CN102174318A - 一类基于活性的在体标记蛋白酪氨酸磷酸酶的透膜荧光小分子探针的合成和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一类基于活性的在体标记蛋白酪氨酸磷酸酶的透膜荧光小分子探针及其合成和应用,属于生物分子学领域。这一类基于活性的在体标记蛋白酪氨酸磷酸酶的透膜荧光小分子探针可以实现在活细胞内目标蛋白的标记。
Description
技术领域
本发明属于生物分子学领域。
背景技术
基于酶活性的化学小分子探针(Activity-based probes,ABPs)是一种功能性的蛋白质组学的研究工具。经典的探针包括三个部分:反应基团,连接基团与标记基团。反应基团通常是根据靶酶的催化机理设计的一类强吸电子能力的化学小分子,它能够与靶酶的催化中心共价结合,从而起到基于活性的标记的目的。连接基团用来隔开反应基团与标记基团,减小合成中的空间位阻。标记基团用来示踪,便于检测,比如有同位素标记、荧光标记与生物素标记等。传统的ABPs标记目标底物的过程如下:当ABPs暴露在底物中处于合适的标记环境中时,有活性的底物中心会被ABP占据并结合,而非底物或者非活性的底物不能被ABP结合,这样通过一维电泳胶分离,可以达到将底物与背景分离开的目的,再通过酶解,结合蛋白质的质谱技术,就可以检测被标记的底物。
ABPs的优点主要表现在:1)直接从功能角度切入蛋白质研究,而不是仅对蛋白质进行定性定量鉴定。2)可实现基于活性的蛋白质检测,消除了那些没被激活,不具有活性的蛋白质对检测结果的影响。3)分子量小,避免体积过大而有可能影响其在细胞内的分布及与蛋白质的相互作用的问题。4)实验过程简单,可获得的信息量大。
目前,ABPs作为一种功能性的蛋白质组学研究工具已经在多种酶家族中有应用。具体对于蛋白酪氨酸磷酸酶家族来说,其酶家族本身所具有的高分散性、高度依赖于翻译后修饰的活性,以及较大一部分分布于细胞膜上的特点,使得其本身比较适合用这种基于活性的检测方法。但目前,用ABP的方法研究这种酶家族的研究工作进行得相对来说比较少,而且只能在裂解液中标记。这种先将细胞裂解再与探针共孵育的方法,由于其对于活细胞的破坏作用,将丢失一部分信息,得到的信息也会存在失真状况。
发明内容
本发明的目的是解决上述问题而提供了一类基于活性的在体标记蛋白酪氨酸磷酸酶的透膜荧光小分子探针,该小分子探针可以实现在活细胞内目标蛋白的标记。
本发明所采用的技术方案是:
一类基于活性的在体标记蛋白酪氨酸磷酸酶的透膜荧光小分子探针,具有式Ⅰ所示的结构:
Ⅰ
式Ⅰ中,为α-溴苄基亚磷酸,对蛋白酪氨酸磷酸酶有着高特异性的反应基团;为谷氨酸,作为连接基团1,用于引出一个比反应识别基团上的氨基更加活泼的氨基、减小反应识别基团与其它部分连接时的空间位阻以及借助于其侧伸出的基团与树脂相连;为八聚精氨酸,是透膜基团,其作用是携带整个探针进入细胞,赋予探针穿膜功能;为6-氨基己酸,为连接基团2,其作用是是减小透膜基团与荧光基团之前的空间位阻;R为荧光基团,用于示踪。
一类基于活性的在体标记蛋白酪氨酸磷酸酶的透膜荧光小分子探针,其特征在于,具有式Ⅱ所示的结构:
Ⅱ
一类基于活性的在体标记蛋白酪氨酸磷酸酶的透膜荧光小分子探针Ⅰ的合成方法,包括以下步骤:
1)反应识别基团的合成及修饰:从反应起始物对氰基溴苄开始,利用液相有机合成,得到乙基保护下的反应识别基团,接着采用羧基活化法在其氨基端连入一个谷氨酸,反应式如下:
2)全探针的初步合成:从上述修饰后的反应识别基团开始,选用氨基AM树脂,采用固相Fmoc合成策略,在去掉Fmoc后,依次连接八个精氨酸,6-氨基己酸,荧光基团R,其反应式如下:
3)亚磷酸保护基的去保护:反应识别基团上的乙基Et最后去掉,在切掉树脂与其它保护基之后,要求无水环境,其反应式如下:
