BRPI0610203A2

BRPI0610203A2 - processo de preparação in vivo de anti-corpo monoclonal anti-cd 20 biologicamente ativo e composição farmacêutica

Info

Publication number: BRPI0610203A2
Application number: BRPI0610203-4A
Authority: BR
Inventors: Norawala Patell Villoo
Original assignee: Avestha Gengraine Tech Pvt Ltd
Priority date: 2005-05-24
Filing date: 2006-05-24
Publication date: 2010-06-01
Also published as: EP1885757A2; AU2006250888A2; MX2007014673A; WO2006126069A3; CA2609731A1; CN101273063A; KR20080039844A; AU2006250888A1; IL187478A0; US20090285795A1; JP2009508467A; WO2006126069A2; AP2007004252A0; ZA200711010B; RU2007147598A

Abstract

A presente invenção refere-se ao processo recombinante usado para a produção da forma solúvel de um anticorpo que se liga a CD2O para o tratamento de pacientes com linfoma sem ser de Hodgkin (NHL) de células B positivas em relação a CD2O de baixo grau ou folicular reincidente ou refratário. O tratamento irá compreender o uso de anticorpos anti-CD2O imunologicamente ativos ou de anticorpos anti-CD2O marcados radioativamente e ou estratégias de cooperação em que serão usados anticorpos tanto marcados como não marcados para tratamento do NHL. O procedimento descreve a síntese de novo da seqúência de ácido nucléico que codifica anti-CD2O, a transformação das sequências de ácidos nucléicos construídas em bactérias competentes e a subclonagem das mesmas em vetores de expressão em mamíferos para a expressão da proteína desejada. Foram descritas construções de DNA que compreendem os elementos de controle associados ao gene de interesse. A seqúência de ácido nucléico de interesse teve os códons otimizados para permitir a expressão nas células hospedeiras adequadas de mamíferos.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "PROCESSOPARA A PRODUÇÃO DE UM ANTICORPO MONOCLONAL PARA CD20PARA O TRATAMENTO DE LINFOMA DE CÉLULAS B".

Camoo da Invenção

A presente invenção refere-se ao processo recombinante usadopara a produção da forma solúvel de um anticorpo que se liga a CD20 para otratamento de pacientes com linfoma sem ser de Hodgkin (NHL) de células Bpositivas em relação a CD20 de baixo grau ou folicular reincidente ou refra-tário. O tratamento irá compreender o uso de anticorpos anti-CD20 imunolo-gicamente ativos ou de anticorpos anti-CD20 marcados radiativamente e ouestratégias de cooperação em que serão usados anticorpos tanto marcadoscomo não marcados para tratamento de NHL. O procedimento descreve asíntese de novo da seqüência de ácido nucléico que codifica anti-CD20, atransformação das seqüências de ácidos nucléicos construídas em bactériascompetentes e a subclonagem das mesmas em vetores de expressão emmamíferos para a expressão da proteína desejada. Foram descritas constru-ções de DNA que compreendem os elementos de controle associados aogene de interesse. A seqüência de ácido nucléico de interesse teve seuscódons otimizados para permitir a expressão nas células hospedeiras ade-quadas de mamíferos.

Fundamentos da Invenção

Os anticorpos têm sido considerados como um poderoso instru-mento para reconhecer e direcionar quase qualquer molécula com um altograu de especificidade e afinidade. Os anticorpos monoclonais (mAbs) têmsido usados como diagnósticos in vitro permitindo, portanto, a padronizaçãono mundo todo de reagentes para RIA, imunocitopatologia ELISA e citome-tria do fluxo. Os anticorpos monoclonais também têm sido usados extensi-vamente usados para localização in vivo de antígenos de tumores e na imu-noterapia do câncer.

