CN106018814B

CN106018814B - 一种用于白血病和自身免疫病检测用试剂盒

Info

Publication number: CN106018814B
Application number: CN201610642436.XA
Authority: CN
Inventors: 廖颖; 刘朝辉
Original assignee: Shenzhen Nanhai Biotechnology Co Ltd
Current assignee: Shenzhen Nanhai Biotechnology Co ltd
Priority date: 2016-08-07
Filing date: 2016-08-07
Publication date: 2017-11-14
Anticipated expiration: 2036-08-07
Also published as: CN106018814A

Abstract

本发明涉及一种用于白血病和自身免疫病检测用试剂盒，其包含CD52突变的抗体，本发明将CD52的抗体通过模拟优化寻找到了最优的对抗体结合起到最大功能的位点，通过特定位点的点突变获得了一系列的突变抗体，所述的抗体相对于原始的抗体，具有更好的结合特性以及结合的准确性，具有不可以预料的效果。同时将突变后的抗体去制备用于检测白细胞个数的试剂盒，具有更好的应用前景。

Description

一种用于白血病和自身免疫病检测用试剂盒

技术领域

本发明涉及医学领域。具体涉及一种用于白血病和自身免疫病检测用试剂盒。

背景技术

CD52又称CAMPATH-1抗原，该抗原表达于正常及恶性的B和T淋巴细胞、NK细胞、单核细胞、巨噬细胞表面及男性的生殖系统组织，是一种存在于B淋巴细胞和T淋巴细胞表面的抗原。针对CD52抗原的单克隆抗体在体内可以暂时清除血液内的淋巴细胞，使免疫系统处于失效状态，使器官移植入患者体内，不会遭到患者免疫系统的排斥，抗CD52单克隆抗体在体内还能够导致抗体依赖性溶解细胞或杀细胞作用，从而清除血液、骨髓和其他受影响细胞中的恶性淋巴细胞。抗CD52单克隆抗体(CAMPATH-1系列)已经被广泛地用于临床治疗，此抗体为人源化抗CD52抗体，于2001年5月7日获得美国FDA批准上市，适应症为"烷化剂及氟达拉宾治疗无效的慢性B淋巴细胞性白血病"。另外，抗CD52单克隆抗体在体内还能够导致抗体依赖性地溶胞或杀细胞作用，从而清除血液、骨髓和其他受影响器官中的恶性淋巴细胞。

目前，虽然国内外已经获得了多种抗CD52抗原的单克隆抗体，但这些单克隆抗体的特异性等特性不够理想。因此，本领域还需要研制对人免疫原性更小，表达量更高，以及具有其他优良特性的抗CD52单克隆抗体，从而开发出对于慢性淋巴细胞白血病具有显著疗效的药物。

CN1225480 C中公开了抗人CD52抗体，但是其结合能力还是不高。和大多数蛋白分子一样，抗CD52单抗具有不稳定性，会经历多种化学和物理降解。和传统合成的小分子药物相比，生物分子具有复杂的结构如一级、二级、三级等高级结构。而蛋白质的结构特别是高级结构非常脆弱，容易发生结构变化，如变性、聚集、和沉淀。保持抗体的高级结构是发挥它们生物学活性的最基本要求。这些降解的产物会对生物制药的安全性产生很大的影响。特别是一些蛋白聚集物会激发人体的免疫反应，轻者会降低生物药物的疗效，重者甚至会造成病人的死亡。抗体药物不仅仅需要在生产的时候能得到高纯度的产品，还要在运输、储存和使用过程中保持结构稳定。CN 101619305 A中同样公开了抗人CD52抗体编码序列及其应用，但是该抗体仍然存在一定的缺陷，效价仍然存在一定的提高空间。

CD52高表达在很多白血病恶性细胞表面。有文献表明，在病人体内，恶性细胞表面的CD52密度远远大于体内的正常细胞，CD52抗原具有的高度糖基化带来的细胞表面负电荷的增加被认为与细胞的恶性程度城正相关性。还有观察报道恶性细胞表面CD52抗原分子可能脱落于血液中，检测病人血清中的可溶性CD52分子可以作为诊断白血病的一个标志。因此，通过抗体检测CD52的表达量可以用来鉴定白血病和相应的自身免疫性疾病。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供针对人CD52具有更高结合特性的的突变的工程抗体，同时提供该单域抗体在制备检测的应用。