一类基于活性的在体标记蛋白酪氨酸磷酸酶的透膜荧光小分子探针Ⅱ的合成方法,包括以下步骤:
1)反应识别基团的合成及修饰:从反应起始物对氰基溴苄开始,利用液相有机合成,得到乙基保护下的反应识别基团,接着采用羧基活化法在其氨基端连入一个谷氨酸,反应式如下:
2)全探针的初步合成:从上述修饰后的反应识别基团开始,选用氨基AM树脂,采用固相Fmoc合成策略,在去掉Fmoc后,依次连接八个精氨酸,带有生物素的赖氨酸,6-氨基己酸,荧光素R,其反应式如下:
3)亚磷酸保护基的去保护:反应识别基团上的乙基(Et)最后去掉,在切掉树脂与其它保护基之后,要求无水环境,其反应式如下:
一类基于活性的在体标记蛋白酪氨酸磷酸酶的透膜荧光小分子探针Ⅰ、Ⅱ用于活细胞内的目标蛋白酶的标记检测,包括细胞外源信号刺激后的目标蛋白酶的标记检测,以及对活细胞标记后的目标蛋白酶的纯化和质谱鉴定。
本发明具有以下优点:
本发明合成了一类基于活性的针对蛋白酪氨酸磷酸酶家族的透膜荧光小分子探针,它把高效的细胞穿膜肽-八聚精氨酸引入到传统基于活性的小分子探针的结构中,赋予探针穿膜功能,从而构造了一类穿膜型的小分子探针,这种探针可以实现在活细胞内的目标蛋白标记。为了提高探针的穿膜效率以及标记范围,我们还在传统的天然构型的多聚精氨酸中引入了非天然的D型构象,而且实验结果表明它能高效携带探针到达细胞质,并具有很好的生物稳定性,因此能更好的标记目标蛋白。本发明的这种功能引入的思想,在保留了基于活性的小分子探针(ABP)的优点基础上,又拓展了探针的应用范围。另外,酶本身起着传递信号的作用,用这种改进了的探针可以研究酶在信号刺激前后的动态变化。基于以上特点,本发明以后将有更广泛的应用前景。
附图说明
下面结合附图和实施方式对本发明作进一步详细的说明。
图1为实施例1中基于活性的针对蛋白酪氨酸磷酸酶家族的透膜荧光小分子探针Ⅰ的质谱检测报告;
图2为实施例2中基于活性的针对蛋白酪氨酸磷酸酶家族的透膜荧光小分子探针Ⅱ的质谱检测报告;
图3为实施例3中基于活性的针对蛋白酪氨酸磷酸酶家族的透膜荧光小分子探针Ⅲ的质谱检测报告;
图4为实施例1中基于活性的针对蛋白酪氨酸磷酸酶家族的透膜荧光小分子探针Ⅰ在HeLa活细胞内随时间变化的分布图;
图5为实施例2中基于活性的针对蛋白酪氨酸磷酸酶家族的透膜荧光小分子探针Ⅱ在HeLa活细胞内随时间变化的分布图;
图6为实施例2中透膜荧光小分子探针Ⅱ与HeLa活细胞进行孵育,裂解细胞后SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳图。
具体实施方式
实施例1
基于活性的针对蛋白酪氨酸磷酸酶家族的透膜荧光小分子探针Ⅰ结构为:
其反应条件为:对氰基溴苄在液相有机合成反应后得到乙基保护的形式,谷氨酸在无水二氯甲烷环境中,在EDC催化下活化成NHS保护的形式;这个形式与氨基AM树脂在无水DMF中,HBTU和HOBt缩合环境下,由DIEA催化反应,接到树脂上,成为固相反应的起始物。之后这个起始物在20%哌啶的DMF环境中去掉Fmoc保护基,在HBTU/HOBt/DIEA三者共同作用下接上第一个天然精氨酸。之后,依然是在20%哌啶的DMF环境中去掉Fmoc保护基,在HBTU/HOBt/DIEA作用下依次接上剩余的七个氨基酸、氨基乙酸和FAM。之后,全部的反应物用DMF和二氯甲烷重复洗干净,干燥树脂后在TFA/Tis/H2O的混合溶液中去掉精氨酸的侧链保护基并切下树脂,剩下的东西干燥。完全干燥后,在无水DMF环境中,加入去乙基试剂TMSBr去掉反应识别基团上的保护基,得到粗品,干燥粗口,制备色谱中分纯得到纯度大于95%的产物。
基于活性的针对蛋白酪氨酸磷酸酶家族的透膜荧光小分子探针Ⅰ的质谱检测报告如图1所示。
基于活性的针对蛋白酪氨酸磷酸酶家族的透膜荧光小分子探针Ⅰ孵育细胞激光共聚焦扫描成像的时间序列实验:
