CN101942496B - 一种神经坏死病毒的病毒类似物的制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明属于生物技术领域，涉及一种神经坏死病毒病毒类似物的制备方法，包括以下步骤：（1）在原核条件下，将已含有编码神经坏死病毒衣壳蛋白基因的 pQE30质粒载体的大肠杆菌，进行神经坏死病毒病毒类似物的表达；表达的条件为：将OD600=1.5的大肠杆菌菌液按照1%的质量分数接种到培养基中，于37℃，250rpm下培养至OD600为0.3-0.5时，加入异丙基-β-D-硫代半乳糖苷至异丙基-β-D-硫代半乳糖苷终浓度为900μM，转移至25-30℃，200rpm的转速下继续培养3-4小时完成表达；（2）表达结束后，破裂菌体、分离及纯化获得神经坏死病毒的病毒类似物。其中质粒所编码的基因还可以含有组氨酸标签的神经坏死病毒衣壳蛋白基因，其表达产物可以通过亲和层析纯化。本发明所提供的方法可以获得较大的病毒类似物表达量；层析纯化方式简便，需要仪器设备及试剂成本低。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域，涉及一种神经坏死病毒病毒类似物的制备方法。
背景技术
鱼类的病毒性神经坏死病（viral nervous necrosis，VNN），又称病毒性脑病和视网膜病（viral encephalopathy and retinopathy，VER），每次病情暴发都给当地的孵苗场养殖场带来巨大经济损失，是水产养殖业发展的一大障碍。该病的致病原是β属诺达病毒（Betanodavirus），多种鱼类的仔鱼和稚鱼是其敏感宿主，病发后死亡率高达90%以上，甚至可达 100%。病毒的宿主种类遍布 16个科 40 多种鱼，大多数是海洋鱼类。近年来随着研究工作的推广和深入，报道发现β诺达病毒感染淡水鱼类的案例有增多的趋势。
近几年神经坏死病毒（NNV）的病毒类似物（virus-like particle，VLP）研究开展较多。当NNV的唯一结构蛋白，衣壳蛋白（cpasid protein，CP）也称α蛋白，在适当的环境下表达时，可以自身形成3聚体，并且60个3聚体会形成具有180个CP单体的病毒类似物（VLP）。不少文献已经证明，所形成的VLP与野生型病毒的蛋白三维构象非常类似；VLP是针对神经坏死病毒非常有用的免疫原；VLP是基因工程疫苗重要的候选抗原。但无论是用杆状病毒在真核细胞中表达还是原核状态的大肠杆菌表达，均集中在野生型表达优化的研究和通过缺失突变来研究形成VLP的重要氨基酸两大方面，但对如何方便有效的纯化VLP以达到工厂生产的需要方面还没有相关研究。成功生产了VLP后，如何快速低成本的纯化得到VLP成为另外一个重要的研究方向。一般VLP的纯化是用超速密度梯度离心的纯化方法（即类似病毒的纯化方法），纯化过程不但耗时而且花费大，不适合大规模纯化及生产。因此，作为基因工程疫苗免疫原要大规模生产纯化的问题急需解决。
发明内容
本发明的目的在于提供一种成本低、操作性强，并且适用于大规模纯化生产神经坏死病毒（NNV）的病毒类似物的方法。
发明通过以下技术方案实现上述目的：
发明提供了一种神经坏死病毒的病毒类似物的制备方法，包括以下步骤：
（1）在原核条件下，将已含有编码神经坏死病毒衣壳蛋白基因的 pQE30质粒载体的大肠杆菌，进行神经坏死病毒病毒类似物的表达；表达的条件为：将OD600=1.5的大肠杆菌菌液按照1%的质量分数接种到培养基中，于37 ℃，250 rpm下培养至OD600为0.3-0.5时，加入异丙基-β-D-硫代半乳糖苷至异丙基-β-D-硫代半乳糖苷终浓度为900 μM，转移至25-30 ℃，200 rpm的转速下继续培养3-4小时完成表达；
（2）表达结束后，破裂菌体、分离及纯化获得神经坏死病毒的病毒类似物。
所述的培养基是Luria-Bertani培养基。