Este problema foi controlado pelo desenvolvimento de anticor-pos de dois tipos básicos. O primeiro tipo, denominado anticorpos quiméri-cos, em que os domínios constantes murinos são substituídos apenas pordomínios equivalentes de origem humana (Morrison e outros, P. N. A. S.,1984, 81, 6851-6855; Boulianne e outros, Nature, 1985, 314, 268-270 eNeuberger e outros, Nature, 1985, 314, 268-270). O segundo tipo é quandoos domínios constantes murinos e as regiões estruturais murinas são todossubstituídos por domínios e regiões equivalentes de origem humana. Estesegundo tipo de anticorpo é referido como anticorpo humanizado ou comCDR enxertado (Jones e outros, Nature, 1986, 321, 522-525 e Riechmann eoutros, Nature, 1988, 332, 323-327). Por exemplo, para fins terapêuticos, aIgGt humana e a lgG2b de rato são isotipos favorecidos correntemente. A-lém disso, dos isotipos IgG humanos, lgG1 e lgG3 parecem ser os mais efi-cazes para complemento e lise mediada pela célula e, portanto, para matarcélulas de tumor. Um anticorpo humano evitaria evidentemente a necessida-de de "humanização", entretanto, as linhagens de células, que secretam an-ticorpos humanos, são muito instáveis e geralmente foram provadas comosendo inadequadas para produção em escala comercial.

Para gerar quantidades suficientes de anticorpo para uso clínicoglobal é desejável empregar um sistema de expressão recombinante eficien-te. Como as células de mieloma representam um hospedeiro natural especi-alizado para a produção e secreção de anticorpo, linhagens de células deri-vadas destes têm sido usadas para a expressão de anticorpos recombinan-tes. Freqüentemente, é necessário o projeto de um vetor complexo, baseadoem torno de elementos reguladores de gene da ímunoglobulina e foram rela-tados níveis de expressão finais que são altamente variáveis (Winter e ou-tros, Nature, 1988, 332, 323-327; Weidle e outros, Gene, 1987, 60, 205-216;Nakatani e outros, Bio/Technology, 1989, 7, 805-810 e Gillies e outros, Bi-o/Technology, 1989, 7, 799-804). Um sistema de expressão em mamíferosalternativo é aquele oferecido pelo uso de células de ovário de hamster chi-nês (CHO). O uso destas células permitiu a produção de grandes quantida-des de diversas proteínas terapêuticas para pesquisa e uso clínico (Kaufmane outros, Mol. Cell. Biol, 1985, 5, 1750-1759 e Zettlmeissl e outros, Bi-o/Technology, 1987, 5, 720-725). Há, entretanto, muitos poucos casos douso destas células para a expressão de anticorpos e os níveis de expressãode anticorpos murinos registrados até esta data são baixos da ordem de0,01-0,1 ug/mL (Weidle e outros, Gene, 1987, 51, 21-29 e Feys e outros, Int.J. Câncer, 1988, 2, 26-27).

O anticorpo anti-CD20 se liga especificamente ao antígenoCD20 (antígeno de diferenciação restrito a linfócito B humano, Bp35), umaproteína transmembrana hidrofóbica com um peso molecular de aproxima-damente 35 kD localizada nos linfócitos pré-B e B maduros. O antígeno tam-bém é expresso em > 90 % de linfomas de Hodgkin sem ser de células B(NHL), mas não é encontrado em células-tronco hematopoiéticas, célulaspró-B, células normais do plasma ou outros tecidos normais. CD20 regulauma (ou mais) etapa (s) precoce (s) no processo de ativação para iniciaçãoe diferenciação do ciclo celular e, possivelmente, funciona como um canal deíons cálcio. CD20 não é eliminado da superfície da célula e não se internali-za após a ligação do anticorpo. O antígeno CD20 livre não é encontrado nacirculação. O anticorpo anti-CD20 atua através do recrutamento das defesasnaturais do corpo para atacar e matar a célula B à qual se liga por meio doantígeno CD20. A eliminação da célula hospedeira ocorre por dois meca-nismos: 1) a via de citoxicidade dependente do complemento (CDC) e 2) avia de citoxicidade mediada por células dependente de anticorpo (ADCC).

