BRPI0610304A2 - método recombinante para a produção de um anticorpo monoclonal para cd52 para o tratamento de leucemia linfocìtica crÈnica - Google Patents

Abstract

A presente invenção refere-se ao método recombinante usado para a produção de anticorpo monoclonal em forma solúvel que se liga a CD52. O procedimento descreve a síntese de novo da seqúência de ácido nuclélco codificando anti-CD52, transformação das seqúências de ácido nucléico construídas em bactérias competentes e a subclonagem das mesmas em vetores de expressão de mamífero para expressão da proteína desejada. Construtos de DNA compreendendo os elementos de controle associados com o gene de interesse foram revelados. A seqúência de ácido nucléico de interesse foi otimizada no códon para permitir expressão em células hospedeiro de mamífero adequadas.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "MÉTODORECOMBINANTE PARA A PRODUÇÃO DE UM ANTICORPO MONO-CLONAL PARA CD52 PARA O TRATAMENTO DE LEUCEMIA LINFOCÍTICA CRÔNICA".

CAMPO DA INVENÇÃO

A presente invenção refere-se ao método recombinante usadopara a produção de anticorpo monoclonal em forma solúvel que se liga aCD52. O procedimento descreve a síntese de novo da seqüência de ácidonucléico codificando anti-CD52, transformação das seqüências de ácido nu-cléico construídas em bactérias competentes e a subclonagem das mesmasem vetores de expressão de mamífero para expressão da proteína desejada.Construtos de DNA compreendendo os elementos de controle associadoscom o gene de interesse foram revelados. A seqüência de ácido nucléico deinteresse foi otimizada no códon para permitir expressão em células hospe-deiro de mamífero adequadas.

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO

Anticorpos são uma parte de sistema imune do ser humano.Quando um antígeno (tal como, uma proteína estranha em um germe) entrano corpo, o corpo produz anticorpos naturais para lutar contra ele. Essesanticorpos se ligam ao antígeno e o marca para destruição pelo sistema i-mune do ser humano. Anticorpos, ou imunoglobulinas, compreendem duascadeias pesadas ligadas juntas por ligações dissulfeto e duas cadeias leves,cada cadeia leve sendo ligada a uma respectiva cadeia pesada por ligaçõesdissulfeto. Cada cadeia pesada tem em uma extremidade um domínio variá-vel (VH) seguido por vários domínios constantes (CH1, 2, 3). Cada cadeialeve tem um domínio variável (VL) em uma extremidade e um domínio cons-tante (CL) em sua outra extremidade, o domínio variável de cadeia leve dacadeia pesada (VH) e o domínio constante da cadeia leve sendo alinhadoscom o primeiro domínio constante da cadeia pesada. Os domínios constan-tes nas cadeias leve e pesada (Fc) não estão envolvidos diretamente emligação do anticorpo ao antígeno.

Os domínios variáveis de cada par de cadeias leve e pesada(Fab) formam o sítio de ligação de antígeno. Os domínios nas cadeias leve epesada têm a mesma estrutura geral e cada domínio compreende quatroregiões de estrutura, cujas seqüências são relativamente conservadas, co-nectadas por três regiões complementares (CDRs). As quatro regiões deestrutura adotam amplamente uma conformação de folha beta e as CDRsformam alças conectando e em alguns casos formando parte da, estruturade folha beta. As CDRs são mantidas em proximidade íntima pelas regiõesde estrutura e, com as CDRs de outros domínios, contribuem para a forma-ção do sítio de ligação de antígeno.

Uma etapa principal de progresso aconteceu em 1975 quandoKohler e Milstein (Nature, 1975, 256, 495-497) relataram a fusão bem-suce-dida de células de baço de camundongos imunizados com um antígeno comcélulas de uma linhagem de mieloma de murino. As células híbridas resul-tantes, chamadas hibridomas, têm as propriedades de produção de anticor-po derivadas de células do baço e de crescimento contínuo derivadas dascélulas de mieloma. Cada hibridoma sintetiza e secreta um anticorpo únicopara um determinante particular do antígeno original. Para assegurar quetodas as células em uma cultura sejam idênticas, isto é, que elas contenhama informação genética requerida para a síntese de uma espécie de anticorpoúnica, os hibridomas resultantes de fusão celular são clonados e subclona-dos. Deste modo, os hibridomas clonados produzem anticorpos homogê-neos ou monoclonais. A imortalidade da linhagem de célula assegura queum fornecimento ilimitado de um anticorpo bem caracterizado, homogêneo,esteja disponível para uso em uma variedade de aplicações incluindo emparticular diagnóstico e imunoterapia de distúrbios patológicos. Infelizmente,os anticorpos monoclonais desenvolvidos que não foram úteis em um ambi-ente clínico podem ser severamente impedidos pelo desenvolvimento deanticorpos anticamundongo humanos, que podem interferir com a terapia ecausar hipersensibilidade alérgica ou imune complexa.