生长状态良好的HeLa细胞(2x104 cells/well)接种于无菌的Lab-Tek I 8孔板。37℃、5% CO2、300μl有血清的DMEM高糖溶液境下培养过夜,至细胞在皿中铺成合适的密度。将透膜荧光小分子Ⅰ用纯水配成高浓度(1mM)的溶液,之后用PBS稀释到终浓度为20μM。实验前,吸去培养基,用PBS溶液洗涤细胞两次。当探针溶液恢复到37℃时,取300μl探针溶液加入到细胞培养皿中,37℃、5% CO2避光培养半小时。之后去掉探针溶液,小心加入150μl的1mM的台酚蓝溶液,一分钟后吸走台酚蓝,PBS溶液小心洗涤细胞三次,加入鲜有血清的DMEM高糖溶液,上镜观察。在每次观察的时间间隔内,将细胞仍放回37℃、5% CO2避光环境中,下次观察之前加150μl的1mM的台酚蓝溶液洗一分钟,PBS溶液洗涤细胞三次,加入鲜有血清的DMEM高糖溶液。
成像条件:激光扫描共聚焦显微镜FV1000(Olympus, Japan)观察。FAM由通道488 nm激发,在495-555 nm观察。每次成像选取同样的电压(650V),同样的光功率(2%)。
其孵育细胞后激光共聚焦成像的显示图见附图4。图4中用高浓度的探针溶液(20μM)与HeLa细胞共孵育半小时,之后隔半小时、3小时、6小时分别成像。可以看出探针一直包被在囊泡中,虽然进入细胞,但无法释放,不利于标记。
实施例2
基于活性的针对蛋白酪氨酸磷酸酶家族的透膜荧光小分子探针Ⅱ结构为:
其中,荧光集团R为5-羧基荧光素(FAM),八聚精氨酸为八聚精氨酸R2(Rr)3(R:L-精氨酸;r:D-精氨酸),其化学反应式为:
反应条件为:对氰基溴苄在液相有机合成反应后得到乙基保护的形式,谷氨酸在无水二氯甲烷环境中,在EDC催化下活化成NHS保护的形式;这个形式与氨基AM树脂在无水DMF中,HBTU和HOBt缩合环境下,由DIEA催化反应,接到树脂上,成为固相反应的起始物。之后这个起始物在20%哌啶的DMF环境中去掉Fmoc保护基,在HBTU/HOBt/DIEA三者共同作用下接上第一个天然精氨酸。之后,依然是在20%哌啶的DMF环境中去掉Fmoc保护基,在HBTU/HOBt/DIEA作用下依次接上天然、天然、非天然、天然、非天然、天然、非天然七个精氨基酸、氨基乙酸和FAM。之后,全部的反应物用DMF和二氯甲烷重复洗干净,干燥树脂后在TFA/Tis/H2O的混合溶液中去掉精氨酸的侧链保护基并切下树脂,剩下的东西干燥。完全干燥后,在无水DMF环境中,加入去乙基试剂TMSBr去掉反应识别基团上的保护基,得到粗品,干燥粗口,制备色谱中分纯得到纯度大于95%的产物。
基于活性的针对蛋白酪氨酸磷酸酶家族的透膜荧光小分子探针Ⅱ的质谱检测报告如图2所示。
针对组织蛋白酶家族的透膜荧光小分子探针Ⅱ孵育细胞激光共聚焦扫描成像的时间序列实验:
生长状态良好的HeLa细胞(2x104 cells/well)接种于无菌的Lab-Tek I 8孔板。37℃、5% CO2、300μl有血清的DMEM高糖溶液境下培养过夜,至细胞在皿中铺成合适的密度。将透膜荧光小分子Ⅱ用纯水配成高浓度(1mM)的溶液,之后用PBS稀释到终浓度为10μM。实验前,吸去培养基,用PBS溶液洗涤细胞两次。当探针溶液恢复到37℃时,取300μl探针溶液加入到细胞培养皿中,37℃、5% CO2避光培养半小时。之后去掉探针溶液,小心加入150μl的1mM的台酚蓝溶液,一分钟后吸走台酚蓝,PBS溶液小心洗涤细胞三次,加入鲜有血清的DMEM高糖溶液,上镜观察。在每次观察的时间间隔内,将细胞仍放回37℃、5% CO2避光环境中,下次观察之前加150μl的1mM的台酚蓝溶液洗一分钟,PBS溶液洗涤细胞三次,加入鲜有血清的DMEM高糖溶液。
成像条件:激光扫描共聚焦显微镜FV1000(Olympus, Japan)观察。FAM由通道488 nm激发,在495-555 nm观察。每次成像选取同样的电压(650V),同样的光功率(2%)。
