CN105572396B - 表达重组蛋白g的细菌磁颗粒及其应用 - Google Patents

表达重组蛋白g的细菌磁颗粒及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供一种表达重组蛋白G的细菌磁颗粒，该表达重组蛋白G的细菌磁颗粒是对趋磁细菌MSR‑1重组株进行扩大培养、分离纯化得到的，并且还提供了表达重组蛋白G的细菌磁颗粒在用于血型不规则抗体IgG的检测中的应用；本发明提供的表达重组蛋白G的细菌磁颗粒利用细菌磁颗粒的磁特性，在外加磁场的作用下可以帮助致敏红细胞凝集，一方面最大限度减少细菌磁颗粒的使用量，另一方面最大限度提高低效价IgG抗体的检测敏感性。

Description

表达重组蛋白G的细菌磁颗粒及其应用
技术领域
本发明涉及纳米磁珠应用和医学检测领域，具体是涉及表达重组蛋白G的细菌磁颗粒及其应用。
背景技术
细菌磁颗粒是趋磁细菌生产的一种磁性纳米颗粒，内核是Fe3O4晶体，外面有一层磷脂生物膜包被，粒径在30-120nm之间。同一种趋磁细菌生产的细菌磁颗粒粒径大小和晶体晶型基本一致，磁学性质均一，有天然生物膜包被，具有很好的水溶性质和胶体性质。此外，因为细菌磁颗粒是生物来源，因此具有较好的生物相容性。细菌磁颗粒膜上带有大量的氨基基团，可通过化学修饰和双功能偶联剂连接不同的功能大分子，如抗体，从而具有不同的独特功能。
细菌磁颗粒最独特的地方在于它可以通过基因工程的方法在细菌磁颗粒膜上表达特殊的蛋白质，通过和细菌磁颗粒膜上锚定蛋白的融合表达，功能性的靶蛋白可以在细菌磁颗粒上展示出来。相比化学修饰的方法，这种生物学功能修饰的好处和优势更加显而易见。因此，细菌磁颗粒作为一种新型的微生物来源纳米磁珠材料，在生物医学和纳米材料领域具有广泛的应用前景。
链球菌蛋白G(Streptococcus Protein G,SPG)是在A、C和G群链球菌的细胞壁上发现的一种能够和人及多种哺乳动物的IgG相结合的蛋白质，它同IgG的亲和力强，结合谱广，在免疫学和免疫化学上有着广泛的应用。重组的蛋白G去除了天然的蛋白G与其他诸如白蛋白、Fab抗体段结合的位点，可特异性结合IgG抗体的Fc区段。
抗人球蛋白试验，又称为Coombs试验(库姆试验)，是检测血型不规则抗体IgG的重要依据。血型抗体有IgG和IgM两类，其中的IgM抗体在盐水介质中能与含相应抗原的红细胞发生肉眼可见的凝集反应。而IgG抗体只能致敏红细胞，不能使其凝集，因此需要通过抗人球蛋白抗体作为第二抗体，将致敏红细胞表面的IgG连接起来才能使得红细胞发生凝集。在自动化检测中，抗人球蛋白试验需要结合微柱凝胶卡来使用，随着微柱凝胶卡的成本越来越高，一定程度上增加了常规试验和血型抗体筛查中抗人球试验的成本。
发明内容
为了解决上述技术问题，本发明提供一种表达重组蛋白G的细菌磁颗粒及其应用。本发明利用重组蛋白G作为第二抗体，替代抗人球试验中的抗人球抗体试剂；利用细菌磁颗粒的磁特性，在外加磁场的作用下可以帮助致敏红细胞凝集，一方面最大限度减少细菌磁颗粒的使用量，另一方面最大限度提高低效价IgG抗体的检测敏感性。
本发明具体技术方案如下：
本发明一方面提供了表达重组蛋白G的细菌磁颗粒在用于血型不规则抗体IgG的检测中的应用。
本发明另一方面提供一种表达重组蛋白G的细菌磁颗粒，该表达重组蛋白G的细菌磁颗粒是对趋磁细菌MSR-1重组株进行扩大培养、分离纯化得到的。
进一步的改进，该重组蛋白G的序列是：
进一步的改进，本发明提供述趋磁细菌MSR-1重组株是通过如下方法构建而成的：
a.构建细菌磁颗粒膜蛋白mamC/mamF基因缺失的趋磁细菌MSR-1突变株；
b.构建细菌磁颗粒膜蛋白融合表达质粒；
c.将功能化细菌磁颗粒融合表达质粒通过接合转入到步骤a制得的趋磁细菌MSR-1突变株，构建趋磁细菌MSR-1重组株。
本发明另一方面提供一种表达重组蛋白G的细菌磁颗粒的制备方法，该方法包括如下步骤：
a.构建细菌磁颗粒膜蛋白mamC/mamF基因缺失的趋磁细菌MSR-1突变株；
b.构建功能化细菌磁颗粒膜蛋白融合表达质粒；
c.将功能化细菌磁颗粒融合表达质粒通过接合转入到步骤a制得的趋磁细菌MSR-1突变株，构建趋磁细菌MSR-1重组株；
d.对趋磁细菌MSR-1重组株进行培养；
e.分离纯化，制得功能化细菌磁颗粒。
进一步的改进，步骤a所述构建细菌磁颗粒膜蛋白mamC/mamF基因缺失的趋磁细菌MSR-1突变株的具体方法为：
(a)扩增细菌磁颗粒膜蛋白mamC/mamF基因左右两侧共两个长均为700-1000bp的同源片段；左右两同源片段均带有两个酶切位点；
(b)左右同源片段分别用相应的限制性内切酶进行双酶切；同时对自杀质粒pKmobsacB进行双酶切；
(c)将经过双酶切后的左右同源片段和经过双酶切后的自杀质粒pKmobsacB进行连接，连接产物转到E.coli感受态细胞中，挑选连接正确的阳性克隆菌；
