CN104278048B

CN104278048B - 一种重组磁螺菌及其应用

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Publication number: CN104278048B
Application number: CN201310291562.1A
Authority: CN
Inventors: 田杰生; 胡俊英; 徐俊; 王旭; 李丽; 刘凌子; 钱欣欣; 姜伟; 李颖; 李季伦
Original assignee: China Agricultural University
Current assignee: China Agricultural University
Priority date: 2013-07-11
Filing date: 2013-07-11
Publication date: 2017-05-17
Anticipated expiration: 2033-07-11
Also published as: CN104278048A

Abstract

本发明提供了一种重组磁螺菌及其构建方法。具体为首先构建丢失了磁小体膜蛋白基因的趋磁细菌突变株，然后将一个磁小体膜蛋白基因与一个功能性蛋白基因进行基因融合，连接到pMD18‑T Simple Vector上，转化入E.coli DH5α感受态细胞，构建得到重组质粒。通过本发明方法构建得到的重组磁螺菌可用于合成表面展示有功能性蛋白的磁小体，所述磁小体可以很容易地与抗体，乃至核酸、糖类、脂类、非抗体蛋白等功能性蛋白相连，形成具有特定功能的磁性复合体，该复合体既能够用于磁性分离，还可以组装成特定结构的磁性材料或构件。

Description

一种重组磁螺菌及其应用

技术领域

本发明涉及一种磁螺菌，具体地说，涉及一种合成功能化磁小体的重组磁螺菌及其应用。

背景技术

趋磁细菌(Magnetotactic bacteria，MTB)是水生原核生物的一个多系类群(polyphyletic group)，有球状、卵状、杆状、弧状和螺旋状等形状，可以是单细胞，也可以是多细胞，一般具有端生或双生鞭毛。在系统发育上属于变形杆菌门(Proteobacteria)的α-变形杆菌纲(Alphaproteobacteria)、δ-变形杆菌纲(Deltaproteobacteria)、γ-变形杆菌纲(Gammaproteobacteria)和硝化螺旋菌门(Nitrospirae)。

趋磁细菌可以从环境中吸收大量的铁，形成一种特殊的细胞器，其内部含有一个单磁畴的四氧化三铁(Fe₃O₄)或四硫化三铁(Fe₃S₄)的晶体，外部有脂类和蛋白组成的单位膜包被，称为磁小体。不同的菌株可以合成不同形状的磁小体，具有种专一性。磁小体主要有平截八面体、棱柱状、子弹状、箭头状、齿状等，直径30～120nm。在细胞内，磁小体通常高度有序地排列成一条或几条链，形成一个或多个“小磁针”，从而使菌体可以感知外界磁场。

磁小体的形成过程属于生物矿化(biomineralization)，其整个过程多在50nm左右的泡囊内进行，受到严格的生物调控，条件温和，产物为单磁畴晶体，粒径均一、晶形稳定，在同类材料中磁性最强，是名副其实的“纳米工厂(Nanofactory)”。同时，磁小体有单位膜包被，与裸露的磁性材料相比，易于分散，目前尚无法人工模拟。

由于氧化铁磁性颗粒(磁珠)已经广泛用于磁性分离、固定化酶、食品检测、环境监测、医学诊断、造影剂、磁共振成像、磁热疗、靶向治疗、磁性记录材料等许多领域，因此，成分与之类似的磁小体也受到了学者的关注。研究表明，不同趋磁细菌形成的磁小体形状多样，而同一种趋磁细菌合成的磁小体大小、晶型、磁学性质均一，且由于有单位膜包被，磁小体相对容易分散，是理想的三维纳米磁性材料。同时，磁小体膜上含有大量的磷脂酰乙醇胺，可提供丰富的氨基，用于偶联功能性的分子，便于对磁小体的化学修饰。

