CN105624081A - 表达特定重组蛋白的功能化细菌磁颗粒及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种表达特定重组蛋白的功能化细菌磁颗粒，该细菌磁颗粒膜蛋白通过一段柔性多肽链融合表达特定重组蛋白；该特定重组蛋白为重组蛋白A改良的Z结构域二聚体或重组蛋白G的C结构域二聚体，并对它们的基因序列进行了特别修饰，使得制备的功能化细菌磁颗粒均显示优异的IgG结合能力。

Description

表达特定重组蛋白的功能化细菌磁颗粒及其制备方法
技术领域
本发明涉及分子生物学领域和纳米磁珠材料领域，具体是涉及表达特定重组蛋白的功能化细菌磁颗粒及其制备方法。
背景技术
细菌磁颗粒是趋磁细菌生产的一种磁性纳米颗粒，内核是Fe3O4晶体，外面有一层磷脂生物膜包被，粒径在30-120nm之间。同一种趋磁细菌生产的细菌磁颗粒粒径大小和晶体晶型基本一致，磁学性质均一，有天然生物膜包被，具有很好的水溶性质和胶体性质。此外，因为细菌磁颗粒是生物来源，因此具有较好的生物相容性。细菌磁颗粒膜上带有大量的氨基基团，可通过化学修饰和双功能偶联剂连接不同的功能大分子，如抗体，从而具有不同的特殊功能。细菌磁颗粒最独特的地方在于它可以通过基因工程的方法在细菌磁颗粒膜上表达特殊的蛋白质，功能性的靶蛋白可以在细菌磁颗粒上展示出来。
重组蛋白A(rProteinA)来源是金黄色葡萄球菌蛋白A(StaphylococcusProteinA，SPA)，SpA是葡球菌胞璧蛋白，具有独特的生物学活性，它能够与哺乳动物免疫球蛋白IgG的Fc段特异结合。天然的SPA具有5个同源结构域(A-E)能与IgG结合，但结合强度有差别，其中的B结构域和IgG的结合力较好。重组蛋白G(rProteinG)来源是链球菌蛋白G(StreptococcusProteinG，SPG)，SPG是A、C和G群链球菌的胞璧蛋白，能和人以及多种哺乳动物的IgG以及人血清白蛋白(HSA)结合。SPG同IgG的亲和力强，结合谱广，SPG分子中的C结构域负责同IgG的Fc段结合。
现有技术公开了利用偶联剂或交联剂分别将酶、抗体连接在细菌磁颗粒上，构建磁性复合物，用于固定化酶或检测病原菌等有害物质；这些方法的构建都是直接将细菌磁颗粒与上述物质偶联，而CN104278048公开了一种重组质粒，该质粒通过磁螺旋菌野生型菌株MSR-1的基因组DNA为模板，通过带有(GLy4Ser)3Linker的引物扩增得到生物素羧基载体蛋白基因。现有技术公开的linker的氨基酸序列短，细菌磁颗粒膜蛋白与不同的抗体或蛋白结合后，会产生两者的空间结构相互影响的技术问题。
并且重组蛋白A和重组蛋白G最普遍的应用是原核表达后偶联到凝胶树脂或者磁珠上用作免疫分析及纯化等用途。但现有技术中普遍存在着重组蛋白与磁珠或磁性颗粒结合形成的颗粒与IgG的结合特异性差，负载IgG的载量低等技术问题。
发明内容
为了解决上述技术问题，本发明提供一种新的表达特定重组蛋白的功能化细菌磁颗粒，该功能化细菌磁颗粒通过引入一个较长的多肽链，从而克服了两种不同蛋白的空间结构相互影响的技术问题，并且制备而成的功能化细菌磁颗粒与IgG的结合特异性强，负载IgG的载量高。
本发明具体技术方案如下：
本发明提供一种表达特定重组蛋白的功能化细菌磁颗粒，该功能化细菌磁颗粒的结构物质由特定重组蛋白通过多肽链与细菌磁颗粒膜蛋白融合表达而成；所述多肽链的氨基酸残基为(AlamGlySer)n(GlyaSer)b(GlySerAlam)n，m＝2-5，n＝2-5，a＝2-5，b＝3-7。
进一步的改进，所述细菌磁颗粒膜蛋白基因为mamC或mamF。
本发明提供的功能化细菌磁颗粒是由重组趋磁细菌合成，该重组趋磁细菌是通过如下方法构建而成的：
a)构建细菌磁颗粒膜蛋白基因缺失的趋磁细菌MSR-1突变株；
b)构建功能化细菌磁颗粒膜蛋白融合表达质粒；
c)将功能化细菌磁颗粒融合表达质粒通过接合转入到步骤a制得的趋磁细菌MSR-1突变株，构建重组趋磁细菌MSR-1。
进一步的改进，述多肽链的氨基酸残基为(AlamGlySer)n(GlyaSer)b(GlySerAlam)n，m＝3，n＝3，a＝2-5，b＝3-7。
