CN116655751A - 重组猪瘟e2蛋白及其亚单位疫苗的制备方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了重组猪瘟E2蛋白及其亚单位疫苗的制备方法和应用，所述重组猪瘟E2蛋白的制备方法包括下列步骤：1)将猪瘟E2蛋白编码基因克隆到真核表达载体中得到含有猪瘟E2蛋白编码基因的重组质粒；2)再将含有猪瘟E2蛋白编码基因的重组质粒转染至CHO细胞株中；3)通过培养、筛选、驯化2)中所述的CHO细胞株得到高度表达的细胞株；以及4)发酵培养3)中所述的细胞株，纯化后得到重组猪瘟E2蛋白。本发明提供的方法能够从细胞培养上清中收获目的蛋白，且产量高达1g/L，不仅缩短蛋白纯化时间和简化疫苗生产步骤，也大大降低疫苗生产成本。

Description

重组猪瘟E2蛋白及其亚单位疫苗的制备方法和应用
技术领域
本发明涉及一种悬浮稳定高效表达猪瘟E2蛋白的CHO细胞株及构建、筛选该细胞株的方法和猪瘟E2蛋白亚单位疫苗的制备方法及应用，属于动物疫苗与兽用生物制品技术领域。
背景技术
猪瘟在欧洲称为古典猪瘟(Classical Swine Fever，CSF)是由猪瘟病毒(Classical Swine Fever Virus，CSFV)引起的一种急性、热性、致死性疾病。猪瘟具有高度接触传染性、发病急、高热稽留和小血管壁变性引起广泛出血、梗塞和坏死等病变特征。家养和野生猪是其唯一的天然宿主。世界动物卫生组织(OIE)将其定为A类传染病，我国《动物防疫法》将其列为一类传染病。猪瘟是目前危害我国养猪业发展的主要疫病之一。
猪瘟病毒属于黄病毒科、瘟病毒属成员，为单链线状RNA病毒。病毒粒子略呈圆形，具有脂蛋白囊膜，病毒粒子表面有脆弱的纤突结构。CSFV基因组长约12.5kb，仅含有1个大的开放性阅读框(ORF)，此ORF编码约3898个氨基酸残基，分子量约438kDa的多聚蛋白。此多聚蛋白在翻译的同时和在翻译后经病毒与宿主细胞蛋白酶加工成12种成熟蛋白，依次为Npro,C,Erns,E1,E2,p7,NS2,NS3,NS4A,NS4B,NS5A,NS5B，其中C,Erns,E1和E2为结构蛋白,其余为非结构蛋白。E2是CSFV最主要的免疫原性蛋白，能够诱导机体产生中和抗体并且能够保护猪抵抗CSFV强毒株的攻击，也是研究猪瘟基因工程疫苗的重要靶蛋白。
猪瘟在世界范围内都有流行，对养猪业危害极大，目前对该病的有效预防措施是疫苗免疫。经过多年应用，公认安全有效的弱毒疫苗株有三种：①中国兔化弱毒疫苗；②日本GPE(-)细胞弱毒疫苗；③法国“Thiveosal”冷变异弱毒株。其中中国学者研制成功的中国系(C系)猪瘟兔化弱毒疫苗，自1957年起，除在我国广泛应用外，已推广到欧亚很多国家，并帮助这些国家控制或消灭了猪瘟。该疫苗被公认为目前世界上比较理想的猪瘟疫苗。目前我国市场上常用的猪瘟疫苗有3种，即猪瘟细胞活疫苗(细胞苗)、猪瘟乳兔组织活疫(组织苗)、猪瘟脾淋活疫苗(脾淋苗)。组织苗、脾淋苗的生产需要大量健康动物，生产过程中人工劳动强度大、成本高、有接种副反应等不利因素影响了此类苗的广泛应用。细胞苗同样也受到诸多因素困扰，如存在批次差异；无细胞病变，不易控制病毒产量；细胞苗原辅材料涉及犊牛睾丸细胞和牛血清，导致其制备过程中存在BVDV污染的风险。BVDV感染猪能引起疑似猪瘟的症状。近几年，在我国就有报道由BVDV污染的猪瘟疫苗引起的猪病。另外，由于长期使用活疫苗，导致无法从根本上净化猪瘟。
鉴于现有猪瘟疫苗的种种缺陷和不足，以及随着现代基因工程技术和细胞技术的发展，许多科研人员试图以现代分子生物学手段研制出可以克服现有疫苗缺陷的新型猪瘟疫苗。这些新型的猪瘟疫苗有病毒活载体疫苗、合成肽疫苗、DNA疫苗、大肠杆菌表达蛋白的亚单位疫苗、昆虫杆状病毒表达的E2蛋白亚单疫苗。其中至目前得到应用的有欧洲科研人员研制的以昆虫杆状病毒表达的E2蛋白亚单位疫苗，该疫苗免疫不受母源抗体影响，而且可以与病毒感染进行抗体检测鉴别诊断。但该疫苗是通过昆虫杆状病毒表达系统表达的，该表达系统相对原核表达系统而言，蛋白表达后可以在一定程度上进行翻译后加工与修饰，但与病毒天然抗原蛋白结构仍有一定差异，蛋白表达后折叠与修饰不如哺乳动物细胞表达系统。而且该系统生产制备抗原时，细胞经病毒感染后细胞会裂解与死亡，对下游纯化等生产工艺增加难度。另外，该系统制备目的蛋白的产量不会很高，一般只有200-300mg/L，很难达到500mg/L的产量。