日本学者松永是(Tadashi Matsunaga)利用双功能交联剂分别尝试了将酶、抗体、核酸等连接在磁小体上，构建成磁性复合物，用于固定化酶，富集和检测血液中的蛋白、食品中的病原菌、环境中的有害物质等。我们也用类似的方法建立了对7种沙门氏菌(Salmonella)、大肠杆菌(Escherichia coli)O157、乙肝抗原HBsAg、禽白血病病毒(AvianLeukosis Virus)、葡萄扇叶病毒(Grapevine fanleaf virus)、李环斑坏死病毒(Prunusnecrotic ringspot virus)、蓖麻毒素(Ricin)和肠毒素(Enterotoxin)的检测方法。从理论上讲，市售磁珠多为微米级的多磁畴颗粒或球体(如Dynabeads)，其磁性(矫顽力)小于磁小体，当前者用于磁性分离时，效果应逊于磁小体。但实际上，二者的在检测或诊断方面的测试灵敏度相仿。分析上述实验可以看出，这些实验主要是利用抗体的氨基与磁小体相连，而这些氨基更多地分布于其氮末端，这也正是抗体与抗原结合的区域(Fab)，如果Fab与磁小体偶联，则无法再去结合抗原，从而造成抗体活性的损失。同时，在上述方法中，磁小体与抗体偶联，仍然需要通过昂贵的双功能试剂，没有发挥出磁小体作为生物材料的优势。

发明内容

本发明的目的是提供一种重组磁螺菌的构建方法。

本发明的另一目的是利用重组磁螺菌合成具有不同功能的磁小体。

为了实现本发明的目的，本发明的技术方案如下：

本发明提供了一种重组质粒，所述重组质粒是将一个磁小体膜蛋白基因与一个功能性蛋白基因进行基因融合，构建重组质粒；

其中，磁小体膜蛋白基因为mamC、mms13或mamF；功能性蛋白基因为spa、bccp或msa。

本发明还提供了一种含有上述重组质粒的重组磁螺菌的构建方法，其特征在于，步骤如下：

1）构建趋磁细菌突变株；

2）构建得到上述的重组质粒；

3）将步骤2）得到的重组质粒导入步骤1）得到的趋磁细菌突变株，构建重组磁螺菌。

具体地，所述步骤1）还包括以下步骤：

（1）通过PCR扩增趋磁细菌磁小体膜蛋白基因的上游长约1kb的基因序列记作S片段，下游长约1kb的基因序列记作X片段；

（2）将所述两个片段和0.8kb的庆大霉素(Gm)抗性基因片段定向克隆到自杀载体pUX19的多克隆位点，构建成重组自杀质粒pUX19-S-Gm-X；优选地，所述的磁小体膜蛋白基因为mamC或mamF；

（3）用抗性基因置换磁小体膜蛋白基因的片段以实现同源双交换，得到丢失了磁小体膜蛋白基因的趋磁细菌突变株。

当磁小体膜蛋白基因为mamC时，S片段如SEQ ID No.1所示，X片段如SEQ ID No.2所示。

当磁小体膜蛋白基因为mamF时，S片段如SEQ ID No.3所示，X片段如SEQ ID No.4所示。

本发明还提供了上述的构建方法的步骤1）得到的趋磁细菌突变株。

本发明还提供了上述的构建方法得到的重组磁螺菌。

本发明还提供了利用一种表面展示有功能性蛋白的磁小体，所述磁小体通过上述重组磁螺菌合成。

本发明还提供了上述磁小体在与功能性蛋白相连、磁性分离或组装成特定结构的磁性材料中的应用。

所述磁小体易与抗体，乃至核酸、糖类、脂类、非抗体蛋白等功能性蛋白相连，形成具有特定功能的磁性复合体，该复合体既能够用于磁性分离，还可以组装成特定结构的磁性材料或构件。

