CN113735943A - 一种重组的非洲猪瘟病毒p72亚单位蛋白和制备方法及其应用 - Google Patents

一种重组的非洲猪瘟病毒p72亚单位蛋白和制备方法及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种重组的非洲猪瘟病毒p72亚单位蛋白及其制备方法及其应用，其氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示，所述制备方法如下：1)将密码子优化后的非洲猪瘟病毒pB602L蛋白编码基因序列克隆到原核表达载体中，得到含有非洲猪瘟病毒pB602L亚单位蛋白编码基因的重组质粒；2)再将所述含有非洲猪瘟病毒pB602L亚单位蛋白编码基因的质粒重组表达载体转化大肠杆菌感受态细胞中，得到重组工程菌；3)中重组工程菌进行诱导表达，并从菌体裂解上清中纯化非洲猪瘟pB602L亚单位结构蛋白。本发明能够提供一种可大规模工业化生产的非洲猪瘟结构蛋白pB602L亚单位蛋白且制备方法简单、成本低能够达到国家现有标准。

Description

一种重组的非洲猪瘟病毒p72亚单位蛋白和制备方法及其 应用
技术领域
本发明属于兽用生物制品技术领域。涉及一种非洲猪瘟p72蛋白大规模制备方法和应用。
背景技术
非洲猪瘟(African swine fever，ASF)是可引起的猪的急性、热性、高度接触性传染病，发病率及死亡率高达100％。家猪和野猪是ASFV自然感染的唯一哺乳动物宿主，对畜牧业影响巨大。该病最早在1921年于非洲的肯尼亚国家确认发生，对非洲乃至全球多个国家的养猪业造成极大损失。2018年8月份以来，在我国多个省份爆发，给我国养猪业造成毁灭性打击。该病是世界动物卫生组织A类疫病，在我国被列为一类动物传染病。
国内外学者对非洲猪瘟做了大量的研究工作，但研究发现：常规制备的非洲猪瘟灭活苗效果不明显，而自然弱毒苗或重组弱毒苗保护效果好，但安全性差，易造成散毒。目前，世界上尚未有有效预防非洲猪瘟的疫苗和治疗该病的药物发现，迫切需要新型疫苗的研发和生产来预防非洲猪瘟。
非洲猪瘟病毒(African swine fever virus，ASFV)是具有囊膜的DNA病毒。病毒粒子平均直径200nm，呈二十面体对称结构，表面有含糖脂类的囊膜覆盖。其病毒基因组为双股线性DNA，大小为170-190kb，整个基因组大约有150个ORF，编码150-200中蛋白质。由外至内分五层结构：分别为外层囊膜结构、外层衣壳蛋白、内层囊膜结构、内层衣壳蛋白，病毒核酸。P72蛋白是非洲猪瘟表面外层衣壳最主要结构蛋白。其蛋白含量约占病毒粒子蛋白量的32％。该蛋白由ASFV病毒B646L基因编码的，分子量大小约32kD的蛋白。研究发现，p72蛋白相对比较保守，有稳定的抗原性。且与病毒进入宿主细胞的过程有关，针对p72的抗体能够抑制病毒与巨噬细胞的结合。因此，p72是一个很好的保护性抗原。目前，已经有P72蛋白能成功的表达在原核系统，但表达产量低，且以包涵体形式存在，(具体参见公开号为CN103805615的发明专利)结构折叠不正确，无法满足基因工程亚单位疫苗的开发。pB602L蛋白由B602L基因编码的病毒非结构蛋白。目前的研究发现，该蛋白是病毒复制晚期的一种非结构蛋白，其作为分子伴侣，促进衣壳蛋白p72蛋白的正确折叠，若缺少pB602L蛋白，会导致衣壳蛋白p72不能正确折叠，导致病毒装配过程发生改变不能形成二十面体，最终病毒不能正确组装成病毒颗粒。因此，pB602L对p72蛋白的正确折叠非常关键，因此要想成功大量表达p72蛋白必须同时表达pB602L。Liu等利用HEK293同时表达p72和B602L得到了三聚体p72蛋白，首次展示了p72的结构(Structure of the African swine fever virus majorcapsid protein p72，2019)，但该方法在HEK293中尚不能大量生产，对于后续的开发仍然是个挑战。专利CN111363016A，文章(Expression and purification of p72 trimers assubunit vaccine candidate，2020)等公开了一种在酵母中生产重组P72的方法，虽然酵母操作相对于真核细胞发酵周期短，成本较低，但该方法生产的p72蛋白产量不高50mg/L,且p72不纯无法去除B602L。不利于后续亚单位疫苗评价。
发明内容
为解决现有技术的上述技术问题，本发明提供一种重组的非洲猪瘟p72亚单位蛋白，所述非洲猪瘟病毒p72亚单位蛋白主要为三聚体结构的p72亚单位蛋白，其中，所述三聚体结构的p72亚单位蛋白为非洲猪瘟病毒结构蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示，所述三聚体结构的p72亚单位蛋白占总p72亚单位蛋白量不低于75％。本发明所述重组的非洲猪瘟p72亚单位蛋白的纯度高，几乎不含B602L，且基本为三聚体结构。
在本发明的优选技术方案中，所述三聚体结构的p72亚单位蛋白占总p72亚单位蛋白含量不低于80％。
在本发明的优选技术方案中，所述三聚体结构的p72亚单位蛋白占总p72亚单位蛋白量不低于85％。
在本发明的优选技术方案中，所述非洲猪瘟病毒p72亚单位蛋白占总蛋白含量不低于80％，且pB602L亚单位蛋白不高于5％。本发明还提供一种非洲猪瘟p72亚单位蛋白的制备方法，该方法能有效去除B602L。
在本发明的优选技术方案中，本发明提供了一种可在昆虫-杆状病毒表达系统中表达p72蛋白的优化后的OPTI-p72的核苷酸序列。为了能够在昆虫细胞sf9或High Five5中高效表达P72蛋白，本发明根据GenBank:FR682468.1上已经存在公开的序列，我们对p72基因进行分析，首先对p72基因编码的密码子的在昆虫细胞表达中的密码子偏好性进行了优化，其次对p72基因的GC含量、mRNA，重复序列等在昆虫细胞的稳定性进行优化。所述最终优化后OPTI-p72的核苷酸序列如SEQ ID NO 1所示。
在本发明的优选技术方案中，优化后的OPTI-p72直接在昆虫杆状病毒表达系统中也不能大量得到可溶性表达p72，为了能够得到大量的可溶性P72蛋白，本发明在利用双表达载体pFastBacDual在同一个载体同时表达OPTI-p72核苷酸序列和OPTI-pB602L核苷酸序列，所述的OPTI-pB602L伴侣蛋白的基因编码序列如SEQ ID NO 4所示。
在本发明的优选技术方案中，优化后的OPTI-p72核苷酸序列和OPTI-pB602L核苷酸序列也可分别克隆到pFastBac1载体上。
为了方便使用亲和层析的方法纯化融合蛋白，根据本发明的优选技术方案，在如SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列的氨基末端或羧基末端连接有FLAG、poly-His、c-myc、Strep-tagⅡ中的一种标签。
在本发明的优选技术方案中，为了能够在昆虫杆状病毒中高效可溶性表达P72蛋白，本发明将OPTI-p72核苷酸序列导入杆状病毒表达载体。所述表达载体可以是任何一种杆状病毒表达载体，所述表达载体具体但不限于pFastBacDual表达载体、pFastBac1表达载体。优选地，所述表达载体为pFastBacDual载体。
在本发明的优选技术方案中，为了能够在昆虫杆状病毒中高效可溶性表达P72蛋白，必须将p72和B602L共表达；所述共表达是指将p72和B602L放到一个表达载体筛选制备成一个病毒，也可以放在不同的表达载体，筛选两个病毒共同感染sf9细胞或HighFive细胞发酵表达p72蛋白。
根据本发明的再一个方面，本发明还提供一种非洲猪瘟p72亚单位蛋白的大规模制备方法，该方法能有效去除B602L。所述大规模制备方法包括以下步骤：
1)重组杆状病毒的制备：为将密码子优化后的非洲猪瘟病毒p72蛋白和密码子优化后的pB602L蛋白表达基因经克隆、转化、感染sf9细胞和/或HighFive5细胞，以得到含有非洲猪瘟病毒p72亚单位蛋白表达基因的重组杆状病毒；
2)发酵培养：再将所述重组杆状病毒进行扩大培养后进行发酵，收集培养液；
3)亚单位蛋白纯化：发酵培养步骤2)中所述培养液进行纯化，纯化后得到重组的非洲猪瘟病毒p72亚单位可溶性蛋白。
在本发明的优选技术方案中，在步骤1)中，所述将密码子优化后的非洲猪瘟病毒p72蛋白和密码子优化后的pB602L蛋白表达基因经克隆、转化、感染sf9细胞和/或HighFive5细胞为将密码子优化后的非洲猪瘟病毒p72蛋白和密码子优化后的pB602L蛋白表达基因同时克隆到pFastBac1转移载体，经克隆、转化、感染sf9细胞和/或HighFive5细胞，再经发酵培养及纯化，以得到含有非洲猪瘟病毒p72亚单位蛋白表达基因的重组杆状病毒rBac-p72-pB602L。
在本发明的优选技术方案中，在步骤1)中，所述将密码子优化后的非洲猪瘟病毒p72蛋白和密码子优化后的pB602L蛋白表达基因经克隆、转化、感染sf9细胞和/或HighFive5细胞为将密码子优化后的非洲猪瘟病毒p72蛋白和密码子优化后的pB602L分别克隆到pFastBac1转移载体，经克隆、转化、感染sf9细胞，以得到含有非洲猪瘟病毒p72亚单位蛋白表达基因的重组杆状病毒rBac-p72和含有非洲猪瘟病毒pB602L亚单位蛋白表达基因的重组杆状病毒rBac-pB602L。
