CN113995849A - 荷载自噬抑制剂及化疗药物的凝胶因子前体、凝胶材料及制法和应用 - Google Patents

荷载自噬抑制剂及化疗药物的凝胶因子前体、凝胶材料及制法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种荷载自噬抑制剂及化疗药物的凝胶因子前体、凝胶材料及制法，通过固相有机合成反应合成荷载自噬抑制剂及化疗药物的凝胶因子前体，通过加入碱性磷酸酶和羧酸酯酶进行恒温孵育的方式控制成胶，能够直观地显示牛小肠来源的碱性磷酸酶和猪肝脏来源的羧酸酯酶的活性。本发明的荷载自噬抑制剂及化疗药物的超分子水凝胶纳米材料凝胶因子合成简单，成胶条件容易控制。由于凝胶因子前体荷载有小分子自噬抑制剂及化疗药物，小分子自噬抑制剂及化疗药物可从侧链缓慢释放，因此可以延长药物驻留时间及提高化疗的疗效。本发明填补了荷载小分子自噬抑制剂及化疗药物的超分子水凝胶材料及酶敏感凝胶因子前体及其制备方法方面的空白。

Description

荷载自噬抑制剂及化疗药物的凝胶因子前体、凝胶材料及制 法和应用
技术领域
本发明属于超分子水凝胶纳米材料，具体涉及荷载小分子自噬抑制剂及化疗药物的超分子水凝胶纳米材料及酶敏感凝胶因子前体及其制备方法。
背景技术
德国威利集团的《先进材料》杂志(Advanced Materials 2019,32,1805798)报道了一类基于酶促自组装(EISA)的新型抗肿瘤药物。一方面，这类药物通过共价键将药物分子偶联到短肽前体分子上，具有合成简单、结构明确可控，且于规模化生产等优点，同时利用多肽的固有属性可以改善所修饰药物的水溶性、生物相容性以及生物降解性。另一方面，该短肽-药物偶联分子可以利用肿瘤组织/细胞中过度表达的酶作为刺激响应源，诱导其选择性地在肿瘤细胞膜或细胞质内发生原位自组装以形成高度有序的纳米结构。通过EISA过程，可以实现药物分子在肿瘤区域的选择性富集以达到理想的药物浓度，同时增加药物在肿瘤部位的停留时间；而设计可被细胞内高表达物质作用发生响应性断裂的化学键来偶联化疗药物，可以实现药物分子的智能缓释。此外，自组装形成的纳米结构/水凝胶有可能通过与肿瘤细胞内组分发生相互作用，进一步抑制其活性，但未见进一步对荷载小分子自噬抑制剂及化疗药物的凝胶因子前体及其成胶方式和相应凝胶性质的研究。
发明内容
发明目的：本发明的目的在于提供一种采用荷载羟基氯喹及喜树碱的凝胶因子前体；本发明的第二目的在于提供上述凝胶因子前体的制备方法；本发明的第三目的在于提供一种通过碱性磷酸酶和羧酸酯酶作用形成的凝胶材料；本发明的第四目的在于提供上述凝胶材料的制备方法；本发明的第五目的在于提供上述凝胶材料的应用。
技术方案：本发明的一种荷载自噬抑制剂及化疗药物的凝胶因子前体，结构如下所示：
Figure BDA0003331825840000021
本发明进一步保护上述凝胶因子前体的制备方法，包括以下步骤：
(1)将喜树碱、丁二酸酐和二甲氨基吡啶溶于吡啶溶液中，在氩气保护下室温搅拌反应过夜，然后除去吡啶并加入去离子水，通过冷冻干燥及高效液相色谱纯化后，得到喜树碱丁二酸，记为P1；
(2)取羟基氯喹硫酸盐溶解到去离子水中，再加入氨水，室温搅拌反应并通过二氯甲烷萃取，得羟基氯喹，记为P2；
(3)取P2、丁二酸酐和二甲氨基吡啶溶于吡啶溶液中，在氩气保护下室温搅拌反应过夜，然后除去吡啶并加入去离子水，通过冷冻干燥及高效液相色谱纯化后，得到氯喹丁二酸，记为P3；