(d)将阳性克隆菌作为供体与趋磁细菌MSR-1受体菌进行亲本接合，并导入pKmobsacB重组质粒，通过卡那抗性筛选趋磁细菌MSR-1同源整合突变株，突变株再通过蔗糖梯度筛选趋磁细菌MSR-1双交换突变株，最后选择卡那抗性敏感的双交换菌株进行验证，构建成细菌磁颗粒膜蛋白mamC/mamF基因缺失的趋磁细菌MSR-1突变株；
步骤b所述细菌磁颗粒膜蛋白融合表达质粒的构建方法如下：
(1)扩增细菌磁颗粒膜蛋白mamC/mamF基因跨膜结构域的DNA片段，所述DNA片段两端分别带有双酶切位点；对扩增产物DNA片段及pBBR质粒进行双酶切，回收双酶切的DNA片段及双酶切的pBBR质粒；将双酶切的DNA片段与双酶切的pBBR质粒进行连接，连接产物转化大肠杆菌感受态细胞中，筛选连接正确的阳性克隆，得到重组质粒pBBR-细菌磁颗粒膜蛋白mamC/mamF基因；
(2)重组蛋白G的编码序列克隆在pUC57载体上，在两端分别加上双酶切位点，制得重组蛋白G质粒；
(3)对步骤(2)基因合成得到的重组蛋白G质粒进行扩增和双酶切；
(4)对步骤(1)得到的重组质粒pBBR-细菌磁颗粒膜蛋白mamC/mamF基因进行双酶切并纯化，和步骤(3)得到的经过双酶切的重组蛋白G质粒的基因片段进行连接，连接产物转化大肠感觉感受态细胞中，筛选并验证连接正确的阳性克隆，最终得到细菌磁颗粒膜蛋白融合表达质粒pBBR--细菌磁颗粒膜蛋白mamC/mamF基因-重组蛋白G；
步骤c所述的具体方法为：
Ⅰ以细菌磁颗粒膜蛋白融合表达质粒pBBR--细菌磁颗粒膜蛋白mamC/mamF基因-重组蛋白G作为供体，通过亲本接合实验将其导入到细菌磁颗粒膜蛋白mamC/mamF基因缺失的趋磁细菌MSR-1突变株，构建生产功能化细菌磁颗粒的趋磁细菌MSR-1重组株。
进一步的改进，所述步骤d中对趋磁细菌MSR-1重组株进行培养包括如下步骤：
d-a.向培养罐中加入第一培养基，加热灭菌15-20min，加热温度为110-120℃，将趋磁细菌MSR-1重组株接种到培养罐中，无氧状态进行第一次培养，获得第一培养液；第一次培养的条件为：起始pH值为5.3-5.5，培养温度为28-30℃，培养时间为1-2天，摇床转速为250-280转/分钟；
d-b.将第一培养液加入含有第二培养基的培养罐中，进行第二次培养；第二次培养的条件为：起始pH值为6.2-6.3，培养温度为20-22℃，培养时间为5-8天，摇床转速为150-180转/分钟，培养过程中通入氧气，通入氧气的方式为：间隔5min，通入20min氧气，间隔5min，通入10min空气，循环5次。
进一步的改进，所述第一培养基由重量份数为0.2-0.3份甘油酸三乙酯、1.5-3份多聚谷氨酸、0.2-0.3份磷酸吡哆醛、0.5-1份硝酸铵、0.02-0.05份维生素C、10-12份葡萄糖酸钙、0.2-0.3份十二烷基硫酸钠、0.5-1份月桂酰肌氨酸、0.5-1份成纤维细胞生长因子和1-2份琼脂组成；所述第二培养基由重量份数为1-1.5份硬脂酰肌氨酸、0.2-0.5份磷酸二氢钾、10-12份果聚糖、0.5-1份蛋白胨、0.1-0.3份碳酸钙、0.5-1份海藻酸钠、0.5-0.7份硫酸亚铁、1-2份脯氨酸和0.2-0.5份硫酸镁组成。
本发明所提供的培养步骤不但能够提高对趋磁细菌MSR-1重组株的扩增能力，同时能够增强细菌磁颗粒对重组蛋白G的负载能力。
进一步的改进，分离纯化具体步骤如下：
1)离心并收集培养后的趋磁细菌MSR-1重组株，用磷酸盐缓冲液悬浮，得悬浮液；
2)超声波破碎悬浮液中的细胞；
3)磁力装置吸附破碎后的细胞，静置过夜，弃去上清，用磷酸盐缓冲液重新悬浮吸附到的沉淀，超声波清洗，磁力装置再次吸附，弃上清，将吸附到的沉淀用磷酸盐缓冲液悬浮，洗涤3次，即得功能化细菌磁颗粒；
离心条件为：转速10500-11500rpm，离心时间10-12min；超声波破碎条件为：超声功率360-375w，超声时间3-5s，间隔时间2s，超声次数45次；超声波清洗条件为：超声功率130w，超声时间3-5s，间隔时间1s，超声次数30次。
本发明通过将重组蛋白G与细菌磁颗粒结合之后，由于有细菌磁颗粒锚定蛋白及细菌磁颗粒膜的保护，重组蛋白G的稳定性得到极大的提高。重组蛋白G具有适合基因操作以及化学合成修饰的两种优点，利用其基因操作的特点可以和细菌磁颗粒成为互相修饰的“最佳伴侣”，并且细菌磁颗粒高效表达重组蛋白G，重组蛋白G利用细菌磁颗粒作磁修饰。
细菌磁颗粒表达重组蛋白G一方面可以继续发挥细菌磁颗粒磁纳米颗粒的特点，另一个方面可发挥重组蛋白G的优越特性。
细菌磁颗粒与化学合成磁珠相比最大的优势是它具有重组基因分子操作的特性，能够在细菌里直接表达功能化目的蛋白，并在细菌磁颗粒膜表面固定展示。这等于把原核重组表达和体外化学合成、修饰这些不同的过程完美地结合在一起，这也是基于基因工程的生产功能化细菌磁颗粒的好处所在。
本发明的一方面提供了表达重组蛋白G的细菌磁颗粒，即通过特定重组基因分子操作的方法在趋磁细菌内生产表达重组蛋白G的细菌磁颗粒。该表达重组蛋白G均显示与天然抗体近似的抗原结合能力。