以上所述的大规模制备方法，其特征在于，所述p72核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。所述pB602L核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示
根据本发明的所述大规模制备方法，所述步骤1)的操作步骤为：首先将密码子优化后的非洲猪瘟病毒p72蛋白表达基因克隆到pFastBacDual的EcoRI/HindIII位点，构建pFastBacDual-p72，然后将密码子优化后的非洲猪瘟病毒pB602L蛋白表达基因克隆到pFastDual-p72转移载体的XhoI/KpnI位点，经克隆、转化DH10Bac大肠杆菌中，蓝白斑筛选获得Bacmid-p72-pB602L，经感染sf9细胞得到含有非洲猪瘟病毒p72亚单位蛋白表达基因的重组杆状病毒rBac-p72-pB602L；或者，将密码子优化后的非洲猪瘟病毒p72蛋白和pB602L分别克隆到pFastBac1转移载体EcoRI/HindIII位点，经克隆、转化DH10Bac，蓝白斑筛选获得Bacmid-P72和Bacmid-pB602L，经感染sf9细胞得到含有非洲猪瘟病毒p72亚单位蛋白表达基因的重组杆状病毒rBac-p72和含有非洲猪瘟病毒pB602L亚单位蛋白表达基因的重组杆状病毒rBac-pB602L。
优选的，所述杆状病毒表达系统为真核昆虫杆状病毒表达系统。
在本发明的优选技术方案中，在步骤2)中，将所述重组杆状病毒进行扩大培养的方法包括：
将所述重组杆状病毒转染sf9细胞，培养72h，得到P1代重组杆状病毒；
将所述第一代重组杆状病毒转染sf9细胞，培养72h，得到P2代重组杆状病毒；
重复转染sf9细胞的步骤，获得Pn代重组杆状病毒；
其中所述n为自然数；
步骤2)中所述发酵培养的细胞为sf9细胞和/或HighFive5细胞，细胞密度为1×106-2.5×106/ml,感染用的病毒为rBac-p72-pB602L，按照感染复数(MOI)为0.2-2的接种量接种到sf9或HighFive上；或rBac-p72和rBac-pB602L，按照感染复数(MOI)为0.1-1的接种量同时接种到sf9或HighFive上。
具体地，所述发酵反应器包括1L、5L、15L、50L、200L，培养方式采用分批培养或分批加补料培养。
收集步骤2)中发酵液和细胞裂解液使用镍柱、anti-flag亲和层析柱对所述培养液进行纯化。在纯化过程中我们意外的发现，当p72三聚体纯度达75％以上，B602L容易有效去除。
利用本方法获得重组p72蛋白能稳定的保存在4℃和-20℃，以该蛋白免疫动物安全性好，能产生高滴度的p72抗体。
与现有技术相比，本发明公开的表达序列、表达载体以及相应的纯化制备方法克服了现有技术中的缺陷，解决了不能直接大量可溶性表达p72蛋白且产量低的问题。本发明能够在昆虫杆状病毒系统中直接可溶性表达p72，克服了现有技术中的诸多问题，且制备方法简单、表达量高、成本低。
附图说明
图1表示质粒酶切图谱；图1A，pFastBacDual-p72-B602L质粒酶切图谱；图1B，pFastBac1-p72质粒酶切图谱；图1C，pFastBac1-B602L质粒酶切图谱。
图2表示质粒双酶切鉴定结果：M是DNA Marker：DL10000 Marker；图2A，1-3为pFastBacDual-p72-B602L质粒HindIII/EcoRI酶切,条带大小分别为6756bp和2044bp，质粒酶切正确酶切鉴定构建正确；图2B,1-4为pFastBac1-p72质粒1-4号EcoRI/HindIII双酶切,条带大小分别为4693bp和1959bp,质粒酶切正确；图2C，1-2为pFastbac1-B602L质粒HindIII-/EcoRI双酶切,条带大小分别为4963bp和1723bp,质粒酶切正确。
图3表示重组表达p72的杆状病毒感染sf9细胞western-blot结果M是蛋白Marker，1是未感染杆状病毒的sf9细胞上清；2是rBac-p72单独感染的细胞裂解上清中表达量很低只有微弱的表达，3是rBac-p72和rBac-B602L共感染sf9细胞裂解上清；4是rBac-p72-B602L感染sf9细胞。rBac-p72单独感染的细胞裂解上清中表达量很低只有微弱的表达，rBac-p72和rBac-B602L共感染sf9细胞中表达量较高，说明在B602L存在的情况下促进了p72的表达。
图4表示重组p72的分子筛结果：峰1的出峰体积8.69ml，峰2的出峰体积为10.57ml，分子量均大于670kDa，为纯化后的p72的多聚体；峰3的出峰体积为15.39ml，分子量在158kDa与440kDa之间，为纯化后的p72三聚体(p72三聚体大小约232kDa)。
图5表示重组p72的SDS-PAGE纯化检测结果：1是蛋白Marker，2是纯化后的p72蛋白。
图6表示p72蛋白纯化后Western-blot检测结果：1是蛋白Marker，2是p72蛋白。
具体实施方式
以下将结合附图和实施例对本发明做进一步说明，本发明的实施例仅用于说明本发明的技术方案，并非限定本发明。
本发明实施例中所使用的菌株、质粒和试剂均为市售产品。
实施例1 p72蛋白表达及制备
1.1非洲猪瘟p72蛋白的选择
非洲猪瘟结构蛋白p72是由B646L基因编码的一段多肽，已有研究表明，p72蛋白的正确折叠需要pB602L蛋白参与，若缺少pB602L蛋白，p72蛋白的表达会显著减少，现有的报道，均不能有效高表达生产p72蛋白。目前还没有报道在杆状表达系统中能大规模可溶性表达及纯化得到该蛋白，这也是本发明所要解决的一个重要的技术问题。
1.2非洲猪瘟p72、pB602L蛋白密码子优化
本实验室以2018年在中国报道流行的非洲猪瘟毒株亚型，参考Georgia 2007/1全基因序列(GenBank：FR682468.1)为模板，对编码非洲猪瘟p72、pB602L蛋白的B602L的核苷酸序列进行密码子优化，得到OPTI-p72序列、OPTI-pB602L序列，如SEQ ID NO.1所示和SEQID NO.4所示，为了后续检测和纯化方便，在P72的N端引入了flag抗体标签，B602L的C端引入了HA标签。该序列合成工作委托南京金斯瑞生物科技有限公司完成。
1.3 pFastBacDual-p72-pB602L重组质粒构建
1.3.1 PCR扩增目的片段OPTI-p72
1.3.1.1 PCR反应
(1)引物设计及合成
上游引物:5’-CGGAATTCGACTACAAAGACCATGACGGT-3’
下游引物:5’-GACAAGCTTAGGTAGAGTACCTCAGCAC-3’
(2)以优化后的OPTI-P72为模板，加样体系50μL，如下表所示：
Figure BDA0003065365890000061
Figure BDA0003065365890000071
PCR扩增程序：
Figure BDA0003065365890000072
1.3.1.2 PCR产物进行胶回收
(1)标记好样品收集EP管、吸附柱以及收集管；
(2)称取标记好的空的EP管重量，并记录数值；
(3)将单一的目的DNA条带在切胶仪上从琼脂糖凝胶中用手术刀小心切下放入干净的1.5mL离心管中；
(4)向步骤(3)中的1.5mL离心管中加入600μL PC buffer，50℃水浴放置5min左右，其间不断温和上下翻转离心管，以确保胶块充分溶解；
(5)柱平衡：向吸附柱CB2中(吸附柱预先放入收集管中)加入500μL平衡液BL，离心12,000rpm/min，1min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中；
(6)将步骤(5)所得溶液加至吸附柱CB2中，静置2min，10,000rpm/min，离心30s，倒掉收集管中的废液，再将吸附柱CB2放入收集管中；
(7)向吸附柱中加入600μL漂洗液PW buffer，静置3min，离心10,000rpm/min，30s，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CB2放入收集管中；
(8)重复步骤(7)；
(9)空吸附柱离心，12,000rpm/min，2min，尽量除去漂洗液，将吸附柱置于室温放置10min，彻底晾干；
(10)将吸附柱CB2放入收集管中，向吸附膜中间位置悬空滴加50μL Elutionbuffer(65℃预热)，静置3min，离心12,000rpm/min，2min；
(11)从离心机中取出步骤(10)中离心管，丢弃中间的吸附柱CB2，盖上离心管盖子，保留离心管中的DNA样品；
(12)将步骤11中的DNA样品置于4℃保存，准备琼脂糖凝胶电泳鉴定胶回收DNA片段。
1.3.2 PCR产物及载体双酶切反应
(1)标记好需要用到的1.5mL EP管，在1.5mL EP管中按照下表进行加样、混匀：50μL反应体系
Figure BDA0003065365890000081
(2)将步骤(1)中的1.5mL EP管置于相应酶最适温度恒温水浴锅中，水浴2-3h。
双酶切产物胶回收：取出上述双酶切体系，进行琼脂糖凝胶电泳以回收其中的DNA片段，方法同1.2.1中PCR产物胶回收。
1.3.3连接反应
(1)准备洁净的1.5mL EP管若干，做好标记，置于EP管架上待用。
(2)在1.5mL EP管按照下表进行加样、混匀。
Figure BDA0003065365890000082