CHO细胞是1957年美国科罗拉多大学Theodore T.Puck博士从一成年雌性仓鼠卵巢分离获得的，为上皮贴壁型细胞。该细胞具有不死性，可以传代百代以上，是目前生物工程上广泛使用的细胞。相对于其他的表达系统，它有如下优势：(1)具有准确的转录后修饰功能，表达的蛋白在分子结构、理化特性和生物学功能方面最接近于天然蛋白分子；(2)既可贴壁生长，又可以悬浮培养，且有较高的耐受剪切力和渗透压能力；(3)具有重组基因的高效扩增和表达能力，外源蛋白的整合稳定；(4)具有产物胞外分泌功能，并且很少分泌自身的内源蛋白，便于下游产物分离纯化；(5)能以悬浮培养方式或在无血清培养基中达到高密度培养，且培养体积能达到1,000L以上，可以大规模生产。
CHO细胞类型比较多，例如：DG44、DXB11、CHO K1和CHO-S等。自20世纪80-90年代开始，工业上较早使用的是DHFR(二氢叶酸还原酶缺陷型)基因扩增筛选系统，宿主细胞株为DG44。当细胞培养基内含有甲氨蝶呤(methotrexate，MTX)时，二氢叶酸还原酶被抑制，通过反馈调节，使得该基因进行扩增，其上下游100-1,000kb范围内的基因都会随之扩增，因此将目的基因插入此位点范围即可得到扩增。现在很多单抗生产的体系依然是DG44的DHFR体系。GS(谷氨酰胺合成酶)扩增系统，以CHO-K1为宿主细胞，是近些年发展的一种新型基因扩增筛选系统，较DHFR系统有明显的优越性，目前在国际上得到了广泛的认可。其原理是GS在ATP水解提供能量的同时，利用细胞内的氨和谷氨酸合成谷氨酰胺。在缺乏外源谷氨酰胺的培养基中加入GS抑制剂甲硫氨酸亚砜亚铵(L-methioninesulfoximine，MSX)，可使GS基因及与之相连的目的基因得到有效扩增，从而达到提高目的基因表达水平的目的。该系统的优点主要在：不需要基因缺陷型的CHO-K1细胞株作为宿主细胞；CHO-K1细胞易于培养更强壮；在培养基中无需加谷氨酰胺，能够避免谷氨酰胺分解造成培养体系中氨水平高的问题，降低了工艺控制的难度，并且可有效提高细胞发酵密度和延长细胞生存时间。
但是，本发明人一开始使用CHO细胞表达猪瘟E2蛋白时，发现猪瘟E2蛋白的基因未经密码子优化时，CHO细胞基本不表达猪瘟E2蛋白，因此，在使用CHO细胞表达猪瘟E2蛋白时，密码子优化是一个非常重要的步骤。
发明内容
本发明要解决的问题是提供一种可大规模工业化生产猪瘟病毒重组亚单位疫苗的制备方法与应用。
根据本发明的一个方面，本发明提供了一种重组猪瘟E2蛋白的制备方法，所述制备方法含有下列步骤：1)将密码子优化后的猪瘟E2蛋白编码基因克隆到真核表达载体中得到含有猪瘟E2蛋白编码基因的重组质粒；2)再将含有猪瘟E2蛋白编码基因的重组质粒转染至CHO细胞株中；3)通过培养、筛选、驯化2)中所述的CHO细胞株得到高度表达的细胞株；以及4)发酵培养3)中所述的细胞株，纯化后得到重组猪瘟E2蛋白。
本发明的优选技术方案中，优选地，所述密码子优化后的猪瘟E2蛋白编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。
本发明的优选技术方案中，优选地，所述真核表达载体为pEE6.4、pEE12.4、pGL4.13、pcDNA3.1。更优选地，所述真核表达载体为pEE12.4。
本发明的优选技术方案中，优选地，所述CHO细胞株为DG44、DXB11、CHO-K1、CHO-S细胞株。更优选地，所述CHO细胞株为CHO-K1。
根据本发明的另一个方面，本发明还提供了一种含有重组猪瘟E2蛋白亚单位疫苗的制备方法，将上述制备方法得到的重组猪瘟E2蛋白与药学上可接受的佐剂充分混匀，得到猪瘟E2重组亚单位疫苗。
本发明的优选技术方案中，优选地，所述重组亚单位疫苗所用佐剂为ISA201VG。
本发明的优选技术方案中，优选地，所述重组猪瘟E2蛋白与佐剂ISA201VG按体积比46:54混合乳化。
根据本发明的再一方面，本发明还提供了一种重组猪瘟E2蛋白和猪瘟病毒重组亚单位疫苗在制备相关诊断试剂中的应用。
本发明构建并筛选了悬浮稳定高效表达猪瘟E2蛋白的CHO细胞株，该细胞株表达E2蛋白产量高、易于纯化、易于大规模生产，且表达的猪瘟E2蛋白抗原能对免疫猪诱导产生良好的免疫反应并能耐受猪瘟石门株强毒攻击；由该重组E2蛋白制备的亚单位疫苗具有以下优点：1.大规模生产、供量充足、质控容易；2.安全性高、免疫原性好；3.批次间稳定；4.生产成本低；5.无BVDV污染风险。