O anticorpo anti-CD20 é um anticorpo monoclonal quimérico mu-rino / humano engenheirado geneticamente. O anticorpo é uma imunoglobu-lina Igd kappa que contém seqüências de murinas de região variável decadeia leve e pesada e seqüências de região constante humanas. O anticor-po anti-CD20 é composto de duas cadeias pesadas de 451 aminoácidos eduas cadeias leves de 213 aminoácidos (com base na análise do cDNA) etem um peso molecular aproximado de 145 kD. O anticorpo anti-CD20 temuma afinidade de ligação em relação ao antígeno CD20 de aproximadamen-te 8,0 nM. O anticorpo anti-CD20 quimérico é produzido por uma cultura emsuspensão de células de mamífero (Ovário de Hamster Chinês) em um meionutriente que contém o antibiótico gentamicina. O anticorpo anti-CD20 é pu-rificado por cromatografia por afinidade e de troca iônica.

A presente invenção refere-se à construção, clonagem, expres-são, purificação e produção de anticorpos que podem se ligar a CD20. Oanticorpo será uma terapia direcionada indicada para o tratamento de paci-entes com linfoma sem ser de Hodgkin (NHL) de células B positivas em rela-ção a CD20 de baixo grau ou folicular reincidente ou refratário.

Sumário da Invenção

A presente invenção é dirigida à transformação da seqüência deácido nucléico que codifica o polipeptídeo anti-CD20.

De acordo com um aspecto da invenção, são fornecidas as se-qüências de ácidos nucléicos que codificam as cadeias pesadas e leves damolécula de anti-CD20. De acordo com um aspecto adicional da invenção éfornecida a seqüência de aminoácidos correspondente codificada pelas se-qüências de ácidos nucléicos.

Um aspecto em particular da invenção refere-se à síntese denovo das regiões variáveis da cadeia pesada e da leve da molécula de anti-CD20. Também é descrita a construção das construções de vetor com a se-qüência de ácido nucléico de interesse, a transformação das construções devetor em bactérias competentes e a subclonagem das cadeias anti-CD20 emvetores de expressão em mamíferos.

Descrição Detalhada da Invenção

O anticorpo anti-CD20 é um anticorpo quimérico de camundon-go-humano. Este é compreendido de duas cadeias - 1) a cadeia leve que éconstituída do domínio variável derivado da cadeia leve do anticorpo mono-clonal de camundongo 2B8 e do domínio constante kappa humano e 2) acadeia pesada que é constituída do domínio variável da cadeia pesada doanticorpo monoclonal de camundongo 2B8 e do domínio constante de lgG1humana. A seqüência de anticorpo é descrita na patente WO 94/11026.

Foi seguida uma abordagem de novo em termos da síntese dasregiões codificadoras de construção de cDNA porque o hibridoma 2B8 quesecreta o anticorpo monoclonal de camundongo anti-CD20 não está disponí-vel no domínio público. A síntese gênica de novo permitiria também a otimi-zação dos códons em relação à linhagem de células de mamífero em parti-cular que será usada para expressão de proteína.A seqüência de nucleotídeos que codifica a cadeia leve do anti-corpo anti-CD20 foi representada na SEQ ID 1.

A versão com códons otimizados da seqüência de nucleotídeosque codifica a cadeia leve do anticorpo anti-CD20 foi representada na SEQID2.

Os códons na seqüência codificadora de DNA da cadeia leve doanticorpo anti-CD20 que foram alterados como parte do processo de otimi-zação de códons para garantir expressão ótima da proteína recombinanteem linhagens de células de mamíferos tais como CHO Kl e HEK 293. A se-qüência de nucleotídeos que codifica a cadeia pesada do anticorpo anti-CD20 foi representada na SEQ ID 3.

