CN116199748A - 多肽荧光探针及其在检测活细胞内聚集蛋白中的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种多肽荧光探针及其在检测活细胞内聚集蛋白中的应用，该荧光探针的结构式由5部分组成：QB荧光小分子、穿膜肽(RRRRRR)、线粒体毒性肽(KLAKLAKKLAKLAK)、CB酶切位点(GFLG)以及叠氮肽。本发明制备的多肽荧光探针可以用于活细胞内聚集蛋白的检测，解决传统的荧光探针只能检测溶液的聚集蛋白现象，可以避免固定细胞的试验步骤。

Description

多肽荧光探针及其在检测活细胞内聚集蛋白中的应用
技术领域
本发明涉及分子探针应用技术领域，具体涉及一种多肽荧光探针及其在检测活细胞内聚集蛋白中的应用。
背景技术
蛋白质的结构对其功能至关重要，蛋白质的异常聚集行为可能导致许多神经退行性疾病，比如阿尔茨海默病、渐冻人症、帕金森病、亨廷顿症等。
蛋白质的聚集过程十分复杂，包括解折叠、错误折叠、形成可溶性的聚集蛋白体、不溶性聚集蛋白体等。目前，商业化聚集蛋白靶向探针(如ThT和刚果红等amyloid探针)，通常只能在胞外识别β折叠高度富集晚期淀粉样变聚集态蛋白质。而商业化的细胞内PROTEOSTATR试剂盒，无法穿透细胞膜，只能在固定后的死细胞内探测聚集态的蛋白质。科学家们较少实现在活细胞内观察研究聚集态蛋白的检测分析。因此，若能在活细胞内检测蛋白质的聚集行为将有助于加深对疾病发病机理的理解。
由于缺乏活细胞内检测蛋白质聚集的有效方案，人们对活细胞内蛋白质聚集行为的发生、发展和机制认识不全面，因此开发一种能够在活细胞内检测聚集蛋白行为的多肽荧光探针具有十分重要的意义。
发明内容
基于此，有必要提供多肽荧光探针及其在检测活细胞内聚集蛋白中的应用。
本发明采用如下技术方案：
本发明提供一种可用于活细胞内聚集蛋白检测的多肽荧光探针，其结构主要由QB有机荧光小分子、穿膜肽、线粒体毒性肽、CB酶切位点GFLG和叠氮肽反应连接而成，叠氮肽为线粒体复合体IV抑制部分。具体化学结构式如图1所示。
可用于活细胞内聚集蛋白检测的多肽荧光探针的制备方法，包括如下步骤：
S1，分别制备含纯多肽RKN的水溶液和含QB有机荧光小分子的溶液，混合，加入催化剂，搅拌反应时长不低于12h，得多肽荧光探针粗产物。
S2，对所述多肽荧光探针粗产物纯化，即得多肽荧光探针。
在其中一些实施例中，多肽RKN和QB有机荧光小分子的反应摩尔比为1：5。
在其中一些实施例中，催化剂选自PyBOP、PPTS和NMM的混合。
在其中一些实施例中，采用高效液相色谱对所述粗产物进行纯化，工艺条件为：采用色谱柱为Welchrom C18色谱柱，采用流动相A和流动相B的流动相以1mL/min流速进行梯度洗脱，所述流动相A为含0.1％ TFA的水溶液，所述流动相B为含0.1％ TFA的乙腈溶液。
本发明还提供上述多肽荧光探针在活细胞内聚集蛋白检测中的应用。
具体地，上述多肽荧光探针可以应用于pH 6.5～7.4环境下的活细胞内线粒体成像。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：
(1)多肽荧光探针的结构式由5部分组成：QB有机荧光小分子，用于图像示踪和响应聚集蛋白；穿膜肽(RRRRRR)，有助于将探针进入细胞膜，线粒体毒性肽(KLAKLAKKLAKLAK)可以形成a螺旋破环线粒体膜，造成线粒体损伤；CB酶切位点(GFLG)将多肽切割成两部分发挥作用；叠氮肽为线粒体复合体IV抑制剂，进而抑制线粒体的氧化呼吸链，被酶切后的这两种多肽分别作用于线粒体造成线粒体损伤。采用该多肽荧光探针可以实现活细胞线粒体内聚集蛋白的检测，解决传统的荧光探针只能检测溶液的聚集蛋白，避免固定细胞的过程。
(2)本发明用于活细胞线粒体内聚集蛋白的荧光探针的制备方法，工艺简单，成本低。
(3)本发明提供的多肽荧光探针表现出明显的分子转子发光现象，避免背景荧光的干扰，实现活细胞内聚集蛋白检测，在生物医学成像领域中有着巨大的应用前景。
附图说明
图1为用于检测活细胞线粒体内聚集蛋白的多肽荧光探针的化学结构图。
图2为图1中多肽荧光探针的合成路线图。
图3为图1中多肽荧光探针的质谱表征图。
图4为图1中多肽荧光探针检测聚集蛋白溶液中荧光强度变化的实验图。
图5为图1中多肽荧光探针染色由MG132诱导的乳腺癌MCF-7细胞的共聚焦显微照片图。
