BR112016022841B1 - Anticorpo igm, iga, igg/igm ou igg/iga compreendendo uma cadeia j modificada - Google Patents

Anticorpo igm, iga, igg/igm ou igg/iga compreendendo uma cadeia j modificada Download PDF

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Fen Zhang
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Abstract

anticorpo igm, iga, igg / igm ou igg / iga, ou um fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, composição que o compreende e uso do mesmo. a presente invenção refere-se a polipeptídeos de cadeia j recombinantes modificados, moléculas de ligação, como anticorpos que compreendem os mesmos e seus usos.

Description

REFERÊNCIA CRUZADA A PEDIDOS RELACIONADOS
[0001] Este pedido reivindica prioridade e o benefício do Pedido Provisório U.S. com No. de Série 61 / 974.738, depositado em 3 de abril de 2014, cujo conteúdo é aqui incorporado por referência na sua totalidade.
CAMPO DA INVENÇÃO
[0002] A presente invenção refere-se a polipeptídeos de cadeia J recom- binantes modificados e moléculas de ligação, como anticorpos compreendendo os mesmos.
ANTECEDENTES DA INVENÇÃO
[0003] A cadeia J é um polipeptídeo acídico de 15 kDa, que está associado à IgM pentamérica e à IgA dimérica através de ligações de dissulfureto envolvendo o penúltimo resíduo de cisteína na parte traseira (tp) secretora de aminoácido- 18 no terminal C da IgM μ ou cadeia pesada de IgA α. As três pontes de dissulfureto são formadas entre Cys 12 e 100, Cys 71 e 91 e Cys 108 e 133, respectivamente. Ver, por exemplo, Frutiger et al. 1992, Biochemistry 31, 12643-12647. Os requisitos estruturais para a incorporação da cadeia J à IgM e IgA humanas e para a montagem da imunoglobulina polimérica e associação com a cadeia J são relatados por Sorensen et al. 2000, Int. Immunol. 12(1): 19-27 e Yoo et al. 1999, J. Biol. Chem. 274(47):33771- 33777, respectivamente. A produção recombinante de cadeias J solúveis em E. coli é referida por Redwan et al. 2006, Human Antibodies 15:95-102.
[0004] Os métodos para produzir anticorpos de IgA / IgG e IgM / IgG híbridas são conhecidos na técnica. Assim, a produção recombinante de anticorpos de IgA 2 / IgG1 híbridos é relatada em Chintalacharuvu et al. 2001, Clin Immunol 101(1):21-31. Foi relatado que a adição de αtp ou μtp na extremidade da cadeia pesada de IgG Y facilita a polimerização e potencializa funções efetoras, como a ativação complementar (Smith et al., J Immunol 1995, 154: 2.226-2.236). Os anticorpos híbri-dos de IgA / IgG possuem propriedades de IgA e de IgG.
[0005] Apesar dos avanços feitos na concepção de anticorpos, permanece a necessidade de anticorpos modificados com propriedades melhoradas, tais como uma melhor afinidade, especificidade e/ou avidez.
[0006] Conforme o campo progrediu, a função do anticorpo foi melhorada através de meios criativos de engenharia de proteínas, tal como para proporcionar uma afinidade mais elevada, maior meia-vida e/ou uma melhor distribuição no tecido, bem como a combinação de tecnologias de pequenas e grandes moléculas para maior enfoque em destruição das células através de entrega de carga tóxica (por exemplo, conjugados de anticorpo-fármaco). Outra abordagem para melhorar a função dos anticorpos tira vantagem da ligação bivalente da estrutura de imunoglobulina G (IgG), que permite que uma molécula de IgG se ligue a dois antígenos. Inclusive, em determinadas aplicações, há um bom potencial para anticorpos assimétricos exercerem funções úteis pela ligação simultânea de dois antígenos alvo diferentes. Para abordar essa necessidade, uma variedade de construções foi produzida para produzir uma única molécula que se possa ligar a dois antígenos diferentes, permitindo funções nunca antes vistas na natureza. Um exemplo dessa a abordagem biespecífica é "bli- natumumab" (MT103 ou AMG103) que liga os receptores CD3 e CD19 em células T e B, respectivamente. Esta amarração de uma célula T citotóxica a uma célula B cancerosa permite o tratamento eficaz de leucemia de células B.
[0007] No entanto, continuam a existir dificuldades técnicas significativas na construção, expressão e produção de anticorpos biespecíficos. Embora os anticorpos biespecíficos sejam considerados agentes terapêuticos promissores, devido à sua capacidade de se ligar simultaneamente a dois antígenos diferentes, a sua utilidade é limitada devido a problemas com a estabilidade e complexidade de fabricação.
[0008] Várias formas de engenharia de proteínas têm sido usadas para combinar cadeias pesadas heterólogas, além de correspondência de pares adequados de cadeias pesadas e leves para produzir eficientemente uma IgG biespecífica. Além disso, vários formatos de anticorpos biespecíficos, incluindo quadromas, hete- roconjugados químicos, construtos recombinantes que utilizam domínios de heterodi- merização selecionados e construtos recombinantes de tamanho mínimo que consistem de dois sítios mínimos de ligação ao antígeno.
[0009] No entanto, todos esses esforços têm sido repletos de dificuldades.
[00010] Assim, apesar dos esforços voltados para o desenvolvimento de anticorpos de engenharia, como os biespecíficos, continua a haver uma grande ca-rência de desenvolvimento de plataformas mais eficientes. Isso e particularmente verdadeiro no caso de anticorpos terapêuticos, onde a concepção e a produção de novos anticorpos modificados e de moléculas semelhantes a anticorpos com várias especificidades podem encurtar a linha do tempo entre a descoberta e a introdução clínica desses anticorpos terapêuticos.
SUMARIO DA INVENÇÃO
[00011] A presente invenção é baseada, pelo menos em parte, no reco-nhecimento de que a cadeia J de um anticorpo de IgM ou IgA pode ser modificada através da introdução de uma ou mais porções de ligação a uma sequência de cadeia J nativa, e a cadeia J modificada pode ser introduzida em IgM, IgA, IgG / IgM ou IgG / IgA, sem comprometer a funcionalidade do anticorpo receptor ou a ligação da cadeia J modificada ao seu alvo. Isso permite que a cadeia J modificada com uma porção de ligação interaja com um conjunto de antígenos, enquanto que a IgA, IgM, IgG / IgM ou a IgG / IgA podem reagir com um conjunto diferente de antígenos alvo.
[00012] A invenção é baseada também no reconhecimento que, ao dire-cionar a cadeia J modificada a uma célula efetora, como uma célula T, célula NK, macrófagos ou neutrófilos, a resposta imunológica do corpo pode ser ativada e a resposta de citotoxicidade celular dependente de anticorpos (ADCC) pode ser melho-rada.
[00013] Em um aspecto, a presente invenção diz respeito a uma cadeia J modificada que compreende uma porção de ligação estranha introduzida em uma sequência nativa da cadeia J.
[00014] Em uma modalidade, a cadeia J de sequência nativa é a sequência de cadeia J humana nativa da SEQ ID NO:1 ou um fragmento funcional seu.
[00015] Em outra modalidade, a porção de ligação estranha é inserida na sequência da cadeia J humana nativa da SEQ ID NO: 1 através de fusão direta ou indireta.
[00016] Em outra modalidade, a porção de ligação é inserida por fusão indireta por meio de um ligante peptídico.
[00017] Em uma modalidade, a fusão indireta é obtida por meio de um ligante peptídico no ou perto do terminal C e/ou N da porção de ligação.
[00018] Em outra modalidade, a porção de ligação estranha é inserida na sequência da cadeia J humana nativa da SEQ ID NO: 1 ou em torno do terminal C e/ou N, como em cerca de 10 resíduos a partir do terminal C e/ou N.
[00019] Em outra modalidade, a porão de ligação estranha é inserida na sequência da cadeia J humana nativa entre os resíduos de cisteína 92 e 101 da SEQ ID NO:1.
[00020] Em outra modalidade, ainda, a porção de ligação estranha é inserida em uma sequência da cadeia J humana nativa da SEQ ID NO: 1 no ou perto de um local de glicosilação.
[00021] O ligante peptídico, se estiver presente, pode, por exemplo, ter de cerca de 10 a 20 aminoácidos de comprimento ou de cerca de 15 a 20 aminoácidos de comprimento ou 15 aminoácidos de comprimento.
[00022] Em outra modalidade, a porção de ligação estranha é inserida em uma sequência da cadeia J humana nativa da SEQ ID NO: 1 por derivação química ou quimioenzimática. O ligante químico pode ser um ligante clivável ou não clivável, em que o ligante clivável pode ser, por exemplo, um ligante quimicamente lábil ou um ligante lábil de enzima.
[00023] Em outra modalidade, o ligante é selecionado dentre o grupo que consiste em N-sucinimidil-3-(2-piridiltio)propionato (SPDP), sucinimidil-4-(N-maleimi- dometil)ciclo-hexano-1-carboxilato (SMCC), N-sucinimidil-4-(2-piridiltio)pentanoato (SPP), iminotiolano (IT), derivados bifuncionais de imido-ésteres, ésteres ativos, alde-ídos, compostos de bis-azido, derivados de bis-diazônio, di-isocianatos e compostos de fluorina bis-ativos.
[00024] Em uma modalidade diferente, a cadeia J é modificada pela inserção de um local de reconhecimento de enzima e pela fixação pós-translacional de uma porção de ligação estranha no local de reconhecimento da enzima por meio de um ligante peptídico ou não peptídico.
[00025] Em todas as modalidades, a porção de ligação estranha pode, por exemplo, ser selecionada a partir de um grupo que consiste em anticorpos, fragmen-tos de ligação a antígenos de anticorpos, conjugados anticorpo-fármaco, moléculas semelhantes a anticorpos, fragmentos de ligação a antígenos de moléculas semelhantes a anticorpos, proteínas ligadas à membrana e solúveis, ligantes, receptores, partículas semelhantes a vírus, toxinas de proteínas, enzimas e suportes alternativos. Exemplos de suportes alternativos incluem darpinas, domínios de fibronectinas, ad- nectinas e knottinas. Os fragmentos de ligação a antígenos incluem F (ab')2, F (ab)2, Fab ', Fab, Fv, scFv e anticorpos de domínio simples. Em uma modalidade, o fragmento de ligação a antígenos é scFv.
[00026] Em uma modalidade, a porção de ligação estranha da cadeia J modificada se liga a uma célula efetora, onde a célula efetora pode, por exemplo, ser selecionada a partir do grupo que consiste em células T, células assassinas naturais (NK), macrófagos e neutrófilos.
[00027] Em uma modalidade, a célula efetora é uma célula T, onde a porção de ligação estranha pode, por exemplo, ligar-se a CD3ε na célula T.
[00028] Em outra modalidade, a célula efetora é uma célula NK, em que o alvo para a porção de ligação estranha da cadeia J modificada pode ser selecionado, por exemplo, a partir do grupo que consiste em CD16, CD64 e NKG2D na célula NK.
[00029] Em outra modalidade, a célula efetora é um macrófago, em que a porção de ligação estranha da cadeia J modificada pode, por exemplo, ligar-se a CD14 no macrófago.
[00030] Em outra modalidade, a célula efetora é um neutrófilo, em que a porção de ligação estranha da cadeia J modificada por, por exemplo, ligar-se a CD16b ou CD177 no neutrófilo.
[00031] Em outro aspecto, a invenção diz respeito a um anticorpo que compreende uma cadeia J modificada, conforme descrito aqui anteriormente, ou um fragmento de ligação a antígeno desse anticorpo. O anticorpo pode ser um anticorpo de IgM, IgA, IgG / IgM ou IgG / IgA, e inclui anticorpos multiespecíficos, por exemplo, biespecíficos.
[00032] Em uma modalidade, o anticorpo é um anticorpo de IgM, um anti-corpo de IgA, ou um anticorpo de IgG que compreende uma parte traseira ou um fragmento de ligação a antígeno desta.
[00033] Em outra modalidade, o anticorpo tem uma especificidade de ligação a um ou mais alvos de ligação selecionados dentre o grupo que consiste em células-alvo, alvos de ligação solúveis, receptores da superfície celular, proteínas de matriz e receptores transportadores.
[00034] Em outra modalidade, ainda, o anticorpo se liga a uma célula tu-moral.
[00035] Em outra modalidade, ainda, o anticorpo se liga a um antígeno associado ao alvo tumoral listado na FIG. 19, em que a cadeia J pode, por exemplo, ser modificada qualquer um dos alvos de células efetoras listadas na FIG. 19.
[00036] Em outras modalidades, ainda, a cadeia J modificada está presente nos anticorpos em uma orientação V-ligante-J ou em uma orientação J-ligante- V.
[00037] Em uma modalidade, o tumor é um câncer hematológico ou um tumor sólido, em que o câncer hematológico pode ser, por exemplo, leucemia, linfoma, mieloma e síndrome mielodisplástica, incluindo especialmente leucemia mieloide aguda, leucemia linfoblástica aguda, leucemia mielógena crônica ou leucemia linfocí- tica crônica, linfoma de Hodgkin e linfoma não Hodgkin. Nessas modalidades, o anticorpo pode, por exemplo, ligar-se a um ou mais dentre CDIM, CD19, CD20, CD22, CD33, CD70, CD56, CD138 e a cadeia J modificada pode ligar-se a CD3ε.
[00038] Em outra modalidade, o tumor é um tumor epitelial.
[00039] Em outra modalidade ainda, o anticorpo se liga a um alvo à base de carboidrato no tumor.
[00040] Em outra modalidade, o anticorpo se liga a um antígeno viral, como um antígeno de HBV ou um antígeno de HIV, por exemplo: PreS1 ou GP120.
[00041] Em um outro aspecto, a invenção diz respeito a uma composição que compreende os anticorpos IgM, IgA, IgG / IgM, IgG / IgA compreendendo uma cadeia J modificada, conforme descrito. A composição pode, por exemplo, ser uma composição farmacêutica ou uma composição de diagnóstico.
[00042] Em outro aspecto, ainda, a invenção diz respeito a um método para tratar um tumor ou uma doença viral que compreende administrar a um indivíduo em necessidade de uma quantidade eficaz de um anticorpo de IgM, IgA, IgG / IgM, IgG / IgA com uma cadeia J modificada, como aqui descrito.
[00043] Em outro aspecto, a invenção diz respeito ao uso de um anticorpo de IgM, IgA, IgG / IgM, IgG / IgA com uma cadeia J modificada, tal como se descreve aqui, na preparação de um medicamento para o tratamento de um tumor ou de uma doença viral.
[00044] Em outro aspecto, ainda, a invenção diz respeito ao uso de um anticorpo de IgM, IgA, IgG / IgM, IgG / IgA com uma cadeia J modificada, tal como se descreve aqui no tratamento de um tumor ou de uma doença viral.
BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS
[00045] A FIG. 1 ilustra a estrutura de um pentâmero de IgM, que compre-ende uma cadeia J, em que as cadeias A e B são idênticas em IgM nativa.
[00046] A FIG. 2 mostra as estruturas esquemáticas de IgA, IgA dimérica e IgA secretora (IgAs).
[00047] A FIG. 3 mostra a sequência de aminoácidos da cadeia J humana madura (SEQ ID NO: 1).
[00048] A FIG. 4 mostra o alinhamento da cadeia J humana madura (SEQ ID NO: 1) e cadeias J de várias espécies de animais (SEQ ID NOS: 1-44). Hum = NP_653247 de humano 23-159 (SEQ ID NO: 1) Chm = XP_001160135 de chimpanzé 39-175 (SEQ ID NO: 2) Gor = XP_004038830 de gorila 23-159 (SEQ ID NO: 3) Ora = NP_001125381 de orangotango 23-159 (SEQ ID NO: 4 Gib = XP_003265761 de gibão 39-175 (SEQ ID NO: 5) Mar = XP_003732538 de sagui 32-168 (SEQ ID NO: 6) Cyn = NP_001247815 de macaco cinomolgo 23-159 (SEQ ID NO: 7) Bab = XP_003898844 de babuíno 23-159 (SEQ ID NO: 8) Squ = XP_003931978 de macaco-esquilo 23-159 (SEQ ID NO: 9) Shr = XP_006142955 de musaranho das árvores 25-160 (SEQ ID NO: 10) Dol = XP_004328961 de golfinho 25-158 (SEQ ID NO: 11) Kil = XP_004283629 de baleia assassina 25-158 (SEQ ID NO: 12) Ele = XP_003414110 de elefante 25-158 (SEQ ID NO: 13) Sea = XP_006729388 de foca 25-158 (SEQ ID NO: 14) Rhi = XP_004419202 de rinoceronte 25-157 (SEQ ID NO: 15) Cat = XP_003985350 de gato doméstico 25-158 (SEQ ID NO: 16) Wol = XP_532398 de lobo 26-159 (SEQ ID NO: 17) Pan = EFB23253 de panda gigante 1-134 (SEQ ID NO: 18) Fer = XP_004766376 de doninha 26-158 (SEQ ID NO: 19) Hor = NP_001271464 de cavalo 25-158 (SEQ ID NO: 20) Gui = NP_001265705 de porquinho-da-índia 25-160 (SEQ ID NO: 21) Cam = XP_006188738 de camelo 25-158 (SEQ ID NO: 22) Goa = XP_005681786 de cabra 25-158 (SEQ ID NO: 23) Chn = XP_005392838 de chinchila 94-229 (SEQ ID NO: 24) Ham = XP_005068228 de hamster 24-160 (SEQ ID NO: 25) She = XP_004009937 de ovelha 25-158 (SEQ ID NO: 26) BBa = XP_006094475 de morcego marrom 25-158 (SEQ ID NO: 27) Ant = XP_005983836 de antílope 25-158 (SEQ ID NO: 28) Cow = NP_786967 de vaca 25-157 (SEQ ID NO: 29) Mou = NP_690052 de camundongo 23-159 (SEQ ID NO: 30) Rat = EDL88516 de rato 23-159 (SEQ ID NO: 31) Hed = XP_004703237 de porco-espinho 25-157 (SEQ ID NO: 32) Rab = P23108 de coelho 1-136 (SEQ ID NO: 33) Opo = XP_003341415 de gambá 29-162 (SEQ ID NO: 34) All = XP_006270094 de crocodilo 26-159 (SEQ ID NO: 35) Tur = XP_005304167 de tartaruga 26-159 (SEQ ID NO: 36) Tas = XP_003772863 de diabo da Tasmânia 27-160 (SEQ ID NO: 37) Pla = XP_003430954 de ornitorrinco 36-160 (SEQ ID NO: 38) Par = XP_005142787 de periquito 28-160 (SEQ ID NO: 39) Duc = XP_005031370 de pato 28-160 (SEQ ID NO: 40) Chi = NP_989594 de galinha 26-158 (SEQ ID NO: 41) Tur = XP_003205717 de peru 27-159 (SEQ ID NO: 42) Fal = XP_005243236 de falcão 29-160 (SEQ ID NO: 43) Spa = XP_005492217 de pardal 29-158 (SEQ ID NO: 44)
[00049] A FIG. 5 mostra o alinhamento da sequência de aminoácidos de humano e morcego (raposa voadora negra, Pteropus alecto) com as sequências de aminoácidos de cadeia J (SEQ ID NOs: 1 e 45, respectivamente).
