PL199190B1

PL199190B1 - Ciałka inkluzyjne jako antygeny do pokarmowej immunizacji zwierząt

Info

Publication number: PL199190B1
Application number: PL358082A
Authority: PL
Inventors: Andrzej Plucienniczak; Malgorzata Kesik; Anna Porebska; Violetta Saczynska; Boguslaw Szewczyk; Jolanta Ficinska
Original assignee: Inst Biotechnologii I Antybiot; Instytut Biotechnologii I Antybiotykow; Univ Gdanski; Uniwersytet Gdanski
Priority date: 2002-12-31
Filing date: 2002-12-31
Publication date: 2008-08-29
Also published as: WO2004058806A2; PL358082A1; AU2003294192A8; EP1603938B1; DE60327896D1; AU2003294192A1; ES2328350T3; ATE432943T1; WO2004058806A3; EP1603938A2

Abstract

Ujawniono m.in. szczepionk e doustn a oraz zastosowanie cia lek inkluzyjnych do wytwarzania szczepionek doustnych przeciwko chorobie wywo lywanej przez pestiwirusa, zw laszcza przeciwko klasycznemu pomorowi swi n. PL PL PL PL

Description

Opis wynalazku

Przedmiotem wynalazku jest szczepionka doustna oraz środki i metody służące do jej wytwarzania. Ogólnie wynalazek dotyczy sposobu wywoływania odpowiedzi immunologicznej, obejmującego podawanie szczepionki przez układ pokarmowy. Przedmioty wynalazku służą do otrzymywania szczepionek doustnych przeciwko chorobie wywoływanej przez pestiwirusa, zwłaszcza przeciwko klasycznemu pomorowi świń.

Klasyczny pomór świń jest wywoływany przez wirusa klasycznego pomoru świń (ang. Classical Swine Fever Virus - CSFV dawniej zwany również hog cholera virus).

Klasyczny pomór świń jest jedną z chorób, powodowanych przez pestiwirusy, należące do rodziny Flaviviridae. Pestiwirusy atakują zwierzęta z rodziny Suidae (świnie) oraz niektóre gatunki przeżuwaczy (krowy, owce, kozy), a także wiele dzikich gatunków zwierząt. Po raz pierwszy klasyczny pomór świń został opisany w 1833 roku w Ohio. Od tego czasu drastycznie zwiększył zasięg występowania na całym świecie, stając się jednym z najbardziej ograniczających czynników ekonomicznych w hodowli świń. W 1997 roku podczas epidemii pomoru świń w Hiszpanii wybito ponad milion zwierząt. Straty sięgnęły wówczas 140 min dolarów. Do dnia dzisiejszego nie stwierdzono tej choroby tylko w 16 krajach na świecie. Światowa organizacja Office International des Epizooties wymienia tę chorobę na liście A - piętnastu najgroźniejszych chorób zwierząt. W zależności od stopnia wirulencji wirusa, choroba może mieć przebieg: ostry, umiarkowany lub łagodny. Podczas ostrego ataku choroby, u zwierzą t obserwuje się : wysoką gorączkę , naprzemiennie zaparcia i biegunkę , leukopenię, (apoptozę leukocytów), wybroczyny skórne, silną immunosupresję. Skutkiem ostrego ataku pomoru świń jest w większości przypadków śmierć zwierzęcia. Łagodna postać może przebiegać bezobjawowo, co więcej choroba ma dość długi - od 2 do 14 dni - okres inkubacji, co dodatkowo utrudnia kontrolowanie epidemii. Najczęstszymi drogami przenoszenia wirusa jest kontakt zwierzęcia chorego ze zdrowym, możliwe jest również przenoszenie fizycznie przez ludzi, ptaki lub owady, przez narzędzia rolnicze, paszę, pojazdy, odzież, itp. Zakażenie następuje przez noso-gardziel. Jak dotąd nie udało się opracować leku na tę chorobę. Po wykryciu obecności patogenu, wszystkie stada w promieniu 25 km od ogniska epidemii muszą być zlikwidowane. O wysokiej odporności wirusa pomoru świń na warunki środowiska świadczy fakt, iż może on przetrwać poza organizmem żywiciela nawet przez miesiąc. Obecnie istnieją trzy rodzaje szczepionki - oparta na atenuowanym żywym szczepie C [Terpstra i wsp. Dtsch Tierarztl Wochenschr 1990; 97 (2): 77-9], na zmodyfikowanym infekcyjnym klonie cDNA [Meyers i wsp. J. Virol., 1996; 70 (3): 1588-95], oraz tzw. „szczepionki markerowe oparte głównie na glikoproteinie E2 [van Rijn i wsp., Vaccine 1999; 17 (5): 433-40].