所述的破裂菌体是在表达结束后的菌液中加入Triton X-100至其终浓度为1%；再加入苯甲基磺酰氟至其终浓度为2 mM；混匀后冰上放置，再进行超声破碎。
所述的冰上放置时间为30分钟，每隔5分钟混匀一次；超声破碎总作用时间为30分钟，分次进行，每次连续超声10-15秒，停30秒。
所述的分离是将破裂后的菌液在40,000 g下离心10 min，收集上清。
所述的分离步骤所获得的上清液继续进行离心及上清的收集，共离心及收集3次获得上清。
所述的纯化包括初纯化和最终纯化；初纯化是将所述上清通过质量分数30%蔗糖垫进行超速离心，离心条件为250,000 g下离心1 h，弃上清；所述的最终纯化是初步纯化获得的沉淀以PBS充分重悬，重悬液通过等体积的质量分数为10%、20%、30%、40%的蔗糖梯度进行超速离心，离心条件为250,000 g下离心4 h。
本发明同时提供了另一种方案，与上述方案的区别在于采用了带组氨酸标签的神经坏死病毒衣壳蛋白基因，重组进质粒载体中，即载体是重组了带组氨酸标签的神经坏死病毒衣壳蛋白基因的pQE30质粒。
这种方案中，所采用的纯化步骤也区别于第一种方案，是将通过超声破碎后离心分离所得的上清粗提液与Ni-NTA柱料按1 L诱导后菌液体积比2 ml柱料的比例在4 ℃混合2 h，用含有20 mM咪唑的PBS洗涤液洗涤4次，每次使用3倍柱床体积。最后用含有250 mM咪唑的PBS洗脱液以一个柱床体积将His-VLP进行洗脱，共洗脱3次。
以下将更为具体的阐述本发明的方案：
方案一：神经坏死病毒（orange-spotted grouper nervous necrosis virus，OGNNV）的病毒类似物（VLP）的制备：
在原核条件下，利用修饰过的 pQE30质粒载体进行野生型衣壳蛋白（capsid protein，CP）的表达（参见文献Lu MW et al. Infection competition against grouper nervous necrosis virus by virus-like particles produced in Escherichia coli. Journal of General Virology (2003), 84, 1577–1582.），由于需要CP在表达后能在大肠杆菌中有时间和空间进行自组装，因此表达的速度和数量要严格控制，需要在产量和VLP质量之间取得很好的平衡。进行了VLP原核表达的优化得到最终制备条件：将过夜菌（OD600>1.5）按1%接种，VLP的菌液培养体积是培养器皿的一半或以下，于37 ℃，250 rpm培养到OD600为0.3-0.5时加入 异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）至终浓度为900 μM，转移至30 ℃，200 rpm表达3-4 h。完成表达后，在4 ℃收集菌体，并用冷冻PBS按培养菌体的1%充分重悬沉淀菌体。为菌体破裂充分，加入Triton X-100至终浓度为1%，为减少VLP被降解的机会，加入苯甲基磺酰氟（PMSF，一种蛋白酶抑制剂）至终浓度为2 mM，然后混匀冰上放置30 min，每5 min混匀一次。将重悬液进行超声破碎，每次连续破碎10-15 s，停30 s，总作用时间在30 min以上使菌体充分破裂。然后40,000 g离心10 min，收集上清，共重复离心3次去除不溶蛋白。将上清通过30%蔗糖垫进行初步的超速离心（250,000 g离心1 h）纯化，弃上清。以PBS充分重悬超离沉淀，重悬液通过等体积的质量分数为10%、20%、30%、40%的蔗糖梯度进行超速离心（250,000 g离心4 h）进行最终纯化。
为了验证方案的效果，将离心后吸取的蔗糖梯度中出现明显的两条白色条带，经过SDS-PAGE、Western Blot和电镜负染观察，确定所得蛋白为CP，纯度达95%以上，并且VLP具有与野生型病毒OGNNV相似的显微结构。通过该方法制备的OGNNV VLP完全满足作为基因工程疫苗的免疫原的需要。