本发明提供一种抗体突变的方法，包括结合抗体结构数据分析，针对抗体功能区结构的残基进行计算机结构模拟，通过改变结构域的残基是否突变以及突变的方向，将以往需要多轮突变筛选或是通过噬菌体库筛选突变的方式大大简化，将所有突变选择集中在一起进行结构分析及其可行性，直接一步获得最终的突变方案。因此相比以往方法，本方法更加简捷明确。

本发明提供一种原始的工程抗体，该抗体的重链可变区氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示，其轻链可变区氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。

本发明针对所述的工程抗体，发现其重链可变区氨基酸序列中的第11Leu、14Pro、36Trp、40Ser、81Val、84Gln、86Asn，轻链可变区氨基酸序列中的14Thr、16Gly、35Lys、39Asn、41Leu、84Glu、87Asp、89Gly是抗体中提高抗体性能的决定性位点。

本发明另外提供一种改造后的抗体，所述抗体的在重链可变区氨基酸序列中的第11Leu、14Pro、36Trp、40Ser、81Val、84Gln、86Asn，轻链可变区氨基酸序列中的14Thr、16Gly、35Lys、39Asn、41Leu、84Glu、87Asp、89Gly进行了任一的突变。

通过一系列的验证，所述的位点对于突变后的氨基酸也是有比较苛刻的要求，并非在相应的位点突变为任何的氨基酸均可以提高抗体性能，有些甚至导致抗体的功能减弱。具体的最优的突变氨基酸序列分别为：

重链可变区氨基酸序列中的突变方式为Leu11Pro(表示第11位的Leu突变)、Pro14Ser、Trp36Met、Ser40Val、Val81Cys、Gln84Trp、Asn86Gly任一一个；轻链可变区氨基酸序列突变方式为Thr14Val、Gly16Ser、Lys35Gly、Asn39Met、Leu41Ser、Glu84Tyr、Asp87Ser、Gly89Pro任一一个。

本发明另外提供一种具体的突变组合为：重链可变区的Leu11Pro和轻链可变区的Glu84Tyr、重链可变区的Pro14Ser和轻链可变区的Gly89Pro、重链可变区的Trp36Met和轻链可变区的Lys35Gly、重链可变区的Gln84Trp和轻链可变区的Gly16Ser、重链可变区的Gln84Trp和轻链可变区的Glu84Tyr、重链可变区的Gln84Trp和轻链可变区的Gly89Pro、重链可变区的Asn86Gly和轻链可变区的Thr14Val、重链可变区的Asn86Gly和轻链可变区的Lys35Gly、重链可变区的Asn86Gly和轻链可变区的Leu41Ser、重链可变区的Asn86Gly和轻链可变区的Gly89Pro。

本发明另外一方面，提供了一种DNA分子，它编码选自下组的蛋白质：本发明所述的人CD52的突变的单克隆抗体，或本发明所述的人CD52突变的单克隆抗体。

本发明的另外一方面，提供了一种宿主细胞，其特征在于，它含有表达上述突变的单克隆抗体的编码链。

本发明的另外一方面，提供了本发明所述的人CD52突变单克隆抗体用于检测以及治疗白血病的用途。

有益效果：与现有技术相比，本发明的优点如下：本发明将CD52单克隆抗体通过优化寻找到了最优的对抗体结合起到最大功能的位点，通过特定位点的点突变获得了一系列的突变抗体，所述的抗体相对于原始的抗体，具有更好的结合结合特性以及结合的准确性，具有不可以预料的效果。同时将突变后的抗体去制备用于检测及治疗白血病的试剂盒，具有更好的应用前景。

具体实施方式

实施例1抗体突变位点的选定

首先，针对SEQ ID NO：1和2的抗体重链可变区和轻链可变区链进行抗体结构数据分析，针对结构域的残基进行计算机结构模拟，重链可变区氨基酸序列中的第11Leu、14Pro、36Trp、40Ser、81Val、84Gln、86Asn，轻链可变区氨基酸序列中的14Thr、16Gly、35Lys、39Asn、41Leu、84Glu、87Asp、89Gly是抗体中提高抗体性能的决定性位点。