进一步的改进，a＝3，b＝5，多肽链的序列(如SEQIDNo.1所示)为5-GCAGCCGCTGGAAGCGCAGCCGCTGGAAGCGCAGCCGCTGGAAGCGGAGGTGGAAGCGGAGGTGGAAGCGGAGGTGGAAGCGGAGGTGGAAGCGGAGGTGGAAGCGGAAGCGCAGCCGCTGGAAGCGCAGCCGCTGGAAGCGCAGCCGCT-3。
本发明通过提供的多肽链是一般柔性linker多肽长度的3倍；并且其两端增加了刚性的Ala残基，以此用于稳定两个不同蛋白的空间结构，并且克服了两个蛋白之间存在着相互影响的技术问题。
进一步的改进，特定重组蛋白为特定重组蛋白A，该特定重组蛋白A为在重组蛋白A的B结构域的氨基酸的基础上，将第29位Gly突变成Ala。
优选地，特定重组蛋白A的序列(如SEQIDNo.2所示)是：5-GCCGACAATAAATTCAACAAAGAACAACAAAATGCGTTCTATGAAATTTTACATTTACCTAATTTAACTGAAGAACAACGTAATGGCTTCATCCAAAGCCTTAAAGACGATCCTTCAGTGAGCAAAGAAATTTTAGCCGAAGCGAAAAAGCTAAACGATGCCCAAGCACCAAAAGGTTCAGGCGGAAGCGGCGGCGGAAGCGGAGGCTCAGGTAGCGCCGACAATAAATTCAACAAAGAACAACAAAATGCTTTCTATGAAATTTTACATTTACCTAATTTAACTGAAGAACAACGTAATGGCTTCATCCAAAGCCTTAAAGACGATCCTTCAGTGAGCAAAGAAATTTTAGCCGAAGCCAAAAAGCTAAATGATGCGCAAGCGCCAAAA-3。
将重组蛋白A的B结构域中第29位Gly突变成Ala可改良成Z结构域，可提高B结构域的耐受性，具有结合IgG恒定区Fc段的高特异性。并且改良的Z结构域的寡聚体与IgG的结合能力比重组蛋白A的B结构域或重组蛋白A要好。
进一步的改进，所述特定重组蛋白为特定重组蛋白G，所述特定重组蛋白G为重组蛋白G的C结构域二聚体。
优选地，特定重组蛋白G的序列(如SEQIDNo.3所示)是：5-ACTTACAAACTTGTCATTAATGGTAAAACATTGAAAGGCGAAACAACTACTAAAGCAGTCGACGCAGAAACTGCAGAAAAAGCCTTCAAACAATACGCTAACGACAACGGTGTCGATGGTGTGTGGACTTATGATGATGCGACTAAGACCTTTACGGTCACTGAAGGTTCAGGCGGAAGCGGCGGCGGAAGCGGAGGCTCAGGTAGCGGCACTTACAAACTTGTCATTAATGGTAAAACATTGAAAGGCGAAACAACTACTAAAGCAGTCGACGCAGAAACTGCAGAAAAAGCCTTCAAACAATACGCTAACGACAACGGTGTCGATGGTGTGTGGACTTATGATGATGCGACTAAGACCTTTACGGTCACTGAA-3。
本发明另一方面提供一种表达特定重组蛋白的功能化细菌磁颗粒的制备方法，该方法包括如下步骤：
a.构建细菌磁颗粒膜蛋白基因缺失的趋磁细菌MSR-1突变株；
b.构建功能化细菌磁颗粒膜蛋白融合表达质粒；
c.将功能化细菌磁颗粒融合表达质粒通过接合转入到步骤a制得的趋磁细菌MSR-1突变株中，构建趋磁细菌MSR-1重组株，培养，制备功能化细菌磁颗粒；
优选地，所述细菌磁颗粒膜蛋白基因为mamC或mamF。
进一步的改进，本发明还提供了细菌磁颗粒膜蛋白基因缺失的趋磁细菌MSR-1突变株的构建方法，具体步骤如下：
(a)扩增细菌磁颗粒膜蛋白基因左右两侧共两个长均为700-1000bp的同源片段；左右两同源片段均带有两个酶切位点；
(b)左右同源片段分别用相应的限制性内切酶进行双酶切；同时对自杀质粒pK18mobsacB进行双酶切；
(c)将经过双酶切后的左右同源片段和经过双酶切后的自杀质粒进行连接，连接产物转到E.coli感受态细胞中，挑选连接正确的阳性克隆菌；
(d)将阳性克隆菌作为供体与趋磁细菌MSR-1受体菌进行亲本接合，并导入pK18mobsacB重组质粒，通过卡那抗性筛选趋磁细菌MSR-1同源整合突变株，突变株再通过蔗糖梯度筛选趋磁细菌MSR-1双交换突变株，最后选择卡那抗性敏感的双交换菌株进行验证，构建成细菌磁颗粒膜蛋白基因缺失的趋磁细菌MSR-1突变株。