磁小体上展示有SpA蛋白，该蛋白可与多数哺乳动物抗体的碳末端(Fc)结合，Fc端远离抗体与抗原结合的部分(antigen binding fragment，Fab片段，位于氮末端)，可以有效地形成磁小体-抗体复合物，而不会影响抗体的活性(滴度)，以这种复合物为载体，用磁性免疫分离的方法富集相应的抗原，提高监测和诊断的灵敏度。

磁小体上展示有重组单体链霉亲和素(SA)，SA可以特异性地与生物素(biotin)迅速、高效、牢固地结合，从而可以使磁小体与生物素化的蛋白、核酸、糖类、脂类结合，形成复合体，执行相应的功能；

磁小体上展示有生物素分子。由于天然的链霉亲和素是四聚体，可以结合4个生物素分子，这些磁小体可以占据链霉亲和素的1～2个生物素结合位点，则剩余的位点可与生物素化的蛋白、核酸、糖类、脂类结合，形成磁小体复合体，执行相应的功能；还可以与展示有重组单体链霉亲和素的磁小体组装成特定的胶体晶体结构。

本发明的优势在于建立了磁小体表面展示技术，通过磁小体膜蛋白的融合表达，分别将SpA蛋白、链霉亲和素、生物素展示在磁小体的表面。使磁小体可以很容易地抗体，乃至核酸、糖类、脂类、非抗体蛋白等功能性蛋白相连，形成具有特定功能的磁性复合体，既能够用于磁性分离，还可以组装成特定结构的磁性材料或构件。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。

实施例1

M.gryphiswaldense MSR-1的mamC突变株和mamF突变株的构建

通过构建重组质粒，分别用PCR扩增的方法，将mamC基因上、下游长约1kb的片段(分别记作S、X片段，S片段如SEQ ID No.1所示，X片段如SEQ ID No.2所示)，将这两个片段和0.8kb的庆大霉素(Gm)抗性基因片段定向克隆到自杀载体pUX19的多克隆位点，构建成重组自杀质粒pUX19-MamC-S-Gm-X，再通过同源双交换将mamC基因片段用抗性基因置换下来。具体步骤如下：

1、分别用引物mamC-S-F-XbaⅠ/mamC-S-R-KpnⅠ和mamC-X-F-KpnⅠ/mamC-X-R-PstⅠ扩增mamC基因上、下游区域(以全基因组方向来看其上下游)，电泳分离扩增产物，切胶回收，然后连接到pMD18-T Simple Vector【购自TaKaRa宝生物工程（大连）有限公司】上，转化入大肠杆菌(E.coli)DH5α感受态细胞【购自普洛麦格(北京)生物技术有限公司】。经PCR验证正确后，分别命名为重组质粒pT-MamC-S和pT-MamC-X，测序，确定上下游基因的正确性。

其中，引物mamC-S-F-XbaⅠ如SEQ ID No.5所示；

引物mamC-S-R-KpnⅠ如SEQ ID No.6所示；

引物mamC-X-F-KpnⅠ如SEQ ID No.7所示；

引物mamC-X-R-PstⅠ如SEQ ID No.8所示。

2、分别用内切酶XbaⅠ/KpnⅠ和KpnⅠ/PstⅠ（内切酶XbaI购自TaKaRa公司，1500U，Code D1093A；内切酶KpnI购自TaKaRa公司，5000U，1068A；内切酶PstI购自TaKaRa公司，3000U，D1073A）双酶切重组质粒pT-MamC-S和pT-MamC-X，以获得mamC基因上、下游片段(分别记作S、X片段)。再以内切酶XbaⅠ/PstⅠ双酶切自杀载体pUX19，以获得该质粒的其开环片段；并用内切酶KpnⅠ单酶切抗性质粒pUC-Gm，以获得庆大霉素(Gm)抗性基因片段。分别电泳分离酶切后的产物，并切胶回收目的片段：mamC基因的上下游片段mamC-S和mamC-X、抗性片段Gm和自杀载体pUX19。用T4DNA连接酶（购自TIANGEN公司，目录号：RT406，60u）连接上述酶切后得到的四个片段，构建成重组自杀质粒pUX19-MamC-S-Gm-X。

