CN105001334A - Cd20抗体及其用途 - Google Patents

Cd20抗体及其用途 Download PDF

Info

Publication number
CN105001334A
CN105001334A CN201510382067.0A CN201510382067A CN105001334A CN 105001334 A CN105001334 A CN 105001334A CN 201510382067 A CN201510382067 A CN 201510382067A CN 105001334 A CN105001334 A CN 105001334A
Authority
CN
China
Prior art keywords
antibody
fragment
cell
antibodies
acid
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN201510382067.0A
Other languages
English (en)
Inventor
J·德克尔特
芮凌云
P·U·帕克
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Iminokin
Original Assignee
Iminokin
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Iminokin filed Critical Iminokin
Publication of CN105001334A publication Critical patent/CN105001334A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2887—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against CD20
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
    • A61K39/39533—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum against materials from animals
    • A61K39/39541—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum against materials from animals against normal tissues, cells
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6801—Drug-antibody or immunoglobulin conjugates defined by the pharmacologically or therapeutically active agent
    • A61K47/6803—Drugs conjugated to an antibody or immunoglobulin, e.g. cisplatin-antibody conjugates
    • A61K47/6811—Drugs conjugated to an antibody or immunoglobulin, e.g. cisplatin-antibody conjugates the drug being a protein or peptide, e.g. transferrin or bleomycin
    • A61K47/6817—Toxins
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6801—Drug-antibody or immunoglobulin conjugates defined by the pharmacologically or therapeutically active agent
    • A61K47/6803—Drugs conjugated to an antibody or immunoglobulin, e.g. cisplatin-antibody conjugates
    • A61K47/6811—Drugs conjugated to an antibody or immunoglobulin, e.g. cisplatin-antibody conjugates the drug being a protein or peptide, e.g. transferrin or bleomycin
    • A61K47/6817—Toxins
    • A61K47/6819—Plant toxins
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6835—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site
    • A61K47/6849—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site the antibody targeting a receptor, a cell surface antigen or a cell surface determinant
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K51/00—Preparations containing radioactive substances for use in therapy or testing in vivo
    • A61K51/02—Preparations containing radioactive substances for use in therapy or testing in vivo characterised by the carrier, i.e. characterised by the agent or material covalently linked or complexing the radioactive nucleus
    • A61K51/04—Organic compounds
    • A61K51/08—Peptides, e.g. proteins, carriers being peptides, polyamino acids, proteins
    • A61K51/10—Antibodies or immunoglobulins; Fragments thereof, the carrier being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. a camelised human single domain antibody or the Fc fragment of an antibody
    • A61K51/1027—Antibodies or immunoglobulins; Fragments thereof, the carrier being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. a camelised human single domain antibody or the Fc fragment of an antibody against receptors, cell-surface antigens or cell-surface determinants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A61P1/04—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system for ulcers, gastritis or reflux esophagitis, e.g. antacids, inhibitors of acid secretion, mucosal protectants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A61P1/16—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system for liver or gallbladder disorders, e.g. hepatoprotective agents, cholagogues, litholytics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P11/00—Drugs for disorders of the respiratory system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P11/00—Drugs for disorders of the respiratory system
    • A61P11/06—Antiasthmatics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P13/00—Drugs for disorders of the urinary system
    • A61P13/12—Drugs for disorders of the urinary system of the kidneys
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
    • A61P17/06—Antipsoriatics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
    • A61P19/02—Drugs for skeletal disorders for joint disorders, e.g. arthritis, arthrosis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P21/00—Drugs for disorders of the muscular or neuromuscular system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P21/00—Drugs for disorders of the muscular or neuromuscular system
    • A61P21/04—Drugs for disorders of the muscular or neuromuscular system for myasthenia gravis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P27/00—Drugs for disorders of the senses
    • A61P27/02—Ophthalmic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A61P3/08—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis
    • A61P3/10—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis for hyperglycaemia, e.g. antidiabetics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
    • A61P31/18—Antivirals for RNA viruses for HIV
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/20—Antivirals for DNA viruses
    • A61P31/22—Antivirals for DNA viruses for herpes viruses
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A61P35/02—Antineoplastic agents specific for leukemia
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A61P37/06—Immunosuppressants, e.g. drugs for graft rejection
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/08—Antiallergic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P5/00—Drugs for disorders of the endocrine system
    • A61P5/14—Drugs for disorders of the endocrine system of the thyroid hormones, e.g. T3, T4
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
    • A61P7/02—Antithrombotic agents; Anticoagulants; Platelet aggregation inhibitors
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
    • A61P7/04—Antihaemorrhagics; Procoagulants; Haemostatic agents; Antifibrinolytic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
    • A61P7/06—Antianaemics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A61P9/10—Drugs for disorders of the cardiovascular system for treating ischaemic or atherosclerotic diseases, e.g. antianginal drugs, coronary vasodilators, drugs for myocardial infarction, retinopathy, cerebrovascula insufficiency, renal arteriosclerosis
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/30—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants from tumour cells
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/574—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer
    • G01N33/57407—Specifically defined cancers
    • G01N33/57426—Specifically defined cancers leukemia
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
    • C07K2317/21—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin from primates, e.g. man
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
    • C07K2317/24—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin containing regions, domains or residues from different species, e.g. chimeric, humanized or veneered
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/73—Inducing cell death, e.g. apoptosis, necrosis or inhibition of cell proliferation
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/73—Inducing cell death, e.g. apoptosis, necrosis or inhibition of cell proliferation
    • C07K2317/732—Antibody-dependent cellular cytotoxicity [ADCC]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/73—Inducing cell death, e.g. apoptosis, necrosis or inhibition of cell proliferation
    • C07K2317/734—Complement-dependent cytotoxicity [CDC]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/76—Antagonist effect on antigen, e.g. neutralization or inhibition of binding
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
    • C07K2317/92—Affinity (KD), association rate (Ka), dissociation rate (Kd) or EC50 value
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/55—Fusion polypeptide containing a fusion with a toxin, e.g. diphteria toxin
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/40—Regulators of development
    • C12N2501/48—Regulators of apoptosis

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Diabetes (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Pulmonology (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Optics & Photonics (AREA)
  • Hospice & Palliative Care (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)

Abstract

CD20是在B细胞表面表达的四穿膜蛋白家族的跨膜蛋白，并且已在来自周围血以及淋巴组织的B细胞上发现。CD20表达从早期前B细胞阶段持续至浆细胞分化阶段。相反，并未在造血干细胞、祖B细胞、分化浆细胞或非淋巴组织上发现CD20。除在正常B细胞中表达外，CD20还在例如非霍奇金氏淋巴瘤(NHL)和B细胞慢性淋巴细胞性白血病(CLL)等B细胞源性恶性肿瘤中表达。已知表达CD20的细胞在包括炎症的其它疾病和病症中起作用。本发明包括具有优良物理和功能特性的抗CD20抗体、形式和片段；免疫偶联物、组合物、诊断试剂、抑制生长的方法、治疗方法、改良的抗体和细胞系；和编码CD20的多核苷酸、载体和基因构建体。

