KR102343742B1 - 항-pd-l1 항체 - Google Patents

항-pd-l1 항체 Download PDF

Info

Publication number
KR102343742B1
KR102343742B1 KR1020187035104A KR20187035104A KR102343742B1 KR 102343742 B1 KR102343742 B1 KR 102343742B1 KR 1020187035104 A KR1020187035104 A KR 1020187035104A KR 20187035104 A KR20187035104 A KR 20187035104A KR 102343742 B1 KR102343742 B1 KR 102343742B1
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
antibody
delete delete
antigen
binding
sequence
Prior art date
Application number
KR1020187035104A
Other languages
English (en)
Other versions
KR20190003989A (ko
Inventor
브루스 키트
레너드 조지 프레스타
라메쉬 발리가
Original Assignee
아이쥐엠 바이오사이언스 인코포레이티드
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 아이쥐엠 바이오사이언스 인코포레이티드 filed Critical 아이쥐엠 바이오사이언스 인코포레이티드
Publication of KR20190003989A publication Critical patent/KR20190003989A/ko
Application granted granted Critical
Publication of KR102343742B1 publication Critical patent/KR102343742B1/ko

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/20—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans from protozoa
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2803—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily
    • C07K16/2827—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily against B7 molecules, e.g. CD80, CD86
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A61P35/02—Antineoplastic agents specific for leukemia
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/30—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants from tumour cells
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • G01N33/6854—Immunoglobulins
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
    • C07K2317/21—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin from primates, e.g. man
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
    • C07K2317/24—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin containing regions, domains or residues from different species, e.g. chimeric, humanized or veneered
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C07K2317/31—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency multispecific
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C07K2317/33—Crossreactivity, e.g. for species or epitope, or lack of said crossreactivity
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C07K2317/34—Identification of a linear epitope shorter than 20 amino acid residues or of a conformational epitope defined by amino acid residues
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/52—Constant or Fc region; Isotype
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/60—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments
    • C07K2317/62—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments comprising only variable region components
    • C07K2317/622—Single chain antibody (scFv)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/76—Antagonist effect on antigen, e.g. neutralization or inhibition of binding
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
    • C07K2317/92—Affinity (KD), association rate (Ka), dissociation rate (Kd) or EC50 value
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/435—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans
    • G01N2333/705—Assays involving receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • G01N2333/70503—Immunoglobulin superfamily, e.g. VCAMs, PECAM, LFA-3
    • G01N2333/70532—B7 molecules, e.g. CD80, CD86

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Medicinal Preparation (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)

Abstract

본 발명의 측면은 단리된 항-PD-L1 항체, 상기 항체를 함유하는 조성물, 및 PD-L1 신호전달에 의해 매개되는 질환 또는 병태의 치료에서 이를 사용하는 방법을 포함한다.