(4)取P3、二环己基碳二亚胺混合溶解于N,N-二甲基甲酰胺中，加入N-羟基琥珀酰亚胺，在氩气保护下，室温磁力搅拌反应过夜，通过冷冻干燥及高效液相色谱纯化后，得氯喹丁二酸N-羟基琥珀酰亚胺活性酯，记为P4；
(5)将2-氯三苯甲基氯树脂在N,N-二甲基甲酰胺里溶胀后，加入N-芴甲氧羰基-O-磷酸基-L-酪氨酸，再加入N,N-二异丙基乙胺，反应后用甲醇封端反应，切去酪氨酸的保护基；加入活化的N-芴甲氧羰基-N'-叔丁氧羰基-L-赖氨酸反应，切去赖氨酸的保护基；加入活化的N-芴甲氧羰基-N'-1-(4,4-二甲基-2,6-二氧代环己亚基)乙基-L-赖氨酸反应，切去赖氨酸的保护基；加入活化的N-芴甲氧羰基-L-苯丙氨酸反应时，切去苯丙氨酸的保护基；加入活化的N-芴甲氧羰基-L-苯丙氨酸反应，切去苯丙氨酸的保护基；加入活化的1-萘乙酸反应，用水合肼切去赖氨酸侧链的1-(4,4-二甲基-2,6-二氧代环己亚基)乙基保护基；加入活化的P1反应，最后用三氟乙酸的二氯甲烷从树脂上切下合成的肽段，用乙醚使其沉淀析出，冷冻离心并倒掉上层乙醚，乙醚挥发后经过高效液相色谱分离提纯，得到萘乙酸修饰的荷载小分子化疗药物喜树碱的磷酸化多肽序列：萘乙酸-苯丙氨酸-苯丙氨酸-赖氨酸(喜树碱丁二酸)-赖氨酸-酪氨酸-O-磷酸基，记为P5；
(6)取P4溶解于N,N-二甲基甲酰胺中，再将P5和N,N-二异丙基乙胺加入上述溶液中，室温磁力搅拌反应过夜，反应液经过高效液相色谱分离提纯，收集在紫外波长320纳米处有特征吸收的组分，即为凝胶因子前体。
进一步的，步骤(5)中，所用的氨基酸都是以9-芴甲氧羰基作为α-氨基保护基；所用的赖氨酸侧链氨基由1-(4,4-二甲基-2,6-二氧代环己亚基)及叔丁基羰基修饰；所用的酪氨酸的侧链酚羟基由磷酸基修饰；活化氨基酸的试剂是与氨基酸等摩尔量的1-羟基苯并三唑和苯并三氮唑-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸盐；切除9-芴甲氧羰基的试剂是体积分数为20％的哌啶。
进一步的，所述步骤(5)中，2-氯三苯甲基氯树脂、N-芴甲氧羰基-O-磷酸基-L-酪氨酸、N-芴甲氧羰基-N'-叔丁氧羰基-L-赖氨酸、N-芴甲氧羰基-N'-1-(4,4-二甲基-2,6-二氧代环己亚基)乙基-L-赖氨酸、N-芴甲氧羰基-L-苯丙氨酸、N-芴甲氧羰基-L-苯丙氨酸、1-萘乙酸、P1的摩尔比为1：2：1.6：1.6：1.6：1.6：1.6：1.6。
进一步的，所述步骤(1)中，喜树碱、丁二酸酐和二甲氨基吡啶的摩尔比为2.55：7.65：0.255。
进一步的，所述步骤(6)中，P4、P5和N,N-二异丙基乙胺的摩尔比为0.12：0.12：0.24。
进一步的，所述步骤(2)中，每200微升的氨水中添加2.3毫摩尔的羟基氯喹硫酸盐：所述步骤(3)中，P2、丁二酸酐和二甲氨基吡啶的摩尔比为2.55：7.65：0.255；所述步骤(4)中，P3、二环己基碳二亚胺和N-羟基琥珀酰亚胺的摩尔比为0.1：0.15：0.15。
本发明还保护一种荷载自噬抑制剂及化疗药物的凝胶材料，由所述的凝胶因子前体制备得到。
本发明还保护一种荷载自噬抑制剂及化疗药物的凝胶材料的制备方法，将凝胶因子前体溶于磷酸盐缓冲液中，直至完全溶解形成无色透明溶液，再加入牛小肠来源的碱性磷酸酶和猪肝脏来源的羧酸酯酶，振荡溶液使之混合均匀，在37摄氏度孵育直至形成超分子水凝胶纳米材料。
本发明还保护所述的凝胶材料作为自噬抑制剂及化疗小分子药物联用的缓释材料的应用。