Para gerar quantidades suficientes de anticorpo para uso clínicointegral é desejável empregar um sistema de expressão recombinante efici-ente. Uma vez que células de mieloma representam um hospedeiro naturalespecializado para produção e secreção de anticorpo, as linhagens de céluladerivadas dessas foram usadas para a expressão de anticorpos recombinan-tes. Freqüentemente, projeto de vetor complexo, com base em elementosreguladores de gene de imunoglobulina, é requerido, e níveis de expressãofinais foram descritos, os quais são altamente variáveis (Winter e outros, Na-ture, 1988, 332, 323-327; Weidle e outros, Gene, 1987, 60, 205-216; Naka-tani e outros, Bio/Technology, 1989, 7, 805-810; e Giilies e outros, Bi-o/Technologies, 1989, 7, 799-804). Um sistema de expressão de mamíferoalternativo é aquele oferecido pelo uso de células de ovário de hamster Chi-nês (CHO). O uso dessas células permitiu a produção de grandes quantida-des de várias proteínas terapêuticas para pesquisa e uso clínico (Kaufman eoutros, Mol. Cell. BioL, 1985, 5, 1750-1759; e Zettlmeissl e outros, Bi-o/Technology, 1987, 5, 720-725). Há, no entanto, muitos poucos casos douso dessas células para a expressão de anticorpos e os níveis de expressãode anticorpos de murino relatados até agora são baixos da ordem de 0,01-0,1 jo/ml (Weidle e outros, Gene, 1987, 51, 21-29; e Feys e outros, Int. J.Câncer, 1988, 2, 26-27).

CD52 é fortemente expresso em virtualmente todos os linfócitose monócitos humanos, mas está ausente de outras células sangüíneas inclu-indo as células-tronco hematopoiéticas, o antígeno sendo descrito por Hale eoutros, Blood, 1983, 62, 873-882. Um anticorpo monoclonal de camundongofoi desenvolvido YTH66.9 que é específico para CD52 e mais tarde um anti-corpo monoclonal de rato para CD52 YTH 34.5HL. O uso desses anticorposem ambiente clínico foi limitado devido à resposta antiglobulina.

CD52 é expresso sobre a superfície de linfócitos B e T normais emalignos, células NK, monócitos, macrófagos e tecidos do sistema reprodu-tor masculino. A presente invenção refere-se a um método onde um anticor-po que se liga a CD25 é indicado para o tratamento de leucemia linfocíticacrônica de célula B (B-CLL). O anticorpo pode ser também usado para tra-tamento de pacientes que foram tratados com agentes de alquilação e quefalharam com a terapia de fludarabina. O anticorpo na invenção é um lgG1kappa com regiões de estrutura variáveis e constantes humanas, e regiõesde determinação de complementaridade a partir de um anticorpo monoclonalde murino (rato). O anticorpo tem um peso molecular aproximado de 150 kd.

A presente invenção permitiria a produção de anti-CD52 em sis-tema de vetor de expressão de mamífero através da incorporação dos veto-res recombinantes compreendendo as seqüências de ácido nucléico codifi-cando os polipeptídeos possuindo a atividade de anti-CD52.

O anticorpo anti-CD52 será usado para tratar leucemia linfocíticacrônica de célula B também conhecida como B-CLL. O anticorpo será tam-bém usado para tratar pacientes que já receberam e/ou não responderam aoutros fármacos de quimioterapia de câncer (por exemplo, agentes de alqui-lação, fludarabina). O anticorpo também encontrará uso em linfoma de não-hodgkin, tratamento de algumas doenças autoimunes, pacientes com enxer-to de rim.