Description

항-PD-L1 항체
관련 출원에 대한 교차 참조
본원은 2016년 5월 9일 출원된 미국 특허 가출원 제62/333,643호의 출원일의 우선권 이익을 주장하고, 상기 출원의 개시내용은 그 전체가 본원에 참고로 포함된다.
발명의 분야
본 발명은 단리된 항-PD-L1 항체 및 이의 제조 및 용도에 관한 것이다.
프로그램된 세포 사멸 단백질 1(PD-1)은 세포 표면 및 세포의 인식, 결합 및 부착 과정에 관여하는 가용성 단백질을 포함하는 면역글로불린 수퍼패밀리에 속하는 세포 표면 수용체이다. 이 패밀리의 초기 구성원은 모노클로날 항체의 첨가 후에 T 세포 증식의 증가에 대한 그의 기능적 효과로 인해 발견되었다([Hutloff et al. (1999) Nature 397:263-266]; [Hansen et al. (1980) Immunogenics 10:247-260]). PD-L1 및 PD-L2로 지칭되는, PD-1에 대한 2개의 세포 표면 당단백질 리간드가 확인되었으며, PD-1에 결합시에 T 세포 활성화 및 사이토카인 분비를 하향조절하는 것으로 나타났다([Freeman et al. (2000) J Exp Med 192:1027-34]; [Latchman et al. (2001) Nat Immunol 2:261-8]; [Carter et al. (2002) Eur J Immunol 32:634-43]; [Ohigashi et al. (2005) Clin Cancer Res 11:2947-53]). PD-L1 및 PD-L2 둘 모두는, PD-1에 결합하지만 다른 CD28 패밀리 구성원에는 결합하지 않는 B7 상동체이다(Blank et al. (2004)). 세포 표면 상에서의 PD-L1의 발현은 IFN-γ 자극을 통해 상향조절될 수 있다.
PD-L1 발현은 인간 폐암, 난소암 및 결장암뿐만 아니라 다양한 골수종을 포함하는 여러 뮤린 및 인간 암에서 발견되었다([Iwai et al. (2002) PNAS 99:12293-7]; [Ohigashi et al. (2005) Clin Cancer Res 11:2947-53]). PD-L1은 또한 항원 특이적 T 세포 클론의 아폽토시스를 증가시켜 종양 면역에서 기능하는 것으로 제안되었다(Dong et al. (2002) Nat Med 8:793-800). 따라서, PD-1과 PD-L1 사이의 상호작용의 표적화는 치료적 개입을 위해 특히 관심을 끄는 영역이다. 이 경로의 표적에 대해 작용하는 항-PD-L1 항체와 같은 치료용 조성물에 대한 필요성이 존재한다.
발명의 요약
본 발명의 측면은 단리된 항-PD-L1 항체뿐만 아니라, 그러한 항체를 함유하는 조성물, 및 PD-L1 신호전달에 의해 매개되는 질환 또는 병태의 치료에서 이를 사용하는 방법에 관한 것이다.
일부 실시양태에서, 단리된 항-PD-L1 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 (i) GFSLTSYDIS(서열 번호 4) 서열에 대해 적어도 약 99%의 서열 동일성을 갖는 HVR-H1 서열; (ii) VIWTGVGTN(서열 번호 5)의 서열에 대해 적어도 약 99%의 서열 동일성을 갖는 HVR-H2 서열; 및 (iii) DPYYYGMDY(서열 번호 6)의 서열에 대해 적어도 약 99%의 서열 동일성을 갖는 HVR-H3 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함한다. 일부 실시양태에서, HVR-H1 서열은 GFSLTSYDIS(서열 번호 4)의 서열을 포함하고; HVR-H2 서열은 VIWTGVGTN(서열 번호 5)의 서열을 포함하고; HVR-H3 서열은 DPYYYGMDY(서열 번호 6)의 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 단리된 항-PD-L1 항체는 (i) RASQDISIWLS(서열 번호 1)의 서열에 대해 적어도 약 99%의 서열 동일성을 포함하는 HVR-L1; (ii) KASNLHT(서열 번호 2)의 서열에 대해 적어도 약 99%의 서열 동일성을 포함하는 HVR-L2; 및 (iii) LQSQSFPRT(서열 번호 3)의 서열에 대해 적어도 약 99%의 서열 동일성을 포함하는 HVR-L3으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 HVR 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 추가로 포함한다. 특정 실시양태에서, 경쇄 가변 영역은 상기 HVR-L1, HVR-L2 및 HVR-L3 서열을 모두 포함한다.
일부 실시양태에서, 항-DP-L1 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 (i) RASQDISIWLS(서열 번호 1)의 서열을 포함하는 HVR-L1; (ii) KASNLHT(서열 번호 2)의 서열을 포함하는 HVR-L2; 및 (iii) LQSQSFPRT(서열 번호 3)의 서열을 포함하는 HVR-L3을 포함한다. 일부 실시양태에서, 항체 또는 항원 결합 단편은 (i) RASQDISIWLS(서열 번호 1)의 서열을 포함하는 HVR-L1; (ii) KASNLHT(서열 번호 2)의 서열을 포함하는 HVR-L2; 및 (iii) LQSQSFPRT(서열 번호 3)의 서열을 포함하는 HVR-L3을 포함한다.
일부 실시양태에서, 항체 또는 항원 결합 단편은 모노클로날 항체이다. 일부 실시양태에서, 항체는 키메라, 인간화 또는 인간 항체이다. 일부 실시양태에서, 중쇄 가변 영역은 프레임워크 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 프레임워크 서열의 적어도 일부는 인간 프레임워크 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 프레임워크 서열의 적어도 일부는 인간 컨센서스 프레임워크 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 프레임워크 서열은 서열 번호 7, 8, 9, 10 및 11로 이루어지는 군으로부터 선택되는 프레임워크 영역 1(FR1) 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 프레임워크 서열은 서열 번호 12, 13, 14, 15 및 16으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 프레임워크 영역 2(FR2) 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 프레임워크 서열은 서열 번호 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23 및 24로 이루어지는 군으로부터 선택되는 프레임워크 영역 3(FR3) 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 프레임워크 서열은 서열 번호 25 및 26으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 프레임워크 영역 4(FR4) 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 프레임워크 서열은 서열 번호 7, 8, 9, 10 및 11로 이루어지는 군으로부터 선택되는 FR1 서열; 서열 번호 12, 13, 14, 15 및 16으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 FR2 서열; 서열 번호 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23 및 24로 이루어지는 군으로부터 선택되는 FR3 서열; 및 서열 번호 25 및 26으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 FR4 서열을 포함한다.
일부 실시양태에서, 경쇄 가변 영역은 프레임워크 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 프레임워크 서열의 적어도 일부는 인간 프레임워크 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 프레임워크 서열의 적어도 일부는 인간 컨센서스 프레임워크 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 프레임워크 서열은 서열 번호 27, 28 및 29로 이루어지는 군으로부터 선택되는 프레임워크 영역 1(FR1) 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 프레임워크 서열은 서열 번호 30 및 31로 이루어지는 군으로부터 선택되는 프레임워크 영역 2(FR2) 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 프레임워크 서열은 서열 번호 32 및 33으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 프레임워크 영역 3(FR3) 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 프레임워크 서열은 서열 번호 34 및 35로 이루어지는 군으로부터 선택되는 프레임워크 영역 4(FR4) 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 프레임워크 영역은 서열 번호 27, 28 및 29로 이루어지는 군으로부터 선택되는 FR1 서열; 서열 번호 30 및 31로 이루어지는 군으로부터 선택되는 FR2 서열; 서열 번호 32 및 33으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 FR3 서열; 및 서열 번호 34 및 35로 이루어지는 군으로부터 선택되는 FR4 서열을 포함한다.
일부 실시양태에서, 단리된 항-PD-L1 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 서열 번호 45에 대해 적어도 약 90%의 서열 동일성을 갖는 중쇄 가변 도메인 및/또는 서열 번호 46에 대해 적어도 약 90%의 서열 동일성을 갖는 경쇄 가변 도메인을 포함한다. 일부 실시양태에서, 단리된 항-PD-L1 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 서열 번호 45를 포함하는 중쇄 가변 도메인 및/또는 서열 번호 46을 포함하는 경쇄 가변 도메인을 포함한다.
일부 실시양태에서, 항체는 모노클로날 항체이다. 일부 실시양태에서, 항체는 키메라, 인간화 또는 인간 항체이다.
일부 실시양태에서, 단리된 항-PD-L1 항체, 또는 그의 항원 결합 단편은 서열 번호 36, 37, 38, 39, 40, 41 또는 42 중 어느 하나에 대해 적어도 90%의 서열 동일성을 갖는 중쇄 가변 도메인 및/또는 서열 번호 43 또는 44 중 어느 하나에 대해 적어도 90%의 서열 동일성을 갖는 경쇄 가변 도메인을 포함한다. 일부 실시양태에서, 단리된 항-PD-L1 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 서열 번호 36, 37, 38, 39, 40, 41 또는 42 중 어느 하나를 포함하는 중쇄 가변 도메인 및/또는 서열 번호 43 또는 44 중 어느 하나를 포함하는 경쇄 가변 도메인을 포함한다. 일부 실시양태에서, 항체는 (i) 서열 번호 36, 37, 38, 39, 40, 41 또는 42 중 어느 하나를 포함하는 중쇄 가변 도메인 및/또는 서열 번호 43 또는 44 중 어느 하나를 포함하는 경쇄 가변 도메인을 포함하는 항-PD-L1 항체와 동일한 에피토프에 실질적으로 결합하거나; 또는 (ii) 서열 번호 36, 37, 38, 39, 40, 41 또는 42 중 어느 하나의 중쇄 가변 도메인, 및 서열 번호 43 또는 44 중 어느 하나의 경쇄 가변 도메인을 포함하는 항-PD-L1 항체와 동일한 에피토프에 결합하기 위해 경쟁한다. 일부 실시양태에서, 항-PD-L1 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 (a) 서열 번호 36, 37, 38, 39, 40, 41 또는 42 중 어느 하나의 중쇄 가변 도메인, 및 서열 번호 43 또는 44 중 어느 하나의 경쇄 가변 도메인을 포함하는 항체를 발현하는 세포를 배양하고; (b) 세포로부터 또는 세포가 배양된 세포 배양 배지로부터 항체를 단리하는 과정에 의해 생산된다. 일부 실시양태에서, 항체는 모노클로날 항체이다. 일부 실시양태에서, 항체는 키메라, 인간화 또는 인간 항체이다.
일부 실시양태에서, 항체 또는 항원 결합 단편은 단일특이적이다. 일부 실시양태에서, 항체 또는 항원 결합 단편은 이중특이적이다. 일부 실시양태에서, 항체 또는 항원 결합 단편은 PD-L1 단백질 및 세포 표면 단백질에 결합한다. 일부 실시양태에서, 세포 표면 단백질은 CD20, EGFR, HER2, CTLA-4, TIM3, LAG3, VISTA 및 TIGIT로 이루어지는 군으로부터 선택된다. 일부 실시양태에서, 항체 또는 항원 결합 단편은 다중특이적이다. 일부 실시양태에서, 항체 또는 항원 결합 단편은 PD-L1 단백질 및 하나 이상의 세포 표면 단백질에 결합한다. 일부 실시양태에서, 세포 표면 단백질은 CD20, EGFR, HER2, CTLA-4, TIM3, LAG3, VISTA 및 TIGIT로 이루어지는 군으로부터 선택된다.
일부 실시양태에서, 항원 결합 단편은 Fab, Fab', F(ab)2, F(ab')2, Fv, scFv 및 단일 도메인 항체로 이루어지는 군으로부터 선택된다. 일부 실시양태에서, 항체는 카파 경쇄 또는 람다 경쇄를 포함한다. 일부 실시양태에서, 항체는 IgG, IgM, IgA, IgD 또는 IgE 이소형이다. 일부 실시양태에서, 항체는 IgG 이소형이고, 항체는 IgG1, IgG2, IgG3 및 IgG4로 이루어지는 군으로부터 선택되는 하위클래스이다. 일부 실시양태에서, 항체는 IgM 이소형이다. 일부 실시양태에서, 항체는 J 사슬을 포함한다. 일부 실시양태에서, 항체는 IgA 이소형이고, 여기서 항체는 IgA1 및 IgA2로 이루어지는 군으로부터 선택되는 하위클래스이다. 일부 실시양태에서, 항체는 J 사슬을 포함한다. 일부 실시양태에서, 항체는 J 사슬을 포함하는 IgG/IgM 또는 IgG/IgA 하이브리드 항체이다. 일부 실시양태에서, J 사슬은 외인성 결합 모이어티를 포함하는 변형된 J 사슬이다. 일부 실시양태에서, 외인성 결합 모이어티는 항체, 항체의 항원 결합 단편, 항체-약물 접합체, 항체 유사 분자, 항체 유사 분자의 항원 결합 단편, 가용성 및 막 결합된 단백질, 리간드 및 수용체로 이루어지는 군으로부터 선택된다. 일부 실시양태에서, 외인성 잔기는 항체의 항원 결합 단편이고, Fab, Fab', F(ab)2, F(ab')2, Fv, scFv 및 단일 도메인 항체로 이루어지는 군으로부터 선택된다. 일부 실시양태에서, 항원 결합 단편은 scFv이다.
일부 실시양태에서, 외인성 결합 모이어티는 T 세포 신호전달 경로에 영향을 미친다. 일부 실시양태에서, 외인성 결합 모이어티는 T 세포 억제 신호전달 경로를 길항한다. 일부 실시양태에서, 외인성 결합 모이어티는 CTLA-4, PD-1, TIM3, LAG3, BTLA, VISTA 및 TIGIT로 이루어지는 군으로부터 선택되는 세포 표면 단백질에 결합한다. 일부 실시양태에서, 외인성 결합 모이어티는 알부민 단백질 또는 알부민 단백질의 단편에 결합한다. 일부 실시양태에서, 외인성 결합 모이어티는 알부민 결합 펩티드를 포함한다. 일부 실시양태에서, 외인성 결합 모이어티는 알부민 결합 항체 단편을 포함한다. 일부 실시양태에서, 알부민 결합 항체 단편은 Fab, scFv, VHH, scFab 및 dAb로 이루어지는 군으로부터 선택된다. 일부 실시양태에서, 외인성 결합 모이어티는 FcRn 결합 펩티드를 포함한다. 일부 실시양태에서, 외인성 결합 모이어티는 FcRn 결합 항체 단편을 포함한다. 일부 실시양태에서, FcRn 결합 항체 단편은 Fab, scFv, VHH, scFab 및 dAb로 이루어지는 군으로부터 선택된다. 일부 실시양태에서, 외인성 결합 모이어티는 Fc 도메인을 포함한다.
본 발명의 측면은 외인성 결합 모이어티를 포함하는 변형된 J 사슬을 포함하는 IgM, IgA, IgG/IgM 또는 IgG/IgA 항체 또는 항원 결합 단편을 포함하고, 여기서 항체는 세포 표면 단백질에 결합하며, 외인성 결합 모이어티는 본원에서 설명되는 항-PD-L1 항체 또는 항원 결합 단편을 포함한다. 일부 실시양태에서, 세포 표면 단백질은 CD20, EGFR, HER2, CTLA-4, PD-1, TIM3, LAG3, BTLA, VISTA 및 TIGIT로 이루어지는 군으로부터 선택된다.
일부 실시양태에서, 외인성 결합 모이어티는 이펙터 세포에 결합한다. 일부 실시양태에서, 이펙터 세포는 T 세포, 자연 살해 세포(NK), 대식세포 및 호중구로 이루어지는 군으로부터 선택된다. 일부 실시양태에서, 이펙터 세포는 T 세포이다. 일부 실시양태에서, 외인성 결합 모이어티는 T 세포 상의 CD3 단백질(예를 들어, CD3ε 단백질)에 결합한다. 일부 실시양태에서, 이펙터 세포는 NK 세포이다. 일부 실시양태에서, 외인성 결합 모이어티는 CD16, CD64 및 NKG2D로 이루어지는 군으로부터 선택되는 NK 세포 상의 표적에 결합한다. 일부 실시양태에서, 이펙터 세포는 대식세포이다. 일부 실시양태에서, 외인성 결합 모이어티는 대식세포 상의 CD14에 결합한다. 일부 실시양태에서, 이펙터 세포는 호중구이다. 일부 실시양태에서, 외인성 결합 모이어티는 호중구 상의 CD16b 또는 CD177에 결합한다.
일부 실시양태에서, 항체 또는 항원 결합 단편은 PD-L1 길항제이다. 일부 실시양태에서, 항체 또는 항원 결합 단편은 PD-L1 신호전달 경로를 길항한다. 일부 실시양태에서, 항체 또는 항원 결합 단편은 PD-L1 단백질과 PD-1 단백질 사이의 상호작용을 길항한다. 일부 실시양태에서, 항체 또는 항원 결합 단편은 PD-L1 단백질과 PD-1 단백질 사이의 결합을 억제한다. 일부 실시양태에서, 항체 또는 항원 결합 단편은 PD-L1 단백질과 PD-1 단백질 사이의 결합을 차단한다. 일부 실시양태에서, 항체 또는 항원 결합 단편은 PD-L1 단백질에 결합하고, PD-1 단백질의 하나 이상의 기능을 억제한다.
본 발명의 측면은 본원에서 설명되는 항체의 중쇄 및/또는 경쇄를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 본 발명의 측면은 본원에서 설명되는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터를 포함한다. 본 발명의 측면은 본원에서 설명되는 벡터를 포함하는 숙주 세포를 포함한다. 일부 실시양태에서, 숙주 세포는 원핵 세포이다. 일부 실시양태에서, 숙주 세포는 진핵 세포이다.
본 발명의 측면은 본원에서 설명되는 항-PD-L1 항체를 포함하는 키트를 포함한다.
본 발명의 측면은 단리된 항-PD-L1 항체를 생산하는 방법을 포함하고, 상기 방법은 본원에서 설명되는 항-PD-L1 항체의 중쇄 및/또는 경쇄를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 핵산으로 숙주 세포를 형질감염시키는 단계; 항-PD-L1 항체를 생산하기 적합한 조건 하에 숙주 세포를 배양하는 단계; 및 항-PD-L1 항체를 단리하는 단계를 포함한다.
본 발명의 측면은 PD-1 단백질의 하나 이상의 기능을 억제하는 방법을 포함하고, 상기 방법은 PD-L1 단백질을 본원에서 설명되는 항체와 접촉시키는 단계를 포함한다. 일부 실시양태에서, 방법은 시험관 내에서 수행된다. 일부 실시양태에서, 방법은 포유동물 대상체의 생체 내에서 수행된다.
본 발명의 측면은 PD-L1을 발현하는 종양 세포의 성장을 억제하는 방법을 포함하고, 상기 방법은 본원에서 설명되는 항체를 종양 세포를 갖는 대상체에게 투여하여 (i) 종양 세포의 성장 또는 증식을 억제하거나 또는 (ii) 종양 세포의 사멸을 유도하는 단계를 포함한다.
본 발명의 측면은 본원에서 설명되는 항체 및 약학적으로 허용되는 담체를 포함하는 약학 조성물을 포함한다.
본 발명의 측면은 암을 갖는 대상체를 치료하는 방법을 포함하고, 상기 방법은 본원에서 설명되는 유효량의 약학 조성물을 대상체에게 투여하는 것을 포함한다. 본 발명의 측면은 암을 치료하기 위한 의약의 제조에서의 본원에서 설명되는 항체의 용도를 포함한다. 일부 실시양태에서, 암은 혈액암 또는 상피암이다. 일부 실시양태에서, 혈액암은 백혈병, 림프종, 골수종 또는 골수이형성 증후군이다. 일부 실시양태에서, 백혈병은 급성 골수성 백혈병, 급성 림프모구성 백혈병, 만성 골수성 백혈병 또는 만성 림프구성 백혈병이다. 일부 실시양태에서, 림프종은 호지킨(Hodgkin) 림프종 또는 비호지킨 림프종이다. 일부 실시양태에서, 상피암은 비소세포 폐암, 방광암, 신장암, 간암, 결직장암, 난소암, 위암, 식도암, 췌장암, 갑상선암, 유방암 또는 비인두암이다. 일부 실시양태에서, 유방암은 호르몬 수용체 음성 또는 삼중 음성 유방암이다. 일부 실시양태에서, 암은 흑색종이다. 일부 실시양태에서, 암은 교아세포종이다.
일부 실시양태에서, 약학 조성물 또는 의약은 유효량의 제2 치료제를 추가로 포함한다.
본 발명의 측면은 샘플에서 PD-L1 폴리펩티드의 존재를 결정하기 위해 샘플을 스크리닝하는 방법을 포함하고, 상기 방법은 샘플을 본원에서 설명되는 항-PD-L1 항체와 접촉시키는 단계; 및 항-PD-L1 항체가 샘플 내의 PD-L1 폴리펩티드에 결합하는지의 여부를 결정하는 단계를 포함하고, 상기 결합의 존재는 상기 샘플 내의 PD-L1 폴리펩티드의 존재를 나타낸다. 일부 실시양태에서, 항-PD-L1 항체가 검출 가능하게 표지되고, 항-PD-L1 항체가 PD-L1 폴리펩티드에 결합하는지의 여부를 결정하는 단계는 검출 가능한 표지를 검출하는 단계를 포함한다.
도 1은 간접 ELISA 검정의 개략도이다.
도 2는 항-인간 PD-L1 항체의 반응성 및 특이성을 결정하기 위해 사용된 유동 세포 계측 검정의 개략도이다.
도 3에서 패널 A는 양성 및 음성 대조군 항체와 함께 간접 ELISA에서 3개의 하이브리도마 상청액의 활성을 나타내는 그래프이다. 패널 B는 양성 및 음성 대조군과 함께 하이브리도마 상청액의 FACS 스크리닝으로부터의 예시적인 데이터를 보여주는 그래프이다.
도 4는 PD-L1 항원을 과다발현하는 CHO 세포의 존재 하에 억제되고 PD-1을 과다발현하는 주르카트(Jurkat) 기반 리포터 세포주에서 루시퍼라제의 NFAT 유도 발현에 기초한 PD-1/PD-L1 차단 검정의 개략도이다.
도 5에서, 패널 A는 PD-1/PD-L1 차단 검정에서 하이브리도마 상청액의 스크리닝으로부터의 예시적인 데이터를 보여주는 그래프이다. 패널 B는 하이브리도마 스크리닝 전략 및 결과의 개략도이다.
도 6에서, 패널 A는 3C5-2G12 경쇄로부터의 NGS 유도 서열의 분포를 보여주는 막대 그래프이다. 패널 B는 3C5-2G12 중쇄로부터의 NGS 유도 서열의 분포를 나타내는 막대 그래프이다. 모든 중쇄가 동일한 수준으로 발현되지는 않는다.
도 7은 쿠마시 염색 하이브리드 겔(좌측) 및 항-J 사슬 항체를 사용한 웨스턴 블롯의 이미지이다. 이미지는 완전히 조립된 IgM 오량체의 형성 및 J 사슬의 혼입을 보여준다.
도 8은 3C5.2G12 IgM, 3C5.2G12 IgM + J 사슬 및 3C5.2G12 IgG 항체 포맷으로부터의 PD-L1 차단 데이터를 보여주는 그래프이다.
도 9에서, 패널 A는 Cyno PD-L1과의 3C5.2G12 교차 반응성을 보여주는 그래프이다. 패널 B는 마우스 PD-L1과의 3C5.2G12 교차 반응성이 결여된 것을 보여주는 그래프이다. 패널 C는 인간 PD-L2와의 3C5.2G12 교차 반응성이 결여된 것을 보여주는 그래프이다.
도 10은 3C5.2G12 IgM 및 3C5.2G12 IgG 포맷 항체뿐만 아니라, IgG h3C5-1, IgG h3C5-2, IgG h3C5-3 및 IgG h3C5-4 항체로부터의 PD-L1 차단 데이터를 보여주는 그래프이다.
도 11은 인간 PD-L1을 발현하는 재조합 CHO 세포에 대한, 형광 표지된 항-PD-L1 항체 S70 IgG(패널 A) 또는 형광 표지된 항-PD-L1 항체 3C5(패널 B)의 결합을 보여주고, 여기서 세포는 표지되지 않은 S70(닫힌 정사각형) 또는 3C5(닫힌 원)의 연속 희석액과 이전에 결합 처리되었다. 결과는 S70이 3C5의 결합을 차단할 수 있고 3C5가 S70의 결합을 차단할 수 있음을 보여준다.
발명의 상세한 설명
일반적인 기술
본 발명의 실시는 달리 지시되지 않는 한, 관련 기술 분야의 범위 내에 포함되는 분자 생물학(재조합 기술 포함), 미생물학, 세포 생물학, 생화학 및 면역학의 통상적인 기술을 사용할 것이다. 이러한 기술은 예를 들어 다음 문헌에 상세하게 설명되어 있다: ["Molecular Cloning: A Laboratory Manual", second edition (Sambrook et al., 1989)]; ["Oligonucleotide Synthesis" (M. J. Gait, ed., 1984)]; ["Monoclonal Antibodies: Principles and Practice" (Goding, Academic Press, 3rd Edition, 1996)]; ["Antibody Engineering" (R.E. Kontermann & S. Dubel, 2013)]; ["Animal Cell Culture" (R. I. Freshney, ed., 1987)]; ["Methods in Enzymology" (Academic Press, Inc.)]; ["Current Protocols in Molecular Biology" (F. M. Ausubel et al., eds., 1987] 및 주기적인 최신판; ["PCR: The Polymerase Chain Reaction", (Mullis et al., ed., 1994)]; ["A Practical Guide to Molecular Cloning" (Perbal Bernard V., 1988)]; ["Phage Display: A Laboratory Manual" (Barbas et al., 2001)].
관련 기술 분야의 통상의 기술자는 본 발명의 실시에 사용될 수 있는, 본원에서 설명되는 것과 유사하거나 동등한 많은 방법 및 물질을 인식할 것이다. 실제로, 본 발명은 설명된 방법 및 재료로 결코 제한되지 않는다. 본 발명의 목적을 위해, 하기 용어가 아래에서 정의된다.
정의
본 명세서를 해석하기 위해, 다음 정의가 적용될 것이고, 적절한 경우 단수로 사용된 용어는 복수형을 포함할 것이고 그 반대도 마찬가지이다. 제시된 임의의 정의가 본원에 참고로 포함된 임의의 문헌과 상충되는 경우, 아래에서 제시되는 정의가 우선한다.
본원에서 교환 가능하게 사용되는 용어 "PD-L1" 및 "프로그램된 세포 사멸 단백질 1 리간드 1"은 달리 나타내지 않으면, 포유동물, 예컨대 영장류(예를 들어, 인간) 및 설치류(예를 들어, 마우스 및 래트)를 비롯한 임의의 척추동물 공급원으로부터의 임의의 PD-L1을 의미한다. "인간 PD-L1"은 구체적으로 서열 번호 48(UniProtKB-Q9NZQ7)의 290개 아미노산 길이의 PD-L1 인간 폴리펩티드를 포함한다.
용어 "PD-L1"은 처리되지 않은 "전장" PD-L1뿐만 아니라, 세포 내에서의 처리로 인해 생성되는 PD-L1의 임의의 형태를 포함한다. 상기 용어는 또한 PD-L1의 자연 발생 변이체, 예를 들어 스플라이스 변이체, 대립유전자 변이체 및 이소형을 포함한다. 본원에서 설명되는 PD-L1 폴리펩티드는 인간 조직 유형 또는 또 다른 공급원과 같은 다양한 공급원 중 임의의 것으로부터 단리되거나, 또는 재조합 또는 합성 방법에 의해 제조될 수 있다. "천연 서열 PD-L1 폴리펩티드"는 자연으로부터 유래되는 상응하는 PD-L1 폴리펩티드와 동일한 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드를 포함한다. 이러한 천연 서열 PD-L1 폴리펩티드는 자연으로부터 단리될 수 있거나, 또는 재조합 또는 합성 수단에 의해 생산될 수 있다. 용어 "천연 서열 PD-L1 폴리펩티드"는 구체적으로 자연 발생하는 말단 절단된 또는 분비된 형태의 PD-L1(예를 들어, 세포외 도메인 서열), 자연 발생 변이체 형태(예를 들어, 선택적 스플라이싱된 형태) 및 폴리펩티드의 자연 발생 대립유전자 변이체를 포함한다. 본 발명의 특정 실시양태에서, 본원에서 개시되는 천연 서열 PD-L1 폴리펩티드는 PD-L1의 전장 아미노산 서열을 포함하는 성숙 또는 전장 천연 서열 폴리펩티드이다. 용어 "PD-L1"은 아미노산 1 내지 18에 N 말단 신호 펩티드가 있거나 없는, 서열 번호 48의 인간 PD-L1 폴리펩티드를 포함하고 이로 제한되지 않는 천연 인간 PD-L1 폴리펩티드를 구체적으로 포함한다.
본원에서 교환 가능하게 사용되는 용어 "PD-1" 및 "프로그램된 세포 사멸 단백질 1"은 달리 나타내지 않으면, 포유동물, 예컨대 영장류(예를 들어, 인간) 및 설치류(예를 들어, 마우스 및 래트)를 비롯한 임의의 척추동물 공급원으로부터의 임의의 PD-1을 의미한다. "인간 PD-1"은 구체적으로 UniProtKB - Q15116에 제시된 288개 아미노산 길이의 PD-1 인간 폴리펩티드를 포함한다.
용어 "PD-1"은 처리되지 않은 "전장" PD-1뿐만 아니라, 세포 내에서의 처리로 인해 생성되는 PD-1의 임의의 형태를 포함한다. 상기 용어는 또한 PD-1의 자연 발생 변이체, 예를 들어 스플라이스 변이체, 대립유전자 변이체 및 이소형을 포함한다. 본원에서 설명되는 PD-1 폴리펩티드는 인간 조직 유형 또는 또 다른 공급원과 같은 다양한 공급원 중 임의의 것으로부터 단리되거나, 또는 재조합 또는 합성 방법에 의해 제조될 수 있다. "천연 서열 PD-1 폴리펩티드"는 자연으로부터 유래되는 상응하는 PD-1 폴리펩티드와 동일한 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드를 포함한다. 이러한 천연 서열 PD-1 폴리펩티드는 자연으로부터 단리될 수 있거나, 또는 재조합 또는 합성 수단에 의해 생산될 수 있다. 용어 "천연 서열 PD-1 폴리펩티드"는 구체적으로 자연 발생하는 말단 절단된 또는 분비된 형태의 PD-1(예를 들어, 세포외 도메인 서열), 자연 발생 변이체 형태(예를 들어, 선택적 스플라이싱된 형태) 및 폴리펩티드의 자연 발생 대립유전자 변이체를 포함한다. 본 발명의 특정 실시양태에서, 본원에서 개시되는 천연 서열 PD-1 폴리펩티드는 PD-1의 전장 아미노산 서열을 포함하는 성숙 또는 전장 천연 서열 폴리펩티드이다. 용어 "PD-1"은 N 말단 신호 펩티드가 있거나 없는, UniProtKB - Q15116의 인간 PD-1 폴리펩티드를 포함하고 이로 제한되지 않는 천연 인간 PD-1 폴리펩티드를 구체적으로 포함한다.
"에피토프"는 단일 항체 분자가 결합하는 항원 분자의 표면 상의 부위이다. 일반적으로, 항원은 여러 개의 또는 많은 상이한 에피토프를 갖고, 많은 상이한 항체와 반응한다. 이 용어는 구체적으로 선형 에피토프 및 입체형태적 에피토프를 포함한다.
"에피토프 매핑"은 그의 표적 항원 상의 항체의 결합 부위 또는 에피토프를 확인하는 과정이다. 항체 에피토프는 선형 에피토프 또는 입체형태적 에피토프일 수 있다. 선형 에피토프는 단백질에서 아미노산의 연속적인 서열에 의해 형성된다. 입체형태적 에피토프는 단백질 서열에서 불연속적이지만 단백질을 그의 3차원 구조로 접을 때 함께 회합되는 아미노산으로 형성된다.
본원에서 정의되는 "에피토프 비닝(binning)"은 항체가 인식하는 에피토프에 기초하여 항체를 분류하는 과정이다. 보다 구체적으로, 에피토프 비닝은 항체의 에피토프 인식 특성에 기초하여 항체를 클러스터링하기 위한 컴퓨터 이용 과정과 조합하여 상이한 항체의 에피토프 인식 특성을 구별하고 별개의 결합 특이성을 갖는 항체를 확인하는 방법 및 시스템을 포함한다.
항체는 두 항체가 동일하거나 입체적으로 중첩되는 에피토프를 인식할 때 참조 항체와 "본질적으로 동일한 에피토프"에 결합한다. 2개의 에피토프가 동일하거나 입체적으로 중첩되는 에피토프에 결합하는지의 여부를 결정하기 위해 가장 널리 사용되는 신속한 방법은 경쟁 검정이고, 이것은 표지된 항원 또는 표지된 항체를 사용하여 매우 많은 상이한 포맷으로 구성될 수 있다. 일반적으로, 항원은 96웰 플레이트 상에 고정화되고, 표지된 항체의 결합을 차단하는 비표지된 항체의 능력은 방사성 또는 효소 표지를 사용하여 측정된다. 바람직하게는, 이러한 항체는 본질적으로 GFSLTSYDIS(서열 번호 4)의 HVR-H1; VIWTGVGTN(서열 번호 5)의 HVR-H2 서열; 및 DPYYYGMDY(서열 번호 6)의 HVR-H3 서열을 포함하는 항체에 의해 결합된 것과 동일한 PD-L1 에피토프에 결합한다. 한 실시양태에서, 이러한 항체는 서열 번호 4의 서열에 대해 적어도 약 99%의 서열 동일성을 갖는 HVR-H1 서열, 서열 번호 5의 서열에 대해 적어도 약 99%의 서열 동일성을 갖는 HVR-H2 서열, 및 서열 번호 6에 대해 적어도 약 99%의 서열 동일성을 갖는 HVR-H3 서열을 포함할 것이다. 이러한 맥락에서, "PD-L1"은 바람직하게는 N 말단 신호 펩티드가 있거나 없는, 서열 번호 48의 인간 PD-L1 폴리펩티드이다.
본원에서 사용되는 아미노산 잔기/위치의 "변형"은 출발 아미노산 서열과 비교한 1차 아미노산 서열의 변화를 의미하고, 상기 변화는 상기 아미노산 잔기/위치를 포함하는 서열 변경에 기인한다. 예를 들어, 전형적인 변형은 잔기를(또는 상기 위치에서) 또 다른 아미노산으로 치환하는 것(예를 들어, 보존적 또는 비보존적 치환), 상기 잔기/위치에 인접한 하나 이상의(일반적으로 5 또는 3개 미만의) 아미노산의 삽입 및 상기 잔기/위치의 결실을 포함한다. "아미노산 치환" 또는 이의 변형 표현은 미리 결정된(출발) 아미노산 서열의 존재하는 아미노산 잔기를 상이한 아미노산 잔기로 대체하는 것을 의미한다. 일반적으로, 바람직하게는, 변형은 출발(또는 "야생형") 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드와 비교하여 변이체 폴리펩티드의 적어도 하나의 물리적 또는 생화학적 활성의 변화를 초래한다. 예를 들어, 항체의 경우, 변경되는 물리적 또는 생화학적 활성은 표적 분자에 결합 친화도, 결합 능력 및/또는 결합 효과일 수 있다.
용어 "항체"는 모노클로날 항체(면역글로불린 Fc 영역을 갖는 전장 항체 포함), 단일 사슬 분자, 및 항체 단편(예를 들어, Fab, F(ab')2 및 Fv)을 포함한다. 용어 "면역글로불린"(Ig)은 본원에서 "항체"와 교환 가능하게 사용된다. 기본적인 4 사슬 항체 단위는 2개의 동일한 경쇄(L) 및 2개의 동일한 중쇄(H)로 구이루어진 이종사량체 당단백질이다. 다르게 언급하지 않는 한, 용어 "항체"는 본원에서 가장 넓은 의미로 사용되고, 구체적으로는 IgG, IgM, IgA, IgD 및 IgE 항체를 포함하는 항체의 모든 이소형, 하위클래스 및 형태, 및 이들의 단편, 바람직하게는 항원 결합 단편을 포함한다. 본원에서 바람직한 항체는 IgG, IgM 및 IgA 항체 및 그의 항원 결합 단편을 포함한다. 일부 실시양태에서, IgM과 같은 제1 이소형의 항체는 하이브리드 항체를 생산하기 위해 IgG와 같은 또 다른 이소형으로부터의 서열을 포함하도록 변형될 수 있고, 하이브리드 항체의 비제한적인 예는 IgG/IgM 및 IgG/IgA 하이브리드 항체를 포함한다.
달리 언급하지 않는 한, 용어 "항체"는 구체적으로 자연 발생 변이체를 포함하는, 천연 인간 및 비인간 IgG1, IgG2(IgG2a, IgG2b), IgG3, IgG4, IgE, IgA, IgD 및 IgM 항체를 포함한다. 따라서, 예를 들어, 인간 IgM 서열은 GenBank 등록 번호 X14940.1 하에 이용가능하고, 변이체는 GenBank CAB37838.1, CAC20458.1, AFM37312.1, X57331.1, 및 J00260.1로 보고되었다.
폴리펩티드(예를 들어, 항체 또는 J 사슬)를 지칭할 때 용어 "천연"은 그의 제조 방식에 상관없이 자연에서 발생하는 서열을 갖는 폴리펩티드를 지칭하기 위해 본원에서 사용된다. 따라서, 용어 "천연" 및 "천연 서열"은 본원에서 교환 가능하게 사용되고, 자연에서 발견되는 서열을 갖는 재조합 폴리펩티드를 명시적으로 포함한다.
본원에서 사용되는 용어 "모노클로날 항체"는 실질적으로 균질한 항체의 집단으로부터 수득된 항체를 의미한다. 즉, 집단을 이루는 개개의 항체는 소량으로 존재할 수 있는 가능한 자연 발생 돌연변이를 제외하고는 동일하다. 모노클로날 항체는 매우 특이적이며, 단일 항원 부위에 대해 작용한다. 또한, 전형적으로 상이한 결정기(에피토프)에 대해 작용하는 상이한 항체를 포함하는 통상적인 (폴리클로날) 항체 제제와는 대조적으로, 각각의 모노클로날 항체는 항원 상의 단일 결정기에 대해 작용한다. 수식어 "모노클로날"은 실질적으로 균질한 항체 집단으로부터 얻어진 것으로서의 항체의 특징을 나타내고, 임의의 특정 방법에 의한 항체의 생산을 필요로 하는 것으로 해석되지 않아야 한다. 예를 들어, 본 발명에 따라 사용되는 모노클로날 항체는 문헌 [Kohler et al. (1975) Nature 256:495]에서 처음 설명된 하이브리도마 방법에 의해 제조될 수 있거나, 또는 재조합 DNA 방법에 의해 제조될 수 있다(예를 들어, 미국 특허 제4,816,567호 참조). "모노클로날 항체"는 또한 예를 들어 문헌 [Clackson et al. (1991) Nature 352:624-628 and Marks et al. (1991) J. Mol . Biol. 222:581-597]에 기재된 기술을 사용하여 파지 항체 라이브러리로부터 단리될 수 있다.
본원에서 모노클로날 항체는 구체적으로 중쇄 및/또는 경쇄의 일부가 특정 종으로부터 유래한 항체의 상응하는 서열과 동일하거나 또는 이에 상동성이고 사슬(들)의 나머지는 또 다른 종으로부터 유래한 항체의 상응하는 서열과 동일하거나 또는 이에 상동성인 "키메라" 항체(면역글로불린), 및 원하는 생물학적 활성을 나타내는 상기 항체의 단편을 포함한다(미국 특허 제4,816,567호 및 문헌 [Morrison et al. (1984) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:6851-6855] 참조).
비인간(예를 들어, 뮤린) 항체의 "인간화" 형태는 비인간 면역글로불린으로부터 유래한 최소 서열을 함유하는 항체이다. 대부분의 경우, 인간화 항체는 수혜자의 초가변 영역으로부터의 잔기가 원하는 특이성, 친화도 및 능력을 갖는 비인간 종(공여자 항체), 예컨대 마우스, 래트, 토끼 또는 비인간 영장류의 초가변 영역으로부터의 잔기에 의해 대체된 인간 면역글로불린(수혜자 항체)이다. 몇몇 경우에, 인간 면역글로불린의 Fv 프레임워크 영역(FR) 잔기는 또한 상응하는 비인간 잔기에 의해 대체된다. 더구나, 인간화 항체는 수혜자 항체 또는 공여자 항체에서 발견되지 않는 잔기를 포함할 수 있다. 이 변형은 항체 성능을 추가로 개선하도록 이루어진다. 일반적으로, 인간화 항체는 적어도 1개, 통상적으로 2개의 가변 도메인을 실질적으로 전부 포함할 것이고, 초가변 루프의 전부 또는 실질적으로 전부가 비인간 면역글로불린의 것에 상응하고, FR 영역의 전부 또는 실질적으로 전부는 인간 면역글로불린 서열의 것이다. 인간화 항체는 또한 면역글로불린 불변 영역(Fc)의 적어도 일부, 통상적으로 인간 면역글로불린의 것을 선택적으로 포함할 것이다. 추가의 상세한 내용에 대해서는, 문헌 [Jones et al. (1986) Nature 321:522-525]; [Riechmann et al. (1988) Nature 332:323-329]; 및 [Presta (1992) Curr . Op. Struct . Biol . 2:593-596]을 참조한다.
본원에서 "단리된" 항체는 확인되고, 재조합 숙주 세포에서 그의 천연 환경의 성분으로부터 분리되고/되거나 회수된 것이다. 그의 천연 환경의 오염물질 성분은 항체의 진단 또는 치료 용도를 방해하는 물질이고, 효소, 호르몬, 및 다른 단백질성 또는 비단백질성 용질, 및 원치않는 제조 부산물을 포함할 수 있다. 바람직한 실시양태에서, 단리된 항체는 본원에서 (1) SDS-PAGE 또는 SEC-HPLC 방법에 의해 결정시에 95 중량% 초과, 또는 98 중량% 초과, 또는 99 중량% 초과로, (2) 아미노산 서열분석기의 사용에 의해 N 말단 또는 내부 아미노산 서열의 적어도 15개의 잔기를 얻기에 충분한 정도로, 또는 (3) 쿠마시 블루 또는 바람직하게는 은 염색을 이용하여 환원 또는 비환원 조건 하에 SDS-PAGE에 의해 균일한 수준으로 정제될 것이다. 보통, 단리된 항체는 적어도 하나의 정제 단계에 의해 제조될 것이다.
IgG의 경우, 4 사슬 단위는 일반적으로 약 150,000달톤이다. 각각의 L 사슬은 하나의 공유 디술피드 결합에 의해 H 사슬에 연결되고, 2개의 H 사슬은 H 사슬 이소형에 따라 하나 이상의 디술피드 결합에 의해 서로 연결된다. 각각의 H 및 L 사슬은 또한 규칙적으로 이격된 사슬내 디술피드 다리를 갖는다. 각각의 H 사슬은 N-말단에 가변 도메인(VH), 이어서 α 및 γ 사슬 각각에 대해 3개의 불변 도메인(CH), 및 μ 및 ε 이소형에 대해 4개의 CH 도메인을 갖는다. 각각의 L 사슬은 N 말단에 가변 도메인(VL), 이어서 그의 다른 말단에 불변 도메인을 갖는다. VL은 VH와 정렬되고, CL은 중쇄(CH1)의 제1 불변 도메인과 정렬된다. 특정 아미노산 잔기는 경쇄와 중쇄 가변 도메인 사이의 계면을 형성한다고 여겨진다. VH와 VL의 쌍 형성은 단일 항원 결합 부위를 함께 형성한다.
IgM은 다수의 면역글로불린이 디술피드 결합에 의해 함께 공유 연결된 중합체를 형성하는 당단백질이다. IgM은 대부분 오량체로서 존재하지만, 또한 육량체로도 존재하고, 따라서 10개 또는 12개의 항원 결합 부위를 함유한다. 오량체 형태는 통상적으로 J 사슬이라 불리는 추가의 폴리펩티드를 함유하지만, J 사슬의 부재 하에서도 만들어질 수 있다. 오량체 IgM 분자는 대략 970 kDa의 분자량을 갖는다. 그의 중합체 성질로 인해, IgM은 높은 결합력을 보유하고, 보체 활성화에서 특히 효과적이다. IgG에서와 달리, IgM 단량체에서의 중쇄는 1개의 가변 도메인 및 4개의 불변 도메인으로 이루어진다. IgM 불변 도메인은 본원에서 CM1 또는 Cμ1, CM2 또는 Cμ2, CM3 또는 Cμ3, 및 CM4 또는 Cμ4로 지칭되고, 여기서 "CM" 및 Cμ" 지칭은 교환 가능하게 사용된다.
용어 "IgM"은 본원에서 가장 넓은 의미로 사용되며, 구체적으로는 단일특이적 및 다중특이적(이중특이적 포함) IgM 분자, 예컨대 그의 전체 개시내용이 본원에 명백하게 참고로 포함된 PCT 출원 PCT/US2014/054079에 개시된 다중특이적 IgM 결합 분자를 포함한다.
용어 "IgM 결합 단위" 또는 "IgM 항체 결합 단위"는 가장 넓은 의미로 사용되고, 구체적으로 연관 항체 경쇄 가변 도메인(VL) 서열 없이 또는 이 서열과 함께 표적(예를 들어, 항원)에 결합하는 가변 도메인 서열(VH)에 융합된 적어도 Cμ4 불변 도메인을 포함하는, IgM 항체 중쇄 불변 영역 폴리펩티드를 포괄한다.
용어 "이중특이적 IgM 결합 단위" 또는 "이중특이적 IgM 항체 결합 단위"는 가장 넓은 의미로 사용되고, 구체적으로 가변 도메인 서열(VH)에 융합된 적어도 Cμ4 불변 도메인을 포함하는 IgM 항체 중쇄 불변 영역 폴리펩티드의 쌍을 포괄하고, 각각의 가변 도메인 서열은 연관 항체 경쇄 가변 도메인(VL) 서열과 함께 또는 이 서열 없이 상이한 표적에 결합한다. 한 실시양태에서, 이중특이적 IgM 항체는 2개의 VHVL 항원 결합 영역을 포함하고, 각각의 영역은 1개의 항원 상의 상이한 에피토프 또는 2개의 상이한 항원 상의 에피토프에 결합할 수 있다. 이중특이적 IgM 항체 결합 단위는 단일 종으로부터의 전장일 수 있거나, 키메라 또는 인간화될 수 있다. 본 발명의 이중특이적 IgM 항체는 5개 또는 6개의 이중특이적 IgM 결합 단위를 포함하는 오량체 또는 육량체 고리 구조를 갖는다.
용어 "다중특이적 IgM"은 본원에서 가장 넓은 의미로 사용되어서, 2개 이상의 결합 특이성을 갖는 IgM 항체를 의미한다. 따라서, 용어 "다중특이적"은 적어도 2개의 단일특이적 하위단위(각각 상이한 항원(AA, BB)에 결합함), 또는 5개 또는 6개의 이중특이적 하위단위(각각 2개의 상이한 항원(AB, AB)에 결합함)를 포함하는 IgM 오량체를 포함하는, "이중특이적", 예를 들어 이중특이적 항체 또는 이중특이적 결합 단위를 포함한다. 따라서, 이중특이적 및 다중특이적 IgM 오량체는 5개의 동일한 이중특이적 결합 단위, 단일특이적 IgM 결합 단위(이들 중 적어도 2개는 상이한 결합 특이성을 가짐), 또는 이들의 임의의 조합을 포함할 수 있다.
"전장 IgM 항체 중쇄"는 N 말단에서 C 말단 방향으로 항체 중쇄 가변 도메인(VH), 항체 불변 중쇄 불변 도메인 1(CM1 또는 Cμ1), 항체 중쇄 불변 도메인 2(CM2 또는 Cμ2), 항체 중쇄 불변 도메인 3(CM3 또는 Cμ3), 및 항체 중쇄 불변 도메인 4(CM4 또는 Cμ4)으로 이루어진 폴리펩티드이다. 본원에서 정의된 바와 같은 이중특이적 전장 IgM 항체는 2개의 상이한 결합 표적(에피토프)에 특이적으로 결합하는, 각각 2개의 항원 결합 부위를 갖는 5개 또는 6개의 단량체(결합 단위)를 포함한다. 전장 항체의 중쇄 또는 경쇄의 C 말단은 중쇄 또는 경쇄의 C 말단에서의 마지막 아미노산을 의미한다. 전장 항체의 중쇄 또는 경쇄의 N 말단은 중쇄 또는 경쇄의 N 말단에서의 제1 아미노산을 의미한다.
천연 IgA는 2개의 동일한 경쇄(κ 또는 λ) 및 2개의 동일한 중쇄(α)를 포함하는 사량체 단백질이다. 인간에서, 2개의 IgA 이소형, 즉 IgA1 및 IgA2가 존재한다. IgA는 IgG와 유사하게, Cα1 도메인과 Cα2 도메인 사이의 힌지 영역과 함께 3개의 불변 도메인(CA1-CA3 또는 Cα1-Cα3)을 함유하고, 여기서 "CA" 및 "Cα" 지칭은 교환 가능하게 사용된다. 모든 IgA 이소형은 중합체 Ig 형성을 가능하게 하는, Cα3 도메인의 C 말단에 위치하는 18개의 아미노산 "꼬리 조각"을 갖는다(예를 들어, 문헌[Garcia-Pardo et al., 1981, J. Biol . Chem. 256, 11734-11738] 및 [Davis et al., 1988, Eur . J. Immunol . 18, 1001-1008] 참조). 혈청 IgA는 단량체이지만, 또한 중합할 수 있다. 그의 분비 형태에서, IgA는 꼬리 조각을 포함할 수 있고 분비 성분에 의해 회합될 수 있는, J 사슬에 의해 연결된 기본적인 4 사슬 단위를 2-5개 포함한다. IgA 항체는 IgA1 및 IgA2 하위클래스로 더 나뉠 수 있다. 용어 "IgA" 항체는 구체적으로 분비 성분이 있거나 없는 이량체 및 다량체를 포함하는 모든 하위클래스, 즉 IgA1 및 IgA2 항체, 및 상기 항체의 단편, 바람직하게는 항원 결합 단편을 포함하기 위해 사용된다. 본 발명의 목적을 위해, IgA 항체는 바람직하게는 2개의 꼬리 조각이 J 사슬에 의해 연결된 이량체이다.
용어 "IgA"는 본원에서 가장 넓은 의미로 사용되고, 구체적으로 단일특이적 및 다중특이적 IgA 분자, 예컨대 그의 전체 개시내용이 본원에 명백하게 참고로 포함된 PCT 출원 PCT/US2015/015268에 개시된 다중특이적 IgA 결합 분자를 포함한다.
용어 "다중특이적 IgA"는 2개 이상의 결합 특이성을 갖는 IgA 항체를 의미하기 위해 본원에서 가장 넓은 의미로 사용된다. 따라서, 용어 "다중특이적"은 2개의 단일특이적 하위단위(각각 상이한 항원(AA, BB)에 결합함), 또는 2개의 이중특이적 하위단위(각각 2개의 상이한 항원(AB, AB)에 결합함)를 포함하는 IgA 이량체를 포함하는, "이중특이적", 예를 들어 이중특이적 항체 또는 이중특이적 결합 단위를 포함한다.
한 실시양태에서, 이량체 다중특이적 IgA 분자는 2개의 단일특이적 결합 단위로 이루어지고, 각각의 결합 단위는 상이한 결합 표적(AA, BB)에 대한 결합 특이성을 갖는다. 또 다른 실시양태에서, 이량체 IgA 분자에서, 2개의 결합 단위 중 적어도 하나는 2개의 상이한 결합 특이성(즉, 이중특이적, 예를 들어 AA, AB 또는 AA, BC임)을 갖는다. 또 다른 실시양태에서, 2개의 결합 단위는 각각 2개의 특이성을 갖고, 이것은 동일(AB, AB) 또는 상이(예를 들어, AC, CD 또는 AB, AC)할 수 있다.
용어 "이중특이적 IgA 항체 결합 단위"는 가장 넓은 의미로 사용되고, 구체적으로 가변 도메인 서열(VH)에 융합된 적어도 CA3 불변 도메인을 포함하는 IgA 항체 중쇄 불변 영역 폴리펩티드의 쌍을 포괄하고, 각각의 가변 도메인 서열은 연관 항체 경쇄 가변 도메인(VL) 서열과 함께 또는 이 서열 없이 상이한 표적에 결합한다. 한 실시양태에서, 이중특이적 IgA 항체는 2개의 VHVL 항원 결합 영역을 포함하고, 각각의 영역은 하나의 항원 상의 상이한 에피토프 또는 2개의 상이한 항원 상의 에피토프에 결합할 수 있다. 이중특이적 IgA 항체 결합 단위는 단일 종으로부터의 전장일 수 있거나, 키메라 또는 인간화될 수 있다.
"전장 IgA 항체 중쇄"는 N 말단에서 C 말단 방향으로 항체 중쇄 가변 도메인(VH), 항체 불변 중쇄 불변 도메인 1(CA1 또는 Cα1), 항체 불변 중쇄 불변 도메인 2(CA2 또는 Cα2), 및 항체 중쇄 불변 도메인 3(CA3 또는 Cα3)으로 이루어진 폴리펩티드이다. 본 발명에 따른 이중특이적 또는 다중특이적 전장 IgA 항체는 2개의 단량체(결합 단위)를 포함하고, 이들은 각각 분비 성분을 갖거나 갖지 않으면서 단일특이적 또는 이중특이적일 수 있다. 따라서, 본 발명의 다중특이적 IgA 항체는 단일특이적 및 이중특이적 결합 단위를 포함할 수 있되, 생성된 IgA 항체는 적어도 2개의 결합 특이성을 갖는다. 전장 항체의 중쇄 또는 경쇄의 C 말단은 중쇄 또는 경쇄의 C 말단에서의 마지막 아미노산을 의미한다. 전장 항체의 중쇄 또는 경쇄의 N 말단은 중쇄 또는 경쇄의 N 말단에서의 제1 아미노산을 의미한다.
상이한 클래스의 항체의 구조 및 특성에 대한 추가의 상세한 내용에 대해서는, 예를 들어 문헌 [Basic and Clinical Immunology, 8th Edition, Daniel P. Stites, Abba I. Terr and Tristram G. Parslow (eds), Appleton & Lange, Norwalk, Conn., 1994, page 71 and Chapter 6]을 참조한다.
용어 "계면"은 본원에서 사용되는 바와 같이, 제2 항체 중쇄 불변 영역 내의 하나 이상의 "접촉" 아미노산 잔기(또는 다른 비아미노산 기)와 상호작용하는 제1 항체 중쇄 불변 영역 내의 "접촉" 아미노산 잔기(또는 다른 비아미노산 기, 예를 들어 탄수화물 기)를 포함하는 영역을 의미하도록 사용된다.
용어 "비대칭 계면"은 2개의 항체 사슬, 예컨대 제1 및 제2 IgM 중쇄 불변 영역 사이 및/또는 IgM 중쇄 불변 영역 및 그의 매치되는 경쇄 사이에 형성된 (상기 정의된 바와 같은) 계면을 의미하도록 사용되고, 여기서 제1 및 제2 사슬 내의 접촉 잔기는 상보성 접촉 잔기를 포함하도록 하는 설계에 의해 다르다. 비대칭 계면은 손잡이/홀(knob/hole) 상호작용 및/또는 염 가교 커플링(전하 교환)에 의해 및/또는 관련 기술 분야에 공지된 다른 기술, 예를 들어 그의 매치되는 경쇄에 대한 μ 중쇄의 커플링을 위한 크로스맵(CrossMab) 접근법 등에 의해 생성될 수 있다.
"동공(cavity)" 또는 "홀"은 제2 폴리펩티드의 계면로부터 오목하게 되고 따라서 제1 폴리펩티드의 인접한 계면 상의 상응하는 돌기("손잡이")를 수용하는 적어도 하나의 아미노산 측쇄를 의미한다. 동공(홀)은 원래의 계면에 존재할 수 있거나, 합성에 의해(예를 들어, 계면을 코딩하는 핵산을 변경함으로써) 도입될 수 있다. 보통, 제2 폴리펩티드의 계면을 코딩하는 핵산은 동공을 코딩하도록 변경된다. 이를 달성하기 위해, 제2 폴리펩티드의 계면 내의 적어도 하나의 "원래의" 아미노산 잔기를 코딩하는 핵산이 원래의 아미노산 잔기보다 작은 측쇄 용적을 갖는 적어도 하나의 "도입" 아미노산 잔기를 코딩하는 DNA로 대체된다. 하나 초과의 원래의 및 상응하는 도입 잔기가 존재할 수 있는 것이 이해될 것이다. 대체되는 원래의 잔기의 수에 대한 상한은 제2 폴리펩티드의 계면 내의 잔기의 총수이다. 동공의 형성을 위한 바람직한 도입 잔기는 보통 자연 발생 아미노산 잔기이고, 바람직하게는 알라닌(A), 세린(S), 트레오닌(T), 발린(V) 및 글리신(G)으로부터 선택된다. 가장 바람직한 아미노산 잔기는 세린, 알라닌 또는 트레오닌이고, 가장 바람직하게는 알라닌이다. 바람직한 실시양태에서, 돌기의 형성을 위한 원래의 잔기, 예컨대 티로신(Y), 아르기닌(R), 페닐알라닌(F) 또는 트립토판(W)은 큰 측쇄 용적을 갖는다.
"원래의" 아미노산 잔기는 원래의 잔기보다 작거나 큰 측쇄 용적을 가질 수 있는 "도입" 잔기에 의해 대체된 것이다. 도입 아미노산 잔기는 자연 발생 또는 비자연 발생 아미노산 잔기일 수 있지만, 바람직하게는 자연 발생 잔기이다.
"비자연 발생" 아미노산 잔기는 유전자 코드에 의해 코딩되지 않지만, 폴리펩티드 사슬 내의 인접한 아미노산 잔기(들)에 공유 결합할 수 있는 잔기를 의미한다. 비자연 발생 아미노산 잔기의 예는 노르류신, 오르니틴, 노르발린, 호모세린 및 다른 아미노산 잔기 유사체, 예를 들어 문헌 [Ellman et al., Meth. Enzym. 202:301-336 (1991)]에 기재된 것이다. 이러한 비자연 발생 아미노산 잔기를 생성하기 위해, 문헌 [Noren et al. Science 244: 182 (1989)] 및 [Ellman et al., 상기 문헌]의 절차를 이용할 수 있다. 간단히 설명하면, 이것은 비자연 발생 아미노산 잔기에 의한 억제인자 tRNA의 화학적 활성화, 이어서 RNA의 시험관 내 전사 및 번역을 포함한다. 본 발명의 방법은 특정 실시양태에서, IgM 중쇄 내의 적어도 하나의 원래의 아미노산 잔기의 대체를 포함하지만, 하나 초과의 원래의 잔기가 대체될 수 있다. 보통, 단지 제1 또는 제2 폴리펩티드의 계면 내의 전체 잔기만이 대체되는 원래의 아미노산 잔기를 포함할 것이다. 대체를 위한 바람직한 원래의 잔기는 "매립"된다. "매립"은 잔기가 본질적으로 용매에 접근할 수 없다는 것을 의미한다. 바람직한 도입 잔기는 디술피드 결합의 가능한 산화 또는 잘못된 쌍 형성을 막기 위해 시스테인이 아니다.
돌기는 동공 내에 "배치가능"하고, 이것은 각각 제1 폴리펩티드 및 제2 폴리펩티드의 계면 상의 돌기 및 동공의 공간 위치, 및 돌기 및 동공의 크기가, 돌기가 계면에서 제1 및 제2 폴리펩티드의 정상적인 회합을 유의하게 방해하지 않으면서 동공에 배치될 수 있도록 함을 의미한다. 돌기, 예컨대 Tyr, Phe 및 Trp가 통상적으로 계면의 축으로부터 직각으로 연장되지 않고 바람직한 입체형태를 갖지 않으므로, 상응하는 동공에 의한 돌기의 정렬은 예컨대 X선 결정학 또는 핵 자기 공명(NMR)에 의해 얻은 3차원 구조에 기초하여 돌기/동공 쌍을 모델링하는 것에 의존한다. 이것은 분자 모델링의 기술을 포함하는, 관련 기술 분야에서 널리 승인된 기술을 이용하여 달성될 수 있다.
"원래의 핵산"은 돌기 또는 동공을 코딩하도록 "변경"(즉, 유전자 조작 또는 돌연변이)될 수 있는 관심 폴리펩티드를 코딩하는 핵산을 의미한다. 원래의 또는 출발 핵산은 자연 발생 핵산일 수 있거나, 이전의 변경으로 처리된 핵산(예를 들어, 인간화 항체 단편)을 포함할 수 있다. 핵산을 "변경한다"는 것은 원래의 핵산이 관심 아미노산 잔기를 코딩하는 적어도 하나의 코돈을 삽입하거나 결실시키거나 대체함으로써 돌연변이된다는 것을 의미한다. 보통, 원래의 잔기를 코딩하는 코돈은 도입 잔기를 코딩하는 코돈에 의해 대체된다. 이러한 방식으로 DNA를 유전적으로 변형하는 기술은 문헌 [Mutagenesis: a Practical Approach, M. J. McPherson, Ed., (IRL Press, Oxford, UK. (1991)]에 검토되어 있고, 예를 들어 부위 지정 돌연변이 유발, 카세트 돌연변이 유발 및 폴리머라제 연쇄 반응(PCR) 돌연변이 유발을 포함한다.
돌기 또는 동공은 합성 수단에 의해, 예를 들어 재조합 기술, 시험관 내 펩티드 합성, 이전에 설명된 비자연 발생 아미노산 잔기를 도입하는 기술, 펩티드의 효소에 의한 또는 화학적 커플링 또는 이들 기술의 여러 조합에 의해 제1 또는 제2 폴리펩티드의 계면 내로 "도입"될 수 있다. 따라서, "도입"된 돌기 또는 동공은 "비자연 발생" 또는 "비천연"이고, 이것은 이들이 자연에서 또는 원래의 폴리펩티드(예를 들어, 인간화 모노클로날 항체)에 존재하지 않는다는 것을 의미한다.
바람직하게는, 돌기를 형성하기 위한 도입 아미노산 잔기는 비교적 적은 수(예를 들어, 약 3-6)의 "로타머(rotamer)"를 갖는다. "로타머"는 아미노산 측쇄의 에너지 측면에서 유리한 입체형태이다. 다양한 아미노산 잔기에 대한 로타머의 수는 문헌 [Ponders and Richards, J. Mol. Biol. 193: 775-791(1987)]에 검토되어 있다.
용어 "천연 서열 J 사슬" 또는 "천연 J 사슬"은 본원에서 사용되는 바와 같이, 성숙 인간 J 사슬(이의 아미노산 서열은 서열 번호 47에 제시됨)을 포함하는, 임의의 동물 종의 천연 서열 IgM 또는 IgA 항체의 J 사슬을 의미한다.
용어 "변형된 J 사슬"은 본원에서 천연 서열 내에 도입된 외인성 결합 모이어티를 포함하는 천연 서열 J 사슬 폴리펩티드의 변이체를 의미하기 위해 사용된다. 도입은 외인성 결합 모이어티의 직접 또는 간접 융합을 포함하는 임의의 수단에 의해 또는 화학 링커를 통한 부착에 의해 달성될 수 있다. 용어 "변형된 인간 J 사슬"은 구체적으로, 결합 모이어티의 도입에 의해 변형된 서열 번호 47의 아미노산 서열의 천연 서열 인간 J 사슬을 비제한적으로 포함한다. 상기 용어는 구체적으로, IgM 또는 IgA의 효율적인 중합(이량체화) 및 표적에 대한 이러한 중합체(이량체)의 결합을 방해하지 않는, 외인성 결합 모이어티의 도입에 의해 변형된 서열 번호 47의 아미노산 서열의 천연 서열 인간 J 사슬을 비제한적으로 포함한다.
용어 "결합 모이어티"는 본원에서 표적, 예컨대 항원에 특이적으로 결합할 수 있는 임의의 화학 물질을 포함하도록 가장 넓은 의미로 사용된다. 결합 모이어티의 예는 비제한적으로 항체, 항체의 항원 결합 단편, 항체-약물 접합체, 항체 유사 분자, 항체 유사 분자의 항원 결합 단편, 리간드 및 수용체를 포함한다. 바람직한 결합 모이어티는 바람직하게는 생물학적 기능을 갖는 폴리펩티드(펩티드 포함)이다. 생물학적 기능의 예는 결합하여 신호전달 경로를 활성화하거나 활성을 차단하는 결합 모이어티의 능력이다.
용어 "폴리펩티드"는 본원에서 가장 넓은 의미로 사용되고, 펩티드 서열을 포함한다. 용어 "펩티드"는 일반적으로 펩티드 결합에 의해 공유 연결된 약 60개 이하, 바람직하게는 약 30개 이하의 아미노산을 함유하는 아미노산의 선형 분자 사슬을 의미한다.
"결합 모이어티"와 관련하여 용어 "외인성"은 본원에서 동일한 위치에서 기준 천연 폴리펩티드 서열에 존재하지 않는 결합 모이어티를 의미하기 위해 사용된다. 따라서, 외인성 폴리펩티드 서열(펩티드 서열 포함)은 상응하는 천연 서열 내에 포함되지만, 상이한 위치에서 포함된다. 바람직한 실시양태에서, "외인성" 서열은 임의의 위치에서 상응하는 천연 서열에 존재하지 않는다.
용어 "특이적 결합" 또는 "특이적으로 결합하다" 또는 "특이적인"은 결합 표적에 대한 결합 모이어티의 결합, 예컨대 표적 항원, 예를 들어 특정 폴리펩티드, 펩티드, 또는 다른 표적(예를 들어, 당단백질 표적) 상의 에피토프에 대한 항체의 결합을 의미하고, 비특이적 상호작용으로부터 측정 가능하게 상이한 결합을 의미한다(예를 들어, 비특이적 상호작용은 소 혈청 알부민 또는 카제인에 대한 결합일 수 있음). 특이적 결합은 예를 들어 결합 모이어티, 또는 항체, 또는 결합 모이어티의 도입에 의해 변형된 항체의 표적 분자에 대한 결합을, 대조군 분자에 대한 결합과 비교하여 결정함으로써 측정될 수 있다. 예를 들어, 특이적 결합은 표적, 예를 들어 과량의 비표지된 표적과 유사한 대조군 분자와의 경쟁에 의해 결정될 수 있다. 이 경우에, 프로브에 대한 표지된 표적의 결합이 과량의 비표지된 표적에 의해 경쟁적으로 억제된다면, 특이적 결합이 나타난다. 본원에서 사용되는 바와 같이, 특정 폴리펩티드 또는 특정 폴리펩티드 표적 상의 에피토프에 대한 "특이적 결합" 또는 "특이적으로 결합하다" 또는 "특이적인"은 예를 들어 표적에 대한 Kd가 적어도 약 200 nM, 대안으로 적어도 약 150 nM, 대안으로 적어도 약 100 nM, 대안으로 적어도 약 60 nM, 대안으로 적어도 약 50 nM, 대안으로 적어도 약 40 nM, 대안으로 적어도 약 30 nM, 대안으로 적어도 약 20 nM, 대안으로 적어도 약 10 nM, 대안으로 적어도 약 8 nM, 대안으로 적어도 약 6 nM, 대안으로 적어도 약 4 nM, 대안으로 적어도 약 2 nM, 대안으로 적어도 약 1 nM이거나 이보다 좋은 분자에 의해 나타날 수 있다. 특정 예에서, 용어 "특이적 결합"은 임의의 다른 폴리펩티드 또는 폴리펩티드 에피토프에 실질적으로 결합하지 않으면서 분자가 특정 폴리펩티드 또는 특정 폴리펩티드 상의 에피토프에 결합하는 결합을 의미한다.
"결합 친화도"는 분자의 단일 결합 부위(예를 들어, 항체)와 그의 결합 파트너(예를 들어, 항원) 사이의 비공유 상호작용의 총합의 강도를 의미한다. 달리 표시되지 않은 한, 본원에서 사용되는 바와 같이, "결합 친화도"는 결합 쌍의 구성원(예를 들어, 항체 및 항원) 사이의 1:1 상호작용을 반영하는 고유한 결합 친화도를 의미한다. 그의 파트너 Y에 대한 분자 X의 친화도는 일반적으로 해리 상수(Kd)에 의해 표시될 수 있다. 예를 들어, Kd는 약 200 nM, 150 nM, 100 nM, 60 nM, 50 nM, 40 nM, 30 nM, 20 nM, 10 nM, 8 nM, 6 nM, 4 nM, 2 nM, 1 nM이거나 이보다 좋을 수 있다. 친화도는 본원에서 설명되는 것을 포함하는 관련 기술 분야에 공지된 통상적인 방법에 의해 측정될 수 있다. 저친화도 항체는 일반적으로 항원에 천천히 결합하고, 신속하게 해리하는 경향이 있는 반면, 고친화도 항체는 일반적으로 항원에 보다 빠르게 결합하고, 보다 오래 결합한 채 유지되는 경향이 있다. 결합 친화도를 측정하는 다양한 방법이 관련 기술 분야에 공지되어 있다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, "Kd" 또는 "Kd 값"은 항체 및 표적 쌍에 적절한 기술에 의해, 예를 들어 표면 플라스몬 공명 검정을 이용하여, 예를 들어 약 10 반응 단위(RU)에서 고정된 항원 CM5 칩을 사용하여 25℃에서 비아코어(BIAcore)™-2000 또는 비아코어™-3000(BIAcore, Inc., 미국 뉴저지주 피스카타웨이 소재)을 이용하여 측정된 해리 상수를 의미한다.
용어 "접합체", "접합된" 및 "접합"은 공유 또는 비공유 연결의 임의의 및 모든 형태를 의미하고, 비제한적으로, 직접적인 유전자 또는 화학적 융합, 링커 또는 가교결합제를 통한 커플링, 및 비공유 회합을 포함한다.
용어 "융합"은 본원에서 그의 코딩 뉴클레오티드 서열의 인-프레임 조합에 의한 하나의 폴리펩티드 사슬 내의 상이한 기원의 아미노산 서열의 조합을 의미하기 위해 사용된다. 용어 "융합"은 그의 말단 중 하나에 대한 융합 이외에, 내부 융합, 즉 폴리펩티드 사슬 내의 상이한 기원의 서열의 삽입을 명확히 포함한다. 용어 "융합"은 본원에서 상이한 기원의 아미노산 서열의 조합을 의미하기 위해 사용된다.
용어 "결합가"는 본원에서 사용되는 바와 같이, 항체에서 특정 수의 결합 부위의 존재를 의미한다. 따라서, 용어 "2가", "4가" 및 "6가"는 각각 2개의 결합 부위, 4개의 결합 부위 및 6개의 결합 부위의 존재를 나타낸다. 따라서, 본 발명에 따른 이중특이적 IgA 항체에서 각각의 결합 단위가 2가인 경우, 이중특이적 IgA 항체는 4의 결합가를 가질 것이다.
용어 "에피토프"는 항체에 특이적으로 결합할 수 있는 임의의 분자 결정기를 포함한다. 특정 실시양태에서, 에피토프 결정기는 분자의 화학적 활성 표면 기, 예컨대 아미노산, 당 측쇄, 포스포릴 또는 술포닐을 포함하고, 특정 실시양태에서, 특정한 3차원 구조적 특징, 및/또는 특정한 전하 특징을 가질 수 있다. 에피토프는 항체에 의해 결합되는 항원의 영역이다. "결합 영역"은 결합 분자에 의해 결합되는 결합 표적 상의 영역이다.
"다중에피토프 특이성"은 동일한 또는 상이한 표적(들) 상의 2개 이상의 상이한 에피토프에 특이적으로 결합하는 능력을 의미한다. "단일특이적"은 오직 1개의 에피토프에 결합하는 능력을 의미한다. 한 실시양태에 따라, 항체는 적어도 10-7 M, 또는 10-8 M 또는 이보다 좋은 친화도로 각각의 에피토프에 결합한다.
용어 "표적" 또는 "결합 표적"은 가장 넓은 의미로 사용되고, 구체적으로 이것이 자연에 존재할 때 생물학적 기능을 갖거나 갖지 않는, 비제한적으로 폴리펩티드, 핵산, 탄수화물, 지질, 세포, 및 다른 분자를 포함한다.
용어 "항원"은 항체에 결합하거나 세포 면역 반응을 촉발할 수 있는 물질 또는 그의 단편을 의미한다. 면역원은 유기체, 특히 동물, 보다 특히 인간을 포함하는 포유동물에서 면역 반응을 유도할 수 있는 항원을 의미한다. 용어 항원은 상기 정의된 바와 같이, 항원 결정기 또는 에피토프로서 알려진 영역을 포함한다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "면역원"은 항체의 생성을 유도하고/하거나, T 세포 및/또는 면역원의 항원에 대해 작용하는 다른 반응성 면역 세포를 활성화하는 물질을 의미한다.