本发明的凝胶因子前体是通过固相有机合成反应合成荷载自噬抑制剂及化疗药物的凝胶因子前体，具体制备原理为：
先制备喜树碱丁二酸(P1)，作为自噬抑制剂，得到的结构如下：
Figure BDA0003331825840000041
再合成一段荷载小分子化疗药物喜树碱的多肽序列(P5)，多肽骨架上赖氨酸侧链的氨基与喜树碱丁二酸(P1)的羧基发生酰胺化缩合反应，经过高效液相色谱分离提纯，即得到P5，得到的结构如下：
Figure BDA0003331825840000042
接着依次制备羟基氯喹(P2)和氯喹丁二酸(P3)，并得到氯喹丁二酸N-羟基琥珀酰亚胺活性酯(P4)，作为化疗小分子药物；其中羟基氯喹(P2)的羟基与丁二酸酐的羧基发生亲核取代反应，经过高效液相色谱分离提纯，即得到氯喹丁二酸(P3)，氯喹丁二酸(P3)的氨基与N-羟基琥珀酰亚胺发生NHS酯化反应，即得到氯喹丁二酸N-羟基琥珀酰亚胺活性酯(P4)，各自得到的结构如下：
Figure BDA0003331825840000043
Figure BDA0003331825840000051
最后将P4和P5混合合成荷载喜树碱和羟基氯喹小分子药物的凝胶因子前体，P4的NHS与P5的氨基发生酰胺反应，由于凝胶因子前体含有通过酯键与肽链底物相连接的自噬抑制剂和化疗小分子药物，其可以在酯酶的作用下被缓慢剪切，从而可以达到在酯酶高表达的病理部位缓释小分子药物的效果。
该凝胶因子前体也是荷载自噬抑制剂和化疗小分子药物的可以被牛小肠来源的碱性磷酸酶及猪肝脏来源的羧酸酯酶特异性识别并剪切的化合物，因此可以作为制备凝胶材料的原料，通过加入碱性磷酸酶和羧酸酯酶进行恒温孵育的方式控制成胶，能够直观地显示牛小肠来源的碱性磷酸酶和猪肝脏来源的羧酸酯酶的活性。
有益效果：与现有技术相比，本发明的具有如下显著优点：(1)本发明基于串联酶控自组装的策略来设计合成一种肿瘤微环境响应型自组装前体超分子水凝胶材料，以实现自噬抑制剂和化疗小分子药物的精准递送和缓释，并通过药物分子的协同作用实现高效的自噬抑制和化疗联用，有望增强肿瘤的治疗效果，填补了双酶控制的药物缓释超分子水凝胶材料在自噬抑制和化疗联用方面的空白。(2)本发明的凝胶因子前体合成简单，成胶条件可控，可用于高效荷载自噬抑制剂和化疗小分子药物，有效地实现自噬抑制增强的化疗效果。由于凝胶因子前体荷载有小分子自噬抑制剂及化疗药物，小分子自噬抑制剂及化疗药物可从侧链缓慢释放，因此可以延长药物驻留时间及提高化疗的疗效。(3)本发明拟开发一种新型的基于串联酶促自组装的多肽-药物偶联物实体以改善偶联药物的水溶性和稳定性，增加血液循环时间，降低毒副作用，并实现药物在肿瘤细胞的特异性富集和智能缓释。
附图说明
图1为实施例1中合成的第一种纯化合物P1的质谱图；
图2为实施例1中合成的第二种纯化合物P2的质谱图；
图3为实施例1中合成的第三种纯化合物P3的质谱图；
图4为实施例1中合成的第四种纯化合物P4的质谱图；
图5为实施例2中合成的第五种纯化合物P5的质谱图；
图6为实施例2中合成的第六种纯化合物P6的质谱图；
图7为实施例2中合成的第六种纯化合物P6的核磁共振氢谱；
图8为实施例2中合成的第六种纯化合物P6的核磁共振碳谱；
图9为实施例2中第六种纯化合物P6形成的超分子水凝胶纳米材料的光学照片；
图10为实施例2中第六种纯化合物P6形成的超分子水凝胶纳米材料的透射电子显微镜表征结果；
图11为实施例3中第六种纯化合物P6形成的超分子水凝胶纳米材料的储能模量(G’)及损失模量(G”)的频率扫描图谱；