Em um aspecto adicional, o anticorpo anti-CD52 será usado pa-ra o tratamento de humanos com cânceres, particularmente linfomas, ou pa-ra propósitos de imunossupressão.

DESCRIÇÃO DE FIGURAS:

Figura 1. Alinhamento em par das versões não-otimizada e oti-mizada no códon da seqüência de nucleotídeo de DNA codificando a cadeialeve do anticorpo anti-CD52.

Figura 2. Alinhamento em par das versões não-otimizada e oti-mizada no códon da seqüência de nucleotídeo de DNA codificando a cadeiapesada do anticorpo anti-CD52.

Figura 3. Alinhamento dos domínios constantes de cadeia levede anticorpo anti-CD20 (Rituximab) e anticorpo anti-CD52 (Campath).

Figura 4. Alinhamento dos domínios constantes de cadeia pesa-da de anticorpo anti-CD20 (Rituximab) e anticorpo anti-CD52 (Campath).

Figura 5. Digestão de restrição dos clones pBSKII/ALZ-VLC (fai-xa 3) e pSBKII/RTX-LC (faixa 1) com Bgll BsiWI. Faixa 2 - ladderáe DNA de1 kb.

Figura 6. Digestão de restrição dos clones pBSKII/ALZ-LC comBglll e EcoRI para identificação dos transformantes contendo o inserto. Paratodos os clones testados um fragmento de queda (fall-out) correspondendoao tamanho do anticorpo ALZ-LC foi observado.

Figura 7. Digestão com restrição dos clones pBSKII/ALZ-LC comBamHI para distinção dos clones contendo inserto ALZ-LC dos clones con-tendo o RTX-LC.

Figura 8. Digestão com restrição dos clones de comprimentocomplexo pBSKII/ALZ-VHC para confirmar a presença do inserto.

Figura 9. Alinhamento de seqüência da cadeia pesada do anti-corpo anti-CD20 (RTX-HC) com o clone da cadeia pesada do anticorpo anti-CD52 (ALZ-HC) submetido à mutagênese direcionada ao sítio. A mudançade CA para TT é mostrada destacada em azul.

Figura 10. ALZ-LC e pCAIN digeridos com restrição e purificadoscom gel para reação de ligação.

Figura 11. Digestão com restrição dos clones de pCAIN/ALZ-LCcom Bglll e EcoRI para identificação dos transformantes contendo o inserto.Para todos os clones testados um fragmento de queda correspondendo aotamanho do fragmento de anticorpo ALZ-LC foi observado (-700 pb).

Figura 12. ALZ-HC e pCAID digeridos com restrição e purifica-dos com gel para reação de ligação.

Figura 13. Digestão com restrição dos clones pCAID/ALZ-HCcom BamHI e EcoRI para identificação dos transformantes contendo o inser-to. Para todos os clones testados um fragmento de queda correspondendoao tamanho do fragmento de anticorpo ALZ-HC foi observado (-1420 pb).

Figura 14. O clone b de pCAID/ALZ-HC foi confirmado atravésde seqüenciamento de nucleotídeo de DNA. Três iniciadores diferentes(camp246, 523 e CHC845) foram usados para a reação de seqüenciamento.A seqüência integral foi verificada combinar com a seqüência molde (C2).LISTAGEM DE SEQÜÊNCIA

SEQ ID NO. 1 Seqüência de nucleotídeo do anticorpo anti-CD52 da cadeialeve

SEQ ID NO. 2 Seqüência de nucleotídeo do anticorpo anti-CD52 da cadeiapesada

SEQ ID NO. 3 Seqüência de aminoácido do peptídeo do anticorpo anti-CD52SEQ ID NO: 4 Seqüência de aminoácido do peptídeo de anticorpo anti-CD52SEQ ID NO: 5 Seqüência otimizada no códon do anticorpo anti-CD52 da ca-deia leve

SEQ ID NO: 6 Seqüência otimizada no códon do anticorpo anti-CD52 da ca-deia pesada

SUMÁRIO DA INVENCÀO

A presente invenção refere-se à transformação de seqüência deácido nucleico codificando o polipeptídeo anti-CD52 em bactérias competen-tes e a subclonagem das mesmas em vetores de expressão de mamíferocom mais preferência em células CHO para a expressão estável do dito anti-corpo monoclonal.