具体实施方式
下面将对本发明的技术方案进行清楚、完整的描述，显然，所描述的实施例仅是本发明的一部分实施例，不能用来限制本发明的范围。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其它实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1表达重组蛋白G的细菌磁颗粒
一种表达重组蛋白G的细菌磁颗粒，该表达重组蛋白G的细菌磁颗粒是对趋磁细菌MSR-1重组株进行扩大培养、分离纯化得到的。
实施例2表达重组蛋白G的细菌磁颗粒
一种表达重组蛋白G的细菌磁颗粒，该表达重组蛋白G的细菌磁颗粒是对趋磁细菌MSR-1重组株进行扩大培养、分离纯化得到的；
该重组蛋白G的序列是：
该趋磁细菌MSR-1重组株是通过如下方法构建而成的：
a.构建细菌磁颗粒膜蛋白mamC/mamF基因缺失的趋磁细菌MSR-1突变株；
b.构建细菌磁颗粒膜蛋白融合表达质粒；
c.将功能化细菌磁颗粒融合表达质粒通过接合转入到步骤a制得的趋磁细菌MSR-1突变株，构建趋磁细菌MSR-1重组株。
实施例3表达重组蛋白G的细菌磁颗粒
一种表达重组蛋白G的细菌磁颗粒，该表达重组蛋白G的细菌磁颗粒是对趋磁细菌MSR-1重组株进行扩大培养、分离纯化得到的；
该重组蛋白G的序列是：
该表达重组蛋白G的细菌磁颗粒的制备方法为：
a.构建细菌磁颗粒膜蛋白mamC/mamF基因缺失的趋磁细菌MSR-1突变株；
(a)扩增细菌磁颗粒膜蛋白mamC/mamF基因左右两侧共两个长均为700-1000bp的同源片段；左右两同源片段均带有两个酶切位点；
(b)左右同源片段分别用相应的限制性内切酶进行双酶切；同时对自杀质粒pKmobsacB进行双酶切；
(c)将经过双酶切后的左右同源片段和经过双酶切后的自杀质粒pKmobsacB进行连接，连接产物转到E.coli感受态细胞中，挑选连接正确的阳性克隆菌；
(d)将阳性克隆菌作为供体与趋磁细菌MSR-1受体菌进行亲本接合，并导入pKmobsacB重组质粒，通过卡那抗性筛选趋磁细菌MSR-1同源整合突变株，突变株再通过蔗糖梯度筛选趋磁细菌MSR-1双交换突变株，最后选择卡那抗性敏感的双交换菌株进行验证，构建成细菌磁颗粒膜蛋白mamC/mamF基因缺失的趋磁细菌MSR-1突变株；
b.构建功能化细菌磁颗粒膜蛋白融合表达质粒；
(1)扩增细菌磁颗粒膜蛋白mamC/mamF基因跨膜结构域的DNA片段，所述DNA片段两端分别带有双酶切位点；对扩增产物DNA片段及pBBR质粒进行双酶切，回收双酶切的DNA片段及双酶切的pBBR质粒；将双酶切的DNA片段与双酶切的pBBR质粒进行连接，连接产物转化大肠杆菌感受态细胞中，筛选连接正确的阳性克隆，得到重组质粒pBBR-细菌磁颗粒膜蛋白mamC/mamF基因；
(2)重组蛋白G的编码序列克隆在pUC57载体上，在两端分别加上双酶切位点，制得重组蛋白G质粒；
(3)对步骤(2)基因合成得到的重组蛋白G质粒进行扩增和双酶切；
(4)对步骤(1)得到的重组质粒pBBR-细菌磁颗粒膜蛋白mamC/mamF基因进行双酶切并纯化，和步骤(3)得到的经过双酶切的重组蛋白G质粒的基因片段进行连接，连接产物转化大肠感觉感受态细胞中，筛选并验证连接正确的阳性克隆，最终得到细菌磁颗粒膜蛋白融合表达质粒pBBR--细菌磁颗粒膜蛋白mamC/mamF基因-重组蛋白G；
c.将功能化细菌磁颗粒融合表达质粒通过接合转入到步骤a制得的趋磁细菌MSR-1突变株，构建趋磁细菌MSR-1重组株；
Ⅰ以细菌磁颗粒膜蛋白融合表达质粒pBBR--细菌磁颗粒膜蛋白mamC/mamF基因-重组蛋白G作为供体，通过亲本接合实验将其导入到细菌磁颗粒膜蛋白mamC/mamF基因缺失的趋磁细菌MSR-1突变株，构建生产功能化细菌磁颗粒的趋磁细菌MSR-1重组株；
d.对趋磁细菌MSR-1重组株进行培养；
d-a.向培养罐中加入第一培养基，加热灭菌15min，加热温度为110℃，将趋磁细菌MSR-1重组株接种到培养罐中，无氧状态进行第一次培养，获得第一培养液；第一次培养的条件为：起始pH值为5.3，培养温度为28℃，培养时间为1天，摇床转速为250转/分钟；
d-b.将第一培养液加入含有第二培养基的培养罐中，进行第二次培养；第二次培养的条件为：起始pH值为6.2，培养温度为20℃，培养时间为5天，摇床转速为150转/分钟，培养过程中通入氧气，通入氧气的方式为：间隔5min，通入20min氧气，间隔5min，通入10min空气，循环5次
所述第一培养基由重量份数为0.2份甘油酸三乙酯、1.5份多聚谷氨酸、0.2份磷酸吡哆醛、0.5份硝酸铵、0.02份维生素C、10份葡萄糖酸钙、0.2份十二烷基硫酸钠、0.5份月桂酰肌氨酸、0.5份成纤维细胞生长因子和1份琼脂组成；所述第二培养基由重量份数为1份硬脂酰肌氨酸、0.2份磷酸二氢钾、10份果聚糖、0.5份蛋白胨、0.1份碳酸钙、0.5份海藻酸钠、0.5份硫酸亚铁、1份脯氨酸和0.2份硫酸镁组成；