Description

CD20抗体及其用途
本申请是申请日为2011年02月10日和发明名称为“CD20抗体及其用途”的201180013918.4号发明专利申请的分案申请。
发明背景
CD20和CD20同种型(“CD20”)通常被鉴别为在B细胞表面表达的四穿膜蛋白家族的跨膜蛋白(Valentine等，J.Biol.Chem.,264(19):11282-11287(1989)；Einfeld等，EMBO J.,7(3):711-717(1988))。CD20由绝大多数周围血B细胞以及来自各种淋巴组织的B细胞表达。CD20表达通常从发育的早期前B细胞阶段持续至发育的浆细胞分化阶段(Tedder等，J.Immunol.,135(2):973-979(1985))。CD20通常并非由造血干细胞、祖B细胞、分化浆细胞或非淋巴组织等表达。除在正常B细胞中表达外，CD20还在例如非霍奇金氏淋巴瘤(NHL)和B细胞慢性淋巴细胞性白血病(CLL)等B细胞源性恶性肿瘤(Anderson等，Blood,63(6):1424-1433(1984))和涉及免疫病症、自身免疫性疾病和炎症性疾病的B细胞中表达。
虽然CD20的确切功能不清楚，但是CD20参与钙动员并且可能起钙通道的功能(Tedder等，J.Cell Biochem.,14D:195(1990))。CD20可能参与B细胞的激活和分化(Tedder等，Eur.J.Immunol.,16(8):881-887(1986))。
CD20的表达谱和现有CD20抗体的了解已使CD20成为抗体疗法的目标靶。在本领域中已知，通常根据功能性质为CD20抗体分类。例如，I型抗体特征在于其将CD20分布于脂筏区室的能力，并且当嵌合时，I型抗体可介导补体依赖的细胞毒性(“CDC”)(Deans JP,J Biol Chem 1998；273:344-8；Cragg MS,Blood 2003；101:1045-52；和Cragg MS Blood.2004；103:2738-2743)。I型抗体通常本身并不具有有效的促凋亡活性，除非抗体交联。需要交联的I型抗体的实例为利妥昔单抗和2F2(Cragg等，Blood,101(3):1045-1052(2003)； 和Teeling等，Blood,104(6):1793-1800(2004))。相反，II型抗体不能将CD20分布至脂筏内。如果嵌合，II型抗体具有有限的CDC活性。II型抗体特征在于其促凋亡活性强。B1和GA101为II型抗体的实例(Cragg MS，Blood 2003；101:1045-52；Cragg MS Blood.2004；103:2738-2743)；和Umana等，Blood,108:72a,Abstract 229(2006))。I型和II型抗体可能潜在地介导抗体依赖细胞介导的细胞毒性(ADCC)。
考虑到例如B细胞淋巴瘤中的有害细胞表达CD20，这种抗原用于靶向有害CD20阳性细胞(例如，淋巴瘤细胞)。其实，这种靶向概括如下：向患者施用对B细胞的CD20表面抗原有特异性的抗体。这些抗CD20抗体特异性结合正常和有害(例如，恶性和免疫反应性)B细胞的CD20抗原；与CD20表面抗原结合的抗体可能导致B细胞破坏和去除。
另外，具有破坏CD20表达肿瘤细胞的潜能的化学试剂或放射性标记可与抗CD20抗体偶联，以致将所述试剂特异性“递送”至赘生性B细胞。不论采用哪种方法，主要目标是破坏有害细胞；可通过利用的特定抗CD20抗体确定具体方法，并且因此，靶向CD20抗原的可用方法可变化相当大。利妥昔单抗()抗体为针对CD20的基因工程化嵌合鼠/人单克隆抗体。利妥昔单抗是美国专利No.5,736,137(Anderson等)中称为“C2B8”的抗体。现批准了利妥昔单抗用于治疗复发或难治性滤泡性淋巴瘤(Leget等，Curr.Opin.Oncol.,10:548-551(1998))。报道指出经每周输注，利妥昔单抗引起48％的总反应率。然而，许多患者对利妥昔单抗治疗并不反应并且服用利妥昔单抗有反应患者最终复发并且常发展对利妥昔单抗治疗的抗性。例如，复发和对现有可用疗法的抗性使得发明新的CD20定向试剂和疗法成为必需。
由于可用抗体有限，正在研发下一代CD20抗体疗法，旨在提高利妥昔单抗的特定功能方面。例如，在ofatumumab的情况下，特别是在具有较低CD20抗原密度的细胞中，报道了体外CDC活性增强的人单克隆2F2抗体(Teeling等，J.Immunol.,177(1):362-371(2006))。已报道阿夫土珠(Afutuzumab)或GA101在体外具有比利妥昔单抗略高的促凋亡活性，但是GA101不能证明CDC活性(Umana P，Blood 2006；108:72a,Abstract 229和WO 2005/044859)。 另外，GA101是ADCC活性提高的糖基工程化的人源化抗体(Umana等，Blood 2006；108:72a,Abstract 229；和WO 2005/044859)。已报道在发育的不同阶段中，其它化合物略微提高了利妥昔单抗或其它已知抗CD20抗体的某些固有特性。然而，到现在为止，没有解决本领域中已知问题的具有独特物理和功能特征的新型分子可用。
在美国还已批准利妥昔单抗联合MTX减轻对至少一种TNF拮抗剂反应不充分的中度至重度活性RA成年患者的病征和症状。许多研究致力于利妥昔单抗在各种非恶性自身免疫性或炎症性病症(包括RA)中的用途，其中B细胞和自身抗体似乎在疾病病理生理学上起作用。Edwards等，Biochem Soc.Trans.30:824-828(2002)。已报道使用抗CD20抗体靶向CD20可能缓解以下疾病的病征和症状，例如RA(Leandro等，Ann.Rheum.Dis.61:883-888(2002)；Edwards等，Arthritis Rheum.,46(Suppl.9):S46(2002)；Stahl等，Ann.Rheum.Dis.,62(Suppl.1):OP004(2003)；Emery等，Arthritis Rheum.48(9):S439(2003))、狼疮(Eisenberg，Arthritis.Res.Ther.5:157-159(2003)；Leandro等，Arthritis Rheum.46:2673-2677(2002)；Gorman等，Lupus,13:312-316(2004))、免疫性血小板减少性紫癜(D'Arena等，Leuk.Lymphoma 44:561-562(2003)；Stasi等，Blood,98:952-957(2001)；Saleh等，Semin.Oncol.,27(Supp 12):99-103(2000)；Zaja等，Haematologica,87:189-195(2002)；Ratanatharathorn等，Ann.Int.Med.,133:275-279(2000))、纯红细胞再生障碍(Auner等，Br.J.Haematol.,116:725-728(2002))、自身免疫性贫血(Zaja等，如上(Haematologica 87:336(2002)中出现勘误)、冷凝集素病(Layios等，Leukemia,15:187-8(2001)；Berentsen等，Blood,103:2925-2928(2004)；Berentsen等，Br.J.Haematol.,115:79-83(2001)；Bauduer,Br.J.Haematol.,112:1083-1090(2001)；Zaja等，Br.J.Haematol.,115:232-233(2001))、严重胰岛素抗性的B型综合征(Coll等，N.Engl.J.Med.,350:310-311(2004)、混合性冷球蛋白血症(DeVita等，Arthritis Rheum.46 Suppl.9:S206/S469(2002))、重症肌无力(Zaja等，Neurology,55:1062-1063(2000)；Wylam等，J.Pediatr.,143:674-677(2003))、韦格纳肉芽肿(Specks等，Arthritis&Rheumatism 44:2836-2840(2001))、难治性寻常型天疱疮(Dupuy等，Arch Dermatol.,140:91-96(2004))、皮肌炎(Levine，Arthritis  Rheum.,46(Suppl.9):S1299(2002))、干燥综合征(Somer等，Arthritis&Rheumatism,49:394-398(2003))、活性II型混合性冷球蛋白血症(Zaja等，Blood,101:3827-3834(2003))、寻常型天疱疮(Dupay等，Arch.Dermatol.,140:91-95(2004))、自身免疫性神经病(Pestronk等，J.Neurol.Neurosurg.Psychiatry 74:485-489(2003))、副肿瘤性眼阵挛-肌阵挛综合征(Pranzatelli等，Neurology 60(Suppl.1)PO5.128:A395(2003))和复发缓解型多发性硬化(RRMS)。Cross等(摘要)"Preliminary Results from a Phase II Trial of Rituximab in MS"Eighth Annual Meeting of the Americas Committees for Research and Treatment in Multiple Sclerosis,20-21(2003)。
关于CD20抗体、CD20结合分子和自身抗原疫苗的专利和专利公布包括美国专利No.5,776,456、5,736,137、5,843,439、6,399,061和6,682,734以及US 2002/0197255、US 2003/0021781、US 2003/0082172、US 2003/0095963、US 2003/0147885、US 2005/0186205和WO 1994/11026(Anderson等)；美国专利No.6,455,043、US 2003/0026804、US 2003/0206903和WO 2000/09160(Grillo-Lopez,A.)；WO 2000/27428(Grillo-Lopez和White)；US 2004/0213784和WO 2000/27433(Grillo-Lopez和Leonard)；WO 2000/44788(Braslawsky等)；WO 2001/10462(Rastetter,W.)；WO 2001/10461(Rastetter和White)；WO 2001/10460(White和Grillo-Lopez)；US 2001/0018041、US 2003/0180292、US 2002/0028178、WO 2001/34194和WO 2002/22212(Hanna和Hariharan)；US 2002/0006404和WO 2002/04021(Hanna和Hariharan)；US 2002/0012665、US 2005/0180975、WO 2001/74388和美国专利No.6,896,885B5(Hanna,N.)；US 2002/0058029(Hanna,N.)；US 2003/0103971(Hariharan和Hanna)；US 2005/0123540(Hanna等)；US 2002/0009444和WO 2001/80884(Grillo-Lopez,A.)；WO 2001/97858；US 2005/0112060、US 2002/0039557和美国专利No.6,846,476(White,C.)；US 2002/0128448和WO 2002/34790(Reff,M.)；WO 2002/060955(Braslawsky等)；WO 2002/096948(Braslawsky等)；WO 2002/079255(Reff和Davies)；美国专利No.6,171,586和6,991,790和WO 1998/56418(Lam等)；US 2004/0191256和WO 1998/58964(Raju,S.)；WO 1999/22764(Raju,S.)；WO 1999/51642、美国 专利No.6,194,551、美国专利No.6,242,195、美国专利No.6,528,624和美国专利No.6,538,124(Idusogie等)；美国专利No.7,122,637、US 2005/0118174、US 2005/0233382、US 2006/0194291、US 2006/0194290、US 2006/0194957和WO 2000/42072(Presta,L.)；WO 2000/67796(Curd等)；WO 2001/03734(Grillo-Lopez等)；US 2002/0004587、US 2006/0025576和WO 2001/77342(Miller和Presta)；US 2002/0197256和WO 2002/078766(Grewal,I.)；US 2003/0157108和WO 2003/035835(Presta,L.)；美国专利No.5,648,267、5,733,779、6,017,733和6,159,730和WO 1994/11523(Reff等)；美国专利No.6,565,827、6,090,365、6,287,537、6,015,542、5,843,398和5,595,721(Kaminski等)；美国专利No.5,500,362、5,677,180、5,721,108、6,120,767、6,652,852和6,893,625以及WO 1988/04936(Robinson等)；美国专利No.6,410,391(Zelsacher)；美国专利No.6,224,866和WO00/20864(Barbera-Guillem,E.)；WO 2001/13945(Barbera-Guillem,E.)；WO 2000/67795(Goldenberg)；美国专利No.7,074,403(Goldenberg和Hansen)；美国专利No.7,151,164(Hansen等)；US 2003/0133930；WO 2000/74718和US 2005/0191300A1(Goldenberg和Hansen)；US 2003/0219433和WO 2003/68821(Hansen等)；WO 2004/058298(Goldenberg和Hansen)；WO 2000/76542(Golay等)；WO 2001/72333(Wolin和Rosenblatt)；美国专利No.6,368,596(Ghetie等)；美国专利No.6,306,393和US 2002/0041847(Goldenberg,D.)；US 2003/0026801(Weiner和Hartmann)；WO 2002/102312(Engleman,E.)；US 2003/0068664(Albitar等)；WO 2003/002607(Leung,S.)；WO 2003/049694、US 2002/0009427和US 2003/0185796(Wolin等)；WO 2003/061694(Sing和Siegall)；US 2003/0219818(Bohen等)；US 2003/0219433和WO 2003/068821(Hansen等)；US 2003/0219818(Bohen等)；US 2002/0136719(Shenoy等)；WO 2004/032828和US 2005/0180972(Wahl等)；和WO 2002/56910(Hayden-Ledbetter)。同样见美国专利No.5,849,898和EP 330,191(Seed等)；EP332,865A2(Meyer和Weiss)；美国专利No.4,861,579(Meyer等)；US 2001/0056066(Bugelski等)；WO 1995/03770(Bhat等)；US 2003/0219433A1(Hansen等)；WO 2004/035607和US 2004/167319(Teeling等)；WO 2005/103081(Teeling等)；US 2006/0034835、 US 2006/0024300和WO 2004/056312(Lowman等)；US 2004/0093621(Shitara等)；WO 2004/103404(Watkins等)；WO 2005/000901(Tedder等)；US 2005/0025764(Watkins等)；US 2006/0251652(Watkins等)；WO 2005/016969(Carr等)；US 2005/0069545(Carr等)；WO 2005/014618(Chang等)；US 2005/0079174(Barbera-Guillem和Nelson)；US 2005/0106108(Leung和Hansen)；US 2005/0123546(Umana等)；US 2004/0072290(Umana等)；US 2003/0175884(Umana等)；和WO 2005/044859(Umana等)；WO 2005/070963(Allan等)；US 2005/0186216(Ledbetter和Hayden-Ledbetter)；US 2005/0202534(Hayden-Ledbetter和Ledbetter)；US 2005/136049(Ledbetter等)；US 2003/118592(Ledbetter等)；US 2003/133939(Ledbetter和Hayden-Ledbetter)；US 2005/0202012(Ledbetter和Hayden-Ledbetter)；US 2005/0175614(Ledbetter和Hayden-Ledbetter)；US 2005/0180970(Ledbetter和Hayden-Ledbetter)；US 2005/0202028(Hayden-Ledbetter和Ledbetter)；US 2005/0202023(Hayden-Ledbetter和Ledbetter)；WO 2005/017148(Ledbetter等)；WO 2005/037989(Ledbetter等)；美国专利No.6,183,744(Goldenberg)；美国专利No.6,897,044(Braslawski等)；WO 2006/005477(Krause等)；US 2006/0029543(Krause等)；US 2006/0018900(McLCCormick等)；US 2006/0051349(Goldenberg和Hansen)；WO 2006/042240(Iyer和Dunussi-Joannopoulos)；US 2006/0121032(Dahiyat等)；WO 2006/064121(Teillaud等)；US 2006/0153838(Watkins),CN 1718587(Chen等)；WO 2006/084264(Adams等)；US 2006/0188495(Barron等)；US 2004/0202658和WO 2004/091657(Benynes,K.)；US 2005/0095243、US 2005/0163775、WO 2005/00351和WO 2006/068867(Chan,A.)；US 2006/0135430和WO 2005/005462(Chan等)；US 2005/0032130和WO 2005/017529(Beresini等)；US 2005/0053602和WO 2005/023302(Brunetta,P.)；US 2006/0179501和WO 2004/060052(Chan等)；WO 2004/060053(Chan等)；US 2005/0186206和WO 2005/060999(Brunetta,P.)；US 2005/0191297和WO 2005/061542(Brunetta,P.)；US 2006/0002930和WO 2005/115453(Brunetta等)；US 2006/0099662和WO 2005/108989(Chuntharapai等)；CN 1420129A(Zhongxin Guojian Pharmaceutical)；US 2005/0276803和WO 2005/113003(Chan等)；US  2005/0271658和WO 2005/117972(Brunetta等)；US 2005/0255527和WO 2005/11428(Yang,J.)；US 2006/0024295和WO 2005/120437(Brunetta,P.)；US 2006/0051345和WO 2005/117978(Frohna,P.)；US 2006/0062787和WO 2006/012508(Hitraya,E.)；US 2006/0067930和WO 2006/31370(Lowman等)；WO 2006/29224(Ashkenazi,A.)；US 2006/0110387和WO 2006/41680(Brunetta,P.)；US 2006/0134111和WO 2006/066086(Agarwal,S.)；WO 2006/069403(Ernst和Yansura)；US 2006/0188495和WO 2006/076651(Dummer,W.)；WO 2006/084264(Lowman,H.)；WO 2006/093923(Quan和Sewell)；WO 2006/106959(Numazaki等)；WO 2006/126069(Morawala)；WO 2006/130458(Gazit-Bornstein等)；US 2006/0275284(Hanna,G.)；US 2007/0014785(Golay等)；US 2007/0014720(Gazit-Bornstein等)；和US 2007/0020259(Hansen等)；US 2007/0020265(Goldenberg和Hansen)；US 2007/0014797(Hitraya)；US 2007/0224189(Lazar等)；和WO 2008/003319(Parren和Baadsgaard)。
关于用抗CD20抗体治疗的一些科学出版物包括：Perotta和Abuel，"Response of chronic relapsing ITP of 10years duration to rituximab"Abstract#3360Blood,10(1)(第1-2部分):88B(1998)；Perotta等，"Rituxan in the treatment of chronic idiopathic thrombocytopaenic purpura(ITP)"，Blood,94:49(摘要)(1999)；Matthews,R.，"Medical Heretics"New Scientist，(2001年4月7日)；Leandro等，"Clinical outcome in 22patients with rheumatoid arthritis treated with B lymphocyte depletion"Ann Rheum Dis.，见上文；Leandro等，"Lymphocyte depletion in rheumatoid arthritis:early evidence for safety,efficacy and dose response"Arthritis and Rheumatism,44(9):S370(2001)；Leandro等，"An open study of B lymphocyte depletion in systemic lupus erythematosus"Arthritis and Rheumatism,46:2673-2677(2002)，其中在两周期间，每个患者接受两次500mg CD20抗体输注，两次750mg环磷酰胺输注和高剂量口服皮质类固醇，并且其中两名经治疗的患者分别在第7个和第8个月治疗复发，并且虽然用不同方法，但是已经再次治疗；"Successful long-term treatment of systemic lupus erythematosus with rituximab maintenance therapy"Weide等，Lupus,12:779-782 (2003)，其中用抗CD20抗体治疗患者(375mg/m2x4，每隔一周重复一次)，每隔5-6个月再进行一次抗体应用，然后按375mg/m2每隔3个月用抗体接受维持治疗，并且用抗CD20抗体利妥昔单抗治疗第二名难治性SLE患者并且每隔3个月继续接受维持治疗；Edwards和Cambridge，"Sustained improvement in rheumatoid arthritis following a protocol designed to deplete B lymphocytes"Rheumatology,40:205-211(2001)；Cambridge等，"B lymphocyte depletion in patients with rheumatoid arthritis:serial studies of immunological parameters"Arthritis Rheum.,46(Suppl.9):S1350(2002)；Cambridge等，"Serologic changes following B lymphocyte depletion therapy for rheumatoid arthritis"Arthritis Rheum.,48:2146-2154(2003)；Edwards等，"B-lymphocyte depletion therapy in rheumatoid arthritis and other autoimmune disorders"Biochem Soc.Trans.，见上文；Edwards等，"Efficacy and safety of rituximab,a B-cell targeted chimeric monoclonal antibody:A randomized,placebo controlled trial in patients with rheumatoid arthritis,“Arthritis and Rheumatism,46(9):S197(2002)；Edwards等，"Efficacy of B-cell-targeted therapy with rituximab in patients with rheumatoid arthritis"N Engl.J.Med.,350:2572-2582(2004)；Pavelka等，Ann.Rheum.Dis.,63:(S1):289-290(2004)；Emery等，Arthritis Rheum.50(S9):S659(2004)；Levine和Pestronk，"IgM antibody-related polyneuropathies:B-cell depletion chemotherapy using rituximab"Neurology,52:1701-1704(1999)；Uchida等，"The innate mononuclear phagocyte network depletes B lymphocytes through Fc receptor-dependent mechanisms during anti-CD20antibody immunotherapy"J.Exp.Med.,199:1659-1669(2004)；Gong等，"Importance of cellular microenvironment and circulatory dynamics in B cell immunotherapy"J.Immunol.,174:817-826(2005)；Hamaguchi等，"The peritoneal cavity provides a protective niche for B1 and conventional B lymphocytes during anti-CD20immunotherapy in mice"J.Immunol.,174:4389-4399(2005)；Cragg等，"The biology of CD20and its potential as a target for mAb therapy"Curr.Dir.Autoimmun.,8:140-174(2005)；Eisenberg，"Mechanisms of autoimmunity"Immunol.Res.,27:203-218(2003)；DeVita等，"Efficacy of selective B cell blockade in the treatment of rheumatoid arthritis"Arthritis&Rheum, 46:2029-2033(2002)；Higashida等，"Treatment of DMARD-refractory rheumatoid arthritis with rituximab"Annual Scientific Meeting of the American College of Rheumatology(Abstract#LB11),New Orleans,La.(2002年10月)；Tuscano，"Successful treatment of infliximab-refractory rheumatoid arthritis with rituximab"Annual Scientific Meeting of the American College of Rheumatology,New Orleans,La.(2002年10月)，出版为Tuscano，Arthritis Rheum.46:3420(2002)；"Pathogenic roles of B cells in human autoimmunity；insights from the clinic"Martin和Chan，Immunity,20:517-527(2004)；Silverman和Weisman，"rituximab therapy and autoimmune disorders,prospects for anti-B cell therapy"，Arthritis and Rheumatism,48:1484-1492(2003)；Kazkaz和Isenberg，"Anti B cell therapy(rituximab)in the treatment of autoimmune diseases"Current Opinion in Pharmacology,4:398-402(2004)；Virgolini和Vanda，"rituximab in autoimmune diseases"Biomedicine&Pharmacotherapy,58:299-309(2004)；Klemmer等，"Treatment of antibody mediated autoimmune disorders with an AntiCD20monoclonal antibody rituximab"Arthritis And Rheumatism,48(9)(SEP):S624-S624(2003)；Kneitz等，"Effective B cell depletion with rituximab in the treatment of autoimmune diseases"Immunobiology,206:519-527(2002)；Arzoo等，"Treatment of refractory antibody mediated autoimmune disorders with an anti-CD 20monoclonal antibody(rituximab)"Annals of the Rheumatic Diseases,61(10):922-924(2002)Comment in Ann.Rheum.Dis.61:863-866(2002)；"Future strategies in immunotherapy"，Lake和Dionne，Burger's Medicinal Chemistry and Drug Discovery中(John Wiley&Sons,Inc.,2003)(第2章"Antibody-Directed Immunotherapy")；Liang和Tedder，Wiley Encyclopedia of Molecular Medicine,Section:CD20as an Immunotherapy Target(2002)；附件4A标题为"Monoclonal Antibodies to Human Cell Surface Antigens"，Stockinger等编：Coligan等，Current Protocols in Immunology中(John Wiley&Sons,Inc.,2003)；Penichet和Morrison，"CD Antibodies/molecules:Definition；Antibody Engineering"，Wiley Encyclopedia of Molecular Medicine Section中：Chimeric,Humanized and Human Antibodies(2002)。
进一步地，见Looney，"B cells as a therapeutic target in autoimmune diseases other than rheumatoid arthritis"Rheumatology,44Suppl.2:ii13-ii17(2005)；Chambers和Isenberg，"Anti-B cell therapy(rituximab)in the treatment of autoimmune diseases"Lupus,14(3):210-214(2005)；Looney等，"B-cell depletion as a novel treatment for systemic lupus erythematosus:a phase I/II dose-escalating trial of rituximab"Arthritis Rheum.,50:2580-2589(2004)；Looney，"Treating human autoimmune disease by depleting B cells"Ann Rheum.Dis.,61:863-866(2002)；Edelbauer等，"Rituximab in childhood systemic lupus erythematosus refractory to conventional immunosuppression Case report"Pediatr.Nephrol.,20(6):811-813(2005)；D'Cruz和Hughes，"The treatment of lupus nephritis"BMJ,330(7488):377-378(2005)；Looney，"B cell-targeted therapy in diseases other than rheumatoid arthritis"J.Rheumatol.Suppl.,73:25-28-讨论29-30(2005)；Sfikakis等，"Remission of proliferative lupus nephritis following B cell depletion therapy is preceded by down-regulation of the T cell costimulatory molecule CD40ligand:an open-label trial"Arthritis Rheum.,52(2):501-513(2005)；Rastetter等，"Rituximab:expanding role in therapy for lymphomas and autoimmune diseases"Annu.Rev.Med.,55:477-503(2004)；Silverman，"Anti-CD20therapy in systemic lupus erythematosus:a step closer to the clinic"Arthritis Rheum.,52(2):371-377(2005)，Arthritis Rheum.52(4):1342(2005)中勘误；Ahn等，"Long-term remission from life-threatening hypercoagulable state associated with lupus anticoagulant(LA)following rituximab therapy"Am.J.Hematol.,78(2):127-129(2005)；Tahir等，"Humanized anti-CD20monoclonal antibody in the treatment of severe resistant systemic lupus erythematosus in a patient with antibodies against rituximab"Rheumatology,44(4):561-562(2005)，2005年1月11日电子出版；Looney等，"Treatment of SLE with anti CD20monoclonal antibody"Curr.Dir.Autoimmun.,8:193-205(2005)；Cragg等，"The biology of CD20and its potential as a target for mAb therapy"Curr.Dir.Autoimmun.,8:140-174(2005)；Gottenberg等，"Tolerance and short term efficacy of rituximab in 43patients with systemic autoimmune diseases"Ann.Rheum.Dis.,64(6):913-920(2005)2004年11月18日电子出版；Tokunaga等，"Down-regulation of CD40and CD80on B cells in  patients with life-threatening systemic lupus erythematosus after successful treatment with rituximab"Rheumatology 44(2):176-182(2005)，2004年10月19日电子出版。同样见Leandro等，"B cell repopulation occurs mainly from naive B cells in patient with rheumatoid arthritis and systemic lupus erythematosus"Arthritis Rheum.,48(Suppl.9):S1160(2003)。
同样见，Specks等"Response of Wegener’s granulomatosis to anti-CD20chimeric monoclonal antibody therapy"Arthritis&Rheumatism,44(12):2836-2840(2001)，其公开了使用4次输注375mg/m2的抗CD20抗体和高剂量糖皮质激素治疗韦格纳肉芽肿。当cANCA复发时在11个月后重复治疗，但是不用糖皮质激素治疗。在抗CD20抗体第二个疗程后第8个月，患者的疾病处于完全缓解。在另一项研究中报道了严重ANCA相关脉管炎缓解，当按375mg/m2×4的剂量与1mg/kg/天的口服强的松一起使用时，到第4周减少到40mg/天，并且在接下来的16周后完全终止。4名患者用单独的重现/升高ANCA滴度的抗CD20抗体再次治疗。Keogh等，Kidney Blood Press.Res.,26:293(2003)报道，11名难治性ANCA相关脉管炎患者在经4次每周一次375mg/m2剂量的抗CD20抗体和高剂量糖皮质激素治疗后缓解。
向难治性ANCA相关脉管炎患者施用抗CD20抗体连同免疫抑制药剂，例如静脉内环磷酰胺、吗替麦考酚酯、硫唑嘌呤或来氟米特。Eriksson，"Short-term outcome and safety in 5patients with ANCA-positive vasculitis treated with rituximab"Kidney and Blood Pressure Research,26:294(2003)(其中5名ANCA相关脉管炎患者用375mg/m2抗CD20抗体治疗4周，每周一次)；Jayne等，"B-cell depletion with rituximab for refractory vasculitis"Kidney and Blood Pressure Research,26:294-295(2003)(6名难治性脉管炎患者接受4次每周一次的375mg/m2抗CD20抗体和环磷酰胺输注，伴有本底免疫抑制和强的松龙经历的脉管炎活性变化)。Smith和Jayne，"A prospective,open label trial of B-cell depletion with rituximab in refractory systemic vasculitis"海报998(第11次国际脉管炎和ANCA学术讨论会)，American Society of Nephrology,J.Am.Soc.Nephrol.,14:755A(2003)中提供了按375mg/m2/剂量，4次剂量，连同使用静脉内环磷酰胺与抗CD20抗体向难治性系统性脉管炎患者施用。同样见 Eriksson,J.Internal Med.,257:540-548(2005)，关于9名ANCA阳性脉管炎患者经2次或4次500mg周剂量的抗CD20抗体治疗；和Keogh等，Arthritis and Rheumatism,52:262-268(2005)，报道了11名难治性ANCA相关脉管炎患者，据报道经4次375mg/m2周剂量的抗CD20抗体治疗或再次治疗诱导因B淋巴细胞去除而缓解。
至于人源化抗CD20抗体的活性，见，例如，Vugmeyster等，"Depletion of B cells by a humanized anti-CD20antibody PRO70769in Macaca fascicularis,"J.Immunother.,28:212-219(2005)。对于人单克隆抗体的讨论，见Baker等，"Generation and characterization of LymphoStat-B,a human monoclonal antibody that antagonizes the bioactivities of B lymphocyte stimulator,"Arthritis Rheum.,48:3253-3265(2003)。用抗CD20抗体进行MINT试验，包括治疗年轻患者的侵袭性非霍奇金淋巴瘤。Pfreundschuh等，Lancet Oncology,7(5):379-391(2006)。
抗体-细胞毒性剂偶联物(或“ACC”)，也称为抗体-药物偶联物(ADC)，已知是一类由通过特化化学连接子与抗体共价连接的细胞毒性剂组成的免疫偶联物。在癌症治疗中使用ACC局部递送细胞毒性剂或细胞生长抑制剂(即，药物)以杀伤或抑制肿瘤细胞(见Syrigos和Epenetos(1999)Anticancer Research 19:605-614；Niculescu-Duvaz和Springer(1997)Adv.Drg Del.Rev.26:151-172；美国专利No.4,975,278)使得药物部分靶向递送至肿瘤，并且在细胞内沉积，当全身性施用这些非偶联药物试剂可能对正常细胞以及试图消除的肿瘤细胞导致不可接受水平的毒性(Baldwin等，(1986)Lancet pp.(Mar.15,1986):603-05；Thorpe,(1985)"Antibody Carriers Of Cytotoxic Agents In Cancer Therapy:A Review,"in Monoclonal Antibodies'84:Biological And Clinical Applications,A.Pinchera等(编)，第475-506页)。寻求具最低毒性的最大疗效。多克隆抗体和单克隆抗体有时均报道为在这方面有用。(见Rowland等，(1986)Cancer Immunol.Immunother.,21:183-87)。已知用于这方面的药物包括道诺霉素、阿霉素、甲氨喋呤和长春地辛(Rowland等，Cancer Immunol.Immunother.21:183-87(1986))。抗体-毒素偶联物中使用的毒素包括细菌毒素(例如白喉毒素)、植物毒素(例如篦麻毒素)、小分子毒素(例如格尔德霉素)。Kerr等(1997) Bioconjugate Chem.8(6):781-784；Mandler等(2000)Journal of the Nat.Cancer Inst.92(19):1573-1581；Mandler等(2000)Bioorganic&Med.Chem.Letters 10:1025-1028；Mandler等(2002)Bioconjugate Chem.13:786-791),类美坦素(maytansinoid)(EP 1391213；Liu等，(1996)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 93:8618-8623)和卡奇霉素(Lode等(1998)Cancer Res.58:2928；Hinman等(1993)Cancer Res.53:3336-3342。毒素可能通过不同机制发挥细胞毒性和/或细胞生长抑制作用，包括微管蛋白结合、DNA结合或拓扑异构酶抑制。Meyer,D.L.和Senter,P.D."Recent Advances in Antibody Drug Conjugates for Cancer Therapy"in Annual Reports in Medicinal Chemistry，第38卷(2003)第23章，229-237。但是许多细胞毒性药物当与大分子抗体或蛋白质受体配体偶联时趋向于无活性或活性较低。
抗体-类美坦素偶联物由靶向细胞表面表达的抗原的单克隆抗体和与抗体共价连接的美登素源性化合物(例如，抑制微管聚合的有效抗有丝分裂药物)组成。Chari RV,Acc.Chem.Res.2008Jan；41(1):98-107。用适当连接子，抗体-类美坦素偶联物(AMC)可在体内稳定并且对不表达靶抗原的细胞的毒性明显较低，从而提高了偶联物的治疗指数。一旦与细胞表面的靶抗原结合，AMC就被内化，在溶酶体中分解，可能被蛋白酶分解，生成之后结合并抑制微管的活性类美坦素代谢物，从而引起细胞周期停滞并最终很可能由细胞凋亡引起细胞死亡。Erickson等，Cancer Res.2006Apr 15；66(8):4426-33。由于类美坦素偶联，mAb可提高体外和体内的靶向杀伤活性。
目前，在临床试验和临床前研究中正在研究大量ACC。理论上，与抗体疗法相似，可易于向患者施用免疫偶联物。尤其已经报道了一种称为曲妥珠单抗-SMCC-DM1(T-DM1)的ACC对已放弃曲妥珠单抗和化学疗法的HER2过表达转移性乳腺癌患者有效，而同样表现出有利的低毒性性质。见Vogel CL,ASCO 2009Abstract#1017。
抗体-类美坦素偶联物，例如用非可裂解连接子SMCC合成的曲妥珠单抗-SMCC-DM1的血浆清除率与单独的抗体的清除率相比极低。US2005/0169933。这与用相对不稳定二硫键制备的偶联物(例如 huC242-SPP-DM1)的血浆清除率形成鲜明对比。例如，SMCC偶联物清除率的半衰期为约320h，而SPP偶联物的半衰期在约40-50h范围内。然而，每种类型偶联物的抗体组分的清除率相同，表明测量的偶联物清除率的差异可能是由于类美坦素从抗体偶联物损耗(即，在SPP-DM1偶联物的情况下)。非可裂解SMCC连接可能在体内具有比SPP-DM1偶联物更高的抗类美坦素-连接子裂解活性。进一步地，与SPP-DM1偶联物相比，SMCC连接子偶联物的清除率下降，导致通过曲线下面积(AuC)测量的动物的总类美坦素暴露增加近5倍。这种暴露增加可对药物功效有实质影响。
已报道，与用可裂解二硫化物连接子制备的偶联物相比，用非可裂解连接子(例如SMCC)制备的类美坦素偶联物在小鼠体内表现出耐受性出乎意料地升高。US2005/0169933。例如，在急性毒性试验中对CD-1小鼠采用单次静脉剂量比较huC242-SMCC-DM1和huC242-SPP-DM1的耐受性。SMCC-DM1偶联物的最大耐受剂量(MTD)高于试验的最高剂量(150mg/kg)，而二硫化物-连接子偶联物SPP-DM1的MTD在45-90mg/kg范围内。150mg/kg下，SMCC-DM1处理组的所有小鼠均存活，而处理后96h观察到对SPP-DM1处理组的所有小鼠有致命毒性。另外，不可还原硫醚连接的抗体-类美坦素偶联物曲妥珠单抗-SMCC-DM1在大鼠体内展现出比可裂解二硫化物-连接的曲妥珠单抗-SPP-DM1耐受性高2-3倍。Lewis Phillips GD,Li G,Dugger DL等，Targeting HER2-positive breast cancer with trastuzumab-DM1,an antibody-cytotoxic drug conjugate,Cancer Res 2008；68:9280-90。因此，可能用非可裂解连接子(例如SMCC)制备的抗体药物偶联物，在临床前模型中可能展现出有利的毒性和药代动力学参数。
虽然CD20在本领域中已知，但是CD20并非抗体-药物偶联的有利靶标，因为已知抗CD20抗体内化极差。Press OW,Cancer Res.1989；49:4906-12和Vangeepuram N,Cancer 1997；80(Suppl.):2425-30。虽然先前已经研究了CD20抗体的偶联物，但是尚未证明明显很强的效力，尤其是当使用非二硫化物或酸稳定连接子时。
例如，已报道抗CD20抗体的非可裂解SMCC-DM1偶联物具有与未偶联 抗体相同的功效，而只有相同抗体的可裂解SPP-DM1偶联物在SCID小鼠的Granta-519异种移植模型中表现出功效略微提高。Polson等，Cancer Res.,69(6):2358-2364(2009)。类似地，已报道用酸稳定性酰胺连接子产生的抗CD20抗体的卡奇霉素偶联物在裸鼠的Ramos异种移植模型中并未表现出比利妥昔单抗高的体内功效。在这项研究中只有用酸不稳定的二甲基酰肼Ac-But连接子产生的利妥昔单抗的卡奇霉素偶联物表现出体内功效升高。DiJoseph等，Cancer Immunol.Immunotherapy,56(7):1107-1117(2007)。在一项不同研究中，据报道抗CD20抗体的酸不稳定亚德里亚霉素偶联物对Daudi异种移植模型仅有中等效果。显示相同抗体的酸稳定性亚德里亚霉素偶联物完全无效。Braslawsky等，Cancer Immunol Immunotherapy,33:367-74(1991)。据报道通过酶可裂解肽连键与单甲基auristatin E(MMAE)偶联为利妥昔单抗-vcMMAE的利妥昔单抗对Ramos淋巴瘤细胞显示出体外和体内功效。Law等，Clin.Cancer Res.,10(23):7842-7851(2004)；Erratum于:Clin.Cancer Res.,11(10):3969(2005)。
报道的另一种提高在B细胞病症治疗中有效的单克隆抗体的能力的方法是将放射性标记偶联至抗体，以致将标记局部化于抗原位点。已经批准CD20靶向的放射性免疫偶联物(131I-托西莫单抗)和Zevalin(90Y-替伊莫单抗)用于复发或难治性非霍奇金B细胞淋巴瘤患者，包括耐利妥昔单抗的患者。在临床情况下，一些耐利妥昔单抗的患者对反应。Horning,J.Clin.Oncol.2005；23:712-9。当在复发或难治性低级或滤泡性NHL中比较Zevalin和利妥昔单抗时，据报道Zevalin治疗表现出比利妥昔单抗治疗明显更好的总体完全反应率。Witzig，J Clin Oncol 2002；20:2453-2463。虽然这些临床数据表明抗CD20放射性免疫偶联物可能比利妥昔单抗更有效，但是由于使用放射性化合物相关的另外的毒性和施用困难，CD20放射性免疫偶联物并未广泛使用。因此，需要研发易于施用且具有较低毒性的有效抗CD20抗体和偶联物。
因此，仍然需要研发改良的较好CD20靶向治疗剂，包括展现出特异性，比已知治疗剂毒性低、稳定及物理和功能特征高的抗体或抗体片段。本发明解决了这些需要。
发明概要
现将对本发明的某些方面做详细参考，以所附结构和公式说明其实例。虽然将结合列举方面描述本发明，但是将理解并非旨在将本发明限于那些方面。相反，本发明旨在包括可能包括在如权利要求书限定的本发明范围内的所有替代性方案、修改和等效物。本领域中的技术人员将认识到与本文所述相似或等效的可用于本发明实践中的许多方法和材料。
一方面，本发明为抗CD20抗体和/或其片段。一方面，本发明为细胞溶解性抗CD20抗体和/或其片段。在本发明的一方面，抗CD20细胞溶解性抗体和片段用于医学病状的治疗，其中表达CD20的B细胞影响病程。一方面，靶向性B细胞有害。一方面，医学病状牵涉有害B细胞的活性。一方面，医学病状为B细胞疾病。本发明的另一方面为特异性结合CD20抗原的抗体或其片段，其中所述抗体或片段能够诱导细胞凋亡、抗体依赖细胞介导的细胞毒性(ADCC)和补体依赖的细胞毒性(CDC)。在优选的方面，医学病状为非霍奇金淋巴瘤。
本发明的一方面为特异性结合CD20的抗体或其片段，其中所述抗体或片段能够诱导细胞凋亡、抗体依赖细胞介导的细胞毒性(ADCC)和补体依赖的细胞毒性(CDC)，其中所述抗体或片段为鼠、非人、人源化、嵌合、表面重塑或人抗体或片段。本发明的另一方面为特异性结合CD20的抗体或其片段，其中所述抗体或片段能够诱导细胞凋亡、抗体依赖细胞介导的细胞毒性(ADCC)和补体依赖的细胞毒性(CDC)，其中所述抗体或片段为单克隆或单链的。
本发明的一方面包括特异性结合CD20的抗体或其片段，其中所述抗体或片段能够诱导细胞凋亡、抗体依赖细胞介导的细胞毒性(ADCC)和补体依赖的细胞毒性(CDC)，其中从CHO或NS0细胞获得抗体。在本发明的又一方面，抗体或其片段特异性结合至少一个包含位于CD20第3个和第4个跨膜结构域之间的氨基酸残基的氨基酸。
在本发明的另一方面，抗体或其片段特异性结合包含SEQ ID NO:45的氨 基酸的至少一个氨基酸或与GI 21330989、GenBank Protein ID 23110989等的任一个相对应的序列。本发明的另一方面为抗体或片段，其中所述抗体或片段能够诱导表达CD20的细胞死亡。在本发明的又一方面，抗体或片段为具有与II类抗体相似在交联剂不存在时大体上诱导细胞凋亡的能力并且具有与I类抗体相似引起CD20重新分布于脂筏和大体上诱导补体依赖的细胞毒性(CDC)的能力的III类抗体。
本发明的一方面包括抗CD20抗体或片段，其中在蛋白质印迹、ELISA或FACS测定中所述抗体或片段特异性结合CD20。
在本发明的一方面，抗CD20抗体或片段包含Fab、Fab'、F(ab')2、Fd、单链Fv或scFv、二硫化物连接的Fv、V-NAR结构域、IgNar、胞内抗体、IgGDCH2、微型抗体、F(ab')3、四链抗体、三链抗体、双链抗体、(scFv)2、单结构域抗体、DVD-Ig、Fcab、mAb2或scFv-Fc。本发明的另一方面为包含免疫球蛋白重链恒定结构域的抗体或片段和/或其偶联物。在本发明的一方面，抗体或片段免疫球蛋白重链恒定结构域选自IgG1恒定结构域、IgG2恒定结构域、IgG3恒定结构域和IgG4恒定结构域。在本发明的一方面，抗CD20抗体为CD20-6。在本发明的另一方面，抗CD20抗体为CD20-7。
在本发明的一方面，抗体、片段或其偶联物诱导淋巴瘤细胞的细胞凋亡。在本发明的一方面，抗体、片段或其偶联物诱导Ramos淋巴瘤细胞和/或Raji淋巴瘤细胞和/或WSU-DLCL-2淋巴瘤细胞和/或Jeko-1淋巴瘤细胞和/或Granta-519淋巴瘤细胞的细胞凋亡。在本发明的另一方面，正如在交联剂不存在时通过Annexin-V染色测量，本发明的抗体、片段和/或其偶联物诱导Ramos淋巴瘤细胞和/或Raji淋巴瘤细胞和/或WSU-DLCL-2淋巴瘤细胞和/或Jeko-1淋巴瘤细胞和/或Granta-519淋巴瘤细胞的细胞凋亡。在本发明的一方面，正如在交联剂不存在时通过Annexin-V染色测量，抗体、片段和/或其偶联物诱导至少约48％的Ramos淋巴瘤细胞和/或至少约53％的Raji淋巴瘤细胞和/或至少约34％的WSU-DLCL-2淋巴瘤细胞和/或至少约12％的Jeko-1淋巴瘤细胞和/或至少约40％的Granta-519淋巴瘤细胞的细胞凋亡。
在本发明的另一方面，抗体、片段或其偶联物能够在交联剂不存在时以 约0.2nM或更低的EC50诱导淋巴瘤细胞的细胞凋亡。在本发明的另一方面，抗体、片段或其偶联物能够在交联剂不存在时以0.2nM或更低的EC50诱导至少48％的Ramos淋巴瘤细胞的细胞凋亡。
在本发明的另一方面，抗体、片段或其偶联物能够有效地将CD20转移至表达CD20的细胞膜的脂筏区室中。在本发明的另一方面，本发明的抗体、片段或其偶联物能够有效地将CD20转移至表达CD20的淋巴瘤细胞和/或至表达CD20的免疫调节细胞的膜的脂筏区室中。在本发明的一方面，抗体、片段或其偶联物能够有效地将CD20转移至Ramos淋巴瘤细胞的膜的脂筏区室中。
在本发明的一方面，抗体、片段和/或其偶联物在具有补体的约5％人血清存在下通过CDC以约0.018μg/mL或更低的EC50杀伤Ramos淋巴瘤细胞和/或以约0.25μg/mL或更低的EC50杀伤Daudi淋巴瘤细胞和/或以约0.58μg/mL或更低的EC50杀伤WSU-DLCL-2淋巴瘤细胞。
在本发明的一方面，抗体、片段和/或其偶联物与CD20上的表位结合，所述表位不包含或不需要位置170和/或172处的氨基酸残基脯氨酸。在本发明的一方面，抗体、片段和/或其偶联物与CD20上的表位结合，所述表位包含或具有位置163和/或166处的氨基酸残基天冬酰胺。在本发明的一方面，抗体、片段和/或其偶联物与CD20上的表位结合，所述表位不包含或不需要位置170和/或172处的氨基酸残基脯氨酸，和/或所述表位包含或具有位置163和/或166处的氨基酸残基天冬酰胺。
在本发明的一方面，抗体、片段和/或其偶联物与CD20上的表位结合，其中所述CD20表位不具有位置170和/或172处的脯氨酸和/或具有位置163和/或166处的氨基酸残基天冬酰胺。
在本发明的一方面，抗体或其片段包含至少一个具有选自SEQ ID NO:25-30的氨基酸序列的互补决定区。在本发明的一方面，抗体或其片段包含至少一个具有选自SEQ ID NO:17-22的氨基酸序列的互补决定区。在本发明的一方面，抗体或其片段包含至少一个具有选自SEQ ID NO:25-30和17-22 的氨基酸序列的互补决定区，并且其中所述抗体或片段结合CD20。在本发明的一方面，抗体或片段包含至少一条重链和至少一条轻链，其中所述重链包含3个具有SEQ ID NOS:20-22或28-30的氨基酸序列的序列互补决定区，并且其中所述轻链包含3个具有SEQ ID NO:17-19或25-27的氨基酸序列的序列互补决定区。在本发明的一方面，Ab或片段重链与SEQ ID NO:47、34、35或36表示的氨基酸序列具有至少90％序列同一性。在本发明的一方面，抗体或片段重链与SEQ ID NO:47、34、35或36表示的氨基酸序列具有至少96％序列同一性。在本发明的一方面，抗体或片段重链与SEQ ID NO:47、34、35或36表示的氨基酸序列具有至少97％序列同一性。在本发明的一方面，抗体或片段重链与SEQ ID NO:47、34、35或36表示的氨基酸序列具有至少98％序列同一性。在本发明的一方面，抗体或片段重链与SEQ ID NO:47、34、35或36表示的氨基酸序列具有至少99％序列同一性。在本发明的一方面，抗体或片段重链具有SEQ ID NO:47、34、35或36的氨基酸序列。
成熟多肽中不存在形成分泌信号序列的序列。
本发明提供了结合人CD20的表面重塑抗体或其去除体内B细胞的抗原结合片段和/或其偶联物。在又一方面，B细胞来自人或猕猴。在其它方面，CDR区包含氨基酸取代，其中残基既非来自供体也非来自受体抗体。
在一个优选的方面，本发明的抗体为全长抗体，其中VH区与人IgG重链恒定区连接。在一些优选方面，IgG为人IgG1或IgG3。
在本发明的一方面，抗体或其片段轻链与SEQ ID NO:46、32或33表示的氨基酸序列具有至少90％序列同一性。在本发明的一方面，抗体或其片段轻链与SEQ ID NO:46、32或33表示的所述氨基酸序列具有至少95％序列同一性。在本发明的一方面，抗体或其片段轻链与SEQ ID NO:46、32或33表示的所述氨基酸序列具有至少96％序列同一性。在本发明的一方面，抗体或其片段轻链与SEQ ID NO:46、32或33表示的所述氨基酸序列具有至少97％序列同一性。在本发明的一方面，抗体或其片段轻链与SEQ ID NO:46、32或33表示的所述氨基酸序列具有至少98％序列同一性。在本发明的一方面，抗体或其片段轻链与SEQ ID NO:46、32或33表示的所述氨基酸序列具有至 少99％序列同一性。在本发明的一方面，抗体或其片段轻链具有SEQ ID NO:46、32或33的氨基酸序列。一方面，表面重塑抗CD20抗体和/或其偶联物为CD20-7或其片段。
在本发明的一方面，抗体或片段为特异性结合CD20的改良抗体或片段，通过以下步骤制备：(a)提供编码包含至少一个选自SEQ ID NO:32-36、46、47、17-22、25-30和1-7的序列的抗体或其片段的DNA；(b)向所述DNA中引入至少一个核苷酸突变、缺失或插入，以致所述DNA编码的所述抗体或抗体片段的氨基酸序列改变；(c)表达所述抗体或抗体片段；(d)筛选所述表达的抗体或抗体片段进行所述改良，由此制备了所述改良抗体或抗体片段。在本发明的一个方面改良为CD20的亲和力增强。在本发明的又一方面，通过已知方式，例如寡核苷酸介导的定点诱变、盒式诱变、易错PCR、DNA改组和使用大肠杆菌的增变菌株产生至少一个核苷酸突变、缺失或插入引起亲和力增强。在本发明的另一方面改良为CD20的亲和力增强。在本发明的另一方面改良为表达CD20的细胞的细胞毒素活性增强。在本发明的另一方面，改良为表达水平提高。在本发明的另一方面，改良为独特型活性增强。
在本发明的另一方面，当与本发明的另一种抗体或其片段比较时，本发明的抗体或其片段包含一个或多个氨基酸残基的保守性取代。在一些实施方案中，这种取代出现在抗体或其片段的重和/或轻链的框架和/或CDR和/或高变部分中。在一些实施方案中，这种取代仅出现在CDR序列中。在一些实施方案中，有约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、35、40、45、50个或更多个这种取代。在其它实施方案中，在本发明抗体或其片段的重和/或轻链中有1-20、1-15、1-10、1-5、1-3、20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2或1个这种取代。
因此，本发明提供了CD20结合抗体或其功能片段和/或其偶联物，及其在治疗CD20表达细胞相关疾病中的用途。在特定方面，结合CD20的抗体更优选为表面重塑、人源化或嵌合抗体。人源化抗体包括在框架区(FR)具有氨基酸取代的抗体和CDR中有变化的亲和力成熟抗体。CDR或FR中经取代 的氨基酸不限于供体或受体抗体中存在的氨基酸。在其它方面，本发明的抗CD20抗体或其功能片段和/或其偶联物进一步包含Fc区中导致效应子功能增强(包括CDC和/或ADCC功能和B细胞杀伤增强)的氨基酸残基变化。
本发明的其它抗CD20抗体或其功能片段和/或其偶联物包括具有提高稳定性的特异性变化的抗CD20抗体或其功能片段和/或其偶联物。在特定方面，人源化CD20抗体或其功能片段稳定性增强。
还提供了具有糖基化变异在体内有更高ADCC功能的抗体。 
在本发明的一方面，抗体或其片段是特异性结合CD20的一种手段，其中所述手段能够诱导细胞凋亡、ADCC和CDC。在本发明的一方面，抗体或片段包含至少一个包含选自SEQ ID NO:1-7和17-36的至少一个成员的多肽。
另一方面，本发明为由与ATCC登录号PTA-10486相对应的杂交瘤(小鼠杂交瘤(B-淋巴细胞)：CD20-6)或与ATCC登录号PTA-10487相对应的杂交瘤(小鼠杂交瘤(B-淋巴细胞)：CD20-7)生成的抗体或其片段。
对于诊断应用，通常将用可检测部分标记本发明的抗体或其片段。可检测部分可为任何一种能够直接或间接产生可检测信号的可检测部分。例如，可检测部分可能为放射性同位素，例如3H、14C、32P、35S或131I；荧光或化学发光化合物，例如异硫氰酸荧光素、若丹明或虫荧光素；或酶，例如碱性磷酸酶、β-半乳糖苷酶或辣根过氧化物酶。
一方面，本发明为抗CD20细胞溶解性抗体和/或片段偶联物。在本发明的一方面，CD20特异性细胞溶解性抗体偶联物用于医学病状的治疗中，其中表达CD20的B细胞影响病程。一方面，靶B细胞有害。一方面，医学病状为B细胞疾病。一方面，医学病状牵涉有害B细胞的活性。本发明的另一方面为特异性结合CD20的抗体偶联物，其中所述抗体或片段能够在表达CD20的细胞中诱导细胞凋亡、抗体依赖细胞介导的细胞毒性(ADCC)和补体依赖的细胞毒性(CDC)。一方面，医学病状为非霍奇金淋巴瘤。
本发明的一方面为包含与细胞毒性剂连接的抗体或片段的抗CD20抗体或片段偶联物。偶联物中使用的细胞毒性剂可为类美坦素和类美坦素类似物、 苯二氮紫杉烷、CC-1065和CC-1065类似物、倍癌霉素和倍癌霉素类似物、烯二炔例如卡奇霉素、海兔毒素和海兔毒素类似物，包括auristatin、茅屋霉素衍生物和来普霉素衍生物。
更优选的细胞毒性剂为类美坦素和类美坦素类似物、苯二氮紫杉烷、CC-1065和CC-1065类似物。
类美坦素和类美坦素类似物是优选细胞毒性剂。本领域中的技术人员已知适合类美坦素的实例并且包括美登醇和美登醇类似物的酯。例如，美国专利No.4,424,219、4,256,746、4,294,757、4,307,016、4,313,946、4,315,929、4,331,598、4,361,650、4,362,663、4,364,866、4,450,254、4,322,348、4,371,533、6,333,410、5,475,092、5,585,499、5,846,545、6,444,163、6,716,821、7,276,497、7,473,796和美国公布No.20050169933中公开了适合的类美坦素。
紫杉烷也是优选的细胞毒性剂。例如，美国专利No.6,372,738、6,340,701、6,436,931、6,596,757、7,441,063、7,495,114和7,598290中公开了适合用于本发明的紫杉烷。
一种制备细胞毒性偶联物的候选物为CC-1065的类似物，这是从链霉菌(Streptomyces zelensis)的肉汤培养基分离的有效抗肿瘤抗生素。CC-1065在体外比通常使用的抗癌药物，例如阿霉素、甲氨喋呤和长春新碱有效约1000倍(B.K.Bhuyan等，Cancer Res.,42,3532-3537(1982))。CC-1065类似物也是用于本发明的优选细胞毒性药物。美国专利No.6,756,397、7,049,316、7,388,026、6,372,738、6,340,701、5,846,545和5,585,499中公开了CC-1065及其类似物。
苯二氮衍生物也是适合用于本发明的细胞毒性药物。吡咯并苯二氮例如美国专利公布No.20090036431和欧洲申请No.2019104中描述的吡咯并苯二氮是适合的细胞毒性药物。苯二氮衍生物，例如美国临时申请No.61/150,201中描述苯二氮衍生物也合适。
细胞毒性药物，例如甲氨喋呤、顺铂、卡铂、柔红霉素、阿霉素、长春新碱、长春碱、美法仑、丝裂霉素C、瘤可宁和吗啉阿霉素也适合用于制备 本发明的偶联物。
为了将细胞毒性剂连接至抗体，使用连接基团。本文描述了适合的可裂解和非可裂解连接基团并且在本领域中众所周知，包括二硫基、硫醚基、酸不稳定基团、光不稳定基团、肽酶不稳定基团和酯酶不稳定基团。优选的连接基团为二硫基和硫醚基，尤其是美国专利6,913,748、美国专利公布No.20050169933、20090274713和WO2009/0134976中所述的连接基团。例如，可使用二硫交换反应或通过在抗体和细胞毒性剂之间形成硫醚键来构建偶联物。用于修饰抗体以产生二硫化物连接的偶联物的优选连接子为4-(2-吡啶二硫代)戊酸N-琥珀酰亚胺酯(SPP)、4-(2-吡啶二硫代)丁酸N-琥珀酰亚胺酯(SPDB)或4-(2-吡啶二硫代)-2-磺酸基丁酸N-琥珀酰亚胺酯(磺酸-SPDB)。
本发明包括以下方面，其中类美坦素与抗体通过非可裂解连接子偶联增强了其效力，同时允许在体内达到高剂量，以致保护了抗CD20抗体或其片段的固有功能活性。用于修饰抗体或抗体片段以与类美坦素生成硫醚键的优选非可裂解连接子为4-(马来酰亚胺基甲基)环己烷羧酸N-琥珀酰亚胺酯(SMCC)、4-(马来酰亚胺基甲基)环己烷羧酸N-磺酸琥珀酰亚胺酯(磺酸SMCC)、4-(碘乙酰基)-氨基苯甲酸N-琥珀酰亚胺酯(SIAB)。
本发明还包括以下方面，其中本文所述的连接子为亲水性的(例如，并入PEG)并且有助于增强药物的活性。因此，本发明的另一方面包括将药物连接至抗CD20抗体，以致连接子设计提供在大范围的肿瘤上，特别是在低抗原表达或耐药性肿瘤中有活性的偶联物的改良方式。另外，并入这些亲水性连接子使得每个抗体分子偶联多达15个药物分子，产量高并且无聚集或沉淀。这些每个抗体分子用亲水性连接子连接多达15个药物分子的偶联物以高亲和力与靶CD20抗原(与未修饰抗体的抗原相似)结合。用于抗体修饰的优选亲水性连接子为N-琥珀酰亚胺基-[(N-马来酰亚胺丙酰胺基)-四聚乙二醇]酯(NHS-PEG4-马来酰亚胺)。
本发明还包括以下方面，其中本文所述的连接子没有硫原子，例如源自基于二羧酸部分的那些链接子(见美国公布No.2005016993)。
本发明还包括以下方面，其中本文所述连接子带电，其中电荷保留在经修饰后的抗CD20抗体或其片段和在所得的药物偶联物中。
本发明还包括以下方面，其中约2-8个药物分子与抗CD20抗体或其片段连接。一个优选方面为偶联物，其中约2-8个药物分子与抗CD20抗体或其片段连接并且与相同抗CD20抗体连接的更低或更高数量药物的药物负载量相比偶联物的细胞杀伤更有效。
本发明的更进一步方面为用所述方法治疗对治疗敏感的癌症的方法，所述方法包括经肠胃外向需要治疗的患者施用有效剂量的包含式CB-[Xl-(-CH2-CH2-O-)n-Yp-D]m(式II)或D-Yp-(-CH2-CH2-O-)n-Xl]m-CB(式II’)的偶联物的组合物
其中，CB表示抗CD20抗体；
D表示药物； 
X表示通过硫醚键、酰胺键、氨基甲酸酯键或醚键与细胞结合剂键合的脂肪族、芳香族或杂环单元；
Y表示通过选自硫醚键、酰胺键、氨基甲酸酯键、醚键、胺键、碳-碳键和腙键与药物键合的脂肪族、芳香族或杂环单元；
l为0或1；
p为0或1；
m为2-15的整数；并且
n为1-2000的整数。
重要的是，本发明中描述的偶联物对多重耐药性(mdr)的对用细胞毒性药物治疗敏感性差的CD20表达细胞非常有效力或有效。例如，癌症治疗为克服在用不同化学治疗剂多次治疗后常遭遇的耐药性机制造成障碍。在癌细胞 中观察到的这样一种机制称为多重耐药性并且是由ATP结合盒(ABC)转运体增加药物输出引起(C.Drumond,B.I.Sikic,J.Clin.Oncology,1999,17,1061-1070,G,Szokacs等，Nature Reviews,5；219–234,2006)。克服这些耐药性机制的疗法，例如干扰或克服癌细胞的这种药物流出具有重要价值。
本发明的一方面为包含抗体或片段和/或其偶联物的组合物。本发明的另一方面为包含抗体或片段和/或其偶联物和药学上可接受的载体的药物组合物。在本发明的一方面，抗体或片段药物组合物包含偶联物和药学上可接受的载体。本发明包括包含抗CD20抗体或片段偶联物和载体(例如，药学上可接受的载体)的组合物(例如，药物组合物)。
本发明也包括包含抗CD20抗体或其片段、偶联物和载体(药学上可接受的载体)，进一步包含第二治疗剂的组合物(例如，药物组合物)。本发明的组合物用于抑制异常细胞生长或治疗哺乳动物(例如，人)的增生性病症。本发明的组合物还用于治疗哺乳动物(例如，人)的抑郁、焦虑、压力、恐怖症、恐慌、烦躁不安、精神病、疼痛和炎症性疾病。
在本发明的一方面，诊断性试剂包含具有如本文所述的抗体或其片段和/或其偶联物的组合物，其中抗体或其片段为经标记的。在本发明的一方面，抗体或片段和/或其偶联物标记选自放射性标记、荧光团、生色团、显像剂和金属离子。
在本发明的一方面，有一种特异性结合CD20表达细胞的方法。在本发明的一方面，CD20由B细胞表达。在本发明的一方面，CD20表达细胞为癌细胞。在本发明的一方面，抗体或片段结合选自以下的癌细胞：B细胞淋巴瘤，包括NHL、前B细胞淋巴细胞性白血病/淋巴瘤和成熟B细胞瘤，例如B细胞慢性淋巴细胞性白血病(CLL)/小淋巴细胞性淋巴瘤(SLL)、B细胞幼淋巴细胞白血病、淋巴浆细胞性淋巴瘤、套细胞淋巴瘤(MCL)、滤泡性淋巴瘤(FL)，包括低级、中级和高级FL，皮肤滤泡中心淋巴瘤、边缘区B细胞淋巴瘤(MALT型、结内和脾型)、毛细胞白血病、弥漫性大B细胞淋巴瘤、伯基特氏淋巴瘤、浆细胞瘤、浆细胞骨髓瘤、移植后淋巴增生性病症、华氏巨球蛋白血症和间变性大细胞淋巴瘤(ALCL)。
在本发明的另一方面，CD20表达细胞影响有害免疫反应。在本发明的另一方面，CD20表达细胞影响炎症。
抗CD20抗体或其偶联物和包含抗CD20抗体或其偶联物的组合物用于治疗或减轻病症的严重程度，例如，特征在于细胞的异常生长(例如，癌症和免疫性疾病和病症)。本发明的其它应用包括但不限于联合治疗骨质疏松症、抑郁、焦虑、压力、恐怖症、恐慌、烦躁不安、精神病和疼痛或作为抗癫痫药、抗菌药、利尿剂和降血压药、降血脂药和抗抑郁药。
在本发明的一个方面，有一种抑制癌细胞生长的方法，所述方法包括使细胞与抗体或抗体片段和/或其偶联物接触。
在本发明的一个方面，有一种治疗癌症患者的方法，所述方法包括向患者施用有效量的本文所述抗体或片段和/或其偶联物。在本发明的一方面，治疗进一步包括向所述患者施用治疗剂。在本发明的一方面，治疗剂为细胞毒性剂。
在又一方面，本发明为用于治疗例如类风湿性关节炎等炎症性疾病的CD20特异性细胞溶解性抗体或片段和/或其偶联物。另一方面，本发明为与甲氨喋呤联合用于治疗类风湿性关节炎的CD20定向细胞溶解性抗体和/或其偶联物。一方面，本发明为与甲氨喋呤联合用于治疗对一种或多种TNF拮抗剂治疗反应不充分的中度至重度活性类风湿性关节炎患者的CD20特异性细胞溶解性抗体和/或其偶联物。
在本发明的一方面，抗体或片段和/或其偶联物是一种治疗癌症患者的方法，所述方法包括向所述患者施用有效量的本文所述偶联物。在本发明的一方面，可治疗癌症为选自以下的癌症：B细胞淋巴瘤，包括NHL、前B细胞淋巴细胞性白血病/淋巴瘤和成熟B细胞瘤，例如B细胞慢性淋巴细胞性白血病(CLL)/小淋巴细胞性淋巴瘤(SLL)、B细胞幼淋巴细胞白血病、淋巴浆细胞性淋巴瘤、套细胞淋巴瘤(MCL)、滤泡性淋巴瘤(FL)，包括低级、中级和高级FL，皮肤滤泡中心淋巴瘤、边缘区B细胞淋巴瘤(MALT型、结内和脾型)、毛细胞白血病、弥漫性大B细胞淋巴瘤、伯基特氏淋巴瘤、浆细胞瘤、浆细 胞骨髓瘤、移植后淋巴增生性病症、华氏巨球蛋白血症和间变性大细胞淋巴瘤(ALCL)。
在本发明的一方面，有一种诊断怀疑患有癌症的受试者的方法，所述方法包括向受试者施用诊断性试剂；和检测受试者体内试剂的分布。在本发明的一方面，诊断方法包括诊断选自以下的癌症：B细胞淋巴瘤，包括NHL、前B细胞淋巴细胞性白血病/淋巴瘤和成熟B细胞瘤，例如B细胞慢性淋巴细胞性白血病(CLL)/小淋巴细胞性淋巴瘤(SLL)、B细胞幼淋巴细胞白血病、淋巴浆细胞性淋巴瘤、套细胞淋巴瘤(MCL)、滤泡性淋巴瘤(FL)，包括低级、中级和高级FL，皮肤滤泡中心淋巴瘤、边缘区B细胞淋巴瘤(MALT型、结内和脾型)、毛细胞白血病、弥漫性大B细胞淋巴瘤、伯基特氏淋巴瘤、浆细胞瘤、浆细胞骨髓瘤、移植后淋巴增生性病症、华氏巨球蛋白血症和间变性大细胞淋巴瘤(ALCL)。
在本发明的另一方面，有一种诊断怀疑患有免疫失调的受试者的方法，所述方法包括向受试者施用诊断性试剂；和检测受试者体内试剂的分布。在本发明的一方面，诊断方法包括诊断选自以下的免疫失调：类风湿性关节炎、幼年型类风湿性关节炎、全身性红斑狼疮(SLE)、韦格纳氏病、炎症性肠病、特发性血小板减少性紫癜(ITP)、血栓性血小板减少性紫癜(TTP)、自身免疫性血小板减少、多发性硬化、银屑病、IgA肾病、IgM多神经病、重症肌无力、脉管炎、糖尿病、雷诺综合征、克罗恩病、溃疡性结肠炎、胃炎、桥本氏甲状腺炎、强直性脊柱炎、丙型肝炎相关性冷球蛋白血症性脉管炎。本发明的一个优选方面为一种诊断怀疑患有选自以下的自身免疫性或炎症性疾病的受试者的方法：类风湿性关节炎、幼年型类风湿性关节炎、全身性红斑狼疮(SLE)、韦格纳氏病、炎症性肠病、特发性血小板减少性紫癜(ITP)、血栓性血小板减少性紫癜(TTP)、自身免疫性血小板减少、多发性硬化、银屑病、IgA肾病、IgM多神经病、重症肌无力、脉管炎、糖尿病、雷诺综合征、克罗恩病、溃疡性结肠炎、胃炎、桥本氏甲状腺炎、强直性脊柱炎、丙型肝炎相关性冷球蛋白血症性脉管炎、慢性病灶性脑炎、大疱性类天疱疮、甲型血友病、膜增生性肾小球肾炎、成人和幼年型皮肌炎、成人多发性肌炎、慢性荨麻疹、原发性胆汁性肝硬变、视神经脊髓炎、Graves甲状腺机能障碍、大疱性类天 疱疮、膜增生性肾小球肾炎、Churg-Strauss综合征、哮喘、银屑病性关节炎、皮炎、呼吸窘迫综合征、脑膜炎、脑炎、葡萄膜炎、湿疹、动脉粥样硬化、白细胞粘附缺陷、幼发型糖尿病、赖特尔病、白塞氏病、溶血性贫血、特应性皮炎、寻常型天疱疮、韦格纳肉芽肿、欧门氏综合征、慢性肾衰竭、急性传染性单核细胞增多症、HIV和疱疹相关性疾病、全身性硬化、Sjorgen综合征和肾小球性肾炎。当自身免疫性疾病为类风湿性关节炎时，可任选连同第二种治疗剂(优选为甲氨喋呤)施用抗体。
本发明的又一方面为在体内诱导B细胞的细胞凋亡的方法，所述方法包括使B细胞与本发明的抗体和/或其偶联物接触，从而杀伤B细胞。
本发明还提供了通过向哺乳动物，例如患有疾病的人患者，施用CD20结合抗体或其片段和/或其偶联物治疗疾病的方法。一方面，在治疗自身免疫性疾病或CD20表达癌症的任何方法中，抗体为CD20-7或CD20-6。因此，一方面为治疗CD20阳性癌症的方法，所述方法包括向患有癌症的患者施用治疗有效量的本发明的CD20结合抗体和/或其偶联物。在一个优选的方面，CD20表达癌症为B细胞淋巴瘤或表达CD20的白血病，包括非霍奇金淋巴瘤(NHL)或淋巴细胞为主型霍奇金病、慢性淋巴细胞性白血病(CLL)或SLL。在治疗B细胞淋巴瘤或白血病的方法的一方面，按约20-2000mg/m2的剂量范围施用抗体和/或其偶联物。在另外的方面，治疗方法进一步包括向患者施用至少一种化学治疗剂，其中对于非霍奇金淋巴瘤(NHL)而言，化学治疗剂选自阿霉素、环磷酰胺、长春新碱和强的松龙。
还提供了一种治疗自身免疫性或炎症性疾病的方法，所述方法包括向患有自身免疫性或炎症性疾病的患者施用治疗有效量的本文讨论的CD20结合抗体或片段和/或其偶联物。自身免疫性或炎症性疾病选自类风湿性关节炎、幼年型类风湿性关节炎、全身性红斑狼疮(SLE)、韦格纳氏病、炎症性肠病、特发性血小板减少性紫癜(ITP)、血栓性血小板减少性紫癜(TTP)、自身免疫性血小板减少、多发性硬化、银屑病、IgA肾病、IgM多神经病、重症肌无力、脉管炎、糖尿病、雷诺综合征、克罗恩病、溃疡性结肠炎、胃炎、桥本氏甲状腺炎、强直性脊柱炎、丙型肝炎相关性冷球蛋白血症性脉管炎、慢性病灶 性脑炎、大疱性类天疱疮、甲型血友病、膜增生性肾小球肾炎、成人和幼年型皮肌炎、成人多发性肌炎、慢性荨麻疹、原发性胆汁性肝硬变、视神经脊髓炎、Graves甲状腺机能障碍、大疱性类天疱疮、膜增生性肾小球肾炎、Churg-Strauss综合征、哮喘、银屑病性关节炎、皮炎、呼吸窘迫综合征、脑膜炎、脑炎、葡萄膜炎、湿疹、动脉粥样硬化、白细胞粘附缺陷、幼发型糖尿病、赖特尔病、白塞氏病、溶血性贫血、特应性皮炎、寻常型天疱疮、韦格纳肉芽肿、欧门氏综合征、慢性肾衰竭、急性传染性单核细胞增多症、HIV和疱疹相关性疾病、全身性硬化、Sjorgen综合征和肾小球性肾炎。当自身免疫性疾病为类风湿性关节炎时，可任选连同第二种治疗剂(优选为甲氨喋呤)施用抗体。
一方面，本发明提供了一种治疗选自以下的自身免疫性或炎症性疾病的方法：皮肌炎、韦格纳肉芽肿、ANCA、再生障碍性贫血、自身免疫性溶血性贫血(AIHA)、因子VIII缺乏症、甲型血友病、自身免疫性嗜中性白血球减少症、Castleman综合征、肺出血肾炎综合征、固体器官移植排斥、移植物抗宿主病(GVHD)、IgM介导的血栓性血小板减少性紫癜(TTP)、桥本氏甲状腺炎、自身免疫性肝炎、淋巴细胞性间质性肺炎(HIV)、闭塞性细支气管炎(非移植)与NSIP、格林-巴利综合征、大血管脉管炎、巨细胞(高安氏)动脉炎、中等血管脉管炎、川崎病、结节性多动脉炎，所述方法包括向患有疾病的患者施用治疗有效量的CD20结合抗体和/或偶联物。在该方法的一方面，CD20结合抗体为CD20-7或CD20-6。
在申请人的治疗方法中，可单独或连同第二种治疗剂，例如第二种抗体或化学治疗剂或免疫抑制剂施用CD20结合抗体和/或其偶联物。第二种抗体或片段和/或其偶联物可为结合CD20或不同B细胞抗原或NK或T细胞抗原的抗体或片段和/或其偶联物。一方面，第二种抗体或片段和/或其偶联物为放射性标记的抗CD20抗体。在其它方面，CD20结合抗体与包括毒素或放射性同位素的细胞毒性剂偶联。
本发明包括抑制有害B细胞和/或异常细胞生长或治疗哺乳动物(例如，人)的增生性病症的方法，所述方法包括向所述哺乳动物单独或联合第二种治 疗剂施用治疗有效量的抗CD20抗体和/或其偶联物(和/或其溶剂化物和盐)或组合物。
本发明的一方面为包含约20mg/mL抗体的CD20抗体和/或其偶联物、约10mM组氨酸硫酸盐pH5.8、约60mg/ml蔗糖(6％)和约0.2mg/ml聚山梨醇酯20(0.02％)的液体制剂。
本发明还提供了编码本文公开的任何抗体的各种分离核酸，包括表达抗体和/或抗体片段的表达载体。本发明的一方面包括编码本文所述抗体或片段的多核苷酸。
在本发明的一方面，多核苷酸编码抗体或片段和/或其偶联物的轻链或重链，并且多核苷酸为DNA或RNA。在本发明的一方面，多核苷酸为载体。在本发明的另一方面，载体为能够表达所述抗体或片段的表达载体。
本发明提供了包含SEQ ID NO.:8-16的核苷酸序列或这些序列的退化变异体等的分离核酸。一方面为包含编码具有选自SEQ ID NO.1-7和17-36的氨基酸序列(任选具有保守性氨基酸取代)的多肽序列的分离核酸。
另一方面为包含本文所述核酸的载体，包括在宿主细胞中表达的表达载体。还包括包含载体的宿主细胞。
本发明的另一方面包括包含核酸的宿主细胞和产生抗体或片段的宿主细胞。在后者的一个优选方面，宿主细胞为CHO细胞或NS0细胞。
提供了一种生成抗体和/或其偶联物的方法，所述方法包括孵育生成抗体的宿主细胞并从细胞培养物中回收抗体。
本发明包括一种合成抗CD20抗体和/或偶联物并将其用于哺乳动物细胞、生物体或相关病理学病状的体外、原位和体内诊断或治疗的方法。
在制品或试剂盒中提供了本发明的各方面。
为用于诊断或治疗受试者，制品进一步包含指出将组合物用于诊断或治 疗适当疾病或病症的药品说明书。
在本发明的所有抗体、抗体片段、偶联物、组合物和使用方法的优选方面，表面重塑CD20结合抗体为CD20-7并具有如本文所述的轻链和重链氨基酸序列。
特别地，本发明涉及以下各项：
1.一种特异性结合CD20的抗体或其片段，其中所述抗体或片段能够诱导细胞凋亡、抗体依赖细胞介导的细胞毒性(ADCC)和补体依赖的细胞毒性(CDC)。
2.根据第1项所述的抗体或片段，其中所述抗体或片段为鼠、非人、人源化、嵌合、表面重塑或人抗体或片段。
3.根据第1项所述的抗体或片段，其中所述抗体或片段为单克隆或单链的抗体或片段。
4.一种抗体或其片段，其由杂交瘤(ATCC登录号PTA-10486)或杂交瘤(ATCC登录号PTA-10487)产生。
5.根据第1项所述的抗体或其片段，其从选自哺乳动物、酵母、昆虫、植物或细菌细胞的真核或原核宿主细胞获得。
6.根据第5项所述的抗体或其片段，其中所述哺乳动物细胞为CHO、NS0、SP2/0、PER.C6或HEK-293细胞。
7.根据第5项所述的抗体或其片段，其中所述酵母细胞为毕赤酵母(Pichia pastoris)或酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)细胞。
8.根据第5项所述的抗体或其片段，其中所述昆虫细胞为Sf-9细胞。
9.根据第5项所述的抗体或其片段，其中所述植物细胞为浮萍(Lemna)细胞。
10.根据第5项所述的抗体或其片段，其中所述细菌细胞为大肠杆菌(E.coli)细胞。
11.根据第1项所述的抗体或片段，其中所述抗体或片段特异性结合至少一个氨基酸，所述氨基酸包括位于CD20第3个和第4个跨膜结构域之间的氨基酸残基。
12.一种偶联物，其包含与细胞毒性剂连接的根据第1项所述的抗体或片段。
13.根据第12项所述的偶联物，其中所述细胞毒性剂选自类美坦素、类美坦素类似物、苯二氮紫杉烷、CC-1065、CC-1065类似物、倍癌霉素、倍癌霉素类似物、卡奇霉素、海兔毒素、海兔毒素类似物、阿里他汀(aristatin)、茅屋霉素衍生物和来普霉素衍生物或所述偶联物的前药。
14.一种药物组合物，其包含根据第1项所述的抗体或片段和药学上可接受的载体。
15.一种药物组合物，其包含根据第12项所述的偶联物和药学上可接受的载体。
16.一种包含根据第12项所述的偶联物的诊断试剂，其中所述抗体或片段为经标记的。
17.根据第16项所述的诊断试剂，其中所述标记选自放射性标记、荧光团、生色团、显像剂和金属离子。
18.根据第1项所述的抗体或片段，其中所述抗体或片段特异性结合至少一个氨基酸，所述氨基酸包括SEQ ID NO:45的氨基酸或与GI 21330989、GenBank Protein ID 23110989的任一个相对应的序列。
19.根据第1项所述的抗体或片段，其中所述抗体或片段能够诱导表达CD20的细胞的死亡。
20.根据第1项所述的抗体或片段，其中所述抗体或所述片段为具有在交联剂不存在时大体上诱导细胞凋亡的能力并且具有引起CD20重新分布于脂筏和大体上诱导补体依赖的细胞毒性(CDC)的能力的III类抗体。
21.根据第1项所述的抗体或片段，其中在蛋白质印迹中所述抗体或其片段特异性结合所述CD20。
22.根据第1项所述的抗体或片段，其中在ELISA中所述抗体或其片段特异性结合所述CD20。
23.根据第1项所述的抗体或其片段，其中在流式细胞仪测定中所述抗体或其片段特异性结合所述CD20。
24.根据第1项所述的抗体或片段，其中所述抗体或片段包含Fab、Fab'、F(ab')2、Fd、单链Fv或scFv、二硫化物连接的Fv、V-NAR结构域、IgNar、胞内抗体、IgG CH2、微型抗体、F(ab')3、四链抗体、三链抗体、双链抗体、单结构域抗体、DVD-Ig、Fcab、mAb2、(scFv)2或scFv-Fc。
25.根据第1项所述的抗体或片段，其包含免疫球蛋白重链恒定结构域。
26.根据第25项所述的抗体或片段，其中所述免疫球蛋白重链恒定结构域选自IgG1恒定结构域、IgG2恒定结构域、IgG3恒定结构域和IgG4恒定结构域。
27.根据第19项所述的抗体，其中所述细胞源自B细胞。
28.根据第19项所述的抗体，其中所述细胞为癌细胞。
29.根据第28项所述的抗体，其中所述癌细胞选自B细胞淋巴瘤、NHL、前体B细胞淋巴细胞性白血病/淋巴瘤和成熟B细胞瘤、B细胞慢性淋巴细胞性白血病(CLL)/小淋巴细胞性淋巴瘤(SLL)、B细胞幼淋巴细胞白血病、淋巴浆细胞性淋巴瘤、套细胞淋巴瘤(MCL)、滤泡性淋巴瘤(FL)、低级、中级和高级(FL)、皮肤滤泡中心淋巴瘤、边缘区B细胞淋巴瘤、MALT型边缘区B细胞淋巴瘤、结内边缘区B细胞淋巴瘤、脾型边缘区B细胞淋巴瘤、毛细胞白 血病、弥漫性大B细胞淋巴瘤、伯基特氏淋巴瘤、浆细胞瘤、浆细胞骨髓瘤、移植后淋巴增生性病症、华氏巨球蛋白血症和间变性大细胞淋巴瘤(ALCL)。
30.根据第19项所述的抗体或片段，其中所述细胞影响有害免疫反应。
31.根据第19项所述的抗体或片段，其中所述细胞影响炎症。
32.根据第1项所述的抗体，其中所述抗体或片段能够杀伤至少约48％的Ramos淋巴瘤细胞，其中所述杀伤包括在交联剂不存在时的细胞凋亡。
33.根据第1项所述的抗体，其中所述抗体或片段能够杀伤至少约48％的Ramos淋巴瘤细胞，其中所述杀伤包括在交联剂不存在时的细胞凋亡；并且其中所述抗体能够以约0.018g/mL或更低的EC50杀伤Ramos淋巴瘤细胞，其中所述杀伤包括CDC。
34.根据第1项所述的抗体，其中所述抗体或片段能够杀伤至少约48％的Ramos淋巴瘤细胞，其中所述杀伤包括在交联剂不存在时的细胞凋亡；并且其中所述抗体或片段能够以约0.018g/mL或更低的EC50杀伤Ramos淋巴瘤细胞，其中所述杀伤包括CDC；并且其中所述抗体或片段能够将CD20转移至所述细胞的膜的脂筏区室中。
35.根据第1项所述的抗体，其中所述抗体或片段能够杀伤至少约53％的Raji淋巴瘤细胞，其中所述杀伤包括在交联剂不存在时的细胞凋亡。
36.根据第1项所述的抗体，其中所述抗体或片段能够杀伤至少约34％的WSU-DLCL-2淋巴瘤细胞，其中所述杀伤包括在交联剂不存在时的细胞凋亡。
37.根据第1项所述的抗体，其中所述抗体或片段能够杀伤至少约34％的WSU-DLCL-2淋巴瘤细胞，其中所述杀伤包括在交联剂不存在时的细胞凋亡；并且其中所述抗体或所述片段能够以约0.58g/mL或更低的EC50杀伤WSU-DLCL-2淋巴瘤细胞，其中所述杀伤包括CDC。
38.根据第1项所述的抗体，其中所述抗体或片段能够杀伤至少约12％ 的Jeko-1淋巴瘤细胞，其中所述杀伤包括在交联剂不存在时的细胞凋亡。
39.根据第1项所述的抗体，其中所述抗体或片段能够杀伤至少约40％的Granta-519淋巴瘤细胞，其中所述杀伤包括在交联剂不存在时的细胞凋亡。
40.根据第1项所述的抗体，其中所述抗体或片段结合CD20上的表位，其中所述表位不包含或不需要位置170和/或172处的氨基酸残基脯氨酸，和/或其中所述表位包含或需要位置163和/或166处的氨基酸残基天冬酰胺。
41.根据第1项所述的抗体，其中所述抗体或片段结合CD20的表位，其中所述表位不包含或不需要位置170和/或172处的氨基酸残基脯氨酸，和/或其中所述表位包含或需要位置163和/或166处的氨基酸残基天冬酰胺；并且其中所述抗体或片段能够杀伤至少约48％的Ramos淋巴瘤细胞，其中所述杀伤包括在交联剂不存在时的细胞凋亡。
42.根据第1项所述的抗体，其中所述抗体或片段结合CD20的表位，其中所述表位不包含或不需要位置170和/或172处的氨基酸残基脯氨酸，和/或其中所述表位包括或需要在位置163和/或166处具有氨基酸残基天冬酰胺的CD20表位；并且其中所述抗体或片段能够杀伤至少约53％的Raji淋巴瘤细胞，其中所述杀伤包括在交联剂不存在时的细胞凋亡。
43.根据第1项所述的抗体，其中所述抗体或片段结合CD20上的表位，其中所述表位不包含或不需要位置170和/或172处的氨基酸残基脯氨酸，和/或其中所述表位包含或需要位置163和/或166处的氨基酸残基天冬酰胺；并且其中所述抗体或片段能够杀伤至少约34％的WSU-DLCL-2淋巴瘤细胞，其中所述杀伤包括在交联剂不存在时的细胞凋亡。
44.根据第1项所述的抗体，其中所述抗体或片段结合CD20上的表位，其中所述表位不包含或不需要位置170和/或172处的氨基酸残基脯氨酸，和/或其中所述表位包含或需要位置163和/或166处的氨基酸残基天冬酰胺；并且其中所述抗体或片段能够杀伤至少约12％的Jeko-1淋巴瘤细胞，其中所述杀伤包括在交联剂不存在时的细胞凋亡。
45.根据第1项所述的抗体，其中所述抗体或片段结合CD20上的表位，其中所述表位不包含或不需要位置170和/或172处的氨基酸残基脯氨酸，和/或其中所述表位包含或需要位置163和/或166处的氨基酸残基天冬酰胺；并且其中所述抗体或片段能够杀伤至少约40％的Granta-519淋巴瘤细胞，其中所述杀伤包括在交联剂不存在时的细胞凋亡。
46.一种抗体或其片段，其包含至少一个具有选自SEQ ID NO:25-30和17-22的氨基酸序列的互补决定区。
47.根据第46项所述的抗体或片段，其中所述抗体或所述片段结合CD20。
48.一种包含至少一条重链和至少一条轻链的抗体或其片段，其中所述重链包含3个具有SEQ ID NO:20-22或28-30的氨基酸序列的序列互补决定区，并且其中所述轻链包含3个具有SEQ ID NO:17-19或25-27的氨基酸序列的序列互补决定区。
49.根据第48项所述的抗体或片段，其中所述重链与SEQ ID NO:47、34、35或36表示的氨基酸序列具有至少90％序列同一性。
50.根据第48项所述的抗体或片段，其中所述重链与SEQ ID NO:47、34、35或36表示的氨基酸序列具有至少95％序列同一性。
51.根据第48项所述的抗体或片段，其中所述重链具有SEQ ID NO:47、34、35或36的氨基酸序列。
52.根据第48项所述的抗体或片段，其中所述轻链与SEQ ID NO:46、32或33表示的氨基酸序列具有至少90％序列同一性。
53.根据第48项所述的抗体或片段，其中所述轻链与SEQ ID NO:46、32或33表示的所述氨基酸序列具有至少95％序列同一性。
54.根据第48项所述的抗体或片段，其中所述轻链具有SEQ ID NO:46、32或33的氨基酸序列。
55.根据第48项所述的抗体或片段，其中与SEQ ID NO:47、34、35或36表示的所述氨基酸序列相比，所述重链的氨基酸序列包含1-5个保守性取代。
56.根据第48项所述的抗体或片段，其中与SEQ ID NO:47、34、35或36表示的所述氨基酸序列相比，所述重链的氨基酸序列包含1-3个保守性取代。
57.根据第48项所述的抗体或片段，其中与SEQ ID NO:47、34、35或36表示的所述氨基酸序列相比，所述重链的氨基酸序列包含3个保守性取代。
58.根据第48项所述的抗体或片段，其中与SEQ ID NO:47、34、35或36表示的所述氨基酸序列相比，所述重链的氨基酸序列包含2个保守性取代。
59.根据第48项所述的抗体或片段，其中与SEQ ID NO:47、34、35或36表示的所述氨基酸序列相比，所述重链的氨基酸序列包含1个保守性取代。
60.根据第48项所述的抗体或片段，其中与SEQ ID NO:46、32或33表示的所述氨基酸序列相比，所述轻链的氨基酸序列包含1-5个保守性取代。
61.根据第48项所述的抗体或片段，其中与SEQ ID NO:46、32或33表示的所述氨基酸序列相比，所述轻链的氨基酸序列包含1-3个保守性取代。
62.根据第48项所述的抗体或片段，其中与SEQ ID NO:46、32或33表示的所述氨基酸序列相比，所述轻链的氨基酸序列包含3个保守性取代。
63.根据第48项所述的抗体或片段，其中与SEQ ID NO:46、32或33表示的所述氨基酸序列相比，所述轻链的氨基酸序列包含2个保守性取代。
64.根据第48项所述的抗体或片段，其中与SEQ ID NO:46、32或33表示的所述氨基酸序列相比，所述轻链的氨基酸序列包含1个保守性取代。
65.一种特异性结合CD20的改良抗体或片段，通过以下步骤制备：
(a)提供编码包含至少一个选自SEQ ID NO:32-36、46、47、17-22、25-30和1-7的序列的抗体或其片段的DNA；
(b)向所述DNA中引入至少一个核苷酸突变、缺失或插入，以致由所述DNA编码的所述抗体或抗体片段的氨基酸序列改变；
(c)表达所述抗体或抗体片段；
(d)对所述表达的抗体或抗体片段筛选所述改良，由此制备了所述改良抗体或抗体片段。
66.根据第65项所述的抗体或片段，其中所述改良为CD20亲和力增强。 
67.根据第65项所述的抗体或片段，其中通过选自寡核苷酸介导的定点诱变、盒式诱变、易错PCR、DNA改组和使用大肠杆菌的增变菌株的方法产生至少一个核苷酸突变、缺失或插入。
68.一种抗体或其片段，其包含含有至少一个选自SEQ ID NO:1-7和17-36的成员的多肽。
69.根据第65项所述的抗体或片段，其中所述改良为效应子功能增强。
70.根据第65项所述的抗体或片段，其中所述改良为CDC活性增强。 
71.根据第65项所述的抗体或片段，其中所述改良为ADCC活性增强。 
72.根据第65项所述的抗体或片段，其中所述改良为ADCC活性增强、CDC活性增强和效应子功能增强。
73.根据第1项所述的抗体或其片段，其中所述抗体或片段从转基因表达宿主获得，其中所述宿主包括转基因山羊、鸡、牛或蛋。
74.一种抑制癌细胞生长的方法，所述方法包括使所述细胞与根据第1项所述的抗体或片段接触。
75.一种用于治疗患有癌症的患者的方法，所述方法包括向所述患者施用有效量的特异性结合CD20的抗体或其片段或偶联物，其中所述抗体或片段能够诱导细胞凋亡、抗体依赖细胞介导的细胞毒性(ADCC)和补体依赖的细胞毒性(CDC)。
76.根据第75项所述的方法，所述方法进一步包括向所述患者施用治疗剂。
77.根据第76项所述的方法，其中所述治疗剂为细胞毒性剂。
78.一种用于治疗患有癌症的患者的方法，所述方法包括向所述患者施用有效量的根据第19项所述的偶联物。
79.根据第75项所述的治疗方法，其中所述癌症为选自以下的癌症：B细胞淋巴瘤、NHL、前体B细胞淋巴细胞性白血病/淋巴瘤和成熟B细胞瘤、B细胞慢性淋巴细胞性白血病(CLL)/小淋巴细胞性淋巴瘤(SLL)、B细胞幼淋巴细胞白血病、淋巴浆细胞性淋巴瘤、套细胞淋巴瘤(MCL)、滤泡性淋巴瘤(FL)、低级、中级和高级(FL)、皮肤滤泡中心淋巴瘤、边缘区B细胞淋巴瘤、MALT型边缘区B细胞淋巴瘤、结内边缘区B细胞淋巴瘤、脾型边缘区B细胞淋巴瘤、毛细胞白血病、弥漫性大B细胞淋巴瘤、伯基特氏淋巴瘤、浆细胞瘤、浆细胞骨髓瘤、移植后淋巴增生性病症、华氏巨球蛋白血症和间变性大细胞淋巴瘤(ALCL)。
80.一种用于诊断怀疑患有癌症的受试者的方法，所述方法包括：
向所述受试者施用根据第16项所述的诊断试剂；并且
检测所述受试者体内所述试剂的分布。
81.根据第80项所述的诊断方法，其中所述癌症为选自以下的癌症：B细胞淋巴瘤、NHL、前体B细胞淋巴细胞性白血病/淋巴瘤和成熟B细胞瘤、B细胞慢性淋巴细胞性白血病(CLL)/小淋巴细胞性淋巴瘤(SLL)、B细胞幼淋巴细胞白血病、淋巴浆细胞性淋巴瘤、套细胞淋巴瘤(MCL)、滤泡性淋巴瘤 (FL)、低级、中级和高级(FL)、皮肤滤泡中心淋巴瘤、边缘区B细胞淋巴瘤、MALT型边缘区B细胞淋巴瘤、结内边缘区B细胞淋巴瘤、脾型边缘区B细胞淋巴瘤、毛细胞白血病、弥漫性大B细胞淋巴瘤、伯基特氏淋巴瘤、浆细胞瘤、浆细胞骨髓瘤、移植后淋巴增生性病症、华氏巨球蛋白血症和间变性大细胞淋巴瘤(ALCL)。
82.一种用于治疗患有自身免疫性或炎症性疾病的患者的方法，所述方法包括向所述患者施用有效量的特异性结合CD20的抗体或其片段或偶联物，其中所述抗体或片段能够诱导细胞凋亡、抗体依赖细胞介导的细胞毒性(ADCC)和补体依赖的细胞毒性(CDC)。
83.根据第82项所述的治疗方法，其中所述自身免疫性或炎症性疾病为选自以下的自身免疫性或炎症性疾病：类风湿性关节炎、幼年型类风湿性关节炎、全身性红斑狼疮(SLE)、韦格纳氏病、炎症性肠病、特发性血小板减少性紫癜(ITP)、血栓性血小板减少性紫癜(TTP)、自身免疫性血小板减少、多发性硬化、银屑病、IgA肾病、IgM多神经病、重症肌无力、脉管炎、糖尿病、雷诺综合征、克罗恩病、溃疡性结肠炎、胃炎、桥本氏甲状腺炎、强直性脊柱炎、丙型肝炎相关性冷球蛋白血症性脉管炎、慢性病灶性脑炎、大疱性类天疱疮、甲型血友病、膜增生性肾小球肾炎、成人和幼年型皮肌炎、成人多发性肌炎、慢性荨麻疹、原发性胆汁性肝硬变、视神经脊髓炎、Graves甲状腺机能障碍、大疱性类天疱疮、膜增生性肾小球肾炎、Churg-Strauss综合征、哮喘、银屑病性关节炎、皮炎、呼吸窘迫综合征、脑膜炎、脑炎、葡萄膜炎、湿疹、动脉粥样硬化、白细胞粘附缺陷、幼发型糖尿病、赖特尔病、白塞氏病、溶血性贫血、特应性皮炎、韦格纳肉芽肿、欧门氏综合征、慢性肾衰竭、急性传染性单核细胞增多症、HIV和疱疹相关性疾病、全身性硬化、Sjorgen综合征和肾小球性肾炎、皮肌炎、ANCA、再生障碍性贫血、自身免疫性溶血性贫血(AIHA)、因子VIII缺乏症、甲型血友病、自身免疫性嗜中性白血球减少症、Castleman综合征、肺出血肾炎综合征、固体器官移植排斥、移植物抗宿主病(GVHD)、自身免疫性肝炎、淋巴细胞性间质性肺炎(HIV)、闭塞性细支气管炎(非移植)、格林-巴利综合征、大血管脉管炎、巨细胞(高安氏)动脉炎、中等血管脉管炎、川崎病和结节性多动脉炎。
84.一种多核苷酸，其编码根据第1、4、18和48中任一项所述的抗体或片段。
85.一种多核苷酸，其编码根据第1、4、18和48中任一项所述的抗体或片段的轻链或重链。
86.一种载体，其包含根据第85项所述的多核苷酸。
87.根据第86项所述的载体，其中所述载体为能够表达所述抗体或抗体片段的表达载体。
88.一种宿主细胞，其包含根据第87项所述的表达载体。
89.一种特异性结合CD20的手段，其中所述手段能够诱导细胞凋亡、ADCC和CDC。
90.一种治疗患有癌症的患者的方法，所述方法包括向所述患者施用有效量的根据第1项所述的抗体或片段，其中所述抗体或片段与放射性标记的化合物连接。