方案二：OGNNV的His-VLP的制备：
成功生产了VLP后，如何快速低成本纯化得到VLP成为另外一个重要的研究方向。本方案正式基于这个目的开发的。通过为VLP加上可用于纯化的标签，以进行亲和层析纯化，这将大大缩短VLP超离纯化的时间及降低因超离造成的高成本纯化过程。这是β属诺达病毒VLP研制中首次对CP插入标签后能形成VLP的研究，并成功通过亲和层析对原核表达的VLP进行纯化。以带6×His纯化标签序列的引物进行PCR扩增，使CP基因的上游或下游分别连上6×His的DNA序列，使相应表达的VLP的N端和C端带上组氨酸纯化标签，分别为His-VLP和VLP-His，并进行与VLP类似的原核表达过程，表达的3种VLP都能用抗CP的单抗和多抗检测，而只有带有6×His标签的His-VLP和VLP-His能用抗His的单抗检测。经过标准化的蔗糖垫及蔗糖梯度超速离心后，均能见到超速离心管中形成明显条带。但His-VLP的条带比VLP及VLP-His更粗，产量更大。电子显微镜观察His-VLP能见到完整的类似病毒的粒子，表明带6×His标签的CP也能自组装成VLP。虽然所形成的VLP有约15%的不能形成完整的二十面体，但是通过本发明特定的表达条件进行优化表达，可以将不完整的His-VLP降低至约5%。之后利用6×His标签，对His-VLP的表达粗提液进行非变性条件下的亲和纯化，即将已诱导表达的His-VLP菌液进行超声破碎后，经过3次40,000 g 10 min的高速离心，将上清与Ni-NTA柱料按1 L诱导后菌液体积比2 ml柱料的比例在4 ℃混合2 h，然后根据操作说明用含有20 mM咪唑的PBS洗涤液洗涤4次，每次使用3倍柱床体积。最后用含有250 mM咪唑的PBS洗脱液以一个柱床体积将His-VLP进行洗脱，共洗脱3次。
为了验证本发明的效果，通过该亲和层析纯化方法可以得到纯度较高的His-VLP，且通过电镜负染观察证明该方法能得到结构完整的His-VLP。His-VLP不但可通过标准的蔗糖纯化，也能通过亲和层析纯化，虽然后者获得的His-VLP的浓度比蔗糖纯化的浓度低，但总体积更大，适当浓度的蛋白更有利于保存，蛋白总量也足够进行后续实验。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
1．本发明所提供的方法可以获得较大的病毒类似物表达量。
2．本发明亲和层析纯化方式简便，需要仪器设备及试剂成本低。
3． 本发明中其中质粒所编码的基因还可以含有组氨酸标签的神经坏死病毒衣壳蛋白基因，其表达产物可以通过亲和层析纯化。亲和层析纯化所得VLP与蔗糖密度梯度离心纯化所得VLP的完整性相似。
附图说明
图1为实施例1的方法超离纯化后形成条带。
图2为实施例1的VLP的Western blot及蛋白电泳检测结果，其中Western Blot用了抗CP的单抗作为一抗，M表示蛋白质标准分子量（M1为NEB公司的预染蛋白分子量标准(Broad Range)，M2为BioRad公司的精确预染蛋白分子量标准(Precision Plus Protein Standards, All blue）。
图3为实施例1的VLP的电子显微镜观察（150K，bar=100nm）结果。
图4为实施例2的三种VLP的Western blot 检测结果。
图5为实施例2的三种VLP超离纯化后形成条带。
图6为实施例2的His-VLP电镜观察（200K，bar=80nm）结果。
图7为实施例2的两种纯化方式产物的电镜观察结果（放大倍数如图所示，bar=100nm）。
图8为实施例1制备获得的VLP进行多种抗原免疫幼龄海鲈后的抗体反应结果，其中横坐标表示时间（天数），纵坐标表示O.D.值。以相同蛋白量的VLP、GST-CP融合蛋白、重组突变病毒和灭活病毒分别对幼龄海鲈进行腹腔注射免疫，特定时间段采血进行鱼抗血清的间接Elisa，检测抗NNV的特异性抗体的产生情况，以反映不同抗原对幼龄海鲈的免疫刺激作用，也说明了不同抗原的免疫原性的差别。