e.分离纯化，制得功能化细菌磁颗粒；
1)离心并收集培养后的趋磁细菌MSR-1重组株，用磷酸盐缓冲液悬浮，得悬浮液；
2)超声波破碎悬浮液中的细胞；
3)磁力装置吸附破碎后的细胞，静置过夜，弃去上清，用磷酸盐缓冲液重新悬浮吸附到的沉淀，超声波清洗，磁力装置再次吸附，弃上清，将吸附到的沉淀用磷酸盐缓冲液悬浮，洗涤3次，即得功能化细菌磁颗粒；
离心条件为：转速10500rpm，离心时间10min；超声波破碎条件为：超声功率360w，超声时间3s，间隔时间2s，超声次数45次；超声波清洗条件为：超声功率130w，超声时间3s，间隔时间1s，超声次数30次。
实施例5一种表达重组蛋白G的细菌磁颗粒的制备方法
该方法包括如下步骤：
a.构建细菌磁颗粒膜蛋白mamC/mamF基因缺失的趋磁细菌MSR-1突变株；
(a)扩增细菌磁颗粒膜蛋白mamC/mamF基因左右两侧共两个长均为700-1000bp的同源片段；左右两同源片段均带有两个酶切位点；
(b)左右同源片段分别用相应的限制性内切酶进行双酶切；同时对自杀质粒pKmobsacB进行双酶切；
(c)将经过双酶切后的左右同源片段和经过双酶切后的自杀质粒pKmobsacB进行连接，连接产物转到E.coli感受态细胞中，挑选连接正确的阳性克隆菌；
(d)将阳性克隆菌作为供体与趋磁细菌MSR-1受体菌进行亲本接合，并导入pKmobsacB重组质粒，通过卡那抗性筛选趋磁细菌MSR-1同源整合突变株，突变株再通过蔗糖梯度筛选趋磁细菌MSR-1双交换突变株，最后选择卡那抗性敏感的双交换菌株进行验证，构建成细菌磁颗粒膜蛋白mamC/mamF基因缺失的趋磁细菌MSR-1突变株；
b.构建功能化细菌磁颗粒膜蛋白融合表达质粒；
(1)扩增细菌磁颗粒膜蛋白mamC/mamF基因跨膜结构域的DNA片段，所述DNA片段两端分别带有双酶切位点；对扩增产物DNA片段及pBBR质粒进行双酶切，回收双酶切的DNA片段及双酶切的pBBR质粒；将双酶切的DNA片段与双酶切的pBBR质粒进行连接，连接产物转化大肠杆菌感受态细胞中，筛选连接正确的阳性克隆，得到重组质粒pBBR-细菌磁颗粒膜蛋白mamC/mamF基因；
(2)重组蛋白G的编码序列克隆在pUC57载体上，在两端分别加上双酶切位点，制得重组蛋白G质粒；
(3)对步骤(2)基因合成得到的重组蛋白G质粒进行扩增和双酶切；
(4)对步骤(1)得到的重组质粒pBBR-细菌磁颗粒膜蛋白mamC/mamF基因进行双酶切并纯化，和步骤(3)得到的经过双酶切的重组蛋白G质粒的基因片段进行连接，连接产物转化大肠感觉感受态细胞中，筛选并验证连接正确的阳性克隆，最终得到细菌磁颗粒膜蛋白融合表达质粒pBBR--细菌磁颗粒膜蛋白mamC/mamF基因-重组蛋白G；
c.将功能化细菌磁颗粒融合表达质粒通过接合转入到步骤a制得的趋磁细菌MSR-1突变株，构建趋磁细菌MSR-1重组株；
Ⅰ以细菌磁颗粒膜蛋白融合表达质粒pBBR--细菌磁颗粒膜蛋白mamC/mamF基因-重组蛋白G作为供体，通过亲本接合实验将其导入到细菌磁颗粒膜蛋白mamC/mamF基因缺失的趋磁细菌MSR-1突变株，构建生产功能化细菌磁颗粒的趋磁细菌MSR-1重组株；
d.对趋磁细菌MSR-1重组株进行培养；
e.分离纯化，制得功能化细菌磁颗粒。
实施例6一种表达重组蛋白G的细菌磁颗粒的制备方法
该方法包括如下步骤：
a.构建细菌磁颗粒膜蛋白mamC/mamF基因缺失的趋磁细菌MSR-1突变株；
(a)扩增细菌磁颗粒膜蛋白mamC/mamF基因左右两侧共两个长均为700-1000bp的同源片段；左右两同源片段均带有两个酶切位点；
(b)左右同源片段分别用相应的限制性内切酶进行双酶切；同时对自杀质粒pKmobsacB进行双酶切；
(c)将经过双酶切后的左右同源片段和经过双酶切后的自杀质粒pKmobsacB进行连接，连接产物转到E.coli感受态细胞中，挑选连接正确的阳性克隆菌；
(d)将阳性克隆菌作为供体与趋磁细菌MSR-1受体菌进行亲本接合，并导入pKmobsacB重组质粒，通过卡那抗性筛选趋磁细菌MSR-1同源整合突变株，突变株再通过蔗糖梯度筛选趋磁细菌MSR-1双交换突变株，最后选择卡那抗性敏感的双交换菌株进行验证，构建成细菌磁颗粒膜蛋白mamC/mamF基因缺失的趋磁细菌MSR-1突变株；
b.构建功能化细菌磁颗粒膜蛋白融合表达质粒；
(1)扩增细菌磁颗粒膜蛋白mamC/mamF基因跨膜结构域的DNA片段，所述DNA片段两端分别带有双酶切位点；对扩增产物DNA片段及pBBR质粒进行双酶切，回收双酶切的DNA片段及双酶切的pBBR质粒；将双酶切的DNA片段与双酶切的pBBR质粒进行连接，连接产物转化大肠杆菌感受态细胞中，筛选连接正确的阳性克隆，得到重组质粒pBBR-细菌磁颗粒膜蛋白mamC/mamF基因；