本发明选择表达猪瘟E2蛋白的系统是CHO表达系统，该系统研究比较清楚，且本发明人所用表达的细胞株是适合悬浮培养的，产量高达1g/L，因此在工业上非常容易放大，特别适合大规模工业化生产，相对于其他的真核表达系统，生产成本很低；另外，本发明人使用CHO细胞表达的猪瘟E2蛋白是分泌在细胞上清中的，因为CHO细胞培养上清中杂蛋白含量较少，因此纯化起来比较方便快捷，本发明人研究发现，表达在细胞上清中的猪瘟E2蛋白在SDS-PAGE上的纯度都能够达到80％以上(见图6中原液的SDS-PAGE检测结果)，因此只需要简单过一个镍柱纯化纯度就能达到95％以上，远远满足猪瘟E2亚单位疫苗制备所需。
附图说明
图1表示pEE12.4-OPTI-E2质粒图谱。
图2表示pCDNA3.1-OPTI-E2质粒图谱。
图3表示pEE12.4-OPTI-E2双酶切鉴定结果：3是DNA Marker：1kb ladder；1是pEE12.4-OPTI-E2未酶切电泳结果；2是pEE12.4-OPTI-E2双酶切电泳结果。
图4表示pCDNA3.1-OPTI-E2双酶切鉴定结果：3是DNA Marker：DL10000；1、2都是pEE12.4-OPTI-E2双酶切电泳结果。
图5表示细胞摇瓶发酵结果。
图6表示镍柱亲和层析色谱图及SDS-PAGE结果。
图7表示IDEXX试剂盒检测重组猪瘟E2蛋白亚单位疫苗免疫后抗体效价结果。
图8表示密码子优化前后的核苷酸序列比较：E2表示密码子优化前的序列；OPTI-E2表示密码子优化后的序列。
具体实施方式
以下将结合附图和实施例对本发明做进一步说明，本发明的实施例仅用于说明本发明的技术方案，并非限定本发明。
本发明实施例中所使用的菌株、质粒和试剂均为市售产品。
本发明试剂及药品的来源列单如下：
CHO-K1细胞来源于中国科学院典型培养物保藏委员会细胞库中国科学院上海生命科学研究所细胞库；
二氢叶酸还原酶缺陷型中华仓鼠卵巢细胞(CHO/dhfr-)购于American TypeCulture Collection(ATCC)公司产品(SCO610)；
细胞培养基购自美国Gibco公司，胎牛血清购自Hyclone公司；
真核表达载体pEE12.4购自上海林渊生物科技有限公司；
真核表达载体pCDNA3.1(+)购于美国Invitrogen公司；
Lipofectamine LTX购自美国Thermo Fisher公司；
氨甲基喋呤(methotrexate，MTX)购于Sigma公司；
甲硫氨酸亚砜亚铵(L-methioninesulfoximine，MSX)购于Sigma公司；
BCA蛋白质定量试剂盒购自美国Thermo Fisher公司；
ISA201VG购自法国赛比克公司。
实施例1：猪瘟E2蛋白密码子优化
通过对编码猪瘟E2蛋白的核苷酸序列进行密码子优化，得到OPTI-E2序列，如SEQID NO.3所示，该工作委托苏州金唯智生物科技有限公司完成。
将SEQ ID NO.3与SEQ ID NO.4的序列进行比对，发现密码子优化后的猪瘟E2蛋白核苷酸序列与未经密码子优化的猪瘟E2蛋白核苷酸序列有21.3％的差异，即1044个核苷酸中有222个核苷酸不同。具体见图8所示。
实施例2：pEE12.4-OPTI-E2重组质粒构建
2.1PCR扩增目的片段OPTI-E2
2.1.1PCR反应
(1)引物设计及合成
上游引物:5’-CCAAGCTTGCCGCCACCATGAAAGTGCTGAGGGGCCAG-3’下游引物:5’-CCGGAATTCTTAGTGATGGTGATGGTGATGAGC-3’
(2)加样体系50μL，如下表所示：
PCR扩增程序：
2.1.2PCR产物进行胶回收
(1)标记好样品收集EP管、吸附柱以及收集管；
(2)称取标记好的空的EP管重量，并记录数值；
(3)将单一的目的DNA条带在切胶仪上从琼脂糖凝胶中用手术刀小心切下放入干净的1.5mL离心管中；
(4)向步骤(3)中的1.5mL离心管中加入600μL PC buffer，50℃水浴放置5min左右，其间不断温和上下翻转离心管，以确保胶块充分溶解；
(5)柱平衡：向吸附柱CB2中(吸附柱预先放入收集管中)加入500μL平衡液BL，离心12,000rpm/min，1min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中；
(6)将步骤(5)所得溶液加至吸附柱CB2中，静置2min，10,000rpm/min，离心30s，倒掉收集管中的废液，再将吸附柱CB2放入收集管中；
(7)向吸附柱中加入600μL漂洗液PW buffer，静置3min，离心10,000rpm/min，30s，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CB2放入收集管中；
