JP2008519030A - 抗体で誘導される細胞膜損傷 - Google Patents
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Abstract
Description
本発明を詳細に記載する前に、特に断らない限り、本発明は変化可能な、特定な緩衝液、賦形剤、化学療法剤、又はその類に限定されないことは当然のことであることは理解されたい。また、当然ながら、本明細書で使用される学術用語は特別な実施態様のみを記載する目的のためであり、本発明の範囲を限定することを意図しているものではない。
VH4−34抗体(重鎖可変領域)は、生殖系列遺伝子(VH4.21)によりコードされている生殖系列抗体の、53個の同定されているヒトの機能的抗体の中の一つである。Cook,G.P.,et al.,(1994)Nat.Genet.7,162-168.VH4−34抗体遺伝子は全てのハプロタイプに存在し、関係の無い個体より単離された生殖系DNAには配列の上で変化のないことが報告されている。Weng,N.P.,et al.,(1992)Eur.J.Immunol.22,1075-1082;van der Maarel,S.,et al.,(1993)J.Immunol.150,2858-2868.VH4−34遺伝によりコードされている抗体は、ユニークな特性を有することが示されている。赤血球(RBCs)の「I」又は「i」抗原に向けられた全てのmAbsはVH4−34遺伝子によりコードされており、一般にIgMクラスであり、RBCsを4℃で凝集させるので、古典的には寒冷凝集素(CAs)と記載されている。Pascual,V.,et al.,(1991)J.Immunol.146,4385-4391;Pascual,V.,(1992)J.Immunol.149,2337-2344;Silberstein,L.E.,et al.,(1991)Blood 78,2372-2386.CAsにより認識されるリガンドは線状又は枝分かれした、RBCsのタンパク質及び/又は脂質上に存在する複合糖質である。新生児及び臍帯血のRBCは線状のi抗原を持つ。枝分かれしたI鎖は生後に作られる。Pruzanski,W.et al.,(1984)Clin.Immunol.Rev.3,131-168;Roelcke,D.(1989)Transfusion Med.Rev.2,140-166.ヒトB細胞上で認識される「i」抗原は、エンド・ベータ・ガラクトシダーゼの酵素に感受性である線状のラクトサミン決定基である。独立に由来するVH4−34抗B細胞/抗iのmAbsの配列解析は、これらは生殖系の構造であることを示した。Bhat N.M.,et al.,(1997)Clin.Exp.Immunol.108,151-159.
従って、本発明の或る実施態様では、細胞膜損傷を誘導するための組成物が提供され、前記組成物は、細胞表面に高発現されている細胞表面抗原に結合する多価剤を含む。好ましくは、この細胞表面抗原は細胞の細胞骨格と結合している。例えば、界面活性剤による可溶性成分の抽出の後にも細胞表面抗原は細胞に結合した状態でとどまっている。細胞膜損傷は生存可能な膜損傷であり、リソソームとの融合で修復され、細胞表面のリソソームタンパク質の出現により検出可能で、そして結果として少なくとも一時的な細胞の透過性の亢進をもたらす。
その他の実施態様では、損傷の修復の失敗若しくは修復不可をもたらすような損傷を細胞に継続して与えるのに十分な量の多価剤を、少なくとも部分的に与えることで、細胞膜損傷を非生存的にできる。致死的細胞損傷は、膜の修復が有効でなくなるか維持できなくなる程度の、細胞表面に高発現されている細胞表面抗原に対して十分過剰量の多価剤を投与することにより、達成されることができる。また、致死的細胞損傷は、抗アクチン剤、又は細胞表面レセプターと細胞下層の細胞骨格との結合に影響する薬剤のように、修復メカニズムの遮断あるいは妨害を引き起こす薬剤を供給することでも達成されることができる。また、致死的細胞損傷は、細胞接着及び/又は運動性に影響する薬剤を投与することでも達成することができる。
本発明者は、これらの細胞膜損傷抗体の毒性は、化学療法剤、放射性同位体、細胞毒性抗体、免疫複合体、リガンド複合体、免疫抑制剤、細胞増殖制御剤及び/又は阻害剤、毒素、又はこれらの混合物のような細胞毒性剤を追加することで、顕著にそして更に相乗的に高まるという、驚くべき発見をした。
特別な実施態様では、細胞の過剰増殖を特徴とする病状を患っているヒト患者の治療手段が提供され、それは細胞表面に高発現されている細胞表面抗原に結合する多価剤の投与を含み、前記多価剤は正常細胞に対して過剰増殖細胞を優先的に殺すような量で投与されるのを特徴とする。好ましくは、過剰増殖細胞は癌細胞である。その他の実施態様では、過剰増殖細胞は成長因子、サイトカイン、及びウイルス感染などの刺激により過剰増殖性状態になる。
更なる実施態様では、組成物は細胞膜損傷を誘導するために提供され、それは細胞表面に高発現されている細胞表面抗原に結合する多価剤を含み、細胞膜損傷を誘導する組成物は更に、架橋剤非存在下における多価剤の細胞毒性に比較して多価剤の細胞毒性を高める架橋剤を含むことができる。