(2)重组蛋白G的编码序列克隆在pUC57载体上，在两端分别加上双酶切位点，制得重组蛋白G质粒；
(3)对步骤(2)基因合成得到的重组蛋白G质粒进行扩增和双酶切；
(4)对步骤(1)得到的重组质粒pBBR-细菌磁颗粒膜蛋白mamC/mamF基因进行双酶切并纯化，和步骤(3)得到的经过双酶切的重组蛋白G质粒的基因片段进行连接，连接产物转化大肠感觉感受态细胞中，筛选并验证连接正确的阳性克隆，最终得到细菌磁颗粒膜蛋白融合表达质粒pBBR--细菌磁颗粒膜蛋白mamC/mamF基因-重组蛋白G；
c.将功能化细菌磁颗粒融合表达质粒通过接合转入到步骤a制得的趋磁细菌MSR-1突变株，构建趋磁细菌MSR-1重组株；
Ⅰ以细菌磁颗粒膜蛋白融合表达质粒pBBR--细菌磁颗粒膜蛋白mamC/mamF基因-重组蛋白G作为供体，通过亲本接合实验将其导入到细菌磁颗粒膜蛋白mamC/mamF基因缺失的趋磁细菌MSR-1突变株，构建生产功能化细菌磁颗粒的趋磁细菌MSR-1重组株；
d.对趋磁细菌MSR-1重组株进行培养；
d-a.向培养罐中加入第一培养基，加热灭菌20min，加热温度为120℃，将趋磁细菌MSR-1重组株接种到培养罐中，无氧状态进行第一次培养，获得第一培养液；第一次培养的条件为：起始pH值为5.5，培养温度为30℃，培养时间为2天，摇床转速为280转/分钟；
d-b.将第一培养液加入含有第二培养基的培养罐中，进行第二次培养；第二次培养的条件为：起始pH值为6.3，培养温度为22℃，培养时间为8天，摇床转速为180转/分钟，培养过程中通入氧气，通入氧气的方式为：间隔5min，通入20min氧气，间隔5min，通入10min空气，循环5次；
所述第一培养基由重量份数为0.3份甘油酸三乙酯、3份多聚谷氨酸、0.3份磷酸吡哆醛、1份硝酸铵、0.05份维生素C、12份葡萄糖酸钙、0.3份十二烷基硫酸钠、1份月桂酰肌氨酸、1份成纤维细胞生长因子和2份琼脂组成；所述第二培养基由重量份数为1.5份硬脂酰肌氨酸、0.5份磷酸二氢钾、12份果聚糖、1份蛋白胨、0.3份碳酸钙、1份海藻酸钠、0.7份硫酸亚铁、2份脯氨酸和0.5份硫酸镁组成；
e.分离纯化，制得功能化细菌磁颗粒
1)离心并收集培养后的趋磁细菌MSR-1重组株，用磷酸盐缓冲液悬浮，得悬浮液；
2)超声波破碎悬浮液中的细胞；
3)磁力装置吸附破碎后的细胞，静置过夜，弃去上清，用磷酸盐缓冲液重新悬浮吸附到的沉淀，超声波清洗，磁力装置再次吸附，弃上清，将吸附到的沉淀用磷酸盐缓冲液悬浮，洗涤3次，即得功能化细菌磁颗粒；
离心条件为：转速11500rpm，离心时间12min；超声波破碎条件为：超声功率375w，超声时间5s，间隔时间2s，超声次数45次；超声波清洗条件为：超声功率130w，超声时间5s，间隔时间1s，超声次数30次。
实施例7一种表达重组蛋白G的细菌磁颗粒的制备方法
该方法包括如下步骤：
a.构建细菌磁颗粒膜蛋白mamC/mamF基因缺失的趋磁细菌MSR-1突变株；
(a)扩增细菌磁颗粒膜蛋白mamC/mamF基因左右两侧共两个长均为700-1000bp的同源片段；左右两同源片段均带有两个酶切位点；
(b)左右同源片段分别用相应的限制性内切酶进行双酶切；同时对自杀质粒pKmobsacB进行双酶切；
(c)将经过双酶切后的左右同源片段和经过双酶切后的自杀质粒pKmobsacB进行连接，连接产物转到E.coli感受态细胞中，挑选连接正确的阳性克隆菌；
(d)将阳性克隆菌作为供体与趋磁细菌MSR-1受体菌进行亲本接合，并导入pKmobsacB重组质粒，通过卡那抗性筛选趋磁细菌MSR-1同源整合突变株，突变株再通过蔗糖梯度筛选趋磁细菌MSR-1双交换突变株，最后选择卡那抗性敏感的双交换菌株进行验证，构建成细菌磁颗粒膜蛋白mamC/mamF基因缺失的趋磁细菌MSR-1突变株；
b.构建功能化细菌磁颗粒膜蛋白融合表达质粒；
(1)扩增细菌磁颗粒膜蛋白mamC/mamF基因跨膜结构域的DNA片段，所述DNA片段两端分别带有双酶切位点；对扩增产物DNA片段及pBBR质粒进行双酶切，回收双酶切的DNA片段及双酶切的pBBR质粒；将双酶切的DNA片段与双酶切的pBBR质粒进行连接，连接产物转化大肠杆菌感受态细胞中，筛选连接正确的阳性克隆，得到重组质粒pBBR-细菌磁颗粒膜蛋白mamC/mamF基因；
(2)重组蛋白G的编码序列克隆在pUC57载体上，在两端分别加上双酶切位点，制得重组蛋白G质粒；
(3)对步骤(2)基因合成得到的重组蛋白G质粒进行扩增和双酶切；
(4)对步骤(1)得到的重组质粒pBBR-细菌磁颗粒膜蛋白mamC/mamF基因进行双酶切并纯化，和步骤(3)得到的经过双酶切的重组蛋白G质粒的基因片段进行连接，连接产物转化大肠感觉感受态细胞中，筛选并验证连接正确的阳性克隆，最终得到细菌磁颗粒膜蛋白融合表达质粒pBBR--细菌磁颗粒膜蛋白mamC/mamF基因-重组蛋白G；
