CN102174319B - 一类针对半胱氨酸蛋白酶c1家族蛋白酶的透膜荧光小分子探针及其合成、纯化的方法和应用 - Google Patents

一类针对半胱氨酸蛋白酶c1家族蛋白酶的透膜荧光小分子探针及其合成、纯化的方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一类针对半胱氨酸蛋白酶C1家族蛋白酶的透膜荧光小分子探针的合成，纯化以及应用，属于生物分子学领域。这一类透膜荧光小分子探针可以在活细胞中实现对半胱氨酸蛋白酶C1家族蛋白酶的实时标记成像，并且能够对目标蛋白酶进行蛋白质组学研究。

Description

一类针对半胱氨酸蛋白酶C1家族蛋白酶的透膜荧光小分子探针及其合成、纯化的方法和应用
技术领域
本发明属于生物分子学领域。
背景技术
基于酶活性的化学小分子探针(activity-based probes，ABPs)是近年来兴起的新一代功能蛋白检测探针，主要是用有机化学的方法人工合成靶向小分子探针与特定酶蛋白结合，实现对特定酶家族的标识和研究。这类小分子探针通常包括3个部分：一个可以和酶共价交联的反应基团；一个可探测的标签基团；及一个能够把反应基团和标签基团连接在一起的联接基团。ABPs的工作原理是：带有反应基团和标签基团的小分子探针与待研究的蛋白质组作用，利用小分子探针中的反应基团能够特异性共价结合蛋白质组中的某类特定酶家族的特性，将化学小分子连接到感兴趣的特定靶酶上。由于探针的反应基团是根据特定酶家族的普遍反应催化机理设计，因此它们能够识别酶是否具有活性，可以选择性地只标记具有活性的特定酶家族成员，而与其它类酶或那些没被激活的特定酶家族成员都不能反应。
根据标签基团的不同，基于酶活性的化学小分子探针(ABPs)还可以分为：含有荧光的荧光小分子探针、含有放射性的放射性探针和含有特定亲合基团的探针。其中，基于酶活性的荧光小分子探针因其所带的荧光基团具有检测方便、快速，ng级的检测灵敏度，环境污染小等优点在近几年来愈来愈受到人们的关注
基于酶活性的化学小分子探针(ABPs)与其它蛋白质组学研究技术相比，其的优点主要表现在：1)直接从功能角度切入蛋白质研究，而不是仅对蛋白质进行定性定量鉴定。2)可实现基于活性，而不是基于丰度的蛋白质检测。3)分子量小，避免体积过大而有可能影响其在细胞内的分布及与蛋白质的相互作用的问题。
目前，基于酶活性的化学小分子探针(ABPs)已成功用于针对多种靶酶家族的功能蛋白质组学研究。其中组织蛋白酶家族是一个重要的研究对象。组织蛋白酶绝大多数成员属于半胱氨酸蛋白酶C1家族蛋白酶，现有的研究表明组织蛋白酶家族在恶性肿瘤的形成，转移和发展过程中有多重生理效应，并在多种恶性肿瘤中高表达，因此近些年来成为研究的热点之一。利用基于酶活性的小分子探针对组织蛋白酶家族的研究还处于起步阶段，很多地方有待改进，主要表现在现有的大多数ABPs因本身所含的标识基团比较大，不能够穿透细胞膜进入细胞内，因此只能实现细胞外(inVitro)如：细胞或组织匀浆中对组织蛋白酶的检测。而细胞或组织的化学和/或物理降解可能改变内生酶和酶阻遏物的浓度及其在亚细胞的分布，降解后获得的细胞或组织匀浆中的蛋白质组最多只能接近活细胞内蛋白质的功能状态，丢失了很多重要信息。