3、将上述自杀质粒转入E.coli S17-1感受态细胞，并在庆大霉素和卡那霉素(Km)双抗性平板上筛选阳性克隆。用菌落PCR筛选，以获得Gm基因反向插入的突变株，避免Gm片段插入后对下游基因的表达产生影响，即极性效应的产生。命名为E.coli S17-1(pUX19-MamC-S-Gm-X)。

4、将菌株E.coli S17-1(pUX19-MamC-S-Gm-X)作为供体菌与MSR-1野生型分别做接合实验，接合后菌液涂布在Gm和萘啶酮酸(Nx)双抗性平板上筛选。所得菌落，如在Km抗性平板上不生长，而在Gm抗性标记的抗性平板上生长良好，可初步鉴定为双交换突变株。

5、将抗性筛选得到的双交换突变株进行菌落PCR复筛验证。具体过程是：在mamC基因内部设计一对引物mamC-F和mamC-R，PCR扩增，验证mamC基因是否被替换掉；同时还需在引物mamC-S-F-Xba Ⅰ所在基因之前设计引物mamC-F-F，在引物mamC-X-R-PstⅠ所在基因之后设计引物mamC-R-R，验证上下游臂是否交换正确。提取所得突变株的基因组，进一步验证菌株是否污染了野生型，并且要通过PCR扩增确保磁小体岛上的其它基因如mamA、mamP、mamS、mamR、mamB等没有丢失，即得ΔmamC突变株M.gryphiswaldense MamC(菌株1)。

6、同法通过引物mamF-S-D1-KpnⅠ如SEQ ID No.13所示；引物mamF-S-D2-PstⅠ如SEQ ID No.14所示；引物mamF-X-G1-XbaⅠ如SEQ ID No.15所示；引物mamF-X-G2-KpnⅠ如SEQID No.16所示。可得ΔmamF突变株M.gryphiswaldense MamF(菌株2)

实施例2spa基因、bccp基因的获得和重组单体msa基因的构建

培养金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)ATCC6538，提取其全基因组为模板，用引物Spa-LF（如SEQ ID No.9所示）和Spa-RB（如SEQ ID No.10所示），扩增得到全长spa基因。其中，引物Spa-LF包含Linker序列(Gly₄Ser)₃，引物Spa-RB包含BamHI酶切位点。

如上法提取磁螺菌野生型菌株MSR-1的基因组DNA，以之作为模板，用引物BCCP-F（如SEQ ID No.11所示）和BCCP-R（如SEQ IDNo.12所示）扩增得到生物素羧基载体蛋白基因bccp。其中，引物BCCP-F包含Linker序列(Gly₄Ser)₃，引物BCCP-R包含XbaI酶切位点。

根据野生型阿维丁链霉菌(Streptomyces avidinii)链霉亲和素基因(sa)序列，我们将其编码55位缬氨酸、76位苏氨酸、109位亮氨酸和125位缬氨酸的密码子GTC、ACG、CTG、GTC分别更换为ACA、AGA、ACA、AGA，则其对应的四个氨基酸，即分别更换为苏氨酸、精氨酸、苏氨酸和精氨酸(即T76R，V125R，V55T，L109T)，同时在起始密码子前面加上了一段Linker序列(Gly₄Ser)₃。把改造后得到的重组单体片段命名为msa，该片段由上海英潍捷基生物技术有限公司合成，其蛋白产物命名为MSA片段。

实施例3各融合蛋白基因的构建

含有MamC与单体链霉亲和素融合蛋白基因的表达质粒pMamC-MSA的构建，具体步骤如下：

1、用野生型MSR-1基因组作为模板，以mamC-exp1-KpnI作为上游引物，mamC-exp2作为下游引物扩增mamC基因。切胶回收，然后连接到pMD18-T Simple Vector上，转化入E.coli DH5α感受态细胞，PCR验证并测序正确后，将所得重组质粒命名为pT-MamC-exp。