图12为实施例3中第六种纯化合物P6形成的超分子水凝胶纳米材料的储能模量(G’)及损失模量(G”)的应力扫描图谱；
图13为实施例4中第六种纯化合物P6在体外环境完成牛小肠来源的碱性磷酸酶及猪肝脏来源的羧酸酯酶的识别及剪切前后进行高效液相色谱分析的结果。
具体实施方式
下面结合附图和实施例对本发明的技术方案做进一步详细说明。
其中，实施例1中提供了第一，二，三，和四种纯化合物P1，P2，P3和P4的合成，实施例2中提供了第五和六种纯化合物P5和P6的合成，实施例3为超分子水凝胶材料力学性质检测实验，实施例4为在体外条件下牛小肠来源的碱性磷酸酶和猪肝脏来源的羧酸酯酶的活性检测实验。第六种纯化合物P6是荷载有自噬抑制剂和化疗小分子药物，是可以被牛小肠来源的碱性磷酸酶和猪肝脏来源的羧酸酯酶特异性识别并剪切的化合物。
实施例1
纯化合物P1，P2，P3和P4的合成
本实施例中第一种纯化合物P1(CPT-COOH)，第二种纯化合物P2(HCQ)，第三种纯化合物P3(HCQ-COOH)和第四种纯化合物P4(HCQ-COOH-NHS)的合成路线如下：
将2.55毫摩尔喜树碱溶于25毫升吡啶，加入含7.65毫摩尔丁二酸酐和0.255毫摩尔二甲氨基吡啶的10毫升吡啶溶液，在氩气保护下室温磁力搅拌反应过夜，用真空泵将吡啶去除后向残留物中加入10毫升去离子水，通过冷冻干燥及高效液相色谱纯化后，得喜树碱丁二酸(命名为P1)。
将2.3毫摩尔的羟基氯喹硫酸盐溶解到10毫升去离子水，向上述溶液中加入200微升的氨水，室温搅拌反应30分钟，通过二氯甲烷萃取，得羟基氯喹(命名为P2)；将2.55毫羟基氯喹溶于25毫升吡啶，加入含7.65毫摩尔丁二酸酐和0.255毫摩尔二甲氨基吡啶的10毫升吡啶溶液，在氩气保护下室温磁力搅拌反应过夜，用真空泵将吡啶去除后向残留物中加入10毫升去离子水，通过冷冻干燥及高效液相色谱纯化后，得氯喹丁二酸(命名为P3)；取0.1毫摩尔羟基氯喹丁二酸与0.15毫摩尔二环己基碳二亚胺混合溶解于1毫升N,N-二甲基甲酰胺中，加入0.15毫摩尔N-羟基琥珀酰亚胺，在氩气保护下，室温磁力搅拌反应过夜，通过冷冻干燥及高效液相色谱纯化后，得氯喹丁二酸N-羟基琥珀酰亚胺活性酯(命名为P4)；
采用赛默飞公司生产的Finnigan LCQ先进离子捕获质谱仪对纯化合物P1，P2，P3和P4进行电喷雾离子质谱数据采集得到如图1，图2，图3和图4所示的四个质谱图：
图1是本实施例中合成的第一种纯化合物P1的质谱图；图2为第二种纯化合物P2的质谱图；图3为第三种纯化合物P3的质谱图；图4为第四种纯化合物P4的质谱图。由图1可见，第一种纯化合物P1的质谱结果为obsvd.ESI-MS[(M+H+)]:m/z 449.1；由图2可见，第二种纯化合物P2的质谱结果为obsvd.ESI-MS[(M-H-)]:m/z 334.2；由图3可见，第三种纯化合物P3的质谱结果为obsvd.ESI-MS[(M+H+)]:m/z 436.2；由图4可见，第四种纯化合物P4的质谱结果为obsvd.ESI-MS[(M+H+)]:m/z 533.2。
实施例2
纯化合物P5和P6的合成
