CN105624082B - 表达单链抗体scFV或多肽适配体的功能化细菌磁颗粒及其应用 - Google Patents

表达单链抗体scFV或多肽适配体的功能化细菌磁颗粒及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供一种表达单链抗体scFV或多肽适配体的功能化细菌磁颗粒，该功能化细菌磁颗粒的结构物质由单链抗体scFV或多肽适配体通过多肽链与细菌磁颗粒膜蛋白融合表达而成，该功能化细菌磁颗粒一方面可以继续发挥细菌磁颗粒磁纳米颗粒的特点，另一个方面可发挥单链抗体scFV和多肽适配体的优越特性。

Description

表达单链抗体scFV或多肽适配体的功能化细菌磁颗粒及其 应用
技术领域
本发明涉及纳米磁珠应用和医学检测领域，具体是涉及表达单链抗体scFV或多肽适配体的功能化细菌磁颗粒及其应用。
背景技术
细菌磁颗粒是趋磁细菌生产的一种磁性纳米颗粒，内核是Fe3O4晶体，外面有一层磷脂生物膜包被，粒径在30-120nm之间。同一种趋磁细菌生产的细菌磁颗粒粒径大小和晶体晶型基本一致，磁学性质均一，有天然生物膜包被，具有很好的水溶性质和胶体性质。此外，因为细菌磁颗粒是生物来源，因此具有较好的生物相容性。细菌磁颗粒膜上带有大量的氨基基团，可通过化学修饰和双功能偶联剂连接不同的功能大分子，如抗体，从而具有不同的特殊功能。细菌磁颗粒最独特的地方在于它可以通过基因工程的方法在细菌磁颗粒膜上表达特殊的蛋白质，功能性的靶蛋白可以在细菌磁颗粒上展示出来。
细菌磁颗粒修饰抗体一直是其功能化应用的重要方面，最常见的是通过双功能偶联试剂进行化学修饰，此外还有通过表达亲和蛋白特异性结合抗体的生物修饰。基因工程抗体又称重组抗体，是通过重组DNA及蛋白质工程技术改良抗体性能，主要是对编码抗体的基因按不同需要进行加工改造和重新装配。其中的单链抗体scFV由抗体重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)通过20个左右的氨基酸短肽(linker)连接而成。单链抗体scFV可以认为是完整抗体的部分片段，比完整抗体要小，可以在原核表达系统中表达。其优点是非特异性结合少，在基因工程上最容易做成抗体融合蛋白，其缺点是缺少Fc结构域片段的保护，在体内容易降解。多肽适配体源于噬菌体展示技术，一般是一段10-20个残基的多肽，其作为适配体能与相应的配体进行高亲和力和强特异性的结合，具有抗体性质。多肽适配体的筛选是化学生物学和生物医学的交叉，提供了一种对靶标配体(可以是抗原、大分子药物、毒素、天然产物等大分子物质)高效快速识别的研究平台，在诊断、化学分析等许多方面显示了良好的应用前景。但是多肽适配体与其靶标配体结合后的分离过程比较复杂，因此严重限制了多肽适配体的应用。现有技术公开了利用偶联剂或交联剂分别将酶、抗体连接在细菌磁颗粒上，构建磁性复合物，用于固定化酶或检测病原菌等有害物质；这些方法的构建都是直接将细菌磁颗粒与上述物质偶联，而CN104278048公开了一种重组质粒，该质粒通过磁螺旋菌野生型菌株MSR-1的基因组DNA为模板，通过带有(GLy4Ser)3Linker的引物扩增得到生物素羧基载体蛋白基因。现有技术公开的linker的氨基酸序列短，细菌磁颗粒膜蛋白与不同的抗体或蛋白结合后，会产生两者的空间结构相互影响的技术问题。
发明内容
为了解决上述技术问题，本发明提供一种表达单链抗体scFV或多肽适配体的功能化细菌磁颗粒及其应用。本发明利用细菌磁颗粒膜上可以融合表达单链抗体scFV或多肽适配体的特性，通过基因工程的方法在细菌磁颗粒膜上展示具有单链scFV抗体和具有抗体性质的多肽适配体。
本发明具体技术方案如下：
本发明提供一种表达单链抗体scFV或多肽适配体的功能化细菌磁颗粒，该功能化细菌磁颗粒的结构物质由单链抗体scFV或多肽适配体通过多肽链与细菌磁颗粒膜蛋白融合表达而成。
进一步的改进，该多肽链的氨基酸残基为Q[(Ala2GlySer)a(Ala Gly3SerAla)b(GlySerAla2)a]，Q＝1-3，a＝1-4，b＝4-7。
本发明通过提供的多肽链是一般柔性linker多肽长度的3倍；并且其两端和中间增加了刚性的Ala残基，以此用于稳定两个不同蛋白的空间结构，并且克服了两个蛋白之间存在着相互影响的技术问题。
进一步的改进，所述功能化细菌磁颗粒的结构物质由单链抗体scFV通过多肽链与细菌磁颗粒膜蛋白融合表达而成；所述多肽链的氨基酸残基为(Ala2GlySer)3(AlaGly3SerAla)5(GlySerAla2)3，多肽链的序列为
Figure BDA0000943872860000033
Figure BDA0000943872860000031
进一步的改进，所述功能化细菌磁颗粒的结构物质由多肽适配体通过多肽链与细菌磁颗粒膜蛋白融合表达而成；所述多肽链的氨基酸残基为2[(Ala2GlySer)2(AlaGly3SerAla)6(GlySerAla2)2]，多肽链的序列为