Glikoproteina E2 wraz z glikoproteinami E0 i E1 buduje otoczkę wirusa pomoru świń. Infekcyjność patogenu najskuteczniej neutralizują przeciwciała skierowane przeciwko epitopom białka E2 (Weiland i wsp. 1992, J. Virol. 66:3677). Biał ko E2 posiada na N-koń cu charakterystyczne epitopy, rozpoznawane przez przeciwciała. Są nimi 4 domeny: A, B, C i D, eksponowane na zewnątrz błony, w której białko jest zakotwiczone C-końcem. (van Rijn i wsp., 1994, J. Virol. 68:3934).

Szczepionki doustne, w przeciwieństwie do parenteralnych, mogą zapewnić nie tylko odporność systemiczną, ale również odporność błon śluzowych, co jest szczególnie ważne w profilaktyce zakażeń pasożytami pokarmowymi. Rosnące zainteresowanie szczepionkami doustnymi wiąże się także z łatwością stosowania, przez co moż liwe staje się ich użycie w szczepieniach na szeroką skalę (Richter L., Kipp B.B., 1999, Curr. Top Microbiol. Immunol., 240,159-176). Podjęto już pierwsze próby opracowania szczepionek doustnych. Opis WO 00/37610 ujawnia wektory służące do otrzymywania polipeptydów immunogennych, takich jak HBsAg, w jadalnych tkankach roślinnych. Uzyskane w ten sposób rośliny transgeniczne wykorzystuje się do otrzymywania szczepionek doustnych.

Nie są one jednak pozbawione wad. Trudność stanowi zapewnienie odpowiednio wysokich i precyzyjnych dawek antygenu szczepionkowego. Poziom syntetyzowanego antygenu jest różny w różnych tkankach i egzemplarzach otrzymywanych roślin transgenicznych.

Opisy US 5 770 214, US 5 811 105 i US 5 804 194 dotyczą stosowania szczepów atenuowanych Salmonella typhi jako szczepionki doustnej.

Opis US6290962 opublikowany 2001.09.18 ujawnia sposób wywoływania odpowiedzi immunologicznej skierowanej przeciwko Helicobacter polegający na podawaniu immunogennej ilości antygenu będącego ureazą z Helicobacter lub jej podjednostką.

Podobne szczepionki doustne zawierające rekombinowane białko ureazy z Helicobacter produkowane w komórkach E. coli są przedmiotem polskich patentów PL 179149 oraz PL 174448.

PL 199 190 B1

Stosunkowo małe doświadczenie w immunizacji doustnej oraz nieprzewidywalne losy antygenu w przewodzie pokarmowym sprawiają, że warunki efektywnej immunizacji tą drogą nie są tak ściśle określone jak w przypadku immunizacji parenteralnej, a ponadto immunizacja doustna niesie za sobą ryzyko wyindukowania tolerancji pokarmowej (McGhee J.R. i wsp., 1999. w: Mucosal Immunology (Ogra P.L., Lamm M.E., Bienenstock J., Mestecky J., Strober W., McGhee J.R., red), str. 485-505, Academic Press).