(8)重复步骤(7)；
(9)空吸附柱离心，12,000rpm/min，2min，尽量除去漂洗液，将吸附柱置于室温放置10min，彻底晾干；
(10)将吸附柱CB2放入收集管中，向吸附膜中间位置悬空滴加50μL Elutionbuffer(65℃预热)，静置3min，离心12,000rpm/min，2min；
(11)从离心机中取出步骤(10)中离心管，丢弃中间的吸附柱CB2，盖上离心管盖子，保留离心管中的DNA样品；
(12)将步骤11中的DNA样品置于4℃保存，准备琼脂糖凝胶电泳鉴定胶回收DNA片段。
2.2PCR产物及载体双酶切反应
(1)标记好需要用到的1.5mL EP管，在1.5mL EP管中按照下表进行加样、混匀：50μL反应体系
(2)将步骤(1)中的1.5mL EP管置于相应酶最适温度恒温水浴锅中，水浴2-3h。
双酶切产物胶回收：取出上述双酶切体系，进行琼脂糖凝胶电泳以回收其中的DNA片段，方法同1.2.1中PCR产物胶回收。
2.3连接反应
(1)准备洁净的1.5mL EP管若干，做好标记，置于EP管架上待用。
(2)在1.5mL EP管按照下表进行加样、混匀。
(3)按照步骤(2)中表格完成加样后，将每个10μl反应体系置于16℃低温冷却液循环机中，水浴10-16h；
(4)取出步骤(3)中EP管，将其置于65℃水浴锅中，水浴15min；
(5)取出步骤(4)中的EP管，置于4℃保存。
1.2.4转化反应
(1)将10μl连接反应液快速加入100μl感受态细胞中，并吹打混匀，冰浴30min；
(2)取出样品管，置于42℃水浴100s，然后立即冰浴2min；
(3)取出样品管，在超净工作台中，向样品管中加入600μL液体LB培养基，然后将样品管置于37℃恒温摇床，220rpm/min，培养1h；
(4)涂板：取出步骤(3)中样品管，室温离心8,000rpm/min，2min，去掉600μl上清液体，剩余上清液重悬管底部的菌体，将重悬的菌液放入相应的转化平板中心，用涂菌棒将转化平板中心的菌液均匀铺开。
(5)将转化步骤(4)平板正置于生化恒温培养箱中，37℃培养1h后，将转化平板倒置进行培养15h；
(6)观察转化结果。
2.5质粒抽提与双酶切鉴定
2.5.1质粒抽提
(1)用10μL移液枪头从转化平板中挑取单克隆至5ml含氨苄抗性的LB液体培养基中，37℃，220rpm/min摇菌过夜；
(2)将菌液移至1.5ml EP管中，室温离心，12,000rpm/min，2min，弃上清；
(3)向步骤(2)的EP管中加入250μL质粒提取试剂P1 buffer，彻底悬浮菌体；
(4)向步骤(3)溶液中加入250μL P2 buffer，立即温和颠倒离心管5-10次混匀，室温静置2-4min；
(5)向步骤(4)溶液中加入350μL P3 buffer，立即温和颠倒离心管5-10次混匀；室温静置2-4min；
(6)将步骤(5)溶液，室温离心，14,000rpm/min，10min；
(7)将步骤(6)中上清溶液移至吸附柱中心，室温离心，12,000rpm/min，30s，倒掉收集管中液体；
(8)向吸附柱中心加入500μL Buffer DW1，室温离心，12,000rpm/min，30s，倒掉收集管中液体；
(9)向吸附柱中心加入500μL wash solution，室温离心，12,000rpm/min，30s，倒掉收集管中液体，重复一次；
(10)空吸附柱，室温离心，12,000rpm，2min。
(11)将吸附柱放入一个干净的1.5ml离心管中，向吸附膜中心加入30μL Elutionbuffer，室温静置5min，室温离心，12,000rpm，2min。保存管中DNA溶液。
2.5.2双酶切鉴定
(1)标记好需要用到的1.5mL EP管，按照下表进行加样：20μL反应体系
(2)将步骤(1)中的EP管20μL反应体系置于37℃恒温水浴锅中，水浴2h。
(3)将步骤(2)中的双酶切体系样品进行琼脂糖凝胶电泳，检查插入片段大小是否正确；实验结果见图3。
(4)选择插入片段正确的克隆送测序公司测序。
2.6无内毒素质粒大提
2.6.1无内毒素质粒提取
(1)测序正确的克隆接种至100ml含氨苄抗性的培养基中，于37℃恒温摇床，220rpm/min，培养15h；
(2)将步骤(1)中培养的菌液转移至50mL离心管中，室温、8,000rpm/min、离心5min，收集菌体，弃掉上清培养基；
(3)向步骤(2)的离心管中加入8mL溶液P1，用移液器充分重悬菌体；
(4)向步骤(3)的离心管中加入8mL溶液P2，立即温和颠倒离心管6-8次，室温静置5min；