进一步的改进，本发明还提供了功能化细菌磁颗粒膜蛋白融合表达质粒的构建方法，具体步骤如下：
(1)扩增细菌磁颗粒膜蛋白基因跨膜结构域的DNA片段，所述DNA片段两端分别带有双酶切位点；对扩增产物DNA片段及pBBR质粒进行双酶切，回收双酶切的DNA片段及双酶切的pBBR质粒；将双酶切的DNA片段与双酶切的pBBR质粒进行连接，连接产物转化大肠杆菌感受态细胞中，筛选连接正确的阳性克隆，得到重组质粒pBBR-细菌磁颗粒膜蛋白基因；
(2)特定重组蛋白的编码序列克隆在pUC57载体上，并分别在其5’端合成编码表达多肽链(AlamGlySer)n(GlyaSer)b(GlySerAlam)n，m＝2-5，n＝2-5，a＝2-5，b＝3-7的基因序列，在合成基因序列两端分别加上双酶切位点，制得多肽链-特定重组蛋白质粒；
(3)对步骤(2)基因合成得到的多肽链-特定重组蛋白质粒进行扩增和双酶切；
(4)对步骤(1)得到的重组质粒pBBR-细菌磁颗粒膜蛋白基因进行双酶切并纯化，和步骤(3)得到的经过双酶切的多肽链-特定重组蛋白质粒的基因片段进行连接，连接产物转化大肠感觉感受态细胞中，筛选并验证连接正确的阳性克隆，最终得到功能化细菌磁颗粒膜蛋白融合表达质粒pBBR--细菌磁颗粒膜蛋白基因-多肽链-特定重组蛋白。
优选地，所述特定重组蛋白为特定重组蛋白A或特定重组蛋白G。
进一步的改进，本发明还提供了功能化细菌磁颗粒的制备方法为：
Ⅰ以功能化细菌磁颗粒膜蛋白融合表达质粒pBBR--细菌磁颗粒膜蛋白基因-多肽链-特定重组蛋白作为供体，通过亲本接合实验将其导入到细菌磁颗粒膜蛋白基因缺失的趋磁细菌MSR-1突变株，构建制备功能化细菌磁颗粒的趋磁细菌MSR-1重组株；
Ⅱ趋磁细菌MSR-1重组株经过转接、发酵培养，用磁装置确定细菌表达制备的功能化细菌磁颗粒，离心收集菌体并从中提取纯化制备功能化细菌磁颗粒。
细菌磁颗粒与化学合成磁珠相比最大的优势是它具有重组基因分子操作的特性，能够在细菌里直接表达功能化目的蛋白，并在细菌磁颗粒膜表面固定展示。这等于把原核重组表达和体外化学合成、修饰这些不同的过程完美地结合在一起，这也是基于基因工程的生产功能化细菌磁颗粒的好处所在。
本发明的一方面提供了表达特定重组蛋白功能化细菌磁颗粒，即通过特定重组基因分子操作的方法在趋磁细菌内生产表达特定重组蛋白的功能化细菌磁颗粒。该表达特定重组蛋白A和重组蛋白G的功能化细菌磁颗粒均显示优异的IgG结合能力。
具体实施方式
下面将对本发明的技术方案进行清楚、完整的描述，显然，所描述的实施例仅是本发明的一部分实施例，不能用来限制本发明的范围。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其它实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1表达特定重组蛋白A的功能化细菌磁颗粒
该功能化细菌磁颗粒的结构物质由特定重组蛋白A通过多肽链与细菌磁颗粒膜蛋白进行融合表达而成；该多肽链的氨基酸残基为(AlamGlySer)n(GlyaSer)b(GlySerAlam)n，m＝3，n＝3，a＝3，b＝5，序列为5-GCAGCCGCTGGAAGCGCAGCCGCTGGAAGCGCAGCCGCTGGAAGCGGAGGTGGAAGCGGAGGTGGAAGCGGAGGTGGAAGCGGAGGTGGAAGCGGAGGTGGAAGCGGAAGCGCAGCCGCTGGAAGCGCAGCCGCTGGAAGCGCAGCCGCT-3；
细菌磁颗粒膜蛋白基因mamC；
其中，特定重组蛋白A在重组蛋白A的B结构域的氨基酸的基础上，将第29位Gly突变成Ala，序列为5-GCCGACAATAAATTCAACAAAGAACAACAAAATGCGTTCTATGAAATTTTACATTTACCTAATTTAACTGAAGAACAACGTAATGGCTTCATCCAAAGCCTTAAAGACGATCCTTCAGTGAGCAAAGAAATTTTAGCCGAAGCGAAAAAGCTAAACGATGCCCAAGCACCAAAAGGTTCAGGCGGAAGCGGCGGCGGAAGCGGAGGCTCAGGTAGCGCCGACAATAAATTCAACAAAGAACAACAAAATGCTTTCTATGAAATTTTACATTTACCTAATTTAACTGAAGAACAACGTAATGGCTTCATCCAAAGCCTTAAAGACGATCCTTCAGTGAGCAAAGAAATTTTAGCCGAAGCCAAAAAGCTAAATGATGCGCAAGCGCCAAAA-3。