De acordo com um aspecto da invenção, são providas seqüên-cias de ácido nucleico codificando as cadeias pesada e leve da moléculaanti-CD52. De acordo com um aspecto adicional da invenção é provida aseqüência de aminoácido correspondente codificada pelas seqüências deácido nucleico.

Um aspecto particular da invenção refere-se à síntese de novodas regiões variáveis das cadeias pesada e leve da molécula anti-CD2. Éainda revelada a construção dos construtos de vetor com a seqüência deácido nucleico de interesse, transformação dos construtos de vetor em bac-térias competentes e subclonagem das cadeias anti-CD52 em vetores deexpressão de mamífero.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

O procedimento descrito abaixo é adequado para a produção deanticorpo anti-CD52 solúvel recombinante, bioativo.

EXEMPLO 1Síntese de novo do cDNA de anticorpo anti-CD52 incluiria oscomponentes que seguem:

• Uma seqüência de consenso Kozak (GCCACC) 3 seguidapor um códon de iniciação (ATG)

• Três nucleotídeos de "proteção" nas extremidades 5' e 3' docDNA

• Sítios de restrição adequados nas extremidades 5' e 3' docDNA para clonar no vetor de expressão.

A seqüência de nucleotídeo codificando a cadeia leve de anti-corpo anti-CD52 foi representada na SEQ ID NO:1.

A seqüência de nucleotídeo codificando a cadeia pesada de an-ticorpo anti-CD52 foi mostrada na SEQ IO NO: 2.

Os códons na seqüência de DNA de codificação da cadeia pe-sada de anticorpo anti-CD52 que foram alterados como parte do processode otimização de códon para assegurar expressão de proteína recombinanteótima em linhagens de célula de mamífero, tal como CHO K1 e HEK 293. Asrespectivas seqüências otimizadas no códon foram representadas nas SEQID Nos: 4 e 5.

EXEMPLO 2

ESCOLHA DO SISTEMA DE EXPRESSÃO:

O projeto do vetor de expressão de mamífero para a expressãode anticorpo anti-CD52 recombinante pode ser baseado em um dos vetorescomercialmente disponíveis (por exemplo: pcDNA ou pIRES da Invitrogen ouBD Biosciences, respectivamente), modificado para incluir as característicasque seguem:

• sítio de clonagem múltiplo para inserção do cDNA codifican-do a cadeia leve e a cadeia pesada de anticorpo anti-CD52junto com o peptídeo de sinal natural. A cadeia leve e a ca-deia pesada de anticorpo anti-CD52 serão clonadas em doisvetores de DNA de plasmídeo separados com marcador deseleção diferente.

• o projeto do vetor pode também acomodar uma co-expres-são mediada por IRES independente (bis-cistrônica) do mar-cador de seleção para ambas cadeia leve e cadeia pesada.• o projeto do vetor de expressão pode também acomodaruma co-expressão mediada por IRES independentemente

(bis-cistrônica) de ambas cadeia pesada e cadeia leve deanticorpo anti-CD52 junto com o peptídeo de sinal natural.

EXEMPLO 3

Síntese de novo dos domínios variáveis de anticorpo anti-CD52

Os domínios variáveis de cadeias pesada e leve de anticorpoanti-CD52 foram dados para a síntese de novo para Epoch Labs, USA. Ascadeias de anticorpo anti-CD52 não foram sintetizadas com os domíniosconstantes; ao invés os domínios constantes kappa e lgG1 foram excisadosdas cadeias de anticorpo anti-CD20 e ligados com os domínios variáveis deanticorpo anti-CD52 para gerar cadeias de anticorpo de comprimento completo.

Os domínios constantes do anticorpo anti-CD52 e anticorpo anti-CD20 são muito similares. Enquanto o domínio constante kappa de anticor-po anti-CD52 é 100% homólogo ao anticorpo anti-CD20, o domínio constan-te de cadeia pesada difere em 2 nucleotídeos. A mudança de dois nucleotí-deos leva a uma mudança de valina para alanina na posição 240.

EXEMPLO 4

Construção das cadeias pesada e leve de comprimentocompleto do anticorpo anti-CD52

Os domínios variáveis que foram sintetizados de novo foramclonados em vetores pBSK contendo as cadeias pesada e leve de anticorpoanti-CD20 de comprimento completo. Os domínios variáveis do anticorpoanti-CD20 foram mudados com os domínios variáveis do anticorpo anti-CD52 para dar os fragmentos de anticorpo anti-CD52 de comprimento completo.