(5)向步骤(4)的离心管中加入8mL溶液P4，立即上下颠倒6-8次，充分混匀至溶液出现白色絮状沉淀，室温放置10min左右。8,000rpm/min室温离心5-10min，使白色沉淀离至管底；
(6)将步骤(5)中上清液全部小心移入过滤器CS1中，慢慢推柄过滤器，滤液收集在干净的50mL离心管中；
(7)柱平衡：向吸附柱CP6中(吸附柱放入50mL收集管中)加入2.5mL的平衡液BL，室温8,000rpm/min离心2min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中；
(8)向步骤(6)滤液中加入0.3倍滤液体积的异丙醇，上下颠倒混匀后转移到吸附柱CP6中。室温8,000rpm/min离心2min，倒掉收集管中液体，将吸附柱CP6重新放入同一个收集管中；
(9)向步骤(8)吸附柱CP6中加入10mL漂洗液PW，室温8,000rpm/min离心2min，弃收集管中废液，将吸附柱重新放回收集管中；
(10)重复操作步骤(9)一次；
(11)向步骤(10)吸附柱CP6中加入3mL无水乙醇，室温8,000rpm/min离心2min，倒掉废液；
(12)将步骤(11)吸附柱CP6重新放回收集管中，室温8,000rpm/min离心5min。将吸附柱CP6开盖，置于室温放置数分钟晾干；
(13)将步骤(12)中吸附柱放入干净的50mL离心管中，在吸附膜中央加入1-2mL缓冲液TB，室温静置5min，室温8,000rpm/min离心2min，将50mL离心管中的洗脱液全部移入一个干净的1.5mL离心管，测浓度，-20℃保存。
(14)取1-2μL所得到的质粒DNA溶液进行琼脂糖凝胶电泳并保存电泳结果数据。
实施例3：pCDNA3.1-OPTI-E2重组质粒构建
按照实施例2中的步骤操作，双酶切鉴定实验结果见图4。
实施例4：pEE12.4-OPTI-E2重组质粒转染CHO-K1细胞与单克隆筛选的建立
4.1CHO-K1细胞转染
(1)准备：生物安全柜紫外灭菌30min；DMEM/F12(含10％血清，1％双抗)、DMEM/F12与PBS置于37℃水浴锅预热至37℃。
(2)从37℃培养箱中取出细胞(10cm细胞培养皿)，弃去上清培养基，用预温的8mlPBS洗细胞一次，并弃去PBS。
(3)每个10cm细胞培养皿加入1-2ml 0.25％trypsin-EDTA，室温消化2min左右，显微镜下观察细胞皱缩变圆，并呈单个细胞。
(4)加入4ml DMEM/F12(含10％血清，1％双抗)终止消化反应，并用移液器将细胞吹散。
(5)将消化好的细胞转移至15ml离心管中，常温离心，200g，5min。
(6)用DMEM/F12(含10％血清，1％双抗)重新悬浮细胞，计数。
(7)稀释细胞至2×105个/ml，取2ml混匀的细胞加入到六孔板，六孔板放置到37℃，5％ CO2细胞培养箱中孵育过夜。
(8)取出步骤(7)细胞培养皿，观察细胞状态：当细胞交汇度达到80％-90％时即可开始转染，转染前将培养基换成无抗生素无血清的DMEM/F12，2mL/孔。
(9)稀释质粒：用OPTI-MEM稀释质粒，125μl OPTI-MEM中加入2.5μg质粒，然后加入2.5μl plus，混匀，室温静置5min。
(10)稀释Lipofectamine LTX：125μl OPTI-MEM中加入9μlLipofectamine LTX，然后加入2.5μl plus，轻轻混匀，室温静置5min。
(11)将步骤(10)和步骤(11)混合物轻轻混匀。室温放置5min，然后逐滴加入六孔板中均匀分布。
(12)将六孔板置于37℃，5％ CO2细胞培养箱中培养4-6h。
(13)换液：弃掉上清培养基，加入2ml DMEM/F12(含10％血清1％双抗)，将六孔板置于37℃，5％ CO2细胞培养箱中培养。
4.2加压筛选
转染后24h开始加压：从37℃培养箱中取出六孔板细胞，弃去上清培养基，加入2mlDMEM/F12(含10％血清+25μM MSX)，加压7天，中间观察细胞，死细胞多换液。
4.3单克隆筛选
(1)加压筛选至阴性对照细胞基本死光时，约7天，开始单克隆筛选。
(2)取出六孔板，弃掉培养基，PBS洗一次，然后加入300μl 0.25％trypsin-EDTA，室温消化2min左右，加入2ml DMEM/F12(含10％血清+25μM MSX)终止消化反应，并用移液器将细胞吹散。
(3)将消化好的细胞转移至15ml离心管中，常温离心，200g，5min。