細胞損傷抗体mAb216は、実施例12に詳しく記載されているようにヒト患者でin vivoでテストされた。患者(ALLと診断された成人)は化学療法剤(VCR/DNR/ASPR/プレドニゾン)による標準の投薬計画の治療に対しては難治性で、すなわち、芽球数は化学療法による治療に対する反応では減少しなくなり、患者は末期的であった。抗体は1.25mg/kgの量が二人の患者に対して、図9A及び9Bの矢印で示すように、0日目及び7日目に投与された。抗体の血清濃度は、患者の体重、投与量及びおおよその血清体積に基づき(血中赤血球容積を30%と想定)、それぞれ約26μg/ml及び25μg/ml血清であった。それぞれの患者の芽球数は(患者1及び患者2)は、mAb216+VCR治療の時点でそれぞれ約125x106/ml及び65x106/mlであった。約106細胞/mlの濃度で行われたin vitro研究との関連で言えば、これらのmAb濃度はそれぞれ約0.2μg/106細胞及び0.38μg/106細胞に相当し、mAb216によるB細胞殺活性致死限界値濃度より十分に低い値の濃度であった。
IX.キット
本明細書に記載の多価剤、特に細胞膜損傷 抗体は、治療を必要とする患者における多価剤の閾値用量を決定するためのキットに利用可能である。哺乳動物において細胞膜損傷を誘導する多価剤の量は、結合測定を行うための、又は多価剤により誘導された結合測定又は細胞損傷及び/又は殺細胞の定量を行うための、高発現する細胞表面抗原に結合する十分な量の多価剤を含むキットを用いることで決定することができる。更なる実施態様では、結合測定又は多価剤により誘導された細胞損傷及び/又は殺細胞の定量を行うための、高発現する細胞表面抗原に結合する十分な量の多価剤を含む、哺乳動物における細胞膜損傷抗体の閾値用量を決定するためのキットが提供される。また、キットは、細胞毒性剤存在下及び又は細胞膜損傷を亢進する架橋剤の存在下で多価剤の閾値用量を決定するために架橋剤、又は細胞毒性剤、又はそれらの組合せを含むことができる。通常は、採取した患者自身の細胞(例えば、血液細胞、癌細胞、など)について、細胞上に発現されている細胞表面抗原数を定量するための、並びに予め決めた多価剤の量による損傷及び/又は殺細胞の量を定量するためのテストを、キットに含まれる薬剤を用いて行う。
細胞の過剰増殖を特徴づける病態は、癌、自己免疫疾患、ウイルス感染及び免疫不全を含む。癌は任意の細胞型又は組織の癌を含むことができる。好ましくは、癌は、リンパ腫や白血病のようなB細胞由来の癌を含む。
本発明者は、細胞損傷抗体の毒性は細胞毒性剤の追加により顕著にそして更に相乗的に亢進されるという驚くべき発見を行ったが、その薬剤には化学療法剤、放射性同位体、細胞毒性抗体、免疫複合体、リガンド複合体、免疫抑制剤、細胞成長制御剤及び/又は阻害剤、毒素、又はこれらの混合物が含まれる。
本発明で有用な細胞損傷抗体は、任意の高発現した細胞表面抗原に対する抗体を含むことができる。細胞表面抗原は、細胞表面に発現されている分子、例えば、レセプター、免疫グロブリン、サイトカイン、糖タンパク質など、を含む。好ましい細胞表面抗原は、細胞骨格と結合している。
治療上有用な免疫複合体、又はリガンド複合体に使用される同位体は、通常は高エネルギーで治療上有効な通過距離を有するα−、γ−又はβ−粒子を産生する。このような放射性核種は、例えば、複合体が結合した新生細胞のような、近接した細胞を殺す。標的送達の利点は、標的細胞に近接しない細胞に対しては放射性標識した抗体又はリガンドは、殆ど若しくは全く、効果を示さないことである。
細胞成長制御剤及び/又は阻害剤は、ホルモン又は抗ホルモン薬、キナーゼ阻害剤、プロテアソーム阻害剤、遺伝子治療薬、又は遺伝子発現修飾薬のような低分子治療剤を含む。
抗体及び細胞毒性剤は任意の方法及び薬剤学的に認容可能な当技術分野で公知の賦形剤を用いて処方することができる。通常、抗体は食塩水に溶かし、随意の賦形剤及び安定化剤と一緒に提供される。化学療法剤では、処方方法及び賦形剤を多様に変化させることが可能で、この情報は、例えば、Remington’s Pharmaceutical Sciences(Arthur Osol、編者)から得ることができる。
《mAb216はB細胞膜を損傷しそしてリソソームによる再密封反応を惹起する》
膜損傷に対する自然反応は、内在的リソソーム膜の損傷部位への付加による、急速な再密封である。Lamp−1は大量に存在するリソソームの膜糖タンパク質であり、正常では原形質膜上には存在しない(Granger,B.L.,et al.(1990)J.Biol.Chem.265,12036;McNeil,P.L.(2002)J.Cell Sci.115,873)。リソソームが誘導されて原形質膜と融合するとき、内在性リソソームのLamp−1のNH2末ドメインは細胞表面上に露出される。この融合事象は、Lamp−1の内腔側のエピトープに向けられたmAbsにより染色することで追跡可能である(Reddy,A.,et al.(2001)Cell 106,157;Rodriguez,A.,et al.(1997)J.Cell.Biol.137,93;Martinez,I.,et al.(2000)J.Cell.Biol.148,1141)。従って、Lamp−1が細胞表面に存在することは、膜破裂に続き膜再密封が起きていることを示す(McNeil,P.L.,and R.A.Steinhardt(2003)Ann.Rev.Cell Dev.Biol.19,697)。