Os domínios variáveis do anticorpo anti-CD52 foram obtidos co-mo fragmentos clonados em pBSKII e o construto resultante referido comopBSKII/ALZ-VLC. O DNA foi transformado em células de E. coli DH10b eposto em placas de ágar LB contendo ampicilina. Uma colônia da placa foiinoculada em meio líquido e um mini prep de DNA foi realizado. A seqüênciados dois domínios variáveis foi confirmada através de seqüenciamento.

Construção da cadeia leve kappa de comprimento completode anticorpo anti-CD52

Os clones pBSKII/ALZ-VLC e pBSKII/RTX-LC (construto expres-sando cadeia leve do anticorpo anti-CD20) foram digeridos com as enzimasde restrição Bglll e BsiWI (figura 5). O inserto de tamanho de 394 pbs doprimeiro e o vetor + domínio constante de kappa do último foram purificadoscom gel. O vetor e inserto foram ligados para dar a cadeia leve kappa deanticorpo anti-CD52 de comprimento completo. As colônias obtidas na trans-formação das células DH10 competentes a choque térmico foram inoculadasem meio LB Amp, e um mini prep do DNA foi feito. Os clones foram checa-dos através de digestão com restrição quanto à presença da cadeia leve decomprimento integral do anticorpo anti-CD52 (figura 6). Os verificados positi-vos através da digestão com restrição foram também confirmados através deseqüenciamento.

Os clones pBSKII/ALZ-LC foram também digeridos com enzimade restrição BamHI para distinção dos clones contendo inserto ALZ-LC dosclones contendo o RTX-LC. Isto era essencial porque pBSKII/RTX-LC foiusado como a estrutura principal do vetor e o RTX-LC é do mesmo tamanhoque o ALZ-LC. O padrão de enzima de restrição difere entre as duas cadeiasleves. Enquanto clones pBSKII/ALZ-C quando digeridos com BamHI vãoapenas linearizar os clones pBSKII/RTX-LC darão um fragmento de quedade 700 pbs (figura 7). Os clones números 6, 9 e 13 eram clones RTX-HC.

Construção da cadeia pesada lgG1 de comprimento comple-to de anticorpo anti-CD52

O construto pBSKII/ALZ-VHC carregando a cadeia pesada vari-ável do anticorpo anti-CD52 e os clones do construto pBSKII/RTX-HC carre-gando a cadeia pesada do anticorpo anti-CD20 foram digeridos com as en-zimas de restrição Hindlll e Nhel. O inserto de tamanho de 426 pbs do pri-meiro e o vetor + domínio constante de lgG1 do último foram purificadoscom gel. O vetor e o inserto foram ligados para dar a cadeia pesada IgG deanticorpo anti-CD52 de comprimento completo. As colônias obtidas na trans-formação das células DH10 competentes a choque térmico foram inoculadasem meio LB Amp, um mini prep do DNA foi feito e os clones foram checadosatravés de digestão com restrição quanto à presença da cadeia pesada decomprimento completo do anticorpo anti-CD52 (figura 8). Os clones verifica-dos positivos através da digestão com restrição foram também confirmadosatravés de seqüenciamento.

Mutagênese direcionada a sítio do clone pBSKII/ALZ-HC

O domínio constante do fragmento de cadeia pesada de anticor-po anti-CD52 difere do fragmento de cadeia pesada do anticorpo anti-CD20no domínio constante por dois nucleotídeos. Um clone contendo o domíniovariável do anticorpo anti-CD52 unido com o domínio constante da cadeiapesada do anticorpo anti-CD20 após verificação de seqüência foi submetidoà mutagênese direcionada a sítio.

Material e métodos:

Enzimas e reagentes:

Taq Polimerase de alta fidelidade Pfu (Stratagene)

Enzima de restrição Dpnl (Stratagene)

Molde de DNA

PBS.KII/ALZ-HC-clóne (a)

Iniciadores

Todos os oligonucleotídeos sintéticos foram sintetizado pelaSIGMA. Os oligonucleotídeos sintetizados foram purificados duas vezes emuma HPLC pela Sigma e transferidos para o Avesthagen. Os oligonucleotí-deos listados na tabela abaixo foram usados para reações de PCR.