(3)按照步骤(2)中表格完成加样后，将每个10μl反应体系置于16℃低温冷却液循环机中，水浴10-16h；
(4)取出步骤(3)中EP管，将其置于65℃水浴锅中，水浴15min；
(5)取出步骤(4)中的EP管，置于4℃保存。
1.3.4转化反应
(1)将10μL连接反应液快速加入100μL感受态细胞中，并吹打混匀，冰浴30min；
(2)取出样品管，置于42℃水浴100s，然后立即冰浴2min；
(3)取出样品管，在超净工作台中，向样品管中加入600μL液体LB培养基，然后将样品管置于37℃恒温摇床，220rpm/min，培养1h；
(4)涂板：取出步骤(3)中样品管，室温离心8,000rpm/min，2min，去掉600μL上清液体，剩余上清液重悬管底部的菌体，将重悬的菌液放入相应的转化平板中心，用涂菌棒将转化平板中心的菌液均匀铺开。
(5)将转化步骤(4)平板正置于生化恒温培养箱中，37℃培养1h后，将转化平板倒置进行培养15h；
(6)观察转化结果。
1.3.5质粒抽提与双酶切鉴定
1.3.5.1质粒抽提
(1)用10μL移液枪头从转化平板中挑取单克隆至5mL含氨苄抗性的LB液体培养基中，37℃，220rpm/min摇菌过夜；
(2)将菌液移至1.5mL EP管中，室温离心，12,000rpm/min，2min，弃上清；
(3)向步骤(2)的EP管中加入250μL质粒提取试剂P1 buffer，彻底悬浮菌体；
(4)向步骤(3)溶液中加入250μL P2 buffer，立即温和颠倒离心管5-10次混匀，室温静置2-4min；
(5)向步骤(4)溶液中加入350μL P3 buffer，立即温和颠倒离心管5-10次混匀；室温静置2-4min；
(6)将步骤(5)溶液，室温离心，14,000rpm/min，10min；
(7)将步骤(6)中上清溶液移至吸附柱中心，室温离心，12,000rpm/min，30s，倒掉收集管中液体；
(8)向吸附柱中心加入500μL Buffer DW1，室温离心，12,000rpm/min，30s，倒掉收集管中液体；
(9)向吸附柱中心加入500μL wash solution，室温离心，12,000rpm/min，30s，倒掉收集管中液体，重复一次；
(10)空吸附柱，室温离心，12,000rpm，2min。
(11)将吸附柱放入一个干净的1.5mL离心管中，向吸附膜中心加入30μL Elutionbuffer，室温静置5min，室温离心，12,000rpm，2min。保存管中DNA溶液。
1.3.5.2双酶切鉴定
(1)标记好需要用到的1.5mL EP管，按照下表进行加样：20μL反应体系
Figure BDA0003065365890000101
(2)将步骤(1)中的EP管20μL反应体系置于37℃恒温水浴锅中，水浴2h。
(3)将步骤(2)中的双酶切体系样品进行琼脂糖凝胶电泳，检查插入片段大小是否正确；将构建正确的质粒为pFastBacDual-p72。
(4)以优化后的OPTI-B602L为模板，按照上述1.3构建pFastBacDual-p72的方法，很容易将B602L克隆到pFastBacDual-p72的XhoI和KpnI酶切位点处，构建最终载体pFastBacDual-p72-B602L。载体构建示意图如图1所示。将pFastBacDual-p72-B602L酶切验证，实验结果见图2A：1-3:pFastBacDual-p72-B602L质粒HindIII/EcoRI酶切,条带大小分别为6756bp,2044bp,质粒酶切正确酶切鉴定构建正确。
(4)选择插入片段正确的克隆送测序公司测序。将测序结果正确的质粒保存备用。
1.4pFastBac1-p72和pFastBac1-B602L载体构建
利用1.3上述试验方法，很容易将优化后的opti-p72和opti-B602L基因分别克隆到pFastBac1的EcoRI和HindIII酶切位点，构建pFastBac1-p72和pFastBac1-B602L，实验结果如图2B和2C所示:图2B,1-4为pFastBac1-p72质粒1-4号EcoRI/HindIII双酶切,条带大小分别为4693bp和1959bp,质粒酶切正确；图2C，1-2为pFastbac1-PB602L质粒HindIII-/EcoRI双酶切,条带大小分别为4963bp和1723bp,质粒酶切正确。
1.5表达p72蛋白的重组杆状病毒rBac-p72-B602L制备
1)将实施例1.3中所述的表达非洲猪瘟p72重组蛋白的载体pFastBacDual-p72-B602L，转化大肠杆菌DH10 Bac培养后，筛选提取含有重组表达p72和B602L基因的阳性质粒，并命名为Bacmid-p72-B602L。
2)将上一步获得的重组杆状病毒质粒Bacmid-p72-B602L，利用脂质体转染的方法，转染sf9细胞获得P1代重组杆状病毒，命名为rBac-p72-B602L。
3)利用同样的方法可获得单独表达p72的重组杆状病毒rBac-p72和单独表达B602L的rBac-B602L。
1.6重组杆状病毒rBac-p72-B602L表达p72 western-blot检测
将上述1.5制备的重组杆状病毒rBac-p72-B602L或rBac-p72或rBac-p72和rBac-B602L分别以0.1个MOI共感染sf9细胞，培养72h，分别收集细胞和上清，取细胞和上清样品进行SDS-PAGE电泳，转膜，5％的脱脂奶粉封闭1h，PBST漂洗3-5次，以1:5000稀释anti-flag鼠单克隆抗体，室温摇床上孵育2h，PBST漂洗3-5次，HRP标记的二抗羊抗鼠室温孵育1h，PBST漂洗3-5次，利用超敏ECL发光液，进行显色。检测结果如图3所示。rBac-p72单独感染的细胞裂解上清中表达量很低只有微弱的表达，rBac-p72-B602L感染、rBac-p72和rBac-B602L共感染细胞裂解上清中表达量较高，说明在B602L存在的情况下促进了p72的表达。
1.7非洲猪瘟p72蛋白的纯化
在制备p72纯化过程中，通过优化纯化条件，我们意外的发现当p72三聚体纯度达到75％以上，B602L的含量会大大降低，SDS-PAGE上检测不到B602L。
将上述1.6获得的重组杆状病毒分别以MOI为1感染High FIVE细胞，培养三天后收获病毒上清和细胞。
1.7.1纯化
细胞破碎取收获的细胞100g(提前化冻)按配比(1g细胞：10mL裂解液)加入1000mlBuffer A重悬，2～8℃下搅拌混匀(无块状固体)1h后，25000×g离心(4℃)10min，取上清作为样品。收获的细胞上清经0.45μm的滤膜过滤，也作为样品。
1)柱平衡：取50ml anti-DYKDDDDK G1亲和填料装入空层析柱中。用Buffer A平衡2～3个柱体积(CV)，流速10mL/min。
2)上样细胞破碎后上清或过滤的培养上清进行上样，流速2mL/min，并收集流穿液
3)洗内毒素用30CV的Washing buffer进行清洗，至少清洗2h。
4)平衡用15CV的Buffer A冲洗柱子。
5)洗脱用Buffer B进行蛋白洗脱，流速15ml/min，洗脱后立即用中和液进行中和(1ml洗脱液：15μl中和液)。
6)透析取洗脱后的样品加入5％甘油(质量体积比)进行透析。
7)除菌过滤在生物安全柜中，过0.22μm低蛋白结合针头滤器，或大量蛋白溶液过灭菌的0.22μm滤膜的Nalgene的滤器，过滤好的蛋白溶液样品存放于-80℃冰箱。
蛋白浓度和纯度测定：采用BCA法测定蛋白浓度，再根据纯化时取用的上清体积和纯化后所得蛋白总量计算蛋白的得率，如本实施例中取用的细胞上清为1000ml，纯化后所得蛋白体积为100ml，浓度为1mg/mL，经过计算蛋白得率约为100mg/L；采用SDS-PAGE方法检测纯度，纯度都能达到90％以上，如图4所示。适合大规模生产所需。
Buffer A：50mM Tris，500mM NaCl，用超纯水完全溶解后，调节pH值至8.0±0.01，0.8μm膜过滤后2～8℃保存。
Washing buffer：50mM Tris，500mM NaCl，用超纯水完全溶解后，调节pH值至8.0±0.01，0.8μm膜过滤后2～8℃保存。
Buffer B：100mM甘氨酸，500mM NaCl，用超纯水完全溶解后，调节pH值至3.5±0.01，0.8μm膜过滤后2～8℃保存。
中和液：1M Tris-HCl，用超纯水完全溶解后，调节pH值至9.0±0.01，0.8μm膜过滤后2～8℃保存。
透析母液：50mM Tris，500mM NaCl，用超纯水完全溶解后，调节pH值至8.0±0.01，0.8μm膜过滤后2～8℃保存。
透析液：50mM Tris，500mM NaCl，10％甘油，用超纯水完全溶解后，调节pH值至8.0±0.01，0.8μm膜过滤后2～8℃保存。
1.7.2分子筛柱检测
1.7.2.1 SuperoseTM 6 Increase 10/300GL柱平衡
用超纯水平衡2个柱体积，排出乙醇保存液；然后用流动相平衡2个柱体积，流速为0.4mL/min，压力控制在1.8MPa以内。
1.7.2.2进样
用进样环进样蛋白0.5mL(浓度0.5mg/mL)，流速为0.4mL/min，控制压力为1.8MPa。
1.7.2.3运行
进样完成后，改inject状态为load状态，运行，流速为0.4mL/min，出峰后进行样品收集，1mL/管。