91.根据第12项所述的偶联物，其中所述抗体或片段与所述细胞毒性剂的连接通过选自二硫基、硫醚基、酸不稳定基团、光不稳定基团、肽酶不稳定基团和酯酶不稳定基团的连接子。
92.根据第91项所述的偶联物，其中所述连接子选自3-(2-吡啶二硫代)丙酸N-琥珀酰亚胺酯(SPDP)、4-(2-吡啶二硫代)丁酸N-琥珀酰亚胺酯(SPDB)、4-(2-吡啶二硫代)2-磺酸基丁酸N-琥珀酰亚胺酯(磺酸-SPDB)、4-(2-吡啶二硫代)戊酸N-琥珀酰亚胺酯(SPP)、2-亚氨基硫烷和乙酰琥珀酰酐。
93.根据第91项所述的偶联物，其中所述连接子选自4-(马来酰亚胺基甲基)环己烷羧酸N-琥珀酰亚胺酯(SMCC)、N-琥珀酰亚胺基-4-(N-马来酰亚胺基甲基)-环己烷-1-羧基-(6-氨基己酸酯)(LC-SMCC)、κ-马来酰亚胺基十一烷酸N-琥珀酰亚胺酯(KMUA)、β-马来酰亚胺丙酸N-琥珀酰亚胺酯(BMPS)、γ-马来酰亚胺丁酸N-琥珀酰亚胺基酯(GMBS)、ε-马来酰亚胺基己酸N-羟基琥珀 酰亚胺酯(EMCS)、间马来酰亚胺苯甲酰基-N-羟基琥珀酰亚胺酯(MBS)、N-(α-马来酰亚胺基乙酸)-琥珀酰亚胺酯(AMAS)、6-(β-马来酰亚胺丙酰胺基)己酸琥珀酰亚胺酯(SMPH)、4-(对马来酰亚胺基苯基)-丁酸N-琥珀酰亚胺酯(SMPB)、N-(对马来酰亚胺基苯基)异氰酸酯(PMPI)、4-(碘乙酰基)-氨基苯甲酸N-琥珀酰亚胺酯(SIAB)、碘代乙酸N-琥珀酰亚胺酯(SIA)、溴代乙酸N-琥珀酰亚胺酯(SBA)和3-(溴乙酰胺基)丙酸N-琥珀酰亚胺酯(SBAP)。
附图简述
图1描述了与非转染300-19对照细胞(左图)和CD20表达300-19细胞(右图)结合的抗体的直方图。直方图显示用10nM muCD20-6(顶部)、muCD20-7(中间)染色和不存在一级抗体(底部)。
图2描述了通过流式细胞仪测定的(图1A)muCD20-7和(图1B)muCD20-6与BJAB细胞的结合。使用结合曲线确定与抗体的表观Kd相对应的抗体结合EC50。
图3描述了使用用浓度为10nM的利妥昔单抗、muCD20-2、muCD20-5、muCD20-6或muCD20-7孵育的(图3A)Ramos淋巴瘤细胞和用浓度为10nM的利妥昔单抗、B1、muCD20-2或muCD20-7孵育的(图3B)Raji淋巴瘤细胞进行Annexin-V测定的结果。比较中包括对照样品。
图4描述了使用用浓度为10μg/mL的抗CD20抗体或muIgG1同种型对照抗体染色的Ramos细胞进行脂筏测定的结果。为每次抗体治疗绘制在Triton-X 100不存在(黑色柱)和存在(开口柱)时来自样品的FL1的MFI。试验抗体为(图4A)muCD20-2、muCD20-7、利妥昔单抗、muIgG对照抗体和(图4B)muCD20-2、muCD20-5、muCD20-6、muCD20-7、muIgG对照抗体。
图5描述了使用用浓度为10nM的chCD20-2、chCD20-7、利妥昔单抗或(无Ab)对照孵育的Ramos淋巴瘤细胞进行Annexin-V测定的结果。
图6描述了在具有补体的5％人血清存在下对用chCD20-2、chCD20-7、利妥昔单抗或huIgG1同种型对照抗体孵育的Daudi(图6A)和 WSU-DLCL-2(图6B)细胞进行CDC测定的结果。
图7描述了CD20-7VL(图7A)和CD20-7VH(图7B)表面重塑形式中的CD20-7表面残基和取代。
图8描述了CD20-7可变区示例性表面重塑序列与鼠对应序列的比对。轻链(VL)可变结构域见图8A；重链(VH)可变结构域见图8B。破折号“-”表示与鼠序列的同一性。
图9描述了经流式细胞仪测定muCD20-7、chCD20-7和huCD20-7，而非huIgG1同种型对照抗体与BJAB细胞的结合。使用结合曲线确定与每个抗体的表观Kd相对应的抗体结合EC50。
图10描述了通过ELISA测定的huCD20-7与来自WSU-DLCL-2淋巴瘤细胞的膜制剂的结合。
图11描述了对用浓度为10nM、1nM和0.1nM的muCD20-7、huCD20-7或huIgG1同种型对照抗体孵育的Ramos淋巴瘤细胞进行Annexin-V测定的结果。
图12描述了对用浓度范围为3×10-8M-1.7×10-13M的huCD20-7、B1、利妥昔单抗、GA101-F和2F2孵育的Ramos淋巴瘤细胞进行Annexin-V测定的结果。比较对照样品。“B1”与未标记形式的(Beckman Coulter)相对应；而“GA101-F”与岩藻糖基化形式的阿夫土珠或GA101(Hoffman LaRoche)相对应；而“2F2”与ofatumumab(Genmab/GSK)相对应。
图13描述了对用浓度为10nM的huCD20-7、B1或利妥昔单抗孵育的淋巴瘤细胞进行Annexin-V测定的结果。未处理细胞的对照样品用于比较。实验包括(图13A)Ramos细胞、(图13B)Raji细胞、(图13C)WSU-DLCL-2细胞、(图13D)Jeko-1细胞和(图13E)Granta-519淋巴瘤细胞。
图14描述了使用10μg/mL的Ramos细胞和huCD20-7、利妥昔单抗、2F2和GA101-F抗体进行脂筏测定的结果。为每次抗体治疗绘制在Triton-X 100 不存在(黑色柱)和存在(白色柱)时来自样品的FL1的MFI。
图15描述了在具有补体的5％人血清存在下对用huCD20-7、利妥昔单抗、GA101-F或huIgG1同种型对照抗体孵育的(图15A)Daudi和(图15B)Ramos淋巴瘤细胞进行CDC测定的结果。
图16描述了在具有补体的5％人血清存在下对用huCD20-7、利妥昔单抗或huIgG1同种型对照抗体孵育的(图16A)WSU-DLCL-2和(图16B)RL淋巴瘤细胞进行CDC测定的结果。
图17描述了在作为效应细胞的纯化人NK细胞存在下使用用huCD20-7、利妥昔单抗、2F2或huIgG1同种型对照抗体孵育的(图17A)Ramos淋巴瘤细胞和(图17B)JVM-13CLL细胞进行ADCC测定的结果。
图18描述了使用图18A huCD20-7、利妥昔单抗、2F2、GA101-F、B1和图18B muCD20-6和muCD20-7，用流式细胞仪测定的一组CD20抗体与用人CD20转染的细胞的结合。
图19描述了使用(图19A)huCD20-7、利妥昔单抗、2F2、GA101-F、B1和(图19B)muCD20-6、muCD20-7、利妥昔单抗和2F2，用流式细胞仪测定的一组CD20抗体与用人CD20A179S P172S转染的细胞的结合。
图20描述了使用(图20A)huCD20-7、利妥昔单抗、2F2、GA101-F和(图20B)muCD20-6、muCD20-7、利妥昔单抗和2F2，用流式细胞仪测定的一组CD20抗体与用人CD20N163D转染的细胞的结合。
图21描述了使用(图21A)huCD20-7、利妥昔单抗、2F2、GA101-F和(图21B)muCD20-6、muCD20-7、利妥昔单抗和2F2，用流式细胞仪测定的一组CD20抗体与用人CD20N163D N166D转染的细胞的结合。
图22描述了经ELISA测定，与(图22A)huCD20-7-SMCC-DM1和-SPP-DM1或(图22B)huCD20-7-sulfomal-DM4偶联物相比，huCD20-7与来自WSU-DLCL-2淋巴瘤细胞的膜制剂的结合。
图23描述了对用浓度范围为3×10-8M-1×10-11M的利妥昔单抗、huCD20-7、huCD20-7-SMCC-DM1或huCD20-7-SPDB-DM4孵育的Ramos淋巴瘤细胞进行Annexin-V测定的结果。用相同浓度的非结合huIgG1-SMCC-DM1和huIgG1-SPDB-DM4偶联物处理Ramos细胞。
图24描述了在具有补体的5％人血清存在下对用huCD20-7、huCD20-7-SPDB-DM4、huCD20-7-PEG4-mal-DM4、利妥昔单抗或huIgG1同种型对照抗体孵育的(图24A)Daudi和(图24B)WSU-DLCL-2淋巴瘤细胞进行CDC测定的结果。
图25描述了在具有补体的5％人血清存在下对用huCD20-7、huCD20-7-SMCC-DM1、huCD20-7-sulfo-mal-DM4、利妥昔单抗或huIgG1同种型对照抗体孵育的(图25A)WSU-DLCL-2和(图25B)Ramos淋巴瘤细胞进行CDC测定的结果。
图26描述了在作为效应细胞的纯化人NK细胞存在下对用huCD20-7、huCD20-7-SMCC-DM1、利妥昔单抗、2F2或huIgG1同种型对照抗体孵育的(图26A)Ramos和(图26B)Granta-519淋巴瘤细胞进行ADCC测定的结果。
图27描述了对用浓度范围为3×10-8M-1×10-11M的huCD20-7、huCD20-7-SMCC-DM1、利妥昔单抗或huIgG1-SMCC-DM1对照偶联物孵育5天的(图27A)Ramos和(图27B)Daudi细胞进行WST-8细胞毒性测定的结果。
图28描述了对用浓度范围为3×10-8M-1×10-11M的huCD20-7、huCD20-7-SMCC-DM1、利妥昔单抗或非结合huIgG1-SMCC-DM1对照偶联物孵育5天的(图28A)Granta-519和(图28B)SC-1细胞进行WST-8细胞毒性测定的结果。
图29描述了对用浓度范围为3×10-8M-1×10-11M的huCD20-7、huCD20-7-SMCC-DM1、利妥昔单抗或huIgG1-SMCC-DM1对照偶联物孵育5天的(图29A)DOHH-2B-细胞淋巴瘤细胞和(图29B)Molt-4T-细胞白血病细胞进行WST-8细胞毒性测定的结果。Molt-4细胞为CD20阴性。
图30描述了对用浓度范围为3×10-8M-1×10-11M的huCD20-7、huCD20-7-SMCC-DM1、利妥昔单抗、利妥昔单抗-SMCC-DM1或非结合huIgG1抗体和huIgG1-SMCC-DM1对照偶联物孵育5天的(图30A)Ramos和(图30B)Daudi细胞进行WST-8细胞毒性测定的结果。
图31描述了用流式细胞仪测定的huCD20-7、huCD20-7-SMCC-[3H]DM1、利妥昔单抗或利妥昔单抗-SMCC-[3H]DM1与SU-DHL-4细胞的(图31A)结合。图31B描述了对用huCD20-7、huCD20-7-SMCC-[3H]DM1、利妥昔单抗或利妥昔单抗-SMCC-[3H]DM1孵育5天的抗原阳性SU-DHL-4B-细胞淋巴瘤细胞和抗原阴性COLO205结肠癌细胞进行WST-8毒性测定的结果。
图32描述了每个SU-DHL-4细胞结合的huCD20-7-SMCC-[3H]DM1或利妥昔单抗-SMCC-[3H]DM1的量(图32A)和将SU-DHL-4细胞暴露于huCD20-7-SMCC-[3H]DM1或利妥昔单抗-SMCC-[3H]DM122h后生成的赖氨酸-SMCC-[3H]DM1代谢产物的量(图32B)。
图33描述了对用浓度范围为3×10-8M-1×10-11M的(图31A)huCD20-7、huCD20-7-SMCC-DM1、huCD20-7-PEG4-mal-DM4和huCD20-7-SPDB-DM4和(图31B)huCD20-7、huCD20-7-SMCC-DM1、huCD20-7-SPP-DM1、huCD20-7-sulfo-mal-DM4和huIgG1-SMCC-DM1和huIgG1-SPP-DM1对照偶联物孵育5天的Granta-519细胞进行WST-8细胞毒性测定的结果。
图34描述了使用建立的异种移植模型SU-DHL-4使经皮下植入SCID小鼠体内的大B细胞淋巴瘤细胞扩散的实验结果。细胞接种后第14、21和28天(箭头)用10或1mg/kg的huCD20-7或利妥昔单抗处理小鼠，每周3次。按肿瘤细胞接种后的时间绘制不同处理组的肿瘤中值体积。
图35描述了使用经静脉内植入SCID小鼠体内的Daudi淋巴瘤细胞进行体内异种移植研究的结果。细胞接种后第7天用10mg/kg的huCD20-7、10mg/kg的huCD20-7-SMCC-DM1或5mg/kg的huCD20-7-SPP-DM1(图35A)和10mg/kg的huCD20-7、利妥昔单抗、huCD20-7-SMCC-DM1或huCD20-7-BMPS-DM1(图35B)处理小鼠一次。按肿瘤细胞接种后的时间绘制 不同处理组中存活小鼠的数量。
图36描述了使用经皮下植入SCID小鼠体内的DOHH-2滤泡性淋巴瘤细胞进行示例性异种移植研究的结果。细胞接种后第3天用10mg/kg的huCD20-7、10mg/kg的huCD20-7-SMCC-DM1或5mg/kg的huCD20-7-SPP-DM1处理小鼠一次。按肿瘤细胞接种后的时间绘制不同处理组的肿瘤中值体积。
发明详述
本发明提供了一类新的抗CD20抗体(即，III类)，所述抗体在对CD20表达(例如，阳性)细胞的以下3种细胞毒素活性方面有高效力：诱导细胞凋亡、ADCC和CDC。进一步地，使用体内肿瘤模型证明，抗CD20抗体与SMCC-DM1的偶联物杀伤CD20表达细胞出乎意料好地。
定义
在所有方面，“脂族基团”定义为烷基、烯基或炔基。烷基为可为直链或支链，优选在链或环上具有1-20个碳原子，优选具有3-10个碳原子的脂族烃基。更优选的烷基在链上具有1-12个碳原子。“支链”指一个或多个低级烷基，例如甲基、乙基或丙基与直链烷基链连接。示例性烷基包括甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、叔丁基、n-戊基、3-戊基、辛基、壬基、癸基、环戊基和环己基。
烯基为含有碳-碳双键并且可为直链或支链，优选在链上具有2-15个碳原子的脂族烃基。更优选的烯基在链上具有2-12个碳原子；并且优选在链上具有约2-4个碳原子。示例性烯基包括乙烯基、丙烯基、正丁烯基、异丁烯基、3-甲基-2-丁烯基、正戊烯基、庚烯基、辛烯基、壬烯基和癸烯基。
炔基为含有碳-碳三键并且可为直链或支链，优选在链上具有2-15个碳原子的脂族烃基。更优选的炔基在链上具有2-12个碳原子；并且优选在链上具有约2-4个碳原子。示例性炔基包括乙炔基、丙炔基、正丁炔基、2-丁炔基、3-甲基丁炔基、正戊炔基、庚炔基、辛炔基和癸炔基。
如本文所使用的术语“芳族基”指由6-14个碳原子，优选6-10个碳原子的芳香族单环或多环烃环系组成的经取代或未经取代的芳基。示例性芳基包括苯基和萘基。取代基包括但不限于烷基、卤素、硝基、氨基、羟基和C1-C3烷氧基，例如甲氧基、乙氧基和丙氧基。
术语“杂环”、“杂环基”和“杂环基团”指饱和、部分不饱和或不饱和非芳香族稳定3-14元、优选5-10元的单环、双环或多环，其中环的至少一元为杂原子或具有至少一个杂原子的芳香环，优选5-10元单环、双环或多环。通常，杂原子包括但不限于氧、氮、硫、硒和磷原子。优选杂原子为氧、氮和硫。Paquette,Leo A.；"Principles of Modern Heterocyclic Chemistry"(W.A.Benjamin,New York,1968)，尤其是第1、3、4、6、7和9章；"The Chemistry of Heterocyclic Compounds,A series of Monographs"(John Wiley&Sons,New York,1950to present)，尤其是第13、14、16、19和28卷；和J.Am.Chem.Soc.(1960)82:5566中描述了杂环。“杂环基”还包括其中杂环基与饱和、部分不饱和环或芳香族碳环或杂环稠合的基团。
脂肪族、芳香族和杂环单元还可具有带电取代基。带电取代基可为选自但不限于羧酸盐、硫酸盐和磷酸盐的带负电基团或选自叔胺或季胺基团的带正电基团。
术语“杂芳基”指5元或6元环的一价芳族基，并且包括含有一个或多个独立选自氮、氧和硫的杂原子的5-18个原子的稠环系(其中至少一个环为芳香环)。杂芳基的实例为吡啶基(包括，例如，2-羟基吡啶基)、咪唑基、咪唑并吡啶基、嘧啶基(包括，例如，4-羟基嘧啶基)、吡唑基、三唑基、吡嗪基、四唑基、呋喃基、噻吩基、异噁唑基、噻唑基、噁唑基、异噻唑基、吡咯基、喹啉基、异喹啉基、吲哚基、苯并咪唑基、苯并呋喃基、噌啉基、吲唑基、吲嗪基、酞嗪基、哒嗪基、三嗪基、异吲哚基、蝶啶基、嘌呤基、噁二唑基、三唑基、噻二唑基、呋吖基、苯并呋吖基、苯并噻吩基、苯并噻唑基、苯并噁唑基、喹唑啉基、喹喔啉基、萘啶基和呋喃并吡啶基。
只要可能杂环或杂芳基可与碳(碳连接)或氮(氮连接)连接。举例而言而非限制，碳键合的杂环和杂芳基在吡啶的位置2、3、4、5或6，哒嗪的位置3、 4、5或6，嘧啶的位置2、4、5或6，吡嗪的位置2、3、5或6，呋喃、四氢呋喃、硫代呋喃、噻吩、吡咯或四氢吡咯的位置2、3、4或5，噁唑、咪唑或噻唑的位置2、4或5，异噁唑、吡唑或异噻唑的位置3、4或5，氮丙啶的位置2或3，吖丁啶的位置2、3或4，喹啉的位置2、3、4、5、6、7或8或异喹啉的位置1、3、4、5、6、7或8处键合。
举例而言而非限制，氮键合的杂环和杂芳基在氮丙啶、吖丁啶、吡咯、吡咯烷、2-吡咯啉、3-吡咯啉、咪唑、咪唑烷、2-咪唑啉、3-咪唑啉、吡唑、吡唑啉、2-吡唑啉、3-吡唑啉、哌啶、哌嗪、吲哚、吲哚啉、1H-吲唑的位置1，异吲哚、异吲哚啉的位置2，吗啉的位置4和咔唑或O-咔啉的位置9处键合。
杂芳基和杂环基中存在的杂原子包括氧化形式，例如NO、SO和SO2。杂芳基和杂环基的取代基包括但不限于烷基、卤素、硝基、氨基、羟基和C1-C3烷氧基，例如甲氧基、乙氧基和丙氧基。
“卤素”包括氟、氯、溴和碘原子。优选氟和氯原子。
如本文所使用的术语“偶联物”指与细胞结合剂(即，抗CD20抗体或其片段)连接并用通式：C-L-CBA定义的化合物或其衍生物，其中C＝化合物，L＝连接子和CBA＝细胞结合剂或抗CD20抗体或片段。在一些实施方案中，也可按相同方式使用通式：D-L-CBA，其中D＝药物，L＝连接子和CBA＝细胞结合剂或抗CD20抗体或片段。
连接子为能够以稳定共价方式将化合物，通常为药物(例如类美坦素)，连接至细胞结合剂例如抗CD20抗体或其片段的任何化学部分。在化合物或抗体保持活性的条件下，连接子可易受或大体上抗酸诱导的裂解、光诱导的裂解、肽酶诱导的裂解、酯酶诱导的裂解和二硫键裂解影响。适合连接子在本领域中众所周知并且包括(例如)二硫基、硫醚基、酸不稳定基团、光不稳定基团、肽酶不稳定基团和酯酶不稳定基团。连接子还包括如本文所述的带电连接子及其亲水形式并且在本领域中众所周知。
除非另外指出，如本文所使用的“异常细胞生长”指不依赖正常调节机制(例如，接触抑制丧失)的细胞生长。这包括(例如)以下细胞的异常生长：(1)通过表达突变酪氨酸激酶或过表达受体酪氨酸激酶增殖的肿瘤细胞(肿瘤)；(2)发生异常酪氨酸激酶激活的其它增生性疾病的良性和恶性细胞；(3)通过受体酪氨酸激酶增生的任何肿瘤；(4)通过异常丝氨酸/苏氨酸激酶激活增生的任何肿瘤；和(5)发生异常丝氨酸/苏氨酸激酶激活的其它增生性疾病的良性和恶性细胞。
本发明可用于治疗和/或预防各种牵涉表达CD20的细胞的疾病，包括致瘤性疾病和免疫性疾病，例如自身免疫性或炎症性疾病。
术语“癌症”和“癌性”指或描述通常特征在于细胞生长不受调节的哺乳动物生理学病状。“肿瘤”包括一个或多个癌性细胞。癌症的实例包括但不限于癌、淋巴瘤、胚细胞瘤、肉瘤和白血病或淋巴恶性肿瘤。可治疗和/或预防的“致瘤性”疾病的实例包括B细胞淋巴瘤，包括NHL、前B细胞淋巴细胞性白血病/淋巴瘤和成熟B细胞瘤，例如B细胞慢性淋巴细胞性白血病(CLL)/小淋巴细胞性淋巴瘤(SLL)、B细胞幼淋巴细胞白血病、淋巴浆细胞性淋巴瘤、套细胞淋巴瘤(MCL)、滤泡性淋巴瘤(FL)，包括低级、中级和高级FL，皮肤滤泡中心淋巴瘤、边缘区B细胞淋巴瘤(MALT型、结内和脾型)、毛细胞白血病、弥漫性大B细胞淋巴瘤、伯基特氏淋巴瘤、浆细胞瘤、浆细胞骨髓瘤、移植后淋巴增生性病症、华氏巨球蛋白血症和间变性大细胞淋巴瘤(ALCL)。
可治疗和/或预防的“免疫性病症”和其中牵涉CD20表达细胞的疾病的实例包括银屑病、银屑病性关节炎、皮炎、全身性硬皮病和硬化、炎症性肠病(IBD)、克罗恩病、溃疡性结肠炎、呼吸窘迫综合征、脑膜炎、脑炎、葡萄膜炎、肾小球性肾炎、湿疹、哮喘、动脉粥样硬化、白细胞粘附缺陷、多发性硬化、雷诺综合征、干燥综合征、幼发型糖尿病、赖特尔病、白塞氏病、免疫复合物性肾炎、IgA肾病、IgM多神经病、免疫介导的血小板减少症(例如急性特发性血小板减少性紫癜和慢性特发性血小板减少性紫癜)、溶血性贫血、重症肌无力、狼疮性肾炎、全身性红斑狼疮、类风湿性关节炎(RA)、特 应性皮炎、天疱疮、格雷夫斯氏病、桥本氏甲状腺炎、韦格纳肉芽肿、欧门氏综合征、慢性肾衰竭、急性传染性单核细胞增多症、HN和疱疹病毒相关疾病。更多实例为严重急性呼吸窘迫综合征和脉络膜视网膜炎。还有更多实例为由于病毒(例如巴尔病毒(EBV))感染B细胞引起的疾病和病症。
“治疗剂”涵盖生物试剂，例如抗体、肽、蛋白质、酶或化学治疗剂。
“化学治疗剂”为用于癌症治疗的化学化合物。化学治疗剂的实例包括埃罗替尼(Genentech/OSI Pharm.)、硼替佐米(Millennium Pharm.)、氟维司群(AstraZeneca)、索坦(SU11248,Pfizer)、来曲唑(Novartis)、甲磺酸伊马替尼(Novartis)、PTK787/ZK 222584(Novartis)、奥沙利铂(Sanofi)、5-FU(5-氟尿嘧啶)、甲酰四氢叶酸、雷帕霉素(Sirolimus,Wyeth)、拉帕替尼(GSK572016,Glaxo Smith Kline)、洛那法尼(SCH 66336)、索拉非尼(BAY43-9006,Bayer Labs)和吉非替尼(AstraZeneca)、AG1478、AG1571(SU 5271；Sugen)、烷化剂，例如噻替派和环磷酰胺；烷基磺酸盐，例如白消安、英丙舒凡和哌泊舒凡；氮丙啶，例如苯佐替派、卡波醌、美乌替派(meturedopa)和尿烷亚胺(uredopa)；乙烯亚胺和甲基蜜胺，包括六甲基蜜胺、三乙撑蜜胺、三亚乙基磷酰胺、三亚乙基硫代磷酰胺和三甲基蜜胺；多聚乙酰(尤其是布拉它辛和布拉它辛酮)；喜树碱(包括合成类似物托泊替康)；苔藓虫素；callystatin；CC-1065(包括其阿多来新、卡折来新和比折来新合成类似物)；念珠藻素(尤其是念珠藻素1和念珠藻素8)；海兔毒素；倍癌霉素(包括合成类似物，KW-2189和CB1-TM1)；软珊瑚醇；水鬼蕉碱；匍枝珊瑚醇；海绵抑制素；氮芥，例如瘤可宁、萘氮芥、氯磷酰胺、雌莫司汀、异环磷酰胺、二氯甲基二乙胺、氮芥、盐酸甲氧氮芥、美法仑、新恩比兴、苯芥胆甾醇、泼尼莫司汀、曲洛磷胺、尿嘧啶芥；亚硝基脲，例如卡莫司汀、氯脲霉素、福莫司汀、洛莫司汀、尼莫司汀和雷莫司汀；抗生素，例如烯二炔抗生素(例如，卡奇霉素，尤其是卡奇霉素γ和卡奇霉素ω)(Angew Chem.Intl.Ed.Engl.(1994)33:183-186)；达内霉素，包括达内霉素A；二膦酸盐，例如氯膦酸盐；埃斯培拉霉素；以及新制癌菌素生色团和有关色蛋白烯二炔抗生素生色团)、阿克拉霉素、放射菌素、氨茴霉素、重氮丝 氨酸、博来霉素、放线菌素C、卡柔比星、洋红霉素、嗜癌素、色霉素、放线菌素D、柔红霉素、地托比星、6-重氮-5-氧代-L-正亮氨酸、 (阿霉素)、吗啉-阿霉素、氰基吗啉-阿霉素、2-吡咯啉-阿霉素和脱氧阿霉素)、表阿霉素、依索比星、去甲氧基柔红霉素、麻西罗霉素、丝裂霉素(例如丝裂霉素C)、霉酚酸、诺加霉素、橄榄霉素、培洛霉素、泊非霉素、嘌呤霉素、三铁阿霉素、罗多比星、链黑菌素、链佐星、杀结核菌素、乌苯美司、净司他丁、佐柔比星；抗代谢产物，例如甲氨喋呤和5-氟尿嘧啶(5-FU)；叶酸类似物，例如二甲叶酸、甲氨喋呤、蝶罗呤、曲美沙特；嘌呤类似物，例如氟达拉滨、6-巯基嘌呤、硫咪嘌呤、硫鸟嘌呤；嘧啶类似物，例如环胞苷、阿扎胞苷、6-阿扎胞苷、卡莫氟、阿糖胞苷、双脱氧尿苷、去氧氟尿苷、依诺他宾、氟尿苷；雄激素，例如卡鲁睾酮、甲雄烷酮丙酸酯、环硫雄醇、美雄烷、睾内脂；抗肾上腺素，例如氨鲁米特、米托担、曲洛司坦；叶酸补充物，例如亚叶酸；醋葡醛内酯；醛磷酰胺糖苷；氨基硐戊酸；恩尿嘧啶；安吖啶；bestrabucil；比山群；依达曲沙；defofamine；地美可辛；地吖醌；依氟鸟氨酸；依利醋铵；埃博霉素；依托格鲁；硝酸镓；羟基脲；香菇多糖；氯尼达明；类美坦素，例如美登素和安丝菌素；米托胍腙；米托蒽醌；莫哌达醇；硝胺；喷司他丁；蛋氨氮芥；吡柔比星；洛索蒽醌；鬼臼酸；2-乙基酰肼；甲基苄肼；多糖复合物(JHS Natural Products,Eugene,Oreg.)；丙亚胺；根霉菌素；西索菲兰；锗螺胺；细交链孢菌酮酸；三亚胺醌；2,2',2”-三氯三乙胺；单端孢霉烯(尤其是T-2毒素、疣孢菌素A、杆孢菌素A和蛇形毒素)；乌拉坦；长春地辛；达卡巴嗪；甘露醇氮芥；二溴甘露醇；二溴卫矛醇；哌泊溴烷；gacytosine；阿拉伯糖苷(“Ara-C”)；环磷酰胺；噻替派；紫杉烷，例如(紫杉醇；Bristol-Myers Squibb Oncology,Princeton,N.J.)、(无Cremophor)、紫杉醇的白蛋白工程化纳米颗粒制剂(American Pharmaceutical Partners,Schaumberg,Ill.)和(多西他赛；Rhone-Poulenc Rorer,Antony,France)；苯丁酸氮芥；(吉西他滨)；6-硫鸟嘌呤；巯基嘌呤；甲氨喋呤；铂类似物，例如顺铂和卡铂；长春碱；依托泊苷(VP-16)；异环磷酰胺；米托蒽醌；长春新碱；(长春瑞滨)；诺消灵；替尼泊苷；依达曲沙；道诺霉素；氨基蝶呤；卡培他滨()；伊班膦酸盐；CPT-11；拓扑异构酶抑制剂RFS 2000；二氟甲 基鸟氨酸(DMFO)；类维生素A，例如视黄酸；和以上任一种的药学上可接受的盐、酸和衍生物。
“化学治疗剂”的定义中还包括：(i)作用以调节或抑制对肿瘤的激素作用的抗肿瘤剂，例如抗雌激素和选择性雌激素受体调节剂(SERM)，包括(例如)它莫西芬(包括柠檬酸它莫西芬)、雷洛昔芬、屈洛昔芬、4-羟基它莫西芬、曲沃昔芬、雷洛西芬、LY117018、奥那司酮和 (柠檬酸托瑞米芬)；(ii)抑制调节肾上腺中雌激素生成的芳香酶的芳香酶抑制剂，例如4(5)-咪唑、氨鲁米特、(醋酸甲地孕酮)、 (依西美坦；Pfizer)、福美坦、法屈唑、(伏氯唑)、 (来曲唑；Novartis)和(阿那曲唑；AstraZeneca)；(iii)抗雄激素，例如氟他胺、尼鲁米特、比卡鲁胺、亮丙瑞林和戈舍瑞林以及曲沙他滨(1,3-二氧戊环核苷胞嘧啶类似物)；(iv)蛋白激酶抑制剂；(v)脂质激酶抑制剂；(vi)反义寡核苷酸，尤其是抑制细胞异常增殖牵涉的信号途径中的基因表达的反义寡核苷酸，例如PKC-α、Ralf和H-Ras；(vii)核酶，例如VEGF表达抑制剂(例如，)和HER2表达抑制剂；(viii)疫苗，例如基因治疗疫苗，例如和 rIL-2；拓扑异构酶1抑制剂，例如 rmRH；(ix)抗血管生成剂，例如贝伐单抗(Genentech)；和(x)以上任一种的药学上可接受的盐、酸和衍生物。其它抗血管生成剂包括MMP-2(基质金属蛋白酶2)抑制剂、MMP-9(基质金属蛋白酶9)抑制剂、COX-II(环氧合酶II)抑制剂和VEGF受体酪氨酸激酶抑制剂。WO 96/33172、WO 96/27583、EP 818442、EP 1004578、WO 98/07697、WO 98/03516、WO 98/34918、WO 98/34915、WO 98/33768、WO 98/30566、EP 606,046、EP 931,788、WO 90/05719、WO 99/52910、WO 99/52889、WO 99/29667、WO 99/07675、EP 945864、美国专利No.5,863,949、美国专利No.5,861,510和EP 780,386中描述了这种可与现有化合物和/或组合物联合使用的有用基质金属蛋白酶抑制剂的实例，其全部通过引用整体并入本文。VEGF受体酪氨酸激酶抑制剂的实例包括4-(4-溴-2-氟苯胺)-6-甲氧基-7-(1-甲基哌啶-4-基甲氧基)喹唑啉(ZD6474；WO 01/32651中的实施例2)、4-(4-氟-2-甲基吲哚-5-基氧 基)-6-甲氧基-7-(3-吡咯烷-1-基丙氧基)-喹唑啉(AZD2171；WO 00/47212中的实施例240)、瓦他拉尼(PTK787；WO 98/35985)和SU11248(舒尼替尼；WO 01/60814)和例如PCT公布No.WO 97/22596、WO 97/30035、WO 97/32856和WO 98/13354中公开的化合物。
化学治疗剂的其它实例包括PI3K(磷酸肌醇-3激酶)的抑制剂，例如Yaguchi等(2006)Jour.of the Nat.Cancer Inst.98(8):545-556；美国专利No.7,173,029、美国专利No.7,037,915、美国专利No.6,608,056、美国专利No.6,608,053、美国专利No.6,838,457、美国专利No.6,770,641、美国专利No.6,653,320、美国专利No.6,403,588、WO 2006/046031、WO 2006/046035、WO 2006/046040、WO 2007/042806、WO 2007/042810、WO 2004/017950、US 2004/092561、WO 2004/007491、WO 2004/006916、WO 2003/037886、US 2003/149074、WO 2003/035618、WO 2003/034997、US 2003/158212、EP 1417976、US 2004/053946、JP 2001247477、JP 08175990、JP 08176070、美国专利No.6,703,414和WO 97/15658中公开的PI3K抑制剂，其全部通过引用整体并入本文。这种PI3K抑制剂的特定实例包括SF-1126(PI3K抑制剂，Semafore Pharmaceuticals)、BEZ-235(PI3K抑制剂，Novartis)、XL-147(PI3K抑制剂，Exelixis,Inc.)。
如本文所使用的术语“CD20”或“CD20抗原”指自然表达或在经CD20基因等转染的细胞上表达CD20的多肽和任何变异体、同种型和物种同系物。人CD20也称为MS4A1，跨膜4-结构域亚家族A成员1。在本领域中公认的CD20另外的异名包括CD20抗原、CD20受体、B-淋巴细胞表面抗原B1、B1、Bp35、LEU-16、MGC3969、MS4A2和S7。已描述了人CD20的两种转录变异体。变异体1表示较长转录变异体并且与GenBank ID(GI)68348720相对应。与变异体1相比，变异体3没有5'UTR部分并且与GenBank ID(GI)68348721相对应。变异体1和3编码相同蛋白质。人CD20的主要形式包括由GenBank Protein ID 23110989描述的297个氨基酸蛋白。
术语“表位”指能够与抗体特异性结合的蛋白质决定簇。表位通常由分子的化学活性表面分组(例如氨基酸或糖侧链)组成，并且通常具有特定的三维 结构特征以及特定的电荷特征。
术语“筏”指位于细胞质膜外小叶区中的鞘脂和胆固醇富集膜微结构域。某些蛋白质在此结构域中的缔合能力可影响蛋白质的功能。例如，在被本发明的抗体和/或其片段结合后，CD20分子向脂筏内移动在质膜内产生高密度的CD20抗原-抗体复合物。这种高密度的CD20抗原-抗体复合物可使补体系统在CDC期间有效激活。
如本文所使用的术语“抗体”或片段等包括含有分子的任何蛋白质或肽，所述分子包含免疫球蛋白分子的至少一部分，例如但不限于重链或轻链的至少一个互补决定区(CDR)或其配体结合部分，重链或轻链可变区、重链或轻链恒定区、框架区或其任何部分，或可并入本发明CD20抗体中的抗原或抗原受体或结合蛋白的至少一部分。这种抗体任选进一步影响特定配体，例如但不限于，这种抗体在体外、原位、体内和离体调节、降低、增强、拮抗、促进、减轻、缓和、阻碍、抑制、废除和/或干扰至少一种抗原活性或结合，或抗原受体活性或结合。作为非限制性实例，公开了各种CD20特异性抗体，其中特定部分或变异体可结合至少一个抗原分子或其特定部分、变异体或结构域。适合的抗原特异性抗体、特定部分或变异体也可任选影响至少一种活性或功能，例如但不限于，RNA、DNA或蛋白质合成、释放、受体信号、膜缔合、结合活性、蛋白质生成和/或合成。
抗体是由两条相同轻链(LC)和两条相同重链(HC)组成的杂四聚糖蛋白。通常，每条轻链通过一个共价二硫键与重链连接，而二硫键的数量随不同免疫球蛋白同种型的重链变化。每条重链和轻链还具有间隔的链内二硫桥。每条重链的一端具有可变结构域(VH)，接着是许多恒定结构域。每条轻链的一端具有可变结构域(VL)并且其另一端具有恒定结构域；轻链的恒定结构域与重链的第一恒定结构域对齐并且轻链可变结构域与重链的可变结构域对齐。根据其恒定结构域的氨基酸序列，可将任何脊椎动物物种的抗体轻链分为两个明显不同类型即κ和λ其中之一。可根据重链恒定结构域氨基酸序列将免疫球蛋白分为5大类，即IgA、IgD、IgE、IgG和IgM。IgA和IgG进一步再分类为同种型IgA1、IgA2、IgG1、IgG2、IgG3和IgG4。
抗体片段包括含有分子的任何蛋白质或肽，所述分子包含免疫球蛋白分子的至少一部分，例如但不限于至少一个重链或轻链的互补决定区(CDR)或其配体结合部分，重链或轻链可变区、重链或轻链恒定区、框架区或其任何部分，或可并入本发明CD20抗体中的抗原或抗原受体或结合蛋白的至少一部分。
术语“可变”指在抗体之中可变结构域的某些部分在序列上广泛不同的事实并且在每种特定抗体对其特定抗原的结合和特异性中使用。然而，可变性并非均匀分布于抗体的整个可变结构域。可变性集中在轻链和重链可变结构域中称为互补决定区(CDR)或高变区的3个区段中。可变结构域的更加高度保守部分称为框架(FR)。天然重链和轻链的可变结构域各自包含4个FR区，大部分采用β折叠构型，由三个CDR连接，形成环连接，并且在一些情况下形成β折叠结构的一部分。通过FR区使每条链上的CDR与来自另一条链的CDR紧紧靠在一起，有助于形成抗体的抗原结合位点(见Kabat等，Sequences of Proteins of Immunological Interest，第5版，National Institute of Health,Bethesda,Md.(1991))。恒定结构域未直接牵涉使抗体与抗原结合，但展现出各种效应子功能，例如抗体参与抗体依赖的细胞毒性。
术语“抗体”还包括消化片段、其特定部分和变异体，包括抗体模拟物或包含模拟抗体或其特定片段或部分的结构和/或功能的抗体部分，包括单链抗体及其片段。功能片段包括抗原结合片段，所述抗原结合片段单独或与其它抗原联合结合哺乳动物抗原(例如CD20)，所述其它抗原例如人表皮生长因子受体(HER1)、IgE、血管内皮生长因子、HER二聚化抑制剂、Bcl-2家族蛋白、MET、IL-13、IFNα、EGFL7、CD40、DR4和DR5、PI3激酶、淋巴毒素α、β7整联蛋白、淀粉样蛋白β、CRIg、TNF、补体(C5)、CBL、CD147、IL-8、gp120、VLA-4、CD11a、CD18、VEGF、CD40L、Id、ICAM-1、CD2、EGFR、TGF-β、TNF-α、E-选择蛋白、Fact VII、TNF、Her2/neu、F gp、CD11/18、CD14、ICAM-3、CD80、CD40L、CD4、CD23、β2-整联蛋白、α4β7、CD52、HLA DR、CD22、CD64(FcR)、TCRαβ、CD2、CD3、Hep B、CA 125、EpCAM、gp120、CMV、gpIIbIIIa、IgE、IL5、IL-4、CD25、CD3、CD33、CD19、CD22、CD28、CD36、CD37、CD44、CD55、CD59、CD70、CD79、CD80、CD103、 CD134、CD137、CD138、CD152、CD30、HLA、VNR整联蛋白、CD25、IL-23和IL-12。例如，能够与抗原或其部分结合的抗体片段包括但不限于Fab(例如，经木瓜蛋白酶消化)、Fab'(例如，经胃蛋白酶消化和部分还原)和F(ab')2(例如，经胃蛋白酶消化)、facb(例如，经纤维蛋白溶酶消化)、pFc'(例如，经胃蛋白酶或纤维蛋白溶酶消化)、Fd(例如，经胃蛋白酶消化、部分还原和再聚集)、Fv或scFv(例如，经分子生物学技术)片段为本发明所涵盖(见，例如，Colligan,Immunology)。
可通过如本领域中已知和/或如本文所述的酶裂解、合成或重组技术生成此类片段。也可使用在自然终止位点上游引入了一个或多个终止密码子的抗体基因生成各种截断形式的抗体。例如，可将编码F(ab')2重链部分的组合基因设计为包括编码重链的CH1结构域和/或铰链区的DNA序列。可在化学上通过常规技术将抗体的各个部分连在一起，或可使用基因工程技术制备为邻接蛋白。
“封闭性”抗体或“拮抗剂”抗体为抑制或降低其结合的抗原(例如CD20)的生物学活性的抗体。优选的封闭性抗体或拮抗剂抗体大体上或完全抑制抗原的生物学活性。令人满意的是，生物学活性降低10％、20％、30％、50％、70％、80％、90％、95％或甚至100％。
如本文所使用的“激动剂抗体”为模拟目标参考多肽的至少一种功能活性的抗体。
“抗独特型(抗-Id)抗体”为识别通常与抗体的抗原结合位点缔合的独特决定簇的抗体。可通过用正要制备抗Id的mAb使相同物种和基因型的动物(例如，小鼠)免疫作为mAb源制备Id抗体。免疫动物将识别免疫抗体的独特型决定簇并通过产生这些独特型决定簇的抗体(抗Id抗体)对所述独特型决定簇反应。见，例如，美国专利No.4,699,880，其通过引用整体并入本文。抗Id抗体也可用作“免疫原”以诱导另一种动物的免疫反应，从而生成所谓的抗-抗Id抗体。抗-抗Id表位可能与诱导抗Id的原mAb相同。因此，通过使用mAb独特型决定簇的抗体，可能鉴定其它表达具有相同特异性的抗体的克隆。
“分离”抗体是从其自然环境分离和/或回收的抗体。其自然环境的污染物组分为会影响抗体的诊断或治疗用途的物质，并且可能包括酶、激素和其它蛋白质或非蛋白质溶质。在优选的方面，将抗体纯化至(1)按抗体重量计高于95％，如通过(例如)劳里法确定，且最优选为按重量计高于99％，(2)纯化至足以使用旋转杯序列分析仪获得N末端或内部氨基酸序列的至少15个残基的程度，或(3)纯化至均质，通过在还原或非还原条件下使用考马斯蓝或优选银染色进行SDS-PAGE(十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳)。分离抗体包括重组细胞内的原位CD20抗体，因为抗体自然环境的至少一种组分将不存在。然而，一般地，将通过至少一个纯化步骤制备分离的抗体。
术语“利妥昔单抗”或“”指美国专利No.5,736,137(Anderson等)中描述为“C2B8”的市售的嵌合抗CD20抗体。术语“2F2”或“ofatumumab”指WO 2004/035607(Teeling等(2004))中描述的全人抗CD20抗体。术语“GA101”或“阿夫土珠”指WO 2005/0448959(Umana，美国专利序列No.5,639,641(2005))中描述的由重链B-HH6和轻链B-KV1组成的人源化和糖基-工程化抗CD20抗体。术语“B1”指与的未标记抗体组分相对应的鼠抗CD20抗体托西莫单抗。
如本文所使用的术语“III类”抗体包括与CD20、其表位和/或其同种型结合的完整抗体或其片段，所述完整抗体或其片段与II类抗体相似具有在交联剂不存在时大体上诱导细胞凋亡的能力，并且与I类抗体相似具有引起CD20重新分布于脂筏和大体上诱导补体依赖的细胞毒性(CDC)的能力。
如本文所使用的术语“工程化抗体”或“改变抗体”包括具有重要人框架和恒定区(CL、CH结构域(例如，CH1、CH2、CH3)和铰链)和源自抗原结合抗体(例如抗CD20抗体)或其片段的CDR的抗体。全人框架包括与人种系序列以及具有体细胞突变的序列相对应的框架。CDR可能源自一个或多个与任何抗体框架环境中或外部的抗原缔合或结合的CDR。例如，本发明针对CD20的人工程化抗体的CDR可能源自结合小鼠抗体框架环境中的抗原的CDR，然后工程化以结合人框架环境中的抗原。通常，人工程化抗体在人体内大体上非免疫原性。
类似地，抗体指定为灵长类(猴子、狒狒、黑猩猩等)、啮齿动物(小鼠、大鼠、兔、豚鼠、仓鼠等)和其它哺乳动物的抗体分为此物种、亚属、属、亚家族和家族特异性抗体。进一步地，嵌合抗体可包括以上的任何组合。相对于非修饰抗体，这种变化或变异任选且优选保持或降低在人体或其它物种中的免疫原性。人工程化抗体不同于嵌合或人源化抗体。
可用能够表达功能性重排人或人工程化免疫球蛋白(例如，重链和/或轻链)基因的非人动物或原核或真核细胞产生工程化抗体。进一步地，当工程化抗体为单链抗体时，其可包含在天然人或非人抗体中未发现的连接肽。例如，Fv可包含连接重链可变区和轻链可变区的连接肽，例如2至约8个甘氨酸或其它氨基酸残基。这种连接肽被认为是人源性。
可使用的双特异性、异种特异性、异种偶联或相似抗体为对至少两种不同抗原(例如CD20和非CD20抗原)具有结合特异性的单克隆抗体，优选为人、人工程化、表面重塑或人源化抗体。在目前情况下，一种结合特异性对于至少一种抗原蛋白，另一种结合特异性对于另一种抗原蛋白。制备双特异性抗体的方法在本领域中已知。传统地，双特异性抗体的重组生成是基于两个免疫球蛋白重链-轻链对的共表达，其中两条重链具有不同特异性(Milstein和Cuello，Nature 305:537(1983))。由于免疫球蛋白重链和轻链随机分配，这些杂交瘤(四源杂交瘤)生成约10种不同抗体分子的可能混合物，其中仅一种具有正确的双特异性结构。正确分子的纯化通常通过亲和色谱步骤或如本文另外所述进行。例如，在WO 93/08829、美国专利No.6,210,668、6,193,967、6,132,992、6,106,833、6,060,285、6,037,453、6,010,902、5,989,530、5,959,084、5,959,083、5,932,448、5,833,985、5,821,333、5,807,706、5,643,759、5,601,819、5,582,996、5,496,549、4,676,980、WO 91/00360、WO 92/00373、EP 03089，Traunecker等，EMBO J.10:3655(1991)，Suresh等，Methods in Enzymology 121:210(1986)，U.S.20090258026、U.S.20060140946和U.S.20070298040中公开了相似方法，每个均通过引用整体并入本文。
抗体“效应子功能”指可归因于抗体的Fc区(天然序列Fc区或氨基酸序列变异体Fc区)的那些生物学活性，并且随抗体同种型变化。抗体效应子功 能的实例包括：C1q结合和补体依赖的细胞毒性(CDC)、Fc受体结合、抗体依赖细胞介导的细胞毒性(ADCC)、吞噬作用、细胞表面受体(例如，B细胞受体)的下调和B细胞激活。
“人效应细胞”为表达一个或多个FcR并执行效应子功能的白细胞。在某些方面，细胞表达至少一个FcyRIII并执行ADCC效应子功能。介导ADCC的人白细胞的实例包括周围血单核细胞(PBMC)、自然杀伤(NK)细胞、单核细胞、细胞毒性T细胞和嗜中性粒细胞。可从天然来源，例如从血液中分离效应细胞。
抗CD20抗体
根据申请人的发现，尤其，本发明的抗CD20抗体及其片段、偶联物、组合物和方法可为突变抗体等。抗CD20抗体可为“工程化抗体”或改变抗体，例如抗CD20抗体的氨基酸序列变异体，其中抗CD20抗体的一个或多个氨基酸残基经修饰。除非本文另外指出或已知，对抗CD20抗体氨基酸序列的修饰包括用于提高抗体或片段对其抗原的亲和力或亲和势的多肽和/或多核苷酸序列的修饰，和/或用于提高效应子功能的抗体的Fc部分的修饰。可对任何已知的抗CD20抗体或本文所述的鉴定的抗CD20抗体进行修饰。这种改变抗体与参考抗CD20抗体必须具有低于100％序列同一性或相似性。在优选的方面，改变抗体将具有与抗CD20抗体重链或轻链可变结构域的氨基酸序列具有至少20％、25％、35％、45％、55％、65％或75％氨基酸序列同一性或相似性，更优选至少80％，更优选至少85％，更优选至少90％和最优选至少95％氨基酸序列同一性或相似性的氨基酸序列。在优选的方面，改变抗体将具有与抗CD20抗体重链CDR1、CDR2或CDR3的氨基酸序列具有至少25％、35％、45％、55％、65％或75％氨基酸序列同一性或相似性，更优选至少80％，更优选至少85％，更优选至少90％和最优选至少95％氨基酸序列同一性或相似性的氨基酸序列。在优选的方面，改变抗体将保持人CD20结合能力。在某些方面，本发明的抗CD20抗体包含与SEQ ID NO:47、34、35和36的氨基酸序列具有约10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、 98％、99％或更多同一性的重链。在某些方面，本发明的抗CD20抗体包含与SEQ ID NO:46、32或33的氨基酸序列具有约10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或更多同一性的轻链。在优选的方面，改变抗体将具有与抗CD20抗体轻链CDR1、CDR2或CDR3的氨基酸序列具有至少25％、35％、45％、55％、65％或75％氨基酸序列同一性或相似性，更优选至少80％，更优选至少85％，更优选至少90％和最优选至少95％、96％、97％、98％、99％氨基酸序列同一性或相似性的氨基酸序列。
在本发明的一些实施方案中，抗CD20抗体可为“工程化抗体”或改变抗体，例如抗CD20抗体的氨基酸序列变异体，其中抗CD20抗体的一个或多个氨基酸残基经修饰。除非本文另外指出或已知，对抗CD20抗体氨基酸序列的修饰包括对用于提高抗体或片段对其抗原的亲和力或亲和势的多肽和/或多核苷酸序列的修饰，和/或用于提高效应子功能的抗体的Fc部分的修饰。可对任何已知抗CD20抗体或如本文所述鉴定的抗CD20抗体进行修饰。这种改变抗体与参考抗CD20抗体必须具有低于100％序列同一性或相似性。在优选的方面，当与抗CD20抗体重链或轻链可变结构域的氨基酸序列相比时，改变抗体将具有至少1-5、1-3、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、35、40、45或50个保守性氨基酸取代的氨基酸序列。在优选的方面，当与抗CD20抗体重链CDR1、CDR2或CDR3的氨基酸序列相比时，改变抗体将具有至少1-20、1-15、1-10、1-5、1-3、20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2或1个保守性氨基酸取代的氨基酸序列。在优选方面，改变抗体将保持人CD20结合能力。在某些方面，本发明的抗CD20抗体包含具有与SEQ ID NO:47、34、35和36的氨基酸序列的氨基酸序列相比具有约1-20、1-15、1-10、1-5、1-3、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、35、40、45或50个保守性氨基酸取代的氨基酸序列的重链。在某些方面，本发明的抗CD20抗体包含具有与SEQ ID NO:46、32或33的氨基酸序列的的氨基酸序列相比具有约1-20、1-15、1-10、1-5、 1-3、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、35、40、45或50个保守性氨基酸取代的氨基酸序列的重链。在优选方面，改变抗体将具有与抗CD20抗体的轻链CDR1、CDR2或CDR3的氨基酸序列相比具有至少1-20、1-15、1-10、1-5、1-3、20、19、18、17、16、15、14,13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2或1个保守性氨基酸取代的氨基酸序列。
生成抗CD20抗体CD20-7和CD20-6的杂交瘤已经保藏于ATCC，保藏编号为PTA-10487和PTA-10486。
如本领域中已知的“％同一性”是通过比较其序列确定的两个多核苷酸或两个多肽之间关系的测量。本文将关于序列的同一性或相似性定义为比对序列并且必要时引入空位以达到最高百分比序列同一性后，候选序列中与抗CD20抗体残基具有同一性(即，相同残基)或相似性(即，来自基于常见侧链性质的相同基团的氨基酸残基，见下文)的氨基酸残基的百分比。不应将N末端、C末端或内部延伸、缺失或插入至可变结构域外的抗体序列视为影响序列同一性或相似性。通常，比对待比较的两个序列以给出序列之间的最大相关性。检查两个序列的比对，给出检查的两个序列之间准确氨基酸或核苷酸对应的位置数量除以比对总长度并乘以100以给出％同一性数字。可确定待比较序列整个长度上的％同一性数字，这尤其适于长度相同或非常相似和高度同源的序列，或可确定较短限定长度上的％同一性数字，这更适于长度不等或具有较低同源水平的序列。
例如，可在生成扩展名为“.aln”的文件的Unix下用软件clustalW比对序列，然后可将这个文件输入Bioedit程序(Hall,T.A.1999,BioEdit:a user-friendly biological sequence alignment editor and analysis program for Windows 95/98/NT.Nucl.Acids.Symp.Ser.41:95-98)，该程序打开.aln文件。在Bioedit窗口中，人们可选择个别序列(一次两个)并对其进行比对。这种方法允许比较整个序列。
比较两个或更多个序列的同一性的方法在本领域中众所周知。因此，例如，9.1版Wisconsin序列分析包中程序可用(Devereux J.等，Nucleic Acids Res., 12:387-395,1984，可从Genetics Computer Group,Madison,Wis.,USA购买获得)。可使用数学算法实现两个序列之间百分比同一性的确定。例如，可使用程序BESTFIT和GAP确定两个多核苷酸之间的％同一性和两个多肽序列之间的％同一性。BESTFIT使用Smith和Waterman的“局部同源性”算法(Advances in Applied Mathematics,2:482-489,1981)并找出两个序列之间具有相似性的最佳单一区。BESTFIT更适于比较长度不同的两个多核苷酸或两个多肽序列，该程序假设较短序列表示较长序列的一部分。相比之下，GAP比对两个序列，根据Neddleman和Wunsch算法(J.Mol.Biol.,48:443-354,1970)找出“最大相似性”。GAP更适于比较长度大致相同的序列并且预期比对整个长度。优选地，每个程序中使用的参数“空位权重”和“长度权重”对于多核苷酸而言分别为50和3，对于多肽而言分别为12和4。优选地，当最佳比对待比较的两个序列时确定％同一性和相似性。
本领域中还已知用于确定两个序列之间的同一性和/或相似性的其它程序，例如BLAST家族程序(Karlin&Altschul,1990,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,87:2264-2268，按Karlin&Altschul,1993,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,90:5873-5877修改，可从美国马里兰州贝塞斯达国家生物技术信息中心获得并且可通过www.ncbi.nlm.nih.gov上的NCBI主页访问)。这些程序例示了用于比较两个序列的数学算法的优选非限制性实例。这种算法并入了Altschul等，1990,J.Mol.Biol.,215:403-410的NBLAST和XBLAST程序中。可用NBLAST程序进行BLAST核苷酸搜索，得分＝100，字长＝12，以获得与编码本发明任何抗CD20抗体的全部或一部分的核酸分子同源的核苷酸序列。可用XBLAST程序进行BLAST蛋白质搜索，得分＝50，字长＝3，以获得与本发明蛋白质分子同源的氨基酸序列。为了比较获得空位比对，可如Altschul等，1997,Nucleic Acids Res.,25:3389-3402所述利用空位BLAST。可选地，PSI-Blast可用于进行迭代搜索，检测分子之间的远距关系(Id.)。利用BLAST、空位BLAST和PSI-Blast程序时，可使用各个程序的缺省参数(例如，XBLAST和NBLAST)。见，http://www.ncbi.nlm.nih.gov。用于比较序列的数学算法的另一优选非限制性实例为Myers和Miller的算法，1988,CABIOS 4:11-17。这种算法并入ALIGN程序(2.0版)，其是GCG序列比对软件包的一部分。当利 用ALIGN程序比较氨基酸序列时，可使用PAM120重量残基表，空位长度罚份为12，且空位罚分为4。
本领域中已知用于确定序列之间的同一性和/或相似性的程序的另一非限制性实例为FASTA(Pearson W.R.和Lipman D.J.，Proc.Nat.Acad.Sci.USA,85:2444-2448,1988，可作为Wisconsin序列分析包的一部分使用)。优选地，BLOSUM62氨基酸取代矩阵(Henikoff S.和Henikoff J.G.,Proc.Nat.Acad.Sci.USA,89:10915-10919,1992)用于多肽序列比较，包括在比较之前首先将核苷酸序列翻译为氨基酸序列。
本领域中已知用于确定氨基酸序列之间的同一性和/或相似性的程序的又一非限制性实例为SeqWeb软件(GCG Wisconsin软件包的基于网页的界面：空位程序)，与程序的缺省算法和参数设置一起利用：blosum62、空位权重8、长度权重2。
可使用与以上所述技术相似的允许或不允许空位的技术确定两个序列之间的百分比同一性。在计算百分比同一性时，通常计数精确匹配。
可使用程序BESTFIT确定查询多核苷酸或多肽序列与本发明多核苷酸或多肽序列的％同一性，最佳比对查询和参考序列并且将程序的参数设定为缺省值。
为生成改变抗体，将一个或多个氨基酸改变(例如，取代)引入抗体的一个或多个高变区。可选地，或另外，可将框架区残基的一个或多个改变(例如，取代)引入抗CD20抗体，其中这些改变引起抗体突变体对抗原的结合亲和力增强。修饰的框架区残基的实例包括直接非共价结合抗原(Amit等，Science,233:747-753(1986))；与CDR构象相互作用/影响CDR构象(Chothia等，J.Mol.Biol.,196:901-917(1987))；和/或参与VL VH界面的残基。在某些方面，修饰一个或多个此类框架区残基引起抗体对抗原的结合亲和力增强。例如，在本发明的这个方面可改变约1至约5个框架残基(例如，1、2、3、4或5)。有时，这可能足以产生结合亲和力增强的抗体，甚至在没有改变高变区残基时。然而，通常改变抗体将包含另外的高变区改变。
经改变的高变区残基可随机变化，尤其是当抗CD20抗体对抗原的起始结合亲和力以致可易于筛选这种随机生成的改变抗体时。
一种生成这种改变抗体的有用方法称为“丙氨酸扫描诱变”(Cunningham和Wells，Science,244:1081-1085(1989))。可用丙氨酸或多聚丙氨酸残基取代一个或多个高变区残基以影响氨基酸与抗原的相互作用。然后可通过在取代位点引入另外或其它的突变改进那些对取代展示出功能敏感性的高变区残基。因此，虽然预先确定了引入氨基酸序列变异的位点，但突变本身的性质不需要预先确定。筛选用这种方法生成的Ala-突变体如本文所述和/或如本领域中已知的生物学活性。
生成这种改变抗体的另一种方法包括使用噬菌体展示进行亲和力成熟化(Hawkins等，J.Mol.Biol.,254:889-896(1992)和Lowman等，Biochemistry,30(45):10832-10837(1991))。简言之，使若干高变区位点(例如，6-7个位点)突变以在每个位点生成所有可能的氨基酸取代。因此以来自丝状噬菌体颗粒的单价形式将生成的抗体突变体展示为与每个颗粒中包裹的M13的基因III产物融合。然后筛选噬菌体展示突变体如本文公开和/或如本领域中已知的生物学活性(例如，结合亲和力)。
抗体序列的突变可能包括取代、缺失(包括内部缺失)、添加(包括产生融合蛋白的添加)，或氨基酸序列中和/或与之相邻的氨基酸残基的保守性取代，但保守性取代引起“沉默”变化，因为所述变化产生功能等效抗CD20抗体或片段。可以基于所涉残基的极性、电荷、溶解性、疏水性、亲水性和/或两亲性质的相似性进行保守性氨基酸取代。例如，非极性(疏水性)氨基酸包括丙氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、色氨酸和甲硫氨酸；极性中性氨基酸包括甘氨酸、丝氨酸、苏氨酸、半胱氨酸、酪氨酸、天冬酰胺和谷氨酰胺；带正电的(碱性)氨基酸包括精氨酸、赖氨酸和组氨酸；并且带负电的(酸性)氨基酸包括天冬氨酸和谷氨酸。另外，甘氨酸和脯氨酸是可影响链定向的残基。非保守性取代将需要使这些类别其中之一的成员换为另一类别的成员。而且，如果需要，可将非传统氨基酸或化学氨基酸类似物作为取代或添加引入抗体序列。非传统氨基酸通常包括但不限于常见氨基酸的D-异 构体，α-氨基异丁酸、4-氨基丁酸、Abu、2-氨基丁酸、γ-Abu、ε-Ahx、6-氨基己酸、Aib、2-氨基异丁酸、3-氨基丙酸、鸟氨酸、正亮氨酸、正缬氨酸、羟基脯氨酸、肌氨酸、瓜氨酸、磺基丙氨酸、叔丁基甘氨酸、叔丁基丙氨酸、苯基甘氨酸、环己基丙氨酸、β-丙氨酸、氟-氨基酸、设计氨基酸，例如β-甲基氨基酸、Cα-甲基氨基酸、Nα-甲基氨基酸和氨基酸类似物。
另一方面，使用噬菌体展示使选择进行修饰的位点亲和力成熟化(见上文)。
为了在抗体序列中产生氨基酸取代，或为了生成/缺失限制性位点以利于进一步操作，可使用本领域中已知的任何诱变技术修饰DNA序列中的单独核苷酸。此类技术包括但不限于化学诱变、体外定点诱变(Kunkel,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,82:488(1985)；Hutchinson,C.等，J.Biol.Chem.,253:6551(1978))、寡核苷酸定点诱变(Smith,Ann.Rev.Genet.,19:423-463(1985)；Hill等，Methods Enzymol.,155:558-568(1987))、基于PCR的重叠延伸(Ho等，Gene,77:51-59(1989))、基于PCR的大引物诱变(Sarkar等，Biotechniques,8:404-407(1990))等。可通过双链双脱氧DNA测序确认修饰。
本发明的分离核酸可用于产生至少一种CD20特异性抗体或其片段或特定变异体，其可用于在细胞、组织、器官或动物(包括哺乳动物和人)中测量或实现，用于诊断、监测、调节、治疗、缓解、帮助预防至少一种病状发病或减轻所述病状的症状，所述病状选自但不限于至少一种免疫性病症或疾病、心血管病症或疾病、传染性、恶性和/或神经病症或疾病或其它已知或特定抗原相关的病状。
明显地，可将对人蛋白质或其片段(例如CD20)有特异性的人工程化抗体工程化为针对其它免疫原性抗原或同种型，例如CD20蛋白和/或其部分(包括合成分子，例如合成肽)或任一种抗原或抗原组合，例如CD56、人表皮生长因子受体(HER1)、IgE、血管内皮生长因子、HER二聚化抑制剂、Bcl-2家族蛋白、MET、IL-13、IFNα、EGFL7、CD40、DR4和DR5、PI3激酶、淋巴毒素α、β7整联蛋白、淀粉样蛋白β、CRIg、TNF、补体(C5)、CBL、CD147、IL-8、gp120、VLA-4、CD11a、CD18、VEGF、CD40L、Id、ICAM-1、CD2、 EGFR、TGF-β、TNF-α、E-选择蛋白、Fact VII、TNF、Her2/neu、F gp、CD11/18、CD14、ICAM-3、CD80、CD40L、CD4、CD23、β2-整联蛋白、α4β7、CD52、HLA DR、CD22、CD64(FcR)、TCRαβ、CD2、CD3、Hep B、CA 125、EpCAM、gp120、CMV、gpIIbIIIa、IgE、IL5、IL-4、CD25、CD3、CD33、CD30、CD19、CD22、CD28、CD36、CD37、CD44、CD55、CD59、CD70、CD79、CD80、CD103、CD134、CD137、CD138、CD152、HLA、VNR整联蛋白、CD25、IL-23和IL-12。
抗体生成
可任选用本领域中众所周知的细胞系、混合细胞系、永生化细胞或永生化细胞的无性系种群生成本发明至少一种抗原特异性抗体，例如抗CD20抗体。见，例如，Ausubel等编，Current Protocols in Molecular Biology,John Wiley&Sons,Inc.,NY,N.Y.(1987-2001)；Sambrook等，Molecular Cloning:A Laboratory Manual，第2版，Cold Spring Harbor,N.Y.(1989)；Harlow和Lane，Antibodies,a Laboratory Manual,Cold Spring Harbor,N.Y.(1989)；Colligan等编，Current Protocols in Immunology,John Wiley&Sons,Inc.,NY(1994-2001)；Colligan等，Current Protocols in Protein Science,John Wiley&Sons,NY,N.Y.,(1997-2001)。
在一种方法中，通过使合适的永生细胞系(例如，骨髓瘤细胞系，例如但不限于Sp2/0、Sp2/0-AG14、NS0、NS1、NS2、AE-1、L.5、L243、P3X63Ag8.653、Sp2SA3、Sp2MAI、Sp2SS1、Sp2SA5、U937、MLA 144、ACT IV、MOLT4、DA-1、JURKAT、WEHI、K-562、COS、RAJI、NIH 3T3、HL-60、MLA 144、NAMALWA、NEURO 2A等，或异源骨髓瘤、其融合产物或源自其中的任何细胞或融合细胞，或本领域中已知的任何其它适合细胞系)(见，例如www.atcc.org,www.lifetech.com.等)与抗体生成细胞融合生成杂交瘤，所述抗体生成细胞例如但不限于分离或克隆脾、周围血、淋巴、扁桃体或其它免疫性或含有B细胞的细胞，或表达重链或轻链恒定或可变或框架或CDR序列的任何其它细胞，如同内源或异源核酸，如同重组或内源、病毒、细菌、海藻、原核、两栖动物、昆虫、爬行动物、鱼、哺乳动物、啮齿动物、马、羊、 山羊、绵羊、灵长类动物、真核、基因组DNA、cDNA、rDNA、线粒体DNA或RNA、叶绿体DNA或RNA、hnRNA、mRNA、tRNA、单链、双链或三链杂交核酸等或其任何组合。见，例如Ausubel，同上和Colligan,Immunology，同上，第2章，通过引用整体并入本文。
也可从已经用目标抗原免疫的人或其它适合动物的周围血，或优选从脾脏或淋巴结获得抗体生成细胞。任何其它适合宿主细胞也可用于表达编码本发明抗体、其特定片段或变异体的异源或内源核酸。可使用选择培养基条件或其它适合的已知方法分离融合细胞(杂交瘤)或重组细胞，并且可通过有限稀释或细胞分选或其它已知方法克隆。可通过适合测定(例如，ELISA，更特别地CD20ELISA)选择生成具有所需特异性的抗体的细胞。
另外，可如本文所述和/或如本领域中已知，通过免疫能够生成一系列人抗体的转基因动物(例如，小鼠、大鼠、仓鼠、非人灵长类动物等)生成人抗原特异性抗体。可从此类动物中分离生成抗原特异性抗体的细胞并使用适合方法，例如本文所述方法使细胞永生化。
可通过已知方法(例如，但不限于授予Lonberg等的美国专利No.5,770,428、5,569,825、5,545,806、5,625,126、5,625,825、5,633,425、5,661,016和5,789,650；Jakobovits等WO 98/50433，Jakobovits等WO 98/24893，Lonberg等WO 98/24884，Lonberg等WO 97/13852，Lonberg等WO 94/25585，Kucherlapate等WO 96/34096，Kucherlapate等EP 0463151B1，Kucherlapate等EP 0710 719 A1，Surani等美国专利No.5,545,807，Bruggemann等WO 90/04036，Bruggemann等EP 0438 474 B1，Lonberg等EP 0814 259 A2，Lonberg等GB 2 272 440 A，Lonberg等Nature 368:856-859(1994)，Taylor等Int.Immunol.6(4)579-591(1994)，Green等Nature Genetics 7:13-21(1994)，Mendez等Nature Genetics 15:146-156(1997)，Taylor等Nucleic Acids Research 20(23):6287-6295(1992)，Tuaillon等Proc Natl Acad Sci USA 90(8)3720-3724(1993)，Lonberg等Int Rev Immunol 13(1):65-93(1995)和Fishwald等Nat Biotechnol 14(7):845-851(1996)，其每个均通过引用整体并入本文)产生可生成一系列与人抗原(例如CD20)结合的人抗体的转基因小鼠。通常，这些小鼠包 含至少一个转基因，所述转基因包含来自至少一个功能性重排或可经受功能性重排的人免疫球蛋白基因座的DNA。可破坏或去除此类小鼠体内的内源性免疫球蛋白基因座以消除动物生成内源基因编码抗体的能力。
使用肽展示库、噬菌体展示和其它已知方法可方便地实现筛选抗体与类似蛋白质或片段的特异性结合。肽展示方法包括从大量肽中筛选出具有所需功能或结构的个体成员。肽展示库的抗体筛选在本领域中众所周知。展示的肽序列长度可为3-5000个或更多个氨基酸，常常为5-100个氨基酸长，并且通常为约8-25个氨基酸长。除生成肽库的直接化学合成法外，还描述了若干重组DNA方法。一类方法包括在噬菌体或细胞表面展示肽序列。每个噬菌体或细胞均含有编码特定展示肽序列的核苷酸序列。PCT专利公布No.91/17271、91/18980、91/19818和93/08278中描述了此方法。
生成肽库的其它系统具有体外化学合成和重组方法的多个方面。例如，PCT专利公布No.92/05258、92/14843和96/19256中描述了这些系统的实例。同样见，美国专利No.5,658,754和5,643,768。肽展示库、载体和筛选试剂盒可从诸如Invitrogen(Carlsbad,Calif.)和Cambridge Antibody Technologies(Cambridgeshire,UK)等供应商处购买获得。例如，让与Enzon的美国专利No.4,704,692、4,939,666、4,946,778、5,260,203、5,455,030、5,518,889、5,534,621、5,656,730、5,763,733、5,767,260、5,856,456；让与Dyax的美国专利No.5,223,409、5,403,484、5,571,698、5,837,500；让与Affymax的美国专利No.5,427,908、5,580,717；让与Cambridge Antibody Technologies的美国专利No.5,885,793；让与Genentech的美国专利No.5,750,373；让与Xoma等的美国专利No.5,618,920、5,595,898、5,576,195、5,698,435、5,693,493、5,698,417；和Sambrook，见上文中描述了这些系统的实例。也可使用至少一种抗原特异性抗体编码核酸以提供在其乳汁中生成此类抗体的转基因动物或哺乳动物，例如山羊、牛、马、绵羊、兔等，制备本发明的CD20抗体。也可使用已知方法提供此类动物。例如，但不限于，美国专利No.5,827,690、5,849,992、4,873,316、5,849,992、5,994,616、5,565,362、5,304,489等中描述了这些方法的实例。本文提到的每个参考通过引用整体并入。
另外可使用至少一种抗原特异性抗体编码核酸以提供在植物部分或由此培养的细胞中生成此类抗体、特定部分或变异体的转基因植物和培养的植物细胞(例如，但不限于，烟草和玉米)来制备本发明的抗CD20抗体。作为非限制性实例，成功使用表达重组蛋白的转基因烟草叶提供大量重组蛋白，例如使用诱导型启动子。见，例如，Cramer等，Curr.Top.Microbol.Immunol.240:95-118(1999)和本文引用的参考。同样，可使用转基因玉米在商业生产水平表达哺乳动物蛋白，生物活性与其它重组系统中生成的蛋白质或从自然来源中纯化的蛋白质相当。见，例如，Hood等，Adv.Exp.Med.Biol.464:127-147(1999)和其中引用的参考。由转基因植物种子，包括烟草种子和马铃薯块茎生成大量抗体(包括抗体片段，例如单链抗体(ScFv))。见，例如，Conrad等，Plant Mol.Biol.38:101-109(1998)和其中引用的参考。因此，根据已知方法使用转基因植物产生本发明的CD20抗体。同样见，例如，Fischer等，Biotechnol.Appl.Biochem.30:99-108(1999年10月)；Ma等，Trends Biotechnol.13:522-7(1995)；Ma等，Plant Physiol.109:341-6(1995)；Whitelam等，Biochem.Soc.Trans.22:940-944(1994)；和其中引用的参考。
抗体工程化、人源化和表面重塑
也可使用工程化、人源化或表面重塑非人或人抗体的方法并且在本领域中众所周知。人源化、表面重塑或相似工程化抗体可能具有一个或多个来自非人来源，例如但不限于小鼠、大鼠、兔、非人灵长类动物或其它哺乳动物的氨基酸残基。可用通常取自已知人序列的“引入”可变、恒定或其它结构域的常称为“引入”残基的残基取代这些非人氨基酸残基。
例如，www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi；www.ncbi.nih.gov/igblast；www.atcc.org/phage/hdb.html；www.mrc-cpe.cam.ac.uk/ALIGNMENTS.php；www.kabatdatabase.com/top.html；ftp.ncbi.nih.gov/repository/kabat；www.sciquest.com；www.abcam.com；www.antibodyresource.com/onlinecomp.html；www.public.iastate.edu/.about.pedro/research_tools.html；www.whfreeman.com/immunology/CH05/kuby05.htm； www.hhmi.org/grants/lectures/1996/vlab；www.path.cam.ac.uk/.about.mrc7/mikeimages.html；mcb.harvard.edu/BioLinks/Immunology.html；www.immunologylink.com；pathbox.wustl.edu/.about.hcenter/index.html；www.appliedbiosystems.com；www.nal.usda.gov/awic/pubs/antibody；www.m.ehime-u.ac.jp/.about.yasuhito/Elisa.html；www.biodesign.com；www.cancerresearchuk.org；www.biotech.ufl.edu；www.isac-net.org；baserv.uci.kun.nl/.about.jraats/links1.html；www.recab.uni-hd.de/immuno.bme.nwu.edu；www.mrc-cpe.cam.ac.uk；www.ibt.unam.mx/vir/V_mice.html；http://www.bioinf.org.uk/abs；antibody.bath.ac.uk；www.unizh.ch；www.cryst.bbk.ac.uk/.about.ubcg07s；www.nimr.mrc.ac.uk/CC/ccaewg/ccaewg.html；www.path.cam.ac.uk/.about.mrc7/humanisation/TAHHP.html；www.ibt.unam.mx/vir/structure/stat_aim.html；www.biosci.missouri.edu/smithgp/index.html；www.jerini.de；Kabat等，Sequences of Proteins of Immunological Interest,U.S.Dept.Health(1983)中公开了已知人Ig序列，每个均通过引用整体并入本文。
如本领域中已知，此类引入序列可用于降低免疫原性或降低、增强或改变结合性、亲和力、结合率、解离率、亲和势、特异性、半衰期或任何其它适合特征。通常，CDR残基直接且最主要地牵涉于影响CD20结合。因此，在用人或其它氨基酸取代可变区和恒定区的非人序列的同时，保持了部分或全部非人或人CDR序列。
也可任选人源化、表面重塑、工程化抗体或工程化人抗体，保持对抗原CD20的高亲和力和其它有利生物性质。为实现这个目标，可任选通过使用亲本、工程化和人源化序列的三维模型分析亲本序列和各种概念性人源化和工程化产物的方法制备人源化(或人)或工程化抗CD20抗体和表面重塑抗体。三维免疫球蛋白模型通常可用并且为本领域中的人员所熟知。计算机程序可用，其阐明并展示所选候选免疫球蛋白序列的可能三维构象结构。检查这些展示允许分析残基在候选免疫球蛋白序列功能中的可能作用，即，分析残基影响 候选免疫球蛋白结合其抗原(例如CD20)的能力。这样，可从共有和引入序列选择框架(FR)残基并组合，以致获得所需抗体特征，例如对靶抗原的亲和力增强。
可使用任何已知方法进行本发明抗体的人源化、表面重塑或工程化，例如但不限于Winter(Jones等，Nature 321:522(1986)；Riechmann等，Nature 332:323(1988)；Verhoeyen等，Science 239:1534(1988)),Sims等，J.Immunol.151:2296(1993)；Chothia和Lesk,J.Mol.Biol.196:901(1987)，Carter等，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.89:4285(1992)；Presta等，J.Immunol.151:2623(1993)，美国专利No.5,639,641、5,723,323；5,976,862；5,824,514；5,817,483；5,814,476；5,763,192；5,723,323；5,766,886；5,714,352；6,204,023；6,180,370；5,693,762；5,530,101；5,585,089；5,225,539；4,816,567；PCT/:US98/16280；US96/18978；US91/09630；US91/05939；US94/01234；GB89/01334；GB91/01134；GB92/01755；WO90/14443；WO90/14424；WO90/14430；EP 229246；7,557,189；7,538,195；和7,342,110中描述的方法，每个均通过引用整体并入本文，包括其中引用的参考。
Fc区
在某些方面，抗体包含改变的(例如，突变的)Fc区。例如，在一些方面，Fc区已经改变以降低或增强抗体的效应子功能。在一些方面，Fc区为选自IgM、IgA、IgG、IgE或其它同种型的同种型。
可选地或另外，将氨基酸修饰和一个或多个改变抗原结合分子的Fc区的C1q结合和/或补体依赖的细胞毒性(CDC)功能的其它氨基酸修饰组合可能有用。特定的目标起始多肽可以为与C1q结合并展示出补体依赖的细胞毒性的多肽。可修饰具有预先存在的C1q结合活性，任选进一步具有介导CDC的能力的多肽，以致增强这些活性中的一种或两种。例如，在通过引用特此整体并入的WO0042072中描述了改变C1q和/或改变其补体依赖的细胞毒性功能的氨基酸修饰。
人们可(例如)通过改变C1q结合和/或FcγR结合设计本发明抗体的效应 子功能改变的Fc区，从而改变CDC活性和/或ADCC活性。“效应子功能”负责激活或减弱生物活性(例如，在受试者体内)。效应子功能的实例包括但不限于：C1q结合、补体依赖的细胞毒性(CDC)、Fc受体结合、抗体依赖细胞介导的细胞毒性(ADCC)、吞噬作用、下调细胞表面受体(例如，B细胞受体；BCR)等。此效应子功能可能需要Fc区与结合结构域(例如，抗体可变结构域)组合并且可使用各种测定法(例如，Fc结合测定法、ADCC测定法、CDC测定法等)评估效应子功能。
例如，人们可生成C1q结合增强且FcγRIII结合增强(例如，具有更强的ADCC活性和更强的CDC活性)的工程化抗CD20抗体的变异体Fc区。可选地，如果需要降低或除去效应子功能，可工程化变异体Fc区，CDC活性降低和/或ADCC活性降低。在其它方面，这些活性中仅有一种活性可增强，并且任选地，同样另一种活性降低(例如，以生成ADCC活性增强但CDC活性降低的Fc区变异体，并且反之亦然)。示例性Fc突变体为三个残基变化，S239D、A330L和I332D(EU编号系统)，其中ADCC增强而CDC活性减弱。例如，在Lazar等(2006,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.103(11):4005-4010)和Okazaki等(2004,J.Mol.Biol.336(5):1239-49)中可找到设计此类突变体的非限制性方法。同样见WO 03/074679、WO 2004/029207、WO 2004/099249、WO2006/047350、WO 2006/019447、WO 2006/105338、WO 2007/041635。
也可将Fc突变引入工程化抗体中以改变其与新生儿Fc受体(FcRn)的相互作用并增强其药代动力学性质。已描述了许多与FcRn的结合增强的人Fc变异体并且包括，例如，Shields等，2001.High resolution mapping of the binding site on human IgG1for FcγRI,FcγRII,FcγRIII,and FcRn and design of IgG1variants with improved binding to the FcγR,J.Biol.Chem.276:6591-6604)，其通过引用特此整体并入。
另一类氨基酸取代用以改变抗体Fc区的糖基化模式。Fc区的糖基化通常为N连接或O链接。N连接通常指碳水化物部分与天冬酰胺残基侧链连接。碳水化物部分与天冬酰胺侧链肽序列酶促连接的识别序列为天冬酰胺-X-丝氨酸和天冬酰胺-X-苏氨酸，其中X为除脯氨酸外的任何氨基酸。因此，多肽 中这些肽序列中任一条的存在产生可能糖基化位点。O连接糖基化通常指糖N-乙酰半乳糖胺、半乳糖或木糖之一与羟基氨基酸连接，虽然也可使用5-羟基脯氨酸或5-羟基赖氨酸，但最常见的是与丝氨酸或苏氨酸。
例如，可通过除去多肽中发现的一个或多个糖基化位点，和/或添加一个或多个多肽中不存在的糖基化位点改变抗体或其片段的糖基化模式。通过改变氨基酸序列，以致其消除以上所述三肽序列的一个或多个可方便地实现抗体或抗体片段Fc区中糖基化位点的去除(对于N连接糖基化位点而言)。示例性糖基化变异体具有重链残基N297与A297(EU编号系统)的氨基酸取代。也可通过用除丝氨酸或苏氨酸外的任何氨基酸取代一个或多个糖基化丝氨酸或苏氨酸残基实现O连接的糖基化位点的去除。
抗体包含Fc区时，可改变与之相连的碳水化合物。例如，美国专利申请No.US 2003/0157108(Presta,L.)和US 2004/0093621(Kyowa Hakko Kogyo Co.,Ltd)中描述了具有缺乏与抗体Fc区连接的岩藻糖的成熟碳水化合物结构的抗体。例如，WO 2003/011878，Jean-Mairet等和美国专利No.6,602,684，Umana等中提到在与抗体Fc区连接的碳水化合物中具有二等分N-乙酰葡糖胺(GlcNAc)的抗体。例如，WO 1997/30087，Patel等中报道了在与抗体Fc区连接的寡糖中具有至少一个半乳糖残基的抗体。同样见，关于与其Fc区连接的碳水化合物改变的抗体的WO 1998/58964和WO 1999/22764(Raju,S.)。同样见，例如，有关糖基化改变的抗原结合分子的US 2005/0123546(Umana等)。
在某些方面，糖基化变异体包含Fc区，其中与Fc区连接的碳水化合物结构缺乏岩藻糖。此类变异体的ADCC功能增强。与“去岩藻糖基化”或“岩藻糖缺乏”抗体有关的出版物的实例包括：US 2003/0157108、WO 2000/61739、WO 2001/29246、US 2003/0115614、US 2002/0164328、US 2004/0093621、US 2004/0132140、US 2004/0110704、US 2004/0110282、US 2004/0109865、WO 2003/085119、WO 2003/084570、WO 2005/035586、WO 2005/035778、W02005/053742；Okazaki等，J.Mol.Biol.,336:1239-1249(2004)；Yamane Ohnuki等，Biotech.Bioeng.,87:614(2004)。生成去岩藻糖基化抗体的细胞系的非限制性实例包括蛋白质岩藻糖基化缺乏的Lec13CHO细胞(Ripka等， Arch.Biochem.Biophys.249:533-545(1986)；美国专利申请No.US 2003/0157108 AI,Presta,L；和WO 2004/056312 AI，Adams等，尤其是实施例11)、敲除细胞系，例如α-1,6-岩藻糖基转移酶基因、FUT8、敲除CHO细胞(Yamane-Ohnuki等，Biotech.Bioeng.,87:614(2004))，和通过使用岩藻糖基化途径的抑制剂，例如细胞培养基中的栗精胺(美国专利申请No.2009/0041765)。
在某些方面，本发明的抗体在表达β(1,4)-N-乙酰葡糖胺转移酶III(GnT III)的细胞中表达，以致GnT III将GlcNAc添加至人工程化抗原特异性抗体。WO/9954342,WO/03011878、专利公布20030003097A1和Umana等，Nature Biotechnology,17:176-180,1999年2月中提供了以此方式生成抗体的方法。
抗体亲和力 
本发明的抗体以广泛的亲和力(KD)结合人CD20。在优选的方面，本发明的至少一种mAb可以高亲和力任选结合人抗原。例如，如本领域中的技术人员所实践，通过酶联免疫吸附测定(ELISA)、表面等离子体共振(SPR)或 方法确定，人或人工程化或人源化或表面重塑mAb可以等于或低于约10-7M的KD结合人抗原，例如但不限于0.1-9.9(或其中的任何范围或值)x10-7、10-8、10-9、10-10、10-11、10-12、10-13、10-14、10-15或其中的任何范围或值。抗CD20抗体以约10-9M或更低的Kd，更特别地以约10-9-10-10M的Kd结合。
实验上使用本领域中众所周知的任何适合方法，例如酶联免疫吸附测定(ELISA)或放射免疫测定(RIA)或动力学(例如，BIACORE TM分析)确定抗体对抗原的亲和力或亲和势。直接结合测定以及竞争性结合测定形式可易于采用。(见，例如，Berzofsky等，"Antibody-Antigen Interactions,"In Fundamental Immunology,Paul,W.E.,Ed.,Raven Press:New York,N.Y.(1984)；Kuby,Janis Immunology,W.H.Freeman and Company:New York,N.Y.(1992)；和本文所述的方法。如果在不同条件(例如，盐浓度、pH、温度)下测量，测量的特定抗体-抗原相互作用的亲和力可不同。因此，优选用抗体和抗原的标准化溶液和如本领域中已知的标准化缓冲液和诸如本文所述缓冲液进行亲和力和其它抗 原结合参数(例如，KD或Kd、K结合、K解离)的测量。
一方面，可使用酶联免疫吸附测定(例如，ELISA)用CD20抗原进行结合测定。例如，可用由CD20表达B细胞系制备的细胞溶解粗产物或重组蛋白作为如本文所述的CD20抗原的来源。在4℃将此CD20抗原制剂涂在于50mM碳酸钠(pH 9.6)中的Immulon 2HB板上，100μL/孔，进行约18-24h。用洗涤缓冲液(于TBS中的0.1％吐温-20，pH 7.4)洗涤板。接着，在室温下用于TBS中的1％酪蛋白(pH 7.4)封闭板。将连续稀释的抗体加至板上并且在室温下孵育约3h，然后像之前那样洗涤。为了检测，加入HRP-偶联的山羊抗人或山羊抗鼠抗体作为二级抗体并使其在室温下孵育1h。像之前那样洗涤板并加入100μL/孔的TMB1基质(BioFX)进行显影。约20min后用100μL/孔的450nm终止试剂(BioFX)终止反应。读取450nm下的吸光度并且按每种抗体的抗体浓度绘图。将S形剂量曲线拟合为结合曲线并且使用例如GraphPad Prism v4等程序，用缺省参数(GraphPad software,San Diego,CA)计算EC50值。EC50值可用作每种抗体表观解离常数“Kd”或“KD”的量度。
关于肽或多肽的百分比(％)氨基酸序列同一性也定义为，比对序列并在必要时引入空位以达到最高百分比序列同一性后，并且不将任何保守性取代视为序列同一性的一部分，候选序列中与特定肽或多肽序列中氨基酸残基相同的氨基酸残基百分比。为了确定百分比氨基酸序列同一性，可以本领域技术范围内的各种方式，例如本文讨论的方式，例如通过使用公开可用的计算机软件例如BLAST、BLAST-2、ALIGN或Megalign(DNASTAR)软件实现比对。本领域中的技术人员可确定用于测量比对的适当参数，包括实现比较序列全长最大比对所需的任何算法。在ALIGN-2可用并且可用于氨基酸序列比较的情况下，指定氨基酸序列A对、与或相对指定氨基酸序列B的％氨基酸序列同一性(可选择性地表述为具有或包含对、与或相对指定氨基酸序列B的一定％氨基酸序列同一性的指定氨基酸序列A)计算如下：100×分数X/Y，其中X为在A和B的程序比对中序列比对程序ALIGN-2评分为相同匹配的氨基酸残基数量，并且其中Y为B中的氨基酸残基总数。将意识到，氨基酸序列A的长度与氨基酸序列B的长度不相等时，A对B的％氨基酸序列同一性不等于B对A的％氨基酸序列同一性
期望地，两个或更多个氨基酸序列具有至少50％、60％、70％、80％或90％的同一性。更期望地，两个或更多个氨基酸序列具有至少95％、96％、97％、98％、99％或甚至100％的同一性。除非另外特别规定，本文所用的所有％氨基酸序列同一性的值均如前一段中所述，例如使用ALIGN-2或BLAST计算机程序获得。
抗体用途
通常，用于本发明所述方法和组合物中一些形式的抗原特异性抗体可任选特征在于与抗原的高亲和力结合，任选且优选为对受体的低毒性和不良后果。尤其，单独组分，例如可变区、恒定区和框架，单独和/或共同，任选且优选具有低免疫原性时，本发明的抗体、特定片段或变异体用于本发明。可用于本发明的抗体任选特征在于其长时间治疗患者的能力，症状可测量地减轻且毒性低和/或可接受。低或可接受的免疫原性和/或高亲和力以及其它适合性质可有助于达到的治疗效果。本文将“低免疫原性”定义为用抗体治疗的患者体内抗体对抗原的可滴定水平的发生率，如在少于25％受治疗患者中发生，优选地，在治疗期间用推荐剂量治疗推荐疗程的患者中少于10％发生。
本发明的分离核酸可用于产生至少一种CD20特异性抗体片段或其特定变异体，其可用于在细胞、组织、器官或动物(包括哺乳动物和人)中测量或实现，可用于诊断、监测、调节、治疗、缓解、帮助预防至少一种病状发病或减轻所述病状的症状，所述病状选自但不限于至少一种免疫性病症或疾病、心血管病症或疾病、传染性、恶性和/或神经病症或疾病或其它已知或特定抗原相关的病状。
这种方法可包括向需要这样调节、治疗、缓解、预防或减轻症状、影响或机制的细胞、组织、器官、动物或患者施用有效量的包含至少一种抗原特异性抗体(例如抗CD20抗体)或片段的组合物或药物组合物。有效量可包含如本文所述或本领域中已知，使用已知方法进行并确定，每单次(例如，推注)、多次或连续施用约0.001-500mg/kg的量，或达到每单次、多次或连续施用约0.01-5000μg/ml血清浓度的血清浓度，或其间的任何有效范围或值。
示例性抗体 
本发明的优选抗原特异性CD20抗体具有所示序列。例如，本发明的抗原特异性抗体包括表1所示其中一个轻链CDR序列(即，CDRL1、CDRL2和DRL3)和/或表1所示其中一个重链CDR序列(即，CDRH1、CDRH2和CDRH3)。更特别地，抗CD20-6抗体具有SEQ ID NO:25的CDRL1、SEQ ID NO:26的CDRL2、SEQ ID NO:27的CDRL3、SEQ ID NO:28的CDRH1、SEQ ID NO:29的CDRH2、SEQ ID NO:30的CDRH3。并且抗CD20-7抗体具有SEQ ID NO:17的CDRL1、SEQ ID NO:18的CDRL2、SEQ ID NO:19的CDRL3、SEQ ID NO:20的CDRH1、SEQ ID NO:21的CDRH2、SEQ ID NO:22的CDRH3。
本发明的示例性方面包括：
鼠氨基酸序列
muCD20-7LC
DIVLTQSPASLAVSLGQRATISCRASGSVDSFGNSFMHWYQQKPGQPPKLLIYRASNLESGVPARFSGGGSRTDFTLTINPVEADDIATYFCQQSYEDPFTFGAGTKLELMRADAAPTVSIFPPSSEQLTSGGASVVCFLNNFYPKDINVKWKIDGSERQNGVLNSWTDQDSKDSTYSMSSTLTLTKDEYERHNSYTCEATHKTSTSPIVKSFNRNEC[SEQ ID NO:1]；
muCD20-7LC可变区
DIVLTQSPASLAVSLGQRATISCRASGSVDSFGNSFMHWYQQKPGQPPKLLIYRASNLESGVPARFSGGGSRTDFTLTINPVEADDIATYFCQQSYEDPFTFGAGTKLELMR[SEQ ID NO:32] 
muCD20-7HC
QLQLVQSGPELKKPGETVKISCKASGYSFTNYGMNWVKQAPGKGLKWMGWINTYTGEPSYADDFKGRFAFSLETSASTAYLQISNLKNEDTATYFCARGAYYRYDLGMDYWGQGTSVTVSSAKTTPPSVYPLAPGSAAQTNSMVTLGCL VKGYFPEPVTVTWNSGSLSSGVHTFPAVLESDLYTLSSSVTVPSSMRPSETVTCNVAHPASSTKVDKKIVPRDCGCKPCICTVPEVSSVFIFPPKPKDVLTITLTPKVTCVVVDISKDDPEVQFSWFVDDVEVHTAQTQPREEQFNSTFRSVSELPIMHQDWLNGKEFKCRVNSAAFPAPIEKTISKTKGRPKAPQVYTIPPPKEQMAKDKVSLTCMITDFFPEDITVEWQWNGQPAENYKNTQPIMNTNGSYFVYSKLNVQKSNWEAGNTFTCSVLHEGLHNHHTEKSLSHSPGK[SEQ ID NO:2]；
muCD20-7HC可变区
QLQLVQSGPELKKPGETVKISCKASGYSFTNYGMNWVKQAPGKGLKWMGWINTYTGEPSYADDFKGRFAFSLETSASTAYLQISNLKNEDTATYFCARGAYYRYDLGMDYWGQGTSVTVSS[SEQ ID NO:34] 
muCD20-6LC
DIVLTQSPASLAVSLGQRAIISCRASESVDNFGNSFMHWYQQKPGQPPTLLIYRASNLESGIPARFSGSGSRTDFTLTVNPVEADDIATYYCQQSYEDPFTFGAGTKLELKRADAAPTVSIFPPSSEQLTSGGASVVCFLNNFYPKDINVKWKIDGSERQNGVLNSWTDQDSKDSTYSMSSTLTLTKDEYERHNSYTCEATHKTSTSPIVKSFNRNEC[SEQ ID NO:3]；
muCD20-6LC可变区
DIVLTQSPASLAVSLGQRAIISCRASESVDNFGNSFMHWYQQKPGQPPTLLIYRASNLESGIPARFSGSGSRTDFTLTVNPVEADDIATYYCQQSYEDPFTFGAGTKLELKR[SEQ ID NO:46] 
muCD20-6HC
QIQLVQSGPELKKPGETVKISCKASGYKFTNVGMNWVKQVPGKGLKWMGWINTYTGEPAYADDFKGRFVFSLETSASAAFLQINNLKNEDTATYFCARGAYYRYDLGMDYWGQGTSVTVSSAKTTPPSVYPLAPGSAAQTNSMVTLGCLVKGYFPEPVTVTWNSGSLSSGVHTFPAVLESDLYTLSSSVTVPSSMRPSET VTCNVAHPASSTKVDKKIVPRDCGCKPCICTVPEVSSVFIFPPKPKDVLTITLTPKVTCVVVDISKDDPEVQFSWFVDDVEVHTAQTQPREEQFNSTFRSVSELPIMHQDWLNGKEFKCRVNSAAFPAPIEKTISKTKGRPKAPQVYTIPPPKEQMAKDKVSLTCMITDFFPEDITVEWQWNGQPAENYKNTQPIMNTNGSYFVYSKLNVQKSNWEAGNTFTCSVLHEGLHNHHTEKSLSHSPGK[SEQ ID NO:4]；
muCD20-6HC可变区
QIQLVQSGPELKKPGETVKISCKASGYKFTNVGMNWVKQVPGKGLKWMGWINTYTGEPAYADDFKGRFVFSLETSASAAFLQINNLKNEDTATYFCARGAYYRYDLGMDYWGQGTSVTVSS[SEQ ID NO:47] 
人源化氨基酸序列
huCD20-7LCv1.0
DIVLTQSPASLAVSPGQRATISCRASGSVDSFGNSFMHWYQQKPGQPPKLLIYRASNLESGVPARFSGGGSRTDFTLTINPVEANDIATYFCQQSYEDPFTFGQGTKLELKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC[SEQ ID NO:5]；
huCD20-7LCv1.0可变区
DIVLTQSPASLAVSPGQRATISCRASGSVDSFGNSFMHWYQQKPGQPPKLLIYRASNLESGVPARFSGGGSRTDFTLTINPVEANDIATYFCQQSYEDPFTFGQGTKLELKR[SEQ ID NO:33] 
huCD20-7HCv1.0
ELQLVQSGGELKKPGETVRISCAASGYTFTNYGMNWVKQAPGKGLKWMGWINTYTGEPSYAAPFKGRFAFSLETSASTAYLQISSLKTEDTATYFCARGAYYRYDLGMDYWGQGTSVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQT YICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK[SEQ ID NO:6]；
huCD20-7HCv1.0可变区
ELQLVQSGGELKKPGETVRISCAASGYTFTNYGMNWVKQAPGKGLKWMGWINTYTGEPSYAAPFKGRFAFSLETSASTAYLQISSLKTEDTATYFCARGAYYRYDLGMDYWGQGTSVTVSS[SEQ ID NO:35] 
huCD20-7HCv1.1
ELQLVQSGGELKKPGETVRISCAASGYSFTNYGMNWVKQAPGKGLKWMGWINTYTGEPSYAAPFKGRFAFSLETSASTAYLQISSLKTEDTATYFCARGAYYRYDLGMDYWGQGTSVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK[SEQ ID NO:7]；
huCD20-7HCv1.1可变区
ELQLVQSGGELKKPGETVRISCAASGYSFTNYGMNWVKQAPGKGLKWMGWINTYTGEPSYAAPFKGRFAFSLETSASTAYLQISSLKTEDTATYFCARGAYYRYDLGMDYWGQGTSVTVSS[SEQ ID NO:36] 
鼠可变区DNA序列
muCD20-7LC
gatattgtgctgacccagtctccagcttctttggctgtgtctctagggcagagggccaccatatcctgcagagccagtggaagtgttgatagttttggcaatagttttatgcactggtaccagcagaaaccaggacagcctcccaaactcctcatctatcgtgcatccaacctagaatctggggtccctgccaggttcagtggcggtgggtctaggacagacttcaccctcaccattaatcctgtggaagctgatgatattgcaacctatttctgtcagcaaagttatgaggatccgttcacgttcggtgctgggaccaagctggagctgatgcgg[SEQ ID NO.8]；
muCD20-7HC
cagctccagttggtgcagtctggacctgagctgaagaagcctggagagacagtcaagatctcctgcaaggcttctgggtatagtttcacaaactatggaatgaactgggtgaagcaggctccaggaaagggtttaaagtggatgggctggataaacacctacactggagagccatcttatgctgatgacttcaagggacggtttgccttctctttggaaacctctgccagcactgcctatttgcagatcagcaacctcaaaaatgaggacacggctacatatttctgtgcaaggggggcctactataggtacgacttaggtatggactactggggtcaaggaacctcagtcaccgtctcctca[SEQ ID NO:9]；
muCD20-6LC
gatattgtgctgacccagtctccagcttctttggctgtgtctttagggcagagggccattatatcctgcagagccagtgaaagtgttgataattttggcaatagctttatgcactggtaccagcagaagccaggacagccacccacactcctcatctatcgtgcatccaacctagaatctgggatccctgccaggttcagtggcagtgggtctaggacagacttcaccctcaccgttaatcctgtggaggctgatgatattgcaacttattactgtcaacaaagttatgaggatccgttcacgttcggtgctgggaccaagctggagctgaaacgg[SEQ ID NO:10]；
muCD20-6HC
cagatccagttggtgcagtctggacctgagctgaagaagcctggagagacagtcaagatctcctgcaaggcttctgggtataaattcacaaacgttggaatgaactgggtgaagcaggttccaggaaagggtttaaagtggatgggctggataaacacctacactggagagccagcatatgctgatgacttcaagggacggtttgtcttttctttggaaacctctgccagcgctgcctttttgcagatcaacaacctcaaaaatgaggacacggctacatatttctgtgcaaggggggcctactataggtatgacttaggtatggactactggggtcaaggaacctcagtcaccgtctcctca[SEQ ID NO:11]；
人源化和嵌合可变区DNA序列
huCD20-7LCv1.0
gaattcgccaccatgggctggagctgtattattctgttcctggtagcaaccgctacaggtgtacactccgatattgttctta cccaaagcccagcctccctcgctgtcagtccaggccagcgagccactatctcctgccgtgcaagtggatctgtcgacagctttggaaatagcttcatgcactggtaccagcagaagcctggtcagcccccaaaactcctgatttatcgggcttccaatctggagtcaggagtgcccgcaaggttctctggcgggggcagccggacagatttcacattgactataaatcccgtggaggctaacgatatcgcaacatacttctgtcagcagtcttatgaggaccccttcacattcggccagggcacaaagctggagctcaaacgtacg[SEQ ID NO:12]；
huCD20-7HCv1.0
aagcttgccaccatgggatggagttgcatcatcctgttcctcgtcgcaaccgcaacaggggtgcattccgaactgcagctggtccagtctggtggtgagttgaagaaaccaggggaaacagttcgcattagctgtgctgcaagcggctatacattcacaaattatggaatgaattgggtgaaacaggcccccggcaagggcctgaagtggatgggctggataaatacctatactggagagcctagttacgccgctcccttcaaggggcggtttgccttctctcttgagacaagtgccagcaccgcctatttgcagatttctagtttgaaaaccgaagacacagctacatacttctgcgcccgcggcgcatattacagatatgatctggggatggactattggggccagggtacctccgtgaccgtatcatccgcctccacaaagggccc[SEQ ID NO:13]；