实施例2表达特定重组蛋白G的功能化细菌磁颗粒
该功能化细菌磁颗粒的结构物质由特定重组蛋白G通过多肽链与细菌磁颗粒膜蛋白进行融合表达而成；该多肽链的氨基酸残基为(AlamGlySer)n(GlyaSer)b(GlySerAlam)n，m＝3，n＝3，a＝3，b＝5，序列为5-GCAGCCGCTGGAAGCGCAGCCGCTGGAAGCGCAGCCGCTGGAAGCGGAGGTGGAAGCGGAGGTGGAAGCGGAGGTGGAAGCGGAGGTGGAAGCGGAGGTGGAAGCGGAAGCGCAGCCGCTGGAAGCGCAGCCGCTGGAAGCGCAGCCGCT-3；
细菌磁颗粒膜蛋白基因为mamF；
其中，特定重组蛋白G为重组蛋白G的C结构域二聚体，序列为：5-ACTTACAAACTTGTCATTAATGGTAAAACATTGAAAGGCGAAACAACTACTAAAGCAGTCGACGCAGAAACTGCAGAAAAAGCCTTCAAACAATACGCTAACGACAACGGTGTCGATGGTGTGTGGACTTATGATGATGCGACTAAGACCTTTACGGTCACTGAAGGTTCAGGCGGAAGCGGCGGCGGAAGCGGAGGCTCAGGTAGCGGCACTTACAAACTTGTCATTAATGGTAAAACATTGAAAGGCGAAACAACTACTAAAGCAGTCGACGCAGAAACTGCAGAAAAAGCCTTCAAACAATACGCTAACGACAACGGTGTCGATGGTGTGTGGACTTATGATGATGCGACTAAGACCTTTACGGTCACTGAA-3。
实施例3表达特定重组蛋白A的功能化细菌磁颗粒
该功能化细菌磁颗粒与实施例1或实施例2不同的是，该功能化细菌磁颗粒是由重组趋磁细菌合成，重组趋磁细菌是通过如下方法构建而成的：
a)构建细菌磁颗粒膜蛋白基因缺失的趋磁细菌MSR-1突变株；
b)构建功能化细菌磁颗粒膜蛋白融合表达质粒；
c)将功能化细菌磁颗粒融合表达质粒通过接合转入到步骤a制得的趋磁细菌MSR-1突变株，构建趋磁细菌MSR-1重组株。
实施例4表达特定重组蛋白A的功能化细菌磁颗粒
该功能化细菌磁颗粒与实施例1或实施例2不同的是，该功能化细菌磁颗粒是通过如下方法制备得到的：
a.构建mamC或mamF缺失的趋磁细菌MSR-1突变株；具体构建方法如下：
(a)扩增细菌磁颗粒膜蛋白基因左右两侧共两个长均为700-1000bp的同源片段；左右两同源片段均带有两个酶切位点；
(b)左右同源片段分别用相应的限制性内切酶进行双酶切；同时对自杀质粒pK18mobsacB进行双酶切；
(c)将经过双酶切后的左右同源片段和经过双酶切后的自杀质粒进行连接，连接产物转到E.coli感受态细胞中，挑选连接正确的阳性克隆菌；
(d)将阳性克隆菌作为供体与趋磁细菌MSR-1受体菌进行亲本接合，并导入pK18mobsacB重组质粒，通过卡那抗性筛选趋磁细菌MSR-1同源整合突变株，突变株再通过蔗糖梯度筛选趋磁细菌MSR-1双交换突变株，最后选择卡那抗性敏感的双交换菌株进行验证，构建成细菌磁颗粒膜蛋白基因缺失的趋磁细菌MSR-1突变株；
b.构建功能化细菌磁颗粒膜蛋白融合表达质粒；具体构建方法如下：
(1)扩增细菌磁颗粒膜蛋白基因跨膜结构域的DNA片段，所述DNA片段两端分别带有双酶切位点；对扩增产物DNA片段及pBBR质粒进行双酶切，回收双酶切的DNA片段及双酶切的pBBR质粒；将双酶切的DNA片段与双酶切的pBBR质粒进行连接，连接产物转化大肠杆菌感受态细胞中，筛选连接正确的阳性克隆，得到重组质粒pBBR-细菌磁颗粒膜蛋白基因；
(2)特定重组蛋白的编码序列克隆在pUC57载体上，并分别在其5’端合成编码表达多肽链(AlamGlySer)n(GlyaSer)b(GlySerAlam)n，m＝2-5，n＝2-5，a＝2-5，b＝3-7的基因序列，在合成基因序列两端分别加上双酶切位点，制得多肽链-特定重组蛋白质粒；
(3)对步骤(2)基因合成得到的多肽链-特定重组蛋白质粒进行扩增和双酶切；