分子筛结果如图4所示：从蛋白分子筛出峰结果可以看出，峰1的出峰体积8.69ml，峰2的出峰体积为10.57ml，分子量均大于670kDa，为纯化后的p72的多聚体；峰3的出峰体积为15.39ml，分子量在158kDa与440kDa之间，为纯化后的p72三聚体(p72三聚体大小约232kDa)。
从图中可以看出，峰3面积(49.8966)占总面积(58.3792)的百分比为85％，这说明纯化后的p72蛋白在未进一步优化缓冲体系前就有85％为三聚体，这符合预测分析。
1.8非洲猪瘟p72蛋白的鉴定
1.8.1 SDS-PAGE检测
将实施例1.7纯化后的蛋白进行SDS-PAGE检测，所用样品中p72蛋白浓度为2μg/孔，结果如图5所示：从图中可以计算出，纯化后的p72蛋白SDS-PAGE纯度为85％，分子量约为97kD。
1.8.2 WESTERN-BLOT检测
将实施例1纯化后的蛋白进行WESTERN-BLOT检测，转膜时间为1h，所用抗体为Antiflag-Tag Mouse，稀释比为1:2000，孵育时间为90min，结果如图6所示：从图中结果可以看出，纯化后的p72蛋白能与抗体发生有效结合。
1.8重组p72蛋白免疫原性实验
1.8.1疫苗制备
1.8.1.1按油佐剂：水相(v:v)＝54:46的比例配比。
1.8.1.2抗原准备：将纯化后的重组非洲猪瘟p72蛋白经过0.22μm滤膜更除菌过滤，检测浓度及纯度，备用。
1.8.1.3水相配制：根据疫苗中p72蛋白的含量，用1XPBS将p72蛋白稀释至适当浓度，搅拌10min，使之充分混匀。
1.8.1.4油相准备：按照1.9.1.1的水油比例，量取适量ISA 201VG佐剂。
1.8.1.5乳化：乳化要求油相温度为33±1℃，开启搅拌器，搅拌转速为350rpm/min，在搅拌条件下将水相匀速加入至油相，并持续搅拌10min，使水相和油相充分混合，乳化成双向油乳剂疫苗。
1.8.1.6稳定：乳化结束后，关闭搅拌器，将乳化好的疫苗放入20℃稳定1h。
1.8.1.7分装、贮存：根据免疫需求进行分装，检验合格后于2-8℃进行保存备用。
1.8.2免疫原性实验
1.8.2.1免疫实验
取6周龄左右2-3kg的健康新西兰大白兔10只，随机分成2组，每组5只，用1.9.1中制备疫苗进行免疫实验。试验组免疫5只；对照组用PBS免疫5只。分别于免前，一免后14天，二免后14天进行采血，分离血清进行ELISA检测抗体。
1.8.2.2 ELISA检测实验
(1)包被：用包被液(50mM碳酸盐缓冲液，pH 9.5)将纯化的p72蛋白稀释至0.5μg/ml，于96孔板加入100μl/孔，封口膜封好后4℃冰箱放置过夜；
(2)洗涤：从冰箱取出酶标板后，用PBST洗板5次；
(3)封闭：每孔加入200μl封闭液(5％脱脂奶)，封口膜封好后37℃孵育2h；
(4)洗涤：同2；
(5)血清稀释：将用p72蛋白免疫后的兔子的免前血清、一免后14天、二免14天血清用封闭液稀释，免前血清100倍稀释起始(10μl血清+990μl血清稀释液),免疫后血清从5000倍稀释起始(先100倍稀释(10μl血清+990μl血清稀释液)，再50倍稀释(20μl(100x)+980μl血清稀释液；
(6)2x倍比稀释样品上样：取步骤4酶标板，取稀释好的血清200l按蛋白包被的方向加入第一孔中(纵向稀释加入第一横排孔(1～12孔)，横向稀释加入第1纵列孔(A～H孔)),其余各均加100l血清稀释液，然后用多道移液器从第一孔中取100ml样品加入到第二孔中混匀，依次倍比稀释下去。纵向稀释至G孔止，横向稀释至第11孔止(G孔与11列孔混匀后吸取100l稀释样丢弃；纵向H孔，横向12列孔为空白对照孔)
(7)洗涤：同(2)；
(8)加样：加入稀释血清，同时用封闭液做阴性对照，37℃孵育1h；
(9)洗涤：同(2)；
(10)加二抗：每孔加入稀释(稀释比为1:5000)的HRP标记的羊抗兔IgG二抗100μl，37℃孵育0.5h；
(11)洗涤：同(2)；
(12)显色：避光条件下每孔加入100μl的TMB显色液，37℃孵育10min；
(13)终止：每孔加入50μl终止液(2M H2SO4)，终止反应；
(14)检测：于450nm波长测定样品OD值，分析数据；
(15)结果如下表所示：包被的p72蛋白的能与p72蛋白免疫后兔血清特异性结合，免前及对照组的抗体效价为1:50～200；一免14天后免疫组抗体效价显著增高抗体效价达1:25600～1:51200，二免14天后免疫组抗体效价更抗体效价达1:128000～1:512000。这说明，p72蛋白可以作为Elisa试剂盒的抗原，且免疫后的血清能与p72蛋白特异性结合，为后期开发一种检测非洲猪瘟感染和免疫的诊断试剂盒及作为亚单位疫苗候选抗原奠定基础。
Figure BDA0003065365890000151
本发明通过上面的实施例进行举例说明，但是，应当理解，本发明并不限于这里所描述的特殊实施例和实施方案。在这里包含这些特殊实施例和实施方案的目的在于帮助本领域中的技术人员实践本发明。任何本领域中的技术人员很容易在不脱离本发明精神和范围的情况下进行进一步的改进和完善，因此本发明只受到本发明权利要求的内容和范围的限制，其意图涵盖所有包括在由附录权利要求所限定的本发明精神和范围内的备选方案和等同方案。
Figure BDA0003065365890000161
Figure BDA0003065365890000171
Figure BDA0003065365890000181
Figure BDA0003065365890000191
Figure BDA0003065365890000201
Figure BDA0003065365890000211
序列表
<110> 浙江海隆生物科技有限公司
<120> 一种重组的非洲猪瘟病毒p72亚单位蛋白和制备方法及其应用
<160> 6
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 4
<211> 1938
<212> DNA
<213> 密码子优化后的p72蛋白核苷酸序列(DNA)
<400> 4
atggcttccg gtggcgcttt ctgcctgatc gctaacgacg gcaaggccga caagatcatc 60
ctggcccagg acctgctgaa ctcccgcatc agcaacatca agaacgtgaa caagtcttac 120
ggcaagccag accctgaacc caccctgtca cagatcgagg aaactcacct ggtgcacttc 180
aacgctcact tcaagccata cgtgcctgtc ggcttcgagt acaacaaggt ccgtcctcac 240
accggtactc ccaccctggg caacaagctg accttcggaa tcccacagta cggtgacttc 300
ttccacgaca tggtcggcca ccacatcctg ggagcttgcc actccagctg gcaggacgcc 360
cctatccagg gaacctccca gatgggagcc cacggtcagc tgcagacttt cccaaggaac 420
ggctacgact gggacaacca gacccctctg gaaggagctg tgtacactct ggtcgacccc 480
ttcggaaggc ccatcgtgcc aggtactaag aacgcctaca gaaacctggt ctactactgc 540
gagtaccctg gagaaaggct gtacgagaac gtgagattcg acgtcaacgg taacagcctg 600
gacgagtact cttcagacgt gaccactctg gtcaggaagt tctgcatccc tggtgacaag 660
atgaccggct acaagcacct ggtgggccag gaagtgtctg tcgagggcac ttcaggaccc 720
ctgctgtgca acatccacga cctgcacaag ccacaccagt ctaagcctat cctgaccgac 780
gaaaacgaca ctcagagaac ctgctcacac actaacccaa agttcctgtc ccagcacttc 840
cctgagaaca gccacaacat ccagaccgct ggcaagcagg acatcactcc catcaccgac 900
gccacttacc tggacatccg ccgtaacgtg cactactctt gcaacggacc tcagactccc 960
aagtactacc agcctcccct ggctctgtgg atcaagctgc gcttctggtt caacgaaaac 1020
gtgaacctgg ccatcccctc cgtcagcatc ccattcggag agcgtttcat caccatcaag 1080
ctggcttcac agaaggacct ggtgaacgag ttcccaggtc tgttcgtgag gcagtctagg 1140
ttcatcgctg gaaggccttc aaggagaaac atccgtttca agccctggtt catcccaggt 1200