INICIADOR SEQÜÊNCIA

Campath-mut-sentido 5'AAGGTGGACAAGAAAGTTGAGCCCAAATCTTGT3'

Campath-mut-anti-sentido 5'ACAAGAI I IGGGCICAAGI MCI lülCGACCI 13'

Reação de Síntese de Filamento Mutante (Ciclização Térmica):

Os componentes/reagentes que seguem foram adicionados aum tubo de PCR de 0,2 ml estéril na ordem indicada abaixo. O volume finalde todas as reações de PCR era 50 jil.

<table>table see original document page 12</column></row><table>

Parâmetros de Ciclização para o Método de Mutagênese Direcionada aSítio de Mudança Rápida:

Etapa 1 (1 ciclo) 95° C/30 segundos

Etapa 2 95° Cl 30 segundos

Etapa 3 55° C/30 segundos

Etapa 4 68° C/7 minutos

Etapa 5 vai para a etapa 2 e repete as etapas 2-4 por 16 vezes

Digestão com Dpn I dos Produtos de Amplificação:

1 uJ de Dpn I (10 U/jo.1) foi adicionado à reação de amplificação. amistura de reação. A mistura foi suavemente e completamente misturada,girada e incubada a 37° C por 1 hora.

Transformação de células competentes DH10b:

A transformação foi realizada conforme recomendado pelo fabri-cante (Stratagene).

4 uJ da reação de PCR foram usados para transformação.

Resultados:

Alinhamento de seqüência da cadeia pesada do anticorpo anti-CD20 (RTX-HC) com o clone da cadeia pesada do anticorpo anti-CD52(ALZ-HC) submetido à mutagênese direcionada ao sítio. A mudança de CApara TT é mostrada destacada em azul.

Alinhamento de seqüência da cadeia pesada do anticorpo anti-CD20 (RTX-HC) com o clone da cadeia pesada do anticorpo anti-CD52(ALZ-HC) submetido à mutagênese direcionada ao sítio. Foi representado nafigura 9.

Subclonagem das cadeias do anticorpo anti-CD52 em veto-res de expressão de mamífero

As cadeias leve e pesada de anticorpo de cadeia pesada do an-ticorpo anti-CD52 de comprimento completo foram clonadas subclonadasnos vetores de expressão de mamífero pCAIN e pCAID respectivamente.

O clone pBSKII/ALZ-LC e o vetor pCAIN foram digeridos comBglll e EcoRI e o construto resultante é referido como pCAIN/ALZ-LC. O in-serto (700 pb) do primeiro e a estrutura de vetor do último foram purificadoscom gel e ligados (figura 10). A mistura de ligação foi transformada em célu-las DH10b competentes a choque térmico e posta em placa em placas deágar LB contendo ampicilina e o antibiótico de seleção. Alguns transforman-tes foram pegos e um mini prep de DNA foi realizado. Os clones foram che-cados através de digestão com enzima de restrição (figura 11).

O clone pBSKII/ALZ-HC-SDM (I.4) e o vetor pCAID foram digeri-dos com BamHI e EcoRI. O construto resultante é referido como pCAID/ALZ-HC. O inserto (1429 pb) do primeiro e a estrutura de vetor do último forampurificados com gel e ligados (figura 12). A mistura de ligação foi transfor-mada em células DH10b competentes a choque térmico e posta em placaem placas de ágar LB contendo ampicilina e o antibiótico de seleção. Algunstransformantes foram pegos e um mini prep de DNA foi realizado. Os clonesforam checados através de digestão com enzima de restrição (figura 13).Seqüenciamento e análise de DNA:

Os clones finais de ALZ-HC e ALC-LC clonados em vetores deexpressão de mamífero pCAID e pCAIN respectivamente foram seqüencia-dos e sua precisão de seqüência confirmada. Os alinhamentos da análise deseqüência foram representados.

O clone b de pCAID/ALZ-HC foi confirmado através de seqüen-ciamento de nucleotídeo de DNA. Três iniciadores diferentes (camp246, 523e CHC845) foram usados para a reação de seqüenciamento. A seqüênciaintegral foi verificada combinar com a seqüência molde (C2).6- Purificação de anticorpo anti-CD52:O anticorpo anti-CD52 é um anticorpo humanizado, que é secre-tado no sobrenadante da célula. Subseqüente ao estabelecimento de umsistema de cultura de célula livre de contaminante de acordo com as orienta-ções das agências reguladoras, que superexpressa a proteína recombinantedesejada, a purificação de proteína de anticorpo anti-CD52 pode ser feitausando uma série de etapas envolvendo procedimentos de diálise-filtrageme cromatografia de coluna envolvendo cromatografia de afinidade. O anticor-po eluído será recuperado para maximizar a atividade in vivo.

