistatina; sarcodictina; espongistatina; mostazas de nitrógeno tales como clorambucilo, clornafazina, colofosfamida, estramustina, ifosfamida, mecloretamina, clorhidrato de óxido de mecloretamina, melfalan, novembicina, fenesterina, prednimustina, trofosfamida, mostaza de uracilo; nitrosoureas tales como carmustina, clorozotocina, fotemustina, lomustina, nimustina, ranimustina; antibióticos tales como antibióticos de enediina (por ejemplo caliqueamicina, especialmente caliqueamicina gammall y caliqueamicina phill, ver por ejemplo, Agnew (1994) Chem. Intl. Ed. Engl., 33, 183-186; dinemicina, incluyendo dinemicina A; bisfosfonatos tales como clodronato; esperamicina; así como el cromóforo de neocarzinostatina y cromóforos de antibióticos de enediina y cromoproteína relacionados), aclacinomicinas, actinomicina, autramicina, azaserina, bleomicinas, cactinomicina, carabicina, carminomicina, carzinofilina, cromomicinas, dactinomicina, daunorrubicina, detorrubicina, 6-diazo-5-oxo-L-norleucina, doxorrubicina (AdriamycinMR) (incluyendo morfolino-doxorrubicina, cianomorfolino-doxorrubicina, 2-pirrolino-doxorrubicina y desoxidoxorrubicina) , epirrubicina, esorrubicina, idarrubicina, marcelomicina, mitomicinas tales como mitomicina C, ácido micofenólico, nogalamicina, olivomicinas , peplomicina, potfiromicina, puromicina, quelamicina, rodorrubicina, estreptonigrina, estreptozocina, tubercidina, ubenimex, zinostatina, zorrubicina; anti-metabolitos tales como metotrexato y 5-fluorouracilo (5-FU) ; análogos de ácido fólico tales como denopterina, metotrexato, pteropterina, trimetrexato; reabastecedor de ácido fólico tal como ácido folínico; análogos de purina tales como fludarabina, 6-mercaptopurina, tiamiprina, tioguanina; análogos de pirimidina tales como ancitabina, azacitidina, 6-azauridina, carmofur, citarabina, didesoxiuridina, doxifluridina, enocitabina, floxuridina; andrógenos tales como calusterona, propionato de dromostanolona, epitiostanol , mepitiostano, testolactona; anti-adrenales tales como aminoglutetimida, mitotano, trilostano; aceglatona; glucósido de aldofosfamida; ácido aminolevulínico; eniluracilo; amsacrina; bestrabucilo; bisantreno; edatraxato; defofamina; demecolcina; diaziquona; elfornitina; acetato de eliptinium; una epotilona; etoglucid; nitrato de galio; hidroxiurea; lentinan; lonidamina; maitansinoides tales como maitansina y ansamitocinas; mitoguazona; mitoxantrona; mopidamol; nitracrina; pentostatina; fenamet; pirarrubicina; losoxantrona; ácido podofilínico ; 2-etilhidrazida; procarbazina; PSK®; razoxano; rizoxina, sizofiran; espirogermanio; ácido tenuazónico; triaziquona; 2 , 2 ' , 2 " -triclorotrietilamina; tricotecenos (especialmente toxina T-2, verracurina A, roridina A y anguidina) ; uretano; vindesina; dacarbazina; mannomustina; mitobronitol; mitolactol; pipobroman; gacitosina; citosina, arabinósido ("Ara-C"); ciclofosfamida; tiotepa; taxoides, por ejemplo paclitaxel (TAXOL®, Bristol-Myers Squibb Oncology, Princeton, N.J.) y doxetaxel (TAXOTERE®, Rhone-Poulenc Rorer, Antony, Francia) ; clorambucilo; gemcitabina (Gemzar™) ; 6-tioguanina; mercaptopurina; metotrexato; análogos de platino tales como cisplatina y carboplatina ; vinblastina, vincristina; vinorelbina (Navelbine™) ; etopósido (VP-16) ; ifosfamida; mitoxantrona; novantrona; tenipósido; edatrexato; daunomicina; aminopterina; xeioda; ibandronato; CPT-ll; inhibidor de topoisomerasa RFS 2000; difluorometilornitina (DMFO) ) ; retinoides tales como el ácido retinoico; capecitabina; y sales farmacéuticamente aceptables, ácidos o derivados de cualquiera de los anteriores . Son particularmente preferidos los agentes que interfieren con la polimerización o la despolimerización de los microtúbulos. Los agentes ejemplares incluyen colchicina, alcaloides de vinca per vinca, tales como vincristina, vinblastina, vindesina, o vinorelbina, y taxanos tales como taxol, paclitaxel y docetaxel. Las mezclas de cualquiera de los agentes anteriores pueden ser también utilizadas . Agentes preferidos adicionales son agentes anti-actina. En una modalidad preferida, el agente anti-actina es el jasplacinólido y la citochalasina, y se utiliza en un tratamiento ex vivo, por ejemplo, para purgar la médula ósea de las células neoplásicas. Las toxinas pueden ser administradas como inmunoconjugados, conjugados de ligando o coadministrados con un anticuerpo. Las toxinas incluyen, sin limitación, etotoxina A de Pseudomonas, ricina, toxina de la difteria, momordina, proteína antiviral de hierba carmín, enterotoxina A estafilocócica , gelonina, maitansinoides (por ejemplo, como se describe en la Patente de los Estados Unidos No. 6,441,163) o similares.

XII. Anticuerpos Los anticuerpos que hieren la célula, útiles en la presente invención pueden incluir anticuerpos para cualquier antígeno de la superficie celular altamente expresado. Los antígenos de la superficie celular incluyen moléculas expresadas en la superficie celular tales como receptores, inmunoglobulinas, citocinas, glucoproteínas, etc. Los antígenos de la superficie celular preferidos están asociados con el citoesqueleto. Los anticuerpos que hieren la célula preferidos, incluyen anticuerpos para antígenos de la superficie celular que están asociados con el citoesqueleto, ya que esta característica parece aumentar la herida celular. Los anticuerpos preferidos que hieren a la célula incluyen los anticuerpos codificados por el gen VH4-34, por ejemplo, anticuerpos, anti-CDIM. Como se discutió previamente, el término "anticuerpos" es utilizado en su sentido más amplio e incluye fragmentos de anticuerpo que no poseen una porción Fc (por ejemplo, anticuerpos que no poseen Fc) . Los ejemplos de anticuerpo y fragmentos de anticuerpo pueden incluir los fragmentos Fab, Fab', F(ab')2 y Fv; diacuerpos; anticuerpos lineales (Zapata et al. (1995) Protein Eng. 8 (10), 1057-1062) moléculas de anticuerpo de cadena simple; y anticuerpos multiespecíficos formados a partir de fragmentos de anticuerpo. El término "anticuerpos" y los "fragmentos de anticuerpo" incluyen los agentes desarrollados de aquí en adelante que muestren características de enlace al anticuerpo tales como aquellas descritas. Preferentemente, los anticuerpos y fragmentos de anticuerpo pueden ser además reticulados con un agente de reticulación, tal como un anticuerpo que tiene enlace específico para una porción de los anticuerpos que hieren a la célula, o los fragmentos de anticuerpo que hieren a la célula, siempre y cuando el enlace del anticuerpo de reticulación no interfiera con el enlace de los anticuerpos que hieren a la célula o los fragmentos de anticuerpo al antígeno de la superficie celular. En una modalidad preferida, el agente de reticulación es un anticuerpo de reticulación que se enlaza a un anticuerpo que hiere la célula, enlazado a la célula. Preferentemente, el anticuerpo de reticulación no interfiere con el enlace del anticuerpo que hiere a la célula. En una modalidad, el anticuerpo que hiere a la célula comprende una porción Fc, y el agente de reticulación se enlaza a la porción Fc del anticuerpo que hiere la célula. En una modalidad adicional, el agente de reticulación se enlaza a una porción del anticuerpo diferente de la porción Fc, si está presente. En una modalidad preferida, el anticuerpo que hiere a la célula es un anticuerpo VH4-34, preferentemente un anticuerpo anti-CDIM. El anticuerpo anti-CDIM puede ser utilizado para herir, permeabilizar o matar células. En una modalidad particular, el anticuerpo anti-CDIM es un fragmento de anticuerpo, por ejemplo, Fab2 ' y puede ser reticulado por un anticuerpo que tiene enlace específico para el anticuerpo anti-CDIM (por ejemplo, 9G4 ) . Preferentemente, el anticuerpo de reticulación no previene el enlace del anticuerpo anti-CDIM al epitopo de CDIM sobre la célula, y proporciona reticulación del anticuerpo anti-CDIM enlazado al epitopo de CDIM sobre la célula. Los anticuerpos anti-CDIM pueden ser utilizados en conjunto para los anticuerpos citotóxicos adicionales que tienen enlace específico para las moléculas de la superficie celular sobre las células, por ejemplo, las células B. Los anticuerpos anti-CDIM y los anticuerpos citotóxicos adicionales pueden ser utilizados en un régimen de tratamiento en combinación. En una modalidad preferida, el anticuerpo citotóxico puede tener enlace específico para cualquier molécula de la superficie celular sobre una célula B. Por ejemplo, el anticuerpo citotóxico puede mostrar enlace específico para moléculas de la superficie celular sobre células B, tales como CDlla, CD19, CD20, CD21, CD22, CD25, CD34, CD37, CD38, CD40, CD45, CD52, CD80, CD 86, IL-4R, IL-6R, IL-8R, IL-13, IL-13R, a-4/ß-l integrina (VLA4), el receptor BLYS, la Ig idiotípica de la superficie celular, el factor de necrosis tumoral (TNF) , o mezclas de los mismos, sin limitación. Por ejemplo, el anticuerpo citotóxico que tiene enlace específico para CDll puede ser por ejemplo, efalizumab (RAPTIVA) . El anticuerpo citotóxico que tiene enlace específico para CD20 puede ser rituximab (RITUXAN) . El anticuerpo citotóxico que tiene enlace específico para CD22 puede ser, por ejemplo epratuzumab. El anticuerpo citotóxico que tiene enlace específico para CD25 puede ser, por ejemplo daclizumab (ZENAPAX) ó basiliximab (SIMULECT) . Los anticuerpos para CD52 incluyen, por ejemplo, CAMPATH. Los anticuerpos para la integrina a-4/ß-l (VLA4) incluyen, por ejemplo, natalizumab. Los anticuerpos para TNF incluyen, por ejemplo, infliximab (REMICADE) . De este modo, en modalidades preferidas, el anticuerpo que tiene enlace específico para los epitopos de CDIM sobre una célula B pueden ser utilizados en un régimen de inmunoterapia combinada con RITUXAN, ZENAPAX, REMICADE ó RAPTIVA, por ejemplo, o en combinaciones de los mismos. El anticuerpo citotóxico puede ser también utilizado como un inmunoconjugado que comprende un isótopo reactivo o toxina por ejemplo. Además, en modalidades adicionales, puede ser utilizada una terapia combinada que comprende el anticuerpo que tiene enlace específico para los epitopos de CDIM sobre una célula B, un anticuerpo citotóxico original que tiene enlace específico para las moléculas de la superficie celular con una célula B, y uno o más agentes quimioterapéuticos. Por ejemplo, el mAb216 podría ser utilizado en combinación con un anticuerpo anti-CD20 tal como rituximab, tosutimab, o ibritumomab, con un anticuerpo anti-CD22, tal como epratuzumab, o en combinación con un anticuerpo anti-CD52 tal como CAMPATH. La terapia en combinación puede además incluir la quimioterapia, tal como un agente que perturba el citoesqueleto de la célula, por ejemplo, la vincristina, en un régimen combinado de quimioterapia e inmunoterapia.

