CN108203704A - 一种定向修饰肽核酸的生物纳米磁珠及其mRNA提取应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种定向修饰肽核酸的生物纳米磁珠及其mRNA提取应用，该磁珠由链亲和蛋白SA通过柔性linker多肽链与细菌磁颗粒的膜蛋白融合表达而成，其中，链亲和蛋白SA与生物素标记的肽核酸PNA探针偶联；本发明还提供了的定向修饰肽核酸的生物纳米磁珠在mRNA富集纯化及分离提取中的应用。本发明提供的定向修饰肽核酸的生物纳米磁珠通过柔性linker多肽链结合链亲和蛋白SA，能够使结合蛋白后的结构更加牢固，刚性增强，磁颗粒高效表达链亲和蛋白SA，链亲和蛋白SA利用细菌磁颗粒作为磁修饰；链亲和蛋白SA偶联生物素标记的肽核酸PNA探针能够有效用于mRNA的特异性富集捕获，实现专门分离提取mRNA的效。

Description

一种定向修饰肽核酸的生物纳米磁珠及其mRNA提取应用
技术领域
本发明涉及功能性纳米磁珠制备应用和生物技术领域，特别涉及一种定向修饰肽核酸的生物纳米磁珠及其mRNA提取应用。
背景技术
生物纳米磁珠是趋磁细菌生产的一种磁性纳米颗粒，也称为细菌磁颗粒，内核是Fe3O4晶体，外面有一层磷脂生物膜包被，粒径在30-120nm之间。同一种趋磁细菌生产的生物纳米磁珠，它们的粒径大小和晶体晶型基本一致，磁学性质均一，有天然生物膜包被，具有很好的水溶性质，胶体性质和生物相容性。生物纳米磁珠表面质膜和膜蛋白上带大量的功能基团，可通过化学修饰和双功能偶联剂连接不同的功能大分子，如抗体，从而具有不同的特殊功能。细菌磁颗粒最独特的地方在于它可以通过基因工程的方法在表面膜上表达特殊的蛋白质及多肽分子，成为具有特殊生物活性的功能性生物纳米磁珠。
链亲和蛋白(streptavidin，SA)，也称为链亲和素，是链霉菌的分泌蛋白，能与生物素特异结合，性能和效果高于鸡蛋清中的亲和素蛋白。亲和蛋白-生物素系统中的相互作用是目前已知最强的非共价作用，比抗原抗体之间的亲和力还要强。因此，该系统可用于微量检测及标记示踪等新技术开发方面，特别是在免疫标记，生物反应级联放大，以及亲和分离纯化等方面有广泛的应用。链亲和蛋白是一种四聚体蛋白，由四条相同的肽链组成，每条肽链能结合一个生物素，虽然是糖蛋白，但是它不带任何糖基，与鸡蛋清的亲和蛋白一样。在蛋白水解酶的作用下，链亲和蛋白可在N端10～12和C端19～21间断裂，形成的核心链亲和蛋白仍保持完成的结合生物素的能力。
肽核酸(PNA)，是一类以多肽骨架取代糖磷酸主链的DNA类似物，具体是肽链酰胺2-氨基乙基甘氨酸键取代磷酸二酯键。关键的是，PNA可以通过碱基配对的形式识别并结合DNA或RNA序列，成为稳定的双螺旋结构。由于PNA具有诸多核酸分子不具备的优点，在生物技术和医学领域找到很多用途，如核酸分子捕获富集，分子探针，核酸药物载体等。随着PNA专利保护逐渐到期，PNA的合成和应用将会迎来更多的机遇。
目前，现有技术中公开了利用偶联剂或交联剂将蛋白直接连接在细菌磁颗粒上构建磁性复合物，但是这种方法形成的功能性生物纳米磁珠结构不够牢固，刚性较低，此外，现有技术中还没有公开通过定向修饰肽核酸的生物纳米磁珠提取mRN的应用。
发明内容
为了解决现有技术中存在的上述问题，本发明公开了一种利用生物纳米磁珠表面质膜和膜蛋白上带大量的功能基团，通过基因工程的方法在生物纳米磁珠膜上表达展示链亲和蛋白，同时链亲和蛋白与生物素标记的多聚胸腺嘧啶PNA(poly T-PNA)偶联的定向修饰肽核酸的生物纳米磁珠及其mRNA提取应用。
本发明具体技术方案如下：
本发明提供了一种定向修饰肽核酸的生物纳米磁珠，所述生物纳米磁珠由链亲和蛋白SA通过柔性linker多肽链与细菌磁颗粒的膜蛋白融合表达而成，其中，所述链亲和蛋白SA与生物素标记的肽核酸PNA探针偶联。
本发明提供的生物纳米磁珠通过柔性linker多肽链融合链亲和蛋白SA，融合结构更加牢固，与现有的通过偶联或其他方式直接将蛋白融合磁珠相比，刚性增强，此外，链亲和蛋白SA与生物素标记的肽核酸PNA探针偶联能够有效通过生物素标记的肽核酸PNA探针实现核酸分子、分子探针、核酸药物载体等捕获富集，因此该磁珠可以广泛应用于生物技术和医学领域。
进一步的，所述柔性linker多肽链的氨基酸序列为GASGLYWLGA SAGGALSWLLGAASLYWSGL。
柔性linker多肽链能够增强磁珠与蛋白融合的刚性，稳定链亲和蛋白SA与磁珠的空间结构，有效克服了磁珠膜蛋白与链亲和蛋白SA之间存在着相互影响的技术问题。
进一步的，所述链亲和蛋白SA的基因序列为5-GCAGAAGCAG GCATCACTGGCACGTGGTAT AACCAGCTGG GTTCCACGTT CATTGTAACT GCCGGCGCAG ACGGTGCACT GACTGGTACGTACGAGTCCG CGGTGGGCAA CGCAGAGAGC CGTTATGTTC TGACGGGCCG CTACGACTCT GCACCAGCTACGGATGGTTC CGGTACTGCT CTGGGTTGGA CGGTGGCATG GAAGAACAAC TACCGTAACG CACATTCTGCGACGACTTGG TCTGGCCAGT ACGTAGGTGG TGCAGAGGCA CGTATCAACA CGCAGTGGCT GCTGACGTCCGGCACGACGG AGGCGAACGC ATGGAAATCT ACGCTGGTGG GTCACGACAC GTTCACTAAG GTGAAGCCATCTGCC-3。
本发明还提供了所述的定向修饰肽核酸的生物纳米磁珠在mRNA富集纯化及分离提取中的应用。
本发明还提供了一种定向修饰肽核酸的生物纳米磁珠的制备方法，所述制备方法包括以下步骤：
S1、构建细菌磁颗粒膜蛋白MamC和MamF基因缺失的趋磁细菌MSR-1突变株为一级重组菌株；
S2、构建链亲和蛋白SA通过柔性linker多肽链与缺失的所述细菌磁颗粒膜蛋白MamC或MamF基因融合表达载体，将所述融合表达载体导入步骤S1制得所述一级重组菌株中，筛选表达二级重组菌株；
S3、对所述二级重组菌株进行培养即得到表达展示链亲和蛋白SA的功能性生物纳米磁珠；