通过建模，发现，在以上位点进行特定氨基酸的突变，可以提高与CD52的结合能力，这些具体的重链可变区突变形式分别为：Leu11Pro、Pro14Ser、Trp36Met、Ser40Val、Val81Cys、Gln84Trp、Asn86Gly任一一个；轻链可变区氨基酸序列突变方式为Thr14Val、Gly16Ser、Lys35Gly、Asn39Met、Leu41Ser、Glu84Tyr、Asp87Ser、Gly89Pro任一一个；另外提供一种具体的突变组合为：重链可变区的Leu11Pro和轻链可变区的Glu84Tyr、重链可变区的Pro14Ser和轻链可变区的Gly89Pro、重链可变区的Trp36Met和轻链可变区的Lys35Gly、重链可变区的Gln84Trp和轻链可变区的Gly16Ser、重链可变区的Gln84Trp和轻链可变区的Glu84Tyr、重链可变区的Gln84Trp和轻链可变区的Gly89Pro、重链可变区的Asn86Gly和轻链可变区的Thr14Val、重链可变区的Asn86Gly和轻链可变区的Lys35Gly、重链可变区的Asn86Gly和轻链可变区的Leu41Ser、重链可变区的Asn86Gly和轻链可变区的Gly89Pro任一一种形式。

实施例2突变抗体的制备

通过全序列合成的方式，获得了编码SEQ ID NO：1和2的氨基酸序列的编码核苷酸序列，在生物工程公司合成。采用定点突变法分三段扩增带有上述突变位点的序列，然后用搭桥PCR法，扩增得到突变抗体CD52的编码基因序列。将前面所获得25种不同的单克隆抗体亚克隆至表达性的载体PET32a中，并将测序鉴定正确的重组质粒转化到表达型宿主菌DE3中，其涂布在含有100μg/mL氨苄青霉素的LB固体培养基的板上，37℃过夜。(2)挑选单个菌落接种在10mL含有氨苄青霉素的LB培养液中，37℃摇床培养过夜。(3)接种1mL的过夜菌种至300mL LB培养基中，37℃摇床培养，培养到OD值达到1.0时，加入IPTG，28℃摇床培养过夜，(4)第二天，离心收菌。(5)将菌体破碎以获得抗体粗提液。(6)经镍柱离子亲和层析纯化抗体蛋白，为获得高纯度的抗体，所述抗体为ScFv。采用咪唑梯度洗脱法，低浓度咪唑洗脱液(50mmol)用于洗去杂带，高浓度咪唑洗脱液(250mmol，500mmol)最终可制备纯度达99％以上的蛋白。将蛋白浓度调整为140mg/ml。

实施例3抗体性质分析

1、表面胞质团共振法测突变体抗体的结合常数Kd

抗原CD52采用(人CD52基因的克隆及稳定转染细胞系的建立，刘友等)方法制备得到得到，蛋白浓度稀释为10mg/mL。抗原也可以采用商业购买的方式获得。利用Biacore3000测突变后的抗体与抗原的绝对亲和力。选用CM-5传感片，表面吸附羧甲基葡聚糖。两个流通池(pathway)均以20μ1/min的流速活化6min,将5μg抗原CD52溶于50mM pH7.0的磷酸溶液，以15μl/min的流速注入芯片流通池1，其表面密度约为10KRu，抗原标记后再用1M乙醇胺将芯片表面封闭。结合条件：各检测抗体原液浓度为1Omg/ml,依次稀释成200μg/ml,100μg/ml,50μg/ml,25μg/ml,12μg/ml,0μg/ml,以10μl/min的速度注入芯片的两个流通池,上样3min；解离条件：流速10μ1/min,解离3min。芯片再生条件：10mM NaOH,1M NaCl。用Biacoreevaluation软件分析抗体亲和常数KD。结果如下：

从以上结果可以看出，经过突变后的抗体其亲和常数得到大大的提高，对于抗原的结合能力也提高了一个数量级。但是针对位点的突变，也不是任一的突变都具有提高抗体亲和力的效果，比如重链Trp36Asp突变的抗体、重链Asn86Pro突变的抗体、轻链Glu84Gly突变的抗体、轻链Asp87Gly突变的抗体、轻链Gly89Met突变的抗体均导致抗体的亲和力大幅度的降低，其它的位点突变也不能提高抗体的亲和力，在此不一一列举。