2、以pT-MamC-exp和重组单体链霉亲和素片段MSA同时作为模板，用mamC-exp1-KpnI作为上游引物，MSA-EcoRI作为下游引物，进行融合PCR，以获得mamC基因与msa基因的融合片段，琼脂糖凝胶电泳，切胶回收，然后连接到pMD18-T Simple Vector上，转化入E.coliDH5α感受态细胞，PCR验证并测序正确后，将所得重组质粒命名为pT-MamC-MSA。

3、提质粒pT-MamC-MSA，用内切酶KpnI/EcoRI双酶切，获得MamC-MSA融合基因片段，两端酶切位点为KpnI和EcoRI；质粒pBBR1MCS-2（美国五大湖生物能源研究中心发酵实验室，张耀平先生赠送）也用内切酶KpnI/EcoRI双酶切，获得pBBR1MCS-2开环片段，两端酶切位点为KpnI和EcoRI。将上述两种酶切体系经琼脂糖凝胶电泳，回收，再用T4DNA连接酶连接，命名为重组质粒pMamC-SA。通过转化入E.coli DH5α感受态细胞，PCR验证、酶切，并测序，以该质粒验证含有MamC与MSA融合蛋白基因。

同法，可构建重组质粒pMamC-Spa和pMamC-BCCP。

与上述方法类似，可分别扩增mamF和mms13基因，并构建成重组质粒pMms13-MSA、pMms13-BCCP、pMms13-Spa、pMamF-MSA、pMamF-BCCP、pMamF-Spa。

实施例4重组磁螺菌的构建

将含有mamC或mms13的质粒pMamC-MSA、pMamC-SpA、pMamC-BCCP、pMms13-MSA、pMms13-BCCP、pMms13-Spa分别导入菌株1[M.gryphiswaldense MSR-1的mamC缺失突变株(ΔmamC)]，得到重组磁螺菌M.gryphiswaldense MamC-SpA(菌株3)、MamC-MSA(菌株4)、MamC-BCCP(菌株5)、Mms13-SpA(菌株6)、Mms13-MSA(菌株7)、Mms13-BCCP(菌株8)；将含有mamF基因的质粒pMamF-MSA、pMamF-BCCP、pMamF-Spa分别导入菌株2[M.gryphiswaldenseMSR-1的mamF缺失突变株(ΔmamF)]，即得菌株M.gryphiswaldense MamF-SpA(菌株9)、MamF-MSA(菌株10)、MamF-BCCP(菌株11)。详见表1：

表1本发明中构建的菌株

以重组磁螺菌MamC-MSA为例，具体步骤是：

将质粒pMamC-MSA通过热激转化法转化入E.coli S17-1，得到菌株E.coli S17-1(pMamC-MSA)。此菌株作为供体菌与MamC缺失突变株(ΔmamC)菌株1进行接合实验，接合后菌液涂布在Gm、Km和萘啶酮酸(Nx)三种抗性平板上进行筛选。经接合实验3-7天后，对GmNxKm抗性平板上的接合子划线扩大培养，后进行PCR筛选。

具体步骤如下：分别挑取接合子作为模板，用引物mamC-exp1-KpnI作为上游引物，引物MSA-EcoRI作为下游引物配对进行PCR扩增。观察琼脂糖凝胶电泳显示结果。若扩增产物约800bp，说明所对应的转化子可初步断定是正确的。转化子经PCR验证正确后，测序进一步验证，最后通过PCR扩增确保磁小体岛上的其它基因如mamA、mamP、mamS、mamR、mamB等没有丢失。验证正确的接合子命名为重组磁螺菌MamC-MSA，即MamC缺失突变株(ΔmamC)M.gryphiswaldense MamC(菌株1)中含有MamC与重组单体链霉亲和素融合蛋白基因的重组质粒。