본 발명의 항체의 "항원 결합 부위" 또는 "항원 결합 영역"은 전형적으로 항원에 대한 결합 부위의 친화도에 변하는 정도로 기여하는 6개의 초가변 영역(HVR)을 함유한다. 용어 "상보성 결정 영역" 또는 "CDR"은 본원에서 용어 "초가변 영역" 또는 "HVR"과 교환 가능하게 사용된다. 3개의 중쇄 가변 도메인 HVR(HVR-H1, HVR-H2 및 HVR-H3) 및 3개의 경쇄 가변 도메인 HVR(HVR-L1, HVR-L2 및 HVR-L3)이 존재한다. HVR 및 프레임워크 영역(FR)의 정도는 항체/항원 복합체로부터의 서열 및/또는 구조 정보 중에서 가변성에 따라 해당 영역이 정의된 아미노산 서열의 편집된 데이터베이스에 비교함으로써 결정된다. 또한, 더 적은 HVR(즉, 여기서 결합 특이성은 3개, 4개 또는 5개의 HVR에 의해 결정됨)로 이루어진 기능적 항원 결합 부위가 본 발명의 범위 내에 포함된다. 6개 HVR의 완전한 세트의 미만이 일부 결합 표적에 대한 결합에 충분할 수 있다. 따라서, 몇몇 경우에, VH 또는 VL 도메인 단독의 HVR이 충분할 것이다. 더구나, 특정 항체는 항원에 대한 비-HVR 연관 결합 부위를 가질 수 있다. 이러한 결합 부위는 본 정의 내에 구체적으로 포함된다.
용어 "숙주 세포"는 본원에 사용되는 바와 같이, 본 발명에 따라 항체를 생성하도록 조작될 수 있는 임의의 종류의 세포계를 의미한다. 한 실시양태에서, 중국 햄스터 난소(CHO) 세포는 숙주 세포로서 사용된다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 표현 "세포", "세포주" 및 "세포 배양액"은 교환 가능하게 사용되고, 모든 이러한 지칭은 자손체를 포함한다. 따라서, 단어 "형질전환체" 및 "형질전환된 세포"는 해당 1차 세포 및 전달 횟수와 무관하게 이로부터 유래된 배양액을 포함한다. 모든 자손체에서 의도적인 또는 부주의한 돌연변이로 인해 DNA 함량이 정확히 동일하지 않을 수 있는 것이 또한 이해된다. 처음 형질전환된 세포에서 스크리닝되는 것과 동일한 기능 또는 생물학적 활성을 갖는 변이체 자손이 포함된다.
핵산은 또 다른 핵산 서열과 기능적 관계에 있을 때 "작동 가능하게 연결된" 것이다. 예를 들어, 프리서열 또는 분비 리더에 대한 DNA는 폴리펩티드의 분비에 참여하는 프리단백질로서 발현될 때 폴리펩티드의 DNA에 대해 작동 가능하게 연결되거나; 프로모터 또는 인핸서는 서열의 전사에 영향을 미치는 경우 코딩 서열에 작동 가능하게 연결되거나; 리보솜 결합 부위는 번역을 용이하게 하도록 위치할 때 코딩 서열에 작동 가능하게 연결된 것이다. 일반적으로, "작동 가능하게 연결된"은 연결된 DNA 서열이 인접하고, 분비 리더의 경우에 인접하고 리딩 프레임에 있다는 것을 의미한다. 그러나, 인핸서는 인접할 필요는 없다. 연결은 편리한 제한 부위에서의 라이게이션에 의해 달성된다. 이러한 부위가 존재하지 않을 때, 합성 올리고뉴클레오티드 어댑터 또는 링커가 통상적인 관례에 따라 사용된다.
용어 "항-PD-L1 항체", "PD-L1 항체" 또는 "PD-L1에 결합하는 항체"는 모두 항체가 PD-L1을 표적화할 때 진단제 및/또는 치료제로서 유용하도록 충분한 친화도로 PD-L1에 결합할 수 있는 항체를 지칭한다. 특정 실시양태에서, 항-PD-L1 항체는 상이한 종으로부터의 PD-L1 중에서 보존되는 PD-L1의 에피토프에 결합한다.
한 실시양태에서, "PD-L1 항체"는 (i) 서열 번호 36-42 또는 45 중 어느 하나에 제시된 중쇄 가변 도메인 서열, 및/또는 서열 43, 44 또는 46 중 어느 하나에 제시된 경쇄 가변 도메인 서열을 포함하거나, 또는 (ii) 서열 번호 1-6에 제시된 1, 2, 3, 4, 5 또는 6개의 HVR을 포함하는 항-PD-L1 모노클로날 항체를 구체적으로 지칭하기 위해 본원에서 사용된다.
용어 "가변"은 가변 도메인의 특정 세그먼트가 항체 사이에서 서열이 크게 상이하다는 사실을 의미한다. "가변" 또는 "V" 도메인은 항원 결합을 매개하고, 그의 특정 항원에 대한 특정 항체의 특이성을 규정한다. 그러나, 가변성은 가변 도메인의 110개 아미노산 범위에 걸쳐 고르게 분포되어 있지 않다. 대신에, V 영역은 각각 9-12개 아미노산 길이인 "초가변 영역"이라 불리는 가변성이 극히 높은 짧은 영역에 의해 분리된, 15-30개의 아미노산으로 이루어진 프레임워크 영역(FR)으로 불리는 상대적으로 변하지 않는 스트레치로 이루어진다. 천연 중쇄 및 경쇄의 가변 도메인은, β-시트 구조를 연결하고 일부 경우에는 그 구조의 일부를 형성하는 루프를 형성하는 3개의 초가변 영역에 의해 연결되는 β-시트 배열을 주로 취하는 4개의 FR을 각각 포함한다. 각각의 사슬 내의 초가변 영역은 FR에 의해 매우 근접하여 함께 유지되고, 다른 사슬의 초가변 영역과 함께 항체의 항원 결합 부위의 형성에 기여한다(문헌 [Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD. (1991)] 참조).
"무손상" 항체는 특정 항체 클래스의 경쇄 불변 도메인(CL) 및 적어도 중쇄 불변 도메인뿐만 아니라 항원 결합 부위를 포함하는 것이다. 예를 들어, 무손상 IgG 항체는 항원 결합 부위, 경쇄 불변 도메인 CL 및 적어도 중쇄 불변 도메인 CH1(Cγ1), CH2(Cγ2) 및 CH3(Cγ3)을 포함한다. 무손상 IgM 항체는 항원 결합 부위, 경쇄 불변 도메인 CL 및 적어도 중쇄 불변 도메인 CM1(Cμ1), CM2(Cμ2), CM3(Cμ3) 및 CM4(Cμ4)를 포함한다. 무손상 IgA 항체는 항원 결합 부위, 경쇄 불변 도메인 CL 및 적어도 중쇄 불변 도메인 CA1(Cα1), CA2(Cα2) 및 CA3(Cα3)을 포함한다. 무손상 IgD 항체는 항원 결합 부위, 경쇄 불변 도메인 CL, 및 적어도 중쇄 불변 도메인 CD1(Cδ1), CD2(Cδ2) 및 CD3(Cδ3)을 포함한다. 무손상 IgE 항체는 항원 결합 부위, 경쇄 불변 도메인 CL 및 적어도 중쇄 불변 도메인 CE1(Cε1), CE2(Cε2), CE3(Cε3) 및 CE4(Cε4)를 포함한다. 불변 도메인은 천연 서열 불변 도메인(예를 들어, 인간 천연 서열 불변 도메인) 또는 그의 아미노산 서열 변이체일 수 있다. 바람직하게는, 무손상 항체는 하나 이상의 이펙터 기능을 갖는다.
"항체 단편"은 무손상 항체의 일부, 바람직하게는 무손상 항체의 항원 결합 또는 가변 영역을 포함한다. 항체 단편의 비제한적인 예는 Fab, Fab', F(ab')2 및 Fv 단편; 디아바디; 선형 항체(미국 특허 제5,641,870호, 실시예 2; [Zapata et al., Protein Eng. 8(10): 1057-1062 (1995)] 참조); 단일쇄 항체 분자; 및 항체 단편으로 형성된 다중특이적 항체를 포함한다. 한 실시양태에서, 항체 단편은 무손상 항체의 항원 결합 부위를 포함하고, 따라서 항원에 결합하는 능력을 보유한다. 관련 기술 분야의 통상의 기술자는 항원 결합 단편을 생성하기 위해 적어도 항체의 항원 결합 부분을 그의 경쇄 및 중쇄의 나머지로부터 분리함으로써, 임의의 무손상 항체, 예를 들어 IgG, IgM, IgA, IgD 또는 IgE 항체로부터 항체 단편이 생성될 수 있음을 이해할 것이다. 특정 실시양태에서, 항체 단편은 항체의 항원 결합 영역뿐만 아니라 항체의 경쇄 및/또는 중쇄의 하나 이상의 추가의 도메인을 포함할 수 있다. 예를 들어, 일부 실시양태에서, 항체 단편은 VH 및 VL 도메인, 경쇄 불변 도메인 CL 및 하나 이상의 중쇄 불변 도메인, 예를 들어, CH1(Cγ1) 도메인, CM1(Cμ1) 도메인, CA1(Cα1) 도메인, CD1(Cδ1) 도메인 또는 CE1(Cε1) 도메인을 포함할 수 있다.
IgG 항체 단편의 경우, 파파인 분해는 "Fab" 단편으로 불리는 2개의 동일한 항원 결합 단편, 및 쉽게 결정화하는 능력을 반영하는 명칭인 잔여 "Fc 단편"을 생성한다. Fab 단편은 H쇄의 가변 영역 도메인(VH) 및 하나의 중쇄의 제1 불변 도메인(CH1)과 함께 전체 L쇄로 이루어진다. 각각의 Fab 단편은 항원에 대해 1가이고, 즉, 이 단편은 단일 항원 결합 부위를 갖는다. IgG 항체의 펩신 처리는 2가 항원 결합 활성을 갖는 2개의 디술피드 연결 Fab 단편에 대략적으로 상응하는 하나의 큰 F(ab')2 단편을 생성하고, 여전히 항원을 가교결합시킬 수 있다. Fab' 단편은 항체 힌지 영역으로부터의 하나 이상의 시스테인을 포함하는 CH1 도메인의 카르복시 말단에 추가의 일부 잔기를 갖는다는 점에서 Fab 단편과 상이하다. Fab'-SH는 불변 도메인의 시스테인 잔기(들)가 자유 티올기를 보유하는 Fab'에 대한 지정이다. F(ab')2 항체 단편은 원래 그들 사이에 힌지 시스테인을 갖는 Fab' 단편의 쌍으로 생성되었다. 항체 단편의 다른 화학적 커플링이 또한 공지되어 있다.
IgG 항체의 Fc 단편은 디술피드에 의해 함께 유지된 2개의 H 사슬의 카르복시 말단 부분을 포함한다. 항체의 이펙터 기능은 Fc 영역의 서열에 의해 결정되며, 이 영역은 또한 특정 유형의 세포에서 발견되는 Fc 수용체(FcR)에 의해 인식되는 부분이다.
"Fv"는 완전한 항원 인식 및 결합 부위를 포함하는 최소 항체 단편이다. 이 단편은 긴밀한 비공유 회합된 하나의 중쇄 및 경쇄 가변 영역 도메인의 이량체로 이루어진다. 단일쇄 Fv(scFv) 종에서, 하나의 중쇄 및 하나의 경쇄 가변 도메인은 가요성 펩티드 링커에 의해 공유 연결되어, 경쇄 및 중쇄가 2개의 사슬 Fv 종에서와 유사한 "이량체" 구조로 회합될 수 있다. 이 두 도메인의 폴딩으로부터, 항원 결합을 위한 아미노산 잔기를 제공하고 항체에 대한 항원 결합 특이성을 부여하는 6개의 초가변 루프(H 및 L 쇄로부터 각각 3개의 루프)가 발생한다. 그러나, 심지어 단일 갸변 도메인(또는 항원에 특이적인 단지 3개의 HVR을 포함하는 Fv의 절반)은 전체 결합 부위보다 낮은 친화도이지만, 항원을 인식하고 결합하는 능력을 갖는다.
"단일쇄 Fv"("sFv" 또는 "scFv"로도 약칭함)는 단일 폴리펩티드 사슬에 연결된 VH 및 VL 항체 도메인을 포함하는 항체 단편이다. 바람직하게는, sFv 폴리펩티드는 sFv가 항원 결합을 위한 원하는 구조를 형성할 수 있게 하는, VH 도메인과 VL 도메인 사이의 폴리펩티드 링커를 추가로 포함한다. sFv에 대한 검토를 위해, 문헌 [Pluckthun in The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 113, Rosenburg and Moore eds., Springer-Verlag, New York, pp. 269-315 (1994)]; [Borrebaeck 1995,하기 문헌]을 참조한다.
본원에서 사용되는 바와 같은 용어 "길항제"는 상기 분자의 부재 하에서의 동일한 기능 또는 활성과 비교하여 기능 또는 활성의 감소를 유발하는 분자를 지칭한다. 따라서, 신호전달 경로의 "길항제"는 그의 존재가 신호전달 경로의 기능 또는 활성을 감소시키는 분자이다. 본원에서 사용되는 용어 "길항하다"는 기능 또는 활성의 감소를 유발하는 것을 의미한다. "차단" 항체 또는 "길항제" 또는 "길항" 항체는 그것이 결합하는 항원의 생물학적 활성을 억제하거나 감소시키는 것이다. 바람직한 차단 항체 또는 길항제 항체는 항원의 생물학적 활성을 실질적으로 또는 완전히 억제할 수 있다.
관심 항원, 예를 들어 PD-L1 에피토프 항원 표적에 "결합하는" 항체는 항체가 항원을 발현하는 세포 또는 조직을 표적화하는 치료제로서 유용하도록 하기에 충분한 친화도로 항원에 결합하는 것이며, 다른 단백질과 유의하게 교차 반응하지 않는다. 항체의 표적 분자에 대한 결합과 관련하여, 특정 폴리펩티드 또는 특정 폴리펩티드 표적 상의 에피토프에 "대한 특이적 결합" 또는 "특이적으로 결합하는" 또는 "특이적인"이란 용어는 비특이적 상호작용과 측정 가능하게 상이한 결합을 의미한다. 예를 들어, 특이적인 결합은 일반적으로 결합 활성을 갖지 않는 유사한 구조의 분자인 대조군 분자의 결합에 비해 분자의 결합을 결정함으로써 측정될 수 있다. 예를 들어, 특이적 결합은 표적에 유사한 대조군 분자, 예를 들어 과량의 비표지된 표적과의 경쟁에 의해 결정될 수 있다. 이 경우에, 표지된 표적의 프로브에 대한 결합이 과량의 비표지된 표적에 의해 경쟁적으로 억제되면, 특이적 결합이 나타난다. 한 실시양태에서, 용어 "특이적 결합"은 분자가 임의의 다른 폴리펩티드 또는 폴리펩티드 에피토프에 실질적으로 결합하지 않으면서 특정 폴리펩티드 또는 특정 폴리펩티드 상의 에피토프에 결합하는 결합을 의미한다.
특이적 결합은 표지된 표적과 프로브의 결합이 과량의 표지되지 않은 표적에 의해 경쟁적으로 억제되는 경우에 나타난다. 한 실시양태에서, 용어 "특이적 결합"은 임의의 다른 폴리펩티드 또는 폴리펩티드 에피토프에 실질적으로 결합하지 않으면서 특정 폴리펩티드상의 특정 폴리펩티드 또는 에피토프에 결합하는 결합을 의미한다. 특이적 결합은 표지된 표적과 프로브의 결합이 과량의 표지되지 않은 표적에 의해 경쟁적으로 억제되는 경우에 나타난다. 한 실시양태에서, 용어 "특이적 결합"은 분자가 임의의 다른 폴리펩티드 또는 폴리펩티드 에피토프에 실질적으로 결합하지 않으면서 특정 폴리펩티드상의 특정 폴리펩티드 또는 에피토프에 결합하는 결합을 의미한다.
"PD-L1 에피토프를 발현하는 종양 세포의 성장을 억제하는" 항체 또는 "성장 억제성" 항체는 PD-L1 에피토프를 발현 또는 과다발현하는 암세포의 측정 가능한 성장 억제를 유도하는 항체이다. PD-L1 에피토프는 암세포의 표면 상에 발현되는 트랜스멤브레인 폴리펩티드이거나, 암세포에 의해 생성되고 분비되는 폴리펩티드일 수 있다. 바람직한 성장 억제성 항-PD-L1 항체는 PD-L1 발현 종양 세포의 성장을, 전형적으로 시험되는 항체로 처리되지 않은 종양 세포인 적절한 대조군에 비해 20% 초과, 바람직하게는 약 20% 내지 약 50%, 훨씬 더 바람직하게는 50% 초과(예를 들어, 50% 내지 약 100%)로 억제한다.
"PD-L1 에피토프를 발현하는 종양 세포의 성장을 억제하는" 항체는 또한 (i) 그들이 결합하는 세포의 성장 또는 증식을 억제할 수 있거나; (ii) 그들이 결합하는 세포의 사멸을 유도하거나; 또는 (iii) 이들이 결합하는 세포의 전이를 억제할 수 있다.
본원에서 사용되는 용어 "작용제"는 분자의 부재 하에서의 동일한 기능 또는 활성과 비교하여 기능 또는 활성의 증가를 유도하는 분자를 지칭한다. 따라서, 신호전달 경로의 "작용제"는 그의 존재가 신호전달 경로의 기능 또는 활성의 증가를 유도하는 분자이다. 본원에서 사용되는 용어 "작용하다"는 기능 또는 활성의 증가를 유도하는 것을 의미한다.
본원에서 사용되는 용어 "T 세포 억제 신호전달 경로"는 T 세포 면역 반응의 정성적 또는 정량적 감소, 차단 또는 정지를 유도하는 T 세포 신호전달 경로를 나타낸다.
본원에서 사용되는 용어 "T 세포 자극 신호전달 경로"는 T 세포 면역 반응의 정성적 또는 정량적 증가 또는 유지를 유도하는 T 세포 신호전달 경로를 나타낸다.
용어 "암" 및 "암성"은 일반적으로 조절되지 않은 세포 성장을 특징으로 하는 포유동물의 생리학적 상태를 나타내거나 설명한다. "종양"은 하나 이상의 암성 세포를 포함한다. 암의 예는 암종, 림프종, 모세포종, 육종 및 백혈병 또는 림프성 악성 종양을 포함하고 이로 제한되지 않는다. 상기 암의 보다 구체적인 예는 다음을 포함한다: 편평 세포 암(예를 들어, 상피 편평 세포 암), 피부암, 흑색종, 소세포 폐암, 비소세포 폐암("NSCLC"), 폐의 선암종 및 폐의 편평 암종을 포함하는 폐암, 복막암, 간세포암, 위장관암을 포함하는 위암 또는 위장암, 췌장암(예를 들어, 췌관 선암종), 교아세포종, 자궁경부암, 난소암(예를 들어, 고등급 장액 난소암), 간암(예를 들어, 간세포 암종(HCC)), 방광암(예를 들어, 요로방광암), 고환(생식 세포 종양) 암, 간종양, 유방암, 뇌암(예를 들어, 성상세포종), 결장암, 직장암, 결직장암, 자궁내막암 또는 자궁 암종, 타액선 암종, 신장암 또는 신암(예를 들어 신장 세포 암종, 신장모세포종 또는 윌름스(Wilms) 종양), 전립선암, 외음부암, 갑상선암, 간암종, 항문 암종, 음경 암종, 및 두경부암. 암의 추가의 예는 비제한적으로 다음을 포함한다: 망막모세포종, 난포막종, 남성배소포종, 간종양, 비호지킨 림프종(NHL), 다발성 골수종 및 급성 혈액 종양을 비롯한 혈액 악성 종양, 자궁내막 또는 자궁 암종, 자궁내막증, 섬유육종, 융모막암종, 타액선 암종, 외음부암, 갑상선암, 식도암, 간 암종, 항문 암종, 음경 암종, 비인두암종, 후두 암종, 카포시(Kaposi) 육종, 흑색종, 피부 암종, 신경초종(Schwannoma), 희소돌기아교세포종, 신경모세포종, 횡문근육종, 골원성 육종, 평활근육종 및 요로 암종.
용어 "전이성 암"은 기원하는 조직의 암세포가 원래의 부위에서 신체의 하나 이상의 다른 부위로, 혈관 또는 림프관에 의해 전파되어 기원하는 조직 이외의 하나 이상의 장기에서 하나 이상의 2차 종양을 형성하는 암의 상태를 의미한다. 현저한 예는 전이성 유방암이다.
본원에서 사용되는 바와 같이, "PD-L1 관련 암"은 PD-L1 유전자 또는 유전자 산물의 발현 또는 과다발현과 관련된 암으로서, 적절한 대조군 세포에 비해 정상 또는 상승된 수준의 하나 이상의 PD-L1 유전자 산물을 발현하는 세포를 특징으로 한다. 적절한 대조군 세포는 PD-L1 발현 또는 과다발현 암에 영향을 받지 않는 개체로부터의 세포일 수 있거나, 또는 필요한 대상체로부터의 비암성 세포일 수 있거나, 또는 PD-L1을 발현 또는 과다발현 암에 영향을 받는 또 다른 개체로부터의 비암성 세포일 수 있다.
용어 "세포 증식성 장애" 및 "증식성 장애"는 어느 정도의 비정상적인 세포 증식과 관련된 장애를 지칭한다. 한 실시양태에서, 세포 증식성 장애는 암이다.
본원에서 사용되는 바와 같이, "종양"은 악성 또는 양성 여부와 상관 없는 모든 신생물성 세포 성장 및 증식, 및 모든 전암성 세포 및 암성 세포 및 조직을 지칭한다.
본원에서 사용되는 용어 "예측" 및 "예후"는 예측 또는 예후 방법을 통해, 항-PD-L1 항체를 포함하는 항암제를 사용한 치료에 대해 반응할 가능성이 보다 큰 것으로 (반드시는 아니지만, 대체로 치료 전에) 간주되는 환자를 이 방법을 실시하는 인간이 선택할 수 있다는 의미에서 교환 가능하게 사용된다.
본원에서 사용되는 용어 "치료하다", "치료" 또는 "치료하는"은 치료적 처치 및 예방적 조치를 모두 지칭하며, 그 목적은 표적으로 하는 병리학적 상태 또는 장애를 억제하거나 감속(완화)시키는 것이다. 치료가 필요한 대상체는 이미 특정 병태 또는 장애를 가지고 있는 대상체뿐만 아니라, 장애를 갖기 쉬원 대상체 또는 장애가 예방되어야 하는 대상체를 포함한다.
항-PD-L1 조성물
본 발명의 측면은 비제한적으로 IgM, IgG 및 IgA 항체를 구체적으로 포함하는 항-PD-L1 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 포함한다. 한 측면에서, 본 발명은 본원에서 설명되는 바와 같이 PD-L1 폴리펩티드에, 바람직하게는 특이적으로 결합하는 항체를 제공한다. 일부 실시양태에서, 항체는 예를 들어 Fab, Fab', F(ab')2 및 Fv 단편, 디아바디 및 단일 도메인 항체를 포함하는 모노클로날 항체 또는 그의 항원 결합 단편이다. 일부 실시양태에서, 항체는 키메라 항체, 인간화 항체, 단일쇄 항체 또는 그의 각각의 항원 에피토프에 대한 항-PD-L1 항체의 결합을 경쟁적으로 억제하는 항체이다. 본 발명의 항체는 선택적으로 CHO 세포 또는 박테리아 세포에서 생성될 수 있고, PD-L1 단백질과 그것이 결합하는 수용체 또는 리간드 사이의 상호작용을 억제할 수 있다. 일부 실시양태에서, 항-PD-L1 항체는 그것이 결합하는 세포의 사멸을 유도할 수 있다. 검출 목적을 위해, 본 발명의 항체는 예를 들어 검출 가능하게 표지되거나, 고체 지지체에 부착될 수 있다.
한 측면에서, 항-PD-L1 항체가 제공되고, 상기 항체는 다음 활성 중 하나 이상을 갖는다: (i) PD-L1 단백질이 결합할 수 있는 수용체 또는 리간드(예를 들어, PD-1 단백질)와 PD-L1 단백질 사이의 상호작용의 억제; (ii) 생체 내에서 종양 전이의 억제; (iii) 생체 내에서 종양 성장의 억제; (iv) 생체 내에서 종양 크기의 감소; (v) 생체 내에서 PD-L1을 발현하는 종양 세포에 대한 세포독성 활성의 제시; 또는 (vi) 생체 내에서 PD-L1을 발현하는 종양 세포에 대한 세포 증식 억제 활성의 제시. 특정 측면에서, 항-PD-L1 항체는 PD-L1과 PD-1 사이의 상호작용을 억제하는 길항 항체이다. 특정 측면에서, 항-PD-L1 항체는 PD-L1 단백질에 결합하여 PD-1 단백질의 하나 이상의 기능(예를 들어, 하나 이상의 면역억제 기능)을 억제할 수 있다.
한 측면에서, 서열 번호 4, 5 및 6에 제시된 서열에 대해 적어도 약 99%의 서열 동일성을 갖는 하나 이상의 중쇄 HVR 서열을 포함하는, PD-L1에 결합하는 항체가 제공된다. 일부 실시양태에서, 항체는 서열 번호 4, 5 및 6에 제시된 3개의 중쇄 HVR 서열을 모두 포함한다. 일부 실시양태에서, 항체는 서열 번호 1, 2 및 3에 제시된 서열에 대해 적어도 약 99%의 서열 동일성을 갖는 하나 이상의 경쇄 HVR 서열을 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 항체는 서열 번호 1, 2 및 3에 제시된 3개의 경쇄 HVR 서열을 모두 포함한다. 특정 실시양태에서, 항체는 서열 번호 4, 5 및 6에 제시된 3개의 중쇄 HVR 서열을 모두 포함하는 중쇄 가변 도메인을 포함하고, 서열 번호 1, 2 및 3에 제시된 3개의 경쇄 HVR 서열을 모두 포함하는 경쇄 가변 도메인을 포함한다.
본 발명의 측면은 그의 중쇄 및 경쇄 서열이 프레임워크 서열을 포함하는 항-PD-L1 항체를 포함한다. 본 발명의 실시양태에 따른 프레임워크 서열은 예를 들어 인간 단백질 및 DNA 생식세포 계열 서열뿐만 아니라, 임의의 수의 인간 단백질 및/또는 DNA 생식세포 계열 서열로부터 유래된 컨센서스 프레임워크 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 항-PD-L1 항체 경쇄 서열은 인간 프레임워크 서열 또는 인간 컨센서스 프레임워크 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 항-PD-L1 항체 중쇄 서열은 인간 프레임워크 서열 또는 인간 컨센서스 프레임워크 서열을 포함한다.
일부 실시양태에서, 항-PD-L1 항체는 서열 번호 7-11에 제시된 중쇄 프레임워크 영역 1(FR1) 서열 중 어느 하나에 대해 적어도 약 80% 동일한, 예컨대 약 85%, 약 90%, 약 95% 또는 약 99% 동일한 FR1 서열을 포함한다. 특정 실시양태에서, 항체는 서열 번호 7-11 중 어느 하나에 제시된 중쇄 FR1 서열을 포함한다.
일부 실시양태에서, 항-PD-L1 항체는 서열 번호 12-16에 제시된 중쇄 프레임워크 영역 2(FR2) 서열 중 어느 하나에 대해 적어도 약 80% 동일한, 예컨대 약 85%, 약 90%, 약 95% 또는 약 99% 동일한 FR2 서열을 포함한다. 특정 실시양태에서, 항체는 서열 번호 12-16 중 어느 하나에 제시된 중쇄 FR2 서열을 포함한다.
일부 실시양태에서, 항-PD-L1 항체는 서열 번호 17-24에 제시된 중쇄 프레임워크 영역 3(FR3) 서열 중 어느 하나에 대해 적어도 약 80% 동일한, 예컨대 약 85%, 약 90%, 약 95% 또는 약 99% 동일한 FR3 서열을 포함한다. 특정 실시양태에서, 항체는 서열 번호 17-24 중 어느 하나에 제시된 중쇄 FR3 서열을 포함한다.
일부 실시양태에서, 항-PD-L1 항체는 서열 번호 25-26에 제시된 중쇄 프레임워크 영역 4(FR4) 서열 중 어느 하나에 대해 적어도 약 80% 동일한, 예컨대 약 85%, 약 90%, 약 95% 또는 약 99% 동일한 FR4 서열을 포함한다. 특정 실시양태에서, 항체는 서열 번호 25-26 중 어느 하나에 제시된 중쇄 FR4 서열을 포함한다.
일부 실시양태에서, 항-PD-L1 항체는 서열 번호 27-29에 제시된 경쇄 프레임워크 영역 1(FR1) 서열 중 어느 하나에 대해 적어도 약 80% 동일한, 예컨대 약 85%, 약 90%, 약 95% 또는 약 99% 동일한 FR1 서열을 포함한다. 특정 실시양태에서, 항체는 서열 번호 27-29 중 어느 하나에 제시된 경쇄 FR1 서열을 포함한다.
일부 실시양태에서, 항-PD-L1 항체는 서열 번호 30-31에 제시된 경쇄 프레임워크 영역 2(FR2) 서열 중 어느 하나에 대해 적어도 약 80% 동일한, 예컨대 약 85%, 약 90%, 약 95% 또는 약 99% 동일한 FR2 서열을 포함한다. 특정 실시양태에서, 항체는 서열 번호 30-31 중 어느 하나에 제시된 경쇄 FR2 서열을 포함한다.
일부 실시양태에서, 항-PD-L1 항체는 서열 번호 32-33에 제시된 경쇄 프레임워크 영역 3(FR3) 서열 중 어느 하나에 대해 적어도 약 80% 동일한, 예컨대 약 85%, 약 90%, 약 95% 또는 약 99% 동일한 FR3 서열을 포함한다. 특정 실시양태에서, 항체는 서열 번호 32-33 중 어느 하나에 제시된 경쇄 FR3 서열을 포함한다.
일부 실시양태에서, 항-PD-L1 항체는 서열 번호 34-35에 제시된 경쇄 프레임워크 영역 4(FR4) 서열 중 어느 하나에 대해 적어도 약 80% 동일한, 예컨대 약 85%, 약 90%, 약 95% 또는 약 99% 동일한 FR4 서열을 포함한다. 특정 실시양태에서, 항체는 서열 번호 34-35 중 어느 하나에 제시된 경쇄 FR4 서열을 포함한다.
한 측면에서, PD-L1에 결합하는 항체가 제공되며, 여기서 항체는 서열 번호 36-42 또는 45에 제시된 중쇄 가변 도메인 서열 중 어느 하나에 대해 적어도 약 80% 동일한, 예컨대 약 85%, 약 90%, 약 95% 또는 약 99% 동일한 중쇄 가변 도메인 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 항체는 서열 번호 36-42 또는 45 중 어느 하나에 제시된 중쇄 가변 도메인 서열을 포함한다.
일부 실시양태에서, 항체는 서열 번호 43, 44 또는 46에 제시된 경쇄 가변 도메인 서열 중 어느 하나에 대해 적어도 약 80% 동일한, 예컨대 약 85%, 약 90%, 약 95% 또는 약 99% 동일한 경쇄 가변 도메인 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 항체는 서열 번호 43, 44 또는 46 중 어느 하나에 제시된 중쇄 가변 도메인 서열을 포함한다.
일부 실시양태에서, 항-PD-L1 항체는 서열 번호 45에 제시된 중쇄 가변 도메인 서열에 대해 적어도 약 80% 동일한, 예컨대 약 85%, 약 90%, 약 95% 또는 약 99% 동일한 중쇄 가변 도메인 서열을 포함하고, 서열 번호 46에 제시된 경쇄 가변 도메인 서열에 대해 적어도 약 80% 동일한, 예컨대 약 85%, 약 90%, 약 95% 또는 약 99% 동일한 경쇄 가변 도메인 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 항-PD-L1 항체는 서열 번호 45에 제시된 중쇄 가변 도메인 서열 및 서열 번호 46에 제시된 경쇄 가변 도메인 서열을 포함한다.
일부 실시양태에서, 항-PD-L1 항체는 서열 번호 36에 제시된 서열에 대해 적어도 약 80% 동일한, 예컨대 약 85%, 약 90%, 약 95% 또는 약 99% 동일한 중쇄 가변 도메인 서열을 포함하고, 서열 번호 43에 제시된 서열에 대해 적어도 약 80% 동일한, 예컨대 약 85%, 약 90%, 약 95% 또는 약 99% 동일한 경쇄 가변 도메인 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 항-PD-L1 항체는 서열 번호 36에 제시된 중쇄 가변 도메인 서열 및 서열 번호 43에 제시된 경쇄 가변 도메인 서열을 포함한다.
일부 실시양태에서, 항-PD-L1 항체는 서열 번호 37에 제시된 서열에 대해 적어도 약 80% 동일한, 예컨대 약 85%, 약 90%, 약 95% 또는 약 99% 동일한 중쇄 가변 도메인 서열을 포함하고, 서열 번호 43에 제시된 서열에 대해 적어도 약 80% 동일한, 예컨대 약 85%, 약 90%, 약 95% 또는 약 99% 동일한 경쇄 가변 도메인 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 항-PD-L1 항체는 서열 번호 37에 제시된 중쇄 가변 도메인 서열 및 서열 번호 43에 제시된 경쇄 가변 도메인 서열을 포함한다.
일부 실시양태에서, 항-PD-L1 항체는 서열 번호 38에 제시된 서열에 대해 적어도 약 80% 동일한, 예컨대 약 85%, 약 90%, 약 95% 또는 약 99% 동일한 중쇄 가변 도메인 서열을 포함하고, 서열 번호 43에 제시된 서열에 대해 적어도 약 80% 동일한, 예컨대 약 85%, 약 90%, 약 95% 또는 약 99% 동일한 경쇄 가변 도메인 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 항-PD-L1 항체는 서열 번호 38에 제시된 중쇄 가변 도메인 서열 및 서열 번호 43에 제시된 경쇄 가변 도메인 서열을 포함한다.
일부 실시양태에서, 항-PD-L1 항체는 서열 번호 39에 제시된 서열에 대해 적어도 약 80% 동일한, 예컨대 약 85%, 약 90%, 약 95% 또는 약 99% 동일한 중쇄 가변 도메인 서열을 포함하고, 서열 번호 43에 제시된 서열에 대해 적어도 약 80% 동일한, 예컨대 약 85%, 약 90%, 약 95% 또는 약 99% 동일한 경쇄 가변 도메인 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 항-PD-L1 항체는 서열 번호 39에 제시된 중쇄 가변 도메인 서열 및 서열 번호 43에 제시된 경쇄 가변 도메인 서열을 포함한다.
일부 실시양태에서, 항-PD-L1 항체는 서열 번호 36에 제시된 서열에 대해 적어도 약 80% 동일한, 예컨대 약 85%, 약 90%, 약 95% 또는 약 99% 동일한 중쇄 가변 도메인 서열을 포함하고, 서열 번호 44에 제시된 서열에 대해 적어도 약 80% 동일한, 예컨대 약 85%, 약 90%, 약 95% 또는 약 99% 동일한 경쇄 가변 도메인 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 항-PD-L1 항체는 서열 번호 36에 제시된 중쇄 가변 도메인 서열 및 서열 번호 44에 제시된 경쇄 가변 도메인 서열을 포함한다.
일부 실시양태에서, 항-PD-L1 항체는 서열 번호 37에 제시된 서열에 대해 적어도 약 80% 동일한, 예컨대 약 85%, 약 90%, 약 95% 또는 약 99% 동일한 중쇄 가변 도메인 서열을 포함하고, 서열 번호 44에 제시된 서열에 대해 적어도 약 80% 동일한, 예컨대 약 85%, 약 90%, 약 95% 또는 약 99% 동일한 경쇄 가변 도메인 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 항-PD-L1 항체는 서열 번호 37에 제시된 중쇄 가변 도메인 서열 및 서열 번호 44에 제시된 경쇄 가변 도메인 서열을 포함한다.
일부 실시양태에서, 항-PD-L1 항체는 서열 번호 38에 제시된 서열에 대해 적어도 약 80% 동일한, 예컨대 약 85%, 약 90%, 약 95% 또는 약 99% 동일한 중쇄 가변 도메인 서열을 포함하고, 서열 번호 44에 제시된 서열에 대해 적어도 약 80% 동일한, 예컨대 약 85%, 약 90%, 약 95% 또는 약 99% 동일한 경쇄 가변 도메인 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 항-PD-L1 항체는 서열 번호 38에 제시된 중쇄 가변 도메인 서열 및 서열 번호 44에 제시된 경쇄 가변 도메인 서열을 포함한다.
일부 실시양태에서, 항-PD-L1 항체는 서열 번호 39에 제시된 서열에 대해 적어도 약 80% 동일한, 예컨대 약 85%, 약 90%, 약 95% 또는 약 99% 동일한 중쇄 가변 도메인 서열을 포함하고, 서열 번호 44에 제시된 서열에 대해 적어도 약 80% 동일한, 예컨대 약 85%, 약 90%, 약 95% 또는 약 99% 동일한 경쇄 가변 도메인 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 항-PD-L1 항체는 서열 번호 39에 제시된 중쇄 가변 도메인 서열 및 서열 번호 44에 제시된 경쇄 가변 도메인 서열을 포함한다.
일부 실시양태에서, 항-PD-L1 항체는 서열 번호 40에 제시된 서열에 대해 적어도 약 80% 동일한, 예컨대 약 85%, 약 90%, 약 95% 또는 약 99% 동일한 중쇄 가변 도메인 서열을 포함하고, 서열 번호 43에 제시된 서열에 대해 적어도 약 80% 동일한, 예컨대 약 85%, 약 90%, 약 95% 또는 약 99% 동일한 경쇄 가변 도메인 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 항-PD-L1 항체는 서열 번호 40에 제시된 중쇄 가변 도메인 서열 및 서열 번호 43에 제시된 경쇄 가변 도메인 서열을 포함한다.
일부 실시양태에서, 항-PD-L1 항체는 서열 번호 41에 제시된 서열에 대해 적어도 약 80% 동일한, 예컨대 약 85%, 약 90%, 약 95% 또는 약 99% 동일한 중쇄 가변 도메인 서열을 포함하고, 서열 번호 43에 제시된 서열에 대해 적어도 약 80% 동일한, 예컨대 약 85%, 약 90%, 약 95% 또는 약 99% 동일한 경쇄 가변 도메인 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 항-PD-L1 항체는 서열 번호 41에 제시된 중쇄 가변 도메인 서열 및 서열 번호 43에 제시된 경쇄 가변 도메인 서열을 포함한다.
일부 실시양태에서, 항-PD-L1 항체는 서열 번호 42에 제시된 서열에 대해 적어도 약 80% 동일한, 예컨대 약 85%, 약 90%, 약 95% 또는 약 99% 동일한 중쇄 가변 도메인 서열을 포함하고, 서열 번호 43에 제시된 서열에 대해 적어도 약 80% 동일한, 예컨대 약 85%, 약 90%, 약 95% 또는 약 99% 동일한 경쇄 가변 도메인 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 항-PD-L1 항체는 서열 번호 42에 제시된 중쇄 가변 도메인 서열 및 서열 번호 43에 제시된 경쇄 가변 도메인 서열을 포함한다.
일부 실시양태에서, 항-PD-L1 항체는 서열 번호 40에 제시된 서열에 대해 적어도 약 80% 동일한, 예컨대 약 85%, 약 90%, 약 95% 또는 약 99% 동일한 중쇄 가변 도메인 서열을 포함하고, 서열 번호 44에 제시된 서열에 대해 적어도 약 80% 동일한, 예컨대 약 85%, 약 90%, 약 95% 또는 약 99% 동일한 경쇄 가변 도메인 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 항-PD-L1 항체는 서열 번호 40에 제시된 중쇄 가변 도메인 서열 및 서열 번호 44에 제시된 경쇄 가변 도메인 서열을 포함한다.
일부 실시양태에서, 항-PD-L1 항체는 서열 번호 41에 제시된 서열에 대해 적어도 약 80% 동일한, 예컨대 약 85%, 약 90%, 약 95% 또는 약 99% 동일한 중쇄 가변 도메인 서열을 포함하고, 서열 번호 44에 제시된 서열에 대해 적어도 약 80% 동일한, 예컨대 약 85%, 약 90%, 약 95% 또는 약 99% 동일한 경쇄 가변 도메인 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 항-PD-L1 항체는 서열 번호 41에 제시된 중쇄 가변 도메인 서열 및 서열 번호 44에 제시된 경쇄 가변 도메인 서열을 포함한다.
일부 실시양태에서, 항-PD-L1 항체는 서열 번호 42에 제시된 서열에 대해 적어도 약 80% 동일한, 예컨대 약 85%, 약 90%, 약 95% 또는 약 99% 동일한 중쇄 가변 도메인 서열을 포함하고, 서열 번호 44에 제시된 서열에 대해 적어도 약 80% 동일한, 예컨대 약 85%, 약 90%, 약 95% 또는 약 99% 동일한 경쇄 가변 도메인 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 항-PD-L1 항체는 서열 번호 42에 제시된 중쇄 가변 도메인 서열 및 서열 번호 44에 제시된 경쇄 가변 도메인 서열을 포함한다.
일부 실시양태에서, 본원에서 언급되는 임의의 서열 또는 서열의 조합을 포함하는 항체는 모노클로날 항체이다. 일부 실시양태에서, 항-PD-L1 항체는 키메라, 인간화 또는 인간 항체이다.
일부 실시양태에서, 항체는 인간 VH 하위군 III(VH3) 중쇄 프레임워크 컨센서스 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 항체는 인간 VH 하위군 II(VH2) 중쇄 프레임워크 컨센서스 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 항체는 인간 VH 하위군 I(VH1) 중쇄 프레임워크 컨센서스 서열을 포함한다. VH3 중쇄 FR1 서열의 예는 서열 번호 10 및 11에 제시된다. VH3 중쇄 FR2 서열의 예는 서열 번호 15 및 16에 제시된다. VH3 중쇄 FR3 서열의 예는 서열 번호 22, 23 및 24에 제시된다.
일부 실시양태에서, 항체는 인간 카파 경쇄 프레임워크 컨센서스 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 항체는 인간 람다 경쇄 프레임워크 컨센서스 서열을 포함한다.
관련 기술 분야에 공지되어 있고, 본원에서 보다 상세하게 설명되는 바와 같이, 항체의 초가변 영역을 설명하는 아미노산 위치/경계는 문맥 및 관련 기술 분야에 공지된 다양한 정의에 따라 달라질 수 있다(아래에서 설명되는 바와 같이). 가변 도메인 내의 일부 위치는 이들 위치가 한 세트의 기준 하에서 초가변 영역의 내부에 있는 것으로 간주는 반면, 상이한 세트의 기준 하에서는 초가변 영역의 외부에 있는 것으로 간주될 수 있다. 이들 위치 중 하나 이상은 또한 연장된 초가변 영역에서 발견될 수 있다(아래에서 추가로 정의되는 바와 같이). 본 발명은 이들 하이브리드 초가변 위치에 변형을 포함하는 항체를 제공한다. 한 실시양태에서, 이들 초가변 위치는 중쇄 가변 도메인 내의 위치 26-30, 33-35B, 47-49, 57-65, 93, 94 및 101-102 중 하나 이상의 위치를 포함한다. 한 실시양태에서, 이들 하이브리드 초가변 위치는 경쇄 가변 도메인 내의 위치 24-29, 35-36, 46-49, 56 및 97 중 하나 이상의 위치를 포함한다.
본 발명의 측면에 따른 항체는 구체적으로 IgG, IgM, IgA, IgD 및 IgE 항체 및 이들의 단편, 바람직하게는 항원 결합 단편을 비제한적으로 포함하는 항체의 모든 이소형, 하위클래스 및 형태를 포함한다. 본원에서 바람직한 항체는 키메라 항체를 생성하기 위해 다른 이소형, 예컨대 IgG로부터의 서열을 포함하도록 변형될 수 있는 IgG, IgM 및 IgA 항체 및 이들의 항원 결합 단편을 포함한다.
일부 실시양태에서, 항-PD-L1 항체는 IgG 항체이다. 특정 실시양태에서, IgG 항체는 IgG1, IgG2(IgG2a, IgG2b), IgG3 또는 IgG4로 이루어지는 군으로부터 선택되는 하위클래스이다.
일부 실시양태에서, 항-PD-L1 항체는 IgM 항체이다. IgM 항체는 공개된 PCT 출원 PCT/US2014/054079에 기재되어 있으며, 그 개시내용은 그 전체가 본원에 참고로 포함된다.
일부 실시양태에서, 항-PD-L1 항체는 IgA 항체이다. 특정 실시양태에서, IgA 항체는 IgA1 또는 IgA2로 이루어지는 군으로부터 선택되는 하위클래스이다. IgA 항체는 공개된 PCT 출원 PCT/US2015/015268에 기재되어 있으며, 그 개시내용은 그 전체가 본원에 참고로 포함된다.
일부 실시양태에서, 항-PD-L1 항체는 변형된 J 사슬을 포함하는 IgM 항체이다. 일부 실시양태에서, 항-PD-L1 항체는 변형된 J 사슬을 포함하는 IgA 항체이다. 일부 실시양태에서, 항-PD-L1 항체는 변형된 J 사슬을 포함하는 IgG/IgM 하이브리드 항체이다. 일부 실시양태에서, 항-PD-L1 항체는 변형된 J 사슬을 포함하는 IgG/IgA 하이브리드 항체이다. 변형된 J 사슬을 포함하는 IgM, IgA, IgG/IgM 및 IgG/IgA 항체는 공개된 PCT 출원 PCT/US2015/024149에 기술되어 있으며, 그 개시내용은 그 전체가 본원에 참고로 포함된다.
본 발명의 실시양태에 따른 항체는 단일특이적, 이중특이적 또는 다중특이적일 수 있다. 이중특이적 IgG 항체는 예를 들어 미국 특허 출원 공개 2014/0120096에 기재되어 있으며, 그 개시내용은 그 전체가 본원에 참고로 포함된다.
본 발명의 측면은 2개의 상이한 결합 영역에 대한 결합 특이성을 갖는 이중특이적 IgM 항체를 포함한다. 이중특이적 IgM 항체는 공개된 PCT 출원 PCT/US2014/054079에 기재되어 있으며, 그 개시내용은 그 전체가 본원에 참고로 포함된다.
본 발명의 측면은 2개의 상이한 결합 영역에 대한 결합 특이성을 갖는 이중특이적 IgA 항체를 포함한다. 이중특이적 IgA 항체는 예를 들어 공개된 PCT 출원 PCT/US2015/015268에 기재되어 있으며, 그 개시내용은 그 전체가 본원에 참고로 포함된다.
본 발명의 측면은 IgG/IgM 및 IgG/IgA 하이브리드 항체를 포함한다. 이러한 항체는 공개된 PCT 출원 PCT/US2015/024149에 기재되어 있으며, 그 개시내용은 그 전체가 본원에 참고로 포함된다.
하나의 특정 실시양태에서, 전장 항-PD-L1 항체는 IgG 항체이다.
하나의 특정 실시양태에서, 전장 항-PD-L1 항체는 IgM 항체이다. 한 실시양태에서, 전장 항-PD-L1 IgM 항체는 외인성 결합 모이어티를 포함하는 변형된 J 사슬을 포함한다.
하나의 특정 실시양태에서, 전장 항-PD-L1 항체는 IgA 항체이다. 한 실시양태에서, 전장 항-PD-L1 IgA 항체는 외인성 결합 모이어티를 포함하는 변형된 J 사슬을 포함한다.
하나의 특정 실시양태에서, 전장 항-PD-L1 항체는 IgG/IgM 항체 하이브리드 항체이다. 한 실시양태에서, 전장 항-PD-L1 IgG/IgM 하이브리드 항체는 외인성 결합 모이어티를 포함하는 변형된 J 사슬을 포함한다.
하나의 특정 실시양태에서, 전장 항-PD-L1 항체는 IgG/IgA 하이브리드 항체이다. 한 실시양태에서, 전장 항-PD-L1 IgG/IgA 항체는 외인성 결합 모이어티를 포함하는 변형된 J 사슬을 포함한다.
본원에서 언급되는 아미노산 서열은 하기 표 1에 제시된다:
<표 1> 아미노산 서열
Figure 112018121219076-pct00001
Figure 112018121219076-pct00002
Figure 112018121219076-pct00003
Figure 112018121219076-pct00004
Figure 112018121219076-pct00005
Figure 112018121219076-pct00006
Figure 112018121219076-pct00007
Figure 112018121219076-pct00008
Figure 112018121219076-pct00009
본 발명의 측면은 IgM, IgA, IgG/IgM 또는 IgG/IgA 항체가 그의 결합 표적(들)(예를 들어, PD-L1)에 결합하는 것을 방해하지 않으면서 T 세포 억제 신호전달 경로를 길항하는 결합 모이어티를 포함하는 J 사슬을 포함하는 항체를 포함한다. 본 발명의 실시양태에 따른 항체는 예를 들어 그의 결합 모이어티가 T 세포 억제 신호전달 경로를 길항하는 변형된 J 사슬을 갖는 중합체를 혼입하고 형성하는 능력을 포함하는, IgM 항체, IgA 항체, 또는 IgG 중쇄에 IgM 또는 IgA 꼬리 조각을 함유하여 IgG 및 IgM 또는 IgA의 특성을 조합할 수 있는 IgG/IgM 또는 IgG/IgA 하이브리드 항체일 수 있다. IgG/IgM 및 IgG/IgA 하이브리드 항체에 대한 보다 상세한 내용은 예를 들어 문헌 [Koteswara et al., Clinical Immunology 2001, 101(1):21-31]을 참조한다.
T 세포 억제 신호전달 경로는 관련 기술 분야에 공지되어 있으며, 그 개시내용 전체가 본원에 참고로 포함된 문헌 [Pardoll , Drew M. "The blockade of immune checkpoints in cancer immunotherapy." Nature Reviews Cancer 12.4 (2012): 252-264]에 기재된 것을 비제한적으로 포함한다. T 세포 억제 신호전달 경로 및 이의 성분의 비제한적인 예가 아래에서 보다 상세히 설명된다.
프로그램된 세포 사멸-1(PD-1) 및 그의 리간드, 프로그램된 세포 사멸 리간드-1(PD-L1)은 일반적으로 T 세포의 면역억제 활성에 관여한다. PD-1은 면역글로불린 수퍼패밀리의 억제성 세포 표면 수용체 단백질이고, T 세포의 표면에서 발현되고 면역 및 자가 관용(self-tolerance)에서 T 세포 기능의 조절에 관여한다. PD-L1은 T 세포의 표면 상의 PD-1과 상호작용하고, 세포 주기의 진행 및 사이토카인 생산을 차단함으로써 T 세포의 증식을 억제한다(상기 문헌 참조). PD-1의 면역억제 기능의 예는 PD-1을 발현하는 T 세포의 고갈, 무반응(anergy) 및 무활동(quiescence)을 포함하고 이로 제한되지 않는다. 상기 검토된 바와 같이, 일부 실시양태에서, 항-PD-L1 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 PD-L1 단백질에 결합하여, PD-L1 단백질의 하나 이상의 면역억제 기능을 억제할 수 있다.
세포독성 T 림프구 관련 단백질 4(CTLA-4)는 면역글로불린 수퍼패밀리의 구성원이고, 억제 신호를 T 세포에 전달하는 것으로 밝혀졌다. CTLA-4의 막 결합 이소형은 디술피드 결합에 의해 상호 연결된 동종이량체로서 기능하는 반면, 가용성 이소형은 단량체로서 기능한다. 예를 들어, 상기 파돌(Pardoll)의 문헌 255 페이지를 참조한다.
T 세포 억제 신호전달 경로의 또 다른 예는 T 세포 면역글로불린 및 뮤신 도메인 3(TIM3)과 관련된 신호전달 경로이다. TIM3은 T 세포의 표면에서 발현되고 Th1 세포의 종결에 관여하는 억제 분자로서 기능하는 세포 표면 당단백질이다(상기 문헌 참조).
T 세포 억제 신호전달 경로의 또 다른 예는 림프구 활성화 유전자 3(LAG3)과 관련된 신호전달 경로이다. LAG3은 면역글로불린 수퍼패밀리에 속하며, T 세포의 세포 증식, 활성화 및 항상성의 억제제로서 기능한다(상기 문헌 참조).
T 세포 억제 신호전달 경로의 또 다른 예는 B 림프구 및 T 림프구 약화인자(attenuator) 단백질(BTLA)을 포함하는 신호전달 경로이다. BTLA는 종양 괴사 인자 수용체 수퍼패밀리와의 상호작용을 통해 T 세포를 억제함으로써 기능하는 세포 표면 단백질이다. BTLA는 T 세포 면역 반응을 부정적으로 조절하는 것으로 알려져 있다(상기 문헌 참조).
T 세포 억제 신호전달 경로의 또 다른 예는 T 세포 활성화의 V-도메인 Ig 억제인자(VISTA)를 포함하는 신호전달 경로이다. VISTA는 조혈 세포 및 백혈구에서 발현되고 T 세포 활성화를 억제함으로써 기능하는 T 세포 기능의 조절인자이다. 예를 들면, 문헌 [Lines JL , et al., Cancer research. 2014;74(7):1924-1932]을 참조한다.
T 세포 억제 신호전달 경로의 또 다른 예는 Ig 및 ITIM 도메인을 갖는 단백질 T 세포 면역수용체(TIGIT)를 포함하는 신호전달 경로이다. TIGIT는 여러 종류의 T 세포에서 발현되고, 폴리오바이러스 수용체에 높은 친화도로 결합한다. TIGIT는 성숙한 면역조절 수지상 세포의 생성을 촉진함으로써 T 세포 활성화를 억제한다. 예를 들어, 문헌 [E.g., Yu X. et al., Nat Immunol. 2009 Jan;10(1):48-57]을 참조한다.
상기 검토된 바와 같이, 본 발명의 실시양태에 따른 항체는 T 세포 억제 신호전달 경로를 길항하는 J 사슬 상의 결합 모이어티를 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, J 사슬 상의 결합 모이어티는 T 세포 억제 신호전달 경로 내의 표적에 결합하고, 따라서 경로를 통해 T 세포에 의해 수용되는 억제 신호를 차단하거나 감소시킨다. 그 결과, T 세포의 면역 반응은 차단되거나 중단되거나 감소되지 않으며, 적어도 T 세포의 면역 반응 억제가 감소되거나 감소된다. 대상 항체의 J 사슬 상의 결합 모이어티는 하기 표 2에 제시된 단백질을 포함하는 억제 신호전달 경로를 포함하고 이로 제한되지 않는 임의의 T 세포 억제 신호전달 경로를 길항하기 위해 사용될 수 있다.
<표 2> T 세포 억제 신호전달 경로 표적에 대한 서열 정보
Figure 112018121219076-pct00010
본 발명의 측면은 대상체의 순환계로부터 항체의 제거를 감소시켜 대상체에서 항체의 반감기를 증가시키는 결합 모이어티를 포함하는 J 사슬을 갖는 항-PD-L1 항체를 포함한다. 알부민 결합은 단백질의 약동학을 개선하기 위한 일반적인 전략으로 관련 기술 분야에 공지되어 있다. 예를 들어, 알부민과의 비공유 회합은 수명이 짧은 단백질의 반감기를 연장시키는 것으로 밝혀졌다. 예를 들어, 그 개시내용 전체가 본원에 참고로 포함된 문헌 [Dennis, Mark S. et al., J. Biol . Chem ., 2002, 277:35035-35043]을 참조한다. 따라서, 알부민(인간 혈청 알부민), 알부민 유사 단백질 또는 알부민 결합 펩티드를 항-PD-L1 항체에서 J 사슬 상의 결합 모이어티로서 사용하는 것은 항체의 약동학을 조작하기 위한 효과적인 전략을 제공한다. 또한, 신생아 Fc 수용체(FcRn)는 면역글로불린 분자에 대해 보다 긴 순환 반감기를 제공하는 재순환 경로를 제공하는 것으로 알려져 있다. 예를 들어, 문헌 [Roopenian D.C. et al., Nature Reviews Immunology 7, 715-725 (2007)]을 참조한다. 따라서, FcRn 결합 단백질, FcRn에 결합하는 Fc 도메인, 또는 FcRn에 결합하는 항체 모이어티의 사용은 또한 항체의 약동학을 조작하기 위한 효과적인 전략을 제공한다.
일부 실시양태에서, 대상 항-PD-L1 항체의 J 사슬 상의 결합 모이어티는 알부민 단백질을 포함한다. 알부민 단백질은 혈장에서 흔히 발견되는 가용성의 비글리코실화된 단백질이다. 알부민 단백질은 FcRn 매개 재순환 경로와 상호작용하고, 결과적으로 매우 긴 순환 반감기를 갖는 것으로 알려져 있다.
특정 실시양태에서, 대상 항-PD-L1 항체의 J 사슬 상의 결합 모이어티는 알부민 단백질에 결합함으로써, 그 자체를 알부민 단백질에 연결시키고 FcRn 매개 재순환 경로를 이용한다. 따라서, 특정 실시양태에서, 대상 항-PD-L1 항체의 J 사슬 상의 결합 모이어티는 알부민 결합 펩티드를 포함한다. 알부민 결합 펩티드의 비제한적인 예가 미국 특허 출원 공개 US20050287153에 개시되어 있으며, 그 개시내용은 그 전체가 본원에 참고로 포함된다. 일부 실시양태에서, 대상 항-PD-L1 항체의 J 사슬 상의 결합 모이어티는 알부민 결합 항체 잔기를 포함한다. 알부민에 결합하는 항체 모이어티의 비제한적인 예는 항-알부민 Fab, 항-알부민 scFv, 항-알부민 VHH(예를 들어, 낙타류(camelid) 유사 항체 분자), 항-알부민 scFab, 및 항-알부민 dAb(예를 들어, 인간 도메인 항체)를 포함한다.
일부 실시양태에서, 대상 항-PD-L1 항체의 J 사슬 상의 결합 모이어티는 FcRn 결합 펩티드를 포함한다. 특정 실시양태에서, 대상 항-PD-L1 항체의 J 사슬 상의 결합 모이어티는 FcRn 결합 항체 모이어티를 포함한다. FcRn에 결합하는 항체 모이어티의 비제한적인 예는 항-FcRn Fab, 항-FcRn scFv, 항-FcRn VHH, 항-FcRn scFab 및 항-FcRn dAb를 포함한다.
일부 실시양태에서, 대상 항-PD-L1 항체의 J 사슬 상의 결합 모이어티는 FcRn 수용체에 의해 결합된 면역글로불린 분자의 Fc 도메인을 포함한다. 항-PD-L1 항체의 청소를 감소시키기 위해 대상 항-PD-L1 항체의 J 사슬에 포함될 수 있는 결합 모이어티는 비제한적으로 하기 표 3에 제시된 결합 모이어티를 포함한다. 대상 항-PD-L1 항체의 J 사슬 상의 결합 모이어티로서 사용될 수 있는 항체 모이어티를 생성하기 위해 사용될 수 있는 단백질의 비제한적인 예가 또한 표 3에 제시된다.
<표 3> 청소 감소 결합 모이어티에 대한 서열 정보
Figure 112018121219076-pct00011
대상 항체의 J 사슬 상의 결합 모이어티는 비제한적으로, 항체, 항체의 항원 결합 단편, 항체-약물 접합체, 항체-약물 접합체의 항원 결합 단편, 항체 유사 분자, 항체 유사 분자의 항원 결합 단편, 가용성 및 막 결합 단백질, 리간드 및 수용체를 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 항체의 항원 결합 단편은 Fab, Fab', F(ab)2, F(ab')2, Fv, scFv 및 단일 도메인 항체로 이루어지는 군으로부터 선택된다. 바람직한 실시양태에서, J 사슬 상의 결합 모이어티는 T 세포 억제 신호전달 경로의 길항제로서 기능하는 단일특이적, 이중특이적 및 다중특이적 항체 및 항체 단편을 포함하는 항체 또는 항체의 항원 결합 단편("항체 단편"으로도 언급됨)이다. 바람직한 실시양태에서, 항체 단편은 단일쇄 Fv(scFv)이다.
본 발명의 측면은 세포 표면 단백질(예를 들어, CD20, EGFR, HER2, CTLA-4, TIM3, LAG3, VISTA 또는 TIGIT 단백질)에 결합하는 IgM, IgA, IgG/IgM 또는 IgG/IgA 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 포함하고, 여기서 IgM, IgA, IgG/IgM 또는 IgG/IgA 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 본원에서 설명되는 항-PD-L1 항체 또는 항원 결합 단편을 포함하는 외인성 결합 모이어티를 포함하는 변형된 J 사슬을 포함한다.
일부 측면에서, 본 발명은 본원에서 설명되는 임의의 항-PD-L1 항체를 코딩하는 DNA를 포함하는 벡터를 제공한다. 임의의 상기 벡터를 포함하는 숙주 세포도 제공된다. 예를 들어, 숙주 세포는 CHO 세포, 이. 콜라이(E. coli) 세포 또는 효모 세포일 수 있다. 본원에서 설명되는 임의의 폴리펩티드를 생산하는 방법이 추가로 제공되며, 목적하는 폴리펩티드의 발현에 적합한 조건 하에 숙주 세포를 배양하고 세포 배양물로부터 목적하는 폴리펩티드를 회수하는 것을 포함한다.
본 발명의 실시양태에 따른 항체는 임의의 공지된 검정 방법, 예컨대 ELISA, 경쟁 결합 검정, 직접 및 간접 샌드위치 검정, 및 면역침강 검정에서 사용될 수 있다(Zola, (1987) Monoclonal Antibodies: A Manual of Techniques, pp.147-158, CRC Press, Inc.).
검출 표지는 결합 또는 인식 이벤트를 국재화, 시각화 및 정량화하기 위해 유용할 수 있다. 본 발명의 표지된 항체는 세포 표면 수용체를 검출할 수 있다. 검출 가능하게 표지된 항체에 대한 또 다른 용도는 비드를 형광 표지된 항체와 접합시키고 리간드의 결합시에 형광 신호를 검출하는 것을 포함하는 비드 기반 면역캡쳐 방법이다. 유사한 결합 검출 방법은 항체-항원 상호작용을 측정하고 검출하기 위해 표면 플라스몬 공명(SPR) 효과를 이용한다.
검출 표지, 예컨대 형광 염료 및 화학발광 염료(Briggs et al. (1997) "Synthesis of Functionalised Fluorescent Dyes and Their Coupling to Amines and Amino Acids," J. Chem. Soc., Perkin-Trans. 1:1051-1058)는 검출 가능한 신호를 제공하고, 바람직하게는 다음 특성과 함께 항체 표지에 일반적으로 적용될 수 있다: (i) 표지된 항체는 낮은 배경에서 매우 높은 신호를 생성하여, 소량의 항체가 무세포 및 세포 기반 검정에서 민감하게 검출될 수 있어야 하고; (ii) 표지된 항체는 형광 신호가 현저한 광 표백(photo bleaching) 없이 관찰, 모니터링 및 기록될 수 있도록 광 안정성이어야 한다. 막 또는 세포 표면, 특히 살아있는 세포에 대한 표지된 항체의 세포 표면 결합을 포함하는 적용의 경우, 표지는 바람직하게는 (iii) 효과적인 접합체 농도 및 검출 감도를 달성하기에 양호한 수 용해도를 갖고, (iv) 세포의 정상적인 대사 과정을 방해하거나 조기 세포 사멸을 유발하지 않도록 살아있는 세포에 무독성이다.
세포 형광 강도 및 형광 표지된 이벤트, 예를 들어 펩티드-염료 접합체의 세포 표면 결합의 직접적인 정량은 살아있는 세포 또는 비드를 사용한 혼합 및 판독, 비방사성 검정을 자동화하는 시스템(FMAT® 8100 HTS 시스템, Applied Biosystems, 미국 포스터 시티 소재)에서 수행할 수 있다(Miraglia, "Homogeneous cell- and bead-based assays for high throughput screening using fluorometric microvolume assay technology", (1999) J. of Biomolecular Screening 4:193-204). 표지된 항체의 용도는 또한 세포 표면 수용체 결합 검정, 면역포획 분석, 형광 연결 면역흡착 검정(FLISA), 카스파제 절단([Zheng, "Caspase-3 controls both cytoplasmic and nuclear events associated with Fas-mediated apoptosis in vivo", (1998) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95:618-23]; US 6372907), 아폽토시스(Vermes, "A novel assay for apoptosis. Flow cytometric detection of phosphatidylserine expression on early apoptotic cells using fluorescein labelled Annexin V" (1995) J. Immunol. Methods 184:39-51) 및 세포독성 검정을 포함한다. 형광측정 마이크로볼륨 검정 기술은 세포 표면을 표적으로 하는 분자에 의한 상향 또는 하향 조절을 확인하기 위해 사용될 수 있다(Swartzman, "A homogeneous and multiplexed immunoassay for high-throughput screening using fluorometric microvolume assay technology", (1999) Anal. Biochem. 271:143-51).
본 발명의 표지된 항체는 다음과 같은 생체의학 및 분자 영상화의 다양한 방법 및 기술에 의한 영상화 바이오마커 및 프로브로서 유용하다: (i) MRI(자기 공명 영상화; (ii) MicroCT(전산화 단층 촬영); (iii) SPECT(단일 광자 방출 컴퓨터 단층 촬영); (iv) PET(양전자 방출 단층 촬영)(Chen et al. (2004) Bioconjugate Chem. 15:41-49); (v) 생물발광; (vi) 형광; 및 (vii) 초음파. 면역섬광조영술 (immunoscintigraphy)은 방사성 물질로 표지된 항체를 동물 또는 인간 환자에게 투여하고 항체가 위치하는 신체 내 부위의 사진을 찍는 영상화 절차이다(US 6528624). 영상화 바이오마커는 객관적으로 측정되고, 정상적인 생물학적 과정, 병원성 과정, 치료적 개입에 대한 약리학적 반응의 표지자로서 평가될 수 있다.
펩티드 표지 방법은 잘 알려져 있다. 다음 문헌을 참조한다: [Haugland, 2003, Molecular Probes Handbook of Fluorescent Probes and Research Chemicals, Molecular Probes, Inc.]; [Brinkley, 1992, Bioconjugate Chem. 3:2]; [Garman, (1997) Non-Radioactive Labelling: A Practical Approach, Academic Press, London]; [Means (1990) Bioconjugate Chem. 1:2]; [Glazer et al (1975) Chemical Modification of Proteins. Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology (T. S. Work and E. Work, Eds.) American Elsevier Publishing Co., New York]; [Lundblad, R. L. and Noyes, C. M. (1984) Chemical Reagents for Protein Modification, Vols. I and II, CRC Press, New York]; [Pfleiderer, G. (1985) "Chemical Modification of Proteins", Modern Methods in Protein Chemistry, H. Tschesche, Ed., Walter DeGryter, Berlin and New York]; [Wong (1991) Chemistry of Protein Conjugation and Cross-linking, CRC Press, Boca Raton, Fla.)]; [De Leon-Rodriguez et al (2004) Chem.Eur. J. 10:1149-1155]; [Lewis et al (2001) Bioconjugate Chem. 12:320-324]; [Li et al (2002) Bioconjugate Chem. 13:110-115]; [Mier et al (2005) Bioconjugate Chem. 16:240-237].
충분히 근접한 2개의 모이어티, 즉 형광 리포터 및 소광체(quencher)로 표지된 펩티드 및 단백질은 형광 공명 에너지 전달(FRET)을 겪는다. 리포터 기는 전형적으로 특정 파장의 빛에 의해 여기되고 에너지를 수용체 또는 소광체 기에 전달하는 형광 염료이며, 최대 휘도에서 방출을 위한 적절한 스토크스 이동(Stokes shift)을 한다. 형광 염료는 플루오레세인 및 로다민과 같은 확장된 방향족 특성(aromaticity)을 갖는 분자 및 이들의 유도체를 포함한다. 형광 리포터는 무손상 펩티드의 소광제 모이어티에 의해 부분적으로 또는 현저하게 소광될 수 있다. 펩티다제 또는 프로테아제에 의한 펩티드의 절단시에, 검출 가능한 형광의 증가가 측정될 수 있다(Knight, C. (1995) "Fluorimetric Assays of Proteolytic Enzymes", Methods in Enzymology, Academic Press, 248:18-34).
본 발명의 표지된 항체는 또한 친화도 정제제로도 사용될 수 있다. 이 과정에서, 표지된 항체는 관련 기술 분야에 공지된 방법을 사용하여 세파덱스(Sephadex) 수지 또는 여과지와 같은 고상에 고정된다. 고정된 항체를 정제하고자 하는 항원을 함유하는 샘플과 접촉시킨 후, 고정된 폴리펩티드 변이체에 결합된 정제되는 항원을 제외한 샘플 내의 실질적으로 모든 물질을 제거하는 적절한 용매로 지지체를 세척한다. 최종적으로, 지지체는 폴리펩티드 변이체로부터 항원을 방출할 또 다른 적합한 용매, 예컨대 글리신 버퍼(pH 5.0)로 세척한다.
일부 실시양태에서, 본 발명은 치료제로서 본원에서 사용될 수 있는 항-PD-L1 항체를 제공한다. 예시적인 항체는 폴리클로날, 모노클로날, 키메라, 인간화 및 인간 항체를 포함한다.
폴리클로날 항체
폴리클로날 항체는 바람직하게는 관련 항원 및 보조제의 다중 피하(sc) 또는 복강내(ip) 주사에 의해 동물에서 유도된다. 관련 항원(특히 합성 펩티드가 사용되는 경우)을 면역화되는 종에서 면역원성인 단백질에 접합시키는 것이 유용할 수 있다. 예를 들어, 항원은 2기능성 또는 유도체화제, 예를 들어 말레이미도벤조일 술포숙신이미드 에스테르(시스테인 잔기를 통한 접합), N-히드록시숙신이미드(리신 잔기를 통한), 글루타르알데히드, 숙신산 무수물, SOCl2, 또는 R'N=C=NR(여기서 R 및 R1은 상이한 알킬기임)을과 같은 를 사용하여 키홀 림펫 헤모시아닌(KLH), 혈청 알부민, 소 티로글로불린 또는 대두 트립신 억제제에 접합될 수 있다.
동물은 예를 들어, 100 ㎍ 또는 5 ㎍의 단백질 또는 접합체(각각 토끼 또는 마우스에 대해)를 3배 부피의 프로인트 완전 보조제와 조합하고 용액을 다수의 부위에서 피내 주사함으로써 항원, 면역원성 접합체 또는 유도체에 대해 면역화된다. 한 달 후, 동물은 다수의 부위에서 피하 주사에 의해 프로인트 완전 보조제 내의 원래 양의 1/5 내지 1/10의 펩티드 또는 접합체로 부스팅된다. 7 내지 14일 후, 동물에서 채혈하고, 혈청을 항체 역가에 대해 검정한다. 역가가 평탄해질 때까지 동물을 부스팅한다. 접합체는 또한 단백질 융합체로서 재조합 세포 배양에서 제조될 수 있다. 또한, 면역 반응을 향상시키기 위해 명반과 같은 응집제가 적절하게 사용된다.
모노클로날 항체