将1毫摩尔2-氯三苯甲基氯树脂在5毫升N,N-二甲基甲酰胺里溶胀30分钟后，加入2毫摩尔N-芴甲氧羰基-O-磷酸基-L-酪氨酸，再加入5毫摩尔N,N-二异丙基乙胺，反应1.5后，用500微升甲醇封端反应30分钟，切去酪氨酸的保护基，加入活化的1.6毫摩尔第二个氨基酸N-芴甲氧羰基-N'-叔丁氧羰基-L-赖氨酸反应1小时，切去赖氨酸的保护基，加入活化的1.6毫摩尔第三个氨基酸N-芴甲氧羰基-N'-1-(4,4-二甲基-2,6-二氧代环己亚基)乙基-L-赖氨酸反应1小时，切去赖氨酸的保护基，加入活化的1.6毫摩尔第四个氨基酸N-芴甲氧羰基-L-苯丙氨酸反应1小时，切去苯丙氨酸的保护基，加入活化的1.6毫摩尔第五个氨基酸N-芴甲氧羰基-L-苯丙氨酸反应1小时，切去苯丙氨酸的保护基，加入活化的1.6毫摩尔1-萘乙酸反应1小时，用2％水合肼切去赖氨酸侧链的1-(4,4-二甲基-2,6-二氧代环己亚基)乙基保护基，加入活化的1.6毫摩尔喜树碱丁二酸反应4小时，最后用体积浓度为95％的三氟乙酸的二氯甲烷从树脂上切下合成的肽段，用乙醚使其沉淀析出，4℃冷冻离心并倒掉上层乙醚，乙醚挥发后所得的黄色固体粉末即为萘乙酸修饰的荷载小分子化疗药物的磷酸化多肽序列：萘乙酸-苯丙氨酸-苯丙氨酸-赖氨酸(喜树碱丁二酸)-赖氨酸-酪氨酸-O-磷酸基，经过高效液相色谱分离提纯，收集在紫外波长320纳米处有特征吸收的主要组分，即为纯化合物P5；
最后合成荷载喜树碱和羟基氯喹小分子药物的凝胶因子前体，按：将0.12毫摩尔羟基氯喹丁二酸N-羟基琥珀酰亚胺活性酯(P4)溶解于4毫升N,N-二甲基甲酰胺中，再将0.12毫摩尔P5和0.24毫摩尔N,N-二异丙基乙胺加入上述溶液中并在室温磁力搅拌反应过夜，反应液经过高效液相色谱分离提纯，收集在紫外波长320纳米处有特征吸收的主要组分，即为纯化合物P6。
结构如下：
Figure BDA0003331825840000081
采用赛默飞公司生产的Finnigan LCQ先进离子捕获质谱仪对纯化合物P5和P6进行电喷雾离子质谱数据采集得到如图5和图6所示的两个质谱图：
图5是本实施例中合成的第五种纯化合物P5的质谱图；图6为第六种纯化合物P6的质谱图。由图5可见，第五种纯化合物P5的质谱结果为obsvd.ESI-MS[(M-H-)]:m/z 1408.5；由图6可见，第六种纯化合物P6的质谱结果为obsvd.ESI-MS[(M+H+)]:m/z 1827.7。
采用德国布鲁克公司(bruker)布鲁克核磁软件解析本实施例中合成的纯化合物得到如图7和图8所示的核磁共振谱图：
图7是本实施例中合成的第六种纯化合物P6的核磁共振氢谱图；图8为第六种纯化合物P6的核磁共振碳谱图。由图7可见，第六种纯化合物P6的核磁共振氢谱(d6-二甲亚砜，600MHz)：δ8.89(d,J＝7.8Hz,1H),8.71–8.52(m,3H),8.28–8.06(m,5H),7.93–7.43(m,12H),7.22–6.92(m,15H),5.49(s,3H),5.34–5.28(m,2H),4.59–4.06(m,9H),3.71–3.34(m,4H),3.16–2.94(m,10H),2.92–2.58(m,11H),2.37(ddd,J＝22.3,13.7,6.4Hz,4H),1.76–1.43(m,8H),1.35–1.05(m,16H),0.94–0.80(m,3H).由图8可见，第六种纯化合物P6的核磁共振碳谱(d6-二甲亚砜，151MHz)：δ174.49,172.95,172.95,172.75,171.88,171.88,171.71,171.23,171.01,167.74,162.79,158.91,157.01,157.01,155.26,150.59,150.59,148.29,145.22,143.59,138.77,138.27,133.36,133.36,133.36,133.36,133.36