S4、将步骤S3培养得到所述功能性生物纳米磁珠通过与生物素标记的肽核酸PNA探针偶联，即得到定向修饰肽核酸的生物纳米磁珠。
经过大量的实验验证表明，细菌磁颗粒中MamC和MamF基因同时缺失部分膜蛋白，并不会造成纳米磁珠产量的下降，而且这两个蛋白的表达水平相近，构建双突变体有利于充分发挥蛋白作为新融合蛋白表达的骨架，而且融合构建后的磁珠结构更加稳定。
进一步的，所述步骤S1包括如下步骤：
S1.1：分别对缺失的所述细菌磁颗粒膜蛋白MamC和MamF基因两侧500bp的同源DNA片段进行扩增，通过分子克隆构建两条微载体；
S1.2：将两条所述微载体通过电转化的方式同时转入MSR-I野生型菌株中；
S1.3：对电转化后的所述MSR-I野生型菌株进行筛选和鉴定，获得缺失所述细菌磁颗粒膜蛋白MamC和MamF基因的趋磁细菌MSR-1突变株，即为一级重组菌株。
进一步的，所述步骤S2包括如下步骤：
S2.1：对所述链亲和蛋白SA的基因序列进行PCR扩增；
S2.2：用EcoRI/BamHI对扩增产物和表达载体pBBR-RC分别进行双酶切，回收双酶切的所述扩增产物和所述表达载体pBBR-RC；
S2.3：将经过双酶切的所述扩增产物与通过柔性linker多肽链与缺失的所述细菌磁颗粒膜蛋白MamC或MamF基因融合，并连接到同样经过双酶切的所述表达载体pBBR-RC，得到pBRC-SA表达质粒，其中，所述柔性linker多肽链的氨基酸序列为GASGLYWLGASAGGALSWLL GAASLYWSGL；
S2.4：通过电转化的方式将所述pBRC-SA表达质粒转入至所述一级重组菌株中，经过筛选验证得到二级重组菌株；
优选的，步骤S2.4的具体步骤如下：
S2.4.1、使用PBS缓冲液调节所述pBRC-SA表达质粒的浓度为2mg/mL，待用；
S2.4.2、配置浓度为15％的甘油缓冲液为洗涤缓冲液，配置好后灭菌处理，置于-20℃冷冻备用；
S2.4.3、将所述一级重组菌株培养过夜，离心收集菌体，用PBS缓冲液重悬菌泥洗涤2次；
S2.4.4、再次离心收集菌体后，用15％的甘油缓冲液以重悬比例为1g菌泥用150-200mL的甘油缓冲液重悬菌泥，然后在-20℃冷柜中放置30min，期间晃动或轻微涡旋处理1-2次，使菌体保持重悬状态；
S2.4.5、用4000g的离心力4度离心20min，轻轻倒去上清缓冲液，保留2ml左右的上清液，用移液器轻轻将菌泥重悬起来，按照100μL每EP管分装，即获得电转化感受态菌株；
S2.4.6、将制备的所述电转化感受态菌株放入液氮中迅速冷冻，然后置于-80℃冰箱中保存；
S2.4.7、电转化时，取出所述电转化感受态菌株，置于冰上待其溶解；
S2.4.8、加入1-2μL浓度为2mg/mL的所述pBRC-SA表达质粒，轻轻混匀，将混合物置于1mm电转化杯中进行电转化处理；
S2.4.9、电转化结束后，迅速往电转化杯里加入100μL血清培养基，混匀后，用移液器吸出转移到EP管中，37℃摇床培养1-2h；
S2.4.10、将培养产物涂布在含有庆大霉素和卡那霉素抗生素的培养基平板上进行筛选培养，对生长的单菌落细菌进行转接培养，并验证是否将所述pBRC-SA表达质粒成功转化到所述一级重组菌株中，成功转化并能正确表达所述链亲和蛋白SA的菌株即为二级重组菌株。
进一步的，所述步骤S3包括如下步骤：
S3.1：使用200-500mL培养基在氧气含量5-10％、氮气含量90-95％、培养温度37℃的培养条件预培养16小时；
S3.2：将经过预培养的菌株转接到发酵罐中，在培养温度37℃、氧气含量5％、氢气含量1％及氮气含量94％的培养条件下深层培养3～4天；
S3.3：通过均质设备对深层培养物进行处理、将菌体粉碎，通过磁装置吸附细菌磁颗粒，并用磷酸缓冲液洗涤2～3次；
S3.4：用超声波及蛋白酶缓冲液进行梯度处理，最终得到纯化后的功能性生物纳米磁珠；
本发明提供的培养步骤不但能够提高对趋磁细菌MSR-1重组株的扩增能力，同时能够增强细菌磁颗粒对链亲和蛋白SA的表达能力。
优选的，所述预培养中使用的培养基包括如下重量份数的成分：
8-15份蛋白胨、1-5份脂肪酸乳酰脂、2-6份地衣多糖、3-8份糖基化蛋白质、0.5-1.2份海藻酸钾、1-2份醋酸纤维素；
所述深层培养中使用的培养基包括如下重量份数的成分：15-20份牛肉膏、1-8份肽聚糖、2-6份地衣多糖、1-3份双磷脂酰甘油、1-2份氢化豆磷脂、0.5-1.8份海藻酸铵、0.5-0.8份柠檬酸钠。
通过上述对预培养中培养基的限定，可以有效提高细菌的活性，从而提高后续培养中的增殖能力和存活能力；此外，本发明通过对深层培养中的培养基的限定，使用上述培养基对预培养后的二级重组菌株进行深层培养，可以有效提高细菌的抗逆性和对链亲和蛋白SA融合表达质粒的承载能力，促进细菌的增殖以及链亲和蛋白SA的同时表达。
进一步的，所述步骤S4包括如下步骤：
S4.1：将合成的肽核酸PNA干粉溶于pH为8.0的水中，加入等体积的标记缓冲液，使其最终浓度为10mM；
S4.2：加入20μL100mM的NH2-Biotin，轻轻吹打混匀，置于培养箱中在温度为37℃的条件下避光孵育30分钟，转入过滤管中12000g离心15min，加入适量标记缓冲液，混匀后12000g离心15min；
S4.3：加入适量标记缓冲液，将过滤管中的滤芯倒置，转入新的离心管中，6000g离心10min，收集生物素标记的肽核酸PNA探针；
S4.4：将步骤S3培养得到所述功能性生物纳米磁珠用磷酸缓冲液洗涤2次，溶于MES缓冲液中，加入步骤S4.3得到的所述生物素标记的肽核酸PNA探针，室温反应1h后，用磁力架吸附磁珠，用磷酸缓冲液洗涤2次，溶于pH7.5的TBS缓冲液中，即得到定向修饰肽核酸的生物纳米磁珠。
通过上述方法能够实现融合有链亲和蛋白SA的生物纳米磁珠与生物素标记的肽核酸PNA有效偶联。
进一步的，所述电转化的具体方法如下：
采用方波电脉冲，在3100～3200V条件下，进行1～2次时长为3.1～3.3ms电脉冲。
