KR20100001091A - 항체를 세포내로 도입하는 융합 펩타이드，및 이를 이용한세포이미징 및 약물전달 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 항체를 세포내로 도입하는 융합 펩타이드, 및 이를 이용한 세포이미징 및 약물전달에 관한 것으로, 보다 상세하게는 항체에 특이적인 결합을 하는 저분자 펩타이드와 세포투과 신호를 융합한 융합 펩타이드가 세포에 큰 손상을 주지 않으면서 다양한 항체를 세포내로 운반하고, 항체에 공유결합 없이 단지 용액 중에 첨가만으로 항체를 세포내로 운반하는 특성을 가짐으로써 세포의 면역이미징(immuno-staining), 표적지향형 약물전달 및 치료용 단백질의 세포내 수송 등과 같은 다양한 생물학적 실험에 유용하게 이용될 수 있다.
면역글로불린 G(IgG), 형질전환 펩타이드, 세포내 Fc-결합 펩타이드, 세포투과 신호 펩타이드, 표적화 펩타이드, 세포내 항체수송, 세포이미징, 표적지향형 약물전달.

Description

항체를 세포내로 도입하는 융합 펩타이드，및 이를 이용한 세포이미징 및 약물전달{Fusion peptides introducing antibody into cells，and cellular imaging and targeted drug delivery system using the same}
본 발명은 항체를 세포내로 도입하는 융합 펩타이드, 및 이를 이용한 세포이미징 및 약물전달에 관한 것으로, 보다 상세하게는 항체에 특이적인 결합을 하는 저분자 펩타이드와 세포투과 신호를 융합한 융합 펩타이드가 세포에 큰 손상을 주지 않으면서 다양한 항체를 세포내로 운반하고, 항체에 공유결합 없이 단지 용액 중에 첨가만으로 항체를 세포내로 운반하는 특성을 가짐으로써 세포의 면역이미징(immuno-staining), 표적지향형 약물전달 및 치료용 단백질의 세포내 수송으로의 이용에 관한 것이다.
저분자 물질, 단백질, 핵산 또는 나노입자 등을 세포내로 수송하려는 연구는 현재 활발히 진행되고 있다. 저분자 물질, 핵산 또는 나노입자 등의 경우 다양한 시약, 전기천공법(electroporation) 또는 열충격(heatshock) 등의 방법을 사용하여 세포내 수송이 가능하지만, 단백질의 경우는 상기한 대부분의 시약과 실험조건 등이 고유한 3차 구조에 악 영향을 미쳐 활성을 소실할 수 있으므로 이들의 세포내 수송은 특히 어려운 과제이다.
특정 단백질을 세포내로 형질전환 하는 기술은 단백질 치료제 개발 및 단백질의 생물학적 활성을 관찰하기 위하여 매우 중요한 기술이다. 상기 분야의 연구는 1980년대 HIV에서 관찰된 세포투과신호인 Tat의 발견으로 활성화되었으며, 그 후에도 하기 <표 1>에 제시된 많은 세포투과신호 펩타이드(Cell penetrating peptide: CPP)들이 보고되었다. 또한, 많은 연구자들이 세포투과 신호 펩타이드를 활용하여 단백질, 핵산, 나노입자 등을 세포 안으로 도입하는 연구를 수행하여 왔으며, 이 연구 분야는 이제 약물전달의 중요한 기술로 자리 잡고 있다(K.M. Wagstaff et al., Current Medicinal Chemistry 13 (2006) 1371-1387).
Figure 112008046061122-PAT00001
많은 경우에 단백질의 형질전환을 위해서는 CPP를 해당 단백질에 화학적 공유 결합을 통하여 융합시키며, 비공유 결합의 경우에도 바이오틴-스트렙토비딘(biotin-streptavidin) 등의 결합을 사용함으로써 해당 단백질의 구조에 변형을 초래하고 있다.
최근에는 공유결합을 통하지 않고 항체를 형질전환시킬 수 있는 방법이 보고되었으며, 상기 방법은 항체의 Fc 영역에 결합하는 특정세균 유래 단백질인 단백질 A(Protein A)에 Tat 신호 펩타이드를 융합시킴으로써 완성할 수 있다(M. Mie, F. et al., Biochemical and Biophysical Research Communications 310, 730-734, 2003). 그러나 이 방법은 항체뿐만 아니라 세균 유래 단백질도 함께 세포내로 유입되는 문제를 가지고 있으며, 장기간 보존에 적합한 안정성이 결여되며, 생체 적용시 면역작용 등이 예상된다.
이에, 본 발명자들은 기존에 보고된 단백질 A 또는 단백질 G 융합체에 비하여 안정하며, 크기가 작아 면역 작용의 우려가 적고, 합성 및 필요에 따라 구조변형이 자유로운 저분자 펩타이드를 활용하여 공유결합 없이 항체를 세포내로 수송하는 융합 펩티드를 규명함으로써 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 목적은 항체 Fc 부위 결합 펩타이드(Fc-binding protein; FcBP)에 세포투과신호 펩타이드(Cell penetrating peptide: CPP)를 융합한 세포투과성 융합 펩타이드, 이의 제조방법, 및 상기 융합펩타이드를 이용한 표적 세포내 항체 도입 방법, 면역 이미징 및 약물전달체 기술을 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 항체 Fc 부위 결합 펩타이드(Fc-binding protein; FcBP)에 세포투과신호 펩타이드(Cell penetrating peptide: CPP)를 융합한 세포투과성 융합 펩타이드, 또는 상기 융합 펩타이드에 추가적으로 형광 펩타이드를 융합한 융합 펩타이드를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 융합 펩타이드를 코딩하는 유전자를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 유전자를 포함하는 발현벡터를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 발현벡터를 숙주세포에 도입한 형질전환체를 제공한다.
또한, 본 발명은
1) 상기 형질전환체를 배지에서 배양하는 단계; 및
2) 상기 배양액으로부터 상기 융합 펩타이드를 분리 및 정제하는 단계를 포함하는 융합 펩타이드 제조방법을 제공한다.