Figure BDA0000943872860000034
Figure BDA0000943872860000032
以上限定的多肽链序列可以有效地转录。
进一步的改进，所述单链抗体scFV为anti-CD19单链抗体，所述多肽适配体为MUC1适配体或CTLA4适配体。
本发明另一方面提供了表达单链抗体scFV或多肽适配体的功能化细菌磁颗粒在用于抗原的磁分选，用于蛋白质、药物分子或天然产物的富集纯化及分离提取，或用于制备清除肿瘤细胞或组织的复合物中的应用。
本发明另一方面提供一种表达单链抗体scFV或多肽适配体的功能化细菌磁颗粒的制备方法，该方法包括如下步骤：
a.构建细菌磁颗粒膜蛋白mamC/mamF基因缺失的趋磁细菌MSR-1突变株；
b.构建功能化细菌磁颗粒膜蛋白融合表达质粒；
c.将功能化细菌磁颗粒融合表达质粒通过接合转入到步骤a制得的趋磁细菌MSR-1突变株，构建趋磁细菌MSR-1重组株；
d.对趋磁细菌MSR-1重组株进行培养；
e.分离纯化，制得功能化细菌磁颗粒。
进一步的改进，步骤a所述构建细菌磁颗粒膜蛋白mamC/mamF基因缺失的趋磁细菌MSR-1突变株的具体方法为：
(a)扩增细菌磁颗粒膜蛋白mamC/mamF基因左右两侧共两个长均为700-1000bp的同源片段；左右两同源片段均带有两个酶切位点；
(b)左右同源片段分别用相应的限制性内切酶进行双酶切；同时对自杀质粒pKmobsacB进行双酶切；
(c)将经过双酶切后的左右同源片段和经过双酶切后的自杀质粒pKmobsacB进行连接，连接产物转到E.coli感受态细胞中，挑选连接正确的阳性克隆菌；
(d)将阳性克隆菌作为供体与趋磁细菌MSR-1受体菌进行亲本接合，并导入pKmobsacB重组质粒，通过卡那抗性筛选趋磁细菌MSR-1同源整合突变株，突变株再通过蔗糖梯度筛选趋磁细菌MSR-1双交换突变株，最后选择卡那抗性敏感的双交换菌株进行验证，构建成细菌磁颗粒膜蛋白mamC/mamF基因缺失的趋磁细菌MSR-1突变株；
步骤b所述功能化细菌磁颗粒膜蛋白融合表达质粒的构建方法如下：
(1)扩增细菌磁颗粒膜蛋白mamC/mamF基因跨膜结构域的DNA片段，所述DNA片段两端分别带有双酶切位点；对扩增产物DNA片段及pBBR质粒进行双酶切，回收双酶切的DNA片段及双酶切的pBBR质粒；将双酶切的DNA片段与双酶切的pBBR质粒进行连接，连接产物转化大肠杆菌感受态细胞中，筛选连接正确的阳性克隆，得到重组质粒pBBR-细菌磁颗粒膜蛋白mamC/mamF基因；
(2)单链抗体scFV或多肽适配体的编码序列克隆在pUC57载体上，并分别在其5’端合成编码表达多肽链Q[(Ala2GlySer)a(Ala Gly3SerAla)b(GlySerAla2)a]，Q＝1-3，a＝1-4，b＝4-7的基因序列，在合成基因序列两端分别加上双酶切位点，制得多肽链-单链抗体scFV或多肽适配体质粒；
(3)对步骤(2)基因合成得到的多肽链-单链抗体scFV或多肽适配体质粒进行扩增和双酶切；
(4)对步骤(1)得到的重组质粒pBBR-细菌磁颗粒膜蛋白mamC/mamF基因进行双酶切并纯化，和步骤(3)得到的经过双酶切的多肽链-单链抗体scFV或多肽适配体质粒的基因片段进行连接，连接产物转化大肠感觉感受态细胞中，筛选并验证连接正确的阳性克隆，最终得到功能化细菌磁颗粒膜蛋白融合表达质粒pBBR--细菌磁颗粒膜蛋白mamC/mamF基因-多肽链-单链抗体scFV或多肽适配体；
步骤c的具体制备方法为：
Ⅰ以功能化细菌磁颗粒膜蛋白融合表达质粒pBBR--细菌磁颗粒膜蛋白mamC/mamF基因-多肽链-单链抗体scFV或多肽适配体作为供体，通过亲本接合实验将其导入到细菌磁颗粒膜蛋白mamC/mamF基因缺失的趋磁细菌MSR-1突变株，构建生产功能化细菌磁颗粒的趋磁细菌MSR-1重组株。
进一步的改进，步骤d中对趋磁细菌MSR-1重组株进行培养包括如下步骤：
d-a.向培养罐中加入第一培养基，紫外线灭菌5-7min，静置1h后，将趋磁细菌MSR-1重组株接种到培养罐中，进行第一次培养，获得第一培养液；第一次培养的条件为：起始pH值为4.5-5.1，培养温度为20-25℃，培养时间为5-7天，摇床转速为120-150转/分钟，培养过程中通入氧气，通入氧气的方式为：间隔5min，通入20min氧气；
d-b.将第一培养液加入含有第二培养基的培养罐中，无氧状态进行第二次培养；第二次培养的条件为：起始pH值为5.7-5.9，培养温度为30-32℃，培养时间为2-3天，摇床转速为200-250转/分钟。
进一步的改进，所述第一培养基由重量份数为10-12份生物素、0.8-1.2份多聚谷氨酸、1-2份壳聚糖、1-3份磷酸二氢钠、0.5-1份脂肪酸乳酰酯、0.1-0.3份抗坏血酸钠、0.5-1份海藻酸铵和1-2份硝酸钾组成；