(4)对步骤(1)得到的重组质粒pBBR-细菌磁颗粒膜蛋白基因进行双酶切并纯化，和步骤(3)得到的经过双酶切的多肽链-特定重组蛋白质粒的基因片段进行连接，连接产物转化大肠感觉感受态细胞中，筛选并验证连接正确的阳性克隆，最终得到功能化细菌磁颗粒膜蛋白融合表达质粒pBBR--细菌磁颗粒膜蛋白基因-多肽链-特定重组蛋白；特定重组蛋白为特定重组蛋白A或特定重组蛋白G；
c.将功能化细菌磁颗粒融合表达质粒通过接合转入到步骤a制得的趋磁细菌MSR-1突变株中，构建趋磁细菌MSR-1重组株，培养，制备功能化细菌磁颗粒；具体方法如下：
Ⅰ以功能化细菌磁颗粒膜蛋白融合表达质粒pBBR--细菌磁颗粒膜蛋白基因-多肽链-特定重组蛋白作为供体，通过亲本接合实验将其导入到细菌磁颗粒膜蛋白基因缺失的趋磁细菌MSR-1突变株，构建趋磁细菌MSR-1重组株；
Ⅱ趋磁细菌MSR-1重组株经过转接、发酵培养，用磁装置确定细菌表达制备的功能化细菌磁颗粒，离心收集菌体并从中提取纯化功能化细菌磁颗粒。优选地，所述细菌磁颗粒膜蛋白基因为mamC或mamF。
实施例5一种表达特定重组蛋白A的功能化细菌磁颗粒的制备方法
该方法包括如下步骤：
a.构建mamC或mamF缺失的趋磁细菌MSR-1突变株；
b.构建功能化细菌磁颗粒膜蛋白融合表达质粒；
c.将功能化细菌磁颗粒融合表达质粒通过接合转入到步骤a制得的趋磁细菌MSR-1突变株中，构建趋磁细菌MSR-1重组株，培养，制备功能化细菌磁颗粒。
实施例6一种表达特定重组蛋白A的功能化细菌磁颗粒的制备方法
该方法与实施例5不同的是，该方法还包括对mamC或mamF缺失的趋磁细菌MSR-1突变株的构建方法，具体步骤如下：
(a)扩增mamC或mamF左右两侧共两个长均为700-1000bp的同源片段；左右两同源片段均带有两个酶切位点；
(b)左右同源片段分别用相应的限制性内切酶进行双酶切；同时对自杀质粒进行双酶切；
(c)将经过双酶切后的左右同源片段和经过双酶切后的自杀质粒进行连接，连接产物转到E.coli感受态细胞中，挑选连接正确的阳性克隆菌；
(d)将阳性克隆菌作为供体与趋磁细菌MSR-1受体菌进行亲本接合，并导入pK18mobsacB重组质粒，通过卡那抗性筛选趋磁细菌MSR-1同源整合突变株，突变株再通过蔗糖梯度筛选趋磁细菌MSR-1双交换突变株，最后选择卡那抗性敏感的双交换菌株进行验证，构建成mamC或mamF缺失的趋磁细菌MSR-1突变株。
实施例7一种表达特定重组蛋白A的功能化细菌磁颗粒的制备方法
该方法与实施例6不同的是，mamC或mamF缺失的趋磁细菌MSR-1突变株的构建方法具体步骤如下：
(a)设计两对引物扩增mamC或mamF基因左右两侧共两个800bp左右的同源片段，左侧片段带EcoRI和KpnI酶切位点，右侧片段带有KpnI和XbaI酶切位点；
(b)两条PCR扩增产物左右同源片段分别用相应的限制性内切酶进行双酶切，同时用EcoRI/XbaI双酶切蔗糖敏感自杀质粒pK18mobsacB；
(c)将经过双酶切后的左右同源片段和经过双酶切后的自杀质粒pK18mobsacB按照3：3：1的摩尔比进行连接，连接产物转到E.coli感受态细胞中，验证挑选连接正确的阳性克隆菌；
(d)将阳性克隆菌作为供体与趋磁细菌MSR-1受体菌进行亲本接合实验，导入pK18mobsacB重组质粒，通过卡那抗性筛选MSR-1同源整合突变株，突变株再通过蔗糖梯度筛选MSR-1双交换突变株，最后选择卡那抗性敏感的双交换菌株进行验证，确认为mamC或mamF缺失的趋磁细菌MSR-1突变株。
实施例8一种表达特定重组蛋白A的功能化细菌磁颗粒的制备方法
该方法与实施例5不同的是，该方法还包括对功能化细菌磁颗粒膜蛋白融合表达质粒的构建方法，具体步骤如下：
(1)扩增mamC或mamF跨膜结构域的DNA片段，该DNA片段两端分别带有双酶切位点；对扩增产物DNA片段及pBBR质粒进行双酶切，回收双酶切的DNA片段及双酶切的pBBR质粒；将双酶切的DNA片段与双酶切的pBBR质粒进行连接，连接产物转化大肠杆菌感受态细胞中，筛选连接正确的阳性克隆，得到重组质粒pBBR-mamC或mamF；
(2)特定重组蛋白A或G(标记为rPA/rPG)的编码序列克隆在pUC57载体上，并分别在其5’端合成编码表达多肽链(AlamGlySer)n(GlyaSer)b(GlySerAlam)n，m＝2-5，n＝2-5，a＝2-5，b＝3-7的基因序列，在合成基因序列两端分别加上双酶切位点，制得多肽链-rPA/rPG质粒；