gtgatcaacg aaatctccct gaccaacaac gagctgtaca tcaacaacct gttcgtcact 1260
cccgagatcc acaacctgtt cgtgaagcgc gtccgtttca gcctgatccg cgtgcacaag 1320
acccaggtca ctcacaccaa caacaaccac cacgacgaaa agctgatgtc cgctctgaag 1380
tggccaatcg agtacatgtt catcggtctg aagcccactt ggaacatcag cgaccagaac 1440
ccacaccagc acagggactg gcacaagttc ggccacgtgg tcaacgctat catgcagccc 1500
acccaccacg ccgaaatctc cttccaggac agagacactg ctctgccaga cgcctgctcc 1560
agcatctctg acatctcacc tgtgacctac cccatcactc tgccaatcat caagaacatc 1620
tccgtcaccg ctcacggtat caacctgatc gacaagttcc ctagcaagtt ctgctcttca 1680
tacatcccct tccactacgg aggtaacgct atcaagaccc cagacgaccc tggcgccatg 1740
atgatcactt tcgctctgaa gcctagggag gaataccagc cctccggaca catcaacgtg 1800
agcagggcca gagagttcta catctcctgg gacactgact acgtcggaag catcaccact 1860
gctgacctgg tggtctctgc ttcagccatc aacttcctgc tgctgcagaa cggttctgcc 1920
gtgctgaggt actctacc 1938
<210> 4
<211> 1938
<212> DNA
<213> 密码子优化前的p72蛋白核苷酸序列(DNA)
<400> 4
atggcatcag gaggagcttt ttgtcttatt gctaacgatg ggaaggccga caagattata 60
ttggcccaag acttgctgaa tagcaggatc tctaacatta aaaatgtgaa caaaagttat 120
gggaaacccg atcccgaacc cactttgagt caaatcgaag aaacacattt ggtgcatttt 180
aatgcgcatt ttaagcctta tgttccagta gggtttgaat acaataaagt acgcccgcat 240
acgggtaccc ccaccttggg aaacaagctt acctttggta ttccccagta cggagacttt 300
ttccatgata tggtgggcca tcatatattg ggtgcatgtc attcatcctg gcaggatgct 360
ccgattcagg gcacgtccca gatgggggcc catgggcagc ttcaaacgtt tcctcgcaac 420
ggatatgact gggacaacca aacaccctta gagggcgccg tttacacgct tgtagatcct 480
tttggaagac ccattgtacc cggcacaaag aatgcgtacc gaaacttggt ttactactgc 540
gaataccccg gagaacgact ttatgaaaac gtaagattcg atgtaaatgg aaattcccta 600
gacgaatata gttcggatgt cacaacgctt gtgcgcaaat tttgcatccc aggggataaa 660
atgactggat ataagcactt ggttggccag gaggtatcgg tggagggaac cagtggccct 720
ctcctatgca acattcatga tttgcacaag ccgcaccaaa gcaaacctat tcttaccgat 780
gaaaatgata cgcagcgaac gtgtagccat accaacccga aatttctttc acagcatttt 840
cccgagaact ctcacaatat ccaaacagca ggtaaacaag atattactcc tatcacggac 900
gcaacgtatc tggacataag acgtaatgtt cattacagct gtaatggacc tcaaacccct 960
aaatactatc agccccctct tgcgctctgg attaagttgc gcttttggtt taatgagaac 1020
gtgaaccttg ctattccctc agtatccatt cccttcggcg agcgctttat caccataaag 1080
cttgcatcgc aaaaggattt ggtgaatgaa tttcctggac tttttgtacg ccagtcacgt 1140
tttatagctg gacgccccag tagacgcaat atacgcttta aaccatggtt tatcccagga 1200
gtcattaatg aaatctcgct cacgaataat gaactttaca tcaataacct gtttgtaacc 1260
cctgaaatac acaacctttt tgtaaaacgc gttcgctttt cgctgatacg tgtccataaa 1320
acgcaggtga cccacaccaa caataaccac cacgatgaaa aactaatgtc tgctcttaaa 1380
tggcccattg aatatatgtt tataggatta aaacctacct ggaacatctc cgatcaaaat 1440
cctcatcaac accgagattg gcacaagttc ggacatgttg ttaacgccat tatgcagccc 1500
actcaccacg cagagataag ctttcaggat agagatacag ctcttccaga cgcatgttca 1560
tctatatctg atattagccc cgttacgtat ccgatcacat tacctattat taaaaacatt 1620
tccgtaactg ctcatggtat caatcttatc gataaatttc catcaaagtt ctgcagctct 1680
tacataccct tccactacgg aggcaatgcg attaaaaccc ccgatgatcc gggtgcgatg 1740
atgattacct ttgctttgaa gccacgggag gaataccaac ccagtggtca tattaacgta 1800
tccagagcaa gagaatttta tattagttgg gacacggatt acgtggggtc tatcactacg 1860
gctgatcttg tggtatcggc atctgctatt aactttcttc ttcttcagaa cggttcagct 1920
gtgctgcgtt acagtacc 1938
<210> 4
<211> 646
<212> PRT
<213> p72蛋白的氨基酸序列(PRT)
<400> 4
Met Ala Ser Gly Gly Ala Phe Cys Leu Ile Ala Asn Asp Gly Lys Ala
1 5 10 15
Asp Lys Ile Ile Leu Ala Gln Asp Leu Leu Asn Ser Arg Ile Ser Asn
20 25 30
Ile Lys Asn Val Asn Lys Ser Tyr Gly Lys Pro Asp Pro Glu Pro Thr
35 40 45
Leu Ser Gln Ile Glu Glu Thr His Leu Val His Phe Asn Ala His Phe
50 55 60
Lys Pro Tyr Val Pro Val Gly Phe Glu Tyr Asn Lys Val Arg Pro His
65 70 75 80
Thr Gly Thr Pro Thr Leu Gly Asn Lys Leu Thr Phe Gly Ile Pro Gln
85 90 95
Tyr Gly Asp Phe Phe His Asp Met Val Gly His His Ile Leu Gly Ala
100 105 110
Cys His Ser Ser Trp Gln Asp Ala Pro Ile Gln Gly Thr Ser Gln Met
115 120 125
Gly Ala His Gly Gln Leu Gln Thr Phe Pro Arg Asn Gly Tyr Asp Trp
130 135 140
Asp Asn Gln Thr Pro Leu Glu Gly Ala Val Tyr Thr Leu Val Asp Pro
145 150 155 160