所述第二培养基由重量份数为1-1.5份琼脂、0.2-0.5份普鲁兰、1-2份6-苄基氨基嘌呤、0.5-1份异丙醇胺、1-2份硝酸铵、0.5-1份聚乙二醇4000、0.5-0.7份氯化钙、0.2-0.5份维生素E和0.2-0.5份木糖醇酐单油酸酯组成。
本发明所提供的培养步骤不但能够提高对趋磁细菌MSR-1重组株的扩增能力，同时能够增强细菌磁颗粒对单链抗体scFV或多肽适配体的负载能力。进一步的改进，步骤e所述的分离纯化具体步骤如下：
1)离心并收集培养后的趋磁细菌MSR-1重组株，用磷酸盐缓冲液悬浮，得悬浮液；
2)超声波破碎悬浮液中的细胞；
3)磁力装置吸附破碎后的细胞，静置过夜，弃去上清，用磷酸盐缓冲液重新悬浮吸附到的沉淀，超声波清洗，磁力装置再次吸附，弃上清，将吸附到的沉淀用磷酸盐缓冲液悬浮，洗涤3次，即得功能化细菌磁颗粒；
优选地，
离心条件为：转速12000-15000rpm，离心时间6-7min；超声波破碎条件为：超声功率300-320w，超声时间3-5s，间隔时间4-5s，超声次数50次；超声波清洗条件为：超声功率100-120w，超声时间3-5s，间隔时间3-5s，超声次数25次。
本发明通过将单链抗体scFV与细菌磁颗粒结合之后，由于有细菌磁颗粒锚定蛋白及细菌磁颗粒膜的保护，单链抗体scFV的稳定性得到极大的提高。多肽适配体具有适合基因操作以及化学合成修饰的两种优点，利用其基因操作的特点可以和细菌磁颗粒成为互相修饰的“最佳伴侣”，并且结合后多肽适配体的稳定性也得到了很大的提高；并且细菌磁颗粒高效表达多肽适配体，多肽适配体利用细菌磁颗粒作磁修饰。
细菌磁颗粒表达单链抗体scFV或多肽适配体一方面可以继续发挥细菌磁颗粒磁纳米颗粒的特点，另一个方面可发挥单链抗体scFV和多肽适配体的优越特性。相比天然抗体需要通过化学偶联或者亲和偶联才能修饰在磁性纳米颗粒上，单链抗体scFV和多肽适配体作为小分子多肽可以更容易在不同表达系统中表达，这也可以充分发挥细菌磁颗粒表达单链抗体scFV或多肽适配体的优势。基于这些，细菌磁颗粒成功表达单链抗体scFV或多肽适配体的应用价值可在很多领域得到体现。
细菌磁颗粒与化学合成磁珠相比最大的优势是它具有重组基因分子操作的特性，能够在细菌里直接表达功能化目的蛋白，并在细菌磁颗粒膜表面固定展示。这等于把原核重组表达和体外化学合成、修饰这些不同的过程完美地结合在一起，这也是基于基因工程的生产功能化细菌磁颗粒的好处所在。
本发明的一方面提供了表达单链抗体scFV或多肽适配体功能化细菌磁颗粒，即通过特定重组基因分子操作的方法在趋磁细菌内生产表达单链抗体scFV或多肽适配体的功能化细菌磁颗粒。该表达单链抗体scFV或多肽适配体均显示与天然抗体近似的抗原结合能力。
具体实施方式
下面将对本发明的技术方案进行清楚、完整的描述，显然，所描述的实施例仅是本发明的一部分实施例，不能用来限制本发明的范围。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其它实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1表达单链抗体scFV的功能化细菌磁颗粒
该功能化细菌磁颗粒的结构物质由单链抗体scFV通过多肽链与细菌磁颗粒膜蛋白融合表达而成；该多肽链的氨基酸残基为(Ala2GlySer)3(AlaGly3SerAla)5(GlySerAla2)3，多肽链的序列为
Figure BDA0000943872860000082
Figure BDA0000943872860000081
实施例2表达多肽适配体的功能化细菌磁颗粒
该功能化细菌磁颗粒的结构物质由多肽适配体通过多肽链与细菌磁颗粒膜蛋白融合表达而成；该多肽链的氨基酸残基为2[(Ala2GlySer)2(AlaGly3SerAla)6(GlySerAla2)2]，多肽链的序列为
Figure BDA0000943872860000093
Figure BDA0000943872860000091
实施例3表达单链抗体scFV的功能化细菌磁颗粒
该功能化细菌磁颗粒的结构物质由单链抗体scFV通过多肽链与细菌磁颗粒膜蛋白融合表达而成；该多肽链的氨基酸残基为2[(Ala2GlySer)2(AlaGly3SerAla)6(GlySerAla2)2]，多肽链的序列为
Figure BDA0000943872860000094
Figure BDA0000943872860000092
该功能化细菌磁颗粒是通过如下方法制备得到的：
a.构建细菌磁颗粒膜蛋白mamC/mamF基因缺失的趋磁细菌MSR-1突变株；
b.构建功能化细菌磁颗粒膜蛋白融合表达质粒；
c.将功能化细菌磁颗粒融合表达质粒通过接合转入到步骤a制得的趋磁细菌MSR-1突变株，构建趋磁细菌MSR-1重组株；
d.对趋磁细菌MSR-1重组株进行培养；
e.分离纯化，制得功能化细菌磁颗粒。
实施例4表达多肽适配体的功能化细菌磁颗粒