(3)对步骤(2)基因合成得到的多肽链-rPA/rPG质粒进行扩增和双酶切；
(4)对步骤(1)得到的重组质粒pBBR-mamC或mamF进行双酶切并纯化，和步骤(3)得到的经过双酶切的多肽链-rPA/rPG质粒的基因片段进行连接，连接产物转化大肠感觉感受态细胞中，筛选并验证连接正确的阳性克隆，最终得到功能化细菌磁颗粒膜蛋白融合表达质粒pBBR--mamC或mamF-多肽链-rPA/rPG。
实施例9一种表达特定重组蛋白A的功能化细菌磁颗粒的制备方法
该方法与实施例8不同的是，功能化细菌磁颗粒膜蛋白融合表达质粒的构建方法具体步骤如下：
(a)设计引物扩增mamC或mamF跨膜结构域的DNA片段，两端分别带有BamHI、XbaI酶切位点；对扩增产物DNA片段及pBBR质粒双酶切后，回收双酶切的DNA片段及双酶切的pBBR质粒，将双酶切的DNA片段与双酶切的pBBR质粒进行连接，连接产物转化大肠杆菌感受态细胞中，筛选连接正确的阳性克隆，得到重组质粒pBBR-mamC或mamF；
(2)特定重组蛋白A或G(标记为rPA/rPG)的编码序列通过人工基因合成的方法克隆在pUC57载体上，同样分别在其5’端合成编码表达多肽链(AlamGlySer)n(GlyaSer)b(GlySerAlam)n，m＝2-5，n＝2-5，a＝2-5，b＝3-7的基因序列，在合成基因两端分别加上XbaI和HindIII酶切位点，制得多肽链-rPA/rPG质粒；
(3)对步骤(2)基因合成得到的多肽链-rPA/rPG质粒进行扩增提取，用XbaI/HindIII双酶切；
(4)对步骤(1)得到的重组质粒pBBR-mamC或mamF进行XbaI/HindIII双酶切并纯化，和步骤(3)得到的经过双酶切的多肽链-rPA/rPG基因片段进行连接，连接产物转化大肠感觉感受态细胞中，筛选并验证连接正确的阳性克隆，最终得到功能化细菌磁颗粒膜蛋白融合表达质粒pBBR--mamC或mamF-多肽链-rPA/rPG。
实施例10一种表达特定重组蛋白A的功能化细菌磁颗粒的制备方法
该方法与实施例5不同的是，该方法中功能化细菌磁颗粒的制备方法具体步骤为：
Ⅰ以功能化细菌磁颗粒膜蛋白融合表达质粒pBBR--细菌磁颗粒膜蛋白基因-多肽链-特定重组蛋白作为供体，通过亲本接合实验将其导入到细菌磁颗粒膜蛋白基因缺失的趋磁细菌MSR-1突变株，构建重组趋磁细菌MSR-1制备；
Ⅱ趋磁细菌MSR-1重组株经过转接、发酵培养，用磁装置确定细菌表达制备的功能化细菌磁颗粒，离心收集菌体并从中提取纯化功能化细菌磁颗粒。
实施例11一种表达特定重组蛋白A的功能化细菌磁颗粒的制备方法
该方法与实施例10不同的是，该方法中功能化细菌磁颗粒的制备方法具体步骤为：
Ⅰ将功能化细菌磁颗粒膜蛋白融合表达质粒pBBR--mamC或mamF-多肽链-rPA/rPG作为供体，通过亲本接合实验把pBBR--mamC或mamF-多肽链-rPA/rPG融合表达质粒导入mamC或mamF缺失的趋磁细菌MSR-1突变株中得到重组趋磁细菌MSR-1；
Ⅱ趋磁细菌MSR-1重组株经过转接、发酵培养48小时，期间可以用磁装置确定重组趋磁细菌MSR-1表达生产的功能化细菌磁颗粒，离心并收集菌体；
Ⅲ菌体用磷酸盐缓冲液洗涤2-3次，加入裂解缓冲液重悬后进行超声波破碎，通过磁装置吸附功能化细菌磁颗粒，弃去上清；
Ⅳ功能化细菌磁颗粒粗液用磷酸盐缓冲液洗涤3-5次，期间用超声波及蛋白酶缓冲液进行梯度处理，最终得到纯化后的功能化细菌磁颗粒。
实施例12一种表达特定重组蛋白A的功能化细菌磁颗粒的制备方法
该方法与实施例11不同的是，步骤Ⅲ中的发酵培养条件为：起始pH值为5.8-6.2，培养温度为28-30℃，培养时间为1-3天，摇床转速为250-300转/分钟，培养过程中通入氧气，通入氧气的方式为：间隔10min，通入30min氧气，发酵培养基由重量份数为2-3份的谷氨酰胺、1-2份硫酸亚铁、1-3份麦芽糖醇、2-5份磷酯酰肌氨酸、0.5-1份泛酸钙、0.5-1份酪蛋白酸钠、0.2-0.5份磷酸二氢钾、0.5-1份月桂酸肌氨酸和1-2份胆甾醇组成。
试验例1实施例1生产的功能化细菌磁颗粒结合人IgG能力检测
