CN111378016B - 小反刍兽疫病毒的亚单位h蛋白及其制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于动物疫苗与兽用生物制品技术领域，特别涉及一种小反刍兽疫病毒的亚单位H蛋白及其制备方法和应用，所述亚单位H蛋白为小反刍兽疫病毒H蛋白截短的头部功能区蛋白，亚单位H蛋白的氨基酸序列为：①如序列SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列；②由序列SEQ ID NO.1经过取代、缺失或添加若干氨基酸得到的具有免疫原性的衍生氨基酸序列，且所述衍生氨基酸序列与序列SEQ ID NO.1具有80％‑100％的序列同一性。亚单位H蛋白主要通过构建重组质粒、重组质粒转染细胞株、筛选高表达的细胞株、纯化小反刍兽疫病毒的亚单位H蛋白制备而成，能较好的适用于小反刍兽疫病毒的亚单位疫苗或诊断试剂中，具有分泌表达高效、蛋白纯度高、易于纯化、生产成本降低、安全性能高等特点。

Description

小反刍兽疫病毒的亚单位H蛋白及其制备方法和应用

技术领域

本发明属于动物疫苗与兽用生物制品技术领域，特别涉及一种小反刍兽疫病毒的亚单位H蛋白及其制备方法和应用。

背景技术

小反刍兽疫(Peste des Petits of Ruminats，PPR)是由小反刍兽疫病毒(Pestedes Petits of RuminatsVirus，PPRV)引起的一种烈性、接触性传染的病毒性疾病。世界动物卫生组织(OIE) 将其列为A类传染病，我国也将其列为一类疫病。PPRV主要感染羊，特别是山羊高度易感。一旦感染羊会以突然发热、精神沉郁、口腔溃疡、咳嗽，眼和鼻排出分泌物、腹泻为特征，发病率和死亡率可达100％，造成巨大经济损失，严重影响养羊业的发展。

目前对该病尚无有效的治疗手段，主要依靠疫苗进行防控。由于PPRV和牛瘟(RPV)两种病毒同属，且抗原存在交叉反应性，因此历史上曾用RPV弱毒苗进行PPRV的预防，但该疫苗可导致RPV检测假阳性，不利于国家牛瘟消灭计划的实施，故现已停止使用。目前预防该病的发生主要是通过弱毒疫苗。该疫苗是通过常规手段在Vero细胞中连续传代致弱获得。疫苗持续期长，免疫动物安全。但该疫苗是常规致弱的活疫苗在大面积使用过程中，有可能与同源的强毒株发生重组，毒力变强或出现新型毒株，造成免疫失败，甚至导致新的疫情发生。此外，该疫苗免疫动物后，不能通过血清学手段区分免疫动物和自然感染动物，故既不利于PPR疫情的检测，也不利于PPR消灭计划的实施。

PPRV属副粘病毒科麻疹病毒属成员，病毒粒子成椭圆形或圆形，病毒粒子的最外层包裹有囊膜，囊膜上有突出的纤突。PPRV基因组为单股负链不分节段RNA，全长约15.6kb，基因组依次编码衣壳蛋白(N)、磷蛋白(P)、基质蛋白(M)、融合蛋白(F)、血凝素蛋白 (H)、大蛋白(L)六个结构蛋白和C、V两种非结构蛋白。其中F蛋白和H蛋白是病毒囊膜的主要蛋白，能够刺激机体产生中和抗体，是亚单位疫苗的首先糖蛋白。亚单位疫苗不含有核酸物质，接种后不会产生持续感染或潜伏感染；产生的免疫应答可以与野毒感染相区分，有利于疫病的控制和消灭。但是亚单位疫苗也有明显的缺陷：生产成本高，应用受到限制。

亚单位疫苗的成本主要在亚单位蛋白的生产上，本发明人注意到H蛋白是小反刍兽疫病毒的黏附蛋白，一般由609个氨基酸组成，分子量约为67kd，主要作用是在病毒与细胞的相互作用过程中，H蛋白作为配体与细胞表面受体CD46相互作用，通过构象的改变调控H 蛋白发挥融合作用，从而介导病毒的入侵，进而引起细胞病变。因此，H蛋白是小反刍兽疫病毒的重要毒力蛋白和保护性抗原。而H蛋白作为一种囊膜糖基化修饰蛋白，为了保证表达蛋白能够有糖基化修饰和形成完整活性的H蛋白，必须在动物细胞中才能实现。

工程化细胞是目前生物制药工程上广泛使用的表达细胞，在该系统表达的蛋白在分子结构、理化特性和转录后修饰等生物学功能方面最接近于天然蛋白分子，其通常以悬浮培养方式达到高密度培养，且培养体积能达到2,000L以上，因此可以大规模生产。

然而，在使用工程化细胞表达H蛋白时，H蛋白的编码基因序列未经优化时，工程化细胞基本不表达H蛋白，进而难以获得具有优良免疫原性和稳定性的H蛋白以供小反刍兽疫病毒的防控。因此，在使用工程化细胞表达H蛋白时，对H蛋白的编码基因序列进行结构分析及优化是一个必须的过程。

发明内容

针对现有技术存在的不足，本发明的第一个目的在于提供一种小反刍兽疫病毒的亚单位H蛋白，其亚单位H蛋白具有小反刍兽疫病毒H蛋白优良的免疫原性和稳定性，同时便于在工程化细胞株中稳定高效的分泌表达。

本发明的第二个目的在于提供一种小反刍兽疫病毒的亚单位H蛋白的制备方法，便于亚单位H蛋白的大规模生产，降低了亚单位H蛋白的生产成本。

本发明的第三个目的在于提供一种小反刍兽疫病毒的亚单位H蛋白的应用，其能够较好的适用于小反刍兽疫病毒的亚单位疫苗和诊断试剂中，从而便于人们对小反刍兽疫病毒的防控。

为实现上述第一个目的，本发明提供了如下技术方案：

一种小反刍兽疫病毒的亚单位H蛋白，所述亚单位H蛋白为小反刍兽疫病毒H蛋白截短的头部功能区蛋白，所述亚单位H蛋白的氨基酸序列为：

①如SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列；

②由SEQ ID NO.1经过取代、缺失或添加一个或几个氨基酸得到的具有免疫原性的衍生的氨基酸序列。

根据本发明的技术方案，优先地，在如SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列的氨基末端或羧基末端连接有poly-His、FLAG、c-myc、HA和poly-Arg中的一种标签。

根据本发明的技术方案，优先地，所述亚单位H蛋白的编码基因序列如SEQ IDNO.2 所示，或由SEQ ID NO.2经密码子优化后所得。

根据本发明的技术方案，优先地，所述亚单位H蛋白的编码基因序列如SEQ IDNO.3 所示。

为实现上述第二个目的，本发明提供了如下技术方案：

一种小反刍兽疫病毒H蛋白的制备方法，包括以下步骤：

①、构建小反刍兽疫病毒的亚单位H蛋白的编码基因序列；

②、将亚单位H蛋白的编码基因序列克隆到真核表达载体中，得到含有亚单位H蛋白编码基因序列的重组质粒；

③、将含有亚单位H蛋白编码基因序列的重组质粒转染至动物的工程化细胞中，得到细胞株；

④、从步骤③得到的细胞株中筛选出高度表达的细胞株；

⑤、发酵培养步骤④中得到的高度表达的细胞株，纯化后得到小反刍兽疫病毒的亚单位H蛋白。

本发明的技术方案中，优选地，步骤②中，所述真核表达载体为pEE6.4、pEE12.4、pGL4.13和pcDNA3.1中的一种。

本发明的技术方案中，优选地，步骤②中，所述真核表达载体为pEE12.4。

本发明的技术方案中，优选地，步骤③中，所述细胞株为CHO细胞株、HEK293细胞株和293T/17细胞株的一种。

本发明的技术方案中，优选地，步骤③中，所述CHO细胞株为DG44细胞株、DXB11 细胞株、CHO-K1细胞株和CHO-S细胞株的一种。

为实现上述第二个目的，本发明提供了如下技术方案：

一种小反刍兽疫病毒亚单位H蛋白的应用，所述亚单位H蛋白适用于小反刍兽疫病毒的亚单位疫苗或诊断试剂中。

综上所述，本发明具有以下有益效果：

本发明提供了一种亚单位H蛋白，具有小反刍兽疫病毒H蛋白优良的免疫原性和稳定性，同时便于在工程化细胞株中稳定高效的分泌表达，其产量高且易于纯化，在细胞培养上清中的目的蛋白纯度都能达到80％以上，只需一步亲和层析就能使目的蛋白纯度达到90％以上，远远满足亚单位疫苗和诊断试剂的需求，以便于大规模生产，由此解决了小反刍兽疫病毒H蛋白生产成本高的技术问题。另外，由于生产用的CHO细胞株、HEK293细胞株、293T/17细胞株等工程化细胞株在培养时可控制性高、质控容易、生产蛋白批次间稳定，因此本发明生产的小反刍兽疫病毒亚单位H蛋白中其他病毒量少，有效降低了散毒的风险，具有优异的生物安全性。