该功能化细菌磁颗粒的结构物质由多肽适配体通过多肽链与细菌磁颗粒膜蛋白融合表达而成；该多肽链的氨基酸残基为(Ala2GlySer)3(AlaGly3SerAla)5(GlySerAla2)3，多肽链的序列为
Figure BDA0000943872860000102
Figure BDA0000943872860000101
该功能化细菌磁颗粒是通过如下方法制备得到的：
a.构建细菌磁颗粒膜蛋白mamC/mamF基因缺失的趋磁细菌MSR-1突变株；
b.构建功能化细菌磁颗粒膜蛋白融合表达质粒；
c.将功能化细菌磁颗粒融合表达质粒通过接合转入到步骤a制得的趋磁细菌MSR-1突变株，构建趋磁细菌MSR-1重组株；
d.对趋磁细菌MSR-1重组株进行培养；
e.分离纯化，制得功能化细菌磁颗粒。
实施例5一种表达单链抗体scFV的功能化细菌磁颗粒的制备方法该方法包括如下步骤：
a.构建细菌磁颗粒膜蛋白mamC/mamF基因缺失的趋磁细菌MSR-1突变株；
(a)扩增细菌磁颗粒膜蛋白mamC/mamF基因左右两侧共两个长均为700-1000bp的同源片段；左右两同源片段均带有两个酶切位点；
(b)左右同源片段分别用相应的限制性内切酶进行双酶切；同时对自杀质粒pKmobsacB进行双酶切；
(c)将经过双酶切后的左右同源片段和经过双酶切后的自杀质粒pKmobsacB进行连接，连接产物转到E.coli感受态细胞中，挑选连接正确的阳性克隆菌；
(d)将阳性克隆菌作为供体与趋磁细菌MSR-1受体菌进行亲本接合，并导入pKmobsacB重组质粒，通过卡那抗性筛选趋磁细菌MSR-1同源整合突变株，突变株再通过蔗糖梯度筛选趋磁细菌MSR-1双交换突变株，最后选择卡那抗性敏感的双交换菌株进行验证，构建成细菌磁颗粒膜蛋白mamC/mamF基因缺失的趋磁细菌MSR-1突变株；
b.构建功能化细菌磁颗粒膜蛋白融合表达质粒；
(1)扩增细菌磁颗粒膜蛋白mamC/mamF基因跨膜结构域的DNA片段，所述DNA片段两端分别带有双酶切位点；对扩增产物DNA片段及pBBR质粒进行双酶切，回收双酶切的DNA片段及双酶切的pBBR质粒；将双酶切的DNA片段与双酶切的pBBR质粒进行连接，连接产物转化大肠杆菌感受态细胞中，筛选连接正确的阳性克隆，得到重组质粒pBBR-细菌磁颗粒膜蛋白mamC/mamF基因；
(2)单链抗体scFV的编码序列克隆在pUC57载体上，并分别在其5’端合成编码表达多肽链Q[(Ala2GlySer)a(Ala Gly3SerAla)b(GlySerAla2)a]，Q＝1-3，a＝1-4，b＝4-7的基因序列，在合成基因序列两端分别加上双酶切位点，制得多肽链-单链抗体scFV质粒；
(3)对步骤(2)基因合成得到的多肽链-单链抗体scFV质粒进行扩增和双酶切；
(4)对步骤(1)得到的重组质粒pBBR-细菌磁颗粒膜蛋白mamC/mamF基因进行双酶切并纯化，和步骤(3)得到的经过双酶切的多肽链-单链抗体scFV质粒的基因片段进行连接，连接产物转化大肠感觉感受态细胞中，筛选并验证连接正确的阳性克隆，最终得到功能化细菌磁颗粒膜蛋白融合表达质粒pBBR--细菌磁颗粒膜蛋白mamC/mamF基因-多肽链-单链抗体scFV；
c.将功能化细菌磁颗粒融合表达质粒通过接合转入到步骤a制得的趋磁细菌MSR-1突变株，构建趋磁细菌MSR-1重组株；
Ⅰ以功能化细菌磁颗粒膜蛋白融合表达质粒pBBR--细菌磁颗粒膜蛋白mamC/mamF基因-多肽链-单链抗体scFV作为供体，通过亲本接合实验将其导入到细菌磁颗粒膜蛋白mamC/mamF基因缺失的趋磁细菌MSR-1突变株，构建生产功能化细菌磁颗粒的趋磁细菌MSR-1重组株；
d.对趋磁细菌MSR-1重组株进行培养；
e.分离纯化，制得功能化细菌磁颗粒。
实施例6一种表达多肽适配体的功能化细菌磁颗粒的制备方法
该方法包括如下步骤：
a.构建细菌磁颗粒膜蛋白mamC/mamF基因缺失的趋磁细菌MSR-1突变株；
(a)扩增细菌磁颗粒膜蛋白mamC/mamF基因左右两侧共两个长均为700-1000bp的同源片段；左右两同源片段均带有两个酶切位点；
(b)左右同源片段分别用相应的限制性内切酶进行双酶切；同时对自杀质粒pKmobsacB进行双酶切；
(c)将经过双酶切后的左右同源片段和经过双酶切后的自杀质粒pKmobsacB进行连接，连接产物转到E.coli感受态细胞中，挑选连接正确的阳性克隆菌；
(d)将阳性克隆菌作为供体与趋磁细菌MSR-1受体菌进行亲本接合，并导入pKmobsacB重组质粒，通过卡那抗性筛选趋磁细菌MSR-1同源整合突变株，突变株再通过蔗糖梯度筛选趋磁细菌MSR-1双交换突变株，最后选择卡那抗性敏感的双交换菌株进行验证，构建成细菌磁颗粒膜蛋白mamC/mamF基因缺失的趋磁细菌MSR-1突变株；
b.构建功能化细菌磁颗粒膜蛋白融合表达质粒；