XIII . Isótopos radioactivos Los isótopos utilizados para producir los inmunoconjugados o conjugados con el ligando, terapéuticamente útiles, producen típicamente partículas a-, ?- o ß- de alta energía, las cuales tienen una longitud de trayectoria terapéuticamente efectiva. Tales radionúclidos matan a las células los cuales éstos están en estrecha proximidad, por ejemplo, células neoplásicas a las cuales se enlaza el conjugado. La ventaja de la distribución dirigida es que el anticuerpo o ligando radioactivamente marcado, en general tiene poco o ningún efecto sobre las células no en la proximidad inmediata de la célula objetivo. Con respecto al uso de los isótopos radioactivos como agentes citotóxicos, los anticuerpos o ligandos modificados pueden ser directamente marcados (tales como a través de yodinación) o pueden ser marcados utilizando un agente quelante. En cualquier método, el anticuerpo o ligando es marcado con al menos un radionúclido. Los agentes quelantes particularmente preferidos comprenden el ácido 1-isotiocianatobencil-3-metildietelen-triaminopentaacético ("MX-DTPA") y los derivados del ácido ciclohexil-dietilentriamina-pentaacético ( "CHX-DTPA" ) . Otros agentes quelantes comprenden derivados de P-DOTA y EDTA. Los radionúclidos particularmente preferidos para la marcación indirecta incluyen In y 90Y. El isótopo radioactivo puede ser enlazado a sitios específicos sobre el anticuerpo o el ligando, tal como los residuos de azúcar N-enlazados presentes únicamente sobre la porción Fc del anticuerpo. Los ligandos o anticuerpos con tecnecio 99m pueden ser preparados mediante procesos de intercambio de ligando o mediante procesos de marcación por lotes. Por ejemplo, el anticuerpo puede ser marcado por reducción del pertecnato (Tc04) con solución del ion estanoso, quelando el tecnecio reducido sobre una columna de Sefadex y aplicando el anticuerpo a esta columna. Las técnicas de marcación por lotes incluyen, por ejemplo, la incubación con pertecnato, un agente reductor tal como SnCl2, una solución amortiguadora tal como solución de ftalato de sodio/potasio y el anticuerpo. Los radionúclidos preferidos para la marcación son conocidos en la técnica. Un radionúclido ejemplar para la marcación es de 131I covalentemente enlazado vía los residuos de tirosina. Los anticuerpos radioactivamente marcados de acuerdo a la invención pueden ser preparados con yoduro de sodio o de potasio radioactivo, y un agente oxidante químico tal como el hipoclorito de sodio, cloramina T o similares o un agente oxidante enzimático, tal como lactoperoxidasa, glucosa- oxidasa y glucosa. Las patentes relacionadas a los quelantes y conjugados del quelador son conocidas en la técnica. Por ejemplo, la Patente de los Estados Unidos No. 4,831,175 a Gansow está dirigida al quelato del ácido dietilentria ino pentaacético polisustituido, y a los conjugados de proteína que contienen los mismos, y los métodos para su preparación. Las Patentes de los Estados Unidos Nos. 5,099,069, 5,246,692, 5,286,850, 5,434,287 y 5,124,471 todas a Gansow se refieren también a los quelatos del DTPA polisustituido. Estas patentes son incorporadas por referencia en la presente en su totalidad. Otros ejemplos de quelantes de metales compatibles son el ácido etilendiaminotetraacético (EDTA) , el ácido dietilentriaminopentaacético (DPTA) , 1,4,8,11-tetraazatetradecano, el ácido 1, 4 , 8 , 11-tetraazatetradecan-1,4,8, 11-tetraacético, l-oxa-4 ,7,12, 15-tetraazaheptadecano, ácido 4, 7, 12 , 15-tetraacético, o similares. El ciclohexil-DTPA o el CHX-DTPA son particularmente preferidos. Otros quelantes compatibles, incluyendo aquellos todavía no descubiertos, pueden ser fácilmente discernidos por una persona experta en la técnica y están claramente dentro del alcance de la presente invención. Los quelantes adicionales incluyen los quelantes bifuncionales específicos descritos en las Patentes de los Estados Unidos Nos. 6,682,734, 6,399,061 y 5,843,439, y son preferentemente seleccionados para proporcionar alta afinidad para metales trivalentes, muestran proporciones incrementadas de tumor a no tumor y captación ósea disminuida, así como mayor retención in vivo del radionúclido en los sitios diana u objetivo, por ejemplo, los sitios de tumor de linfoma de células B. No obstante, otros quelantes bifuncionales que pueden o no poseer todas estas características son conocidos en la técnica y pueden también ser benéficos en terapia tumoral . Los anticuerpos modificados pueden ser también conjugados a marcadores radioactivos para fines de diagnóstico así como terapéuticos. Los conjugados terapéuticos radiomarcados para "formación de imagen" de diagnóstico de los tumores pueden ser utilizados antes de la administración del anticuerpo o del agente citotóxico a un paciente. Por ejemplo, el anticuerpo monoclonal que se enlaza al antígeno CD20 humano conocido como C2B2 puede ser radiomarcado con 1ln utilizando un quelante bifuncional, tal como MX-DTPA (ácido dietilentriaminopentaacético) , el cual comprende una mezcla 1:1 de l-isotiocianatobencil-3-metil-DTPA y l-metil-3-isotiocianatobencil-DTPA. El ?:L1In es un isótopo radioactivo de diagnóstico, preferido, ya que entre aproximadamente 1 y aproximadamente 10 mCi pueden ser administrados de manera segura sin toxicidad detectable, y los datos de formación de imagen son un indicador de la distribución subsecuente del anticuerpo marcado con 90Y. Una dosis típica del anticuerpo marcado con In de 5 mCi para estudios de formación de imagen, es utilizada, y la formación óptima de imagen puede ser determinada a diversos tiempos de la administración del anticuerpo o del ligando marcado, típicamente tres a seis días después de la administración. Ver por ejemplo, Murray, J. (1985) Nuc . Med. 26, 3328 y Carraguillo et al., (1985) J. Nuc . Med. 26, 67. Puede ser utilizada una variedad de isótopos radioactivos y una persona experta puede determinar fácilmente cuál isótopo radioactivo es más apropiado bajo diversas condiciones. Por ejemplo, 131I es frecuentemente utilizado para la inmunoterapia dirigida. No obstante, la utilidad clínica de 131I puede ser limitada por su vida media corta (8 días), el potencial para la deshalogenación del anticuerpo yodado en la sangre y en el tumor o en los sitios y su alta emisión de energía gamma que pueden no proporcionar deposición de dosis suficientemente localizada en el tumor, dependiendo del tamaño del tumor, como se desee. Con el advenimiento de agentes quelantes adicionales, son proporcionadas oportunidades adicionales para enlazar grupos quelantes de metales a las proteínas y la utilización de otros radionúclidos tales como ?nIn y 90Y . 90Y proporciona varios beneficios para la utilización en aplicaciones radioipmunoterapéuticas . Por ejemplo, la vida media útil más prolongada de 64 horas para 90Y es suficientemente prolongada para permitir la acumulación del anticuerpo por las células tumorales y, de manera contraria al 131I, y el 90Y es un emisor beta puro de alta energía sin radiación gamma acompañante en su decaimiento teniendo un intervalo en el tejido de 100 a 1,000 células de diámetro. Además, la cantidad mínima de radiación penetrante permite la administración a pacientes externos de anticuerpos marcados con 90Y. Además, la internacionalización del anticuerpo marcado no es requerida para la muerte celular, y la radiación ionizante debe ser letal para las células tumorales adyacentes que carecen del antígeno objetivo. La dosis de tratamiento simple efectiva (por ejemplo, cantidades terapéuticamente efectivas) de los anticuerpos marcados con 90Y están en el intervalo de aproximadamente 5 y aproximadamente 75 mCi , más preferentemente entre aproximadamente 10 y aproximadamente 40 mCi. Las dosis no ablativas de la médula ósea, de tratamiento simple, efectivas de los anticuerpos marcados con 131I están en el intervalo de entre aproximadamente 5 y aproximadamente 70 mCi, más preferentemente entre aproximadamente 5 y aproximadamente 40 mCi . La dosis ablativa de tratamiento simple efectivas (por ejemplo, que puedan requerir transplante de médula ósea autóloga) de anticuerpos marcados con 131I está en el intervalo de entre aproximadamente 30 y aproximadamente 600 mCi, más preferentemente entre aproximadamente 50 y menos que aproximadamente 500 mCi . Cuando el anticuerpo tiene una vida media en circulación más prolongada con relación a una proteína extraña tal como un anticuerpo murino, una dosis ablativa de la médula ósea de tratamiento simple, efectiva del anticuerpo marcado con 131I está en el intervalo de entre aproximadamente 5 y aproximadamente 40 mCi, más preferentemente menor de 30 mCi . Las dosis de formación de imagen para un formador de isótopo radioactivo, por ejemplo, el marcador de 11:LIn son típicamente menores de 5 mCi . Mientras que 131I y 90Y han sido utilizados extensamente en la clínica, son conocidos otros isótopos radioactivos en la técnica y pueden ser utilizados para fines similares. Otros radioisótopos adicionales son utilizados para la formación de imagen. Por ejemplo, los radioisótopos adicionales que pueden ser utilizados incluyen, pero no son limitados a: 131I,125I, 123I,90Y, In, 105Rh, 153Sm, 166Ho, 177Lu, y 188Re y 186R, 32P, 57Co, 64Cu, 67Cu, 77Ga, 81Rb, 81Kr, 87Sr, 113In, 127Cs, 129Cs; 132I, 197Hg, 213Pb, 216Bi, 117Lu, 21Pb, 212Bi, 47Sc, 105Rh, 109Pd, 199Au, 225Ac, 211At, y 213Bi . A este respecto, los emisores de radiación alfa, gamma y beta son todos contemplados como aspectos de la presente invención. Además, se propone que una persona experta en la técnica podría determinar fácilmente cuáles radionúclidos son compatibles con un curso seleccionado de tratamiento sin experimentación indebida. Para este fin, los radionúclidos adicionales que han sido ya utilizados en el diagnóstico clínico incluyen 125I, 123I, 99Tc, 43K, 52Fe, 67Ga, 68Ga, así como ?nIn. Los anticuerpos han sido también marcados con una variedad de radionúclidos para el uso potencial en inmunoterapia dirigida, por ejemplo, como se describe en Peitersz et al. (1987) Immunol . Cell Biol . 65, 111-125. Estos isótopos radioacti ,vos i,ncluyen 188Re y 1 fifiRe asi r como 1 Q9Au y fi7Cu. La Patente de los Estados Unidos No. 5,460,785 proporciona información respecto a tales radioisótopos y es incorporada por referencia en la presente.