Phe Gly Arg Pro Ile Val Pro Gly Thr Lys Asn Ala Tyr Arg Asn Leu
165 170 175
Val Tyr Tyr Cys Glu Tyr Pro Gly Glu Arg Leu Tyr Glu Asn Val Arg
180 185 190
Phe Asp Val Asn Gly Asn Ser Leu Asp Glu Tyr Ser Ser Asp Val Thr
195 200 205
Thr Leu Val Arg Lys Phe Cys Ile Pro Gly Asp Lys Met Thr Gly Tyr
210 215 220
Lys His Leu Val Gly Gln Glu Val Ser Val Glu Gly Thr Ser Gly Pro
225 230 235 240
Leu Leu Cys Asn Ile His Asp Leu His Lys Pro His Gln Ser Lys Pro
245 250 255
Ile Leu Thr Asp Glu Asn Asp Thr Gln Arg Thr Cys Ser His Thr Asn
260 265 270
Pro Lys Phe Leu Ser Gln His Phe Pro Glu Asn Ser His Asn Ile Gln
275 280 285
Thr Ala Gly Lys Gln Asp Ile Thr Pro Ile Thr Asp Ala Thr Tyr Leu
290 295 300
Asp Ile Arg Arg Asn Val His Tyr Ser Cys Asn Gly Pro Gln Thr Pro
305 310 315 320
Lys Tyr Tyr Gln Pro Pro Leu Ala Leu Trp Ile Lys Leu Arg Phe Trp
325 330 335
Phe Asn Glu Asn Val Asn Leu Ala Ile Pro Ser Val Ser Ile Pro Phe
340 345 350
Gly Glu Arg Phe Ile Thr Ile Lys Leu Ala Ser Gln Lys Asp Leu Val
355 360 365
Asn Glu Phe Pro Gly Leu Phe Val Arg Gln Ser Arg Phe Ile Ala Gly
370 375 380
Arg Pro Ser Arg Arg Asn Ile Arg Phe Lys Pro Trp Phe Ile Pro Gly
385 390 395 400
Val Ile Asn Glu Ile Ser Leu Thr Asn Asn Glu Leu Tyr Ile Asn Asn
405 410 415
Leu Phe Val Thr Pro Glu Ile His Asn Leu Phe Val Lys Arg Val Arg
420 425 430
Phe Ser Leu Ile Arg Val His Lys Thr Gln Val Thr His Thr Asn Asn
435 440 445
Asn His His Asp Glu Lys Leu Met Ser Ala Leu Lys Trp Pro Ile Glu
450 455 460
Tyr Met Phe Ile Gly Leu Lys Pro Thr Trp Asn Ile Ser Asp Gln Asn
465 470 475 480
Pro His Gln His Arg Asp Trp His Lys Phe Gly His Val Val Asn Ala
485 490 495
Ile Met Gln Pro Thr His His Ala Glu Ile Ser Phe Gln Asp Arg Asp
500 505 510
Thr Ala Leu Pro Asp Ala Cys Ser Ser Ile Ser Asp Ile Ser Pro Val
515 520 525
Thr Tyr Pro Ile Thr Leu Pro Ile Ile Lys Asn Ile Ser Val Thr Ala
530 535 540
His Gly Ile Asn Leu Ile Asp Lys Phe Pro Ser Lys Phe Cys Ser Ser
545 550 555 560
Tyr Ile Pro Phe His Tyr Gly Gly Asn Ala Ile Lys Thr Pro Asp Asp
565 570 575
Pro Gly Ala Met Met Ile Thr Phe Ala Leu Lys Pro Arg Glu Glu Tyr
580 585 590
Gln Pro Ser Gly His Ile Asn Val Ser Arg Ala Arg Glu Phe Tyr Ile
595 600 605
Ser Trp Asp Thr Asp Tyr Val Gly Ser Ile Thr Thr Ala Asp Leu Val
610 615 620
Val Ser Ala Ser Ala Ile Asn Phe Leu Leu Leu Gln Asn Gly Ser Ala
625 630 635 640
Val Leu Arg Tyr Ser Thr
645
<210> 4
<211> 1590
<212> DNA
<213> 密码子优化后的B602L蛋白核苷酸序列(DNA)
<400> 4
atggctgagt tcaacatcga cgaactgctg aagaacgtcc tggaggaccc atctaccgaa 60
atctcagagg aaactctgaa gcagctgtac cagcgtacca acccttacaa gcagttcaag 120
aacgactcta gggtcgcctt ctgctcattc accaacctga gagagcagta catccgccgt 180
ctgatcatga cttctttcat cggttacgtg ttcaaggctc tgcaggaatg gatgccatcc 240
tacagcaagc ctacccacac cactaagact ctgctgtcag agctgatcac tctggtggac 300
accctgaagc aggaaaccaa cgacgtccct tctgagtcag tggtcaacac tatcctgtcc 360
atcgccgaca gctgcaagac ccagactcag aagtctaagg aagctaagac cactatcgac 420
tcattcctgc gcgagcactt cgtcttcgac cccaacctgc acgcccagtc tgcttacact 480
tgcgccgaca ccaacgtgga cacttgcgcc tctatgtgcg ctgacaccaa cgtcgacact 540
tgcgcctcaa tgtgtgccga tactaacgtt gatacttgcg cctctacctg cacttcaacc 600
gaatacaccg acctggctga ccctgagagg atccccctgc acatcatgca gaagactctg 660
aacgtgccta acgaactgca ggccgacatc gacgctatca ctcagacccc tcagggctac 720
agagctgccg ctcacatcct gcagaacatc gaactgcacc agtctatcaa gcacatgctg 780
gagaaccccc gcgctttcaa gccaatcctg ttcaacacta agatcacccg ttacctgtca 840
cagcacatcc ctccccagga caccttctac aagtggaact actacatcga ggacaactac 900
gaggaactga gggccgctac tgagtctatc tacccagaaa agcctgacct ggagttcgcc 960
ttcatcatct acgacgtggt cgactccagc aaccagcaga aggtcgacga gttctactac 1020
aagtacaagg accagatctt ctccgaggtg tcttcaatcc agctgggcaa ctggaccctg 1080
ctgggttcct tcaaggctaa cagggaaaga tacaactact tcaaccagaa caacgagatc 1140
atcaagcgca tcctggaccg tcacgaggaa gacctgaaga tcggcaagga aatcctgaga 1200
aacaccatct accacaagaa ggccaagaac atccaggaga ctggacccga cgctccaggt 1260
ctgtccatct acaacagcac tttccacacc gactccggta tcaagggcct gctgagcttc 1320
aaggaactga agaacctgga gaaggccagc ggcaacatca agaaggctcg cgagtacgac 1380