图6为图1中的多肽荧光探针染色由星孢菌素诱导的乳腺癌MCF-7细胞的共聚焦显微照片图。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步的详细说明，以使本领域的技术人员更加清楚地理解本发明。
在本发明实施例中，若无特殊说明，所有原料组分均为本领域技术人员熟知的市售产品；在本发明实施例中，若未具体指明，所用的技术手段均为本领域技术人员所熟知的常规手段。
实施例1
本实施例提供一种用于检测活细胞线粒体内聚集蛋白的多肽荧光探针，其化学结构如图1所示。
该多肽荧光探针的结构由以下5部分组成：
1)QB有机荧光小分子，用于图像示踪和响应聚集蛋白；
2)穿膜肽(RRRRRR)，有助于将探针进入细胞膜；
3)线粒体毒性肽(KLAKLAKKLAKLAK)，可以形成a螺旋破环线粒体膜，造成线粒体损伤；
4)CB酶切位点(GFLG)，将多肽切割成两部分发挥作用；
5)叠氮肽为线粒体复合体IV抑制剂，进而抑制线粒体的氧化呼吸链，被酶切后的这两种多肽分别作用于线粒体造成线粒体损伤。
该多肽荧光探针可以实现活细胞内聚集蛋白的检测，解决传统探针只能检测溶液的聚集蛋白行为，可以避免固定细胞的过程。
本实施例进一步多肽荧光探针的制备方法，合成路线参见图2，包括如下步骤：
S1，将纯多肽RKN(委托吉尔生化公司合成)用水溶解制备多肽RKN水溶液。
将QB有机荧光小分子(按照论文Hashoul,D,Yavin,et al.Single pointmutation detection in living cancer cells by far-red emitting PNA-FIT probes[J].Chemical communications,2016中的方法合成)用DMF溶解制备QB溶液。
混合多肽RKN水溶液和QB溶液，加入催化剂，进行酰胺反应，反应过程中伴随的搅拌时间不低于12h，得多肽荧光探针粗产物。
S2，将步骤S1制备的粗产物通过高效液相色谱纯化，得到多肽荧光探针。本部分采用的高效液相色谱柱为Welchrom C18色谱柱(5μm，250×4.6mm)，采用流动相A和流动相B的流动相以1mL/min流速进行梯度洗脱，流动相A为含0.1％ TFA的水溶液，流动相B为含0.1％TFA的乙腈溶液，洗脱程序如下：
时间(min) 流动相B的比例
0 20％
10 40％
20 90％
30 100％
具体的，在本实施例中，在100mL圆底烧瓶中加入RKN(348mg，0.12mmoL)，QB(200mg，0.58mmoL)、PyBOP(六氟磷酸苯并三唑-1-基-氧基三吡咯烷基磷，75mg，0.144μmoL)、PPTS(吡啶对甲苯磺酸盐，30mg，0.12μmoL)、NMM(N-甲基吗啡啉，48mg，0.48μmol)、N,N-二甲基甲酰胺(DMF)2mL，PBS缓冲液2mL，在氮气氛围保护下，室温搅拌反应24h，得到粗产物，经高效液相色谱纯化后冷冻干燥，得到产物多肽荧光探针(QRKN)20mg，产率5.18％。
制备获得的多肽荧光探针(QRKN)经高分辨质谱表征，证实了该探针的结构，其质谱表征如图3所示：
HRMS(ESI)m/z:[M+3H]3+，实测值：1104.69；[M+4H]4+，实测值：828.77；[M+5H]5+，实测值：663.22；[M+6H]6+，实测值：552.85。[M+7H]7+，实测值：474.02。
实施例2
本实施例提供利用多肽荧光探针(QRKN)检测不同条件下诱导BSA模型蛋白发生聚集后的荧光探究，具体步骤为：
采用DMSO溶解QRKN，制备含1mM QRKN的多肽荧光探针溶液(简称“QRKN母液”)。
采用水溶解BSA，制备含1M BSA的模型蛋白溶液(简称“BSA母液”)母液。
取10微升QRKN母液和50微升BSA母液，加940微升水，制成1mL终体积的混合溶液(含5μM QRKN和50mM BSA蛋白)，探究温度升高(298K，303K，308K，313K，318K，323K，328K，333K，338K，343K)对聚集蛋白检测时的荧光强度的影响。
测试不同温度下QRKN的荧光强度如图4中的A图，可以看出：从300K到350K之间的温度诱导聚集蛋白，随着温度的升高，荧光增强，表明聚集蛋白程度增大。
本实施例同时测试混合溶液在0-1800s时间内对聚集蛋白检测时的荧光强度的影响。