XIV. Reguladores y/o inhibidores del crecimiento celular Los reguladores y/o inhibidores del crecimiento celular incluyen agentes terapéuticos de moléculas pequeñas tales como hormonas o agentes antihormonales, inhibidores de cinasa, inhibidores de proteasoma, agentes de terapia génica o modificadores de la expresión génica. Los agentes anti-hormonales pueden ser útiles particularmente en la terapia de enfermedades auto-inmunes donde está implicada la exacerbación hormonal, particularmente la acción estrogénica en mujeres. Los agentes anti-hormonales incluyen para regulan o inhibir la acción de las hormonas sobre los tumores, tales como los anti-estrógenos y moduladores de receptores de estrógenos selectivos (SERMs) , incluyendo, por ejemplo, tamoxifeno (incluyendo Nolvadex™) , raloxifeno, droloxifeno, 4-hidroxitamoxifeno, trioxifeno, keoxifeno, LY117018, onapristona, y toremifeno (Fareston™) ; inhibidores de aromatasa que inhiben la enzima aromatasa, que regula la producción de estrógeno en las glándulas adrenales, tales como, por ejemplo, 4 (5) -imidazoles, aminoglutetimida, acetato de megestrol (MegaceMR) , exemestano, formestano, fadrozol, vorozol (RivisorMR) , letrozol (FemaraMR) , y anastrozol (ArimidexMR) ; y anti-andrógenos tales como flutamida, nilutamida, bicalutamida, leuprolida, y goserelina; y sales, ácidos o derivados farmacéuticamente aceptables de cualquiera de los anteriores. Las hormonas androgénicas pueden ser especialmente útiles en el tratamiento de enfermedades auto-inmunes, y una hormona androgénica representativa es la dihidroepiandrosterona (DHEA) . Los moduladores de receptores de andrógenos selectivos (SARMs) incluyen por ejemplo, los compuestos descritos en la Patente de los Estados Unidos No. 6,645,974 a Hutchinson, tales como las carboxamidas de androstano y androsteno. Los inhibidores de cinasa son ampliamente conocidos, y los inhibidores de cinasa particularmente preferidos incluyen los inhibidores de tirosina-cinasa bcr/abl, tales como imatinib (Gleevec) y sus compuestos relacionados, como se describe en la Patente de los Estados Unidos No. 5,521,184 a Zimmermann. Los inhibidores de tirosina-cinasa adicionales pueden incluir agentes que bloquean los complejos de señalización involucrados en la activación de y transcripción de la cinasa Lyn, incluyendo por ejemplo, ARNips que bloquean la actividad de la Lyn-cinasa. Los inhibidores de cinasa adicionales incluyen compuestos tales como AGL 2592 descrito en Ben-Bassat, H. et al. (2002) J. Pharmacol . Exp . Ther. 303, 163, que mostró que es inductor de la apoptosis para linfomas no Hodgkin; la herbimicina A como se describe por Mahon, TM y O'?eill, LA (1995) J. Biol . Chem . 270, 28557 mostró que bloquea el enlace de AD? y la expresión del gen impulsado por ?F-kappa B; compuestos de indolinona, tales como aquellos descritos en la Patente de los Estados Unidos ?o . 6,680,335 a Tang; derivados de pirazolopirimidina tales como aquellos descritos en la Patente de los Estados Unidos ?o . 6,660,744 a Hirst, y similares. Los inhibidores de proteasoma incluyen los esteres borónicos descritos en la Patente de los Estados Unidos ?o. 6,083,903 a Adams. Un inhibidor de proteasona preferido es el bortezomib (Velcade) . Los agentes de terapia génica y los modificadores de la expresión del gen incluyen secuencias de ácido nucleico antisentido, secuencias de ácido nucleico de interferencia y similares. Los agentes de terapia génica modificadores de la expresión del gen pueden ser utilizados ya sea como un inmunoconjugado o como un agente citotóxico separadamente administrado. Los agentes de terapia génica particularmente útiles y los modificadores de la expresión del gen incluyen aquellos que codifican para proteínas involucradas en las vías pro-apoptóticas, así como aquellos que bloquean los inhibidores de las vías pro-apoptóticas o aquellos que bloquean la señalización proliferativa, todos los cuales pueden contribuir al crecimiento e hiperproliferación descontrolados. Por ejemplo, los modificadores de la expresión del gen pueden incluir antisentido o ARNip que actúan para inhibir la vía de ?F-kB, con lo cual se inhibe la proliferación anormal presente cuando la vía está anormalmente activada. Los oligonucleótidos de AD? antisentido, están típicamente compuestos de secuencias complementarias a la secuencia objetivo, usualmente un ácido ribonucleico R?A mensajero (AR?m) o un precursor de AR?m. El AR?m contiene información genética en la orientación funcional, o en sentido, y el enlace del oligonucleótido en sentido inactiva el AR?m pretendido, y previene su traducción en proteína. Tales moléculas antisentido son determinadas con base en experimentos bioquímicos que muestran que las proteínas son traducidas a partir de ARNm específicos y una vez que la secuencia del RNA es conocida, una molécula antisentido que se enlazará a ésta a través de apareamiento de bases de Watson-Crick complementarias, puede ser designada. Tales moléculas antisentido contienen típicamente entre 10-30 pares de bases, más preferentemente entre 10-25, y lo más preferentemente entre 15 y 20. El oligonucleótido antisentido puede ser modificado para la resistencia mejorada a la hidrólisis con nucleasa, y tales análogos incluyen fosforotioato, metilfosfonato, fosforoselenoato, fosfodiéster y oligonucleótidos p-etoxi como se describe en el documento WO 97/07784. El agente de terapia génica puede también ser una ribozima, ADN enzimático (ADNzima) , RNA catalítico, o un R?A de interferencia pequeño (ARNip) . La interferencia de R?A utiliza RNAs cortos típicamente menores de aproximadamente 30 pares de bases, los cuales actúan a través del apareamiento de bases complementarias como se describe anteriormente. En los ARNips pueden ser lineales o circulares. Como se mencionó anteriormente, los agentes y modificadores que bloquean los complejos de señalización involucrados en la activación y transcripción de la cinasa Lyn, podrían ser ventajosos. En una modalidad particular, un AR?ip que bloquea la actividad de la cinasa Lyn, tal como el ARNip reportado por Ptasznik, A et al., (2004) Nat . Med. 10, 1187, puede ser administrado con un anticuerpo de enlace anti-CDMl, ya sea como un inmunoconjugado o como un agente citotóxico separadamente administrado.

XV. Formulaciones farmacéuticas y modos de administración Los anticuerpos y los agentes citotóxicos pueden ser formulados utilizando cualesquiera métodos y excipientes farmacéuticamente aceptables conocidos en la técnica. Típicamente, los anticuerpos son proporcionados en solución salina, con excipientes y estabilizadores opcionales. Los agentes quimioterapéuticos pueden variar ampliamente en los métodos de formulación y los excipientes, y esta información es disponible por ejemplo en Remington's Pharmaceutical Sciences (Arthur Osol, Editor) . Se contempla que los métodos y composiciones descritos en la presente pueden ser utilizados en aplicaciones in vivo, ex vivo e in vi tro . Las composiciones de la invención pueden ser administradas al paciente mediante una variedad de medios diferentes. Los medios de administración variarán dependiendo de la aplicación pretendida. Como una persona experta en la técnica podría reconocer, la administración de las composiciones pueden ser llevadas a cabo en diversas formas, por ejemplo, vía la administración tópica, incluyendo pero no limitada a, la administración dérmica, ocular, y rectal; administración transdérmica vía medios pasivos o activos, por ejemplo utilizando un parche, un portador y/o iontoforesis; la administración transmucosal, por ejemplo, sublingual, bucal, rectal, vaginal o transuretral ; la administración por ejemplo, gástrica o duodenal; la inyección parenteral en la cavidad corporal o en un bazo, por ejemplo, intraperitoneal, intravenosa, intralinfática, intratumoral, intramuscular, intersticial, intraarterial, subcutánea, intralesional, intraocular, intrasinovial, intraarticular; vía la inhalación, por ejemplo, inhalación pulmonar o nasal, utilizando por ejemplo un nebulizador. Las composiciones y los métodos en donde el agente polivalente es un anticuerpo, son en general administrados parenteralmente. Se debe entender que mientras que la invención no ha sido descrita en conjunto con las modalidades específicas preferidas de la misma, que la descripción anterior así como los ejemplos siguientes están destinados a ilustrar y no a limitar el alcance de la invención. La práctica de la presente invención empleará, a no ser que se indique de otro modo, técnicas convencionales de química orgánica, química de los polímeros, bioquímica y similares, que están dentro de la experiencia en la técnica. Otros aspectos, ventajas y modificaciones del alcance de la invención serán aparentes para aquellos expertos en la técnica a la cual pertenece la invención. Tales técnicas son explicadas completamente en la literatura . Todas las patentes, solicitudes de patente, y publicaciones mencionadas en la presente, anteriormente y más adelante, son incorporadas por referencia aquí.

En los siguientes ejemplos, han sido realizados esfuerzos para asegurar la precisión con respecto a los números utilizados (por ejemplo, cantidades, temperatura, etc . ) , pero debe ser explicado cierto error experimental y desviación. A no ser que se indique de otro modo, la temperatura es en 2C y la presión es o está cerca de la atmosférica.