附图说明

图1表示预测的亚单位H蛋白的三维结构模式图；

图2表示亚单位H蛋白的编码基因序列在优化前后比对结果，具体为SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3的编码基因序列的比对；

图3表示pEE12.4-OPTI-H质粒图谱；

图4表示pEE12.4-OPTI-H双酶切鉴定结果：M是DNA Marker：DL10000 Marker；1是pEE12.4-OPTI-H HindIII和EcoRI双酶切电泳结果；

图5表示亚单位H蛋白在非还原剂存在条件下SDS-PAGE检测结果，其中1是H蛋白，2是 Marker；

图6表示亚单位H蛋白在还原剂存在条件下SDS-PAGE检测结果，其中1是亚单位H蛋白， 2是Marker；

图7表示亚单位H蛋白纯化后Werstern Blot检测结果，其中1亚单位H蛋白，2是Marker；

图8表示亚单位H蛋白纯化后稳定性检测结果，其中A中1是Marker；2是4℃处理后的亚单位H蛋白，未加还原剂，上样量为2μg；3是-20℃处理后的亚单位H蛋白，未加还原剂，上样量为2μg。

具体实施方式

以下将结合附图和实施例对本发明做进一步说明，本发明的实施例仅用于说明本发明的技术方案，并非限定本发明。

本发明实施例中所使用的菌株、质粒和试剂均为市售产品。

本发明试剂及药品的来源列单如下：

CHO-K1细胞来源于中国科学院典型培养物保藏委员会细胞库中国科学院上海生命科学研究所细胞库；

细胞培养基和血清均购自美国gibco公司；

真核表达载体pEE12.4购自上海林渊生物科技有限公司；

Lipofectamine LTX购自美国Thermo Fisher公司；

甲硫氨酸亚砜亚铵((L-methioninesulfoximine，MSX))购于Sigma公司；

BCA蛋白质定量试剂盒购自美国Thermo Fisher公司；

PLUS^TM reagent购自thermo公司，为Lipofectamine LTX转染试剂的添加物；

CB5购自thermo公司，为发酵培养基补料。

实施例1

1a：对小反刍兽疫病毒H蛋白加以结构分析及优化，以此构建小反刍兽疫病毒的亚单位H蛋白的编码基因序列。

通过对小反刍兽疫病毒H蛋白序列(GenBank:KM091959.1)进行分析，发现基因组序列7332-9661bp，编码小反刍兽疫H蛋白序列。进一步分析1M-35P为H蛋白的胞内区， 36Y-58I为H蛋白的跨膜区，59R-609V为H蛋白的胞外区。结合表达病毒囊膜蛋白研究的经验，选择CHO-K1细胞表达H蛋白的胞外区作为本发明的免疫原性蛋白，即为59R-609V的氨基酸序列，且该氨基酸序列为公知片段，可通过NBCI查询获得。

然而，通过CHO-K1细胞株表达59R-609V的氨基酸序列，发现直接表达该片段蛋白表达量很低，不能满足大规模生产的需求。进一步我们通过蛋白结构预测和氨基酸本身结构的研究发现，H蛋白是一个同源二聚体，59R-148I是H蛋白杆部区，149N-609V是H蛋白的头部区。59R-148I氨基酸可能会影响该蛋白在CHO-K1细胞表达，且该段多肽也不是H蛋白的免疫原性位点，149N-609V才是H蛋白的主要抗原表位区。

因此，本发明切除59R-148I的氨基酸，表达149N-609V的氨基酸序列。149N-609V的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，该段氨基酸序列预测的三维结构模式图如图1所示，能在CHO-K1细胞中高效分泌表达，得到相应的亚单位H蛋白。

其中，本领域的技术人员通过常规的技术手段，很容易在氨基酸序列SEQ ID NO.1的基础上，经过取代、缺失或添加一个氨基酸或几个氨基酸制备出衍生的蛋白质，且该衍生的蛋白质与本实施例中亚单位H蛋白的氨基酸序列(如SEQ ID NO.1所示)同源性高达80％-100％，以此保证两者具有同样的免疫原性，因此该衍生的蛋白质也落入本发明的保护范围之内。

为了使所述亚单位H蛋白便于纯化，可在如SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列的氨基末端或羧基末端连接如表一所示的标签，本实施例中具体以Poly-His为例，将其连接于如SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列的氨基末端处。

表一标签及其氨基酸序列

氨基酸序列SEQ ID NO.1的编码基因序列可以如SEQ ID NO.2所示，也可以由SEQID NO.2经密码子优化所得。本实施例中亚单位H蛋白的编码基因序列是在SEQ ID NO.2的基础上进行密码子优化，得到OPTI-H序列，如SEQ ID NO.3所示，该基因序列的人工合成工作委托南京金斯瑞生物科技有限公司完成。

将密码子优化后的序列(如SEQ ID NO.3所示)与密码子优化前的序列(如SEQ IDNO.2所示)进行比对，结果如图2所示，共331/1383＝23.9％不同。

1b：pEE12.4-OPTI-H重组质粒构建

1b.1、PCR扩增目的片段OPTI-H

1b.1.1、PCR反应

(1)引物设计及合成

上游引物：5’-CGGAAGCTTATGAATTTCGACCAGTTTTGTGAGTATAAGGC-3’

下游引物：5’-GGCGAATTCTCAATGGTGATGGTGATGGTGCAC-3’

(2)50μL加样体系，如下表二所示。

表二50μL加样体系

PCR扩增程序：

1b.1.2、PCR产物胶回收

(1)标记好样品收集EP管、吸附柱CB2以及收集管；

(2)称取标记好的空的EP管重量，并记录数值；

(3)将单一的目的DNA条带在切胶仪上从琼脂糖凝胶中用手术刀小心切下放入干净的 1.5mL离心管中；

(4)向步骤(3)中的1.5mL离心管中加入600μL的PC buffer，50℃水浴放置5min左右，其间不断温和上下翻转离心管，以确保胶块充分溶解；

(5)柱平衡：向吸附柱CB2中(吸附柱CB2预先放入收集管中)加入500μL的平衡液BL， 12000rpm/min离心1min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CB2重新放回收集管中；

(6)将步骤(5)所得溶液加至吸附柱CB2中，静置2min，10000rpm/min离心30s，倒掉收集管中的废液，再将吸附柱CB2放入收集管中；

(7)向吸附柱CB2中加入600μL的漂洗液PWbuffer，静置3min，10000rpm/min离心30s，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CB2放入收集管中；

(8)重复步骤(7)；

(9)空吸附柱离心，12000rpm/min离心2min，尽量除去漂洗液，将吸附柱CB2置于室温放置10min，彻底晾干；

(10)将吸附柱CB2放入收集管中，向吸附膜中间位置悬空滴加50μL的Elutionbuffer(65℃预热)，静置3min，12000rpm/min离心2min；