本发明通过电转化的方式克服了现有的亲本接合的方式造成的转移基因的缺少，特别是对大片段基因的质粒。电穿孔转化的方式，是通过瞬时电流在细胞上形成的孔洞，使得溶液中的DNA基因片段能够通过孔洞进入细胞内，完成转化。电转化最大的难点是，每种细胞对电流的适应能力不一样，电流过小不能形成孔洞，或形成孔洞时间短，不利于基因转移，电流过大时间过长则容易对细胞造成不可逆的损伤或者导致细胞死亡。因此，针对每种不同的细菌或细胞需要摸索合适的条件，本发明通过大量的试验验证了，针对MSR-I细菌，采用方波电脉冲，在3100～3200V条件下，进行1～2次时长为3.1～3.3ms电脉冲能够使DNA转化成功率和细菌成活率均较高。
本发明的有益效果如下：本发明提供的定向修饰肽核酸的生物纳米磁珠通过柔性linker多肽链结合链亲和蛋白SA，能够使结合蛋白后的结构更加牢固，刚性增强，磁颗粒高效表达链亲和蛋白SA，链亲和蛋白SA利用细菌磁颗粒作为磁修饰，同时，链亲和蛋白SA偶联生物素标记的肽核酸PNA探针能够有效用于mRNA的特异性富集捕获，实现专门分离提取mRNA的效果，由于PNA具有诸多核酸分子不具备的优点，在生物技术和医学领域找到很多用途，如核酸分子捕获富集，分子探针，核酸药物载体等，此外，通过本发明提供的制备方法制备的磁珠产量高，同时通过本发明提供的培养基对菌株培养过程中，可以有效提高细菌的活性和抗逆性，增强细菌对链亲和蛋白SA表达质粒的承载能力，促进细菌的增值及链亲和蛋白SA的表达。
附图说明
图1为实验1中各组生物纳米磁珠的荧光强度衰减曲线。
具体实施方式
下面结合以下实施例对本发明作进一步详细说明。
实施例1
本发明实施例1提供了一种定向修饰肽核酸的生物纳米磁珠，所述生物纳米磁珠由链亲和蛋白SA通过柔性linker多肽链与细菌磁颗粒的膜蛋白融合表达而成，其中，所述链亲和蛋白SA与生物素标记的肽核酸PNA探针偶联。
实施例2
本发明实施例2提供了一种定向修饰肽核酸的生物纳米磁珠，所述生物纳米磁珠由链亲和蛋白SA通过柔性linker多肽链与细菌磁颗粒的膜蛋白融合表达而成，其中，所述链亲和蛋白SA与生物素标记的肽核酸PNA探针偶联。
所述柔性linker多肽链的氨基酸序列为GASGLYWLGA SAGGALSWLL GAASLYWSGL。
实施例3
本发明实施例3提供了一种定向修饰肽核酸的生物纳米磁珠，所述生物纳米磁珠由链亲和蛋白SA通过柔性linker多肽链与细菌磁颗粒的膜蛋白融合表达而成，其中，所述链亲和蛋白SA与生物素标记的肽核酸PNA探针偶联。
所述柔性linker多肽链的氨基酸序列为GASGLYWLGA SAGGALSWLL GAASLYWSGL。
所述链亲和蛋白SA的基因序列为5-GCAGAAGCAG GCATCACTGG CACGTGGTATAACCAGCTGG GTTCCACGTT CATTGTAACT GCCGGCGCAG ACGGTGCACT GACTGGTACG TACGAGTCCGCGGTGGGCAA CGCAGAGAGC CGTTATGTTC TGACGGGCCG CTACGACTCT GCACCAGCTA CGGATGGTTCCGGTACTGCT CTGGGTTGGA CGGTGGCATG GAAGAACAAC TACCGTAACG CACATTCTGC GACGACTTGGTCTGGCCAGT ACGTAGGTGG TGCAGAGGCA CGTATCAACA CGCAGTGGCT GCTGACGTCC GGCACGACGGAGGCGAACGC ATGGAAATCT ACGCTGGTGG GTCACGACAC GTTCACTAAG GTGAAGCCAT CTGCC-3。
实施例4
本发明实施例4提供了一种实施例1-3任一个提供的定向修饰肽核酸的生物纳米磁珠在mRNA富集纯化及分离提取中的应用。
实施例5
本发明实施例5提供了一种定向修饰肽核酸的生物纳米磁珠，所述生物纳米磁珠由链亲和蛋白SA通过柔性linker多肽链与细菌磁颗粒的膜蛋白融合表达而成，其中，所述链亲和蛋白SA与生物素标记的肽核酸PNA探针偶联。
上述提供的定向修饰肽核酸的生物纳米磁珠的制备方法，所述制备方法包括以下步骤：
S1、构建细菌磁颗粒膜蛋白MamC和MamF基因缺失的趋磁细菌MSR-1突变株为一级重组菌株；
S2、构建链亲和蛋白SA通过柔性linker多肽链与缺失的所述细菌磁颗粒膜蛋白MamC或MamF基因融合表达载体，将所述融合表达载体导入步骤S1制得所述一级重组菌株中，筛选表达二级重组菌株；
S3、对所述二级重组菌株进行培养即得到表达展示链亲和蛋白SA的功能性生物纳米磁珠；
S4、将步骤S3培养得到所述功能性生物纳米磁珠通过与生物素标记的肽核酸PNA探针偶联，即得到定向修饰肽核酸的生物纳米磁珠。
实施例6
本发明实施例6提供了一种定向修饰肽核酸的生物纳米磁珠的制备方法，所述制备方法包括以下步骤：
S1、构建细菌磁颗粒膜蛋白MamC和MamF基因缺失的趋磁细菌MSR-1突变株为一级重组菌株；
所述步骤S1包括如下步骤：
S1.1：分别对缺失的所述细菌磁颗粒膜蛋白MamC和MamF基因两侧500bp的同源DNA片段进行扩增，通过分子克隆构建两条微载体；
S1.2：将两条所述微载体通过电转化的方式同时转入MSR-I野生型菌株中；
S1.3：对电转化后的所述MSR-I野生型菌株进行筛选和鉴定，获得缺失所述细菌磁颗粒膜蛋白MamC和MamF基因的趋磁细菌MSR-1突变株，即为一级重组菌株。
S2、构建链亲和蛋白SA通过柔性linker多肽链与缺失的所述细菌磁颗粒膜蛋白MamC或MamF基因融合表达载体，将所述融合表达载体导入步骤S1制得所述一级重组菌株中，筛选表达二级重组菌株；
S3、对所述二级重组菌株进行培养即得到表达展示链亲和蛋白SA的功能性生物纳米磁珠；
S4、将步骤S3培养得到所述功能性生物纳米磁珠通过与生物素标记的肽核酸PNA探针偶联，即得到定向修饰肽核酸的生物纳米磁珠。
实施例7
本发明实施例7提供了一种定向修饰肽核酸的生物纳米磁珠的制备方法，所述制备方法包括以下步骤：
S1、构建细菌磁颗粒膜蛋白MamC和MamF基因缺失的趋磁细菌MSR-1突变株为一级重组菌株；
所述步骤S1包括如下步骤：
S1.1：分别对缺失的所述细菌磁颗粒膜蛋白MamC和MamF基因两侧500bp的同源DNA片段进行扩增，通过分子克隆构建两条微载体；
S1.2：将两条所述微载体通过电转化的方式同时转入MSR-I野生型菌株中；
S1.3：对电转化后的所述MSR-I野生型菌株进行筛选和鉴定，获得缺失所述细菌磁颗粒膜蛋白MamC和MamF基因的趋磁细菌MSR-1突变株，即为一级重组菌株；