c.将功能化细菌磁颗粒融合表达质粒通过接合转入到步骤a制得的趋磁细菌MSR-1突变株，构建趋磁细菌MSR-1重组株；
Ⅰ以细菌磁颗粒膜蛋白融合表达质粒pBBR--细菌磁颗粒膜蛋白mamC/mamF基因-重组蛋白G作为供体，通过亲本接合实验将其导入到细菌磁颗粒膜蛋白mamC/mamF基因缺失的趋磁细菌MSR-1突变株，构建生产功能化细菌磁颗粒的趋磁细菌MSR-1重组株；
d.对趋磁细菌MSR-1重组株进行培养；
d-a.向培养罐中加入第一培养基，加热灭菌17min，加热温度为115℃，将趋磁细菌MSR-1重组株接种到培养罐中，无氧状态进行第一次培养，获得第一培养液；第一次培养的条件为：起始pH值为5.4，培养温度为29℃，培养时间为1天，摇床转速为270转/分钟；
d-b.将第一培养液加入含有第二培养基的培养罐中，进行第二次培养；第二次培养的条件为：起始pH值为6.2，培养温度为21℃，培养时间为7天，摇床转速为165转/分钟，培养过程中通入氧气，通入氧气的方式为：间隔5min，通入20min氧气，间隔5min，通入10min空气，循环5次；
所述第一培养基由重量份数为0.2份甘油酸三乙酯、2份多聚谷氨酸、0.2份磷酸吡哆醛、0.75份硝酸铵、0.03份维生素C、11份葡萄糖酸钙、0.3份十二烷基硫酸钠、0.75份月桂酰肌氨酸、0.75份成纤维细胞生长因子和1.5份琼脂组成；所述第二培养基由重量份数为1.2份硬脂酰肌氨酸、0.4份磷酸二氢钾、11份果聚糖、0.75份蛋白胨、0.2份碳酸钙、0.75份海藻酸钠、0.6份硫酸亚铁、1.5份脯氨酸和0.3份硫酸镁组成；
e.分离纯化，制得功能化细菌磁颗粒
1)离心并收集培养后的趋磁细菌MSR-1重组株，用磷酸盐缓冲液悬浮，得悬浮液；
2)超声波破碎悬浮液中的细胞；
3)磁力装置吸附破碎后的细胞，静置过夜，弃去上清，用磷酸盐缓冲液重新悬浮吸附到的沉淀，超声波清洗，磁力装置再次吸附，弃上清，将吸附到的沉淀用磷酸盐缓冲液悬浮，洗涤3次，即得功能化细菌磁颗粒；
离心条件为：转速11000rpm，离心时间11min；超声波破碎条件为：超声功率370w，超声时间4s，间隔时间2s，超声次数45次；超声波清洗条件为：超声功率130w，超声时间4s，间隔时间1s，超声次数30次。
对照例1一种表达重组蛋白G的细菌磁颗粒的制备方法
该方法与实施例7不同的是，步骤d中对趋磁细菌MSR-1重组株进行培养包括如下步骤：
d-a.向培养罐中加入第一培养基，加热灭菌12min，加热温度为130℃，将趋磁细菌MSR-1重组株接种到培养罐中，进行第一次培养，获得第一培养液；第一次培养的条件为：起始pH值为5.6，培养温度为32℃，培养时间为3天，摇床转速为290转/分钟；
d-b.将第一培养液加入含有第二培养基的培养罐中，进行第二次培养；第二次培养的条件为：起始pH值为6.4，培养温度为22℃，培养时间为8天，摇床转速为200转/分钟；
所述第一培养基由重量份数为0.2份甘油酸三乙酯、2份多聚谷氨酸、0.2份磷酸吡哆醛、0.75份硝酸铵、0.03份维生素C、11份葡萄糖酸钙、0.3份十二烷基硫酸钠、0.75份月桂酰肌氨酸、0.75份成纤维细胞生长因子和1.5份琼脂组成；所述第二培养基由重量份数为1.2份硬脂酰肌氨酸、0.4份磷酸二氢钾、11份果聚糖、0.75份蛋白胨、0.2份碳酸钙、0.75份海藻酸钠、0.6份硫酸亚铁、1.5份脯氨酸和0.3份硫酸镁组成。
对照例2一种表达重组蛋白G的细菌磁颗粒的制备方法
该方法与实施例7不同的是，步骤d中对趋磁细菌MSR-1重组株进行培养包括如下步骤：
d-a.向培养罐中加入第一培养基，加热灭菌17min，加热温度为115℃，将趋磁细菌MSR-1重组株接种到培养罐中，无氧状态进行第一次培养，获得第一培养液；第一次培养的条件为：起始pH值为5.4，培养温度为29℃，培养时间为1天，摇床转速为270转/分钟；
d-b.将第一培养液加入含有第二培养基的培养罐中，进行第二次培养；第二次培养的条件为：起始pH值为6.2，培养温度为21℃，培养时间为7天，摇床转速为165转/分钟，培养过程中通入氧气，通入氧气的方式为：间隔5min，通入20min氧气，间隔5min，通入10min空气，循环5次；
所述第一培养基由重量份数为0.2份甘油酸三乙酯、2份多聚谷氨酸、0.3份磷酸吡哆醛、1份硝酸铵、0.02份维生素C、10份葡萄糖酸钙、0.5份成纤维细胞生长因子和1份琼脂组成；所述第二培养基由重量份数为1份硬脂酰肌氨酸、0.2份磷酸二氢钾、12份果聚糖、0.5份蛋白胨、0.5-1份海藻酸钠、1份脯氨酸和0.2份硫酸镁组成。
对照例2一种表达重组蛋白GA功能化细菌磁颗粒的制备方法
该方法与实施例7不同的是，步骤d中对趋磁细菌MSR-1重组株进行培养包括如下步骤：
d-a.向培养罐中加入第一培养基，加热灭菌17min，加热温度为115℃，将趋磁细菌MSR-1重组株接种到培养罐中，无氧状态进行第一次培养，获得第一培养液；第一次培养的条件为：起始pH值为5.4，培养温度为29℃，培养时间为1天，摇床转速为270转/分钟；