관심 항원에 대한 모노클로날 항체(mAb)는 관련 기술 분야에 공지된 임의의 기술을 사용하여 제조할 수 있다. 이것은 다음을 포함하고, 이로 제한되지 않는다: 문헌 [Kohler and Milstein (1975, Nature 256, 495-497)]에 원래 설명된 하이브리도마 기술, 인간 B 세포 하이브리도마 기술(Kozbor et al., 1983, Immunology Today 4:72) 및 EBV-하이브리도마 기술(Cole et al., 1985, Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, Inc., pp. 77-96), 선택된 림프구 항체 방법(SLAM) (Babcook, J.S., et al., A novel strategy for generating monoclonal antibodies from single, isolated lymphocytes producing antibodies of defined specificities. Proc Natl Acad Sci U S A, 1996. 93 (15): p. 7843-8.) 및 (McLean GR, Olsen OA, Watt IN, Rathanaswami P, Leslie KB, Babcook JS, Schrader JW. Recognition of human cytomegalovirus by human primary immunoglobulins identifies an innate foundation to an adaptive immune response. J Immunol. 2005 Apr 15;174(8):4768-78). 이러한 항체는 IgG, IgM, IgE, IgA 및 IgD를 포함하는 임의의 면역글로불린 클래스 및 그의 임의의 하위클래스일 수 있다. 본 발명에서 사용되는 mAb를 생산하는 하이브리도마는 시험관 내에서 또는 생체 내에서 배양될 수 있다.
모노클로날 항체는 문헌 [Kohler et al., Nature, 256:495 (1975)]에서 처음 기술된 하이브리도마 방법을 사용하여 제조될 수 있거나, 재조합 DNA 방법(미국 특허 제4,816,567호)에 의해 제조될 수 있다.
하이브리도마 방법에서, 마우스 또는 다른 적절한 숙주 동물, 예컨대 햄스터를 면역화에 사용된 단백질에 특이적으로 결합할 항체를 생산하거나 생산할 수 있는 림프구를 유도하기 위해 상기 설명된 바와 같이 면역화시킨다. 대안으로, 림프구를 시험관 내에서 면역화할 수 있다. 면역화 후, 림프구를 단리한 다음, 적절한 융합제, 예컨대 폴리에틸렌 글리콜을 사용하여 골수종 세포주와 융합시켜 하이브리도마 세포를 형성시킨다(Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, pp. 59-103 (Academic Press, 1986)).
이와 같이 제조된 하이브리도마 세포를 적합한 배양 배지에 접종하고 배양하고, 여기서 배지는 바람직하게는 비융합된 모 골수종 세포(융합 파트너로도 언급됨)의 성장 또는 생존을 억제하는 하나 이상의 물질을 함유한다. 예를 들어, 모 골수종 세포에 효소 히포잔틴 구아닌 포스포리보실 트랜스퍼라제(HGPRT 또는 HPRT)가 결여된 경우, 하이브리도마의 선택 배양 배지는 일반적으로 히포잔틴, 아미노프테린 및 티미딘(HAT 배지)을 포함할 것이고, 이들 물질은 HGPRT 결핍 세포의 성장을 방지한다.
바람직한 융합 파트너 골수종 세포는 효율적으로 융합하고 선택된 항체 생산 세포에 의한 항체의 안정한 고수준 생산을 지지하고 융합되지 않은 모 세포를 선택하는 선택 배지에 민감한 세포이다. 바람직한 골수종 세포주는 미국 캘리포니아주 샌디에고에 소재하는 솔크 인스티튜트 셀 디스트리뷰션 센터(Salk Institute Cell Distribution Center)로부터 입수 가능한 MOPC-21 및 MPC-11 마우스 종양에서 유래된 것과 같은 뮤린 골수종 세포주 및 미국 버지니아주 매너서스 소재의 아메리칸 타입 컬쳐 컬렉션(American Type Culture Collection)으로부터 입수 가능한 SP-2 및 유도체, 예를 들어 X63-Ag8-653 세포이다. 인간 골수종 및 마우스-인간 이종골수종 세포주는 또한 인간 모노클로날 항체의 생산에 대해 기술된 바 있다(Kozbor, J. Immunol., 133:3001 (1984)]; 및 [Brodeur et al., Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, pp. 51-63 (Marcel Dekker, Inc., New York, 1987)]).
하이브리도마 세포가 성장하는 배양 배지는 항원에 대해 작용하는 모노클로날 항체의 생성에 대해 검정된다. 바람직하게는, 하이브리도마 세포에 의해 생성된 모노클로날 항체의 결합 특이성은 면역침강 또는 예를 들어 시험관 내 결합 검정, 예컨대 방사 면역 검정(RIA) 또는 효소 연결 면역흡착 검정(ELISA)에 의해 결정된다.
모노클로날 항체의 결합 친화도는 예를 들어 문헌 [Munson et al., Anal. Biochem., 107:220(1980)]에 기재된 스캐챠드(Scatchard) 분석에 의해 결정될 수 있다.
원하는 특이성, 친화도 및/또는 활성을 갖는 항체를 생산하는 하이브리도마 세포가 확인되면, 클론은 제한 희석 절차에 의해 서브클로닝하고 표준 방법에 의해 성장시킬 수 있다(Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, pp. 59-103 (Academic Press, 1986)). 이 목적에 적합한 배양 배지는 예를 들어 D-MEM 또는 RPMI-1640 배지를 포함한다. 또한, 하이브리도마 세포는 동물에서 복수 종양으로서 생체 내에서, 예를 들어 마우스에 대한 세포의 i.p. 주사에 의해 성장될 수 있다.
서브클론에 의해 분비된 모노클로날 항체는 통상적인 항체 정제 절차, 예를 들어 친화도 크로마토그래피(예를 들어, 단백질 A 또는 단백질 G-세파로스를 사용) 또는 이온 교환 크로마토그래피, 히드록실아파타이트 크로마토그래피, 겔 전기영동, 투석 등에 의해 배양 배지, 복수액 또는 혈청으로부터 적합하게 분리된다.
모노클로날 항체를 코딩하는 DNA는 통상적인 절차를 사용하여(예를 들어, 뮤린 항체의 중쇄 및 경쇄를 코딩하는 유전자에 특이적으로 결합할 수 있는 올리고뉴클레오티드 프로브를 사용하여) 용이하게 단리되고 서열결정된다. 하이브리도마 세포는 그러한 DNA의 바람직한 공급원으로서 작용한다. 일단 단리된 DNA는 발현 벡터 내에 위치시킨 다음, 재조합 숙주 세포에서 모노클로날 항체의 합성을 달성하기 위해 발현 벡터를 항체 단백질을 생산하지 않는 이. 콜라이 세포, 원숭이 COS 세포, 차이니즈 햄스터 난소(CHO) 세포 또는 골수종 세포와 같은 숙주 세포 내로 도입하여 이를 형질감염시킬 수 있다. 항체를 코딩하는 DNA의 박테리아 내에서의 재조합 발현에 대한 검토 논문은 문헌 [Skerra et al., Curr. Opinion in Immunol., 5:256-262 (1993)] 및 [Pliickthun, Immunol. Revs. 130:151-188 (1992)]을 포함한다.
추가의 실시양태에서, 모노클로날 항체 또는 항체 단편은 문헌 [McCafferty et al., Nature, 348:552-554 (1990)]에 기재된 기술을 사용하여 생성된 항체 파지 라이브러리로부터 단리될 수 있다. 문헌 [Clackson et al., Nature, 352:624-628 (1991)] 및 [Marks et al., J. Mol. Biol., 222:581-597 (1991)]은 파지 라이브러리를 사용하여 각각 뮤린 및 인간 항체의 단리를 설명하고 있다. 후속 간행물은 사슬 셔플링에 의한 고 친화도(nM 범위) 인간 항체의 생산(Marks et al., Bio/Technology, 10:779-783 (1992)), 및 매우 큰 파지 라이브러리를 구축하기 위한 전략으로서의 조합 감염 및 생체 내 재조합(Waterhouse et al., Nuc. Acids. Res. 21:2265-2266 (1993))을 설명한 바 있다. 따라서, 이들 기술은 모노클로날 항체의 단리를 위한 전통적인 모노클로날 항체 하이브리도마 기술에 대한 실행 가능한 대안이다.
항체를 코딩하는 DNA는 예를 들어 상동성 뮤린 서열을 인간 중쇄 및 경쇄 불변 도메인(CH 및 CO 서열로 치환함으로써(미국 특허 제4,816,567호; 및 [Morrison, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81:6851 (1984)]), 또는 면역글로불린 코딩 서열을 비면역글로불린 폴리펩티드(이종성 폴리펩티드)에 대한 코딩 서열의 전부 또는 일부와 융합시킴으로써 키메라 또는 융합 항체 폴리펩티드를 생산하도록 변형될 수 있다. 비면역글로불린 폴리펩티드 서열은 항체의 불변 도메인을 치환할 수 있거나, 이들은 한 항원에 대한 특이성을 갖는 하나의 항원 결합 부위 및 상이한 항원에 대한 특이성을 갖는 또 다른 항원 결합 부위를 포함하는 키메라 2가 항체를 생성하기 위해 항체의 하나의 항원 결합 부위의 가변 도메인을 치환한다.
키메라 , 인간화 및 인간 항체
일부 실시양태에서, 항-PD-L1 항체는 키메라 항체이다. 특정 키메라 항체는 예를 들어 미국 특허 제4,816,567호; 및 문헌 [Morrison, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81:6851 (1984)]에 기재되어 있다. 한 예에서, 키메라 항체는 비인간 가변 영역(예를 들어, 마우스, 래트, 햄스터, 토끼 또는 비인간 영장류, 예컨대 원숭이로부터 유래된 가변 영역) 및 인간 불변 영역을 포함한다. 추가의 예에서, 키메라 항체는 클래스 또는 하위클래스가 모 항체의 것으로부터 변경된 "클래스 전환" 항체이다. 키메라 항체는 그의 항원 결합 단편을 포함한다.
일부 실시양태에서, 키메라 항체는 인간화 항체이다. 전형적으로, 비인간 항체는 모 비인간 항체의 특이성 및 친화도를 유지하면서 인간에 대한 면역원성을 감소시키기 위해 인간화된다. 일반적으로, 인간화 항체는 HVR(또는 그의 일부)이 비인간 항체로부터 유래되고 FR(또는 그의 일부)이 인간 항체 서열로부터 유래되는 하나 이상의 가변 도메인을 포함한다. 또한, 인간화 항체는 선택적으로 인간 불변 영역의 적어도 일부를 포함할 것이다. 일부 실시양태에서, 인간화 항체의 일부 FR 잔기는 예를 들어 항체 특이성 또는 친화도를 회복시키거나 개선하기 위해, 비인간 항체(예를 들어, 그로부터 HVR 잔기가 유래되는 항체)로부터의 상응하는 잔기로 치환된다.
본 발명의 실시양태에 따른 항-PD-L1 항체는 인간화 또는 인간 항체일 수 있다. 비인간(예를 들어, 뮤린 또는 토끼) 항체의 인간화 형태는 비인간 면역글로불린으로부터 유도된 최소 서열을 함유하는 키메라 면역글로불린, 면역글로불린 사슬 또는 이의 단편(예컨대, Fv, Fab, Fab', F(ab')2 또는 항체의 다른 항원 결합 하위서열)이다. 인간화 항체는 수여자의 HVR로부터의 잔기가 원하는 특이성, 친화도 및 능력을 갖는 마우스, 래트 또는 토끼와 같은 비인간 종(공여자 항체)의 HVR로부터의 잔기로 대체된 인간 면역글로불린(수여자 항체)을 포함한다. 일부 경우에, 인간 면역글로불린의 Fv 프레임워크 잔기는 상응하는 비인간 잔기로 대체된다. 인간화 항체는 또한 수여자 항체 또는 도입된 HVR 또는 프레임워크 서열에서 발견되지 않는 잔기를 포함할 수 있다. 일반적으로, 인간화 항체는 모든 또는 실질적으로 모든 HVR이 비인간 면역글로불린의 것에 상응하고 모든 또는 실질적으로 모든 FR 영역이 인간 면역글로불린 컨센서스 서열의 것인 적어도 하나, 전형적으로 2개의 가변 도메인을 실질적으로 모두 포함할 것이다. 또한, 인간화 항체는 최적으로 면역글로불린 불변 영역의 적어도 일부(예를 들어, Fc 영역), 전형적으로 인간 면역글로불린의 것을 포함할 것이다([Jones et al., Nature, 321:522-525 (1986)]; [Riechmann et al., Nature, 332:323-329 (1988)]; 및 [Presta, Curr. Op. Struct. Biol., 2:593-596 (1992)]).
비인간 항체를 인간화하는 방법은 관련 기술 분야에 잘 알려져 있다. 일반적으로, 인간화 항체는 비인간 공급원으로부터 도입된 하나 이상의 아미노산 잔기를 갖는다. 이러한 비인간 아미노산 잔기는 종종 "도입(import)" 잔기로 언급되고, 이는 일반적으로 "도입" 가변 도메인으로부터 유도된 것이다. 인간화는 본질적으로 윈터(Winter) 및 동료의 방법([Jones et al., Nature, 321:522-525 (1986)]; [Riechmann et al., Nature, 332:323-327 (1988)]; [Verhoeyen et al., Science, 239:1534-1536 (1988)])에 따라, 인간 항체의 상응하는 서열을 설치류 HVR 또는 HVR 서열로 치환함으로써 수행될 수 있다. 따라서, 이러한 "인간화" 항체는 실질적으로 무손상 인간 가변 도메인보다 짧은 서열이 비인간 종으로부터의 상응하는 서열에 의해 치환된 키메라 항체(미국 특허 제4,816,567호)이다. 실제로, 인간화 항체는 전형적으로 일부의 HVR 잔기 및 가능하게는 일부의 FR 잔기가 설치류 항체의 유사한 부위로부터의 잔기에 의해 치환된 인간 항체이다.
인간화 항체를 만들기 위해 사용되는 경쇄 및 중쇄 둘 모두의 인간 가변 도메인의 선택은 항체가 인간 치료 용도를 위한 것일 때 항원성 및 HAMA 반응(인간 항-마우스 항체)을 감소시키기 위해 매우 중요하다. HAMA 반응의 감소 또는 제거는 적합한 치료제의 임상 개발의 중요한 측면이다. 예를 들어, 문헌 [Khaxzaeli et al., J. Natl. Cancer Inst. (1988), 80:937]; [Jaffers et al., Transplantation (1986), 41:572]; [Shawler et al., J. Immunol. (1985), 135:1530]; [Sears et al., J. Biol. Response Mod. (1984), 3:138]; [Miller et al., Blood (1983), 62:988]; [Hakimi et al., J. Immunol. (1991), 147:1352]; [Reichmann et al., Nature (1988), 332:323]; [Junghans et al., Cancer Res. (1990), 50:1495]을 참조한다. 본원에서 설명되는 바와 같이, 본 발명은 HAMA 반응이 감소되거나 제거되도록 인간화된 항체를 제공한다. 이들 항체의 변이체는 관련 기술 분야에 공지된 통상적인 방법을 사용하여 추가로 수득할 수 있으며, 이들 중 일부는 아래에서 추가로 설명된다. 소위 "최적 맞춤(best-fit)" 방법에 따르면, 설치류 항체의 가변 도메인의 서열은 공지된 인간 가변 도메인 서열의 전체 라이브러리에 대해 스크리닝된다. 설치류에 가장 근접한 인간 V 도메인 서열이 확인되고, 그 내부의 인간 프레임워크 영역(FR)이 인간화 항체에서 수용된다([Sims et al., J. Immunol. 151:2296 (1993)]; [Chothia et al., J. Mol. Biol., 196:901 (1987)]). 또 다른 방법은 경쇄 또는 중쇄의 특정 하위군의 모든 인간 항체의 컨센서스 서열로부터 유도된 특정 프레임워크 영역을 사용한다. 동일한 프레임워크는 몇 가지 상이한 인간화 항체에 사용될 수 있다([Carter et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89:4285 (1992)]; [Presta et al., J. Immunol. 151:2623 (1993)]).
예를 들어, 본원에서 설명되는 항체로부터의 아미노산 서열은 프레임워크 및/또는 초가변 서열(들)의 다양화를 위한 출발(모) 서열로서 작용할 수 있다. 출발 초가변 서열이 연결되는 선택된 프레임워크 서열은 본원에서 수용자 인간 프레임워크로 지칭된다. 수용자 인간 프레임워크는 인간 면역글로불린(그의 VL 및/또는 그의 VH 영역)으로부터 유래되거나 이로부터 유도될 수 있지만, 수용자 인간 프레임워크는 바람직하게는 그러한 프레임워크가 인간 환자에서 최소의 면역원성을 갖거나 면역원성을 전혀 갖지 않는 것으로 증명되었기 때문에 인간 컨센서스 프레임워크 서열로부터 유래되거나 이로부터 유도된다.
수용자가 인간 면역글로불린으로부터 유도된 경우, 선택적으로 공여자 프레임워크 서열을 인간 프레임워크 서열 집합체 내의 다양한 인간 프레임워크 서열과 정렬함으로써 공여자 프레임워크 서열에 대한 그의 상동성에 기초하여 선택된 인간 프레임워크 서열을 임의로 선택할 수 있고, 가장 상동성인 프레임워크 서열을 수용자로서 선택할 수 있다.
인간 면역글로불린 또는 인간 컨센서스 프레임워크에서 유래한 것과는 상관 없이 수용자는 선택된 인간 프레임워크 서열과 그 서열이 동일할 수 있지만, 본 발명은 수용자 서열이 인간 면역글로불린 서열 또는 인간 컨센서스 프레임워크 서열에 비해 이미 존재하는 아미노산 치환을 포함할 수 있음을 고려한다. 이미 존재하는 이들 치환은 바람직하게는 최소이고; 일반적으로 인간 면역글로불린 서열 또는 컨센서스 프레임워크 서열에 비해 단지 4, 3, 2 또는 1개의 아미노산 차이가 존재한다.
일부 실시양태에서, 비인간 항체의 초가변 영역 잔기는 VL 및/또는 VH 수용자 인간 프레임워크 내에 혼입된다. 예를 들어, 카바트(Kabat) CDR 잔기, 코티아(Chothia) 초가변 루프 잔기, Abm 잔기 및/또는 접촉 잔기에 상응하는 잔기를 혼입시킬 수 있다. 선택적으로, 다음과 같은 연장된 초가변 영역 잔기가 혼입된다: 24-34(L1), 50-56(L2) 및 89-97(L3), 26-35B(H1), 50-65, 47-65 또는 49-65(H2) 및 93-102, 94-102 또는 95-102(H3).
초가변 영역 잔기의 "혼입"은 본원에서 논의되지만, 이는 다양한 방식으로 달성될 수 있음이 이해될 것이고, 예를 들어, 그의 프레임워크 잔기가 수용자 인간 프레임워크 잔기로 변경되도록 마우스 가변 도메인 서열을 코딩하는 핵산을 돌연변이시킴으로써 또는 초가변 도메인 잔기가 비인간 잔기로 변경되록 인간 가변 도메인 서열을 코딩하는 핵산을 변형시킴으로써, 또는 원하는 서열을 코딩하는 핵산을 합성함으로써 원하는 아미노산 서열을 코딩하는 핵산을 생성할 수 있다.
본원에서 설명되는 바와 같이, 초가변 영역 이식 변이체는 각각의 초가변 영역에 대해 별개의 올리고뉴클레오티드를 사용하여 인간 수용자 서열을 코딩하는 핵산의 쿤켈(Kunkel) 돌연변이 유발에 의해 생성될 수 있다(Kunkel et al., Methods Enzymol. 154:367-382 (1987)). 적절한 변경은 적절한 초가변 영역-항원 상호작용을 수정하고 재확립하기 위해 통상적인 기술을 사용하여 프레임워크 및/또는 초가변 영역 내에 도입될 수 있다.
파지(미드) 디스플레이(본원에서 일부 문맥에서 파지 디스플레이로도 언급됨)는 서열 무작위화(randomization)에 의해 생성된 라이브러리에서 많은 상이한 잠재적 변이체 항체를 생성하고 스크리닝하기 위한 편리하고 빠른 방법으로서 사용될 수 있다. 그러나, 변형된 항체를 제조하고 스크리닝하기 위한 다른 방법이 통상의 기술자에게 이용 가능하다.
파지(미드) 디스플레이 기술은 항원과 같은 리간드에 결합하는 신규 단백질을 생성하고 선택하기 위한 강력한 도구를 제공한다. 파지(미드) 디스플레이 기술을 사용하면, 표적 분자에 높은 친화도로 결합하는 서열을 신속하게 분류할 수 있는 단백질 변이체의 대형 라이브러리를 생성할 수 있다. 변이체 폴리펩티드를 코딩하는 핵산은 일반적으로 바이러스 코트 단백질, 예컨대 유전자 III 단백질 또는 유전자 VIII 단백질을 코딩하는 핵산 서열에 융합된다. 단백질 또는 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 서열이 유전자 III 단백질의 일부를 코딩하는 핵산 서열에 융합되는 1가 파지미드 디스플레이 시스템이 개발되었다([Bass, S., Proteins, 8:309 (1990)]; [Lowman and Wells, Methods: A Companion to Methods in Enzymology, 3:205 (1991)]). 1가 파지미드 디스플레이 시스템에서, 유전자 융합은 낮은 수준으로 발현되고, 야생형 유전자 III 단백질은 또한 입자의 감염성이 유지되도록 발현된다. 펩티드 라이브러리를 생성하고 이들 라이브러리를 스크리닝하는 방법은 많은 특허(예를 들어, 미국 특허 제5,723,286호, 미국 특허 제5,432,018호, 미국 특허 제5,580,717호, 미국 특허 제5,427,908 호 및 미국 특허 제5,498,530호)에 개시되어 있다.
항체 또는 항원 결합 폴리펩티드의 라이브러리는 무작위 DNA 서열의 삽입에 의해 단일 유전자를 변경하거나 관련 유전자의 패밀리를 클로닝하는 것을 포함하는 많은 방법으로 제조되었다. 파지(미드) 디스플레이를 사용하여 항체 또는 항원 결합 단편을 디스플레이하는 방법은 미국 특허 제5,750,373호, 제5,733,743호, 제5,837,242호, 제5,969,108호, 제6,172,197호, 제5,580,717호 및 제5,658,727호에 기재되어 있다. 이어서, 라이브러리는 원하는 특징을 갖는 항체 또는 항원 결합 단백질의 발현에 대해 스크리닝된다.
선택되는 아미노산을 주형 핵산 내로 치환하는 방법은 관련 기술 분야에 잘 확립되어 있으며, 그 중 일부는 본원에서 설명된다. 예를 들어, 초가변 영역 잔기는 쿤켈 방법을 사용하여 치환될 수 있다. 예를 들어, 문헌 [Kunkel et al., Methods Enzymol. 154:367-382 (1987)]을 참조한다.
올리고뉴클레오티드의 서열은 변경되는 초가변 영역 잔기에 대해 설계된 하나 이상의 코돈 세트를 포함한다. 코돈 세트는 원하는 변이체 아미노산을 코딩하기 위해 사용되는 상이한 뉴클레오티드 삼중자 서열의 세트이다. 코돈 세트는 IUB 코드에 따라 아래에 제시된 바와 같이 특정 뉴클레오티드 또는 뉴클레오티드의 등몰 혼합물을 나타내는 기호를 사용하여 표시될 수 있다.
IUB 코드: G 구아닌; 아데닌; T 티민; C 시토신; R(A 또는 G); Y(C 또는 T); M(A 또는 C); K(G 또는 T); S(C 또는 G); W(A 또는 T); H(A 또는 C 또는 T); B(C 또는 G 또는 T); V(A 또는 C 또는 G); D(A 또는 G 또는 T); H(A 또는 C 또는 T); N(A 또는 C 또는 G 또는 T).
예를 들어, 코돈 세트 DVK에서, D는 뉴클레오티드 A 또는 G 또는 T일 수 있고; V는 A 또는 G 또는 C일 수 있고; K는 G 또는 T일 수 있다. 이 코돈 세트는 18개의 상이한 코돈을 나타낼 수 있고, Ala, Trp, Tyr, Lys, Thr, Asn, Lys, Ser, Arg, Asp, Glu, Gly, 및 Cys를 코딩할 수 있다.
올리고뉴클레오티드 또는 프라이머 세트는 표준 방법을 사용하여 합성될 수 있다. 한 세트의 올리고뉴클레오티드는 예를 들어 고상 합성에 의해 합성될 수 있으며, 코돈 세트에 의해 제공되고 원하는 아미노산의 군을 코딩하는 뉴클레오티드 삼중자의 모든 가능한 조합을 나타내는 서열을 함유한다. 특정 위치에서 선택된 뉴클레오티드 "축퇴성(degeneracy)"을 갖는 올리고뉴클레오티드의 합성은 관련 기술 분야에 잘 알려져 있다. 특정 코돈 세트를 갖는 이러한 뉴클레오티드의 세트는 상업적 핵산 합성기(예를 들어, Applied Biosystems(미국 캘리포니아주 포스터 시티 소재)로부터 입수 가능함)를 사용하여 합성되거나, 상업적으로 수득될 수 있다(예를 들어, Life Technologies, 미국 메릴랜드주 록빌 소재). 따라서, 특정 코돈 세트를 갖는 합성된 올리고뉴클레오티드 세트는 전형적으로 상이한 서열을 갖는 다수의 올리고뉴클레오티드를 포함할 것이며, 그 차이는 전체 서열 내의 코돈 세트에 의해 확립된다. 본 발명에 따라 사용되는 올리고뉴클레오티드는 가변 도메인 핵산 주형에 대한 혼성화를 허용하는 서열을 갖고, 클로닝을 위한 제한 효소 부위를 또한 포함할 수 있다.
한 방법에서, 변이체 아미노산을 코딩하는 핵산 서열은 올리고뉴클레오티드 매개 돌연변이 유발에 의해 생성될 수 있다. 이 기술은 문헌 [Zoller et al. Nucleic Acids Res. 10:6487-6504 (1987)]에 기재된 바와 같이 관련 기술 분야에 잘 알려져 있다. 간단히 설명하면, 변이체 아미노산을 코딩하는 핵산 서열은 원하는 코돈 세트를 코딩하는 올리고뉴클레오티드 세트를 DNA 주형에 혼성화함으로써 생성되고, 여기서 주형은 가변 영역 핵산 주형 서열을 함유하는 플라스미드의 단일 가닥 형태이다. 혼성화 후, 올리고뉴클레오티드 프라이머를 혼입시키고 올리고뉴클레오티드 세트에 의해 제공되는 코돈 세트를 함유할 주형의 전체 제2 상보성 가닥을 합성하기 위해 DNA 폴리머라제가 사용된다.
일반적으로, 길이가 적어도 25개 뉴클레오티드인 올리고뉴클레오티드가 사용된다. 최적의 올리고뉴클레오티드는 돌연변이(들)를 코딩하는 뉴클레오티드(들)의 어느 한 측면 상에서 주형에 완전히 상보성인 12 내지 15개의 뉴클레오티드를 가질 것이다. 이것은 올리고뉴클레오티드가 단일 가닥 DNA 주형 분자에 적절하게 혼성화될 수 있음을 보장한다. 올리고뉴클레오티드는 관련 기술 분야에 공지된 기술, 예컨대 문헌 [Crea et al., Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA, 75:5765 (1978)]에 기재되어 있는 기술을 사용하여 용이하게 합성된다.
DNA 주형은 박테리오파지 M13 벡터로부터 유래된 벡터(상업적으로 입수할 수 있는 M13 mp 18 및 M13 mp 19 벡터가 적합함), 또는 문헌 [Viera et al., Meth. Enzymol., 153:3 (1987)]에 기재된 바와 같이 단일 가닥 파지의 복제 기점을 함유하는 벡터에 의해 생성된다. 따라서, 돌연변이될 DNA는 단일 가닥 주형을 생성하기 위해 이들 벡터 중 하나에 삽입될 수 있다. 단일 가닥 주형의 생산은 상기 샘브룩(Sambrook) 등의 문헌의 섹션 4.21-4.41에 기재되어 있다.
천연 DNA 서열을 변경하기 위해, 올리고뉴클레오티드는 적합한 혼성화 조건 하에서 단일 가닥 주형에 혼성화된다. 이어서, 올리고뉴클레오티드를 합성을 위한 프라이머로 사용하여 주형의 상보성 가닥을 합성하기 위해 DNA 중합 효소, 대체로 T7 DNA 폴리머라제 또는 DNA 폴리머라제 I의 클레나우(Klenow) 단편을 첨가한다. 따라서, DNA의 한 가닥이 유전자 1의 돌연변이 형태를 코딩하고, 다른 가닥(원래의 주형)은 유전자 1의 비변형된 천연 서열을 코딩하도록 이종이중체 분자가 형성된다. 이 이종이중체 분자는 이어서 적절한 숙주 세포, 대체로 원핵 생물, 예컨대 이. 콜라이 JM101 내로 형질전환된다. 세포를 성장시킨 후, 아가로스 플레이트에 플레이팅하고, 돌연변이된 DNA를 함유하는 박테리아 콜로니를 확인하기 위해 32-포스페이트로 방사성 표지된 올리고뉴클레오티드 프라이머를 사용하여 스크리닝한다.
바로 위에서 설명된 방법은 플라스미드의 두 가닥이 돌연변이(들)을 포함하는 동종이중체 분자가 생성되도록 변형될 수 있다. 상기 변형은 다음과 같다: 단일 가닥 올리고뉴클레오티드는 상기한 바와 같이 단일 가닥 주형에 어닐링된다. 3개의 데옥시리보뉴클레오티드, 즉 데옥시리보아데노신(dATP), 데옥시리보구아노신(dGTP) 및 데옥시리보티미딘(dTT)의 혼합물은 dCTP-(aS)(Amersham으로부터 얻을 수 있음)로 불리는 변형된 티오데옥시리보시토신과 조합된다. 이 혼합물은 주형-올리고뉴클레오티드 복합체에 첨가된다. 이 혼합물에 DNA 폴리머라제를 첨가하면, 돌연변이된 염기를 제외하고는 주형과 동일한 DNA의 가닥이 생성된다. 또한, 이 새로운 DNA 가닥은 dCTP 대신 dCTP-(aS)를 함유할 것이고, 이것은 제한 효소 엔도뉴클레아제 소화로부터 DNA를 보호하는 역할을 수행한다. 적절한 제한 효소로 이중 가닥 이종이중체의 주형 가닥에 닉을 형성한 후, 주형 가닥은 돌연변이가 유발되는 부위(들)를 포함하는 영역을 지나서 ExoIII 뉴클레아제 또는 또 다른 적절한 뉴클레아제로 소화될 수 있다. 이어서, 반응은 단지 부분적으로 단일 가닥인 분자를 남기기 위해 중단된다. 완전한 이중 가닥 DNA 동종이중체는 이어서 4개의 모든 데옥시리보뉴클레오티드 트리포스페이트, ATP 및 DNA 리가제의 존재 하에 DNA 폴리머라제를 사용하여 형성된다. 이 동종이중체 분자는 적합한 숙주 세포 내로 형질전환될 수 있다.
상기 나타낸 바와 같이, 올리고뉴클레오티드 세트의 서열은 주형 핵산에 혼성화하기에 충분한 길이를 가지며, 또한 반드시 그런 것은 아니지만, 제한 부위를 함유할 수 있다. DNA 주형은 박테리오파지 M13 벡터로부터 유도된 벡터 또는 문헌 [Viera et al. Meth. Enzymol., 153:3 (1987)]에 기재된 바와 같이 단일 가닥 파지 복제 기점을 함유하는 벡터에 의해 생성될 수 있다. 따라서, 돌연변이되는 DNA는 단일 가닥 주형을 생성하기 위해 이들 벡터 중 하나에 삽입되어야 한다. 단일 가닥 주형의 생산은 상기 샘브룩 등의 문헌의 섹션 4.21-4.41에 기재되어 있다.
또 다른 방법에 따르면, 항원 결합은 복구된 초가변 영역의 선택을 통해 항체의 인간화 동안 회복될 수 있다(2005년 2월 18일 출원된 미국 특허 출원 제11/061,841호 참조). 상기 방법은 비인간 초가변 영역을 수용자 프레임워크 상에 혼입하고 수용자 프레임워크 서열을 변형시키지 않으면서 하나 이상의 초가변 영역에 하나 이상의 아미노산 치환을 추가로 도입하는 것을 포함한다. 대안으로, 하나 이상의 아미노산 치환의 도입은 수용자 프레임워크 서열의 변형을 수반할 수 있다.
또 다른 방법에 따르면, 라이브러리는 올리고뉴클레오티드의 서열 내에 제공된 코돈 세트에 의해 확립된 상이한 서열을 갖는 다수의 올리고뉴클레오티드를 각각 갖는 상류 및 하류 올리고뉴클레오티드 세트를 제공함으로써 생성될 수 있다. 가변 도메인 주형 핵산 서열과 함께 상류 및 하류 올리고뉴클레오티드 세트는 PCR 산물의 "라이브러리"를 생성하기 위해 폴리머라제 연쇄 반응에 사용될 수 있다. PCR 산물은 확립된 분자 생물학 기술을 사용하여 다른 관련 또는 비관련 핵산 서열, 예를 들어 바이러스 코트 단백질 및 이량체화 도메인과 융합될 수 있기 때문에 "핵산 카세트"로 언급될 수 있다.
PCR 프라이머의 서열은 초가변 영역 내의 용매 접근 가능하고 고도로 다양한 위치에 대해 설계된 하나 이상의 코돈 세트를 포함한다. 상기한 바와 같이, 코돈 세트는 원하는 변이체 아미노산을 코딩하기 위해 사용되는 상이한 뉴클레오티드 삼중자 서열의 세트이다.
적절한 스크리닝/선택 단계를 통해 선택된 원하는 기준을 충족시키는 항체 선택제는 표준 재조합 기술을 사용하여 단리되고 클로닝될 수 있다.
항체가 항원에 대한 높은 결합 친화도 및 다른 유리한 생물학적 특성을 유지하면서 인간화되는 것이 더욱 중요하다. 이러한 목표를 달성하기 위해, 바람직한 방법에 따라, 인간화 항체는 모 서열 및 인간화된 서열의 3차원 모델을 사용하여 모 서열 및 다양한 개념적 인간화 산물의 분석 과정에 의해 제조된다. 3차원 면역글로불린 모델은 일반적으로 이용 가능하고, 관련 기술 분야의 통상의 기술자에게 익숙하다. 선택된 후보 면역글로불린 서열의 가능한 3차원 입체형태적 구조를 설명하고 표시하는 컴퓨터 프로그램이 이용 가능하다. 이러한 표시에 대한 검사를 통해, 후보 면역글로불린 서열의 기능에서 잔기의 가능한 역할의 분석, 즉, 후보 면역글로블린이 그의 항원에 결합하는 능력에 영향을 미치는 잔기의 분석을 수행할 수 있다. 이러한 방식으로, FR 잔기는 표적 항원(들)에 대한 증가된 친화도와 같은 원하는 항체 특성이 달성되도록 수여자 및 도입 서열로부터 선택되고 조합될 수 있다. 일반적으로, 초가변 영역 잔기는 항원 결합에 영향을 미치는 데 직접적으로 및 가장 실질적으로 관련된다.
인간화된 항-PD-L1 항체의 다양한 형태가 고려된다. 예를 들어, 인간화 항체는 항체 단편, 예컨대 Fab일 수 있다. 대안으로, 인간화 항체는 무손상 항체, 예컨대 무손상 IgG, IgM 또는 IgA 항체일 수 있다. 일부 실시양태에서, 무손상 항체는 무손상 IgM 항체일 수 있다.
인간화에 대한 대안으로, 인간 항체가 생성될 수 있다. 예를 들어, 이제 면역화시에 내인성 면역글로불린 생산의 부재 하에 인간 항체의 완전한 레퍼토리를 생산할 수 있는 트랜스제닉 동물(예를 들어, 마우스)을 생산할 수 있다. 예를 들어, 키메라 및 생식세포 계열 돌연변이체 마우스에서 항체 중쇄 결합 영역(JH) 유전자의 동형접합성 결실은 내인성 항체 생산의 완전한 억제를 초래한다고 문헌에 기재되어 있다. 이러한 생식세포 계열 돌연변이체 마우스 내에 인간 생식세포 계열 면역글로불린 유전자 어레이를 도입하면, 항원 시험접종시 인간 항체가 생성될 것이다. 예를 들어, 문헌 [Jakobovits et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:2551 (1993)]; [Jakobovits et al., Nature, 362:255-258 (1993)]; [Bruggemann et al., Year in Immuno. 7:33 (1993)]; 미국 특허 제5,545,806호, 제5,569,825호, 제5,591,669호(모두 GenPharm의 특허); 제5,545,807호; 및 WO 97/17852를 참조한다.
대안으로, 면역화되지 않은 공여자로부터의 면역글로불린 가변(V) 도메인 유전자 레퍼토리로부터 인간 항체 및 항체 단편을 시험관 내에서 생산하기 위해 파지 디스플레이 기술(McCafferty et al., Nature 348:552-553 (1990))을 사용할 수 있다. 이 기술에 따르면, 항체 V 도메인 유전자는 섬유상 박테리오파지, 예컨대 M13 또는 fd의 주 또는 부 코트 단백질 유전자 내에 인 프레임으로 클로닝되고, 파지 입자의 표면 상에 기능성 항체 단편으로 디스플레이된다. 섬유상 입자가 파지 게놈의 단일 가닥 DNA 카피를 함유하기 때문에, 항체의 기능적 특성에 기초한 선택은 또한 이들 특성을 나타내는 항체를 코딩하는 유전자의 선택을 초래한다. 따라서, 파지는 B 세포의 특성 중 일부를 모방한다. 파지 디스플레이는 예를 들어 문헌 [Johnson, Kevin S, and Chiswell, David J., Current Opinion in Structural Biology 3:564-571 (1993)]에서 검토된 다양한 포맷으로 수행될 수 있다. V-유전자 분절의 여러 공급원이 파지 디스플레이에 사용될 수 있다. 문헌 [Clackson et al., Nature, 352:624-628 (1991)]에서는 면역화된 마우스의 비장에서 유래된 V 유전자의 작은 무작위 조합 라이브러리로부터 다양한 항-옥사졸론 항체를 단리하였다. 면역화되지 않은 인간 공여자로부터의 V 유전자의 레퍼토리가 구축될 수 있고, 다양한 항원(자가 항원 포함)에 대한 항체는 본질적으로 문헌 [Marks et al., J. Mol. Biol. 222:581-597 (1991)], 또는 [Griffith et al., EMBO J. 12:725-734 (1993)]에 기재되어 있는 기술에 따라 단리될 수 있다. 또한, 미국 특허 제5,565,332호 및 제5,573,905호를 참조한다.
상기한 바와 같이, 인간 항체는 또한 시험관 내에서 활성화된 B 세포에 의해 생성될 수 있다(미국 특허 제5,567,610호 및 제5,229,275호 참조).
일부 실시양태에서, 본 개시내용의 항체는 인간 모노클로날 항체이다. PD-L1에 대해 작용하는 상기 인간 모노클로날 항체는 마우스 면역계보다는 인간 면역계의 일부를 보유하는 트랜스제닉 또는 트랜스염색체성(transchromosomic) 마우스를 사용하여 생성될 수 있다. 이러한 트랜스제닉 및 트랜스염색체성 마우스는 각각 HuMAb Mouse™ 및 KM Mouse™로 본 명세서에 언급되는 마우스를 포함하고, 총칭하여 본원에서 "인간 Ig 마우스"로 지칭된다.
HuMAb Mouse™(Medarex, Inc.)는 내인성 μ 및 κ 사슬 유전자좌를 불활성화하는 표적화된 돌연변이와 함께, 재배열되지 않은 인간 중쇄(μ 및 γ) 및 κ 경쇄 면역글로불린 서열을 코딩하는 인간 면역글로불린 유전자 미니유전자좌를 함유한다(예를 들어, 문헌 [Lonberg, et al. (1994) Nature 368(6474): 856-859] 참조). 따라서, 마우스는 마우스 IgM 또는 κ의 발현 감소를 나타내고, 면역화에 반응하여 도입된 인간 중쇄 및 경쇄 도입 유전자는 클래스 전환 및 체세포 돌연변이를 거쳐 고친화도 인간 IgGκ 모노클로날 항체를 생성한다([Lonberg, N. et al. (1994), 상기 문헌]; [Lonberg, N. (1994) Handbook of Experimental Pharmacology 113:49-101]; [Lonberg, N. and Huszar, D. (1995) Intern. Rev. Immunol. 13: 65-93], 및 [Harding, F. and Lonberg, N. (1995) Ann. N.Y. Acad. Sci. 764:536-546]). HuMAb Mouse™의 제조 및 사용, 및 상기 마우스가 보유하는 게놈 변형은 또한 문헌 [Taylor, L. et al. (1992) Nucleic Acids Research 20:6287-6295]; [Chen, J. et al. (1993) International Immunology 5: 647-656]; [Tuaillon et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:3720-3724]; [Choi et al. (1993) Nature Genetics 4:117-123]; [Chen, J. et al. (1993) EMBO J. 12:821-830]; [Tuaillon et al., (1994) J. Immunol. 152:2912-2920]; [Taylor, L. et al. (1994) International Immunology 6:579-591]; 및 [Fishwild, D. et al. (1996) Nature Biotechnology 14:845-851]에 기재되어 있고, 상기 모든 문헌의 내용은 그 전부가 본원에 참고로 구체적으로 포함된다. 또한, 미국 특허 제5,545,806호; 제5,545,806호; 제5,569,825호; 제5,625,126호; 제5,633,425호; 제5,789,650호; 제5,877,397호; 제5,661,016호; 제5,814,318호; 제5,874,299호; 및 제5,770,429호(모두 Lonberg 및 Kay의 특허); 미국 특허 제5,545,807호(Surani 등); PCT 공개 WO 92/03918, WO 93/12227, WO 94/25585, WO 97/13852, WO 98/24884 및 WO 99/45962(모두 Lonberg 및 Kay의 출원); 및 PCT 공개 WO 01/14424(Korman 등)를 참조한다.
또 다른 실시양태에서, 본 발명의 실시양태에 따른 인간 항체는 도입 유전자 및 트랜스염색체 상에 인간 면역글로불린 서열을 보유하는 마우스, 예컨대 인간 중쇄 도입 유전자 및 인간 경쇄 트랜스염색체를 보유하는 마우스를 사용하여 생성할 수 있다. 이 마우스는 본원에서 "KM Mouse™"으로 언급되고, 이시다(Ishida) 등의 PCT 공개 WO 02/43478에 상세히 기재되어 있다.
또한, 인간 면역글로불린 유전자를 발현하는 다른 트랜스제닉 동물 시스템이 관련 기술 분야에서 이용 가능하고, 본 개시내용의 항-PD-L1 항체를 생성하기 위해 사용될 수 있다. 예를 들어, Xenomouse(Abgenix, Inc.)로 언급되는 다른 트랜스제닉 시스템을 사용할 수 있고; 이러한 마우스는 예를 들어 미국 특허 제5,939,598호; 제6,075,181호; 제6,114,598호; 제6,150,584호 및 제6,162,963호(Kucherlapati et al.)에 기재되어 있다.
또한, 인간 면역글로불린 유전자를 발현하는 다른 트랜스염색체성 동물 시스템이 관련 기술 분야에서 이용 가능하며, 본 개시내용의 항-PD-L1 항체를 생성하기 위해 사용될 수 있다. 예를 들어, "TC 마우스"로 언급되는, 인간 중쇄 트랜스 염색체 및 인간 경쇄 트랜스염색체 둘 모두를 보유하는 마우스를 사용할 수 있고; 이러한 마우스는 문헌 [Tomizuka et al. (2000) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97:722-727]에 기재되어 있다. 또한, 인간 중쇄 및 경쇄 트랜스염색체를 보유하는 소가 관련 기술 분야에 기재되어 있고(예를 들어, [Kuroiwa et al. (2002) Nature Biotechnology 20:889-894] 및 PCT 출원 공개 WO 2002/092812), 본 개시내용의 항-PD-L1 항체를 생성하기 위해 사용될 수 있다.
항체 단편
특정 상황에서, 전체 항체보다는 항체 단편을 사용하는 것이 유리하다. 단편의 크기가 작으면 신속한 청소가 가능하며, 고형 종양에 대한 접근성이 개선될 수 있다.
항체 단편의 생산을 위한 다양한 기술이 개발되었다. 전통적으로, 이들 단편은 무손상 항체의 단백질 분해 소화를 통해 유도되었다(예를 들어, 문헌 [Morimoto et al., Journal of Biochemical and Biophysical Methods 24:107-117 (1992)]; 및 [Brennan et al., Science, 229:81 (1985)] 참조). 그러나, 이들 단편은 재조합 숙주 세포에 의해 직접 생산될 수 있다. Fab, Fv 및 scFv 항체 단편은 이. 콜라이에서 모두 발현되어 분비될 수 있고, 따라서 다량의 상기 단편을 쉽게 생산할 수 있다. 항체 단편은 상기 논의된 항체 파지 라이브러리로부터 단리될 수 있다. 대안으로, Fab'-SH 단편은 이. 콜라이로부터 직접 회수될 수 있고, 화학적으로 커플링되어 F(ab')2 단편을 형성한다(Carter et al., Bio/Technology 10:163-167 (1992)). 또 다른 방법에 따르면, F(ab')2 단편은 재조합 숙주 세포 배양물로부터 직접 단리될 수 있다. 샐비지(salvage) 수용체 결합 에피토프 잔기를 포함하는, 증가된 생체 내 반감기를 갖는 Fab 및 F(ab')2 단편은 미국 특허 제5,869,046호에 기재되어 있다. 항체 단편의 생산을 위한 다른 기술은 통상의 기술자에게 명백할 것이다. 다른 실시양태에서, 선택된 항체는 단일쇄 Fv 단편(scFv 또는 sFv)이다. WO 93/16185; 미국 특허 제5,571,894호; 및 제5,587,458호를 참조한다. Fv 및 sFv는 불변 영역이 없는 무손상 결합 부위를 갖는 유일한 종이고; 따라서, 이들은 생체 내 사용 동안 감소된 비특이적 결합에 적합하다. sFv 융합 단백질은 sFv의 아미노 또는 카르복시 말단에서 이펙터 단백질의 융합을 생성하도록 구축될 수 있다. 문헌 [Antibody Engineering, ed. Borrebaeck, 상기 문헌]을 참조한다. 항체 단편은 예를 들어 미국 특허 제5,641,870호에 기재되어 있는 "선형 항체"일 수 있다.
이중특이적 및 다중특이적 항체
상기에서 검토된 바와 같이, 이중특이적 및 다중특이적 항체는 적어도 2개의 상이한 에피토프에 대한 결합 특이성을 갖는 항체이다. 예시적인 이중특이적 항체는 본원에서 설명되는 PD-L1 단백질의 2개의 상이한 에피토프에 결합할 수 있다. 그와 같은 다른 항체는 PD-L1 결합 부위를 또 다른 단백질(예를 들어, 세포 표면 단백질, 예를 들어 종양 항원)에 대한 결합 부위와 조합할 수 있다. 대안으로, 항-PD-L1 결합 단위는 세포 방어 메커니즘을 PD-L1 발현 세포에 집중시키고 국재화하기 위해, 백혈구 상의 촉발 분자, 예컨대 T 세포 수용체 분자(예를 들어, CD3) 또는 IgG(FcγR)에 대한 Fc 수용체, 예컨대 FcγRI(CD64), FcγRII(CD32) 및 FcγRIII(CD16)에 결합하는 결합 단위와 조합될 수 있다. 일부 실시양태에서, 이중특이적 항체는 PD-L1에 결합하는 하나의 결합 단위 및 또 다른 결합 표적, 예를 들어 세포 표면 단백질, 예컨대 종양 항원에 결합하는 제2 결합 단위를 포함할 수 있다. 결합 표적으로 작용할 수 있는 세포 표면 단백질의 비제한적인 예는 CD20, EGFR, HER2, CTLA-4, TIM3, LAG3, VISTA 및 TIGIT를 포함한다. CTLA-4, TIM3, LAG3, VISTA 및 TIGIT에 상응하는 Genbank 등록 번호는 표 2에서 볼 수 있다. 인간 CD20의 아미노산 서열은 UniProtKB 번호 P11836에 제공되어 있다. 인간 EGFR의 아미노산 서열은 UniProtKB 번호 P00533에 제공되어 있다. 인간 HER2(인간 ERBB2)의 아미노산 서열은 UniProtKB 번호 P04626에 제공되어 있다.
이중특이적 항체는 또한 세포독성제를 PD-L1을 발현하는 세포에 위치시키기 위해 사용될 수 있다. 이들 항체는 PD-L1 결합 단위 및 세포독성제(예를 들어, 사포린, 항-인터페론-α, 빈카 알칼로이드, 리신 A 사슬, 메토트렉세이트 또는 방사성 동위원소 합텐)에 결합하는 결합 단위를 갖는다. 이중특이적 항체는 전장 항체 또는 항체 단편(예를 들어, F(ab')2 이중특이적 항체)으로 제조될 수 있다.
이중특이적 항체를 제조하는 방법은 관련 기술 분야에 공지되어 있다. 전장 이중특이적 항체의 전통적인 생산은 2개의 사슬이 다른 특이성을 갖는 2개의 면역글로불린 중쇄-경쇄 쌍의 동시 발현에 기초한다(Millstein et al., Nature 305:537-539 (1983)). 면역글로불린 중쇄 및 경쇄의 무작위 분류 때문에, 이들 하이브리도마(쿼드로마)는 10개의 상이한 항체 분자의 잠재적인 혼합물을 생성하며, 그 중 하나만 정확한 이중특이적 구조를 갖는다. 친화도 크로마토그래피 단계에 의해 일반적으로 수행되는 정확한 분자의 정제는 다소 번거롭고, 제품 수율은 낮다. 유사한 절차가 WO 93/08829 및 문헌 [Traunecker et al., EMBO J. 10:3655-3659 (1991)]에 개시되어 있다.
이펙터 기능 조작
예를 들어, 항체의 항원 의존성 세포 매개 세포독성(ADCC) 및/또는 보체 의존성 세포독성(CDC)을 향상시키기 위해, 이펙터 기능과 관련하여 본 발명의 항체를 변형하는 것이 바람직할 수 있다. 이는 항체의 중쇄 불변 영역(즉, Fc 영역)에 하나 이상의 아미노산 치환을 도입함으로써 달성될 수 있다. 대안으로 또는 추가적으로, 시스테인 잔기(들)가 Fc 영역에 도입되어, 상기 영역에 사슬간 디술피드 결합이 형성될 수 있다. 이와 같이 생성된 동종이량체 항체는 개선된 내재화 능력 및/또는 증가된 보체 매개 세포 사멸 및 항체 의존성 세포 매개 세포독성(ADCC)을 가질 수 있다. 문헌 [Caron et al., J. Exp Med. 176:1191-1195 (1992)] 및 [Shopes, B. J. Immunol. 148:2918-2922 (1992)]을 참조한다. 향상된 항-종양 활성을 갖는 동종이 량체 항체는 또한 문헌 [Wolff et al., Cancer Research 53:2560-2565 (1993)]에 기재된 바와 같은 이종 2기능성 가교결합제를 사용하여 제조할 수 있다. 대안으로, 항체는 증가된 수의 Fc 영역(예를 들어, 2개 이상의 Fc 영역을 갖도록 조작된 IgG 분자)을 갖도록 조작될 수 있고, 이에 의해 향상된 보체 용해 및 ADCC 능력을 가질 수 있다. 문헌 [Stevenson et al., Anti-Cancer Drug Design 3:219-230 (1989)]을 참조한다. 항체의 혈청 반감기를 증가시키기 위해, 예를 들어 미국 특허 제5,739,277호에 기재된 바와 같이 샐비지 수용체 결합 에피토프를 항체(특히 항체 단편) 내에 도입할 수 있다. 본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "샐비지 수용체 결합 에피토프"는 에피토프를 포함하는 분자(예를 들어, IgG 항체)의 생체 내 혈청 반감기 증가를 책임지하는 IgG 분자(예를 들어, IgG1, IgG2, IgG3 또는 IgG4)의 Fc 영역의 에피토프를 지칭한다.
항체 변이체
본원에서 설명되는 항-PD-L1 항체 이외에, 항-PD-L1 항체 변이체를 제조할 수 있는 것이 고려된다. 항-PD-L1 항체 변이체는 적절한 뉴클레오티드 변화를 코딩 DNA에 도입함으로써, 및/또는 목적하는 항체 또는 폴리펩티드의 합성에 의해 제조될 수 있다. 관련 기술 분야의 통상의 기술자는 아미노산 변화가 글리코실화 부위의 수 또는 위치를 변화시키거나 막 고정 특징을 변경하는 것과 같이 항-PD-L1 항체의 번역 후 과정을 변경할 수 있다는 것을 이해할 것이다.
예를 들어, 본원에서 설명되는 항-PD-L1 항체의 변이는 예를 들어 미국 특허 제5,364,934호에 제시된 보존적 및 비보존적 돌연변이를 위한 임의의 기술 및 지침을 사용하여 만들 수 있다. 변이는 천연 서열 항체 또는 폴리펩티드와 비교하여 아미노산 서열의 변화를 초래하는, 항체 또는 폴리펩티드를 코딩하는 하나 이상의 코돈의 치환, 결실 또는 삽입일 수 있다. 선택적으로, 변이는 항-PD-L1 항체의 하나 이상의 도메인에서 적어도 하나의 아미노산이 임의의 다른 아미노산으로 치환됨으로써 이루어진다. 어떤 아미노산 잔기가 목적하는 활성에 유해한 영향을 주지 않으면서 삽입, 치환 또는 결실될 수 있는지 결정하는 방법에 대한 지침은 항-PD-L1 항체의 서열을 공지된 상동성 단백질 분자의 서열과 비교하고 높은 상동성의 영역에서 이루어진 아미노산 서열 변화의 수를 최소화함으로써 발견될 수 있다. 아미노산 치환은 하나의 아미노산을 유사한 구조적 및/또는 화학적 특성을 갖는 또 다른 아미노산으로의 대체, 예를 들어, 류신의 세린으로의 대체, 즉 보존적 아미노산 대체의 결과일 수 있다. 삽입 또는 결실은 선택적으로 약 1 내지 5개의 아미노산 범위일 수 있다. 허용된 변이는 서열에서 아미노산의 삽입, 결실 또는 치환을 체계적으로 만들고, 생성되는 변이체를 전장 또는 성숙한 천연 서열에 의해 제시되는 활성에 대해 시험함으로써 결정될 수 있다.
항-PD-L1 항체 단편이 본원에서 제시된다. 이러한 단편은 N 말단 또는 C 말단에서 절단되거나, 또는 예를 들어 전장 천연 항체 또는 단백질에 비해 내부 잔기가 결여될 수 있다. 특정 단편은 항-PD-L1 항체의 원하는 생물학적 활성에 필수적이지 않은 아미노산 잔기가 결여될 수 있다.
항-PD-L1 항체 단편은 임의의 많은 통상적인 기술에 의해 제조될 수 있다. 원하는 펩티드 단편은 화학적으로 합성될 수 있다. 대안적인 접근법은 효소 소화에 의해, 예를 들어, 특정 아미노산 잔기에 의해 규정되는 부위에서 단백질을 절단하는 것으로 공지된 효소로 단백질을 처리하거나 또는 적절한 제한 효소로 DNA를 소화하고 원하는 단편을 단리함으로써 항체 또는 폴리펩티드 단편을 생성하는 것을 포함한다. 또 다른 적절한 기술은 폴리머라제 연쇄 반응(PCR)에 의해 원하는 항체 또는 폴리펩티드 단편을 코딩하는 DNA 단편을 단리하고 증폭하는 것을 포함한다. DNA 단편의 목적하는 말단을 규정하는 올리고뉴클레오티드는 PCR에서 5' 및 3' 프라이머에 사용된다. 바람직하게는, 항-PD-L1 항체 단편은 본원에서 개시되는 전장 항-PD-L1 항체와 적어도 하나의 생물학적 및/또는 면역학적 활성을 공유한다.
특정 실시양태에서, 관심 보존적 치환을 바람직한 치환의 표제 하에 하기 표 4에 제시한다. 이러한 치환이 생물학적 활성의 변화를 유발하는 경우, 표 4에 예시적인 치환으로 명명되거나 아미노산 클래스와 관련하여 아래에서 추가로 설명되는 보다 실질적인 변화가 도입되고, 그 생성물이 스크리닝된다.
<표 4>
Figure 112018121219076-pct00012
Figure 112018121219076-pct00013
항-PD-L1 항체의 기능 또는 면역학적 특성의 실질적인 변형은 (a) 예를 들어 시트로서, 치환 영역에서 폴리펩티드 백본의 구조, (b) 표적 부위에서의 분자의 전하 또는 소수성, 또는 (c) 대부분의 측쇄를 유지하는 것에 대한 그의 효과에서 유의하게 상이한 치환을 선택함으로써 수행된다. 자연 발생하는 잔기는 공통적인 측쇄의 특성에 기초하여 여러 군으로 분류된다:
(1) 소수성: 노르류신, met, ala, val, leu, ile;
(2) 중성 친수성: cys, ser, thr;
(3) 산성: asp, glu;
(4) 염기성: asn, gln, his, lys, arg;
(5) 사슬 배향에 영향을 미치는 잔기: gly, pro; 및
(6) 방향족: trp, tyr, phe.
비보존적 치환은 이들 클래스 중 하나의 멤버를 또 다른 클래스로 교환하는 것을 수반한다. 상기 치환된 잔기는 또한 보존적 치환 부위, 또는 보다 바람직하게는 나머지(비보존되는) 부위에 도입될 수 있다.
변이는 올리고뉴클레오티드 매개(부위 지정) 돌연변이 유발, 알라닌 스캐닝 및 PCR 돌연변이 유발과 같은 관련 기술 분야에 공지된 방법을 사용하여 이루어질 수 있다([Carter et al., Nucl. Acids Res., 13:4331 (1986)]; [Zoller et al., Nucl. Acids Res., 10:6487 (1987)]), 카세트 돌연변이 유발(Wells et al., Gene, 34:315 (1985)), 제한 선택 돌연변이 유발(Wells et al., Philos. Trans. R. Soc. London SerA, 317:415(1986)) 또는 다른 공지된 기술을 클로닝된 DNA 상에서 수행하여 항-PD-L1 항체 변이체 DNA를 생성할 수 있다.
스캐닝 아미노산 분석은 또한 인접한 서열을 따라 하나 이상의 아미노산을 확인하기 위해 사용될 수 있다. 바람직한 스캐닝 아미노산 중에는 비교적 작고 중성인 아미노산이 있다. 이러한 아미노산은 알라닌, 글리신, 세린 및 시스테인을 포함한다. 알라닌은 전형적으로 베타-탄소를 넘어선 측쇄를 제거하고 변이체의 주쇄 입체형태를 변경하지 않기 때문에, 상기 군 중에서 바람직한 스캐닝 아미노산이다(Cunningham and Wells, Science, 244:1081-1085(1989)). 알라닌은 또한 가장 통반적인 아미노산이기 때문에 일반적으로 바람직하다. 또한, 이것은 매립된 위치와 노출된 위치 둘 모두에서 자주 발견된다([Creighton, The Proteins, (W.H. Freeman & Co., N.Y.)]; [Chothia, J. Mol. Biol., 150:1 (1976)]). 알라닌 치환이 적당한 양의 변이체를 생산하지 않으면, 동배체 아미노산을 사용할 수 있다.
항-PD-L1 항체의 적절한 입체형태를 유지하는데 관여하지 않는 임의의 시스테인 잔기는 또한 분자의 산화 안정성을 개선하고 비정상적인 가교결합을 방지하기 위해 일반적으로 세린으로 치환될 수 있다. 반대로, 시스테인 결합(들)을 항-PD-L1 항체에 첨가하여 안정성을 개선할 수 있다(특히, 항체가 Fv 단편과 같은 항체 단편인 경우).
특히 바람직한 유형의 치환 변이체는 모 항체(예를 들어, 인간화 또는 인간 항체)의 하나 이상의 초가변 영역 잔기를 치환하는 것을 포함한다. 일반적으로, 추가의 개발을 위해 선택된 생성되는 변이체(들)는 이들이 생성되는 모 항체와 비교하여 개선된 생물학적 특성을 가질 것이다. 그러한 치환 변이체를 생성하는 편리한 방법은 파지 디스플레이를 이용한 친화도 성숙을 포함한다. 간단히 설명하면, 여러 개의 초가변 영역 부위(예를 들어, 6-7개의 부위)가 돌연변이되어, 각각의 부위에 가능한 모든 아미노산 치환을 생성한다. 이렇게 생성된 항체 변이체는 각각의 입자 내에 패키징된 M13의 유전자 III 산물에 대한 융합체로서 섬유상 파지 입자로부터 1가 방식으로 제시된다. 이어서, 파지 디스플레이된 변이체는 본원에서 개시되는 바와 같은 그의 생물학적 활성(예를 들어, 결합 친화도)에 대해 스크리닝된다. 변형을 위한 후보 초가변 영역 부위를 확인하기 위해, 알라닌 스캐닝 돌연변이 유발을 수행하여 항원 결합에 유의하게 기여하는 초가변 영역 잔기를 확인할 수 있다. 대안으로, 또는 부가적으로, 항체와 PD-L1 폴리펩티드 사이의 접촉점을 확인하기 위해 항원-항체 복합체의 결정 구조를 분석하는 것이 유익할 수 있다. 이러한 접촉 잔기 및 이웃 잔기는 본원에서 제시되는 기술에 따른 치환을 위한 후보 잔기이다. 일단 이러한 변이체가 생성되면, 변이체 패널을 본원에서 설명되는 바와 같이 스크리닝하고, 하나 이상의 관련 검정에서 우수한 특성을 갖는 항체를 추가로 개발하기 위해 선택할 수 있다.
항-PD-L1 항체의 아미노산 서열 변이체를 코딩하는 핵산 분자는 관련 기술 분야에 공지된 다양한 방법에 의해 제조된다. 이들 방법은 천연 공급원으로부터의 단리(자연 발생 아미노산 서열 변이체의 경우), 또는 항-PD-L1 항체의 미리 제조된 변이체 또는 비변이체 버전의 올리고뉴클레오티드 매개(또는 부위 지정) 돌연변이 유발, PCR 돌연변이 유발 및 카세트 돌연변이 유발에 의한 제조를 포함하고 이로 제한되지 않는다.
항체 변형
항-PD-L1 항체의 공유 변형은 본 발명의 범위 내에 포함된다. 공유 변형의 한 유형은 항-PD-L1 항체의 선택된 측쇄 또는 N 또는 C 말단 잔기와 반응할 수 있는 유기 유도체화제와 항-PD-L1 항체의 표적화된 아미노산 잔기를 반응시키는 것을 포함한다. 2기능성 작용제로 유도체화하는 것은 예를 들어 항-PD-L1 항체를 정제하기 위한 방법에서 사용하기 위해 수불용성 지지체 매트릭스 또는 표면에 항-PD-L1 항체를 가교 결합시키기 위해, 및 그 반대의 경우를 위해 유용하다. 통상적으로 사용되는 가교결합제는 예를 들어 1,1-비스(디아조아세틸)-2-페닐에탄, 글루타르알데히드, N-히드록시숙신이미드 에스테르, 예를 들어 4-아지도살리실산과의 에스테르, 동종2기능성(homobifunctional) 이미도에스테르, 예를 들어 디숙신이미딜 에스테르, 예컨대 3,3'-디티오비스(숙신이미딜프로피오네이트), 2기능성 말레이미드, 예컨대 비스-N-말레이미도-1,8-옥탄, 및 메틸-3-[(p-아지도페닐)디티오]프로피오이미데이트와 같은 작용제를 포함한다.
다른 변형은 글루타미닐 및 아스파라기닐 잔기의 상응하는 글루타밀 및 아스파르틸 잔기로의 탈아미드화, 프롤린 및 리신의 히드록실화, 세릴 또는 트레오닐 잔기의 히드록실기의 인산화, 리신, 아르기닌 및 히스티딘 측쇄의 α-아미노기의 메틸화(T.E. Creighton, Proteins: Structure and Molecular Properties, W.H. Freeman & Co., San Francisco, pp. 79-86 (1983)), N 말단 아민의 아세틸화 및 C 말단 카르복실기의 아미드화를 포함한다.
본 발명의 범위 내에 포함되는 항-PD-L1 항체의 공유 변형의 또 다른 유형은 항체 또는 폴리펩티드의 천연 글리코실화 패턴의 변경을 포함한다. "천연 글리코실화 패턴의 변경"은 천연 서열 항-PD-L1 항체에서 발견되는 하나 이상의 탄수화물 모이어티의 제거(기본적인 글리코실화 부위를 제거하거나, 화학적 및/또는 효소적 수단에 의해 글리코실화를 제거함으로써), 및/또는 천연 서열 항-PD-L1 항체에 존재하지 않는 하나 이상의 글리코실화 부위의 부가를 의미하는 것으로서 본원의 목적을 위해 의도된다. 또한, 상기 문구는 존재하는 다양한 탄수화물 모이어티의 특성 및 비율의 변화를 포함하는, 천연 단백질의 글리코실화의 질적 변화를 포함한다.
항체 및 다른 폴리펩티드의 글리코실화는 전형적으로 N 연결 또는 O 연결된다. N 연결은 탄수화물 모이어티의 아스파라긴 잔기의 측쇄에 대한 부착을 지칭한다. 트리펩티드 서열인 아스파라긴-X-세린 및 아스파라긴-X-트레오닌(여기서, X는 프롤린을 제외한 임의의 아미노산임)은 탄수화물 모이어티를 아스파라긴 측쇄에 효소에 의해 부착시키기 위한 인식 서열이다. 따라서, 폴리펩티드 내에서 이러한 트리펩티드 서열 중 하나의 존재는 잠재적인 글리코실화 부위를 생성한다. O 연결된 글리코실화는 히드록시아미노산, 가장 일반적으로는 세린 또는 트레오닌에 대한 당 N-아세틸갈락토사민, 갈락토스 또는 크실로스 중 하나의 부착을 지칭하지만, 5-히드록시프롤린 또는 5-히드록시리신도 사용될 수 있다.
항-PD-L1 항체에 글리코실화 부위를 부가하는 것은 하나 이상의 상기 트리펩티드 서열을 포함하도록 아미노산 서열을 변경함으로써 편리하게 달성된다(N 연결 글리코실화 부위에 대한). 상기 변경은 원래의 항-PD-L1 항체의 서열에 대해 하나 이상의 세린 또는 트레오닌 잔기를 부가하거나 치환함으로써 이루어질 수 있다(O 연결 글리코실화 부위에 대한). 항-PD-L1 항체 아미노산 서열은 특히 원하는 아미노산으로 번역될 코돈이 생성되도록 미리 선택된 염기에서 항-PD-L1 항체를 코딩하는 DNA를 돌연변이시킴으로써, DNA 수준에서의 변화를 통해 선택적으로 변경될 수 있다.
항-PD-L1 항체 상의 탄수화물 모이어티의 수를 증가시키는 또 다른 수단은 폴리펩티드에 글리코시드를 화학적으로 또는 효소에 의해 커플링시키는 것이다. 이러한 방법은 관련 기술 분야에, 예를 들어 1987년 9월 11일 공개된 WO 87/05330 및 문헌 [Aplin and Wriston, CRC Crit. Rev. Biochem, pp. 259-306 (1981)]에 기재되어 있다.
항-PD-L1 항체 상에 존재하는 탄수화물 모이어티의 제거는 화학적으로 또는 효소에 의해, 또는 글리코실화의 표적으로 작용하는 아미노산 잔기를 코딩하는 코돈의 돌연변이에 의한 치환에 의해 달성될 수 있다. 화학적 탈글리코실화 기술은 관련 기술 분야에 공지되어 있으며, 예를 들어, 문헌 [Hakimuddin, et al., Arch. Biochem. Biophys., 259:52 (1987)] 및 [Edge et al., Anal. Biochem., 118:131 (1981)]에 기재되어 있다. 폴리펩티드 상의 탄수화물 모이어티의 효소에 의한 절단은 문헌 [Thotakura et al., Meth. Enzymol. 138:350 (1987)]에 의해 설명된 바와 같은 다양한 엔도- 및 엑소-글리코시다제의 사용에 의해 달성될 수 있다.
면역접합체
본 발명의 측면은 세포독성제, 예컨대 화학요법제, 성장 억제제, 독소(예를 들어, 박테리아, 진균, 식물 또는 동물 기원의 효소 활성 독소 또는 그의 단편) 또는 방사성 동위원소(즉, 방사성 접합체)에 접합된 항체(본원에서 설명된 바와 같은)를 포함하는 면역접합체("항체-약물 접합체" 또는 "ADC"와 교환 가능하게 언급됨)를 포함한다. 독소의 비제한적인 예는 그 개시내용은 그 전체가 본원에 참고로 포함되는 WO 2014144871 및 미국 특허 제8,466,260호에 기재된 것을 포함한다. 본 발명의 실시양태에 따른 면역접합체 또는 "ADC"는 하기 화학식 I로 표시될 수 있고, 여기서 항체는 선택적인 링커(L)를 통해 하나 이상의 약물 모이어티(D)에 접합(즉, 공유 부착)된다. ADC는 thioMAb 약물 접합체("TDC")를 포함할 수 있다.
Ab-(L-D)p I
따라서, 항체는 직접 또는 링커를 통해 약물에 접합될 수 있다. 화학식 I에서, p는 항체당 약물 모이어티의 평균 수이고, 예컨대 항체당 약 1 내지 약 20개의 약물 모이어티, 특정 실시양태에서 항체당 1 내지 약 8개의 약물 모이어티의 범위일 수 있다. 본 발명의 측면은 항체당 평균 약물 부하량이 약 2 내지 약 5, 또는 약 3 내지 약 4인 화학식 I의 항체-약물 화합물의 혼합물을 포함하는 조성물을 포함한다.
링커는 하나 이상의 링커 성분을 포함할 수 있다. 예시적인 링커 성분은 미국 특허 제8,466,260호에 기재된 것을 포함하며, 상기 특허의 개시내용은 그 전체가 본원에 참고로 포함된다. 스트레쳐(stretcher), 스페이서 및 아미노산 단위를 포함하는 링커 성분은 관련 기술 분야에 공지된 방법, 예를 들어 그 개시내용 전체가 본원에 참고로 포함된 U.S. 2005/0238649 A1에 기재된 방법에 의해 합성될 수 있다. 링커의 추가의 비제한적인 예는 그 개시내용 전체가 본원에 참고로 포함된 WO 2015095953에 기재된 것을 포함한다.
메이탄시노이드를 함유하는 면역접합체, 그의 제조 방법 및 그의 치료 용도는 예를 들어 문헌 [Erickson, et al (2006) Cancer Res. 66(8):4426-4433]; 미국 특허 제5,208,020호, 제5,416,064호, US 2005/0276812 A1, 및 유럽 특허 EP 0 425 235 B1에 기재되어 있으며, 이들의 개시내용은 그 전체가 본원에 참고로 포함된다.
일부 실시양태에서, 면역접합체는 돌라스타틴 또는 돌라스타틴 펩티드 유사체 또는 유도체, 예를 들어 아우리스타틴(그 개시내용 전체가 본원에 참고로 포함된 미국 특허 제5,635,483호 및 제5,780,588호)에 접합된 항체를 포함한다.
일부 실시양태에서, 면역접합체는 하나 이상의 칼리케아미신 분자에 접합된 항체를 포함한다. 칼리케아미신 패밀리의 접합체의 제조에 대해서는, 미국 특허 제5,712,374호, 제5,714,586호, 제5,739,116호, 제5,767,285호, 제5,770,701호, 제5,770,710호, 제5,773,001호, 제5,877,296호(모두 American Cyanamid Company의 특허)를 참조하고, 이들 특허의 개시내용은 그 전체가 본원에 참고로 포함된다.
항체에 접합될 수 있는 다른 항종양제는 미국 특허 제5,053,394호, 미국 특허 제5,770,710호에 기재된, LL-E33288 복합체로서 집합적으로 공지된 작용제의 패밀리인 BCNU, 스트렙토조신, 빈크리스틴 및 5-플루오로우라실, 및 미국 특허 제5,877,296호에 기재된 에스파라미신을 포함하고, 상기 특허의 개시내용은 그 전체가 본원에 참고로 포함된다.
약학 제제