또한, 본 발명은
1) 상기 융합 펩타이드에 항체를 첨가하여 혼합시키는 단계; 및
2) 상기 혼합물을 표적 세포에 처리한 후 배양하는 단계를 포함하는 표적 세포내 항체를 도입하는 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 항체 Fc 부위 결합 펩타이드(FcBP), 세포투과신호 펩타이드(CPP) 및 형광펩타이드가 융합된 융합 펩타이드, 및 세포내 항원에 특이적인 항체를 포함하는 상기 항원에 특이적인 세포 영상화제를 제공한다.
또한, 본 발명은
1) 항체 Fc 부위 결합 펩타이드(FcBP), 세포투과신호 펩타이드(CPP) 및 형광펩타이드가 융합된 융합 펩타이드에 항체를 혼합시키는 단계; 및
2) 상기 혼합물을 표적 세포에 처리한 후 배양하는 단계를 포함하는 항원에 특이적인 세포의 영상화 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 항체 Fc 부위 결합 펩타이드(FcBP)에 세포투과신호 펩타이드(CPP)를 융합한 융합 펩타이드, 상기 융합 펩타이드에 형광 펩타이드가 융합된 융합 펩타이드, 항체에 대한 특이적으로 친화성을 갖는 올리고 펩타이드, 및 상기 올리고 펩타이드에 PEG를 혼합한 혼성체로 구성된 군으로부터 선택된 어느 하나, 및 약물전달용 입자를 포함하는 표적지향적 약물전달체를 제공한다.
아울러, 본 발명은
1) 약물을 봉입한 약물전달용 입자를 포함하는 상기 약물전달체를 제조하는 단계;
2) 상기 단계 1)의 약물전달체에 항체를 혼합시키는 단계; 및
3) 상기 혼합물을 표적 세포에 처리한 후 배양하는 단계를 포함하는 표적 세포에 선택적으로 약물을 전달하는 방법을 제공한다.
본 발명은 융합 펩타이드는 세포에 큰 손상을 주지 않으며 항체를 세포 안으로 수송할 수 있는 저분자 수송체로서, 안정하고 면역부작용이 적으므로 살아있는 약물의 선택적 전달과 치료용 항체의 세포내 유입 등을 통한 치료방법 개발 및 세포의 면역이미징을 통한 생물학적 실험 등을 가능하게 하는 플랫폼 기술로 다양한 관련 시약개발 및 기술의 개발에 활용될 수 있다.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명은 항체 Fc 부위 결합 펩타이드(Fc-binding protein; FcBP)에 세포투과신호 펩타이드(Cell penetrating peptide: CPP)를 융합한 세포투과성 융합 펩타이드를 제공한다.
상기 항체 Fc 부위 결합 펩타이드는 항체에 특이적으로 결합을 하는 저분자 펩타이드로서, 선행특허(출원번호: PCT/KR2007/005106)에 기재된 펩타이드를 이용하는 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다.
상기 세포투과신호(Cell penetration signal or peptides)로는 이미 알려진 Tat, 페너트라틴(penetratin), pVEC, MAP, MTS, MPS, Arg8, MPG, 트란스포르탄(Transportan) KALA, 부포린 2(Buforin 2), 마스토파란(Mastoparan) 및 VP22로 구성된 군으로부터 선택된 어느 하나를 이용하는 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다.
상기 융합 펩티드는 추가적으로 형광 펩타이드를 융합한 융합 단백질 형태로 사용될 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다.
상기 형광 펩타이드는 EGFP, ECFP, EYFP 및 RFP로 구성된 군으로부터 선택된 어느 하나인 것이 바람직하고, EGFP인 것이 더욱 바람직하나 이에 한정되지 않는다.
본 발명의 융합 펩티드는 항체 Fc 부위 결합 펩타이드가 항체에 결합하고, 세포투과신호가 표적 세포를 투과시킴으로써 항체를 표적 세포내로 수송할 수 있다.
본 발명자들은 기존에 보고된 항체 Fc 영역 결합 펩타이드(FcBP)를 세포투과신호 펩타이드(표 1 참조)에 융합시킨 새로운 융합 펩타이드를 개발하였고, 융 합펩타이드가 항체를 세포 안으로 잘 수송하는지 여부를 형광으로 측정하기 위하여 융합펩타이드를 형광단백질인 eGFP에 융합시킨 새로운 형광 융합 단백질을 제조하였다(도 1 참조).
본 발명자들은 항체결합 펩타이드(FcBP), 형광유전자(eGFP) 및 세포투과 신호(Tat)가 연결된 융합벡터(pET 28a FcBP-eGFP-Tat)를 제조한 후, 대장균에 형질전 환하여 배양함으로써 항체결합 펩타이드(FcBP), 형광단백질(eGFP) 및 세포투과 신호(Tat)가 연결된 재조합 단백질을 FcBP-eGFP-Tat을 수득하였다.
본 발명자들은 상기 융합 단백질이 항체를 세포내로 수송할 수 있는지 알아보기 위해, 우선 5종(인간, 쥐, 토끼, 생쥐 및 염소) 유래의 면역 글로불린 G(Immunoglobulin G; IgG)를 각각 형광염료인 Cy3로 표지한 후, 표적 세포를 포함하는 배지에 상기 형광 표지된 항체 및 FcBP-eGFP-Tat 융합단백질을 첨가하여 함께 배양한 후, 현미경 및 DeltaVision을 이용하여 세포이미지와 형광이미지를 관찰하였다. 그 결과, 도 2에서 보는 바와 같이 FcBP-eGFP-Tat 융합단백질과 함께 Cy-3로 표지된 IgG가 동시에 세포안으로 삽입되었음을 알 수 있었다(도 2 참조).