ヒト前駆B細胞株Nalm−6(Hurwitz,R.,et al.(1979)Int.J.Cancer 23,174)、Reh(Rosenfield,C.,A.et al.(1977)Nature 267,841)、及び成熟B細胞株OCI−Ly8(Tweeddale,M.E.,et al.(1987)Blood 69,1307)は、熱不活化10%FCSを含むイスコブ(Iscove’s)培地で、対数増殖期の状態で維持した。B細胞株はATCCより得た。VH4−34でコードされるmAbs、mAb216(Bhat,N.M.,et al.(1993)J.Immunol.151,5011)、Z2D2(Bhat,N.M.,et al.(2000)Scand.J.Immunol.51,134)、及びY2K、並びにイソタイプが同じコントロール用のmAb、VH3ファミリーのメンバー由来のMS2B6(Glasky,M.S.,et al.(1992)Hum.Antibod.Hybridomas 3,114)は、実験室で製造し、血清を含まないハイブリドーマの培養上清から水とともに2回沈澱させて精製した。MAbsは、必要な時にはセントリプレプ濃縮器(アミコン、ダンサーズ、MA)で濃縮した。IgMmAbsの純度はポリアクリルアミド・ゲル電気泳動でチェックしたところ、90から95%純粋であった。精製IgMsの濃度はヒトIgMを標準に用いたサンドイッチELISAにより決定した(カタログ#31146、ピアス・バイオケミカルズ、ロックフォード、IL)。MS2B6に加えて、ピアスIgMもまたイソタイプのコントロールとして用いた。全てのmAbsは濾過滅菌し、アジ化ナトリウムを含んでいなかった。
原形質膜の保全は、細胞がヨウ化プロピジウム(PI、シグマ、セントルイス、MO)を排除する能力で評価した。PI取り込みのレベルは、スタンフォードのファックス施設にあるバーサタームプロ(VersatermPro)及びフロージョーのソフトウエアと連動させたファックスキャン(ベクトン・ディッキンソン、サンゼノ、CA)によるフロー・サイトメトリーで定量した。前方散乱シグナルによる測定で、正常の大きさを有しPI陰性の細胞は、生細胞と考えた。
細胞内及び放出されたATPを、生体発光測定キット(カタログ#A−22066、モレキュラー・プローブズ)を用い、製造業者の使用説明書に従い、測定した。1nMから1μMの範囲の、標準のATP希釈が陽性コントロールとしてテストされた。細胞は、それぞれの実験で特定された異なる培地中で、種々の濃度のmAb216に曝された。10μlの反応上清を90μlの、DTT、ルシフェリン及びルシフェラーゼを含む標準反応溶液に加えた。補基質としてのATP存在下での発光は、直ちにマイクロウイン2000、バージョン4.2ソフトウエア(マイクロテック・ラボルシステメ(Mikrotek Laborsysteme,Gmbh)と連動させた照度計(ルミマーク・マイクロプレート・リーダー、バイオラド)で測定された。この測定によりフェムトモラーの量のATPを検出できる。細胞内ATP含有量を測定するためには、細胞を1%NP−40を用いて10分間室温にて溶解させ、10μlの溶解物を前記の試験にかけた。
表面Lamp−1の発現は落射蛍光、フロー・サイトメトリー及び共焦点顕微鏡法で調べた。ヒトLamp−1の内腔側エピトープに対する抗体(CD107a,clone H4A3)及びLamp−1のイソタイプコントロールであるマウスIgG1kはBD−ファーミンジェンから得た。両方の抗体は、FITC結合ヤギF(ab)2の抗マウスIgG二次抗体(ピアス・バイオケミカルズ)で検出した。細胞(5X105)は、それぞれの実験において特定の時間37℃で、種々の濃度のmAb216又はヒトIgMコントロール(mAb MS2B6又はピアスIgM)に曝した。次いで、細胞は予め温めておいた2%パラホルムアルデヒドで、室温にて20分間固定し、予め温めておいた培地で洗い、そして抗Lamp−1又はイソタイプコントロールで15分間染色した。次いで、細胞は二回染色用溶液(3%FCSを含むPBS及び0.2%アジ化ナトリウム)で洗い、抗Lamp−1に対する二次抗体と更に15分間インキュベーションした。二回洗浄後、細胞は染色用溶液に再度浮遊させ、フロー・サイトメトリー、蛍光抗体法又は共焦点顕微鏡法で調べた。
非処理細胞のLamp−1の発現は、5%という低値から50%まで、実験ごとに変動した。この変動は、B細胞株の標準操作で生じる。基礎レベルのlamp−1発現が50%であった実験では、イソタイプのコントロールで処理した細胞では50%陽性にとどまっていたが、mAb216処理細胞では100%がLamp−1陽性であった。細胞株のLamp−1による染色は、再現性を確保するために5回繰り返した。結果は、Lamp−1発現の基礎ラインが5%であった実験で検討した。