(11)从离心机中取出步骤(10)中离心管，丢弃中间的吸附柱CB2，盖上离心管盖子，保留离心管中的DNA样品；

(12)将步骤11中的DNA样品置于4℃保存，准备琼脂糖凝胶电泳鉴定胶回收DNA片段。

1b.2、PCR产物及载体双酶切反应

(1)标记好需要用到的1.5mL的EP管，在该EP管中按照下表三进行加样、混匀，其中表三中的DNA样品即为步骤1b.1.2(12)最终回收得到的DNA片段；

表三50μL反应体系

(2)将步骤(1)中的EP管置于37℃的恒温水浴锅中，水浴2-3h；

双酶切产物胶回收：取出上述双酶切体系，进行琼脂糖凝胶电泳以回收其中的DNA片段，方法同步骤1b.1.2中PCR产物胶回收。

1b.3、连接反应

(1)准备洁净的1.5mL的EP管若干，做好标记，置于EP管架上待用；

(2)在步骤(1)的EP管中按照下表四进行加样、混匀，其中表四中的目的片段即为步骤 1b.2(2)最终回收得到的DNA片段；

表四10μL反应体系

(3)按照步骤(2)中表格完成加样后，将每个10μL反应体系置于16℃低温冷却液循环机中，水浴10-16h；

(4)取出步骤(3)中EP管，置于65℃水浴锅中，水浴15min；

(5)取出步骤(4)中的EP管，置于4℃保存，得到连接反应液。

1b.4、转化反应

(1)将步骤1b.3(5)制得的10μL连接反应液快速加入100μL感受态细胞中，并吹打混匀，冰浴30min；

(2)取出样品管，置于42℃水浴100s，然后立即冰浴2min；

(3)取出样品管，在超净工作台中，向样品管中加入600μL的液体LB培养基，然后将样品管置于37℃恒温摇床，220rpm/min，培养1h；

(4)涂板：取出步骤(3)中样品管，在室温、8000rpm/min的条件下离心2min，去掉600 μL上清液体，剩余上清液重悬管底部的菌体，将重悬的菌液放入相应的转化平板中心，用涂菌棒将转化平板中心的菌液均匀铺开；

(5)将转化步骤(4)平板正置于生化恒温培养箱中，37℃培养1h后，将转化平板倒置进行培养15h，转化得到单克隆菌落；

1b.5、质粒抽提与双酶切鉴定

1b.5.1、质粒抽提

(1)用10μL移液枪头从步骤1b.4(5)的转化平板中挑取单克隆菌株至5mL含氨苄抗性的液体LB培养基中，在37℃、220rpm/min的条件下摇菌过夜；

(2)将菌液移至1.5mL的EP管中，在室温、12000rpm/min的条件下离心2min，弃上清；

(3)向步骤(2)的EP管中加入250μL的质粒提取试剂P1 buffer，彻底悬浮菌体；

(4)向步骤(3)溶液中加入250μL的质粒提取试剂P2 buffer，立即温和颠倒离心管5-10 次混匀，室温静置2-4min；

(5)向步骤(4)溶液中加入350μL的质粒提取试剂P3 buffer，立即温和颠倒离心管5-10 次混匀；室温静置2-4min；

(6)将步骤(5)溶液，在室温、14000rpm/min的条件下离心10min；

(7)将步骤(6)中上清溶液移至吸附柱中心，在室温、12000rpm/min的条件下离心30s，倒掉收集管中液体；

(8)向吸附柱中心加入500μL的Buffer DW1，在室温、12000rpm/min的条件下离心30s，倒掉收集管中液体；

(9)向吸附柱中心加入500μL的wash solution，在室温、12000rpm/min的条件下离心30s，倒掉收集管中液体，重复一次；

(10)空吸附柱，在室温、12000rpm/min的条件下离心2min；

(11)将吸附柱放入一个干净的1.5mL的离心管中，向吸附膜中心加入30μL的Elution buffer，室温静置5min，在室温、12000rpm/min的条件下离心2min，保存管中DNA溶液。

1b.5.2、双酶切鉴定

(1)标记好需要用到的1.5mL的EP管，按照下表五进行加样，其中表五中的DNA样品即为步骤1b.5.1(11)最终得到的DNA溶液；

表五20μL反应体系

(2)将步骤(1)中的EP管20μL反应体系置于37℃恒温水浴锅中，水浴2h；

(3)将步骤(2)中的双酶切体系样品进行琼脂糖凝胶电泳，检查插入片段大小是否正确；实验结果见图2：酶切鉴定构建正确；

(4)选择插入片段正确的重组质粒送测序公司测序，本发明将该重组质粒送至金唯智生物科技有限公司进行测定，测得的亚单位H蛋白编码基因序列如SEQ ID NO.3所示。

1b.6、无内毒素质粒大提

1b.6.1、无内毒素质粒提取

(1)将步骤1b.5.2(4)测序正确的克隆接种至100mL含氨苄抗性的培养基中，于37℃恒温摇床，220rpm/min，培养15h；

(2)将步骤(1)中培养的菌液转移至50mL离心管中，在室温、8000rpm/min的条件下离心 5min，收集菌体，弃掉上清培养基；

(3)向步骤(2)的离心管中加入8mL的质粒提取试剂P1 buffer，用移液器充分重悬菌体；

(4)向步骤(3)的离心管中加入8mL的质粒提取试剂P2 buffer，立即温和颠倒离心管6-8 次，室温静置5min；

(5)向步骤(4)的离心管中加入8mL的质粒提取试剂P4 buffer，立即上下颠倒6-8次，充分混匀至溶液出现白色絮状沉淀，室温放置10min左右，在室温、8000rpm/min的条件下离心5-10min，使白色沉淀离至管底；

(6)将步骤(5)中上清液全部小心移入过滤器CS1中，慢慢推柄过滤器，滤液收集在干净的50mL离心管中；

(7)柱平衡：向吸附柱CP6中(吸附柱CP6放入50mL收集管中)加入2.5mL的平衡液BL，在室温、8000rpm/min的条件下离心2min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CP6重新放回收集管中；

(8)向步骤(6)滤液中加入0.3倍滤液体积的异丙醇，上下颠倒混匀后转移到吸附柱CP6 中，在室温、8000rpm/min的条件下离心2min，倒掉收集管中液体，将吸附柱CP6重新放入同一个收集管中；

(9)向步骤(8)吸附柱CP6中加入10mL的漂洗液PWbuffer，在室温、8000rpm/min的条件下离心2min，弃收集管中废液，将吸附柱重新放回收集管中；

(10)重复操作步骤(9)一次；

(11)向步骤(10)吸附柱CP6中加入3mL无水乙醇，在室温、8000rpm/min的条件下离心 2min，倒掉废液；

(12)将步骤(11)吸附柱CP6重新放回收集管中，在室温、8000rpm/min的条件下离心5min，将吸附柱CP6开盖，置于室温放置数分钟晾干；

(13)将步骤(12)中吸附柱放入干净的50mL离心管中，在吸附膜中央加入1-2mL的TB buffer，室温静置5min，在室温、8000rpm/min的条件下离心2min，将50mL离心管中的洗脱液全部移入一个干净的1.5mL离心管中，洗脱液即为pEE12.4-OPTI-F重组质粒的DNA溶液，该重组质粒的图谱如图3所示，将其测定浓度后于-20℃保存；

(14)取1-2μL步骤(13)中得到的DNA溶液进行琼脂糖凝胶电泳并保存电泳结果数据，电泳图如图4所示。

1c：pEE12.4-OPTI-F重组质粒转染CHO-K1细胞与单克隆筛选的建立

1c.1、CHO-K1细胞转染

(1)准备：生物安全柜紫外灭菌30min；DMEM/F12培养基(含10wt％血清、1wt％双抗) 与PBS缓冲液置于37℃水浴锅预热至37℃；

(2)从37℃的CO₂细胞培养箱中取出CHO-K1细胞(10cm细胞培养皿)，弃去上清培养基，用8mL预温的PBS缓冲液洗细胞一次，弃去PBS缓冲液；

(3)每个10cm细胞培养皿加入1-2mL 0.25wt％的trypsin-EDTA，室温消化2min左右，显微镜下观察细胞皱缩变圆，并呈单个细胞；

(4)加入4mL的DMEM/F12培养基(含10wt％血清、1wt％双抗)终止消化反应，并用移液器将细胞吹散；

(5)将消化好的细胞转移至15mL离心管中，常温离心，200g，5min；

(6)用DMEM/F12培养基(含10wt％血清、1wt％双抗)重新悬浮细胞，计数；

(7)稀释细胞至2×10⁵个/mL，取2mL混匀的细胞加入到六孔板，六孔板放置于37℃、 CO₂体积百分数为5％的CO₂细胞培养箱中孵育过夜；

(8)取出步骤(7)中的六孔板，观察细胞状态：当细胞交汇度达到80％-90％时即可开始转染，转染前将培养基换成无抗生素无血清的DMEM/F12培养基，2mL/孔；

(9)稀释重组质粒：用OPTI-MEM培养基稀释重组质粒，每125μL的OPTI-MEM培养基中加入2.5μg重组质粒，然后加入2.5μL的PLUS^TM reagent，混匀，室温静置5min；

(10)稀释Lipofectamine LTX：125μL的OPTI-MEM培养基中加入9μL的Lipofectamine LTX，然后加入2.5μL的PLUS^TM reagent，轻轻混匀，室温静置5min；