所述电转化的具体方法如下：
采用方波电脉冲，在3100V条件下，进行1次时长为3.1ms电脉冲；
S2、构建链亲和蛋白SA通过柔性linker多肽链与缺失的所述细菌磁颗粒膜蛋白MamC或MamF基因融合表达载体，将所述融合表达载体导入步骤S1制得所述一级重组菌株中，筛选表达二级重组菌株；
S3、对所述二级重组菌株进行培养即得到表达展示链亲和蛋白SA的功能性生物纳米磁珠；
S4、将步骤S3培养得到所述功能性生物纳米磁珠通过与生物素标记的肽核酸PNA探针偶联，即得到定向修饰肽核酸的生物纳米磁珠。
实施例8
本发明实施例8提供了一种定向修饰肽核酸的生物纳米磁珠的制备方法，所述制备方法包括以下步骤：
S1、构建细菌磁颗粒膜蛋白MamC和MamF基因缺失的趋磁细菌MSR-1突变株为一级重组菌株；
S2、构建链亲和蛋白SA通过柔性linker多肽链与缺失的所述细菌磁颗粒膜蛋白MamC或MamF基因融合表达载体，将所述融合表达载体导入步骤S1制得所述一级重组菌株中，筛选表达二级重组菌株；
所述步骤S2包括如下步骤：
S2.1：对所述链亲和蛋白SA的基因序列进行PCR扩增；
S2.2：用EcoRI/BamHI对扩增产物和表达载体pBBR-RC分别进行双酶切，回收双酶切的所述扩增产物和所述表达载体pBBR-RC；
S2.3：将经过双酶切的所述扩增产物与通过柔性linker多肽链与缺失的所述细菌磁颗粒膜蛋白MamC或MamF基因融合，并连接到同样经过双酶切的所述表达载体pBBR-RC，得到pBRC-SA表达质粒，其中，所述柔性linker多肽链的氨基酸序列为GASGLYWLGASAGGALSWLL GAASLYWSGL；
S2.4：通过电转化的方式将所述pBRC-SA表达质粒转入至所述一级重组菌株中，经过筛选验证得到二级重组菌株；
S3、对所述二级重组菌株进行培养即得到表达展示链亲和蛋白SA的功能性生物纳米磁珠；
S4、将步骤S3培养得到所述功能性生物纳米磁珠通过与生物素标记的肽核酸PNA探针偶联，即得到定向修饰肽核酸的生物纳米磁珠。
实施例9
本发明实施例9提供了一种定向修饰肽核酸的生物纳米磁珠的制备方法，所述制备方法包括以下步骤：
S1、构建细菌磁颗粒膜蛋白MamC和MamF基因缺失的趋磁细菌MSR-1突变株为一级重组菌株；
S2、构建链亲和蛋白SA通过柔性linker多肽链与缺失的所述细菌磁颗粒膜蛋白MamC或MamF基因融合表达载体，将所述融合表达载体导入步骤S1制得所述一级重组菌株中，筛选表达二级重组菌株；
所述步骤S2包括如下步骤：
S2.1：对所述链亲和蛋白SA的基因序列进行PCR扩增；
S2.2：用EcoRI/BamHI对扩增产物和表达载体pBBR-RC分别进行双酶切，回收双酶切的所述扩增产物和所述表达载体pBBR-RC；
S2.3：将经过双酶切的所述扩增产物与通过柔性linker多肽链与缺失的所述细菌磁颗粒膜蛋白MamC或MamF基因融合，并连接到同样经过双酶切的所述表达载体pBBR-RC，得到pBRC-SA表达质粒，其中，所述柔性linker多肽链的氨基酸序列为GASGLYWLGASAGGALSWLL GAASLYWSGL；
S2.4：通过电转化的方式将所述pBRC-SA表达质粒转入至所述一级重组菌株中，经过筛选验证得到二级重组菌株；
步骤S2.4的具体步骤如下：
S2.4.1、使用PBS缓冲液调节所述pBRC-SA表达质粒的浓度为2mg/mL，待用；
S2.4.2、配置浓度为15％的甘油缓冲液为洗涤缓冲液，配置好后灭菌处理，置于-20℃冷冻备用；
S2.4.3、将所述一级重组菌株培养过夜，离心收集菌体，用PBS缓冲液重悬菌泥洗涤2次；
S2.4.4、再次离心收集菌体后，用15％的甘油缓冲液以重悬比例为1g菌泥用150-200mL的甘油缓冲液重悬菌泥，然后在-20℃冷柜中放置30min，期间晃动或轻微涡旋处理1-2次，使菌体保持重悬状态；
S2.4.5、用4000g的离心力4度离心20min，轻轻倒去上清缓冲液，保留2ml左右的上清液，用移液器轻轻将菌泥重悬起来，按照100μL每EP管分装，即获得电转化感受态菌株；
S2.4.6、将制备的所述电转化感受态菌株放入液氮中迅速冷冻，然后置于-80℃冰箱中保存；
S2.4.7、电转化时，取出所述电转化感受态菌株，置于冰上待其溶解；
S2.4.8、加入1-2μL浓度为2mg/mL的所述pBRC-SA表达质粒，轻轻混匀，将混合物置于1mm电转化杯中进行电转化处理；
S2.4.9、电转化结束后，迅速往电转化杯里加入100μL血清培养基，混匀后，用移液器吸出转移到EP管中，37℃摇床培养1-2h；
S2.4.10、将培养产物涂布在含有庆大霉素和卡那霉素抗生素的培养基平板上进行筛选培养，对生长的单菌落细菌进行转接培养，并验证是否将所述pBRC-SA表达质粒成功转化到所述一级重组菌株中，成功转化并能正确表达所述链亲和蛋白SA的菌株即为二级重组菌株；
所述电转化的具体方法如下：
采用方波电脉冲，在3200V条件下，进行2次时长为3.3ms电脉冲；
S3、对所述二级重组菌株进行培养即得到表达展示链亲和蛋白SA的功能性生物纳米磁珠；
S4、将步骤S3培养得到所述功能性生物纳米磁珠通过与生物素标记的肽核酸PNA探针偶联，即得到定向修饰肽核酸的生物纳米磁珠。
实施例10
本发明实施例10提供了一种定向修饰肽核酸的生物纳米磁珠的制备方法，所述制备方法包括以下步骤：
S1、构建细菌磁颗粒膜蛋白MamC和MamF基因缺失的趋磁细菌MSR-1突变株为一级重组菌株；
S2、构建链亲和蛋白SA通过柔性linker多肽链与缺失的所述细菌磁颗粒膜蛋白MamC或MamF基因融合表达载体，将所述融合表达载体导入步骤S1制得所述一级重组菌株中，筛选表达二级重组菌株；
S3、对所述二级重组菌株进行培养即得到表达展示链亲和蛋白SA的功能性生物纳米磁珠；
所述步骤S3包括如下步骤：
S3.1：使用200mL培养基在氧气含量5％、氮气含量95％、培养温度37℃的培养条件预培养16小时；
S3.2：将经过预培养的菌株转接到发酵罐中，在培养温度37℃、氧气含量5％、氢气含量1％及氮气含量94％的培养条件下深层培养3～4天；
S3.3：通过均质设备对深层培养物进行处理、将菌体粉碎，通过磁装置吸附细菌磁颗粒，并用磷酸缓冲液洗涤2～3次；