实施例5重组磁小体的表达

将9种重组磁螺菌(菌株3～11)经发酵培养48小时后，离心收获菌体，经超声波破碎、清洗，即可得到9种重组磁小体。这些磁小体的膜蛋白MamC、MamF或Mms13分别与抗体结合蛋白Protein A(即SPA蛋白)、单体链霉亲和素(MSA)或生物素羧基载体蛋白(BCCP)融合，使后面这三种蛋白展示在磁小体的表面。

SpA蛋白可与多数哺乳动物抗体的碳末端(Fc)结合，Fc端远离抗体与抗原结合的部分(antigen binding fragment，Fab片段，位于氮末端)，可以有效地形成磁小体-抗体复合物，而不会影响抗体的活性(滴度)，以这种复合物为载体，用磁性免疫分离的方法富集相应的抗原，提高监测和诊断的灵敏度。

链霉亲和素(SA)及其重组单体(MSA)可以特异性地与生物素(biotin)迅速、高效、牢固地结合，从而可以使磁小体与生物素化的蛋白、核酸、糖类、脂类结合，形成复合体，从而扩展了可与磁小体结合的功能性物质的范围。

生物素羧基载体蛋白可在磁螺菌体内自行与生物素分子结合，因此这类磁小体上展示有生物素分子。由于天然的链霉亲和素是四聚体，可以结合4个生物素分子，这些磁小体可以占据链霉亲和素的1～2个生物素结合位点，则剩余的位点可与生物素化的蛋白、核酸、糖类、脂类结合，形成磁小体复合体；还可以与展示有重组单体链霉亲和素的磁小体组装成特定结构的胶体晶体。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之做一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

Claims

1.一种重组磁螺菌的构建方法，其特征在于，步骤如下：

1)构建敲除磁小体膜蛋白基因的趋磁细菌突变株；

2)构建重组质粒：将一个所述磁小体膜蛋白基因与一个功能性蛋白基因进行基因融合，连接到pMD18-T Simple Vector上，转化入E.coli DH5α感受态细胞，构建得到重组质粒；

其中，磁小体膜蛋白基因为mamC、mms13或mamF；功能性蛋白基因为spa、bccp或msa；

3)将步骤2)得到的重组质粒导入步骤1)得到的趋磁细菌突变株，构建重组磁螺菌。

2.如权利要求1所述的构建方法，其特征在于，所述步骤1)包括如下步骤：

(1)通过PCR扩增趋磁细菌磁小体膜蛋白基因的上游长1kb的基因序列记作S片段，下游长1kb的基因序列记作X片段；

(2)将所述两个片段和0.8kb的庆大霉素抗性基因片段定向克隆到自杀载体pUX19的多克隆位点，构建成重组自杀质粒pUX19-S-Gm-X；

(3)用抗性基因置换磁小体膜蛋白基因的片段以实现同源双交换，得到丢失了磁小体膜蛋白基因的趋磁细菌突变株。

3.如权利要求2所述的构建方法，其特征在于，所述步骤(1)中的磁小体膜蛋白基因为mamC或mamF。

4.一种趋磁细菌突变株，其特征在于，其构建方法包括如下步骤：

(3)用抗性基因置换磁小体膜蛋白基因的片段以实现同源双交换，得到丢失了磁小体膜蛋白基因的趋磁细菌突变株；

其中，磁小体膜蛋白基因为mamC、mms13或mamF。

5.如权利要求1所述的重组磁螺菌的构建方法构建得到的重组磁螺菌。

6.权利要求5所述的重组磁螺菌在合成表面展示有功能性蛋白的磁小体方面的应用。

7.权利要求5所述的重组磁螺菌在合成与功能性蛋白相连、磁性分离或组装成特定结构的磁性材料的磁小体方面的应用。