Opis WO 98/32427 opublikowany 1998.07.30 ujawnia polimer służący do przygotowywania osłonkowanych szczepionek doustnych o spowolnionym tempie uwalniania substancji czynnej.

Niezależnie od drogi podania, forma antygenu w znacznej mierze warunkuje stopień jego immunogenności.

Nabycie odporności w wyniku szczepienia wymaga zastosowania właściwego reżimu immunizacji, który obejmuje m.in. odpowiednie określenie takich parametrów jak wielkość i ilość dawek antygenu oraz odstępy czasu między poszczególnymi szczepieniami. Kwaśne pH soku żołądkowego, enzymy proteolityczne oraz perystaltyka jelit powodują, że w przypadku szczepień doustnych efektywne dawki antygenu są o wiele wyższe niż w szczepieniach parenteralnych. Jednakże podanie zbyt wysokich dawek antygenu przez układ pokarmowy może powodować wspomnianą już tolerancję pokarmową. Nie oznacza to jednak, że użycie niskich dawek antygenu nie może wywołać tolerancji pokarmowej. Dotychczas nie poznano podstawowych mechanizmów rządzących tym zjawiskiem i nie osiągnięto standardowego rozwiązania problemu indukowanej tolerancji. Przypuszcza się, że zjawisko tolerancji jest w pewnym stopniu zależne od wspomnianych wyżej czynników, tj. wielkości dawki, terminarza szczepień oraz rodzaju antygenu (Tacket C.O., Mason H.S., 1999, Microbes and Infection 1, 777-783). Perspektywa uzyskania uniwersalnych adiuwantów, optymalnych składów szczepionek, korzystnych dawek i terminarza szczepień dla szczepionek doustnych w świetle dotychczasowych badań wydaje się być jeszcze bardzo odległa. (Makela P.H., 2000, FEMS Microbiology Rewiews 24, 9-20).

Wydaje się, że warunkiem immunizacji przez błony śluzowe jest wielokrotne podawanie antygenu w wielokrotnie wyższych dawkach niż dawki skuteczne parenteralnie. Bardziej korzystne są antygeny tworzące formy multimeryczne. Nie ma również pewności co do zasadności stosowania adiuwantów. W przypadku roślinnych szczepionek jadalnych wydaje się być to niepożądane, jednak w przypadku pewnych antygenów może być ono konieczne (Richter L., Kipp B.B, 1999, Curr. Top Microbiol. Immunol. 240, 159-176).

Podsumowując, z istoty szczepień doustnych wynika, że opracowanie protokołu efektywnej immunizacji przez układ pokarmowy jest o wiele trudniejsze niż w przypadku szczepień metodami tradycyjnymi. W przypadku każdego preparatu jest to odrębne wyzwanie obarczone dużym ryzykiem niepowodzenia.

Wskaźnikami efektywności immunizacji przez błony śluzowe, w tym przez układ pokarmowy, są m.in.: poziom antygenowo-specyficznych sekrecyjnych przeciwciał klasy IgA (S-IgA) związanych z błonami ś luzowymi, miano przeciwciał klasy IgG i IgA w surowicy, profil przeciwciał klasy IgG oraz profil cytokin. W celu określenia odporności komórkowej stosowane są testy na cytotoksyczność limfocytów.