分别取1mg功能化细菌磁颗粒与不同浓度(5mg/ml，1mg/ml，0.5mg/ml，0.1mg/ml，0.05mg/ml，0.01mg/ml)的人IgG溶液反应，在5分钟，10分钟，15分钟，30分钟每个时间点进行磁分离并取上清在紫外分光光度计上测量该时间点上清溶液中的IgG含量，检测后的上清样品继续加回试管中进行重悬孵育，在细菌磁颗粒过饱和结合IgG后结束实验，通过计算剩余IgG的含量推算功能化细菌磁颗粒结合IgG数量，根据一个重组蛋白A分子可以结合两分子IgG，计算功能化细菌磁颗粒上重组蛋白A的表达情况；同样的实验也选择了市售的重组蛋白A人工合成磁珠进行比较，结果显示两者结合特异性相似，功能化细菌磁颗粒结合时间稍快；但在结合IgG的载量方面，功能化细菌磁颗粒明显优于市售磁珠产品，同样1mg的磁性颗粒，功能化细菌磁颗粒结合能力是磁珠颗粒的3倍左右。通过电镜观察发现功能化细菌磁颗粒的晶型特征与普通细菌磁颗粒相同，结合IgG后功能化细菌磁颗粒大小明显增大，边缘不再清晰可辨，显示携带有IgG分子，整个颗粒的亲水能力变强。结论是该功能化细菌磁颗粒同等条件下比常规市售磁珠和磁性颗粒具有更强的性能。

Claims (10)

1.一种表达特定重组蛋白的功能化细菌磁颗粒，其特征在于，所述功能化细菌磁颗粒的结构物质由特定重组蛋白通过多肽链与细菌磁颗粒膜蛋白融合表达而成；所述多肽链的氨基酸残基为(AlamGlySer)n(GlyaSer)b(GlySerAlam)n，m＝2-5，n＝2-5，a＝2-5，b＝3-7。
2.如权利要求1所述的表达特定重组蛋白的功能化细菌磁颗粒，其特征在于，所述细菌磁颗粒膜蛋白基因为mamC或mamF；优选地，所述特定重组蛋白为特定重组蛋白A或特定重组蛋白G，所述特定重组蛋白A为在重组蛋白A的B结构域的氨基酸的基础上，将第29位Gly突变成Ala；所述特定重组蛋白G为重组蛋白G的C结构域二聚体。
3.如权利要求1所述的表达特定重组蛋白的功能化细菌磁颗粒，其特征在于，所述功能化细菌磁颗粒是由重组趋磁细菌合成，所述重组趋磁细菌是通过如下方法构建而成的：
a)构建细菌磁颗粒膜蛋白基因缺失的趋磁细菌MSR-1突变株；
b)构建功能化细菌磁颗粒膜蛋白融合表达质粒；
c)将功能化细菌磁颗粒融合表达质粒通过接合转入到步骤a制得的趋磁细菌MSR-1突变株，构建重组趋磁细菌MSR-1。
4.如权利要求1所述的表达特定重组蛋白的功能化细菌磁颗粒，其特征在于，所述多肽链的氨基酸残基为(AlamGlySer)n(GlyaSer)b(GlySerAlam)n，m＝3，n＝3，a＝2-5，b＝3-7；优选地，m＝3，n＝3，a＝3，b＝5，多肽链的序列为5-GCAGCCGCTGGAAGCGCAGCCGCTGGAAGCGCAGCCGCTGGAAGCGGAGGTGGAAGCGGAGGTGGAAGCGGAGGTGGAAGCGGAGGTGGAAGCGGAGGTGGAAGCGGAAGCGCAGCCGCTGGAAGCGCAGCCGCTGGAAGCGCAGCCGCT-3。
5.如权利要求2所述的表达特定重组蛋白的功能化细菌磁颗粒，其特征在于，所述特定重组蛋白A的序列是：5-GCCGACAATAAATTCAACAAAGAACAACAAAATGCGTTCTATGAAATTTTACATTTACCTAATTTAACTGAAGAACAACGTAATGGCTTCATCCAAAGCCTTAAAGACGATCCTTCAGTGAGCAAAGAAATTTTAGCCGAAGCGAAAAAGCTAAACGATGCCCAAGCACCAAAAGGTTCAGGCGGAAGCGGCGGCGGAAGCGGAGGCTCAGGTAGCGCCGACAATAAATTCAACAAAGAACAACAAAATGCTTTCTATGAAATTTTACATTTACCTAATTTAACTGAAGAACAACGTAATGGCTTCATCCAAAGCCTTAAAGACGATCCTTCAGTGAGCAAAGAAATTTTAGCCGAAGCCAAAAAGCTAAATGATGCGCAAGCGCCAAAA-3。