,133.36,130.59,130.59,130.59,130.59,130.59,130.59,129.69,129.69,129.69,129.69,129.69,129.69,128.46,128.38,128.38,127.90,127.90,127.90,127.90,127.90,127.90,127.69,127.69,127.69,127.69,127.69,120.25,119.54,119.54,116.60,115.90,114.68,99.21,99.21,76.51,67.52,66.65,58.47,55.38,55.38,54.32,54.32,52.60,50.67,49.65,49.65,42.52,42.52,39.10,38.00,36.47,36.47,36.47,32.34,31.24,31.24,30.76,30.76,29.33,23.13,23.13,22.04,22.04,22.04,19.90,19.90,8.81,8.02,8.02。
第六种纯化合物P6是荷载自噬抑制剂和化疗小分子药物的可以被牛小肠来源的碱性磷酸酶和猪肝脏来源的羧酸酯酶特异性识别并剪切的化合物；第六种纯化合物P6与牛小肠来源的碱性磷酸酶和猪肝脏来源的羧酸酯酶共孵育的方式调节成胶得到超分子水凝胶纳米材料。
本发明的酶敏感的超分子水凝胶纳米材料，按照如下配比进行调节成胶：将1毫克的纯化合物P6溶于100微升pH为7.4，浓度为200毫摩尔的磷酸盐缓冲液中，直至纯化合物P6完全溶解形成无色透明溶液，再加入50单位每毫升的牛小肠来源的碱性磷酸酶和猪肝脏来源的羧酸酯酶各100微升，振荡溶液使之混合均匀，在37摄氏度孵育直至形成超分子水凝胶纳米材料。
采用上述方法制备得到的超分子水凝胶纳米材料，后续用透射电子显微镜进行微观形貌观察。
图9给出的对比光学照片中，b瓶为第六种纯化合物P6形成超分子水凝胶纳米材料后的光学照片，表现为凝胶，表明经过与牛小肠来源的碱性磷酸酶和猪肝脏来源的羧酸酯酶的共孵育，确实得到了荷载自噬抑制剂和化疗小分子药物的凝胶材料；图10给出的为第六种纯化合物P6形成的超分子水凝胶纳米材料的透射电子显微镜表征结果，表明所得到的超分子水凝胶材料由纳米纤维组成。
实施例3
超分子水凝胶材料力学性质检测实验
图11为实施例2中第六种纯化合物P6形成的超分子水凝胶纳米材料的储能模量(G’)及损失模量(G”)的动态频率扫描图谱。图12为实施例2中第六种纯化合物P6形成的超分子水凝胶纳米材料的储能模量(G’)及损失模量(G”)的应力扫描图谱。由图11中储能模量随频率变化的方块曲线c和损失模量随频率变化的圆点曲线d可以看出，采用本发明方法制备的超分子水凝胶纳米材料在频率扫描范围为0.1赫兹到10赫兹时，储能模量(G’)的数值始终大于损失模量(G”)，表明所得材料为超分子水凝胶材料。由图12中储能模量随应力变化的方块曲线e和损失模量随应力变化的圆点曲线f可以看出，采用本发明方法制备的超分子水凝胶纳米材料在所受应力从0.1％增加到10％时，储能模量(G’)的数值始终大于损失模量(G”)，表明所得材料为超分子水凝胶材料。
实施例4
牛小肠来源的碱性磷酸酶及猪肝脏来源的羧酸酯酶的活性检测实验
本实施例活性检测实验中采用浓度为10毫摩尔每升的第六种纯化合物P6，在含有浓度为200毫摩尔的磷酸盐缓冲液中，加入10微升1000个单位每毫升的牛小肠来源的碱性磷酸酶及10微升1000个单位每毫升猪肝脏来源的羧酸酯酶，37摄氏度下孵育4小时完成酶的识别及剪切。