A versão com códons modificados da seqüência de nucleotídeosque codifica a cadeia pesada do anticorpo anti-CD20 foi representada naSEQ ID 4.

Os códons na seqüência de DNA codificadora da cadeia pesadado anticorpo anti-CD20 que foram alterados como parte do processo de oti-mização de códons para garantir expressão ótima da proteína recombinanteem linhagens de células de mamíferos tais como CHO Kl e HEK 293.

Escolha do Vetor de Expressão

O planejamento do vetor de expressão em mamíferos para aexpressão do anticorpo anti-CD20 pode estar baseado em um dos vetoresdisponíveis comercialmente (por exemplo: pcDNA oxpIRES da Invitrogen ouda BD Biosciences respectivamente), modificado para incluir as seguintescaracterísticas:

(a) um sítio de clonagem múltipla para inserção de cDNA quecodifica tanto as cadeias de anticorpo leves como pesadas do anticorpo anti-CD20 em cassetes de expressão separados no mesmo vetor;

(b) o planejamento do vetor de expressão também pode acomo-dar uma co-expressão mediada por IRES (bicistrônica) independente da pro-teína fluorescente verde que permitiria uma rápida seleção de transfectantescom expressão alta usando-se a seleção de células auxiliada por fluores-cência.(c) clonagem das cadeias leves e pesadas quiméricas do anti-corpo em dois sistemas de expressão em mamíferos separados que têmdiferentes marcadores selecionáveis.

Subclonagem das cadeias do anticorpo RTX nos vetores de expressão em mamíferos

A cadeia pesada do anticorpo anti-CD20 (RTX-HC) e a cadeialeve do anticorpo anti-CD20 (RTX-LC) sintetizadas de novo foram obtidas naforma de fragmentos de cDNA clonados no vetor pBSKII e na construçãodenominada pBSKII-RTX-LC e pBSKII-RTX-HC, respectivamente. O DNA foitransformado em células de E. coli DH10b e plaqueadas sobre placas deágar LB contendo ampicilina. Uma colônia proveniente da placa foi inoculadaem meio líquido e foi realizada uma mini prep de DNA. A seqüência das du-as cadeias de anticorpo foi confirmada por seqüenciamento.

As cadeias leves e pesadas do anticorpo anti-CD20 de compri-mento total foram clonadas e subclonadas em vetores de expressão emmamíferos pCAIN e pCAID, respectivamente. O clone pBSKII/ RTX-LC e ovetor pCAIN foram digeridos com Bglll e EcoRI. A construção resultante foidenominada de pCAIN/RTX-LC. O inserto (700 pb) do primeiro e a cadeiaprincipal do vetor do último foram purificados do gel e ligados (figura 5). Amistura da ligação foi transformada em células DH10b competentes por cho-que térmico e plaqueadas sobre placas de ágar LB contendo ampicilina co-mo o antibiótico de seleção. Alguns transformantes foram escolhidos e foirealizada uma mini prep de DNA. Os clones foram verificados através dadigestão com enzima de restrição (figura 6).

O clone pBSKII/ RTX-HC e o vetor pCAID foram digeridos comBamHI e EcoRI e a construção resultante denominada pCAID/RTX-HC. Oinserto (1429 pb) do primeiro e a e a cadeia principal do vetor do último fo-ram purificados do gel e ligados (figura 7). A mistura de ligação foi transfor-mada em células DH10b competentes por choque térmico e plaqueadas so-bre placas de ágar LB contendo ampicilina como o antibiótico de seleção.Alguns transformantes foram escolhidos e foi realizada uma mini prep deDNA. Os clones foram verificados através da digestão com enzimas de res-trição (figura 8).

Seqüenciamento e análise de DNA

Os clones finais de RTX-HC e RTX-LC clonados vetores de ex-pressão em mamíferos pCAID e pCAIN, respectivamente, foram seqüencia-dos e a acurácia de suas seqüências foi confirmada.