(1)扩增细菌磁颗粒膜蛋白mamC/mamF基因跨膜结构域的DNA片段，所述DNA片段两端分别带有双酶切位点；对扩增产物DNA片段及pBBR质粒进行双酶切，回收双酶切的DNA片段及双酶切的pBBR质粒；将双酶切的DNA片段与双酶切的pBBR质粒进行连接，连接产物转化大肠杆菌感受态细胞中，筛选连接正确的阳性克隆，得到重组质粒pBBR-细菌磁颗粒膜蛋白mamC/mamF基因；
(2)多肽适配体的编码序列克隆在pUC57载体上，并分别在其5’端合成编码表达多肽链Q[(Ala2GlySer)a(Ala Gly3SerAla)b(GlySerAla2)a]，Q＝1-3，a＝1-4，b＝4-7的基因序列，在合成基因序列两端分别加上双酶切位点，制得多肽链-多肽适配体质粒；
(3)对步骤(2)基因合成得到的多肽链-多肽适配体质粒进行扩增和双酶切；
(4)对步骤(1)得到的重组质粒pBBR-细菌磁颗粒膜蛋白mamC/mamF基因进行双酶切并纯化，和步骤(3)得到的经过双酶切的多肽链-多肽适配体质粒的基因片段进行连接，连接产物转化大肠感觉感受态细胞中，筛选并验证连接正确的阳性克隆，最终得到功能化细菌磁颗粒膜蛋白融合表达质粒pBBR--细菌磁颗粒膜蛋白mamC/mamF基因-多肽链-多肽适配体；
c.将功能化细菌磁颗粒融合表达质粒通过接合转入到步骤a制得的趋磁细菌MSR-1突变株，构建趋磁细菌MSR-1重组株；
Ⅰ以功能化细菌磁颗粒膜蛋白融合表达质粒pBBR--细菌磁颗粒膜蛋白mamC/mamF基因-多肽链-多肽适配体作为供体，通过亲本接合实验将其导入到细菌磁颗粒膜蛋白mamC/mamF基因缺失的趋磁细菌MSR-1突变株，构建生产功能化细菌磁颗粒的趋磁细菌MSR-1重组株；
d.对趋磁细菌MSR-1重组株进行培养；
e.分离纯化，制得功能化细菌磁颗粒。
实施例7一种表达单链抗体scFV功能化细菌磁颗粒的制备方法
该方法与实施例5不同的是，步骤d中对趋磁细菌MSR-1重组株进行培养包括如下步骤：
d-a.向培养罐中加入第一培养基，紫外线灭菌5min，静置1h后，将趋磁细菌MSR-1重组株接种到培养罐中，进行第一次培养，获得第一培养液；第一次培养的条件为：起始pH值为4.5，培养温度为20℃，培养时间为6天，摇床转速为120转/分钟，培养过程中通入氧气，通入氧气的方式为：间隔5min，通入20min氧气；
d-b.将第一培养液加入含有第二培养基的培养罐中，无氧状态进行第二次培养；第二次培养的条件为：起始pH值为5.7，培养温度为30℃，培养时间为2天，摇床转速为200转/分钟；
所述第一培养基由重量份数为10份生物素、0.8份多聚谷氨酸、1份壳聚糖、1份磷酸二氢钠、0.5份脂肪酸乳酰酯、0.1份抗坏血酸钠、0.5份海藻酸铵和1份硝酸钾组成；
所述第二培养基由重量份数为1份琼脂、0.2份普鲁兰、1份6-苄基氨基嘌呤、0.5份异丙醇胺、1份硝酸铵、0.5份聚乙二醇4000、0.5份氯化钙、0.2份维生素E和0.2份木糖醇酐单油酸酯组成。
实施例8一种表达多肽适配体A功能化细菌磁颗粒的制备方法
该方法与实施例6不同的是，步骤d中对趋磁细菌MSR-1重组株进行培养包括如下步骤：
d-a.向培养罐中加入第一培养基，紫外线灭菌7min，静置1h后，将趋磁细菌MSR-1重组株接种到培养罐中，进行第一次培养，获得第一培养液；第一次培养的条件为：起始pH值为5.1，培养温度为25℃，培养时间为7天，摇床转速为150转/分钟，培养过程中通入氧气，通入氧气的方式为：间隔5min，通入20min氧气；
d-b.将第一培养液加入含有第二培养基的培养罐中，无氧状态进行第二次培养；第二次培养的条件为：起始pH值为5.9，培养温度为32℃，培养时间为3天，摇床转速为250转/分钟；
所述第一培养基由重量份数为12份生物素、1.2份多聚谷氨酸、2份壳聚糖、3份磷酸二氢钠、1份脂肪酸乳酰酯、0.3份抗坏血酸钠、1份海藻酸铵和2份硝酸钾组成；
所述第二培养基由重量份数为1.5份琼脂、0.5份普鲁兰、2份6-苄基氨基嘌呤、1份异丙醇胺、2份硝酸铵、1份聚乙二醇4000、0.7份氯化钙、0.5份维生素E和0.5份木糖醇酐单油酸酯组成。
实施例9一种表达单链抗体scFV功能化细菌磁颗粒的制备方法
1.该方法与实施例7不同的是，步骤e所述的分离纯化具体步骤如下：
1)离心并收集培养后的趋磁细菌MSR-1重组株，用磷酸盐缓冲液悬浮，得悬浮液；
2)超声波破碎悬浮液中的细胞；
3)磁力装置吸附破碎后的细胞，静置过夜，弃去上清，用磷酸盐缓冲液重新悬浮吸附到的沉淀，超声波清洗，磁力装置再次吸附，弃上清，将吸附到的沉淀用磷酸盐缓冲液悬浮，洗涤3次，即得功能化细菌磁颗粒；
离心条件为：转速12000rpm，离心时间6min；超声波破碎条件为：超声功率300w，超声时间3s，间隔时间4s，超声次数50次；超声波清洗条件为：超声功率100w，超声时间3s，间隔时间3s，超声次数25次。
实施例10一种表达多肽适配体功能化细菌磁颗粒的制备方法