Abreviaturas : ALL leucemia linfoblástica aguda ASPR aparaginasa BCR receptor de célula B BFA brefeldina A DNR daunorrubicina FITC isotiocianato de fluoresceína IM mononucleósis infecciosa mAb anticuerpo monoclonal Pl yoduro de propidio RBC células sanguíneas rojas SLE lupus eritomatoso sistémico VCR vincristina WBC células sanguíneas blancas Ejemplo 1 El mAb 216 hiere las membranas de células B e invoca una respuesta de re-selladura por los lisosomas La respuesta natural al daño membranal es la re-selladura rápida por adición de la membrana lisosomal interna en el sitio de la herida. Lamp-1 es una glucoproteína de la membrana lisosomal abundante, normalmente no presente sobre la membrana plasmática (Granger, B. L . , et al . (1990) J. Biol . Chem . 265, 12036; McNeil, P. L. (2002) J. Cell Sci . 115, 873) . Cuando los lisosomas son inducidos a fusionarse con la membrana plasmática, el dominio NH2-terminal intra-lisosomal de Lamp-1 se llega a exponer sobre la superficie celular. Este evento de fusión puede ser monitorizado por tinción superficial de las células vivas con los mAbs dirigidos al epitopo lumenal de Lamp-1 (Reddy, A., et al . (2001) Cell 106, 157; Rodríguez, A., et al . (1997) J. Cell . Biol 137, 93; Martínez, L, et al . (2000) J. Cell . Biol . 148, 1141). De este modo, la presencia de Lamp-1 sobre la superficie celular es una indicación de la re-selladura de membrana después de la perturbación de la membrana (McNeil, P. L., y R. A. Steinhardt (2003) Ann . Rev. Cell Dev. Biol . 19, 697). Para probar si el mAb 216 codificado por VH4-34 hiere las células y de este modo invoca una reparación y respuesta de selladura rápidas, la línea de células B humanas tratadas con mAb 216 fueron evaluadas para la aparición súbita sobre la superficie celular de la proteína Lamp-1 específica del lisosoma.

Células y Reactivos La línea de células pre-B humanas Nalm-6 (Hurwitz, R. , et al (1979) Int . J. Cáncer 23 , 174), Reh (Rosenfield, C, A. et al . (1977) Nature 267, 841), y la línea de células B maduras 0CI-Ly8 (Tweeddale, M. E., et al . (1987) Blood 69, 1307) fueron mantenidas en fase logarítmica en medio de Iscove con FCS al 10% inactivado por calor. Las líneas de células B fueron obtenidas de la ATCC. Los mAbs codificados por el VH4-34, el mAb 216 (Bhat, N. M. , et al . (1993) J. Im unol . 151, 5011), Z2D2 (Bhat, N. M. , et al . (2000) Scand. J. Inmuno 1 . 51, 134) , y Y2K así como el mAb control equiparado al isotipo, MS2B6, derivado de un miembro de la familia VH3 (Glasky, M. S., et al . (1992) Hum . Antibod. Hybridomas 3, 114), fueron producidos en el laboratorio y purificados a partir de sobrenadante de hibridoma libre de suero mediante precipitación 2X con agua. Los MAbs fueron concentrados cuando fue necesario sobre un concentrador Centriprep (Amnicon, Dancers, MA) . La pureza de los mAbs IgM, verificada mediante electroforesis en gel de poliacrilamida fue de 90-95%. La concentración de los IgMs purificados fue determinada mediante ELISA de emparedado utilizando la IgM humana como un estándar (catálogo # 31146, Pierce Biochemicals, Rockford, IL) . Además de MS2B6, la IgM de Pierce fue también utilizada como un control de isotipo. Todos los mAbs fueron esterilizados por filtración y libre de azida de sodio.

Ensayo de viabilidad celular utilizando tinción con Pl y dispersión delantera La integridad de la membrana plasmática fue evaluada por la habilidad de las células para excluir el yoduro de propidium (Pl, Sigma, St. Louis, MO) . El nivel de incorporación de Pl fue cuantificada mediante citometría de flujo de FACScan (Becton-Dickinson, San José CA) interconectado con el software VersatermPro y FlowJo en las instalaciones de FACS de Stanford. Las células negativas a Pl con tamaño normal como se midieron por las señales de dispersión delantera fueron consideradas células vivas. En resumen, las células tratadas como se especifica en cada experimento y resuspendidas en PBS con 3% de FCS y 10 µg/ml de Pl . En los experimentos donde la toxicidad fue valuada en el medio libre de calcio, las células fueron resuspendidas en medios apropiados con o sin calcio a los cuales se agregó 10 µgs/ml de Pl . Ya que los estudios previos han mostrado que la toxicidad mediada por el mAb 216 es notablemente pronunciada a menores temperaturas (Bhat, N.

M., et al . (1996) Clin . Exp . Inmuno 1. 105,183), fueron tomadas precauciones para mantener todos los medios y células a 37 aC y la centrifugación a temperatura ambiente.

Ensayo de agotamiento y liberación del ATP El ATP intracelular y liberado fue medido de acuerdo a las instrucciones del fabricante por el equipo de ensayo de bioluminiscencia (Catálogo # A-22066, Molecular Probes) . Las diluciones de ATP estándares en el intervalo de 1 nM a 1 µM fueron probadas como control positivo. Las células fueron expuestas a diferentes concentraciones del mAb 216, en diferentes medios, como se especifica en cada experimento. Se agregaron 10 µl de sobrenadante de reacción a 90 µl de la solución de reacción estándar que contenía DTT, luciferina y luciferasa. La generación de luz, en presencia de ATP como un sustrato, fue inmediatamente medida por el luminómetro (Lumimark Microplate Reader, Bio-Rad) interconectado con Micro Win 2000, software versión 4.2 (Mikrotek Laborsysteme, Gmbh) . Este ensayo permite la detección de cantidades fentomolares del ATP. Para evaluar el contenido de ATP intracelular, las células fueron lisadas con 1% de NP-40 a temperatura ambiente por 10 minutos, y 10 µl del lisado fueron probados como se describió anteriormente .

Estudios de expresión de Lamp-1 La expresión superficial de Lamp-1 fue estudiada por epi-fluorescencia, citometría de flujo y microscopía confocal. Los anticuerpos para el epitopo lumenal de Lamp-1 humana (CDl07a, clon H4A3 ) y el control de isotipo para La p-1, una IgGik de ratón, fueron obtenidos de BD-PharMingen. Ambos anticuerpos fueron detectados con una IgG F(ab)2 de cabra conjugada a FITC, secundaria, anti-ratón (Pierce Biochemicals) . 5 X 105 células fueron expuestas a diversas concentraciones del mAb 216 o al control de IgM humano (mAb MS2B6 o IgM de Pierce) para el tiempo especificado en cada experimento a 372C. Las células fueron luego fijadas con parafolmadehído calentado a 2% a temperatura ambiente por 20 minutos, lavado dos veces con el medio precalentado y teñidas con anti-Lamp-1 al control isotipo por 15 minutos. Las células fueron luego lavadas dos veces con el medio de tinción (PBS con 3% FCS y 0.2% de azida de sodio) e incubados con el anticuerpo secundario para anti-Lamp-1 por otros 15 minutos. Después de dos lavados, las células fueron resuspendidas en el medio de tinción y analizadas mediante citometría de flujo, inmunofluorescencia o microscopía confocal . La formación de imagen confocal fue realizada en las instalaciones de Stanford' s Cell Sciences Imaging Facility con el microscopio confocal láser MultiProbe 2010 (Molecular Dynamics, Sunnyvale, CA) . MultiProbe utiliza un láser de gas mixto de argón/criptón con líneas de excitación a 488, 568 y 647 y está construido sobre un microscopio invertido Nikon Diaphot 200. Con una longitud de onda de excitación de 488 nm, la luz emitida se hizo pasar a través de un divisor de haz 510LP y recolectada con un filtro de paso largo 510. Se utilizó un objetivo planapo Nikon 60X (NA1.4). La formación de imagen de epi-fluorescencia fue realizada sobre un microscopio Axioplan 2 (Cari Zeiss, Inc., GmbH) equipado con una cámara AxioCam HRc (Cari Zeiss) y un suministro de energía Opti-Quip (Modelo 1200, Highland Mills, Nueva York), interconectado con un software Axiovision 3.1 (Cari Zeiss). La citometría de flujo fue realizada sobre FACScan.

Resultados y conclusiones La expresión de Lamp-1 sobre células no tratadas varió tan baja como 5% hasta 50% de experimento a experimento. La variación ocurre debido al manejo estándar en laboratorio de las líneas de células B. En experimentos donde el nivel de línea base de expresión de Lamp-1 fue de 50%, las células tratadas con el control isotipo permanecieron 50% positivas y las células tratadas con el mAb 216 fueron 100% positivas a Lamp-1. La tinción de Lamp-1 sobre las líneas celulares fue repetida 5 veces para asegurar la reproducibilidad. Los resultados son discutidos a partir de los experimentos donde la expresión de línea base Lamp-1 es de 5%. Las células Nalm-6 expuestas al mAb 216 por 1 minuto demostraron un incremento dramático en la tinción de Lamp-1, pero las células expuestas al control de isotipo en las células sin tratamiento no incrementaron la expresión de Lamp-1. La exposición de Lamp-1 fue también observada en otras líneas de células B, 0CI-Ly8 (B madura) y Reh por FACS y epi-fluorescencia (datos no mostrados) . La integridad de la membrana de las células fue simultáneamente evaluada para cada muestra mediante captación de Pl . Las células permanecieron negativas a Pl a 1 minuto después de la exposición a 216. La tinción con Lamp-1 y la captación de Pl fue también medida a diferentes puntos de tiempo después de la exposición al mAb 216. La exposición a Lamp-1 fue un evento rápido con una tinción más brillante observada a los 30 segundos de la exposición al anticuerpo, decayendo gradualmente en los siguientes 5 minutos (figura 5A) . Las células permanecieron negativas a Pl durante este periodo de tiempo. La captación de Pl fue demostrada después de 5 minutos de exposición al mAb 216, y por 20 minutos, 10 a 25% de las células se volvieron permeables a la membrana, como se pone en evidencia por la captación de Pl .