S3.4：用超声波及蛋白酶缓冲液进行梯度处理，最终得到纯化后的功能性生物纳米磁珠；
S4、将步骤S3培养得到所述功能性生物纳米磁珠通过与生物素标记的肽核酸PNA探针偶联，即得到定向修饰肽核酸的生物纳米磁珠。
实施例11
本发明实施例11提供了一种定向修饰肽核酸的生物纳米磁珠的制备方法，所述制备方法包括以下步骤：
S1、构建细菌磁颗粒膜蛋白MamC和MamF基因缺失的趋磁细菌MSR-1突变株为一级重组菌株；
S2、构建链亲和蛋白SA通过柔性linker多肽链与缺失的所述细菌磁颗粒膜蛋白MamC或MamF基因融合表达载体，将所述融合表达载体导入步骤S1制得所述一级重组菌株中，筛选表达二级重组菌株；
S3、对所述二级重组菌株进行培养即得到表达展示链亲和蛋白SA的功能性生物纳米磁珠；
所述步骤S3包括如下步骤：
S3.1：使用500mL培养基在氧气含量10％、氮气含量90％、培养温度37℃的培养条件预培养16小时；所述预培养中使用的培养基包括如下重量份数的成分：
8份蛋白胨、1份脂肪酸乳酰脂、2份地衣多糖、3份糖基化蛋白质、0.5份海藻酸钾、1份醋酸纤维素；
S3.2：将经过预培养的菌株转接到发酵罐中，在培养温度37℃、氧气含量5％、氢气含量1％及氮气含量94％的培养条件下深层培养3～4天；
S3.3：通过均质设备对深层培养物进行处理、将菌体粉碎，通过磁装置吸附细菌磁颗粒，并用磷酸缓冲液洗涤2～3次；所述深层培养中使用的培养基包括如下重量份数的成分：15份牛肉膏、1份肽聚糖、2份地衣多糖、1份双磷脂酰甘油、1份氢化豆磷脂、0.5份海藻酸铵、0.5份柠檬酸钠；
S3.4：用超声波及蛋白酶缓冲液进行梯度处理，最终得到纯化后的功能性生物纳米磁珠；
S4、将步骤S3培养得到所述功能性生物纳米磁珠通过与生物素标记的肽核酸PNA探针偶联，即得到定向修饰肽核酸的生物纳米磁珠。
实施例12
本发明实施例12提供了一种定向修饰肽核酸的生物纳米磁珠的制备方法，所述制备方法包括以下步骤：
S1、构建细菌磁颗粒膜蛋白MamC和MamF基因缺失的趋磁细菌MSR-1突变株为一级重组菌株；
S2、构建链亲和蛋白SA通过柔性linker多肽链与缺失的所述细菌磁颗粒膜蛋白MamC或MamF基因融合表达载体，将所述融合表达载体导入步骤S1制得所述一级重组菌株中，筛选表达二级重组菌株；
S3、对所述二级重组菌株进行培养即得到表达展示链亲和蛋白SA的功能性生物纳米磁珠；
所述步骤S3包括如下步骤：
S3.1：使用300mL培养基在氧气含量8％、氮气含量92％、培养温度37℃的培养条件预培养16小时；所述预培养中使用的培养基包括如下重量份数的成分：
15份蛋白胨、5份脂肪酸乳酰脂、6份地衣多糖、8份糖基化蛋白质、1.2份海藻酸钾、2份醋酸纤维素；
S3.2：将经过预培养的菌株转接到发酵罐中，在培养温度37℃、氧气含量5％、氢气含量1％及氮气含量94％的培养条件下深层培养3～4天；
S3.3：通过均质设备对深层培养物进行处理、将菌体粉碎，通过磁装置吸附细菌磁颗粒，并用磷酸缓冲液洗涤2～3次；所述深层培养中使用的培养基包括如下重量份数的成分：20份牛肉膏、8份肽聚糖、6份地衣多糖、3份双磷脂酰甘油、2份氢化豆磷脂、1.8份海藻酸铵、0.8份柠檬酸钠；
S3.4：用超声波及蛋白酶缓冲液进行梯度处理，最终得到纯化后的功能性生物纳米磁珠；
S4、将步骤S3培养得到所述功能性生物纳米磁珠通过与生物素标记的肽核酸PNA探针偶联，即得到定向修饰肽核酸的生物纳米磁珠。
实施例13
本发明实施例13提供了一种定向修饰肽核酸的生物纳米磁珠的制备方法，所述制备方法包括以下步骤：
S1、构建细菌磁颗粒膜蛋白MamC和MamF基因缺失的趋磁细菌MSR-1突变株为一级重组菌株；
S2、构建链亲和蛋白SA通过柔性linker多肽链与缺失的所述细菌磁颗粒膜蛋白MamC或MamF基因融合表达载体，将所述融合表达载体导入步骤S1制得所述一级重组菌株中，筛选表达二级重组菌株；
S3、对所述二级重组菌株进行培养即得到表达展示链亲和蛋白SA的功能性生物纳米磁珠；
所述步骤S3包括如下步骤：
S3.1：使用400mL培养基在氧气含量7％、氮气含量93％、培养温度37℃的培养条件预培养16小时；所述预培养中使用的培养基包括如下重量份数的成分：
10份蛋白胨、3份脂肪酸乳酰脂、4份地衣多糖、5份糖基化蛋白质、0.8份海藻酸钾、1.5份醋酸纤维素；
S3.2：将经过预培养的菌株转接到发酵罐中，在培养温度37℃、氧气含量5％、氢气含量1％及氮气含量94％的培养条件下深层培养3～4天；
S3.3：通过均质设备对深层培养物进行处理、将菌体粉碎，通过磁装置吸附细菌磁颗粒，并用磷酸缓冲液洗涤2～3次；所述深层培养中使用的培养基包括如下重量份数的成分：18份牛肉膏、6份肽聚糖、5份地衣多糖、2份双磷脂酰甘油、1.5份氢化豆磷脂、1份海藻酸铵、0.7份柠檬酸钠；
S3.4：用超声波及蛋白酶缓冲液进行梯度处理，最终得到纯化后的功能性生物纳米磁珠；
S4、将步骤S3培养得到所述功能性生物纳米磁珠通过与生物素标记的肽核酸PNA探针偶联，即得到定向修饰肽核酸的生物纳米磁珠。
实施例14
本发明实施例14提供了一种定向修饰肽核酸的生物纳米磁珠的制备方法，所述制备方法包括以下步骤：
S1、构建细菌磁颗粒膜蛋白MamC和MamF基因缺失的趋磁细菌MSR-1突变株为一级重组菌株；
S2、构建链亲和蛋白SA通过柔性linker多肽链与缺失的所述细菌磁颗粒膜蛋白MamC或MamF基因融合表达载体，将所述融合表达载体导入步骤S1制得所述一级重组菌株中，筛选表达二级重组菌株；
S3、对所述二级重组菌株进行培养即得到表达展示链亲和蛋白SA的功能性生物纳米磁珠；
S4、将步骤S3培养得到所述功能性生物纳米磁珠通过与生物素标记的肽核酸PNA探针偶联，即得到定向修饰肽核酸的生物纳米磁珠；
所述步骤S4包括如下步骤：
S4.1：将合成的肽核酸PNA干粉溶于pH为8.0的水中，加入等体积的标记缓冲液，使其最终浓度为10mM；
S4.2：加入20μL100mM的NH2-Biotin，轻轻吹打混匀，置于培养箱中在温度为37℃的条件下避光孵育30分钟，转入过滤管中12000g离心15min，加入适量标记缓冲液，混匀后12000g离心15min；