Genom CSFV stanowi pojedyncza nić o wielkości od 9,5 do 12,5 kpz i dodatniej polarności. Cząsteczka RNA zawiera jedną ramkę odczytu kodującą jedną poliproteinę zbudowaną z około 4 tys. aminokwasów, która ulega ko- i postranslacyjnej obróbce do białek strukturalnych: C, E0, E1, E2 i niestrukturalnych np. wirusowych proteaz. Struktura wirionu nie jest jeszcze szczegółowo poznana. Wiadomo, że wiriony są prawdopodobnie ikozaedralnymi cząsteczkami o średnicy około 50 nm i składają się ze sferycznego nukleokapsydu i otoczki. Nukloeokapsyd zbudowany jest z wielu cząsteczek białka C, natomiast w skład otoczki wchodzą fosfolipidy błonowe i glikoproteiny powierzchniowe E0, E1 i E2. Białka otoczki tworzą homo- (E0 i E2) i heterodimery (E1-E2) za pośrednictwem mostków dwusiarczkowych. Dopiero takie dimery budują otoczkę wirusa (Meyers G., Thiel H. J 1996, van Rijn P. A., van Gennip H. G. P., de Meijer E. J, Moormann R. J. M 1993, Thiel H. J., Stark R., Weiland E., Rumenapf T., Meyers G. 1991). Białka E1 i E2 zawierają domeny transbłonowe, zapewniające ich zakotwiczenie w błonach (van Rijn P. A., van Gennip H. G. P., de Meijer E. J, Moormann R. J. M 1993, van Rijn P. A., Miedema G. K. W, Wensvoort G, van Gennip H. G. P., Moormann R. J. M. 1994). Wszystkie glikoproteiny otoczkowe mają właściwości immunogenne. Sądzi się, że białko E2 jest najsilniejszym antygenem, silniejszym od E0 i E1.

Opis patentowy US6207165 (opublikowany 2001.03.27) ujawnia rozwiązanie dotyczące szczepionki chroniącej świnie przed patologiami związanymi z chorobami układu oddechowego i rozrodczego. W rozwiązaniu tym przedstawiona jest kompozycja immunogenna indukująca odpowiedź immuno4

PL 199 190 B1 logiczną przeciwko CSFV, zawierająca plazmid kodujący przynajmniej jedno z białek E1 bądź E2 i ulegają cy ekspresji w warunkach in vivo w komórkach gospodarza.

Opis patentowy US5965134 (opublikowany 1999.10.12) opisuje immunogenne polipeptydy pestiwirusów, zwłaszcza CSFV, a w szczególności niestrukturalne białko p10 oraz szczepionki i diagnozowanie z zastosowaniem opisanych polipeptydów lub cząsteczek kwasu nukleinowego.

Pomimo opisanych powyżej badań poświęconych dostarczeniu szczepionki przeciwko CSFV, istnieje ciągła potrzeba uzyskania skutecznych narzędzi pozwalających na łatwe uzyskiwanie skutecznych szczepionek uodparniających przed tym wirusem.

W świetle przedstawionego powyżej stanu techniki celem niniejszego wynalazku jest dostarczenie skutecznych i łatwo dostępnych środków, które mogą być stosowane w szczepieniach doustnych przeciw klasycznemu pomorowi świń, pozwalających uzyskać odporność systemiczną, a także odporność błon śluzowych. Środki według wynalazku powinny być łatwe do stosowania i pozbawione innych znanych niedogodności związanych z przygotowywaniem i stosowaniem szczepionek, takich jak stosunkowo wysokie koszty przygotowania preparatu i niebezpieczeństwo przypadkowego zakażenia krwi w trakcie szczepienia. Szczepionki doustne według wynalazku powinny zapewniać skuteczną immunizację przez układ pokarmowy.

Kolejnym celem wynalazku jest dostarczenie środków, które mogłyby być wykorzystane do otrzymywania skutecznej, prostej w stosowaniu i łatwo dostępnej szczepionki przeciwko chorobie wywoływanej przez pestiwirusa, zwłaszcza przeciwko klasycznemu pomorowi świń. Szczególnym celem wynalazku jest dostarczenie białek rekombinowanych, które zawierałyby wybrane antygeny pochodzące z wirusa klasycznego pomoru świń i mogłyby być wykorzystane do szczepień przeciwko temu wirusowi, a także narzędzi pozwalających na ich ekspresję w E. coli. Szczególnym celem wynalazku jest dostarczenie środków pozwalających otrzymać rekombinowane białka, które mogłyby być zastosowane do produkowania jadalnych szczepionek przeciwko chorobie wywoływanej przez pestiwirusa, zwłaszcza przeciwko klasycznemu pomorowi świń.