La perforación de la membrana medida por liberación del ATP también mostró un curso de tiempo similar. Como se muestra en la figura 5B, el ATP no fue detectado en el sobrenadante a los 2 minutos, un punto de tiempo donde Lamp-1 es detectado sobre la membrana celular. Pero a los 15 minutos y a 1 hora la liberación del ATP se incrementó, sugiriendo que ocurrió el daño a la membrana que pudo no ser sellada nuevamente. A las 2 y 24 horas después del tratamiento con el mAb 216, existió una disminución en el ATP medido que puede ser el resultado de la lisis celular y la necrosis que degrada el ATP liberado. Cuando el contenido de ATP en la pella celular es evaluado, el ensayo de bioluminiscencia se vuelve una medida de la proliferación celular y la citotoxicidad. Los efectos citotóxicos del mAb 216 fueron aparentes dentro de 1 hora de exposición. Estos resultados demuestran que el daño a la membrana mediado por el mAb 216 es reparado por el mismo mecanismo que restaura la viabilidad celular después del daño mediante herida mecánica o física, indicando que el tratamiento con el mAb 216 da como resultado un evento de herida celular similar a cualquier otra perforación de membrana grande. La herida celular por un anticuerpo no ha sido observada hasta la fecha. El daño a la membrana por el mAb 216 fue inicialmente re-sellado conforme la membrana interna fue agregada rápidamente a la bicapa lipídica, pero con tiempo incrementado de exposición al mAb, los intentos para las re-selladuras fallaron y la membrana se volvió permeable a Pl y ATP. Además del mAb 216, otros mAbs IgM codificados por VH-34 anti-células B, mediaron el daño a la membrana de manera similar e invocaron una respuesta de reselladura similar, por los lisosomas.

Ejemplo 2 La reparación del daño a la membrana inducida por los mAb 216 es dependiente de la actina funcional Como se discute por McNeil, P. ((2002) J. Cell Sci . 115, 873) y otros, la reparación de la herida membranal involucra procesos dependientes de la actina. Para probar si la reparación de la herida membranal inducida por el mAb 216 utiliza mecanismos de reparación dependientes de la actina, las células fueron tratadas con agentes que afectan la polimerización de lactina, y el efecto sobre la reparación de la herida de la membrana, inducida por el mAb 216 fue evaluada. Las células fueron tratadas con citochalasina o j splacinólido, dos agentes que tienen efectos opuestos sobre la polimerización de actina. La citochalasina despolimeriza la actina en monómeros, mientras que el jasplacinólido, un péptido cíclico obtenido de una esponja marina, inmoviliza la actina en su forma filamentosa. Ambos tratamientos impiden las actividades citoesqueléticas basadas en actina.

Métodos La citochalasina fue obtenida de Sigma y el jasplacinólido fue obtenido de Molecular Probes (Eugene, OR) .

Los inhibidores de caspasa, Ac-IETD-CHO y Ac-DEVD-CHO fueron obtenidos de PharMingen (San Diego, CA) . Las células Nalm-6 (1 X 106 células/ml) fueron tratadas con el jasplacinólido (3 µgs/ml) , la citochalasina (5 µgs/ml) , o los inhibidores de caspasa (10 µM) por 2 horas a 37°C antes del tratamiento con el mAb 216. Las muestras control con cantidades equivalentes del DMSO fueron establecidas en paralelo. Las células fueron expuestas a 25 µg de mAb 216 o el anticuerpo control Ab y analizadas mediante citometría de flujo.

Resultados Las células tratadas con la citochalasina o el jasplacinólido y el mAb 216 mostraron viabilidad disminuida (porcentaje de células viables) y por lo tanto incrementó la susceptibilidad al mAb 216, demostrando un efecto sinérgico e indicando un requerimiento para la actina funcional en el proceso de reparación. Las células tratadas con citochalasina o jasplacinólido y los anticuerpos control no mostraron una disminución en la viabilidad. Los datos provenientes de un experimento representativo son mostrados en la figura 6. Fueron obtenidos resultados similares de otros tres experimentos. La incubación de las células con los inhibidores de caspasa Ac-IETD-CHO y Ac-DEVD-CHO no alteraron la viabilidad celular, indicando que el mecanismo de muerte celular no es debido a la apoptosis. Estos resultados apoyan además el mecanismo de herida a la membrana celular inducida por el anticuerpo, provocado por la exposición a estos anticuerpos.

Ejemplo 3 La reparación del daño a la membrana inducida por el mAb 216 es dependiente del calcio Ya que la exocitosis de los lisosomas se sabe que es un fenómeno dependiente del calcio (Miyake, K. , y P. L. McNeil (1995) J. Cell Biol . 131, 1737; Bi , G. Q., et al . (1995) J. Cell Biol 131, 1747), la herida a la membrana por el mAb 216 y la reparación de la herida fue probada en condiciones libres de calcio y de calcio normal . La viabilidad celular de las células Nalm-6 fue tratada con dos mAbs codificados por VH4-34, el mAb 216 a concentraciones de 50, 25 y 12.5 ng/ml, e Y2K a 50 ng/ml, se probó en presencia del medio con o sin calcio. Como se muestra en la figura 6A, la viabilidad celular disminuyó significativamente en ausencia del calcio, indicando que el calcio era necesario para la reparación de las heridas. Las células tratadas con el anticuerpo control o sin el anticuerpo no mostró ningún cambio en la viabilidad celular en presencia o ausencia del calcio. Otras líneas de células B, 0CI-Ly8 y Reh también mostraron un incremento similar en la citotoxicidad en condiciones libres de calcio (datos no mostrados) .

Ejemplo 4 La reparación del daño a la membrana inducida por el mAb 216 es dependiente de golgi funcional Se sabe que el tratamiento con Brefeldina A ( BFA) da como resultado la liberación de proteínas de recubrimiento asociadas al aparato de golgi , la redistribución de la membrana de golgi en el retículo endoplásmico y un bloque en secreción proveniente del aparato de golgi (Klausner, R. D. , (1992) J. Cell Biol . 116, 1071) . Los lisosomas recién formados no son generados en las células tratadas con BFA, proporcionando de este modo una condición para probar su requerimiento en la preparación de heridas . Por lo tanto, la habilidad de los lisosomas recién f ornados para ayudar en la reparación de las heridas a la membrana, inducidas por las células mAb 216 fue probada mediante el tratamiento de las células con BFA.

Métodos La Brefeldina-A obtenida de Sigma, las células Nalm-6 (1 X 106 células/ml) fueron tratadas con 25 µg/ml de BFA por 2 horas a 37°C antes del tratamiento con el mAb 216. Las muestras control con cantidades equivalentes de DMSO fueron ajustadas en paralelo. Las células fueron luego expuestas a 25 µg de mAb 216 o del anticuerpo control y analizadas mediante citometría de flujo.

Resultados Como se muestra en la figura 6B, las viabilidad celular (porcentaje de células viables) fue disminuida por la disminución de la BFA y el mAb 216, demostrando un efecto sinérgico sobre la viabilidad. BFA no tuvo efecto sobre la viabilidad de las células tratadas con los anticuerpos control. Este resultado demuestra que la reparación de las membranas fue bloqueada por BFA, sugiriendo que los lisosomas recién formados son necesarios para la reparación de la membrana y la supervivencia e integridad continua de las líneas de células B heridas por el mAb 216. Este resultado confirma además así que el mAb 216 genera heridas en la membrana de las células y que las células intentan parchar la herida utilizando la fusión lisosomal con la membrana plasmática. Cuando la generación de los lisosomas adicionales es inhibida por BFA, el proceso de reparación no puede ser adecuado para mantener la viabilidad celular.

Ejemplo 5 Muerte sinérgica de células B con vincristina La muerte celular aumentada fue demostrada cuando el mAb 216 fue combinado con agentes quimioterapéuticos, particularmente con vincristina, en ensayos de citotoxicidad dirigidos contra líneas de células B. Tres líneas celulares que han sido derivadas de los blastos ALL de diferentes genotipos y fenotipos, Nalm 6, REH, y SUPB15, fueron incubadas con el mAb 216 solo o en combinación con vincristina (VCR) , por 48 horas a 372C. Como se muestra en la figura 4, y en la Tabla 1 siguiente, estos resultados muestran que a bajas concentraciones de vincristina (0.2 ng/ml), no ocurrió la muerte celular debida al tratamiento con la vincristina sola. No obstante, cuando la vincristina fue combinada con el mAb 216, el porcentaje de células B muertas fue más que duplicado, demostraron una interacción sinérgica. Las citotoxicidad del mAb 216 para los linfoblastos progenitores de B, solo o en combinación con quimioterapia hace a este anticuerpo un reactivo promisorio para estudios adicionales de inmunoterapia en ALL tempranos .

Ejemplo 6 Citotoxicidad aumentada del mAb 216 para las lineas de células B por agentes quimioterapéuticos La citotoxicidad in vi tro del mAb 216 en combinación con agentes quimioterapéuticos solos, fue probada. Tres líneas celulares que han sido derivadas de los blastos ALL de diferente genotipo y fenotipo, Nalm 6, REH, y SUPB15, fueron incubadas con el mAb 216 solo o en combinación con vincristina (VCR) , daunorrubicina (DNR) , o L-asparaginasa (ASPR) . Todos los agentes quimioterapéuticos cuando son utilizados en combinación con el mAb 216 dieron como resultado mayor grado de citotoxicidad que el que fue observado ya sea con la quimioterapia con el agente solo o el mAb 216 solo. No obstante, la combinación de vincristina con el mAb 216 fue más eficaz, dando como resultado una magnitud de citotoxicidad que fue sinérgica en comparación a la cantidad de muerte celular inducida ya sea por vincristina o el mAb 216 solo. Los resultados son presentados en la tabla 1 siguiente. Estos resultados demuestran la citotoxicidad aumentada del mAbs 216 en presencia de agentes quimioterapéuticos en parte al menos debido a que el tratamiento con el mAb 216 da como resultado la permeabilización de las células B y permite el acceso de los agentes quimioterapéuticos de otro modo impermeable hacia el interior de la célula.