《mAb216誘導による膜損傷の修復は機能性アクチンに依存する》
McNeil,P.((2002)J.Cell Sci.115,873)及び他で議論されているように、膜損傷の修復はアクチンに依存する過程を含む。mAb216により誘導される膜損傷の修復がアクチンに依存する修復メカニズムを利用しているかどうか試験するために、細胞はアクチンの重合に影響を与える薬剤で処理され、mAb216で誘導された膜損傷の修復に対する効果が評価された。細胞は、アクチンの重合に対して逆の効果をもたらす二つの薬剤、サイトカラシン又はジャスプラキノリド、で処理された。サイトカラシンはアクチンを脱重合させて単体にするが、一方、海綿より得られる円形ペプチドであるジャスプラキノリドは、アクチンを線維性の形態のままに固定化する。両方の処理共に、アクチンに基づく細胞骨格の活性を妨害する。
サイトカラシンはシグマより得、そしてジャスプラキノリドはモレキュラー・プローブより得た(ユージン、OR)。カスパーゼ阻害剤、Ac−IETD−CHO及びAc−DEVD−CHOは、ファーミンジェン(サン・ジェゴ、CA)より得た。Nalm−6細胞(1X106細胞/ml)は、mAb216処理に先立ち、ジャスプラキノリド(3μgs/ml)、サイトカラシン(5μgs/ml)、又はカスパーゼ阻害剤(10μM)で2時間、37℃で処理した。同等の量のDMSOで処理されたコントロールのサンプルは並行して設定した。次いで、細胞を25μgのmAb216又はコントロールのAbに曝し、フロー・サイトメトリーで分析した。
サイトカラシン又はジャスプラキノリド、並びにmAb216で処理された細胞は、生存率(生存細胞のパーセント)の減少、従って、mAb216に対する感受性の増加を示し、これは、相乗的効果を示すとともに、復過程に機能的アクチンの修関与が必要であることを示した。サイトカラシン又はジャスプラキノリド、並びにコントロール抗体で処理された細胞は、生存率の減少を示さなかった。図6Bに、一つの代表的実験のデータを示す。同様な結果は、他の3回の実験でも得られた。
《mAb216誘導膜損傷の修復はカルシウム依存性である》
リソソームのエクソサイトーシスはカルシウム依存性の現象であることが知られているので(Miyake,K.,and P.L.McNeil(1995)J.Cell Biol.131,1737;Bi,G.Q.,et al.(1995)J.Cell Biol.131,1747)、mAb216による膜損傷及び損傷の修復を、カルシウム不含及び正常のカルシウムの条件下でテストした。50、25及び12.5ng/mlの濃度の、VH4−34でコードされるmAbs及びmAb216の二つ、並びに50ng/mlのY2Kで処理された時の、Nalm−6細胞の細胞生存率を、カルシウム含及び不含培地でテストした。図6Aに示すように、細胞生存率はカルシウム非存在下では有意に減少し、損傷の修復にはカルシウムが必要なことが示された。コントロール抗体で処理されても、また抗体処理無しでも、細胞は、カルシウム存在下と非存在下のいずれの場合にも、細胞生存率に何らの変化も受けなかった。また、他のB細胞株、OCI−Ly8及びRehも似たようなカルシウム非存在下の条件での細胞毒性の増加を示した(データは示さない)。
《mAb216誘導膜損傷の修復は機能性ゴルジに依存性である》
ブレフェルジンA(BFA)処理は、ゴルジに結合した外皮タンパク質の放出、ゴルジ膜の小胞体への再分布、及びゴルジ体からの分泌の遮断をもたらすことが知られている(Klausner,R.D.,(1992)J.Cell Biol.116,1071)。新たなリソソーム形成は、BFA処理細胞ではなされることはなく、従って、それが損傷修復に必要性かどうかをテストするための条件を提供する。従って、新たに形成されたリソソームによるmAb216処理細胞膜の損傷修復を助ける能力を、細胞をBFA処理することでテストした。
ブレフェルジンAはシグマから得た。Nalm−6細胞(1X106細胞/ml)は、mAb216処理に先立ってBFA(25μg/ml)で2時間、37℃で処理した。同等の量のDMSOで処理したコントロールサンプルは並行して設定した。次いで、細胞を25μgのmAb216又はコントロールのAbに曝し、フロー・サイトメトリーで分析した。
図6Bに示すように、細胞生存率(生存細胞のパーセント)はBFA及びmAb216の併用により減少し、生存率に対する相乗効果が示された。BFAは、コントロール抗体で処理された細胞の生存率には効果を示さなかった。この結果は、膜修復はBFAにより遮断されることを示し、新たに生成されたリソソームは、膜修復及び引き続くmAb216損傷B細胞株の生存と保全に必要であることが示唆された。更に、この結果は、mAb216はB細胞に膜損傷を引き起こすこと、及び細胞はリソソームと原形質膜の融合を利用して損傷を貼り合わせようと試みること、を確認するものである。追加のリソソームの生成がBFAにより阻害されると、修復過程は細胞生存率を適切に維持するのに役立たなくなるであろう。