具体实施方式
为了更好地理解本发明的实质，下面用实例详细说明发明的技术内容，但发明的内容并不局限于此。
实施例1
野生型斜带石斑神经坏死病毒（OGNNV）VLP的生产和纯化。
在原核条件下，利用修饰过的pQE30载体进行野生型衣壳蛋白（capsid protein，CP）的表达，由于需要CP在表达后能在大肠杆菌中有时间和空间进行自组装，因此表达的速度和数量要严格控制，需要在产量和VLP质量之间取得很好的平衡。我们进行了VLP原核表达的优化。将过夜培养的菌液（OD600=2）以1:100同时接种到多个1 L培养基中，分别在37℃培养至OD600=0.4，然后加入IPTG达到终浓度分别为900 μM诱导表达4小时，最后通过SDS检查CP的表达量和通过纯化后电镜负染观察鉴定VLP形成的数量和质量。最终优化得到VLP的生产和纯化方法如下：VLP的生产一次用4 L培养基，用2 L的锥形瓶摇1 L菌。过夜菌（OD600>1.5）按1%接种（10 ml到1 L LA中），37 ℃，250 rpm培养到OD600为0.4左右时加入900 μl的1 M IPTG（终浓度为900 μM），转移至30 ℃，200 rpm表达4 h。然后4000 g冷冻离心10 min收集菌体（等待离心的细菌要放4 ℃）。用冷冻PBS充分重悬，加入30%的Triton X-100至终浓度为1%，再加PMSF至终浓度为2 mM，最终体积大约是4 L菌重悬至40 ml，然后混匀放冰上30 min，每5 min混匀一次。
将悬液进行超声破碎，每次连续破碎15 s，停30 s，总共超声时间在30 min以上，以菌液颜色和粘稠度变化调整时间。然后40,000 g离心10 min，收集上清，共重复离心3次。将上清小心加入含有4 ml 30%蔗糖垫的12 ml超速离心管中，配平后以250,000 g离心1 h，弃上清。以2 ml PBS重悬沉淀，然后小心加入含有40%，30%，20%，10%蔗糖梯度的超离管中，配平后以250,000 g离心4 h。离心后的蔗糖梯度中出现明显的两条白色条带（如图1所示）。将溶液以500 μl为一个分类部分（fraction，F），从上至下分别吸出24 个部分，经过SDS-PAGE和电镜负染观察，发现第二条带（F18-19）的VLP纯度最高（图2），形成VLP的完整性最好（图3）。VLP的Western blot结果（以抗CP的抗体检测）显示蛋白电泳所见条带为CP的单体和三聚体，纯度高，完全满足作为免疫原的需求。以上是制备OGNNV VLP的标准化程序。
实施例2
OGNNV His-VLP的生产和纯化。
这是诺达病毒VLP研制中首次对CP插入标签后能形成VLP的研究并可以通过亲和层析进行纯化。成功生产了VLP后，如何快速低成本的纯化得到VLP成为另外一个重要的研究方向。因此我们尝试为VLP加上可用于纯化的标签，以进行亲和层析纯化，这将大大缩短VLP纯化的时间及降低因超速离心造成的高成本纯化过程。将6×His作为纯化标签，分别插入VLP的N端和C端，分别为His-VLP和VLP-His，并进行与VLP类似的原核表达过程，表达的3种VLP都能用抗CP的单抗和多抗检测，而只有带有6×His标签的His-VLP和VLP-His能用抗His的单抗检测（图4）。经过标准的蔗糖垫及蔗糖梯度离心后，均能见到超速离心管中形成明显条带（图5）。但是明显His-VLP的条带（产量）比VLP及VLP-His更粗，产量更大。His-VLP的F18部分的电子显微镜观察能见到完整的类似病毒的粒子（图6），表明带6×His标签的CP也能自组装成VLP。虽然所形成的VLP有约15%的不能形成完整的二十面体，但是通过表达条件的优化，可以将不完整的His-VLP降低至约5%。之后利用6×His标签，对His-VLP的表达粗提液进行非变性条件下的亲和纯化，即将已诱导表达的His-VLP菌液进行超声破碎后，经过3次40,000 g 10 min的高速离心，将上清与Ni-NTA柱料在4 ℃混合2 h，然后根据操作说明用含有20 mM咪唑的PBS洗涤液洗涤4次，每次使用3倍柱床体积。最后用含有250 mM咪唑的PBS洗脱液以一个柱床体积将His-VLP进行洗脱。如图7所示，His-VLP通过标准的蔗糖纯化及亲和层析纯化都可以得到纯度较高的His-VLP。虽然从图中所见，亲和层析纯化获得的His-VLP的浓度比蔗糖纯化的浓度低，但亲和层析纯化得到的His-VLP的总体积更大（适当浓度的蛋白更有利于保存），蛋白总量也足够进行后续实验。