ttcatcgacg actgcgagga aaagatcaag cagctgctgt ccaaggaaaa cctgaccccc 1440
gacgaggaaa gcgagctgat caagactaag aagcagctgg acaacgccct ggaaatgctg 1500
aacgtgccag acgacaccat ccgtgtggac atgtgggtca acaacaacaa caagctggag 1560
aaggaaatcc tgtacactaa ggctgagctg 1590
<210> 4
<211> 1590
<212> DNA
<213> 密码子优化前的B602L蛋白核苷酸序列(DNA)
<400> 4
atggcagaat ttaatattga tgagcttctc aaaaacgtat tggaggatcc ctctactgaa 60
atatccgaag aaacgcttaa acagctttac caaaggacga acccttacaa acagttcaaa 120
aatgatagca gggtggcctt ttgctctttt acaaatttgc gggagcagta tattcgacgt 180
cttataatga ctagctttat tggatatgtc ttcaaagctc tgcaggaatg gatgccttcc 240
tattcaaaac ctacccacac gaccaaaact cttctcagtg agctaataac gttagttgat 300
actttgaaac aggaaactaa tgatgttccc tctgaatcgg tagtaaatac aattttatct 360
atagcagata gctgcaaaac ccagacgcag aaaagcaagg aagctaaaac aacgatcgat 420
agctttttac gagaacattt tgtgtttgat cctaatcttc atgctcaaag tgcgtatact 480
tgtgcagata ccaatgtaga cacttgtgca agcatgtgtg cagataccaa tgtagacacc 540
tgtgcaagca tgtgtgcaga taccaatgta gatacctgtg caagcacttg tacaagcaca 600
gaatacaccg atttagcaga tcctgagcgc atccctttac acatcatgca aaaaacatta 660
aatgtgccta atgagcttca ggccgatatt gatgcaatca cccaaacccc acagggctat 720
agggcagcag cccacatatt acaaaatata gaacttcacc aaagcattaa acatatgctt 780
gaaaatccga gggcgtttaa acccattctc tttaacacaa aaattactag atatctttcg 840
cagcatattc cacctcagga tactttttat aagtggaatt attacattga ggataattac 900
gaagagttgc gggccgctac ggaaagcatc tacccagaaa aacccgacct agagtttgcc 960
ttcattattt atgatgtggt ggatagcagc aaccaacaaa aggttgatga attttattat 1020
aaatataaag accagatttt ctcagaggtt tcatccattc aattaggcaa ctggacactc 1080
ctgggaagct ttaaggccaa cagagagcgc tacaattatt ttaatcaaaa taatgaaata 1140
ataaaacgga ttttggaccg tcatgaggaa gacctaaaga taggaaaaga gattttacga 1200
aatactattt accacaaaaa agcaaaaaat atacaagaaa ctggcccgga tgctccgggg 1260
ctctccatct ataattcaac ctttcacacg gatagcggga ttaagggact gctttccttt 1320
aaggagctaa aaaacctaga aaaagcatct ggaaatatca aaaaagctcg agagtatgat 1380
tttatagacg actgcgaaga aaaaattaag caactgctta gtaaagaaaa tttaaccccc 1440
gatgaagaaa gcgagctgat aaaaacaaaa aaacagttag ataatgcgct tgaaatgctc 1500
aatgtgcctg atgatacgat acgggtagat atgtgggtca acaataataa taaactcgaa 1560
aaagaaattt tatatacaaa agcagaattg 1590
<210> 4
<211> 530
<212> PRT
<213> B602L蛋白的氨基酸序列(PRT)
<400> 4
Met Ala Glu Phe Asn Ile Asp Glu Leu Leu Lys Asn Val Leu Glu Asp
1 5 10 15
Pro Ser Thr Glu Ile Ser Glu Glu Thr Leu Lys Gln Leu Tyr Gln Arg
20 25 30
Thr Asn Pro Tyr Lys Gln Phe Lys Asn Asp Ser Arg Val Ala Phe Cys
35 40 45
Ser Phe Thr Asn Leu Arg Glu Gln Tyr Ile Arg Arg Leu Ile Met Thr
50 55 60
Ser Phe Ile Gly Tyr Val Phe Lys Ala Leu Gln Glu Trp Met Pro Ser
65 70 75 80
Tyr Ser Lys Pro Thr His Thr Thr Lys Thr Leu Leu Ser Glu Leu Ile
85 90 95
Thr Leu Val Asp Thr Leu Lys Gln Glu Thr Asn Asp Val Pro Ser Glu
100 105 110
Ser Val Val Asn Thr Ile Leu Ser Ile Ala Asp Ser Cys Lys Thr Gln
115 120 125
Thr Gln Lys Ser Lys Glu Ala Lys Thr Thr Ile Asp Ser Phe Leu Arg
130 135 140
Glu His Phe Val Phe Asp Pro Asn Leu His Ala Gln Ser Ala Tyr Thr
145 150 155 160
Cys Ala Asp Thr Asn Val Asp Thr Cys Ala Ser Met Cys Ala Asp Thr
165 170 175
Asn Val Asp Thr Cys Ala Ser Met Cys Ala Asp Thr Asn Val Asp Thr
180 185 190
Cys Ala Ser Thr Cys Thr Ser Thr Glu Tyr Thr Asp Leu Ala Asp Pro
195 200 205
Glu Arg Ile Pro Leu His Ile Met Gln Lys Thr Leu Asn Val Pro Asn
210 215 220
Glu Leu Gln Ala Asp Ile Asp Ala Ile Thr Gln Thr Pro Gln Gly Tyr
225 230 235 240
Arg Ala Ala Ala His Ile Leu Gln Asn Ile Glu Leu His Gln Ser Ile
245 250 255
Lys His Met Leu Glu Asn Pro Arg Ala Phe Lys Pro Ile Leu Phe Asn
260 265 270
Thr Lys Ile Thr Arg Tyr Leu Ser Gln His Ile Pro Pro Gln Asp Thr
275 280 285
Phe Tyr Lys Trp Asn Tyr Tyr Ile Glu Asp Asn Tyr Glu Glu Leu Arg
290 295 300
Ala Ala Thr Glu Ser Ile Tyr Pro Glu Lys Pro Asp Leu Glu Phe Ala
305 310 315 320
Phe Ile Ile Tyr Asp Val Val Asp Ser Ser Asn Gln Gln Lys Val Asp
325 330 335
Glu Phe Tyr Tyr Lys Tyr Lys Asp Gln Ile Phe Ser Glu Val Ser Ser
340 345 350
Ile Gln Leu Gly Asn Trp Thr Leu Leu Gly Ser Phe Lys Ala Asn Arg
355 360 365
Glu Arg Tyr Asn Tyr Phe Asn Gln Asn Asn Glu Ile Ile Lys Arg Ile
370 375 380