《ビンクリスチンとの相乗的B細胞の殺作用》
mAb216が化学療法剤、特にビンクリスチン、と併用されるとき、殺細胞活性の亢進が、B細胞株に対する細胞毒性測定で示された。異なる遺伝子型及び表現型の、ALL芽細胞由来の三つの細胞株、Nalm6、REH及びSUPB15は、mAb216のみと、又はビンクリスチン(VCR)との併用で、48時間37℃でインキュベートされた。
《化学療法剤によるB細胞株に対するmAB216細胞毒性の亢進》
単剤の化学療法剤との併用によるmAb216のin vitro細胞毒性がテストされた。異なる遺伝子型及び表現型の、ALL芽細胞由来の三つの細胞株、Nalm6、REH及びSUPB15は、mAb216のみと、又はビンクリスチン(VCR)、ダウノルビシン(DNR)、又はL−アスパラギナーゼ(ASPR)と併用でインキュベーションされた。全ての化学療法剤はmAb216と併用した場合に、化学療法剤単剤又はmAb216単独の場合より強い細胞毒性をもたらした。しかし、ビンクリスチンとmAb216の併用が最も効果的であり、ビンクリスチン又はmAb216の単独による殺細胞活性に比較し、相乗的な細胞毒性をもたらした。この結果は下記の表1に示す。これらの結果は、化学療法剤存在下におけるmAb216の亢進された細胞毒性を示し、その理由の少なくとも一部は、mAb216処理によりB細胞の透過性が増し、その結果本来透過性でない化学療法剤のB細胞への透過を可能にしたことである。
《Bリンパ球上のmAb216レセプターの密度》
mAb216に結合するB細胞上の表面レセプターの密度は、以下に簡単に述べる標準的な方法で決定された。前駆B細胞株Nalm−6及びヒト脾臓Bリンパ球が使用された。簡単に述べると、MAb216にフルオレセインイソチオシアネート(FITC、モレキュラー・プローブズ社)を結合させ、純粋な結合抗体の280nm及び492nmにおける吸光度を、タンパク質に対する蛍光色素分子の割合(F/P)を決めるために測定した。216の分子当たりのFITCの量は標準的な公式を用いて算出した。
《文献》
1. Siiman,O and Burshteyn,A.(2000)“Cell surface receptor−antibody association constants and enumeration of receptor sites for monoclonal antibodies,” Cytometry 40(4),316−26.
2. http://www.drmr.com/abcon/FITC.html. FITC conjugation of antibodies.
3. http://www.cyto.purdue.edu/hmarchiv/1995/0979.htm. Antigen density.
4. http://iacf.bsd.uchicago.edu/FlowHome/Protocols/abconjugate.htm. Antibody conjugation.
《mAb216に対するエピトープ細胞骨格と結合している》
細胞表面レセプターは、特異的なリガンドと結合した、レクチンにより架橋した、又は結合しない状態でも、細胞骨格構造と結合した状態でとどまることができる。レセプターと細胞骨格の結合は、非イオン性合成洗剤NP−40により可溶化されずに、不溶性の細胞骨格マトリクスと結合して残っているレセプターの割合を測定することで調べることができる。B細胞のCDIMエピトープが細胞骨格と結合しているかどうか決めるために、不溶性の細胞骨格と結合したmAbの共局在性を、下記に示すように、蛍光及び放射性標識した抗体を使用して調べた。
Nalm−6細胞は、ビオチン化したmAb216、又はFITC結合抗CD71又はFITC結合抗CD19抗体を用い、4℃で標識した。FITC標識細胞は2度洗浄し、そして0.5%NP−40を含む抽出用緩衝液に再度浮遊させた。ビオチン化したmAb216で標識した細胞は、2度洗浄し、次いでアビジン−FITCで染色し、再度洗浄し、そして0.5%NP−40を含む抽出用緩衝液に再度浮遊させた。NP−40処理により、細胞から合成洗剤に可溶性の膜タンパク質を除去し、その結果跡に細胞骨格及び無傷の核が残る。この無傷な裸の細胞はFACS又は蛍光顕微鏡法で解析された。
Nalm−6細胞上で膜抗原CD71及びCD19と結合しているFITC結合抗体である蛍光抗体は、NP−40緩衝液に曝した後には消去された。しかし、B細胞リガンドに結合しているmAb216の蛍光強度は、合成洗剤により変化しなかった。
《mAb216の細胞毒性は架橋により増強される》
Nalm−6細胞に対するmAb216のin vitro細胞毒性は、存在するmAb216の量に応じたPI染色及び生存率の値(生存細胞のパーセント)を用いて、評価した。50%及び80%の生存率を架橋剤(二次mAb、すなわち、抗ヒトラムダ)の存在下及び非存在下で達成するのに必要なmAb216の量は、表1に示され、細胞へのPIの進入を指標にして決めた、求める細胞毒性のレベルを達成するために必要な抗体は、ナノグラムで表示された。