본 발명자들은 상기 융합단백질가 고분자 나노입자을 세포내로 도입할 수 있는지 알아보기 위하여, 직경이 각각 200 nm, 100 nm 및 50 nm이고, 표면에 카복실기(-COOH)를 포함한 폴리스틸렌(polystyrene; PS) 나노입자들을 표면의 카복실기를 활성형 에스테르(active ester) 전환 방법을 이용하여 FcBP-eGFP-Tat 융합단백질과 결합시킨 후, 표적 세포를 포함하는 배지에 상기 고분자 나노입자와 FcBP-eGFP-Tat 융합 단백질의 복합체를 첨가하여 함께 배양한 후, 현미경 및 DeltaVision을 이용하여 세포이미지와 형광이미지를 관찰하였다. 그 결과, 도 3 내지 도 5에서 보는 바와 같이 FcBP-eGFP-Tat 융합단백질과 함께 고정된 나노입자들이 세포내로 도입된 것을 알 수 있었다(도 3 내지 도 5 참조).
또한, 본 발명은 상기 융합 펩타이드를 코딩하는 유전자를 제공한다.
또한, 본 발명은 유전자를 포함하는 발현벡터를 제공한다.
상기 발현벡터는 항시 발현벡터인 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다.
또한, 본 발명은 상기 발현벡터를 숙주세포에 도입한 형질전환체를 제공한다.
상기 숙주세포는 대장균(E. coli) 또는 바실러스(Bacillus subtilis)와 같은 원핵 생물일 수 있다. 또한, 사카로마이세스 세르비시아(Saccharomyces cerevisiae)와 같은 효모, 곤충 세포, 식물 세포, 동물 세포로부터 유래한 진핵 세포일 수 있다. 상기 숙주세포로의 발현벡터 도입방법은 당업자에게 공지된 어느 방법을 사용해도 무방하다.
또한, 본 발명은
1) 상기 형질전환체를 배지에서 배양하는 단계; 및
2) 상기 배양액으로부터 상기 융합 펩타이드를 분리 및 정제하는 단계를 포함하는 융합 펩타이드 제조방법을 제공한다.
상기 배양 배지로는 당업자에게 공지된 배양 배지 중 형질전환체에 적합한 배지를 선택하여 이용하는 것이 바람직하다. 상기 정제는 당업자에게 공지된 어떠한 정제 방법도 사용 가능하다.
상기 숙주세포는 대장균(E. coli) 또는 바실러스(Bacillus subtilis)와 같은 원핵 생물일 수 있다. 또한, 사카로마이세스 세르비시아(Saccharomyces cerevisiae)와 같은 효모, 곤충 세포, 식물 세포, 동물 세포로부터 유래한 진핵 세 포일 수 있다. 상기 숙주세포로의 발현벡터 도입방법은 당업자에게 공지된 어느 방법을 사용해도 무방하다.
또한, 본 발명은
1) 항체 Fc 부위 결합 펩타이드(FcBP)와 세포투과신호 펩타이드(CPP)를 융합한 융합 펩타이드에 항체를 첨가하여 혼합시키는 단계; 및
2) 상기 혼합물을 표적 세포에 처리한 후 배양하는 단계를 포함하는 표적 세포내 항체를 도입하는 방법을 제공한다.
상기 방법에 있어서, 단계 1)의 항체는 면역글로불린 G(Immunoglobulin G; IgG)인 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다.
상기 방법에 있어서, 단계 2)의 표적 세포는 살아있는 세포인 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다.
본 발명의 항체 도입 방법은 항체에 공유결합 없이 단지 용액 중에 첨가만으로 항체를 표적 세포내로 운반할 수 있는 특성이 있다.
또한, 본 발명은 항체 Fc 부위 결합 펩타이드(FcBP), 세포투과신호 펩타이드(CPP) 및 형광펩타이드를 융합한 융합 펩타이드, 및 세포내 항원에 특이적인 항체를 포함하는 상기 항원에 특이적인 세포 영상화제를 제공한다.
또한, 본 발명은
1) 항체 Fc 부위 결합 펩타이드(FcBP), 세포투과신호 펩타이드(CPP) 및 형광 펩타이드를 융합한 융합 펩타이드에 항체를 혼합시키는 단계; 및
2) 상기 혼합물을 표적 세포에 처리한 후 배양하는 단계를 포함하는 표적 세포의 영상화 방법을 제공한다.
상기 형광 펩타이드는 EGFP, ECFP, EYFP 및 RFP로 구성된 군으로부터 선택된 어느 하나인 것이 바람직하고, EGFP인 것이 더욱 바람직하나 이에 한정되지 않는다.
상기 방법은 항체를 고정화한 융합단백질이 표적 세포내로 들어가서 영상화함으로써, 세포내 영상화의 조건이 확립되면 실시간 영상화뿐 아니라 정량적 분석이 가능하여, 리간드들간의 상호작용을 시각화하여 세포내 작용 기작 또는 진단이 가능하다. 또한, 상기 방법은 세포내 분포 및 움직임을 시간상 기록할 수 있다.
또한, 본 발명은 항체 Fc 부위에 결합하는 저분자 펩타이드(FcBP)에 세포투과신호 펩타이드(CPP)를 융합한 융합 펩타이드, 상기 융합 펩타이드에 형광 펩타이드가 융합된 융합 펩타이드, 항체에 대한 특이적으로 친화성을 갖는 올리고 펩타이드, 및 상기 올리고 펩타이드에 PEG를 혼합한 혼성체로 구성된 군으로부터 선택된 어느 하나, 및 약물전달용 입자를 포함하는 표적지향적 약물전달체를 제공한다.
상기 항체에 대한 특이적으로 친화성을 갖는 펩타이드 및 이에 PEG를 혼합한 혼성체는 선행특허 PCT/KR2007/005106에 기재되는 펩타이드 및 혼성체를 사용하는 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다.
아울러, 본 발명은
1) 약물을 봉입한 약물전달용 입자를 포함하는 상기 약물전달체를 제조하는 단계;
2) 상기 단계 1)의 약물전달체에 항체를 혼합시키는 단계; 및
3) 상기 혼합물을 표적 세포에 처리한 후 배양하는 단계를 포함하는 표적 세포에 선택적으로 약물을 전달하는 방법을 제공한다.
상기 약물전달용 입자는 리포좀, 마이셀, 고분자 나노입자 및 금속 나노입자로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나인 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다.