其孵育细胞后激光共聚焦成像的显示图见附图5。图5中用中等浓度的探针溶液(10μM)与MCF-7细胞共孵育半小时,之后隔半小时、3小时、8小时分别成像。可以看出探针不仅可以进入细胞,而且均匀充满在细胞质内,达到了标记的理想效果。
活细胞蛋白标记实验:
高糖的DMEM中培养到约1.6*107个HeLa细胞,之后用PBS溶液洗涤细胞两次,加入透膜荧光小分子探针Ⅱ的无血清DMEM高糖溶液(探针的终浓度为10 μM),37℃、5% CO2环境下避光孵育1 h,吸出探针溶液,加入含血清的DMEM高糖溶液。将细胞置于37℃、5% CO2环境下培养5h,之后去掉培养基,用PBS溶液洗涤细胞两次,加入胰酶消化收集细胞。收集的细胞用冷的PBS溶液洗涤后,加入RIPA裂解液(Beyotime)裂解液。裂解后的蛋白13000 g/min离心5 min,取上清,用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分析。其电泳的结果如图6所示。
实施例3
基于活性的针对蛋白酪氨酸磷酸酶家族的透膜荧光小分子探针Ⅲ结构为:
反应条件为:对氰基溴苄在液相有机合成反应后得到乙基保护的形式,谷氨酸在无水二氯甲烷环境中,在EDC催化下活化成NHS保护的形式;这个形式与氨基AM树脂在无水DMF中,HBTU和HOBt缩合环境下,由DIEA催化反应,接到树脂上,成为固相反应的起始物。之后这个起始物在20%哌啶的DMF环境中去掉Fmoc保护基,在HBTU/HOBt/DIEA三者共同作用下接上第一个天然精氨酸。之后,依然是在20%哌啶的DMF环境中去掉Fmoc保护基,在HBTU/HOBt/DIEA作用下依次接上天然、天然、非天然、天然、非天然、天然、非天然七个精氨基酸、带Biotin的赖氨酸、氨基乙酸和FAM。之后,全部的反应物用DMF和二氯甲烷重复洗干净,干燥树脂后在TFA/Tis/H2O的混合溶液中去掉精氨酸的侧链保护基并切下树脂,剩下的东西干燥。完全干燥后,在无水DMF环境中,加入去乙基试剂TMSBr去掉反应识别基团上的保护基,得到粗品,干燥粗口,制备色谱中分纯得到纯度大于95%的产物。
基于活性的针对蛋白酪氨酸磷酸酶家族的透膜荧光小分子探针Ⅲ的质谱检测报告如图3所示。
以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制,尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明,本领域的普通技术人员应当理解,可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换,而不脱离本发明技术方案的精神和范围,其均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。
Claims (7)
3.根据权利要求1或2任意一项所述的一类基于活性的在体标记蛋白酪氨酸磷酸酶的透膜荧光小分子探针,其特征在于,所述荧光集团R为5-羧基荧光素。
4.根据权利要求1或2任意一项所述的一类基于活性的在体标记蛋白酪氨酸磷酸酶的透膜荧光小分子探针,其特征在于,所述八聚精氨酸为天然型的八聚精氨酸或者天然与非天然的杂合型八聚精氨酸。
7.权利要求1至2任意一项所述的一类基于活性的在体标记蛋白酪氨酸磷酸酶的透膜荧光小分子探针的应用,其特征在于,所述一类基于活性的在体标记蛋白酪氨酸磷酸酶的透膜荧光小分子探针I、II用于活细胞内的目标蛋白酶的标记检测,包括细胞外源信号刺激后的目标蛋白酶的标记检测,以及对活细胞标记后的目标蛋白酶的纯化和质谱鉴定。
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