7. Ensaios para atividade in vitro e in vivo de anticorpo anti-CD52:

Bioensaios para detecção de atividade de ligação in vitro do an-ticorpo anti-CD52 serão feitos usando:

• Ensaio ELISA de anticorpo anti-CD52

• Lise mediada por complemento de células de leucemia lin-focítica de célula B (células 422 Karpas)

• Os estudos de eficácia in vivo de anticorpo anti-CD52 foramrealizados em pacientes humanos com leucemia linfocíticacrônica de célula B (B-CLL) que foram anteriormente trata-dos com agentes de alquilação e tinham falhado com trata-mento com fludarabina com base em dados atualmentedisponíveis.

Otimização de procedimentos de purificação:

Subseqüente ao estabelecimento de bioatividade reproduzívelde acordo com os ensaios funcionais/de ligação recomendados menciona-dos acima, esforços serão feitos para otimizar os procedimentos de purifica-ção. As estratégias de purificação visarão economia do processo, velocidadepara mercado, escalabilidade, reproducibilidade e pureza máxima do produtocom estabilidade funcional e integridade estrutural como os objetivos princi-pais. Para este efeito, uma abordagem combinatorial com ambas filtragem(filtragem de fluxo normal e tangencial) e cromatografia seria explorada. Osestudos de necessidades de qualificação do processo e critério de aceitaçãoserão conduzidos em 3 bateladas.Deste modo, a presente invenção prevê as etapas que seguemprocesso de purificação:

a. Clarificação inicial usando COHC/A1 HC/filtros de 0,45 |i deprofundidade

b. Concentração usando filtro de corte de 50 kDa Pellicon XLBiomax com base em filtragem de fluxo tangencial

c. Etapa Chromo - I: Cromatografia de afinidade usando oProsep VA Ultra para sobrenadantes de cultura baseadosem soro (2% de soro bovino fetal [FCS]/e Prosep VA paralivres de soro

d. Etapa Chromo - II: Trocador de cátion forte, tal como SPSepharose

e. Etapa Chromo - III: Fluxo através de trocador de ânion fortebaseado, tal como Cellufine Q (um meio baseado em celu-lose) para a remoção de proteínas e ácidos nucléicos decélula hospedeiro.

f. Remoção de vírus usando filtragem por exclusão de tama-nho e proteína A lixiviada usando sulfato Cellufine

g. Filtragem estéril

h. Remoção de endotoxina usando cromatografia Remtox/CelIufine ET

i. Formulação.LISTAGEM DE SEQÜÊNCIA

<110> Avestha Gengraine Technologies Pvt.Ltd, tatianaMorawala Patell, villoo

<120> Método recombinante para a produção de um anticorpo monoclonal paraCD52 para o tratamento de leucemia linfocitica crônica

<130> 23-05-06

<150> 625/CHE/2005<151> 2005-05-05

<160> 6

<170> Patentln versão 3.3

<210> 1

<211> 702

<212> DNA

<213> homo sapiens

<220>

<222> (1) .. (702)<223> -BHQ-HEG-

<400> 1

atg gga tgg age tgt ate ate etc ttc ttg gta gea aca gct aca ggt 48Met Gly Trp ser Cys lie ile teu Phe Leu Vai Ala Thr Ala Thr Gly1 5 10 15

gtc cac tec gac ate cag atg acc cag age cca age age ctg age gcc 96Vai His ser Asp ile Gln Met Thr Gln ser Pro ser Ser Leu'Ser Ala20 25 30

age gtg ggt gac aga gtg acc ate acc tgt aaa gea agt cag aat att 144ser vai Gly Asp Arg VaT Thr Ile Thr cys Lys Ala Ser Gln Asn lie35 40 45

gac aaa tac tta aac tgg tac cag cag aag cca ggt aag gct eca aag 192Asp Lys Tyr Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys pro Gly Lys Al a, Pro Lys50 55 60

ctg ctg ate tac aat aca aac aat ttg caa acg ggt gtg cca age agaLeu Leu ile Tyr Asn Thr Asn Asn Leu Gln Thr Glv VaT pro ser Arg65 70 75 80