상기 약물은 저분자 약물, 단백질, 펩타이드, RNA, DNA를 포함하는 핵산 또는 변형 핵산계열, PNA, 합성신약, 백신, 면역 조절제, 및 난용성 약물로 구성된 군으로부터 선택된 어느 하나인 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다.
상기 약물전달체는 약물을 봉입시킨 약물전달용 입자의 표면에 상기 융합펩티드 결합시킨 후, 융합단백질을 매개로 항체를 상기 입자 표면에 고정시킨 다음, 상기 항체가 고정된 입자를 표적 세포에 처리함으로써 표적 세포내 약물을 운반하여 방출할 수 있는, 표적 세포 지향성 약물수송체이다.
이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다.
단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실 시예에 한정되는 것은 아니다.
< 실시예 1> 항체결합 펩타이드와 형광유전자 융합 벡터의 제조
본 발명자들은 항체결합 펩타이드(Fc binding protein; FcBP)와 형광단백질 (enhanced green fluorescent protein; eGFP)를 융합하기 위하여, 형광단백질 유전자인(eGFP)의 염기서열에 대해 5' 방향으로 항체결합 펩타이드(FcBP)에 해당하는 염기서열을 삽입하여 융합벡터를 제작하였다. 항체결합 펩타이드(FcBP)에 해당하는 염기서열의 삽입은 프라이머를 설계할 때 삽입할 수 있다[정방향 프라이머 염기서열: 5'-GAA TTC CAT ATG GAC TGT GCA TGG CAC CTG GGA GAA CTG GTC TGG TGC ACC gga tcc gaa ttc gag ctc gtg agc aag GGC-3'(서열번호: 1); 역방향 프라이머 염기서열: 5'-CCG CTC GAG CTT GTA CAG CTC GTC CAT GCC GAG-3'(서열번호: 2)].
eGFP 유전자를 주형으로 하여 DNA 1 ㎕, 유전자의 20 μΜ 정방향 프라이머 및 역방향 각각 1 ㎕, 중합효소 활성 완충액 2.5 ㎕, dNTP 2 ㎕, Taq 중합효소 1 ㎕, 및 멸균증류수 16.5 ㎕를 첨가하여 최종 25 ㎕가 되도록 혼합한 뒤, 하기의 조건으로 PCR 반응을 수행하였다: 초기변성 95℃ 5분, 변성 95℃ 30초, 어닐링 55℃ 1분, 신장 68℃ 2분, 25회 반복, 최종 신장 72℃ 10분, 반응 종결 및 보관(4℃).
상기 PCR 반응 산물을 1% 아가로즈 젤 전기 영동을 통하여 약 800 bp 크기의 DNA 단편을 확인하였다. 상기 최종 PCR 반응 산물 및 pET28a 벡터(Novagen, USA)는 제한효소 NdeI과 XhoI(New England Biolabs, UK)으로 37℃에서 2시간 동안 반응시킨 후, DNA Ligation kit(Takara, 일본)를 이용하여 연결해 주었고, 상기 벡터의 염기서열을 시퀀싱(sequencing)하여 확인함으로써 항체결합 펩타이드(FcBP)와 형광유전자(eGFP)의 융합벡터(28a-FcBP-eGFP)를 제작하였다.
< 실시예 2> 세포투과 신호가 포함된 항체결합 펩타이드와 형광유전자 융합 벡터의 제조
본 발명자들은 항체결합 펩타이드(FcBP)와 형광유전자(eGFP)의 융합벡터에 세포 투과 능력을 부여하기 위하여 알려진 세포투과신호 펩타이드를 도입하였다. 상기 <실시예 1>에서와 동일한 방법 및 조건으로 세포투과신호 펩타이드의 삽입은 프라이머를 설계할 때 삽입하였다.
<2-1> 세포투과신호( Tat )의 삽입
본 발명자들은 상기 <실시예 1>에서 제작한 28a-FcBP-eGFP 유전자를 주형으로 하여 DNA 1 ㎕, 유전자의 20 μΜ 정방향 프라이머[5'-GAA TTC CAT ATG GAC TGT GCA TGG CAC CTG GGA GAA CTG GTC TGG TGC ACC gga tcc gaa ttc gag ctc gtg agc aag GGC-3'(서열번호: 3)] 및 역방향 프라이머[5'-CCG CTC GAG TTA ACC ACG ACG ACG CTG ACG ACG TTT TTT ACG ACC GTA GGA TCC CTT GTA CAG CTC GTC CAT-3'(서열번호: 4)]를 각각 1 ㎕, 중합효소 활성 완충액 2.5 ㎕, dNTP 2 ㎕, Taq 중합효소 1 ㎕, 및 멸균증류수 16.5 ㎕를 첨가하여 최종 25 ㎕가 되도록 혼합한 뒤, 하기의 조건으로 PCR 반응을 수행하였다: 초기변성 95℃ 5분, 변성 95℃ 30초, 어닐링 55℃ 1분, 신장 68℃ 2분, 25회 반복, 최종 신장 72℃ 10분, 반응 종결 및 보관(4℃).
상기 PCR 반응 산물을 1% 아가로즈 젤 전기 영동을 통하여 약 800 bp 크기의 DNA 단편을 확인하였다. 상기 최종 PCR 반응 산물 및 pET28a 벡터(Novagen, USA)는 제한효소 NdeI과 XhoI(New England Biolabs, UK)으로 37℃에서 2시간 동안 반응시킨 후, DNA Ligation kit(Takara, 일본)를 이용하여 연결해 주었고, 상기 벡터의 염기서열을 시퀀싱하여 확인함으로써 항체결합 펩타이드(FcBP), 형광유전자(eGFP) 및 세포투과 신호(Tat)가 연결된 융합벡터(pET 28a FcBP-eGFP-Tat)를 제작하였다.