该方法与实施例8不同的是，步骤e所述的分离纯化具体步骤如下：
1)离心并收集培养后的趋磁细菌MSR-1重组株，用磷酸盐缓冲液悬浮，得悬浮液；
2)超声波破碎悬浮液中的细胞；
3)磁力装置吸附破碎后的细胞，静置过夜，弃去上清，用磷酸盐缓冲液重新悬浮吸附到的沉淀，超声波清洗，磁力装置再次吸附，弃上清，将吸附到的沉淀用磷酸盐缓冲液悬浮，洗涤3次，即得功能化细菌磁颗粒；
离心条件为：转速15000rpm，离心时间7min；超声波破碎条件为：超声功率320w，超声时间5s，间隔时间5s，超声次数50次；超声波清洗条件为：超声功率120w，超声时间5s，间隔时间5s，超声次数25次。
对照例1一种表达单链抗体scFV功能化细菌磁颗粒的制备方法
该方法与实施例5不同的是，步骤d中对趋磁细菌MSR-1重组株进行培养包括如下步骤：
d-a.向培养罐中加入第一培养基，紫外线灭菌8min，静置1h后，将趋磁细菌MSR-1重组株接种到培养罐中，进行第一次培养，获得第一培养液；第一次培养的条件为：起始pH值为4，培养温度为15℃，培养时间为6天，摇床转速为100转/分钟；
d-b.将第一培养液加入含有第二培养基的培养罐中，无氧状态进行第二次培养；第二次培养的条件为：起始pH值为5.5，培养温度为25℃，培养时间为2天，摇床转速为150转/分钟；
所述第一培养基由重量份数为10份生物素、0.8份多聚谷氨酸、1份壳聚糖、1份磷酸二氢钠、0.1份抗坏血酸钠和1份硝酸钾组成；
所述第二培养基由重量份数为1份琼脂、0.2份普鲁兰、1份6-苄基氨基嘌呤、0.5份异丙醇胺、1份硝酸铵、0.5份氯化钙、0.2份维生素E组成。
对照例2一种表达多肽适配体A功能化细菌磁颗粒的制备方法
该方法与实施例6不同的是，步骤d中对趋磁细菌MSR-1重组株进行
培养包括如下步骤：
d-a.向培养罐中加入第一培养基，紫外线灭菌8min，静置1h后，将趋磁细菌MSR-1重组株接种到培养罐中，进行第一次培养，获得第一培养液；第一次培养的条件为：起始pH值为5.2，培养温度为30℃，培养时间为7天，摇床转速为160转/分钟，培养过程中通入氧气，通入氧气的方式为：间隔5min，通入20min氧气；
d-b.将第一培养液加入含有第二培养基的培养罐中，进行第二次培养；第二次培养的条件为：起始pH值为6.0，培养温度为35℃，培养时间为3天，摇床转速为300转/分钟；
所述第一培养基由重量份数为1.2份多聚谷氨酸、2份壳聚糖、3份磷酸二氢钠、1份脂肪酸乳酰酯、0.3份抗坏血酸钠、1份海藻酸铵、1.5份琼脂、0.5份普鲁兰、2份硝酸钾组成；
所述第二培养基由重量份数为12份生物素、2份6-苄基氨基嘌呤、1份异丙醇胺、2份硝酸铵、1份聚乙二醇4000、0.7份氯化钙、0.5份维生素E和0.5份木糖醇酐单油酸酯组成。
试验例1表达单链抗体scFV或多肽适配体的功能化细菌磁颗粒的应用试验：
试验例1-1表达anti-CD19单链抗体功能化细菌磁颗粒的应用
CD19是谱系特异的泛B细胞表面抗原，只在正常和恶性B细胞上表达，在其他单个核细胞中不表达。在本实施例中采用淋巴细胞分离液从全血中分离单个核细胞(PBMC)，用表达anti-CD单链抗体的功能化细菌磁颗粒与PBMC悬液孵育，洗涤后通过磁性分选从单个核细胞群中分离B细胞，结果显示分离效率较佳，细胞接种培养存活率高。由于CD19是B细胞白血病和淋巴瘤最常见的特异性表面标志，表达anti-CD19单链抗体的功能化细菌磁颗粒在血液循环中可逐渐富集在相应肿瘤细胞的表面，研究显示可以对富集功能化细菌磁颗粒较多的相应肿瘤细胞进行磁热疗加热实现定向杀死癌细胞的效果。
试验例1-2表达多肽适配体功能化细菌磁颗粒的应用
CTLA4(cytotoxic T lymphocyte-associtated antigen-4)是细胞毒性T淋巴细胞相关抗原4，也称为CD152，是一种细胞跨膜受体，与白细胞的分化有关。CTLA4作为一些特定分化的T淋巴细胞受体，和它的亲和配体结合后可抑制T细胞免疫反应。表达CTLA4多肽适配体的功能化细菌磁颗粒可应用在T细胞体外免疫抑制实验中，从全血中分离单个核细胞(PBMC)，用表达CTLA4多肽适配体的功能化细菌磁颗粒与PBMC悬液孵育，洗涤后通过磁性分选可从单个核细胞群中分离CTLA4+细胞，由于CTLA4多肽适配体结合位点可以抑制T细胞免疫反应，可作为阴性对照和以正常方式分离的T细胞进行免疫响应检测实验。这种功能化细菌磁颗粒的优势是可以一次分离CTLA4+细胞，无需其他处理可直接用于后续免疫响应检测作为阴性对照。
试验例2表达单链抗体scFV或多肽适配体的功能化细菌磁颗粒的稳定性试验
分组：试验1组：实施例1的表达单链抗体scFV的功能化细菌磁颗粒；
对照1组：该功能化细菌磁颗粒的结构物质由单链抗体scFV通过多肽链与细菌磁颗粒膜蛋白融合表达而成；该多肽链的氨基酸残基为(Ala2GlySer)3(Gly3Ser)5(GlySerAla2)3，多肽链的序列为