본 발명의 항-PD-L1 조성물(예를 들어, 항-PD-L1 항체, 항-PD-L1 항체의 항원 결합 단편, 또는 본원에서 설명되는 ADC)은 치료할 병태에 적절한 임의의 경로에 의해 투여될 수 있다. 전형적으로, 투여는 비경구로, 즉 주입, 피하, 근내, 정맥내, 피내, 경막내 및/또는 경막외 투여를 통해 수행된다.
한 실시양태에서, 조성물은 정맥내 주입을 통해 투여된다. 주입을 통해 투여되는 투여량은 투여당 약 1 ㎍/m2 내지 약 10,000 ㎍/m2의 범위로서, 일반적으로 1, 2, 3 또는 4회의 총 투여를 위해 주당 1회 투여된다. 일부 실시양태에서, 투여량은 약 1 ㎍/m2 내지 약 1,000 ㎍/m2, 약 1 ㎍/m2 내지 약 800 ㎍/m2, 약 1 ㎍/m2 내지 약 600 ㎍/m2, 약 1 ㎍/m2 내지 약 400 ㎍/m2, 약 1 ㎍/m2 내지 약 200 ㎍/m2, 또는 약 1 ㎍/m2 내지 약 100 ㎍/m2이다. 일부 실시양태에서, 투여량은 약 10 ㎍/m2 내지 약 500 ㎍/m2, 약 10 ㎍/m2 내지 약 300 ㎍/m2, 또는 약 10 ㎍/m2 내지 약 200 ㎍/m2이다.
일부 실시양태에서, 용량은 질환의 증상을 완화하거나 경감시키기 위해 1일 1회, 1주 1회, 1주일에 다수 회 투여되지만 1일 1회보다 덜 빈번하게, 1개월에 다수 회 투여되지만 1일 1회보다 덜 빈번하게, 1개월에 다수 회 투여되지만 1주 1회보다 덜 빈번하게, 1개월에 1회, 격월로 1회, 3개월마다 1회, 6개월마다 1회, 매년 1회 또는 간헐적으로 투여된다. 투여는 종양 또는 치료되는 암의 증상의 완화가 나타날 때까지 개시된 간격들 중 어느 하나에서 계속 시행될 수 있다. 투여는 증상의 완화 또는 경감이 달성된 후에 계속될 수 있고, 상기 완화 또는 경감은 상기 계속된 투여에 의해 연장된다.
한 측면에서, 본 발명은 본 발명의 적어도 하나의 항-PD-L1 조성물을 포함하는 약학 제제를 제공한다. 일부 실시양태에서, 약학 제제는 (1) 본 발명의 항-PD-L1 조성물 및 (2) 약학적으로 허용되는 담체를 포함한다.
본 발명에 따라 사용되는 항-PD-L1 항체를 포함하는 치료 제제는 원하는 수준의 순도를 갖는 항체를 선택적인 약학적으로 허용되는 담체, 부형제 또는 안정화제(Remington's Pharmaceutical Sciences 16th edition, Osol, A. Ed. (1980)]와 혼합하여 동결건조된 제제 또는 수용액의 형태로 제조할 수 있다. 허용되는 담체, 부형제 또는 안정화제는 사용되는 투여량 및 농도에서 수여자에게 무독성이며, 버퍼, 예컨대 아세테이트, 트리스, 포스페이트, 시트레이트 및 다른 유기산; 아스코르브산 및 메티오닌을 포함하는 항산화제; 보존제(예컨대, 옥타데실디메틸벤질 암모늄 클로라이드, 헥사메토늄 클로라이드; 벤즈알코늄 클로라이드, 벤제토늄 클로라이드, 페놀, 부틸 또는 벤질 알코올; 알킬 파라벤, 예컨대 메틸 또는 프로필 파라벤; 카테콜; 레소르시놀; 시클로헥산올; 3-펜탄 올; 및 m-크레졸); 저분자량(약 10개 잔기 미만) 폴리펩티드; 단백질, 예컨대 혈청 알부민, 젤라틴 또는 면역글로불린; 친수성 중합체, 예컨대 폴리비닐피롤리돈; 아미노산, 예컨대 글리신, 글루타민, 아스파라긴, 히스티딘, 아르기닌 또는 리신; 모노사카라이드, 디사카라이드, 및 글루코스, 만노스 또는 덱스트린을 포함하는 다른 탄수화물; 킬레이팅제, 예컨대 EDTA; 장성 부여제(tonicifier), 예컨대 트레할로스 및 염화나트륨; 당, 예컨대 수크로스, 만니톨, 트레할로스 또는 소르비톨; 계면활성제, 예컨대 폴리소르베이트; 염 형성 반대 이온, 예컨대 나트륨; 금속 착체(예를 들어, Zn-단백질 복합체); 및/또는 비이온성 계면 활성제, 예컨대 트윈(TWEEN)®, 플루로닉스(PLURONICS)® 또는 폴리에틸렌 글리콜(PEG)를 포함한다. 생체 내 투여를 위해 사용되는 사용되는 약학 제제는 일반적으로 멸균된다. 이것은 멸균 여과막을 통한 여과에 의해 쉽게 달성된다.
활성 성분은 또한 예를 들어 코아세르베이션(coacervation) 기술 또는 계면 중합에 의해 제조된 마이크로캡슐, 예를 들어, 각각 히드록시메틸셀룰로스 또는 젤라틴-마이크로캡슐 및 폴리-(메틸메타크릴레이트) 마이크로캡슐에, 콜로이드성 약물 전달 시스템(예를 들어, 리포솜, 알부민 미세구, 마이크로에멀젼, 나노입자 및 나노캡슐)에, 또는 매크로에멀젼에 포획될 수 있다. 이러한 기술은 문헌 [Remington's Pharmaceutical Sciences, 16th edition, Osol, A. Ed. (1980)]에 개시되어 있다.
지효성 제제를 제조할 수 있다. 지효성 제제의 적합한 예는 항-PD-L1 조성물을 함유하는 고체 소수성 중합체의 반투과성 매트릭스를 포함하며, 상기 매트릭스는 성형된 물품, 예를 들어 필름 또는 마이크로캡슐의 형태이다. 지효성 매트릭스의 예는 폴리에스테르, 히드로겔(예를 들어, 폴리(2-히드록시에틸-메타크릴레이트) 또는 폴리(비닐알코올)), 폴리락티드(미국 특허 제3,773,919호), L-글루탐산과 γ 에틸-L-글루타메이트의 공중합체, 비분해성 에틸렌-비닐 아세테이트, 분해성 락트산-글리콜산 공중합체, 예컨대 LUPRON DEPOT®(락트산-글리콜산 공중합체 및 류프롤리드 아세테이트로 이루어진 주사용 미세구), 및 폴리-D-(-)-3-히드록시부티르산을 포함한다. 에틸렌-비닐 아세테이트 및 락트산-글리콜산과 같은 중합체는 100일 초과의 기간 동안 분자의 방출을 가능하게 할 수 있지만, 특정 히드로겔은 보다 짧은 시간 동안만 단백질을 방출한다. 캡슐화된 면역글로불린은 연장된 시간 동안 체내에 남아있지만, 37℃에서 수분에 노출되면 변성되거나 응집되어 생물학적 활성이 상실되고 면역원성이 변경될 수도 있다. 관련 메커니즘에 따라 안정화를 위한 합리적인 전략을 고안할 수 있다. 예를 들어, 응집 메커니즘이 티오-디술피드 교환을 통한 분자간 S-S 결합 형성인 것으로 밝혀지면, 안정화는 술프히드릴 잔기를 변형시키고, 산성 용액으로부터 동결건조하고, 수분 함량을 조절하고, 적절한 첨가제를 사용하고, 특정 중합체 매트릭스 조성물을 개발함으로써 달성될 수 있다.
항-PD-L1 조성물은 표적 세포/조직에 전달하기 위한 임의의 적합한 형태로 제제화될 수 있다. 예를 들어, 항체는 면역 리포솜으로서 제제화될 수 있다. "리포솜"은 포유동물에게 약물을 전달하는데 유용한 지질, 인지질 및/또는 계면활성제의 다양한 유형으로 이루어진 작은 베시클이다. 리포솜의 성분은 일반적으로 생물학적 막의 지질 배열과 유사한 이중층 형태로 배열된다. 항체를 함유하는 리포솜은 관련 기술 분야에 공지된 방법, 예를 들어 문헌 [Epstein et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:3688 (1985)]; [Hwang et al., Proc. Natl Acad. Sci. USA 77:4030 (1980)]; 미국 특허 제4,485,045호 및 제4,544,545호; 및 1997년 10월 23일 공개된 WO97/38731에 기재되어 있는 방법에 의해 제조된다. 순환 시간이 증가된 리포솜은 미국 특허 제5,013,556호에 개시되어 있다.
특히 유용한 리포솜은 포스파티딜콜린, 콜레스테롤 및 PEG-유도체화 포스파티딜에탄올아민(PEG-PE)을 포함하는 지질 조성물을 이용한 역상 증발 방법에 의해 생성될 수 있다. 리포솜은 규정된 공극 크기의 필터를 통해 압출되어 원하는 직경을 갖는 리포솜을 생성한다. 본 발명의 항체의 Fab' 단편은 디술피드 교환 반응을 통해 문헌 [Martin et al., J. Biol. Chem. 257:286-288 (1982)]에 기재된 바와 같이 리포솜에 접합될 수 있다. 화학치료제는 선택적으로 리포솜 내에 함유된다. 문헌 [Gabizon et al., J. National Cancer Inst. 81(19):1484 (1989)]을 참조한다.
생체 내 투여를 위해 사용되는 제제는 멸균되어야 한다. 이것은 멸균 여과막을 통한 여과에 의해 쉽게 달성된다.
제조품 및 키트
본 발명의 측면은 PD-L1에 의해 매개되는 질환 또는 장애, 예를 들어, PD-L1 발현 암의 치료, 예방 및/또는 진단에 유용한 물질을 함유하는 제조품을 포함한다. 제조품은 용기 및 용기 상의 또는 용기와 결합된 라벨 또는 포장 삽입물을 포함한다. 적합한 용기는 예를 들어 병, 바이알, 주사기 등을 포함한다. 용기는 유리 또는 플라스틱과 같은 다양한 물질로 형성될 수 있다. 용기는 질환 또는 장애를 치료, 예방 및/또는 진단하는데 효과적인 조성물을 보유하고, 멸균 접근 포트를 가질 수 있다(예를 들어, 용기는 피하 주사 바늘에 의해 관통 가능한 마개를 갖는 정맥 내 용액 백 또는 바이알일 수 있다). 조성물 내의 적어도 하나의 활성제는 본 발명의 항-PD-L1 조성물이다. 라벨 또는 포장 삽입물은 조성물이 질환 또는 장애의 치료에 사용됨을 나타낸다. 라벨 또는 포장 삽입물은 환자에게 항체 조성물을 투여하기 위한 설명서를 추가로 포함할 것이다. 추가로, 제조품은 약학적으로 허용되는 버퍼, 예컨대 주사용 정균수(BWFI), 포스페이트 완충 염수, 링거액 또는 덱스트로스 용액을 포함하는 제2 용기를 추가로 포함할 수 있다. 제조품은 다른 버퍼, 희석제, 필터, 바늘 및 주사기를 포함하는, 상업적 및 사용자 관점에서 바람직한 다른 물질을 추가로 포함할 수 있다.
다양한 목적을 위해, 예를 들어, PD-L1 발현 세포 사멸 검정을 위해 또는 세포로부터 PD-L1 폴리펩티드의 정제 또는 면역침전을 위해 유용한 키트가 또한 제공된다. PD-L1 폴리펩티드의 단리 및 정제를 위해, 키트는 비드(예를 들어, 세파로스 비드)에 커플링된 항-PD-L1 항체를 함유할 수 있다. 예를 들어, ELISA 또는 웨스턴 블롯에서, 시험관 내에서 PD-L1 폴리펩티드의 검출 및 정량을 위한 항체를 포함하는 키트를 제공할 수 있다. 제조품과 마찬가지로, 키트는 용기 및 용기 상의 또는 용기와 결합된 라벨 또는 포장 삽입물을 포함한다. 용기는 본 발명의 적어도 하나의 항-PD-L1 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 포함하는 조성물을 보유한다. 예를 들어, 희석제, 버퍼 및/또는 대조군 항체를 함유하는 추가의 용기가 포함될 수 있다. 라벨 또는 포장 삽입물은 조성물에 대한 설명 및 의도되는 시험관 내 또는 검출 용도에 대한 설명서를 제공할 수 있다.
사용 방법
본 발명의 측면은 다양한 암 및 면역 질환의 치료를 포함하고 이로 제한되지 않는, 적어도 부분적으로는 PD-L1에 의해 매개되는(예를 들어, PD-1과 PD-L1 사이의 상호작용에 의해) 질환 또는 병태의 치료, 예방 및/또는 진단에서, 본원에서 설명되는 바와 같은 하나 이상의 항-PD-L1 조성물(예를 들어, 항-PD-L1 항체, 항-PD-L1 항체의 항원 결합 단편, 또는 ADC)을 사용하는 방법을 포함한다. 비제한적인 예가 아래에서 보다 상세히 설명된다.
A. 치료 방법
본 발명의 항-PD-L1 조성물은 예를 들어 시험관 내, 생체 외 및 생체 내 치료 방법에 사용될 수 있다. 한 측면에서, 본 발명은 PD-L1 단백질과 하나 이상의 수용체 또는 리간드(예를 들어, PD-1 단백질) 사이의 상호작용을 억제하는 방법을 제공한다. 한 측면에서, 본 발명은 생체 내에서 또는 시험관 내에서 세포 성장 또는 증식을 억제하는 방법을 제공하고, 이 방법은 조성물 내의 항-PD-L1 항체 또는 그의 항원 결합 단편의 PD-L1에 대한 결합을 허용하는 조건 하에 세포를 항-PD-L1 조성물과 접촉시키는 단계를 포함한다. "세포 성장 또는 증식을 억제하는 것"은 세포의 성장 또는 증식을 적어도 약 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 또는 100%까지 감소시키는 것을 의미하고, 세포 사멸의 유도를 포함한다. 특정 실시양태에서, 세포는 종양 세포이다. 본 발명의 실시양태에 따른 항-PD-L1 조성물은 (i) PD-L1 단백질이 결합할 수 있는 수용체 또는 리간드(예를 들어, PD-1 단백질)와 PD-L1 단백질 사이의 상호작용을 억제하거나; (ii) 생체 내에서 종양 전이를 억제하거나; (iii) 생체 내에서 종양 성장을 억제하거나; (iv) 생체 내에서 종양 크기를 감소시키거나; (v) 생체 내에서 PD-L1을 발현하는 종양 세포에 대한 세포독성 활성을 나타내거나; 또는 (vi) 생체 내에서 PD-L1을 발현하는 종양 세포에 대한 세포 증식 억제 활성을 나타낼 수 있다. 일부 측면에서, 항-PD-L1 조성물은 PD-L1 단백질에 결합하여 PD-1 단백질의 하나 이상의 기능을 억제(예를 들어, PD-1 단백질의 하나 이상의 면역억제 기능을 억제)할 수 있다. 따라서, 일부 측면에서, 본 발명의 치료 방법은 PD-L1 단백질을 본원에서 설명되는 항-PD-L1 항체 또는 항원 결합 단편과 접촉시켜 PD-L1 단백질의 하나 이상의 기능(예를 들어, 하나 이상의 면역억제 기능)을 억제하는 단계를 포함한다.
본 발명의 측면은 PD-L1 단백질을 본원에서 설명되는 항-PD-L1 항체와 접촉시킴으로써 PD-1 단백질과 PD-L1 단백질 사이의 상호작용을 억제하는 방법을 포함한다. 일부 실시양태에서, 이 방법은 대상체에서 PD-1 단백질과 PD-L1 단백질 사이의 상호작용을 억제하기 위한 치료를 필요로 하는 대상체에게 유효량의 항-PD-L1 항체를 투여함으로써 생체 내에서 수행된다.
한 측면에서, 본 발명의 항-PD-L1 조성물은 암과 같은 세포 증식성 장애를 치료 또는 예방하기 위해 사용된다. 암의 종류는 비제한적으로, 급성 림프모구성 백혈병, 급성 골수성 백혈병, 담도암, 유방암(예를 들어, 삼중 음성 유방암, 호르몬 수용체 음성 유방암), 자궁경부암, 만성 림프구성 백혈병, 만성 골수성 백혈병, 결장직장암, 자궁내막암, 식도암, 위암, 두경부암, 비인두암, 호지킨 림프종, 폐암(예를 들면, 비소세포 폐암), 갑상선 수질암, 비호지킨 림프종, 다발성 골수종, 신장암, 난소암, 췌장암, 신경교종, 흑색종, 간암, 전립선암, 방광암, 흑색종 및 교아세포종을 포함한다.
일부 측면에서, 암은 상피암이다. 본 발명의 항-PD-L1 조성물을 사용한 치료에 적합한 상피암은 비제한적으로, 비소세포 폐암, 방광암, 신장암, 간암, 결장직장암, 난소암, 위암, 식도암, 췌장암, 갑상선암, 유방암(예를 들어, 호르몬 수용체 음성 유방암, 또는 삼중 음성 유방암), 및 비인두암을 포함한다.
일부 측면에서 암은 혈액암이다. 본 발명의 항-PD-LL 조성물을 사용하는 치료에 적합한 혈액암은 비제한적으로, 백혈병, 림프종, 골수종, 골수이형성 증후군, 급성 골수성 백혈병, 급성 림프모구성 백혈병, 만성 골수성 백혈병, 만성 림프구성 백혈병, 호지킨 림프종, 비호지킨 림프종을 포함한다.
일부 측면에서, 암은 흑색종 또는 교아세포종이다.
하나의 바람직한 실시양태에서, 암은 흑색종이다. 하나의 바람직한 실시양태에서, 암은 신장암이다. 하나의 바람직한 실시양태에서, 암은 방광암이다. 하나의 바람직한 실시양태에서, 암은 폐암이다. 하나의 바람직한 실시양태에서, 암은 비소세포 폐암이다. 하나의 바람직한 실시양태에서, 암은 소세포 폐암이다.
한 측면에서, 본 발명은 개체에게 유효량의 항-PD-L1 조성물을 투여하는 것을 포함하는, 세포 증식성 장애를 치료하는 방법을 제공한다. 일부 실시양태에서, 항-PD-L1 조성물은 수의 목적을 위해 또는 인간 질환의 동물 모델로서 항체가 그와 교차 반응하는 PD-L1을 발현하는 비인간 포유동물(예를 들어, 영장류, 돼지, 래트 또는 마우스)에 투여될 수 있다. 후자에 대해, 상기 동물 모델은 본 발명의 항-PD-L1 조성물의 치료 효능의 평가(예를 들어, 투여량 및 시간 경로 시험)를 위해 유용할 수 있다.
본 발명의 항-PD-L1 조성물(및 임의의 추가의 치료제 또는 보조제)은 비경구, 피하, 복강내, 폐내 및 비내, 및 국소 치료를 위해 필요한 경우의 병변내 투여를 포함하는 임의의 적합한 수단에 의해 투여될 수 있다. 비경구 주입은 근내, 정맥내, 동맥내, 복강내 또는 피하 투여를 포함한다. 또한, 항-PD-L1 조성물은 특히 조성물의 투여량을 감소시키면서 펄스 주입에 의해 적절하게 투여될 수 있다. 투여는 부분적으로 투여가 단기적인지 만성인지의 여부에 따라, 임의의 적합한 경로, 예를 들어, 주사, 예컨대 정맥내 또는 피하 주사에 의해 실시될 수 있다.
본 발명의 실시양태에 따른 항-PD-L1 조성물은 일반적으로 양호한 의학적 실무와 일치하는 방식으로 제제화되고, 투여되고, 관리된다. 이 문맥에서 고려해야 할 요인은 치료되는 특정 장애, 치료되는 특정 포유동물, 개별 환자의 임상 상태, 장애의 원인, 작용제의 전달 부위, 투여 방법, 투여 일정, 및 의료 종사자들에게 알려진 다른 요인을 포함한다.
스크리닝 방법
본 발명의 측면은 PD-L1 폴리펩티드를 함유하는 것으로 의심되는 샘플에서 PD-L1 폴리펩티드의 존재를 결정하는 방법을 포함하고, 상기 방법은 샘플을 PD-L1 폴리펩티드에 결합하는 항체와 접촉시키고, 샘플 내의 PD-L1 폴리펩티드에 대한 항체의 결합을 결정하는 단계를 포함하며, 상기 결합의 존재는 샘플 내의 PD-L1 폴리펩티드의 존재를 나타낸다. 선택적으로, 샘플은 PD-L1 폴리펩티드를 발현하는 것으로 의심되는 세포(예를 들어, 암세포)를 함유할 수 있다. 상기 방법에 사용되는 항체는 예를 들어 선택적으로 검출 가능하게 표지되거나, 고체 지지체에 부착될 수 있다.
본 발명의 또 다른 실시양태는 포유동물에서 종양의 존재를 진단하는 방법에 관한 것으로, 상기 방법은 (a) 포유동물로부터 수득된 세포를 포함하는 시험 샘플을 PD-L1 폴리펩티드에 결합하는 항체와 접촉시키는 단계 및 (b) 항체와 시험 샘플 내의 PD-L1 폴리펩티드 사이의 복합체 형성을 검출하는 단계를 포함하고, 여기서 복합체의 형성은 포유동물에서 PD-L1을 발현하는 종양의 존재를 나타낸다. 선택적으로, 항체는 예를 들어 검출 가능하게 표지되거나 고체 지지체에 부착될 수 있고/있거나, 시험 샘플은 암성 종양이 존재하는 것으로 의심되는 개체로부터 얻어진다. 항체 검출은 본원에서 설명되는 상이한 기술, 예를 들면, IHC 및 PET 영상화를 통해 달성될 수 있다.
활성 검정
본 발명의 실시양태에 따른 항-PD-L1 조성물은 관련 기술 분야에 공지된 다양한 검정에서 사용될 수 있다. 한 측면에서, 항-PD-L1 조성물은 생물학적 활성 검정에 사용될 수 있다. 생물학적 활성 검정은 예를 들어, 항-PD-L1 조성물의 세포 성장 또는 증식(예를 들어, "세포 사멸" 활성)을 억제하는 능력, 또는 프로그램된 세포 사멸(아폽토시스)을 포함하는 세포 사멸을 유도하는 능력을 측정할 수 있다.
특정 실시양태에서, 항-PD-L1 조성물은 세포 성장 또는 증식의 억제를 측정하기 위한 시험관 내 검정에 사용될 수 있다. 세포 성장 또는 증식의 억제에 대한 검정은 관련 기술 분야에 잘 알려져 있다. 본원에서 설명되는 "세포 사멸" 검정에 의해 예시되는 세포 증식을 위한 특정 검정은 세포 생존력을 측정한다. 그러한 검정의 하나는 프로메가(Promega, 미국 위스콘신주 매디슨 소재)로부터 상업적으로 입수 가능한 CellTiter-Glo™ 발광 세포 생존력 검정이다. 이 검정은 대사 활성 세포의 지표인 존재하는 ATP의 정량을 기초로 하여 배양물 내의 생존 가능한 세포의 수를 결정한다. 문헌 [Crouch et al. (1993) J. Immunol. Meth. 160:81-88], 미국 특허 제6,602,677호를 참조한다. 이 검정은 자동화된 고효율 스크리닝(HTS: high-throughput screening)에 적합하도록 96웰 또는 384웰 포맷으로 수행될 수 있다. 문헌 [Cree et al. (1995) Anticancer Drugs 6:398-404]을 참조한다. 검정 절차에는 배양된 세포에 단일 시약(CellTiter-Glo® Reagent)을 직접 첨가하는 것을 포함한다. 이것은 세포 용해 및 루시퍼라제 반응에 의해 생성된 발광 신호의 생성을 초래한다. 발광 신호는 존재하는 ATP의 양에 비례하며, 이것은 배양물에 존재하는 생존 가능한 세포의 수에 직접 비례한다. 데이터는 발광 분석기 또는 CCD 카메라 영상화 장치에 의해 기록될 수 있다. 발광 출력은 상대 광 단위(RLU)로 표현된다.
세포 증식을 위한 또 다른 검정은 미토콘드리아 리덕타제에 의한 3-(4,5-디메틸티아졸-2-일)-2,5-디페닐테트라졸륨 브로마이드의 포르마잔으로의 산화 반응을 측정하는 비색 검정인 "MTT" 검정이다. CellTiter-Glo™ 검정처럼, 이 검정은 세포 배양물에 존재하는 대사 활성 세포의 수를 나타낸다. 예를 들어, 문헌 [Mosmann (1983) J. Immunol. Meth. 65:55-63], 및 [Zhang et al. (2005) Cancer Res. 65:3877-3882]을 참조한다.
한 측면에서, 항-PD-L1 조성물은 시험관 내에서 세포 사멸을 유도하는 그의 능력을 측정하기 위한 검정에서 이용될 수 있다. 세포 사멸의 유도에 대한 검정은 관련 기술 분야에 잘 알려져 있다. 일부 실시양태에서, 그러한 검정은 예를 들어 프로피듐 요오다이드(PI), 트리판 블루(Trypan Blue)(문헌 [Moore et al. (1995) Cytotechnology, 17:1-11] 참조) 또는 7AAD의 섭취에 의해 표시되는 막 통합성의 손실을 측정한다. 예시적인 PI 섭취 검정에서, 세포를 10% 열 불활성화된 FBS(Hyclone) 및 2 mM L-글루타민으로 보충된 둘베코 변경 이글 배지(D-MEM):햄(Ham)의 F-12(50:50)에서 배양한다. 따라서, 검정은 보체 및 면역 이펙터 세포의 부재 하에서 수행된다. 세포를 100 x 20 mm 접시에 접시당 3 x 106개의 밀도로 씨딩하고, 밤새 부착시킨다. 배지를 제거하고, 새로 만든 배지 단독, 또는 다양한 농도의 항-PD-L1 조성물을 함유하는 배지로 교체한다. 세포를 3일 동안 인큐베이팅한다. 처리 후, 단일층을 PBS로 세척하고, 트립신으로 처리하여 탈착시킨다. 이어서, 세포를 4℃에서 1200 rpm으로 5분 동안 원심분리하고, 펠렛을 3 ml의 차가운 Ca2 + 결합 버퍼(10 mM Hepes, pH 7.4, 140 mM NaCl, 2.5 mM CaCl2)에 재현탁하고, 세포 덩어리를 제거하기 위해 35 mm 스트레이너 캡이 씌워진 12 x 75 mm 튜브(튜브당 1 ml, 처리군당 3개의 튜브) 내로 분취한다. 이어서, 튜브에 PI(10 ㎍/ml)를 첨가한다. FACSCAN™ 유동 세포 계측기 및 FACSCONVERT™ 셀퀘스트(CellQuest) 소프트웨어(Becton Dickinson)를 이용하여 샘플을 분석한다. 따라서, PI 섭취에 의해 결정된 바와 같이 통계학적으로 유의한 수준의 세포 사멸을 유도하는 항-PD-L1 조성물이 확인된다.
한 측면에서, 항-PD-L1 조성물은 시험관 내에서 아폽토시스(프로그램된 세포 사멸)을 유도하는 그의 능력에 대해 시험될 수 있다. 아폽토시스를 유도하는 항체에 대한 예시적인 검정은 아넥신 결합 검정이다. 예시적인 아넥신 결합 검정에서, 세포는 이전 단락에서 논의된 바와 같이 배양되고, 접시에 씨딩된다. 배지를 제거하고, 새로 만든 배지 단독 또는 0.001 내지 10 ㎍/ml의 항체를 함유하는 배지로 대체한다. 3일 인큐베이팅 기간 후, 단일층층을 PBS로 세척하고, 트립신으로 처리하여 탈착시킨다. 이어서, 세포를 원심분리하고, Ca2 + 결합 버퍼에 재현탁하고, 앞 단락에서 논의된 바와 같이 튜브 내로 분취한다. 이어서, 튜브에 표지된 아넥신(예를 들어, 아넥신 V-FITC)(1 ㎍/ml)을 넣는다. 샘플은 FACSCAN™ 유동 세포 계측기 및 FACSCONVERT™ 셀퀘스트 소프트웨어(BD Biosciences)를 사용하여 분석한다. 따라서, 대조군에 비해 통계적으로 유의한 수준의 아넥신 결합을 유도하는 항체가 확인된다. 아폽토시스를 유도하는 항체에 대한 또 다른 예시적인 검정은 게놈 DNA의 뉴클레오솜내 분해를 검출하기 위한 히스톤 DNA ELISA 비색 검정이다. 이러한 검정은 예를 들어 세포 사멸 검출 ELISA 키트(Roche, 미국 캘리포니아주 팔로 알토 소재)를 사용하여 수행할 수 있다.
상기한 임의의 시험관 내 검정에 사용하기 위한 세포는 PD-L1을 자연적으로 발현하거나 PD-L1을 발현하도록 조작된 세포 또는 세포주를 포함한다. 이러한 세포는 PD-L1을 발현하거나 동일한 조직 기원의 정상 세포에 비해 PD-L1을 과다발현하는 종양 세포를 포함한다. 이러한 세포는 또한 PD-L1을 발현하는 세포주(종양 세포주 포함) 및 PD-L1을 정상적으로는 발현하지 않지만 PD-L1을 코딩하는 핵산으로 형질감염된 세포주를 포함한다.
한 측면에서, 항-PD-L1 조성물은 생체 내에서 세포 성장 또는 증식을 억제하는 그의 능력에 대해 시험된다. 특정 실시양태에서, 항-PD-L1 조성물은 생체 내에서 종양 성장을 억제하는 그의 능력에 대해 시험된다. 이종이식 모델과 같은 생체 내 모델 시스템이 상기 시험에 사용될 수 있다. 예시적인 이종이식 시스템에서, 인간 종양 세포는 적합하게 면역손상된 비인간 동물, 예를 들어, SCID 마우스에 도입된다. 본 발명의 항-PD-L1 조성물은 동물에게 투여된다. 종양 성장을 억제하거나 감소시키는 항-PD-L1 조성물의 능력을 측정한다. 상기 이종이식 시스템의 특정 실시양태에서, 인간 종양 세포는 인간 환자의 종양 세포이다. 특정 실시양태에서, 인간 종양 세포는 피하 주사 또는 적합한 부위, 예컨대 유선 지방체 내로의 이식에 의해 적합하게 면역손상된 비인간 동물 내에 도입된다.
결합 검정 및 다른 검정
본 발명의 측면은 PD-L1 단백질을 본원에서 설명되는 항-PD-L1 항체와 접촉시킴으로써 PD-1 단백질과 PD-L1 단백질 사이의 상호작용을 억제하는 방법을 포함한다. 일부 실시양태에서, 상기 방법은 시험관 내에서 수행된다.
한 측면에서, 항-PD-L1 항체는 그의 항원 결합 활성에 대해 시험된다. 예를 들어, 특정 실시양태에서, 항-PD-L1 항체는 세포, 예를 들어, 종양 세포의 표면 상에 발현되는 PD-L1에 결합하는 그의 능력에 대해 시험된다. FACS 검정이 그러한 시험을 위해 사용될 수 있다.
한 측면에서, 경쟁 검정은 PD-L1에 결합하기 위해 본원에서 설명되는 모노클로날 항체와 경쟁하는 하나 이상의 항체(예를 들어, 하나 이상의 모노클로날 항체)를 확인하기 위해 사용될 수 있다. 특정 실시양태에서, 그러한 경쟁 항체는 본원에서 설명되는 모노클로날 항체에 의해 결합되는 것과 동일한 에피토프(예를 들어, 선형 또는 입체형태적 에피토프)에 결합한다. 예시적인 경쟁 검정은 문헌 [Harlow and Lane (1988) Antibodies: A Laboratory Manual ch.14 (Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY)]에서 제공되는 것과 같은 통상적인 검정을 포함하고, 이로 제한되지 않는다. 항체가 결합하는 에피토프를 매핑하기 위한 상세한 예시적인 방법은 문헌 [Morris (1996) "Epitope Mapping Protocols," in Methods in Molecular Biology vol. 66 (Humana Press, Totowa, NJ)]에 제시되어 있다. 2개의 항체는 각각의 항체가 서로의 결합을 50% 이상 차단하면 동일한 에피토프에 결합한다고 언급된다.
예시적인 경쟁 검정에서, 고정된 PD-L1은 PD-L1에 결합하는 제1 표지 항체(예를 들어, 본원에서 설명되는 모노클로날 항체) 및 PD-L1에 결합하기 위해 제1 항체와 경쟁하는 그의 능력에 대해 시험되는 제2 비표지 항체를 포함하는 용액 내에서 인큐베이팅된다. 제2 항체는 하이브리도마 상청액에 존재할 수 있다. 대조군으로서, 고정된 PD-L1은 제1 표지 항체를 포함하지만 제2 비표지 항체는 포함하지 않는 용액 내에서 인큐베이팅된다. 제1 항체의 PD-L1에 대한 결합을 허용하는 조건 하에 인큐베이팅한 후, 과량의 비결합 항체를 제거하고, 고정된 PD-L1과 회합된 표지의 양을 측정한다. 고정된 PD-L1과 회합된 표지의 양이 대조군 샘플에 비해 시험 샘플에서 실질적으로 감소되면, 이것은 제2 항체가 PD-L1에 결합하기 위해 제1 항체와 경쟁하고 있음을 나타낸다. 특정 실시양태에서, 고정된 PD-L1은 세포의 표면에 또는 그의 표면에 PD-L1을 발현하는 세포로부터 수득된 막 제제에 존재한다.
한 측면에서, 정제된 항-PD-L1 항체는 N 말단 서열결정, 아미노산 분석, 비변성 크기 배제 고압 액체 크로마토그래피(HPLC), 질량 분광 분석, 이온 교환 크로마토그래피 및 파파인 소화를 포함하고, 이로 제한되지 않는다.
하기 실시예는 단지 본 발명을 예시하기 위해 제공되는 것으로서, 본 발명의 범위를 어떠한 방식으로도 제한하고자 의도되지 않는다. 본 개시내용에서 몇몇 실시양태가 제시되었지만, 개시된 시스템 및 방법은 본 개시내용의 사상 또는 범위를 벗어나지 않으면서 많은 다른 특정 형태로 구현될 수 있다는 것을 이해하여야 한다. 본 실시예는 제한적인 것이 아니라 예시적인 것으로 간주되어야 하며, 그 의도는 본원에서 제시되는 상세한 설명으로 제한되지 않는다. 변화, 대체 및 변경의 다양한 예는 관련 기술 분야의 통상의 기술자에 의해 확인될 수 있으며, 본원에서 개시되는 사상 및 범위를 벗어나지 않으면서 이루어질 수 있다.
본원 명세서 전반에 걸쳐 인용된 모든 참고문헌은 본원에 참고로 포함된다.
실시예
실시예 1: 뮤린 하이브리도마 생성 및 스크리닝
1.1 면역화 프로토콜 및 스케줄:
i) HIS 태그를 갖는 인간 PD-L1(Sino Bio, cat# 10084-H084) 및 ii) HIS 태그(Sino Bio, cat# 90251-C08H)를 갖는 사이노몰거스 PD-L1의 세포외 부분을 포함한 재조합 융합 단백질을 면역화 프로토콜에서 항원으로 이용하였다. PD-L1에 대한 완전한 인간 모노클로날 항체를 생성하기 위해, 3개의 상이한 마우스 주를 면역화하고 스크리닝하였다. Balb/C(3), C57/Black 6(3) 및 스위스 웹스터(Swiss Webster)(3)를 제0, 7, 14, 21, 28 및 35일에 교대 단백질(인간 및 cyno PD-L1)로 6회 면역화하였다. 제1 면역화를 위해 50 ㎍의 단백질을 투여하고, 후속 면역화에서는 25 ㎍을 투여하였다. 항원의 피하 투여는 좌측 및 우측 사타구니 림프절, 좌측 및 우측 상완 림프절 및 좌측 및 우측 축 림프절 근처에서 50 ㎕/부위의 보조 MagicMouse를 사용하여 시행하였다. 항체 반응에 대한 혈청 역가를 평가하기 위해, 제1 면역화 전 제0일(예비 출혈) 및 제42일에 9마리의 마우스 모두로부터 혈액을 채취하였다. 혈청을 ELISA(아래에서 설명됨)에 의해 스크리닝하고, 충분한 역가의 항-인간-PD-L1 면역글로불린을 갖는 마우스를 융합에 사용하였다. 마우스를 희생시켜 비장을 제거하기 3일 전에 재조합 인간 PD-L1을 정맥 내에 부스팅 주사하였다.
1.2 PD-L1에 대한 인간 모노클로날 항체를 생성하는 하이브리도마의 생성.
스위스 웹스터 마우스로부터 단리된 마우스 비장 세포를 표준 프로토콜에 따라 마우스 골수종 세포주와 융합하였다. 이어서, 생성된 하이브리도마를 항원 특이적 항체 생산에 대해 스크리닝하였다.
면역화된 스위스 웹스터 마우스로부터의 비장 세포의 단일 세포 현탁액을 PEG을 사용하여 비분비성 마우스 골수종 세포주인 Sp2/0 세포에 융합시켰다. 세포를 ~1x105/웰로 평평 바닥 96웰 멸균 미량 역가 플레이트에 플레이팅한 후, 완전 DMEM-F12, 10% FBS, 글루타맥스(Glutamax), 피루브산나트륨, HEPES, 비필수 아미노산 및 페니실린/스트렙토마이신(Pen/Strep) 내에서 1xHAT를 사용하여 2주 동안 선택하였다. 2주 후, 세포를 HAT 선택이 HT로 대체된 배지에서 배양하였다. 이어서, 항-인간 PD-L1 모노클로날 IgG 및 IgM 항체에 대해 개별 웰을 ELISA(아래에서 설명됨)에 의해 스크리닝하였다. 항체 분비 하이브리도마를 다시 플레이팅하고, 이들이 항-인간 PD-L1 IgG 또는 IgM에 대해 여전히 양성인지를 조사하기 위해 다시 스크리닝하였다. 이어서, 항-인간 PD-L1 항체를 제한 희석에 의해 서브클로닝하였다. 안정한 클론을 HT 배지로부터 수거하여 DMEM-F12+10% FBS+글루타맥스+Pen/Strep 내로 옮기고, 추가 특성화를 위해 소량의 항체를 생성하도록 배양하였다. 또한, 하이브리도마를 10% DMSO 90% FBS에서 동결하였다.
1.3 상청액에서 뮤린 IgG 특이적 인간 PD-L1 항체의 검출
간접 포획 ELISA:
제1 스크리닝에서 항체 생산 마우스 혈청 또는 하이브리도마의 검출은 간접 ELISA 프로토콜 및 혈청 또는 하이브리도마 상청액의 단일 희석액을 사용하여 수행되었다. 후속 스크리닝은 마우스 혈청 또는 하이브리도마 상청액의 희석액으로 수행하였다. ELISA의 포맷은 개략적인 도 1에 도시된 바와 같다.
96웰 고결합 단백질 플레이트를 4℃에서 밤새 1 ㎍/mL(Southern Biotech, cat# 2014-01)로 PBS 중 50 ㎕의 염소 항-인간 IgG Fc로 코팅하였다. 플레이트를 PBS 0.05% 트윈20으로 3X 세척한 후, 종이 타월로 여러 번 두드려 건조하였다. 플레이트를 실온에서 1시간 동안 200 ㎕의 1% 우유로 차단하였다. 세척 및 건조 단계를 상기한 바와 같이 반복하고, 플레이트를 1% 우유 중 50 ㎕의 200 ng/mL 재조합 인간 B7-H1(PD-L1) Fc 키메라 단백질(R&D, cat# 156-87-1000)과 함께 1시간 동안 실온에서 인큐베이팅하였다. 특이성에 대해 스크리닝하기 위해, 재조합 사이노몰거스 원숭이 PD-L1 Fc 키메라(Sino Biological, cat# 90251-C02H), 재조합 마우스 PD-L1 Fc 키메라(Sino Biologicals, cat# 50010-M02H) 또는 재조합 인간 PD-L2 Fc 키메라 단백질(Sino Biological, cat# 10292-H02H)을 인간 PD-L1 Fc 키메라 대신에 사용하였다. 상기한 바와 같이 플레이트를 세척 및 건조한 후, 양성 대조군 항체(마우스 항-인간 PD-L1, 29E.2A3, BioLegend, cat# 329702) 및 그의 이소형 대조군(마우스 IgG2b k, BioLegend, cat# 400302)를 3 ㎍/ml에서 시작하여 O.1 ng/mL로 1% 우유 내에서 연속 희석하고, 50 ㎕의 적정된 항체를 모든 플레이트의 각각의 웰에 첨가하였다. 하이브리도마 상청액을 각각 1% 우유 내에 1:3으로 희석하였다. 50 ㎕의 상청액을 각각의 웰에 첨가하였다. 플레이트를 실온에서 1시간 동안 인큐베이팅하였다. 이를 상기한 바 같이 세척하고 건조한 후, 양고추냉이 퍼옥시다제(HRP)가 접합된 50 ㎕의 1:5000 염소 항-마우스 IgG Fc(Jackson Immuno Research, cat# 115-035-071)와 함께 실온에서 1시간 동안 인큐베이팅하였다. 세척 및 건조 단계를 반복한 후, 플레이트를 50 ㎕ TMB 기질(BD OptiIEIA, cat# 555214)을 사용하여 20~30분 동안 발색시켰다. 50 ㎕의 2N H2SO4로 반응을 중지시키고, 450 nm에서의 흡광도를 스펙트라맥스 제미니(Spectramax Gemini) 분광광도계로 판독하였다. 연속 희석된 하이브리도마 상청액에 대한 예시적인 데이터를 도 3, 패널 A에 제시한다.
1.4 인간 PD-L1 발현 세포에 결합하는 항체의 검출
유동 세포 계측에 의한 결합 반응성:
도 2에 나타낸 바와 같은 유동 세포 계측에 의한 하이브리도마 상청액에서 항-인간 PD-L1 모노클로날 항체의 반응성 및 특이성을 결정하기 위해, 그의 세포 표면에 인간 PD-L1을 발현하는 그란타(Granta)(DSMZ ACC# 342) 또는 프로메가 187103 세포(Promega, cat# 187106)와 같은 세포주를 사용하였다.
세포는 염색 1일 전에 신선한 배지로 보충되었다. 염색 당일에 HyQtase(GE Health & Life Sciences, cat# SV30030.01)를 사용하여 세포를 제거하였다. 모든 배지로부터 흡인한 후, 세포를 칼슘 또는 마그네슘이 없는 10 ml의 PBS로 헹구었다. PBS로부터 흡인한 후, 세포를 5 ml의 HyQtase와 함께 37℃에서 5분 동안 인큐베이팅하였다. 이어서, 단일 세포 현탁액을 만들기 위해 플라스크를 가볍게 두드려 세포를 제거하였다. 동일한 양의 배지를 첨가하여 HyQtase를 중화하고, 세포 계수기(BioRad TC20)에서 트리판 블루 배제를 사용하여 살아있는 세포의 수를 결정하였다. 세포의 밀도는 FACS 2% FBS 버퍼 60 ㎕당 1.5x10e4 세포로 조정되었다.
압축 염색[3( 하이브리도마 상청액 플레이트) 대 1(PD-L1 발현 세포 플레이트)).
60 ㎕의 FACS 2% FBS 버퍼(BD Pharmingen, cat# 554656) 내의 세포를 1.5x104/웰로 "v" 바닥 96웰 플레이트에 첨가하였다. 12웰 다중채널 피펫으로, 하이브리도마 플레이트의 각각의 웰로부터의 상청액 10 ㎕를 웰에 상응하는 세포에 첨가하였다. 이것은 3개의 하이브리도마 상청액 플레이트를 사용하여 반복하고, 이때 3개의 하이브리도마 웰로부터의 상청액을 세포를 함유하는 각각의 웰 내에 합하였다. 양성 대조군 29E.2A3(BioLegend, cat# 329702) 및 IgG2b k 이소형 대조군(BioLegend, cat# 400302)을 세포에 1 ㎍/mL로 첨가하고, 대조군 웰로 지정하였다. 플레이트를 4℃에서 30분 동안 인큐베이팅하였다. 세포를 150 ㎕의 FACS 2% FBS 버퍼로 세척한 후, 플레이트를 1200 rpm에서 5분 동안 원심분리(Sorvall Legend XIR 원심분리기)하고, 세포 펠렛을 깨뜨리지 않으면서 상청액을 부드럽게 흡인하였다. 항체 결합은 4℃에서 30분 동안 AF647 염소 항-마우스 IgG(Jackson ImmunoResearch, cat# 115-605-164)와 함께 세포를 인큐베이팅함으로써 검출되었다. 세척 단계를 상기한 바와 같이 반복하고, 세포를 1:100 7_AAD(BD Pharm, cat# 68981E)를 함유하는 60 ㎕의 FACS 2% FBS 내에 재현탁하였다. FACSCalibur(Becton Dickinson)에서 각각의 샘플에 대해 1,000개의 샘플을 수집하고, FLOJO® 유동 세포 계측 플랫폼에서 분석을 수행하였다. 상청액에서 검출된 결합을 양성 및 이소형 대조군과 비교하고, 양성 웰을 표시하였다.
FACS 양성 하이브리도마 웰의 디콘볼루션 ( deconvolution )
압축된 플레이트/웰에서 각각의 양성 웰은 개별 플레이트/웰로 압축을 풀고, 여기서 각각의 3개의 압축된 플레이트로부터의 개별 웰의 하이브리도마 상청액은 상기 프로토콜에 따라 프로메가 187103 세포에 대한 양성 염색에 대해 개별적으로 시험되었다. 결합을 항-PD-L1 항체 생산 하이브리도마를 확인하는 이소형 대조군과 비교하였고, PD-L1 발현 세포에 대한 높은 수준의 결합을 나타내는 ELISA-양성 웰을 다음 스크리닝으로 진행시켰다. 하이브리도마 상청액의 FACS 스크리닝에 대한 예시적인 데이터를 도 3, 패널 B에 제시한다.
간접 포획 ELISA: FACS 양성 상청액의 적정.
하이브리도마의 제1 스크리닝으로부터의 양성 상청액의 적정은 웰에 첨가하기 전에 상청액을 1% 우유 내에 연속적으로 3배 희석시키는, 상기 설명된 간접 ELISA 프로토콜을 사용하여 수행하였다. 선택된 하이브리도마 상청액 중의 뮤린 항체의 농도는 공지된 농도의 상업적 29E.2A3 항체를 사용하는 간접 ELISA에 의해 평가되었다. 이어서, 양성 상청액을 PD1/PD-L1 차단 검정에서 기능성에 대해 시험하였다.
실시예 2: PD-1/PD-L1 차단에 대한 기능 검정에서 FACS 및 ELISA 양성 하이브리도마 상청액의 시험
상기 설명된 스크리닝 검정은 플레이트에 코팅된 또는 세포 표면 상의 항원으로서의 PD-L1에 결합할 수 있는 클론을 확인할 수 있지만, 본 발명자들이 개발하려는 항체는 PD-1과 PD-L1의 상호작용을 효과적으로 차단하기 위해 필요한 것이다. 이러한 상호작용을 차단하기 위해 상기 확인된 FACS 및 ELISA 양성 항체의 능력을 시험하기 위해, 본 발명자들은 발광 기반 판독값을 갖는 상업적으로 이용 가능한 PD-1/PD-L1 차단 검정(Promega)을 사용하였다(도 4).
간단히 설명하면, PD-L1(Promega CS187103)의 표면 발현을 나타내는 동결된 CHO 세포를 37℃에서 해동하고, 10% 태아 소 혈청(Invitrogen)으로 보충된 DMEM에 재현탁하였다. 7,500개의 세포를 포함하는 배지를 37℃ 및 5% C02에서 16시간 동안 384웰 플레이트의 웰에 첨가하였다. 배지를 항체 함유 10 ㎕ RPMI + 2% FBS로 대체하였다. 10,000개의 조작된 주르카트 세포(Promega CS187105)를 포함하는 추가의 10 ㎕의 배지를 웰에 첨가하고, 5% C02 하에 37℃에서 5시간 동안 인큐베이팅하였다. 루시퍼라제 리포터 활성을 측정하기 위해 세포를 루시페린(Promega, Cell Titer Glo)을 함유하는 20 ㎕의 용해 버퍼와 혼합하였다. 광 출력은 EnVision 플레이트 판독기로 측정하였다. EC50은 프리즘(Prism) 소프트웨어를 사용하여 4 파라미터 곡선 피트(parameter curve fit)에 의해 결정되었다.
차단 검정에서의 하이브리도마 상청액의 스크리닝으로부터의 예시적인 데이터를 도 5, 패널 A에 제시한다. 하이브리도마 스크리닝 전략 및 결과는 도 5, 패널 B에 요약되어 있다. 전반적으로, ~3000개의 하이브리도마 상청액이 스크리닝되었고, 121개의 ELISA 양성 클론을 수득하였다. 이 중, 9개는 FACS 양성 클론이었고, 하나(3C5)만이 생물검정에서 기능적 활성을 나타내었다. 이 클론을 추가로 서브클로닝하고, 서브클론 3C5-2G12 중 하나를 아래에서 설명되는 바와 같이 VH 및 VL 서열을 확인하기 위한 차세대 서열결정을 수행하기 위해 사용하였다.
실시예 3: 차세대 서열결정( NGS ) 프로토콜을 이용한 하이브리도마 서열결정
전형적인 하이브리도마는 다수의 중쇄 및 경쇄를 발현하고, 이들 중 하나 이상은 기능적 검정에서 보이는 활성을 담당하는 서열일 수 있다. 차세대 서열결정(NGS) 방법을 적용하여 ELISA, FACS 및 차단 검정에서 양성으로 확인된 하이브리도마로부터 서열을 확인하였다. 간단히 설명하면, RNA를 하이브리도마(1x106 세포)로부터 추출하고, 단일 가닥 DNA는 RACE-PCR 프로토콜을 사용하여 생성되었다. 중쇄 및 경쇄 둘 모두를 증폭하기 위해, 마우스 IgG 및 마우스 IgK 영역에 대한 축퇴성 프라이머를 사용하였다. 프라이머는 FR1에서 FR4까지의 가변 영역을 커버하도록 설계되었다. 샘플은 바코드가 부착되었고, MiSeq NGS 서열결정기(Illumina)를 사용하여 쌍 형성 말단부 서열을 결정하였다. 생성되는 Fastq 파일은 파노플라이 바이오(Panoply Bio, 미국 캘리포니아주 칼스바드 소재)의 맞춤형 소프트웨어를 사용하여 분석되었다. 서열은 중첩된 쌍 형성 말단부에 대해 정렬되고, CDR은 마우스 프레임워크 영역을 사용하여 확인되었다. 데이터는 각각의 서열의 빈도에 기초하여 수집되었다. 이 서열 수집 과정에서 많은 말단 절단이 발생할 수 있고, 따라서 클로닝 및 추가의 시험을 위해 선택된 서열은 다음 기준을 기초로 하여 선택되었다:
1) 3개의 모든 CDR의 존재,
2) 서열의 패밀리에서 다중 발생,
3) CDR의 가장 높은 빈도,
4) N 말단에서의 명백한 말단 절단의 부재.
하이브리도마에서, 가장 지배적인 클론은 가장 빈번한 서열을 가질 것이다. 일반적으로, 표적에 잘, 더 좋게 또는 더 나쁘게 결합할 다른 클론이 존재할 수 있지만, 이들 클론은 배양물에서 높게 발현되지 않거나 잘 성장하지 않을 수 있다. 경쇄로부터 얻어진 서열의 패밀리에서, 하나의 서열이 이들 기준을 기초로 하여 다른 서열보다 우세하였다. 도 6, 패널 A에 도시된 바와 같이, 하나의 서열이 24회 발생하였고, 아래에서 제시된다.
Figure 112018121219076-pct00014
그러나, 중쇄 서열결정으로부터의 NGS 데이터는 도 6, 패널 B에 도시된 바와 같이 높은 빈도를 갖는 다수의 서열을 나타내었다. 따라서, 이 하이브리도마에 의해 생성된 활성 항체를 코딩하는 가장 높은 가능성을 나타내는 서열을 결정하기 위해 추가의 필터가 사용되었다. 예를 들어, 상기 세트에서 가장 고빈도로 발생하는 서열은 47회 발생했지만, 큰 N 말단 절단을 보이고 CDR1이 없기 때문에 고려되지 않았다. 대신에, 3개의 모든 CDR을 갖고 N 말단이 절단되지 않은 가장 높은 빈도의 서열이 시험을 위해 선택되었다. 이 서열은 상기 서열 세트에서 19회 발생하였고, 3개의 모든 CDR을 포함하고, 무손상 N 말단(생식세포 계열과 유사)을 갖는 것으로 보인다.
Figure 112018121219076-pct00015
실시예 4: 3C5 -2G12 IgG 및 IgM의 생산 및 시험
1. 설계된 돌연변이가 있는 DNA 구축물의 생성
DNA 구축물 합성. 설계된 돌연변이를 갖는 모든 DNA 구축물은 각각의 발현 벡터 내에 서브클로닝하기 위해 두 말단 모두에 적합한 제한 부위를 갖도록 상업적 판매자(Genescript, Lake Pharma)에 의해 합성되었다.
발현 벡터의 구축. 합성된 DNA 구축물을 1 ㎍/ml로 Tris-EDTA 버퍼 내에 재현탁하였다. DNA(1 ㎍)를 효소에 의해 소화시키고, 합성된 유전자를 전기영동에 의해 캐리어 플라스미드 DNA로부터 분리하였다. 소화된 DNA는 표준 분자 생물학 기술에 의해 미리 소화된 발현 벡터 플라스미드 DNA에 라이게이팅하였다. 라이게이팅된 DNA를 수용성(competent) 박테리아 내로 형질전환시키고, 다중 선택성 항생제가 첨가된 LB 플레이트에 플레이팅하였다. 여러 개의 박테리아 콜로니를 채취하고, DNA 제제를 표준 분자 생물학 기술로 만들었다. 제조된 DNA를 서열결정에 의해 검증하였다. 설계된 DNA 서열과 100% 일치하는 DNA 서열을 갖는 박테리아 클론만이 플라스미드 DNA 제조 및 후속 세포 형질감염에 사용되었다.
IgG 및 IgM 중쇄 및 경쇄와 관련하여 3C5-2G12 VH 및 VL 서열에 대한 서열을아래에 나타낸다.
Figure 112018121219076-pct00016
Figure 112018121219076-pct00017
이들 서열에 상응하는 DNA를 합성하고, HEK293 세포 내로 형질감염시켜 단백질을 생성시킨 다음, IgM에 특이적인 낙타류(camelid) 항체 친화도 매트릭스를 사용하여 정제하였다. 도 7에 도시된 바와 같이, J 사슬은 IgM 내에 혼입될 수 있고, 상응하는 J 사슬을 갖는 IgM의 오량체 형태는 J 사슬이 없는 육량체 형태와는 명백하게 구별 가능하다.
2. 단백질 발현, 정제 및 특성화
a. 형질감염. 중쇄, 경쇄 및 J 사슬 DNA를 CHO 또는 HEK293 세포 내로 형질감염시켰다. 발현 벡터를 위한 DNA는 전형적으로 PEI와 1:1:1 비율로 혼합한 다음, CHO-S 세포에 첨가하였다. CHO-S 세포로의 PEI 형질감염은 확립된 기술에 따라 수행되었다(문헌 [Biotechnology and Bioengineering, Vol 87, 553-545] 참조).
b. 면역 침전.
i. 캡쳐 셀렉트(Capture Select) IgM(BAC, Thermo Fisher). 형질감염된 CHO 세포 상청액으로부터의 IgM 단백질을 제조사의 프로토콜(GE Life Sciences)에 따라 캡쳐 셀렉트 IgM 친화도 매트릭스를 사용한 면역침강에 의해 부분적으로 정제하였다. 실온에서 2시간 동안 인큐베이팅한 후, 친화도 매트릭스를 원심분리에 의해 상청액으로부터 단리하였다. 매트릭스를 PBS로 3회 더 세척한 후, PBS를 조심스럽게 제거하였다. 포획된 단백질은 5분 동안 NuPage LDS 단백질 버퍼(Life Technologies)와 함께 인큐베이팅함으로써 매트릭스로부터 용리되었다.
c. 겔 전기영동.
i. 비환원성 SDS PAGE: 비환원성 SDS PAGE는 크기에 따라 천연 IgM 및 그의 변이체 형태를 분리한다. 동종이량체성 중쇄 및 경쇄로 이루어진 오량체 IgM은 약 1,000,000 분자량의 단백질 밴드를 생성한다. NuPage LDS 샘플 버퍼(Life Technologies)를 IgM 단백질 샘플에 25℃에서 30분 동안 첨가한 후, 겔에 로딩하였다. NativePage 노벡스(Novex) 3-12% 비스-트리스 겔(Life Technologies)을 노벡스 트리스-아세테이트 SDS 이동 버퍼(Life Technologies)와 함께 사용하였다. 염료 앞부분이 겔의 기저부에 도달할 때까지 겔을 이동시켰다.
ii. 환원성 SDS-PAGE: NuPage LDS 샘플 버퍼(Life Technologies) 및 NuPage 환원제인 디티오트레이톨(Life Technologies)을 IgM 단백질 샘플에 첨가하고, 80℃로 10분 동안 가열한 후, NuPage 노벡스 4-12% 비스-트리스 겔(Life Technologies)에 로딩하였다. NuPage MES SDS 이동 버퍼(Life Technologies)를 겔 전기영동에 사용하였다. 염료 앞부분이 겔의 기저부에 도달할 때까지 겔을 이동시켰다. 전기영동이 완료된 후, 겔을 장치로부터 제거하고, 콜로이달 블루 염색(Colloidal Blue Staining)(Life Technologies)을 사용하여 염색하였다.
iii. 웨스턴 블롯: 상기 조건 하에서 이동된 아크릴아미드 겔을 20% 에탄올 용액으로 10분 동안 세척한 후, 상기 단백질을 10분 동안 20V에서 iBlot 건식 블로팅 시스템(Invitrogen)을 사용하여 iBlot PVDF 막(Invitrogen)에 전달하였다. 전달 후, PVDF 막을 2% 소 혈청 알부민, 0.05% 트윈20을 사용하여 적어도 12시간 동안 차단하였다. 피어스(Pierce) J 사슬 항체(ThermoFisher)의 1/500 희석액을 막에 첨가하고, 1시간 동안 인큐베이팅한 후, 퍼옥시다제 접합된 염소 항-토끼 IgG(Jackson ImmunoResearch)의 1/5000 희석액을 첨가하여 암소에서 30분 동안 인큐베이팅하였다. 마지막으로, 수퍼 시그날 웨스트 피코(Super Signal West Pico) 화학발광 기질(ThermoFisher)을 블롯에 첨가하고, ChemiDoc-It HR410 영상화 시스템(UVP)을 사용하거나 또는 블롯을 X선 필름에 노출시켜 생성되는 신호를 가시화하였다.
실시예 5: 3C5 -2G12 IgG 및 IgM의 기능성 시험
상기한 바와 같이, PD-L1(Promega CS187103)의 표면 발현을 나타내는 동결된 CHO 세포를 37℃에서 해동하고, 10% 태아 소 혈청(Invitrogen)으로 보충된 DMEM에 재현탁하였다. 7,500개의 세포를 포함하는 배지를 37℃ 및 5% C02에서 16시간 동안 384웰 플레이트의 웰에 첨가하였다. 배지를 3C5-1G12 또는 대조군 항체를 함유하는 10 ㎕ RPMI + 2% FBS로 대체하였다. 10,000개의 조작된 주르카트 세포(Promega CS187105)를 포함하는 추가의 10 ㎕의 배지를 웰에 첨가하고, 5% C02 하에 37℃에서 5시간 동안 인큐베이팅하였다. 루시퍼라제 리포터 활성을 측정하기 위해 세포를 루시페린(Promega, Cell Titer Glo)을 함유하는 20 ㎕의 용해 버퍼와 혼합하였다. 광 출력은 EnVision 플레이트 판독기로 측정하였다. EC50은 프리즘 소프트웨어를 사용하여 4 파라미터 곡선 피트에 의해 결정되었다.
차단 검정에서 정제된 3C5-2G12 항체 제제의 시험으로부터의 예시적인 데이터를 도 8에 나타내었다. IgM 및 IgM+J 포맷은 효능이 매우 높고(61 pM 및 96 pM), 이 검정에서 IgG 포맷보다 훨씬 더 효능이 있는 것으로 나타났다.
실시예 6: 3C5 -2G12 IgG 및 IgM의 교차 반응성 시험
재조합 인간 PD-L1 Fc 키메라(Sino Biologicals, cat# 10084-H02H), 재조합 사이노몰거스 원숭이 PD-L1 Fc 키메라(Sino Biological, cat# 90251-C02H), 재조합 마우스 PD-L1 Fc 키메라(Sino Biologicals, cat#50010-M02H) 및 재조합 인간 PD-L2 Fc 키메라 단백질(Sino Biological, cat# 10292-H02H)을 4℃에서 밤새 인큐베이팅함으로써 ELISA 플레이트에 1 ㎍/mL로 직접 코팅하였다. 플레이트를 PBS 0.05% 트윈으로 3X 세척한 후, 종이 타월로 여러 번 두드려 건조하였다. 모든 플레이트를 실온에서 1시간 동안 200 ㎕의 1% 우유로 차단하였다. 상기와 같이 플레이트를 세척하고 건조한 후, 3C5.2G12 IgG, 3C5.2G12 IgM 및 3C5.2G12 IgM+wtJ 항체를 각각 3 ㎍/ml에서 시작하여 O.1 ng/mL로 1% 우유 내에서 1:3으로 연속 희석하였다. 50 ㎕의 희석된 항체를 모든 플레이트의 각각의 웰에 첨가하였다. 양성 대조군 항체(마우스 항-인간 PD-L1, 29E.2A3(BioLegend, cat# 329702) 및 그의 이소형 대조군 마우스 IgG2b k(BioLegend, cat# 400302)를 3 ㎍/ml에서 시작하여 O.1 ng/mL로 1% 우유 내에서 3배 연속 희석하고, 50 ㎕의 적정된 항체를 그 각각의 플레이트/웰에 첨가하였다. 이와 유사하게, 래트 항-마우스 PD-L1(BioLegend, cat# 124302) 및 래트 IgG2b 이소형(BioLegend, cat# 400622), 항-인간 PD-L2(BioLegend, cat# 345502) 및 마우스 IgG1 이소형(BioLegend, cat# 4011402)을 상기와 같이 적정하고, 그 각각의 플레이트/웰에 첨가하였다. 플레이트를 실온에서 1시간 동안 인큐베이팅하였다. 이를 상기와 같이 세척하고 건조한 후, 모든 3C5.2G12를 양고추냉이 퍼옥시다제(HRP)가 접합된 50 ㎕의 1:5000 염소 항-인간 카파 경쇄 항체(Jackson Immuno Research, cat# 115-035-071)와 함께 실온에서 1시간 동안 인큐베이팅하였다. 대조군 웰에 대해, 적절한 2차 항체인 염소 항 마우스 HRP(Southern Biotech, cat# 1033) 및 마우스 항 래트 HRP(Southern Biotech, cat# 3070-05)를 상기와 같이 희석하고 인큐베이팅하였다. 세척 및 건조 단계를 반복한 후, 플레이트를 50 ㎕ TMB 기질(BD OptiIEIA, cat# 555214)을 사용하여 20~30분 동안 발색시켰다. 50 ㎕의 2N H2SO4로 반응을 중지시키고, 450 nm에서의 흡광도를 스펙트라맥스 제미니 분광광도계로 판독하였다. 연속 희석된 3C5.2G12에 대한 예시적인 데이터를 도 9, 패널 A, 패널 B 및 패널 C에 나타내었다.
실시예 7: 3C5 -2G12 IgG 및 IgM의 인간화
3C5-2G12 항체의 인간화는 두 포맷(IgG 및 IgM) 모두에서 수행되었다. 시험을 위해 생산된 서열 및 조합을 아래에 제시한다.
Figure 112018121219076-pct00018
Figure 112018121219076-pct00019
하기 조합물은 상기 설명된 표준 기술을 사용하여 IgG의 형태로 만들고, 단백질 A를 사용하여 정제하였다.
h3C5H1-h3C5L1
h3C5H2-h3C5L2
h3C5H3-h3C5L2
h3C5H4-h3C5L2
PD-L1 차단 검정에서 이들 각각의 항체에 대한 시험 결과를 도 10에 나타내었다. 인간화 과정 동안 일어난 보존적 변화는 모두 인간화 항체의 차단 활성에 대해 거의 영향을 미치지 않는 것으로 보인다.
실시예 8: 에피토프 매핑
펩티드 에피토프 매핑은 PEPSCAN™ 시스템을 사용하여 고체 지지체 상에 직접 합성함으로써 PD-L1(Q9NZQ7, 서열 번호 48)의 세포외 도메인의 아미노산 19 내지 132에 걸친 모든 중첩하는 15개 아미노산의 선형 펩티드의 라이브러리를 생성하여 수행되었다.
항체 결합은 자동화된 ELISA 유형 판독을 사용하여 PEPSCAN™ 시스템에서 정량하였다. 3C5 항체(IgG 포맷) 및 PD-L1에 결합하는 참조 항체인 대조군 항체 YW243.55S70(본원에서 "S70"으로 칭함)에 대해 펩티드 어레이에 대한 결합을 결정하였다. S70 중쇄 및 경쇄 서열은 미국 특허 제8,217,149호에 개시되어 있으며, 그의 개시내용은 그 전부가 본원에 참고로 포함된다. S70 항체에 결합하는 hPD-L1 에피토프는 아미노산 서열 QDAGVYRCMIS(서열 번호 48의 아미노산 107 내지 117)에 명확하게 매핑되었다. 이 에피토프는 hPD-1과 접촉하도록 계산된 hPD-L1의 14개의 불연속 잔기 중 3개의 아미노산(R113, M155 및 SI17)을 포함한다. 그 전부가 본원에 참고로포함된 문헌 [Lin, D.Y. et al., Proc . Natl . Acad . Sci . USA 105:3011-3016(2008)]을 참조한다.
3C5 에피토프는 낮은 엄격도의 결합 조건(예를 들어, 항체 예비조건화에 사용된 0.1X 샘플 버퍼 및 ELISA 반응)을 사용하여 단지 부분적으로만 결정될 수 있다. 결합 결과는 S70 에피토프와 부분적으로 겹치는 3C5 에피토프와 일치하였다. 결합 결과는 예를 들어 불연속 또는 입체형태적 에피토프로서 hPD-L1의 다른 영역이 또한 3C5에 의해 결합될 가능성을 배제하지 않았다. 하기 실시예 9에서 제시되는 바와 같이, 3C5 및 S70 항체는 인간 PD-L1에 결합하기 위해 교차 경쟁하고(하기 실시예 9 참조), 이것은 2개의 항체에 대한 에피토프가 중복되다는 것을 추가로 뒷받침한다.
실시예 9: 항체 교차 차단
항체 교차 차단 분석은 다음과 같은 방법으로 수행하였다. 인간 PD-L1을 발현하는 CHO 세포(반응당 20,000-30,000개)를 4℃에서 30분 동안 3C5(IgG의), S70, 또는 무관한 이소형 대조군 IgG 항체의 비표지된 적정된 희석액과 함께 인큐베이팅하였다. 세포를 세척한 다음, 4℃에서 30분 동안 일정한 농도의 알렉사 플루오르(Alexa Fluor)® 647로 표지된 3C5 또는 S70(1 ㎍/mL)과 함께 인큐베이팅하였다. FACSCalibur™ 시스템을 사용하여 형광 염색 강도를 결정하였다. 동일한 항체에 의한 경쟁은 양성 대조군이었지만, 무관한 항체에 의한 경쟁의 결여는 음성 대조군이었다. 교차 차단 결과를 도 11, 패널 A 및 패널 B에 나타내었다. 결과는 3C5 및 S70에 의해 인간 PD-L1에 대한 결합의 상호 교차 차단을 입증한다. 전술한 발명은 이해의 명료성을 위해 예시 및 예로서 일부 상세하게 설명되었지만, 첨부된 청구범위의 사상 또는 범위를 벗어나지 않으면서 본 발명에 대한 특정 변경 및 변형이 가능하다는 것이 본 발명의 교시내용에 비추어 관련 기술 분야의 통상의 기술자에게 자명할 것이다.
따라서, 앞의 설명은 단지 본 발명의 원리를 설명하기 위한 것이다. 관련 기술 분야의 통상의 기술자는 본원에 명시적으로 기재되거나 도시되지는 않았지만 본 발명의 원리를 구현하고 본 발명의 사상 및 범위 내에 포함되는 다양한 배열을 고안할 수 있음이 이해될 것이다. 또한, 본원에서 인용된 모든 예 및 조건부 언어는 주로 독자가 본 발명의 원리 및 발명자가 기술을 발전시키는 데 기여한 개념을 이해하는 것을 돕기 위해 의도된 것이며, 상기 구체적으로 언급된 예 및 조건에 대한 어떠한 제한도 제시하지 않는 것으로 고려되어야 한다. 또한, 본 발명의 원리 및 측면, 및 그의 구체적인 예를 언급하는 본원의 모든 설명은 그의 구조적 및 기능적 등가물 모두를 포함하도록 의도된다. 추가로, 이러한 등가물에는 현재 알려진 등가물 및 향후 개발되는 등가물, 즉 구조와 관계없이 동일한 기능을 수행하는 개발된 임의의 요소가 모두 포함되는 것이 의도된다. 따라서, 본 발명의 범위는 본원에서 제시되고 설명되는 예시적인 측면으로 제한되도록 의도되지 않는다. 오히려, 본 발명의 범위 및 사상은 첨부된 청구범위에 의해 구체화된다.