S4.3：加入适量标记缓冲液，将过滤管中的滤芯倒置，转入新的离心管中，6000g离心10min，收集生物素标记的肽核酸PNA探针；
S4.4：将步骤S3培养得到所述功能性生物纳米磁珠用磷酸缓冲液洗涤2次，溶于MES缓冲液中，加入步骤S4.3得到的所述生物素标记的肽核酸PNA探针，室温反应1h后，用磁力架吸附磁珠，用磷酸缓冲液洗涤2次，溶于pH7.5的TBS缓冲液中，即得到定向修饰肽核酸的生物纳米磁珠。
对照例1
对照例1提供了一种生物纳米磁珠，所述生物纳米磁珠柔性linker多肽链与细菌磁颗粒的膜蛋白融合表达而成，其中，所述链亲和蛋白SA与生物素标记的肽核酸PNA探针偶联。
所述柔性linker多肽链的氨基酸序列为GASSGLYLLA SAWLALSGAL LASSLYWSGL。
对照例2
对照例2与实施例5形成对照，与实施例5的区别在于，步骤S1中，构建细菌磁颗粒膜蛋白仅有MamC基因缺失的趋磁细菌MSR-1突变株为一级重组菌株。
对照例3
对照例3与实施例5形成对照，与实施例5的区别在于，步骤S1中，构建细菌磁颗粒膜蛋白MamC+MamD基因缺失的趋磁细菌MSR-1突变株为一级重组菌株。
对照例4
对照例4与实施例8形成对照，与实施例8的区别在于，步骤S2.4中，通过亲本接合的方式将所述pBRC-SA表达质粒转入至所述一级重组菌株中，经过筛选验证得到二级重组菌株。
对照例5
对照例5与实施例9形成对照，与实施例9的区别在于，所述电转化的具体方法如下：
采用方波电脉冲，在3500V条件下，进行2次时长为3.3ms电脉冲。
对照例6
对照例6与实施例9形成对照，与实施例9的区别在于，所述电转化的具体方法如下：
采用方波电脉冲，在3000V条件下，进行2次时长为3.3ms电脉冲。
对照例7
对照例7与实施例9形成对照，与实施例9的区别在于，所述电转化的具体方法如下：
采用方波电脉冲，在3050V条件下，进行2次时长为3.3ms电脉冲。
对照例8
对照例8与实施例9形成对照，与实施例9的区别在于，所述电转化的具体方法如下：
采用方波电脉冲，在3300V条件下，进行2次时长为3.3ms电脉冲。
对照例9
对照例9与实施例10形成对照，与实施例9的区别在于，所述步骤S3包括如下步骤：
S3.1：使用200mL培养基在氧气含量25％、氮气含量75％、培养温度37℃的培养条件预培养16小时；
S3.2：将经过预培养的菌株转接到发酵罐中，在培养温度37℃、氧气含量25％、氢气含量1％及氮气含量74％的培养条件下深层培养3～4天；
S3.3：通过均质设备对深层培养物进行处理、将菌体粉碎，通过磁装置吸附细菌磁颗粒，并用磷酸缓冲液洗涤2～3次；
S3.4：用超声波及蛋白酶缓冲液进行梯度处理，最终得到纯化后的功能性生物纳米磁珠；
对照例10
对照例10与实施例11形成对照，与实施例11的区别在于，步骤S3.1中所述预培养中使用的培养基包括如下重量份数的成分：
8份蛋白胨、2份地衣多糖、0.5份海藻酸钾、1份醋酸纤维素；
步骤S3.3中，所述深层培养中使用的培养基包括如下重量份数的成分：15份牛肉膏、2份地衣多糖、0.5份海藻酸铵、0.5份柠檬酸钠。
实验一：高温加速实验
以实施例1、2和5提供的生物纳米磁珠作为实验组，将对照例1提供的生物纳米磁珠作为对照组，每组样品做12组平行实验，按照将FITC标记的lgG抗体与生物纳米磁珠结合，将结合后的生物纳米磁珠置于37℃条件下，每组样品分别于第1～12天取出1份，用PBS缓冲液洗涤、磁力吸附后重悬，对FITC荧光强度进行检测，每次均与正常保存的试剂荧光强度进行比较，最后得到纳米磁珠试剂荧光强度的衰减曲线(如图1所示，衰减曲线图中横轴为时间(天)，纵轴为衰减率(％))，并与4℃正常保存的试剂进行比较。
如图1所示，与对照组1相比，实验组中各组的生物纳米磁珠在12天时仍能保持原有活性的70％以上，通常认为37℃下放置1天大约相当于4℃下放置40天，并且生物纳米磁珠荧光强度衰减35％以下均认为符合性能标准。由此可以认为，本发明提供的生物纳米磁珠中通过柔性linker多肽链融合蛋白，能够在4℃下放置一年仍能满足性能标准，说明其具有良好的稳定性、可以满足使用需求，相比实施例1，实施例2中提供的柔性linker多肽链能够使磁珠的衰减程度降低，稳定性更好，此外，与实施例1相比，通过实施例5提供的生产方法制备的磁珠，磁珠的衰减程度降低，因此，通过实施例5提供的方法能够有效提高磁珠结构的稳定性，从而使链亲和蛋白SA与细菌磁颗粒的膜蛋白形成的结构刚性更强。
实验二：生物纳米磁珠提取mRNA比较试验
以实施例1和5提供的生物纳米磁珠作为实验组1～2，以对照例1提供的生物纳米磁珠作为对照组1，使用上述各组生物纳米磁珠按照以下方法分别用于提取mRNA。
a)将从样品中提取的1-3mg总RNA，分别取出3份，用0.5xSSC结合缓冲液稀释混匀，65℃水浴5分钟；
b)每份总RNA中，分别加入20μL实施例1和5、对照例1和2中提供的生物纳米磁珠，轻轻吹打混匀，室温置于200rpm振荡混匀30分钟，每隔5-10分钟用涡旋振荡1次；
c)用磁力架吸附磁珠，用0.1xSSC缓冲液洗涤磁珠2次，然后用75％乙醇洗涤一次，吸干液体；
d)加入mRNA洗脱缓冲液，震荡30秒，置于70℃水浴5分钟，迅速用磁力架吸附磁珠，取上清即为提取的mRNA。
根据提取的mRNA，计算各组纳米磁珠的mRNA载量。实验结果如表1所示。
表1各组纳米磁珠的mRNA载量
组别 mRNA载量(μg/mg)
实验组1 135
实验组2 142
对照组1 79
由表1可知，实验组各组生物纳米磁珠的mRNA载量显著高于对照组。表明本发明在生物纳米磁珠膜蛋白上通过柔性linker多肽链重组表达重组蛋白，可以有效提高mRNA载量、提高实验分析结果的可靠性。
实验三：膜蛋白基因缺失比较实验
以实施例5提供的方法作为实验组，以对照例2和3提供的方法作为对照组1和2，分别采用上述方法对趋磁细菌MSR-Ⅰ进行培养，以野生型菌株作为阳性对照，对各组细菌的磁珠产量进行测定和比较。实验结果如表2所示。
表2各组培养物每升培养基中纳米磁珠的产量
组别 纳米磁珠含量(mg) 占比(％)
阳性对照 256.2 1
实验组 229.4 89.5
对照组1 105.3 41.1
对照组1 125.3 48.1