图13是对本发明方法制备的第六种纯化合物P6在体外环境完成牛小肠来源的碱性磷酸酶及猪肝脏来源的羧酸酯酶的识别及剪切前后进行高效液相色谱跟踪检测的表征结果，曲线g为第六种纯化合物P6不与牛小肠来源的碱性磷酸酶及猪肝脏来源的羧酸酯酶一起孵育，所得到的色谱分析结果，其色谱峰g1即表示第六种纯化合物P6；色谱峰l1即表示化疗小分子药物喜树碱(CPT)；色谱峰m1即表示第二种纯化合物P2；曲线h为第六种纯化合物P6与牛小肠来源的碱性磷酸酶一起孵育4小时，得到的色谱分析结果，其中色谱峰h1与曲线g的色谱峰g1有相同的保留时间，即表示第六种纯化合物P6经过酶识别剪切4小时后仅有很少一部分残留，而新出现的色谱峰h2具有更长的保留时间，并且色谱峰h2与曲线j的色谱峰j1有相同的保留时间，证明其确为第六种纯化合物P6被酶识别剪切后得到的凝胶因子，表明第六种纯化合物P6在体外环境中可以被牛小肠来源的碱性磷酸酶识别并剪切；曲线i为第六种纯化合物P6与牛小肠来源的碱性磷酸酶及猪肝脏来源的羧酸酯酶一起孵育4小时，得到的色谱分析结果，其中色谱峰i1与曲线m的色谱峰m1有相同的保留时间，色谱峰i2与曲线l的色谱峰l1有相同的保留时间，即表示第六种纯化合物P6经过牛小肠来源的碱性磷酸酶和猪肝脏来源的羧酸酯酶识别剪切，实现自噬抑制剂和羧酸酯酶的释放。
通过上述实施例及其检测实验的结果可知：本发明的荷载自噬抑制剂和化疗小分子药物的凝胶因子前体通过简单的有机合成得到，制备容易，可以通过加入碱性磷酸酶和羧酸酯酶进行恒温孵育的方式控制成胶，从而直观地反映碱性磷酸酶及羧酸酯酶的活性情况，同时由于凝胶因子前体通过酯键荷载有自噬抑制剂及化疗小分子药物，该小分子药物可以经过酯键的水解缓慢释放而发挥疗效。综上，利用本发明的荷载自噬抑制剂及化疗小分子药物的超分子水凝胶纳米材料，实现能通过串联酶控自组装向肿瘤细胞高特异性、高选择性地同时递送自噬抑制剂及化疗小分子药物，从而实现高效的自噬抑制和化疗联用，提高肿瘤的治疗效果。本发明填补了双酶控制的药物缓释超分子水凝胶材料在自噬抑制和化疗联用方面的空白，并实现在体外条件下检测牛小肠来源的碱性磷酸酶及猪肝脏来源的羧酸酯酶的活性。

Claims (10)

1.一种荷载自噬抑制剂及化疗药物的凝胶因子前体，其特征在于，结构如下所示：
Figure FDA0003331825830000011
2.权利要求1所述的凝胶因子前体的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)将喜树碱、丁二酸酐和二甲氨基吡啶溶于吡啶溶液中，在氩气保护下室温搅拌反应过夜，然后除去吡啶并加入去离子水，通过冷冻干燥及高效液相色谱纯化后，得到喜树碱丁二酸，记为P1；
(2)取羟基氯喹硫酸盐溶解到去离子水中，再加入氨水，室温搅拌反应并通过二氯甲烷萃取，得羟基氯喹，记为P2；
(3)取P2、丁二酸酐和二甲氨基吡啶溶于吡啶溶液中，在氩气保护下室温搅拌反应过夜，然后除去吡啶并加入去离子水，通过冷冻干燥及高效液相色谱纯化后，得到氯喹丁二酸，记为P3；
(4)取P3、二环己基碳二亚胺混合溶解于N,N-二甲基甲酰胺中，加入N-羟基琥珀酰亚胺，在氩气保护下，室温磁力搅拌反应过夜，通过冷冻干燥及高效液相色谱纯化后，得氯喹丁二酸N-羟基琥珀酰亚胺活性酯，记为P4；