<2-2> 세포투과신호( MTS )의 삽입
본 발명자들은 상기 <실시예 1>에서 제작한 28a-FcBP-eGFP 유전자를 주형으로 하여 DNA 1 ㎕, 유전자의 20 μΜ 정방향 프라이머[5'-GAA TTC CAT ATG GCA GCG GTT GCA CTG CTG CCA GCA GTT CTG CTG GCA CTG CTG GCA CCA GGA TCC GAA TTC GAC TGT GCA TGG CAC CTG GGA GAA-3'(서열번호: 5), 및 역방향 프라이머[5'-CCG CTC GAG CTT GTA CAG CTC GTC CAT GCC GAG-3'(서열번호: 6)]을 각각 1 ㎕, 중합효소 활성 완충액 2.5 ㎕, dNTP 2 ㎕, Taq 중합효소 1 ㎕, 및 멸균증류수 16.5 ㎕를 첨가하여 최종 25 ㎕가 되도록 혼합한 뒤, 하기의 조건으로 PCR 반응을 수행하였다: 초기변성 95℃ 5분, 변성 95℃ 30초, 어닐링 55℃ 1분, 신장 68℃ 2분, 25회 반복, 최종 신장 72℃ 10분, 반응 종결 및 보관(4℃).
상기 PCR 반응 산물을 1% 아가로즈 젤 전기 영동을 통하여 약 800 bp 크기의 DNA 단편을 확인하였다. 상기 최종 PCR 반응 산물 및 pET28a 벡터(Novagen, USA)는 제한효소 NdeI 과 XhoI(New England Biolabs, UK)으로 37℃에서 2시간 동안 반 응 후, DNA Ligation kit(Takara, 일본)를 이용하여 연결해 주었고, 상기 벡터의 염기서열을 시퀀싱하여 확인함으로써 항체결합 펩타이드(FcBP)와 형광유전자(eGFP)와 세포투과 신호(MTS)가 연결된 융합벡터(pET 28a-MTS-FcBP-eGFP)를 제작하였다.
< 실시예 3> 세포투과 신호 및 표적 신호가 동시에 포함된 항체결합 펩타이드와 형광유전자 융합 벡터의 제조
<3-1> pET 28a Tat - FcBP - eGFP - PTS 벡터의 제조
본 발명자들은 상기 실시예 <2-1>에서 최종 완성한 pET 28a-Tat-FcBP-eGFP 유전자를 주형으로 하여 DNA 1 ㎕, 유전자의 20 μΜ 정방향 프라이머[5'-AA TTC CAT ATG TAC GGT CGT AAA AAA CGT CGT CAG CGT CGT CGT GGT GGA TCC GAC TGT GCA TGG CAC CTG GGA GAA CTG-3'(서열번호: 7)], 및 역방향 프라이머[5'-CCG CTC GAG TTA CAG CTT GGA GGA TCC CTT GTA CAG CTC GTC CAT GCC GAG-3'(서열번호: 8)]을 각각 1 ㎕, 중합효소 활성 완충액 2.5 ㎕, dNTP 2 ㎕, Taq 중합효소 1 ㎕, 및 멸균증류수 16.5 ㎕를 첨가하여 최종 25 ㎕가 되도록 혼합한 뒤, 하기의 조건으로 PCR 반응을 수행하였다: 초기변성 95℃ 5분, 변성 95℃ 30초, 어닐링 55℃ 1분, 신장 68℃ 2분, 25회 반복, 최종 신장 72℃ 10분, 반응 종결 및 보관(4℃).
상기 PCR 반응 산물을 1% 아가로즈 젤 전기 영동을 통하여 약 800 bp 크기의 DNA 단편을 확인하였다. 상기 최종 PCR 반응 산물 및 pET28a 벡터(Novagen, USA)는 제한효소 NdeI과 XhoI(New England Biolabs, UK)으로 37℃에서 2시간 동안 반응시킨 후, DNA Ligation kit(Takara, 일본)를 이용하여 연결해 주었고, 상기 벡터의 염기서열을 시퀀싱(sequencing)하여 확인함으로써 항체결합 펩타이드(FcBP), 형광유전자(eGFP), 세포투과 신호(Tat), 및 퍼옥시솜 표적 신호(peroxisome targeting signal; PTS)가 연결된 융합벡터(pET 28a Tat-FcBP-eGFP-PTS)를 제작하였다.
<3-2> pET 28a- MTS - FcBP - eGFP - PTS 벡터의 제조
본 발명자들은 상기 실시예 <2-2>에서 최종 완성한 pET 28a-MTS-FcBP-eGFP 유전자를 주형으로 하여 DNA 1 ㎕, 유전자의 20 μΜ 정방향 프라이머[5'-GAA TTC CAT ATG GCA GCG GTT GCA CTG CTG CCA GCA GTT CTG CTG GCA CTG CTG GCA CCA GGA TCC GAA TTC GAC TGT GCA TGG CAC CTG GGA GAA-3'(서열번호: 9), 및 역방향 프라이머: 5'-CCG CTC GAG TTA CAG CTT GGA GGA TCC CTT GTA CAG CTC GTC CAT GCC GAG-3'(서열번호: 10)]을 각각 1 ㎕, 중합효소 활성 완충액 2.5 ㎕, dNTP 2 ㎕, Taq 중합효소 1 ㎕, 및 멸균증류수 16.5 ㎕를 첨가하여 최종 25 ㎕가 되도록 혼합한 뒤, 하기의 조건으로 PCR 반응을 수행하였다: 초기변성 95℃ 5분, 변성 95℃ 30초, 어닐링 55℃ 1분, 신장 68℃ 2분, 25회 반복, 최종 신장 72℃ 10분, 반응 종결 및 보관(4℃).
상기 PCR 반응 산물을 1% 아가로즈 젤 전기 영동을 통하여 약 800 bp 크기의 DNA 단편을 확인하였다. 상기 최종 PCR 반응 산물 및 pET28a 벡터(Novagen, USA)는 제한효소 NdeI과 XhoI(New England Biolabs, UK)으로 37℃에서 2시간 동안 반응시킨 후, DNA Ligation kit(Takara, 일본)를 이용하여 연결해 주었고, 상기 벡터의 염기서열을 시퀀싱(sequencing)하여 확인함으로써 항체결합 펩타이드(FcBP), 형광 유전자(eGFP), 세포투과 신호(MTS) 및 퍼옥시솜 표적 신호(peroxisome targeting signal; PTS)가 연결된 융합벡터(pET 28a-MTS-FcBP-eGFP-PTS)를 제작하였다.