实施例4：外周血细胞检测

正常人外周血检测

取31个试管，每管加入正常人抗凝外周血100μl(其中白细胞的浓度为6000个)，加入0.5μg PE标记的本申请制备得到的抗体(同时采用磁珠标记)，室温避光孵育20分钟，使用磁性进行细胞分离；加入2ml溶血素室温避光反应10分钟后1000转/分钟离心5分钟，弃上清；加入2ml冷PBS缓冲液，重悬，1000转/分钟离心5分钟，弃上清；加入300μl含1％多聚甲醛的PBS缓冲液，流式细胞仪检测。通过检测，发现其中通过磁珠分离的细胞均为白细胞，通过细胞检测发现，本发明提供的重链可变区和轻链可变区突变的抗体分离后的血液中，残留的白细胞个数均小于10个。而CD52抗体、CD52-26突变抗体、CD52-27突变抗体、CD52-28突变抗体、CD52-29突变抗体、CD52-30突变抗体其处理后的血液通过细胞仪检测其中白细胞残留的数量分别为325、3840、4956、4245、5346、3998个。由此可见，本发明提供的抗体具有更好的检测白细胞的最低限度。

以上仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，凡在本发明的精神和原则之内所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

序列表

〈110〉查文娟

〈120〉一种用于白血病和自身免疫病检测用试剂盒

〈160〉2

<210>1

<211>114

<212>PRT

<400>重链可变区氨基酸序列

Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Met Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Ala

20 25 30

Trp Met Asp Trp Val Arg Arg Ser Pro Glu Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ala Glu Ile Arg Asn Lys Ala Lys Asn His Val Thr Tyr Tyr Ala Ala

50 55 60

Ser Val Lys Gly Arg Phe Ser Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Ser Ser

65 70 75 80

Val Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Gly Ile Tyr

85 90 95

Tyr Cys Thr Thr Leu Asp Lys Trp Gly Gln Gly Thr Pro Val Thr Val

100 105 110

Ser Ser

<210>2

<211>113

<212>PRT

<213> 轻链可变结构域

<400>2

Asp Ile Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Thr Leu Ser Val Thr Ile Gly

1 5 10 15

Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asp Ser

20 25 30

Asp Gly Lys Thr Tyr Leu Asn Trp Leu Leu Gln Arg Pro Gly Gln Ser

35 40 45

Pro Lys Arg Leu Ile Phe Leu Val Ser Ala Leu Asp Ser Gly Val Pro

50 55 60

Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Arg Ile

65 70 75 80

Asn Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Ile Tyr Tyr Cys Trp Gln Gly

85 90 95

Thr His Phe Pro Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Gln Glu Ile Lys

100 105 110

Arg

Claims

1.一种用于白血病检测用试剂盒，其含有抗体，所述抗体含有重链可变区序列和轻链可变区序列，其序列分别如SEQ ID No：1和2所示。

2.一种用于白血病检测用试剂盒，其含有抗体，所述抗体含有重链可变区序列和轻链可变区序列，其特征在于：所述抗体的重链可变区序列和轻链可变区序列分别在SEQ IDNo：1和2的基础上，存在如下任一的突变组合：重链可变区的Leu11Pro和轻链可变区的Glu84Tyr、重链可变区的Pro14Ser和轻链可变区的Gly89Pro、重链可变区的Trp36Met和轻链可变区的Lys35Gly、重链可变区的Gln84Trp和轻链可变区的Gly16Ser、重链可变区的Gln84Trp和轻链可变区的Glu84Tyr、重链可变区的Gln84Trp和轻链可变区的Gly89Pro、重链可变区的Asn86Gly和轻链可变区的Thr14Val、重链可变区的Asn86Gly和轻链可变区的Lys35Gly、重链可变区的Asn86Gly和轻链可变区的Leu41Ser、或重链可变区的Asn86Gly和轻链可变区的Gly89Pro。

3.根据权利要求1-2任一所述的抗体在制备用于白血病检测中的试剂盒应用。