目前已有的能够实现活细胞内(in Vivo)的组织蛋白酶标记的荧光探针只有采用氟硼荧(BODIPY)染料或者Cyanine染料系列(CY3，CY5)探针，但是其透膜速度慢，不能够实现实时成像，同时因为染料种类的限制，检测光谱受限，使用的范围小，并且Cyanine 5染料的价格非常昂贵，严重限制其推广应用。另外，因这种探针也不能携带生物素等标记物实现对目标蛋白的富集和蛋白质组学研究。
发明内容
本发明的目的是解决上述问题而提供了一类针对半胱氨酸蛋白酶C1家族蛋白酶的透膜荧光小分子探针及其合成，纯化方法和应用，这一类透膜荧光小分子探针可以在活细胞中实现对半胱氨酸蛋白酶家族C1家族蛋白酶的实时标记成像，并且能够目标蛋白酶进行蛋白质组学研究。
本发明所采用的技术方案是：
一类针对半胱氨酸蛋白酶C1家族蛋白酶的透膜荧光小分子探针，具有式Ⅰ所示的结构：
式Ⅰ中，R为荧光基团，用于示踪检测；为6-氨基己酸，作为连接部分1，用于隔开空间位阻；为八聚精氨酸，作为透膜基团，引导探针分子进入细胞；为赖氨酸，作为连接部分2，用于隔开空间位阻以及用于结合树脂，利于运用固相肽合成技术合成探针；为反应识别集团，能够识别半胱氨酸蛋白酶C1家族的酶蛋白，并且共价结合。
一类针对半胱氨酸蛋白酶C1家族蛋白酶的透膜荧光小分子探针，具有式Ⅱ所示的结构：
式Ⅱ中，为5-羧基荧光素，用于示踪检测；为6-氨基己酸，作为连接部分1，用于隔开空间位阻；为侧链为Biotin的赖氨酸，用于亲和富集作用；为八聚精氨酸，作为透膜基团，引导探针分子进入细胞；为赖氨酸，作为连接部分2，用于隔开空间位阻，以及用于结合树脂，利于运用固相肽合成技术合成探针；为反应识别集团，能够识别半胱氨酸蛋白酶CA家族的酶蛋白，并且共价结合到酶分子上。
一类针对半胱氨酸蛋白酶C1家族蛋白酶的透膜荧光小分子探针Ⅰ的合成方法，包括以下步骤：
a)从连接部分2开始，采用N-[(9H-芴-9-甲氧基)羰基]-N'-[(2-丙烯氧基)羰基]-L-赖氨酸为起始物，将赖氨酸连接上固相肽合成树脂，运用Fmoc固相合成法，在氨基端依次连接侧链为Pbf保护八个精氨酸，氨基己酸，连接罗丹明或者5-羧基荧光素；
b)去掉连接部分2的侧链保护基，运用Fmoc固相合成法，依加上酪氨酸，异亮氨酸；
c)反应基团的Epoxide的合成以及连接上探针，反应基团的Epoxide合成，从L(+)-酒石酸二乙酯开始合成环氧琥珀酰对硝基苯酯，将环氧琥珀酰对硝基苯酯连接到探针的骨架分子上。
一类针对半胱氨酸蛋白酶C1家族蛋白酶的透膜荧光小分子探针Ⅱ的合成方法，包括以下步骤：
a)从连接部分2开始，将赖氨酸连接上固相肽合成树脂，运用Fmoc固相合成法，在氨基端依次连接侧链为Pbf保护八个精氨酸，氨基己酸，侧链联结有Biotin的赖氨酸，5-羧基荧光素；
b)去掉连接部分2的侧链保护基OALLYL，运用Fmoc固相合成法，依次加上酪氨酸，异亮氨酸；
c)反应基团的Epoxide的合成以及连接上探针，反应基团的Epoxide合成，从L(+)-酒石酸二乙酯开始合成环氧琥珀酰对硝基苯酯，将环氧琥珀酰对硝基苯酯在N,N-二异丙基乙胺(DIEA)的情况下连接到探针的骨架分子上。
一类针对半胱氨酸蛋白酶C1家族蛋白酶的透膜荧光小分子探针Ⅰ、Ⅱ的纯化方法，包括以下步骤：
a)在上述合成步骤完成之后，用TFA：EDT：TIS：H2O＝95:2:1:2处理，去掉精氨酸的Pbf侧链保护，并且将探针从树脂上切下来；