< 실시예 4> 융합단백질의 발현 및 정제
본 발명자들은 상기 <실시예 2> 및 <실시예 3>에서 제조한 벡터를 대장균 Rosetta DE3에 형질전환시켰다.
구체적으로 CaCl2로 처리한 대장균 Rosetta DE3(Novagen, USA)에 상기 벡터들을 열충격 방법으로 형질전환시킨 후, 앰피실린(ampicillin)이 포함된 배지에서 배양하여 상기 발현벡터가 형질전환되어 앰피실린 저항성을 나타내는 콜로니(colony)를 선별하였다. 상기 콜로니를 LB 배지(50 ㎍/㎖ 앰피실린; sigma, USA)에 접종하고, 섭씨 37℃에서 16시간 동안 배양시킨 후 적당량을 취하여 LB 배지(50 ㎍/㎖ 앰피실린; sigma, USA)에 접종하였다. 배양액의 OD600이 0.7 ~ 0.9에 이르렀을 때 IPTG(최종농도: 1 mM)를 첨가하여 18℃에서 18시간 동안 더 배양함으로써 재조합 유전자의 발현을 유도하였다. 상기 배양이 끝난 배양액을 원심분리하여 침전된 균체를 25 ㎖ 세포 파쇄액(lysis buffer, 50 mM Tris pH 7.5, 200 mM NaCl, 5% 글리세롤)에 현탁시키고, 초음파 발생기로 파쇄시켰다. 이를 원심분리하고 상층액을 취하여, 탈론 수지(Talon resin, Clontech, USA)를 이용한 배치(batch) 방법으로 단백질인 FcBP-eGFP-Tat, MTS-FcBP-eGFP, FcBP-eGFP-Tat-PTS, 및 MTS-FcBP-eGFP-PTS을 정제하였다.
상기 배치방법을 이용한 단백질 정제를 상세히 기술하면 하기와 같다: 10 ㎖의 컬럼 완충용액(50 mM Tris pH 7.5, 200 mM NaCl, 5% glycerol, 0.05% β-mercaptoethanol)으로 탈론 레진(1 ㎖)을 2번 씻어서 활성화시킨 후, 상기에서 분리한 상층액을 가하여 4 ℃에서 1시간 동안 천천히 진탕하여 단백질을 탈론 수지에 흡착시켰다. 수용액을 여과 제거한 후, 탈론 수지를 컬럼완충용액(10 ㎖)으로 두 번 씻어 준 후, 10 ㎖의 용출 완충용액(elution buffer: 100 mM 이미다졸)을 가한 후 다시 1시간 천천히 진탕(rocking)한 후 여과하여, 단백질을 회수하였다. 5 ㎖의 용출 완충용액을 사용하여 한 번 더 반복해주어 추가 단백질을 회수하였다. 상기 방법으로 정제된 단백질을 브래드포드 검출(Bradford assay)법을 통해 정량하였고, 12% SDS-PAGE 젤을 통해 단백질의 크기를 추정함으로써 과발현 및 정제 결과를 확인하였다.
< 실시예 5> 항체에 형광염료의 표지
5종(인간, 쥐, 토끼, 생쥐 및 염소) 유래의 면역 글로불린 G(Immunoglobulin G; IgG)[인간 Ig G(Sigma, Cat. No. I8640), 쥐 IgG(Sigma, Cat. No. I4131), 토끼 IgG(Sigma, Cat. No. I5006), 생쥐 IgG(Sigma, Cat. No. I8765), 염소 IgG(Sigma, Cat. No. I9140)]를 각각 PBS(Phophate buffered saline, pH 7.5) 완충용액을 사용하여 1 mg/ml의 농도가 되도록 준비하였다. 형광염료인 CyTM3 Mono NHS ester(GE Healthcare, USA)를 DMSO(dimethylsulfoxamide)에 녹여 10 mg/ml의 농도가 되도록 준비하였다. IgG와 CyTM3 Mono NHS ester를 1 : 20의 비율(molar ratio)이 되도록 혼합한 후, 차광하여 실온에서 1시간 천천히 교반하였다. 미반응한 과량의 Cy3TM Mono NHS ester는 PD-10 탈염 컬럼(GE Healthcare, USA)을 이용하여 제거하였다. PBS(Phosphate buffered saline, pH 7.5) 완충용액으로 용리(elution)시켜 단백질을 회수하였으며, 형광을 나타내는 분획물(Fraction)을 SDS-PAGE에 적용하여 IgG를 관찰함으로써 항체에 형광염료가 표지되었음을 확인하였다.
< 실험예 1> 세포내 항체의 도입
형광 표지된 항체를 세포내로 도입하기 위하여 FcBP-eGFP-Tat 융합단백질을 이용하였다. 실험에 사용된 HeLa 세포는 10% FBS(fetal bovine serum)와 1%의 스트렙토마이신/암피실린이 첨가된 DMEM(Dulbecco's Modified Eagle's Medium) 배지를 이용하여 37℃에서 5%의 이산화탄소가 포함된 배양기에서 배양하였다. FcBP-eGFP-Tat 융합단백질의 세포내 투과를 관찰하기 위하여 웰 당 1×104 개의 HeLa 세포를 8-웰 플레이트에 분주하고 12 ~ 18시간 정도 배양하였다. FcBP-eGFP-Tat 융합단백질은 웰 당 200 nM의 농도로 사용하였으며, Cy-3가 표지된 IgG는 500 nM을 사용하였다. 상기 융합단백질과 IgG를 섞은 후 15분간 정치시키고, 상기 혼합물을 세포가 들어있는 플레이트에 첨가하고 위의 조건에서 3시간 동안 배양하였다. 세포를 PBS로 5회 세척한 후, 현미경 관찰을 용이하게 하기 위하여, 4%의 파라포름알데하이드(para-formaldehyde)로 세포를 고정한 후, DAPI(4',6-diamidino-2- phenylindole)로 세포 핵을 염색하였다. 세포이미지와 형광이미지는 DeltaVision(AppliedPrecesion, USA)을 이용하여 관찰하였다. 그 결과, 도 2에서 보는 바와 같이 FcBP-eGFP-Tat 융합단백질과 함께 Cy-3로 표지된 IgG가 세포내로 삽입된 것을 확인할 수 있었다(도 2).