huCD20-7HCv1.1
aagcttgccaccatgggttggtcttgcatcattctgtttctggtagcaactgcaactggagtgcacagcgagctgcaactcgtccagagcggaggtgagcttaagaagccaggagagaccgtgcgaatctcttgcgccgcatccggctactctttcacaaattacggaatgaattgggtcaagcaggcaccaggtaagggactcaaatggatgggctggatcaatacctacaccggcgagcctagttatgccgcacccttcaagggtcgatttgcattcagcctggagaccagtgcttctacagcttatttgcagatcagctctctgaagaccgaggacacagctacatacttctgcgcccgtggtgcctactaccgatacgatctgggcatggactattggggccaaggcacctcagtgactgtgtcttcagcatcaaccaagggccc[SEQ ID NO:14]；
chCD20-7LC
gaattcgccaccatggggtggtcatgtatcatcctcttccttgtggcaaccgcaacaggcgtacactccgacattgtactgacccagtcacctgcctccctcgccgtatcccttgggcagagagccactattagttgcagggctagtggcagtgtcgattctttcggcaattcatttatgcactggtatcagcagaaaccagggcagccacccaagttgctcatataccgcgcctcaaaccttgagtccggggtcccagcccggttttccggaggcgggtcccgcaccgacttcaccctgacaatcaacccagtagaagcagatgatatcgctacttatttctgtcagcagagctatgaagacccttttacatttggggccggaaccaagttggagctcaagcgtacg[SEQ ID NO:15]；
chCD20-7HC
aagcttgccaccatgggatggagctgcatcattttgtttcttgtcgctaccgcaactggcgtccactcacagctgcagct ggtgcagagtgggcctgagcttaagaaacccggtgagactgtgaagatctcatgtaaggctagcggctattcctttacaaattatggcatgaattgggtgaagcaggcccctgggaagggtctcaagtggatgggatggattaacacctatactggagagccttcatacgccgatgatttcaaagggaggttcgccttctccttggaaacctctgcttctactgcctaccttcagatttctaacctcaagaacgaggacactgcaacctatttttgcgctcgtggcgcatactatcgatatgatctgggcatggattattggggtcaaggcacatccgtaaccgtgtcctcagctagcactaagggccc[SEQ ID NO:16]；
鼠和人CD20-7表面重塑CDR
轻链
CD20-7_LC_CDR1RASGSVDSFGNSFMH[SEQ ID NO:17]；
CD20-7_LC_CDR2RASNLES[SEQ ID NO:18]；
CD20-7_LC_CDR3QQSYEDPFT[SEQ ID NO:19]；
重链
CD20-7_HC_CDR1NYGMN[SEQ ID NO:20]；
CD20-7_HC_CDR2WINTYTGEPS[SEQ ID NO:21]；
CD20-7_HC_CDR3GAYYRYDLGMDY[SEQ ID NO:22]；
Kabat定义的鼠和人源化CD20-7HC CDR2
鼠muCD20-7_HC_KabCDR2WINTYTGEPSYADDFKG[SEQ ID NO:23]；
人源化huCD20-7_HC_KabCDR2WINTYTGEPSYAAPFKG[SEQ ID NO:24]；
鼠CD20-6CDR序列
轻链
CD20-6_LC_CDR1RASESVDNFGNSFMH[SEQ ID NO:25]；
CD20-6_LC_CDR2RASNLES[SEQ ID NO:26]；
CD20-6_LC_CDR3QQSYEDPFT[SEQ ID NO:27]；
重链
CD20-6_HC_CDR1NVGMN[SEQ ID NO:28]；
CD20-6_HC_CDR2WINTYTGEPA[SEQ ID NO:29]；
CD20-6_HC_CDR3GAYYRYDLGMDY[SEQ ID NO:30]；和
Kabat定义的HC CDR2
CD20-6_HC_KabCDR2WINTYTGEPAYADDFKG[SEQ ID NO:31]。
本领域中的普通技术人员理解到，本申请中的序列为非限制性实例。
功能等效物、抗体变异体和衍生物
功能等效物进一步包括具有与全抗体或完整抗体相同或可比结合特征的抗体片段。此类片段可含有一个或两个Fab片段或F(ab')2片段。虽然并非含有全部此类区，例如1、2、3、4或5个CDR的片段也具功能性，但是优选地，抗体片段含有全抗体的全部6个互补决定区。进一步地，功能等效物可为或可组合以下任一免疫球蛋白类别的成员：IgG、IgM、IgA、IgD或IgE及其亚类。
在本发明的某些方面，可修饰抗CD20抗体以生成融合蛋白，即抗体，或与异源蛋白、多肽或肽融合的片段。在某些方面，与抗CD20抗体的部分融合的蛋白质为ADEPT的酶组分。可用抗CD20抗体工程化为融合蛋白的其它蛋白质或多肽的实例包括但不限于毒素例如篦麻毒素、相思豆毒素、核糖核酸酶、脱氧核糖核酸酶Ⅰ、葡萄球菌肠毒素-A(Staphylococcal enterotoxin-A)、美洲商陆抗病毒蛋白、白树毒素、白喉毒素、假单胞菌(Pseudomonas)外毒素 和假单胞菌(Pseudomonas)内毒素。见，例如，Pastan等，Cell,47:641(1986)；和Goldenberg等，Cancer Journal for Clinicians,44:43(1994)。可使用的酶活性毒素及其片段包括白喉A链、白喉毒素的非结合活性片段、外毒素A链(来自绿脓杆菌(Pseudomonas aeruginosa))、篦麻毒素A链、相思豆毒素A链、蒴莲根毒素A链、α-帚曲菌素、油桐(Aleurites fordii)蛋白、石竹素蛋白、美洲商陆(Phytolaca americana)蛋白(PAPI、PAPII和PAP-S)、苦瓜(momordica charantia)抑制剂、泻果素、巴豆毒素、肥皂草(sapaonaria officinalis)抑制剂、白树毒素、丝林霉素、局限曲菌素、酚霉素、依诺霉素和单端孢霉烯。例如，通过引用整体并入本文的1993年10月28日公开的WO 93/21232中包括非限制性实例。
可通过基因改组、基序改组、外显子改组和/或密码子改组(共同称为“DNA改组”)的技术生成另外的融合蛋白。可采用DNA改组改变抗体或其片段的活性(例如，具有更高亲和力和更低解离率的抗体或其片段)。通常见，美国专利No.5,605,793、5,811,238、5,830,721、5,834,252和5,837,458和Patten等，1997,Curr.Opinion Biotechnol.,8:724-33；Harayama，1998,Trends Biotechnol.,16(2):76-82；Hansson等，1999,J.Mol.Biol.,287:265-76；和Lorenzo和Blasco，1998,Biotechniques,24(2):308-313，每个均通过引用特此整体并入。抗体可进一步为如美国公布20030118592、美国公布200330133939和PCT公布WO 02/056910中所述的结合结构域免疫球蛋白融合蛋白，均属于Ledbetter等，通过引用整体并入本文。
结构域抗体。本发明组合物和方法的抗CD20抗体可为结构域抗体，例如含有与人抗体重链(VH)或轻链(VL)的可变区相对应的抗体的小功能结合单元的抗体。结构域抗体的实例包括但不限于可从Domantis Limited(Cambridge,UK)和Domantis Inc.(Cambridge,Mass.,USA)获得，对治疗靶标有特异性的抗体(见，例如，WO04/058821、WO04/003019、美国专利No.6,291,158、6,582,915、6,696,245和6,593,081)。市售的结构域抗体库可用于鉴定抗CD20结构域抗体。在某些方面，本发明的抗CD20抗体包含CD20功能结合单元和Fcγ受体功能结合单元。
双链抗体。术语“双链抗体”指具有两个抗原结合位点的小抗体片段，所述片段包含与相同多肽链中(VH-VL)的轻链可变结构域(VL)连接的重链可变结构域(VH)。通过使用太短而不能使相同链上两个结构域之间配对的连接子，迫使结构域与另一条链的互补结构域配对并产生两个抗原结合位点。例如，在EP 404,097、WO 93/11161和Hollinger等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA,90:6444-6448(1993)中更全面地描述了双链抗体。
疫苗抗体。在本发明的某些方面，抗CD20抗体为疫苗抗体。疫苗抗体为二聚多肽。疫苗抗体的每个单体由对APC上的表面分子有特异性的scFv，通过铰链区和Cg3结构域与第二scFv连接构成。在本发明的其它方面，含有作为scFv其中之一的抗CD20抗体片段的疫苗抗体可用于使要破坏的B细胞和介导ADCC的效应细胞并列。例如，见，Bogen等，美国专利申请公布No.20040253238。
线性抗体。在本发明的某些方面，抗CD20抗体为线性抗体。线性抗体包含一对串联Fd区段(VH-CH1-VH-CH1)，其形成一对抗原结合区。线性抗体可为双特异性或单特异性。例如，Zapata等，Protein Eng.,8(10):1057-1062(1995)中公开了线性抗体的非限制性实例。
亲本抗体。在本发明的某些方面，抗CD20抗体为亲本抗体。“亲本抗体”为与本文公开的改变/突变抗体相比包含在其一个或多个高变区中或相邻处缺乏或缺少一个或多个氨基酸残基的氨基酸序列的抗体。因此，亲本抗体具有比本文公开的抗体突变体的相应高变区更短的高变区。亲本多肽可包含天然序列(即，自然存在)抗体(包括自然存在的等位基因变异体)或具有自然存在序列的预先存在的氨基酸序列修饰(例如其它插入、缺失和/或取代)的抗体。优选地，亲本抗体为人源化抗体或人抗体。
抗体片段。“抗体片段”包含全长抗体的一部分，通常为全长抗体的抗原结合或可变区。抗体片段的实例包括Fab、Fab'、F(ab')2和Fv片段；双链抗体；线性抗体；单链抗体分子；和其中由抗体片段形成的多特异性抗体。
传统地，通过蛋白水解消化完整抗体获得片段(见，例如，Morimoto等， Journal of Biochemical and Biophysical Methods,24:107-117(1992)和Brennan等，Science,229:81(1985))。然而，现在可由重组宿主细胞直接生成片段。例如，可从本文讨论的抗体噬菌体库分离抗体片段。可选地，可从大肠杆菌中直接回收Fab'-SH片段并化学偶联形成F(ab')2片段(Carter等，Bio Technology,10:163-167(1992))。根据另一种方法，可从重组宿主细胞培养物中直接分离F(ab')2片段。考虑到本说明书中的详细教导，产生抗体片段的其它技术对于熟练的从业者而言显而易见。在其它方面，选择的抗体为单链Fv片段(scFv)。见，例如，WO 93/16185。在某些方面，抗体并非Fab片段。
双特异性抗体。双特异性抗体为对至少两个不同表位有结合特异性的抗体。示例性双特异性抗体可与CD20的两个不同表位结合。其它此类抗体可结合CD20并进一步结合第二种抗原。可选地，CD20结合臂可与白细胞上的触发分子例如T细胞受体分子(例如，CD2或CD3)或IgG的Fc受体(FcγR)结合的臂组合，以使细胞防御机制集中于靶标。双特异性抗体也可用于将细胞毒性剂定位至靶标。这些抗体具有细胞标志-结合臂和结合细胞毒性剂(例如，皂草素、抗干扰素α、长春花生物碱、篦麻毒素A链、methola-exate和放射性同位素半抗原)的臂。双特异性抗体可制备为全长抗体或抗体片段(例如，F(ab')：双特异性抗体)。
制备双特异性抗体的方法在本领域中已知。见，例如，Millstein等，Nature,305:537-539(1983)；Traunecker等，EMBO J.,10:3655-3659(1991)；Suresh等，Methods in Enzymology,121:210(1986)；Kostelny等，J.Immunol.,148(5):1547-1553(1992)；Hollinger等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA,90:6444-6448(1993)；Gruber等，J.Immunol.,152:5368(1994)；美国专利No.4,474,893、4,714,681、4,925,648、5,573,920、5,601,81、95,731,168、4,676,980，和4,676,980、WO 94/04690、WO 91/00360、WO 92/200373、WO 93/17715、WO 92/08802、EP 03089和US 2009/0048122。
在本发明的某些方面，组合物和方法包括对人CD20和T细胞受体的CD3ε链有特异性的双特异性鼠抗体或其片段和/或其偶联物，例如Daniel等，Blood,92:4750-4757(1998)描述的双特异性抗体。在优选的方面，本发明组合 物和方法的抗CD20抗体或其片段和/或其偶联物为双特异性，抗CD20抗体为人或人源化抗体并且对人CD20和T细胞上的表位有特异性或能够与人效应细胞，例如单核细胞/巨噬细胞和/或自然杀伤细胞结合以引起细胞死亡。
抗体结合亲和力
在本发明的某些方面，可修饰抗CD20抗体以改变其对CD20及其抗原片段的结合亲和力。可通过本领域中已知的各种体外测定方法，例如酶联免疫吸附测定(ELISA)或放射性免疫测定(RIA)或动力学(例如BIACORETM分析)方法确定结合性质。通常理解优选具有低KD的结合分子。
在本发明的一方面，抗体或抗体片段以低于10-5M、或低于10-6M、或低于10-7M、或低于10-8M、或低于10-9M、或低于10-10M、或低于10-11M、或低于10-12M、或低于10-13M的解离常数或KD或Kd(k解离/k结合)特异性结合CD20及其抗原片段。
另一方面，本发明的抗体或片段以低于1x10-3s-1或低于3x10-3s-1的k解离与CD20和/或其抗原片段结合。在其它方面，抗体以低于10-3s-1、低于5x10-3s-1、低于10-4s-1、低于5x10-4s-1、低于10-5s-1、低于5x10-5s-1、低于10-6s-1、低于5x10-6s-1、低于10-7s-1、低于5x10-7s-1、低于10-8s-1、低于5x10-8s-1、低于10-9s-1、低于5x10-9s-1或低于10-10s-1的k解离与CD20及其抗原片段结合。
另一方面，本发明的抗体或片段以至少105M-1s-1、至少5x105M-1s-1、至少106M-1s-1、至少5x106M-1s-1、至少107M-1s-1、至少5x107M-1s-1、或至少108M-1s-1、或至少109M-1s-1的结合率常数或K结合率与CD20和/或其抗原片段结合。
技术人员理解，本发明的偶联物具有与本文所述偶联物相同的性质。
抗体pI和Tm
在本发明的某些方面，可修饰抗CD20抗体以改变其等电点(pI)。和所有多肽一样，抗体的pI通常定义为多肽不携带净电荷时的pH。本领域中已知 通常在溶液的pH等于蛋白质的等电点(pI)时蛋白质溶解性最低。如本文所使用pI值定义为主要电荷形式的pI。可通过各种方法，包括但不限于等电聚焦和各种计算机算法(见，例如，Bjellqvist等，1993,Electrophoresis,14:1023)确定蛋白质的pI。另外，抗体Fab结构域的热解链温度(Tm)可为抗体热稳定性的良好指标并且可进一步提供保存期限的指示。Tm越低表示聚集越多/稳定性越低，而Tm越高表示聚集越少/稳定性越高。因此，在某些方面优选具有较高Tm的抗体。可使用本领域中已知的任何标准方法，例如通过差示扫描量热法测量蛋白质结构域(例如，Fab结构域)的Tm(见，例如，Vermeer等，2000,Biophys.J.78:394-404；Vermeer等，2000,Biophys.J.79:2150-2154)。
因此，本发明另外的非专有方面包括具有某些优选生物化学特征，例如特定等电点(pI)或解链温度(Tm)的经修饰抗体。
更特别地，一方面，本发明经修饰抗体的pI范围为5.5至9.5。在另一特定方面，本发明经修饰抗体的pI范围为约5.5至约6.0、或约6.0至约6.5、或约6.5至约7.0、或7.0至约7.5、或约7.5至约8.0、或约8.0至约8.5、或约8.5至约9.0、或约9.0至约9.5。在其它特定方面，本发明经修饰抗体的pI范围为5.5-6.0、或6.0-6.5、或6.5-7.0、或7.0-7.5、或7.5-8.0、或8.0-8.5、或8.5-9.0、或9.0-9.5。甚至更特别地，本发明经修饰抗体的pI为至少5.5、或至少6.0、或至少6.3、或至少6.5、或至少6.7、或至少6.9、或至少7.1、或至少7.3、或至少7.5、或至少7.7、或至少7.9、或至少8.1、或至少8.3、或至少8.5、或至少8.7、或至少8.9、或至少9.1、或至少9.3、或至少9.5。在其它特定方面，本发明经修饰抗体的pI为至少约5.5、或至少约6.0、或至少约6.3、或至少约6.5、或至少约6.7、或至少约6.9、或至少约7.1、或至少约7.3、或至少约7.5、或至少约7.7、或至少约7.9、或至少约8.1、或至少约8.3、或至少约8.5、或至少约8.7、或至少约8.9、或至少约9.1、或至少约9.3、或至少约9.5。
可能通过改变抗体中可电离残基的数量和位置以调节pI而最优化溶解性。例如可通过进行适当氨基酸取代(例如，通过将带电氨基酸(例如赖氨酸)取代为不带电的残基(例如丙胺酸))操纵多肽的pI。不希望受任何特定理论束 缚，引起所述抗体的pI变化的抗体氨基酸取代可提高抗体的溶解性和/或稳定性。本领域中的技术人员应了解对于特定抗体而言，为达到预期pI哪些氨基酸取代是最适当的。一方面，在本发明的抗体中产生取代以改变pI。特别考虑到，引起与FcγR(以上所述)的结合改变的Fc区取代也可能引起pI变化。另一方面，特别选择Fc区的取代以实现FcγR结合的预期改变和pI的任何预期变化。
一方面，本发明经修饰抗体的Tm范围为65℃-120℃。在特定方面，本发明经修饰抗体的Tm范围为约75℃至约120℃、或约75℃至约85℃、或约85℃至约95℃、或约95℃至约105℃、或约105℃至约115℃、或约115℃至约120℃。在其它特定方面，本发明经修饰抗体的Tm范围为75℃-120℃、或75℃-85℃、或85℃-95℃、或95℃-105℃、或105℃-115℃、或115℃-120℃。在更多其它特定方面，本发明经修饰抗体的Tm为至少约65℃、或至少约70℃、或至少约75℃、或至少约80℃、或至少约85℃、或至少约90℃、或至少约95℃、或至少约100℃、或至少约105℃、或至少约110℃、或至少约115℃、或至少约120℃。还有其它特定方面中，本发明经修饰抗体的Tm为至少65℃、或至少70℃、或至少75℃、或至少80℃、或至少85℃、或至少90℃、或至少95℃、或至少100℃、或至少105℃、或至少110℃、或至少115℃、或至少120℃。
工程化效应子功能
至于效应子功能可能需要修饰本发明的抗CD20抗体，以增强抗体治疗B细胞相关疾病，例如癌症、GVHD或排斥的功效。例如，可将半胱氨酸残基引入Fc区，从而使得在该区域中链间二硫键形成。因此生成的同源二聚体抗体具有更强的内化能力和/或更强的补体介导的细胞杀伤和/或抗体依赖的细胞毒性(ADCC)。见，Caron等，J.Exp Med.,176:1191-1195(1992)和Shopes,B.,J.Immunol.,148:2918-2922(1992)。也可如Wolff等，Cancer Research,53:2560-2565(1993)所述使用异源双功能交联剂制备活性增强的同源二聚体抗体。可选地，可将抗体工程化为具有两个Fc区并且因此可能具有更强的补体溶解和ADCC能力。见，Stevenson等，Anti-Cancer Drug Design,3:219-230 (1989)。
本领域中已知工程化抗体的Fc区以改变效应子功能的其它方法(例如，美国专利公布No.20040185045和PCT公布No.WO 2004/016750，均属于Koenig等，其描述了与对FCγRIIA的结合亲和力相比，改变Fc区以增强对FcγRIIB的结合亲和力；同样，见，Armour等的PCT公布No.WO 99/58572；Idusogie等的WO 99/51642；和Deo等的美国专利No.6,395,272；其公开内容整体并入本文)。修饰Fc区以降低对FcγRIIB的结合亲和力的方法在本领域中也已知(例如，美国专利公布No.20010036459和PCT公布No.WO 01/79299，均属于Ravetch等，其公开内容整体并入本文)。与野生型Fc区相比对FcγRIIIA和/或FcγRIIA的结合亲和力增强的具有变异体Fc区的经修饰抗体已知(例如，Stavenhagen等的PCT公布No.WO 2004/063351；其公开内容整体并入本文)。
本领域中已知的体外测定可用于确定(例如)本发明的抗CD20抗体、组合物、偶联物和方法是否能够介导ADCC，例如本文所述。
变异体Fc区。本发明提供了包含变异体Fc区的蛋白质制剂。即，非自然存在的Fc区，例如包含一个或多个非自然存在的氨基酸残基的Fc区。本发明的变异体Fc区还涵盖了包含氨基酸缺失、添加和/或修饰的Fc区。
将了解，如本文所使用的Fc区包括包含抗体恒定区，不包括第一恒定区免疫球蛋白结构域的多肽。因此Fc指IgA、IgD和IgG的最后两个恒定区免疫球蛋白结构域和IgE和IgM的最后三个恒定区免疫球蛋白结构域和这些结构域N末端的挠性铰链。对于IgA和IgM而言，Fc可能包括J链。对于IgG而言，Fc包含免疫球蛋白结构域Cγ2和Cγ3(Cγ2和Cγ3)及Cγ1(Cγ1)与Cγ2(Cγ2)之间的铰链。虽然Fc区的边界可能不同，但是通常将人IgG重链Fc区定义为包含其羧基末端的残基C226或P230，其中编号根据如Kabat等(1991,NIH Publication 91-3242,National Technical Information Service,Springfield,Va.)的EU索引。“Kabat中提出的EU索引”指如以上Kabat等所述的人IgG1EU抗体的残基编号。Fc可指分离的该类区域，或在抗体、抗体片段或Fc融合蛋白环境中的该类区域。Fc变异体蛋白可为包含Fc区的抗体、Fc融合或任何 蛋白质或蛋白质结构域。特别优选包含为Fc的非自然存在变异体的变异体Fc区的蛋白质。已经在许多Fc位置，包括但不限于Kabat 270、272、312、315、356和358，观察到多态性，因此提出序列和现有技术中的序列之间可能存在细微差异并且本领域中的技术人员将根据现有教导有所了解。
本发明涵盖相对于可比分子(例如，除具有野生型Fc区外具有相同氨基酸序列的蛋白质)，对Fc配体(例如，Fc受体、C1q)的结合性质改变的Fc变异蛋白。结合性质的实例包括但不限于结合特异性、平衡解离常数(KD)、解离率和结合率(K解离和K结合)、结合亲和力和/或亲和势。人们普遍认为，KD低的结合分子(例如，Fc变异蛋白，如抗体等)比KD高的结合分子更好。然而，在一些情况下，K结合或K解离的值可能比KD值更为相关。本领域中的技术人员可确定哪些动力学参数对于指定抗体应用最为重要。
可通过本领域中确定Fc-FcγR相互作用，即Fc区与FcγR的特异性结合的各种体外测定方法(基于生物化学或免疫学的测定)确定Fc结构域对其配体的亲和力和结合性质，所述体外测定方法包括但不限于平衡法(例如，酶联免疫吸附测定(ELISA)或放射性免疫测定(RIA))或动力学方法(例如，BIACORE. TM分析)，和其它方法，例如间接结合测定、竞争性抑制测定、荧光共振能量转移(FRET)、凝胶电泳和色谱法(例如，凝胶过滤)。这些和其它方法可利用一种或多种检查组分上的标记和/或采用各种检测方法，包括但不限于产色标记、荧光标记、发光标记或同位素标记。例如，在Paul,W.E.编辑的Fundamental Immunology，第4版，Lippincott-Raven,Philadelphia(1999)中可找到结合亲和力和动力学的详细描述。
例如，增强Fc与一种或多种正调节因子(例如，FcγRIIIA)的结合，同时使Fc与负调节因子FcγRIIB的结合不变或甚至减少的修饰将更优选用于增强ADCC活性。可选地，减少与一种或多种正调节因子的结合和/或增强与FcγRIIB的结合的修饰将更优选用于降低ADCC活性。因此，结合亲和力(例如，平衡解离常数(KD))的比值可指示Fc变异体的ADCC活性是增强还是降低。例如，FcγRIIIA/FcγRIIB平衡解离常数(KD)的比值减小将与ADCC活性增强有关，而比值增大将与ADCC活性降低有关。另外，增强与C1q的结合 的修饰将优选用于增强CDC活性，而减弱与C1q的结合的修饰将优选用于减弱或消除CDC活性。
一方面，本发明的Fc变异体以相对于可比分子更高的亲和力结合FcγRIIIA。另一方面，本发明的Fc变异体以相对于可比分子更高的亲和力结合FcγRIIIA并且以不变的结合亲和力结合FcγRIIB。又一方面，本发明的Fc变异体以相对于可比分子更高的亲和力结合FcγRIIIA并且以更低的亲和力结合FcγRIIB。再一方面，本发明的Fc变异体的FcγRIIIA/FcγRIIB平衡解离常数(KD)的比值相对于可比分子降低。
一方面，相对于可比分子，Fc变异蛋白与一种或多种Fc配体的结合增强。另一方面，Fc变异蛋白对Fc配体的亲和力比可比分子强至少2倍、或至少3倍、或至少5倍、或至少7倍、或至少10倍、或至少20倍、或至少30倍、或至少40倍、或至少50倍、或至少60倍、或至少70倍、或至少80倍、或至少90倍、或至少100倍、或至少200倍。在一个特定方面，Fc变异蛋白与Fc受体的结合增强。在另一特定方面，Fc变异蛋白与Fc受体FcγRIIIA的结合增强。在又一特定方面，Fc变异蛋白与Fc受体FcRn的结合增强。在再一特定方面，相对于可比分子Fc变异蛋白与C1q的结合增强。
另一方面，相对于可比分子，本发明的Fc变异体的平衡解离常数(KD)降低约2倍至约10倍、或约5倍至约50倍、或约25倍至约250倍、或约100倍至约500倍、或约250倍至约1000倍。另一方面，相对于可比分子，本发明的Fc变异体的平衡解离常数(KD)降低2倍至10倍、或5倍至50倍、或25倍至250倍、或100倍至500倍、或250倍至1000倍。在一个特定方面，相对于可比分子，本发明Fc变异体对FcγRIIIA的平衡解离常数(KD)降低至少2倍、或至少3倍、或至少5倍、或至少7倍、或至少10倍、或至少20倍、或至少30倍、或至少40倍、或至少50倍、或至少60倍、或至少70倍、或至少80倍、或至少90倍、或至少100倍、或至少200倍、或至少400倍、或至少600倍。
可通过增强Fc区对FcRn的结合亲和力增加包含Fc区的蛋白质的血清半衰期。一方面，相对于可比分子，Fc变异蛋白的血清半衰期增加。
“抗体依赖细胞介导的细胞毒性”或“ADCC”指一种形式的毒素，其中在某些细胞毒性细胞(例如，自然杀伤(NK)细胞、嗜中性粒细胞和巨噬细胞)上存在的Fc受体(FcR)结合的分泌Ig使这些细胞毒性效应细胞能够特异性结合载抗原靶细胞，接着用细胞毒素杀伤靶细胞。例如，指向靶细胞表面的高亲和力IgG“装备”细胞毒性细胞并提供这种杀伤。靶细胞的溶解发生于细胞外，需要细胞与细胞直接接触，并不牵涉补体。考虑到，除抗体外，包含Fc区的其它蛋白质，尤其是具有特异性结合载抗原靶细胞的能力的Fc融合蛋白将能够实现细胞介导的细胞毒性。为简单起见，由Fc融合蛋白活性引起的细胞介导的细胞毒性本文也称为ADCC活性。
可测定任何特定Fc变异蛋白通过ADCC介导靶细胞溶解的能力。为评估ADCC活性，将目标Fc变异蛋白加至于免疫效应细胞组合的靶细胞，这可由引起靶细胞的细胞溶解的抗原抗体复合物激活。通常通过从溶解细胞释放的标记(例如，放射性基质、荧光染料或自然细胞内蛋白)检测细胞溶解。对于此类测定有用的效应细胞包括周围血单核细胞(PBMC)和自然杀伤(NK)细胞。Wisecarver等，1985,79:277-282；Bruggemann等，1987,J Exp Med,166:1351-1361；Wilkinson等，2001,J Immunol Methods,258:183-191；和Patel等，1995,J Immunol Methods,184:29-38中描述了体外ADCC测定的特定实例。可选地，或另外，可评估在体内，例如在如Clynes等，1998,PNAS USA,95:652-656公开的动物模型中目标Fc变异蛋白的ADCC活性。
一方面，相对于可比分子，Fc变异蛋白的ADCC活性增强。在一个特殊方面，Fc变异蛋白的ADCC活性比可比分子的ADCC活性高至少2倍、或至少3倍、或至少5倍、或至少10倍、或至少50倍、或至少100倍。在另一特定方面，相对于可比分子，Fc变异蛋白与Fc受体FcγRIIIA的结合增强并且ADCC活性增强。在其它方面，相对于可比分子，Fc变异蛋白的ADCC活性增强并且血清半衰期增加。
“补体依赖的细胞毒性”和“CDC”指在补体存在下靶细胞的溶解。由补体系统第一组分(C1q)与分子(例如，与同源抗原复合的抗体)的结合开始补体激活途径。为评估补体激活，可进行例如Gazzano-Santoro等，1996,J.Immunol. Methods,202:163中所述的CDC测定。一方面，相对于可比分子，Fc变异蛋白的CDC活性增强。在一个特定方面，Fc变异蛋白的CDC活性比可比分子的CDC活性高至少2倍、或至少3倍、或至少5倍、或至少10倍、或至少50倍、或至少100倍。在其它方面，相对于可比分子，Fc变异蛋白的CDC活性增强且血清半衰期增加。
一方面，本发明提供了制剂，其中Fc区包含在一个或多个选自按Kabat提出的EU索引编号的位置234、235、236、239、240、241、243、244、245、247、252、254、256、262、263、264、265、266、267、269、296、297、298、299、313、325、326、327、328、329、330、332、333和334处的非自然存在氨基酸残基。任选地，Fc区可能包含在本领域技术人员已知或本文公开的另外和/或替代性位置处的非自然存在氨基酸残基(见，例如，美国专利No.5,624,821、6,277,375、6,737,056、PCT专利公布WO 01/58957、WO 02/06919、WO 04/016750、WO 04/029207、WO 04/035752和WO 05/040217)。
在一个特定方面，本发明提供了Fc变异蛋白制剂，其中Fc区包含至少一个选自以下的按Kabat提出的EU索引编号的非自然存在氨基酸残基：234D、234E、234N、234Q、234T、234H、234Y、234I、234V、234F、235A、235D、235R、235W、235P、235S、235N、235Q、235T、235H、235Y、235I、235V、235F、236E、239D、239E、239N、239Q、239F、239T、239H、239Y、240I、240A、240T、240M、241W、241L、241Y、241E、241R、243W、243L、243Y、243R、243Q、244H、245A、247V、247G、252Y、254T、256E、262I、262A、262T、262E、263I、263A、263T、263M、264L、264I、264W、264T、264R、264F、264M、264Y、264E、265G、265N、265Q、265Y、265F、265V、265I、265L、265H、265T、266I、266A、266T、266M、267Q、267L、269H、269Y、269F、269R、296E、296Q、296D、296N、296S、296T、296L、296I、296H、269G、297S、297D、297E、298H、298I、298T、298F、299I、299L、299A、299S、299V、299H、299F、299E、313F、325Q、325L、325I、325D、325E、325A、325T、325V、325H、327G、327W、327N、327L、328S、328M、328D、328E、328N、328Q、328F、328I、328V、328T、328H、328A、329F、329H、329Q、330K、330G、330T、330C、330L、330Y、330V、330I、330F、 330R、330H、332D、332S、332W、332F、332E、332N、332Q、332T、332H、332Y和332A。任选地，Fc区可能包含本领域技术人员已知的另外和/或替代性非自然存在氨基酸残基(见，例如，美国专利No.5,624,821、6,277,375、6,737,056、PCT专利公布WO 01/58957、WO 02/06919、WO 04/016750、WO 04/029207、WO 04/035752和WO 05/040217)。
另一方面，本发明提供了Fc变异蛋白制剂，其中Fc区包含在一个或多个选自按Kabat提出的EU索引编号的位置239、330和332处的至少一个非自然存在氨基酸。在一个特定方面，本发明提供了Fc变异蛋白制剂，其中Fc区包含至少一个选自按Kabat提出的EU索引编号的239D、330L和332E的非自然存在氨基酸。任选地，Fc区可进一步包含在一个或多个选自按Kabat提出的EU索引编号的位置252、254和256处的至少一个非自然存在氨基酸。在一个特定方面，本发明提供了Fc变异蛋白制剂，其中Fc区包含至少一个选自按Kabat提出的EU索引编号的239D、330L和332E的非自然存在氨基酸，并且在一个或多个位置处的至少一个非自然存在氨基酸选自按Kabat提出的EU索引编号的252Y、254T和256E。
一方面，本发明的Fc变异体可与其它已知Fc变异体组合，例如公开了示例性Fc变异体的Ghetie等，1997,Nat.Biotech.15:637-40；Duncan等，1988,Nature 332:563-564；Lund等，1991,J.Immunol.,147:2657-2662；Lund等，1992,Mol.Immunol.,29:53-59；Alegre等，1994,Transplantation 57:1537-1543；Hutchins等，1995,Proc Natl.Acad Sci USA,92:11980-11984；Jefferis等，1995,Immunol Lett.,44:111-117；Lund等，1995,Faseb J.,9:115-119；Jefferis等，1996,Immunol Lett.,54:101-104；Lund等，1996,J.Immunol.,157:4963-4969；Armour等，1999,Eur J Immunol 29:2613-2624；Idusogie等，2000,J.Immunol.,164:4178-4184；Reddy等，2000,J.Immunol.,164:1925-1933；Xu等，2000,Cell Immunol.,200:16-26；Idusogie等，2001,J.Immunol.,166:2571-2575；Shields等，2001,J Biol.Chem.,276:6591-6604；Jefferis等，2002,Immunol Lett.,82:57-65；Presta等，2002,Biochem Soc Trans.,30:487-490)；美国专利No.5,624,821、5,885,573、5,677,425、6,165,745、6,277,375、5,869,046、6,121,022、5,624,821、5,648,260、6,528,624、6,194,551、6,737,056、6,821,505、6,277,375、 美国专利公布No.2004/0002587和PCT公布WO 94/29351、WO 99/58572、WO 00/42072、WO 02/060919、WO 04/029207、WO 04/099249和WO 04/063351中公开的Fc变异体。本发明还涵盖了包含缺失、添加和/或修饰的Fc区。对于本领域中的技术人员而言，Fc结构域的其它修饰/取代/添加/缺失显而易见。
生成非自然存在Fc区的方法在本领域中已知。例如，可通过诱变法，包括但不限于定点诱变(例如，Kunkel,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,82:488-492(1985))、PCR诱变(例如，Higuchi,于"PCR Protocols:A Guide to Methods and Applications",Academic Press,San Diego，第177-183页(1990))和盒式诱变(例如，Wells等，Gene,34:315-323(1985))产生氨基酸取代和/或缺失。优选地，可通过重叠延伸PCR方法(例如，Higuchi,于"PCR Technology:Principles and Applications for DNA Amplification",Stockton Press,New York，第61-70页(1989))进行定点诱变。可选地，重叠延伸PCR技术(例如，Higuchi，见上文)可用于将任何所需突变引入靶序列(起始DNA)。例如，重叠延伸法中第一轮PCR包括用外部引物(引物1)和内部诱变引物(引物3)扩增靶序列，并分别用第二外部引物(引物4)和内部引物(引物2)扩增，获得两个PCR区段(区段A和B)。将内部诱变引物(引物3)设计为含有与靶序列的指定所需突变的错配。在第二轮PCR中，使用两个外部引物(引物1和4)进行PCR扩展第一轮PCR的产物(区段A和B)。用限制酶消化所生成的全长PCR区段(区段C)并将所生成的限制性片段克隆至适当载体中。诱变的第一步，可操作地将起始DNA(例如，编码Fc融合蛋白、抗体或仅编码Fc区)克隆至诱变载体中。将引物设计为反映所需氨基酸取代。本领域中已知用于生成变异体Fc区的其它示例性方法(见，例如，美国专利No.5,624,821、5,885,573、5,677,425、6,165,745、6,277,375、5,869,046、6,121,022、5,624,821、5,648,260、6,528,624、6,194,551、6,737,056、6,821,505、6,277,375、美国专利公布No.2004/0002587和PCT公布WO 94/29351、WO 99/58572、WO 00/42072、WO 02/060919、WO 04/029207、WO 04/099249、WO 04/063351，其全部内容通过引用并入本文)。
在一些方面，Fc变异蛋白包含一种或多种工程化糖型，即与包含Fc区的分子共价连接的碳水化合物。工程化糖型可用于各种用途，包括但不限于 增强或减弱效应子功能。可通过本文公开的方法和本领域中技术人员已知的任何方法，例如通过使用工程化或变异体表达菌株，通过使用影响糖基化的生长条件或基质，通过与一种或多种酶(例如DI N-乙酰葡糖胺转移酶III(GnTI11))共同表达，通过在各种生物体或来自各种生物体的细胞系中表达包含Fc区的分子，或通过在表达包含Fc区的分子后修饰碳水化合物生成工程化糖型。生成工程化糖型的方法在本领域中已知，并且包括但不限于Umana等，1999,Nat.Biotechnol.,17:176-180；Davies等，20017Biotechnol Bioeng.,74:288-294；Shields等，2002,J Biol.Chem.,277:26733-26740；Shinkawa等，2003,J Biol.Chem.,278:3466-3473)美国专利No.6,602,684；美国申请序列No.10/277,370；美国申请序列No.10/113,929；PCT WO 00/61739A1；PCT WO 01/292246A1；PCT WO 02/311140A1；PCT WO 02/30954A1；PotillegentTM技术(Biowa,Inc.,Princeton,N.J.)；GlycoMAbTM糖基化工程技术(GLYCARTTM biotechnology AG,Zurich,Switzerland)中所述的方法。同样见，例如，WO 00061739；EA01229125；US 20030115614；Okazaki等，2004,JMB,336；1239-49。
多核苷酸、载体、宿主细胞和重组方法
本发明进一步提供了包含编码本发明抗体或其表位结合片段的核苷酸序列的多核苷酸。
本发明还涵盖了编码可结合CD20的多肽并且在严格杂交条件下与编码本发明抗体的多核苷酸杂交的多核苷酸，其中所述严格杂交条件包括：在60℃下于6×SSC、0.5％SDS、5×Denhardt溶液和100μg/ml热变性鲑鱼精DNA中预杂交2h；在60℃下杂交18h；在60℃下于4×SSC、0.5％SDS、0.1％焦磷酸钠中30min洗涤2次并且在60℃下于2×SSC、0.1％SDS中30min洗涤2次。
可获得多核苷酸，并通过本领域中已知的方法确定多核苷酸的核苷酸序列。例如，如果抗体的核苷酸序列已知，可由化学合成的寡核苷酸(例如，Kutmeier等，1994,BioTechniques 17:242中所述的寡核苷酸)装配编码抗体的多核苷酸，简言之包括合成含有编码抗体的序列部分的重叠寡核苷酸，退火 和连接那些寡核苷酸，然后通过PCR扩增连接的寡核苷酸。
构建含有抗体编码序列和适当转录和翻译控制信号的重组载体的方法在本领域中众所周知。这些方法包括(例如)体外重组DNA技术、合成技术和体内遗传重组。因此，本发明提供了包含与启动子可操作连接，编码本发明抗体分子或其重链或轻链或重链或轻链可变结构域或其任一个的表位结合片段的核苷酸序列的可复制载体。
通过常规技术将重组载体转移至宿主细胞，然后通过常规技术培养转染的细胞以生成本发明的抗体。因此，本发明包括含有编码本发明抗体或其表位结合片段，与异源启动子可操作连接的多核苷酸的宿主细胞。在优选的方面，编码重链和轻链的载体可在宿主细胞中共同表达以表达整个免疫球蛋白分子。
可利用各种宿主表达载体系统表达本发明的抗体分子。此宿主表达系统表示通过其生成并接着纯化目标编码序列的媒介物，但是还表示用适当核苷酸编码序列转化或转染时，可能原位表达本发明的抗体分子的细胞。这些宿主表达系统包括但不限于微生物，例如用含有抗体编码序列的重组噬菌体DNA、质粒DNA或粘粒DNA表达载体转化的细菌(例如，大肠杆菌和枯草芽孢杆菌(B.subtilis))；用含有抗体表达序列的重组酵母表达载体转化的酵母(例如，酵母菌(Saccharomyces)和毕赤酵母(Pichia))；感染了含有抗体编码序列的重组病毒表达载体(例如，杆状病毒)的昆虫细胞；感染了重组病毒表达载体(例如，花椰菜花叶病毒(CaMV)、烟草花叶病毒(TMV)或用含有抗体编码序列的重组质粒表达载体(例如，Ti质粒)转化的植物细胞系统；或隐匿有含有源自哺乳动物细胞基因组的启动子(例如，金属硫蛋白启动子)或源自哺乳动物病毒的启动子(例如，腺病毒晚期启动子、牛痘病毒7.5K启动子)的重组表达构建体的哺乳动物细胞系统(例如，COS、CHO、BHK、293、3T3细胞)。
优选地，尤其用于表达整个重组抗体分子的细菌细胞例如大肠杆菌，且更优选地，真核细胞用于表达重组抗体分子。例如，连同载体(例如来自人巨细胞病毒的主要即时早期基因启动子元件)的哺乳动物细胞(例如中国仓鼠卵巢细胞(CHO))是有效的抗体表达系统(例如，如Foecking等，1986,Gene  45:101；Cockett等，1990,Bio/Technology 8:2中所公开)。
为长期高产量产生重组蛋白，优选稳定表达。例如，可工程化稳定表达抗体分子的细胞系。可用受适当表达控制元件(例如，启动子、增强子、转录终止子、聚腺苷酸化位点等)控制的DNA和选择标志转化宿主细胞，而不使用含有病毒复制起点的表达载体。引入外源DNA后，可使工程化细胞在富集培养基中生长1-2天，然后转移至选择培养基。重组质粒中的选择标志赋予了对选择的抗性并且使细胞稳定地将质粒整合至其染色体中并生长以形成可依次克隆和扩展至细胞系中的焦点。这种方法可有利地用于工程化表达抗体分子的细胞系。此类工程化细胞系尤其可用于筛选和评价与抗体分子直接或间接相互作用的化合物。
一旦本发明的抗体分子重组表达，就可通过本领域中已知的任何免疫球蛋白分子纯化方法，例如通过色谱法(例如，离子交换、亲和力，尤其是通过对蛋白质A后特异性抗原的亲和力及尺寸柱色谱)、离心、溶解性差异，或通过蛋白质纯化的任何其它标准技术纯化抗体分子。关于这一点，本公开中参考了美国专利No.7,538,195，其教导通过引用特此整体并入。
另一方面，可易于通过在特定CDR组两侧的可变区和恒定区序列中的突变、缺失和/或插入生成不同抗体和抗体片段以及抗体模拟物。因此，例如，对于指定CDR组而言通过取代不同重链可能生成不同类别的Ab，由此例如，可生成IgG1-4、IgM、IgA1-2、IgD、IgE抗体类型和同种型。类似地，可通过将指定CDR组嵌入整个合成框架中生成本发明范围内的人工抗体。本文使用术语“可变”描述抗体中序列不同的可变结构域的某些部分并且在每种特定抗体对其抗原的结合和特异性中使用。然而，可变性通常不是平均分布于抗体的可变结构域。可变性通常集中在轻链和重链可变结构域中3个称为互补决定区(CDR)或高变区的区段中。可变结构域的更加高度保守部分称为框架(FR)。重链和轻链的可变结构域各自包含4个框架区，主要采用β-折叠构型，通过3个CDR连接，形成环连接，并且在一些情况下形成β-折叠结构的一部分。通过FR区使每条链上的CDR与来自另一条链的CDR紧紧靠在一起，有助于形成抗体的抗原结合位点(见，例如，E.A.Kabat等Sequences of  Proteins of Immunological Interest，第5版，1991,NIH)。恒定结构域未直接参与结合抗体与抗原，但展现出各种效应子功能，例如抗体参与抗体依赖的细胞毒性。
可使用若干技术，例如表面重塑和CDR移植生成人源化抗体或适合于不受其它哺乳动物排斥的抗体。在表面重塑技术中，结合分子模拟、统计分析和诱变以将可变区的非CDR表面调节为类似于靶宿主已知抗体的表面。例如，通过引用特此整体并入的美国专利5,639,641中公开了抗体表面重塑的策略和方法和降低抗体在不同宿主中的免疫原性的其它方法。在CDR移植技术中，将鼠重链和轻链CDR移植至全人框架序列中。
本发明还包括该说明书中所述抗体的功能等效物。功能等效物具有与抗体相当的结合特征，并且包括(例如)嵌合、人源化和单链抗体及其片段。通过引用分别整体并入的PCT申请WO 93/21319、欧洲专利申请No.239,400、PCT申请WO 89/09622、欧洲专利申请338,745和欧洲专利申请EP 332,424中公开了生成这种功能等效物的示例性方法。
功能等效物包括具有与本发明抗体的可变区或高变区氨基酸序列大体上相同的氨基酸序列的多肽。本文将应用于氨基酸序列的“大体上相同”定义为通过根据Pearson和Lipman,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85,2444-2448(1988)的FASTA搜索方法确定，与另一氨基酸序列具有至少约90％，且更优选具有至少约95％、96％、97％、98％和99％序列同一性的序列。
嵌合抗体优选具有大体上或全部源自人抗体恒定区的恒定区和大体上或全部源自来自除人以外的哺乳动物的可变区序列的可变区。可通过将(例如)小鼠抗体的互补决定区取代为人框架结构域制备人源化形式的抗体，例如PCT公布No.W092/22653。人源化抗体优选具有恒定区和可变区而非大体上或全部源自相应人抗体区的互补决定区(CDR)和大体上或全部源自除人以外的哺乳动物的CDR。
功能等效物还包括单链抗体片段，也称为单链抗体(scFv)。这些片段含有用或不用一个或多个互连连接子与抗体可变轻链序列(VL)的至少一个片段连 接的抗体可变重链氨基酸序列(VH)的至少一个片段。这种连接子可能是选择的短挠性肽以确保一旦(VL)和(VH)结构域连接就发生适当三维折叠，以保持从中获得单链抗体片段的全抗体的靶分子结合特异性。通常，(VL)或(VH)序列的羧基末端可通过肽连接子与互补(VL)和(VH)序列的氨基末端共价连接。可通过分子克隆、抗体噬菌体展示库或相似技术生成单链抗体片段。这些蛋白质可在真核细胞或原核细胞(包括细菌)中生成。
单链抗体片段含有具有本说明书所述完整抗体的至少一个可变或互补决定区(CDR)的氨基酸序列，但缺乏那些抗体的一些或所有恒定结构域。这些恒定结构域对于抗原结合并非必须，但是构成了完整抗体结构的主要部分。因此单链抗体片段可克服与使用含有部分或整个恒定结构域的抗体相关的一些问题。例如，单链抗体片段倾向于无生物分子和重链恒定区之间的有害相互作用，或其它不良生物活性。另外，单链抗体片段比完整或全抗体小很多并且可能因此具有比完整抗体更强的毛细管渗透性，使得单链抗体片段更有效地定位于靶抗原结合位点并与之结合。同样，可在原核细胞中相对大规模地生成抗体片段，从而促进其生成。而且，单链抗体片段的相对较小尺寸使其比完整抗体更不可能在受体中引起免疫反应。
本文描述的抗CD20抗体及其表面重塑或人源化变异体的氨基酸和核酸序列的知识可用于研发许多也与人CD20结合的抗体。基于一级抗体序列的知识，若干研究已调查了在抗体序列的各个位置引入一个或多个氨基酸变化对抗体的性质，例如结合和表达水平的影响(例如，Yang,W.P.等，1995,J.Mol.Biol.,254,392-403；Rader,C.等，1998,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,95,8910-8915；Vaughan,T.J.等，1998,Nature Biotechnology,16,535-539)。
在这些研究中，已通过使用例如寡核苷酸介导的定点诱变、盒式诱变、易错PCR、DNA改组或大肠杆菌的增变菌株等方法改变CDR1、CDR2、CDR3或框架区中的重链和轻链基因序列生成一级抗体的变异体(Vaughan,T.J.等，1998,Nature Biotechnology,16,535-539；Adey,N.B.等，1996，第16章，第277-291页，"Phage Display of Peptides and Proteins",Eds.Kay,B.K.等，Academic Press)。这些改变一级抗体序列的方法已引起二级抗体的亲和力增 强(例如，Gram,H.等，1992,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,89,3576-3580；Boder,E.T.等，2000,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,97,10701-10705；Davies,J.和Riechmann,L.，1996,Immunotechnolgy,2,169-179；Thompson,J.等，1996,J.Mol.Biol.,256,77-88；Short,M.K.等，2002,J.Biol.Chem.,277,16365-16370；Furukawa,K.等，2001,J.Biol.Chem.,276,27622-27628)。
通过改变抗体一个或多个氨基酸残基的类似定向策略，可将本发明中所述的抗体序列用于研发具有更强功能的抗CD20抗体，例如专利申请公布20090246195中所述的方法，其内容通过引用整体并入本文。
免疫偶联物 
本发明还针对偶联物(本文也称为免疫偶联物)，所述偶联物包含本文公开的与药物或前药连接或偶联的抗CD20抗体、抗体片段、功能等效物、改良抗体及其各方面。适合的药物或前药在本领域中已知。优选的药物或前药为细胞毒性剂。本发明的细胞毒性偶联物中使用的细胞毒性剂可为引起细胞死亡或诱导细胞死亡，或以某种方式降低细胞活力的任何化合物，并且包括(例如)类美坦素和类美坦素类似物、苯二氮紫杉烷、CC-1065和CC-1065类似物、倍癌霉素和倍癌霉素类似物、烯二炔，例如卡奇霉素、海兔毒素和海兔毒素类似物，包括auristatins、茅屋霉素衍生物、来普霉素衍生物、甲氨喋呤、顺铂、卡铂、柔红霉素、阿霉素、长春新碱、长春碱、美法仑、丝裂霉素C、瘤可宁和吗啉阿霉素。更优选的细胞毒性剂为类美坦素和类美坦素类似物、苯二氮紫杉烷、CC-1065和CC-1065类似物。尤其优选类美坦素和类美坦素类似物，其中许多在美国专利公布No.20070048314、20060233814、20080003652、20060155110、20060128970、20090182038、20090042837、20080233618、20080119558、20060099235、20050272727、20050203174、20050112726、20060182750、20090202536、20090142361、20080249085、20080226659、20080171865、20080171856、20080171040、20080145374、20080114153、20070270585、20070269447、20070264266、20070009541、20070009540、20070009539、20060167245、20060127407、20060084141、20050276812、20050169933、20050152913、20050113571、 20050003513、20040241174、20040235840、20040120949、20040014980、20030157694、20020156318、20020156274、20020001587中有描述，其内容通过引用整体并入本文。
可使用连接基团将药物或前药连接至抗体或功能等效物制备这种偶联物。适合的连接基团在本领域中众所周知并且包括(例如)二硫基、硫醚基、酸不稳定基团、光不稳定基团、肽酶不稳定基团和酯酶不稳定基团。
例如，药物或前药可通过二硫键连接至抗CD20抗体或其片段。连接子分子或交联剂包含可与抗CD20抗体或其片段反应的反应性化学基团。与细胞结合剂反应的优选反应性化学基团为N-琥珀酰亚胺酯和N-磺酸琥珀酰亚胺酯。另外连接子分子包含可与药物反应形成二硫键的反应性化学基团，优选二硫代吡啶基。特别优选的连接子分子包括(例如)3-(2-吡啶二硫代)丙酸N-琥珀酰亚胺酯(SPDP)(见，例如，Carlsson等，Biochem.J.,173:723-737(1978))、4-(2-吡啶二硫代)丁酸N-琥珀酰亚胺酯(SPDB)(见，例如，美国专利No.4,563,304)、4-(2-吡啶二硫代)2-磺酸基丁酸N-琥珀酰亚胺酯(磺酸SPDB)(见美国公布No.20090274713)、4-(2-吡啶二硫代)戊酸N-琥珀酰亚胺酯(SPP)(见，例如，CAS登录号341498-08-6)、2-亚氨基硫烷或乙酰琥珀酰酐和例如美国专利No.6,913,748中所述的其它反应性交联剂，其使用已知方法通过引用整体并入本文。见，例如，美国专利No.4,563,304；Carlsson等，Biochem.J.,173:723-737(1978)；Blattler等，Biochem.,24:1517-1524(1985)；Lambert等，Biochem.,22:3913-3920(1983)；Klotz等，Arch.Biochem.Biophys.,96:605(1962)；和Liu等，Biochem.,18:690(1979),Blakey and Thorpe,Antibody,Immunoconjugates and Radiopharmaceuticals,1:1-16(1988)；Worrell等，Anti-Cancer Drug Design,1:179-184(1986)，其公开内容通过引用整体并入本文。例如，可用交联剂使抗体或细胞结合剂改性，并且然后使由此获得的含有游离或保护巯基的抗体或细胞结合剂与含有二硫化物或巯基的类美坦素反应生成偶联物。可通过色谱法，包括但不限于HPLC、尺寸排阻、吸附、离子交换和亲和捕捉、透析或切向流过滤纯化偶联物。
在本发明的另一方面，在增强免疫偶联物的效力、溶解性或功效中，抗 CD20抗体通过二硫键和聚乙二醇间隔与细胞毒性药物连接。WO2009/0134976中描述了这种可裂解亲水性连接子。该连接子设计另外的好处是抗体-药物偶联物的所需高单体比例和最少聚集。在这方面特别考虑到了通过载二硫基(-S-S-)的聚乙二醇间隔((CH2CH2O)n＝1-14)连接的细胞结合剂和药物的偶联物，描述了2-8的狭窄药物负载量范围显示出对癌细胞的相对高效生物活性并且具有偶联产量高、单体比例高和蛋白质聚集最少的所需生物化学性质。
在这方面特别考虑到了式(I)的抗CD20抗体药物偶联物或式(I’)的偶联物：
CB–[Xl–(–CH2–CH2O–)n–Y–D]m  (I) 
[D-Y-(–CH2–CH2O–)n–Xl]m-CB  (I’)
其中：
CB表示抗CD20抗体或片段； 
D表示药物； 
X表示通过硫醚键、酰胺键、氨基甲酸酯键或醚键与细胞结合剂连接的脂肪族、芳香族或杂环单元；
Y表示通过二硫键与药物连接的脂肪族、芳香族或杂环单元；
l为0或1；
m为2-8的整数；并且
n为1-24的整数。
更优选地，m为2-6的整数。
同样，甚至更优选地，m为3-5的整数。
同样，更优选地，n为2-8的整数。可选地，例如美国专利No.6,441,163和7,368,565中所公开，可首先修饰药物以引入适于与细胞结合剂反应的反应性酯。这些含有活化连接子部分的药物与细胞结合剂的反应提供了另一种生成细胞结合剂药物偶联物的方法。也可使用例如美国专利6,716,821中提出的PEG连接基团使类美坦素与抗CD20抗体或片段连接。示例性PEG连接基团包括通过一端的官能巯基或二硫基和另一端的活性酯与连接子两端的细胞毒性剂和细胞结合剂反应的异源双功能PEG连接子。作为使用PEG连接基团合成细胞毒性偶联物的一般实例，再次参考通过引用整体并入本文的美国专利6,716,821。合成从一种或多种载有反应性PEG部分的细胞毒性试与细胞结合剂反应开始，引起每个反应性PEG部分的末端活性酯被细胞结合剂的氨基酸残基置换，以产生包含一种或多种通过PEG连接基团与细胞结合剂共价连接的细胞毒性剂的细胞毒性偶联物。可选地，可用双功能PEG交联剂改变细胞结合以引入反应性二硫化物部分(例如二硫吡啶)，然后可用含硫醇的类美坦素处理以提供偶联物。在另一种方法中，可用双功能PEG交联剂改变细胞结合以引入硫醇部分，然后可用含二硫化物的反应性类美坦素(例如二硫吡啶)处理，以提供偶联物。
也可制备非可裂解连接的抗体-药物偶联物。本领域中描述了此类交联剂(见，例如，ThermoScientific Pierce Crosslinking Technical Handbook和美国公布No.20050169933，每个均通过引用特此并入)并且包括但不限于4-(马来酰亚胺基甲基)环己烷羧酸N-琥珀酰亚胺酯(SMCC)、N-琥珀酰亚胺基-4-(N-马来酰亚胺基甲基)-环己烷-1-羧基-(6-氨基己酸酯)(这是SMCC的“长链”类似物)(LC-SMCC)、κ-马来酰亚胺基十一烷酸N-琥珀酰亚胺酯(KMUA)、β-马来酰亚胺丙酸N-琥珀酰亚胺酯(BMPS)、γ-马来酰亚胺丁酸N-琥珀酰亚胺基酯(GMBS)、ε-马来酰亚胺基己酸N-羟基琥珀酰亚胺酯(EMCS)、间马来酰亚胺苯甲酰基-N-羟基琥珀酰亚胺酯(MBS)、N-(α-马来酰亚胺基乙酸)-琥珀酰亚胺酯(AMAS)、6-(β-马来酰亚胺丙酰胺基)己酸琥珀酰亚胺酯(SMPH)、4-(对马来酰亚胺基苯基)-丁酸N-琥珀酰亚胺酯(SMPB)、N-(对马来酰亚胺基苯基)异氰酸酯(PMPI)、4-(碘乙酰基)-氨基苯甲酸N-琥珀酰亚胺酯(SIAB)、碘代乙酸N-琥珀酰亚胺酯(SIA)、溴代乙酸N-琥珀酰亚胺酯(SBA)和3-(溴乙酰胺基)丙酸 N-琥珀酰亚胺酯(SBAP)。优选地，用交联剂修饰抗体，例如文献中描述的4-(马来酰亚胺基甲基)环己烷-1-羧酸N-琥珀酰亚胺酯(SMCC)、磺酸-SMCC、马来酰亚胺苯甲酰基-N-羟基琥珀酰亚胺酯(MBS)、磺酸-MBS或琥珀酰亚胺碘酸醋酸酯，以引入1-10个反应性基团(Yoshitake等，Eur.J.Biochem.,101:395-399(1979)；Hashida等，J.Applied Biochem.,56-63(1984)；和Liu等，Biochem.,18:690-697(1979))。然后使经修饰抗体与含硫醇的类美坦素衍生物反应以生成偶联物。可通过Sephadex G25柱进行凝胶过滤或通过透析或切向流过滤来纯化偶联物。用含有硫醇的类美坦素(1-2个摩尔当量/马来酰亚胺基)处理经修饰抗体并且通过Sephadex G25柱进行凝胶过滤，在陶瓷羟磷灰石柱上进行色谱法，透析或切向流过滤或其方法的组合纯化抗体-类美坦素偶联物。通常，每个抗体平均连接1-10个类美坦素。优选的方法是用4-(马来酰亚胺基甲基)环己烷-1-羧酸N-琥珀酰亚胺酯(SMCC)修饰抗体以引入马来酰亚胺基，然后经修饰抗体与含有硫醇的类美坦素反应以产生硫醚连接的偶联物。同样产生每个抗体1-10个药物分子的偶联物。以相同方式获得抗体、抗体片段、蛋白质激素、蛋白质生长因子和其它蛋白质的类美坦素偶联物。
在本发明的另一方面，CD20抗体通过PEG间隔中间的非可裂解键与药物连接。在药物和抗CD20抗体或片段之间形成连接子的包含亲水性PEG链的适合交联剂在本领域中也众所周知，或为市售(例如从Quanta Biodesign,Powell,Ohio购买)。也可使用本领域中技术人员已知的标准合成化学技术由市售的PEG自身合成适合的含有PEG的交联剂。可通过美国专利公布20090274713和WO2009/0134976中详细描述的方法，使药物与含有双功能PEG的交联剂反应以产生下式Z–Xl–(–CH2–CH2–O–)n–Yp–D的化合物，然后所述化合物可与细胞结合剂反应以提供偶联物。可选地，可用双功能PEG交联剂改变细胞结合以引入硫醇-反应性基团(例如马来酰亚胺或卤代乙酰胺)，然后可用含有硫醇的类美坦素处理以提供偶联物。在另一种方法中，可用双功能PEG交联剂改变细胞结合以引入硫醇部分，然后可用硫醇-反应性类美坦素(例如载有类美坦素的马来酰亚胺或卤代乙酰胺)处理，以提供偶联物。
因此，本发明的另一方面为式(II)或式(II’)的抗CD20抗体药物偶联物：
CB–[Xl–(–CH2–CH2–O–)n–Yp–D]m  (II) 
[D-Yp–(–CH2–CH2–O–)n–Xl]m-CB  (II’)
其中，CB表示抗CD20抗体或片段； 
D表示药物； 
X表示通过硫醚键、酰胺键、氨基甲酸酯键或醚键与细胞结合剂连接的脂肪族、芳香族或杂环单元；
Y表示通过选自硫醚键、酰胺键、氨基甲酸酯键、醚键、胺键、碳-碳键和腙键的共价键连接与药物连接的脂肪族、芳香族或杂环单元；
l为0或1；
p为0或1；
m为2-15的整数；并且
n为1-2000的整数。
优选地，m为2-8的整数；并且
优选地，n为1-24的整数。
更优选地，m为2-6的整数。
同样，甚至更优选地，m为3-5的整数。
同样，更优选地，n为2-8的整数。含有PEG的适合连接子的实例包括具有与抗CD20抗体或其片段反应的N-琥珀酰亚胺酯或N-磺酸琥珀酰亚胺酯部分，以及与化合物反应的基于马来酰亚胺或卤代乙酰基部分的连接子。可通过本文所述的方法将PEG间隔并入本领域中已知的任何交联剂中。包含基于马来酰亚胺基的部分，可并入PEG间隔的交联剂包括但不限于4-(马来酰亚胺基甲基)环己烷羧酸N-琥珀酰亚胺酯(SMCC)、N-琥珀酰亚胺基-4-(N-马来 酰亚胺基甲基)-环己烷-1-羧基-(6-氨基己酸酯)(这是SMCC的“长链”类似物)(LC-SMCC)、κ-马来酰亚胺基十一烷酸N-琥珀酰亚胺酯(KMUA)、γ-马来酰亚胺丁酸N-琥珀酰亚胺基酯(GMBS)、ε-马来酰亚胺基己酸N-羟基琥珀酰亚胺酯(EMCS)、间马来酰亚胺苯甲酰基-N-羟基琥珀酰亚胺酯(MBS)、N-(α-马来酰亚胺基乙酸)-琥珀酰亚胺酯(AMAS)、6-(β-马来酰亚胺丙酰胺基)己酸琥珀酰亚胺酯(SMPH)、4-(对马来酰亚胺基苯基)-丁酸N-琥珀酰亚胺酯(SMPB)和N-(对马来酰亚胺基苯基)异氰酸酯(PMPI)。包含基于卤代乙酰基的部分的交联剂包括4-(碘乙酰基)-氨基苯甲酸N-琥珀酰亚胺酯(SIAB)、碘代乙酸N-琥珀酰亚胺酯(SIA)、溴代乙酸N-琥珀酰亚胺酯(SBA)和3-(溴乙酰胺基)丙酸N-琥珀酰亚胺酯(SBAP)。
也可使用缺乏硫原子的其它交联剂。此类连接子可源自基于二羧酸的部分。适合的基于二羧酸的部分包括但不限于以下所示通式的α,ω-二羧酸：
HOOC-A’p-E’q-(CH2CH2O)nG’r-COOH
其中A’为具有2-20个碳原子的任选直链或支链烷基、烯基或炔基，E’为具有3-10个碳原子的任选环烷基或环烯基，G’为具有6-10个碳原子的任选经取代或未经取代的芳族基团，或经取代或未经取代的杂环基团，其中杂原子选自N、O或S，并且其中p、q和r各自为0或1，条件是p、q和r不同时全部为0，n为1-2000的整数。
美国专利公布No.20050169933和20090274713和WO2009/0134976中描述了本文公开的许多连接子，其内容通过引用整体并入本文。
本发明提供了带电连接子，其中在修饰抗CD20抗体或其片段后和产生药物偶联物时保持电荷。更特别地，本发明涉及带电连接子将药物连接至抗CD20抗体的用途。在本发明的一方面，带电连接子用于修饰细胞结合剂并将其连接至药物上。在本发明的另一方面，带电连接子用于修饰药物并将其连接至抗CD20抗体或片段上。在本发明的又一方面，带电连接子用于同时连接药物和细胞结合剂。在任何情况下，优选的最终结果是药物-带电连接子-细胞结合剂偶联物，这可用式CB-(-Lc-D)q表示，其中CB为细胞结合剂，即 抗CD20抗体或其片段，Lc为带电连接子，D为药物分子，并且q为1-20的整数。细胞结合剂-药物偶联物中连接子中带电基团的存在提供了若干优势，例如i)最终产物的水溶解性更强，ii)能够在更高的水溶液浓度下操作；iii)能够为每个细胞结合剂分子连接更多数量的药物分子，产生更高效力，iv)可能在靶细胞内部保持带电偶联物种类，产生更高效力，和v)多重耐药性分子的敏感性增强，不能将带电药物种类从细胞中排出。本发明还描述了可与药物和细胞结合剂偶联以产生偶联物的连接子，所述偶联物可在细胞中代谢以生成含有一个或多个带电部分的药物代谢产物。这些连接子将称为前带电连接子。细胞处理后将变得带电的连接子部分将称为前带电部分。
在本发明的一方面，带电或前带电交联剂用式(III)表示，其中Y’可与细胞结合剂反应并且Q可与细胞毒性药物反应：
其中：
Y’表示能够与抗CD20抗体或其片段反应的官能团；
Q表示能够通过二硫键、硫醚键、硫酯键、肽键、腙键、醚键、酯键、氨基甲酸酯键或酰胺键链接细胞毒性药物的官能团；
R1、R2、R3、R4、R5、R6、R7、R8、R9和R10相同或不同并且为H、具有1-6个碳原子的直链烷基、具有3-6个碳原子的支链或环状烷基、具有2-6个碳原子的直链、支链或环状烯基或炔基、阴离子例如但不限于SO3 -、X-SO3 -、OPO3 2-、X-OPO3 2-、PO3 2-、X-PO3 2-、CO2 -和阳离子例如但不限于含氮杂环、N+R11R12R13或X-N+R11R12R13，或苯基，其中：
R11、R12和R13相同或不同并且为H、具有1-6个碳原子的直链烷基、具有3-6个碳原子的支链或环状烷基，并且X表示苯基或具有1-6个碳原子的 直链烷基或具有3-6个碳原子的支链或环状烷基；
l、m和n为0或1-4的整数；并且
A为苯基或经取代的苯基，其中取代基为具有1-6个碳原子的直链烷基或具有3-6个碳原子的支链或环状烷基，或选自阴离子例如但不限于SO3 -、X-SO3 -、OPO3 2-、X-OPO3 2-、PO3 2-、X-PO3 2-、CO2 -和阳离子例如但不限于含氮杂环、N+R11R12R13或X-N+R11R12R13的带电取代基，其中X具有与以上相同的定义，并且其中g为0或1；
Z为式(OCH2CH2)p的任选聚乙烯氧基单元，其中p为0或2至约1000的整数，或F1-E1-P-E2-F2单元中的E1和E2相同或不同并且为C＝O、O或NR14，其中R14为H、具有1-6个碳原子的直链烷基、具有3-6个碳原子的支链或环状烷基、具有2-6个碳原子的直链、支链或环状烯基或炔基；P为长度为2-20个氨基酸的肽单元，其中E1或E2可通过末端氮、末端碳或通过肽其中一个氨基酸的侧链与肽连接；并且F1和F2相同或不同并且为式(OCH2CH2)p的任选聚乙烯氧基单元，其中p为0或2至约1000的整数，条件是当Z不为F1-E1-P-E2-F2时，R1、R2、R3、R4、R5、R6、R7、R8、R9和R10的至少一个为带电取代基或当g为1时，A、R1、R2、R3、R4、R5、R6、R7、R8、R9和R10的至少一个为带电取代基。这是具有带电连接子的偶联物的一个示例性实施方案。公开为2009-0274713(Ravi等)的美国专利申请No.12/433,604中描述了其它实例，其内容通过引用整体并入本文。适合的带电连接子在本领域中众所周知并且包括例如20090274713中所述的带电连接子，其内容通过引用整体并入本文。
本发明包括各个方面，其中约2至约8个药物分子(“药物负载量”)，例如类美坦素，与抗CD20抗体或其片段连接，与相同细胞结合剂连接的更低或更高数量药物的药物负载量相比，偶联物的抗肿瘤效果更加有效。如本文所使用的“药物负载量”指可与细胞结合剂(例如，抗CD20抗体或其片段)连接的药物分子(例如，类美坦素)的数量。一方面，可与细胞结合剂连接的药物分子的数量可能平均为约2至约8(例如，1.9、2.0、2.1、2.2、2.3、2.4、2.5、2.6、2.7、2.8、2.9、3.0、3.1、3.2、3.3、3.4、3.5、3.6、3.7、3.8、3.9、4.0、 4.1、4.2、4.3、4.4、4.5、4.6、4.7、4.8、4.9、5.0、5.1、5.2、5.3、5.4、5.5、5.6、5.7、5.8、5.9、6.0、6.1、6.2、6.3、6.4、6.5、6.6、6.7、6.8、6.9、7.0、7.1、7.2、7.3、7.4、7.5、7.6、7.7、7.8、7.9、8.0、8.1)。在优选方面，可与细胞结合剂连接的药物分子的数量可能平均为约2至约7(例如，1.9、2.0、2.1、2.2、2.3、2.4、2.5、2.6、2.7、2.8、2.9、3.0、3.1、3.2、3.3、3.4、3.5、3.6、3.7、3.8、3.9、4.0、4.1、4.2、4.3、4.4、4.5、4.6、4.7、4.8、4.9、5.0、5.1、5.2、5.3、5.4、5.5、5.6、5.7、5.8、5.9、6.0、6.1、6.2、6.3、6.4、6.5、6.6、6.7、6.8、6.9、7.0、7.1)。在一个更优选的方面，可与细胞结合剂连接的药物分子的数量可能平均为约2至约6(例如，1.9、2.0、2.1、2.2、2.3、2.4、2.5、2.6、2.7、2.8、2.9、3.0、3.1、3.2、3.3、3.4、3.5、3.6、3.7、3.8、3.9、4.0、4.1、4.2、4.3、4.4、4.5、4.6、4.7、4.8、4.9、5.0、5.1、5.2、5.3、5.4、5.5、5.6、5.7、5.8、5.9、6.0、6.1)。在最优选的实施方案中，可与细胞结合剂连接的药物分子的数量可能平均为约2至约5(例如，1.9、2.0、2.1、2.2、2.3、2.4、2.5、2.6、2.7、2.8、2.9、3.0、3.1、3.2、3.3、3.4、3.5、3.6、3.7、3.8、3.9、4.0、4.1、4.2、4.3、4.4、4.5、4.6、4.7、4.8、4.9、5、5.1)。如本文所使用的术语“平均”通过分光光度法测量抗CD20抗体或其片段和与之相连的药物的吸光度确定。另一方面，药物抗CD20抗体或其片段偶联物用式(D) 约2-约8-L-抗-CD20Ab表示，其中D为药物(例如，类美坦素、紫杉烷或CC1065类似物)，L为连接子，其中连接子选自可裂解连接子(例如，可通过二硫化物交换裂解的连接子)或大体上抗裂解的连接子(例如，具有与细胞结合剂反应的N-琥珀酰亚胺酯或N-磺酸琥珀酰亚胺酯部分以及基于马来酰亚胺或卤代乙酰基部分的连接子)，并且抗-CD20Ab为结合本文所述CD20的抗体或其片段。在一个优选元件中，药物细胞结合剂偶联物(例如，免疫偶联物)用式(May)约2-约8-L-抗-CD20Ab表示，其中May为类美坦素，L为连接子，其中所述连接子为可裂解连接子或大体上抗裂解的连接子；并且抗-CD20Ab为结合本文所述CD20的抗体或其片段。适合用于本发明的药物为能够与本文所述细胞结合剂连接的细胞毒性药物。本发明一方面为具有经修饰芳香环的美登醇适合类似物，包括：(1)C-19-脱氯(美国专利no.4,256,746)(通过LAH还原安丝菌素P2制备)；(2)C-20-羟基(或C-20-去甲基)+/-C-19-脱氯(美国专利no.4,361,650和4,307,016)(通过使用链霉菌(Streptomyces)或放线菌(Actinomyces)去甲基化或 使用LAH脱氯化制备)；和(3)C-20-去甲氧基、C-20-酰氧基(-OCOR)、+/-脱氯(美国专利no.4,294,757)(通过使用酰基氯酰化制备)。具有其它位置的修饰的美登醇适合类似物的特定实例包括：(1)C-9-SH(美国专利no.4,424,219)(通过使美登醇与H2S或P2S5反应制备)；(2)C-14-烷氧基甲基(去甲氧基/CH2OR)(美国专利no.4,331,598)；(3)C-14-羟甲基或酰氧基甲基(CH2OH或CH2OAc)(美国专利no.4,450,254)(由诺卡菌(Nocardia)制备)；(4)C-15-羟基/酰氧基(美国专利no.4,364,866)(通过用链霉菌转化美登醇制备)；(5)C-15-甲氧基(美国专利no.4,313,946和4,315,929)(从滑桃树(Trewia nudiflora)中分离)；(6)C-18-N-去甲基(美国专利no.4,362,663和4,322,348)(通过用链霉菌去甲基化美登醇制备)；和(7)4,5-脱氧(美国专利no.4,371,533)(通过三氯化钛/LAH还原美登醇制备)。美国专利No.5,208,020、5,416,064和7,276,497中全面公开了用于本发明的含硫醇的类美坦素的合成。在C-3位置、C-14位置、C-15位置或C-20位置具有硫醇部分的类美坦素全部有用。优选C-3位置并且尤其优选美登醇的C-3位置。还优选含有N-甲基-丙胺酸的C-3硫醇部分类美坦素和含有N-甲基-半胱氨酸的C-3硫醇部分类美坦素及各自的类似物。优选的类美坦素为美国专利5,208,020、5,416,064、6,333.410、6,441,163、6,716,821、RE39,151和7,276,497中描述的类美坦素。其中，优选N2’-去乙酰基-N2’-(3-巯基-1-氧代丙基)-美登素(DM1)和N2’-去乙酰基-N2’-(4-巯基-4-甲基-1-氧代戊基)美登素(DM4)。其它药物可用于本发明的现有方面，例如本文所述的药物。美国临时申请No.61/049,296和美国专利申请No.12/574,430中描述了其它实例，其全部内容通过引用并入本文。
可通过使双功能交联剂与抗CD20抗体或其片段反应来修饰抗CD20抗体或其片段，从而引起连接子分子与抗CD20抗体或其片段共价连接。如本文所使用，术语“双功能交联剂”为共价连接细胞结合剂与药物，例如本文所述药物的任何化学部分。在另一种方法中，由药物提供一部分的连接部分。在这一点上，药物包含为用于连接细胞结合剂与药物的较大连接子分子的一部分的连接部分。例如，为形成类美坦素DM1，修饰美登素C-3羟基处的侧链以具有游离巯基(SH)。该硫醇化形式的美登素可与经修饰的细胞结合剂反应形成偶联物。因此，由两个组分装配成最终连接子，其中一个组分由交联 剂提供，而另一个组分由来自DM1的侧链提供。
也可通过中间载体分子，例如血清白蛋白使药物分子与抗体分子连接。
如本文所使用的表述“与细胞结合剂连接”或“与抗CD20抗体或片段连接”指包含至少一个药物衍生物的偶联物分子通过适合连接基团或其前体与细胞结合剂抗CD20抗体或片段结合。优选的连接基团为SMCC。
尤其优选用于本发明中的细胞毒性剂为类美坦素和类美坦素类似物。适合类美坦素的实例包括美登醇和美登醇类似物的酯。与美登醇和美登醇类似物一样，包括抑制微管形成并且对哺乳动物细胞毒性很高的任何药物。
适合美登醇酯的实例包括具有经修饰芳香环的美登醇酯和在其它位置具有修饰的美登醇酯。美国专利No.4,424,219、4,256,746、4,294,757、4,307,016、4,313,946、4,315,929、4,331,598、4,361,650、4,362,663、4,364,866、4,450,254、4,322,348、4,371,533、5,208,020、5,416,064、5,475,092、5,585,499、5,846,545、6,333,410、7,276,497和7,473,796中公开了这种适合类美坦素。
具有经修饰芳香环的适合美登醇类似物的特定实例包括：
(1)C-19-脱氯(美国专利No.4,256,746)(通过LAH还原安丝菌素P2制备)；
(2)C-20-羟基(或C-20-去甲基)+/-C-19-脱氯(美国专利No.4,361,650和4,307,016)(通过使用链霉菌或放线菌去甲基化或使用LAH脱氯化制备)；和
(3)C-20-去甲氧基、C-20-酰氧基(-OCOR)、+/-脱氯(美国专利No.4,294,757)(通过使用酰基氯酰化制备)。
在其它位置具有修饰的适合美登醇类似物的特定实例包括：
(1)C-9-SH(美国专利No.4,424,219)(通过使美登醇与H2S或P2S5反应制备)；
(2)C-14-烷氧基甲基(去甲氧基/CH2OR)(美国专利No.4,331,598)；
(3)C-14-羟甲基或酰氧基甲基(CH2OH或CH2OAc)(美国专利No.4,450,254)(由诺卡菌制备)；
(4)C-15-羟基/酰氧基(美国专利No.4,364,866)(通过用链霉菌转化美登醇制备)；
(5)C-15-甲氧基(美国专利No.4,313,946和4,315,929)(从滑桃树中分离)；
(6)C-18-N-去甲基(美国专利No.4,362,663和4,322,348)(通过用链霉菌去甲基化美登醇制备)；和
(7)4,5-脱氧(美国专利No.4,371,533)(通过三氯化钛/LAH还原美登醇制备)。
在优选的方面，本发明的偶联物利用含有硫醇的类美坦素(DM1)，正式称为N2’-去乙酰基-N2’-(3-巯基-1-氧代丙基)-美登素，作为细胞毒性剂。DM1用以下结构式(IV)表示：
在优选的方面，本发明的偶联物利用含有硫醇的类美坦素N2’-去乙酰基-N2’-(4-甲基-4-巯基-1-氧代戊基)-美登素(例如DM4)作为细胞毒性剂。DM4用以下结构式(V)表示：
包含含位阻硫醇键的侧链的其它优选类美坦素为用以下结构式(VI)表示的N2’-去乙酰基-N-2’(4-巯基-1-氧代基)-美登素(称为DM3)：
另外的类美坦素包括式(VII-L)、(VII-D)或(VII-D,L)表示的化合物：
其中：
Y表示(CR7R8)l(CR5R5)m(CR3R4)nCR1R2SZ，
其中：
R1和R2各自独立为具有1-10个碳原子的直链烷基或烯基、具有3-10个碳原子的支链或环状烷基或烯基、苯基、经取代的苯基或杂环基团，并且另 外R1和R2的其中一个可为H；
R3、R4、R5、R6、R7和R8各自独立为H、具有1-10个碳原子的直链烷基或烯基、具有3-10个碳原子的支链或环状烷基或烯基、苯基、经取代的苯基或杂环芳香族或杂环烷基基团；
l、m和n各自独立为1-5的整数，并且另外n可为0；
Z为H、SR或-COR，其中R为具有1-10个碳原子的直链或支链烷基或烯基、具有3-10个碳原子的环状烷基或烯基或未经取代或经取代的芳基或杂环基团；并且
May表示在C-3、C-14羟甲基、C-15羟基或C-20去甲基处载有侧链的类美坦素。
式(VII-L)、(VII-D)和(VII-D,L)的优选方面包括式(VII-L)、(VII-D)和(VII-D,L)的化合物，其中：
R1为H，R2为甲基，R5、R6、R7和R8各自为H，l和m各自为1，n为0，并且Z为H。
R1和R2为甲基，R5、R6、R7和R8各自为H，l和m为1，n为0，并且Z为H。
R1为H，R2为甲基，R5、R6、R7和R8各自为H，l和m各自为1，n为0，并且Z为-SCH3。
R1和R2为甲基，R5、R6、R7和R8各自为H，l和m为1，n为0，并且Z为-SCH3。
另外的类美坦素还包括式(VIII)表示的化合物：
其中Y如式(VII)所定义。
式(VIII)的优选方面包括式(VIII)的化合物，其中：
R1为H，R2为甲基，R5、R6、R7和R8各自为H；l和m各自为1；n为0；并且Z为H。
R1和R2为甲基，R5、R6、R7和R8各自为H，l和m为1；n为0；并且Z为H。
R1为H，R2为甲基，R5、R6、R7和R8各自为H，l和m各自为1，n为0，并且Z为-SCH3。
R1和R2为甲基，R5、R6、R7和R8各自为H，l和m为1，n为0，并且Z为-SCH3。
另外的美登素进一步包括式(IX-L)、(IX-D)或(IX-D,L)表示的化合物：
其中：Y2表示(CR7R8)l(CR9＝CR10)p(C≡C)qAo(CR5R6)mDu(CR11＝CR12)r(C≡C)sBt(CR3R4)nCR1R2 SZ2，
其中：
R1和R2各自独立为具有1-10个碳原子的直链烷基或烯基、具有3-10个碳原子的支链或环状烷基或烯基、苯基、经取代的苯基或杂环基团，并且另外R1和R2的其中一个可为H；
A、B和D各自独立为具有3-10个碳原子的环烷基或环烯基、简单或经取代的芳基或杂环芳族基团或杂环烷基；
R3、R4、R5、R6、R7、R8、R9、R10、R11和R12各自独立为H、具有1-10个碳原子的直链烷基或烯基、具有3-10个碳原子的支链或环状烷基或烯基、苯基、经取代的苯基或杂环基团；
l、m、n、o、p、q、r、s和t各自独立为0或1-5的整数，条件是l、m、n、o、p、q、r、s和t中至少一个在任何时候均不为0；并且
Z2为SR或-COR，其中R为具有1-10个碳原子的直链烷基或烯基、具有3-10个碳原子的支链或环状烷基或烯基，或简单或经取代的芳基或杂环芳族基团或杂环烷基，并且
May为类美坦素。 
式(IX)中化合物的优选方面包括其中R1为H而R2为甲基，和R1为甲基而R2为甲基的化合物。
进一步地，类美坦素包括式(X)表示的化合物：
其中Y2’与式(IX)的Y2定义相同。 
美国专利No.5,208,020和7,276,497中教导的每种类美坦素也可用于本发明的偶联物中。在这一点上，5,208,020和7,276,697的全部公开内容通过引用并入本文。
类美坦素上许多位置均可用作化学连接连接部分的位置。例如，预计具有羟基的C-3位置、经羟甲基修饰的C-14位置、经羟基修饰的C-15位置和具有羟基的C-20位置均有用。然而优选C-3位置并且尤其优选美登醇的C-3位置。
以下示出了优选偶联物的结构示意图：
美国专利No.6,333,410和美国申请No.09/867,598、10/161,651和10/024,290中提供了生成此类抗体-类美坦素偶联物的若干描述，其每个均整体并入本文。
通常，可用摩尔过量的具有载有反应性基团的二硫化物部分的类美坦素孵育抗体于含水缓冲液中的溶液。通过添加过量胺(例如乙醇胺、牛磺酸等)猝灭反应混合物。然后可通过凝胶过滤纯化类美坦素-抗体偶联物。
可通过用分光光度法测量在252nm和280nm下的吸光度比例确定每个抗体分子结合的类美坦素分子的数量。优选平均数为1-10个类美坦素分子/抗体分子并且更优选平均数为2-5。
可评估抗体与类美坦素药物的偶联物抑制各种有害细胞系在体外增殖的能力。例如，细胞系(例如人淋巴瘤细胞系Daudi和人淋巴瘤细胞系Ramos)可易于用于评估这些化合物的细胞毒性。可将待评估细胞暴露于化合物4-5天并且通过已知方法直接测定测量细胞的存活分数。然后可由测定结果计算IC50值。
美国临时申请No.61/150,201中所述的苯二氮化合物(例如，吲哚啉苯二氮或噁唑烷苯二氮)、其衍生物、其中间产物也可用于制备抗CD20抗体片段或偶联物。
有用的苯二氮包括式(XIX)、(XX)和(XXI)的化合物，其中二聚体化合物任选载有允许与细胞结合剂连接的连接基团。
其中N和C之间的双线表示单键或双键，条件是当双线为双键时X不存在且Y为H，并且当双线为单键时X为H或将化合物转化为前药的胺保护部分；
Y选自-OR、-OCOR’表示的酯、-OCOOR’表示的碳酸酯、-OCONR’R”表示的氨基甲酸酯、NR’R”表示的胺或羟胺、-NRCOR’表示的酰胺、NRCOP表示的肽(其中P为氨基酸或含有2-20个氨基酸单元的多肽)、SR’表示的硫醚、SOR’表示的亚砜、-SO2R’表示的砜、亚硫酸盐-SO3、重亚硫酸盐-OSO3、卤素、氰基、叠氮基或硫醇，其中R、R’和R”相同或不同并且选自H、具有1-10个碳原子的经取代或未经取代的直链、支链或环状烷基、烯基或炔基、聚乙二醇单元(-OCH2CH2)n(其中n为1-2000的整数)、具有6-10个碳原子的芳基、具有3-10个碳原子的杂环，其中取代基选自卤素、OR7、NR8R9、NO2、NRCOR’、SR10、SOR’表示的亚砜、-SO2R’表示的砜、亚硫酸盐-SO3、重亚硫酸盐-OSO3、SO2NRR’表示的磺酰胺、氰基、叠氮基、-COR11、OCOR11或OCONR11R12，其中R7、R8、R9、R10、R11和R12的定义如以上所给出，任选地R”为OH；
W为C＝O、C＝S、CH2、BH、SO或SO2；
R1、R2、R3、R4、R1’、R2’、R3’和R4’各自独立为选自H、具有1-10个 碳原子的经取代或未经取代的直链、支链或环状烷基、烯基或炔基、聚乙二醇单元(-OCH2CH2)n(其中n为1-2000的整数)或选自卤素、胍[-NH(C＝NH)NH2]、OR7、NR8R9、NO2、NRCOR’、SR10、SOR’表示的亚砜、-SO2R’表示的砜、亚硫酸盐-SO3、重亚硫酸盐-OSO3、SO2NRR’表示的磺酰胺、氰基、叠氮基、-COR11、OCOR11或OCONR11R12的取代基，其中R7、R8、R9、R10、R11和R12各自独立选自H、具有1-10个碳原子的直链、支链或环状烷基、烯基或炔基、聚乙二醇单元(-OCH2CH2)n(其中n为1-2000的整数)、具有6-10个碳原子的芳基、具有3-10个碳原子的杂环，任选地R10为SR13或COR13，其中R13选自具有1-10个碳原子的直链、支链或环状烷基、烯基或炔基、聚乙二醇单元(-OCH2CH2)n(其中n为1-2000的整数)、具有6-10个碳原子的芳基、具有3-10个碳原子的杂环，任选地R11为OR14，其中R14具有与R相同的定义，任选地R1、R2、R3、R4、R1’、R2’、R3’或R4’的任一个为使能够通过共价键与细胞结合剂连接的连接基团或选自任选载有使能够与细胞结合剂连接的连接基团的聚吡咯基、聚吲哚基、聚咪唑基、聚吡咯并咪唑基、聚吡咯并吲哚基或聚咪唑基并吲哚基单元；
Z选自(CH2)n(其中n为1、2或3)、CR15R16、NR17、O或S，其中R15、R16和R17各自独立选自H、具有1-10个碳原子的直链、支链或环状烷基、烯基或炔基、聚乙二醇单元(-OCH2CH2)n(其中n为1-2000的整数)；
R6为OR、SR或NRR’，其中R和R’具有与以上给出的相同定义；
X’选自CH2、NR、CO、BH、SO或SO2，其中R具有与以上给出的相同定义；
Y’为O、CH2、NR或S，其中R具有与以上给出的相同定义；
Z’为CH2或(CH2)n，其中n为2、3或4，条件是X’、Y’和Z’不同时全部为0；
A和A’相同或不同并且选自O、-CRR’O、S、-CRR’S、-NR15或CRR’NHR15，其中R和R’具有与以上给出的相同定义并且其中R15具有与以上对R给出的 相同定义；
D和D’相同或不同并且独立选自具有1-10个碳原子的直链、支链或环状烷基、烯基或炔基，任选由卤素、OR7、NR8R9、NO2、NRCOR’、SR10、SOR’表示的亚砜、-SO2R’表示的砜、亚硫酸盐-SO3、重亚硫酸盐-OSO3、SO2NRR’表示的磺酰胺、氰基、叠氮基、-COR11、OCOR11或OCONR11R12(其中R7、R8、R9、R10、R11和R12的定义如以上给出)、聚乙二醇单元(-OCH2CH2)n(其中n为1-2000的整数)的任一个取代；
L为具有3-10个碳原子，经任选取代的任选苯基或杂环，其中取代基为使能够通过共价键与细胞结合剂连接的连接基团，或选自具有1-10个碳原子的直链、支链或环状烷基、烯基或炔基，任选由卤素、OR7、NR8R9、NO2、NRCOR’、SR10、SOR’表示的亚砜、-SO2R’表示的砜、亚硫酸盐-SO3、重亚硫酸盐-OSO3、SO2NRR’表示的磺酰胺、氰基、叠氮基、-COR11、OCOR11或OCONR11R12(其中R7、R8、R9、R10、R11和R12的定义如以上给出)、聚乙二醇单元(-OCH2CH2)n(其中n为1-2000的整数)的任一个取代；任选地，L本身为使能够通过共价键与细胞结合剂连接的连接基团；或其药学上可接受的溶剂化物、盐、水合物、水合盐、其光学异构体、外消旋物、非对映异构体、对映异构体或这些化合物的多形晶体；条件是化合物仅具有一个使能够通过共价键与细胞结合剂连接的连接基团。
在一个优选的方面，N和C之间的双线表示单键或双键，条件是当双线为双键时X不存在且Y为H，并且当双线为单键时X为H或将化合物转化为前药的胺保护部分；
Y选自-OR、NR’R”、亚硫酸盐-SO3或重亚硫酸盐-OSO3，其中R选自H、具有1-10个碳原子的经取代或未经取代的直链、支链或环状烷基、烯基或炔基、聚乙二醇单元(-OCH2CH2)n(其中n为1-2000的整数)、具有6-10个碳原子的芳基、具有3-10个碳原子的杂环；
W为C＝O、CH2或SO2；
R1、R2、R3、R4、R1’、R2’、R3’和R4’各自独立为选自H、NO2或使能够通过共价键与细胞结合剂连接的连接基团；
R6为OR18，其中R18具有与R相同的定义；
Z选自(CH2)n(其中n为1、2或3)、CR15R16、NR17、O或S，其中R15、R16和R17各自独立选自H、具有1-10个碳原子的直链、支链或环状烷基、烯基或炔基、聚乙二醇单元(-OCH2CH2)n(其中n为1-2000的整数)；
X’选自CH2或C＝O；
Y’为O、NR或S，其中R如以上定义；
Z’为CH2或(CH2)2；
A和A’各自为O；
D和D’相同或不同并且独立选自具有1-10个碳原子的直链、支链或环状烷基、烯基或炔基；
L为具有3-10个碳原子，经任选取代的任选苯基或杂环，其中取代基为使能够通过共价键与细胞结合剂连接的连接基团，或选自具有1-10个碳原子的直链、支链或环状烷基、烯基或炔基，任选由卤素、OR7、NR8R9、NO2、NRCOR’、SR10、SOR’表示的亚砜、-SO2R’表示的砜、亚硫酸盐-SO3、重亚硫酸盐-OSO3、SO2NRR’表示的磺酰胺、氰基、叠氮基、-COR11、OCOR11或OCONR11R12、聚乙二醇单元(-OCH2CH2)n(其中n为1-2000的整数)的任一个取代；任选地，L本身为使能够通过共价键与细胞结合剂连接的连接基团；或其药学上可接受的溶剂化物、盐、水合物、水合盐、其光学异构体、外消旋物、非对映异构体、对映异构体或这些化合物的多形晶体结构。
在另一优选方面，化合物用式(XXII)表示：
其中N和C之间的双线表示单键或双键，条件是当双线为双键时X不存在且Y为H，并且当双线为单键时X为H或将化合物转化为前药的胺保护部分，并且Y选自OH、-OR表示的醚、亚硫酸盐-SO3或重亚硫酸盐-OSO3，其中R选自载有1-10个碳原子的直链、支链或环状烷基、烯基或炔基；
R2、R3的其中一个为使能够通过共价键与细胞结合剂连接的连接基团，而另一个为H，
L’、L”或L”’的其中一个为使能够与细胞结合剂连接的连接基团，而其它的为H；优选地L’为连接基团而G为CH或N。美国专利申请No.61/150,201中描述了其它实例，其全部内容通过引用并入本文。
根据本发明用于细胞毒性偶联物的细胞毒性剂也可能是紫杉烷或其衍生物。紫杉烷为包括广泛用于癌症治疗的两种化合物：细胞毒性自然产物紫杉醇(Taxol)和半合成衍生物多西他赛(Taxotere)的化合物家族。紫杉烷为抑制微管蛋白解聚，引起细胞死亡的有丝分裂纺锤体毒素。虽然多西他赛和紫杉醇是治疗癌症的有用试剂，由于其对正常细胞的非特异性毒性，其抗肿瘤活性有限。进一步地，如同紫杉醇和多西他赛的化合物本身效力不足以用于细胞结合剂，例如本发明的抗CD20抗体及其片段的偶联物中。美国专利No.6,372,738和6,340,701中公开了适合用于本发明的紫杉烷。可使用目前已知或稍后开发的任何技术形成本发明紫杉烷和细胞结合剂的偶联物。USP 5,416,064和USP 5,475,092中教导了许多偶联方法。7,598,290、20090099336、20070031402、20060233814、20060233811、20050123549、20050085513和20040039176中也教导了紫杉烷，其全部通过引用整体并入本文。
CC-1065及其类似物也为用于本发明的优选细胞毒性药物。美国专利No. 6,372,738、6,340,701、5,846,545和5,585,499中公开了CC-1065及其类似物。CC-1065是从链霉菌培养肉汤中分离的有效抗肿瘤抗生素。CC-1065在体外的效力比常用抗癌药物例如阿霉素、甲氨喋呤和长春新碱强约1000倍(B.K.Bhuyan等，Cancer Res.,42,3532-3537(1982))。
倍癌霉素是非常适合用于本发明的细胞毒性药物并且在本文和本领域中公开，例如在美国专利序列No.6,281,354、6,066,742、5,703,080、4,994,578、4,923,990中。每个参考通过引用整体并入本文。
烯二炔，例如卡奇霉素，是非常适合用于本发明的细胞毒性药物并且在本文和本领域中公开，例如在美国专利序列No.5,436,361、5,053,394和20090105461中。每个参考通过引用整体并入本文。
多拉司他汀和多拉司他汀类似物，包括auristatin，是适合用于本发明的细胞毒性药物并且在本文和本领域中公开，例如在美国专利序列No.7,084,110、6,737,409、6,686,445、6,632,795、6,458,765、6,323,315、6,248,865、6,239,104、6,143,721、6,103,698、6,034,065、5,985,837、5,965,537、5,886,147、5,554,725、5,138,036、5,076,973、4,986,988、4,978,744和4,879,278中。每个参考通过引用整体并入本文。
茅屋霉素衍生物是适合用于本发明的细胞毒性药物并且在本文和本领域中公开，例如在美国专利序列No.4,427,588，Arima等，"J.Antibiotics"，第25卷，No.8，第437-444页，(1972)；Kariyone等，"Chem.Pharm.Bull."，第19卷，No.11，第2289-2293页，(1971)；和Leimgruber等，"J.Am.Chem.Soc."，第90卷，第5641-5643页，(1968)中。每个参考通过引用整体并入本文。
来普霉素衍生物是适合用于本发明的细胞毒性药物并且在本文和本领域中公开，例如在美国专利序列No.7,446,196；Kudo等Experimental Cell Research,1998,242(2),54-546；Kuhnt等，Applied Environmental Microbiology,1998,64(2),714-720；美国申请No.10/856,703；Carl等，J.Med.Chem.1981,24(3),479-480,"A Novel Connector Linkage Applicable in Prodrug Design"； Chemical Abstracts No.105:102629(JP 61-109717 A2的摘要(1986))；Doherty等，J.Nat.Cancer Inst.2003,95(24),1859-1868,"Cell Cycle Checkpoint Function in Bladder Cancer"；Fukuda等，Nature 1997,390,308-311,"CRM1is responsible for intracellular transport mediated by the nuclear export signal"；Hamamoto等，J.Antibioticss 1983,36(6),639-645,"Leptomycins A and B,New Antifungal Antibioticss I.Taxonomy of the Producing Strain and Their Fermentation,Purification and Characterization"；Hayakawa等，J.Antibioticss 1987,40(9),1349-1352,"New Antitumor Antibioticss,Anguinomycins A and B"；Inoue等，J.Biol.Chem.2002,277(17),15053-15060,"Nuclear Import and Export Signals in Control of the p53-related Protein p73"；Kobayashi等，Ensho,Saisei 2004,24(5),578-583,"Role of matrix metalloproteinase-9expression on cutaneous inflammation:possible treatment by Leptomycin B application"(摘要)；Komiyama等，J.Antibioticss 1985,38(2),220-223,"Structural Study of a New Antitumor Antibiotics,Kazusamycin"；Komiyama等，J.Antibioticss 1985,38(2),224-229,"Antitumor Activity of a New Antibiotics,Kazusamycin"；Komiyama等，J.Antibioticss 1985,38(3),427-429,"Antitumor activity of Leptomycin B"；Kudo等，Exp.Cell Res.1998,242,540-547,"Lepto-mycin B Inhibition of Signal Mediated Nuclear Export by Direct Binding to CRM1"；Kudo等，Proc.Nat'l Acad.Sci.(USA)1999,96(3),9112-9117,"Leptomycin B inactivates CRM1/exportin 1by covalent modification at a cysteine residue in the central conserved region"；Kuhnt等，Applied Environ.Microbiol.1998,64(2),714-720,"Microbial Conversion Products of Leptomycin B"；Lane等，Proc.Nat'l Acad.Sci.(USA)2000,97,8501-8506,"Activation of p53in cervical carcinoma cells by small molecules"；Marabese等，Nucleic Acids Res.200331(22),6624-6632,"DNA damage induces transcriptional activation of p73by removing C-EBPa repression on E2F1"；Meissner等，FEBS Letters 2004,576(1-2),27-30,"Ratjadone and Leptomycin B block CRM1-dependent nuclear export by identical mechanisms"(摘要)；Nishi等，J.Biol.Chem.1994,269(9),6320-6324,"Leptomycin B Targets a Regulatory Cascade of crm1,a Fission Yeast Nuclear Protein,Involved in Control of Higher Order Chromosome Structure and Gene  Expression"；Peehl等，Prostate 2003,54,258-267,"Leptomycin B Stabilizes and Activates p53in Primary Prostatic Epithelial Cells and Induces Apoptosis in the LNCaP Cell Line"；和2004年12月6日访问的英国邓迪大学外科和分子肿瘤学系Lain集团网站http://www.dundee.ac.uk/surgery/Non-Genotoxic.htm，"Non-genotoxic activation of the p53tumor suppressor function"中。每个参考通过引用整体并入本文。