(5)将2-氯三苯甲基氯树脂在N,N-二甲基甲酰胺里溶胀后，加入N-芴甲氧羰基-O-磷酸基-L-酪氨酸，再加入N,N-二异丙基乙胺，反应后用甲醇封端反应，切去酪氨酸的保护基；加入活化的N-芴甲氧羰基-N'-叔丁氧羰基-L-赖氨酸反应，切去赖氨酸的保护基；加入活化的N-芴甲氧羰基-N'-1-(4,4-二甲基-2,6-二氧代环己亚基)乙基-L-赖氨酸反应，切去赖氨酸的保护基；加入活化的N-芴甲氧羰基-L-苯丙氨酸反应时，切去苯丙氨酸的保护基；加入活化的N-芴甲氧羰基-L-苯丙氨酸反应，切去苯丙氨酸的保护基；加入活化的1-萘乙酸反应，用水合肼切去赖氨酸侧链的1-(4,4-二甲基-2,6-二氧代环己亚基)乙基保护基；加入活化的P1反应，最后用三氟乙酸的二氯甲烷从树脂上切下合成的肽段，用乙醚使其沉淀析出，冷冻离心并倒掉上层乙醚，乙醚挥发后经过高效液相色谱分离提纯，得到萘乙酸修饰的荷载小分子化疗药物喜树碱的磷酸化多肽序列：萘乙酸-苯丙氨酸-苯丙氨酸-赖氨酸(喜树碱丁二酸)-赖氨酸-酪氨酸-O-磷酸基，记为P5；
(6)取P4溶解于N,N-二甲基甲酰胺中，再将P5和N,N-二异丙基乙胺加入上述溶液中，室温磁力搅拌反应过夜，反应液经过高效液相色谱分离提纯，收集在紫外波长320纳米处有特征吸收的组分，即为凝胶因子前体。
3.根据权利要求2所述的凝胶因子前体的制备方法，其特征在于：步骤(5)中，所用的氨基酸都是以9-芴甲氧羰基作为α-氨基保护基；所用的赖氨酸侧链氨基由1-(4,4-二甲基-2,6-二氧代环己亚基)及叔丁基羰基修饰；所用的酪氨酸的侧链酚羟基由磷酸基修饰；活化氨基酸的试剂是与氨基酸等摩尔量的1-羟基苯并三唑和苯并三氮唑-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸盐；切除9-芴甲氧羰基的试剂是体积分数为20％的哌啶。
4.根据权利要求2所述的凝胶因子前体的制备方法，其特征在于：所述步骤(5)中，2-氯三苯甲基氯树脂、N-芴甲氧羰基-O-磷酸基-L-酪氨酸、N-芴甲氧羰基-N'-叔丁氧羰基-L-赖氨酸、N-芴甲氧羰基-N'-1-(4,4-二甲基-2,6-二氧代环己亚基)乙基-L-赖氨酸、N-芴甲氧羰基-L-苯丙氨酸、N-芴甲氧羰基-L-苯丙氨酸、1-萘乙酸、P1的摩尔比为1：2：1.6：1.6：1.6：1.6：1.6：1.6。
5.根据权利要求2所述的凝胶因子前体的制备方法，其特征在于：所述步骤(1)中，喜树碱、丁二酸酐和二甲氨基吡啶的摩尔比为2.55：7.65：0.255。
6.根据权利要求2所述的凝胶因子前体的制备方法，其特征在于：所述步骤(6)中，P4、P5和N,N-二异丙基乙胺的摩尔比为0.12：0.12：0.24。
7.根据权利要求2所述的凝胶因子前体的制备方法，其特征在于：所述步骤(2)中，每200微升的氨水中添加2.3毫摩尔的羟基氯喹硫酸盐：所述步骤(3)中，P2、丁二酸酐和二甲氨基吡啶的摩尔比为2.55：7.65：0.255；所述步骤(4)中，P3、二环己基碳二亚胺和N-羟基琥珀酰亚胺的摩尔比为0.1：0.15：0.15。
8.一种荷载自噬抑制剂及化疗药物的凝胶材料，其特征在于：由权利要求1所述的凝胶因子前体制备得到。
9.权利要求8所述的荷载自噬抑制剂及化疗药物的凝胶材料的制备方法，其特征在于：将凝胶因子前体溶于磷酸盐缓冲液中，直至完全溶解形成无色透明溶液，再加入牛小肠来源的碱性磷酸酶和猪肝脏来源的羧酸酯酶，振荡溶液使之混合均匀，在37摄氏度孵育直至形成超分子水凝胶纳米材料。
10.权利要求8所述的凝胶材料作为自噬抑制剂及化疗小分子药物联用的缓释材料的应用。
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