Tabla 1. Citotoxicidad in vitro del mAb 216 en combinación con agentes quimioterapéuticos Línea Tratamiento Células % de cambio celular / vivas por 10" en las tiempo de células incubación vivas Nalm 6 48 h Control 13 mAb 216 5 µg/ml 10 23 VCR 0.2 ng/ml 13 0 mAb 216 + VCR 6 53 Nalm 6 48 h Control 8.2 mAb 216 5 µg/ml 5.6 31 DNR 5 ng/ml 4.3 41 mAb 216 + DNR 1.5 81 Nalm 6 48 h Control 11 mAb 216 5 µg/ml 7.1 35 VCR 2 ng/ml 5 54 mAb 216 + VCR 0.28 97 Nalm 6 48 h Control 12 mAb 216 5 µg/ml 5.1- 57 ASPR 0.8 U/ml 9.2 23 mAb 216 + ASPR 3.2 73 REH 48 h Control 8.6 mAb 216 5 µg/ml 4.6 46 Línea Tratamiento Células % de cambio celular / vivas por 105 en las tiempo de células incubación vivas VCR 0.2 ng/ml 4.2 86 mAb 216 + VCR 0.45 94 REH 48 h Control 13 mAb 216 5 µg/ml 11 15 VCR 0.2 ng/ml 7.7 40 mAb 216 + VCR 0.9 93 REH 48 h Control 9.6 mAb 216 5 µg/ml 3.4 65 ASPR 0.8 U/ml 6.2 35 mAb 216 + aspar. 2.4 75 SUP B15 48 h Control 5.1 mAb 216 5 µg/ml 3.6 29 VCR 2 ng/ml 2.8 45 DNR 4 ng/ml 0.44 91 mAb 216 + VCR 1.5 50 mAb 216 + DNR 0.38 92 VCR; vincristina, DNR; daunorrubicina, ASPR; asparaginasa Ejemplo 7 Densidad de los receptores del mAb 216 sobre los linfocitos B La densidad de los receptores superficiales a los cuales se enlaza el mAb 216 sobre los linfocitos B, fue determinada utilizando procedimientos estándares, como se describe brevemente más adelante. La línea de células pre-B Nalm-6 y los linfocitos esplénicos B humanos fueron utilizados. En resumen, el mAbs 216 fue conjugado al isotiocianato de fluoeresceína (FITC, Molecular Probes, Inc.), y se midió la absorbancia del anticuerpo puro conjugado a 280 nm y 292 nm para determinar la proporción del fluoróforo a la proteína (F/P) . La cantidad de FITC por molécula de 216 fue calculada utilizando la fórmula estándar. Las células fueron incubadas con concentraciones cada vez más mayores del anticuerpo conjugado y las células marcadas fueron analizadas utilizando citometría de flujo. La cantidad del anticuerpo requerida para alcanzar la saturación, fue registrada. Utilizando la proporción fluoresceína/proteína (F/P) , fueron calculadas las moléculas de los receptores sobre la superficie celular. Se encontró que las células Nalm-6 expresan los receptores a una densidad aproximadamente 2 x 106 receptores por célula y se encontró que las células B esplénicas expresan los receptores a una densidad de aproximadamente 1.34 x 106 receptores por célula sobre la superficie celular. Estas densidades son similares a aquellas observadas para la expresión de CD8 sobre las células T. Las células de la línea celular Nalm-6 son aproximadamente una y media veces más grandes en tamaño que las células B esplénicas.

Referencias 1. Suman, 0 y Burshteyn, A. (2000) "Cell surface receptor-antibody association constants and enumeration of receptor sites for monoclonal antibodies," Cytometry 40(4), 316-26. 2. http://www.drmr.com/abcon/FITC.html. Conjugación a FITC de anticuerpos. 3. http: //www. cyto. purdue.edu/hmarcVIH/1995/0979.htm. Densidad del antígeno 4. http: //iacf .bsd.uchicago. edu/FlowHome/Protocols/abconjugate.htm. Conjugación del anticuerpo.

Ejemplo 8 El epitopo para mAb 216 está asociado con el citoesqueleto Los receptores de la superficie celular pueden permanecer asociados con las estructuras citoesqueléticas después del enlace específico al ligando, después de la reticulación por las lectinas, o en un estado no ocupado. Una asociación entre receptores y el citoesqueleto puede ser investigado por la evaluación de la proporción del receptor que no es solubilizado por el detergente no iónico NP-40 y permanece asociado con la matriz citoesquelética insoluble. Para determinar si el epitopo de CDIM de las células B está asociado con el citoesqueleto, la co-localización del enlace del mAb 216 con la matriz citoesquelética insoluble de las células B, fue investigada utilizando anticuerpos fluorescentes y radiomarcados, como se describe más adelante.

Métodos Las células Nalm-6 fueron marcadas a 42C con el mAb 216 biotinilado, o con el anti-CD71 conjugado a FITC o el anti-CDl9 conjugado a FITC. Las células marcadas con FITC fueron lavadas dos veces, y resuspendidas en un amortiguador de extracción que contenía 0.5% de NP-40. Las células marcadas con el mAb 216 biotinilado fueron lavadas dos veces y luego teñidas con avidina-FITC, lavadas nuevamente y resuspendidas en un amortiguador de extracción que contenía 0.5% de NP-40. El tratamiento con NP-40 depura las células de las proteínas de la membrana solubles en el detergente, dejando detrás la matriz citoesquelética y el núcleo intacto. Las células depuradas intactas fueron analizadas mediante FACS o microscopía de fluorescencia. El mAb 216 conjugado directamente con el radioisótopo 125I fue incubado con la línea de células B Nalm-6 (1 x 105 células) por 15 minutos a 4°C. Después de múltiples lavados, las células fueron ya sea homogeneizadas mecánicamente o las proteínas membranales solubilizadas utilizando 0.5% de NP-40. El material fue luego centrifugado 6000 x g por 15 minutos y la distribución del 125I-mAb 216 fue determinada en el sedimento (que consistió principalmente de los núcleos y el citoesqueleto asociado) y el sobrenadante (que consistió principalmente de la membrana celular y el citoplasma) .

Resultados La fluorescencia de los anticuerpos que se enlazan a los antígenos asociados a la membrana, CD71 y CD19 sobre las células Nalm-6 debido a los anticuerpos conjugados a FITC, fue abolida después de esta exposición al amortiguador NP-40. No obstante, la intensidad de fluorescencia del mAb 216 enlazado al ligando de célula B no cambió después del tratamiento con detergente. Además, la mayor parte de 125I-mAb 216 (80-85%) se encontró que estaba asociada con la fracción nuclear/citoesquelética después de la sedimentación. Muy poco mAb 216 fue encontrado en la fracción citoplásmica donde la mayor parte de las proteínas enlazadas a la membrana se sabe que se fraccionan. Estos datos demuestran que el anticuerpo anti-CDIM, el mAb 216, se enlaza a un epitopo que está asociado con el citoesqueleto de la célula B.

Ejemplo 9 La citotoxicidad del mAb 216 es alimentada por reticulación La citotoxicidad in vi tro del mAb 216 a las células Nalm-6 fue evaluada utilizando tinción con Pl y evaluación de la viabilidad (porcentaje de células vivas) como una función de la cantidad del mAb 216 presente. La cantidad del mAb216 necesaria para lograr 50% y 80% de viabilidad en las células Nalm-6 y sin el agente de reticulación (un mAb secundario, por ejemplo, lambda anti-humano) se muestra en la tabla 1, expresada en nanogramas de anticuerpo requeridos para lograr el nivel indicado de citotoxicidad, como es determinado por la entrada de Pl a las células . Estos resultados demuestran que la viabilidad celular es también influenciada por la adición de un agente de reticulación, aquí un anticuerpo secundario que se enlaza a la IgM. Como se muestra más adelante, la adición de un agente de reticulación aumenta la citotoxicidad del mAb 216 tal que únicamente la mitad del anticuerpo es requerida para lograr 20% de muerte celular (80% de viabilidad), y únicamente 60% del anticuerpo es requerido para alcanzar una muerte celular del 50% (50% de viabilidad) en presencia del anticuerpo de reticulación. El agente de reticulación parece proporcionar rigidez adicional al complejo anticuerpo-receptor de la superficie celular, para aumentar la herida y/o muerte celulares.

Tabla 1. Valores de ED50 y ED80 en el mAb 216 con y sin reticulación Ejemplo 10 La citotoxicidad del mAb 216 es aumentada por reticulación, pero la citotoxicidad del Rituxan no es aumentada por reticulación La citotoxicidad in vi tro del mAb 216 y C2B8 (RITUXAN®) a las células OCI-Ly8 fue evaluada utilizando tinción con Pl y evaluación de la viabilidad (porcentaje de células vivas) de las células tratadas con el mAb 216 y C2B8. Las células OCI-Ly8 (5 x 105 células/ml) fueron tratadas toda la noche a 372C con 15 µg de cada anticuerpo en ausencia del complemento y las células efectoras. El anticuerpo secundario (5 µg) fue agregado a las muestras apropiadas (anti-IgG y anti-IgM) . Las células fueron lavadas, resuspendidas en el medio de tinción que contenía Pl, y analizadas sobre Facscan. Las células fueron mantenidas a 372C a todos los tiempos.

Resultados Las células viables (negativos a Pl) en cada muestra son mostradas en la figura 7. Como se muestra en la figura 7, la viabilidad de las células tratadas sin el anticuerpo (control) y los anticuerpos CDB8, anti-IgG, anti-IgM, y C2B8 + anti-IgG, fue similar, indicando que ninguno de estos tratamientos provocó citotoxicidad significativa en ausencia del complemento o células efectoras. El tratamiento con el mAb 216 sin el anticuerpo secundario dio como resultado, una viabilidad de aproximadamente 65%. En presencia del anticuerpo secundario, la combinación del mAb 216 + anti-IgM dio como resultado una viabilidad únicamente de aproximadamente 20%. Estos resultados demuestran un aumento significativo en la citotoxicidad del mAb 216 (una IgM que posee la capacidad de reticular antígenos en virtud de su estructura pentamérica) que es debida a la reticulación adicional que ocurrió en presencia del agente de hiperreticulación, anti-IgM.

Ejemplo 11 Citotoxicidad dependiente de la dosis del mAb 216 a las células B esplénicas y una linea de células B La titulación del anticuerpo en una suspensión celular de células Nalm-6 o células B esplénicas (a 5 x 105 células por ml) demuestra la citotoxicidad dependiente de la dosis del mAb 216 hacia las células B. Como se muestra en la figura 8, conforme se incrementa la cantidad del anticuerpo conjugado a FITC, la cantidad de fluorescencia detectada utilizando facsan se incrementa rápidamente, hasta que todos los sitios receptores celulares son saturados con el anticuerpo. Las curvas de enlace de ambos tipos celulares parecen ser similares, mostrando saturación casi a la misma concentración del anticuerpo. No obstante, la dependencia de la viabilidad celular sobre la concentración del mAb varía significativamente entre los tipos celulares. Por ejemplo, aproximadamente a 5 µg/ml del anticuerpo, las células B esplénicas muestran una viabilidad de aproximadamente 65%. En contraste, las células Nalm-6 a la misma concentración del anticuerpo muestran una viabilidad únicamente de aproximadamente 42%. Esta cantidad de anticuerpos es suficiente para proporcionar al menos un exceso de tres veces a la cantidad total de los epitopos de CDIM sobre las células Nalm-6, y es más cercana a un exceso de cinco veces para las células B esplénicas. Aproximadamente a 10 µg/ml del anticuerpo, las células B esplénicas muestran una viabilidad de aproximadamente 48%, mientras que las células Nalm-6 muestran una viabilidad únicamente de aproximadamente 30%. De este modo, las líneas de células B muestran mayor susceptibilidad a la muerte con el anticuerpo que se enlaza a CDIM, que los linfocitos B maduros, sugiriendo que las células B neoplásicas son más susceptibles a la muerte en el mAb 216 que las células B maduras.