d-b.将第一培养液加入含有第二培养基的培养罐中，进行第二次培养；第二次培养的条件为：起始pH值为6.2，培养温度为21℃，培养时间为7天，摇床转速为165转/分钟，培养过程中通入氧气，通入氧气的方式为：间隔5min，通入20min氧气，间隔5min，通入10min空气，循环5次；
所述第一培养基由重量份数为0.1份甘油酸三乙酯、4.5份多聚谷氨酸、0.1份磷酸吡哆醛、1.2份硝酸铵、0.01份维生素C、12.5份葡萄糖酸钙、0.4份十二烷基硫酸钠、1.2份月桂酰肌氨酸、0.4份成纤维细胞生长因子和0.8份琼脂组成；所述第二培养基由重量份数为1.6份硬脂酰肌氨酸、0.1份磷酸二氢钾、9.5份果聚糖、1.2份蛋白胨、0.4份碳酸钙、0.4份海藻酸钠、0.8份硫酸亚铁、2.1份脯氨酸和0.6份硫酸镁组成。
本发明提供的表达重组蛋白G的细菌磁颗粒的应用例如下：
应用例1
取100微升2-5％高效价抗-D(64)IgG致敏的红细胞悬液加入试管中，滴入一滴浓度为0.5mg/mL的表达重组蛋白G的细菌磁颗粒悬液，混匀后室温孵育3-5分钟，添加磁场磁力作用，轻摇，观察结果，肉眼可见红细胞凝集块，强度4+。
应用例2
取100微升2-5％中效价抗-D(16)IgG致敏的红细胞悬液加入试管中，滴入一滴浓度为0.5mg/mL的表达重组蛋白G的细菌磁颗粒悬液，混匀后室温孵育3-5分钟，添加磁场磁力作用，轻摇，观察结果，肉眼可见红细胞凝集块，强度大于2+。
应用例3
取100微升2-5％低效价抗-Dia(2)IgG致敏的红细胞悬液加入试管中，滴入一滴浓度为0.5mg/mL的表达重组蛋白G的细菌磁颗粒悬液，混匀后室温孵育3-5分钟，添加磁场磁力作用，轻摇，观察结果，肉眼可见红细胞凝集块，强度大于1+。
应用例4
试管法分析表达表达重组蛋白G的细菌磁颗粒对血型抗体IgG致敏红细胞的凝集作用。
新鲜红细胞用盐水洗涤4次，重悬成2-5％浓度；先往试管中加入适量的低效价抗-Dia血清(效价为2，IgG)；再加入50微升2-5％重悬Di(a+)红细胞并混匀，离心后观察是否有溶血或凝集；重悬后放在37℃孵育15-30分钟；离心观察是否有溶血或凝集；用盐水洗涤红细胞3-4次，重悬成2-5％浓度即可得到致敏红细胞；滴入一滴浓度为0.5mg/mL的表达重组蛋白G的细菌磁颗粒悬液，混匀后室温孵育3-5分钟；使用钕铁硼磁力装置添加外部磁力，磁小体缓慢聚集，肉眼观察可见红细胞凝集，取消外部磁力后，轻轻摇晃，红细胞凝集没有分散，实验结果阳性。阴性对照是未致敏红细胞在外加磁场影响下没有发生凝集或轻轻摇晃后分散。
试验例1细菌磁颗粒负载重组蛋白效果试验
选择实施例7、对照实施例1和对照实施例2的方法制备的表达重组蛋白G的细菌磁颗粒，测试细菌磁颗粒对重组蛋白G的负载量，结果见表1；
表1不同实施例对负载效果的影响
选择不同的培养方法和培养基，可以看出细菌磁颗粒对重组蛋白G的负载数量存在着很大的差异。
试验例2趋磁细菌MSR-1重组株扩大培养情况
1)分组
试验1组：本发明实施例7所述的制备方法；
对照1组：对照例1的制备方法；
对照2组：对照例2的制备方法；
对照3组：CN1952112公开的一种兼性厌氧趋磁细菌及其分离、纯培养方法和细菌磁颗粒的提取、纯化方法中公开的培养方法；
2)采用台盼蓝经典染色法对细胞进行计数，接种时细胞为1×104个/ml，分别统计原代细胞和扩大培养后的数量，结果见表2。
表2各组趋磁细菌MSR-1重组株体外培养扩增试验结果
由表中可以看出，本发明提供的趋磁细菌培养步骤可以有效的体外培养趋磁细菌MSR-1重组株。

Claims (3)

1.一种表达重组蛋白G的细菌磁颗粒的制备方法，所述重组蛋白G的序列是：5-ACTTACAAACTTGT CATTAATGGT AAAACATTGA AAGGCGAAAC AACTACTAAA GCAGTCGACG CAGAAACTGCAGAAAAAGCC TTCAAACAAT ACGCTAACGA CAACGGTGTC GATGGTGTGT GGACTTATGA TGATGCGACTAAGACCTTTA CGGTCACTGA A GGTTCA GGCGGAAGC GGCGGCGGAAGC GGAGGCTCA GGTAGCGGCACTT ACAAACTTGT CATTAATGGT AAAACATTGA AAGGCGAAAC AACTACTAAA GCAGTCGACGCAGAAACTGC AGAAAAAGCC TTCAAACAAT ACGCTAACGA CAACGGTGTC GATGGTGTGT GGACTTATGATGATGCGACT AAGACCTTTA CGGTCACTGA A-3，其特征在于，所述方法包括如下步骤：
a.构建细菌磁颗粒膜蛋白mamC/mamF基因缺失的趋磁细菌MSR-1突变株；
b.构建功能化细菌磁颗粒膜蛋白融合表达质粒；