b)反应体系中加入NMM，调PH至中性，用冰乙醚沉淀产物，将产物再用冰乙醚洗涤两次；
c)得到的粗产物用C18反相硅胶柱进行柱层析，洗脱液使用含0.01％醋酸的H2O/MeOH体系，通过质谱分析确定产物，收集产物组分后冷冻干燥，浓缩得到所需的产物晶体。
所述一类针对半胱氨酸蛋白酶C1家族蛋白酶的透膜荧光小分子探针Ⅰ、Ⅱ用于活细胞内的目标蛋白酶的标记和检测以及对活细胞内标记后的目标蛋白酶的纯化和质谱鉴定。
本发明具有以下优点：
本发明合成了一类用于小分子探针设计的结构模块，并运用此类探针模块设计，合成了针对半胱氨酸蛋白酶C1家族蛋白酶的小分子荧光探针。实验表明该探针能够进入活细胞，标记组织蛋白酶，成像可以发现其定位在溶酶体，细胞裂解后能够发现目标酶蛋白，并且还能够对蛋白进行亲和富集。这类探针能够实现对活细胞内组织蛋白酶的分布定位的实时成像，并能进行相关蛋白质组学的研究。这些研究能够为载体研究组织蛋白酶提供强有力的工具，有可能为癌症转移和早期诊断提供方法。本发明涉及的该类探针模块结构合理，合成方法相对简单，成本较低，具有商业推广价值。
附图说明
下面结合附图和实施方式对本发明作进一步详细的说明。
图1为实施例1中针对半胱氨酸蛋白酶C1家族蛋白酶的透膜荧光小分子探针Ⅰ的质谱(MS)检测报告；
图2为实施例2中针对半胱氨酸蛋白酶C1家族蛋白酶的透膜荧光小分子探针Ⅱ的质谱(MS)检测报告；
图3为实施例3中针对半胱氨酸蛋白酶C1家族蛋白酶的透膜荧光小分子探针Ⅲ的质谱(MS)检测报告；
图4为实施例1中针对半胱氨酸蛋白酶C1家族蛋白酶的透膜荧光小分子探针Ⅰ孵育Hela细胞,与溶酶体染料DND-26共定位成像图；
图5为实施例2中针对半胱氨酸蛋白酶C1家族蛋白酶的透膜荧光小分子探针Ⅱ在Hela活细胞内随时间变化的分布图；
图6为实施例1中针对半胱氨酸蛋白酶C1家族蛋白酶的透膜荧光小分子探针Ⅱ孵育Hela细胞,与溶酶体染料DND-99共定位成像图；
图7为实施例3中针对半胱氨酸蛋白酶C1家族蛋白酶的透膜荧光小分子探针Ⅲ的电泳分析图。
具体实施方式
实施例1
针对半胱氨酸蛋白酶C1家族蛋白酶的透膜荧光小分子探针Ⅰ结构为：
R为罗丹明B,其合成的路线的化学反应式为：
针对半胱氨酸蛋白酶C1家族蛋白酶的透膜荧光小分子探针Ⅰ的质谱(MS)检测报告如图1所示。
针对半胱氨酸蛋白酶C1家族蛋白酶的透膜荧光小分子探针Ⅰ与溶酶体染料共定位实验：
HeLa细胞(2x104细胞/孔)接种于腔室玻片8孔板中(Lab-Tek I)。37℃、5％CO2环境下培养过夜。实验时，吸去培养基，用磷酸盐缓冲液(PBS)溶液洗涤细胞两次。配制含红色透膜荧光小分子探针(10μM)的无血清杜氏改良培养基(DMEM)高糖溶液300μL，将混合好后的混合培养基加入腔室玻片8孔板中(Lab-Tek I)。37℃、5％CO2环境下孵育1h。孵育时间结束后，首先丢弃孵育培养基，用磷酸盐缓冲液(PBS)溶液清洗细胞后，加入含10％胎牛血清的杜氏改良培养基(DMEM)高糖溶液。将细胞置于37℃、5％CO2环境下培养5h，丢弃培养基，加入含有溶酶体染料DND-26(10μM)的杜氏改良培养基(DMEM)无血清培养基，孵育1h。吸出含溶酶体染料的培养基，加入含10％胎牛血清的杜氏改良培养基(DMEM)高糖溶液上镜观察。