由表2可知，实验组各组的磁珠产量均能达到野生型的85％以上，降低幅度不明显；而对照组各组的磁珠产量较野生型菌株均出现显著降低，表明在构建膜蛋白双基因缺失的趋磁细菌的磁珠产量高于单基因缺失的趋磁细菌的磁珠产量，此外，实验组与对照组2相比，MamC+MamF双基因缺失的趋磁细菌的磁珠产量较高，且降低幅度较小。
实验四：电转化条件比较实验
以实施例8和9提供的方法作为实验组1和2，以对照例4-8提供的方法作为对照组1-5，分别采用上述方法对趋磁细菌MSR-Ⅰ进行培养，每组的细菌数目为107个、转化DNA的两位1μg(大小约5kbp)，对电转化后的细菌成活率和基因转化表达的成功率进行测定并比较。实验结果如表3所示。
表3各组细菌电转化后的成活率和转化成功率
组别 细菌成活率(％) 转化成功率(％)
实验组1 75 38.3
实验组2 89 53
对照组1 71.4 17.2
对照组2 74 19.5
对照组3 60 22
对照组4 59 18
对照组5 62 20
由表3可知，实验组1与对照组1相比，实验组1的细菌成活率和基因转化成功率均显著高于对照组1，可以说明，通过电转化能够有效提高细菌成活率和基因转化成功率，实验组1与实验组2相比，在特殊的电转化条件可以在保证细菌存活率的前提下提高转化的成功率，实验组1、实验组2分别与对照组2-5相比，实验组1和2的细菌成活率和基因转化成功率均显著高于对照组2-5，可以说明，通过电转化能够有效提高细菌成活率和基因转化成功率，对照组2中成活率高，但是转化成功率较低，说明电流过低或时间过短均会降低转化的成功率，电流过大或时间过长则或造成细菌死亡率升高，同样会影响转化的成功率；由此表明本发明提供的电转化条件可以在保证细菌存活率的前提下提高转化的成功率。
实验五：发酵培养条件比较实验
以实施例10提供的方法作为实验组1，以对照例9提供的方法作为对照组1，分别采用上述方法对趋磁细菌MSR-Ⅰ进行培养，以野生型菌株作为阳性对照，对各组细菌的磁珠产量进行测定和比较。实验结果如表4所示。
表4各组培养物每升培养基中纳米磁珠的产量
组别 纳米磁珠含量(mg) 对照组减产比例(％)
实验组1 232.5 —
对照组1 177.2 23.8
由表4可知，实验组的磁珠产量显著高于对照组，表明本发明提供的微需氧+少量氢气的培养条件可以显著提高趋磁细菌MSR-Ⅰ的磁珠产量。
实验六：培养基性能比较试验
在接种量相同的条件下，以实施例11提供的方法作为实验组，以对照例10提供的方法作为对照组，分别对趋磁细菌MSR-1进行培养，对培养后的细菌活力和数量进行测定，并进行比较。实验结果如表5所示。
表5各组细菌的活力和数量
组别 细菌活力 细菌数量
实验组 0.842 6.1×109
对照组 0.585 3.7×108
由表5可知，实验组细菌活力和细菌数量均显著高于对照组，说明本发明提供的培养方法可以有效提高趋磁细菌的活力和增殖能力，说明本发明提供的培养方法中使用的预培养培养基和深层培养培养基均可以有效提高细菌的活力和增殖能力，预培养培养基和深层培养培养基中任意一种成分缺失或替换，均容易造成细菌死亡。
本发明不局限于上述最佳实施方式，任何人在本发明的启示下都可得出其他各种形式的产品，但不论在其形状或结构上作任何变化，凡是具有与本申请相同或相近似的技术方案，均落在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 北京国科融智生物技术有限公司
<120> 一种定向修饰肽核酸的生物纳米磁珠及其mRNA提取应用
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 375
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 1
gcagaagcag gcatcactgg cacgtggtat aaccagctgg gttccacgtt cattgtaact 60
gccggcgcag acggtgcact gactggtacg tacgagtccg cggtgggcaa cgcagagagc 120
cgttatgttc tgacgggccg ctacgactct gcaccagcta cggatggttc cggtactgct 180
ctgggttgga cggtggcatg gaagaacaac taccgtaacg cacattctgc gacgacttgg 240
tctggccagt acgtaggtgg tgcagaggca cgtatcaaca cgcagtggct gctgacgtcc 300
ggcacgacgg aggcgaacgc atggaaatct acgctggtgg gtcacgacac gttcactaag 360
gtgaagccat ctgcc 375

Claims (10)

1.一种定向修饰肽核酸的生物纳米磁珠，其特征在于，所述生物纳米磁珠由链亲和蛋白SA通过柔性linker多肽链与细菌磁颗粒的膜蛋白融合表达而成，其中，所述链亲和蛋白SA与生物素标记的肽核酸PNA探针偶联。
2.如权利要求1所述的定向修饰肽核酸的生物纳米磁珠，其特征在于，所述柔性linker多肽链的氨基酸序列为GASGLYWLGA SAGGALSWLL GAASLYWSGL。
3.如权利要求2所述的定向修饰肽核酸的生物纳米磁珠，其特征在于，所述链亲和蛋白SA的基因序列为5-GCAGAAGCAG GCATCACTGG CACGTGGTAT AACCAGCTGG GTTCCACGTTCATTGTAACT GCCGGCGCAG ACGGTGCACT GACTGGTACG TACGAGTCCG CGGTGGGCAA CGCAGAGAGCCGTTATGTTC TGACGGGCCG CTACGACTCT GCACCAGCTA CGGATGGTTC CGGTACTGCT CTGGGTTGGACGGTGGCATG GAAGAACAAC TACCGTAACG CACATTCTGC GACGACTTGG TCTGGCCAGT ACGTAGGTGGTGCAGAGGCA CGTATCAACA CGCAGTGGCT GCTGACGTCC GGCACGACGG AGGCGAACGC ATGGAAATCTACGCTGGTGG GTCACGACAC GTTCACTAAG GTGAAGCCAT CTGCC-3。