< 실험예 2> 융합단백질을 포함한 고분자 나노입자의 세포 투과능력 측정
<2-1> 고분자 나노입자에 대한 융합단백질의 고정화
본 발명자들은 FcBP-eGFP-Tat 융합단백질을 이용하여 나노크기의 고분자 입자를 세포내로 도입하는 연구를 수행하였다. 직경이 각각 200 nm, 100 nm 및 50 nm이고, 표면에 카복실기(-COOH)를 포함한 폴리스틸렌(polystyrene; PS) 나노입자들을 마이크로모드(Micromod, Germany)에서 구입하였다. 상기 나노입자들을 각각 EDC(0.4 M)와 sulfo-NHS(0.1 M)의 혼합액으로 상온에서 30분간 처리하여 표면의 카복실기를 활성형 에스테르(active ester)로 전환하였다. 과량의 미반응 EDC와 NHS는 PD-10 탈염 컬럼(GE Healthcare, USA)을 이용하여 제거하였다. 이어서, 150 μg/mL의 FcBP-eGFP-Tat를 포함한 PBS 완충용액(PBS)을 적용하여 상온에서 30분간 반응시킴으로써, 활성화된 칼르복실(carboxyl) 표면에 융합단백질을 결합시켰다. 100 mM 에탄올아민(ethanolamine)(pH 8.5)을 가하여 단백질과 반응하지 않은 활성형 카르복실기(active ester) 표면을 불활화시켰다. Sephacryl S500 size-exclusion column(GE Healthcare, USA)을 사용하여 미반응 단백질을 제거하였다.
<2-2> 융합단백질을 포함한 고분자 나노입자의 세포 투과
본 발명자들은 상기 실험예 <2-1>에서 융합단백질이 고정된 나노입자들을 이용하여 상기 <실험예 1>과 같은 방법으로 HeLa 세포에 도입하였다. 웰 당 1×104 개의 HeLa 세포를 8-웰 플레이트에 분주하고 12 ~ 18시간 정도 배양하였다. 융합단백질이 고정된 나노입자 용액을 각각 0.12 ~ 2.5 mg/mL이 되도록 첨가하고 37℃에서 3시간 동안 배양하였다. 4%의 파라포름알데하이드(para-formaldehyde)로 세포를 고정화한 후 DAPI(4',6-diamidino-2-phenylindole) 염색을 하여 핵을 표지하였다. 세포이미지와 형광이미지는 DeltaVision(AppliedPrecesion, USA)를 이용하여 관찰하였다. 그 결과, 도 3 내지 도 5에서 보는 바와 같이 융합단백질이 고정된 나노입자들이 세포내로 도입된 것을 확인할 수 있었다(도 3 내지 도 5).
도 1은 FcBP와 CPP를 포함하는 펩타이드 또는 단백질이 FcBP의 작용에 의하여 항체를 결합한 후, CPP의 작용에 의하여 항체를 세포안으로 이동시키는 과정을 도식화 그림이다.
도 2 는 FcBP-eGFP-Tat 융합단백질을 이용하여 형광(Cy3) 표지된 사람유래의 면역글로불린 G (immunoglobulin G: IgG)를 세포내로 도입한 후 형광이미지를 촬영한 사진이다.
도 3 은 eGFP 융합단백질로 표면처리를 한 100 nm 크기의 PS 입자를 세포내로 도입한 후 형광이미지를 촬영한 사진이다.
도 4 는 eGFP 융합단백질로 표면처리를 한 200nm 크기의 PS 입자를 세포내로 도입한 후 형광이미지를 촬영한 사진이다.
도 5 는 Cy3 형광염료로 표면처리를 한 200nm 크기의 PS 입자를 세포내로 도입한 후 형광이미지를 촬영한 사진이다.
<110> Korea Research Institute of Bioscience and Biotechnology <120> Fusion peptides introducing antibody into cells, and cellular imaging and targeted drug delivery system using the same <130> 8p-06-44 <160> 10 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 81 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> fprward primer for FcBP <400> 1 gaattccata tggactgtgc atggcacctg ggagaactgg tctggtgcac cggatccgaa 60 ttcgagctcg tgagcaaggg c 81 <210> 2 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer for FcBP <400> 2 ccgctcgagc ttgtacagct cgtccatgcc gag 33 <210> 3 <211> 81 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer for Tat <400> 3 gaattccata tggactgtgc atggcacctg ggagaactgg tctggtgcac cggatccgaa 60 ttcgagctcg tgagcaaggg c 81 <210> 4 <211> 72 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer for Tat <400> 4 ccgctcgagt taaccacgac gacgctgacg acgtttttta cgaccgtagg atcccttgta 60 cagctcgtcc at 72 <210> 5 <211> 96 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer for MTS <400> 5 gaattccata tggcagcggt tgcactgctg ccagcagttc tgctggcact gctggcacca 60 ggatccgaat tcgactgtgc atggcacctg ggagaa 96 <210> 6 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer for MTS <400> 6 ccgctcgagc ttgtacagct cgtccatgcc gag 33 <210> 7 <211> 80 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer for PTS <400> 7 aattccatat gtacggtcgt aaaaaacgtc gtcagcgtcg tcgtggtgga tccgactgtg 60 catggcacct gggagaactg 80 <210> 8 <211> 51 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer for PTS <400> 8 ccgctcgagt tacagcttgg aggatccctt gtacagctcg tccatgccga g 51 <210> 9 <211> 96 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer for PTS <400> 9 gaattccata tggcagcggt tgcactgctg ccagcagttc tgctggcact gctggcacca 60 ggatccgaat tcgactgtgc atggcacctg ggagaa 96 <210> 10 <211> 51 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer for PTS <400> 10 ccgctcgagt tacagcttgg aggatccctt gtacagctcg tccatgccga g 51

Claims (20)

  1. 항체 Fc 부위 결합 펩타이드(Fc-binding protein; FcBP)에 세포투과신호 펩타이드(Cell penetrating peptide: CPP)를 융합한 세포투과성 융합 펩타이드.