(11)将步骤(10)和步骤(11)混合物轻轻混匀，室温放置5min，然后逐滴加入六孔板中均匀分布；

(12)将六孔板置于37℃、CO₂体积百分数为5％的CO₂细胞培养箱中培养4-6h；

(13)换液：弃掉上清培养基，加入2mL的DMEM/F12培养基(含10wt％血清、1wt％双抗)，将六孔板置于37℃、CO₂体积百分数为5％的CO₂细胞培养箱中培养。

1c.2、加压筛选

转染后24h开始加压：从步骤1c.1(11)的CO₂细胞培养箱中取出六孔板细胞，弃去上清培养基，加入2mL的DMEM/F12(含10wt％血清+25μM的MSX)，加压7d，中间观察细胞，死细胞多换液。

1c.3、单克隆筛选

(1)加压筛选步骤1c.2中的细胞至阴性对照细胞全部死亡时，约7d，开始单克隆筛选；

(2)取出六孔板，弃掉培养基，PBS缓冲液洗一次，然后加入300μL 0.25wt％的trypsin-EDTA，室温消化2min左右，加入2mLDMEM/F12培养基(含10wt％血清+25μM MSX)终止消化反应，并用移液器将细胞吹散；

(3)将消化好的细胞转移至15mL离心管中，常温离心，200g，5min；

(4)用DMEM/F12培养基(含10wt％血清+25μM MSX)重新悬浮细胞，计数；

(5)铺板：稀释细胞至5个/mL，取200μL混匀的细胞加入到96孔板中，放置到37℃、CO₂体积百分数为5％的CO₂细胞培养箱中孵育4-6h；

(6)记录单个细胞的孔；

(7)待96孔板中单个细胞的孔长起来时，弃掉培养基，PBS缓冲液洗一次，加入100μL 0.25wt％的trypsin-EDTA，室温消化2min左右，加入2mL的DMEM/F12培养基(含10wt％血清+25μM MSX)终止消化反应，并用移液器将细胞吹散；将细胞液转移至12孔板，待12 孔板长满时，取上清，ELISA检测克隆是否为阳性，高效表达的阳性克隆继续扩大培养、冻存。

1d：CHO-K1细胞株驯化成悬浮培养

(1)准备：生物安全柜紫外灭菌30min；DMEM/F12培养基(含10wt％血清+25μM MSX)置于37℃水浴锅中预热至37℃；

(2)取出步骤3.3(7)得到的细胞(10cm细胞培养皿)，弃去上清培养基，用8mL预温的PBS缓冲液洗细胞一次，并弃去PBS缓冲液；

(3)每个10cm细胞培养皿加入1-2mL 0.25wt％的trypsin-EDTA，室温消化2min左右，显微镜下观察细胞皱缩变圆，并呈单个细胞；

(4)加入4mL的DMEM/F12培养基(含10wt％血清+25μM MSX)终止消化反应，并用移液枪将细胞吹散；

(5)将消化好的细胞转移至15mL离心管中，常温离心，200g，5min；

(6)用100wt％的DMEM/F12培养基(含10wt％血清+25μM MSX)悬浮细胞，计数；

(7)稀释细胞至5×10⁵个/mL，接种30mL步骤(6)得到的含有悬浮细胞的培养基于一个125mL的摇瓶中；细胞培养瓶放置到37℃、CO₂体积百分数为5％的CO₂细胞培养箱中的轨道式振荡器上，120rpm/min孵育过夜；

(8)生物安全柜台面用75％酒精擦拭消毒，紫外照射30min；

(9)每隔24h计数细胞密度及活力；

(10)待第一代细胞培养一次后细胞存活率达到94-97％时进行第二代培养；

(11)准备：生物安全柜紫外灭菌30min；100wt％的DMEM/F12培养基(含10wt％血清+25μM MSX)和EX-CELL 302培养基置于CO₂体积百分数为5％的CO₂细胞培养箱中预热至 37℃；

(12)从步骤(11)中的CO₂细胞培养箱中取出细胞转移至50mL离心管中，常温200g，离心5min；

(13)将DMEM/F12培养基(含10wt％血清+25μM MSX)和EX-CELL 302培养基按1： 1混合，重新悬浮细胞，计数；

(14)稀释细胞至5×10⁵个/mL，接种30mL步骤(13)得到的含有悬浮细胞的培养基于一个125mL摇瓶中；细胞培养瓶放置到37℃、CO₂体积浓度为5％的CO₂细胞培养箱中的轨道式振荡器上，120rpm/min孵育过夜；

(15)生物安全柜台面用75wt％酒精擦拭消毒，紫外照射30min；

(16)每隔24h计数细胞密度及活力；

(17)第二代培养两次后得到的细胞存活率大于95％；第三至六代培养三次后得到的细胞存活率大于95％；7周后，细胞接种3天后繁殖三代，细胞密度达到1×10⁶个/mL，同时细胞存活率达到95％，该细胞被认为已经适应悬浮培养；细胞接种密度降低到3×10⁵个/mL；

(18)经驯化，CHO-K1细胞株中的6E6细胞株、8E6细胞株都满足要求，这表明，6E6细胞株和8E6细胞株都驯化成功。

1e：细胞摇瓶发酵

(1)传代培养基的配制：将60wt％的CD-CHO培养基+40wt％的Ex-cell 302培养基置于37℃水浴锅中预热至37℃；

(2)取出步骤1d(17)中悬浮培养的10H4细胞株、10H9细胞株，进行计数；

(3)分别稀释步骤(2)中的6E6细胞株和8E6细胞株至2.5×10⁵个/mL-3.5×10⁵个/mL，两个细胞株分别接种30mL步骤(1)的传代培养基于一个125mL摇瓶中，细胞培养瓶放置到 37℃，CO₂体积浓度为5％的CO₂恒温摇床中，100rpm/min孵育过夜；

(4)每隔24h计数细胞密度及活力，测葡萄糖，当血糖低于2g/L时，添加葡萄糖到4g/L；每天取1mL样品，上清用于检测蛋白表达情况；

(5)补料(约第四天)：补充70g/L的CB5，添加量为原培养基的10％；

(6)培养温度调节(第五天)：将CO₂培养箱的温度调整至32℃；

(7)再次补料(第九天)：补充70g/L的CB5，添加量为原培养基的10％；

(8)第十二天，分别收获6E6细胞培养液和8E6细胞培养液。

1f：蛋白纯化

(1)收集步骤1e(8)中收获的6E6细胞培养液和8E6细胞培养液(每批均约100ml)，于4℃、 8000g的条件下离心30min，取上清，过0.8μm滤膜，上样，预留80μL样品加入20μL的5×SDS-样品缓冲液，用于SDS-PAGE检测，以测定样品在纯化前的浓度和纯度；

(2)柱平衡：用超纯水平衡2-3CV(column volume，柱体积)，排出乙醇保存液；然后用 BufferA(20mM NaH₂PO₄(pH＝7.4)，500mM NaCl)平衡2-3CV，平衡速度为4-7mL/min；

(3)上样：准备5mL预装柱一个，以1mL/min的流速进行上样(根据预装柱体积调节上样流速)，保留时间5min，收集Flow through(FT)，取80μL样品加入20μL的5×SDS-样品缓冲液，用于SDS-PAGE检测，以测定目的蛋白在预装柱上的吸附效果；

(4)洗涤：用4wt％的Buffer B(20mM NaH₂PO₄(pH＝7.4)，500mM NaCl，20mMimidazole) 洗柱，流速为4mL/min，把未结合上柱的蛋白和结合能力较弱的杂蛋白冲洗干净，至其280nm 波长处的OD值基线平稳为止；

(5)洗脱：用50wt％的Buffer B(20mM NaH₂PO₄(pH＝7.4)，500mM NaCl，20mMimidazole) 洗脱目的蛋白，至其在280nm波长处的OD值基线洗平，洗脱速度为2mL/min，按10mL/ 管的规格收集目的蛋白，取80μL样品加入20μL的5×SDS-样品缓冲液，用于SDS-PAGE检测，以测定目的蛋白的洗脱效果；

(6)洗涤：用100wt％的Buffer B(20mM NaH₂PO₄(pH＝7.4)，500mM NaCl，500mMimidazole) 洗涤，流速为4mL/min，冲洗2-3CV，至UV基线洗平；随后用超纯水平衡2-3CV，保存 HisTrap excel柱可用20％乙醇保存液平衡2-3CV，得到含有目的蛋白的咪唑洗脱液；