240

ttc age ggt age ggt age ggt acc gac ttc acc ttc acc ate age age 288

Phe ser Gly ser GÍy ser Gly Thr Asp Phe Thr Phe Thr Ile Ser Ser85 90 95

etc cag cca gag gac ate gcc acc tac tac tgc ttg cag cat ata agt 336

Leu Gln Pro Glu Asp lie Ala Thr Tyr Tyr cys Leu Gln His ile ser100 105 110agg ccg cgc acg ttc ggc caa ggg acc aag gtg gaa ate aaa cgt act 384Arg pro Arg Thr phe Gly Gln Gly Thr Lys Vai Glu lie Lys Arg Thr115 12Ô 125

gtg gct gea cca tet gtc ttc ate ttc ccg cca tet gat gag cag ttg 432Vai Ala Ala Pro ser vai Phe lie Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu130 135 140

aaa tet gga act gcc tet gtt gtg tgc ctg ctg aat aac ttc tat cec 480Lys ser Gly Thr Ala ser vai vai cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro145 150 155 160

aga gag gcc aaa gta cag tgg aag gtg gat aac gcc etc caa tcg ggt 528Arg Glu Ala Lys vai Gln Trp Lys VaT Asp Asn Ala Leu Gln ser Gly165 170 175

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210 215 220

aca aag age ttc aac agg gga gag tgt tag 702Thr Lys ser Phe Asn Arg Gly Glu cys225 230

<210> 2

<211> 1413

<212> DNA

<213> homo sapiens

<220>

<221> CDS

<222> (1) .. (1413)

<400> 2

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<211> 1413

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465

Claims (9)

1. Processo de preparação de anticorpo monoclonal anti-CD52biologicamente ativo in vivo compreendendo as etapas:• Uma etapa de síntese de novo das cadeias pesada e levedo anticorpo monoclonal anti-CD52• Uma etapa de construção da cadeia leve kappa de compri-mento completo do anticorpo anti-CD52• Uma etapa de construção da cadeia pesada IgG de com-primento completo do anticorpo anti-CD52• Uma etapa de construção de vetores compreendendo asseqüências de ácido nucléico codificando as cadeias de po-lipeptídeo leve e pesada da molécula anti-CD52• Uma etapa de subclonagem das cadeias do anticorpo anti-CD52 em vetores de expressão de mamífero para produçãoda molécula de anticorpo biologicamente ativa.

2. Método de acordo com a reivindicação 1, onde a seqüênciade nucleotídeo codificando a cadeia leve do anticorpo anti-CD52 foi repre-sentada na SEQ ID 1.

3. Método de acordo com a reivindicação 1, onde a seqüênciade nucleotídeo codificando a cadeia pesada do anticorpo anti-CD52 foi re-presentada na SEQ ID NO 2.

4. Método de acordo com a reivindicação 1, onde a seqüênciade aminoácido da cadeia leve do anticorpo anti-CD52 foi mostrada na SEQID3.

5. Método de acordo com a reivindicação 1, onde a seqüênciade aminoácido da cadeia pesada do anticorpo anti-CD52 foi mostrada naSEQ ID4.

6. Método de acordo com a reivindicação 1, onde o vetor com-preendendo o fragmento de ácido nucléico codificando a cadeia pesada doanti-CD52 é submetido à mutagênese direcionada ao sítio.

7. Método de acordo com a reivindicação 1, onde as cadeiaspesada e leve de anti-CD52 de comprimento completo foram subclonadasem vetores de mamífero pCAIN e pCAID respectivamente.

8. Método de preparação de um anticorpo monoclonal anti-CD52biologicamente ativo in vivo compreendendo as etapas de transformação deuma célula hospedeiro com um construto de vetor da FIGURA NQ._e iso-lamento do dito produto a partir da dita célula hospedeiro ou o meio de seucrescimento.

9. Composição farmacêutica compreendendo uma quantidadeterapeuticamente eficaz de anticorpo anti-CD52 e um diluente, adjuvante ouveículo farmaceuticamente aceitável, onde o dito anticorpo é purificado apartir de células de mamífero cultivadas em cultura.