[00050] A FIG. 6: Um anticorpo de IgM sem a sua cadeia J (controle negativo) e a IgM compreendendo uma cadeia J foram separados na redução de SDS- PAGE e detectados por Western Blot utilizando um anticorpo de cadeia anti-J. O anticorpo de cadeia anti-J reagiu apenas com a IgM que compreende uma cadeia J.
[00051] A FIG. 7: o sobrenadante coletado das células de CHO transfec- tadas foi dividido igualmente para imunoprecipitação com matriz de afinidade anti-mu ou anti-myc. Essas células de CHO expressavam uma IgM com especificidade para células anti-B conhecida como CDIM (para a molécula de indução de morte celular). Esse anticorpo de IgM é conhecido como IgM-55.5. As proteínas imunoprecipitadas foram separadas na redução de SDS-PAGE e detectadas por Western Blot por meio de anticorpos anti-myc ou anti-J. As células transfectadas com anti-CD3scFvJ e J- antiCD3scFv de terminal C apresentaram uma banda positiva próxima de 51kD, que reagiu com anticorpos anti-J e anti-myc.
[00052] A FIG. 8 ilustra duas orientações diferentes de um pentâmero de IgM biespecífica compreendendo uma cadeia J modificada com especificidade de ligação a uma célula T (o antígeno de célula T, CD3).
[00053] A FIG. 9: Sequência (SEQ ID NO: 46) e estrutura de um Fv de cadeia simples de anti-CD3 compreendendo uma cadeia J no terminal C (an- tiCD3scFv-J). SP=peptídeo de sinal
[00054] A FIG. 10: Sequência (SEQ ID NO: 47) e estrutura de um Fv de cadeia simples de anti-CD3 compreendendo uma cadeia J no terminal N (J-an- tiCD3scFv). SP=peptídeo de sinal.
[00055] A FIG. 11 é uma ilustração esquemática de um pentâmero de IgM biespecífica assimétrica com uma especificidade de ligação a um antígeno-alvo, compreendendo um domínio de ligação covalentemente ligado à cadeia J com especificidade de ligação a uma célula efetora.
[00056] A FIG. 12 mostra Western blots de um pentâmero de IgM anti- CD20 com uma cadeia J covalentemente modificada com um domínio de ligação a scFv de CD3. Um PAGE de não redução corado com azul de Coomassie observa o tamanho total da IgM: aproximadamente 1 milhão de Dáltons MW. A cadeia J modificada incorpora-se aos pentâmeros da IgM em ambas as orientações: CD3-J e J-CD3.
[00057] A FIG. 13 mostra os resultados de cotransfecções transientes da cadeia pesada (HC), cadeia leve (LC) e cadeia J modificada de uma IgM anti-CD20 biespecífica (CD20IgM) com uma cadeia J modificada que proporciona a especificidade de ligação a CD3 (CD3J).
[00058] A FIG. 14 mostra que a incorporação de uma cadeia J modificada em uma IgM anti-CD20 não tem efeito negativo sobre a atividade de CDC. Além disso, os dados mostram que uma molécula de IgM que compreende uma cadeia J modificada em qualquer orientação (V15J ou J15V, onde "15" designa o comprimento do ligante) é significativamente mais potente do que um anticorpo de IgG anti-CD20.
[00059] A FIG. 15 mostra que a molécula de CD20IgM x CD3cadeia J é alta-mente potente na depleção de células B como resultado de uma eliminação de células T ativas de células B devido à especificidade de CD3 da cadeia J modificada. Raji, uma linha de células CD19+CD20+ B, foi co-cultivada com T-ALL, uma linha de células T citolíticas de CD8+) com uma IgM de CD20 de tipo selvagem ou uma cadeia de IgM de CD20 x CD3-J por 24 horas a 37 graus, a 5% de CO2. As células foram coletadas e coradas com anticorpos fluorescentes para CD3 e CD19 e analisadas por citometria de fluxo para avaliar as células B viáveis.
[00060] A FIG. 16 mostra que uma molécula de IgM anti-CD20 biespecí- fica com uma cadeia J modificada que proporciona uma especificidade de ligação a CD3 tem uma atividade citotóxica significativamente aumentada em um pentâmero de IgM anti-CD20 com uma cadeia J de tipo selvagem. O pentâmero de IgM biespecífico fixado às células T é eficaz a uma concentração de 1 ng/ml e é 300 vezes mais potente em comparação à IgM anti-CD20 com a cadeia J de tipo selvagem.
[00061] A FIG. 17 mostra a depleção de células B in vivo com a IgG anti- CD20, IgM e IgM biespecífica. Os camundongos NSG humanizados reconstituídos com células da cepa CD34+ humana (Jackson Laboratory; número do artigo: 007799) foram comprados e o sangue total foi analisado quanto aos níveis pré-dose de células B de CD19+. A cadeia de IgM CD20 x CD3-J foi preparada para dosagem intravenosa em animais a 0,5 mg / kg. Após 6 horas após a dosagem, o sangue total foi obtido a partir dos animais e analisado por citometria de fluxo para níveis de circulação de células B humanas utilizando um anticorpo CD19+ marcado com fluorescência.
[00062] A FIG. 18 é um Western blot de uma cadeia J de camelídeo Vhh específica de CD16.
[00063] A FIG. 19 lista os alvos de anticorpos de IgM e os alvos da célula efetora para uma cadeia J modificada. Qualquer um dos alvos de anticorpos de IgM listados na coluna da esquerda da tabela pode ser combinado com qualquer um dos alvos de cadeia J modificados listados na coluna da direita.
DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO I. Definições
[00064] Antes da presente invenção ser descrita mais detalhadamente, deve ser entendido que esta invenção não é limitada a determinadas modalidades descritas e, assim sendo, é claro, variam. Também se deve entender que a termino-logia usada neste documento tem a finalidade de descrever modalidades em particular somente e não se destina a ser limitante, uma vez que o escopo da presente invenção será limitado somente pelas reivindicações em anexo.
[00065] Onde um intervalo de valores é fornecido, entende-se que cada valor interveniente, ao décimo da unidade do limite inferior a menos que o contexto dite claramente de outra forma, entre os limites superior e inferior do intervalo e qualquer outro valor declarado ou interveniente nesse intervalo declarado é englobado na invenção. Os limites superior e inferior destes intervalos menores podem independentemente ser incluídos nos intervalos menores e também são englobados na invenção, sujeitos a qualquer limite especificamente excluído no intervalo indicada.
[00066] A menos que definido de outra forma, os termos técnicos e cien-tíficos usados neste documento têm o mesmo significado conforme comumente en-tendido por alguém ordinariamente versado na técnica a qual esta invenção pertence. Singleton et al., Dictionary of Microbiology and Molecular Biology 2a ed., J. Wiley & Sons (New York, NY 1994), proporciona àqueles versados na técnica um guia geral para vários termos usados no presente pedido.
[00067] Todas as publicações mencionadas neste documento são expres-samente incorporadas neste documento por referência, para divulgar e descrever os métodos e/ou materiais em conexão aos quais as publicações são citadas.
[00068] O termo "anticorpo" inclui anticorpos monoclonais (incluindo anti-corpos de comprimento completo que tenham uma região Fc de imunoglobulina), moléculas de cadeia simples, bem como fragmentos de anticorpo (por exemplo, Fab, F(ab')2 e Fv). O termo "imunoglobulina" (Ig) é usado trocavelmente com "anticorpo" neste documento. A unidade de anticorpo de 4 cadeias básica é uma glicoproteína heterotetramérica composta por duas cadeias leves (L) idênticas e duas cadeias pe-sadas (H) idênticas. Salvo disposição em contrário, o termo "anticorpo" é utilizado aqui no sentido mais lato e inclui, especificamente, todos os isotipos de subclasses e formas de anticorpos, incluindo IgG, IgM, IgA, IgD e IgE, e seus fragmentos, de preferência fragmentos de ligação a antígeno. Os anticorpos preferidos no presente documento incluem anticorpos de IgM e IgA e seus fragmentos de ligação a antígeno, que podem ser modificados para incluir sequências de outros isotipos, como uma IgG para produzir anticorpos quiméricos.
[00069] No caso de IgG, a unidade de 4 cadeias é geralmente de cerca de 150.000 daltons. Cada cadeia L está ligada a uma cadeia H por uma ligação de dissulfeto covalente, enquanto as duas cadeias H estão ligadas entre si por uma ou mais ligações de dissulfeto, dependendo do isotipo de cadeia H. Cada cadeia H e L também possui pontes de dissulfeto intracadeia regularmente espaçadas. Cada ca-deia de H tem, no terminal N, um domínio variável (VH) seguido de três domínios constantes (CH) para cada uma das cadeias α e Y e quatro domínios de CH para os isotipos μ e ε. Cada cadeia L tem, no terminal N, um domínio variável (VL) seguido por um domínio constante em sua outra extremidade. O VL está alinhado com o VH e o CL está alinhado com o primeiro domínio constante da cadeia pesada (CH1). Acredita-se que os resíduos de aminoácidos específicos formem uma interface entre os domínios variáveis de cadeia leve e de cadeia pesada. O emparelhamento de um VH e VL em conjunto forma um único local de ligação ao antígeno.
[00070] A IgM é uma glicoproteína que forma polímeros múltiplos, onde as imunoglobulinas estão covalentemente ligadas entre si por ligações de dissulfureto. A IgM existe principalmente como um pentâmero, mas também como um hexâmero e, por conseguinte, contém 10 ou 12 locais de ligação a antígeno. A forma pentamérica contém tipicamente um peptídeo adicional, chamado cadeia J, mas também pode ser feita na ausência de cadeia J. A molécula de IgM pentamérica tem um peso molecular de aproximadamente 970 kDa. Devido à sua natureza polimérica, IgM possui uma avidez elevada e é particularmente eficaz na ativação do complemento. Ao contrário de IgG, a cadeia pesada em monômeros de IgM é composta de quatro domínios constantes e um variável. Os domínios constantes de IgM são aqui designados como CM1 ou Cμ1, CM2 ou Cμ2, CM3 ou Cμ3 e CM4 ou Cμ4, em que as designações "CM" e Cμ " são utilizadas intercambiavelmente. A estrutura de um pentâmero de IgM é ilus-trada na FIG. 1.
[00071] O termo "IgM" é aqui utilizado no sentido lato e especificamente inclui moléculas de IgM mono e multiespecíficas (incluindo biespecíficas), como, por exemplo, as moléculas de ligação à IgM multiespecíficas divulgadas no Pedido PCT No. PCT/US2014/054079, cuja descrição integral é expressamente incorporada aqui por referência.
[00072] O termo "unidade de ligação à IgM" ou "unidade de ligação ao anticorpo da IgM" é usado no sentido lato e engloba especificamente um polipeptídeo de região constante de cadeia pesada do anticorpo da IgM, compreendendo pelo menos um domínio constante de CM4, fundido a uma sequência de domínio variável (VH) ligando-se a um alvo (por exemplo, antígeno), com ou sem uma sequência de domínio variável de cadeia leve de anticorpos (VL).
[00073] O termo "unidade de ligação à IgM biespecífica" ou "unidade de ligação ao anticorpo de IgM biespecífica" é usado no sentido lato e engloba especifi-camente um par de polipeptídeos de região constante de cadeia pesada de anticorpos da IgM, compreendendo pelo menos um domínio constante de CM4, fundido a uma sequência de domínio variável (VH), cada sequência de domínio variável ligando-se a um alvo diferente, com ou sem sequências de domínio variável de cadeia leve de anticorpos associados (VL). Em uma modalidade, o anticorpo da IgM biespecífica compreende duas regiões de ligação ao antígeno VHVL, cada uma sendo capaz de se ligar a um epítopo diferente em um antígeno ou epítopos em dois antígenos diferentes. As unidades de ligação do anticorpo biespecífico de IgM podem ser de comprimento completo de uma única espécie ou serem quimerizadas ou humanizadas. Os anticorpos de IgM biespecíficos da presente invenção têm uma estrutura em anel penta ou hexa- mérica compreendendo cinco ou seis unidades de ligação biespecíficas de IgM.
[00074] O termo "lgM multiespecífica" é utilizado neste documento no sentido mais amplo para se referir a anticorpos IgM com duas ou mais especificidades de ligação. Assim, o termo "multiespecífico" inclui "biespecífico", por exemplo, anticorpos biespecíficos ou unidades de ligação biespecíficas, incluindo pentâmeros de IgM que compreendem ao menos duas subunidades monoespecíficas, cada uma ligando-se a um antígeno diferente (AA, BB) ou cinco ou seis subunidades biespecíficas, cada uma ligando-se a dois antígenos diferentes (AB, AB). Assim, os pentâmeros de IgM bies- pecíficos e multiespecíficos podem incluir cinco unidades de ligação biespecífica idênticas, unidades de ligação de IgM monoespecífica, pelo menos duas delas tendo diferentes especificidades de ligação diferentes ou qualquer combinação delas.
[00075] Um "anticorpo de cadeia pesada de IgM de comprimento total" é um polipeptídeo que consiste em direção de N-terminal para C-terminal de um anticorpo de domínio variável de cadeia pesada (VH), um domínio constante 1 de cadeia pesada de cadeia pesada constante de anticorpo (CM1 ou Cμ1), um domínio cons-tante 2 de cadeia pesada de cadeia pesada constante de anticorpo (CM2 ou Cμ2), um domínio constante 3 de cadeia pesada de anticorpo (CM3 ou Cμ3) e um domínio cons- tante4 de cadeia pesada de cadeia pesada constante de anticorpo (CM4 ou Cμ4). Os anticorpos de IgM de comprimento total biespecíficos, como definidos aqui, compreendem cinco ou seis monômeros (unidades de ligação), cada um com dois sítios de ligação ao antígeno que se ligam especificamente a dois alvos de ligação diferentes (epítopos). O terminal C da cadeia pesada ou leve do anticorpo de comprimento total indica o último aminoácido no terminal C da cadeia pesada ou leve. O terminal N da cadeia pesada ou leve do anticorpo de comprimento total indica o primeiro aminoácido no terminal N da cadeia pesada ou leve.
[00076] A IgA nativa é uma proteína tetramérica que compreende duas cadeias leves idênticas (K ou À) e duas cadeias pesadas idênticas (α). No ser humano, existem dois isotipos de IgA, IgA1 e IgA2. A IgA, de forma semelhante à IgG, contém três domínios constantes (CA1-CA3 ou Cα1-Cα3), com uma região de haste entre os domínios Cα1 e Cα2, em que as designações "CA" e "Cα " são utilizadas intercambi- avelmente. Todos os isotipos de IgA têm uma "parte traseira" de 18 aminoácidos que é situada no terminal C para o domínio Cα3, que permite a formação da Ig polimérica (ver, por exemplo, Garcia-Pardo et al., 1981, J. Biol. Chem. 256, 11734-11738 e Davis et al., 1988, Eur. J. Immunol. 18, 1001-1008). O soro de IgA é um monômero, mas também pode polimerizar. Na sua forma secretória IgA compreende 2-5 das unidades de 4 cadeias básicas, ligadas por uma cadeia J, que podem incluir uma peça de cauda e podem ser associados por um componente secretor. As estruturas de cauda-peça, lgA dimérica e IgA secretora, associadas a um componente secretor (IgAs) estão ilustradas na FIG. 2. Os anticorpos da IgA podem também ser divididos em subclasses IgA1 e IgA2. O termo anticorpo de "IgA" é usado aqui para incluir especificamente todas as subclasses, isto é, os anticorpos de IgA1 e IgA2, incluindo as formas diméri- cas e multiméricas, com e sem um componente secretor, bem como fragmentos, preferencialmente fragmentos de ligação a antígeno, desses anticorpos. Para os fins da presente invenção, o anticorpo de IgA preferencialmente é um dímero, em que dois pedaços de cauda são, de preferência, ligados por uma cadeia J (ver, FIG. 2).
[00077] O termo "IgA" é aqui utilizado no sentido lato e especificamente inclui moléculas de IgA mono- e multiespecíficas, como, por exemplo, as moléculas de ligação à IgA multiespecíficas divulgadas no Pedido PCT No. PCT / US2015 / 015268, cuja descrição integral é expressamente incorporada aqui por referência.
[00078] O termo "lgA multiespecífica" é utilizado neste documento no sentido mais amplo para se referir a anticorpos IgA com duas ou mais especificidades de ligação. Assim, o termo "multiespecífico" inclui "biespecífico", por exemplo anticorpos biespecíficos ou unidades de ligação biespecíficas, incluindo dímeros de IgA que compreendem duas subunidades monoespecíficas, cada uma ligando-se a um antígeno diferente (AA, BB) ou duas subunidades biespecíficas, cada uma ligando-se a dois antígenos diferentes (AB, AB).