在本发明的另一方面，siRNA分子可与本发明的抗体而不是药物连接。可通过常用于修饰寡核苷酸的方法使siRNA与本发明的抗体连接(见，例如，美国专利公布20050107325和20070213292)。因此呈3’或5’-亚磷酰胺形式的siRNA可与载有羟基官能度的交联剂一端反应以在siRNA和交联剂之间产生酯键。类似地，siRNA亚磷酰胺与载有末端氨基的交联剂反应引起交联剂与siRNA通过胺连接。可选地，可通过标准化学方法衍生化siRNA以引入硫醇基。这种含有硫醇的siRNA可与经修饰引入了活性二硫化物或马来酰亚胺部分的抗体反应，以生成可裂解或非可裂解偶联物。可通过这种方法使1-20个siRNA分子与抗体连接。
诊断和研究应用
除本文讨论的抗体的治疗用途外，可在许多已知的诊断和研究应用中采用本发明的抗体和/或片段。例如，本发明的抗体和/或片段可用于体外和体内诊断方法中包括的纯化、检测和靶向CD20。例如，抗体和/或片段可用于免疫测定中以定性和定量测量生物样品中的细胞表达的CD20水平。见，例如，通过引用整体并入本文的Harlow等，Antibodies:A Laboratory Manual(Cold Spring Harbor Laboratory Press，1988年第2版)。
例如，本发明的抗体可用于竞争性结合测定、直接和间接夹心测定和免疫沉淀测定(Zola，Monoclonal Antibodies:A Manual of Techniques，第147-158页(CRC Press,Inc.,1987))。
例如，本发明还提供了以上抗CD20肽和以下描述的经可检测标记的抗体，用于检测已知或怀疑有CD20介导的病状的患者体内的CD20的诊断方 法中。本发明的抗CD20肽和/或抗体用于检测或定量样品中CD20或抗CD20抗体的免疫测定。CD20的免疫测定通常包括在能够与CD20选择性结合的本发明经可检测标记的高亲和力抗CD20肽和/或抗体存在下孵育生物样品，和检测样品中结合的标记肽或抗体。各种临床测定步骤在本领域中已知，例如A.Voller等编的第80版Immunoassays，University Park,1981中所述。因此，可将抗CD20肽或抗体或其片段加至硝化纤维或能够固定细胞、细胞颗粒或可溶性蛋白的另一种固体支撑物上。然后可用适合缓冲液洗涤支撑物，然后用可检测标记的CD20特异性肽或抗体或其片段处理。然后可用缓冲液再洗一次固相支撑物以去除未结合的肽或抗体或其片段。然后可通过已知方法步骤检测固体支撑物上结合标记的量。
“固相支撑物”或“载体”指能够结合肽、抗原或抗体或其片段的任何支撑物。众所周知的支撑物或载体包括玻璃、聚苯乙烯、聚丙烯、聚乙烯、葡聚糖、尼龙、淀粉酶、自然和经修饰纤维素、聚丙烯酰胺、琼脂糖和磁铁矿。载体的性质可为在一定程度上可溶或对于本发明的目的不溶。支撑物材料实际上可具有任何可能结构构型，只要偶联分子能够与CD20或抗CD20抗体或其片段结合。因此，支撑物构型可为球形如珠子，或圆柱形如试管的内表面或杆的外表面。可选地，表面可平坦，例如薄片、培养皿、试纸条等。优选的支撑物包括聚苯乙烯珠。本领域中的技术人员将了解结合抗体或其片段、肽或抗原的许多其它适合载体，或者可通过常规实验确定其它适合载体。
众所周知的方法步骤可确定许多给定抗CD20肽和/或抗体或其片段的结合活性。本领域中的技术人员可通过常规实验确定有效最佳测定条件。
可通过与用于酶免疫测定(EIA)或酶联免疫吸附测定(ELISA)的酶连接实现可检测标记CD20特异性肽和/或抗体或其片段。连接的酶与暴露底物反应生成(例如)可通过分光光度法、荧光测定法或通过视觉方式检测的化学部分。可用于可检测标记本发明的CD20特异性抗体或其片段的酶包括但不限于苹果酸脱氢酶、葡萄球菌核酸酶、δ-5-类固醇异构酶、酵母醇脱氢酶、α-磷酸甘油脱氢酶、磷酸丙糖异构酶、辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、天冬酰胺酶、葡糖氧化酶、β-半乳糖苷酶、核糖核酸酶、脲酶、过氧化氢酶、葡萄糖-6-磷 酸脱氢酶、葡糖淀粉酶和乙酰胆碱酯酶。
通过放射性标记CD20特异性抗体和/或其片段，可能通过使用放射免疫测定(RIA)检测CD20(见，例如，Work等，Laboratory Techniques and Biochemistry in Molecular Biology,North Holland Publishing Company,N.Y.(1978))。可通过例如使用γ计数器或闪烁计数器或放射自显影术等方式检测放射性同位素。对于本发明目的尤其有用的同位素为：3H、125I、131I、35S、14C，并且优选125I。
也可能用荧光化合物标记CD20特异性抗体和/或其片段。当使荧光标记抗体暴露于适当波长的光时，然后由于荧光可检测其存在。其中最常用的荧光标记化合物为异硫氰酸荧光素、若丹明、藻红蛋白、藻青蛋白、别藻蓝蛋白、邻苯二醛和荧光胺。
也可使用发荧光的金属，例如125Eu或镧系的其它金属可检测标记CD20特异性抗体或其片段。可使用例如二乙三胺五乙酸(DTPA)或乙二胺四乙酸(EDTA)等金属螯合基团使这些金属与CD20特异性抗体或其片段连接。
也可通过偶联化学发光化合物可检测标记CD20特异性抗体或其片段。然后可通过检测化学反应过程中检测发出的光的存在确定化学发光标记抗体的存在。尤其有用的化学发光标记化合物的实例为鲁米诺、异鲁米诺、恒温吖啶酯、咪唑、吖啶盐和草酸酯。同样，生物发光化合物也可用于标记本发明的CD20特异性抗体、其片段或衍生物。生物发光是一类在催化蛋白增强化学发光反应效果的生物系统中找到的化学发光。可通过检测发光的存在确定生物发光蛋白的存在。用作标记目的的重要生物发光化合物为虫荧光素、荧光素酶和水母发光蛋白。
例如如果可检测标记为放射性γ辐射体可用闪烁计数器，例如如果标记为荧光物质可用荧光计实现CD20特异性抗体、其片段或衍生物的检测。在酶标记的情况下，可通过采用酶底物的比色法实现检测。也可通过视觉比较底物酶促反应的程度与类似制备标准实现检测。
为了本发明的目的，通过以上测定检测到的CD20可存在于生物样品中。可使用含有CD20的任何样品。优选地，样品为生物流体，例如血液、血清、淋巴、尿液、炎症性渗出物、脑脊髓液、羊水、组织提取液或匀浆等。然而，本发明不限于仅使用这些样品进行测定，对于本领域中的普通技术人员而言可能确定允许使用其它样品的适合条件。
可通过从患者取组织学样本，并且向此样本提供本发明标记抗体的组合实现原位检测。优选通过将标记抗体或其片段应用或覆盖至生物样品上提供抗体或其片段。通过使用此方法，不仅可能确定检查组织中CD20的存在，而且可能确定CD20的分布。使用本发明，普通技术人员将易于认识到可修改各种组织学方法中的任一种(例如染色法)以实现这种原位检测。
可使本发明的抗体或其片段适合用于免疫测定，也称为“两位点”或“夹心”测定。在典型免疫测定中，一些未标记抗体或其片段与不溶于试验液体的固体支撑物结合，并添加一些可检测标记的可溶性抗体以允许检测和/或定量固相抗体、抗原和标记抗体之间形成的三元复合物。
典型且优选的免疫测定包括“正向”测定，其中首先使与固相结合的抗体与试验样品接触以通过形成二元固相抗体-CD20复合物从样品中提取CD20。适合孵育期后，洗涤固体支撑物以去除液体样品的残余物，包括未反应的CD20，如果有，然后与含有已知量的标记抗体(用作“报告分子”)的溶液接触。在使标记抗体与通过未标记抗体或其片段与固体支撑物结合的CD20复合的第二孵育期后，再洗涤固体支撑物一次以去除未反应的标记抗体或其片段。这类正向夹心测定可为简单的“是/否”测定以确定CD20是否存在或可通过比较标记抗体或其片段的量与从含有已知量的CD20的标准样品的量进行定量正向夹心测定。Wide(Radioimmune Assay Method,Kirkham等，Livingstone,Edinburgh,1970，第99-206页)描述了这种“两位点”或“夹心”测定。
也可用于CD20的另一类“夹心”测定为所谓的“同时”和“反向”测定。同时测定包括单一孵育步骤，其中同时将与固体支撑物结合的抗体和标记抗体两者加至试验样品中。完成孵育之后，洗涤固体支撑物以去除液体样 品和未复合的标记抗体残余物。然后如常规“正向”夹心测定中一样，确定与固体支撑物缔合的标记抗体的存在。
在“反向”测定中，利用首先向液体样品中逐步添加标记抗体溶液，然后在适合孵育期后添加与固体支撑物结合的未标记抗体。第二次孵育后，以常规方式洗涤固相以使其摆脱试验样品的残余物和未反应的标记抗体溶液。然后可如“同时”和“正向”测定中那样确定与固体支撑物缔合的标记抗体。一方面，对单独表位有特异性的本发明抗体的组合可用于构建敏感三位点免疫放射测定。
本发明的抗体或其片段也用于体内成像，其中可向受试者施用用可检测部分，例如射线透不过的试剂或放射性同位素标记的抗体或其片段，优选施用至血流中，并测定宿主中标记抗体的存在和位置。这种成像技术用于恶性肿瘤的分期和治疗。可通过核磁共振、放射学或本领域中已知的其它检测方式用在宿主体内可检测的任何部分标记抗体或其片段。
标记可为能够直接或间接生成可检测信号的任何可检测部分。例如，标记可为生物素标记、酶标记(例如，荧光素酶、碱性磷酸酶、β-半乳糖苷酶和辣根过氧化物酶)、放射性标记(例如，3H、14C、32P、35S和125I)、荧光团例如荧光或化学发光化合物(例如，异硫氰酸荧光素、若丹明)、显像剂(例如，Tc-m99和铟(111In))和金属离子(例如，镓和铕)。
可采用本领域中已知使抗体或其片段与标记偶联的任何方法，包括Hunter等，1962,Nature 144:945；David等，1974,Biochemistry 13:1014；Pain等，1981,J.Immunol.Meth.40:219；Nygren,J.,1982,Histochem.and Cytochem.30:407描述的示例性方法。
基于其在细胞中对CD20功能的抑制，本发明的抗体或其片段也可在生物研究中用作试剂。
本发明的抗体或其片段也可用作亲和纯化剂。在这个过程中，使用本领域中众所周知的方法将(例如)抗体固定在适合支撑物上，例如Sephadex树脂 或滤纸。因此，可从生物样品中分离和纯化CD20。
本发明进一步提供了包含编码本发明抗体或其片段或其表位结合片段的核苷酸序列的多核苷酸。
本发明还涵盖了编码可结合CD20的多肽并且在严格杂交条件下与编码本发明抗体或其片段的多核苷酸杂交的多核苷酸，其中所述严格杂交条件包括：在60℃下于6×SSC、0.5％SDS、5×Denhardt溶液和100μg/ml热变性鲑鱼精DNA中预杂交2h；在60℃下杂交18h；在60℃下于4×SSC、0.5％SDS、0.1％焦磷酸钠中30min洗涤2次并且在60℃下于2×SSC、0.1％SDS中30min洗涤2次。
可获得多核苷酸，并通过本领域中已知的方法确定多核苷酸的核苷酸序列。例如，使用本文所列的抗体或其片段的核苷酸序列，可由化学合成的寡核苷酸(例如，Kutmeier等，1994,BioTechniques 17:242中所述的寡核苷酸)装配编码抗体的多核苷酸，简言之包括合成含有编码抗体的序列部分的重叠寡核苷酸，退火和连接那些寡核苷酸，然后通过PCR扩增连接的寡核苷酸。
构建含有抗CD20抗体或片段编码序列及适当转录和翻译控制信号的重组载体的方法在本领域中众所周知。这些方法包括(例如)体外重组DNA技术、合成技术和体内遗传重组。因此，本发明提供了包含与启动子可操作连接，编码本发明抗体分子或其重链或轻链或重链或轻链可变结构域或其任一个的表位结合片段的核苷酸序列的可复制载体。
通过常规技术将重组载体转移至宿主细胞，然后通过常规技术培养转染细胞以生成本发明的抗体。因此，本发明包括含有编码本发明抗体或其表位结合片段，与异源启动子可操作连接的多核苷酸的宿主细胞。在优选的方面，编码重链和轻链的载体可在宿主细胞中共同表达以表达整个免疫球蛋白分子。
可利用各种宿主表达载体系统表达本发明的抗CD20抗体或其片段分子。此宿主表达系统表示可通过其生成并接着纯化目标编码序列的媒介物，但是 还表示用适当核苷酸编码序列转化或转染时，可能原位表达本发明的抗体分子的细胞。这些宿主表达系统包括但不限于微生物，例如用含有抗体编码序列的重组噬菌体DNA、质粒DNA或粘粒DNA表达载体转化的细菌(例如，大肠杆菌和枯草芽孢杆菌)；用含有抗体编码序列的重组酵母表达载体转化的酵母(例如，酵母菌和毕赤酵母)；感染了含有抗体编码序列的重组病毒表达载体(例如，杆状病毒)的昆虫细胞系统；感染了重组病毒表达载体(例如，花椰菜花叶病毒(CaMV)或烟草花叶病毒(TMV))或用含有抗体编码序列的重组质粒表达载体(例如，Ti质粒)转化的植物细胞系统；或具有含有源自哺乳动物基因组的启动子(例如，金属硫蛋白启动子)或源自哺乳动物病毒的启动子(例如，腺病毒晚期启动子；牛痘病毒7.5K启动子)的重组表达构建体的哺乳动物细胞系统(例如，COS、CHO、BHK、293、3T3细胞)。
优选地，尤其用于表达整个重组抗体分子的细菌细胞例如大肠杆菌，且更优选地，真核细胞用于表达重组抗体分子。例如，连同载体(例如来自人巨细胞病毒的主要即时早期基因启动子元件)的哺乳动物细胞(例如中国仓鼠卵巢细胞(CHO))是有效的抗体表达系统(Foecking等，1986,Gene 45:101；Cockett等，1990,Bio/Technology 8:2)。
为长期高产量产生重组蛋白，优选稳定表达。例如，可工程化稳定表达抗体分子的细胞系。可用受适当表达控制元件(例如，启动子、增强子、序列、转录终止子、聚腺苷酸化位点等)控制的DNA和选择标志转化宿主细胞，而不使用含有病毒复制起点的表达载体。引入外源DNA后，可使工程化细胞在富集培养基中生长1-2天，然后转移至选择培养基。重组质粒中的选择标志赋予了对选择的抗性并且使细胞稳定地将质粒整合至其染色体中并生长以形成可依次克隆和扩展至细胞系中的焦点。这种方法可有利地用于工程化表达抗体分子的细胞系。此类工程化细胞系尤其可用于筛选和评价与抗体分子直接或间接相互作用的化合物。
一旦本发明的抗体分子重组表达，就可通过本领域中已知的任何免疫球蛋白分子纯化方法，例如通过色谱法(例如，离子交换、亲和力，尤其是通过对蛋白质A后特异性抗原的亲和力及尺寸柱色谱)、离心、溶解性差异，或通 过蛋白质纯化的任何其它标准技术纯化抗体分子。关于这一点，本公开中参考了美国专利No.7,538,195，其教导通过引用特此整体并入。
另一方面，使用本文公开或本领域已知的方法可易于通过在特定CDR组两侧的可变区和恒定区序列中的突变、缺失和/或插入生成不同抗体和抗体片段以及抗体模拟物。因此，例如，对于指定CDR组而言通过取代不同重链可能生成不同类别的Ab，由此例如，可生成IgG1-4、IgM、IgA1-2、IgD、IgE抗体类型和同种型。类似地，可通过将指定CDR组嵌入整个合成框架中生成本发明范围内的人工抗体。本文使用术语“可变”描述抗体中序列不同的可变结构域的某些部分并且在每种特定抗体对其抗原的结合和特异性中使用。然而，可变性通常不是平均分布于抗体的可变结构域。可变性通常集中在轻链和重链可变结构域中3个称为互补决定区(CDR)或高变区的区段中。可变结构域的更加高度保守部分称为框架(FR)。重链和轻链的可变结构域各自包含4个框架区，主要采用β-折叠构型，通过3个CDR连接，形成环连接，并且在一些情况下形成β-折叠结构的一部分。通过FR区使每条链上的CDR与来自另一条链的CDR紧紧靠在一起，有助于形成抗体的抗原结合位点(见，例如，E.A.Kabat等Sequences of Proteins of Immunological Interest，第5版，1991,NIH)。恒定结构域未直接参与结合抗体与抗原，但展现出各种效应子功能，例如抗体参与抗体依赖的细胞毒性。
可使用若干技术，例如表面重塑和CDR移植生成人源化抗体或适合于不受其它哺乳动物排斥的抗体。在表面重塑技术中，结合分子模拟、统计分析和诱变以将可变区的非CDR表面调节为类似于靶宿主已知抗体的表面。例如，通过引用特此整体并入的美国专利5,639,641中公开了抗体表面重塑的策略和方法和降低抗体在不同宿主中的免疫原性的其它方法。在CDR移植技术中，将鼠重链和轻链CDR移植至全人框架序列中。
本发明还包括该说明书中所述抗体的功能等效物。功能等效物具有与抗体相当的结合特征，并且包括(例如)嵌合、人源化和单链抗体及其片段。通过引用分别整体并入的PCT申请WO 93/21319、欧洲专利申请No.239,400、PCT申请WO 89/09622、欧洲专利申请338,745和欧洲专利申请EP 332,424中公 开了生成这种功能等效物的方法。
功能等效物包括具有与本发明抗体的可变区或高变区氨基酸序列大体上相同的氨基酸序列的多肽。本文将应用于氨基酸序列的“大体上相同”定义为通过根据Pearson和Lipman,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85,2444-2448(1988)的FASTA搜索方法确定，与另一氨基酸序列具有至少约90％，且更优选具有至少约95％序列同一性的序列。
嵌合抗体优选具有大体上或全部源自人抗体恒定区的恒定区和大体上或全部源自来自除人以外的哺乳动物的可变区序列的可变区。可通过将(例如)小鼠抗体的互补决定区取代为人框架结构域制备人源化形式的抗体，例如PCT公布No.W092/22653。人源化抗体优选具有恒定区和可变区而非大体上或全部源自相应人抗体区的互补决定区(CDR)和大体上或全部源自除人以外的哺乳动物的CDR。
功能等效物还包括单链抗体片段，也称为单链抗体(scFv)。这些片段含有用或不用一个或多个互连连接子与抗体可变轻链序列(VL)的至少一个片段连接的抗体可变重链氨基酸序列(VH)的至少一个片段。这种连接子可能是选择的短挠性肽以确保一旦(VL)和(VH)结构域连接就发生适当三维折叠，以保持从中获得单链抗体片段的全抗体的靶分子结合特异性。通常，(VL)或(VH)序列的羧基末端可通过肽连接子与互补(VL)和(VH)序列的氨基末端共价连接。可通过分子克隆、抗体噬菌体展示库或相似技术生成单链抗体片段。这些蛋白质可在真核细胞或原核细胞(包括细菌)中生成。
单链抗体片段含有具有本说明书所述完整抗体的至少一个可变或互补决定区(CDR)的氨基酸序列，但缺乏那些抗体的一些或所有恒定结构域。这些恒定结构域对于抗原结合并非必须，但是构成了完整抗体结构的主要部分。因此单链抗体片段可克服与使用含有部分或整个恒定结构域的抗体相关的一些问题。例如，单链抗体片段倾向于无生物分子和重链恒定区之间的有害相互作用，或其它不良生物活性。另外，单链抗体片段比完整或全抗体小很多并且可能因此具有比完整抗体更强的毛细管渗透性，使得单链抗体片段更有效地定位于靶抗原结合位点并与之结合。同样，可在原核细胞中相对大规模 地生成抗体片段，从而促进其生成。而且，单链抗体片段的相对较小尺寸使其比完整抗体更不可能在受体中引起免疫反应。
本文描述的抗CD20抗体及其人源化变异体的氨基酸和核酸序列的知识可用于研发许多也与人CD20结合的抗体。基于一级抗体序列的知识，若干研究已调查了在抗体序列的各个位置引入一个或多个氨基酸变化对抗体的性质，例如结合和表达水平的影响(Yang,W.P.等，1995,J.Mol.Biol.,254,392-403；Rader,C.等，1998,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,95,8910-8915；Vaughan,T.J.等，1998,Nature Biotechnology,16,535-539)。
在这些研究中，已通过使用例如寡核苷酸介导的定点诱变、盒式诱变、易错PCR、DNA改组或大肠杆菌的增变菌株等方法改变CDR1、CDR2、CDR3或框架区中的重链和轻链基因序列生成一级抗体的变异体(Vaughan,T.J.等，1998,Nature Biotechnology,16,535-539；Adey,N.B.等，1996，第16章，第277-291页，于"Phage Display of Peptides and Proteins",Eds.Kay,B.K.等，Academic Press)。这些改变一级抗体序列的方法已引起二级抗体的亲和力增强(例如，Gram,H.等，1992,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,89,3576-3580；Boder,E.T.等，2000,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,97,10701-10705；Davies,J.和Riechmann,L.,1996,Immunotechnolgy,2,169-179；Thompson,J.等，1996,J.Mol.Biol.,256,77-88；Short,M.K.等，2002,J.Biol.Chem.,277,16365-16370；Furukawa,K.等，2001,J.Biol.Chem.,276,27622-27628)。
通过改变抗体一个或多个氨基酸残基的类似定向策略，可将本发明中所述的抗体序列用于研发具有更强功能的抗CD20抗体，例如专利申请公布20090246195中所述的方法，其内容通过引用整体并入本文。
可采用本领域中已知偶联抗体至可检测部分的任何方法，包括Hunter等，Nature 144:945(1962)；David等，Biochemistry 13:1014(1974)；Pain等，J.Immunol.Meth.40:219(1981)；和Nygren,J.Histochem.and Cytochem.30:407(1982)描述的方法。
在任何已知测定方法中均可采用本发明的抗体，例如竞争性结合测定、 直接和间接夹心测定和免疫沉淀测定(Zola，Monoclonal Antibodies:A Manual of Techniques,pp.147-158(CRC Press,Inc.,1987))。
本发明的抗体也用于体内成像，其中可向受试者施用用可检测部分，例如射线透不过的试剂或放射性同位素标记的抗体，优选施用至血流中，并测定宿主中标记抗体的存在和位置。这种成像技术用于恶性肿瘤的分期和治疗。可通过核磁共振、放射学或本领域中已知的其它检测方式用在宿主体内可检测的任何部分标记抗体。
本发明的抗体也可用作亲和纯化剂。在这个过程中，使用本领域中众所周知的方法将抗体固定在适合支撑物上，例如Sephadex树脂或滤纸。
治疗应用
本发明还包括抑制表达CD20的细胞生长的方法。这些方法利用本发明的抗体或片段或偶联物，以及本发明的抗体或片段或免疫偶联物，连同一种或多种另外的治疗剂。适合治疗剂包括直接或间接抑制表达CD20的细胞的生长的治疗剂。
如本文所使用的术语“抑制”应理解为包括对细胞生长(包括细胞死亡)的抑制作用。抑制作用包括暂时作用、持续作用和永久作用。
本发明的治疗应用包括治疗患有疾病的受试者的方法。用本发明的方法治疗的疾病为特征在于CD20表达的疾病。此类疾病包括B细胞源性恶性肿瘤，例如非霍奇金淋巴瘤、B细胞慢性淋巴细胞性白血病和B细胞急性淋巴细胞性白血病，以及非恶性自身免疫性或炎症性疾病，包括RA，其中CD20阳性B细胞在疾病病病理生理学中起作用。技术人员将理解本发明的方法也可用于治疗尚待描述，但特征在于CD20表达的其它疾病。
也可在体外和离体实践本发明的治疗应用。
体外使用的实例包括纯化被CD20阳性细胞，例如B细胞系的细胞污染的细胞群。所述方法包括在细胞毒性huCD20-7偶联物存在下培养细胞群， 然后去除死亡CD20阳性细胞。非临床体外使用的条件众所周知(见，例如，Uckun等，1986,J Exp.Med.163,347-368；Uckun等，1985,J.Immunol.134,3504-3515；Ramakrishnan等，1985,J.Immunol.135,3616-3622)。
与固体支撑物连接的本发明抗体、片段和区域、片段或衍生物也可用于从液体或组织或细胞提取物中去除CD20。在优选的方面，它们用于从血液或血浆产品中去除CD20。在另一优选方面，鼠和嵌合抗体、片段和区域有利地用于本领域中已知的体外免疫吸附装置(见，例如，Seminars in Hematology,26(2Suppl.1)(1989))。可使患者血液或其它体液暴露于连接抗体，引起循环CD20(游离或呈免疫复合物)部分或完全去除，之后使液体回到体内。可按连续流排列实现这种免疫吸附，需要或无需插入细胞离心步骤。见，例如，Terman等，J.Immunol.117:1971-1975(1976)。
本发明还包括本发明抗体或偶联物的治疗应用，其中可按药学上可接受的剂型向受试者施用抗体或偶联物。可通过静脉内推注，或通过持续输注一段时间，或通过肌肉内、皮下、关节内、滑膜内、鞘内、口腔、局部或吸入途径施用抗体或偶联物。也可通过瘤内、瘤周、病灶内或病灶周途径施用抗体或偶联物，以发挥局部以及全身性治疗效果。
药物制剂
对于治疗应用，按药学上可接受的剂型向受试者施用本发明的抗体或偶联物。可通过静脉内推注，或通过持续输注一段时间，或通过肌肉内、皮下、关节内、滑膜内、鞘内、口腔、局部或吸入途径施用抗体或偶联物。也可通过瘤内、瘤周、病灶内或病灶周途径施用抗体或偶联物，以发挥局部以及全身性治疗效果。适合的药学上可接受的载体、稀释剂和赋形剂众所周知并且可由本领域中的技术人员确定为临床情况许可。适合载体、稀释剂和/或赋形剂的实例包括：(1)pH约7.4，含有约1mg/ml-25mg/ml人血清白蛋白的杜尔贝科磷酸盐缓冲盐水，(2)0.9％盐水(0.9％w/v NaCl)，(3)5％(w/v)右旋糖和(4)pH5.8的10mM组氨酸硫酸盐、6％蔗糖、0.02％聚山梨醇酯20。
当以含水剂型存在，而非冻干时，通常将按约0.1mg/ml-100mg/ml的浓 度配制抗体或偶联物，虽然允许这些范围之外的广泛变化。为了治疗疾病，抗体或片段或偶联物的适当剂量将取决于如以上定义的待治疗疾病的类型，疾病的严重程度和过程，是否施用抗体或偶联物作预防或治疗用途，先前疗法的过程，患者的临床史和对治疗的反应和主治医师的判断。抗体或片段或偶联物适合同时或在一系列治疗期间向患者施用。
根据疾病的类型和严重程度，约0.015-25mg抗体或偶联物/kg患者体重为(例如)通过一次或多次单独施用或通过连续输注向患者施用的初始候选剂量。为了重复施用几天或更长时间，根据病状，重复治疗直至出现疾病症状的预期抑制。然而，其它剂量方案可能有用并未排除在外。
对于肺部施用，优选地按到达肺部下呼吸道或窦处有效的颗粒尺寸递送至少一种抗CD20抗体或抗体片段或偶联组合物。根据本发明，可通过本领域中已知用于通过吸入施用治疗剂的各种吸入或鼻装置的任一种递送至少一种抗CD20抗体或片段或偶联物。这些能够将雾化制剂置于患者窦腔或肺泡内的装置包括定量吸入器、雾化器、干粉发生器、喷雾器等。适于针对肺部或鼻施用抗体的其它装置在本领域中也已知。所有此类装置均可使用适合施用以使抗体分配于气雾剂中的制剂。此类气雾剂可由溶液(含水和不含水)或固体颗粒组成。定量吸入器，如VentolinTM定量吸入器，通常使用推进气体并且在吸气期间需要刺激(见，例如，WO 94/16970、WO 98/35888)。干粉吸入器，如TurbuhalerTM(Astra)、RotahalerTM(Glaxo)、DiskusTM(Glaxo)、SpirosTM吸入器(Dura)、Inhale Therapeutics在市场上销售的装置和SpinhalerTM干粉吸入器(Fisons)，利用混合粉末的呼吸刺激(美国专利No.4,668,218Astra、EP237507Astra、WO 97/25086Glaxo、WO 94/08552Dura，美国专利No.5,458,135Inhale、WO 94/06498Fisons，通过引用整体并入本文)。雾化器，如AERxTM Aradigin，UltraventTM雾化器(Mallinckrodt)和Acorn IITM雾化器(Marquest Medical Products)(美国专利No.5,404,871Aradigm、WO 97/22376)由溶液产生气雾剂，以上参考通过引用整体并入本文，而定量吸入器、干粉吸入器等产生小颗粒气雾剂。市售的吸入装置的这些特定实例确定为适于本发明实践的特定装置的代表，并不旨在限制本发明的范围。优选地，通过干粉吸入器或喷雾器递送包含至少一种抗CD20抗体或片段或偶联物的组合物。施用本 发明至少一种抗体的吸入装置有若干所需特征。例如，有利的是，通过吸入装置递送可靠、可再生并且精确。为了能呼吸良好，吸入装置可任选递送例如小于约10μm，优选约1-5μm的小干燥颗粒。
为了通过粘膜表面吸收，施用至少一种抗CD20抗体或片段或偶联物的组合物和方法包括包含若干亚微型颗粒、粘膜粘性大分子、生物活性肽和水连续相的乳剂，其通过实现乳剂颗粒的粘膜粘附促进通过粘膜表面吸收(美国专利No.5,514,670)。适合应用本发明乳剂的粘膜表面可包括角膜、结膜、颊部、舌下、鼻、阴道、肺部、胃部、肠和直肠施用途径。阴道或直肠施用的制剂，例如栓剂，可含有作为赋形剂的(例如)聚亚烷基二醇、凡士林、可可油等。鼻内施用的制剂可为固体并且包含作为赋形剂的(例如)乳糖或可为滴鼻剂的含水或油性溶液。对于颊部施用，赋形剂包括糖、硬脂酸钙、硬脂酸镁、预胶化淀粉等(美国专利No.5,849,695)。
对于经皮施用，将所述至少一种抗CD20抗体或偶联物装入递送装置，例如脂质体或聚合纳米颗粒、微粒、微胶囊或微球(除非另有规定，共同称为微粒)。已知许多适合装置，包括由合成聚合物例如多羟基酸(例如聚乳酸、聚乙醇酸及其共聚物)、聚原酸酯、聚酸酐和聚磷腈，和天然聚合物例如胶原、聚氨基酸、白蛋白和其它蛋白质、藻酸盐和其它多糖及其组合制成的微粒(美国专利No.5,814,599)。
本文引用的所有出版物或专利通过引用整体并入本文并且是本领域状况的证据。出版物指任何科学或专利出版物，或呈任何媒体格式的任何其它可用信息，包括所有记录、电子或印刷格式。以下参考通过引用整体并入本文：Ausubel等编，Current Protocols in Molecular Biology,John Wiley&Sons,Inc.,NY,N.Y.(1987-2001)；Sambrook等，Molecular Cloning:A Laboratory Manual，第2增补版，Cold Spring Harbor,N.Y.(1989)；Harlow和Lane，antibodies,a Laboratory Manual,Cold Spring Harbor,N.Y.(1989)；Colligan等编，Current Protocols in Immunology,John Wiley&Sons,Inc.,N.Y.(1994-2001)；Colligan等，Current Protocols in Protein Science,John Wiley&Sons,NY,N.Y.,(1997-2001)；尤其并入关于制备如本文所述的抗CD20抗体、片段、偶联物、 试剂、组合物等的内容中。对于本领域中的技术人员显而易见的是，在不脱离其精神和范围的情况下，对抗体及其片段的各种引用也意在指(例如)偶联物。现已广泛描述了本发明，参考包括在本文内，除非另外指出仅作说明用而非旨在限制的某些特定实施例将进一步理解本发明。
实施例
细胞系和生长
除非另外指出，在37℃使细胞系于加湿的5％CO2孵育箱中在适当培养基中生长，例如补充了10％胎牛血清、2mM谷氨酰胺和1％青霉素-链霉素的RPMI-1640培养基(所有试剂均来自Invitrogen)。通过每周稀释两次至新鲜培养基使细胞传代并保持在0.2-1×106个细胞/ml。
实施例1
鼠CD20抗体的生成
构建表达质粒pSRa-CD20以容纳两侧为XbaI和BamHI限制性位点，使人CD20(GI 23110989)表达的整个CD20编码序列(CDS)。用该表达质粒转染300-19细胞，源自Balb/c小鼠的前B细胞系(Reth等，Nature,317:353-355(1985))以在细胞表面稳定表达高水平的人CD20并用于Balb/c VAF小鼠的免疫。每2-3周，每只小鼠用约5x106个CD20表达300-19细胞，通过本领域中技术人员已知的标准免疫方法，例如ImmunoGen,Inc.使用的方法使小鼠经皮下免疫。处死前3天用抗原加强免疫小鼠以便杂交瘤生成。根据标准动物方法收集小鼠的脾脏，例如在两片无菌、磨砂显微载玻片之间研磨组织以获得于RPMI-1640培养基中的单细胞悬浮液。离心、团块化、洗涤脾脏细胞并使用聚乙二醇-1500(Roche 783641)使其与鼠骨髓瘤，例如P3X63Ag8.653细胞(Kearney等，J.Immunol.,123:1548-1550(1979))融合。使融合细胞再次悬浮于含有次黄嘌呤-氨基蝶呤-胸苷(HAT)(Sigma H-0262)的RPMI-1640选择培养基中并在37℃和5％CO2下在96孔平底培养板(Corning-Costar 3596，200μL细胞悬浮液/孔)上选择生长。孵育5天后，从每个孔去除100μL培养上清液并更换100μL含有次黄嘌呤-胸苷(HT)补充物(Sigma H-0137)的RPMI-1640培养基。继续在37℃和5％CO2下孵育直至杂交瘤克隆准备好进行抗体筛选。也可使用其它免疫和杂交瘤生成技术，包括Langone等，(Eds.,“Immunochemical Techniques,Part I”,Methods in Enzymology,Academic Press,volume 121,Florida)和Harlow等(“Antibodies:A Laboratory Manual”；Cold Spring Harbor Laboratory Press,New York(1988))中描述的技术。
杂交瘤筛选和选择
用流式细胞仪筛选来自杂交瘤的培养上清液是否分泌有结合CD20表达细胞，例如CD20表达300-19细胞，但不结合非转染300-19细胞的小鼠单克隆抗体。在100μL FACS缓冲液(补充了2％正常山羊血清的RPMI-1640培养基)中用CD20表达300-19细胞或非转染300-19细胞孵育100μl杂交瘤上清液3h。然后，离心、团块化、洗涤细胞，并且用100μL PE-偶联的山羊抗小鼠IgG抗体(例如从Jackson Laboratory获得的抗体，6μg/mL于FACS缓冲液中)孵育细胞1h。再次离心、团块化细胞，并用FACS缓冲液洗涤并且再次悬浮于200μL含有1％甲醛的PBS中。使用带有HTS多孔采样器的FACSCalibur流式细胞仪或FACS阵列流式细胞仪获得细胞并使用CellQuest Pro(全部来自BD Biosciences,San Diego,US)分析。
通过有限稀释亚克隆阳性杂交瘤克隆。用流式细胞仪从每个杂交瘤选择一个显示出与亲本细胞相同的抗CD20反应性的亚克隆进行后续分析。培养稳定的亚克隆并使用商用同型化试剂(Roche 1493027)鉴定分泌的每种抗CD20抗体的同种型。
抗体纯化
使用标准方法，例如蛋白质A或G色谱法(HiTrap蛋白质A或G HP，1mL,Amersham Biosciences)从杂交瘤亚克隆上清液纯化抗体。简言之，通过添加1/10体积的pH 8.0的1M Tris/HCl缓冲液制备上清液进行色谱法。通过0.22μm滤过膜过滤调节了pH的上清液并载至用结合缓冲液(PBS，pH 7.3)平衡的柱上。用结合缓冲液洗涤柱直至获得在280nm无吸光度的稳定基线。用含有0.15M NaCl、pH 2.8的0.1M醋酸缓冲液洗脱抗体，使用0.5mL/min的流量。收集约0.25mL的成分并添加1/10体积的pH 8.0的1M Tris/HCl中和。用1×PBS透析峰值成分两次过夜并通过0.2μm滤过膜过滤灭菌。按A280下的吸光度量化纯化抗体。
使用离子交换色谱法(IEX)，对于鼠抗体而言使用季铵盐(Q)色谱法进一步精制蛋白质A纯化成分。简言之，使来自蛋白质A纯化的样品缓冲液交换 为结合缓冲液(10mM Tris、10mM氯化钠，pH 8.0)并通过0.22μm过滤器过滤。然后将制备的样品载至用120cm/h流速的结合缓冲液平衡的Q快速流树脂(GE Lifesciences)上。选择柱尺寸以具有结合样品中所有MAb的足够能力。然后用结合缓冲液洗涤柱直至获得在280nm无吸光度的稳定基线。在20柱体积(CV)下从10mM至500mM氯化钠梯度开始洗脱抗体。基于280nm(A280)下的吸光度测量收集峰值成分。使用Agilent HPLC 1100系统(Agilent,Santa Clara,CA)，用6.0×40mm的SWXL保护柱(Tosoh Bioscience,Montgomeryville,PA)，在7.8×300mm的TSK凝胶G3000SWXL柱上进行尺寸排阻色谱法(SEC)评估单体的百分比。汇聚单体含量高于95％的成分，使用TFF系统使缓冲液交换为PBS(pH 7.4)，并通过0.2μm滤过膜过滤灭菌。使用1.47的消光系数由A280确定纯化抗体的IgG浓度。替代性方法，例如陶瓷羟磷灰石(CHT)也可用于精制具有良好选择性的抗体。用如IEX色谱法所述的相似方法使用颗粒尺寸为40μm的II型CHT树脂(Bio-Rad Laboratories)。CHT的结合缓冲液与pH 7.0的20mM磷酸钠相对应，并且在20CV上用20-160mM磷酸钠梯度洗脱抗体。
实施例2
用流式细胞仪进行结合表征
使用纯化抗体用流式细胞仪测试结合特异性。图1中示出了证明muCD20-7和muCD20-6与CD20表达300-19细胞结合并且没有与亲本300-19细胞结合的FACS直方图。于100μL FACS缓冲液(补充了2％正常山羊血清的RPMI-1640培养基)中用CD20表达300-19细胞或非转染300-19细胞(1×105个细胞/样品)孵育muCD20-7或muCD20-6抗体3h。然后，团块化、洗涤细胞并且用100μL FITC偶联的山羊抗小鼠IgG抗体(例如从Jackson Laboratory获得的抗体，6μg/mL于FACS缓冲液中)孵育细胞1h。使细胞再次团块化，用FACS缓冲液洗涤并再次悬浮于200μL含有1％甲醛的PBS中。使用带有HTS多孔采样器的FACSCalibur流式细胞仪或FACS阵列流式细胞仪获得样品并使用CellQuest Pro(全部来自BD Biosciences,San Diego,US)分析。
用muCD20-7或muCD20-6孵育的CD20表达300-19细胞的FACS直方 图显示出荧光位移，而亲本300-19细胞未显示出荧光位移(图1)。同样，当仅单独用FITC偶联的山羊抗小鼠IgG抗体孵育细胞系时未检测到明显的荧光位移(图1底部)。
当用muCD20-7或muCD20-6孵育BJAB淋巴瘤细胞时也观察到荧光位移(图2)。用不同浓度的muCD20-7或muCD20-6抗体孵育BJAB细胞并且如以上流式细胞仪分析处理所述BJAB细胞。使用CellQuest Pro(BD Biosciences,San Diego,US)进行数据分析，并且为每个样品输出FL1的平均荧光强度(MFI)并按抗体浓度绘制半对数图。通过非线性回归生成剂量反应曲线并且使用GraphPad Prism v4(GraphPad software,San Diego,CA)计算muCD20-7或muCD20-6与BJAB细胞结合的表观解离常数(Kd)的值并且分别对应0.3nM或0.4nM。
实施例3
鼠抗CD20抗体的促凋亡活性
抗CD20抗体muCD20-2、muCD20-6和muCD20-7诱导淋巴瘤细胞系的细胞凋亡。在用Annexin-V(Invitrogen)的FITC偶联物和-3(Invitrogen)染色后通过流式细胞仪分析测量细胞凋亡的程度。在健康正常细胞中，磷脂酰丝氨酸在双层膜的内侧，并且从质膜内叶至外叶的磷脂酰丝氨酸过渡是细胞凋亡的最早可检测信号。Annexin V结合完整细胞的双层细胞膜外侧而非内侧的磷脂酰丝氨酸。因此Annexin V结合的程度是对诱导细胞凋亡的指示。 是在细胞凋亡后期发生膜完整性破坏时唯一可穿透质膜的单体花菁核酸染料。在两色流式细胞仪中可区别3个细胞群：非凋亡细胞(Annexin-V阴性和阴性)、早期凋亡细胞(Annexin-V阳性和 阴性)和坏死细胞或后期凋亡细胞(Annexin-V阳性和阳性)。
按约2×105个细胞/mL将指数生长细胞接种于补充了10％胎牛血清(FBS)、2mM L谷氨酰胺和50μg/mL庆大霉素的RMPI-1640培养基(以下表示为完全RMPI-1640培养基)中的24孔板上。除非另外规定，通常使细胞在完 全RMPI-1640培养基中生长。在37℃下于加湿5％CO2孵育箱中用10nM抗CD20抗体孵育细胞20-24h。然后团块化细胞，用500μl PBS洗涤两次，使细胞再次悬浮于100μL结合缓冲液中(10mM Hepes-NaOH，pH 7.4，140mM NaCl、2.5mM CaCl2)并于冰上用5μL Annexin V-FITC染色15min。然后，向混合物中加入400μL结合缓冲液和1μM的并立即用流式细胞仪测量FITC和的细胞相关荧光性。为每个样品收集5000个结果。使用BD CellQuest软件生成荧光性(FL4-H；y-轴)和Annexin V-FITC荧光性(FL1-H；x-轴)的点阵图。
由这些点为每个样品确定Annexin-V阳性细胞(包括阳性和阴性细胞)的百分比并示于图3中。测试从我们的抗体筛选分离的若干抗体与利妥昔单抗相比的促凋亡活性。出人意料地，muCD20-2、muCD20-6和muCD20-7显示出很强的促凋亡活性。与仅约5％未处理细胞相比，超过70％暴露于muCD20-6、muCD20-7或muCD20-2的Ramos细胞为Annexin-V阳性。用抗CD20抗体利妥昔单抗处理仅产生13％的Annexin-V阳性细胞。类似地，用抗体muCD20-5处理产生12％的Annexin-V阳性细胞。
同样，与5％未处理细胞相比，超过60％用muCD20-7或muCD20-2处理的Raji细胞为Annexin-V阳性细胞。这种未预料到的活性甚至比先前分离的II型抗体B1的活性更强，这产生42％Annexin-V阳性细胞。用利妥昔单抗孵育产生14％Annexin-V阳性细胞。与未处理细胞相比，muCD20-5抗体并未诱导更高比例的Annexin-V阳性细胞。
实施例4
脂筏
已经使抗体结合后CD20重整至脂筏内与抗体有效募集补体因子和引起CDC活性的能力相关。我们采用由上文Cragg等(2003)修改的基于流式细胞仪的方法来测量抗体诱导CD20重新分布于脂筏。该测定法的原理是基于低温下脂筏区室的TritonX-100不溶性。
离心收获细胞，洗涤并使细胞再次悬浮于具有1％BSA的RPMI-1640中。每次测定使用0.2mL细胞，2.5×106个细胞，一式两份。加入10μg/mL的抗CD20抗体并且在37℃下孵育样品15min。离心样品，洗涤两次并再次悬浮于0.2mL FACS缓冲液(1xPBS、1％BSA、20mM叠氮化钠)中。于冰上冷激样品并从此刻起保持冷却。为检测响应于抗体处理与脂筏缔合的抗原分数，于冰上用0.5％TritonX-100孵育样品15min。为检测结合抗体的总量，使样品留在冰上保持原样15min。于FACS缓冲液中洗涤样品两次并且在冰上用稀释至1:200的FITC偶联山羊抗小鼠-Ab染色1h。离心样品，用FACS缓冲液洗涤两次并使细胞再次悬浮于200μL PBS、1％甲醛中以固定。用流式细胞仪获得样品以确定抗CD20抗体结合作为FL-1平均值。图4中绘制了在TritonX-100孵育不存在(未处理)或存在(Triton处理)下每种样品的平均荧光强度(MFI)。
我们使用利妥昔单抗作为对照，利妥昔单抗是先前已经证实有效地将CD20转移至TritonX-100不溶脂筏的I型抗体的实例。正如所料，利妥昔单抗处理的细胞用和不用TritonX-100处理显示出相同荧光水平。相反，用muCD20-2染色的细胞用TritonX-100处理MFI比不用TritonX-100处理低很多。这与muCD20-2不能使CD20重新分布于脂筏一致，这是先前所述II型CD20抗体的典型特征。引人注目地，用muCD20-7染色的细胞用或不用TritonX-100处理MFI相似。另外，我们还测试了muCD20-5和muCD20-6抗体的脂筏活性。正如对muCD20-7所见，用muCD20-5或muCD20-6染色的细胞用或不用TritonX-100处理MFI相似。该数据显示，与利妥昔单抗一样，muCD20-5、muCD20-6和muCD20-7可有效地将CD20转移至淋巴瘤细胞膜的脂筏区室内。综合考虑Annexin-V测定的结果，这证明muCD20-2具有II型抗体的特征。muCD20-2可强有力地诱导细胞凋亡，而不能使CD20重新分布于脂筏内。相反，muCD20-5具有I型抗体的特征。muCD20-5可使CD20重新分布于脂筏内，而不具有促凋亡活性。
这个惊人的结果证明muCD20-6和muCD20-7具有独特和意外的功能性质组合：muCD20-6和muCD20-7均具有I型抗体的脂筏活性和通常对II型抗体所见的强促凋亡活性。
实施例5
CD20-7和CD20-6抗体VL和VH区的克隆和测序
使用RNeasy试剂盒(QIAgen)根据生产商的方法由CD20-7和CD20-6杂交瘤的5×106个细胞制备细胞总RNA。接着使用SuperScript II cDNA合成试剂盒(Invitrogen)由总RNA合成cDNA。
源自杂交瘤细胞的cDNA的第一轮简并PCR反应步骤是基于Wang等((2000)J Immunol Methods.1月13日；233(1-2):167-77)和Co等((1992)J Immunol.2月15日；148(4):1149-54)所述的方法。通过使用以下简并引物进行PCR扩增VH序列：EcoMH1 CTTCCGGAATTCSARGTNMAGCTGSAGSAGTC(SEQ ID NO:37)、EcoMH2 CTTCCGGAATTCSARGTNMAGCTGSAGSAGTCWGG(SEQ ID NO:48)和BamIgG1 GGAGGATCCATAGACAGATGGGGGTGTCGTTTTGGC(SEQ ID NO:38)。通过使用以下简并引物进行PCR扩增VL序列：SacIMK GGAGCTCGAYATTGTGMTSACMCARWCTMCA(SEQ ID NO:39)和HindKL TATAGAGCTCAAGCTTGGATGGTGGGAAGATGGATACAGTTGGTGC(SEQ ID NO:40)。(混合碱基定义如下：N＝G+A+T+C，S＝G+C，Y＝C+T，M＝A+C，R＝A+G，W＝A+T)。
然后使PCR反应混合物在1％低熔点琼脂糖凝胶上进行电泳，切除300-400bp条带，使用Zymo DNA微型柱纯化，并送至Agencourt Biosciences进行测序。各个5’和3’PCR引物用作测序引物以从两个方向生成可变区cDNA。由DNA测序结果推断VH和VL区的氨基酸序列。
使用初步cDNA序列从NCBI IgBlast站点(www.ncbi.nlm.nih.gov/igblast/)搜索从中获得抗体序列的鼠种系序列。然后设计PCR引物使与鼠抗体的种系连接前导序列退火，以致这种新PCR反应将产生不受PCR引物改变的完整可变区cDNA序列。另外，如以上Co等所述进行RACE PCR方法以对CD20-7重链的全长可变区序列测序。如以上所述进行PCR反应、条带纯化和测序。
确定质量以确认序列
结合可变区的cDNA序列信息和种系恒定区序列以获得全长抗体cDNA序列。然后计算重链和轻链的分子量并且与通过鼠CD20-7和CD20-6抗体的LC/MS分析获得的分子量进行比较。分子量测量与CD20-7和CD20-6轻链和重链的cDNA序列一致。
嵌合
将轻链可变区的可变序列克隆至pchCD20-7LCZ质粒中的EcoRI和BsiWI位点。将重链可变区克隆至pchCD20-7HCN质粒中的HindIII和Apa1位点。为chCD20-2、chCD20-9构建等效质粒。使用标准磷酸钙方法(BD Biosciences,CalPhos Mammalian Transfection Kit,Cat#631312)，使用这些质粒在HEK-293T细胞中表达嵌合抗体。使用如以上所述的标准蛋白质A色谱法纯化上清液，但使用羧甲基(CM)快速流离子交换(IEX)树脂(GE Lifesciences)和10mM磷酸氢二钾、10mM氯化钠结合缓冲液(pH 7.5)或以上所述的替代性CHT方法进行精制色谱步骤。
实施例6
嵌合CD20-7的促凋亡活性
通过使用以上实施例中对鼠抗体所述的Annexin-V-FITC和染色测量嵌合抗体诱导Ramos细胞的细胞凋亡的能力。用Ramos细胞孵育每种嵌合抗体(10nM)20h，接着进行Annexin-V染色和流式细胞仪分析，并将结果呈现于图5中。与未处理样品中仅11％Annexin-V阳性细胞相比，chCD20-7处理产生59％Annexin-V阳性细胞。chCD20-2处理诱导43％Annexin-V阳性细胞，而利妥昔单抗处理产生与未处理细胞相似水平的Annexin-V染色。因此，嵌合后CD20-7保持了其诱导Ramos细胞强细胞凋亡的惊人能力。
嵌合CD20-7的CDC活性
为评估嵌合抗CD20抗体的补体依赖的细胞毒性(CDC)活性，根据公开方 法(Gazzano-Santoro,J.Immunol.Methods,202(2):163-171)1997))进行基于细胞的测定。按50μL/孔将抗体等分至平底96孔组织培养板中，一式两份，于RHBP(RPMI-1640、20mM HEPES、0.1％BSA、1％青霉素-链霉素)培养基中各种浓度范围通常为5μg/mL(＝3.3×10-8M)至2.3ng/mL(＝1.5×10-11M)。按于100μL RHBP培养基中5×104个细胞/孔将靶细胞加入抗体中。用每小瓶1mL灭菌纯净水使冻干人补体复原并且在使用之前立即用RHBP培养基稀释5倍为20％储液。向每个孔加入50μL/孔的补体溶液，最终浓度为5％。在37℃下于5％CO2加湿孵育箱中孵育板2h以允许补体介导的溶解。该孵育时间后，向每个孔加入Alamar Blue试剂(Invitrogen)，最终浓度为10％，以测量剩余细胞的活力。在EX540/EM590nm下测量荧光(相对荧光单位，RFU)之前在37℃下孵育板16-20h。对照包括三个具有培养基和补体但没有细胞的孔(仅有培养基，0％活力)和具有细胞和补体但没有抗体的孔(仅有细胞，100％活力)。按以下公式确定每个样品特定细胞活力的百分比：活力百分比＝(样品-仅有培养基)/(仅有细胞-仅有培养基)。
惊人地，如图6所示，chCD20-7抗体对Daudi和WSU-DLCL-2淋巴瘤细胞具有与利妥昔单抗相似的CDC活性。在两种细胞系中chCD20-7使细胞活力完全降低，对Daudi细胞的EC50为1.0nM并且对WSU-DLCL-2细胞的EC50为2.2nM。利妥昔单抗具有CDC活性，对Daudi细胞的EC50为1.1nM并且对WSU-DLCL-2细胞的EC50为2.8nM。正如对典型II型抗体所预料，chCD20-2对Daudi或WSU-DLCL-2细胞无CDC活性。
实施例7
抗体人源化
按先前所述，例如通过引用整体并入本文的Roguska等，Proc.Natl.Acad.Sci.,USA,91(3):969-973(1994)和Roguska等，Protein Eng.9(10):895-904(1996)中所述的表面重塑方法人源化CD20-7抗体。表面重塑通常包括鉴定轻链和重链中的可变区表面残基并用人等效物置换。示例性CDR定义如表1中所示。
表1
表1中通过举例给出了如表面重塑定义的CD20-7轻链和重链CDR。还给出了鼠和人CD20-7的重链CDR2的Kabat定义。加下划线的序列标记了未被视为进行表面重塑的CDR的Kabat重链CDR2部分。
表面残基位置定义为相对可及性为30％或更高的任何位置(Pedersen等，J.Mol.Biol.,235(3):959-973(1994))。使表面残基与人种系表面序列比对以鉴定同源性最高的人表面序列。对于CD20-7而言，对于VL和VH用作置换表面的人种系序列分别为IGKV7-3*01和IGHV3-15*04。由图7中的列表可见，用人对应残基置换轻链中总计4个表面残基和重链中9个表面残基。重链残基S28与CDR-H1靠得很近并且由于其取代人T28，可能引起结合亲和力降低，用保留的鼠S28残基生成第二表面重塑形式。图8示出了轻链和重链CD20-7可变结构域的表面重塑序列与其鼠对应序列的比对。
huCD20-7抗体的重组表达
密码子优化huCD20-7的可变区序列并通过Blue Heron生物学技术合成。序列两侧为限制性酶位点，用于用单链哺乳动物表达质粒中的各自恒定序列进行框内克隆。将轻链可变区克隆至phCD20-7LCZ质粒中的EcoRI和BsiWI位点。将重链可变区克隆至phCD20-7HCN质粒中的HindIII和Apa1位点。这些质粒可用于在哺乳动物细胞瞬时或稳定转染时表达huCD20-7。使用修改的PEI方法(Durocher,Y.等，Nucleic Acids Res.30(2):E9(2002))进行瞬时转染在HEK-293T细胞中表达huCD20-7。使用以上对嵌合抗体所述的标准方法通过蛋白质A和精制色谱步骤纯化上清液。
参考抗体的表达
为了比较huCD20-7的活性，克隆先前鉴定的抗CD20抗体并使其表达。使用WO 2004/035607的SEQ ID NO:2(对于HC可变区而言)和WO 2004/035607的SEQ ID NO:4(对于LC可变区而言)从WO 2004/035607(Teeling等(2004)，见上文)获得2F2抗体(ofatumumab)HC和LC可变区的氨基酸序列。同样，从WO 2005/0448959(Umana，美国专利序列No.5,639,641(2005))获得GA101抗体(阿夫土珠的基础)HC和LC可变区的氨基酸序列。与所述B-HH6构建体相对应的WO 2005/0448959的SEQ ID NO:40用于HC可变区并且与所述B-KV1构建体相对应的WO 2005/0448959的SEQ ID 76用于LC可变区。
密码子优化两种抗体的可变区序列并通过Blue Heron生物学技术合成。序列两侧为限制酶位点，用于用单链哺乳动物表达质粒中的各自恒定序列进行框内克隆。如以上对huCD20-7所述进行克隆、表达和纯化。所得的GA101-F抗体在恒定区中展现出典型岩藻糖基化，因此并非用于阿夫土珠的去岩藻糖基化形式。
实施例8
huCD20-7的结合亲和力
使用BJAB细胞和muCD20-7、chCD20-7或huCD20-7抗体进行流式细胞仪结合测定并且如实施例2中所述进行分析。图9描绘了通过非线性回归为每种抗体生成的剂量反应曲线。使用GraphPad Prism v4(GraphPad software,San Diego,CA)计算每种抗体的表观解离常数(Kd)的值。嵌合或人源化并不影响CD20-7的结合亲和力，正如muCD20-7、chCD20-7和huCD20-7的Kd分别对应0.4nM、0.5nM和0.5nM。
通过ELISA进行结合表征
由WSU-DLCL-2细胞(例如，CD20抗原的来源)制备粗细胞溶解产物以通过ELISA测量结合亲和力。在37℃下于加湿5％CO2孵育箱中，使WSU-DLCL-2细胞在滚瓶中在补充了10％胎牛血清、2mM谷氨酰胺和1％青霉素-链霉素(所有试剂均来自Invitrogen)的RPMI-1640培养基中生长。离心回收细胞并且用冷1×PBS洗涤细胞团块两次，接着在溶解缓冲液(50mM Tris(pH 8)、150mM NaCl、5mM EDTA、1％NP-40、0.25％脱氧胆酸钠、25mM辛基糖苷)中溶解。用1mL体积的溶解缓冲液溶解收获的1×107个细胞。通过22ga注射器针头10次匀化细胞溶解产物并且使溶解产物在4℃下旋转45min。通过在4℃下10,000g离心45min使溶解产物澄清。使上清液滤过0.22μm过滤器，等分，用液氮速冻并保存在-80℃下。通过BCA测定(例如，Micro BCA Protein Assay Kit,PIERCE,US)测量蛋白质总浓度。
对于ELISA实验，将溶解产物制剂稀释于包被缓冲液(15mM Na2CO3、35mMNaHCO3，pH 9.6)中至总蛋白5μg/ml并且在4℃下按100μL/孔涂在Immulon 2HB板上18-24h。然后按200μL/孔用洗涤缓冲液(TBST：0.1％吐温-20/TBS，pH 7.4)洗涤板3次。在室温下用200μL/孔的封闭缓冲液(1％酪蛋白/TBS,pH 7.4)封闭板1h。像以前那样洗涤板，然后按100μL/孔向板中加入连续稀释的抗体。在室温下孵育板3h，然后像以前那样洗涤板。按100μL/孔加入于封闭缓冲液中1:5,000稀释的山羊抗人HRP作为二级抗体并使其在室温下孵育1h。像以前那样洗涤板，然后加入100μL/孔的TMB1底物(BioFX)。用100μL/孔的450nm终止试剂(BioFX)终止之前使反应进行20min。读取450nm下的吸光度并按每种样品的抗体浓度绘图。使用GraphPad Prism  v4(GraphPad software,San Diego,CA)将S形剂量反应曲线拟合为结合曲线。由图10中所示huCD20-7的结合曲线计算表观解离常数(Kd)的值，对应0.8nM。
实施例9
mu和huCD20-7的促凋亡活性
将huCD20-7的促凋亡活性与muCD20-7的活性相比较。用浓度为10nM、1nM或0.1nM的muCD20-7、huCD20-7或huIgG同种型对照抗体孵育Ramos细胞20h，然后进行Annexin-V-FITC和染色和流式细胞仪分析。每种条件的百分比Annexin-V阳性细胞示于图11。huCD20-7保持了muCD20-7的强促凋亡活性。与6％的同种型对照处理细胞相比，用10nM的任一种抗体处理后约60％的Ramos细胞呈Annexin-V阳性。
huCD20-7的促凋亡活性
将huCD20-7对Ramos细胞的促凋亡活性与其它CD20抗体相比较。利妥昔单抗和2F2是具有先前所述的有限促凋亡活性的I型抗体，而GA101和B1是具有已知强促凋亡活性的II型抗体。“B1”与未标记形式的BexxarTM(Coulter)相对应；而“GA101-F”与岩藻糖基化形式的阿夫土珠或GA101(Roche)相对应；并且“2F2”与ofatumumab(Genmab)相对应。用Ramos细胞孵育不同量的每种抗体20h，然后进行Annexin-V-FITC和染色和流式细胞仪分析。按抗体浓度将Annexin-V阳性细胞的百分比绘制为图12中的半对数图，并且由使用非线性回归分析拟合的曲线计算EC50值。huCD20-7具有最强的促凋亡作用，Annexin-V阳性细胞的最大百分比为50％且EC50为0.2nM。甚至更有效的是B1产生34％的Annexin-V阳性细胞，EC50为0.8nM。GA101-F效率较低，产生22％的Annexin-V阳性细胞，EC50为1.7nM。利妥昔单抗对Ramos细胞的细胞凋亡影响有限，并且仅产生12％的Annexin-V阳性细胞，EC50为1.7nM。2F2处理和未处理样品均含有2％的Annexin-V阳性细胞，表明2F2并未诱导Ramos细胞的细胞凋亡。减去未处理对照值后，与B1的32％、GA101-F的20％和利妥昔单抗的10％相比，该值与huCD20-7诱导的48％Annexin-V阳性Ramos细胞相对应。
对一组细胞系的促凋亡活性
可进一步将huCD20-7的促凋亡活性与利妥昔单抗和B1对更多细胞系的促凋亡活性相比较。用10nM或1.5μg/mL的huCD20-7或利妥昔单抗孵育每个细胞系20h，然后进行Annexin-V-FITC和染色和流式细胞仪分析。为每种抗体和未处理样品绘制Annexin-V阳性细胞的百分比并呈现于图13A-13E中。在Ramos和Raji淋巴瘤细胞系中huCD20-7抗体比利妥昔单抗和B1更有活性。与B1的29％、利妥昔单抗的9％和未处理细胞的6％相比，huCD20-7在Ramos淋巴瘤细胞中诱导60％Annexin-V阳性细胞。减去未处理对照值后，与B1的23％和利妥昔单抗的3％相比，这与huCD20-7诱导的54％Annexin-V阳性Ramos细胞相对应。与B1的42％、利妥昔单抗的14％和未处理细胞的5％相比，huCD20-7在Raji淋巴瘤细胞中诱导58％Annexin-V阳性细胞。减去未处理对照值后，与B1的37％和利妥昔单抗的9％相比，这与huCD20-7诱导的53％Annexin-V阳性Raji细胞相对应。另外，与利妥昔单抗的26％和未处理细胞的5％相比，huCD20-7在WSU-DLCL-2DLBCL细胞中诱导39％Annexin-V阳性细胞。减去未处理对照值后，这与huCD20-7诱导的34％Annexin-V阳性WSU-DLCL-2细胞和利妥昔单抗诱导的21％Annexin-V阳性WSU-DLCL-2细胞相对应。与利妥昔单抗的9％和未处理细胞的8％相比，huCD20-7在Jeko-1MCL细胞中诱导20％Annexin-V阳性细胞。减去未处理对照值后，这与huCD20-7诱导的12％Annexin-V阳性Jeko-1细胞和利妥昔单抗诱导的仅1％Annexin-V阳性Jeko-1细胞相对应。最后，与利妥昔单抗的23％和未处理细胞的18％相比，huCD20-7在Granta-519MCL细胞中诱导58％Annexin-V阳性细胞。减去未处理对照值后，这与huCD20-7诱导的40％Annexin-V阳性Granta-519细胞和利妥昔单抗诱导的仅5％Annexin-V阳性Granta-519细胞相对应。
实施例10
使用人抗体进行脂筏测定
如以上所述与其它CD20抗体相比为huCD20-7进行对Ramos细胞的脂筏测定。利妥昔单抗和2F2是具有先前所述脂筏活性的I型抗体，而GA101-F 和B1是缺乏脂筏并因此缺乏CDC活性的II型抗体。不出所料，利妥昔单抗和2F2处理的细胞用和不用TritonX-100处理显示出相同荧光水平(图14)。相反，用B1或GA101-F染色的细胞用TritonX-100处理比不处理的平均荧光低很多，这与它们不能将CD20重新分布于脂筏内一致。惊人地，用huCD20-7染色的细胞用或不用TritonX-100处理平均荧光相似。因此，与利妥昔单抗和2F2一样，huCD20-7可有效地将CD20转移至B细胞膜的脂筏区室内。
huCD20-7的CDC活性
与利妥昔单抗和GA101-F相比，如实施例6中对于嵌合抗体所述测量huCD20-7的CDC活性。惊人地，如图15A所示，huCD20-7抗体对Daudi淋巴瘤细胞的CDC活性与利妥昔单抗相似。利妥昔单抗或huCD20-7处理使Daudi细胞活力完全降低，EC50分别为0.23和0.25μg/mL。不出所料，典型II型抗体GA101-F并未显示出对Daudi细胞有任何CDC活性。如图15B所示，对Ramos淋巴瘤细胞发现相似结果。利妥昔单抗或huCD20-7处理使Ramos细胞活力完全降低，EC50分别为0.09和0.014μg/mL。不出所料，典型II型抗体GA101-F对Ramos细胞具有最低CDC活性。
另外，huCD20-7比利妥昔单抗对WSU-DLCL-2和RL淋巴瘤细胞的CDC活性更强。利妥昔单抗在最高浓度下使WSU-DLCL-2细胞的细胞活力降至34％，EC50为1.9μg/mL。相反，huCD20-7在最高浓度下使WSU-DLCL-2细胞的细胞活力降至11％，EC50为0.58μg/mL(图16A)。利妥昔单抗在最高浓度下使RL细胞的细胞活力适度降至56％，EC50为4.3μg/mL。相反，huCD20-7在最高浓度下使RL细胞的细胞活力更完全降至11％，EC50低很多为0.67μg/mL(图16B)。
实施例11
huCD20-7的ADCC活性
乳酸脱氢酶(LDH)释放测定用于使用新分离的人自然杀伤(NK)细胞作为效应细胞测量肿瘤细胞系的抗体依赖型细胞介导的细胞毒性(ADCC)(例如， Shields,J.Biol.Chem.,276(9):6591-6604(2001))。首先使用NK分离试剂盒II(Miltenyi Biotech,130-091-152)的修改方法从来自正常供体(Research Blood Components,Inc.,Brighton,MA)的人血液中分离NK细胞。用1×PBS稀释血液2倍。小心地将25mL稀释血液置于50mL圆锥管中25mL Ficoll Paque上层并且在室温下400g离心45min。从界面收集周围血单核细胞(PBMC)，转移至新的50mL圆锥管中，并用1×PBS洗涤。使PBMC再次悬浮于2mL的NK分离缓冲液(1×PBS、0.5％BSA、2mM EDTA)中，然后向细胞悬浮液中加入500μL生物素-抗体混合物。生物素-抗体混合物含有与淋巴细胞(除NK细胞外)结合的生物素化抗体，引起NK细胞的阴性选择。在4℃下孵育混合物10min，然后加入1.5mL的NK分离缓冲液和1mL的抗生物素微珠。在4℃下再孵育细胞-抗体混合物15min。接着，用50mL的NK分离缓冲液洗涤细胞1次并再次悬浮于3mL的NK分离缓冲液中。然后，将MACS LS柱安装在自动MACS分离器(Miltenyi Biotech)上并且用3mL的NK分离缓冲液预洗涤。自动将细胞悬浮液涂到柱上，洗涤并将具有未标记NK细胞的洗脱成分收集至新的50mL圆锥管中。将所得的NK细胞接种至30mL完全RPMI培养基中(补充了5％胎牛血清、1％青霉素-链霉素、1mM HEPES、1mM丙酮酸钠、1％100×MEM非必需氨基酸溶液的RPMI-1640)过夜。在RHBP培养基(补充了20mM HEPES(pH 7.4)、0.1％BSA和1％青霉素-链霉素的RPMI-1640培养基)中进行后续测定和所有稀释。
按50μL/孔将于RHBP培养基中各种浓度的抗体等分至圆底96孔板中，一式两份。按106个细胞/mL将靶细胞再次悬浮于RHBP培养基中并且按100μL/孔加入装有抗体稀释液的每个孔中。在37℃下孵育装有靶细胞和抗体稀释液的板30min。然后按50μL/孔将NK细胞加入装有靶细胞的孔中。典型比例为约1个靶细胞：3-4个NK细胞。为每次实验设定以下至少一个对照：单独的NK细胞，单独的靶细胞(自发LDH释放)、靶细胞与NK细胞(不依赖抗体的LDH释放)、靶细胞与10％TritonX-100(最大量LDH释放)。在37℃下孵育混合物4h以允许细胞溶解。在1200rpm下离心板10min，并且小心地将100μL上清液转移至新的平底96孔板中。向每个孔中加入来自细胞毒性检测试剂盒(Roche 1 644 793)的LDH反应混合物(100μL/孔)并且在室温下孵育 5-30min。在490nm(OD490)下测量样品的光密度。使用以下公式确定每个样品的特异性溶解百分比：特异性溶解百分比＝(样品值-自发释放)/(最大量释放-自发释放)*100。
在人NK效应细胞存在下，用huCD20-7孵育导致对Ramos淋巴瘤和JVM-13慢性淋巴细胞性白血病(CLL)细胞的优良ADCC活性。比较huCD20-7、利妥昔单抗、GA101-F和2F2对Ramos淋巴瘤细胞的ADCC活性(图17)。与用其它CD20抗体观察到的活性相似，用huCD20-7处理引起约80％Ramos细胞溶解。huCD20-7的ADCC活性EC50为1.1ng/mL，利妥昔单抗的EC50为3.5ng/mL，2F2的EC50为1.2ng/mL并且GA101-F的EC50为0.59ng/mL。将huCD20-7对JVM-13CLL细胞的ADCC活性与利妥昔单抗和2F2相比较。与利妥昔单抗或2F2相似，huCD20-7处理引起约40％JVM-13细胞溶解。huCD20-7的ADCC活性EC50为0.23ng/mL，利妥昔单抗的EC50为0.29ng/mL并且2F2的EC50为0.17ng/mL。
实施例12
表位绘图
CD20的细胞外结构域含有两个细胞外环。较大环由第三和第四个跨膜结构域之间约44个氨基酸组成。因此所述大多数CD20抗体需要较大环中的氨基酸残基以有效结合。诱变分析已鉴定了至少丙胺酸170(A170)和脯氨酸172(P172)为抗体结合的关键残基(Polyak,Blood,99:3256-3262(2002)；和Polyak,J.Immunol.,161:3242-3248(1998))。将A170和P172残基变成在鼠CD20中该位置处找到的氨基酸丝氨酸消除了CD20抗体(例如B1)的结合。同样，向含有鼠大胞外环的CD20引入A170和P172残基使得结合大多数CD20抗体，包括B1和利妥昔单抗。相反，已报道所述的罕见抗体组(包括2F2)与CD20A170S P172S变异体结合(Teeling等(2006)，见上文)。另外，将残基天冬酰胺163(N163)或天冬酰胺166(N166)变成天冬氨酸减少了2F2的结合，而这并不影响其它抗CD20抗体，例如B1或利妥昔单抗的结合(Teeling等(2006)Blood.177:363-371)。已建议将这种新型表位与其生物学活性联系起来，这需要对肿瘤细胞的有效CDC活性，但是有限的直接促凋亡活性。为进一步表征 CD20-7和CD20-6，我们分析了它们与CD20变异体的结合。
CD20变异体克隆和表达
表达质粒pSRa-CD20含有整个人CD20cDNA序列，密码子优化并通过Blue Heron生物学技术合成，其两侧为XbaI和BamHI限制位点以克隆至pSRa载体中。使用5’引物hCD20sacAP-SS(ATTAGAGCTCACACACCATATATTAACATATACAACTGTGAACCATCGAATTCCTCTGAGAAAAACT(SEQ ID NO:41))与3’端反向引物SRaMfe1R(AATGCAATTGTTGTTGTTAACT(SEQ ID NO:42))进行PCR诱变扩增含有A170S P172S突变的pSRa-CD20质粒的SacI至Mfe1片段生成CD20-A170S P172S变异体(CD20-AP)。将该PCR产物克隆至pSRa-CD20质粒的SacI和Mfe1位点。在通过限制酶消化，然后通过DNA测序检验的所得克隆中诱变引入了EcoRI位点和CD20序列变化。通过PCR诱变相同SacI至Mfe1片段，通过修饰5’端引物的特定密码子生成CD20N163D N166D双突变体(CD20-NNDD)和CD20N163D(CD20-N163D)单突变体。用hCD20sacNN-DD 5’端引物(ATTAGAGCTCACACACCATATATCGATATATACGATTGTGAACCA(SEQ ID NO:43))扩增CD20N163D N166D突变体片段，并且用hCD20sacN163D 5’端引物(ATTAGAGCTCACACACCATATATTGATATCTACAACTGTGA(SEQ ID NO:44))扩增CD20N163D片段。将SacI至Mfe1PCR片段克隆至pSRa-CD20的SacI和Mfe1位点并分别对构建体筛选引入的Cla1和EcoRV位点。通过DNA测序进一步确认阳性克隆。
通过使用已知电穿孔方法将CD20变异体表达质粒转染至300-19细胞中产生稳定细胞系。简言之，在260V和960μF下于RPMI-1640冷培养基中使用BioRad电穿孔仪对5×106个300-19细胞电穿孔。接着，稀释细胞并将细胞接种于补充了10％FBS和50μMβ-巯基乙醇的RPMI-1640培养基中的96孔板中。24h后加入G418(例如，可从Invitrogen获得的G418)，最终浓度为2mg/mL，以选择转染细胞。2周后，分离单个菌落并扩展。
抗体与CD20变异体的结合
用流式细胞仪分析各种CD20抗体与表达人CD20野生型和变异体的CD20AP的结合。正如图18A和图18B中所见，包括CD20-7和CD20-6在内的所有抗体均与野生型CD20表达细胞结合。获得的CD20AP变异体的数据示于图19。不出所料，利妥昔单抗和GA101-F并不结合CD20AP变异体，而B1显示出最低限度的结合。相反，2F2可结合如先前所报道的CD20AP变异体(Teeling等(2006)，见上文)。令人惊讶地，huCD20-7结合CD20AP变异体(见图19A)。类似地，muCD20-6和muCD20-7也能够结合CD20AP变异体(见图19B)。已经证实N163D和N166D突变减少2F2的结合，但并不影响其它抗CD20抗体，例如B1或利妥昔单抗的结合。不出所料，利妥昔单抗和GA101-F结合CD20-N163D变异体，而2F2显示出结合减少(图20A)。相反，huCD20-7、muCD20-7和muCD20-6显示出与CD20N163D的结合丧失。类似地，利妥昔单抗和GA101-F结合CD20-N163D N166D变异体，而2F2显示出最低限度的结合(图21)。再者，huCD20-7、muCD20-7和muCD20-6显示出与CD20N163D N166D的结合丧失。
这个意外结果表明huCD20-7在功能上与II型Ab，例如GA101和B1有关，但是明显需要与那些抗体不同的表位。与大多数其它抗体不同，huCD20-7不依赖于CD20的A170和P172残基。因此huCD20-7是具有迄今未实现的物理和功能特征组合的新型CD20抗体。
实施例13
huCD20-7-SPP-DM1的制备
将4-(2-吡啶二硫代)戊酸N-琥珀酰亚胺酯(SPP)连接子溶于乙醇中。在室温下于含有50mM NaCl、2mM EDTA和5％乙醇的50mM磷酸氢二钾缓冲液(pH 6.5)中，用7倍摩尔过量SPP连接子孵育8mg/mL的huCD20-7抗体约100min。使用用前述磷酸氢二钾缓冲液平衡的SEPHADEXTMG25F柱纯化反应混合物。汇聚含有抗体的成分并用于后续步骤。
将示例性类美坦素DM1溶于二甲基乙酰胺中(DMA，最终浓度为3％)并且向SPP修饰抗体中滴加相对于连接子1.7倍摩尔过量的类美坦素。在室温 下孵育过夜后，通过在pH 6.5的磷酸缓冲盐水(PBS)中平衡的SEPHADEXTMG25F上进行色谱法纯化偶联抗体。然后将huCD20-7-SPP-DM1偶联物透析至含有10mM组氨酸、250mM甘氨酸、1％蔗糖(pH 5.5)的缓冲液中。使用先前报道的抗体和DM1的消光系数确定每个抗体分子连接的DM1分子数量(Liu等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA,93,8618-8623(1996))。通过将20-50μg偶联物注射至于pH 7.0的100mM醋酸铵缓冲液中的25％乙腈中平衡的HiSepTM柱上并在乙腈中洗脱确定偶联反应后存在的游离类美坦素的百分比。使用吸光度检测装置测量波长252nm下总游离类美坦素类(梯度洗脱并且通过将洗脱时间与已知标准作比较进行鉴定)的峰面积并且与和结合类美坦素(在柱流过成分中偶联物峰中洗脱)有关的峰面积相比较以计算总游离类美坦素类的百分比。获得每个huCD20-7抗体与3.5-4个DM1分子的偶联物，<1％作为未偶联类美坦素存在。
huCD20-7-SMCC-DM1的制备
将4-(N-马来酰亚胺基甲基)环己烷-1-羧酸琥珀酰亚胺酯(SMCC,Pierce Biotechnology,Inc)连接子溶于DMA中。用SMCC修饰huCD20-7抗体以通过在50mM磷酸氢二钾、50mM NaCl、2mM EDTA(pH 6.5)中，用7.5-10摩尔过量的SMCC孵育8mg/mL的抗体将马来酰亚胺引入抗体中。在环境温度下于氩气中搅拌2-4h后，使用用相同磷酸氢二钾缓冲液平衡的SEPHADEXTMG25柱纯化反应混合物。汇聚含有抗体的成分并用于后续步骤。
使SMCC修饰的抗体与10mM的DM1溶液反应，相对于马来酰亚胺连接子1.7摩尔过量。在环境温度下于氩气中搅拌反应4至约16h。使偶联反应混合物滤过用pH 6.5的1×PBS平衡的SEPHADEXTMG25凝胶过滤柱。然后使huCD20-7-SMCC-DM1偶联物透析至含有10mM组氨酸、250mM甘氨酸、1％蔗糖的缓冲液(pH 5.5)中。如以上所述确定每个抗体分子连接的DM1分子的量和总游离类美坦素类的百分比。获得每个huCD20-7抗体与3.5-4个DM1分子的偶联物，<1％作为未偶联类美坦素存在。
huCD20-7-SPDB-DM4的制备
将示例性4-(2-吡啶二硫代)丁酸N-琥珀酰亚胺酯(SPDB)连接子溶于乙醇中。在室温下于含有50mM NaCl、2mM EDTA和3％乙醇的50mM磷酸氢二钾缓冲液中用5倍摩尔过量的SPDB连接子孵育8mg/mL的huCD20-7抗体约100分钟。使用用前述磷酸氢二钾缓冲液平衡的SEPHADEXTMG25柱纯化反应混合物。汇聚含有抗体的成分并用于后续步骤。
将类美坦素DM4溶于二甲基乙酰胺中(DMA，最终浓度为3％)并且向SPDB修饰抗体中滴加与连接子相比1.7倍摩尔过量的类美坦素。在室温下孵育过夜后，通过在用pH 6.5的1×PBS平衡的SEPHADEXTMG25F上进行色谱法纯化偶联抗体。然后将huCD20-7-SPDB-DM4偶联物透析至含有10mM组氨酸、250mM甘氨酸、1％蔗糖的缓冲液(pH 5.5)中。使用先前报道的抗体和类美坦素的消光系数确定每个抗体分子连接的DM4分子的数量(Widdison,WC等，J Med Chem,49:4392-4408(2006))。如以上所述确定总游离类美坦素类的百分比。获得每个huCD20-7抗体与3.5-4个DM4分子的偶联物，<1％作为未偶联类美坦素存在。
huCD20-7-PEG4-mal-DM4的制备
将DM4-mal-PEG4-NHS试剂溶于DMA中制备12mM储液。用15个当量的DM4-mal-PEG4-NHS修饰huCD20-7抗体，于50mM磷酸氢二钾、50mM NaCl、2mM EDTA(pH 7.5)和10％DMA中按体积计抗体浓度为4mg/mL。在环境温度下于氩气中搅拌2-4h后，使用用相同磷酸氢二钾缓冲液平衡的SEPHADEXTMG25柱纯化反应混合物。
然后将huCD20-7-PEG4-mal-DM4偶联物透析至含有10mM组氨酸、250mM甘氨酸、1％蔗糖的缓冲液(pH 5.5)中。如以上所述确定每个抗体分子连接的DM4分子的量和总游离类美坦素类的百分比。获得每个huCD20-7抗体与3.5-4个DM4分子的偶联物，<1％作为未偶联类美坦素存在。
huCD20-7-sulfo-mal-DM4的制备
通过在环境温度下使3-sulfo-mal-NHS连接子与1.6个当量的L-DM4-SH 在pH 5的60％DMA/40％200mM琥珀酸盐缓冲液中反应2h生成DM4-mal-3-sulfo-NHS。按体积计在50mM磷酸氢二钾、50mM NaCl、2mM EDTA(pH 7.5)和10％DMA中，每个huCD20-7抗体(5mg/ml)加入8个当量的反应混合物(4mM连接子浓度)。在环境温度下于氩气中搅拌2-4h后，使用用相同磷酸氢二钾缓冲液平衡的SEPHADEXTMG25柱纯化反应混合物。
然后将huCD20-7-sulfo-mal-DM4偶联物透析至含有10mM组氨酸、250mM甘氨酸、1％蔗糖的缓冲液(pH 5.5)中。如以上所述确定每个抗体分子连接的DM4分子的量和总游离类美坦素类的百分比。获得每个huCD20-7抗体与3.5-4个DM4分子的偶联物，<1％作为未偶联类美坦素存在。
实施例14
偶联物的结合亲和力
通过如以上实施例中所述的ELISA测定与SMCC-DM1或SPP-DM1偶联后huCD20-7的结合亲和力。由图22中所示结合曲线计算表观解离常数(Kd)的值，并且对于huCD20-7而言对应0.7nM，对于SMCC-DM1而言对应0.9nM且对于SPP-DM1偶联物而言对应1.1nM。该结果证明(例如)SMCC-DM1或SPP-DM1偶联并未显著改变抗体(例如，CD20-7)的亲和力。
另外，通过如以上实施例中所述的ELISA测定(例如)与sulfo-mal-DM4偶联后huCD20-7的结合亲和力。由图22B中所示结合曲线计算表观解离常数(Kd)的值，并且对于huCD20-7而言对应0.8nM，对于sulfo-mal-DM4偶联物而言对应1.3nM。该结果证明sulfo-mal-DM4偶联并未显著改变抗体(例如，huCD20-7)的亲和力。
偶联物的促凋亡活性
例如，通过以上所述Annexin-V测定对Ramos细胞测定与SMCC-DM1或SPDB-DM4偶联后huCD20-7的促凋亡活性。用不同浓度的huCD20-7抗体或偶联物孵育Ramos细胞20h，然后进行Annexin-V-FITC和染色和流式细胞仪分析。按抗体浓度将Annexin-V阳性细胞的百分比绘制为 图23中的半对数图。与未处理细胞的3％相比，用huCD20-7处理产生最多51％Annexin-V阳性细胞。利妥昔单抗处理仅诱导10％的Annexin-V阳性细胞。用huCD20-7-SMCC-DM1偶联物处理引起Annexin-V阳性细胞增多至73％，而huCD20-7-SPDB-DM4处理引起进一步增多至82％。相反，非结合同种型对照抗体的SMCC-DM1或SPDB-DM4偶联物分别产生4％或8％Annexin-V阳性细胞。类美坦素偶联增强了(例如)huCD20-7对Ramos细胞的促凋亡活性。
偶联物的CDC活性
在以上所述的人补体存在下对淋巴瘤细胞测定偶联后(例如)huCD20-7的CDC活性。如图24A中对于Daudi淋巴瘤细胞所见，huCD20-7的示例性SPDB-DM4和PEG4-mal-DM4偶联物具有与未偶联抗体相似的CDC活性，EC50约为0.4μg/mL。对WSU-DLCL-2弥漫性大B细胞淋巴瘤细胞(图24B)，huCD20-7、huCD20-7-SPDB-DM4和huCD20-7-PEG4-mal-DM4具有相似CDC活性，EC50约为0.5μg/mL。如图25A中对于WSU-DLCL-2细胞所见，huCD20-7、huCD20-7-SMCC-DM1、-SPP-DM1和sulfo-mal-DM4具有相似CDC活性，EC50约为0.5μg/mL。对淋巴瘤细胞(图25B)，huCD20-7、huCD20-7-SMCC-DM1、-SPP-DM1和sulfo-mal-DM4具有相似CDC活性，EC50约为0.02μg/mL。因此，在类美坦素偶联后保持了(例如)huCD20-7的CDC活性。
偶联物的ADCC活性
在人NK效应细胞存在下通过以上所述的LDH释放测定对Ramos和Granta-519细胞评估与SMCC-DM1偶联后(例如)huCD20-7的ADCC活性。如图26中所见，huCD20-7-SMCC-DM1偶联物对Ramos细胞具有与未偶联huCD20-7抗体相似的ADCC活性，各自最多40％细胞溶解且EC50分别为1.8ng/mL和1.4ng/mL。使用其它细胞(例如，Granta-519MCL细胞)作为靶细胞获得相似结果。huCD20-7-SMCC-DM1偶联物对Granta-519细胞具有与未偶联huCD20-7抗体相当的ADCC活性，各自最多约25％细胞溶解并且EC50分别为0.22ng/mL和0.14ng/mL。正如对于CDC所见，在类美坦素偶联后保 持了huCD20-7的ADCC活性。
实施例15
体外细胞毒性测定
使用体外细胞毒性测定测量示例性huCD20-7偶联物抑制细胞生长的能力。通常，按5,000个细胞/孔将100μL靶细胞接种于完全RPMI培养基(RPMI-1640、10％胎牛血清、2mM谷氨酰胺、1％青霉素-链霉素，所有试剂均来自Invitrogen)中。使用3倍稀释系列将抗体和偶联物稀释至完全RPMI培养基中并向每个孔加100μL。最终浓度范围通常为3×10-8M至4.6×10-12M。在37℃下于加湿5％CO2孵育箱中孵育细胞4-5天。通过WST-8比色测定(Dojindo Molecular Technologies,Inc.,Rockville,MD,US)确定剩余细胞的活力。在活细胞中由脱氢酶将WST-8还原为可溶于组织培养基中的橙色甲簪产物。生成的甲簪的量直接与活细胞的数量成比例。加入WST-8至最终体积的10％并且在37℃下于加湿5％CO2孵育箱中再孵育板2-4h。通过在多孔酶标仪中测量450nm下的吸光度(A450)对板进行分析。从所有值中减去仅具有培养基和WST-8的孔的本底A450吸光度。用具有未处理细胞的孔的平均值除以每个处理样品值计算活力百分比。活力百分比＝100*(处理样品A450-本底A450)/(未处理样品A450-本底A450)。对于每种处理，按抗体或偶联物浓度将活力百分比值绘制为半对数图。
huCD20-7和huCD20-7-SMCC-DM1对Ramos细胞的体外细胞毒性
将huCD20-7和huCD20-7-SMCC-DM1对Ramos细胞的体外细胞毒性与利妥昔单抗和非特异性huIgG-SMCC-DM1偶联物的活性作比较。如图27A中所见，huCD20-7孵育引起活力降至60％，而利妥昔单抗使活力降至80％。用huCD20-7-SMCC-DM1处理使活力完全降低，EC50为0.68nM，而非特异性huIgG-SMCC-DM1偶联物的EC50为20nM，引起huCD20-7-SMCC-DM1出乎意料显著的29倍特异性窗。
huCD20-7和huCD20-7-SMCC-DM1对Daudi细胞的体外细胞毒性
将huCD20-7和huCD20-7-SMCC-DM1对Daudi细胞的体外细胞毒性与利妥昔单抗和非特异性huIgG-SMCC-DM1偶联物的活性作比较。如图27B中所见，在最高浓度下huCD20-7孵育引起活力降至65％，而利妥昔单抗更适度地使活力降至80％。在最高试验浓度下用huCD20-7-SMCC-DM1处理使活力完全降低，EC50为0.77nM，而非特异性huIgG-SMCC-DM1偶联物的EC50为12nM，引起huCD20-7-SMCC-DM1对Daudi细胞出乎意料显著的16倍特异性窗。
huCD20-7和huCD20-7-SMCC-DM1对Granta-519细胞的体外细胞毒性
将huCD20-7和huCD20-7-SMCC-DM1对Granta-519细胞的体外细胞毒性与利妥昔单抗和非特异性huIgG-SMCC-DM1偶联物的活性作比较。如图28A中所见，在最高浓度下huCD20-7孵育引起活力降至45％，而利妥昔单抗更适度地使活力降至60％。在最高试验浓度下用huCD20-7-SMCC-DM1处理使活力完全降低，EC50为0.03nM，而非特异性huIgG-SMCC-DM1偶联物的EC50为13nM，引起huCD20-7-SMCC-DM1对Granta-519细胞出乎意料显著的419倍特异性窗。
huCD20-7和huCD20-7-SMCC-DM1对SC-1细胞的体外细胞毒性
将huCD20-7和huCD20-7-SMCC-DM1对SC-1FL细胞的体外细胞毒性与利妥昔单抗和非特异性huIgG-SMCC-DM1偶联物的活性作比较。如图28B中所见，在最高浓度下huCD20-7孵育引起活力降至35％，而利妥昔单抗更适度地使活力降至75％。在最高试验浓度下用huCD20-7-SMCC-DM1处理使活力完全降低，EC50为0.39nM，而非特异性huIgG-SMCC-DM1偶联物的EC50为31nM，引起huCD20-7-SMCC-DM1对SC-1细胞出乎意料显著的79倍特异性窗。
huCD20-7和huCD20-7-SMCC-DM1对DOHH-2细胞的体外细胞毒性
将huCD20-7和huCD20-7-SMCC-DM1对DOHH-2FL细胞的体外细胞毒性与利妥昔单抗和非特异性huIgG-SMCC-DM1偶联物的活性作比较。如图 29A中所见，在最高浓度下huCD20-7孵育引起活力降至20％，而利妥昔单抗使活力降至25％。在最高试验浓度下用huCD20-7-SMCC-DM1处理使活力完全降低，EC50为0.12nM，而非特异性huIgG-SMCC-DM1偶联物的EC50为35nM，引起huCD20-7-SMCC-DM1对DOHH-2细胞出乎意料显著的292倍特异性窗。
huCD20-7-SMCC-DM1对抗原阴性Molt-4细胞的体外细胞毒性
为进一步验证huCD20-7-SMCC-DM1细胞毒性的特异性，将其对非CD20表达Molt-4T-细胞急性淋巴细胞性白血病细胞系的活性与非特异性huIgG-SMCC-DM1偶联物作比较。在该实验中使用增高浓度的两种偶联物以获得相对低的非特异性细胞毒性。如图29B中所见，huCD20-7-SMCC-DM1和非特异性偶联物显示出相同细胞毒性，EC50为33nM。
huCD20-7-SMCC-DM1体外细胞毒性的总结
令人惊讶地，例如huCD20-7比利妥昔单抗对Ramos、Daudi、Grant-519、SC-1和DOHH-2更有活性。用huCD20-7孵育后靶细胞活力降低比对于利妥昔单抗处理所见活力降低更多。另外，例如，huCD20-7的SMCC-DM1偶联为抗体增加了有效细胞毒活性。与单独的抗体处理相比，响应于偶联物处理，肿瘤细胞的活力更完全降低。当比较huCD20-7-SMCC-DM1效力与非靶向huIgG-SMCC-DM1偶联物效力时，对于每种CD20表达细胞系观察到显著特异性窗，表明细胞毒性是huCD20-7抗体与靶细胞结合的结果。另外，例如huCD20-7-SMCC-DM1和非特异性偶联物对抗原阴性Molt-4细胞显示出同样低的细胞毒性。因此，对huCD20-7-SMCC-DM1观察到的细胞毒性依赖于CD20表达。
SMCC-DM1偶联物的EC50
  Ramos Daudi Granta-519 SC-1 DOHH-2 Molt-4
huCD20-7-SMCC-D 0.68nM 0.77nM 0.03nM 0.39nM 0.12nM 33nM
M1            
huIgG1-SMCC-DM1 20nM 12nM 13nM 31nM 35nM 33nM
特异性窗 29 16 419 79 292 1
实施例16
huCD20-7-SMCC-DM1比利妥昔单抗-SMCC-DM1对Ramos细胞更有活性
将(例如)huCD20-7和huCD20-7-SMCC-DM1对Ramos淋巴瘤细胞的体外细胞毒性与利妥昔单抗、利妥昔单抗-SMCC-DM1和非特异性huIgG-SMCC-DM1偶联物的活性作比较。如图30A中所见，在最高浓度下huCD20-7孵育引起活力降至55％，而利妥昔单抗不能使活力显著降低。用huCD20-7-SMCC-DM1处理使活力完全降低，EC50为0.72nM，而非特异性huIgG-SMCC-DM1偶联物的EC50为22nM。用利妥昔单抗-SMCC-DM1处理产生细胞毒性，EC50为3.3nM。因此，huCD20-7-SMCC-DM1偶联物具有比利妥昔单抗-SMCC-DM1更强的体外细胞毒活性。
huCD20-7-SMCC-DM1比利妥昔单抗-SMCC-DM1对Daudi细胞更有活性
将huCD20-7和huCD20-7-SMCC-DM1对(例如)Daudi淋巴瘤细胞的体外细胞毒性与利妥昔单抗、利妥昔单抗-SMCC-DM1和非特异性huIgG-SMCC-DM1偶联物的活性作比较。如图30B中所见，在最高浓度下huCD20-7孵育引起活力降至50％，而利妥昔单抗使活力显著降至65％。用huCD20-7-SMCC-DM1处理使活力消除，EC50为1.0nM，而非特异性huIgG-SMCC-DM1偶联物的EC50为15nM。用利妥昔单抗-SMCC-DM1处理产生细胞毒性，EC50为2.6nM。因此，huCD20-7-SMCC-DM1偶联物具有比利妥昔单抗-SMCC-DM更强的细胞毒活性。
实施例17
放射性标记偶联物的制备
除使用氚标记的DM1([3H]DM1)外，基本上使用Widdison等(Widdison等J Med Chem 2006；49:4392-408)对于非标记偶联物描述的相同方法制备huCD20-7和利妥昔单抗的放射性标记偶联物。Erickson等(Erickson等Bioconjug Chem 2010；21:84-92)中也详细描述了该方法。
简言之，首先在其赖氨酸处用4-(N-马来酰亚胺基甲基)环己烷-1-羧酸N-琥珀酰亚胺酯(SMCC)修饰抗体并通过过滤纯化，然后与氚稳定并入其C-20-甲氧基处的DM1偶联。由安丝菌素P-3制备氚标记的DM1。通过用菌株普拉特链霉菌(Streptomyces platensis)孵育去除安丝菌素P-3的C20甲氧基以产生安丝菌素PDM-3(Asai等，美国专利4,307,016)。然后通过Sawada(Sawada等Bioconj Chem 1993；4:284-289)描述的方法使用氚标记的碘甲烷甲基化安丝菌素PDM-3的C-20-OH部分。每个抗体分子连接的类美坦素分子的比例(D/A)和特定放射性如下：利妥昔单抗-SMCC-[3H]DM1(3.5D/A，1.9Ci/mmol)和huCD20-7-SMCC-[3H]DM1(3.4D/A，1.8Ci/mmol)。
利妥昔单抗-SMCC-[ 3 H]DM1和huCD20-7-SMCC-[ 3 H]DM1的活性
发现两种偶联物和相应的未修饰抗体对CD20阳性SU-DHL-4细胞均具有相似结合亲和力(图31A)。使用如实施例15中所述基于细胞的活力测定评估两种偶联物对CD20阳性SU-DHL-4细胞和CD20-阴性COLO205细胞的细胞毒效力。发现两种偶联物均有效，huCD20-7-SMCC-[3H]DM1和利妥昔单抗-SMCC-[3H]DM1偶联物的IC50值分别为约0.1nM和0.24nM(图31B)。不出所料，两种偶联物对抗原阴性COLO205结肠癌细胞系具有较差效力，huCD20-7-SMCC-[3H]DM1和利妥昔单抗-SMCC-[3H]DM1偶联物的EC50值分别为34nM和11nM。这说明这两种偶联物的细胞杀伤依赖于CD20。如实施例16中对Ramos和Daudi细胞所见，huCD20-7-SMCC-[3H]DM1偶联物具有比利妥昔单抗-SMCC-DM1对SU-DHL-4细胞更强的细胞毒活性。
利妥昔单抗-SMCC-[ 3 H]DM1和huCD20-7-SMCC-[ 3 H]DM1的靶细胞代谢产物
为评估靶细胞暴露于放射性标记偶联物后形成的代谢产物的量和类型，在37℃、6％CO2下将SU-DHL-4细胞(17×106个)于21mL补充了10％FBS的RPMI-1640培养基中的培养物暴露于40nM的3H-偶联物中30min。在RPMI-1640培养基中洗涤细胞3次以去除任何未结合的偶联物并再次悬浮于新鲜培养基中(8×105个细胞/mL)并且在37℃、6％CO2下孵育22h。收集细胞并悬浮于0.3mL、pH 7.5的Tris-缓冲盐水中。加入丙酮(4:3v/v)并混合样品且在-80℃下冷冻1h以使蛋白质沉淀。融解样品并在2,000×g下离心15min并分离上清液和团块。使用抽空离心机将含有无蛋白质的类美坦素代谢产物的上清液蒸发至干。将提取物溶解于0.12mL含有0.025％三氟乙酸的20％含水乙腈中，并且在分析C-18柱(Vydac，0.46×25cm)上分离类美坦素代谢产物(Erickson等，Cancer Res 2006；66:4426-33)。将流出物收集于1mL成分中并通过混合每个小瓶和4mL Ultima Gold液体闪烁混合物，然后在Tri-Carb 2900T液体闪烁计数器中计数5min确定每种成分相关的放射性。
使丙酮团块再次悬浮于0.3mL水中并加1mL可溶性试剂(Perkin Elmer)溶解。然后于50℃水浴中孵育样品过夜。从孵育中移除样品并向每个样品中加入0.1mL的0.1M EDTA和0.3mL的30％过氧化氢，接着在室温下孵育15min。然后在50℃下孵育样品1h。在加入15ml Ultima Gold闪烁液之前，向每个样品中加入0.2mL的1N HCl。剧烈搅拌样品并且在用LSC计数之前黑暗保存过夜。
SU-DHL-4细胞短时间暴露于huCD20-7-SMCC-[3H]DM1和利妥昔单抗-SMCC-[3H]DM1引起每个细胞结合相似高水平的偶联物(图32A)。由首次暴露于偶联物和洗涤步骤后与细胞相关的总放射性确定每个细胞结合的每种偶联物的量。暴露22h后通过丙酮萃取和HPLC分离与放射性检测定量类美坦素代谢产物。发现在暴露于两种偶联物22h后，在细胞内观察到的唯一代谢产物是赖氨酸-SMCC-[3H]DM1。未观察到其它代谢产物。先前鉴定赖氨酸-SMCC-[3H]DM1代谢产物为huC242-SMCC-[3H]DM1的唯一靶细胞代谢产物(Erickson等，Cancer Res 2006；66:4426-33)。发现在细胞暴露于huCD20-7-SMCC-[3H]DM1偶联物22h后赖氨酸-SMCC-[3H]DM1代谢产物的水平为约0.6pmol/106个细胞。相反，发现在细胞暴露于利妥昔单抗-[3H]DM1 偶联物22h后赖氨酸-SMCC-[3H]DM1代谢产物的水平为约0.3pmol/106个细胞。因此，在细胞暴露于huCD20-7-SMCC-[3H]DM1后形成的代谢产物水平比暴露于利妥昔单抗-SMCC-[3H]DM1后高2倍(图32B)。这种由huCD20-7偶联物形成的代谢产物水平升高可能导致huCD20-7偶联物的体外活性更强。因此，例如huCD20-7是具有使其在体外作为不可裂解偶联物更有效的独特物理和功能性质的抗体。
实施例18
具有不同连接子的huCD20-7偶联物的体外细胞毒性
将huCD20-7-SMCC-DM1的细胞毒性与用不同连接子制备的偶联物的细胞毒性作比较。如图33A中可见，例如huCD20-7的SPDB-DM4和PEG4-mal-DM4偶联物对Granta-519细胞具有与SMCC-DM1偶联物相似的细胞毒活性。任一种偶联物引起细胞活力完全降低，EC50为0.06nM。如图33B中所见，例如huCD20-7的SPP-DM1和sulfo-mal-DM4偶联物对Granta-519细胞也具有与SMCC-DM1偶联物相似的细胞毒活性。所有偶联物均引起细胞活力完全降低，EC50为0.1nM。
实施例19
SU-DHL-4异种移植模型中huCD20-7抗体的体内功效
使用建立的经皮下植入SCID小鼠体内的SU-DHL-4弥漫性大B细胞淋巴瘤细胞的异种移植模型试验示例性huCD20-7抗体。按体重将小鼠随机分为处理组并且在细胞接种后第14、21和28天用10或1mg/kg的huCD20-7或利妥昔单抗处理小鼠，每周3次。图34中绘制了不同处理组的中值肿瘤体积。在两个剂量下，与PBS对照相比利妥昔单抗处理引起中值肿瘤体积减小，10mg/kg剂量比1mg/kg剂量更有效。与PBS相比，用1mg/kg的huCD20-7处理引起中值肿瘤体积的减少比相同剂量的利妥昔单抗更显著。与利妥昔单抗相比，用10mg/kg的huCD20-7处理引起肿瘤生长更加显著减慢。在研究第66天，huCD20-7处理10只中产生7只无瘤存活小鼠(TFS)，而利妥昔单 抗处理10只中仅产生1只TFS。在PBS对照和两个1mg/kg处理组中未观察到TFS。
实施例20
Daudi异种移植模型中huCD20-7抗体、-SPP-DM1、SMCC-DM1和BMPS-DM1偶联物的体内功效
在使用经静脉内植入SCID小鼠体内的Daudi淋巴瘤细胞的异种移植模型中测试huCD20-7抗体及其偶联物的体内功效。按体重将小鼠随机分为处理组并且在细胞接种后第7天用10mg/kg的huCD20-7、10mg/kg的huCD20-7-SMCC-DM1或5mg/kg的huCD20-7-SPP-DM1处理小鼠1次。图35A中绘制了不同处理组中存活小鼠的数量。小鼠PBS处理组的中值存活期为27天。huCD20-7处理引起中值存活期增加至45天。与抗体相比，两种偶联物均引起中值存活期进一步增加。huCD20-7-SMCC-DM1和huCD20-7-SPP-DM1分别产生64天和58天的中值存活期。
在使用经静脉内植入SCID小鼠体内的Daudi淋巴瘤细胞的相似异种移植模型中，在细胞接种后第7天用10mg/kg的huCD20-7、利妥昔单抗、huCH20-7-SMCC-DM1或huCH20-7-BMPS-DM1处理小鼠。图35B中绘制了不同处理组中存活小鼠的数量。小鼠PBS处理组的中值存活期为31天，huCD20-7处理引起中值存活期增加至49天。相反，利妥昔单抗处理引起中值存活期增加至仅40天。与抗体相比，两种基于huCD20-7的偶联物引起存活期进一步增加，在第5天huCH20-7-SMCC-DM1和huCH20-7-BMPS-DM1分别引起90％和100％存活。
DOHH-2异种移植模型中huCD20-7抗体和-SPP-DM1和SMCC-DM1偶联物的体内功效
在使用经皮下植入SCID小鼠体内的DOHH-2滤泡性淋巴瘤细胞的可预先触知异种移植模型中测试示例性huCD20-7抗体及其偶联物。按体重将小鼠随机分为处理组并且在细胞接种后第3天用10mg/kg的huCD20-7、10mg/kg 的huCD20-7-SMCC-DM1或5mg/kg的huCD20-7-SPP-DM1处理小鼠。图36中绘制了不同处理组的中值肿瘤体积。与PBS对照相比，huCD20-7抗体处理引起中值肿瘤体积减小。与未偶联抗体相比，发现huCD20-7偶联物功效增强。在第90天研究结束时，huCD20-7处理10只中产生2只无瘤存活小鼠(TFS)，而huCD20-7-SMCC-DM1处理10只中产生6只TFS并且huCD20-7-SPP-DM1处理10只中产生10只TFS。在PBS对照组中未观察到TFS。
基于huCD20-7的偶联物的体内功效的总结
先前已经描述了CD20抗体的偶联物。在一种情况下，抗CD20抗体的不可裂解SMCC-DM1偶联物显示出与未偶联抗体相同的功效，而相同抗体的可裂解SPP-DM1偶联物在SCID小鼠的Granta-519异种移植模型中显示出更强的功效(Polson等，见上文)。类似地，用酸稳定酰胺连接子制备的利妥昔单抗的卡奇霉素偶联物在裸小鼠的Ramos异种移植模型中并未显示出更强的体内功效。只有用酸不稳定二甲基酰肼Ac-But连接子制备的利妥昔单抗的卡奇霉素偶联物在该项研究中显示出更强的体内功效(DiJoseph等，见上文)。
令人惊讶地，与未偶联抗体相比，huCD20-7的不可裂解偶联物，例如SMCC-DM1或BMPS-DM1偶联物在2个不同异种移植模型中显示出明显增强的体内功效。另外，与未偶联抗体相比，huCD20-7的可裂解偶联物，例如SPP-DM1偶联物表现出同样增强的体内功效。例如，huCD20-7是具有使其在体内作为不可裂解偶联物更有效的独特物理和功能性质的抗体。
虽然已参考其特定方面详细描述了本发明，但是对于本领域中的技术人员显而易见的是，在不脱离本发明精神和范围的情况下可对本发明做各种改变和修改。