实施例3
VLP的免疫原性。
为研究VLP的免疫原性及免疫保护性，将实施例1表达、分离、纯化过的VLP作为抗原，免疫幼龄海鲈（平均体重为1.6 g，平均体长为3.3 cm），以检测鱼体产生的抗VLP抗体的反应曲线，研究鱼血清中和病毒的能力及检测免疫后功毒对海鲈的保护率及保护周期。以每克鱼体重注射5 μg蛋白的量，包括VLP、GST-CP（重组蛋白）、灭活病毒（inactive virus）和重组突变病毒（RDV），分别腹腔注射免疫25尾幼龄海鲈（每尾鱼注射少于30 μl），对照组用相同注射量的PBS进行注射。免疫后的7，14，21，28 d，各取5尾鱼进行采血，以间接Elisa检测血清中产生的抗病毒抗体的变化情况。如图8所示，图中数据是以对照组（注射PBS）血清读数均一化后的数据，在相同蛋白量免疫下，对VLP所产生的抗体滴度明显比GST-CP和RDV高，在7，21和28 d时与灭活病毒相近，但是在14 d（免疫后两周）时抗体滴度也高于灭活病毒，并达到最高峰。表明VLP的免疫原性较GST-CP融合蛋白、灭活病毒和RDV都好，是非常好的免疫原，是基因工程疫苗重要的候选免疫原。
Claims (6)
1.一种神经坏死病毒的病毒类似物的制备方法，其特征在于包括以下步骤：
（1）在原核条件下，将已含有编码神经坏死病毒衣壳蛋白基因的 pQE30质粒载体的大肠杆菌，进行神经坏死病毒病毒类似物的表达；所述的载体是重组了带组氨酸标签的神经坏死病毒基因的pQE30质粒；表达的条件为：将OD600=1.5的大肠杆菌菌液按照1%的质量分数接种到培养基中，于37 ℃，250 rpm下培养至OD600为0.3-0.5时，加入异丙基-β-D-硫代半乳糖苷至异丙基-β-D-硫代半乳糖苷终浓度为900 μM，转移至25-30 ℃，200 rpm的转速下继续培养3-4小时完成表达；
（2）表达结束后，破裂菌体、分离及纯化获得神经坏死病毒的病毒类似物；所述的纯化是将通过超声破碎后离心分离所得的上清粗提液与Ni-NTA柱料按1 L诱导后菌液体积比2 ml柱料的比例在4 ℃混合2 h，用含有20 mM咪唑的PBS洗涤液洗涤4次，每次使用3倍柱床体积；最后用含有250 mM咪唑的PBS洗脱液以一个柱床体积将His-VLP进行洗脱，共洗脱3次。
2.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于所述的培养基是Luria-Bertani培养基。
3.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于所述的破裂菌体是在表达结束后的菌液中加入Triton X-100至其终浓度为1%；再加入苯甲基磺酰氟至其终浓度为2 mM；混匀后冰上放置，再进行超声破碎。
4.如权利要求3所述的制备方法，其特征在于所述的冰上放置时间为30分钟，每隔5分钟混匀一次；超声破碎总作用时间为30分钟，分次进行，每次连续超声10-15秒，停30秒。
5.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于所述的分离是将破裂后的菌液在40,000 g下离心10 min，收集上清。
6.如权利要求5所述的制备方法，其特征在于所述的分离步骤所获得的上清液继续进行离心及上清的收集，共离心及收集3次获得上清。
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