(4)用DMEM/F12(含10％血清+25μM MSX)重新悬浮细胞，计数。
(5)铺板：稀释细胞至5个/ml，取200μL混匀的细胞加入到96孔板中，放置到37℃，5％ CO2细胞培养箱中孵育4-6h。
(6)记录单个细胞的孔。
(7)待96孔板中单个细胞的孔长起来时，弃掉培养基，PBS洗一次，加入100μl0.25％trypsin-EDTA，室温消化2min左右，加入2ml DMEM/F12(含10％血清+25μM MSX)终止消化反应，并用移液器将细胞吹散。将细胞液转移至12孔板，待12孔板长满时，取上清，ELISA检测克隆是否为阳性，高效表达的阳性克隆继续扩大培养、冻存。
(8)经过筛选，共收获2株细胞株，编号为133株、54株。
实施例5：pCDNA3.1-OPTI-E2重组质粒转染CHO/dhfr-细胞与单克隆筛选的建立
5.1 CHO/dhfr-细胞转染
将构建好的质粒pCDNA3.1-OPTI-E2及pSV2-dhfr按照摩尔比5:1混合，用Lipofectamine LTX共转染CHO/dhfr-细胞。具体操作见实施例4的CHO-K1细胞转染。
5.2加压筛选
转染后24h开始加压：从37℃培养箱中取出六孔板细胞，弃去上清培养基，加入2mlDMEM/F12(含10％血清+25nM MTX)，加压7d，中间观察细胞，死细胞多换液。
5.3单克隆筛选
将实施例4中单克隆筛选步骤中的25μM MSX替换为25nM MTX，其他操作一样。
经过筛选，共收获1株细胞株，编号为251株。
实施例6：CHO-K1细胞株驯化成悬浮培养
(1)准备：生物安全柜紫外灭菌30min；DMEM/F12(含10％血清，25μM MSX)置于37℃水浴锅中预热至37℃。
(2)从37℃培养箱中取出细胞(10cm细胞培养皿)，弃去上清培养基，用预温的8mlPBS洗细胞一次，并弃去PBS。
(3)每个10cm细胞培养皿加入1-2ml 0.25％trypsin-EDTA，室温消化2min左右，显微镜下观察细胞皱缩变圆，并呈单个细胞。
(4)加入4ml DMEM/F12(含10％血清，25μM MSX)终止消化反应，并用移液枪将细胞吹散。
(5)将消化好的细胞转移至15ml离心管中，常温离心，200g，5min。
(6)用100％ DMEM/F12(含10％血清，25μM MSX)悬浮细胞，计数。
(7)稀释细胞至5×105个细胞/ml接种30ml培养基于一个125ml摇瓶中。细胞培养瓶放置到37℃，5％ CO2细胞培养箱中的轨道式振荡器上120rpm/min孵育过夜。
(8)生物安全柜台面用75％酒精擦拭消毒，紫外照射30min。
(9)每隔24h计数细胞密度及活力。
(10)待第一代细胞培养一次后细胞存活率达到94-97％时进行第二代培养。
(11)准备：生物安全柜紫外灭菌30min；100％DMEM/F12(含10％血清，25μM MSX)，EX-CELL 302置于CO2细胞培养箱中预热至37℃。
(12)从37℃培养箱中取出细胞转移至50ml离心管中，常温200g离心5min。
(13)将DMEM/F12(含10％血清，25μM MSX)和EX-CELL 302按1：1混合混匀，重新悬浮细胞，计数。
(14)稀释细胞至5×105个细胞/ml接种30ml培养基于一个125ml摇瓶中。细胞培养瓶放置到37℃，5％ CO2细胞培养箱中的轨道式振荡器上120rpm/min孵育过夜。
(15)生物安全柜台面用75％酒精擦拭消毒，紫外照射30min。
(16)每隔24h计数细胞密度及活力。
(17)第二代培养两次后得到的细胞存活率大于95％；第三至六代培养三次后得到的细胞存活率大于95％。7周后，细胞接种3天后繁殖三代，密度达到1×106个细胞/ml，同时细胞存活率达到95％，该细胞被认为已经适应悬浮培养。接种密度降低到3×105个/ml。
(18)经驯化，133株、54株都满足要求，这表明133株、54株都驯化成功。
实施例7：CHO/dhfr-细胞株驯化成悬浮培养
将实施例6中的25μM MSX替换为25nM MTX，其他操作一样。
经驯化，251株满足要求，这表明251株驯化成功。
实施例8：细胞摇瓶发酵
(1)传代培养基的配制：60％的CD-CHO+40％的Ex-cell 302置于37℃水浴锅中预热至37℃。
(2)从CO2恒温摇床取出摇瓶细胞，进行计数。
(3)稀释细胞至2.5-3.5×105个细胞/ml接种30ml培养基于一个125ml摇瓶中。细胞培养瓶放置到37℃，5％ CO2恒温摇床中100rpm/min孵育过夜。