《mAb216の細胞毒性は架橋で亢進されるが、リツキサンの細胞毒性は架橋で亢進されない》
mAb216及びC2B8(RITUXAN(商標))のOCI−Ly8細胞に対するin vitro細胞毒性は、mAb216及びC2B8で処理した細胞のPI染色及び生存率値(生細胞のパーセント)で評価した。OCI−Ly8細胞(5x105細胞/ml)は、一夜37℃で、補体及びエフェクター細胞の非存在下で、15μgのそれぞれの抗体で処理した。二次抗体(5μg)は、適切なサンプル(抗IgG及び抗IgM)に加えた。細胞を洗浄し、PIを含む染色溶液に再度浮遊させ、そしてファクスキャンで分析した。細胞は常時37℃で維持した。
それぞれのサンプルの生細胞(PI陰性)は図7に示す。図7に示すように、抗体非処理(コントロール)及び抗C2B8、抗IgG、抗IgM、及びC2B8+抗IgGで処理した細胞の生存率は類似しており、このことによりこれらのいずれの処理も、補体及びエフェクター細胞の非存在下では有意な細胞毒性を生じないことが示された。二次抗体無しにMAb216で処理すると、生存率は約65%であった。二次抗体が存在すると、mAb216+抗IgMの併用では生存率は僅か約20%であった。
《脾臓B細胞及びB細胞株に対するmAb216の用量依存的細胞毒性》
Nalm−6細胞又は脾臓B細胞(5x105細胞/ml)の細胞浮遊液での抗体の滴定は、B細胞に対するmAbの細胞毒性が用量依存的であることを示めした。図8に示すように、FITC結合抗体の量が増すにつれて、抗体により全ての細胞レセプター部位が飽和するまで、ファクスキャンにより検出される蛍光量は急速に増加した。両方の細胞タイプの結合曲線は類似して見え、ほぼ類似した抗体量での飽和を示した。しかし、mAb濃度に対する細胞生存率の依存性は細胞タイプにより有意に変化した。例えば、約5μg/mlの抗体においては、脾臓B細胞では約65%の生存率を示した。これに対して、Nalm−6細胞は同じ抗体濃度で、僅か約42%の生存率を示したに過ぎなかった。この抗体量は、Nalm−6細胞上の少なくとも3倍過剰の全CDIMエピトープに供給するのに十分であり、脾臓B細胞についてはその5倍過剰を供給するのに十分である。約10μg/mlの抗体においては、脾臓B細胞は約48%の生存率を示したが、一方、Nalm−6細胞は僅か約30%の生存率を示したに過ぎなかった。従って、B細胞株は、成熟Bリンパ球に比較して、CDIM結合抗体による殺活性に対する強い感受性を示し、このことは、新生物のB細胞は成熟B細胞に比較してmAb216による殺活性により感受性があることを示唆している。
《臨床試験でのALL患者に対するmAb216の効果》
このヒトmAb216の第I相増量試験は、再発性又は難治性前駆B細胞ALLの成人患者で、予備試験的にmAb216の抗腫瘍活性を第I相試験の範囲内で明らかにするため、そして、再発性又は難治性ALL患者でのmAb216の生物学的活性を評価するために、施行された。患者は以前に複数回多剤療法プログラムの一環としてビンクリスチンの治療を受けたが、しかし、ビンクリスチン治療に対して難治性になった、すなわち、ビンクリスチン治療が白血病性芽球を減らす効果を示さなくなった。
最初に使用したmAb216の輸液の初期の投与速度は、最初の半時間は25mg/時間であった。もしも、毒性や輸液に関連した事象が起こらなかった時には、投与速度(25mg/時間の割合で、30分間ごとに増量)を、最大200mg/時間まで高め、総投与量は1.25mg/kgとした。
二度目の抗体の輸液に先立ち、治療に対する初期の反応は7日目に観察した。患者はビンクリスチンとの併用で二度目の抗体量を摂取した。
ビンクリスチンは、抗体開始投与量#2に先立ち7日目に、1.5mg/m2/IVP用量の投与量で与えられた。
mAb216のみの治療を受けた患者は、抗体の輸液後にWBCの減少を示した。次いでビンクリスチン及びmAb216の併用治療を受けた患者は、更に劇的なWBCの減少を示した。これらのデータはグラフで図9A及び9Bに示した。矢印は、ビンクリスチンと共に、又はビンクリスチン無しでmAb216を投与した日にちを示す。
Claims (86)
- 細胞表面に存在する高発現細胞膜抗原に結合する多価剤を含み、前記細胞膜表現抗原が細胞骨格と結合している、細胞膜損傷を誘導用組成物。
- 多価剤が抗体である、請求項1に記載の組成物。
- 抗体がIgMである、請求項2に記載の組成物。
- 細胞表面抗原がB細胞表面に存在するCDIMエピトープである、請求項1に記載の組成物。
- 細胞表面に存在する高発現細胞膜抗原に結合する多価剤に架橋を提供する架橋剤を更に含む、請求項1に記載の組成物。
- 架橋剤が抗体である、請求項5に記載の組成物。
- リンパ球様細胞の高発現細胞表面抗原と結合する多価剤を含み、そして架橋剤の非存在下での多価剤による細胞膜損傷に比較して、多価剤による細胞損傷を増強させる架橋剤を更に含む、リンパ球様細胞において細胞損傷の増強用組成物。
- 多価剤が抗体である、請求項7に記載の組成物。
- 抗体がIgMである、請求項8に記載の組成物。