Nieoczekiwanie, realizacja tak określonego celu i rozwiązanie opisanych w stanie techniki problemów zostały osiągnięte w niniejszym wynalazku.

Przedmiotem wynalazku jest polipeptyd produkowany w genetycznie zmodyfikowanym mikroorganizmie zawierający sekwencję aminokwasową pochodzącą z sekwencji białka E2 pestiwirusa, zwłaszcza wirusa CSFV. Korzystnie ma on postać ciałek inkluzyjnych. Korzystnej realizacji wynalazku polipeptyd według wynalazku zawiera sekwencję aminokwasową białka E2 pestiwirusa, zwłaszcza wirusa CSFV, bez fragmentu transbłonowego. Szczególnie korzystnie polipeptyd według wynalazku zawiera sekwencję kodowaną przez sekwencję przedstawioną na fig. 4 albo fig. 5.

Przedmiotem wynalazku jest także sekwencja kodująca polipeptyd, która zawiera sekwencję nukleotydową kodującą sekwencję aminokwasową pochodzącą z sekwencji białka E2 pestiwirusa, zwłaszcza wirusa CSFV. Korzystnie, sekwencja według wynalazku zawiera sekwencję nukleotydową kodującą sekwencję aminokwasową białka E2 pestiwirusa, zwłaszcza wirusa CSFV, bez fragmentu transbłonowego, a w szczególności jest przedstawiona na fig. 4 albo fig. 5.

Przedmiotem wynalazku jest także konstrukt zawierający sekwencję kodującą polipeptyd, charakteryzujący się tym, że jako sekwencję kodującą polipeptyd według wynalazku, zdefiniowaną powyżej. Korzystnie, konstrukt według wynalazku jest plazmidem powstałym poprzez włączenie sekwencji kodującej polipeptyd do plazmidu pIGDM1, szczególnie korzystnie plazmidu pIGCmT7.

Przedmiotem wynalazku jest także komórka bakteryjna transformowana konstruktem ekspresyjnym zawierającym sekwencję kodującą polipeptyd, charakteryzująca się tym, że konstrukt jako sekwencję kodującą polipeptyd zawiera sekwencję według wynalazku zdefiniowaną powyżej. Korzystnie, komórka bakteryjna według wynalazku zawiera plazmid powstały poprzez włączenie sekwencji kodującej polipeptyd do plazmidu pIGDM1, korzystnie plazmidu pIGCmT7. Korzystnie, komórka bakteryjna według wynalazku jest szczepem E. coli. Specjalista jest w stanie wykorzystać również dowolny inny mikroorganizm dostępny w stanie techniki jako szczep nadający się do ekspresji.

Przedmiotem wynalazku są także ciałka inkluzyjne zawierające zdefiniowany powyżej polipeptyd według wynalazku.

Przedmiotem wynalazku jest także sposób otrzymywania szczepionki doustnej przeciwko chorobie wywoływanej przez pestiwirusa, zwłaszcza przeciwko klasycznemu pomorowi świń, charakteryzujący się tym, że obejmuje transformację komórek E. coli wektorem ekspresyjnym, ekspresję polipeptydu kodowanego przez ten wektor, izolowanie ciałek inkluzyjnych zawierających produkowany poliPL 199 190 B1 peptyd służących do przygotowania szczepionki, przy czym wektor zawiera kodującą polipeptyd sekwencję nukleotydową według wynalazku zdefiniowaną powyżej.

Przedmiotem wynalazku jest także zastosowanie polipeptydu według wynalazku zdefiniowanego powyżej, do otrzymywania szczepionki przeciwko chorobie wywoływanej przez pestiwirusa, zwłaszcza przeciwko klasycznemu pomorowi świń.