(7)透析换液：将步骤(6)得到的含有目的蛋白的咪唑洗脱液倒入透析袋内，用1×PBS 缓冲液透析1000倍，得到透析样，取80μL样品留样，用于SDS-PAGE检测，以测定纯化后目的蛋白的浓度和纯度；

(8)除菌过滤：在生物安全柜中，将步骤(7)得到的透析样过孔径为0.22μm的低蛋白结合针头滤器；除此之外，若透析样中蛋白含量过多可使用经灭菌处理的带有0.22μm滤膜的 Nalgene滤器加以过滤，过滤好的蛋白溶液样品存放于-80℃冰箱；

(9)蛋白浓度测定：采用BCA法测定经过除菌过滤后的蛋白的浓度，6E6细胞株和8E6细胞株纯化的蛋白浓度均为1.6mg/mL-1.8mg/mL，两者的体积均约为40ml；经过计算(蛋白得率＝蛋白浓度*蛋白体积/所取发酵上清体积)，6E6细胞株和8E6细胞株的蛋白得率均为 2.1g/L-2.4g/L。

1g：亚单位H蛋白的鉴定

1g.1、SDS-PAGE检测

将步骤1f纯化后的蛋白进行SDS-PAGE检测，所用样品中亚单位H蛋白浓度为2μg/孔。若所用样品中不含有还原剂，结果如图5所示；若所用样品中含有还原剂，结果如图6所示。从图中可以计算出，纯化后的亚单位H蛋白SDS-PAGE纯度为95％，其在非还原剂存在条件下以二聚体形式存在，分子量约为110kD左右，其在还原剂存在条件下以单体形式存在，分子量约为55kD左右。

1g.2、Werstern Blot检测

将步骤1f纯化后的蛋白进行Werstern Blot检测，检测结果如图7所示。所用样品中亚单位H 蛋白(图中标记为1)浓度为2μg/孔；所用一抗来源于小反刍兽疫弱毒苗免疫后羊的血清，稀释比例为1：100；二抗为HRP标记的驴抗羊IgG二抗，稀释比为1：5000。从图中可以看出，该血清能与本发明的亚单位H蛋白特异性结合，由此可得，本发明制得的亚单位H蛋白具有优异的免疫原性。

1g.3、Elisa检测

(1)包被：在酶标板上，用包被液(50mM碳酸盐缓冲液，pH＝9.5)将纯化的亚单位H蛋白稀释至0.5μg/ml，每种抗原均包被8孔(4孔加血清样品，4孔加封闭液作为对照)，每种抗原均加入100μl/孔，用封口膜封好后4℃冰箱放置过夜；

(2)洗涤：从冰箱取出步骤(1)的酶标板，用PBST缓冲液洗板5次；

(3)封闭：往每个装有亚单位H蛋白的孔中加入200μl封闭液(5wt％脱脂奶)，封口膜封好后37℃孵育2h；

(4)血清稀释：将用小反刍兽疫弱毒苗免疫后的羊的阳性血清用封闭液稀释100倍；

(5)洗涤：同(2)；

(6)加样：加入稀释血清，同时用封闭液做阴性对照，37℃孵育1h；

(7)洗涤：同(2)；

(8)加二抗：每孔加入稀释(稀释比为1:5000)的HRP标记的驴抗羊IgG二抗100μl，37℃孵育0.5h；

(9)洗涤：同(2)；

(10)显色：避光条件下每孔加入100μl的TMB显色液，37℃孵育10min；

(11)终止：每孔加入50μl终止液(2M H₂SO₄)，终止反应；

(12)检测：于450nm波长测定样品OD值，分析数据；

(13)结果如下表六所示：包被亚单位H蛋白的能与血清特异性结合，OD450的均值为0.965；包被亚单位H蛋白与封闭液均没有特异性结合，OD450的均值为0.051。这说明，亚单位H 蛋白可以作为Elisa试剂盒的抗原，具有良好的免疫原性，在摸索合适的包被浓度和血清稀释比后，可以开发用于检测小反刍兽疫感染和免疫的诊断试剂盒。

表六Elisa检测法对亚单位H蛋白的鉴定结果

1g.4稳定性验证

将步骤1f纯化后的亚单位H蛋白用PBS缓冲液稀释到1mg/ml，分成20份，每份0.5ml；其中10份置于4℃冰箱中，每周取样一份，连续取样10次；另外10份置于-20℃冰箱中，每周取样一份，连续取样10次；每次取样后用BCA检测蛋白浓度，结果如下表七所示：

表七亚单位H蛋白的稳定性

参见表七，从蛋白浓度的变化来看，两组实验过程中蛋白基本保持稳定。为了进一步验证处理后的蛋白的是否降解，我们用第10次的样品进行SDS-PAGE检测，具体结果如图8所示。其中，图8的1表示Marker；2表示4℃处理后的亚单位H蛋白，未加还原剂，上样量为2 μg；3表示-20℃处理后的亚单位H蛋白，未加还原剂，上样量为2μg。从图中可以看出，处理后的样品(第10次取样)仍然稳定，由此可得，本发明制得的亚单位H蛋白具有优异的稳定性。

1h：疫苗制备

1h.1、疫苗制备

(1)水相准备：根据疫苗中亚单位H蛋白含量，使用PBS缓冲液(或生理盐水)将亚单位 H蛋白稀释成不同浓度梯度的若干份，如50μg/mL、100μg/mL、200μg/mL、400μg/mL 等，本实施例中将亚单位H蛋白稀释至50μg/mL，即为水相；

(2)油相准备：根据制备疫苗总量，按照抗原相和佐剂重量比为1:1，体积比为46:54，量取适量ISA201 VG佐剂；

(3)乳化：将水相和油相都预热到33℃，将水相缓缓加到油相中，200-500rpm/min搅拌20-30 min，于20℃静置1后置于4℃过夜；

(4)分装、贮存：根据需要进行分装，检验合格后于4℃保存备用。

1h.2、疫苗质检

物理性状采用眼观的方法观察外观(是否是乳白色乳剂)；

采用清洁吸管吸取少量疫苗滴于冷水中，观察(除第1滴外)，疫苗应为云雾状扩散，判定为水包油包水剂型；

将疫苗10mL加入离心管中，在3000r/min的转速下离心15min，管底析出的水相应≤0.5mL，判为稳定；

使用粘度仪对疫苗进行粘度检测，应在20-50cp，判为合格。

实施例2：与实施例1的区别之处在于，本实施例中未对亚单位H蛋白的编码基因序列进行密码子优化，即亚单位H蛋白的编码基因序列如SEQ ID NO.2所示。

实施例3：与实施例1的区别之处在于，本实施例中对亚单位H蛋白的编码基因序列进行密码子优化，其具体的编码基因序列如SEQ ID NO.4所示。

实施例4：与实施例1的区别之处在于，本实施例中对亚单位H蛋白的编码基因序列进行密码子优化，其具体的编码基因序列如SEQ ID NO.5所示。

实施例5：与实施例1的区别之处在于，本实施例中对亚单位H蛋白的编码基因序列进行密码子优化，其具体的编码基因序列如SEQ ID NO.6所示。

实施例6：与实施例1的区别之处在于，本实施例中对亚单位H蛋白的编码基因序列进行密码子优化，其具体的编码基因序列如SEQ ID NO.7所示。

实施例7：与实施例1的区别之处在于，本实施例中使用的真核表达载体为pEE6.4，细胞株为CHO细胞株中的DG44细胞株。

实施例8：与实施例1的区别之处在于，本实施例中使用的真核表达载体为pGL4.13，细胞株为CHO细胞株中的CHO-K1细胞株。

实施例9：与实施例1的区别之处在于，本实施例中使用的真核表达载体为pcDNA3.1，细胞株为CHO细胞株中的CHO-S细胞株。

实施例10：与实施例1的区别之处在于，本实施例中使用的真核表达载体为pEE12.4，细胞株为CHO细胞株中的CHO-S细胞株。

实施例11：与实施例1的区别之处在于，本实施例中使用的真核表达载体为pEE12.4，细胞株为HEK293细胞株，且亚单位H蛋白在制备过程中无需对步骤1d中的驯化操作。

实施例12：与实施例1的区别之处在于，本实施例中使用的真核表达载体为pEE12.4，细胞株为293T/17细胞株，且亚单位H蛋白在制备过程中无需步骤1d中的驯化操作。