  2. 제 1항에 있어서, 추가적으로 형광펩타이드를 융합하는 세포투과성 융합 펩타이드.
  3. 제 2항에 있어서, 상기 형광펩타이드는 EGFP, ECFP, EYFP 및 RFP로 구성된 군으로부터 선택된 어느 하나인 것을 특징으로 하는 융합 펩타이드.
  4. 제 1항에 있어서, 세포투과신호 펩타이드는 Tat, 페너트라틴(penetratin), pVEC, MAP, MTS, Arg8, MPG, 트란스포르탄(Transportan) KALA, 부포린 2(Buforin 2), 마스토파란(Mastoparan) 및 VP22로 구성된 군으로부터 선택된 어느 하나인 것을 특징으로 하는 세포투과성 융합 펩타이드.
  5. 제 1항의 융합 펩타이드, 또는 상기 융합 펩타이드에 추가적으로 형광펩타이드가 융합된 융합 펩타이드를 코딩하는 유전자.
  6. 제 5항의 유전자를 포함하는 발현벡터.
  7. 제 6항의 발현벡터를 숙주세포에 도입한 형질전환체.
  8. 1) 제 7항의 형질전환체를 배지에서 배양하는 단계; 및
    2) 상기 배양액으로부터 제 1항의 융합 펩타이드, 또는 상기 융합 펩타이드에 형광펩타이드가 융합된 융합 펩타이드를 분리 및 정제하는 단계를 포함하는 융합 펩타이드 제조방법.
  9. 1) 제 1항의 융합 펩타이드, 또는 상기 융합 펩타이드에 형광펩타이드가 융합된 융합 펩타이드에 항체를 첨가하여 혼합시키는 단계; 및
    2) 상기 혼합물을 표적 세포에 처리한 후 배양하는 단계를 포함하는 표적 세포내 항체를 도입하는 방법.
  10. 제 9항에 있어서, 단계 1)의 항체는 면역글로불린 G(Immunoglobulin G; IgG)인 것을 특징으로 하는 방법.
  11. 항체 Fc 부위 결합 펩타이드(FcBP), 세포투과신호 펩타이드(CPP) 및 형광펩타이드가 융합된 융합 펩타이드, 및 세포내 항원에 특이적인 항체를 포함하는 상기 항원에 특이적인 세포 영상화제.
  12. 제 11항에 있어서, 형광펩타이드는 EGFP, ECFP, EYFP 및 RFP로 구성된 군으로부터 선택된 어느 하나인 것을 특징으로 하는 세포 영상화제.
  13. 1) 항체 Fc 부위 결합 펩타이드(FcBP), 세포투과신호 펩타이드(CPP) 및 형광펩타이드가 융합된 융합 펩타이드에 항체를 혼합시키는 단계; 및
    2) 상기 혼합물을 표적 세포에 처리한 후 배양하는 단계를 포함하는 항원에 특이적인 세포의 영상화 방법.
  14. 제 13항에 있어서, 형광펩타이드는 EGFP, ECFP, EYFP 및 RFP로 구성된 군으로부터 선택된 어느 하나인 것을 특징으로 하는 방법.
  15. 항체 Fc 부위 결합 펩타이드(FcBP)에 세포투과신호 펩타이드(CPP)를 융합한 융합 펩타이드, 상기 융합 펩타이드에 형광 펩타이드가 융합된 융합 펩타이드, 항체에 대한 특이적으로 친화성을 갖는 올리고 펩타이드, 및 상기 올리고 펩타이드에 PEG를 혼합한 혼성체로 구성된 군으로부터 선택된 어느 하나, 및 약물전달용 입자를 포함하는 표적지향적 약물전달체.
  16. 제 15항에 있어서, 약물전달용 입자는 리포좀, 마이셀, 고분자 나노입자 및 금속 나노입자로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나인 것을 특징으로 하는 표적지향적 약물전달체.
  17. 1) 약물을 봉입한 약물전달용 입자를 포함하는 제 15항의 약물전달체를 제조하는 단계;
    2) 상기 단계 1)의 약물전달체에 항체를 혼합시키는 단계; 및
    3) 상기 혼합물을 표적 세포에 처리한 후 배양하는 단계를 포함하는 표적 세포에 선택적으로 약물을 전달하는 방법.
  18. 제 17항에 있어서, 단계 1)의 약물은 저분자 약물, 단백질, 펩타이드, RNA, DNA를 포함하는 핵산 또는 변형 핵산계열, PNA, 백신, 면역 조절제, 또는 난용성 약물인 것을 특징으로 하는 방법.
  19. 제 17항에 있어서, 단계 1)의 약물전달용 나노 입자는 리포좀, 마이셀, 고분자 나노입자 및 금속 나노입자로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나인 것을 특징으로 하는 방법.
  20. 제 17항에 있어서, 단계 2)의 항체는 면역글로불린 G(Immunoglobulin G; IgG)인 것을 특징으로 하는 방법.
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CN102174318A (zh) * 2011-02-13 2011-09-07 华中科技大学 一类基于活性的在体标记蛋白酪氨酸磷酸酶的透膜荧光小分子探针的合成和应用
KR101477123B1 (ko) * 2011-10-12 2014-12-29 한국생명공학연구원 항체결합 펩타이드-페리틴 융합단백질 및 이의 용도
CN107556385A (zh) * 2016-07-02 2018-01-09 清华大学 双环肽Fc‑4C及其在抗体检测和重组蛋白表达中的应用
WO2023224388A1 (ko) * 2022-05-17 2023-11-23 주식회사 엔이에스바이오테크놀러지 금속 나노 입자-핵산 결합체를 기반으로 하는 유전자 운반체

Cited By (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
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