Ejemplo 12 Eficacia del mAb 216 en pacientes con ALL en pruebas clínicas Este estudio de elevación de escala de fase de dosis I del mAb 216 humano, fue realizado en adultos con ALL precursor de células B en recaída o refractario, para definir preliminarmente la actividad antitumoral del mAb 216 dentro de los confines de un estudio de fase I; y para evaluar la actividad biológica del mAb 216 en pacientes con ALL en recaída o refractario. Los pacientes habían sido previamente tratados múltiples veces con vincristina como parte de un programa de tratamiento de múltiples fármacos, pero se había vuelto refractario el tratamiento con vincristina, por ejemplo, el tratamiento con vincristina no fue efectivo para reducir las cuentas de blastos leucémicos .

Administración del anticuerpo: dia 0 y dia 7 La proporción de dosis inicial al tiempo de la primera infusión del mAb 216 fue de 25 mg/hora para la primera media hora. Si no ocurrió ningún evento relacionado a la toxicidad o la infusión, la proporción de dosis fue elevada de escala (incrementos de 25 mg/hora a intervalos de 30 minutos) haeta un máximo de 200 mg/hora, a una dosis total de 1.25 mg/kg. Evaluación de la Enfermedad y Farmacocinética La respuesta temprana hacia la terapia fue realizada en el día 7, antes de proceder con la infusión del segundo anticuerpo. Los pacientes recibieron la segunda dosis de anticuerpo en conjunto con vincristina. Quimioterapia Se administró la vincristina a una dosis de 1.5 mg/m/dosis IVP en el día 7 antes de iniciar la dosis # 2 del anticuerpo . Resultados Los pacientes tratados con el mAb 216 solo mostraron una disminución en WBC después de la infusión del anticuerpo. Los pacientes tratados subsecuentemente con la combinación de vincristina y el mAb 216 mostraron una disminución más dramática en WBC. Estos datos son presentados gráficamente en las figuras 9A y 9B. Las flechas indican los días de administración de la mAb 216, con o sin vincristina. El paciente 2 presentado con 90-95% de blastos en sangre periférica y en médula ósea, y una cuenta elevada de WBC. El tratamiento con 1.25 mg/kg del mAb 216 solo, dio como resultado una disminución transitoria en la cuenta de WBC, y por el día 7, las cuentas de WBC fueron elevadas nuevamente a más de 105 WBC por µl . El tratamiento con 1.25 mg/kg del mAb216 en combinación con vincristina a 1.5 mg/m2/dosis de IVP, dio como resultado una disminución dramática en WBC. Los resultados se muestran en la figura 9A. El paciente 3 presentó 90-98% de blastos en sangre periférica en médula ósea, y una cuenta de WBC de aproximadamente 40,000 WBC/µl. El tratamiento con 1.25 mg/kg de mAb 216 solo, dio como resultado una disminución transitoria en la cuenta de WBC, y por el día 7, las cuentas de WBC se elevaron nuevamente. El tratamiento con 1.25 mg/kg del mAb 216 en combinación con vincristina a 1.5 mg/m2/dosis de IVP dio como resultado nuevamente la disminución dramática en WBC. Los resultados se muestran en la figura 9B. Estos datos demuestran que la combinación del tratamiento quimioterapéutico con el mAb 216 da como resultado una eficacia sorprendente y sinérgica en pacientes humanos que sufren de ALL. Se demuestra que las WBC se vuelven más susceptibles al tratamiento con los agentes quimioterapéuticos debido al tratamiento con el mAb 216, incluso a concentraciones subletales del anticuerpo, aumentando la eficacia de los tratamientos con agentes quimioterapéuticos adicionales. Se hace constar que con relación a esta fecha, el mejor método conocido por la solicitante para llevar a la práctica la citada invención es el que resulta claro de la presente descripción de la invención.

Claims

REIVINDICACIONES Habiéndose descrito la invención como antecede, se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes reivindicaciones:

1. Una composición para inducir herida en la membrana celular, caracterizada porque comprende un agente polivalente que se enlaza a un antígeno de la superficie celular altamente expresado presente sobre la superficie de una célula, en donde el antígeno de la superficie celular está asociado con el citoesqueleto de la célula.

2. La composición de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque el agente polivalente es un anticuerpo.

3. La composición de conformidad con la reivindicación 2, caracterizada porque el anticuerpo es un IgM.

4. La composición de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque el antígeno de la superficie celular es el epitopo de CDIM presente sobre la superficie de las células B.

5. La composición de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque comprende además un agente de reticulación que proporciona reticulación del agente polivalente que se enlaza al antígeno de la superficie celular altamente expresado presente sobre la superficie de la célula.

6. La composición de conformidad con la reivindicación 5, caracterizada porque el agente de reticulación es un anticuerpo.

7. Una composición para aumentar la herida de la membrana celular en una célula linfoide, caracterizada porque comprende un agente polivalente que se enlaza a un antígeno de la superficie celular altamente expresado sobre una célula linfoide, y que comprende además un agente de reticulación que aumenta la herida de la membrana celular del agente polivalente con relación a la herida de la membrana celular del agente polivalente en ausencia del agente de reticulación.

8. La composición de conformidad con la reivindicación 7, caracterizada porque el agente polivalente es un anticuerpo.

9. La composición de conformidad con la reivindicación 8, caracterizada porque el anticuerpo es un IgM.

10. La composición de conformidad con la reivindicación 7, caracterizada porque el antígeno de la superficie celular es el epitopo de CDIM presente sobre la superficie de las células B.

11. La composición de conformidad con la reivindicación 7, caracterizada porque el agente de reticulación es un anticuerpo.

12. Una composición para matar una célula, caracterizada porque comprende un agente polivalente que se enlaza a un antígeno de la superficie celular altamente expresado, presente sobre la superficie de una célula, y que comprende además un agente de reticulación que proporciona reticulación del agente polivalente.

13. La composición de conformidad con la reivindicación 12, caracterizada porque el agente polivalente es un anticuerpo VH4-34.

14. La composición de conformidad con la reivindicación 12, caracterizada porque el agente de reticulación es un anticuerpo anti-agente kappa, anti-agente lambda o anti-VH4-34.

15. La composición de conformidad con la reivindicación 12, caracterizada además porque comprende un agente citotóxico.

16. La composición de conformidad con la reivindicación 12, caracterizada porque la célula es maligna.

17. La composición de conformidad con la reivindicación 16, caracterizada porque la célula maligna está asociada con un neoplasma de un tejido corporal seleccionado del tejido nervioso, linfoide, ovárico, cervical, endometrial, testicular, prostático, renal, colónico, pancreático, estomacal, intestinal, esofágico, pulmonar, tiroideo, adrenal, hepático, óseo, cutáneo, bucal o de garganta .

18. Una composición para permeabilizar una célula, caracterizada porque comprende un agente polivalente que se enlaza a un antígeno de la superficie celular altamente expresado presente sobre la superficie de una célula.

19. La composición de conformidad con la reivindicación 18, caracterizada porque la célula es una célula B.

20. La composición de conformidad con la reivindicación 17, caracterizada porque el agente polivalente es un anticuerpo.

21. La composición de conformidad con la reivindicación 18, caracterizada porque el anticuerpo es un IgM.

22. La composición de conformidad con la reivindicación 18, caracterizada porque el antígeno de la superficie celular es el epitopo CDIM.

23. La composición de conformidad con la reivindicación 17, caracterizada porque el anticuerpo es un anticuerpo VH4-34.

24. La composición de conformidad con la reivindicación 18, caracterizada porque el agente de reticulación es un anticuerpo anti-agente kappa, anti-agente lambda o anti-VH4-34.

25. Una composición para inducir herida de la membrana celular en células B, caracterizada porque comprende un anticuerpo VH4-34 polivalente que se enlaza a un antígeno para la superficie celular, sobre la superficie de la célula B.

26. La composición de conformidad con la reivindicación 25, caracterizada además porque comprende un agente de reticulación que se retícula al anticuerpo VH4-34 enlazado al antígeno de la superficie celular sobre la superficie de la célula B.

27. La composición de conformidad con la reivindicación 26, caracterizada porque el agente que se retícula con el anticuerpo VH4-34 es un anticuerpo anti-VH4-34.

28. Una composición farmacéutica para tratar a un mamífero que sufre de una condición que se distingue por la hiperproliferación de las células, caracterizada porque comprende un agente polivalente que se enlaza a un antígeno de la superficie celular altamente expresado, presente sobre la superficie de una célula, en donde el agente polivalente induce herida de la membrana celular.

29. La composición farmacéutica de conformidad con la reivindicación 28, caracterizada porque comprende además un agente citotóxico.

30. La composición farmacéutica de conformidad con la reivindicación 28, caracterizada porque la hiperproliferación de las células es una hiperproliferación de células B.

31. La composición farmacéutica de conformidad con la reivindicación 30, caracterizada porque la condición por una hiperproliferación de células B es el cáncer linfoide, infección viral, inmunodeficiencia o enfermedad autoinmune.

32. La composición farmacéutica de conformidad con la reivindicación 31, caracterizada porque la infección viral es el virus de inmunodeficiencia humana o mononucleósis .

33. La composición farmacéutica de conformidad con la reivindicación 31, caracterizada porque la inmunodeficiencia es una enfermedad linfoproliferativa posttrasplante, o síndrome de inmunodeficiencia.

34. La composición farmacéutica de conformidad con la reivindicación 29, caracterizada porque el agente citotóxico es un agente quimioterapéutico humano, un isótopo radioactivo, un anticuerpo citotóxico, un inmunoconjugado, un conjugado de ligando, un inmunosupresor, un regulador y/o inhibidor del crecimiento celular, una toxina o mezclas de los mismos.

35. La composición farmacéutica de conformidad con la reivindicación 28, caracterizada porque comprende además un agente de reticulación que proporciona reticulación del agente polivalente.

36. Una composición para aumentar la herida de la membrana celular inducida por un anticuerpo que hiere la membrana celular, que comprende un anticuerpo polivalente que se enlaza a un antígeno de la superficie celular altamente expresado, y el medio de reticulación que aumenta la citotoxicidad del anticuerpo polivalente, caracterizada porque el medio de reticulación aumenta la citotoxicidad del anticuerpo polivalente con relación a la citotoxicidad del anticuerpo polivalente en ausencia del medio de reticulación.