实施例13：与实施例1的区别之处在于，本实施例中使用的真核表达载体为pCEP4，细胞株为CHO细胞株中的DG44细胞株。

对比例：与实施例1的区别之处在于，本对比例中小反刍兽疫病毒的H蛋白的编码基因序列为GenBank:KM091959.1中7332-9661bp的基因组序列。

对实施例2-实施例13以及对比例中亚单位H蛋白的表达产量以及蛋白纯度加以测定，其表达结果如下表八所示。

表八实施例2-实施例13以及对比例的亚单位H蛋白的得率和纯度

参见表八，本发明的蛋白得率在1.6g/L-2.4g/L，蛋白纯度高于80％，明显优于对比例中0.0g/L-0.02g/L的蛋白得率以及39％的蛋白纯度，由此可以得到，本发明构建的亚单位H 蛋白编码基因能够在细胞株中高效分泌表达出亚单位H蛋白，且其获得的亚单位H蛋白的蛋白纯度较高。

实施例2-实施例6的蛋白得率在1.8g/L-2.0g/L，蛋白纯度在86％-90％，而实施例1的蛋白得率为2.1g/L-2.4g/L，蛋白纯度达95％，因此实施例1为实施例1至实施例6中的优选实施例，由此可得，亚单位H蛋白的编码基因序列为SEQ ID NO.3时，其对应的蛋白得率和蛋白纯度达到最优值。

实施例7-实施例13的蛋白得率在1.6g/L-2.0g/L，蛋白纯度在81％-88％，低于实施例1 的检测结果。由此可得，当真核表达载体选用pEE12.4、细胞株选用CHO细胞株、HEK293 细胞株、293T/17细胞株中一种时，亚单位H蛋白的表达产量和蛋白纯度均较高；尤其当真核表达载体选用pEE12.4、细胞株选用CHO-K1细胞株时，亚单位H蛋白的表达量和蛋白纯度达到最优值。

综上，本发明构建的重组质粒能够在工程化细胞株中被有效表达，得到高产量、高纯度的小反刍兽疫病毒的亚单位H蛋白，该小反刍兽疫病毒的亚单位H蛋白具有良好的特异性和稳定性，能够被大规模生产，有效降低了小反刍兽疫病毒的亚单位H蛋白的生产成本，同时还能较好的适用于小反刍兽疫病毒的亚单位疫苗或诊断试剂中的应用。由此，本发明的亚单位H蛋白具有分泌表达高效、蛋白纯度高、易于纯化、生产成本低、安全性能高等特点。

本发明通过上面的实施例进行举例说明，但是，应当理解，本发明并不限于这里所描述的特殊实例和实施方案。在这里包含这些特殊实例和实施方案的目的在于帮助本领域中的技术人员实践本发明。任何本领域中的技术人员很容易在不脱离本发明精神和范围的情况下进行进一步的改进和完善，因此本发明只受到本发明权利要求的内容和范围的限制，其意图涵盖所有包括在由附录权利要求所限定的本发明精神和范围内的备选方案和等同方案。