Manutenção e propagação dos genes que codificam as cadeias do anticorpoanti-CD20

A construção de cDNA que codifica a cadeia leve e pesada qui-mérica do anticorpo anti-CD20 será mantida e propaganda em uma linha-gem de células bacterianas padrão tal como Top 10 (Invitrogen).

Expressão de proteína recombinante transitória / estável em CHO-KI

(a) A expressão de transitória / estável da construção será feitausando-se as células de ovário de hamster chinês (CHO) uma linhagem decélulas de mamífero que é aprovada pela FDA para aplicações industriais. Aexpressão transitória é útil para verificar a expressão de uma construção epara se obter rapidamente pequenas quantidades de uma proteína recombi-nante.

(b) Subseqüentemente, as células de CHO que apresentam umaexpressão estável e alta do anticorpo monoclonal desejado serão desenvol-vidas usando procedimentos padronizados.

Purificação do anticorpo anti-CD20:

O anticorpo quimérico maduro do anticorpo anti-CD20 é com-preendido de duas cadeias pesadas de anticorpo (451 x 2 aminoácidos) eduas cadeia leves de anticorpo (213 x 2 aminoácidos) e tem um peso mole-cular aproximado de 145 kDa. Ambas as cadeias têm uma seqüência líderN-terminal de 20 aminoácidos que é clivada antes da secreção do hormônio.

Subseqüente ao estabelecimento da atividade biológica que po-de ser reproduzida de acordo com os ensaios funcionais / de ligação reco-mendados mencionados acima, serão feitos esforços para otimizar os pro-cedimentos de purificação. As estratégias de purificação irão visar à econo-mia do processo, a velocidade para comercialização, a capacidade de au-mento da escala, a capacidade de reprodução e a pureza máxima do produ-to com estabilidade funcional e integridade estrutural como os principais ob-jetivos. Para este efeito, seria explorada uma abordagem combinatória tantocom filtração (filtração normal e de fluxo tangencial) e cromatografia. Os re-quisitos para a qualificação dos processos e os estudos dos critérios de acei-tação serão conduzidos em 3 bateladas.

Conseqüentemente, a presente invenção considera as etapas aseguir no processo de purificação:

a. clarificação inicial usando filtros COHC / AIHC / com profundi-dade de 0,45 u.

b. concentração usando um filtro com limite de 50 kDa PelliconXL Biomax com base na filtração fluxo tangencial

c. etapa chromo -1: cromatografia por afinidade que usa ProsepVA Ultra para base em soro (2 % de soro fetal de bezerro [FCS]) / e ProsepVA para sobrenadantes da cultura isentos de soro.

d. etapa chromo - II: trocador de cátion forte tal como SP Sepharose

e. etapa chromo— III: trocador de ânion forte com base no fluxoque passa tal como Cellufine Q (um meio à base de celulose) para a remo-ção de proteínas e ácidos nucléicos da célula hospedeira.

f. remoção de vírus usando filtração por exclusão de tamanho eproteína A lixiviada usando sulfato de Cellufine

g. esterilização por filtração

h. remoção de endotoxinas usando cromatografia com Remtox /Cellufine ET;

h. formulação.

Estabelecimento da identidade da proteína alvo usando métodos bioquími-cos, imunolóqicos e físíco-químicos

A recuperação percentual da proteína total em cada estágio seráquantificada usando-se o procedimento com ácido bicinchonínico (BCA) /método de ligação com corante de Bradford. A concentração de proteínaalvo em cada estágio de purificação será sondada usando-se ensaios imu-nológicos confiáveis com base em enzimas tal como ELISA em sanduíchedireto ou indireto.