测试不同时间下QRKN的荧光强度，统计结果如图4中的B图，可以看出：从0s到1800s的时间诱导聚集蛋白测试结果表明，随着时间的延长，检测的荧光增强，表明聚集蛋白程度增大。
实施例3
本实施例提供利用多肽荧光探针(QRKN)检测活细胞内聚集蛋白的方法，包括如下步骤：
将乳腺癌MCF-7细胞(市售)在含10％胎牛血清和1％青霉素-链霉素的DMEM培养基中贴壁培养。
然后将乳腺癌MCF-7细胞以1×105密度传代到含有Dulbecco's Modified EagleMedium(DMEM)的玻璃底细胞培养皿中。24小时培养后，用PBS缓冲液(pH＝7.4)洗涤细胞两次。然后在玻璃底细胞培养皿中加入0.5μg/mL MG132药物，作用是通过干扰蛋白质的降解途径来诱导细胞内蛋白质聚集。并在37℃、5％二氧化碳培养箱中孵育1小时。然后加入5μM多肽荧光探针水溶液，置于培养箱中孵育4小时。待培养结束后，取出培养玻底皿，去除上清液，之后用PBS缓冲液轻轻洗涤细胞两次，并在光学成像前浸没在DMEM培养基中，并使培养玻底皿进行荧光共聚焦成像。
细胞荧光成像仪器所用为Zeiss LSM 880共聚焦显微镜，激发波长为543nm，成像测试结果如图5所示：采用实施例1制备的多肽荧光探针确实具有优异的细胞内聚集蛋白成像效果。
实施例4
本实施例提供活细胞内聚集蛋白的检测方法，其试验方法步骤与实施例3基本相同，区别仅在于：利用10μM星孢菌素(Staurosporine)药物替代0.5μg/mL MG132药物。
细胞荧光成像仪器所用为Zeiss LSM 880共聚焦显微镜，激发波长为543nm，成像测试结果如图6所示：可以看出，采用实施例1制备的多肽荧光探针确实具有优异的细胞内聚集蛋白成像效果。
由此可以看出，本发明多肽荧光探针应用于乳腺癌细胞的细胞内聚集蛋白成像，该荧光探针表现很好成像细胞内聚集蛋白体的性能，在由MG132和星孢菌素诱导的病变活细胞中均可检测聚集蛋白行为的发生。
在此有必要指出的是，以上实施例仅限于对本发明的技术方案做进一步的阐述和说明，并不是对本发明的技术方案的进一步的限制，本发明的方法仅为较佳的实施方案，并非用于限定本发明的保护范围。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种多肽荧光探针，其结构式为：
Figure FDA0004068577570000011
2.权利要求1所述多肽荧光探针的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
S1，分别制备含多肽RKN的水溶液和含QB有机荧光小分子的溶液，混合含多肽RKN的水溶液和含QB有机荧光小分子的溶液，加入催化剂，搅拌反应时长不低于12h，得多肽荧光探针粗产物；
S2，对所述多肽荧光探针粗产物纯化，即得多肽荧光探针。
3.根据权利要求2所述多肽荧光探针的制备方法，其特征在于，多肽RKN和QB有机荧光小分子的反应摩尔比为(1～1.5)：(5～6)。
4.根据权利要求2所述多肽荧光探针的制备方法，其特征在于，催化剂选自PyBOP、PPTS和NMM的混合。
5.根据权利要求2至4任一项所述多肽荧光探针的制备方法，其特征在于，采用高效液相色谱对所述粗产物进行纯化。
6.根据权利要求5所述多肽荧光探针的制备方法，其特征在于，采用高效液相色谱对所述粗产物进行纯化的工艺条件为：采用色谱柱为Welchrom C18色谱柱，采用流动相A和流动相B的流动相以1mL/min流速进行梯度洗脱，所述流动相A为含0.1％TFA的水溶液，所述流动相B为含0.1％TFA的乙腈溶液。
7.权利要求1所述多肽荧光探针在检测活细胞内聚集蛋白中的应用。
8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述多肽荧光探针可应用于pH6.5～7.4环境下的病变活细胞内聚集蛋白的荧光成像。
9.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述病变活细胞为癌细胞。
10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，所述病变活细胞为乳腺癌细胞。
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