成像条件：所有细胞样品通过共聚焦显微镜FV1000观察。DND-26由Ar激光器在488nm处激发，在495-555nm观察。罗丹明B采用543nm激光器激发，在580nm观察。共聚焦显微镜型号：FV1000(日本奥林巴斯公司)。
其孵育细胞后激光共聚焦成像的显示图见附图4，从图4中可以看出针对半胱氨酸蛋白酶C1家族蛋白酶的透膜荧光小分子探针A能够在活细胞内标记组织蛋白，并且与溶酶体染料DND-26共定位在溶酶体内。
实施例2
针对半胱氨酸蛋白酶C1家族蛋白酶的透膜荧光小分子探针Ⅱ结构为：
R为5-羧基荧光素,其合成的路线的化学反应式为：
针对半胱氨酸蛋白酶C1家族蛋白酶的透膜荧光小分子探针Ⅱ的质谱(MS)检测报告如图2所示。
针对半胱氨酸蛋白酶C1家族蛋白酶的透膜荧光小分子探针Ⅱ孵育细胞激光共聚焦扫描成像的时间序列实验：
HeLa细胞(2x104细胞/孔)接种于腔室玻片8孔板中(Lab-Tek I)。37℃、5％CO2环境下培养过夜。实验时，吸去培养基，用磷酸盐缓冲液(PBS)溶液洗涤细胞两次。配制含透膜荧光小分子探针(10μM)的无血清杜氏改良培养基(DMEM)高糖溶液300μL，将混合好后的混合培养基加入腔室玻片8孔板中(Lab-Tek I)。37℃、5％CO2环境下孵育1h。孵育时间结束后，首先丢弃孵育培养基，用磷酸盐缓冲液(PBS)溶液清洗细胞后，加入含10％胎牛血清的杜氏改良培养基(DMEM)高糖溶液。将细胞置于37℃、5％CO2环境下，按时间上镜观察。
成像条件：所有细胞样品通过共聚焦显微镜FV1000观察。FAM由Ar激光器在488nm处激发，在495-555nm观察。共聚焦显微镜型号：FV1000(Olympus,Japan)。
针对半胱氨酸蛋白酶C1家族蛋白酶的透膜荧光小分子探针Ⅱ在Hela活细胞内随时间变化的分布图如图5所示。
针对半胱氨酸蛋白酶C1家族蛋白酶的透膜荧光小分子探针Ⅱ活细胞内与溶酶体染料的共定位实验：
HeLa细胞(2x104细胞/孔)接种于腔室玻片8孔板中(Lab-Tek I)。37℃、5％CO2环境下培养过夜。实验时，吸去培养基，用磷酸盐缓冲液(PBS)溶液洗涤细胞两次。配制含红色透膜荧光小分子探针(10μM)的无血清杜氏改良培养基(DMEM)高糖溶液300μL，将混合好后的混合培养基加入腔室玻片8孔板中(Lab-Tek I)。37℃、5％CO2环境下孵育1h。孵育时间结束后，首先丢弃孵育培养基，用磷酸盐缓冲液(PBS)溶液清洗细胞后，加入含10％胎牛血清的杜氏改良培养基(DMEM)高糖溶液。将细胞置于37℃、5％CO2环境下培养5h，丢弃培养基，加入含有溶酶体染料DND-99(10μM)的杜氏改良培养基(DMEM)无血清培养基，孵育1h。吸出含溶酶体染料的培养基，加入含10％胎牛血清的杜氏改良培养基(DMEM)高糖溶液上镜观察。
成像条件：所有细胞样品通过共聚焦显微镜FV1000观察。FAM由Ar激光器在488nm处激发，在495-555nm观察。DND-99采用543nm激光器激发，在580nm观察。共聚焦显微镜型号：FV1000(Olympus,Japan)。
其孵育细胞后激光共聚焦成像的显示图见附图6，从图6中可以看出针对半胱氨酸蛋白酶C1家族蛋白酶的透膜荧光小分子探针B能够在活细胞内标记组织蛋白，并且与溶酶体染料DND-99共定位在溶酶体内。