[00079] Em uma modalidade, as moléculas multiespecíficas de IgA dimé- ricas consistem em duas unidades de ligação monoespecíficas, cada unidade de ligação com especificidade de ligação a um alvo de ligação diferente (AA, BB). Em outra modalidade, as moléculas diméricas da IgA em pelo menos uma das duas unidades de ligação têm duas especificidades de ligação diferentes (isto é, uma biespecífica, por exemplo: AA, A, B ou AA, BC). Em uma outra modalidade, cada uma das duas unidades de ligação tem duas especificidades, que podem ser as mesmas (AB, AB) ou diferentes (AC, CD ou AB, AC, por exemplo).
[00080] O termo "unidade de ligação do anticorpo de IgA biespecífico" é utilizado no sentido mais amplo e abrange, especificamente, um par de polipeptídeos de região constante de cadeia pesada de anticorpo de IgA que compreende pelo me-nos um domínio constante de CA3 fundido com uma sequência de domínio variável (VH), cada sequência de domínio variável com ligação a um alvo diferente, com ou sem sequências de domínio variável (VL) de cadeia leve do anticorpo relacionado. Em uma modalidade, o anticorpo biespecífico de IgA compreende duas regiões VHVL de ligação ao antígeno, cada uma capaz de se ligar a um epítopo diferente em um antí- geno ou epítopos em dois antígenos diferentes. As unidades de ligação do anticorpo biespecífico de IgA podem ser de comprimento completo de uma única espécie ou ser quimerizadas ou humanizadas.
[00081] Uma "cadeia pesada de anticorpo lgA de comprimento completo" é um polipeptídeo que consiste na direção N-terminal para C-terminal de um domínio variável de cadeia pesada de anticorpo (VH), domínio constante de cadeia pesada constante de anticorpo 1 (CA1 ou Cα1), um domínio constante de cadeia pesada constante de anticorpo 2 (CA2 ou Cα2) e um domínio constante de cadeia pesada de anticorpo 3 (CA3 ou Cα3). Os anticorpos lgA de comprimento completo bi ou multi-espe- cíficos, de acordo com a invenção, compreendem dois monômeros (unidades de ligação), cada um dos quais pode ser mono- ou biespecífico, com ou sem um compo-nente secretor. Assim, os anticorpos IgA multi-específicos da presente invenção po-dem incluir unidades de ligação biespecíficas e monoespecíficas, desde que o anti-corpo IgA resultante tenha pelo menos duas especificidades de ligação. O terminal C da cadeia pesada ou leve do anticorpo de comprimento total indica o último aminoá- cido no terminal C da cadeia pesada ou leve. O terminal N da cadeia pesada ou leve do anticorpo de comprimento total indica o primeiro aminoácido no terminal N da ca-deia pesada ou leve.
[00082] Para mais detalhes da estrutura e as propriedades das diferentes classes de anticorpos, vide, por exemplo, Basic and Clinical Immunology, 8a. ed., Da-niel P. Stites, Abba I. Terr e Tristram G. Parslow (eds.), Appleton & Lange, Norwalk, Conn. 1994, página 71 e capítulo 6.
[00083] O termo "interface", tal como aqui utilizado, é utilizado para se referir a uma região que compreende os resíduos de aminoácidos de "contato" (ou outros grupos não aminoácido tais como, por exemplo, os grupos de carboidratos), em uma primeira região constante da cadeia pesada de IgM que interage com um ou mais resíduos de "contato" de aminoácidos (ou outros grupos não aminoácido) de uma se-gunda região constante de cadeia pesada de IgM.
[00084] O termo "interface assimétrica" é usado para referir-se a uma in-terface (como acima definido) formada entre duas cadeias de anticorpo, tais como uma primeira e uma segunda região constante de cadeia pesada de IgM e / ou entre uma cadeia pesada de região constante de IgM e sua cadeia leve correspondente, em que os resíduos de contato na primeira e na segunda cadeias são projetados diferentes, que compreende resíduos de contato complementares. A interface assimétrica pode ser criada pelas interações pinos/furos e ou acoplamento de pontes de sal (swaps de carga) e / ou outras técnicas conhecidas na técnica, tais como, por exemplo, pela abordagem CrossMab para o acoplamento de uma cadeia pesada μ com sua cadeia leve correspondente.
[00085] Uma "cavidade" ou "furo" refere-se a, pelo menos, uma cadeia lateral de aminoácido, que é rebaixada a partir da interface do segundo polipeptídeo e, por conseguinte, acomoda uma protuberância correspondente ("pino") na interface adjacente do primeiro polipeptídeo. A cavidade (furo) pode estar na interface original ou pode ser introduzida sinteticamente (por exemplo, alterando o ácido nucleico que codifica a interface). Normalmente, o ácido nucleico que codifica a interface do se-gundo polipeptídeo é alterado para codificar a cavidade. Para alcançar esse objetivo, o ácido nucleico que codifica pelo menos um resíduo de aminoácido "original" na in-terface do segundo polipeptídeo é substituído com DNA que codifica, pelo menos, um resíduo de aminoácido "importado" que tem um volume de cadeia lateral menor do que o resíduo de aminoácido inicial. Será apreciado que pode haver mais do que um resíduo de importação original e correspondente. O limite superior para o número de resíduos originais que são substituídos é o número total de resíduos na interface do segundo polipeptídeo. Os resíduos importados preferidos para a formação de uma cavidade são normalmente resíduos de aminoácidos de ocorrência natural e são, de preferência, selecionados a partir de alanina (A), serina (S), treonina (T), valina (V) e glicina (G). A maior parte dos resíduos de aminoácidos preferenciais são serina, treo- nina ou alanina, com maior preferência por alanina. Na modalidade preferida, o resí-duo original para a formação da protuberância tem um grande volume de cadeia late-ral, tal como a tirosina (Y), arginina (R), fenilalanina (F) ou triptofano (W).
[00086] Um resíduo de aminoácido "original" é um que é substituído por um resíduo de "importação", que pode ter um volume de cadeia lateral menor ou maior do que o resíduo inicial. O resíduo de aminoácido importado pode ser um resíduo de aminoácido de ocorrência natural ou de ocorrência não natural, mas de preferência natural.
[00087] Por resíduo de aminoácido "não natural" entende-se um resíduo que não é codificado pelo código genético, mas que é capaz de ligar covalentemente resíduos de aminoácido adjacentes na cadeia de polipeptídeo. Exemplos de resíduos de ocorrência não natural de aminoácido são norleucina, ornitina, norvalina, homos- serina e outros análogos de resíduos de aminoácidos, tais como os descritos em Ell- man et al., Meth. Enzym. 202: 301-336 (1991), por exemplo. Para gerar tais resíduos de aminoácidos de ocorrência não natural, os procedimentos de Noren et al. Science 244: 182 (1989) e Ellman et al., supra, podem ser usados. De forma breve, esses procedimentos envolvem ativar quimicamente um tRNA supressor com um resíduo de aminoácido de ocorrência não natural, seguido por transcrição e tradução in vitro do RNA. Os métodos da presente invenção, em certas modalidades, envolvem substituição de pelo menos um resíduo de aminoácido original em uma cadeia pesada de IgM, mas mais do que um resíduo original pode ser substituído. Normalmente, não mais do que o total de resíduos na interface do primeiro ou segundo polipeptídeo compreenderá resíduos de aminoácidos originais que são substituídos. Os resíduos originais preferidos para substituição são "enterrados". Por "enterrado" entende-se que o resíduo é essencialmente inacessível ao solvente. O resíduo de importação preferencial não é cisteína para evitar possível oxidação ou pareamento incorreto de pontes de dissulfeto.
[00088] A protuberância é "posicionável" na cavidade, o que significa que a localização espacial da protuberância e cavidade na interface do primeiro polipeptí- deo e segundo polipeptídeo, respectivamente, e os tamanhos da protuberância e ca-vidade são tais que a protuberância possa ser localizada no interior da cavidade sem perturbar significativamente a associação normal do primeiro e segundo polipeptídeos na interface. Uma vez que as saliências, tais como Tyr, Phe e Trp, tipicamente não se estendem perpendicularmente em relação ao eixo da interface e têm conformações preferenciais, o alinhamento de uma protuberância com uma cavidade correspondente baseia-se na modelação do par protuberância / cavidade com base em uma estrutura tridimensional, tal como a obtida por cristalografia de raios X ou ressonância magnética nuclear (RMN). Isto pode ser conseguido utilizando técnicas amplamente aceitas na técnica, incluindo as técnicas de modelação molecular.
[00089] Por "ácido nucleico original" entende-se o ácido nucleico que co-difica um polipeptídeo de interesse que pode ser "alterado" (ou seja geneticamente modificado ou mutado) para codificar uma protuberância ou cavidade. O ácido nu- cleico original ou de partida pode ser um ácido nucleico de ocorrência natural ou pode compreender um ácido nucleico que foi submetido à alteração antes (por exemplo, um fragmento de anticorpo humanizado). Por "alteração" do ácido nucleico entende-se que o ácido nucleico original sofre mutação por inserção, eliminação ou substituição de pelo menos um códon codificador de um resíduo de aminoácido de interesse. Normalmente, um códon que codifica um resíduo inicial é substituído por um códon que codifica um resíduo de importação. As técnicas para a modificação genética de um DNA desse modo foram analisadas em Mutagenesis: a Practical Approach, M. J. McPherson, Ed., (IRL Press, Oxford, UK. (1991) e inclui mutagênese direcionada ao local, mutagênese de cassete e mutagênese por reação em cadeia de polimerase (PCR), por exemplo.
[00090] A protuberância ou cavidade pode ser "introduzida" na interface do primeiro ou segundo polipeptídeo por meios sintéticos, por exemplo, por técnicas recombinantes, síntese de peptídeos in vitro, técnicas para introdução de resíduos de aminoácidos que não ocorrem naturalmente anteriormente descritas, por acoplamento enzimático ou químico de peptídeos ou alguma combinação destas técnicas. De acordo, a protuberância ou cavidade que é "introduzida" é "de ocorrência não natural" ou "não nativa", o que significa que não existe na natureza ou no polipeptídeo original (por exemplo, um anticorpo monoclonal humanizado).
[00091] De preferência, o resíduo de aminoácido de importação para a formação da protuberância tem um número relativamente pequeno de "rotâmeros" (por exemplo, cerca de 3-6). Um "rotâmero" é uma conformação energeticamente fa-vorável de uma cadeia lateral de aminoácido. O número de rotâmeros para os vários resíduos de aminoácidos são revistos em Ponders e Richards, J. Mol. Biol. 193: 775-791 (1987).
[00092] A menos que indicado de outra forma, o termo "anticorpo" inclui especificamente anticorpos humanos nativos e de humanos IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgE, IgA, IgD e IgM, incluindo variantes que ocorrem naturalmente. Assim, por exem-plo, a sequência de IgM humana está disponível sob o Número de Acesso GenBank X14940.1, enquanto variantes foram relatadas como GenBank CAB37838.1, CAC20458.1, AFM37312.1, X57331.1 e J00260.1.
[00093] O termo "nativo" com referência a um polipeptídeo (por exemplo, um anticorpo ou uma cadeia J) é aqui utilizado para referir-se a um polipeptídeo com uma sequência de ocorrência natural, independentemente do seu modo de prepara-ção. Assim, os termos "nativo" e "sequência nativa" são aqui utilizados intercambia- velmente e abrangem expressamente polipeptídeos recombinantes com uma sequência que é encontrada na natureza.
[00094] O termo "cadeia J de sequência nativa" ou "cadeia J nativa", con-forme usado aqui, refere-se a uma cadeia J dos anticorpos de IgA ou IgM de sequên-cia nativa, cuja sequência de aminoácidos é exibida na FIG. 3 (SEQ ID NO: 1) e as cadeias J de espécies de animais não humanas, incluindo, sem limitação, os polipep- tídeos de cadeia J de sequência nativa das SEQ ID NOS: 2 a 44 mostrados na FIG. 4 ou o polipeptídeo de cadeia J de morcego (SEQ ID NO: 45) mostrado na FIG. 5.
[00095] O termo "cadeia J modificada" é aqui utilizada para se referir a variantes de polipeptídeos de cadeia J de sequência nativa que compreendem uma porção de ligação estranha inserida na sequência nativa. A introdução pode ser obtida por quaisquer meios, inclusive por infusão direta ou indireta de uma porção de ligação estranha ou pela ligação através de um ligante químico. O termo "cadeia J humana modificada" abrange especificamente, sem limitação, uma cadeia J humana de se-quência nativa da sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 1 modificada pela intro-dução de uma porção de ligação. O termo abrange especificamente, sem limitação, uma cadeia J humana de sequência nativa da sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:1 modificada pela introdução de uma porção de ligação estranha que não interfere na polimerização eficiente (dimerização) da IgM ou IgA e a ligação desses polímeros (dímeros) a um alvo.
[00096] O termo "porção de ligação" é aqui utilizado no sentido mais lato para abranger qualquer entidade química capaz de se ligar especificamente a um alvo, como um antígeno. Exemplos de porções de ligação incluem, sem limitação, anticor-pos, fragmentos de anticorpos, conjugados anticorpo-fármaco, moléculas semelhan-tes a anticorpos, fragmentos de ligação a antígeno de moléculas semelhantes a anti-corpos, proteínas ligadas às membranas solúveis, ligantes, receptores, partículas se-melhantes a vírus, toxinas da proteína, enzimas e suportes alternativos. As porções de ligação preferíveis são polipeptídeos (incluindo peptídeos), preferencialmente com uma função biológica. Uma função biológica exemplificativa é a capacidade de uma porção de ligação de se ligar a e ativar uma célula efetora, como uma célula B, uma célula T ou uma célula assassina natural (NK).
[00097] O termo "polipeptídeo" é aqui utilizado no sentido mais lato e inclui sequências peptídicas. O termo "peptídeo" descreve de modo geral cadeias molecu-lares lineares de aminoácidos contendo até cerca de 60, preferencialmente até cerca de 30 aminoácidos ligados de maneira covalente por ligações peptídicas.
[00098] O termo "estranho" com referência a uma "porção de ligação" é utilizado aqui para se referir a uma porção de ligação que não está presente em uma sequência polipeptídica nativa de referência no mesmo local. Assim, uma sequência polipeptídica estranha (incluindo sequências peptídicas) pode ser compreendida na sequência nativa correspondente, mas em um local diferente. Em uma modalidade preferível, a sequência "estranha" não está presente na sequência nativa correspon-dente nenhum local.
[00099] O termo "anticorpo monoclonal", como usado neste documento se refere a um anticorpo obtido a partir de uma população de anticorpos substancial-mente homogêneos, isto é, os anticorpos individuais compreendendo a população são idênticos exceto para mutações de ocorrência natural possíveis que podem estar presentes em quantidades menores. Os anticorpos monoclonais são altamente específicos, sendo dirigidos contra um único local antigênico. Ademais, em contraste com preparações de anticorpo (policlonal) convencionais, as quais tipicamente incluem diferentes anticorpos direcionados contra diferentes determinantes (epítopos), cada anticorpo monoclonal é direcionado contra um único determinante no antígeno. O modificador "monoclonal" indica o caráter do anticorpo como sendo obtido de uma população substancialmente homogênea de anticorpos e não deve ser interpretado como exigindo a produção do anticorpo por qualquer método em particular. Por exemplo, os anticorpos monoclonais a serem utilizados de acordo com a presente invenção podem ser feitos pelo método do hibridoma primeiro descrito por Kohler et al. (1975) Nature 256:495, ou podem ser produzidos por métodos de DNA recombinante (ver, por exemplo, Patente U.S. No. 4816567). Os "anticorpos monoclonais" também podem ser isolados de bibliotecas de anticorpos em fagos utilizando as técnicas descritas em Clack- son et al. (1991) Nature 352:624-628 e Marks et al. (1991) J. Mol. Biol. 222: 581-597, por exemplo.
[000100] Os anticorpos monoclonais neste documento incluem anticorpos especificamente "quiméricos" (imunoglobinas), em que uma porção da cadeia leve e/ou pesada é idêntica às ou homóloga às sequências correspondentes em anticorpos derivados de uma determinada espécie, enquanto o restante da(s) cadeia(s) é(são) idêntica(s) às ou homóloga(s) às sequências correspondentes em anticorpos derivados de uma outra espécie, bem como fragmentos de tais anticorpos, contanto que eles exibam a atividade biológica desejada (Patente U.S. No. 4,816,567; e Morrison et al. (1984) Proc. Natl. Acad. Sci. EUA 81:6851-6855).
[000101] As formas "humanizadas" de anticorpos não humanos (por exem-plo, murino) são anticorpos que contêm uma sequência mínima derivada de imuno- globulina não humana. No geral, os anticorpos humanizados são imunoglobulinas humanas (anticorpo receptor) em que resíduos de uma região hipervariável do receptor são substituídos por resíduos de uma região hipervariável de uma espécie não humanas (anticorpo doador), tais como camundongo, rato, coelho ou primata não humano, possuindo a especificidade, afinidade e capacidade desejadas. Em alguns casos, resíduos da região estrutural de Fv (FR) da imunoglobulina humana também são substituídos pelos correspondentes resíduos não humanos. Além disso, os anticorpos humanizados podem compreender resíduos que não são encontrados no anticorpo receptor ou no anticorpo doador. Estas modificações são feitas para adicionalmente refinar o desempenho do anticorpo. Em geral, o anticorpo humanizado compreenderá substancialmente a totalidade de pelo menos um e, tipicamente dois, domínios variáveis, em que todos ou substancialmente todos os ciclos hipervariáveis correspondem aos de uma imunoglobulina não humana e todas, ou substancialmente todas, as regiões FR são as de uma sequência de imunoglobulina humana. O anticorpo humanizado opcionalmente compreenderá também, pelo menos, uma parte de uma região constante de imunoglobulina (Fc), normalmente o de uma imunoglobulina humana. Para mais detalhes, ver Jones et al. (1986) Nature 321:522-525; Riechmann et al. (1988) Nature 332:323-329; e Presta (1992) Curr. Op. Struct. Biol. 2:593-596.