SEQUENCE LISTING <110> IGM BIOSCIENCES, INC. <120> ANTI-PD-L1 ANTIBODIES <130> IGM-0009-WO <140> PCT/US2017/031791 <141> 2017-05-09 <150> 62/333,643 <151> 2016-05-09 <160> 71 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide" <400> 1 Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser Ile Trp Leu Ser 1 5 10 <210> 2 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide" <400> 2 Lys Ala Ser Asn Leu His Thr 1 5 <210> 3 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide" <400> 3 Leu Gln Ser Gln Ser Phe Pro Arg Thr 1 5 <210> 4 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide" <400> 4 Gly Phe Ser Leu Thr Ser Tyr Asp Ile Ser 1 5 10 <210> 5 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide" <400> 5 Val Ile Trp Thr Gly Val Gly Thr Asn 1 5 <210> 6 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide" <400> 6 Asp Pro Tyr Tyr Tyr Gly Met Asp Tyr 1 5 <210> 7 <211> 25 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide" <400> 7 Gln Val Gln Leu Lys Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Ala Pro Ser Gln 1 5 10 15 Ser Leu Ser Ile Thr Cys Thr Val Ser 20 25 <210> 8 <211> 25 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide" <400> 8 Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu 1 5 10 15 Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser 20 25 <210> 9 <211> 25 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide" <400> 9 Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu 1 5 10 15 Thr Leu Ser Ile Thr Cys Thr Val Ser 20 25 <210> 10 <211> 25 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide" <400> 10 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser 20 25 <210> 11 <211> 25 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide" <400> 11 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Ile Ser Cys Ala Val Ser 20 25 <210> 12 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide" <400> 12 Trp Val Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Leu Gly 1 5 10 <210> 13 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide" <400> 13 Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile Gly 1 5 10 <210> 14 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide" <400> 14 Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Leu Gly 1 5 10 <210> 15 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide" <400> 15 Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ser 1 5 10 <210> 16 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide" <400> 16 Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Leu Gly 1 5 10 <210> 17 <211> 39 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide" <400> 17 Tyr Asn Ser Ala Phe Met Ser Arg Leu Ser Ile Ser Lys Asp Asn Ser 1 5 10 15 Lys Ser Gln Val Phe Leu Lys Met Asn Ser Leu Gln Thr Asp Asp Thr 20 25 30 Ala Met Tyr Tyr Cys Val Arg 35 <210> 18 <211> 39 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide" <400> 18 Tyr Asn Pro Ser Leu Lys Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser 1 5 10 15 Lys Asn Gln Phe Ser Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr 20 25 30 Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg 35 <210> 19 <211> 39 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide" <400> 19 Tyr Asn Pro Ser Leu Lys Ser Arg Val Thr Ile Ser Lys Asp Thr Ser 1 5 10 15 Lys Asn Gln Phe Ser Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr 20 25 30 Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg 35 <210> 20 <211> 39 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide" <400> 20 Tyr Asn Pro Ser Phe Lys Ser Arg Leu Thr Ile Ser Lys Asp Thr Ser 1 5 10 15 Lys Asn Gln Val Ser Leu Lys Met Ser Ser Leu Thr Ala Ala Asp Thr 20 25 30 Ala Val Tyr Tyr Cys Val Arg 35 <210> 21 <211> 39 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide" <400> 21 Tyr Asn Pro Ser Phe Lys Ser Arg Leu Thr Ile Ser Lys Asp Asn Ser 1 5 10 15 Lys Asn Gln Val Ser Leu Lys Met Ser Ser Leu Thr Ala Ala Asp Thr 20 25 30 Ala Val Tyr Tyr Cys Val Arg 35 <210> 22 <211> 39 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide" <400> 22 Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser 1 5 10 15 Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr 20 25 30 Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg 35 <210> 23 <211> 39 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide" <400> 23 Tyr Ala Asp Ser Phe Lys Gly Arg Leu Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser 1 5 10 15 Lys Asn Thr Val Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr 20 25 30 Ala Val Tyr Tyr Cys Val Arg 35 <210> 24 <211> 39 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide" <400> 24 Tyr Ala Asp Ser Phe Lys Gly Arg Leu Thr Ile Ser Lys Asp Asn Ser 1 5 10 15 Lys Asn Thr Val Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr 20 25 30 Ala Val Tyr Tyr Cys Val Arg 35 <210> 25 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide" <400> 25 Trp Gly Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser 1 5 10 <210> 26 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide" <400> 26 Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 1 5 10 <210> 27 <211> 23 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide" <400> 27 Asp Ile Gln Met Asn Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Leu Gly 1 5 10 15 Asp Thr Ile Thr Ile Thr Cys 20 <210> 28 <211> 23 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide" <400> 28 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys 20 <210> 29 <211> 23 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide" <400> 29 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Ile Thr Ile Thr Cys 20 <210> 30 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide" <400> 30 Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Asn Ile Pro Glu Leu Leu Ile Tyr 1 5 10 15 <210> 31 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide" <400> 31 Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr 1 5 10 15 <210> 32 <211> 32 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide" <400> 32 Gly Val Pro Pro Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr 1 5 10 15 Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Tyr Cys 20 25 30 <210> 33 <211> 32 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide" <400> 33 Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr 1 5 10 15 Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys 20 25 30 <210> 34 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide" <400> 34 Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 1 5 10 <210> 35 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide" <400> 35 Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 1 5 10 <210> 36 <211> 117 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide" <400> 36 Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu 1 5 10 15 Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Thr Ser Tyr 20 25 30 Asp Ile Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Val Ile Trp Thr Gly Val Gly Thr Asn Tyr Asn Pro Ser Leu Lys 50 55 60 Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser Leu 65 70 75 80 Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala 85 90 95 Arg Asp Pro Tyr Tyr Tyr Gly Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu 100 105 110 Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 37 <211> 117 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide" <400> 37 Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu 1 5 10 15 Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Thr Ser Tyr 20 25 30 Asp Ile Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Leu 35 40 45 Gly Val Ile Trp Thr Gly Val Gly Thr Asn Tyr Asn Pro Ser Leu Lys 50 55 60 Ser Arg Val Thr Ile Ser Lys Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser Leu 65 70 75 80 Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala 85 90 95 Arg Asp Pro Tyr Tyr Tyr Gly Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu 100 105 110 Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 38 <211> 117 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide" <400> 38 Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu 1 5 10 15 Thr Leu Ser Ile Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Thr Ser Tyr 20 25 30 Asp Ile Ser Trp Val Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Leu 35 40 45 Gly Val Ile Trp Thr Gly Val Gly Thr Asn Tyr Asn Pro Ser Phe Lys 50 55 60 Ser Arg Leu Thr Ile Ser Lys Asp Thr Ser Lys Asn Gln Val Ser Leu 65 70 75 80 Lys Met Ser Ser Leu Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Val 85 90 95 Arg Asp Pro Tyr Tyr Tyr Gly Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu 100 105 110 Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 39 <211> 117 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide" <400> 39 Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu 1 5 10 15 Thr Leu Ser Ile Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Thr Ser Tyr 20 25 30 Asp Ile Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Leu 35 40 45 Gly Val Ile Trp Thr Gly Val Gly Thr Asn Tyr Asn Pro Ser Phe Lys 50 55 60 Ser Arg Leu Thr Ile Ser Lys Asp Asn Ser Lys Asn Gln Val Ser Leu 65 70 75 80 Lys Met Ser Ser Leu Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Val 85 90 95 Arg Asp Pro Tyr Tyr Tyr Gly Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu 100 105 110 Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 40 <211> 117 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide" <400> 40 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Ser Leu Thr Ser Tyr 20 25 30 Asp Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Val Ile Trp Thr Gly Val Gly Thr Asn Tyr Ala Asp Ser Val Lys 50 55 60 Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu 65 70 75 80 Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala 85 90 95 Arg Asp Pro Tyr Tyr Tyr Gly Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu 100 105 110 Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 41 <211> 117 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide" <400> 41 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Ile Ser Cys Ala Val Ser Gly Phe Ser Leu Thr Ser Tyr 20 25 30 Asp Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Leu 35 40 45 Gly Val Ile Trp Thr Gly Val Gly Thr Asn Tyr Ala Asp Ser Phe Lys 50 55 60 Gly Arg Leu Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Val Tyr Leu 65 70 75 80 Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Val 85 90 95 Arg Asp Pro Tyr Tyr Tyr Gly Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu 100 105 110 Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 42 <211> 117 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide" <400> 42 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Ile Ser Cys Ala Val Ser Gly Phe Ser Leu Thr Ser Tyr 20 25 30 Asp Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Leu 35 40 45 Gly Val Ile Trp Thr Gly Val Gly Thr Asn Tyr Ala Asp Ser Phe Lys 50 55 60 Gly Arg Leu Thr Ile Ser Lys Asp Asn Ser Lys Asn Thr Val Tyr Leu 65 70 75 80 Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Val 85 90 95 Arg Asp Pro Tyr Tyr Tyr Gly Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu 100 105 110 Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 43 <211> 107 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide" <400> 43 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser Ile Trp 20 25 30 Leu Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Lys Ala Ser Asn Leu His Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gln Ser Gln Ser Phe Pro Arg 85 90 95 Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 <210> 44 <211> 107 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide" <400> 44 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Ile Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser Ile Trp 20 25 30 Leu Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Lys Ala Ser Asn Leu His Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gln Ser Gln Ser Phe Pro Arg 85 90 95 Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 <210> 45 <211> 117 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide" <400> 45 Gln Val Gln Leu Lys Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Ala Pro Ser Gln 1 5 10 15 Ser Leu Ser Ile Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Thr Ser Tyr 20 25 30 Asp Ile Ser Trp Val Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Leu 35 40 45 Gly Val Ile Trp Thr Gly Val Gly Thr Asn Tyr Asn Ser Ala Phe Met 50 55 60 Ser Arg Leu Ser Ile Ser Lys Asp Asn Ser Lys Ser Gln Val Phe Leu 65 70 75 80 Lys Met Asn Ser Leu Gln Thr Asp Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys Val 85 90 95 Arg Asp Pro Tyr Tyr Tyr Gly Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Ser 100 105 110 Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 46 <211> 107 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide" <400> 46 Asp Ile Gln Met Asn Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Leu Gly 1 5 10 15 Asp Thr Ile Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser Ile Trp 20 25 30 Leu Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Asn Ile Pro Glu Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Lys Ala Ser Asn Leu His Thr Gly Val Pro Pro Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gln Ser Gln Ser Phe Pro Arg 85 90 95 Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 <210> 47 <211> 137 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 47 Gln Glu Asp Glu Arg Ile Val Leu Val Asp Asn Lys Cys Lys Cys Ala 1 5 10 15 Arg Ile Thr Ser Arg Ile Ile Arg Ser Ser Glu Asp Pro Asn Glu Asp 20 25 30 Ile Val Glu Arg Asn Ile Arg Ile Ile Val Pro Leu Asn Asn Arg Glu 35 40 45 Asn Ile Ser Asp Pro Thr Ser Pro Leu Arg Thr Arg Phe Val Tyr His 50 55 60 Leu Ser Asp Leu Cys Lys Lys Cys Asp Pro Thr Glu Val Glu Leu Asp 65 70 75 80 Asn Gln Ile Val Thr Ala Thr Gln Ser Asn Ile Cys Asp Glu Asp Ser 85 90 95 Ala Thr Glu Thr Cys Tyr Thr Tyr Asp Arg Asn Lys Cys Tyr Thr Ala 100 105 110 Val Val Pro Leu Val Tyr Gly Gly Glu Thr Lys Met Val Glu Thr Ala 115 120 125 Leu Thr Pro Asp Ala Cys Tyr Pro Asp 130 135 <210> 48 <211> 290 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 48 Met Arg Ile Phe Ala Val Phe Ile Phe Met Thr Tyr Trp His Leu Leu 1 5 10 15 Asn Ala Phe Thr Val Thr Val Pro Lys Asp Leu Tyr Val Val Glu Tyr 20 25 30 Gly Ser Asn Met Thr Ile Glu Cys Lys Phe Pro Val Glu Lys Gln Leu 35 40 45 Asp Leu Ala Ala Leu Ile Val Tyr Trp Glu Met Glu Asp Lys Asn Ile 50 55 60 Ile Gln Phe Val His Gly Glu Glu Asp Leu Lys Val Gln His Ser Ser 65 70 75 80 Tyr Arg Gln Arg Ala Arg Leu Leu Lys Asp Gln Leu Ser Leu Gly Asn 85 90 95 Ala Ala Leu Gln Ile Thr Asp Val Lys Leu Gln Asp Ala Gly Val Tyr 100 105 110 Arg Cys Met Ile Ser Tyr Gly Gly Ala Asp Tyr Lys Arg Ile Thr Val 115 120 125 Lys Val Asn Ala Pro Tyr Asn Lys Ile Asn Gln Arg Ile Leu Val Val 130 135 140 Asp Pro Val Thr Ser Glu His Glu Leu Thr Cys Gln Ala Glu Gly Tyr 145 150 155 160 Pro Lys Ala Glu Val Ile Trp Thr Ser Ser Asp His Gln Val Leu Ser 165 170 175 Gly Lys Thr Thr Thr Thr Asn Ser Lys Arg Glu Glu Lys Leu Phe Asn 180 185 190 Val Thr Ser Thr Leu Arg Ile Asn Thr Thr Thr Asn Glu Ile Phe Tyr 195 200 205 Cys Thr Phe Arg Arg Leu Asp Pro Glu Glu Asn His Thr Ala Glu Leu 210 215 220 Val Ile Pro Glu Leu Pro Leu Ala His Pro Pro Asn Glu Arg Thr His 225 230 235 240 Leu Val Ile Leu Gly Ala Ile Leu Leu Cys Leu Gly Val Ala Leu Thr 245 250 255 Phe Ile Phe Arg Leu Arg Lys Gly Arg Met Met Asp Val Lys Lys Cys 260 265 270 Gly Ile Gln Asp Thr Asn Ser Lys Lys Gln Ser Asp Thr His Leu Glu 275 280 285 Glu Thr 290 <210> 49 <211> 470 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide" <400> 49 Met Asp Pro Lys Gly Ser Leu Ser Trp Arg Ile Leu Leu Phe Leu Ser 1 5 10 15 Leu Ala Phe Glu Leu Ser Tyr Gly Gln Val Gln Leu Lys Glu Ser Gly 20 25 30 Pro Gly Leu Val Ala Pro Ser Gln Ser Leu Ser Ile Thr Cys Thr Val 35 40 45 Ser Gly Phe Ser Leu Thr Ser Tyr Asp Ile Ser Trp Val Arg Gln Pro 50 55 60 Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Leu Gly Val Ile Trp Thr Gly Val Gly 65 70 75 80 Thr Asn Tyr Asn Ser Ala Phe Met Ser Arg Leu Ser Ile Ser Lys Asp 85 90 95 Asn Ser Lys Ser Gln Val Phe Leu Lys Met Asn Ser Leu Gln Thr Asp 100 105 110 Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys Val Arg Asp Pro Tyr Tyr Tyr Gly Met 115 120 125 Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr 130 135 140 Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser 145 150 155 160 Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu 165 170 175 Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His 180 185 190 Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser 195 200 205 Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys 210 215 220 Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu 225 230 235 240 Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro 245 250 255 Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys 260 265 270 Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val 275 280 285 Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp 290 295 300 Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr 305 310 315 320 Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp 325 330 335 Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu 340 345 350 Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg 355 360 365 Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys 370 375 380 Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp 385 390 395 400 Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys 405 410 415 Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser 420 425 430 Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser 435 440 445 Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser 450 455 460 Leu Ser Leu Ser Pro Gly 465 470 <210> 50 <211> 594 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide" <400> 50 Met Asp Pro Lys Gly Ser Leu Ser Trp Arg Ile Leu Leu Phe Leu Ser 1 5 10 15 Leu Ala Phe Glu Leu Ser Tyr Gly Gln Val Gln Leu Lys Glu Ser Gly 20 25 30 Pro Gly Leu Val Ala Pro Ser Gln Ser Leu Ser Ile Thr Cys Thr Val 35 40 45 Ser Gly Phe Ser Leu Thr Ser Tyr Asp Ile Ser Trp Val Arg Gln Pro 50 55 60 Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Leu Gly Val Ile Trp Thr Gly Val Gly 65 70 75 80 Thr Asn Tyr Asn Ser Ala Phe Met Ser Arg Leu Ser Ile Ser Lys Asp 85 90 95 Asn Ser Lys Ser Gln Val Phe Leu Lys Met Asn Ser Leu Gln Thr Asp 100 105 110 Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys Val Arg Asp Pro Tyr Tyr Tyr Gly Met 115 120 125 Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser Gly Ser Ala 130 135 140 Ser Ala Pro Thr Leu Phe Pro Leu Val Ser Cys Glu Asn Ser Pro Ser 145 150 155 160 Asp Thr Ser Ser Val Ala Val Gly Cys Leu Ala Gln Asp Phe Leu Pro 165 170 175 Asp Ser Ile Thr Phe Ser Trp Lys Tyr Lys Asn Asn Ser Asp Ile Ser 180 185 190 Ser Thr Arg Gly Phe Pro Ser Val Leu Arg Gly Gly Lys Tyr Ala Ala 195 200 205 Thr Ser Gln Val Leu Leu Pro Ser Lys Asp Val Met Gln Gly Thr Asp 210 215 220 Glu His Val Val Cys Lys Val Gln His Pro Asn Gly Asn Lys Glu Lys 225 230 235 240 Asn Val Pro Leu Pro Val Ile Ala Glu Leu Pro Pro Lys Val Ser Val 245 250 255 Phe Val Pro Pro Arg Asp Gly Phe Phe Gly Asn Pro Arg Lys Ser Lys 260 265 270 Leu Ile Cys Gln Ala Thr Gly Phe Ser Pro Arg Gln Ile Gln Val Ser 275 280 285 Trp Leu Arg Glu Gly Lys Gln Val Gly Ser Gly Val Thr Thr Asp Gln 290 295 300 Val Gln Ala Glu Ala Lys Glu Ser Gly Pro Thr Thr Tyr Lys Val Thr 305 310 315 320 Ser Thr Leu Thr Ile Lys Glu Ser Asp Trp Leu Ser Gln Ser Met Phe 325 330 335 Thr Cys Arg Val Asp His Arg Gly Leu Thr Phe Gln Gln Asn Ala Ser 340 345 350 Ser Met Cys Val Pro Asp Gln Asp Thr Ala Ile Arg Val Phe Ala Ile 355 360 365 Pro Pro Ser Phe Ala Ser Ile Phe Leu Thr Lys Ser Thr Lys Leu Thr 370 375 380 Cys Leu Val Thr Asp Leu Thr Thr Tyr Asp Ser Val Thr Ile Ser Trp 385 390 395 400 Thr Arg Gln Asn Gly Glu Ala Val Lys Thr His Thr Asn Ile Ser Glu 405 410 415 Ser His Pro Asn Ala Thr Phe Ser Ala Val Gly Glu Ala Ser Ile Cys 420 425 430 Glu Asp Asp Trp Asn Ser Gly Glu Arg Phe Thr Cys Thr Val Thr His 435 440 445 Thr Asp Leu Pro Ser Pro Leu Lys Gln Thr Ile Ser Arg Pro Lys Gly 450 455 460 Val Ala Leu His Arg Pro Asp Val Tyr Leu Leu Pro Pro Ala Arg Glu 465 470 475 480 Gln Leu Asn Leu Arg Glu Ser Ala Thr Ile Thr Cys Leu Val Thr Gly 485 490 495 Phe Ser Pro Ala Asp Val Phe Val Gln Trp Met Gln Arg Gly Gln Pro 500 505 510 Leu Ser Pro Glu Lys Tyr Val Thr Ser Ala Pro Met Pro Glu Pro Gln 515 520 525 Ala Pro Gly Arg Tyr Phe Ala His Ser Ile Leu Thr Val Ser Glu Glu 530 535 540 Glu Trp Asn Thr Gly Glu Thr Tyr Thr Cys Val Val Ala His Glu Ala 545 550 555 560 Leu Pro Asn Arg Val Thr Glu Arg Thr Val Asp Lys Ser Thr Gly Lys 565 570 575 Pro Thr Leu Tyr Asn Val Ser Leu Val Met Ser Asp Thr Ala Gly Thr 580 585 590 Cys Tyr <210> 51 <211> 234 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide" <400> 51 Met Glu Thr Asp Thr Leu Leu Leu Trp Val Leu Leu Leu Trp Val Pro 1 5 10 15 Gly Ser Thr Gly Asp Ile Gln Met Asn Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser 20 25 30 Ala Ser Leu Gly Asp Thr Ile Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp 35 40 45 Ile Ser Ile Trp Leu Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Asn Ile Pro 50 55 60 Glu Leu Leu Ile Tyr Lys Ala Ser Asn Leu His Thr Gly Val Pro Pro 65 70 75 80 Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser 85 90 95 Ser Leu Gln Pro Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gln Ser Gln 100 105 110 Ser Phe Pro Arg Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg 115 120 125 Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln 130 135 140 Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr 145 150 155 160 Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser 165 170 175 Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr 180 185 190 Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys 195 200 205 His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro 210 215 220 Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 225 230 <210> 52 <211> 470 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide" <400> 52 Met Asp Pro Lys Gly Ser Leu Ser Trp Arg Ile Leu Leu Phe Leu Ser 1 5 10 15 Leu Ala Phe Glu Leu Ser Tyr Gly Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly 20 25 30 Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val 35 40 45 Ser Gly Phe Ser Leu Thr Ser Tyr Asp Ile Ser Trp Ile Arg Gln Pro 50 55 60 Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile Gly Val Ile Trp Thr Gly Val Gly 65 70 75 80 Thr Asn Tyr Asn Pro Ser Leu Lys Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Asp 85 90 95 Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala 100 105 110 Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Asp Pro Tyr Tyr Tyr Gly Met 115 120 125 Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr 130 135 140 Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser 145 150 155 160 Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu 165 170 175 Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His 180 185 190 Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser 195 200 205 Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys 210 215 220 Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu 225 230 235 240 Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro 245 250 255 Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys 260 265 270 Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val 275 280 285 Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp 290 295 300 Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr 305 310 315 320 Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp 325 330 335 Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu 340 345 350 Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg 355 360 365 Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys 370 375 380 Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp 385 390 395 400 Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys 405 410 415 Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser 420 425 430 Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser 435 440 445 Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser 450 455 460 Leu Ser Leu Ser Pro Gly 465 470 <210> 53 <211> 470 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide" <400> 53 Met Asp Pro Lys Gly Ser Leu Ser Trp Arg Ile Leu Leu Phe Leu Ser 1 5 10 15 Leu Ala Phe Glu Leu Ser Tyr Gly Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly 20 25 30 Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val 35 40 45 Ser Gly Phe Ser Leu Thr Ser Tyr Asp Ile Ser Trp Ile Arg Gln Pro 50 55 60 Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Leu Gly Val Ile Trp Thr Gly Val Gly 65 70 75 80 Thr Asn Tyr Asn Pro Ser Leu Lys Ser Arg Val Thr Ile Ser Lys Asp 85 90 95 Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala 100 105 110 Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Asp Pro Tyr Tyr Tyr Gly Met 115 120 125 Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr 130 135 140 Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser 145 150 155 160 Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu 165 170 175 Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His 180 185 190 Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser 195 200 205 Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys 210 215 220 Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu 225 230 235 240 Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro 245 250 255 Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys 260 265 270 Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val 275 280 285 Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp 290 295 300 Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr 305 310 315 320 Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp 325 330 335 Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu 340 345 350 Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg 355 360 365 Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys 370 375 380 Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp 385 390 395 400 Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys 405 410 415 Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser 420 425 430 Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser 435 440 445 Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser 450 455 460 Leu Ser Leu Ser Pro Gly 465 470 <210> 54 <211> 470 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide" <400> 54 Met Asp Pro Lys Gly Ser Leu Ser Trp Arg Ile Leu Leu Phe Leu Ser 1 5 10 15 Leu Ala Phe Glu Leu Ser Tyr Gly Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly 20 25 30 Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu Thr Leu Ser Ile Thr Cys Thr Val 35 40 45 Ser Gly Phe Ser Leu Thr Ser Tyr Asp Ile Ser Trp Val Arg Gln Pro 50 55 60 Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Leu Gly Val Ile Trp Thr Gly Val Gly 65 70 75 80 Thr Asn Tyr Asn Pro Ser Phe Lys Ser Arg Leu Thr Ile Ser Lys Asp 85 90 95 Thr Ser Lys Asn Gln Val Ser Leu Lys Met Ser Ser Leu Thr Ala Ala 100 105 110 Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Val Arg Asp Pro Tyr Tyr Tyr Gly Met 115 120 125 Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr 130 135 140 Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser 145 150 155 160 Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu 165 170 175 Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His 180 185 190 Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser 195 200 205 Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys 210 215 220 Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu 225 230 235 240 Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro 245 250 255 Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys 260 265 270 Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val 275 280 285 Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp 290 295 300 Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr 305 310 315 320 Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp 325 330 335 Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu 340 345 350 Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg 355 360 365 Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys 370 375 380 Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp 385 390 395 400 Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys 405 410 415 Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser 420 425 430 Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser 435 440 445 Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser 450 455 460 Leu Ser Leu Ser Pro Gly 465 470 <210> 55 <211> 470 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide" <400> 55 Met Asp Pro Lys Gly Ser Leu Ser Trp Arg Ile Leu Leu Phe Leu Ser 1 5 10 15 Leu Ala Phe Glu Leu Ser Tyr Gly Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly 20 25 30 Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu Thr Leu Ser Ile Thr Cys Thr Val 35 40 45 Ser Gly Phe Ser Leu Thr Ser Tyr Asp Ile Ser Trp Ile Arg Gln Pro 50 55 60 Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Leu Gly Val Ile Trp Thr Gly Val Gly 65 70 75 80 Thr Asn Tyr Asn Pro Ser Phe Lys Ser Arg Leu Thr Ile Ser Lys Asp 85 90 95 Asn Ser Lys Asn Gln Val Ser Leu Lys Met Ser Ser Leu Thr Ala Ala 100 105 110 Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Val Arg Asp Pro Tyr Tyr Tyr Gly Met 115 120 125 Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr 130 135 140 Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser 145 150 155 160 Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu 165 170 175 Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His 180 185 190 Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser 195 200 205 Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys 210 215 220 Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu 225 230 235 240 Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro 245 250 255 Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys 260 265 270 Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val 275 280 285 Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp 290 295 300 Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr 305 310 315 320 Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp 325 330 335 Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu 340 345 350 Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg 355 360 365 Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys 370 375 380 Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp 385 390 395 400 Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys 405 410 415 Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser 420 425 430 Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser 435 440 445 Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser 450 455 460 Leu Ser Leu Ser Pro Gly 465 470 <210> 56 <211> 234 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide" <400> 56 Met Glu Thr Asp Thr Leu Leu Leu Trp Val Leu Leu Leu Trp Val Pro 1 5 10 15 Gly Ser Thr Gly Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser 20 25 30 Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp 35 40 45 Ile Ser Ile Trp Leu Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro 50 55 60 Lys Leu Leu Ile Tyr Lys Ala Ser Asn Leu His Thr Gly Val Pro Ser 65 70 75 80 Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser 85 90 95 Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gln Ser Gln 100 105 110 Ser Phe Pro Arg Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg 115 120 125 Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln 130 135 140 Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr 145 150 155 160 Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser 165 170 175 Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr 180 185 190 Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys 195 200 205 His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro 210 215 220 Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 225 230 <210> 57 <211> 234 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide" <400> 57 Met Glu Thr Asp Thr Leu Leu Leu Trp Val Leu Leu Leu Trp Val Pro 1 5 10 15 Gly Ser Thr Gly Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser 20 25 30 Ala Ser Val Gly Asp Arg Ile Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp 35 40 45 Ile Ser Ile Trp Leu Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro 50 55 60 Lys Leu Leu Ile Tyr Lys Ala Ser Asn Leu His Thr Gly Val Pro Ser 65 70 75 80 Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser 85 90 95 Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gln Ser Gln 100 105 110 Ser Phe Pro Arg Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg 115 120 125 Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln 130 135 140 Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr 145 150 155 160 Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser 165 170 175 Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr 180 185 190 Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys 195 200 205 His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro 210 215 220 Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 225 230 <210> 58 <211> 11 <212> PRT <213> Unknown <220> <221> source <223> /note="Description of Unknown: Albumin binding peptide" <400> 58 Asp Leu Cys Leu Arg Asp Trp Gly Cys Leu Trp 1 5 10 <210> 59 <211> 11 <212> PRT <213> Unknown <220> <221> source <223> /note="Description of Unknown: Albumin binding peptide" <400> 59 Asp Ile Cys Leu Pro Arg Trp Gly Cys Leu Trp 1 5 10 <210> 60 <211> 15 <212> PRT <213> Unknown <220> <221> source <223> /note="Description of Unknown: Albumin binding peptide" <400> 60 Met Glu Asp Ile Cys Leu Pro Arg Trp Gly Cys Leu Trp Gly Asp 1 5 10 15 <210> 61 <211> 20 <212> PRT <213> Unknown <220> <221> source <223> /note="Description of Unknown: Albumin binding peptide" <400> 61 Gln Arg Leu Met Glu Asp Ile Cys Leu Pro Arg Trp Gly Cys Leu Trp 1 5 10 15 Glu Asp Asp Glu 20 <210> 62 <211> 20 <212> PRT <213> Unknown <220> <221> source <223> /note="Description of Unknown: Albumin binding peptide" <400> 62 Gln Gly Leu Ile Gly Asp Ile Cys Leu Pro Arg Trp Gly Cys Leu Trp 1 5 10 15 Gly Arg Ser Val 20 <210> 63 <211> 21 <212> PRT <213> Unknown <220> <221> source <223> /note="Description of Unknown: Albumin binding peptide" <400> 63 Gln Gly Leu Ile Gly Asp Ile Cys Leu Pro Arg Trp Gly Cys Leu Trp 1 5 10 15 Gly Arg Ser Val Lys 20 <210> 64 <211> 15 <212> PRT <213> Unknown <220> <221> source <223> /note="Description of Unknown: Albumin binding peptide" <400> 64 Glu Asp Ile Cys Leu Pro Arg Trp Gly Cys Leu Trp Glu Asp Asp 1 5 10 15 <210> 65 <211> 18 <212> PRT <213> Unknown <220> <221> source <223> /note="Description of Unknown: Albumin binding peptide" <400> 65 Arg Leu Met Glu Asp Ile Cys Leu Pro Arg Trp Gly Cys Leu Trp Glu 1 5 10 15 Asp Asp <210> 66 <211> 16 <212> PRT <213> Unknown <220> <221> source <223> /note="Description of Unknown: Albumin binding peptide" <400> 66 Met Glu Asp Ile Cys Leu Pro Arg Trp Gly Cys Leu Trp Glu Asp Asp 1 5 10 15 <210> 67 <211> 15 <212> PRT <213> Unknown <220> <221> source <223> /note="Description of Unknown: Albumin binding peptide" <400> 67 Met Glu Asp Ile Cys Leu Pro Arg Trp Gly Cys Leu Trp Glu Asp 1 5 10 15 <210> 68 <211> 18 <212> PRT <213> Unknown <220> <221> source <223> /note="Description of Unknown: Albumin binding peptide" <400> 68 Arg Leu Met Glu Asp Ile Cys Leu Ala Arg Trp Gly Cys Leu Trp Glu 1 5 10 15 Asp Asp <210> 69 <211> 20 <212> PRT <213> Unknown <220> <221> source <223> /note="Description of Unknown: Albumin binding peptide" <400> 69 Glu Val Arg Ser Phe Cys Thr Arg Trp Pro Ala Glu Lys Ser Cys Lys 1 5 10 15 Pro Leu Arg Gly 20 <210> 70 <211> 20 <212> PRT <213> Unknown <220> <221> source <223> /note="Description of Unknown: Albumin binding peptide" <400> 70 Arg Ala Pro Glu Ser Phe Val Cys Tyr Trp Glu Thr Ile Cys Phe Glu 1 5 10 15 Arg Ser Glu Gln 20 <210> 71 <211> 11 <212> PRT <213> Unknown <220> <221> source <223> /note="Description of Unknown: Albumin binding peptide" <400> 71 Glu Met Cys Tyr Phe Pro Gly Ile Cys Trp Met 1 5 10