- 細胞表面抗原がB細胞表面に存在するCDIMエピトープである、請求項7に記載の組成物。
- 架橋剤が抗体である、請求項7に記載の組成物。
- 細胞表面に存在する高発現細胞表面抗原に結合する多価剤を含み、そして多価剤の架橋を提供する架橋剤を更に含む、細胞を殺すための組成物。
- 多価剤がVH4−34抗体である、請求項12に記載の組成物。
- 架橋剤が抗カッパ剤、抗ラムダ剤、又は抗VH4−34抗体である、請求項12に記載の組成物。
- 細胞毒性剤を更に含む、請求項12に記載の組成物。
- 細胞が悪性である、請求項12に記載の組成物。
- 悪性細胞が、神経、リンパ、卵巣、頚部、子宮内膜、睾丸、前立腺、腎臓、大腸、膵臓、胃、腸、食道、肺、甲状腺、副腎、肝臓、骨、皮膚、口、又は喉、から選択される体組織の新生物と関連している、請求項16に記載の組成物。
- 細胞表面に存在する高発現細胞表面抗原に結合する多価剤を含む、細胞透過用の組成物。
- 細胞がB細胞である、請求項18に記載の組成物。
- 多価剤が抗体である、請求項17に記載の組成物。
- 抗体がIgMである、請求項18に記載の組成物。
- 細胞表面抗原がCDIMエピトープである、請求項18に記載の組成物。
- 抗体がVH4−34抗体である、請求項17に記載の組成物。
- 架橋剤が抗カッパ剤、抗ラムダ剤、又は抗VH4−34抗体である、請求項18に記載の組成物。
- B細胞の表面の細胞表面抗原に結合する多価VH4−34抗体を含む、B細胞における細胞膜損傷誘導用組成物。
- B細胞の表面の細胞表面抗原に結合するVH4−34抗体を架橋する架橋剤を更に含む、請求項25に記載の組成物。
- VH4−34抗体を架橋する架橋剤が抗VH4−34抗体である、請求項26に記載の組成物。
- 細胞の過剰増殖を特徴とする病状を患っている哺乳動物の治療用の医薬組成物であって、細胞表面に存在する高発現細胞表面抗原に結合する前記多価剤を含み、前記多価剤が細胞膜損傷を誘導する、前記医薬組成物。
- 細胞毒性剤を更に含む、請求項28に記載の医薬組成物。
- 過剰増殖細胞が過剰増殖B細胞である、請求項28に記載の医薬組成物。
- B細胞の過剰増殖を特徴とする病状がリンパ性癌、ウイルス感染、免疫不全、又は自己免疫疾患である、請求項30に記載の医薬組成物。
- 前記ウイルス感染がヒト免疫不全ウイルス、又は単核球症である、請求項31に記載の医薬組成物。
- 前記免疫不全症が移植後リンパ増殖性疾患、又は免疫不全症候群である、請求項31に記載の医薬組成物。
- 細胞毒性剤が、化学療法剤、放射性同位体、細胞毒性抗体、免疫複合体、リガンド複合体、免疫抑制剤、細胞成長制御剤及び/又は阻害剤、毒素、又はこれらの混合物である、請求項29に記載の医薬組成物。
- 多価剤の架橋を提供する架橋剤を更に含む、請求項28に記載の医薬組成物。
- 細胞膜損傷抗体により誘導される細胞膜損傷の増強用医薬組成物であって、高発現細胞表面抗原に結合する多価抗体、及び多価抗体の細胞毒性を増強する架橋手段を含み、架橋手段非存在下における多価抗体の細胞毒性と比較し、架橋手段が多価抗体の細胞毒性を増強する、前記医薬組成物。
- 多価抗体がIgMである、請求項36に記載の組成物。
- 架橋手段が、抗カッパ、抗ラムダ、又は抗ミュー抗体、若しくは細胞表面に存在する高発現細胞表面抗原に結合した隣接する多価抗体を架橋する、多価抗体上に発現されたエピトープに対する特異的抗体である、請求項36に記載の組成物。
- 細胞表面に高発現する細胞表面抗原と結合する前記多価剤を含み、前記多価剤が細胞表面の細胞表面抗原に対する複数の結合部位を含む、細胞の過剰増殖を特徴とする病状を患っている哺乳動物の治療用の医薬組成物。
- 複数の結合部位が少なくとも5である、請求項39に記載の組成物。
- 複数の結合部位が約5から約100までである、請求項39に記載の組成物。
- 複数の結合部位が約15から約50までである、請求項39に記載の組成物。
- 過剰増殖細胞の表面の高発現細胞表面レセプターに結合する多価剤の投与を含み、前記多価剤が正常細胞に比較して過剰増殖細胞を優先的に殺す有効量を投与される、細胞の過剰増殖を特徴とする病状を患っている哺乳動物の治療方法。
- 哺乳動物がヒトである、請求項43に記載の方法。
- 哺乳動物が非ヒト哺乳動物である、請求項44に記載の方法。
- 過剰増殖細胞が癌細胞である、請求項43に記載の方法。
- 成長因子、サイトカイン、又はウイルス感染により過剰増殖細胞が刺激されて過剰増殖状態になる、請求項46に記載の方法。
- 多価剤が細胞膜損傷抗体である、請求項43に記載の方法。
- 癌細胞の生存率が、正常細胞の生存率より少なくとも10パーセントより多い量で低減させることができる、請求項46に記載の方法。
- 癌細胞を、癌細胞の表面に高発現した細胞表面抗原に結合し、そして癌細胞に細胞膜損傷を誘導する、細胞毒性量の細胞膜損傷抗体と接触させることを含む、癌細胞を殺す方法。
- 癌細胞を優先的に殺すが、正常細胞は殺さない有効量の、細胞膜損傷抗体を投与する、請求項50に記載の方法。
- 細胞毒性剤を細胞膜損傷抗体との併用で投与することを更に含む、請求項50に記載の方法。