A análise de western qualitativa e específica ao alvo será feitaapós cada estágio. A cromatografia em fase inversa, a focalização isoelétricae a eletroforese bidimensional em gel serão empregadas para avaliar o pro-duto purificado. A análise da estrutura secundária seria verificada usando-sedicroísmo circular em UV distante. A massa molecular e o status oligoméricoserão investigados usando-se exclusão de tamanho e MALDI-TOF. As inves-tigações também irão focalizar a estabilidade da proteína em relação ao pHe à temperatura. Como NESP é uma proteína hiperglicosilada, os padrõesde glicosilação da proteína purificada seriam documentados usando-se aná-lise com cromatografia gasosa (GC).

7. Ensaios para atividade in vitro e in vivo do anticorpo anti-CD20

Os bioensaios para detectar a ligação de CD20 in vitro do anti-corpo anti-CD20 e a função efetora do anticorpo serão feitos usando-se: a)Ligação a C1q humano e células SB positivas em relação a CD-20 em umensaio de citometria de fluxo que usa Clq marcado com fluorosceína; b) Lisecelular dependente do complemento das células SB positivas em relação aCD-20; c) Ensaio efetor de citotoxicidade celular dependente de anticorpousando células positivas em relação a e células negativas em relação aCD20.

A atividade biológica pré-clínica in vivo do anticorpo anti-CD20será testada em primatas não-humanos (macacos cynomolgus) para: a) efi-cácia de eliminação de células B de nodos linfáticos do sangue periférico eda medula óssea; b) avaliação de qualquer toxicidade associada ao anticor-po quimérico.Listagem de Seqüências

<110> avestha

Morawala patsll» Vílloo

<120> Processo de produção de mAB CD20

<130> 23-05-06

<160> 3

<170> Patentln versão 3.3

<210> 1<2W> 708

<212> DNA

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470

1152120012481296134413921413

Claims

1. Processo de preparação in vivo de anticorpo monoclonal anti-CD 2 biologicamente ativo que compreende as etapas:- uma etapa de síntese de novo das cadeias leves e pesadas doanticorpo anti-CD20;- uma etapa de construção da cadeia leve kappa de comprimen-to total do anticorpo anti-CD20;- uma etapa de construção da cadeia pesada de lgG1 de com-primento total do anticorpo anti-CD20;- uma etapa de construção de vetores que compreendem as se-qüências de ácidos nucléicos que codificam as cadeias polipeptídicas levese pesadas da molécula de anti-CD20;- uma etapa de subclonagem das cadeias do anticorpo anti-CD20 em vetores de expressão em mamíferos para a produção da moléculade anticorpo biologicamente ativa.

2. Processo de acordo com a reivindicação 1, em que a seqüên-cia de nucleotídeos que codifica a cadeia leve do anticorpo anti-CD20 foirepresentada na SEQ ID 1.

3. Processo de acordo com a reivindicação 1, em que a seqüên-cia de nucleotídeos que codifica a cadeia pesada do anticorpo anti-CD20 foirepresentada na SEQ ID 2.

4. Processo de acordo com a reivindicação 1, em que o vetorque compreende o fragmento de ácido nucléico que codifica a cadeia pesa-da do anti-CD20 está sujeito à mutagênese direcionada ao sítio.

5. Processo de acordo com a reivindicação 1, em que a cadeiapesada e a leve do anti-CD20 de comprimento total foram subclonadas emvetores de mamíferos.

6. Processo de preparação de um anticorpo monoclonal anti-CD20 biologicamente ativo in vivo que compreende as etapas de transfor-mação de uma célula hospedeira com uma construção de vetor da figura N-e o isolamento do dito produto da dita célula hospedeira ou do meio do cres-cimento do mesma.

7. Composição farmacêutica que compreende uma quantidadeterapeuticamente eficaz de anticorpo anti-CD20 e um diluente, adjuvante ouveículo farmaceuticamente aceitável, em que o dito anticorpo é purificado decélulas de mamíferos crescidas em cultura.