Claims (109)

  1. 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역을 포함하는 단리된 항-PD-L1 항체 또는 그의 항원 결합 단편으로서, 중쇄 가변 영역은
    (i) GFSLTSYDIS(서열 번호 4)의 서열을 포함하는 HVR-H1;
    (ii) VIWTGVGTN(서열 번호 5)의 서열을 포함하는 HVR-H2; 및
    (iii) DPYYYGMDY(서열 번호 6)의 서열을 포함하는 HVR-H3
    을 포함하고, 경쇄 가변 영역은
    (iv) RASQDISIWLS(서열 번호 1)의 서열을 포함하는 HVR-L1;
    (v) KASNLHT(서열 번호 2)의 서열을 포함하는 HVR-L2; 및
    (vi) LQSQSFPRT(서열 번호 3)의 서열을 포함하는 HVR-L3
    을 포함하는, 단리된 항-PD-L1 항체 또는 그의 항원 결합 단편.
  2. 제1항에 있어서, 서열 번호 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42 또는 45 중 어느 하나에 대해 적어도 90%의 서열 동일성을 갖는 중쇄 가변 도메인 및 서열 번호 43, 44 또는 46 중 어느 하나에 대해 적어도 90%의 서열 동일성을 갖는 경쇄 가변 도메인을 포함하고, 여기서 HVR의 서열은 제1항에서 정의된 바와 같은 것인, 항체 또는 그의 항원 결합 단편.
  3. (a) 서열 번호 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42 또는 45 중 어느 하나의 중쇄 가변 도메인 및 서열 번호 43, 44 또는 46 중 어느 하나의 경쇄 가변 도메인을 포함하는 항체를 발현하는 세포를 배양하는 단계; 및
    (b) 항체를 세포로부터 또는 세포가 배양된 세포 배양 배지로부터 단리하는 단계
    의 방법에 의해 생산되는, 단리된 항-PD-L1 항체 또는 그의 항원 결합 단편.
  4. 제1항에 있어서, 이중특이적인 항체 또는 항원 결합 단편.
  5. 제2항에 있어서, 이중특이적인 항체 또는 항원 결합 단편.
  6. 제4항에 있어서, 이중특이적 항체 또는 항원 결합 단편이 PD-L1 단백질 및 세포 표면 단백질에 결합하는 것인 항체 또는 항원 결합 단편.
  7. 제5항에 있어서, 이중특이적 항체 또는 항원 결합 단편이 PD-L1 단백질 및 세포 표면 단백질에 결합하는 것인 항체 또는 항원 결합 단편.
  8. 제1항에 있어서, 항원 결합 단편이 Fab, Fab', F(ab)2, F(ab')2, Fv, 및 scFv로 이루어지는 군으로부터 선택되는 것인 항체 또는 항원 결합 단편.
  9. 제2항에 있어서, 항원 결합 단편이 Fab, Fab', F(ab)2, F(ab')2, Fv, 및 scFv로 이루어지는 군으로부터 선택되는 것인 항체 또는 항원 결합 단편.
  10. 제4항에 있어서, 항원 결합 단편이 Fab, Fab', F(ab)2, F(ab')2, Fv, 및 scFv로 이루어지는 군으로부터 선택되는 것인 항체 또는 항원 결합 단편.
  11. 제5항에 있어서, 항원 결합 단편이 Fab, Fab', F(ab)2, F(ab')2, Fv, 및 scFv로 이루어지는 군으로부터 선택되는 것인 항체 또는 항원 결합 단편.
  12. 제6항에 있어서, 항원 결합 단편이 Fab, Fab', F(ab)2, F(ab')2, Fv, 및 scFv로 이루어지는 군으로부터 선택되는 것인 항체 또는 항원 결합 단편.
  13. 제7항에 있어서, 항원 결합 단편이 Fab, Fab', F(ab)2, F(ab')2, Fv, 및 scFv로 이루어지는 군으로부터 선택되는 것인 항체 또는 항원 결합 단편.
  14. 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 항체가 카파 경쇄 또는 람다 경쇄를 포함하고, 항체가 IgM 또는 IgA 이소형이거나, IgG/IgM 또는 IgG/IgA 하이브리드 항체인 항체 또는 항원 결합 단편.
  15. 제14항에 있어서, 항체가 J 사슬을 포함하는 것인 항체 또는 항원 결합 단편.
  16. 제15항에 있어서, J 사슬이 항체, 항체의 항원 결합 단편, 항체-약물 접합체, 항체 유사 분자, 항체 유사 분자의 항원 결합 단편, 가용성 단백질, 리간드 및 수용체로 이루어지는 군으로부터 선택된 외인성 결합 모이어티를 포함하는 변형된 J 사슬이고, 항체의 항원 결합 단편은 Fab, Fab', F(ab)2, F(ab')2, Fv, 및 scFv로 이루어지는 군으로부터 선택되는 것인 항체 또는 항원 결합 단편.
  17. 제16항에 있어서, 외인성 결합 모이어티가
    (a) CTLA-4, TIM3, LAG3, BTLA, VISTA 및 TIGIT로 이루어지는 군으로부터 선택된 세포 표면 단백질에 결합하거나;
    (b) 알부민 단백질 또는 알부민 단백질의 단편을 포함하거나;
    (c) 알부민 결합 펩티드 또는 항체 단편을 포함하거나;
    (d) FcRn 결합 펩티드 또는 FcRn 결합 항체 단편을 포함하거나;
    (e) T 세포, 자연 살해(NK) 세포, 대식세포 및 호중구로 이루어진 군으로부터 선택된 이펙터 세포에 결합하거나; 또는
    (f) T 세포 상의 CD3에 결합하는 것인 항체 또는 항원 결합 단편.
  18. 외인성 결합 모이어티를 포함하는 변형된 J 사슬을 포함하는 IgM, IgA, IgG/IgM 또는 IgG/IgA 항체로서, 항체 또는 항원 결합 단편이 세포 표면 단백질에 결합하고, 외인성 결합 모이어티가 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 따른 항-PD-L1 항체 또는 항원 결합 단편을 포함하는 것인, 외인성 결합 모이어티를 포함하는 변형된 J 사슬을 포함하는 IgM, IgA, IgG/IgM 또는 IgG/IgA 항체.
  19. 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 따른 항체의 중쇄를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 및 상기 항체의 경쇄를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 조성물.
  20. 제14항에 따른 항체의 중쇄를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 및 상기 항체의 경쇄를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 조성물.
  21. 제15항에 따른 항체의 중쇄를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 및 상기 항체의 경쇄를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 조성물.
  22. 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 따른 항체의 중쇄를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 및 상기 항체의 경쇄를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터.
  23. 제14항에 따른 항체의 중쇄를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 및 상기 항체의 경쇄를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터.
  24. 제15항에 따른 항체의 중쇄를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 및 상기 항체의 경쇄를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터.
  25. 제19항의 조성물을 포함하는 단리된 재조합 숙주 세포.
  26. 제20항의 조성물을 포함하는 단리된 재조합 숙주 세포.
  27. 제21항의 조성물을 포함하는 단리된 재조합 숙주 세포.
  28. 제22항의 벡터를 포함하는 단리된 재조합 숙주 세포.
  29. 제23항의 벡터를 포함하는 단리된 재조합 숙주 세포.
  30. 제24항의 벡터를 포함하는 단리된 재조합 숙주 세포.
  31. 제19항의 조성물로 단리된 숙주 세포를 형질감염시키는 단계;
    항-PD-L1 항체를 생산하기 적합한 조건 하에 단리된 숙주 세포를 배양하는 단계; 및
    항-PD-L1 항체를 단리하는 단계
    를 포함하는, 단리된 항-PD-L1 항체를 생산하는 방법.
  32. 제20항의 조성물로 단리된 숙주 세포를 형질감염시키는 단계;
    항-PD-L1 항체를 생산하기 적합한 조건 하에 단리된 숙주 세포를 배양하는 단계; 및
    항-PD-L1 항체를 단리하는 단계
    를 포함하는, 단리된 항-PD-L1 항체를 생산하는 방법.
  33. 제21항의 조성물로 단리된 숙주 세포를 형질감염시키는 단계;
    항-PD-L1 항체를 생산하기 적합한 조건 하에 단리된 숙주 세포를 배양하는 단계; 및
    항-PD-L1 항체를 단리하는 단계
    를 포함하는, 단리된 항-PD-L1 항체를 생산하는 방법.
  34. 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 따른 단리된 항체를 포함하는 암 치료용 약학 조성물.
  35. 제14항에 따른 단리된 항체를 포함하는 암 치료용 약학 조성물.
  36. 제15항에 따른 단리된 항체를 포함하는 암 치료용 약학 조성물.
  37. 제18항에 따른 단리된 항체를 포함하는 암 치료용 약학 조성물.
  38. 삭제
  39. 삭제
  40. 삭제
  41. 삭제
  42. 삭제
  43. 삭제
  44. 삭제
  45. 삭제
  46. 삭제
  47. 삭제
  48. 삭제
  49. 삭제
  50. 삭제
  51. 삭제
  52. 삭제
  53. 삭제
  54. 삭제
  55. 삭제
  56. 삭제
  57. 삭제
  58. 삭제
  59. 삭제
  60. 삭제
  61. 삭제
  62. 삭제
  63. 삭제
  64. 삭제
  65. 삭제
  66. 삭제
  67. 삭제
  68. 삭제
  69. 삭제
  70. 삭제
  71. 삭제
  72. 삭제
  73. 삭제
  74. 삭제
  75. 삭제
  76. 삭제
  77. 삭제
  78. 삭제
  79. 삭제
  80. 삭제
  81. 삭제
  82. 삭제
  83. 삭제
  84. 삭제
  85. 삭제
  86. 삭제
  87. 삭제
  88. 삭제
  89. 삭제
  90. 삭제
  91. 삭제
  92. 삭제
  93. 삭제
  94. 삭제
  95. 삭제
  96. 삭제
  97. 삭제
  98. 삭제
  99. 삭제
  100. 삭제
  101. 삭제
  102. 삭제
  103. 삭제
  104. 삭제
  105. 삭제
  106. 삭제
  107. 삭제
  108. 삭제
  109. 삭제
KR1020187035104A 2016-05-09 2017-05-09 항-pd-l1 항체 KR102343742B1 (ko)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201662333643P 2016-05-09 2016-05-09
US62/333,643 2016-05-09
PCT/US2017/031791 WO2017196867A1 (en) 2016-05-09 2017-05-09 Anti-pd-l1 antibodies