- 細胞毒性剤が、化学療法剤、放射性同位体、細胞毒性抗体、免疫複合体、リガンド複合体、免疫抑制剤、細胞成長制御剤及び/又は阻害剤、毒素、又はこれらの混合物である、請求項52に記載の方法。
- 癌細胞の表面の高発現細胞表面抗原に結合する細胞膜損傷抗体に架橋を提供する架橋剤の投与を更に含む、請求項50に記載の方法。
- 架橋剤が抗体である、請求項54に記載の方法。
- 癌細胞が新生物のB細胞である、請求項50に記載の方法。
- 細胞膜損傷抗体がVH4−34抗体である、請求項50に記載の方法。
- 抗体が抗VH4−34抗体である、請求項55に記載の方法。
- 細胞を、リンパ様細胞の表面に存在する高発現細胞表面抗原に結合する多価剤と接触させることを含む、ヒト患者のリンパ様細胞に細胞膜損傷を誘導する方法。
- 多価剤が抗体である、請求項59に記載の方法。
- リンパ様細胞がCDIMエピトープを発現しているB細胞である、請求項59に記載の方法。
- 正常B細胞に比較して過剰増殖性B細胞を優先的に損傷する有効量の抗体を患者に投与する、請求項59に記載の方法。
- 過剰増殖性B細胞に損傷するが過剰増殖性B細胞を殺さない、有効量の抗体が患者に投与される、請求項59に記載の方法。
- 方法が、
(1)患者血液中の過剰増殖性B細胞の数を定量するための、治療を必要とする患者の血液のサンプリング、
(2)抗体による損傷に対する過剰増殖性B細胞及び正常B細胞の感受性の定量、及び
(3)患者において、十分に過剰増殖性B細胞を優先的に損傷及び/又は殺す抗体量の患者への投与、を含む請求項62に記載の方法。 - 望ましい量の細胞損傷及び/又は殺効果を達成するために、患者に対する追加量の抗体を滴定することを含む、請求項64に記載の方法。
- (1)患者血液中の過剰増殖性B細胞の数を定量するための、治療を必要とする患者の血液のサンプリング、
(2)抗体による損傷に対する過剰増殖性B細胞の感受性の定量、及び
(3)患者において十分に過剰増殖性B細胞を損傷するための抗体量の患者への投与、を含む、請求項63に記載の方法。 - 患者に対して有効な量の細胞毒性剤を投与することを更に含む、請求項59に記載の方法。
- 細胞に、細胞表面の高発現細胞表面抗原に結合する多価剤を接触させることを含む、細胞膜損傷誘導の方法。
- 細胞に、架橋剤非存在下における多価剤の細胞毒性に比較し、多価剤の細胞毒性を増強する架橋剤を接触させることを更に含む、請求項68に記載の方法。
- 多価剤が抗体であり、そして架橋剤が抗体に結合する抗体であり、それにより細胞表面に結合している抗体に架橋を提供する、請求項69に記載の方法。
- 細胞がB細胞であり、そして抗体が抗CDIM抗体である、請求項68に記載の方法。
- 抗CDIM抗体がIgMである、請求項68に記載の方法。
- 抗CDIM抗体に結合する架橋剤を更に含む、請求項72に記載の方法。
- 抗CDIM抗体に結合する架橋剤が、抗カッパ若しくは抗ラムダ抗体、又は抗VH4−34抗体である、請求項73に記載の方法。
- 細胞と、細胞表面に存在する高発現細胞表面抗原に結合する多価剤を接触させることを含む、細胞透過用の方法。
- (1)B細胞上のCDIMエピトープに特異的な結合を有する細胞毒性量の抗体、及び(2)B細胞上のCDIMエピトープに特異的な結合を有する抗体を架橋する架橋剤を、B細胞に接触させることを含む、B細胞の過剰増殖を特徴とする病状を患うヒト患者の治療方法。
- 前記B細胞を細胞毒性剤と接触させることを更に含む、請求項76に記載の方法。
- B細胞の過剰増殖を特徴とする病状が、リンパ性癌、ウイルス感染、免疫不全、又は自己免疫疾患である、請求項76に記載の方法。
- 前記ウイルス感染がHIV、EBV、又はHPVにより引き起こされる、請求項78に記載の方法。
- 前記免疫不全が、移植後リンパ性増殖疾患、又は免疫不全症候群である、請求項78に記載の方法。
- 骨髄細胞を、B細胞表面のCDIMエピトープに対する特異的な結合を有する抗体と接触させることを含み、そしてB細胞をB細胞表面のCDIMエピトープに結合する抗体を架橋する架橋剤と接触させることを更に含み、それにより悪性B細胞に対する抗CDIM抗体の細胞毒性の亢進をもたらす、排除を必要とする患者から悪性B細胞の骨髄からの排除の方法。
- 悪性B細胞を骨髄から更に排除するために細胞を細胞毒性剤と接触させることを更に含む、請求項81に記載の方法。
- 結合アッセイを実施するために高発現細胞表面抗原に結合する十分な量の多価剤を含む、哺乳動物に細胞膜損傷を誘導する多価剤の閾値量の定量用キット。
- 結合アッセイを実施するために高発現細胞表面抗原に結合する十分な量の細胞損傷抗体、架橋剤、細胞毒性剤、又はこれらの組合せを含む、哺乳動物において細胞膜損傷抗体の閾値量の定量用キット。
- 細胞の過剰増殖を特徴とする疾患又は疾患を患う哺乳動物の治療用薬剤の製造における、細胞膜損傷多価剤の使用。
- 細胞の過剰増殖を特徴とする疾患又は疾患を患う哺乳動物の治療用薬剤の製造における、細胞膜損傷抗体の使用。
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