序列表

<110> 浙江海隆生物科技有限公司

<120> 小反刍兽疫病毒的亚单位H蛋白及其制备方法和应用

<130> P010PTA01F1800034

<160> 7

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 461

<212> PRT

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<400> 1

Asn Phe Asp Gln Phe Cys Glu Tyr Lys Ala Ala Val Lys Ser Ile Glu

1 5 10 15

His Ile Phe Glu Ser Pro Leu Asn Lys Ser Lys Lys Leu Gln Ser Leu

20 25 30

Thr Leu Gly Pro Gly Thr Gly Cys Leu Gly Arg Thr Val Thr Arg Ala

35 40 45

His Phe Ser Glu Leu Thr Met Thr Leu Met Asp Leu Asp Leu Glu Met

50 55 60

Lys His Asn Val Ser Ser Val Phe Thr Val Val Glu Glu Gly Leu Phe

65 70 75 80

Gly Arg Thr Tyr Thr Val Trp Arg Ser Asp Ala Arg Asp Pro Ser Thr

85 90 95

Asp Leu Gly Ile Gly His Phe Leu Arg Val Phe Glu Ile Gly Leu Val

100 105 110

Arg Asp Leu Gly Leu Gly Pro Pro Val Phe His Met Thr Asn Tyr Leu

115 120 125

Thr Val Asn Met Ser Asp Asp Tyr Arg Arg Cys Leu Leu Ala Val Gly

130 135 140

Glu Leu Lys Leu Thr Ala Leu Cys Thr Ser Ser Glu Thr Val Thr Leu

145 150 155 160

Ser Glu Arg Gly Val Pro Arg Arg Glu Pro Leu Val Val Val Ile Leu

165 170 175

Asn Leu Ala Gly Pro Thr Leu Gly Gly Glu Leu Tyr Ser Val Leu Pro

180 185 190

Thr Ser Asp Leu Met Val Glu Lys Leu Tyr Leu Ser Ser His Arg Gly

195 200 205

Ile Ile Lys Asp Asp Glu Ala Asn Trp Val Val Pro Ser Thr Asp Val

210 215 220

Arg Asp Leu Gln Asn Lys Gly Glu Cys Leu Val Glu Ala Cys Lys Thr

225 230 235 240

Arg Pro Pro Ser Phe Cys Asn Gly Thr Gly Ser Gly Pro Trp Ser Glu

245 250 255

Gly Arg Ile Pro Ala Tyr Gly Val Ile Arg Val Ser Leu Asp Leu Ala

260 265 270

Ser Asp Pro Asp Val Val Ile Thr Ser Val Phe Gly Pro Leu Ile Pro

275 280 285

His Pro Ser Gly Met Asp Leu Tyr Asn Asn Pro Phe Ser Lys Ala Val

290 295 300

Trp Leu Ala Val Pro Pro Tyr Glu Gln Ser Phe Leu Gly Met Ile Asn

305 310 315 320

Thr Ile Gly Phe Pro Asn Arg Ala Glu Val Met Pro His Ile Leu Thr

325 330 335

Thr Glu Ile Arg Gly Pro Arg Gly Arg Cys His Val Pro Ile Glu Leu

340 345 350

Ser Arg Arg Val Asp Asp Asp Ile Lys Ile Gly Ser Asn Met Val Ile

355 360 365

Leu Pro Thr Met Asp Leu Arg Tyr Ile Thr Ala Thr Tyr Asp Val Ser

370 375 380

Arg Ser Glu His Ala Ile Val Tyr Tyr Ile Tyr Asp Thr Ser Arg Ser

385 390 395 400

Ser Ser Tyr Phe Tyr Pro Val Arg Leu Asn Phe Lys Gly Asn Pro Leu

405 410 415

Ser Leu Arg Ile Glu Cys Phe Pro Trp Arg His Lys Val Trp Cys Tyr

420 425 430

His Asp Cys Leu Ile Tyr Asn Thr Ile Thr Gly Glu Glu Val His Thr

435 440 445

Arg Gly Leu Thr Gly Ile Glu Val Thr Cys Asn Pro Val

450 455 460

<210> 2

<211> 1383

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<400> 2

aattttgatc agttttgtga gtacaaggct gcggttaagt caattgaaca tatatttgag 60

tcaccactca acaagtcaaa aaagctgcaa tctttgactc tcgggcccgg aacaggctgt 120

ctaggcagga cagtaacaag agcccatttc tcagaactta caatgacctt aatggacctg 180

gatctagaga tgaagcacaa cgtgtcctca gtgtttaccg tagttgaaga gggattattc 240

ggaagaacat ataccgtctg gagatccgat gccagggatc cgagcaccga tctaggtatc 300

ggccattttt taagagtctt cgagattgga ctggtaagag atcttgggct gggtccccct 360

gtttttcata tgaccaacta tctcacggtg aacatgagtg atgactatcg gagatgtctt 420

ttagcggtag gggagttgaa gttgacagcc ctatgcacct catctgagac tgtgacactg 480

agtgagagag gagttccaag gagggaacct cttgtggttg tgatacttaa tctagctgga 540

cccactctag ggggagagct atacagtgtc ttgcctacct ctgatctcat ggtggagaaa 600

ctctatttgt cttcacatag agggatcatc aaagatgatg aggccaattg ggtagtgccg 660

tctaccgatg ttcgtgatct tcagaacaaa ggtgaatgtc tggtggaagc atgcaagact 720

cgacctcctt cattttgcaa tggcacagga tcaggcccgt ggtcagaagg gagaatccct 780

gcctacgggg tgatcagggt cagtcttgac ttagcgagtg acccggatgt agttatcact 840

tcagtgtttg gcccactgat acctcaccca tccggcatgg atctttacaa caacccgttt 900

tcaaaagctg tatggttggc tgtaccacct tatgagcagt catttctagg aatgataaat 960

acaattggat tccctaacag agcagaggtt atgccgcaca ttttgaccac agagatcaga 1020

ggccctcggg gtcgttgcca tgttcccata gaattgtccc gccgggttga tgacgatatc 1080

aagatcgggt ccaacatggt catattgccg acgatggacc tgaggtatat tacagccact 1140

tatgatgttt ccaggagcga gcatgcaatc gtgtactata tctatgacac gagtcgctca 1200

tcatcttact tctacccagt tcgactgaat ttcaaaggca atcctctctc tttgaggata 1260

gagtgtttcc cctggcgtca taaggtgtgg tgctaccatg attgtcttat atacaacacc 1320

ataacaggtg aagaggtcca tacgagaggg ctgaccggca tagaggtaac atgcaatcca 1380

gtc 1383

<210> 3

<211> 1383

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<400> 3

aatttcgacc agttttgtga gtataaggcc gctgtgaaga gcatcgagca catcttcgag 60

tcccccctga acaagagcaa gaagctgcag tctctgaccc tgggacctgg aacaggatgc 120

ctgggaagga ccgtgacaag ggctcacttt tctgagctga ccatgacact gatggatctg 180

gacctggaga tgaagcataa cgtgtccagc gtgttcaccg tggtggagga gggcctgttt 240

ggccggacct acacagtgtg gagaagcgat gctcgcgacc catctacaga tctgggcatc 300

ggccacttcc tgagagtgtt tgagatcgga ctggtgcgcg acctgggact gggaccaccc 360

gtgttccata tgaccaacta cctgacagtg aatatgtctg acgattatag gcggtgcctg 420

ctggctgtgg gagagctgaa gctgaccgcc ctgtgcacat cttccgagac cgtgacactg 480

tccgagaggg gagtgcctag aagggagcca ctggtggtgg tcatcctgaa cctggctgga 540

ccaaccctgg gaggagagct gtactccgtg ctgcccacaa gcgacctgat ggtggagaag 600

ctgtatctga gctctcacag gggcatcatc aaggacgatg aggccaactg ggtggtgccc 660

tccaccgatg tgagagacct gcagaataag ggcgagtgcc tggtggaggc ttgtaagacc 720

cgccctccct ccttctgcaa tggaacagga agcggaccat ggtctgaggg aaggatccct 780

gcctacggcg tgatccgggt gtctctggat ctggcttccg atcccgacgt ggtcatcacc 840

tccgtgttcg gccctctgat cccacatccc tccggcatgg acctgtacaa caatcccttc 900

tccaaggccg tgtggctggc tgtgccacct tatgagcagt ccttcctggg catgatcaac 960

accatcggct ttccaaatag agctgaagtg atgccccaca tcctgaccac agagatcagg 1020

ggacctagag gccgctgtca tgtgccaatc gagctgtcta ggcgggtgga cgatgacatc 1080

aagatcggct ccaacatggt catcctgccc accatggatc tgaggtacat caccgccaca 1140

tatgacgtgt cccggagcga gcacgctatc gtgtactata tctatgatac aagcagatcc 1200

agctcttact tctatcccgt gcgcctgaac tttaagggca atcctctgtc tctgaggatc 1260

gagtgctttc catggcggca caaagtgtgg tgctaccatg actgtctgat ctataacacc 1320

atcacaggcg aggaggtgca taccagaggc ctgacaggca tcgaggtgac ctgtaatcct 1380

gtg 1383

<210> 4

<211> 1383

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<400> 4

aacttcgacc agttctgcga gtacaaggcc gccgtgaaga gcatcgagca catcttcgag 60

agccccctga acaagagcaa gaagctgcag agcctgaccc tgggccccgg caccggctgc 120

ctgggcagga ccgtgaccag ggcccacttc agcgagctga ccatgaccct gatggacctg 180

gacctggaga tgaagcacaa cgtgagcagc gtgttcaccg tggtggagga gggcctgttc 240

ggcaggacct acaccgtgtg gaggagcgac gccagggacc ccagcaccga cctgggcatc 300

ggccacttcc tgagggtgtt cgagatcggc ctggtgaggg acctgggcct gggccccccc 360

gtgttccaca tgaccaacta cctgaccgtg aacatgagcg acgactacag gaggtgcctg 420

ctggccgtgg gcgagctgaa gctgaccgcc ctgtgcacca gcagcgagac cgtgaccctg 480

agcgagaggg gcgtgcccag gagggagccc ctggtggtgg tgatcctgaa cctggccggc 540

cccaccctgg gcggcgagct gtacagcgtg ctgcccacca gcgacctgat ggtggagaag 600

ctgtacctga gcagccacag gggcatcatc aaggacgacg aggccaactg ggtggtgccc 660

agcaccgacg tgagggacct gcagaacaag ggcgagtgcc tggtggaggc ctgcaagacc 720

aggcccccca gcttctgcaa cggcaccggc agcggcccct ggagcgaggg caggatcccc 780