Claims (21)

1.一种特异性结合CD20的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或片段包含轻链可变区和重链可变区，其中所述轻链可变区的CDR1、CDR2和CDR3分别如SEQ ID NO：25-27的氨基酸序列所示，和其中所述重链可变区的CDR1、CDR2和CDR3分别如SEQ ID NO：28-30的氨基酸序列所示。
2.根据权利要求1所述的抗体或片段，其中所述抗体或片段为人源化或人抗体或片段。
3.根据权利要求1所述的抗体或片段，其中所述抗体或片段为嵌合、表面重塑或鼠抗体或片段。
4.根据权利要求1所述的抗体或其片段，其中所述抗体或片段特异性结合位于CD20第3个和第4个跨膜结构域之间的至少一个氨基酸。
5.根据权利要求1所述的抗体或其片段，其中所述抗体或片段特异性结合SEQ ID NO:45的包含位置163处的天冬酰胺或位置166处的天冬酰胺的表位。
6.根据权利要求1所述的抗体或其片段，其中所述重链可变区如SEQ IDNO:47的氨基酸序列所示。
7.根据权利要求1所述的抗体或其片段，其中所述轻链可变区如SEQ IDNO:46的氨基酸序列所示。
8.根据权利要求7所述的抗体或其片段，其中其中所述重链可变区如SEQ ID NO:47的氨基酸序列所示和所述轻链可变区如SEQ ID NO:46的氨基酸序列所示。
9.一种抗体或其抗原结合片段，其由ATCC登录号PTA-10486的杂交瘤产生。
10.一种偶联物，其包含与细胞毒性剂连接的根据权利要求1-9任一项所述的抗体或其片段，其中所述细胞毒性剂选自类美坦素、类美坦素类似物、苯二氮紫杉烷、CC-1065、CC-1065类似物、倍癌霉素、倍癌霉素类似物、卡奇霉素、海兔毒素、海兔毒素类似物、阿里他汀、茅屋霉素衍生物和来普霉素衍生物。
11.根据权利要求10所述的偶联物，其中所述抗体或其片段与所述细胞毒性剂的连接通过选自3-(2-吡啶二硫代)丙酸N-琥珀酰亚胺酯、4-(2-吡啶二硫代)丁酸N-琥珀酰亚胺酯、4-(2-吡啶二硫代)2-磺基丁酸N-琥珀酰亚胺酯、4-(2-吡啶二硫代)戊酸N-琥珀酰亚胺酯、2-亚氨基硫烷和乙酰琥珀酰酐的连接子。
12.根据权利要求10所述的偶联物，其中所述抗体或其片段与所述细胞毒性剂的连接通过选自4-(马来酰亚胺基甲基)环己烷羧酸N-琥珀酰亚胺酯、N-琥珀酰亚胺基-4-(N-马来酰亚胺基甲基)-环己烷-1-羧基-(6-酰胺基己酸酯)、κ-马来酰亚胺基十一烷酸N-琥珀酰亚胺酯、β-马来酰亚胺丙酸N-琥珀酰亚胺酯、γ-马来酰亚胺丁酸N-琥珀酰亚胺基酯、ε-马来酰亚胺基己酸N-羟基琥珀酰亚胺酯、间马来酰亚胺苯甲酰基-N-羟基琥珀酰亚胺酯、N-(α-马来酰亚胺基乙酰氧基)-琥珀酰亚胺酯、6-(β-马来酰亚胺丙酰胺基)己酸琥珀酰亚胺酯、4-(对马来酰亚胺基苯基)-丁酸N-琥珀酰亚胺酯、N-(对马来酰亚胺基苯基)异氰酸酯、4-(碘乙酰基)-氨基苯甲酸N-琥珀酰亚胺酯、碘代乙酸N-琥珀酰亚胺酯、溴代乙酸N-琥珀酰亚胺酯和3-(溴乙酰胺基)丙酸N-琥珀酰亚胺酯的连接子。
13.根据权利要求10所述的偶联物，其中所述类美坦素是DM1或DM4。
14.根据权利要求13所述的偶联物，其中所述类美坦素是DM1且其中所述抗体或其片段与所述DM1的连接通过连接子4-(马来酰亚胺基甲基)环己烷羧酸N-琥珀酰亚胺酯、4-(2-吡啶二硫代)丁酸N-琥珀酰亚胺酯或4-(2-吡啶二硫代)-2-磺基丁酸N-琥珀酰亚胺酯。
15.一种用于治疗表达CD20的白血病或淋巴瘤的药物组合物，其包含根据权利要求1-9任一项所述的抗体或其片段和药学上可接受的载体。
16.一种用于治疗表达CD20的白血病或淋巴瘤的药物组合物，其包含根据权利要求10所述的偶联物和药学上可接受的载体。
17.一种包含根据权利要求1-9任一项所述的抗体或其片段的诊断试剂。
18.一种体外抑制CD20表达白血病或淋巴瘤细胞的生长的方法，所述方法包括使所述细胞与根据权利要求1-9任一项所述的抗体或其片段接触。
19.根据权利要求10所述的偶联物在制备用于治疗白血病或淋巴瘤的药物中的用途，其中所述白血病或淋巴瘤细胞表达CD20。
20.根据权利要求1-9任一项所述的抗体或其片段在制备用于治疗白血病或淋巴瘤的药物中的用途，其中所述白血病或淋巴瘤细胞表达CD20。
21.一种多核苷酸，其编码根据权利要求1-9任一项所述的抗体或其片段的轻链或重链可变区。
CN201510382067.0A 2010-02-10 2011-02-10 Cd20抗体及其用途 Pending CN105001334A (zh)