Publications (2)

Publication Number Publication Date
KR20190003989A KR20190003989A (ko) 2019-01-10
KR102343742B1 true KR102343742B1 (ko) 2021-12-24

Family

ID=58710168

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020187035104A KR102343742B1 (ko) 2016-05-09 2017-05-09 항-pd-l1 항체

Country Status (15)

Country Link
US (3) US10954302B2 (ko)
EP (1) EP3455257B1 (ko)
JP (1) JP6979971B2 (ko)
KR (1) KR102343742B1 (ko)
CN (1) CN109311985B (ko)
AU (1) AU2017264683B2 (ko)
CA (1) CA3021669A1 (ko)
DK (1) DK3455257T3 (ko)
ES (1) ES2899361T3 (ko)
HU (1) HUE055972T2 (ko)
IL (1) IL262295B2 (ko)
PL (1) PL3455257T3 (ko)
PT (1) PT3455257T (ko)
SG (1) SG11201809336QA (ko)
WO (1) WO2017196867A1 (ko)

Families Citing this family (38)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2015053887A1 (en) 2013-09-05 2015-04-16 Igm Biosciences, Inc. Constant chain modified bispecific, penta- and hexavalent ig-m antibodies
KR102378289B1 (ko) 2014-02-10 2022-03-23 아이쥐엠 바이오사이언스 인코포레이티드 IgA 다중-특이적 결합 분자
GB201403775D0 (en) 2014-03-04 2014-04-16 Kymab Ltd Antibodies, uses & methods
BR112016022841B1 (pt) 2014-04-03 2023-09-26 Igm Biosciences, Inc Anticorpo igm, iga, igg/igm ou igg/iga compreendendo uma cadeia j modificada
PL3247728T3 (pl) 2015-01-20 2020-11-16 Igm Biosciences, Inc. Cząsteczki wiążące receptor nadrodziny czynnika martwicy nowotworów (TNF) i ich stosowanie
BR112017018941B8 (pt) 2015-03-04 2023-01-10 Igm Biosciences Inc Molécula de ligação a cd20, seu uso, composição e método in vitro para direcionar a morte mediada por complemento de uma célula que expressa cd20
MA42971A (fr) 2015-03-13 2018-08-15 Cytomx Therapeutics Inc Anticorps anti-pdl1, anticorps anti-pld1 activables, et leurs procédés d'utilisation
AU2016238246B2 (en) 2015-03-25 2021-05-13 Igm Biosciences, Inc. Multi-valent hepatitis B virus antigen binding molecules and uses thereof
CA2983034A1 (en) 2015-04-17 2016-10-20 Igm Biosciences, Inc. Multi-valent human immunodeficiency virus antigen binding molecules and uses thereof
CA2999284C (en) 2015-09-30 2023-06-13 Igm Biosciences A/S Binding molecules with modified j-chain
CN108463472A (zh) 2015-09-30 2018-08-28 Igm生物科学有限公司 具有修饰的j-链的结合分子
US9567399B1 (en) 2016-06-20 2017-02-14 Kymab Limited Antibodies and immunocytokines
CN109843327B (zh) 2016-07-07 2022-05-13 小利兰·斯坦福大学托管委员会 抗体佐剂缀合物
WO2018083248A1 (en) 2016-11-03 2018-05-11 Kymab Limited Antibodies, combinations comprising antibodies, biomarkers, uses & methods
KR20190137821A (ko) 2017-04-07 2019-12-11 아이쥐엠 바이오사이언스 인코포레이티드 보체-의존성 세포용해 효과기 기능의 조정을 위한 변형된 인간 IgM 불변 영역
EP3610022A1 (en) 2017-04-14 2020-02-19 Tollnine, Inc. Immunomodulating polynucleotides, antibody conjugates thereof, and methods of their use
KR20200016899A (ko) 2017-06-01 2020-02-17 싸이톰스 테라퓨틱스, 인크. 활성화가능 항-pdl1 항체, 및 이의 이용 방법
SG11202004144VA (en) 2017-11-17 2020-06-29 Nanjing Legend Biotech Co Ltd Single-domain antibodies and variants thereof against pd-l1
CN111356702B (zh) * 2017-12-06 2022-07-26 正大天晴药业集团南京顺欣制药有限公司 抗pd-l1抗体及其抗原结合片段
CN109970856B (zh) 2017-12-27 2022-08-23 信达生物制药(苏州)有限公司 抗lag-3抗体及其用途
WO2019137397A1 (zh) * 2018-01-10 2019-07-18 江苏恒瑞医药股份有限公司 Pd-l1抗体、其抗原结合片段及医药用途
US11078283B2 (en) * 2018-01-17 2021-08-03 Apexigen, Inc. Anti-PD-L1 antibodies and methods of use
WO2019169314A1 (en) 2018-03-01 2019-09-06 Igm Biosciences, Inc. IgM Fc AND J-CHAIN MUTATIONS THAT AFFECT IgM SERUM HALF-LIFE
TWI756621B (zh) * 2019-01-25 2022-03-01 大陸商信達生物製藥（蘇州）有限公司 新型雙特異性抗體分子以及同時結合pd-l1和lag-3的雙特異性抗體
BR112021016596A2 (pt) * 2019-02-21 2021-12-21 Eucure Beijing Biopharma Co Ltd Anticorpo anti-pd-l1 e uso do mesmo
JP2022525594A (ja) 2019-03-15 2022-05-18 ボルト バイオセラピューティクス、インコーポレーテッド Ｈｅｒ２を標的とする免疫結合体
JP2022544405A (ja) * 2019-08-15 2022-10-18 アイジーエム バイオサイエンシズ インコーポレイテッド 免疫刺激性多量体型結合分子
CN110746493A (zh) * 2019-09-06 2020-02-04 中国药科大学 一种pd-l1拮抗剂多肽及其应用
CN113121686A (zh) * 2019-12-31 2021-07-16 迈威(上海)生物科技股份有限公司 抗pd-l1抗体及其应用
BR112022017136A2 (pt) 2020-02-28 2022-10-11 Tallac Therapeutics Inc Conjugação mediada por transglutaminase
BR112022021392A2 (pt) 2020-04-22 2022-12-06 Igm Biosciences Inc Moléculas de ligação multiméricas de agonista de pd-1
CN113754775A (zh) * 2020-06-02 2021-12-07 三生国健药业（上海）股份有限公司 一种抗pd-l1和her2的双特异性抗体
IL298946A (en) 2020-06-18 2023-02-01 Genentech Inc Treatment with anti-TIGIT antibodies and PD-1 spindle-binding antagonists
TW202320848A (zh) 2021-07-28 2023-06-01 美商建南德克公司 治療癌症之方法及組成物
TW202321308A (zh) 2021-09-30 2023-06-01 美商建南德克公司 使用抗ｔｉｇｉｔ抗體、抗ｃｄ３８抗體及ｐｄ—１軸結合拮抗劑治療血液癌症的方法
CN113943371B (zh) * 2021-11-01 2023-05-05 达石药业(广东)有限公司 一种抗her2/抗pd-l1双功能抗体及其应用
WO2023178253A2 (en) * 2022-03-18 2023-09-21 Igm Biosciences, Inc. Use of a multimeric anti-pd-l1 binding molecule in combination with a monoclonal antibody therapy
WO2023240058A2 (en) 2022-06-07 2023-12-14 Genentech, Inc. Prognostic and therapeutic methods for cancer

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2016000619A1 (en) 2014-07-03 2016-01-07 Beigene, Ltd. Anti-pd-l1 antibodies and their use as therapeutics and diagnostics

Family Cites Families (27)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20050287153A1 (en) 2002-06-28 2005-12-29 Genentech, Inc. Serum albumin binding peptides for tumor targeting
US20050014932A1 (en) 2003-05-15 2005-01-20 Iogenetics, Llc Targeted biocides
ES2551502T3 (es) 2004-11-05 2015-11-19 Igm Biosciences, Inc. Formación de heridas en la membrana celular inducida por anticuerpos
HRP20240240T1 (hr) * 2008-12-09 2024-04-26 F. Hoffmann - La Roche Ag Protutijela anti-pd-l1 i njihova uporaba za poboljšanje funkcije t-stanice
DK2785375T3 (da) 2011-11-28 2020-10-12 Merck Patent Gmbh Anti-pd-l1-antistoffer og anvendelser deraf
JP6335796B2 (ja) 2012-02-08 2018-06-06 アイジーエム バイオサイエンシズ インク．Ｉｇｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｉｎｃ． Ｃｄｉｍ結合タンパク質及びその使用
WO2015053887A1 (en) 2013-09-05 2015-04-16 Igm Biosciences, Inc. Constant chain modified bispecific, penta- and hexavalent ig-m antibodies
TWI680138B (zh) * 2014-01-23 2019-12-21 美商再生元醫藥公司 抗ｐｄ-ｌ１之人類抗體
KR102378289B1 (ko) 2014-02-10 2022-03-23 아이쥐엠 바이오사이언스 인코포레이티드 IgA 다중-특이적 결합 분자
BR112016022841B1 (pt) 2014-04-03 2023-09-26 Igm Biosciences, Inc Anticorpo igm, iga, igg/igm ou igg/iga compreendendo uma cadeia j modificada
US9885721B2 (en) 2014-05-29 2018-02-06 Spring Bioscience Corporation PD-L1 antibodies and uses thereof
NZ766660A (en) * 2014-08-05 2024-02-23 Cb Therapeutics Inc Anti-pd-l1 antibodies
PL3247728T3 (pl) 2015-01-20 2020-11-16 Igm Biosciences, Inc. Cząsteczki wiążące receptor nadrodziny czynnika martwicy nowotworów (TNF) i ich stosowanie
BR112017018941B8 (pt) 2015-03-04 2023-01-10 Igm Biosciences Inc Molécula de ligação a cd20, seu uso, composição e método in vitro para direcionar a morte mediada por complemento de uma célula que expressa cd20
AU2016238246B2 (en) 2015-03-25 2021-05-13 Igm Biosciences, Inc. Multi-valent hepatitis B virus antigen binding molecules and uses thereof
CA2983034A1 (en) 2015-04-17 2016-10-20 Igm Biosciences, Inc. Multi-valent human immunodeficiency virus antigen binding molecules and uses thereof
CA2999284C (en) 2015-09-30 2023-06-13 Igm Biosciences A/S Binding molecules with modified j-chain
CN108463472A (zh) 2015-09-30 2018-08-28 Igm生物科学有限公司 具有修饰的j-链的结合分子
AU2017300647A1 (en) 2016-07-20 2019-02-07 Igm Biosciences, Inc. Multimeric GITR binding molecules and uses thereof
WO2018017763A1 (en) 2016-07-20 2018-01-25 Igm Biosciences, Inc. Multimeric cd40 binding molecules and uses thereof
EP3487533A4 (en) 2016-07-20 2020-03-25 IGM Biosciences, Inc. MULTIMERE OX40-BINDING MOLECULES AND USES THEREOF
WO2018017761A1 (en) 2016-07-20 2018-01-25 Igm Biosciences, Inc. Multimeric cd137/4-1bb binding molecules and uses thereof
KR20190137821A (ko) 2017-04-07 2019-12-11 아이쥐엠 바이오사이언스 인코포레이티드 보체-의존성 세포용해 효과기 기능의 조정을 위한 변형된 인간 IgM 불변 영역
EP3759229A4 (en) 2018-02-26 2021-12-29 IGM Biosciences Inc. Use of a multimeric anti-dr5 binding molecule in combination with a chemotherapeutic agent for treating cancer
WO2019169314A1 (en) 2018-03-01 2019-09-06 Igm Biosciences, Inc. IgM Fc AND J-CHAIN MUTATIONS THAT AFFECT IgM SERUM HALF-LIFE
MX2021004660A (es) 2018-10-23 2021-05-28 Igm Biosciences Inc Moleculas de union multivalentes a base de igm- e iga-fc.
WO2020163646A1 (en) 2019-02-08 2020-08-13 Igm Biosciences, Inc. Anti-gitr antigen-binding domains and uses thereof

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2016000619A1 (en) 2014-07-03 2016-01-07 Beigene, Ltd. Anti-pd-l1 antibodies and their use as therapeutics and diagnostics

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Lancet, Vol. 387, No. 10031, pp. 1909-1920(2016.05.07.)

Also Published As

Publication number Publication date
EP3455257A1 (en) 2019-03-20
PT3455257T (pt) 2021-12-06
PL3455257T3 (pl) 2022-01-17
ES2899361T3 (es) 2022-03-11
EP3455257B1 (en) 2021-09-22
AU2017264683B2 (en) 2024-02-29
HUE055972T2 (hu) 2022-01-28
AU2017264683A1 (en) 2018-11-01
CN109311985B (zh) 2022-09-30
WO2017196867A1 (en) 2017-11-16
CA3021669A1 (en) 2017-11-16
CN109311985A (zh) 2019-02-05
KR20190003989A (ko) 2019-01-10
IL262295B1 (en) 2023-05-01
US20190338031A1 (en) 2019-11-07
IL262295B2 (en) 2023-09-01
DK3455257T3 (da) 2021-11-01
US20210163600A1 (en) 2021-06-03
JP6979971B2 (ja) 2021-12-15
US10954302B2 (en) 2021-03-23
IL262295A (en) 2018-12-31
JP2019519492A (ja) 2019-07-11
SG11201809336QA (en) 2018-11-29
US20240002514A1 (en) 2024-01-04

Similar Documents

Publication Publication Date Title
KR102343742B1 (ko) 항-pd-l1 항체
JP6726238B2 (ja) 血小板非減少性かつ赤血球非減少性ｃｄ４７抗体及びその使用方法
CN111629754B (zh) 不引起显著红血细胞凝集的抗cd47抗体
CN107406503B (zh) Cd47抗体、方法和用途
JP6273212B2 (ja) Ｃｄ４７抗体及びその使用方法
JP2019518742A (ja) Ｃｄ４７抗体およびその使用方法
KR20200061320A (ko) 세포독성 t-림프구-관련 단백질 4 (ctla-4)에 대한 신규의 단일클론 항체
AU2015384281B2 (en) Novel antibody binding to TFPI and composition comprising the same
JP2007525434A (ja) Ｔ細胞、免疫グロブリンドメインおよびムチンドメイン１（ｔｉｍ−１）抗原に対する抗体およびその使用。
CA2752136C (en) Anti-mst1r antibodies and uses thereof
CN114057876A (zh) Cd47抗体及其应用
JP2022550121A (ja) Ｌｉｆに特異的な結合分子及びその使用

Legal Events

Date Code Title Description
E902 Notification of reason for refusal
E701 Decision to grant or registration of patent right
GRNT Written decision to grant