[000102] Um anticorpo "isolado" neste documento é um que foi identificado e separado e/ou recuperado de um componente do seu ambiente natural em uma célula hospedeira recombinante. Os componentes contaminantes de seu ambiente natural são materiais que interfeririam na pesquisa, nos usos diagnósticos ou terapêuticos para o anticorpo, e podem incluir enzimas, hormônios, e outros solutos proteicos ou não proteicos, bem como subprodutos indesejados da produção. Em uma modali-dade preferencial, um anticorpo isolado, neste documento, será purificado (1) a mais de 95% em peso, ou mais do que 98% em peso, ou mais do que 99% em peso, tal como determinado por métodos SDS-PAGE ou SEC-HPLC, (2) até um grau suficiente para se obter pelo menos 15 resíduos da sequência interna de aminoácido ou N-ter- minal por utilização de um sequenciador de aminoácidos, ou (3) até à homogeneidade por SDS-PAGE sob condições redutoras ou não-redutoras utilizando azul de Coomas- sie ou, preferivelmente, coloração de prata. Normalmente, um anticorpo isolado será preparado por pelo menos uma etapa de purificação.
[000103] O termo "ligação específica" ou "especificamente se liga a" ou "é específico para" refere-se à ligação de uma porção de ligação a um alvo de ligação, por exemplo, um epítopo num polipeptídeo particular, peptídeo, ou outro alvo (por exemplo, uma glicoproteína alvo), e significa ligação que é mensuravelmente diferente de uma interação não específica (por exemplo, uma interação não específica pode ser a ligação a albumina de soro bovino ou caseína). A ligação específica pode ser medida, por exemplo, por determinação da ligação de uma porção de ligação ou de um anticorpo, ou de um anticorpo modificado por introdução de uma porção de ligação a uma molécula alvo em relação à ligação a uma molécula de controle. Por exemplo, a ligação específica pode ser determinada por competição com uma molécula de controle que é semelhante ao alvo, por exemplo, um excesso de alvo não marcado. Nesse caso, a ligação específica é indicada se a ligação do alvo marcado a uma sonda é inibida competitivamente pelo excesso de alvo não marcado. O termo "ligação específica a" ou "liga-se especificamente a" ou "específico para" um polipeptídeo em particular ou um epítopo num polipeptídeo alvo particular, tal como aqui utilizado, pode ser exibido, por exemplo, por uma molécula possuindo um Kd para o alvo de pelo menos cerca de 200 nM, alternativamente pelo menos cerca de 150 nM, alternativamente pelo menos cerca de 100 nM, alternativamente pelo menos cerca de 60 nM, alternativamente pelo menos cerca de 50 nM, alternativamente pelo menos cerca de 40 nM, alternativamente pelo menos cerca de 30 nM, alternativamente pelo menos cerca de 20 nM, alternativamente pelo menos cerca de 10 nM, alternativamente pelo menos cerca de 8 nM, alternativamente pelo menos cerca de 6 nM, alternativamente pelo menos cerca de 4 nM, alternativamente pelo menos cerca de 2 nM, alternativa-mente pelo menos cerca de 1 nM ou mais. Em certos casos, o termo "ligação especí-fica" refere-se a uma molécula de ligação que se liga a um polipeptídeo em particular ou epítopo num polipeptídeo em particular, sem substancialmente se ligar a qualquer outro polipeptídeo ou epítopo de polipeptídeo.
[000104] "Afinidade de ligação" refere-se à força da soma total de interações não covalentes entre um único local de ligação de uma molécula (por exemplo, um anticorpo) e o seu parceiro de ligação (por exemplo, um antígeno). Salvo indicação em contrário, como usado neste documento, "afinidade de ligação" se refere à afini-dade de ligação intrínseca que reflete uma interação de 1:1 entre membros de um par de ligação (por exemplo, anticorpo e antígeno). A afinidade de uma molécula X com seu parceiro Y geralmente pode ser representada pela constante de dissociação (Kd). Por exemplo, o valor de Kd pode ser cerca de 200 nM, 150 nM, 100 nM, 60 nM, 50 nM, 40 nM, 30 nM, 20 nM, 10 nM, 8 nM, 6 nM, 4 nM, 2 nM, 1 nM, ou mais forte. A afinidade pode ser medida por métodos comuns conhecidos na técnica, incluindo aqueles descritos neste documento. Os anticorpos de baixa afinidade geralmente se ligam ao antígeno lentamente e tendem a se dissociar facilmente, enquanto que os anticorpos de alta afinidade geralmente se ligam ao antígeno mais rapidamente e tendem a permanecer ligado por mais tempo. Uma variedade de métodos de medição da afinidade de ligação é conhecida na técnica.
[000105] Tal como aqui utilizado, o "Kd" ou "valor de Kd" refere-se a uma constante de dissociação medida por uma técnica apropriada para o par de anticorpo e alvo, por exemplo, utilizando ensaios de ressonância de plasma de superfície, por exemplo, utilizando um BIAcore™-2000 ou um BIAcore™-3000 (BIAcore, Inc., Pisca-taway, NJ) a 25°C com um antígeno imobilizado em chips de CM5 com cerca de 10 unidades de resposta (RU).
[000106] Os termos "conjugado" e "conjugação" referem-se a qualquer e todas as formas de ligação covalente ou de ligação não covalente, e incluem, sem limitação, a fusão genética ou química direta, o acoplamento através de um ligante ou um agente de reticulação e associação não covalente.
[000107] O termo "fusão" é utilizado aqui para se referir à combinação de sequências de aminoácidos de origem diferente em uma cadeia de polipeptídeos de combinação na estrutura das suas sequências de nucleotídeos de codificação. O termo "fusão" abrange explicitamente fusões internas, isto é, a inserção de sequências de origem diferente em uma cadeia de polipeptídeos, em adição à fusão a um de seus terminais. O termo "fusão" é empregado aqui para se referir à combinação das sequências de aminoácidos de origem diferente
[000108] O termo "valente", tal como usado neste documento, denota a presença de um determinado número de locais de ligação de um anticorpo. Como tal, os termos "bivalentes", "tetravalentes", e "hexavalentes" denotam a presença de dois locais de ligação, quatro locais de ligação e seis locais de ligação, respectivamente. Assim, em caso de um anticorpo biespecífico de IgA, de acordo com a presente in-venção, cada unidade de ligação é bivalente é, o anticorpo biespecífico de IgA terá 4 valências.
[000109] O termo "epítopo" inclui qualquer determinante molecular capaz de se ligar a um anticorpo específico. Em certas modalidades, o epítopo determinante inclui agrupamentos superficiais quimicamente ativos de moléculas, tais como amino- ácidos, cadeias laterais de açúcar, fosforila ou sulfonila e, em certas formas de realização, podem ter três características estruturais dimensionais específicas e/ou características de carga específicas. Um epítopo é uma região de um antígeno que é ligada por um anticorpo. Uma "região de ligação" é uma região em um alvo ligada por uma molécula de ligação.
[000110] "Especificidade poliepitópica" refere-se à capacidade de se ligar especificamente a dois ou mais epítopos diferentes no mesmo ou diferente(s) alvo(s). "Monoespecífico" refere-se à capacidade de se ligar a apenas um epítopo. De acordo com uma modalidade, o anticorpo biespecífico de IgM se liga a cada epítopo com uma afinidade de pelo menos 10-7H, ou 10-8 M ou melhor.
[000111] O termo "alvo" ou "alvo de ligação" é utilizado no sentido lato e inclui especificamente polipeptídeos, sem limitação, ácidos nucleicos, carboidratos, lipídios, células e outras moléculas com ou sem função biológica conforme existem na natureza.
[000112] O termo "antígeno" refere-se a uma entidade ou um seu fragmento, que pode ligar-se a um anticorpo ou desencadear uma resposta imune celular. Um imunógeno refere-se a um antígeno que pode eliciar uma resposta imunitária num organismo, particularmente um animal e mais particularmente um mamífero, incluindo um ser humano. O termo antígeno inclui regiões conhecidas como determinantes an- tigênicos ou epítopos, conforme definido acima.
[000113] Tal como utilizado neste documento, o termo "imunogênico" refere-se a substâncias, as quais induzem a produção de anticorpos e/ou ativam as células T e/ou outras células do sistema imunológico reativas dirigidas contra um an- tígeno do imunógeno.
[000114] Um "local de ligação a antígeno" ou "região de ligação a antígeno" de um anticorpo da presente invenção contém tipicamente seis regiões determinantes de complementaridade (CDRs) que contribuem em vários graus para a afinidade do local de ligação ao antígeno. Existem três CDRs de domínio variável de cadeia pesada (CDRH1, CDRH2 e CDRH3) e três CDRs de domínio variável da cadeia leve (CDRL1, CDRL2 e CDRL3). A extensão da CDR e as regiões estruturais (FR) são determinadas por comparação com uma base de dados compilados de sequências de aminoácidos, em que essas regiões foram definidas de acordo com a variabilidade entre as sequências e/ou informação estrutural de complexos anticorpo / antígeno. Também estão incluídos dentro do âmbito da invenção os locais de ligação ao antígeno funcional constituídos por menos CDRs (isto é, em que a especificidade de ligação é determinada por três, quatro ou cinco CDRs). Menos do que um conjunto completo de 6 CDRs pode ser suficiente para se ligar a alguns alvos de ligação. Assim, em alguns casos, os CDRs de um domínio VH ou um VL sozinhos serão suficientes. Além disso, certos anticorpos podem ter locais de ligação não-CDR-associados a um antígeno. Tais locais de ligação são especificamente incluídos no âmbito da presente definição.
[000115] O termo "célula hospedeira", tal como usado no presente pedido de patente, indica qualquer tipo de sistema celular que pode ser manipulado para gerar os anticorpos de acordo com a presente invenção. Em uma modalidade, ovários de hamster chinês (CHO) são utilizados como células hospedeiras.
[000116] Tal como utilizado neste documento, as expressões "célula", "linha celular" e "cultivo celular" são utilizadas indiferentemente e todas estas designações incluem a descendência. Assim, as palavras "transformantes" e "células trans-formadas" incluem a célula primária em questão e cultivos dela derivadas, sem levar em conta o número de transferências. Entende-se também que nem toda a descen-dência precisa ser exatamente idêntica em teor de DNA, devido a mutações delibera-das ou inadvertidas. A descendência variante que tem a mesma função ou atividade biológica, conforme triada ou selecionada na célula originalmente transformada, está incluída neste documento.
[000117] Um ácido nucleico está "operacionalmente ligado" quando é colo-cado em uma relação funcional com outra sequência de ácido nucleico. Por exemplo, o DNA para uma pré-sequência ou sequência líder de secreção é ligado operacionalmente ao DNA para um polipeptídeo se ele estiver expressado na forma de uma pré- proteína que participa na secreção do polipeptídeo; um promotor ou potencializador está operativamente ligado a uma sequência se codificação se ele afetar a transcrição da sequência; ou um local de ligação ribossômica está operativamente ligado a uma sequência de codificação se ele estiver posicionado de modo a facilitar a tradução. De um modo geral, "operacionalmente ligado" significa que as sequências de DNA a serem ligadas são contíguas e, no caso de um líder secretor, contíguas e em enquadramento de leitura. No entanto, os potenciadores não precisam ser contíguos. A ligação é obtida por ligação em locais de restrição convenientes. Se esses locais não existirem, os adaptadores ou ligantes de oligonucleotídeos sintéticos são utilizados de acordo com a prática convencional.
Descrição Detalhada Concepção e produção de anticorpos com uma cadeia j modificada
[000118] A IgM é a primeira imunoglobulina produzida por células B em resposta a um estímulo de um antígeno e está presente em cerca de 1,5 mg / ml em soro com uma meia-vida de 5 dias. A IgM é uma molécula hexamérica ou pentamérica. Assim como a IgG, os monômeros da IgM consistem em duas cadeias leves e duas cadeias pesadas. No entanto, enquanto IgG contém três domínios constantes de cadeia pesada (CH1, CH2 e CH3), a cadeia pesada (μ) de IgM contém adicionalmente um quarto domínio constante (CH4), de forma semelhante às cadeias pesada ε da IgE. Esse domínio constante adicional situa-se no lugar da região de dobradiça rica em prolina de IgG e IgA que é responsável pela flexibilidade rotacional dos domínios Fab de ligação ao antígeno em relação ao domínio Fc dos anticorpos de IgG e IgA.
[000119] Cinco monômeros de IgM formam um complexo com uma pequena cadeia de polipeptídeo adicional (a cadeia J) para formar uma molécula de IgM nativa. Considera-se que a cadeia J facilita a polimerização de cadeias μ antes de IgM ser secretada de células produtoras de anticorpos. Embora a cristalização de IgM tenha mostrado ser extremamente desafiadora, Czajkowsky e Shao (PNAS 106 (35): 14960-14965, 2009) publicaram recentemente um modelo estrutural baseado em ho- mologia de IgM, com base na estrutura do domínio Fc de IgE e os emparelhamentos de dissulfeto conhecidos. Os autores relatam que o pentâmero de IgM humana é uma molécula em forma de cogumelo com uma inclinação flexural. A cadeia pesada de IgM (μ) contém cinco locais de glicosilação ligada a N: Asn-171, Asn-332, Asn-395, Asn- 402 e Asn-563.
[000120] A imunoglobulina A (IgA), como a principal classe de anticorpos presente nas secreções mucosas da maior parte dos mamíferos, representa uma pri-meira linha de defesa chave contra a invasão por patógenos inalados e ingeridos. IgA também é encontrada em concentrações significativas no soro de várias espécies, onde funciona como uma segunda linha de defesa que realiza mediação da eliminação de agentes patogênicos que violaram a superfície da mucosa. Os receptores específicos para a região Fc de IgA, FcαR, são mediadores chave de função efetora de IgA. IgA humana pode ter dois genes diferentes de região constante e pesada de IgA (Cα) que dão origem às duas subclasses, IgA1 e IgA2. A principal diferença entre IgA1 e IgA2 reside na região de dobradiça que se situa entre os dois braços Fab e a região Fc. A IgA1 tem uma região de dobradiça prolongada devido à inserção de um trecho duplicado de aminoácidos, que está ausente em IgA2. A IgA tem a capacidade de formar dímeros, na qual duas unidades monoméricas, cada uma compreendendo duas cadeias pesadas e cadeias leves, são postuladas de modo a serem dispostas em uma configuração de extremidade a extremidade estabilizadas por pontes de dis- sulfureto e a incorporação de uma cadeia J. IgA dimérica, produzida localmente nos locais das mucosas, é transportada através do limite da célula epitelial e para fora através das secreções pela interação com o receptor de imunoglobulina polimérica (plgR). Durante este processo, o plgR é clivado e o fragmento grande, denominado componente secretor (CS), fica covalentemente ligado ao dímero de IgA.
[000121] A IgA e a IgM possuem uma extensão de aminoácido 18 no terminal C chamada "parte traseira" (TP). As partes de cauda da IgM (μtp) e da IgA (αtp) diferem em sete posições de aminoácidos. A parte da causa da IgM e da IgA é altamente conservada entre várias espécies de animais. Demonstrou-se que o penúltimo resíduo de cisteína conservado nas partes da causa da IgA e da IgM está envolvido na polimerização. Ambas as partes de causa contêm um local de adição do carboidrato ligado a N, cuja presença é necessária à formação do dímero em uma incorporação de cadeia J e de IgA e à formação do pentâmero na IgM. No entanto, a estrutura e composição dos carboidratos ligados a N nas partes traseiras diferem, indicando diferenças na acessibilidade dos glicanos para o processamento por glicosil- transferases.
[000122] As sequências de nucleotídeos e/ou proteínas de cadeias J de humanos, e de várias espécies de animais vertebrados, como vaca, camundongo, aves, anfíbios e coelho, foram relatadas. A cadeia J humana contém oito resíduos de cisteína, dois (Cys13 e Cys69) estão envolvidos em pontes de dissulfureto com as cadeias α ou μ (em IgA e IgM, respectivamente) e seis estão envolvidos em pontes de dissulfureto intracadeia (Cys13: Cys101, Cys72: Cys92, Cys109: Cys134). A estrutura cristalina tridimensional da cadeia J não foi relatada.
[000123] A presente invenção é baseada, pelo menos em partes, no reco-nhecimento de que a cadeia J de anticorpos de IgM e IgA podem ser modificadas pela introdução de uma especificidade de ligação (porção de ligação), sem interferir na capacidade do anticorpo da IgM ou da IgA de se ligar ao(s) seu(s) alvo(s) de ligação. Com efeito, a presente invenção diz respeito a cadeias J modificadas que compreendem uma porção de ligação inserida em uma cadeia J de sequência nativa, como uma cadeia J humana de sequência nativa da SEQ ID NO: 1. A invenção também diz respeito a moléculas de ligação compreendendo uma cadeia J modificada. A molécula de ligação pode ser, por exemplo, um anticorpo de IgM, um anticorpo de IgA ou um anticorpo híbrido de IgG / IgM ou IgG / IgA, que pode conter uma parte traseira de IgM ou IgA na cadeia pesada de IgG e, assim, combinar propriedades da IgG e IgA ou IgA, incluindo a capacidade de incorporar e de formar polímeros com uma cadeia J modificada da presente invenção. Para mais detalhes sobre os anticorpos híbridos de IgG / IgM e IgG / IgA, ver, por exemplo, Koteswara et al, Clinical Immunology 2001, 101 (1):21-31.
[000124] A cadeia J modificada compreende uma porção de ligação estra-nha, que inclui, sem se limitar a, um polipeptídeo (incluindo peptídeos) capaz de se ligar especificamente a um algo de ligação, ou a componentes catalíticos, como pro-teases semelhantes a enzimas. Como discutido anteriormente, as porções de ligação incluem, sem limitação, anticorpos, fragmentos de anticorpos, conjugados anticorpo- fármaco, fragmentos de ligação a antígeno do conjugado anticorpo-fármaco, molécu-las semelhantes a anticorpos, fragmentos de ligação a antígeno de moléculas seme-lhantes a anticorpos, proteínas ligadas a uma membrana solúveis, ligantes, recepto-res, partículas semelhantes a vírus, toxinas de proteína, componentes catalíticos, como enzimas e proteases semelhantes a enzimas, e suportes alternativos. Enfatiza- se que qualquer tipo de porção de ligação pode ser introduzido em uma cadeia J, seguindo o ensinamento da presente descrição, selecionando-se apropriadamente o local e o tipo de adição (por exemplo, por fusão direta ou indireta, titulação química, etc.).