Applications Claiming Priority (5)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US30324910P 2010-02-10 2010-02-10
US61/303,249 2010-02-10
US40646410P 2010-10-25 2010-10-25
US61/406,464 2010-10-25
CN201180013918.4A CN102933231B (zh) 2010-02-10 2011-02-10 Cd20抗体及其用途

Related Parent Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201180013918.4A Division CN102933231B (zh) 2010-02-10 2011-02-10 Cd20抗体及其用途

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN105001334A true CN105001334A (zh) 2015-10-28

Family

ID=44353889

Family Applications (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201510382067.0A Pending CN105001334A (zh) 2010-02-10 2011-02-10 Cd20抗体及其用途
CN201180013918.4A Expired - Fee Related CN102933231B (zh) 2010-02-10 2011-02-10 Cd20抗体及其用途

Family Applications After (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201180013918.4A Expired - Fee Related CN102933231B (zh) 2010-02-10 2011-02-10 Cd20抗体及其用途

Country Status (14)

Country Link
US (2) US9173961B2 (zh)
EP (1) EP2533810B1 (zh)
JP (1) JP5841072B2 (zh)
KR (1) KR20130009760A (zh)
CN (2) CN105001334A (zh)
AR (1) AR080154A1 (zh)
AU (1) AU2011215900A1 (zh)
BR (1) BR112012020102A2 (zh)
CA (1) CA2789629A1 (zh)
HK (1) HK1216540A1 (zh)
MX (1) MX341687B (zh)
RU (1) RU2573994C2 (zh)
TW (1) TW201129384A (zh)
WO (1) WO2011100403A1 (zh)

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN105963711A (zh) * 2016-06-20 2016-09-28 杭州皓阳生物技术有限公司 一种抗人cd20单克隆抗体-dm1偶联物及其制备方法
CN110088135A (zh) * 2016-12-20 2019-08-02 豪夫迈·罗氏有限公司 抗cd20/抗cd3双特异性抗体和4-1bb(cd137)激动剂的组合疗法
CN111133007A (zh) * 2017-09-13 2020-05-08 特尼奥生物股份有限公司 与胞外酶结合的重链抗体

Families Citing this family (67)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP1355666B1 (en) 2000-12-22 2012-06-13 Max-Planck-Gesellschaft zur Förderung der Wissenschaften e.V. Use of repulsive guidance molecule (RGM) and its modulators
US7612181B2 (en) 2005-08-19 2009-11-03 Abbott Laboratories Dual variable domain immunoglobulin and uses thereof
EP1928905B1 (de) 2005-09-30 2015-04-15 AbbVie Deutschland GmbH & Co KG Bindungsdomänen von proteinen der repulsive guidance molecule (rgm) proteinfamilie und funktionale fragmente davon sowie deren verwendung
US8962803B2 (en) 2008-02-29 2015-02-24 AbbVie Deutschland GmbH & Co. KG Antibodies against the RGM A protein and uses thereof
DK2510001T3 (en) 2009-12-08 2016-02-29 Abbvie Deutschland MONOCLONAL ANTIBODIES AGAINST RGM A PROTEIN USED TO TREAT DEGENERATION OF THE RETINAL NERVE FIBER LAYER
AR080155A1 (es) * 2010-02-10 2012-03-14 Immunogen Inc Anticuerpos anti-cd20 y su utilizacion
RU2742743C2 (ru) 2010-03-12 2021-02-10 Дебиофарм Интернешнл, С.А. Cd37-связывающие молекулы и их иммуноконъюгаты
WO2012177837A2 (en) 2011-06-21 2012-12-27 Immunogen, Inc. Novel maytansinoid derivatives with peptide linker and conjugates thereof
JP2014523884A (ja) * 2011-06-24 2014-09-18 セントローズ， エルエルシー 細胞外標的化薬物複合体
AU2012275390A1 (en) 2011-06-28 2014-01-16 Whitehead Institute For Biomedical Research Using sortases to install click chemistry handles for protein ligation
CN102435728B (zh) * 2011-09-07 2014-06-25 福州大学 一种用于免疫组化过程质量检控的阳性参照物的制备方法
UA118083C2 (uk) 2012-01-27 2018-11-26 Еббві Дойчланд Гмбх Унд Ко. Кг ВИДІЛЕНЕ МОНОКЛОНАЛЬНЕ АНТИТІЛО ПРОТИ МОЛЕКУЛИ ВІДШТОВХУВАЛЬНОГО НАПРЯМНОГО СИГНАЛУ (RGMa) ТА ЙОГО ЗАСТОСУВАННЯ В ЛІКУВАННІ РОЗЛАДУ, АСОЦІЙОВАНОГО З ДЕГЕНЕРАЦІЄЮ НЕЙРИТІВ
KR20200110711A (ko) * 2012-09-07 2020-09-24 제넨테크, 인크. Ｉｉ형 항-ｃｄ20 항체와 선택적 ｂｃｌ-2 억제제와의 병용 치료요법
SI2766048T1 (sl) 2012-10-12 2015-03-31 Spirogen Sarl Pirolobenzodiazepini in njihovi konjugati
WO2014089177A2 (en) 2012-12-04 2014-06-12 Massachusetts Institute Of Technology Compounds, conjugates and compositions of epipolythiodiketopiperazines and polythiodiketopiperazines
CN103333245B (zh) * 2012-12-21 2015-03-18 百奥泰生物科技(广州)有限公司 一种针对细胞受体并抑制癌细胞生长的药物分子及其制备方法和用途
WO2014114801A1 (en) * 2013-01-25 2014-07-31 Amgen Inc. Antibodies targeting cdh19 for melanoma
BR112015021965B1 (pt) 2013-03-13 2022-05-03 Medimmune Limited Conjugados e compostos de pirrolobenzodiazepinas, composição farmacêutica, uso dos mesmos para o tratamento de uma doença proliferativa e método de síntese dos ditos compostos
CA2901941C (en) 2013-03-13 2020-04-07 Spirogen Sarl Pyrrolobenzodiazepines and conjugates thereof
CN103254317B (zh) * 2013-05-08 2014-08-13 浙江大学 一种抗cd20单克隆抗体-海兔毒素偶联物及其制备方法和应用
EP4119662A1 (en) 2013-05-10 2023-01-18 Whitehead Institute For Biomedical Research Protein modification of living cells using sortase
US10471099B2 (en) 2013-05-10 2019-11-12 Whitehead Institute For Biomedical Research In vitro production of red blood cells with proteins comprising sortase recognition motifs
AU2014283185B2 (en) * 2013-06-21 2019-05-02 Innate Pharma Enzymatic conjugation of polypeptides
CN104341503A (zh) * 2013-07-29 2015-02-11 西藏海思科药业集团股份有限公司 对蒙古人种和高加索人种低免疫原性的、抗cd20的人抗体
WO2015073746A2 (en) 2013-11-13 2015-05-21 Whitehead Institute For Biomedical Research 18f labeling of proteins using sortases
WO2015118538A1 (en) 2014-02-06 2015-08-13 Yeda Research And Development Co. Ltd. Anti cd84 antibodies, compositions comprising same and uses thereof
CN103880958B (zh) * 2014-03-27 2016-01-20 安徽大学 抗cd20抗原的抗体l4h6及其应用
CN103880957B (zh) * 2014-03-27 2016-01-20 安徽大学 抗cd20抗原的抗体l1h1及其应用
PL3560954T3 (pl) 2014-04-03 2021-12-13 Igm Biosciences, Inc. Zmodyfikowany łańcuch J
CA2950926A1 (en) * 2014-06-13 2015-12-17 Mayo Foundation For Medical Education And Research Albumin-bound paclitaxel nanoparticle/rituximab complexes for treatment of cd20-expressing lymphomas
GB201416112D0 (en) 2014-09-12 2014-10-29 Medimmune Ltd Pyrrolobenzodiazepines and conjugates thereof
CN104391114B (zh) * 2014-11-13 2016-06-22 中国医学科学院肿瘤医院 Elisa方法定量测定人血清中重组人鼠嵌合抗cd20单克隆抗体浓度
ES2874558T3 (es) 2015-03-04 2021-11-05 Igm Biosciences Inc Moléculas de unión a CD20 y usos de las mismas
SG10202108116SA (en) 2015-06-08 2021-08-30 Debiopharm International S A Anti-cd37 immunoconjugate and anti-cd20 antibody combinations
MA42706A (fr) 2015-08-28 2021-04-14 Debiopharm Int Sa Anticorps et dosages pour la détection de cd37
CN108463472A (zh) 2015-09-30 2018-08-28 Igm生物科学有限公司 具有修饰的j-链的结合分子
AU2016329197B2 (en) 2015-09-30 2021-01-21 Igm Biosciences, Inc. Binding molecules with modified J-chain
EP4218833A1 (en) * 2015-10-01 2023-08-02 Whitehead Institute for Biomedical Research Labeling of antibodies
AR106188A1 (es) 2015-10-01 2017-12-20 Hoffmann La Roche Anticuerpos anti-cd19 humano humanizados y métodos de utilización
CN105678109A (zh) * 2016-01-11 2016-06-15 天津师范大学 一种基于邻接蛋白的蛋白功能注释方法
JP6902548B2 (ja) 2016-01-15 2021-07-14 バークレー ライツ，インコーポレイテッド 患者特異的抗癌治療剤の製造方法及びその治療方法
GB201601431D0 (en) 2016-01-26 2016-03-09 Medimmune Ltd Pyrrolobenzodiazepines
GB201602356D0 (en) 2016-02-10 2016-03-23 Medimmune Ltd Pyrrolobenzodiazepine Conjugates
GB201602359D0 (en) 2016-02-10 2016-03-23 Medimmune Ltd Pyrrolobenzodiazepine Conjugates
GB201607478D0 (en) 2016-04-29 2016-06-15 Medimmune Ltd Pyrrolobenzodiazepine Conjugates
WO2017197045A1 (en) 2016-05-11 2017-11-16 Movassaghi Mohammad Convergent and enantioselective total synthesis of communesin analogs
GB201617466D0 (en) 2016-10-14 2016-11-30 Medimmune Ltd Pyrrolobenzodiazepine conjugates
JP2020510608A (ja) 2016-11-02 2020-04-09 デビオファーム インターナショナル， エス． アー． 抗ｃｄ３７イムノコンジュゲート療法を改善するための方法
AU2017370942A1 (en) 2016-12-07 2019-06-13 Progenity Inc. Gastrointestinal tract detection methods, devices and systems
BR112019016373B1 (pt) 2017-02-08 2022-01-25 Medimmune Limited Conjugado anticorpo-fármaco que se liga ao axl, composição e composição farmacêutica que compreende o mesmo e uso terapêutico do dito conjugado
GB201702031D0 (en) 2017-02-08 2017-03-22 Medlmmune Ltd Pyrrolobenzodiazepine-antibody conjugates
EP3600416B1 (en) 2017-03-30 2023-06-07 Biora Therapeutics, Inc. Treatment of a disease of the gastrointestinal tract with an immune modulatory agent released using an ingestible device
PT3612537T (pt) 2017-04-18 2022-08-29 Medimmune Ltd Conjugados de pirrolobenzodiazepina
WO2018209239A1 (en) 2017-05-11 2018-11-15 Massachusetts Institute Of Technology Potent agelastatin derivatives as modulators for cancer invasion and metastasis
EA039276B1 (ru) 2017-08-18 2021-12-27 Медимьюн Лимитед Пирролобензодиазепиновые конъюгаты
US10640508B2 (en) 2017-10-13 2020-05-05 Massachusetts Institute Of Technology Diazene directed modular synthesis of compounds with quaternary carbon centers
RU2696096C2 (ru) * 2017-12-07 2019-07-31 Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования "Московский государственный университет имени М.В. Ломоносова" (МГУ) Низкомолекулярные конъюгаты противоопухолевых агентов и высокоселективных лигандов асиалогликопротеинового рецептора для терапии онкологических патологий печени
GB201803342D0 (en) 2018-03-01 2018-04-18 Medimmune Ltd Methods
GB201806022D0 (en) 2018-04-12 2018-05-30 Medimmune Ltd Pyrrolobenzodiazepines and conjugates thereof
WO2019246317A1 (en) 2018-06-20 2019-12-26 Progenity, Inc. Treatment of a disease or condition in a tissue originating from the endoderm
US20230041197A1 (en) 2018-06-20 2023-02-09 Progenity, Inc. Treatment of a disease of the gastrointestinal tract with an immunomodulator
EP3883635A1 (en) 2018-11-19 2021-09-29 Progenity, Inc. Methods and devices for treating a disease with biotherapeutics
US11535634B2 (en) 2019-06-05 2022-12-27 Massachusetts Institute Of Technology Compounds, conjugates, and compositions of epipolythiodiketopiperazines and polythiodiketopiperazines and uses thereof
KR20220045047A (ko) * 2019-08-19 2022-04-12 션양 파마슈티컬 유니버시티 항체 변이체 및 이의 적용
US11707610B2 (en) 2019-12-13 2023-07-25 Biora Therapeutics, Inc. Ingestible device for delivery of therapeutic agent to the gastrointestinal tract
EP4240494A1 (en) 2020-11-06 2023-09-13 Novartis AG Anti-cd19 agent and b cell targeting agent combination therapy for treating b cell malignancies
CN112924665B (zh) * 2021-02-19 2023-10-03 山东莱博生物科技有限公司 一种抗体辣根过氧化物酶标记物及其制备与应用

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20020034765A1 (en) * 1991-05-17 2002-03-21 Merck & Co., Inc. Method for reducing the immunogenicity of antibody variable domains
US20040167319A1 (en) * 2002-10-17 2004-08-26 Jessica Teeling Human monoclonal antibodies against CD20
CN101282993A (zh) * 2005-06-02 2008-10-08 阿斯利康公司 针对cd20的抗体和其用途