4.权利要求1-3任一项所述的定向修饰肽核酸的生物纳米磁珠在mRNA富集纯化及分离提取中的应用。
5.一种权利要求1-3任一项所述的定向修饰肽核酸的生物纳米磁珠的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括以下步骤：
S1、构建细菌磁颗粒膜蛋白MamC和MamF基因缺失的趋磁细菌MSR-1突变株为一级重组菌株；
S2、构建链亲和蛋白SA通过柔性linker多肽链与缺失的所述细菌磁颗粒膜蛋白MamC或MamF基因融合表达载体，将所述融合表达载体导入步骤S1制得所述一级重组菌株中，筛选表达二级重组菌株；
S3、对所述二级重组菌株进行培养即得到表达展示链亲和蛋白SA的功能性生物纳米磁珠；
S4、将步骤S3培养得到所述功能性生物纳米磁珠通过与生物素标记的肽核酸PNA探针偶联，即得到定向修饰肽核酸的生物纳米磁珠。
6.如权利要求5所述的制备方法，其特征在于，所述步骤S1包括如下步骤：
S1.1：分别对缺失的所述细菌磁颗粒膜蛋白MamC和MamF基因两侧500bp的同源DNA片段进行扩增，通过分子克隆构建两条微载体；
S1.2：将两条所述微载体通过电转化的方式同时转入MSR-I野生型菌株中；
S1.3：对电转化后的所述MSR-I野生型菌株进行筛选和鉴定，获得缺失所述细菌磁颗粒膜蛋白MamC和MamF基因的趋磁细菌MSR-1突变株，即为一级重组菌株。
7.如权利要求5所述的制备方法，其特征在于，所述步骤S2包括如下步骤：
S2.1：对所述链亲和蛋白SA的基因序列进行PCR扩增；
S2.2：用EcoRI/BamHI对扩增产物和表达载体pBBR-RC分别进行双酶切，回收双酶切的所述扩增产物和所述表达载体pBBR-RC；
S2.3：将经过双酶切的所述扩增产物与通过柔性linker多肽链与缺失的所述细菌磁颗粒膜蛋白MamC或MamF基因融合，并连接到同样经过双酶切的所述表达载体pBBR-RC，得到pBRC-SA表达质粒，其中，所述柔性linker多肽链的氨基酸序列为GASGLYWLGA SAGGALSWLLGAASLYWSGL；
S2.4：通过电转化的方式将所述pBRC-SA表达质粒转入至所述一级重组菌株中，经过筛选验证得到二级重组菌株；
优选的，步骤S2.4的具体步骤如下：
S2.4.1、使用PBS缓冲液调节所述pBRC-SA表达质粒的浓度为2mg/mL，待用；
S2.4.2、配置浓度为15％的甘油缓冲液为洗涤缓冲液，配置好后灭菌处理，置于-20℃冷冻备用；
S2.4.3、将所述一级重组菌株培养过夜，离心收集菌体，用PBS缓冲液重悬菌泥洗涤2次；
S2.4.4、再次离心收集菌体后，用15％的甘油缓冲液以重悬比例为1g菌泥用150-200mL的甘油缓冲液重悬菌泥，然后在-20℃冷柜中放置30min，期间晃动或轻微涡旋处理1-2次，使菌体保持重悬状态；
S2.4.5、用4000g的离心力4度离心20min，轻轻倒去上清缓冲液，保留2ml左右的上清液，用移液器轻轻将菌泥重悬起来，按照100μL每EP管分装，即获得电转化感受态菌株；
S2.4.6、将制备的所述电转化感受态菌株放入液氮中迅速冷冻，然后置于-80℃冰箱中保存；
S2.4.7、电转化时，取出所述电转化感受态菌株，置于冰上待其溶解；
S2.4.8、加入1-2μL浓度为2mg/mL的所述pBRC-SA表达质粒，轻轻混匀，将混合物置于1mm电转化杯中进行电转化处理；
S2.4.9、电转化结束后，迅速往电转化杯里加入100μL血清培养基，混匀后，用移液器吸出转移到EP管中，37℃摇床培养1-2h；
S2.4.10、将培养产物涂布在含有庆大霉素和卡那霉素抗生素的培养基平板上进行筛选培养，对生长的单菌落细菌进行转接培养，并验证是否将所述pBRC-SA表达质粒成功转化到所述一级重组菌株中，成功转化并能正确表达所述链亲和蛋白SA的菌株即为二级重组菌株。
8.如权利要求5所述的制备方法，其特征在于，所述步骤S3包括如下步骤：
S3.1：使用200-500mL培养基在氧气含量5-10％、氮气含量90-95％、培养温度37℃的培养条件预培养16小时；
S3.2：将经过预培养的菌株转接到发酵罐中，在培养温度37℃、氧气含量5％、氢气含量1％及氮气含量94％的培养条件下深层培养3～4天；
S3.3：通过均质设备对深层培养物进行处理、将菌体粉碎，通过磁装置吸附细菌磁颗粒，并用磷酸缓冲液洗涤2～3次；
S3.4：用超声波及蛋白酶缓冲液进行梯度处理，最终得到纯化后的功能性生物纳米磁珠；
优选的，所述预培养中使用的培养基包括如下重量份数的成分：
8-15份蛋白胨、1-5份脂肪酸乳酰脂、2-6份地衣多糖、3-8份糖基化蛋白质、0.5-1.2份海藻酸钾、1-2份醋酸纤维素；
所述深层培养中使用的培养基包括如下重量份数的成分：15-20份牛肉膏、1-8份肽聚糖、2-6份地衣多糖、1-3份双磷脂酰甘油、1-2份氢化豆磷脂、0.5-1.8份海藻酸铵、0.5-0.8份柠檬酸钠。
9.如权利要求5所述的制备方法，其特征在于，所述步骤S4包括如下步骤：
S4.1：将合成的肽核酸PNA干粉溶于pH为8.0的水中，加入等体积的标记缓冲液，使其最终浓度为10mM；
S4.2：加入20μL100mM的NH2-Biotin，轻轻吹打混匀，置于培养箱中在温度为37℃的条件下避光孵育30分钟，转入过滤管中12000g离心15min，加入适量标记缓冲液，混匀后12000g离心15min；
S4.3：加入适量标记缓冲液，将过滤管中的滤芯倒置，转入新的离心管中，6000g离心10min，收集生物素标记的肽核酸PNA探针；
S4.4：将步骤S3培养得到所述功能性生物纳米磁珠用磷酸缓冲液洗涤2次，溶于MES缓冲液中，加入步骤S4.3得到的所述生物素标记的肽核酸PNA探针，室温反应1h后，用磁力架吸附磁珠，用磷酸缓冲液洗涤2次，溶于pH7.5的TBS缓冲液中，即得到定向修饰肽核酸的生物纳米磁珠。
10.如权利要求6或7所述的制备方法，其特征在于，所述电转化的具体方法如下：
采用方波电脉冲，在3100～3200V条件下，进行1～2次时长为3.1～3.3ms电脉冲。
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