(4)每隔24h计数细胞密度及活力，测葡萄糖，当低于2g/L的时候，添加葡萄糖到4g/L；每天取1ml样品，上清用于检测蛋白表达情况。
(5)补料(约第四天)：补充70g/L CB5，添加基础培养基的10％。
(6)第5天开始，将CO2培养箱温度调整至32℃。
(7)第九天，补充70g/L CB5，添加基础培养基的10％。
(8)第十二天，收获细胞上清。
(9)如图5所示，经Werstern-Blot检测，133株表达产量最高，适合大规模生产所需。
实施例9：蛋白纯化
收集实施例8中细胞培养上清，4℃，8,000g离心30min，取上清，过0.8μm滤膜，上样，预留80μl样品加入20μl的5×SDS-样品缓冲液，用于SDS-PAGE检测。
柱平衡：用超纯水平衡2～3CV(column volume柱体积)，排出乙醇保存液；然后用Buffer A(20mM NaH2PO4(pH 7.4)，500mM NaCl)平衡2～3CV，4～7ml/min。
上样：若5ml预装柱一个，1ml/min进行上样(根据预装柱体积调节上样流速，保留时间5min)，收集Flow through(FT)，取80μl样品加入20μl的5×SDS-样品缓冲液，用于SDS-PAGE检测。
洗涤：用4％buffer B(20mM NaH2PO4(pH 7.4)，500mM NaCl，20mM imidazole)洗柱，流速为4ml/min，把未结合上柱的蛋白和结合能力较弱的杂蛋白冲洗干净，至OD280 nm基线平稳为止。
洗脱：50％buffer B(20mM NaH2PO4(pH 7.4)，500mM NaCl，500mM imidazole)洗脱目的蛋白，至基线洗平，2ml/min,收集：10ml/管；收集样品混合后(Elutethrough-ET)取80μl样品加入20μl的5×SDS-样品缓冲液，用于SDS-PAGE检测。见图6所示。
洗涤：100％buffer B(20mM NaH2PO4(pH 7.4)，500mM NaCl，500mM imidazole)，4ml/min，不收集，冲洗2-3个柱体积，至UV基线洗平。超纯水平衡2～3CV。保存HisTrapexcel柱可用20％乙醇保存液平衡2～3CV。
超滤换液：Millipore 30KD的超滤膜包进行超滤换液，采用PBS 10倍稀释后浓缩到原体积的方法进行换液，重复三次，总共稀释1000倍换液。
除菌过滤：在生物安全柜中，过0.22μm低蛋白结合针头滤器，或大量蛋白溶液过灭菌的0.22μm滤膜的Nalgene的滤器，过滤好的蛋白溶液样品存放于-80℃冰箱。
蛋白浓度和纯度测定：采用BCA法测定纯化后蛋白浓度，根据纯化后所得蛋白总体积计算纯化后所得蛋白总量，再根据取用的细胞上清体积计算蛋白得率，经过计算，133株蛋白得率为1g/L，其他均不到500mg/L；采用HPLC方法检测纯度，纯度都能达到95％以上。
实施例10：疫苗制备与免疫攻毒试验
10.1疫苗制备
将适量CHO细胞表达的猪瘟E2蛋白加入到ISA 201VG佐剂中(体积比为46:54)，使蛋白终浓度为30μg/ml，乳化、质检合格后置于4℃保存。
将适量昆虫杆状病毒表达的猪瘟E2蛋白加入到ISA 201VG佐剂中(体积比为46:54)，使蛋白终浓度为140μg/ml，乳化、质检合格后置于4℃保存。
10.2免疫攻毒试验(在金宇保灵生物技术股份有限公司兽用疫苗国家工程实验室进行)
筛选3-4周龄长白猪(猪瘟抗体抗原均阴性、圆环抗原阴性、蓝耳抗原阴性，每组5头)进行试验，每次免疫1ml CHO细胞表达的猪瘟E2蛋白亚单位疫苗(30μg/ml)和昆虫杆状病毒表达的猪瘟E2蛋白亚单位疫苗(140μg/ml)，初免三周后加强免疫一次，免疫后每周取血1次，分离血清，用IDXEE试剂盒测定抗体效价。
二免后3周用猪瘟石门株血毒(购自中国兽医药品监察所)进行攻毒，每头猪肌肉注射猪瘟石门株血毒2ml(1/2支)，连续观察16天。以对照组猪只死亡4/5以上试验成立。
图7结果显示：2组免疫组在二免后阻断率一直在70％左右，但是CHO细胞表达E2蛋白疫苗中E2蛋白含量仅30μg/ml，远远低于杆状病毒表达E2蛋白疫苗中的E2蛋白含量，这说明低剂量的CHO细胞表达E2蛋白免疫后与高剂量的杆状病毒表达E2蛋白免疫后产生的抗体效价相当。
另外，攻毒后，对照组猪只在攻毒后8天内全部死亡，说明攻毒实验成立；CHO细胞表达E2蛋白免疫组在攻毒过程中没有死亡，且5头猪只也没有任何的临床症状(如体温升高、精神沉郁、食欲减退等)，因此综合保护率为100％；杆状病毒表达E2蛋白免疫组在攻毒过程中虽然没有死亡，但是有一头猪只在攻毒过程中体温升高到40.5℃以上，且精神沉郁、食欲明显减退，可判断为攻毒后猪瘟发病症状，因此综合判断保护率为80％。所以，从攻毒保护结果来看，CHO细胞表达E2蛋白免疫组较杆状病毒表达E2蛋白免疫组保护效果要好。