Leu Asp Arg His Glu Glu Asp Leu Lys Ile Gly Lys Glu Ile Leu Arg
385 390 395 400
Asn Thr Ile Tyr His Lys Lys Ala Lys Asn Ile Gln Glu Thr Gly Pro
405 410 415
Asp Ala Pro Gly Leu Ser Ile Tyr Asn Ser Thr Phe His Thr Asp Ser
420 425 430
Gly Ile Lys Gly Leu Leu Ser Phe Lys Glu Leu Lys Asn Leu Glu Lys
435 440 445
Ala Ser Gly Asn Ile Lys Lys Ala Arg Glu Tyr Asp Phe Ile Asp Asp
450 455 460
Cys Glu Glu Lys Ile Lys Gln Leu Leu Ser Lys Glu Asn Leu Thr Pro
465 470 475 480
Asp Glu Glu Ser Glu Leu Ile Lys Thr Lys Lys Gln Leu Asp Asn Ala
485 490 495
Leu Glu Met Leu Asn Val Pro Asp Asp Thr Ile Arg Val Asp Met Trp
500 505 510
Val Asn Asn Asn Asn Lys Leu Glu Lys Glu Ile Leu Tyr Thr Lys Ala
515 520 525
Glu Leu
530

Claims (10)

1.一种重组的非洲猪瘟病毒p72亚单位蛋白，其特征在于，所述非洲猪瘟病毒p72亚单位蛋白主要为三聚体结构的p72亚单位蛋白，其中，所述三聚体结构的p72亚单位蛋白为非洲猪瘟病毒结构蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示，所述三聚体结构的p72亚单位蛋白占总p72亚单位蛋白量不低于75％。
2.根据权利要求1所述的非洲猪瘟病毒p72亚单位蛋白，其特征在于，在如SEQ ID NO.3所示的氨基酸序列的氨基末端或羧基末端连接有poly-His、FLAG、c-myc、Strep-tagⅡ中的一种标签。
3.根据权利要求1-2任一所述的非洲猪瘟病毒p72亚单位蛋白，其特征在于，所述三聚体结构的p72亚单位蛋白占总p72亚单位蛋白含量不低于80％。
4.根据权利要求1-2任一所述的非洲猪瘟病毒p72亚单位蛋白，其特征在于，所述三聚体结构的p72亚单位蛋白占总p72亚单位蛋白量不低于85％。
5.根据权利要求1-2任一所述的非洲猪瘟病毒p72亚单位蛋白，其特征在于，所述非洲猪瘟病毒p72亚单位蛋白占总蛋白含量不低于80％，且pB602L亚单位蛋白不高于5％。
6.一种如权利要求1-5任一所述的重组的非洲猪瘟病毒p72亚单位蛋白的制备方法，其特征在于，所述大规模制备方法包括如下步骤：
1)重组杆状病毒的制备：为将密码子优化后的非洲猪瘟病毒p72蛋白和密码子优化后的pB602L蛋白表达基因经克隆、转化、感染sf9细胞和/或HighFive5细胞，以得到含有非洲猪瘟病毒p72亚单位蛋白表达基因的重组杆状病毒；
2)发酵培养：再将所述重组杆状病毒进行扩大培养后进行发酵，收集培养液；
3)亚单位蛋白纯化：发酵培养步骤2)中所述培养液进行纯化，纯化后得到重组的非洲猪瘟病毒p72亚单位可溶性蛋白。
7.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，在步骤1)中，所述将密码子优化后的非洲猪瘟病毒p72蛋白和密码子优化后的pB602L蛋白表达基因经克隆、转化、感染sf9细胞和/或HighFive5细胞为将密码子优化后的非洲猪瘟病毒p72蛋白和密码子优化后的pB602L蛋白表达基因同时克隆到pFastBac1转移载体，经克隆、转化、感染sf9细胞和/或HighFive5细胞，再经发酵培养及纯化，以得到含有非洲猪瘟病毒p72亚单位蛋白表达基因的重组杆状病毒rBac-p72-pB602L。
8.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，在步骤1)中，所述将密码子优化后的非洲猪瘟病毒p72蛋白和密码子优化后的pB602L蛋白表达基因经克隆、转化、感染sf9细胞和/或High Five5细胞为将密码子优化后的非洲猪瘟病毒p72蛋白和密码子优化后的pB602L分别克隆到pFastBac1转移载体，经克隆、转化、感染sf9细胞，以得到含有非洲猪瘟病毒p72亚单位蛋白表达基因的重组杆状病毒rBac-p72和含有非洲猪瘟病毒pB602L亚单位蛋白表达基因的重组杆状病毒rBac-pB602L。
9.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，在步骤2)中，将所述重组杆状病毒进行扩大培养的方法包括：
将所述重组杆状病毒转染sf9细胞，培养72h，得到P1代重组杆状病毒；
将所述第一代重组杆状病毒转染sf9细胞，培养72h，得到P2代重组杆状病毒；
重复转染sf9细胞的步骤，获得Pn代重组杆状病毒；
其中所述n为自然数；
步骤2)中所述发酵培养的细胞为sf9细胞和/或HighFive5细胞，细胞密度为1×106-2.5×106/ml,感染用的病毒为rBac-p72-pB602L，按照感染复数(MOI)为0.2-2的接种量接种到sf9或HighFive上；或rBac-p72和rBac-pB602L，按照感染复数(MOI)为0.1-1的接种量同时接种到sf9或HighFive上。
10.一种根据权利要求1-5任一所述的非洲猪瘟病毒p72亚单位蛋白在制备非洲猪瘟p72蛋白或非洲猪瘟p72亚单位疫苗的诊断试剂中的应用。
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Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN114262381A (zh) * 2021-12-17 2022-04-01 扬州大学 表面展示非洲猪瘟病毒抗原p30蛋白的重组杆状病毒、制备方法及其应用

Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN110760006A (zh) * 2019-10-31 2020-02-07 河南省生物工程技术研究中心 一种非洲猪瘟免疫系统靶向基因工程疫苗
CN111363016A (zh) * 2020-03-30 2020-07-03 中国农业大学 一种非洲猪瘟免疫抗原及其制备方法和应用
CN111549040A (zh) * 2020-06-15 2020-08-18 畜科生物工程有限公司 表达非洲猪瘟病毒p72、B602L蛋白的重组腺病毒载体、重组腺病毒及构建方法
CN111607001A (zh) * 2019-02-26 2020-09-01 浙江海隆生物科技有限公司 一种重组的非洲猪瘟病毒p72亚单位可溶性融合蛋白及其制备方法和应用
CN113543801A (zh) * 2019-03-27 2021-10-22 勃林格殷格翰动物保健有限公司 含有非洲猪瘟病毒肽及蛋白的免疫原性组合物及疫苗以及其用途

Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN111607001A (zh) * 2019-02-26 2020-09-01 浙江海隆生物科技有限公司 一种重组的非洲猪瘟病毒p72亚单位可溶性融合蛋白及其制备方法和应用
CN113543801A (zh) * 2019-03-27 2021-10-22 勃林格殷格翰动物保健有限公司 含有非洲猪瘟病毒肽及蛋白的免疫原性组合物及疫苗以及其用途
CN110760006A (zh) * 2019-10-31 2020-02-07 河南省生物工程技术研究中心 一种非洲猪瘟免疫系统靶向基因工程疫苗
CN111363016A (zh) * 2020-03-30 2020-07-03 中国农业大学 一种非洲猪瘟免疫抗原及其制备方法和应用
CN111549040A (zh) * 2020-06-15 2020-08-18 畜科生物工程有限公司 表达非洲猪瘟病毒p72、B602L蛋白的重组腺病毒载体、重组腺病毒及构建方法

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
CHAPMAN,D.A.: "African swine fever virus Georgia 2007/1 complete genome", 《GENBANK》 *

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN114262381A (zh) * 2021-12-17 2022-04-01 扬州大学 表面展示非洲猪瘟病毒抗原p30蛋白的重组杆状病毒、制备方法及其应用
CN114262381B (zh) * 2021-12-17 2023-07-07 扬州大学 表面展示非洲猪瘟病毒抗原p30蛋白的重组杆状病毒、制备方法及其应用

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