37. La composición de conformidad con la reivindicación 36, caracterizada porque el anticuerpo polivalente es un IgM.

38. La composición de conformidad con la reivindicación 36, caracterizada porque el medio de reticulación es un anticuerpo anti-kappa, anti-lambda o anti-mu, o un anticuerpo específico para un epitopo expresado sobre el anticuerpo polivalente que se retícula a los anticuerpos polivalentes adyacentes enlazados al antígeno de la superficie celular altamente expresado sobre la superficie de la célula.

39. Una composición farmacéutica para tratar a un mamífero que sufre de una condición distinguida por hiperproliferación de las células, caracterizada porque comprende un agente polivalente que se enlaza a un antígeno de la superficie celular altamente expresado presente sobre la superficie de una célula, en donde el agente polivalente comprende una pluralidad de sitios de enlace para el antígeno de la superficie celular, sobre la superficie de la célula.

40. La composición de conformidad con la reivindicación 39, caracterizada porque la pluralidad de sitios de enlace es al menos cinco.

41. La composición de conformidad con la reivindicación 39, caracterizada porque la pluralidad de sitios de enlace es de aproximadamente 5 a aproximadamente 100.

42. La composición de conformidad con la reivindicación 39, caracterizada porque la pluralidad de sitios de enlace es de aproximadamente 15 a aproximadamente 50.

43. Un método para tratar a un mamífero que sufre de una condición distinguida por una hiperproliferación de células, caracterizado porque comprende administrar un agente polivalente que se enlaza a un receptor de la superficie celular altamente expresado sobre la superficie de las células hiperproliferativas, en donde el agente polivalente es administrado en una cantidad efectiva para matar preferentemente las células hiperproliferativas con relación a las células normales.

44. El método de conformidad con la reivindicación 43, caracterizado porque el mamífero es un humano.

45. El método de conformidad con la reivindicación 44, caracterizado porque el mamífero es un mamífero no humano .

46. El método de conformidad con la reivindicación 43, caracterizado porque las células hiperproliferativas son células cancerosas .

47. El método de conformidad con la reivindicación 46, caracterizado porque las células hiperproliferativas son estimuladas en una condición de hiperproliferación por factores de crecimiento, citocinas o infección viral.

48. El método de conformidad con la reivindicación 43, caracterizado porque el agente polivalente es un anticuerpo que hiere la membrana celular.

49. El método de conformidad con la reivindicación 46, caracterizado porque la viabilidad de las células cancerosas puede ser reducida por una cantidad que es al menos 10% mayor que la viabilidad de las células normales.

50. Un método para matar a una célula cancerosa, caracterizado porque comprende poner en contacto una célula cancerosa con una cantidad citotóxica de un anticuerpo que hiere la membrana celular, que se enlaza a un antígeno de la superficie celular altamente expresado sobre la superficie de la célula cancerosa, e induce la herida de la membrana celular en la célula cancerosa.

51. El método de conformidad con la reivindicación 50, caracterizado porque el anticuerpo que hiere la membrana celular es administrada a una cantidad efectiva para matar preferentemente las células cancerosas, pero no para matar las células normales.

52. El método de conformidad con la reivindicación 50, caracterizado porque comprende además administrar a un agente citotóxico en combinación con el anticuerpo que hiere la membrana celular.

53. El método de conformidad con la reivindicación 52, caracterizado porque el agente citotóxico es un agente quimioterapéutico, un isótopo radioactivo, un anticuerpo citotóxico, un inmunoconjugado, un conjugado ligando, un inmunosupresor, un regulador y/o inhibidor de crecimiento celular, una toxina o mezclas de los mismos.

54. El método de conformidad con la reivindicación 50, caracterizado porque comprende además la administración de un agente de reticulación que proporciona reticulación del anticuerpo que hiere la membrana celular, que se enlaza a un antígeno de la superficie celular altamente expresado sobre la superficie de la célula cancerosa.

55. El método de conformidad con la reivindicación 54, caracterizado porque el agente de reticulación es un anticuerpo.

56. El método de conformidad con la reivindicación 50, caracterizado porque la célula cancerosa es una célula B neoplásica .

57. El método de conformidad con la reivindicación 50, caracterizado porque el anticuerpo que hiere la membrana celular es un anticuerpo VH4-34.

58. El método de conformidad con la reivindicación 55, caracterizado porque el anticuerpo es un anticuerpo anti-VH4-34.

59. Un método para inducir herida en la membrana celular en una célula linfoide en un paciente humano, caracterizado porque comprende poner en contacto una célula con un agente polivalente que se enlaza a un antígeno de la superficie celular altamente expresado, presente sobre la superficie de la célula linfoide.

60. El método de conformidad con la reivindicación 59, caracterizado porque el agente polivalente es un anticuerpo .

61. El método de conformidad con la reivindicación 59, caracterizado porque la célula linfoide es una célula B que expresa el epitopo de CDIM.

62. El método de conformidad con la reivindicación 59, caracterizado porque el anticuerpo es administrado al paciente en una cantidad efectiva para herir preferentemente las células B hiperproliferativas con relación a las células B normales .

63. El método de conformidad con la reivindicación 59, caracterizado porque el anticuerpo es administrado al paciente en una cantidad efectiva para herir las células B hiperproliferativas pero no efectiva para matar las células B hiperproliferativas .

64. El método de conformidad con la reivindicación 62, caracterizado porque el método comprende (1) la toma de muestra de sangre de un paciente en necesidad de tratamiento para determinar el número de células B hiperproliferativas en la sangre del paciente, (2) determinar la susceptibilidad de las células hiperproliferativas y las células B normales a la herida por el anticuerpo, y (3) administrar una cantidad del anticuerpo al paciente, suficiente para herir preferentemente y/o matar las células B hiperproliferativas en el paciente.

65. El método de conformidad con la reivindicación 64, caracterizado porque comprende además la titulación en cantidades adicionales del anticuerpo al paciente, para alcanzar una cantidad deseada de herida y/o muerte de las células.

66. El método de conformidad con la reivindicación 63, caracterizado porque comprende (1) la toma de muestra de sangre de un paciente en necesidad de tratamiento para determinar el número de células B hiperproliferativas en la sangre del paciente, (2) determinar la susceptibilidad de las células B hiperproliferativas a la herida por el anticuerpo, y (3) administrar una cantidad del anticuerpo al paciente, suficiente para herir las células B hiperproliferativas en el paciente .

67. El método de conformidad con la reivindicación 59, caracterizado porque comprende además administrar una cantidad efectiva del agente citotóxico al paciente.

68. Un método para inducir herida de la membrana celular, caracterizado porque comprende poner en contacto una célula con un agente polivalente que se enlaza a un antígeno de la superficie celular altamente expresado sobre la superficie de la célula.

69. El método de conformidad con la reivindicación 68, caracterizado porque comprende además poner en contacto la célula con un agente de reticulación que aumenta la citotoxicidad del agente polivalente con relación a la citotoxicidad del agente polivalente en ausencia del agente de reticulación.

70. El método de conformidad con la reivindicación 69, caracterizado porque el agente polivalente es un anticuerpo, y el agente de reticulación es un anticuerpo que se enlaza al anticuerpo, proporcionando reticulación del anticuerpo enlazado a la superficie de la célula.

71. El método de conformidad con la reivindicación 68, caracterizado porque la célula es una célula B y el anticuerpo es un anticuerpo anti-CDIM.

72. El método de conformidad con la reivindicación 68, caracterizado porque el anticuerpo anti-CDIM es una IgM.

73. El método de conformidad con la reivindicación 72, caracterizado porque comprende además un agente de reticulación que se enlaza a un anticuerpo anti-CDIM.

74. El método de conformidad con la reivindicación 73, caracterizado porque el agente de reticulación que se enlaza al anticuerpo anti-CDIM, es un anticuerpo anti-kappa o anti-lambda o un anticuerpo anti-VH4-34.

75. Un método para permeabilizar una célula, caracterizado porque comprende poner en contacto una célula con un agente polivalente que se enlaza a un antígeno de la superficie celular altamente expresado, presente sobre la superficie de la célula.

76. Un método para tratar a un paciente humano que sufre de una condición distinguida por una hiperproliferación de las células B, caracterizado porque comprende poner en contacto las células con (1) una cantidad citotóxica de un anticuerpo que tiene enlace específico para los epitopos de CDIM sobre células B, y (2) un agente de reticulación que se enlaza al anticuerpo que tiene enlace específico para los epitopos de CDIM sobre una célula B.

77. El método de conformidad con la reivindicación 76, caracterizado porque comprende además poner en contacto las células B con un agente citotóxico.

78. El método de conformidad con la reivindicación 76, caracterizado porque la condición distinguida por una hiperproliferación de las células B es cáncer linfoide, infección viral, inmunodeficiencia o enfermedad autoinmune.

79. El método de conformidad con la reivindicación 78, caracterizado porque la infección viral es provocada por el VIH, EBV o HPV.

80. El método de conformidad con la reivindicación 78, caracterizado porque la inmunodeficiencia es enfermedad linfoproliferativa post-trasplante o síndrome de inmunodeficiencia .

81. Un método para purgar la médula ósea de células B malignas de un paciente en necesidad del mismo, caracterizado porque comprende poner en contacto las células de la médula ósea con un anticuerpo que tiene enlace específico para un epitopo de CDIM sobre la superficie de las células B, y que comprende además poner en contacto las células B con un agente de reticulación que retícula el anticuerpo enlazado al epitopo de CDIM sobre la superficie de las células B, con lo cual se proporciona una citotoxicidad aumentada para el anticuerpo anti-CDIM hacia las células B malignas .

82. El método de conformidad con la reivindicación 81, caracterizado porque comprende además poner en contacto las células con un agente citotóxico para purgar adicionalmente la médula ósea de células B malignas.

83. Un kit para determinar el umbral de dosis a un agente polivalente que induce la herida en la membrana celular en un mamífero, caracterizado el equipo porque comprende una cantidad suficiente de un agente polivalente que se enlaza a un antígeno de la superficie celular altamente expresado para realizar ensayos de enlace.

84. Un kit para determinar el umbral de dosis para un anticuerpo que hiere la membrana celular en un mamífero, caracterizado porque comprende una cantidad suficiente de un anticuerpo que hiere la célula, que se enlaza a un antígeno de la superficie celular altamente expresado, para realizar ensayos de enlace, un agente de reticulación, o un agente citotóxico, o combinaciones de los mismos.

85. El uso de un agente polivalente que hiere la membrana celular, en la fabricación de un medicamento para el tratamiento de un mamífero que sufre de una enfermedad o trastorno distinguido por una hiperproliferación de las células.

86. El uso de un anticuerpo que hiere la membrana celular, en la fabricación de un medicamento para el tratamiento de un mamífero que sufre de una enfermedad o trastorno caracterizado por una hiperproliferación de las células .