c.将功能化细菌磁颗粒融合表达质粒通过接合转入到步骤a制得的趋磁细菌MSR-1突变株，构建趋磁细菌MSR-1重组株；
d.对趋磁细菌MSR-1重组株进行培养；具体包括如下步骤：
d-a.向培养罐中加入第一培养基，加热灭菌15-20min，加热温度为110-120℃，将趋磁细菌MSR-1重组株接种到培养罐中，无氧状态进行第一次培养，获得第一培养液；第一次培养的条件为：起始pH值为 5.3-5.5，培养温度为28-30℃，培养时间为1-2天，摇床转速为250-280转/分钟；
d-b.将第一培养液加入含有第二培养基的培养罐中，进行第二次培养；第二次培养的条件为：起始pH值为6.2-6.3，培养温度为20-22℃，培养时间为5-8天，摇床转速为150-180转/分钟，培养过程中通入氧气，通入氧气的方式为：间隔5min，通入20min氧气，间隔5min，通入10min空气，循环5次；所述第一培养基由重量份数为0.2-0.3份甘油酸三乙酯、1.5-3份多聚谷氨酸、0.2-0.3份磷酸吡哆醛、0.5-1份硝酸铵、0.02-0.05份维生素C、10-12份葡萄糖酸钙、0.2-0.3份十二烷基硫酸钠、0.5-1份月桂酰肌氨酸、0.5-1份成纤维细胞生长因子和1-2份琼脂组成；所述第二培养基由重量份数为1-1.5份硬脂酰肌氨酸、0.2-0.5份磷酸二氢钾、10-12份果聚糖、0.5-1份蛋白胨、0.1-0.3份碳酸钙、0.5-1份海藻酸钠、0.5-0.7份硫酸亚铁、1-2份脯氨酸和0.2-0.5份硫酸镁组成；
e.分离纯化，制得功能化细菌磁颗粒。
2.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤a所述构建细菌磁颗粒膜蛋白mamC/mamF基因缺失的趋磁细菌MSR-1突变株的具体方法为：
(a)扩增细菌磁颗粒膜蛋白mamC/mamF基因左右两侧共两个长均为700-1000bp的同源片段；左右两同源片段均带有两个酶切位点；
(b)左右同源片段分别用相应的限制性内切酶进行双酶切；同时对自杀质粒pKmobsacB进行双酶切；
(c)将经过双酶切后的左右同源片段和经过双酶切后的自杀质粒pKmobsacB进行连接，连接产物转到E.coli感受态细胞中，挑选连接正确的阳性克隆菌；
(d)将阳性克隆菌作为供体与趋磁细菌MSR-1受体菌进行亲本接合，并导入pKmobsacB重组质粒，通过卡那抗性筛选趋磁细菌MSR-1同源整合突变株，突变株再通过蔗糖梯度筛选趋磁细菌MSR-1双交换突变株，最后选择卡那抗性敏感的双交换菌株进行验证，构建成细菌磁颗粒膜蛋白mamC/mamF基因缺失的趋磁细菌MSR-1突变株；
步骤b所述细菌磁颗粒膜蛋白融合表达质粒的构建方法如下：
(1)扩增细菌磁颗粒膜蛋白mamC/mamF基因跨膜结构域的DNA片段，所述DNA片段两端分别带有双酶切位点；对扩增产物DNA片段及pBBR质粒进行双酶切，回收双酶切的DNA片段及双酶切的pBBR质粒；将双酶切的DNA片段与双酶切的pBBR质粒进行连接，连接产物转化大肠杆菌感受态细胞中，筛选连接正确的阳性克隆，得到重组质粒pBBR-细菌磁颗粒膜蛋白mamC/mamF基因；
(2)重组蛋白G的编码序列克隆在pUC57载体上，在两端分别加上双酶切位点，制得重组蛋白G质粒；
(3)对步骤(2)基因合成得到的重组蛋白G质粒进行扩增和双酶切；
(4)对步骤(1)得到的重组质粒pBBR-细菌磁颗粒膜蛋白mamC/mamF基因进行双酶切并纯化，和步骤(3)得到的经过双酶切的重组蛋白G质粒的基因片段进行连接，连接产物转化大肠杆菌感受态细胞中，筛选并验证连接正确的阳性克隆，最终得到细菌磁颗粒膜蛋白融合表达质粒pBBR-细菌磁颗粒膜蛋白mamC/mamF基因-重组蛋白G；
步骤c所述的具体方法为：
以细菌磁颗粒膜蛋白融合表达质粒pBBR-细菌磁颗粒膜蛋白mamC/mamF基因-重组蛋白G作为供体，通过亲本接合实验将其导入到 细菌磁颗粒膜蛋白mamC/mamF基因缺失的趋磁细菌MSR-1突变株，构建生产功能化细菌磁颗粒的趋磁细菌MSR-1重组株。
3.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述分离纯化具体步骤如下：
1)离心并收集培养后的趋磁细菌MSR-1重组株，用磷酸盐缓冲液悬浮，得悬浮液；
2)超声波破碎悬浮液中的细胞；
3)磁铁吸附破碎后的细胞，静置过夜，弃去上清，用磷酸盐缓冲液重新悬浮吸附到的沉淀，超声波清洗，磁铁再次吸附，弃上清，将吸附到的沉淀用磷酸盐缓冲液悬浮，洗涤3次，即得功能化细菌磁颗粒；
离心条件为：转速10500-11500rpm，离心时间10-12min；超声波破碎条件为：超声功率360-375w，超声时间3-5s，间隔时间2s，超声次数45次；超声波清洗条件为：超声功率130w，超声时间3-5s，间隔时间1s，超声次数30次。
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