[000125] Em uma modalidade preferida, a porção de ligação é um anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno de um anticorpo (também denominado "fragmento de anticorpo"), incluindo anticorpos monoespecíficos, biespecíficos e multiespecíficos e fragmentos de anticorpos. O termo "fragmento de anticorpo" é utilizado no sentido mais amplo e inclui, sem limitação, fragmentos Fab, Fab', F(ab')2, scFv e (scFv)2 , fragmentos de região determinante de complementaridade (CDR), anticorpos lineares, moléculas de anticorpos de cadeia simples, minicorpos e anticorpos multiespecíficos formados a partir de fragmentos do anticorpo. Em uma modalidade preferível, o fragmento de anticorpo é scFv.
[000126] Em outra modalidade preferível, a porção de ligação é uma molé-cula semelhante a anticorpo, como, por exemplo, um anticorpo de domínio humano (dAb), molécula de redirecionamento de afinidade dupla (DART), um diacorpo, um di- diacorpo, um anticorpo de domínio variável duplo, um anticorpo de domínio variável empilhado, um imunofarmacêutico modular pequeno (SMIP), um surrocorpo, um corpo de domínio de engenharia de troca de cepa (SEED) ou TandAb.
[000127] A porção de ligação pode ser um ligante, como neurotrofina, uma interleucina, um fator molecular solúvel ou um fator de crescimento.
[000128] Os receptores, como as moléculas de ligação, incluem receptores de superfície celular ligados à enzima, ligados a uma proteína G e ligados a um canal iônico. Os exemplos específicos, incluem, sem limitação, ErbB1, ErbB2, ErbB3, ErbB4, TNFR, PDL1 e CTLA-4.
[000129] Em outra modalidade preferida, a porção de ligação é um suporte alternativo. Nesse contexto, o termo "suporte" destina-se a descrever uma estrutura de proteína que pode transportar aminoácidos alterados ou inserções de sequências que conferem às variantes de proteínas a capacidade de se ligar a alvos específicos. Os suportes alternativos de proteína incluem, sem limitação, CTLA-4, tendamistat, fi- bronectina, lipocalinas, receptor de células T, CBM4-2, domínio A da proteína, lm9, proteínas AR projetadas, proteínas TPR projetadas, dedos de zinco, pVIII, polipeptí- deo pancreático de aves, GCN4, domínio WW, domínios de homologia de SRC 2 e 3, domínios PDZ, TEM-1, β-lactamase, GFP, tiorredoxina, nuclease de estafilococos, dedo de PHD, cl-2, BPTI, APPI, HPSTI, ecotina, LACI-D1, LDTI, MTI-II, toxinas de escorpião, knottinas, peptídeo A de defensina de inseto, EETI-II, Min-23, CBD, PBP, citocromo b562, domínio A de receptor LDL, Ycristalina, ubiquitina, transferrina, domínio semelhante a lectina de tipo C. Os suportes alternativos preferíveis são darpinas, domínios de fibronectina e adnectinas. Para mais detalhes, ver: Binz HK et al, 2005 Nature Biotechnology 23 (10): 1257-1268.
[000130] A porção de ligação pode ser introduzida na sequência da cadeia J nativa em qualquer local que permita a ligação da porção de ligação ao seu alvo de ligação sem interferir na ligação do receptor de IgM, IgA, IgG / IgM ou molécula de IgG / IgA ao seu alvo de ligação ou alvos de ligação. Os locais preferidos incluem no ou próximo ao terminal C, no ou próximo ao terminal N ou no local interno que, com base na estrutura tridimensional da cadeia J, esteja acessível. Em modalidades pre-feríveis, a porção de ligação é inserida na cadeia J de sequência nativa sem cerca de 10 resíduos do terminal C ou sem cerca de 10 resíduos de aminoácidos do terminal N, onde a cadeia J de sequência nativa preferencialmente é a cadeia J humana da SEQ ID NO:1. Em outra modalidade, a porção de ligação é inserida na cadeia J hu-mana de sequência nativa da SEQ ID NO: 1, entre os resíduos da cisteína 92 e 101 da SEQ ID NO: 1 ou em um local equivalente de outra sequência nativa da cadeia J. Em outra modalidade, a porção de ligação é inserida em uma cadeia J de sequência nativa, como uma cadeia J da SEQ ID NO: 1, no ou perto do local de glicosilação. Mais preferencialmente, a porção de ligação é inserida na cadeia J humana de se-quência nativa da SEQ ID NO: em cerca de 10 resíduos de aminoácidos de terminal C.
[000131] A inserção pode ser obtida por fusão direta ou indireta, isto é, pela combinação da cadeia J e das sequências de aminoácidos da porção de ligação em uma cadeia de polipeptídeos por uma combinação em estrutura de suas sequências de nucleotídeos de codificação, com ou sem um ligante de peptídeos. O ligante pep- tídico (fusão indireta), se utilizado, pode, por exemplo, ter de cerca de 1 a 50, ou cerca de 1 a 40, ou cerca de 1 a 30, ou cerca de 1 a 20, ou cerca de 1 a 10, ou cerca de 10 a 20 resíduos de aminoácidos e pode estar presente em uma ou em ambas as extre-midades da porção de ligação a serem inseridas na sequência da cadeia J. Em uma modalidade preferível, o ligante peptídico tem cerca de 10 a 20 ou de 10 a 15 aminoácidos de comprimento. Em outra modalidade preferível, o ligante peptídico tem 15 aminoácidos de comprimento.
[000132] A porção de ligação também pode ser adicionada à sequência da cadeia J nativa por ligação química usando reticuladores de proteínas hetero-bifunci- onais que contêm dois grupos funcionais diferentes, que têm sua própria reatividade e seletividade. Esses reticuladores podem ser usados em um processo de uma etapa ou podem ser usados para criar proteínas ativadas, que podem seguidamente ser preservados e reagidos com a segunda biomolécula em uma etapa separada. Assim, por exemplo, um reagente de reticulação hetero-bifuncional pode ser utilizado para formar conjugados entre uma cadeia J e uma porção de ligação. Os grupos reativos incluem, sem limitação, grupos reativos de imina (como NHS ou sulfo-NHS), grupos de maleimida e afins. Esses reticuladores, que podem ser cliváveis ou não cliváveis, foram usados, por exemplo, na formação de proteínas transportadoras de hapteno e na preparação de conjugados enzima-anticorpo. Quimicamente, os reticuladores cli-váveis incluem especificamente, sem limitação, ligantes à base de dissulfureto, hidra- zona e peptídeos. Um ligante lábil de enzima bem conhecido e bastante estudado é um ligante de citrulina, mas outros ligantes peptídicos também são conhecidos e adequados. Os representantes típicos de ligantes não cliváveis incluem tioésteres, tais como SMCC (N-sucinimidil-4- (N-maleimidometil)-ciclo-hexano-1-carboxilato). Para mais detalhes, ver, por exemplo, Ducry L and Stump B, Bioconjugate Chem. 2010, 21: 5-13, cuja descrição integral é expressamente incorporada aqui por referência. Para obter outra listagem de mais ligantes adequados, ver, por exemplo, Klein et al., Protein Engineering, Design & Selection; 2014, 27(10): 325-330, cuja descrição integral é incorporada expressamente aqui por referência.
[000133] Embora a cadeia J modificada geralmente contenha uma porção de ligação estranha, também é possível inserir mais de uma porção de ligação em uma cadeia J.
[000134] A cadeia J modificada pode ser produzida por técnicas bem co-nhecidas de tecnologia de DNA recombinante, expressando-se um ácido nucleico que codifica a cadeia J modificada em um organismo hospedeiro procariótico ou eurcarió- tico adequado, como células de CHO ou E. coli. Desse modo, a cadeia J modificada pode, por exemplo, ser expressa em E. coli, conforme descrito em Symersky et al., Mol Immunol 2000, 37:133-140.
[000135] Em uma modalidade, a cadeia J pode ser inicialmente modificada pela inserção de um local de reconhecimento de enzima e modificado pós-translacio- nalmente por um ligante peptídico ou não peptídico, que pode titular qualquer porção de ligação estranha para uma cadeia J, como, por exemplo, uma molécula pequena citotóxica, de modo a produzir um conjugado anticorpo-fármaco (ADC).
[000136] A cadeia J modificada também pode ser coexpressa com as cadeias pesadas e leves do anticorpo receptor de IgM, IgA, IgG / IgM ou IgG / IgA. Embora, devido à sua estrutura complexa, a produção em grande escala de IgM recom- binante tenha sido difícil, vários sistemas de produção recombinantes para IgM utili-zando células não linfoides foram reportados, incluindo a coexpressão das cadeias pesada (H) e leve (L) de IgM em células de glioma C6, células CHO e células HeLa (ver, por exemplo, W089/01975 e Wood et al., J. Immunol. 145, 3011-3016 (1990) para expressão nas células de CHO). A expressão de um anticorpo monoclonal de IgM em E. coli, com ou sem uma cadeia J, é descrita, por exemplo, em Azuma et al., Clin Cancer Res 2007, 13(9):2745-2750. A produção de IgM em uma linhagem de células de retina humana imortalizada expressando proteínas E1A e E1B de um ade- novírus é descrita na Publicação do Pedido US No. 20060063234.
[000137] O anticorpo receptor pode ser monoespecífico, biespecífico ou multiespecífico. As moléculas de ligação à IgA e à IgM biespecíficas e multiespecífi- cas, incluindo anticorpos, são descritas, por exemplo, no Pedido de Patente U.S. com o No. de série 61/874.277 e 61/937.984, cujo conteúdo integral é incorporado neste documento por referência.
Aplicações de anticorpos com cadeia J modificada
[000138] Os anticorpos que compreendem uma cadeia J modificada da presente invenção têm amplas aplicações terapêuticas e de diagnóstico.
[000139] Em uma modalidade, os anticorpos que compreendem uma cadeia J modificada ligada a dois ou mais locais no mesmo alvo solúvel, como, por exemplo, VEGF, TNFαou IL6. O efeito pode, por exemplo, estar antagonizando vários locais da proteína e/ou aumentar a avidez para um determinado alvo.
[000140] Em outra modalidade, os anticorpos que compreendem uma cadeia J modificada deste documento se ligam a dois ou mais locais no mesmo alvo da superfície celular (receptor), como EGFR ou HER2 (ErbB2). Assim, por exemplo, es-ses anticorpos podem se direcionar a epítopos 4D5 e 2C4 em uma molécula HER2. Esta abordagem pode aumentar a bio-potência e/ou avidez para um determinado alvo.
[000141] Em outra modalidade, ainda, os anticorpos que compreendem as cadeias J modificadas da presente invenção se ligam a dois ou mais alvos solúveis diferentes (peptídeos ou proteínas globulares), por exemplo, TNFα e IL6, VEGFα e Ang2 ou duas citocinas. Essa abordagem pode resolver, por exemplo, em um bloqueio mais complexo de uma passagem específica; em um bloqueio da assim chamada "tempestade de citocinas", isto é, a ativação de células T indesejáveis, resultante de certos anticorpos biespecíficos multivalentes, como os anticorpos biespecíficos para o antígeno CD3, ou coordenar uma enzima e seu substrato, por exemplo, Fator IXa e Fator X. Exemplos específicos incluem, sem limitação, anticorpos biespecíficos com uma cadeia J modificada, em que uma primeira especificidade é dirigida a VEGF e uma segunda especificidade é dirigida a Ang2 ou DLL4 (antiangiogênse) ou uma primeira especificidade é dirigida a TNF e uma segunda especificidade é dirigida a Ang2 ou IL-17 (propriedades anti-inflamatórias), onde a especificidade pode ser inserida na cadeia J de um anticorpo de IgM, IgA, IgG / IgM ou de IgG / IgA ou um fragmento de ligação a antígeno seu.
[000142] Em outra modalidade, ainda, os anticorpos compreendem uma cadeia J modificada podem se ligar a um ou mais alvos solúveis e um ou mais alvos receptores da superfície celular, como um fator angiogênico e um receptor específico neovascular. O objetivo desta abordagem também pode ser entrega aumentada e blo-queio em locais específicos ou tecidos.
[000143] Em outra modalidade, ainda, os anticorpos que compreendem uma cadeia J modificada são concebidos para se ligar a dois ou mais alvos receptores da superfície celular diferentes, como, por exemplo, HER1, HER2 (ErbB2) e HER3 (ErbB3), inibindo vários alvos através da mesma passagem ou de passagens diferen-tes. Isso pode resultar no aumento da especificidade e seletividade e/ou no bloqueio mais completo de uma determinada passagem. Exemplos específicos de tais anticor-pos incluem, sem limitação, anticorpos biespecíficos, com uma cadeia J modificada, onde uma especificidade é direcionada a HER2 e outra especificidade é direcionada a HER3; ou uma especificidade é direcionada a EGFR (HER1) e uma outra especifi-cidade é direcionada a HER2. Outros anticorpos biespecíficos IgM, IgA, IgG / IgM ou IgG / IgA com uma cadeia J modificada podem, por exemplo, ligar-se a EGFR e HER3, IL-1α e IL-1β, IL-4 e IL-13, a Ang-2 e VEGF-A, ao fator IXa e ao fator X ou IL-17A e IL-17F.
[000144] Os anticorpos que compreendem uma cadeia J modificada da presente invenção também podem ser concebidos para se ligar a um ou mais alvos solúveis ou alvos receptores da superfície celular e um ou mais alvos de tempo de residência mais longo, como, por exemplo, TNFα e / ou VEGF e albumina de soro. Essas moléculas deverão ter meia-vida de circulação mais longa do que as moléculas de ligação sem a especificidade de albumina.
[000145] Em outra modalidade, os anticorpos que compreendem uma cadeia J modificada deste documento podem se ligar a um ou mais alvos solúveis e uma ou mais proteínas de matriz e/ou substratos, como, por exemplo, VEGFα e ácido hia- lurônico. As moléculas de ligação multiespecíficas resultantes podem encontrar utili-dade, por exemplo, na terapia antiangiogênica de condições oculares, tais como a degeneração macular relacionada com a idade (AMD), devido a seu maior tempo de permanência no espaço intraocular.
[000146] Os anticorpos que compreendem uma cadeia J modificada e a ligando-se a um ou mais alvo receptor ou solúvel, mais um ou mais receptor transpor-tador (isto é, receptor de transferrina), por exemplo, anti-EGFRvIII (forma mutante com éxon III excluído), revelaram um glioblastoma combinado com especificidade de anti- transferrina, podem ter utilidade na administração dos anticorpos pela barreira cere-bral de sangue.
[000147] Em uma modalidade preferida, os anticorpos de IgM, IgA, IgG / IgM e IgG / IgA aqui descritos compreendem uma cadeia J modificada com especificidade de ligação a uma célula imunitária, como uma célula T, célula NK, um macró- fago ou um neutrófilo, e se ligam a um antígeno expresso em uma célula doente ou um patógeno. Visto que a molécula de IgM compreende 5 unidades de ligação e uma molécula de IgA é um dímero que compreende duas unidades de ligação, essas mo-léculas são significativamente mais potentes devido à sua maior avidez do que os anticorpos biespecíficos de IgG. Além disso, através da ativação e do redireciona- mento das células efetoras, por exemplo, das células T efetoras, às células doentes alvejadas, tecidos ou patógenos, os anticorpos de IgM, IgA, IgG / IgM e IgG / IgA deste documento induzem uma resposta imunitária contra o alvo, aumentando ainda mais a potência e a eficácia. Devido a essas propriedades benéficas, os anticorpos de IgM, a IgA, IgG / IgM e IgG / IgA deste documento, que compreendem uma cadeia J modi-ficada, são especialmente vantajosos em situações em que os anticorpos da IgG se ligam ao seu alvo com baixa afinidade. Assim, em uma modalidade, os anticorpos de IgM, a IgA, IgG / IgM e IgG / IgA deste documento podem compreender o domínio de ligação de um anticorpo de IgG terapêutico.
[000148] Em certas modalidades, os anticorpos de IgM, a IgA, IgG / IgM e IgG / IgA deste documento que compreendem uma cadeia J modificada podem ser usados para o tratamento do câncer. É previsto que qualquer tipo de tumor e qualquer tipo de antígeno associado a tumor podem ser alvejados. Exemplos de tipos de câncer incluem, sem limitação, leucemia mieloide aguda, câncer das vias biliares, câncer de mama, câncer cervical, leucemia linfocítica crônica, leucemia mieloide crônica, câncer colorretal, câncer endometrial, esofagal, de estômago, de cabeça e pescoço, linfoma de Hodgkin, câncer de pulmão, câncer medular da tiroide, linfoma não Hodgkin, mi- eloma múltiplo, câncer renal, câncer de ovário, câncer pancreático, glioma, melanoma, câncer de fígado, câncer de próstata e câncer de bexiga urinário. No entanto, aquele versado na técnica perceberá que os antígenos associados a tumores são conhecidos na técnica para virtualmente qualquer tipo de câncer.