6.如权利要求2所述的表达特定重组蛋白的功能化细菌磁颗粒，其特征在于，所述特定重组蛋白G的序列是：5-ACTTACAAACTTGTCATTAATGGTAAAACATTGAAAGGCGAAACAACTACTAAAGCAGTCGACGCAGAAACTGCAGAAAAAGCCTTCAAACAATACGCTAACGACAACGGTGTCGATGGTGTGTGGACTTATGATGATGCGACTAAGACCTTTACGGTCACTGAAGGTTCAGGCGGAAGCGGCGGCGGAAGCGGAGGCTCAGGTAGCGGCACTTACAAACTTGTCATTAATGGTAAAACATTGAAAGGCGAAACAACTACTAAAGCAGTCGACGCAGAAACTGCAGAAAAAGCCTTCAAACAATACGCTAACGACAACGGTGTCGATGGTGTGTGGACTTATGATGATGCGACTAAGACCTTTACGGTCACTGAA-3。
7.一种表达特定重组蛋白的功能化细菌磁颗粒的制备方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：
a.构建细菌磁颗粒膜蛋白基因缺失的趋磁细菌MSR-1突变株；
b.构建功能化细菌磁颗粒膜蛋白融合表达质粒；
c.将功能化细菌磁颗粒融合表达质粒通过接合转入到步骤a制得的趋磁细菌MSR-1突变株中，构建趋磁细菌MSR-1重组株，培养，制备功能化细菌磁颗粒；
优选地，所述细菌磁颗粒膜蛋白基因为mamC或mamF。
8.如权利要求7所述的表达特定重组蛋白的功能化细菌磁颗粒的制备方法，其特征在于，步骤a所述细菌磁颗粒膜蛋白基因缺失的趋磁细菌MSR-1突变株的构建方法如下：
(a)扩增细菌磁颗粒膜蛋白基因左右两侧共两个长均为700-1000bp的同源片段；左右两同源片段均带有两个酶切位点；
(b)左右同源片段分别用相应的限制性内切酶进行双酶切；同时对自杀质粒pK18mobsacB进行双酶切；
(c)将经过双酶切后的左右同源片段和经过双酶切后的自杀质粒进行连接，连接产物转到E.coli感受态细胞中，挑选连接正确的阳性克隆菌；
(d)将阳性克隆菌作为供体与趋磁细菌MSR-1受体菌进行亲本接合，并导入pK18mobsacB重组质粒，通过卡那抗性筛选趋磁细菌MSR-1同源整合突变株，突变株再通过蔗糖梯度筛选趋磁细菌MSR-1双交换突变株，最后选择卡那抗性敏感的双交换菌株进行验证，构建成细菌磁颗粒膜蛋白基因缺失的趋磁细菌MSR-1突变株。
9.如权利要求8所述的表达特定重组蛋白的功能化细菌磁颗粒的制备方法，其特征在于，步骤b所述功能化细菌磁颗粒膜蛋白融合表达质粒的构建方法如下：
(1)扩增细菌磁颗粒膜蛋白基因跨膜结构域的DNA片段，所述DNA片段两端分别带有双酶切位点；对扩增产物DNA片段及pBBR质粒进行双酶切，回收双酶切的DNA片段及双酶切的pBBR质粒；将双酶切的DNA片段与双酶切的pBBR质粒进行连接，连接产物转化大肠杆菌感受态细胞中，筛选连接正确的阳性克隆，得到重组质粒pBBR-细菌磁颗粒膜蛋白基因；
(2)特定重组蛋白的编码序列克隆在pUC57载体上，并分别在其5’端合成编码表达多肽链(AlamGlySer)n(GlyaSer)b(GlySerAlam)n，m＝2-5，n＝2-5，a＝2-5，b＝3-7的基因序列，在合成基因序列两端分别加上双酶切位点，制得多肽链-特定重组蛋白质粒；
(3)对步骤(2)基因合成得到的多肽链-特定重组蛋白质粒进行扩增和双酶切；
(4)对步骤(1)得到的重组质粒pBBR-细菌磁颗粒膜蛋白基因进行双酶切并纯化，和步骤(3)得到的经过双酶切的多肽链-特定重组蛋白质粒的基因片段进行连接，连接产物转化大肠感觉感受态细胞中，筛选并验证连接正确的阳性克隆，最终得到功能化细菌磁颗粒膜蛋白融合表达质粒pBBR--细菌磁颗粒膜蛋白基因-多肽链-特定重组蛋白；所述特定重组蛋白为特定重组蛋白A或特定重组蛋白G。
10.如权利要求9所述的表达特定重组蛋白的功能化细菌磁颗粒的构建方法，其特征在于，步骤c所述功能化细菌磁颗粒的制备方法为：
Ⅰ以功能化细菌磁颗粒膜蛋白融合表达质粒pBBR--细菌磁颗粒膜蛋白基因-多肽链-特定重组蛋白作为供体，通过亲本接合实验将其导入到细菌磁颗粒膜蛋白基因缺失的趋磁细菌MSR-1突变株，构建生产功能化细菌磁颗粒的趋磁细菌MSR-1重组株；
Ⅱ趋磁细菌MSR-1重组株经过转接、发酵培养，用磁装置确定细菌表达制备功能化细菌磁颗粒，离心收集菌体并从中提取纯化目标功能化细菌磁颗粒。
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