本发明通过上面的实施例进行举例说明，但是应当理解，本发明并不限于这里所描述的特殊实例和实施方案。在这里包含这些特殊实例和实施方案的目的在于帮助本领域中的技术人员实践本发明。任何本领域中的技术人员很容易在不脱离本发明精神和范围的情况下进行进一步的改进和完善，因此本发明只受到本发明权利要求的内容和范围的限制，其意图涵盖所有包括在由附录权利要求所限定的本发明精神和范围内的备选方案和等同方案。

Claims (13)

1.一种重组猪瘟E2亚单位蛋白，其特征在于，所述重组猪瘟E2亚单位蛋白为猪瘟包膜截短的胞外区糖蛋白，且为CHO表达系统修饰的糖基化蛋白，分子量约为55Kd，其氨基酸序列为：
①如SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列；或
②由SEQ ID NO.1经过取代、缺失或添加一个或几个氨基酸得到的具有免疫原性的衍生的氨基酸序列。
2.根据权利要求1所述的重组猪瘟E2亚单位蛋白，其特征在于，在如SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列的氨基末端或羧基末端连接有poly-His、FLAG、c-myc、HA和poly-Arg中的一种标签。
3.根据权利要求2所述的重组猪瘟E2亚单位蛋白，其特征在于，在如SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列的氨基末端或羧基末端连接有poly-His，其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。
4.根据权利要求3所述的重组猪瘟E2亚单位蛋白，其特征在于，所述重组猪瘟E2亚单位蛋白的编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示，或由SEQ ID NO.4经密码子优化后所得的重组猪瘟E2亚单位蛋白。
5.根据权利要求4所述的重组猪瘟E2亚单位蛋白，其特征在于，所述密码子优化后所得的重组猪瘟E2亚单位蛋白的编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。
6.根据权利要求1所述的重组猪瘟E2亚单位蛋白，其特征在于，所述CHO表达系统的细胞株为DG44细胞株、DXB11细胞株、CHO-K1细胞株和CHO-S细胞株的一种。
7.一种如权利要求1-6中任意一项所述的重组猪瘟E2亚单位蛋白的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
1)将密码子优化后的猪瘟E2蛋白编码基因克隆到真核表达载体中得到含有猪瘟E2蛋白编码基因的重组质粒；其中，所述密码子优化后的猪瘟E2蛋白编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示；
2)再将含有猪瘟E2蛋白编码基因的重组质粒转染至CHO细胞中；
3)依次通过培养、加压筛选、单克隆筛选、悬浮培养驯化步骤2)中所述的CHO细胞株得到高度表达的细胞株；
4)发酵培养3)中所述的细胞株，纯化后得到重组猪瘟E2蛋白。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述真核表达载体为pEE6.4、pEE12.4、pGL4.13、pcDNA3.1。
9.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述CHO细胞株为DG44、DXB11、CHO-K1、CHO-S细胞株。
10.一种含有重组猪瘟E2蛋白亚单位疫苗的制备方法，其特征在于将根据权利要求1-6中任意一项所述的重组猪瘟E2亚单位蛋白与药学上可接受的佐剂充分混匀，得到猪瘟E2蛋白重组亚单位疫苗。
11.根据权利要求10所述的方法，其特征在于，所述重组亚单位疫苗所用佐剂为ISA201VG。
12.根据权利要求10所述的制备方法，其特征在于，所述重组猪瘟E2蛋白与佐剂ISA201VG按体积比46:54混合乳化。
13.一种根据权利要求1～6任一所述的重组猪瘟E2亚单位蛋白在制备相关诊断试剂或亚单位疫苗中的应用。
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