Figure BDA0000943872860000193
Figure BDA0000943872860000191
对照2组：该功能化细菌磁颗粒的结构物质由单链抗体scFV通过多肽链与细菌磁颗粒膜蛋白融合表达而成；该多肽链的氨基酸残基为(GlySer)3(AlaGly3SerAla)5(GlySer)3，多肽链的序列为
Figure BDA0000943872860000194
Figure BDA0000943872860000192
通过间接ELISA分析单链抗体scFV的抗原结合活性：将检测抗原CD19用PBS稀释至2μg/mL，每孔100μL加入微孔板中，于4℃包被过液；用PBST(含有0.5％吐温-20的PBS溶液)洗涤3次，每孔加入300μL5％脱脂牛奶于37℃封闭1h，PBST洗涤3次，自然晾干后保存于4℃备用；分别将试验1组、试验2组、对照1组和对照2组的功能化细菌磁颗粒与PBST悬液孵育，孵育温度分别为37℃、55℃和80℃，均孵育45min后，PBST洗涤4次，每孔100μL加入TMB底物液显色5-10min，用2mol/L H2SO4终止反应，酶标仪测定450nm下的吸光度值，结果见表1。
表1各组吸光度值
Figure BDA0000943872860000201
从表中可以看出，对照1组和对照2组的功能化细菌磁颗粒在37℃孵育过程中的活性低于试验1组，并且在55℃孵育过程中，已失活一半，80℃孵育已完全失活，本发明提供的功能化细菌磁颗粒在55℃孵育过程中还存在一定的活性，表明本发明的多肽链可以到稳定单链抗体scFV的作用。
试验例3趋磁细菌MSR-1重组株扩大培养情况
1)分组
试验1组：本发明实施例7所述的制备方法；
试验2组：本发明实施例8所述的制备方法；
对照1组：对照例1的制备方法；
对照2组：对照例2的制备方法；
对照3组：CN1952112公开的一种兼性厌氧趋磁细菌及其分离、纯培养方法和细菌磁颗粒的提取、纯化方法中公开的培养方法；
2)采用台盼蓝经典染色法对细胞进行计数，接种时细胞为1×104个/ml，分别统计原代细胞和扩大培养后的数量，结果见表2。
表2各组趋磁细菌MSR-1重组株体外培养扩增试验结果
Figure BDA0000943872860000211
由表中可以看出，本发明提供的趋磁细菌培养步骤可以有效的体外培养趋磁细菌MSR-1重组株。
Figure IDA0000943872930000011
Figure IDA0000943872930000021

Claims (9)

1.一种表达单链抗体scFV或多肽适配体的功能化细菌磁颗粒，其特征在于，所述功能化细菌磁颗粒的结构物质由单链抗体scFV或多肽适配体通过多肽链与细菌磁颗粒膜蛋白融合表达而成；
所述多肽链的氨基酸残基为(Ala2GlySer)3(Ala Gly3SerAla)5(GlySerAla2)3；
所述细菌磁颗粒膜蛋白为趋磁细菌MSR磁颗粒膜蛋白基因mamC或mamF。
2.如权利要求1所述的表达单链抗体scFV或多肽适配体的功能化细菌磁颗粒，其特征在于，所述功能化细菌磁颗粒的结构物质由单链抗体scFV通过多肽链与细菌磁颗粒膜蛋白融合表达而成；所述多肽链的氨基酸残基为(Ala2GlySer)3(AlaGly3SerAla)5(GlySerAla2)3，多肽链的基因编码序列为5-GCAGCCGGAA GCGCAGCCGG AAGCGCAGCCGGAAGCGCAG GAGGTGGAAG CGCCGCAGGA GGTGGAAGCG CCGCAGGAGG TGGAAGCGCC GCAGGAGGTGGAAGCGCCGC AGGAGGTGGA AGCGCCGGAA GCGCAGCCGG AAGCGCAGCC GGAAGCGCAG CC-3。
3.如权利要求1所述的表达单链抗体scFV或多肽适配体的功能化细菌磁颗粒，其特征在于，所述单链抗体scFV为anti-CD19单链抗体，所述多肽适配体为MUC1适配体或CTLA4适配体。
4.权利要求1-3任一所述的表达单链抗体scFV或多肽适配体的功能化细菌磁颗粒在用于抗原的磁分选，用于蛋白质、药物分子或天然产物的富集纯化及分离提取，或用于制备清除肿瘤细胞或组织的复合物中的应用。
5.一种权利要求1所述的表达单链抗体scFV或多肽适配体的功能化细菌磁颗粒的制备方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：
a.构建细菌磁颗粒膜蛋白mamC/mamF基因缺失的趋磁细菌MSR-1突变株；
b.构建功能化细菌磁颗粒膜蛋白融合表达质粒；
c.将功能化细菌磁颗粒融合表达质粒通过接合转入到步骤a制得的趋磁细菌MSR-1突变株，构建趋磁细菌MSR-1重组株；
d.对趋磁细菌MSR-1重组株进行培养；
e.分离纯化，制得功能化细菌磁颗粒。
6.如权利要求5所述的制备方法，其特征在于，步骤a所述构建细菌磁颗粒膜蛋白mamC/mamF基因缺失的趋磁细菌MSR-1突变株的具体方法为：