[000149] Os antígenos associados a tumor que podem ser direcionados pelos anticorpos de IgM, IgA, IgG/IgM ou IgG/IgA da presente invenção incluem, sem limitação, alfa-fetoproteína (AFP), antígenos associados, Ba 733, BAGE, antígeno BrE3, CA125, CAMEL, CAP-1, anidrase carbônica IX, CASP-8/m, CCCL19, CCCL21, CD1, CD1a, CD2, CD3, CD4, CD5, CD8, CD11A, CD14, CD15, CD16, CD18, CD19, CD20, CD21, CD22, CD23, CD25, CD29, CD30 , CD32b, CD33, CD37, CD38, CD40, CD40L, CD44, CD45, CD46, CD52, CD54, CD55, CD59, CD64, CD66a-e, CD67, CD70, CD70L, CD74, CD79a, CD80, CD83, CD95, CD126, CD132, CD133, CD138, CD147, CD154, CDC27, CDK-4/m, CDKN2A, CTLA-4, CXCR4, CXCR7, CXCL12, HIF-1a, dois pontos específicos do antígeno-p (Chop), CEA (CEACAM5), CEACAM6, c-Met, barragem, EGFR (HER1, ErbB1), ErbB2 (HER2), ErbB4 (HER3), EGFRvIII, EGP-1 (TROP-2), 2-EGP, ELF2-M, Ep-CAM, fator de crescimento fibroblástico (FGF) , Flt-1, Flt-3, receptor de folato, antígeno G250, GAGE, gp100, GRO beta, HLA-DR, HM1.24, gonadotrofina coriônica humana (HCG) e suas subunidades, HER2/neu, HMGB-1, fator induzível de hipóxia (HIF-1), HSP70 - 2m, HST-2 Ia, IGF-1R, IFN-Y IFN- α, IFN-β, IFN-À, IL-4R, IL-6R IL-13R, IL-15R, IL-17R, IL-18R, Il-2, IL-6, IL-8, IL-12, IL- 15, IL-17, IL-18, IL-23, IL-25, fator 1 de crescimento semelhante a insulina (IGF-1), antígeno KC4, antígeno KS-1, KS1-4, Le-Y, LDR/FUT, fator inibitório da migração de macrófagos (MIF), MAGE, MAGE-3, MART-1, MART-2, NY-ESO-1, TRAG-3, mCRP, MCP-1 MIP-1A, MIP-1B, MIF, MUC1, MUC2, MUC3, MUC4, MUC5ac, MUC13, MUC16, MUM-1/2, MUM-3, NCA66, NCA95, NCA90, antígeno PAM4, mucina de cân-cer pancreático, receptor PD-1, fator de crescimento da placenta, p53, PLAGL2, fos- fatase de ácido prostático, PSA, PRAME, PSMA, PlGF, ILGF, ILGF-1R, IL-6, IL-25, RS5, RANTES, T101, SAGE, S100, survivina, survivina-2B, TAC, TAG-72, tenascina, receptores TRAIL, TNF-alfa, antígeno Tn, antígenos Thomson-Triedenreich, antíge- nos de necrose tumoral, VEGFR, fibronectina ED-B fibronectina, WT-1, antígeno 17- 1A, fatores de complemento C3, C3a, C3b, C5a, C5, marcador de angiogênese, bcl- 2, bcl-6, Kras.
[000150] Como discutido acima, para aplicações oncológicas, os anticorpos que compreendem uma cadeia J modificada pode ser concebida para desencadear a função de morte de células do sistema imunológico contra células cancerosas alvo. Assim, por exemplo, a cadeia J de anticorpos IgM, IgA, IgG/IgM ou IgG/IgA ou seus fragmentos de ligação ao antígeno, pode ser modificada através da introdução em uma cadeia J nativa de uma especificidade de ligação para uma célula imune, tais como uma célula T ou uma célula assassinas naturais (NK), enquanto que um anti-corpo IgA, IgG/IgM ou IgG/IgA fornece especificidade de ligação a uma célula alvo, por exemplo, um marcador tumoral, tal como um oncogene, na superfície de um tumor de células, incluindo, por exemplo, qualquer um ou mais dos antígenos associados a tumores listados acima.
[000151] No caso das células T, o aglomerado de diferenciação 3 (CD3) é um complexo proteico multimérico, conhecido historicamente como o complexo T3 e é composto por quatro cadeias de polipeptídeos distintas (ε, Y, δ, Z) que montam e funcionam como três pares de dímeros (εY, εδ, ZZ). O complexo CD3 serve como um correceptor de células T que se associa de forma não covalente com o receptor de células T (TCR). Os componentes deste complexo CD3, especialmente CD3ε, são alvos para uma cadeia J modificada de um anticorpo de IgM que se liga especifica-mente a um antígeno associado a um tumor. Embora a cadeia J modificada específica para células T efetoras de preferência liga-se a antígeno CD3 (CD3ε), outros antíge- nos expressos em células T efetoras são conhecidos e podem ser alvo da cadeia J modificada. Antígenos de células T exemplares incluem, mas não estão limitados a CD2, CD3, CD4, CD5, CD6, CD8, CD25, CD28, CD30, CD40, CD40L, CD44, CD45, CD69 e CD90.
[000152] Anticorpos IgM, IgA, IgG / IgM ou IgG / IgA exemplares que incluem uma cadeia J modificada com especificidade de ligação a CD3, pode incluir as regiões de ligação de anticorpos IgG conhecidos para antígenos associados a tumo-res, tais como, por exemplo, blinatumomab (também conhecido como MT103) (anti- CD19), CD19hA19 (anti-CD19, Pat. No. 7.109.304), hPAM4 (anti-mucina, Pat. EUA No. 7.282.567), hA20 (anti-CD20, Pat. No. 7.251.164), hIMMU31 (anti-AFP, Pat. No. 7.300.655), hLL1 (anti-CD74, Pat. No. 7.312.318), hLL2 (anti-CD22, Pat. No. 7.074.403), hmu-9 (anti-CSAp, Pat. No. 7.387.773), hL243 (anti-HLA-DR, Pat. No. 7.612.180), HMN-14 (anti-CEACAM5, US Pat. No. 6.676.924), hMN-15 (anti- CEACAM6, US Pat. No. 7.541.440), hRS7 (anti-GPE-1, Pat. No. 7.238.785), hMN-3 (anti-CEACAM6, Pat. No. 7.541.440), Ab124 e Ab125 (anti-CXCR4, Pat. No. 7.138.496), as divulgações dos quais são expressamente incorporadas neste docu-mento por referência.
[000153] Em uma modalidade específica, um anticorpo IgM, IgA, IgG / IgM ou IgG / IgA que compreende a região de ligação CD19 de blinatumomab compreende uma cadeia J modificada que compreende a região de ligação CD3 de blinatumomab.Este anticorpo pode ser usado, por exemplo, para o tratamento de linfoma não Hod-gkin ou leucemia de linfoblastos aguda da série de células B (B-ALL).
[000154] Em uma outra modalidade específica, um anticorpo IgM, IgA, IgG / IgM ou IgG / IgA que compreende a região de ligação CD20 do rituximab que com-preende uma cadeia J modificada com especificidade de CD3, tal como uma cadeia J modificada que compreende a região de ligação de CD3 de blinatumomab.
[000155] Em uma outra modalidade específica, um anticorpo IgM, IgA, IgG / IgM ou IgG / IgA que compreende a região de ligação EpCAM do MT110 que com-preende uma cadeia J modificada com especificidade de CD3, tal como uma cadeia J modificada que compreende a região de ligação de CD3 de MT110. Tais anticorpos biespecíficos podem ser utilizados para o tratamento do câncer gastrointestinal.
[000156] Anticorpos alternativos que podem proporcionar regiões de ligação para utilização em combinação com uma cadeia J modificada com especificidade de ligação de CD3 que inclui, por exemplo, abciximab (anti-glicoproteína Ilb / IIIa), alemtuzumab (anti-CD52), bevacizumab (anti-VEGF), cetuximab (anti-EGFR), gem- tuzumab (anti-CD33), ibritumomab (anti-CD20), panitumumab (anti-EGFR), tositu- momab (anti-CD20), trastuzumab (anti-ErbB2), lambrolizumab (receptor de anti-PD- 1), nivolumab (receptor de anti-PD-1), ipilimumab (anti-CTLA-4), abagovomab (anti- CA-125), adecatumumab (anti-EpCAM), atlizumab (receptor de anti-IL-6), benralizu- mab (anti -CD125), obinutuzumab (GA101, anti-CD20), CC49 (anti-TAG-72), AB-PG1- XG1-026 (anti-PSMA, pedido de patente EUA Ser. No. 11 / 983,372, depositado como ATCC PTA-4405 e PTA-4406), D2 / B (anti-PSMA, WO 2009/130575), o tocilizumab (receptor de anti-IL-6), basiliximab (anti-CD25), daclizumab (anti-CD25), efalizumab (anti-CD11a), GA101 (anti-CD20; Glycart Roche), atalizumab (anti-alfa.4 integrin), omalizumab (anti-IgE); anti-TNF-.alpha. anticorpos, tais como CDP571 (Ofei et al., 2011, Diabetes 45:881-85), MTNFAI, M2TNFAI, M3TNFAI, M3TNFABI, M302B, M303 (Thermo Scientific, Rockford, Ill.), infliximab (Centocor, Malvern, Pa.), certolizumab pegol (UCB, Bruxelas, Bélgica), anti-CD40L (UCB, Bruxelas, Bélgica), adalimumab (Abbott, Abbott Park, Ill.), BENLYSTA.RTM. (Human Genome Sciences); anticorpos para terapia da doença de Alzheimer, tais como Alz 50 (Ksiezak-Reding et al., 1987, J Biol Chem 263:7943-47), gantenerumab, solanezumab e infliximab; anticorpos anti- fibrina como 59D8, T2G1s, MH1; anticorpos anti-CD38, tais como MOR03087 (Mor-phoSys AG), MOR202 (Celgene), HuMax-CD38 (Genmab) ou daratumumab (Johnson & Johnson); anticorpos anti-HIV, tais como P4 / D10 (Pat. No. 8,333,971), Ab 75, Ab 76, Ab 77 (Paulik et al., 1999, Biochem Pharmacol 58:1781-90), bem como os anticorpos anti-HIV descritos na Pat. No. 5.831.034, EUA Pat. No. 5,911,989 e Vcelar et al., AIDS 2007; 21(16):2161-2170 e Joos et al., Antimicrob. Agentes de Quimioterapia 2006; 50 (5): 1773-9.
[000157] FIG. 19 lista antígenos alvo exemplares para o tratamento de câncer hematológico, tumores epiteliais, tumores ricos em glicosilo e antígenos exemplares em células T, células NK, macrófagos e neutrófilos para o alvejar com uma cadeia J modificada. Deve ser compreendido que uma molécula de ligação de IgM para qual-quer dos antígenos tumorais listados pode ser combinada com uma cadeia J modifi-cada com qualquer uma das especificidades de ligação listadas. Assim, qualquer alvo dos anticorpos de IgM listados na coluna da esquerda da tabela pode ser combinado com qualquer alvo de cadeia J modificada listado na coluna da direita.
[000158] Em uma modalidade preferida, um pentâmero de IgM fornece es-pecificidade de ligação para as células alvo, tais como células B, enquanto que um domínio de ligação a uma célula efetora, por exemplo uma célula T, pode ser ligado de forma covalente à cadeia J do anticorpo IgM. Assim, a cadeia J pode ser modificada por ligação covalente com um domínio de ligação de CD3 (CD3ε). Nesta configuração, o pentâmero de IgM (que compreende 10 cópias de cadeia pesada e 10 cópias de cadeia leve) fornece especificidade de ligação para as células B alvo, enquanto que a corrente de células T da cadeia J proporciona potência citotóxica. Em outras palavras, um anticorpo IgM que se liga a um alvo de tumor adquire adicionalmente uma função de ligação a células T. O domínio de ligação de CD3 ligado de forma covalente a uma cadeia J nativa, ou uma variante de uma cadeia J nativa, pode, por exemplo, ser uma cadeia simples de Fv (scFv) de um anticorpo anti-CD3, ou um único anticorpo de cadeia pesada de ocorrência natural, por exemplo, um de camelídeos (camelos, lhamas, alpacas) ou anticorpo de cadeia única de peixes cartilagíneos (tubarões, raias), um suporte, por exemplo, fibronectina (por exemplo fibronectina III) com especificidade de ligação a CD3. Enquanto certas modalidades preferidas são especificamente aqui referidas, é para ser entendido que os anticorpos IgM, IgA, IgG / IgM e IgG / IgA com especificidade de ligação para qualquer alvo, tal como qualquer um antígeno de tumor, compreendendo uma ligação modificada de cadeia J a qualquer marcador de células T são contemplados e estão dentro do escopo da presente invenção.
[000159] Em uma modalidade, um anticorpo de IgM, IgA, IgG / IgM ou IgG / IgA multiespecífico liga-se a um ou mais dos alvos tumorais listados acima, enquanto que a cadeia J é modificada para se ligar a CD3ε. Em uma modalidade preferencial, um anticorpo de IgM, IgA, IgG / IgM ou IgG / IgA multiespecífico liga-se a um ou mais dos alvos tumorais listados na FIG. 19, enquanto que a cadeia J é modificada para se ligar a CD3ε.
[000160] As células assassinas naturais (NK) são componentes importantes da imunidade inata e desempenham um papel chave na defesa do hospedeiro em virtude da sua capacidade de liberação de citocinas e de mediar a atividade citolítica contra células tumorais e células infectadas por vírus. Antígenos de células NK in-cluem, sem limitação, CD16, CD32A, CD56, CD57, CD64, CD117 (ou c-kit), moléculas de adesão, incluindo molécula-2 associada a linfócito (LFA-2 ou CD2), LFA-3 (CD58) e LFA-1 (CD11a/CD18).
[000161] Exemplos de células NK que engatam anticorpos biespecíficos com cadeia J modificada incluem IgM, IgA, IgG / IgM e anticorpos IgG / IgA com especificidade de ligação a qualquer dos antígenos tumorais listados acima que compreendam uma cadeia J modificada que se liga a uma célula NK. Em uma modalidade em particular, um anticorpo IgM biespecífico, IgA, IgG / IgM e IgG / IgA com especificidade de ligação de HER2 compreende uma cadeia J modificada para se ligar a CD16, CD32A, CD56 ou CD64. Em uma outra modalidade preferencial, um anticorpo multi-específica de IgM, IgA, IgG / IgM ou IgG / IgA liga-se a qualquer um dos alvos tumorais listados na coluna da esquerda da tabela na Figura 19 e a cadeia J é modificada para se ligar a CD16, CD64 ou NKG2D em células NK.
[000162] Envolvimento de macrófagos nos anticorpos de cadeia J modificada da presente invenção pode ser fornecido, por exemplo, através da introdução de uma especificidade de CD14 na cadeia J.
[000163] Em uma modalidade, um anticorpo de IgM, IgA, IgG / IgM ou IgG / IgA multiespecífico liga-se a um ou mais dos alvos tumorais listados acima, enquanto que a cadeia J é modificada para se ligar a CD14. Em uma modalidade preferencial, um anticorpo de IgM, IgA, IgG / IgM ou IgG / IgA multiespecífico liga-se a um ou mais dos alvos tumorais listados na FIG. 19, enquanto que a cadeia J é modificada para se ligar a CD14.
[000164] Os anticorpos IgM, IgA, IgG / IgM e IgG / IgA com cadeia J modi-ficada pode ter como alvo antígenos baseados em carboidratos, ver, por exemplo, um artigo de resenha por Cazet et al., Breast Cancer Research.; 2010, 12: 204. Têm-se demonstrado que antígenos tumorais à base de carboidrato têm boa associação ao tumor, com forma alternativa de glicosilação que permite a produção de anticorpos IgG que se ligam a tais antígenos com especificidade razoável, mas não necessaria-mente elevada afinidade. Utilizar anticorpos IgM, IgA, IgG / IgM ou IgG / IgA com au-mento da avidez associada contra esta classe de antígenos representa grandes opor-tunidades para novos anticorpos terapêuticos, em especial juntamente com a mobili-zação de células efetoras conseguida por modificação de cadeia J. Em uma modalidade preferida, o anticorpo IgM, IgA, IgG / IgM e IgG / IgA se liga a um ou mais carboidratos com base no antígeno tumoral, enquanto a cadeia J é modificada para ligar-se qualquer uma das células efetoras listadas na FIG. 19.
[000165] Em uma outra modalidade preferencial, os anticorpos IgM, IgA, IgG / IgM e IgG / IgA com cadeia J modificada podem ser utilizados como parte de anticorpos IgM, IgA, IgG / IgM ou IgG / IgA direcionados contra os agentes patogêni-cos. Em uma modalidade preferencial, os patógenos são selecionados do grupo con-sistindo de vírus de HIV, tuberculose de Micobactéria, Streptococcus agalactiae, Sta-phylococcus aureus resistente à meticilina, Legionella pneumophila, Streptococcus pyogenes, Escherichia coli, Neisseria gonorrhoeae, Neisseria meningitidis, Pneumo-coccus, Cryptococcus neoformans, Histoplasma capsulatum, Hemophilis influenzae B, Treponema pallidum, Lyme disease spirochetes, Pseudomonas aeruginosa, Mico- bacterium leprae, Brucella abortus, vírus da raiva, vírus da gripe, citomegalovírus, ví-rus I da herpes simplex, vírus II da herpes simplex , vírus do tipo parvo do soro hu-mano, vírus sincicial respiratório, vírus varicela- zoster, vírus da hepatite B, vírus da hepatite C, vírus do sarampo, adenovírus, vírus de leucemia de células T humanas, vírus Epstein-Barr, vírus da leucemia de murino, vírus da caxumba, vírus da estomatite vesicular, vírus de sindbis, vírus da coriomeningite, vírus da verruga, vírus da língua azul, vírus Sendai, vírus da leucemia felina, reovírus, vírus da pólio, vírus símio 40, vírus do tumor mamário de rato, vírus da dengue, vírus da rubéola , vírus do Nilo Ocidental, Plasmodium falciparum, Plasmodium vivax,Toxoplasma gondii, Trypanosoma rangeli, Trypanosoma cruzi, Trypanosoma rhodesiensei, Trypanosoma brucei, Schistosoma mansoni, Schistosoma japonicum, Babesia bovis, Elmeria tenella, Onchocerca volvulus, Leishmania tropica, Trichinella spiralis, Theileria parva, Taenia hydatigena, Taenia ovis, Taenia saginata, Echinococcus granulosus, Mesocestoides corti, Mycoplasma arthritidis, M. hyorhinis, M. orale, M. arginini, Acholeplasma lai- dlawii, M. salivarium e M. pneumoniae, tal como divulgado na Pat. EUA No. 6.440.416.
[000166] Nesta modalidade, a célula imune efetora pode, por exemplo, ser um dos neutrófilos.
[000167] A Figura 19 apresenta especificamente antígenos virais como alvos para os anticorpos IgM, IgA, IgG / IgM e IgG / IgA apresentados neste documento, em combinação com marcadores de neutrófilos, que pode ser alvo de cadeia J modi-ficada de tais anticorpos.
[000168] Nota-se que os anticorpos IgM, IgA, IgG / IgM e IgG / IgA da in-venção também pode ter como alvo antígenos de carboidrato em cânceres ricos em carboidratos. Tais antígenos incluem CEA, CA-125, TADG78, Sialil Lewis-X (CD15), por exemplo.