gcctacggcg tgatcagggt gagcctggac ctggccagcg accccgacgt ggtgatcacc 840

agcgtgttcg gccccctgat cccccacccc agcggcatgg acctgtacaa caaccccttc 900

agcaaggccg tgtggctggc cgtgcccccc tacgagcaga gcttcctggg catgatcaac 960

accatcggct tccccaacag ggccgaggtg atgccccaca tcctgaccac cgagatcagg 1020

ggccccaggg gcaggtgcca cgtgcccatc gagctgagca ggagggtgga cgacgacatc 1080

aagatcggca gcaacatggt gatcctgccc accatggacc tgaggtacat caccgccacc 1140

tacgacgtga gcaggagcga gcacgccatc gtgtactaca tctacgacac cagcaggagc 1200

agcagctact tctaccccgt gaggctgaac ttcaagggca accccctgag cctgaggatc 1260

gagtgcttcc cctggaggca caaggtgtgg tgctaccacg actgcctgat ctacaacacc 1320

atcaccggcg aggaggtgca caccaggggc ctgaccggca tcgaggtgac ctgcaacccc 1380

gtg 1383

<210> 5

<211> 1383

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<400> 5

aacttcgacc agttctgcga gtacaaggcc gccgtgaagt ccatcgagca catcttcgag 60

tcccccctga acaagtccaa gaagctgcag tccctgaccc tgggccccgg caccggctgc 120

ctgggccgca ccgtgacccg cgcccacttc tccgagctga ccatgaccct gatggacctg 180

gacctggaga tgaagcacaa cgtgtcctcc gtgttcaccg tggtggagga gggcctgttc 240

ggccgcacct acaccgtgtg gcgctccgac gcccgcgacc cctccaccga cctgggcatc 300

ggccacttcc tgcgcgtgtt cgagatcggc ctggtgcgcg acctgggcct gggccccccc 360

gtgttccaca tgaccaacta cctgaccgtg aacatgtccg acgactaccg ccgctgcctg 420

ctggccgtgg gcgagctgaa gctgaccgcc ctgtgcacct cctccgagac cgtgaccctg 480

tccgagcgcg gcgtgccccg ccgcgagccc ctggtggtgg tgatcctgaa cctggccggc 540

cccaccctgg gcggcgagct gtactccgtg ctgcccacct ccgacctgat ggtggagaag 600

ctgtacctgt cctcccaccg cggcatcatc aaggacgacg aggccaactg ggtggtgccc 660

tccaccgacg tgcgcgacct gcagaacaag ggcgagtgcc tggtggaggc ctgcaagacc 720

cgccccccct ccttctgcaa cggcaccggc tccggcccct ggtccgaggg ccgcatcccc 780

gcctacggcg tgatccgcgt gtccctggac ctggcctccg accccgacgt ggtgatcacc 840

tccgtgttcg gccccctgat cccccacccc tccggcatgg acctgtacaa caaccccttc 900

tccaaggccg tgtggctggc cgtgcccccc tacgagcagt ccttcctggg catgatcaac 960

accatcggct tccccaaccg cgccgaggtg atgccccaca tcctgaccac cgagatccgc 1020

ggcccccgcg gccgctgcca cgtgcccatc gagctgtccc gccgcgtgga cgacgacatc 1080

aagatcggct ccaacatggt gatcctgccc accatggacc tgcgctacat caccgccacc 1140

tacgacgtgt cccgctccga gcacgccatc gtgtactaca tctacgacac ctcccgctcc 1200

tcctcctact tctaccccgt gcgcctgaac ttcaagggca accccctgtc cctgcgcatc 1260

gagtgcttcc cctggcgcca caaggtgtgg tgctaccacg actgcctgat ctacaacacc 1320

atcaccggcg aggaggtgca cacccgcggc ctgaccggca tcgaggtgac ctgcaacccc 1380

gtg 1383

<210> 6

<211> 1383

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<400> 6

aatttcgatc aattctgtga atataaagct gctgttaaat ctattgaaca tattttcgaa 60

tctccactta ataaatctaa aaaacttcaa tctcttactc ttggaccagg aactggatgt 120

cttggaagaa ctgttactag agctcatttc tctgaactta ctatgactct tatggatctt 180

gatcttgaaa tgaaacataa tgtttcttct gttttcactg ttgttgaaga aggacttttc 240

ggaagaactt atactgtttg gagatctgat gctagagatc catctactga tcttggaatt 300

ggacatttcc ttagagtttt cgaaattgga cttgttagag atcttggact tggaccacca 360

gttttccata tgactaatta tcttactgtt aatatgtctg atgattatag aagatgtctt 420

cttgctgttg gagaacttaa acttactgct ctttgtactt cttctgaaac tgttactctt 480

tctgaaagag gagttccaag aagagaacca cttgttgttg ttattcttaa tcttgctgga 540

ccaactcttg gaggagaact ttattctgtt cttccaactt ctgatcttat ggttgaaaaa 600

ctttatcttt cttctcatag aggaattatt aaagatgatg aagctaattg ggttgttcca 660

tctactgatg ttagagatct tcaaaataaa ggagaatgtc ttgttgaagc ttgtaaaact 720

agaccaccat ctttctgtaa tggaactgga tctggaccat ggtctgaagg aagaattcca 780

gcttatggag ttattagagt ttctcttgat cttgcttctg atccagatgt tgttattact 840

tctgttttcg gaccacttat tccacatcca tctggaatgg atctttataa taatccattc 900

tctaaagctg tttggcttgc tgttccacca tatgaacaat ctttccttgg aatgattaat 960

actattggat tcccaaatag agctgaagtt atgccacata ttcttactac tgaaattaga 1020

ggaccaagag gaagatgtca tgttccaatt gaactttcta gaagagttga tgatgatatt 1080

aaaattggat ctaatatggt tattcttcca actatggatc ttagatatat tactgctact 1140

tatgatgttt ctagatctga acatgctatt gtttattata tttatgatac ttctagatct 1200

tcttcttatt tctatccagt tagacttaat ttcaaaggaa atccactttc tcttagaatt 1260

gaatgtttcc catggagaca taaagtttgg tgttatcatg attgtcttat ttataatact 1320

attactggag aagaagttca tactagagga cttactggaa ttgaagttac ttgtaatcca 1380

gtt 1383

<210> 7

<211> 1383

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<400> 7

aacttcgacc agttctgcga atacaaagct gctgttaaat ctatcgaaca catcttcgaa 60

tctccgctga acaaatctaa aaaactgcag tctctgaccc tgggtccggg taccggttgc 120

ctgggtcgta ccgttacccg tgctcacttc tctgaactga ccatgaccct gatggacctg 180

gacctggaaa tgaaacacaa cgtttcttct gttttcaccg ttgttgaaga aggtctgttc 240

ggtcgtacct acaccgtttg gcgttctgac gctcgtgacc cgtctaccga cctgggtatc 300

ggtcacttcc tgcgtgtttt cgaaatcggt ctggttcgtg acctgggtct gggtccgccg 360

gttttccaca tgaccaacta cctgaccgtt aacatgtctg acgactaccg tcgttgcctg 420

ctggctgttg gtgaactgaa actgaccgct ctgtgcacct cttctgaaac cgttaccctg 480

tctgaacgtg gtgttccgcg tcgtgaaccg ctggttgttg ttatcctgaa cctggctggt 540

ccgaccctgg gtggtgaact gtactctgtt ctgccgacct ctgacctgat ggttgaaaaa 600

ctgtacctgt cttctcaccg tggtatcatc aaagacgacg aagctaactg ggttgttccg 660

tctaccgacg ttcgtgacct gcagaacaaa ggtgaatgcc tggttgaagc ttgcaaaacc 720

cgtccgccgt ctttctgcaa cggtaccggt tctggtccgt ggtctgaagg tcgtatcccg 780

gcttacggtg ttatccgtgt ttctctggac ctggcttctg acccggacgt tgttatcacc 840

tctgttttcg gtccgctgat cccgcacccg tctggtatgg acctgtacaa caacccgttc 900

tctaaagctg tttggctggc tgttccgccg tacgaacagt ctttcctggg tatgatcaac 960

accatcggtt tcccgaaccg tgctgaagtt atgccgcaca tcctgaccac cgaaatccgt 1020

ggtccgcgtg gtcgttgcca cgttccgatc gaactgtctc gtcgtgttga cgacgacatc 1080

aaaatcggtt ctaacatggt tatcctgccg accatggacc tgcgttacat caccgctacc 1140

tacgacgttt ctcgttctga acacgctatc gtttactaca tctacgacac ctctcgttct 1200

tcttcttact tctacccggt tcgtctgaac ttcaaaggta acccgctgtc tctgcgtatc 1260

gaatgcttcc cgtggcgtca caaagtttgg tgctaccacg actgcctgat ctacaacacc 1320

atcaccggtg aagaagttca cacccgtggt ctgaccggta tcgaagttac ctgcaacccg 1380

gtt 1383

Claims (9)

1. 一种小反刍兽疫病毒的亚单位H蛋白，其特征在于，所述亚单位H蛋白为小反刍兽疫病毒H蛋白截短的头部功能区蛋白，所述亚单位H蛋白的氨基酸序列为如SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列；

所述亚单位H蛋白在如SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列的氨基末端或羧基末端连接有poly-His、FLAG、c-myc、HA和poly-Arg中的一种标签。

2. 根据权利要求1所述的小反刍兽疫病毒的亚单位H蛋白，其特征在于，所述亚单位H蛋白的编码基因序列如SEQ ID NO.2所示，或由SEQ ID NO.2经密码子优化后所得。

3. 根据权利要求2所述的小反刍兽疫病毒的亚单位H蛋白，其特征在于，所述亚单位H蛋白的编码基因序列如SEQ ID NO.3所示。

4.权利要求1-3中任意一项所述的小反刍兽疫病毒的亚单位H蛋白的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

①、构建小反刍兽疫病毒的亚单位H蛋白的编码基因序列；

②、将亚单位H蛋白的编码基因序列克隆到真核表达载体中，得到含有亚单位H蛋白编码基因序列的重组质粒；

③、将含有亚单位H蛋白编码基因序列的重组质粒转染至动物的工程化细胞中，得到细胞株；

④、从步骤③得到的细胞株中筛选出高度表达的细胞株；

⑤、发酵培养步骤④中得到的高度表达的细胞株，纯化后得到小反刍兽疫病毒的亚单位H蛋白。

5.根据权利要求4所述的小反刍兽疫病毒的亚单位H蛋白的制备方法，其特征在于，步骤②中，所述真核表达载体为pEE6.4、pEE12.4、pGL4.13和pcDNA3.1中的一种。

6.根据权利要求5所述的小反刍兽疫病毒的亚单位H蛋白的制备方法，其特征在于，步骤②中，所述真核表达载体为pEE12.4。

7.根据权利要求4所述的小反刍兽疫病毒的亚单位H蛋白的制备方法，其特征在于，步骤③中，所述细胞株为CHO细胞株、HEK293细胞株、293T/17细胞株的一种。

8.根据权利要求7所述的小反刍兽疫病毒的亚单位H蛋白的制备方法，其特征在于，步骤③中，所述CHO细胞株为DG44细胞株、DXB11细胞株、CHO-K1细胞株和CHO-S细胞株的一种。

9.权利要求1-3中任意一项所述的小反刍兽疫病毒的亚单位H蛋白在制备适用于小反刍兽疫病毒的亚单位疫苗或诊断试剂中的应用。

Images