(a)扩增细菌磁颗粒膜蛋白mamC/mamF基因左右两侧共两个长均为700-1000bp的同源片段；左右两同源片段均带有两个酶切位点；
(b)左右同源片段分别用相应的限制性内切酶进行双酶切；同时对自杀质粒pKmobsacB进行双酶切；
(c)将经过双酶切后的左右同源片段和经过双酶切后的自杀质粒pKmobsacB进行连接，连接产物转到E.coli感受态细胞中，挑选连接正确的阳性克隆菌；
(d)将阳性克隆菌作为供体与趋磁细菌MSR-1受体菌进行亲本接合，并导入pKmobsacB重组质粒，通过卡那抗性筛选趋磁细菌MSR-1同源整合突变株，突变株再通过蔗糖梯度筛选趋磁细菌MSR-1双交换突变株，最后选择卡那抗性敏感的双交换菌株进行验证，构建成细菌磁颗粒膜蛋白mamC/mamF基因缺失的趋磁细菌MSR-1突变株；
步骤b所述功能化细菌磁颗粒膜蛋白融合表达质粒的构建方法如下：
(1)扩增细菌磁颗粒膜蛋白mamC/mamF基因跨膜结构域的DNA片段，所述DNA片段两端分别带有双酶切位点；对扩增产物DNA片段及pBBR质粒进行双酶切，回收双酶切的DNA片段及双酶切的pBBR质粒；将双酶切的DNA片段与双酶切的pBBR质粒进行连接，连接产物转化大肠杆菌感受态细胞中，筛选连接正确的阳性克隆，得到重组质粒pBBR-细菌磁颗粒膜蛋白mamC/mamF基因；
(2)单链抗体scFV或多肽适配体的编码序列克隆在pUC57载体上，并分别在其5’端合成编码表达多肽链 (Ala2GlySer)3(Ala Gly3SerAla)5(GlySerAla2)3的基因序列，在合成基因序列两端分别加上双酶切位点，制得多肽链-单链抗体scFV或多肽适配体质粒；
(3)对步骤(2)基因合成得到的多肽链-单链抗体scFV或多肽适配体质粒进行扩增和双酶切；
(4)对步骤(1)得到的重组质粒pBBR-细菌磁颗粒膜蛋白mamC/mamF基因进行双酶切并纯化，和步骤(3)得到的经过双酶切的多肽链-单链抗体scFV或多肽适配体质粒的基因片段进行连接，连接产物转化大肠感觉感受态细胞中，筛选并验证连接正确的阳性克隆，最终得到功能化细菌磁颗粒膜蛋白融合表达质粒pBBR--细菌磁颗粒膜蛋白mamC/mamF基因-多肽链-单链抗体scFV或多肽适配体；
步骤c的具体制备方法为：
Ⅰ以功能化细菌磁颗粒膜蛋白融合表达质粒pBBR--细菌磁颗粒膜蛋白mamC/mamF基因-多肽链-单链抗体scFV或多肽适配体作为供体，通过亲本接合实验将其导入到细菌磁颗粒膜蛋白mamC/mamF基因缺失的趋磁细菌MSR-1突变株，构建生产功能化细菌磁颗粒的趋磁细菌MSR-1重组株。
7.如权利要求6所述的制备方法，其特征在于，所述步骤d中对趋磁细菌MSR-1重组株进行培养包括如下步骤：
d-a.向培养罐中加入第一培养基，紫外线灭菌5-7min，静置1h后，将趋磁细菌MSR-1重组株接种到培养罐中，进行第一次培养，获得第一培养液；第一次培养的条件为：起始pH值为4.5-5.1，培养温度为20-25℃，培养时间为5-7天，摇床转速为120-150转/分钟，培养过程中通入氧气，通入氧气的方式为：间隔5min，通入20min氧气；
d-b.将第一培养液加入含有第二培养基的培养罐中，无氧状态进行第二次培养；第二次培养的条件为：起始pH值为5.7-5.9，培养温度为30-32℃，培养时间为2-3天，摇床转速为200-250转/分钟。
8.如权利要求7所述的制备方法，其特征在于，
所述第一培养基由重量份数为10-12份生物素、0.8-1.2份多聚谷氨酸、1-2份壳聚糖、1-3份磷酸二氢钠、0.5-1份脂肪酸乳酰酯、0.1-0.3份抗坏血酸钠、0.5-1份海藻酸铵和1-2份硝酸钾组成；
所述第二培养基由重量份数为1-1.5份琼脂、0.2-0.5份普鲁兰、1-2份6-苄基氨基嘌呤、0.5-1份异丙醇胺、1-2份硝酸铵、0.5-1份聚乙二醇4000、0.5-0.7份氯化钙、0.2-0.5份维生素E和0.2-0.5份木糖醇酐单油酸酯组成。
9.如权利要求5所述的制备方法，其特征在于，步骤e所述的分离纯化具体步骤如下：
1)离心并收集培养后的趋磁细菌MSR-1重组株，用磷酸盐缓冲液悬浮，得悬浮液；
2)超声波破碎悬浮液中的细胞；
3)磁铁吸附破碎后的细胞，静置过夜，弃去上清，用磷酸盐缓冲液重新悬浮吸附到的沉淀，超声波清洗，磁铁再次吸附，弃上清，将吸附到的沉淀用磷酸盐缓冲液悬浮，洗涤3次，即得功能化细菌磁颗粒；
离心条件为：转速12000-15000rpm，离心时间6-7min；超声波破碎条件为：超声功率300-320w，超声时间3-5s，间隔时间4-5s，超声次数50次；超声波清洗条件为：超声功率100-120w，超声时间3-5s，间隔时间3-5s，超声次数25次。
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