[000169] Em todas as modalidades, a porção de ligação (unidade de ligação) utilizada para modificar uma cadeia J nativa pode ser introduzida antes ou após a cadeia J. Assim, uma cadeia J modificada com especificidade de ligação de CD3 pode ter uma configuração anti-CD3scFv-J ou um J-anti-CD3scFv. A sequência (SEQ ID NO: 46) e a estrutura de cadeia simples anti-CD3 Fv que compreende a cadeia J na extremidade C-terminal (anti-CD3scFv-J) são mostradas na Figura 8. A sequência (SEQ ID NO: 47) e uma estrutura de cadeia simples anti-CD3 Fv que compreende a cadeia J na extremidade N-terminal (J-anti-CD3scFv) é mostrada na Figura 9. Devido à sua maior avidez, tais anticorpos são superiores em relação a anticorpos IgG biespecífi- cos. Por exemplo, como resultado, eles são adequados para ter como alvo alvos de número de cópias reduzido, tais como células de linfoma de Burkitt resistentes a Ritu- xan caracterizadas por baixo nível de expressão de CD20. Além disso, os anticorpos IgM, a IgA, IgG / IgM e IgG / IgA neste documento que compreendem uma cadeia J modificada têm potência muito maior, em relação a anticorpos IgG biespecíficos.
Composições Farmacêuticas de Anticorpos com Cadeia J Modificada
[000170] Para fins terapêuticos, os anticorpos que compreendem uma cadeia J modificada podem ser formulados em composições farmacêuticas. Uma composição farmacêutica da presente invenção pode ser administrada por uma vari-edade de métodos conhecidos na técnica. Tal como será apreciado por aqueles ver-sados na técnica, a via e/ou modo de administração irão variar dependendo da doença ou condição-alvo e os resultados desejados. Para administrar um composto da invenção por certas vias de administração pode ser necessário revestir o composto ou co- administrar o mesmo com um material para prevenir a sua inativação. Por exemplo, o composto pode ser administrado a um indivíduo num veículo apropriado, por exemplo, lipossomas ou um diluente. Os diluentes farmaceuticamente aceitáveis incluem soluções tampão salinas e aquosas. Veículos farmacêuticos incluem soluções ou dispersões aquosas estéreis e pós estéreis para a preparação extemporânea de soluções ou dispersões injetáveis estéreis. O uso de tais meios e agentes para substâncias ativas farmaceuticamente é conhecido na técnica.
[000171] As composições também podem conter adjuvantes tais como con-servantes, agentes umectantes, agentes emulsificantes e/ou agentes de dispersão. Prevenção da presença de micro-organismos pode ser assegurada por procedimen-tos de esterilização e pela inclusão de vários agentes antibacterianos e antifúngicos, por exemplo, parabenos, clorobutanol, ácido sórbico fenol e afins. Também pode ser desejável incluir agentes isotônicos tais como, por exemplo, açúcares, cloreto de sódio e similares nas composições. Além disso, absorção prolongada da forma farmacêutica injetável pode ser provocada pelo uso de agentes que atrasem a absorção, tais como o monoestearato de alumínio e gelatina.
[000172] Os níveis de dosagem reais dos ingredientes ativos nas composi-ções farmacêuticas da presente invenção podem ser variados de modo a obter uma quantidade do ingrediente ativo que seja eficaz para alcançar a resposta terapêutica desejada para um paciente em particular, composição, e modo de administração, sem ser tóxico para o paciente. O nível de dosagem selecionado dependerá de uma vari-edade de fatores farmacocinéticos, incluindo a atividade das composições particulares da presente invenção empregadas, a via de administração, o tempo de administração, a taxa de excreção do composto específico a ser usado, a duração do tratamento, outros fármacos, compostos e/ou materiais usados em combinação com as composições específicas empregadas, a idade, o gênero, o peso, a condição, a saúde geral e história médica anterior do paciente a ser tratado e fatores similares bem conhecidos nas técnicas médicas.
[000173] A composição deve ser estéril e fluida na medida em que a com-posição possa ser entregue por meio de seringa. Em adição à água, o veículo é de preferência uma solução salina isotônica tamponada.
[000174] Os exemplos que seguem, listagem de sequências e figuras são fornecidos para auxiliar a compreensão da presente invenção, o verdadeiro âmbito da qual é definido nas reivindicações anexas. Entende-se que podem ser feitas modificações nos procedimentos apresentados sem se afastar do espírito da invenção.
[000175] Mais detalhes da invenção são ilustrados pelos seguintes exemplos não limitativos.
Exemplo 1 Preparação de um anticorpo anti-IgM CDIM biespecífico que compreende um CD3 que se liga a uma cadeia J modificada 1. Produção de construções de DNA com mutações projetadas
[000176] a. Síntese de construto de DNA. Todos os construtos de DNA com mutações projetadas são sintetizados por fornecedores comerciais (Genescript), com locais de restrição compatíveis nas duas extremidades para subclonagem nos respectivos vetores de expressão.
[000177] b. Construção de vetores de expressão. Os construtos de DNA sintetizados são ressuspensos em tampão de Tris-EDTA a 1 μg / ml. DNA (1 μg) é sujeito a digestão enzimática e o gene sintetizado é separado a partir do DNA plasmí- deo transportador por eletroforese. O DNA digerido é ligado ao DNA de plasmídeo pré-digerido (pCAGGS para cadeia J, Gene 108 (1991) 193-200), através de técnicas de biologia molecular padrão. O DNA ligado é transformado em bactérias competentes e plaqueado em placas de LB com múltiplos antibióticos seletivos. Várias colônias bacterianas são escolhidas e preparações de DNA são feitas através de técnicas padrão de biologia molecular. O DNA preparado é verificado por sequenciamento. Apenas utilizam-se os clones bacterianos com 100% de correspondência de sequência de DNA com a sequência de DNA projetada para preparação de DNA de plasmídeo e, subsequentemente, para a transfecção de células.
[000178] c. Diferentes cadeias J A fim de demonstrar que as variantes de cadeia J serão capazes de acoplar com IgM, duas variantes de cadeia J diferentes são construídas com locais de fusão distintos que incorporam o anticorpo anti-CD3 (OKT3 scFv).
[000179] i. Esta construto é composto de um scFv de OKT3 (anti-CD3) fun-dido com N-terminal da cadeia J humana (CD3scFv-15 Aa J Ligante):QVQLQQSGAELARPGASVKMSCKASGYTFTRYTMHWVKQRPGQGLEWIG YINPSRGYTNYNQKFKDKATLTTDKSSSTAYMQLSSLTSEDSAVYYCARYYDDHYS LDYWGQGTTLTVSSGGGGSGGGGSGGGGSQIVLTQSPAIMSASPGEKVTMTCSA SSSVSYMNWYQQKSGTSPKRWIYDTSKLASGVPAHFRGSGSGTSYSLTISGMEAE DAATYYCQQWSSNPFTFGSGTKLEIKGGGGSGGGGSGGGGSQEDERIVLVDNKC KCARITSRIIRSSEDPNEDIVERNIRIIVPLNNRENISDPTSPLRTRFVYHLSDLCKKCD PTEVELDNQIVTATQSNICDEDSATETCYTYDRNKCYTAVVPLVYGGETKMVETALT PDACYPDGGGSEQKLISEEDLNSAVDHHHHHH-(SEQ ID NO: 46)
[000180] Este construto tem um peso molecular de cerca de 45kD e é capaz de se ligar a cadeia epsilon solúvel de células CD3 (sino Biológicas) ou células T; e é capaz de se ligar ao anticorpo monoclonal anti-myc 4A6 ou outros anticorpos anti- myc.
[000181] ii. Este construto é composto de um scFv de OKT3 (anti-CD3) fun-dido com o C-terminal da cadeia J humana (J-15 AA-ligante-CD3scFv):QEDERIVLVDNKCKCARITSRIIRSSEDPNEDIVERNIRIIVPLNNRENISDPTS PLRTRFVYHLSDLCKKCDPTEVELDNQIVTATQSNICDEDSATETCYTYDRNKCYTA VVPLVYGGETKMVETALTPDACYPDGGGGSGGGGSGGGGSQVQLQQSGAELAR PGASVKMSCKASGYTFTRYTMHWVKQRPGQGLEWIGYINPSRGYTNYNQKFKDK ATLTTDKSSSTAYMQLSSLTSEDSAVYYCARYYDDHYSLDYWGQGTTLTVSSGGG GSGGGGSGGGGSQIVLTQSPAIMSASPGEKVTMTCSASSSVSYMNWYQQKSGTS PKRWIYDTSKLASGVPAHFRGSGSGTSYSLTISGMEAEDAATYYCQQWSSNPFTF GSGTKLEIKEQKLISEEDLNSAVDHHHHHH- (SEQ ID NO: 47)
[000182] Este construto J-CD3scFv tem um peso molecular de cerca de 45kD e é capaz de se ligar a cadeia epsilon solúvel de células CD3 (sino Biológicas) ou células T; e é capaz de se ligar ao anticorpo monoclonal anti-myc 4A6 ou outros anticorpos anti-myc.
[000183] d. Cadeia pesada de IgM: Este construto de cadeia pesada tem uma cadeia comprimento total μ para IgM-55,5 que se liga a CDIM na superfície de células B:QVQLQQWGAGLLKPSETLSLTCAVYGGSFSGYYWSWIRQPPGKGLEWIG EINHSGSTNYNPSLKSRVTISVDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCARGRMAWGAS VNFDYWGQGTLVTVSSGSASAPTLFPLVSCENSPSDTSSVAVGCLAQDFLPDSITF SWKYKNNSDISSTRGFPSVLRGGKYAATSQVLLPSKDVMQGTDEHVVCKVQHPNG NKEKNVPLPVIAELPPKVSVFVPPRDGFFGNPRKSKLICQATGFSPRQIQVSWLREG KQVGSGVTTDQVQAEAKESGPTTYKVTSTLTIKESDWLSQSMFTCRVDHRGLTFQ QNASSMCVPDQDTAIRVFAIPPSFASIFLTKSTKLTCLVTDLTTYDSVTISWTRQNGE AVKTHTNISESHPNATFSAVGEASICEDDWNSGERFTCTVTHTDLPSPLKQTISRPK GVALHRPDVYLLPPAREQLNLRESATITCLVTGFSPADVFVQWMQRGQPLSPEKYV TSAPMPEPQAPGRYFAHSILTVSEEEWNTGETYTCVVAHEALPNRVTERTVDKSTG KPTLYNVSLVMSDTAGTCY (SEQ ID NO: 3)
[000184] Este construto de cadeia pesada possui um peso molecular de cerca de 64 kD e quando co-expresso com a cadeia leve, o IgM resultante é capaz de se ligar a células B positivas para CDIM.
[000185] e. Cadeia leve para IGM-55,5 conhecida como IGM-55,5, que liga a CDIM (molécula que induz morte celular) na superfície de células B: DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISSYLNWYQQKPGKAPKLLIYAAS SLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSYSTPITFGQGTRLEIKRT VAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTE QDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC (SEQ ID NO: 5)
[000186] O construto da cadeia leve tem um peso molecular de cerca de 24 kD e quando coexpresso com a cadeia pesada adequada (SEQ ID NO 3) é capaz de se ligar a células B positivas para CDIM.
[000187] 2. A expressão de proteínas, purificação e caracterização
[000188] a. Transfecção. DNA de cadeia J Modificada, Leve e Pesada é transfectado para células CHO. DNA para vectores de expressão são misturados, ti-picamente em uma proporção de 1:1:1, com PEI e, em seguida, adicionados a células CHO-S. Transfecção PEI com células CHO-S é realizada de acordo com técnicas es-tabelecidas (ver "Biotechnology and Bioengineering, Vol 87, 553-545").
[000189] b. Imunoprecipitação
[000190] i. Capturar IgM Seleto (BAC, Thermo Fisher). Proteínas IgM de sobrenadantes de células CHO transfectadas são parcialmente purificadas por imu- noprecipitação com a matriz de afinidade de Captura de IgM Seleto, de acordo com o protoloco dos fabricantes' (GE Life Sciences). Após incubação à temperatura ambiente durante 2 horas, a matriz de afinidade é separada do sobrenadante por centrifugação. A matriz é ainda lavada com PBS 3 vezes antes do PBS ser removido cuidadosamente. A proteína capturada é eluída da matriz por incubação com tampão de proteína NuPage LDS (Life Technology) durante 5 minutos.
[000191] ii. Matriz de afinidade de agarose anti-myc (Sigma). Proteínas IgM a partir de sobrenadantes de células CHO transfectadas são parcialmente purificadas por imunoprecipitação com matriz de afinidade anti-myc, de acordo com o protocolo dos fabricantes'. Após incubação à temperatura ambiente durante 2 horas, a matriz de afinidade é separada do sobrenadante por centrifugação. A matriz é ainda lavada com PBS 3 vezes antes do PBS ser removido cuidadosamente após a lavagem final. A proteína capturada é eluída da matriz por incubação com tampão de proteína NuPage LDS (Life Technology) durante 5 minutos.
[000192] c. Electroforese por gel
[000193] i. PAGE SDS Não redutor
[000194] ii. PAGE SDS não redutor separa IgM nativa e as suas formas mutantes de acordo com o tamanho. IgM pentamérica, composta por cadeias pesadas e leves homodiméricas, produz uma banda de proteína de cerca de 1.000.000 de peso molecular. Tampão de Amostra NuPage LDS (Life Technologies) é adicionado a amostras de proteína de IgM a 25°C durante 30 minutos antes do carregamento para o gel. Gel NativePage Novex 3-12% Bis-Tris (Life Technologies) é utilizado com tampão de corrida SDS Novex Tris-Acetato (Life Technologies). Executar gel até a frente do corante atingir o fundo do gel.
[000195] iii. PAGE SDS Redutor. Tampão de amostra NuPage LDS (Life Technologies) e agente redutor NuPage ditiotreitol (Life Technologies) são adiciona-dos a amostras de proteína IgM e aquecidos a 80°C durante 10 minutos antes de carregar no Gel NuPage Novex 4-12% Bis-Tris (Life Technologies). Tampão de corrida NuPage MES SDS (Life Technologies) é usado para eletroforese em gel. Gel é executado até a frente do corante atingir o fundo do gel. Após a eletroforese ser con-cluída, remover o gel dos aparelhos e tingir o gel usando Coloração Coloidal Azul (Life Technologies)
[000196] iv. Detecção de Western Blot. Após a eletroforese ser concluída, remover gel de XCell SureLock Mini-Cell. Transferência para membrana de PVDF a 30 volts por 1 hora (consulte o manual da Life Technologies). Bloco com 20 ml de BSA a 3% em PBST a 25 C durante 1 hora.
[000197] Para Western blot anticadeia J, adicione anti-J (SP105, Thermo Fisher) a 1: 500 em BSA a 3% em PBST durante a noite a 4C. Lavar com PBST quatro vezes à temperatura ambiente. Adicionar HPR-IgG de cabra anti-coelho (Jackson Immunology) a 1: 5.000 em BSA a 3% em PBST durante 1 hora à temperatura ambiente. Lavar com PBST 4 vezes à temperatura ambiente. Adicionar 10 ml de substrato quimioluminescente HRP (Thermo Fisher), durante 10 minutos, antes de expor o blot à película. Anticorpo anticadeia J reage somente com IgM que é co-expresso com cadeia J não modificada (Figura 6) ou cadeia J modificada (Figura 7).
[000198] Para Western blot anti-myc, adicionar anti-myc (4A6, Millipore), a 1: 200 em BSA a 3% em PBST durante a noite a 4C. Lavar com PBST quatro vezes à temperatura ambiente. Adicionar HRP-IgG de Cabra anticamundongo (Jackson Immunology) a 1: 5.000 em BSA a 3% em PBST durante 1 hora à temperatura ambi-ente. Lavar com PBST 4 vezes à temperatura ambiente. Adicionar 10 ml de substrato quimioluminescente HRP (Thermo Fisher), durante 10 minutos, antes de expor o blot à pelicula. O anticorpo anti-myc reage apenas com cadeia J modificada com marcador myc (Figura 2).
[000199] 3. Análise funcional biespecífica
[000200] a. Análise FACS da ligação alvo
[000201] IGM-55,5 com CD3scFv-J ou IgM-55,5 com J-CD3scFv que se liga a células T é confirmada pela ligação do anticorpo a linha de células T (Jurkat, linha de células positivas para CD3) e a linha celular B (Nalm6, linha celular de controle negativo). Após a lavagem, 4A6 marcado com rodamina, é adicionado à suspensão de células. A célula alvo de ligação é detectada por MFI de ambas as células de controle positivas e negativas com ou sem antígeno CD3.
[000202] IGM-55,5 com CD3scFv-J ou IgM-55,5 com J-CD3scFv que se liga a células que expressam CDIM é confirmada pela ligação do anticorpo à linha celular positiva (Daudi, linha celular positiva) e à linha celular negativa (Peer). Após a lavagem, 4A6 marcado com rodamina, é adicionado à suspensão de células. A célula- alvo de ligação é detectada por MFI de ambas as células de controle positivas e negativas com ou sem antígeno de CDIM.
[000203] b. A análise FACS da morte de células B mediada por céulas T em co-cultura Raji, uma linha de células CD19+CD20+ B, foi co-cultivada com T-ALL, uma linha de células T citolíticas de CD8+ com uma IgM de CD20 de tipo selvagem ou uma cadeia de IgM de CD20 x CD3-J por 24 horas a 37 graus, a 5% de CO2. As células foram colhidas e coradas com anticorpos fluorescentes para CD3 (552852 / BD Biosciences) e CD19 (555413 / BD Biosciences) e analisadas por citometria de fluxo para avaliar as células B viáveis.
[000204] c. Citotoxicidade dependente do complemento de células B
[000205] Ramos, uma linha de células CD20+ foi semeada em placas bran-cas de meia área de 96 poços a 25.000 células / poço. O anticorpo e o complemento humano (5% final, Quidel) foram adicionados para iniciar a citotoxicidade dependente do complemento e o número de células viáveis foi medido usando Cell Titer Glo e o protocolo do fabricante. A luminescência foi medida num leitor Envision multimodo (Perkin Elmer) usando 0,1s de tempo de integração por poço. Porcentagem de células viáveis foi calculada através da normalização dos valores de luminescência (unidades de luminescência relativa - RLU) versus poços sem medicamento adicionado. Os dados foram analisados utilizando GraphPad Prism e um ajuste de quatro parâmetros com os valores superior e inferior fixados em 100 e 0% de viabilidade, respectiva-mente.