Family Cites Families (438)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US2429001A (en) 1946-12-28 1947-10-14 Axel H Stone Artificial hand
FR2413974A1 (fr) 1978-01-06 1979-08-03 David Bernard Sechoir pour feuilles imprimees par serigraphie
US4307016A (en) 1978-03-24 1981-12-22 Takeda Chemical Industries, Ltd. Demethyl maytansinoids
US4256746A (en) 1978-11-14 1981-03-17 Takeda Chemical Industries Dechloromaytansinoids, their pharmaceutical compositions and method of use
JPS55102583A (en) 1979-01-31 1980-08-05 Takeda Chem Ind Ltd 20-acyloxy-20-demethylmaytansinoid compound
JPS55162791A (en) 1979-06-05 1980-12-18 Takeda Chem Ind Ltd Antibiotic c-15003pnd and its preparation
JPS5645483A (en) 1979-09-19 1981-04-25 Takeda Chem Ind Ltd C-15003phm and its preparation
JPS5645485A (en) 1979-09-21 1981-04-25 Takeda Chem Ind Ltd Production of c-15003pnd
EP0028683A1 (en) 1979-09-21 1981-05-20 Takeda Chemical Industries, Ltd. Antibiotic C-15003 PHO and production thereof
WO1982001188A1 (en) 1980-10-08 1982-04-15 Takeda Chemical Industries Ltd 4,5-deoxymaytansinoide compounds and process for preparing same
US4450254A (en) 1980-11-03 1984-05-22 Standard Oil Company Impact improvement of high nitrile resins
US4315929A (en) 1981-01-27 1982-02-16 The United States Of America As Represented By The Secretary Of Agriculture Method of controlling the European corn borer with trewiasine
US4313946A (en) 1981-01-27 1982-02-02 The United States Of America As Represented By The Secretary Of Agriculture Chemotherapeutically active maytansinoids from Trewia nudiflora
US4563304A (en) 1981-02-27 1986-01-07 Pharmacia Fine Chemicals Ab Pyridine compounds modifying proteins, polypeptides or polysaccharides
JPS57192389A (en) 1981-05-20 1982-11-26 Takeda Chem Ind Ltd Novel maytansinoid
US4474893A (en) 1981-07-01 1984-10-02 The University of Texas System Cancer Center Recombinant monoclonal antibodies
US4714681A (en) 1981-07-01 1987-12-22 The Board Of Reagents, The University Of Texas System Cancer Center Quadroma cells and trioma cells and methods for the production of same
US4427588A (en) 1982-11-08 1984-01-24 Bristol-Myers Company Process for conversion of oxotomaymycin to tomaymycin
US4816567A (en) 1983-04-08 1989-03-28 Genentech, Inc. Recombinant immunoglobin preparations
US4699880A (en) 1984-09-25 1987-10-13 Immunomedics, Inc. Method of producing monoclonal anti-idiotype antibody
JPS61109717A (ja) 1984-11-02 1986-05-28 Teruhiko Beppu 抗腫瘍剤
EP1186660A3 (fr) 1985-03-30 2002-03-20 KAUFFMAN, Stuart A. Procédé d'obtension d'ADN, ARN, peptides, polypeptides ou protéines, par une technique de recombination d'ADN
US6492107B1 (en) 1986-11-20 2002-12-10 Stuart Kauffman Process for obtaining DNA, RNA, peptides, polypeptides, or protein, by recombinant DNA technique
SE448277B (sv) 1985-04-12 1987-02-09 Draco Ab Indikeringsanordning vid en doseringsanordning for lekemedel
US4676980A (en) 1985-09-23 1987-06-30 The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services Target specific cross-linked heteroantibodies
US5618920A (en) 1985-11-01 1997-04-08 Xoma Corporation Modular assembly of antibody genes, antibodies prepared thereby and use
US5576195A (en) 1985-11-01 1996-11-19 Xoma Corporation Vectors with pectate lyase signal sequence
DE3600905A1 (de) 1986-01-15 1987-07-16 Ant Nachrichtentech Verfahren zum dekodieren von binaersignalen sowie viterbi-dekoder und anwendungen
SE453566B (sv) 1986-03-07 1988-02-15 Draco Ab Anordning vid pulverinhalatorer
GB8607679D0 (en) 1986-03-27 1986-04-30 Winter G P Recombinant dna product
US5225539A (en) 1986-03-27 1993-07-06 Medical Research Council Recombinant altered antibodies and methods of making altered antibodies
JPH0684377B1 (zh) 1986-04-17 1994-10-26 Kyowa Hakko Kogyo Kk
US4946778A (en) 1987-09-21 1990-08-07 Genex Corporation Single polypeptide chain binding molecules
US5260203A (en) 1986-09-02 1993-11-09 Enzon, Inc. Single polypeptide chain binding molecules
US4704692A (en) 1986-09-02 1987-11-03 Ladner Robert C Computer based system and method for determining and displaying possible chemical structures for converting double- or multiple-chain polypeptides to single-chain polypeptides
US6893625B1 (en) 1986-10-27 2005-05-17 Royalty Pharma Finance Trust Chimeric antibody with specificity to human B cell surface antigen
IL85035A0 (en) 1987-01-08 1988-06-30 Int Genetic Eng Polynucleotide molecule,a chimeric antibody with specificity for human b cell surface antigen,a process for the preparation and methods utilizing the same
EP0832981A1 (en) 1987-02-17 1998-04-01 Pharming B.V. DNA sequences to target proteins to the mammary gland for efficient secretion
DE3883899T3 (de) 1987-03-18 1999-04-22 Sb2 Inc Geänderte antikörper.
US4873316A (en) 1987-06-23 1989-10-10 Biogen, Inc. Isolation of exogenous recombinant proteins from the milk of transgenic mammals
US4975278A (en) 1988-02-26 1990-12-04 Bristol-Myers Company Antibody-enzyme conjugates in combination with prodrugs for the delivery of cytotoxic agents to tumor cells
US4939666A (en) 1987-09-02 1990-07-03 Genex Corporation Incremental macromolecule construction methods
US5677425A (en) 1987-09-04 1997-10-14 Celltech Therapeutics Limited Recombinant antibody
US5053394A (en) 1988-09-21 1991-10-01 American Cyanamid Company Targeted forms of methyltrithio antitumor agents
US4994578A (en) 1987-11-27 1991-02-19 Meiji Seika Kaisha, Ltd. Certain anti-tumor duocarmycin antibiotics from streptomyces
US5506126A (en) 1988-02-25 1996-04-09 The General Hospital Corporation Rapid immunoselection cloning method
WO1989008114A1 (en) 1988-02-25 1989-09-08 The General Hospital Corporation Rapid immunoselection cloning method
IL89489A0 (en) 1988-03-09 1989-09-10 Hybritech Inc Chimeric antibodies directed against human carcinoembryonic antigen
US4861579A (en) 1988-03-17 1989-08-29 American Cyanamid Company Suppression of B-lymphocytes in mammals by administration of anti-B-lymphocyte antibodies
US6010902A (en) 1988-04-04 2000-01-04 Bristol-Meyers Squibb Company Antibody heteroconjugates and bispecific antibodies for use in regulation of lymphocyte activity
EP0362371A4 (en) 1988-04-15 1990-10-24 Protein Design Labs, Inc. Il-2 receptor-specific chimeric antibodies
ATE119198T1 (de) 1988-04-16 1995-03-15 Celltech Ltd Verfahren zur herstellung von proteinen mittels rekombinanter dna.
US4925648A (en) 1988-07-29 1990-05-15 Immunomedics, Inc. Detection and treatment of infectious and inflammatory lesions
US5601819A (en) 1988-08-11 1997-02-11 The General Hospital Corporation Bispecific antibodies for selective immune regulation and for selective immune cell binding
US5223409A (en) 1988-09-02 1993-06-29 Protein Engineering Corp. Directed evolution of novel binding proteins
GB8823869D0 (en) 1988-10-12 1988-11-16 Medical Res Council Production of antibodies
US5076973A (en) 1988-10-24 1991-12-31 Arizona Board Of Regents Synthesis of dolastatin 3
US5750373A (en) 1990-12-03 1998-05-12 Genentech, Inc. Enrichment method for variant proteins having altered binding properties, M13 phagemids, and growth hormone variants
GB8827305D0 (en) 1988-11-23 1988-12-29 British Bio Technology Compounds
US5530101A (en) 1988-12-28 1996-06-25 Protein Design Labs, Inc. Humanized immunoglobulins
US4978744A (en) 1989-01-27 1990-12-18 Arizona Board Of Regents Synthesis of dolastatin 10
DE3909708A1 (de) 1989-03-23 1990-09-27 Boehringer Mannheim Gmbh Verfahren zur herstellung bispezifischer antikoerper
CA2016841C (en) 1989-05-16 1999-09-21 William D. Huse A method for producing polymers having a preselected activity
US6291158B1 (en) 1989-05-16 2001-09-18 Scripps Research Institute Method for tapping the immunological repertoire
CA2016842A1 (en) 1989-05-16 1990-11-16 Richard A. Lerner Method for tapping the immunological repertoire
WO1990014443A1 (en) 1989-05-16 1990-11-29 Huse William D Co-expression of heteromeric receptors
US4879278A (en) 1989-05-16 1989-11-07 Arizona Board Of Regents Isolation and structural elucidation of the cytostatic linear depsipeptide dolastatin 15
US4986988A (en) 1989-05-18 1991-01-22 Arizona Board Of Regents Isolation and structural elucidation of the cytostatic linear depsipeptides dolastatin 13 and dehydrodolastatin 13
DE3920358A1 (de) 1989-06-22 1991-01-17 Behringwerke Ag Bispezifische und oligospezifische, mono- und oligovalente antikoerperkonstrukte, ihre herstellung und verwendung
EP0479909B1 (en) 1989-06-29 1996-10-30 Medarex, Inc. Bispecific reagents for aids therapy
DE69032483T2 (de) 1989-10-05 1998-11-26 Optein Inc Zellfreie synthese und isolierung von genen und polypeptiden
US5208020A (en) 1989-10-25 1993-05-04 Immunogen Inc. Cytotoxic agents comprising maytansinoids and their therapeutic use
US5138036A (en) 1989-11-13 1992-08-11 Arizona Board Of Regents Acting On Behalf Of Arizona State University Isolation and structural elucidation of the cytostatic cyclodepsipeptide dolastatin 14
SG48759A1 (en) 1990-01-12 2002-07-23 Abgenix Inc Generation of xenogenic antibodies
TW212184B (zh) 1990-04-02 1993-09-01 Takeda Pharm Industry Co Ltd
US5427908A (en) 1990-05-01 1995-06-27 Affymax Technologies N.V. Recombinant library screening methods
CA2084307A1 (en) 1990-06-01 1991-12-02 Cetus Oncology Corporation Compositions and methods for identifying biologically active molecules
US5723286A (en) 1990-06-20 1998-03-03 Affymax Technologies N.V. Peptide library and screening systems
ATE204902T1 (de) 1990-06-29 2001-09-15 Large Scale Biology Corp Melaninproduktion durch transformierte mikroorganismen
US5789650A (en) 1990-08-29 1998-08-04 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals for producing heterologous antibodies
DE69133476T2 (de) 1990-08-29 2006-01-05 GenPharm International, Inc., Palo Alto Transgene Mäuse fähig zur Produktion heterologer Antikörper
US5625126A (en) 1990-08-29 1997-04-29 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals for producing heterologous antibodies
US5661016A (en) 1990-08-29 1997-08-26 Genpharm International Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies of various isotypes
US5770429A (en) 1990-08-29 1998-06-23 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies
US5633425A (en) 1990-08-29 1997-05-27 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies
US6300129B1 (en) 1990-08-29 2001-10-09 Genpharm International Transgenic non-human animals for producing heterologous antibodies
US5545806A (en) 1990-08-29 1996-08-13 Genpharm International, Inc. Ransgenic non-human animals for producing heterologous antibodies
WO1992005258A1 (en) 1990-09-20 1992-04-02 La Trobe University Gene encoding barley enzyme
ATE160379T1 (de) 1990-10-29 1997-12-15 Chiron Corp Bispezifische antikörper, verfahren zu ihrer herstellung und deren verwendungen
US5582996A (en) 1990-12-04 1996-12-10 The Wistar Institute Of Anatomy & Biology Bifunctional antibodies and method of preparing same
EP0572529A4 (en) 1991-02-21 1994-11-02 Gilead Sciences Inc SPECIFIC APTAMER OF BIOMOLECULES AND PROCESS FOR PRODUCING THE SAME.
US5404871A (en) 1991-03-05 1995-04-11 Aradigm Delivery of aerosol medications for inspiration
US20070298040A1 (en) 1991-03-18 2007-12-27 Centocor, Inc. Methods of treating seronegative arthropathy with anti-TNF antibodies
US6284471B1 (en) 1991-03-18 2001-09-04 New York University Medical Center Anti-TNFa antibodies and assays employing anti-TNFa antibodies
AU665758B2 (en) 1991-04-26 1996-01-18 Surface Active Limited Novel antibodies, and methods for their use
EP0586505A1 (en) 1991-05-14 1994-03-16 Repligen Corporation Heteroconjugate antibodies for treatment of hiv infection
DE4118120A1 (de) 1991-06-03 1992-12-10 Behringwerke Ag Tetravalente bispezifische rezeptoren, ihre herstellung und verwendung
DK0590058T3 (da) 1991-06-14 2004-03-29 Genentech Inc Humaniseret heregulin-antistof
US5637481A (en) 1993-02-01 1997-06-10 Bristol-Myers Squibb Company Expression vectors encoding bispecific fusion proteins and methods of producing biologically active bispecific fusion proteins in a mammalian cell
AU662919B2 (en) 1991-07-02 1995-09-21 Inhale, Inc. Method and device for delivering aerosolized medicaments
US5270170A (en) 1991-10-16 1993-12-14 Affymax Technologies N.V. Peptide library and screening method
WO1993008829A1 (en) 1991-11-04 1993-05-13 The Regents Of The University Of California Compositions that mediate killing of hiv-infected cells
JPH07501451A (ja) 1991-11-25 1995-02-16 エンゾン・インコーポレイテッド 多価抗原結合タンパク質
US5932448A (en) 1991-11-29 1999-08-03 Protein Design Labs., Inc. Bispecific antibody heterodimers
ATE463573T1 (de) 1991-12-02 2010-04-15 Medimmune Ltd Herstellung von autoantikörpern auf phagenoberflächen ausgehend von antikörpersegmentbibliotheken
ATE249840T1 (de) 1991-12-13 2003-10-15 Xoma Corp Verfahren und materialien zur herstellung von modifizierten variablen antikörperdomänen und ihre therapeutische verwendung
WO1993016185A2 (en) 1992-02-06 1993-08-19 Creative Biomolecules, Inc. Biosynthetic binding protein for cancer marker
DK0627940T3 (da) 1992-03-05 2003-09-01 Univ Texas Anvendelse af immunokonjugater til diagnose og/eller terapi af vaskulariserede tumorer
DE4207475A1 (de) 1992-03-10 1993-09-16 Goldwell Ag Mittel zum blondieren von menschlichen haaren und verfahren zu dessen herstellung
EP0563475B1 (en) 1992-03-25 2000-05-31 Immunogen Inc Cell binding agent conjugates of derivatives of CC-1065
AU4025193A (en) 1992-04-08 1993-11-18 Cetus Oncology Corporation Humanized C-erbB-2 specific antibodies
ZA932522B (en) 1992-04-10 1993-12-20 Res Dev Foundation Immunotoxins directed against c-erbB-2(HER/neu) related surface antigens
CA2118508A1 (en) 1992-04-24 1993-11-11 Elizabeth S. Ward Recombinant production of immunoglobulin-like domains in prokaryotic cells
DE69308573T2 (de) 1992-08-17 1997-08-07 Genentech Inc Bispezifische immunoadhesine
US5639641A (en) 1992-09-09 1997-06-17 Immunogen Inc. Resurfacing of rodent antibodies
WO1994006498A1 (en) 1992-09-23 1994-03-31 Fisons Plc Inhalation device
AU5322494A (en) 1992-10-02 1994-04-26 Trustees Of Dartmouth College Bispecific reagents for redirected targeting of low density lipoprotein
DK0665759T3 (da) 1992-10-19 1999-08-23 Dura Pharma Inc Tørpulverinhalator
JP3095175B2 (ja) 1992-11-13 2000-10-03 アイデック ファーマシューティカルズ コーポレイション Ｂ細胞リンパ腫の治療のためのヒトｂリンパ球限定分化抗原に対するキメラ抗体と放射能標識抗体の療法利用
US5736137A (en) 1992-11-13 1998-04-07 Idec Pharmaceuticals Corporation Therapeutic application of chimeric and radiolabeled antibodies to human B lymphocyte restricted differentiation antigen for treatment of B cell lymphoma
CA2149326C (en) 1992-11-13 2007-04-17 Mitchell E. Reff Fully impaired consensus kozak sequences for mammalian expression
US5648267A (en) 1992-11-13 1997-07-15 Idec Pharmaceuticals Corporation Impaired dominant selectable marker sequence and intronic insertion strategies for enhancement of expression of gene product and expression vector systems comprising same
US7744877B2 (en) 1992-11-13 2010-06-29 Biogen Idec Inc. Expression and use of anti-CD20 Antibodies
AU5670194A (en) 1992-11-20 1994-06-22 Enzon, Inc. Linker for linked fusion polypeptides
US6034065A (en) 1992-12-03 2000-03-07 Arizona Board Of Regents Elucidation and synthesis of antineoplastic tetrapeptide phenethylamides of dolastatin 10
US5455258A (en) 1993-01-06 1995-10-03 Ciba-Geigy Corporation Arylsulfonamido-substituted hydroxamic acids
US5849695A (en) 1993-01-13 1998-12-15 The Regents Of The University Of California Parathyroid hormone analogues useful for treatment of osteoporosis and disorders of calcium meatabolism in mammals
ATE172933T1 (de) 1993-01-19 1998-11-15 Glaxo Group Ltd Aerosol-spender und verfahren zu seiner herstellung
US5770428A (en) 1993-02-17 1998-06-23 Wisconsin Alumni Research Foundation Chimeric retrovial expression vectors and particles containing a simple retroviral long terminal repeat, BLV or HIV coding regions and cis-acting regulatory sequences, and an RNA translational enhancer with internal ribsome entry site
EP0754225A4 (en) 1993-04-26 2001-01-31 Genpharm Int HETEROLOGIC ANTIBODY-PRODUCING TRANSGENIC NON-HUMAN ANIMALS
US5885573A (en) 1993-06-01 1999-03-23 Arch Development Corporation Methods and materials for modulation of the immunosuppressive activity and toxicity of monoclonal antibodies
CA2163345A1 (en) 1993-06-16 1994-12-22 Susan Adrienne Morgan Antibodies
US5417972A (en) 1993-08-02 1995-05-23 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Method of killing B-cells in a complement independent and an ADCC independent manner using antibodies which specifically bind CDIM
US5514670A (en) 1993-08-13 1996-05-07 Pharmos Corporation Submicron emulsions for delivery of peptides
US5595721A (en) 1993-09-16 1997-01-21 Coulter Pharmaceutical, Inc. Radioimmunotherapy of lymphoma using anti-CD20
US5432930A (en) 1993-09-30 1995-07-11 Eagle Crest Limited System for accessing cobol data files by generating a dictionary of NF.sup.2
US5625825A (en) 1993-10-21 1997-04-29 Lsi Logic Corporation Random number generating apparatus for an interface unit of a carrier sense with multiple access and collision detect (CSMA/CD) ethernet data network
DE4337197C1 (de) 1993-10-30 1994-08-25 Biotest Pharma Gmbh Verfahren zur selektiven Herstellung von Hybridomazellinien, die monoklonale Antikörper mit hoher Zytotoxizität gegen humanes CD16-Antigen produzieren, sowie Herstellung bispezifischer monoklonaler Antikörper unter Verwendung derartiger monoklonaler Antikörper und des CD30-HRS-3-Antikörpers zur Therapie menschlicher Tumore
US5814599A (en) 1995-08-04 1998-09-29 Massachusetts Insitiute Of Technology Transdermal delivery of encapsulated drugs
FR2713447B1 (fr) 1993-12-15 1996-02-09 Chenier Ste Civile Procédé et installation de torréfaction de fruits du genre noix de cajou ou analogues.
US5827690A (en) 1993-12-20 1998-10-27 Genzyme Transgenics Corporatiion Transgenic production of antibodies in milk
US5605793A (en) 1994-02-17 1997-02-25 Affymax Technologies N.V. Methods for in vitro recombination
US5834252A (en) 1995-04-18 1998-11-10 Glaxo Group Limited End-complementary polymerase reaction
US5837458A (en) 1994-02-17 1998-11-17 Maxygen, Inc. Methods and compositions for cellular and metabolic engineering
ES2178669T3 (es) 1994-03-07 2003-01-01 Medarex Inc Moleculas biespecificas que tienen utilidad clinica.
US5436361A (en) 1994-04-22 1995-07-25 Clemson University Process for synthesizing enediynes
DE4415998A1 (de) 1994-05-06 1995-11-09 Basf Ag Neue Tetrapeptide, ihre Herstellung Verwendung
JPH07309761A (ja) 1994-05-20 1995-11-28 Kyowa Hakko Kogyo Co Ltd デュオカルマイシン誘導体の安定化法
EP0771208B1 (en) 1994-08-12 2005-10-19 Immunomedics, Inc. Immunoconjugates and humanized antibodies specific for b-cell lymphoma and leukemia cells
US5554725A (en) 1994-09-14 1996-09-10 Arizona Board Of Regents Acting On Behalf Of Arizona State University Synthesis of dolastatin 15
US5763733A (en) 1994-10-13 1998-06-09 Enzon, Inc. Antigen-binding fusion proteins
JPH08175990A (ja) 1994-12-19 1996-07-09 Mitsubishi Chem Corp Ｐｉ３キナーゼ阻害剤とその製造法
JPH08176070A (ja) 1994-12-19 1996-07-09 Mitsubishi Chem Corp ジデプシド誘導体及びｐｉ３キナーゼ阻害剤
US5549551A (en) 1994-12-22 1996-08-27 Advanced Cardiovascular Systems, Inc. Adjustable length balloon catheter
US5731168A (en) 1995-03-01 1998-03-24 Genentech, Inc. Method for making heteromultimeric polypeptides
US5863949A (en) 1995-03-08 1999-01-26 Pfizer Inc Arylsulfonylamino hydroxamic acid derivatives
US6037453A (en) 1995-03-15 2000-03-14 Genentech, Inc. Immunoglobulin variants
US5656730A (en) 1995-04-07 1997-08-12 Enzon, Inc. Stabilized monomeric protein compositions
US6121022A (en) 1995-04-14 2000-09-19 Genentech, Inc. Altered polypeptides with increased half-life
US5869046A (en) 1995-04-14 1999-02-09 Genentech, Inc. Altered polypeptides with increased half-life
US5861510A (en) 1995-04-20 1999-01-19 Pfizer Inc Arylsulfonyl hydroxamic acid derivatives as MMP and TNF inhibitors
EP0823941A4 (en) 1995-04-28 2001-09-19 Abgenix Inc HUMAN ANTIBODIES DERIVED FROM IMMUNIZED XENO MOUSES
US6410690B1 (en) 1995-06-07 2002-06-25 Medarex, Inc. Therapeutic compounds comprised of anti-Fc receptor antibodies
DE19526926A1 (de) 1995-07-24 1997-01-30 Bayer Ag Verfahren zur Herstellung beladener nichtporöser Trägermaterialien
GB9521987D0 (en) 1995-10-26 1996-01-03 Ludwig Inst Cancer Res Phosphoinositide 3-kinase modulators
GB9624482D0 (en) 1995-12-18 1997-01-15 Zeneca Phaema S A Chemical compounds
DK0780386T3 (da) 1995-12-20 2003-02-03 Hoffmann La Roche Matrixmetalloproteaseinhibitorer
GB9526100D0 (en) 1995-12-20 1996-02-21 Intersurgical Ltd Nebulizer
ES2167987T3 (es) 1996-01-03 2002-05-16 Glaxo Group Ltd Dispositivo inhalador.
CZ291386B6 (cs) 1996-02-13 2003-02-12 Zeneca Limited Chinazolinové deriváty jako inhibitory VEGF, způsob jejich přípravy a farmaceutický prostředek, který je obsahuje
GB9603256D0 (en) 1996-02-16 1996-04-17 Wellcome Found Antibodies
NZ331191A (en) 1996-03-05 2000-03-27 Zeneca Ltd 4-anilinoquinazoline derivatives and pharmaceutical compositions thereof
US5714352A (en) 1996-03-20 1998-02-03 Xenotech Incorporated Directed switch-mediated DNA recombination
DE19624387C2 (de) 1996-06-19 1999-08-19 Hatz Motoren Kaltstartvorrichtung
EP0818442A3 (en) 1996-07-12 1998-12-30 Pfizer Inc. Cyclic sulphone derivatives as inhibitors of metalloproteinases and of the production of tumour necrosis factor
KR20000067904A (ko) 1996-07-18 2000-11-25 디. 제이. 우드, 스피겔 알렌 제이 매트릭스 메탈로프로테아제의 포스피네이트계 억제제
US20010056066A1 (en) 1996-07-26 2001-12-27 Smithkline Beecham Corporation Method of treating immune cell mediated systemic diseases
WO1998007697A1 (en) 1996-08-23 1998-02-26 Pfizer Inc. Arylsulfonylamino hydroxamic acid derivatives
DK0826695T3 (da) 1996-09-03 2002-04-15 Gsf Forschungszentrum Umwelt Tilintetgørelse af kontaminerende tumorceller i stamcelletransplantater med bispecifikke antistoffer
JPH1087666A (ja) 1996-09-18 1998-04-07 Kyorin Pharmaceut Co Ltd デュオカルマイシンｓａ及びその誘導体の製造中間体と製造方法
GB9718972D0 (en) 1996-09-25 1997-11-12 Zeneca Ltd Chemical compounds
DK0942968T3 (da) 1996-12-03 2008-06-23 Amgen Fremont Inc Fuldt humane antistoffer, der binder EGFR
ATE272640T1 (de) 1997-01-06 2004-08-15 Pfizer Cyclische sulfonderivate
DK0977733T3 (da) 1997-02-03 2003-11-24 Pfizer Prod Inc Arylsulfonylaminohydroxamsyrederivater
AU5493598A (en) 1997-02-07 1998-08-26 Pfizer Inc. N-hydroxy-beta-sulfonyl-propionamide derivatives and their use as inhibitors of matrix metalloproteinases
YU37499A (sh) 1997-02-11 2002-09-19 Pfizer Inc. Derivati arilsulfonil hidroksamske kiseline
DK0961780T3 (da) 1997-02-12 2007-08-27 Electrophoretics Ltd Proteinmarkörer for lungecancer og anvendelse deraf
US5921447A (en) 1997-02-13 1999-07-13 Glaxo Wellcome Inc. Flow-through metered aerosol dispensing apparatus and method of use thereof
EP0973540B1 (en) 1997-02-25 2005-11-02 Arizona Board Of Regents Isolation and structural elucidation of the cytostatic linear and cyclo-depsipeptides dolastatin 16, dolastatin 17, and dolastatin 18
US6277375B1 (en) 1997-03-03 2001-08-21 Board Of Regents, The University Of Texas System Immunoglobulin-like domains with increased half-lives
US5965537A (en) 1997-03-10 1999-10-12 Basf Aktiengesellschaft Dolastatin 15 derivatives with carbonyl and heterocyclic functionalities at the C-terminus
US6103698A (en) 1997-03-13 2000-08-15 Basf Aktiengesellschaft Dolastatin-15 derivatives in combination with taxanes
US6306393B1 (en) 1997-03-24 2001-10-23 Immunomedics, Inc. Immunotherapy of B-cell malignancies using anti-CD22 antibodies
US6183744B1 (en) 1997-03-24 2001-02-06 Immunomedics, Inc. Immunotherapy of B-cell malignancies using anti-CD22 antibodies
US6235883B1 (en) 1997-05-05 2001-05-22 Abgenix, Inc. Human monoclonal antibodies to epidermal growth factor receptor
ATE271041T1 (de) 1997-05-22 2004-07-15 Scripps Research Inst Analoga von duocarmycin and cc-1065
DK0999853T3 (da) 1997-06-13 2003-04-22 Genentech Inc Stabiliseret antostofformulering
US6171586B1 (en) 1997-06-13 2001-01-09 Genentech, Inc. Antibody formulation
US6991790B1 (en) 1997-06-13 2006-01-31 Genentech, Inc. Antibody formulation
JP2002506353A (ja) 1997-06-24 2002-02-26 ジェネンテック・インコーポレーテッド ガラクトシル化糖タンパク質の方法及び組成物
US20040191256A1 (en) 1997-06-24 2004-09-30 Genentech, Inc. Methods and compositions for galactosylated glycoproteins
WO1999002567A2 (en) 1997-07-08 1999-01-21 Board Of Regents, The University Of Texas System Compositions and methods for producing homoconjugates of antibodies which induce growth arrest or apoptosis of tumor cells
US6143721A (en) 1997-07-18 2000-11-07 Basf Aktiengesellschaft Dolastatin 15 derivatives
CN1171866C (zh) 1997-08-08 2004-10-20 辉瑞产品公司 芳氧基芳基磺酰氨基异羟肟酸衍生物
US6686445B1 (en) 1997-09-24 2004-02-03 Arizona Board Of Regents, Acting For And On Behalf Of Arizona State University Synthetic antineoplastic agents derived from dolastatin 15 and methods of making same
GB9722131D0 (en) 1997-10-20 1997-12-17 Medical Res Council Method
JP2001521909A (ja) 1997-10-31 2001-11-13 ジェネンテク・インコーポレイテッド 糖タンパク質グリコフォームを含む方法及び組成物
GB9725782D0 (en) 1997-12-05 1998-02-04 Pfizer Ltd Therapeutic agents
GB9801690D0 (en) 1998-01-27 1998-03-25 Pfizer Ltd Therapeutic agents
JP4462654B2 (ja) 1998-03-26 2010-05-12 ソニー株式会社 映像素材選択装置及び映像素材選択方法
US6194551B1 (en) 1998-04-02 2001-02-27 Genentech, Inc. Polypeptide variants
US6528624B1 (en) 1998-04-02 2003-03-04 Genentech, Inc. Polypeptide variants
IL138608A0 (en) 1998-04-02 2001-10-31 Genentech Inc Antibody variants and fragments thereof
US6242195B1 (en) 1998-04-02 2001-06-05 Genentech, Inc. Methods for determining binding of an analyte to a receptor
PA8469401A1 (es) 1998-04-10 2000-05-24 Pfizer Prod Inc Derivados biciclicos del acido hidroxamico
PA8469501A1 (es) 1998-04-10 2000-09-29 Pfizer Prod Inc Hidroxamidas del acido (4-arilsulfonilamino)-tetrahidropiran-4-carboxilico
DE69942021D1 (de) 1998-04-20 2010-04-01 Glycart Biotechnology Ag Glykosylierungs-engineering von antikörpern zur verbesserung der antikörperabhängigen zellvermittelten zytotoxizität
GB9809951D0 (en) 1998-05-08 1998-07-08 Univ Cambridge Tech Binding molecules
US5985837A (en) 1998-07-08 1999-11-16 Basf Aktiengesellschaft Dolastatin 15 derivatives
PL195870B1 (pl) 1998-08-11 2007-11-30 Biogen Idec Inc Zastosowanie przeciwciała anty-CD20, zastosowanieznakowanego radioaktywnie przeciwciała anty-CD20,zastosowanie przeciwciała anty-CD20 do przygotowania leku zwierającego przeciwciało i chemioterapięoraz zastosowanie przeciwciała anty-CD20 do przygotowania leku zawierającego przeciwciało i szpik kostny
US6224866B1 (en) 1998-10-07 2001-05-01 Biocrystal Ltd. Immunotherapy of B cell involvement in progression of solid, nonlymphoid tumors
DK1004578T3 (da) 1998-11-05 2004-06-28 Pfizer Prod Inc 5-oxo-pyrrolidin-2-carboxylsyrehydroxamidderivater
CA2350058C (en) 1998-11-09 2015-10-13 Idec Pharmaceuticals Corporation Treatment of hematologic malignancies associated with circulating tumor cells using chimeric anti-cd20 antibody
TR200101302T2 (tr) 1998-11-09 2001-10-22 Idec Pharmaceuticals Corporation BMT yada PBSC transplantı alan hastalarda in vitro ya da in vivo temizleyici madde olarak kimerik anti-CD20 antikorunun kullanımı.
KR101077001B1 (ko) 1999-01-15 2011-10-26 제넨테크, 인크. 효과기 기능이 변화된 폴리펩티드 변이체
US6737056B1 (en) 1999-01-15 2004-05-18 Genentech, Inc. Polypeptide variants with altered effector function
US6897044B1 (en) 1999-01-28 2005-05-24 Biogen Idec, Inc. Production of tetravalent antibodies
US7074800B1 (en) 1999-02-10 2006-07-11 Astrazeneca Ab Quinazoline derivatives as angiogenesis inhibitors
DK2270149T3 (en) 1999-04-09 2016-05-09 Kyowa Hakko Kirin Co Ltd PROCEDURE TO CONTROL THE ACTIVITY OF IMMUNOLOGICAL FUNCTIONAL MOLECULE.
CA2372603C (en) 1999-05-07 2015-11-17 Genentech, Inc. Treatment of autoimmune diseases with antagonists which bind to b cell surface markers
DE60042785D1 (de) 1999-06-09 2009-10-01 Immunomedics Inc Immuntherapie von autoimmunerkrankungen durch die verwendung von b-zell spezifischen antikörpern
ITMI991299A1 (it) 1999-06-11 2000-12-11 Consiglio Nazionale Ricerche Uso di anticorpi contro antigeni di superficie per il trattamento della malattia trapianto contro ospite
DE19930748C2 (de) 1999-07-02 2001-05-17 Infineon Technologies Ag Verfahren zur Herstellung von EEPROM- und DRAM-Grabenspeicherzellbereichen auf einem Chip
AU778863B2 (en) 1999-07-12 2004-12-23 Genentech Inc. Blocking immune response to a foreign antigen using an antagonist which binds to CD20
US6451284B1 (en) 1999-08-11 2002-09-17 Idec Pharmaceuticals Corporation Clinical parameters for determining hematologic toxicity prior to radioimmunotheraphy
US8557244B1 (en) 1999-08-11 2013-10-15 Biogen Idec Inc. Treatment of aggressive non-Hodgkins lymphoma with anti-CD20 antibody
CN100389825C (zh) 1999-08-11 2008-05-28 拜奥根Idec公司 用抗cd20抗体治疗累及骨髓的非霍奇金淋巴瘤患者
AU6929100A (en) 1999-08-23 2001-03-19 Biocrystal Limited Methods and compositions for immunotherapy of b cell involvement in promotion ofa disease condition comprising multiple sclerosis
US6323315B1 (en) 1999-09-10 2001-11-27 Basf Aktiengesellschaft Dolastatin peptides
US20030039659A1 (en) 1999-09-24 2003-02-27 Mccormick Alison A. Self antigen vaccines for treating B cell lymphomas and other cancers
EP2266607A3 (en) 1999-10-01 2011-04-20 Immunogen, Inc. Immunoconjugates for treating cancer
CA2388245C (en) 1999-10-19 2012-01-10 Tatsuya Ogawa The use of serum-free adapted rat cells for producing heterologous polypeptides
CN101219145A (zh) 1999-11-05 2008-07-16 阿斯特拉曾尼卡有限公司 作为vegf抑制剂的喹唑啉衍生物
US20020028178A1 (en) 2000-07-12 2002-03-07 Nabil Hanna Treatment of B cell malignancies using combination of B cell depleting antibody and immune modulating antibody related applications
AU2001264612C1 (en) 1999-11-08 2007-11-22 Biogen Idec Inc. Treatment of B cell malignancies using combination of B cell depleting antibody and immune modulating antibody related applications
US20020006404A1 (en) 1999-11-08 2002-01-17 Idec Pharmaceuticals Corporation Treatment of cell malignancies using combination of B cell depleting antibody and immune modulating antibody related applications
AU784174B2 (en) 1999-11-08 2006-02-16 Biogen Idec Inc. Treatment of B cell malignancies using anti-CD40L antibodies in combination with anti-CD20 antibodies and/or chemotherapeutics and radiotherapy
JP2003514903A (ja) 1999-11-24 2003-04-22 イムノージェン インコーポレーテッド タキサンを含有する細胞傷害薬とその治療への利用
DK1252192T3 (da) 2000-02-11 2006-11-20 Merck Patent Gmbh Forbedring af antistofbaserede fusionsproteiners serumhalveringstid
DE122008000002I1 (de) 2000-02-15 2008-04-17 Sugen Inc Pyrrol substituierte indolin-2-on protein kinase inhibitoren
JP2001247477A (ja) 2000-03-03 2001-09-11 Teikoku Hormone Mfg Co Ltd 抗腫瘍剤
US7097840B2 (en) 2000-03-16 2006-08-29 Genentech, Inc. Methods of treatment using anti-ErbB antibody-maytansinoid conjugates
US20030185796A1 (en) 2000-03-24 2003-10-02 Chiron Corporation Methods of therapy for non-hodgkin's lymphoma
WO2001072333A1 (en) 2000-03-24 2001-10-04 Chiron Corporation Methods of therapy for non-hodgkin's lymphoma using a combination_of an antibody to cd20 and interleuking-2
AU8729101A (en) 2000-03-31 2001-10-15 Idec Pharma Corp Combined use of anti-cytokine antibodies or antagonists and anti-CD20 for the treatment of B cell lymphoma
JP2003531588A (ja) 2000-04-11 2003-10-28 ジェネンテック・インコーポレーテッド 多価抗体とその用途
IL151348A0 (en) 2000-04-13 2003-04-10 Univ Rockefeller Enhancement of antibody-mediated immune responses
CA2405632A1 (en) 2000-04-25 2001-11-01 Idec Pharmaceutical Corporation Intrathecal administration of rituximab for treatment of central nervous system lymphomas
US6608053B2 (en) 2000-04-27 2003-08-19 Yamanouchi Pharmaceutical Co., Ltd. Fused heteroaryl derivatives
US6403588B1 (en) 2000-04-27 2002-06-11 Yamanouchi Pharmaceutical Co., Ltd. Imidazopyridine derivatives
WO2001097858A2 (en) 2000-06-20 2001-12-27 Idec Pharmaceuticals Corporation Cold anti-cd20 antibody/radiolabeled anti-cd22 antibody combination
ATE440618T1 (de) 2000-06-22 2009-09-15 Univ Iowa Res Found Kombination von cpg und antikírpern gegen cd19, cd20,cd22 oder cd40 zur prävention oder behandlung von krebs.
US6725230B2 (en) 2000-07-18 2004-04-20 Aegis Analytical Corporation System, method and computer program for assembling process data of multi-database origins using a hierarchical display
US6333410B1 (en) 2000-08-18 2001-12-25 Immunogen, Inc. Process for the preparation and purification of thiol-containing maytansinoids
AR030612A1 (es) 2000-09-12 2003-08-27 Smithkline Beecham Corp Procedimiento e intermedios
CN1592645A (zh) 2000-09-18 2005-03-09 拜奥根Idec公司 使用b细胞耗尽/免疫调节抗体组合治疗自身免疫病的联合疗法
US7064191B2 (en) 2000-10-06 2006-06-20 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. Process for purifying antibody
CN102311986B (zh) 2000-10-06 2015-08-19 协和发酵麒麟株式会社 产生抗体组合物的细胞
AU2001294175A1 (en) 2000-10-06 2002-04-22 Kyowa Hakko Kogyo Co. Ltd. Method of purifying antibody
US6946292B2 (en) 2000-10-06 2005-09-20 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. Cells producing antibody compositions with increased antibody dependent cytotoxic activity
US20020128448A1 (en) 2000-10-20 2002-09-12 Idec Pharmaceuticals Corporation Variant IgG3 Rituxan and therapeutic use thereof
CA2431600C (en) 2000-12-12 2012-04-17 Medimmune, Inc. Molecules with extended half-lives, compositions and uses thereof
CA2433353C (en) 2000-12-28 2017-03-21 Altus Biologics, Inc. Crystals of whole antibodies and fragments thereof and methods for making and using them
JP4458746B2 (ja) 2001-01-16 2010-04-28 グラクソ グループ リミテッド 癌の治療方法
US7754208B2 (en) 2001-01-17 2010-07-13 Trubion Pharmaceuticals, Inc. Binding domain-immunoglobulin fusion proteins
US20030133939A1 (en) 2001-01-17 2003-07-17 Genecraft, Inc. Binding domain-immunoglobulin fusion proteins
CN101684158A (zh) 2001-01-17 2010-03-31 特鲁比昂药品公司 结合域-免疫球蛋白融合蛋白
US7829084B2 (en) 2001-01-17 2010-11-09 Trubion Pharmaceuticals, Inc. Binding constructs and methods for use thereof
IL157142A0 (en) 2001-01-29 2004-02-08 Idec Pharma Corp Modified antibodies and methods of use
WO2002096948A2 (en) 2001-01-29 2002-12-05 Idec Pharmaceuticals Corporation Engineered tetravalent antibodies and methods of use
US20030103971A1 (en) 2001-11-09 2003-06-05 Kandasamy Hariharan Immunoregulatory antibodies and uses thereof
US6444163B1 (en) 2001-03-06 2002-09-03 Kawasaki Steel Corporation Heat shielding apparatus for vertical continuous annealing furnace
US20020156274A1 (en) 2001-03-16 2002-10-24 Terfloth Gerald J. Process for preparing maytansinol
EP1383800A4 (en) 2001-04-02 2004-09-22 Idec Pharma Corp RECOMBINANT ANTIBODIES CO-EXPRESSED WITH GNTIII
EP1383532B1 (en) 2001-04-02 2011-05-04 Genentech, Inc. Combination therapy
ITPD20010108A1 (it) 2001-05-08 2002-11-08 Fidia Advanced Biopolymers Srl Biomateriali polimerici elettricamente conduttori, loro processo di preparazione ed impiego nel settore biomedico sanitario.
WO2003061694A1 (en) 2001-05-10 2003-07-31 Seattle Genetics, Inc. Immunosuppression of the humoral immune response by anti-cd20 antibodies
US6441163B1 (en) 2001-05-31 2002-08-27 Immunogen, Inc. Methods for preparation of cytotoxic conjugates of maytansinoids and cell binding agents
JP2005515161A (ja) 2001-06-14 2005-05-26 インターミューン インコーポレイテッド γ−インターフェロンおよびＢ細胞特異的抗体の併用療法
US7321026B2 (en) 2001-06-27 2008-01-22 Skytech Technology Limited Framework-patched immunoglobulins
US6737409B2 (en) 2001-07-19 2004-05-18 Hoffmann-La Roche Inc. Dolastatin 10 derivatives
EP1417976A4 (en) 2001-07-26 2004-09-15 Santen Pharmaceutical Co Ltd AGENT FOR TREATING GLAUKOM WITH A COMPOUND WITH PI3-KINASE INHIBITING EFFECT
NZ581474A (en) 2001-08-03 2011-04-29 Glycart Biotechnology Ag Antibody glycosylation variants having increased antibody-dependent cellular cytotoxicity
US6703414B2 (en) 2001-09-14 2004-03-09 Arizona Board Of Regents On Behalf Of The University Of Arizona Device and method for treating restenosis
AU2002327037A1 (en) 2001-09-20 2003-04-01 Board Of Regents, The University Of Texas System Measuring circulating therapeutic antibody, antigen and antigen/antibody complexes using elisa assays
WO2003035618A2 (en) 2001-10-24 2003-05-01 Iconix Pharmaceuticals, Inc. Modulators of phosphoinositide 3-kinase
AU2002357667A1 (en) 2001-10-24 2003-05-06 Iconix Pharmaceuticals, Inc. Modulators of phosphoinositide 3-kinase
US20030157108A1 (en) 2001-10-25 2003-08-21 Genentech, Inc. Glycoprotein compositions
MXPA04004064A (es) 2001-10-30 2004-09-06 Pharmacia Corp Derivados heteroaromaticos de carboxamida para el tratramiento de la inflamacion.
CN1210307C (zh) 2001-11-16 2005-07-13 上海中信国健药业有限公司 抗cd20人源化单克隆抗体
AU2002360413A1 (en) 2001-11-21 2003-06-10 University Of Washington Biosynthetic gene cluster for the maytansinoid antitumor agent ansamitocin
JP2005538034A (ja) 2001-12-07 2005-12-15 カイロン コーポレイション 非ホジキンリンパ腫の治療方法
US6716821B2 (en) 2001-12-21 2004-04-06 Immunogen Inc. Cytotoxic agents bearing a reactive polyethylene glycol moiety, cytotoxic conjugates comprising polyethylene glycol linking groups, and methods of making and using the same
US20040093621A1 (en) 2001-12-25 2004-05-13 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd Antibody composition which specifically binds to CD20
US6790954B2 (en) 2002-01-29 2004-09-14 Immunogen, Inc. Mutant Actinosynnema pretiosum strain with increased maytansinoid production
CN100522999C (zh) 2002-02-14 2009-08-05 免疫医疗公司 抗cd20抗体及其融合蛋白和使用方法
US20040002587A1 (en) 2002-02-20 2004-01-01 Watkins Jeffry D. Fc region variants
US7317091B2 (en) 2002-03-01 2008-01-08 Xencor, Inc. Optimized Fc variants
US20040110226A1 (en) 2002-03-01 2004-06-10 Xencor Antibody optimization
US20040132101A1 (en) 2002-09-27 2004-07-08 Xencor Optimized Fc variants and methods for their generation
US20030180292A1 (en) 2002-03-14 2003-09-25 Idec Pharmaceuticals Treatment of B cell malignancies using anti-CD40L antibodies in combination with anti-CD20 antibodies and/or chemotherapeutics and radiotherapy
US6756397B2 (en) 2002-04-05 2004-06-29 Immunogen, Inc. Prodrugs of CC-1065 analogs
PL373256A1 (en) 2002-04-09 2005-08-22 Kyowa Hakko Kogyo Co, Ltd. Cells with modified genome
WO2003085118A1 (fr) 2002-04-09 2003-10-16 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. Procede de production de composition anticorps
AU2003236017B2 (en) 2002-04-09 2009-03-26 Kyowa Kirin Co., Ltd. Drug containing antibody composition
WO2003085102A1 (fr) 2002-04-09 2003-10-16 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. Cellule avec inhibition ou suppression de l'activite de la proteine participant au transport du gdp-fucose
WO2003084570A1 (fr) 2002-04-09 2003-10-16 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. Medicament contenant une composition d'anticorps appropriee au patient souffrant de polymorphisme fc$g(g)riiia
EP1498491A4 (en) 2002-04-09 2006-12-13 Kyowa Hakko Kogyo Kk METHOD FOR INCREASING THE ACTIVITY OF AN ANTIBODY COMPOSITION FOR BINDING TO THE FC GAMMA RECEPTOR IIIA
US20050276812A1 (en) 2004-06-01 2005-12-15 Genentech, Inc. Antibody-drug conjugates and methods
US20030219818A1 (en) 2002-05-10 2003-11-27 Bohen Sean P. Methods and compositions for determining neoplastic disease responsiveness to antibody therapy
AU2003228998A1 (en) 2002-05-13 2003-12-02 Smithkline Beecham Corporation Process for preparing maytansinol
US6596757B1 (en) 2002-05-14 2003-07-22 Immunogen Inc. Cytotoxic agents comprising polyethylene glycol-containing taxanes and their therapeutic use
US7538195B2 (en) 2002-06-14 2009-05-26 Immunogen Inc. Anti-IGF-I receptor antibody
ES2263984T3 (es) 2002-06-28 2006-12-16 Domantis Limited Ligandos doble-especificos con una vida media serica aumentada.
BR0312752A (pt) 2002-07-10 2005-04-26 Applied Research Systems Derivados de benzeno fundido de azolidinona-vinil
US20040092561A1 (en) 2002-11-07 2004-05-13 Thomas Ruckle Azolidinone-vinyl fused -benzene derivatives
JP2006500327A (ja) 2002-07-10 2006-01-05 アプライド リサーチ システムズ エーアールエス ホールディング ナームロゼ フェンノートシャップ 精子の運動性を増大させるための化合物の使用
EP1575514A2 (en) 2002-07-31 2005-09-21 Seattle Genetics, Inc. Anti-cd20 antibody-drug conjugates for the treatment of cancer and immune disorders
JP2005539009A (ja) 2002-08-02 2005-12-22 イミュノジェン・インコーポレーテッド 新規の効力のあるタキサンを含む細胞毒性物質、および、それらの治療用途
PT1534335E (pt) 2002-08-14 2012-02-28 Macrogenics Inc Anticorpos específicos de fcγriib e processos para a sua utilização
WO2004016801A2 (en) 2002-08-16 2004-02-26 Immunogen, Inc. Cross-linkers with high reactivity and solubility and their use in the preparation of conjugates for targeted delivery of small molecule drugs
EP1391213A1 (en) 2002-08-21 2004-02-25 Boehringer Ingelheim International GmbH Compositions and methods for treating cancer using maytansinoid CD44 antibody immunoconjugates and chemotherapeutic agents
AU2003255845A1 (en) 2002-08-22 2004-03-11 Piramed Limited Phosphadidylinositol 3,5-biphosphate inhibitors as anti-viral agents
EP2298805A3 (en) 2002-09-27 2011-04-13 Xencor, Inc. Optimized Fc variants and methods for their generation
CA2502904C (en) 2002-10-15 2013-05-28 Protein Design Labs, Inc. Alteration of fcrn binding affinities or serum half-lives of antibodies by mutagenesis
US20040120949A1 (en) 2002-11-08 2004-06-24 Boehringer Ingelheim International Gmbh Compositions and methods for treating cancer using cytotoxic CD44 antibody immunoconjugates and radiotherapy
JP4480128B2 (ja) 2002-11-20 2010-06-16 独立行政法人科学技術振興機構 マトリックスメタロプロテアーゼ−９の産生を阻害するための薬剤
KR20070055625A (ko) 2002-12-16 2007-05-30 제넨테크, 인크. 이뮤노글로불린 변이체 및 이들의 용도
CA2507882A1 (en) 2002-12-16 2004-07-22 Genentech, Inc. Transgenic mice expressing human cd20
JP2006523090A (ja) 2002-12-27 2006-10-12 ドマンティス リミテッド リガンドに、そしてリガンド受容体に特異的な二重特異性単一ドメイン抗体
US7534427B2 (en) 2002-12-31 2009-05-19 Immunomedics, Inc. Immunotherapy of B cell malignancies and autoimmune diseases using unconjugated antibodies and conjugated antibodies and antibody combinations and fusion proteins
EP2368578A1 (en) 2003-01-09 2011-09-28 Macrogenics, Inc. Identification and engineering of antibodies with variant Fc regions and methods of using same
EP2862878B1 (en) 2003-02-25 2022-11-02 Nykode Therapeutics ASA Modified antibody
US8084582B2 (en) 2003-03-03 2011-12-27 Xencor, Inc. Optimized anti-CD20 monoclonal antibodies having Fc variants
RU2358762C9 (ru) 2003-04-09 2016-10-10 Джинентех, Инк. Лечение аутоиммунных заболеваний у пациента с неадекватным ответом на ингибитор tnf-альфа
US7755007B2 (en) 2003-04-17 2010-07-13 K&H Manufacturing, Inc Heated pet mat
WO2004094595A2 (en) 2003-04-17 2004-11-04 Alnylam Pharmaceuticals Inc. MODIFIED iRNA AGENTS
JP5416338B2 (ja) 2003-05-09 2014-02-12 デューク ユニバーシティ Ｃｄ２０特異的抗体およびその使用方法
US8088387B2 (en) 2003-10-10 2012-01-03 Immunogen Inc. Method of targeting specific cell populations using cell-binding agent maytansinoid conjugates linked via a non-cleavable linker, said conjugates, and methods of making said conjugates
CA2525553C (en) 2003-05-14 2011-07-05 Immunogen, Inc. Maytansinoid-antibody conjugate compositions
AR044388A1 (es) 2003-05-20 2005-09-07 Applied Molecular Evolution Moleculas de union a cd20
US7276497B2 (en) 2003-05-20 2007-10-02 Immunogen Inc. Cytotoxic agents comprising new maytansinoids
US20050163775A1 (en) 2003-06-05 2005-07-28 Genentech, Inc. Combination therapy for B cell disorders
DK1631313T3 (en) 2003-06-05 2015-06-15 Genentech Inc Combination therapy for b cell disorders
US7834155B2 (en) 2003-07-21 2010-11-16 Immunogen Inc. CA6 antigen-specific cytotoxic conjugate and methods of using the same
NZ580855A (en) 2003-07-21 2012-03-30 Immunogen Inc A CA6 antigen-specific cytotoxic conjugate and methods of using the same
EP1667546B1 (en) 2003-07-25 2011-01-26 Bally Gaming International, Inc. A method to produce uniquely identifiable casino gaming chips
EP1649288A1 (en) 2003-07-29 2006-04-26 Genentech, Inc. Assay for human anti cd20 antibodies and uses therefor
US20050079184A1 (en) 2003-08-08 2005-04-14 Immunomedics, Inc. Bispecific antibodies for inducing apoptosis of tumor and diseased cells
US8147832B2 (en) 2003-08-14 2012-04-03 Merck Patent Gmbh CD20-binding polypeptide compositions and methods
US20050053602A1 (en) 2003-08-29 2005-03-10 Genentech, Inc. Therapy of ocular disorders
US7288396B2 (en) 2003-09-11 2007-10-30 Kosan Biosciences Incorporated Biosynthetic gene cluster for leptomycins
JPWO2005035586A1 (ja) 2003-10-08 2007-11-22 協和醗酵工業株式会社 融合蛋白質組成物
EP1705251A4 (en) 2003-10-09 2009-10-28 Kyowa Hakko Kirin Co Ltd PROCESS FOR PRODUCING ANTIBODY COMPOSITION BY RNA INHIBITION OF FUNCTION OF $ G (A) 1,6-FUCOSYLTRANSFERASE
GB0324368D0 (en) 2003-10-17 2003-11-19 Univ Cambridge Tech Polypeptides including modified constant regions
LT2348051T (lt) * 2003-11-05 2019-02-25 Roche Glycart Ag Cd20 antikūnai su padidintu fc receptoriaus prisijungimo giminingumu ir efektorine funkcija
GB0325952D0 (en) 2003-11-06 2003-12-10 Du Pont Method for producing enhanced solid state polymerization of polyethylene terephthalate
WO2005053742A1 (ja) 2003-12-04 2005-06-16 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. 抗体組成物を含有する医薬
MXPA06006865A (es) 2003-12-19 2006-08-23 Genentech Inc Deteccion de cd20 en rechazo de transplante.
CN1917901A (zh) 2003-12-19 2007-02-21 健泰科生物技术公司 自身免疫病疗法中cd20的检测
US20060018911A1 (en) 2004-01-12 2006-01-26 Dana Ault-Riche Design of therapeutics and therapeutics
CN1918178B (zh) 2004-01-12 2012-08-22 应用分子进化公司 Fc区变体
US20050203174A1 (en) 2004-03-09 2005-09-15 Kosan Biosciences, Inc. Combination therapies using leptomycin B
WO2005099754A2 (en) 2004-04-14 2005-10-27 The Ohio State University Research Foundation Maytansinoid analogs as antitumor agents
JP2007532681A (ja) 2004-04-16 2007-11-15 ジェネンテック・インコーポレーテッド Ｂ細胞の枯渇を増大させる方法
CA2562243A1 (en) 2004-04-16 2005-12-08 Genetech, Inc. Treatment of polychondritis and mononeuritis multiplex with anti-cd20 antibodies
WO2005108989A2 (en) 2004-04-16 2005-11-17 Genentech, Inc. Assay for antibodies
JP5848861B2 (ja) 2004-04-20 2016-01-27 ジェンマブ エー／エスＧｅｎｍａｂ Ａ／Ｓ Ｃｄ２０に対するヒトモノクローナル抗体
CA2564529A1 (en) 2004-05-05 2005-12-15 Genentech, Inc. Preventing autoimmune disease
US7514223B2 (en) 2004-05-15 2009-04-07 Genentech, Inc. Cross-screening system and methods for detecting a molecule having binding affinity for a target molecule
US7446196B2 (en) 2004-06-03 2008-11-04 Kosan Biosciences, Incorporated Leptomycin compounds
KR20150092374A (ko) 2004-06-04 2015-08-12 제넨테크, 인크. 다발성 경화증의 치료 방법
DOP2005000108A (es) 2004-06-04 2007-06-15 Genentech Inc Method for treating lupus
MX2007000327A (es) 2004-07-09 2007-03-12 Schering Ag Tratamiento del linfoma de celulas b.
EP1919950A1 (en) 2004-07-15 2008-05-14 Xencor, Inc. Optimized fc variants
AU2005267028A1 (en) 2004-07-22 2006-02-02 Genentech, Inc. Method of treating Sjogren's syndrome
EP1778728A2 (en) 2004-08-19 2007-05-02 Genentech, Inc. Polypeptide variants with altered effector function
KR20070050950A (ko) 2004-09-08 2007-05-16 제넨테크, 인크. 사멸 수용체 리간드 및 ｃｄ20 항체의 사용 방법
EP1812060A2 (en) 2004-10-05 2007-08-01 Genentech, Inc. Method for treating vasculitis
TW200630106A (en) 2004-10-08 2006-09-01 Wyeth Corp Immunotherapy of autoimmune disorders
WO2006047350A2 (en) 2004-10-21 2006-05-04 Xencor, Inc. IgG IMMUNOGLOBULIN VARIANTS WITH OPTIMIZED EFFECTOR FUNCTION
GB0423653D0 (en) 2004-10-25 2004-11-24 Piramed Ltd Pharmaceutical compounds
US20060099235A1 (en) 2004-11-11 2006-05-11 Medtronic Vascular, Inc. Medical devices and compositions useful for treating or inhibiting restenosis
EP1688415A1 (en) 2004-12-07 2006-08-09 Aventis Pharma S.A. Cytotoxic agents comprising new C-2 modified taxanes
PT1819359E (pt) 2004-12-09 2015-05-28 Janssen Biotech Inc Imunoconjugados anti-integrina, métodos para a sua produção e sua utilização
EP1828117A1 (en) 2004-12-13 2007-09-05 F. Hoffmann-Roche AG Novel process for the manufacture of 3-pyrrolidin-2-yl-propionic acid derivatives
FR2879204B1 (fr) 2004-12-15 2007-02-16 Lab Francais Du Fractionnement Anticorps cytotoxique dirige contre les proliferations hematopoietiques lymphoides de type b.
JP2008524241A (ja) 2004-12-17 2008-07-10 ジェネンテック・インコーポレーテッド 従来の治療の効果がなかった患者の自己免疫性疾患の血管新生阻害治療
ZA200704934B (en) 2004-12-22 2010-09-29 Genentech Inc Methods for producing soluble multi-membrane-spanning proteins
MX2007008218A (es) 2005-01-13 2007-08-17 Genentech Inc Procedimiento de tratamiento.
MX2007008349A (es) 2005-01-13 2007-07-25 Hoffmann La Roche Nueva sintesis de una etapa de aminas disustituidas utiles.
US7301019B2 (en) 2005-01-21 2007-11-27 Immunogen, Inc. Method for the preparation of maytansinoid esters
DOP2006000029A (es) 2005-02-07 2006-08-15 Genentech Inc Antibody variants and uses thereof. (variantes de un anticuerpo y usos de las mismas)
ES2503719T3 (es) 2005-02-11 2014-10-07 Immunogen, Inc. Procedimiento para preparar conjugados de anticuerpos y de maitansinoides
TW200714289A (en) 2005-02-28 2007-04-16 Genentech Inc Treatment of bone disorders
CN101203607B (zh) * 2005-03-31 2012-09-05 生物医药股份有限公司 抗cd20单克隆抗体
WO2006105338A2 (en) 2005-03-31 2006-10-05 Xencor, Inc. Fc VARIANTS WITH OPTIMIZED PROPERTIES
DK2143795T3 (da) 2005-03-31 2011-09-19 Biomedics Inc Anti-CD20 monoklonalt antistof
WO2006113623A2 (en) 2005-04-15 2006-10-26 Immunogen, Inc. Elimination of heterogeneous or mixed cell population in tumors
BRPI0610203A2 (pt) 2005-05-24 2010-06-01 Avestha Gengraine Tech Pvt Ltd processo de preparação in vivo de anti-corpo monoclonal anti-cd 20 biologicamente ativo e composição farmacêutica
WO2006133450A2 (en) 2005-06-08 2006-12-14 Duke University Anti-cd19 antibody therapy for the transplantation
CN1290864C (zh) 2005-07-11 2006-12-20 中国人民解放军军事医学科学院生物工程研究所 一种抗cd20嵌合抗体
NZ599176A (en) 2005-08-03 2014-04-30 Immunogen Inc Immunoconjugate formulations
US20070213292A1 (en) 2005-08-10 2007-09-13 The Rockefeller University Chemically modified oligonucleotides for use in modulating micro RNA and uses thereof
NZ565964A (en) 2005-08-24 2011-11-25 Immunogen Inc Process for preparing maytansinoid antibody conjugates by purifying with tangential flow filtration
WO2007041635A2 (en) 2005-10-03 2007-04-12 Xencor, Inc. Fc variants with optimized fc receptor binding properties
GB0520657D0 (en) 2005-10-11 2005-11-16 Ludwig Inst Cancer Res Pharmaceutical compounds
GB0525214D0 (en) 2005-12-12 2006-01-18 Bioinvent Int Ab Biological materials and uses thereof
US7441063B2 (en) 2005-12-14 2008-10-21 Aten International Co., Ltd. KVM system for controlling computers and method thereof
ATE527262T1 (de) 2006-01-25 2011-10-15 Sanofi Sa Neue tomaymycin derivate enhaltende zytotoxische mittel
SG170750A1 (en) 2006-03-17 2011-05-30 Biogen Idec Inc Stabilized polypeptide compositions
EP1864682A1 (en) 2006-06-09 2007-12-12 Sanofi-Aventis Leptomycin derivatives
US20080003652A1 (en) 2006-06-28 2008-01-03 Hans Iding Novel enzymatic process for the manufacture of Boc-Dap-Oh priority to related application(s)
US20130004480A1 (en) 2006-07-04 2013-01-03 Paul Parren CD20 Binding Molecules for the Treatment of Copd
US7846434B2 (en) 2006-10-24 2010-12-07 Trubion Pharmaceuticals, Inc. Materials and methods for improved immunoglycoproteins
PE20090321A1 (es) 2007-06-04 2009-04-20 Genentech Inc Anticuerpos anti-notch1 nrr, metodo de preparacion y composicion farmaceutica
WO2008156713A2 (en) 2007-06-12 2008-12-24 Wyeth Anti-cd20 therapeutic compositions and methods
PT2019104E (pt) 2007-07-19 2013-12-03 Sanofi Sa Agentes citotóxicos compreendendo novos derivados de tomaimicina e sua utilização terapêutica
GB0714602D0 (en) 2007-07-26 2007-09-05 Novathera Ltd Process
ES2449070T3 (es) * 2007-09-05 2014-03-18 F. Hoffmann-La Roche Ag Terapia de combinación con anticuerpos anti-CD20 de tipo I y tipo II
JP5470817B2 (ja) 2008-03-10 2014-04-16 日産自動車株式会社 電池用電極およびこれを用いた電池、並びにその製造方法
PL2281006T3 (pl) 2008-04-30 2018-01-31 Immunogen Inc Środki łączące i ich zastosowania
AR080155A1 (es) 2010-02-10 2012-03-14 Immunogen Inc Anticuerpos anti-cd20 y su utilizacion
JP6136279B2 (ja) 2013-01-15 2017-05-31 株式会社ジェイテクト 転がり軸受装置
TWI503850B (zh) 2013-03-22 2015-10-11 Polytronics Technology Corp 過電流保護元件
TWI510996B (zh) 2013-10-03 2015-12-01 Acer Inc 控制觸控面板的方法以及使用該方法的可攜式電腦
US9816280B1 (en) 2016-11-02 2017-11-14 Matthew Reitnauer Portable floor
US11392902B2 (en) 2017-06-06 2022-07-19 United Parcel Service Of America, Inc. Systems, methods, apparatuses and computer program products for providing notification of items for pickup and delivery

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20020034765A1 (en) * 1991-05-17 2002-03-21 Merck & Co., Inc. Method for reducing the immunogenicity of antibody variable domains
US20040167319A1 (en) * 2002-10-17 2004-08-26 Jessica Teeling Human monoclonal antibodies against CD20
CN101282993A (zh) * 2005-06-02 2008-10-08 阿斯利康公司 针对cd20的抗体和其用途

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
EDMUND A. ROSSI ET AL: "Novel Designs of Multivalent Anti-CD20 Humanized Antibodies as Improved Lymphoma Therapeutics", 《CANCER RES》 *

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN105963711A (zh) * 2016-06-20 2016-09-28 杭州皓阳生物技术有限公司 一种抗人cd20单克隆抗体-dm1偶联物及其制备方法
CN110088135A (zh) * 2016-12-20 2019-08-02 豪夫迈·罗氏有限公司 抗cd20/抗cd3双特异性抗体和4-1bb(cd137)激动剂的组合疗法
CN111133007A (zh) * 2017-09-13 2020-05-08 特尼奥生物股份有限公司 与胞外酶结合的重链抗体

Also Published As

Publication number Publication date
BR112012020102A2 (pt) 2016-11-29
AR080154A1 (es) 2012-03-14
AU2011215900A1 (en) 2012-07-26
MX2012009352A (es) 2012-10-01
EP2533810A1 (en) 2012-12-19
US20160108126A1 (en) 2016-04-21
MX341687B (es) 2016-08-30
WO2011100403A1 (en) 2011-08-18
EP2533810A4 (en) 2013-07-24
CN102933231A (zh) 2013-02-13
EP2533810B1 (en) 2016-10-12
RU2012138399A (ru) 2014-03-20
TW201129384A (en) 2011-09-01
US9173961B2 (en) 2015-11-03
US20110195021A1 (en) 2011-08-11
RU2573994C2 (ru) 2016-01-27
CN102933231B (zh) 2015-07-29
CA2789629A1 (en) 2011-08-18
KR20130009760A (ko) 2013-01-23
JP5841072B2 (ja) 2016-01-06
HK1216540A1 (zh) 2016-11-18
JP2013519375A (ja) 2013-05-30

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN102933231B (zh) Cd20抗体及其用途
US9175086B2 (en) CD20 antibodies and uses thereof
ES2961381T3 (es) Anticuerpos anti-GD2
US8992917B2 (en) Humanized L243 antibodies
TWI392503B (zh) 抗－ｃｄ７９ｂ抗體及免疫共軛物及使用方法
JP6482525B2 (ja) 高親和性抗ｇｄ２抗体
CN107735093A (zh) Cd123抗体和其结合物
US20070136826A1 (en) Anti-mouse CD20 antibodies and uses thereof
AU2011253938B2 (en) Humanized L243 antibodies

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
REG Reference to a national code

Ref country code: HK

Ref legal event code: DE

Ref document number: 1216540

Country of ref document: HK

WD01 Invention patent application deemed withdrawn after publication
WD01 Invention patent application deemed withdrawn after publication

Application publication date: 20151028

REG Reference to a national code

Ref country code: HK

Ref legal event code: WD

Ref document number: 1216540

Country of ref document: HK