体外蛋白标记实验：
RAW264.7约1.6*107细胞富集后，加入磷酸盐缓冲液(PBS)洗涤两次，再加入裂解液500μL(50mM柠檬酸缓冲液，PH 4.5，0.5％曲拉通X-100，5mM二硫苏糖醇(DTT)，1％3-[(3-胆酰胺基丙基)二甲基铵基]-1-丙磺酸盐(CHAPS))，冰上裂解30min后，13000g/min离心5min,取上清蛋白液冻存。
取上清蛋白质10μL，加入2μL 60μM的透膜探针，探针终浓度为10μM，37℃孵育1h，加入5倍十二烷基硫酸钠上样缓冲液(1*SDS loadingbuffer)终止反应，80℃煮5min，聚丙烯凝胶电泳分析
实施例3
针对半胱氨酸蛋白酶C1家族蛋白酶的透膜荧光小分子探针Ⅲ的结构为：
其合成的路线的化学反应式为：
针对半胱氨酸蛋白酶C1家族蛋白酶的透膜荧光小分子探针Ⅲ的质谱(MS)检测报告如图3所示。
活细胞蛋白标记实验：
RAW264.7约1.6*107细胞，用磷酸盐缓冲液(PBS)洗涤两次，加入透膜荧光小分子探针的无血清杜氏改良培养基(DMEM)稀释液(探针终浓度为10μM)，37℃、5％CO2环境下孵育1h，吸出探针溶液，加入含10％胎牛血清的杜氏改良培养基(DMEM)溶液。将细胞置于37℃、5％CO2环境下培养5h，用磷酸盐缓冲液(PBS)洗涤两次，加入胰酶消化富集细胞。富集的细胞用磷酸盐缓冲液(PBS)洗涤后，加入细胞裂解液(Beyotime公司)裂解液,裂解液中含有蛋白酶抑制剂(Roche公司)。裂解后的蛋白13000g/min离心5min，取上清，用固定化链亲和素树脂(Pierce公司)将目标蛋白富集，随后用1倍十二烷基硫酸钠上样缓冲液(1*SDS loadingbuffer)中将树脂在80℃煮5min，将目标蛋白从树脂上洗脱下来。洗脱下来的蛋白用SDS电泳分析。
从图7中可以看出，针对半胱氨酸蛋白酶C1家族蛋白酶的透膜荧光小分子探针Ⅲ在活细胞中的组织蛋白酶后，裂解细胞，电泳分析，能够发现组织蛋白酶的荧光条带分布。并且在亲和富集后的目标蛋白，能够用于后续的蛋白组学分析。
以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的精神和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。

Claims (7)

1.一类针对半胱氨酸蛋白酶C1家族蛋白酶的透膜荧光小分子探针，其特征在于，具有式Ⅰ所示的结构：
式Ⅰ中，R为荧光基团，用于示踪检测；为6-氨基己酸，作为连接部分1，用于隔开空间位阻；为杂合型八聚精氨酸，作为透膜基团，引导探针分子进入细胞；为赖氨酸，作为连接部分2，用于隔开空间位阻以及用于结合树脂，利于运用固相肽合成技术合成探针；为反应识别基团，能够选择识别半胱氨酸蛋白酶C1家族蛋白酶，并且共价结合到酶分子上。
2.一类针对半胱氨酸蛋白酶C1家族蛋白酶的透膜荧光小分子探针，其特征在于，具有式Ⅱ所示的结构：
式Ⅱ中，为5-羧基荧光素，用于示踪检测；为6-氨基己酸，作为连接部分1，用于隔开空间位阻；为侧链连接有(生物素)Biotin的赖氨酸，用于亲和富集作用；
为杂合型八聚精氨酸，作为透膜基团，引导探针分子进入细胞；为赖氨酸，作为连接部分2，用于隔开空间位阻，以及用于结合树脂，利于运用固相肽合成技术合成探针；