[000206] Ligação multiespecífica e análise funcional multiespecífica podem ser realizadas de um modo semelhante, utilizando técnicas conhecidas na técnica, tais como as descritas acima.
Exemplo 2: A clonagem molecular, expressão e purificação de um anticorpo de IgM anti- CD20 biespecífico com uma cadeia J modificada que leva anti-CD3 que se liga a scFv
[000207] Este exemplo descreve a preparação da clonagem molecular, ex-pressão e purificação de mais um anticorpo de IgM que tem como alvo um antígeno de células B diferente (CD20) e uma cadeia J modificada que se liga a CD3. O DNA que corresponde às sequências de cadeia pesada e leve abaixo foi preparado utili-zando os métodos descritos no Exemplo 1.
[000208] SEQ ID NO: 48: sequência da cadeia leve de IgM do anticorpo anti-CD20 (rituximab) MDMRVPAQLLGLLLLWLRGARCQIVLSQSPAILSASPGEKVTMTCRASSSV SYIHWFQQKPGSSPKPWIYATSNLASGVPVRFSGSGSGTSYSLTISRVEAEDAATY YCQQWTSNPPTFGGGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPRE AKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTH QGLSSPVTKSFNRGEC SEQ ID NO: 49: sequência da cadeia pesada de IgM do anticorpo anti-CD20 (rituximab) MGWSYIILFLVATATGVHSQVQLQQPGAELVKPGASVKMSCKASGYTFTSY NMHWVKQTPGRGLEWIGAIYPGNGDTSYNQKFKGKATLTADKSSSTAYMQLSSLT SEDSAVYYCARSTYYGGDWYFNVWGAGTTVTVSSGSASAPTLFPLVSCENSPSDT SSVAVGCLAQDFLPDSITFSWKYKNNSDISSTRGFPSVLRGGKYAATSQVLLPSKDV MQGTDEHVVCKVQHPNGNKEKNVPLPVIAELPPKVSVFVPPRDGFFGNPRKSKLIC QATGFSPRQIQVSWLREGKQVGSGVTTDQVQAEAKESGPTTYKVTSTLTIKESDWL SQSMFTCRVDHRGLTFQQNASSMCVPDQDTAIRVFAIPPSFASIFLTKSTKLTCLVT DLTTYDSVTISWTRQNGEAVKTHTNISESHPNATFSAVGEASICEDDWNSGERFTC TVTHTDLPSPLKQTISRPKGVALHRPDVYLLPPAREQLNLRESATITCLVTGFSPADV FVQWMQRGQPLSPEKYVTSAPMPEPQAPGRYFAHSILTVSEEEWNTGETYTCVVA HEALPNRVTERTVDKSTGKPTLYNVSLVMSDTAGTCY
[000209] O DNA correspondente a estas cadeias leves e pesadas, bem como que corresponde a qualquer a cadeia J de tipo selvagem (wt), sequências de cadeia J O15J ou J15O descritos no Exemplo 1 foram co-transfectados em células HEK293 e proteínas expressas e purificadas utilizando a resina de camelídeos, tal como descrito anteriormente. Como mostrado na Figura 13, todas as quatro proteínas expressam bem. A IgM anti-CD20 hexâmera sem-cadeia J é claramente resolvida a partir dos pentâmeros que contém cadeia J para o pentâmero de IgM com o tipo sel-vagem da cadeia J, bem como para IgM biespecífica de onde o anti-CD3 scFv é ligado à cadeia J em qualquer orientação (O15J ou J15O).
Exemplo 3: A clonagem molecular, expressão e purificação de anticorpo de IgM anti-CD20 biespecíficoque compreende uma cadeia J modificada que leva anti-CD3 diferente que se liga a scFv
[000210] Para estabelecer que a montagem de IgM biespecífico é viável com uma cadeia J modificada que transporta um scFv anti-CD3 de uma sequência diferente daquela usada nos Exemplos 1 e 2, uma cadeia J que transporta as regiões variáveis do anticorpo visilizumab (Nuvion). Abaixo estão as sequências de duas ca-deias J com o scFv que corresponde ao Visilizumab (V) fundido com a cadeia J através de um ligante que contém 15 aa's em duas orientações diferentes - V15J e J15V. SEQ ID NO: 50: sequência de cadeia J para V15J MGWSYIILFLVATATGVHSQVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFISY TMHWVRQAPGQGLEWMGYINPRSGYTHYNQKLKDKATLTADKSASTAYMELSSLR SEDTAVYYCARSAYYDYDGFAYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSDIQMT QSPSSLSASVGDRVTITCSASSSVSYMNWYQQKPGKAPKRLIYDTSKLASGVPSRF SGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQWSSNPPTFGGGTKLEIKGGGGSGGGGS GGGGSQEDERIVLVDNKCKCARITSRIIRSSEDPNEDIVERNIRIIVPLNNRENISDPT SPLRTRFVYHLSDLCKKCDPTEVELDNQIVTATQSNICDEDSATETCYTYDRNKCYT AVVPLVYGGETKMVETALTPDACYPD SEQ ID NO: 51: sequência de cadeia J para J15V MKNHLLFWGVLAVFIKAVHVKAQEDERIVLVDNKCKCARITSRIIRSSEDPNE DIVERNIRIIVPLNNRENISDPTSPLRTRFVYHLSDLCKKCDPTEVELDNQIVTATQSNI CDEDSATETCYTYDRNKCYTAVVPLVYGGETKMVETALTPDACYPDGGGGSGGG GSGGGGSQVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFISYTMHWVRQAPGQGLEW MGYINPRSGYTHYNQKLKDKATLTADKSASTAYMELSSLRSEDTAVYYCARSAYYD YDGFAYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSDIQMTQSPSSLSASVGDRVTIT CSASSSVSYMNWYQQKPGKAPKRLIYDTSKLASGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQ PEDFATYYCQQWSSNPPTFGGGTKLEIK
[000211] Tal como descrito no Exemplo 1, o DNA que corresponde a estas sequências foi sintetizado e transfectado para células HEK293, juntamente com as cadeias pesada e leve para IgM anti-CD20 para produzir a proteína a qual foi, então, purificada utilizando a matriz de afinidade de anticorpos de camelídeos específica para IgM. Como mostrado na Figura 13, cadeias J fundidas com o novo anti-CD3 scFv com o ligante 15 aa são capazes de se incorporarem na IgM e a forma pentamérica da IgM biespecífica com a correspondente cadeia J é claramente distinguível da forma hexa- mérica sem uma cadeia J.
Exemplo 4: Clonagem molecular, expressão e purificação de uma IgM que compreende uma versão de cadeia J modificada de camelídeo anti-CD16 de um segundo domínio de ligação de células efetoras - anti-CD16 camelídeo
[000212] Este exemplo demonstra que é possível ligar uma porção de ligação diferente de um scFv a uma cadeia J, a qual é dirigida a um alvo diferente em uma população de células efetoras diferentes. Uma sequência Vhh de camelídeo mos-trada abaixo foi usada, que foi selecionada para ligação ao antígeno CD16 em células assassinas naturais (células NK). Mais uma vez, esta sequência estava ligada a uma cadeia J através de um ligante flexível 15 aa para produzir C15J. A IgM biespecífica foi expressa e purificada como descrito no Exemplo 1 e analisada em géis de híbridos. Formação de uma espécie pentamérica é claramente visto. Além disso, a incorporação da cadeia J C15J na IgM pentamérica foi estabelecida utilizando Western blot (Figura 18).SEQ ID NO: 52: sequência de cadeia J para C15J MGWSYIILFLVATATGVHSEVQLVESGGELVQAGGSLRLSCAASGLTFSSY NMGWFRRAPGKEREFVASITWSGRDTFYADSVKGRFTISRDNAKNTVYLQMSSLK PEDTAVYYCAANPWPVAAPRSGTYWGQGTQVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSQE DERIVLVDNKCKCARITSRIIRSSEDPNEDIVERNIRIIVPLNNRENISDPTSPLRTRFV YHLSDLCKKCDPTEVELDNQIVTATQSNICDEDSATETCYTYDRNKCYTAVVPLVYG GETKMVETALTPDACYPD
Exemplo 5: Análise da citotoxicidade dependente do complemento para a família de IgM com um sem cadeias J incorporadas
[000213] Citotoxicidade dependente do complemento é um mecanismo fun-damental para a morte celular por anticorpos. Anticorpos IgM são conhecidos por te-rem morte celular dependente de complementos melhorada (CDC), devido à sua forma multimérica. Um aspecto chave desta invenção foi testar se a incorporação de cadeias J modificadas, que transportam scFv ou ligações de Vhh de camelídeos de células efetoras em terminais N ou C, faz com que a interferência com a ligação de C1q - o principal componente da via complementar e, portanto, pode inibir o CDC. Medimos a atividade CDC de cada uma das IgM e construtos de IgM biespecífico. Como mostrado na Figura 14, descobriu-se que a incorporação da cadeia J modifi-cada não tem, inesperadamente, nenhum efeito prejudicial sobre a atividade de CDC do IgM biespecífico humano, além disso, com os comprimentos de ligantes que foram testados, descobriu-se que os IgM biespecíficos possuem atividade de CDC entre 60-100 vezes aumentada do que a IgG correspondente, em uma base molar (Figura 14).
EXEMPLO 6: Análise de morte de células B dependente de células T por IgM biespecífico em cultura in vitro
[000214] Espera-se que o acoplamento de células T efetoras de anticorpos IgM biespecíficas com uma cadeia J modificada aumente consideravelmente a morte das populações de células B alvo em comparação com o IgM que não possui cadeia J ou cadeia J de tipo selvagem. Para testar a morte de células em co-cultura, foi rea-lizado um ensaio de morte celular, tal como descrito no Exemplo 1. Anticorpo a uma única concentração elevada (100 ng / mL) incubado com as células Raji CD20+ e células T-ALL efetoras CD3+. Como mostrado na Figura 15, IgM biespecífica que transporta CD3 que liga scFv em sua cadeia J é capaz de causar morte completa das células B. A mesma experiência realizada como uma resposta à dose mostra que há uma melhoria superior a 300 vezes em morte de células B em comparação com a IgM que não carrega nenhum scFv capaz de engatar células T. Morte completa das células B por IgM biespecífica é observada a concentrações tão baixas quanto 10 ng / mL.
Exemplo 7: Demonstração de morte de células B dependente de células T in vivo em mo-delo de camundongos NSG
[000215] A fim de testar os IgM biespecficos que foram feitos em um contexto in vivo, realizou-se experimentos com camundongos não-obesos diabéticos com imunodeficiência combinada severa de gama nula (NSG). Estes ratos têm prejudicado gravemente a função imunológica e faltam linfócitos B e T de camundongo. Eles são reconstituídos com células CD34+ humanas de células-tronco para criar ratos com populações de linfócitos essencialmente humanos. Quando CD20 IgM x cadeia J CD3 foi administrado intravenosamente nestes animais a 0,5 mg / kg e sangue total foi obtido e analisado por citometria de fluxo para os níveis de células B humanas em circulação, observou-se a completa depleção da população de células B, mesmo com tratamentos tão curtos quanto 6 horas (Figura 17).
[000216] Embora diversas modalidades tenham sido fornecidas na presente descrição, deve ser entendido que os sistemas e métodos divulgados podem ser realizados de muitas outras formas específicas sem se afastar do escopo ou âmbito da presente descrição. Os presentes exemplos devem ser considerados como ilustrativos e não restritivos, e a intenção não é limitar-se aos detalhes dados neste documento. Vários exemplos de mudanças, substituições e alterações são determi-náveis por aqueles versados na técnica e podem ser feitas sem se afastar do espírito e escopo divulgados neste documento.

Claims (21)

1. Anticorpo IgM, IgA, IgG/IgM ou IgG/IgA CARACTERIZADO pelo fato de que compreende uma cadeia J modificada, em que a cadeia J modificada compreende uma porção de ligação estranha introduzida em uma cadeia J de sequência nativa de SEQ ID NO: 1 em um ou mais dos seguintes locais: (a) em ou dentro de cerca de 10 resíduos de aminoácido do C-termi- nal; (b) em ou dentro de cerca de 10 resíduos de aminoácido do N-termi- nal; ou (c) entre os resíduos de cisteína 92 e 101, em que o anticorpo IgG/IgM ou IgG/IgA é um anticorpo híbrido que tem a capacidade de incorporar e formar polímeros com a cadeia J modificada.
2. Anticorpo IgM, IgA, IgG/IgM ou IgG/IgA, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de que a porção de ligação estranha é um polipeptídeo introduzido na sequência de cadeia J nativa humana de SEQ ID NO: 1 por fusão direta ou indireta.
3. Anticorpo IgM, IgA, IgG/IgM ou IgG/IgA, de acordo com a reivindicação 2, CARACTERIZADO pelo fato de que a porção de ligação estranha é introduzida por fusão indireta por meio de um ligante peptídico.
4. Anticorpo IgM, IgA, IgG/IgM ou IgG/IgA, de acordo com a reivindicação 3, CARACTERIZADO pelo fato de que o referido ligante peptídico tem um comprimento que varia de 1 a 20 aminoácidos.
5. Anticorpo IgM, IgA, IgG/IgM ou IgG/IgA, de acordo com a reivindicação 4, CARACTERIZADO pelo fato de que o referido ligante peptídico é de cerca de 15 a 20 aminoácidos de comprimento.
6. Anticorpo IgM, IgA, IgG/IgM ou IgG/IgA, de acordo com a reivindicação 5, CARACTERIZADO pelo fato de que o referido ligante peptídico é de 15 aminoácidos de comprimento.
7. Anticorpo IgM, IgA, IgG/IgM ou IgG/IgA, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de que a porção de ligação estranha é introduzida na sequência de cadeia J nativa humana de SEQ ID NO: 1 no C- terminal.
8. Anticorpo IgM, IgA, IgG/IgM ou IgG/IgA, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de que a porção de ligação estranha é introduzida na sequência de cadeia J nativa humana de SEQ ID NO: 1 no N- terminal.
9. Anticorpo IgM, IgA, IgG/IgM ou IgG/IgA, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de que a porção de ligação estranha é introduzida na sequência de cadeia J nativa humana da SEQ ID NO: 1 por derivatização química ou quimio-enzimática.
10. Anticorpo IgM, IgA, IgG/IgM ou IgG/IgA, de acordo com a reivindicação 9, CARACTERIZADO pelo fato de que a porção de ligação estranha é introduzida na sequência de cadeia J nativa humana da SEQ ID NO: 1 por um ligante químico.
11. Anticorpo IgM, IgA, IgG/IgM ou IgG/IgA, de acordo com a reivindicação 10, CARACTERIZADO pelo fato de que o ligante é selecionado do grupo que consiste em: propionato de N-succinimidil-3-(2-piridiltio) (SPDP), succinimidil-4-(N-maleimidometil) ciclo-hexano-1-carboxilato (SMCC), penta- noato de N-succinimidil-4-(2-piridiltio) (SPP), iminotiolano (IT), derivados bi- funcionais de imido-ésteres, ésteres ativos, aldeídos, compostos de biazido, derivados de bi-diazônio, di-isocianatos, compostos biativos de flúor e qualquer combinação dos mesmos.
12. Anticorpo IgM, IgA, IgG/IgM ou IgG/IgA, de acordo com a reivindicação 9, CARACTERIZADO pelo fato de que a cadeia J modificada é modificada pela inserção de um sítio de reconhecimento de enzima e pela fixação pós-traducional de uma porção de ligação estranha no sítio de reconhecimento de enzima por meio de um ligante peptídico ou não peptídico.
13. Anticorpo IgM, IgA, IgG/IgM ou IgG/IgA, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de que a porção de ligação estranha é selecionada do grupo que consiste em: anticorpos, fragmentos de ligação ao antígeno de anticorpos, conjugados anticorpo-fármaco, moléculas semelhante a anticorpo, fragmentos de ligação ao antígeno de moléculas semelhantes a anticorpos, proteínas ligadas à membrana e solúveis, ligantes, receptores, partículas semelhante a vírus, toxinas de proteína, enzimas, e arcabouços alternativos.
14. Anticorpo IgM, IgA, IgG/IgM ou IgG/IgA, de acordo com a reivindicação 13, CARACTERIZADO pelo fato de que o arcabouço alternativo é selecionado do grupo que consiste em: darpinas, domínios de fibronectina, ad- nectinas e knottinas.
15. Anticorpo IgM, IgA, IgG/IgM ou IgG/IgA, de acordo com a reivindicação 13, CARACTERIZADO pelo fato de que a porção de ligação estranha compreende um fragmento de ligação ao antígeno selecionado do grupo que consiste em: F(ab')2, F(ab)2, Fab', Fab, Fv, scFv, e anticorpo de domínio único.
16. Anticorpo IgM, IgA, IgG/IgM ou IgG/IgA, de acordo com a reivindicação 15, CARACTERIZADO pelo fato de que a porção de ligação estranha compreende um fragmento de ligação ao antígeno que é um scFv.
17. Anticorpo IgM, IgA, IgG/IgM ou IgG/IgA, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de que é um anticorpo IgA.
18. Anticorpo IgM, IgA, IgG/IgM ou IgG/IgA, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de que é monoespecífico.
19. Anticorpo IgM, IgA, IgG/IgM ou IgG/IgA, de acordo com a reivindicação 18, CARACTERIZADO pelo fato de que ébiespecífico.
20. Anticorpo IgM, IgA, IgG/IgM ou IgG/IgA, de acordo com a reivindicação 18, CARACTERIZADO pelo fato de que é multiespecífico.
21. Anticorpo IgM, IgA, IgG/IgM ou IgG/IgA, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de que compreende ainda uma porção de ligação estranha adicional, em que a porção de ligação estranha adicional é um polipeptídeo introduzido na sequência de cadeia J nativa humana de SEQ ID NO: 1 por fusão direta ou indireta.
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