为反应识别集团，能够识别半胱氨酸蛋白酶C1家族蛋白酶，并且共价结合到酶分子上。
3.根据权利要求1所述的一类针对半胱氨酸蛋白酶C1家族蛋白酶的透膜荧光小分子探针，其特征在于，所述R荧光基团为罗丹明或者5-羧基荧光素。
4.根据权利要求1所述的一类针对半胱氨酸蛋白酶C1家族蛋白酶的透膜荧光小分子探针的合成方法，包括以下步骤：
a)从连接部分2开始，采用N-[(9H-芴-9-甲氧基)羰基]-N'-[(2-丙烯氧基)羰基]-L-赖氨酸为起始物，将赖氨酸连接上固相肽合成树脂，运用芴甲氧羰酰基(Fmoc)固相合成法，在氨基端依次连接侧链为2,2,4,6,7-五甲基二氢苯并呋喃-5-磺酰基(Pbf)保护八个精氨酸，氨基己酸，连接罗丹明或者5-羧基荧光素；连接部分2为为赖氨酸；
b)去掉连接部分2的侧链保护基，运用芴甲氧羰酰基(Fmoc)固相合成法，依加上酪氨酸，异亮氨酸；
c)环氧化合物(Epoxide)反应基团的合成以及连接上探针，反应基团的Epoxide合成，从L(+)-酒石酸二乙酯开始合成环氧琥珀酰对硝基苯酯，将环氧琥珀酰对硝基苯酯连接到探针的骨架分子上。
5.权利要求2所述的一类针对半胱氨酸蛋白酶C1家族蛋白酶的透膜荧光小分子探针的合成方法，包括以下步骤：
a)从连接部分2开始，将赖氨酸连接上固相肽合成树脂，运用芴甲氧羰酰基(Fmoc)固相合成法，在氨基端依次连接侧链为2,2,4,6,7-五甲基二氢苯并呋喃-5-磺酰基(Pbf)保护八个精氨酸，氨基己酸，侧链联结有Biotin的赖氨酸，5-羧基荧光素；连接部分2为为赖氨酸；
b)去掉连接部分2的侧链保护基OALLYL，运用芴甲氧羰酰基(Fmoc)固相合成法，依次加上酪氨酸，异亮氨酸；
c)环氧化合物(Epoxide)反应基团的合成以及连接上探针，反应基团的Epoxide合成，从L(+)-酒石酸二乙酯开始合成环氧琥珀酰对硝基苯酯，将环氧基团连接到探针的骨架分子上。
6.权利要求4或5任意一项所述的一类针对半胱氨酸蛋白酶C1家族蛋白酶的透膜荧光小分子探针的纯化方法，包括以下步骤：
a)在权利要求4以及权利要求5所述的合成方法步骤完成之后，用三氟乙酸(TFA)：乙二硫醇(EDT)：三异丙基硅烷(TIS)：H2O＝95:2:1:2处理，去掉精氨酸的2,2,4,6,7-五甲基二氢苯并呋喃-5-磺酰基(Pbf)侧链保护，并且将探针从树脂上切下来；
b)反应体系中加入NMM，调PH至中性，用冰乙醚沉淀产物，将产物再用冰乙醚洗涤两次；
c)得到的粗产物用C18反相硅胶柱进行柱层析，洗脱液使用含0.01％醋酸的甲醇/水(H2O/MeOH)体系，通过质谱分析确定产物，收集产物组分后冷冻干燥，浓缩得到所需的产物晶体。
7.权利要求1或2任意一项所述的一类针对半胱氨酸蛋白酶C1家族蛋白酶的透膜荧光小分子探针的应用，其特征在于，所述一类针对半胱氨酸蛋白酶C1家族蛋白酶的透膜荧光小分子探针Ⅰ用于活细胞内的目标蛋白酶的标记和检测,能在活细胞中实现对溶酶体的特异性标记，可以作为一类新型的溶酶体特异性探针，具有广泛的商业应用前景,所述一类针对半胱氨酸蛋白酶C1家族蛋白酶的透膜荧光小分子探针Ⅱ能够用于对活细胞中半胱氨酸组织蛋白酶的标记、纯化和蛋白质组学分析。
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