Przedmiotem wynalazku jest także szczepionka doustna przeciwko chorobie wywoływanej przez pestiwirusa, zwłaszcza przeciwko klasycznemu pomorowi świń zawierająca antygen i ewentualnie farmaceutycznie dopuszczalny nośnik i/lub adiuwant, charakteryzująca się tym, że jako antygen zawiera zdefiniowany powyżej polipeptyd według wynalazku, zwłaszcza w postaci ciałek inkluzyjnych.

Przedmiotem wynalazku jest także zastosowanie ciałek inkluzyjnych według wynalazku do wytwarzania szczepionki doustnej przeciwko chorobie wywoływanej przez pestiwirusa, zwłaszcza przeciwko klasycznemu pomorowi świń.

Szczepionkami są odpowiednie białka, których ekspresję uzyskano w komórkach bakterii E. coli szczep BL21(DE3) transformowanych plazmidem ekspresyjnym pIGCmT7 zawierającym daną wstawkę. Białka te izolowano z komórek bakterii E. coli w postaci ciałek inkluzyjnych.

Zaprezentowany wynalazek posiada liczne zalety wyróżniające go na tle znanych ze stanu techniki rozwiązań. Uzyskano wysoce skuteczny sposób indukowania produkcji przeciwciał w błonach śluzowych. Ze względu na fakt, że do zakażenia wirusem CSFV dochodzi przez błony śluzowe, zasadnym miejscem podania opracowanej szczepionki jest droga pokarmowa, ponieważ tylko taka szczepionka indukuje szczególnie skuteczną reakcję immunologiczną w naturalnym miejscu wnikania wirusa. Otrzymana szczepionka jest łatwa do stosowania i pozbawiona innych znanych niedogodności związanych z przygotowywaniem i stosowaniem klasycznych szczepionek, takich jak stosunkowo wysokie koszty uzyskania preparatu i niebezpieczeństwo przypadkowego zakażenia krwi w trakcie szczepienia.

Ekspresja antygenu przebiega w komórkach bakteryjnych. Prosta budowa wybranego gospodarza oraz możliwość kontroli procesu ekspresji antygenu szczepionkowego izolowanego i stosowanego w postaci ciałek inkluzyjnych gwarantuje homogenność otrzymywanych preparatów, a przez to precyzyjne dawkowanie. Załączone figury pozwalają na lepsze wyjaśnienie istoty wynalazku.

Figura 1 przedstawia mapę plazmidu pIGCmT7, przy czym ARG t-RNA - gen argininowy tRNA dla kodonów AGA i AGG, ORI - origin replikacji plazmidu pPIGDM1, Cm-R - gen oporności na chloramfenikol, T7 - promotor, stop - terminacja transkrypcji.

Figura 2 przedstawia elektroforogram wyizolowanego białka E2 wirusa CSFV bez fragmentu transbłonowego w postaci ciałek inkluzyjnych. Ścieżki: 1) Wzorzec mas białkowych LMW 14,4 kDa, 20,1 kDa, 30,0 kDa, 43,0 kDa, 67,0 kDa, 97,0 kDa, 2) wyizolowane białko E2 wirusa CSFV bez fragmentu transbłonowego w postaci ciałek inkluzyjnych.

Figura 3 przedstawia preparat białka podawanego myszom. Ścieżki: 1) Wzorzec mas białkowych LMW 14,4 kDa, 20,1 kDa, 30,0 kDa, 43,0 kDa, 67,0 kDa, 97,0 kDa; 2) i 3) oczyszczone białko E2 wirusa CSFV bez fragmentu transbłonowego; 4)-7) próbki albuminy o masach odpowiednio 1 μg, 2 μg, 4 μg, 6 μg czystego białka; 8) wyizolowane białko E2 wirusa CSFV bez fragmentu transbłonowego w postaci ciałek inkluzyjnych.

Na figurze 4 przedstawiona została sekwencja BresciaE2_Bez_Mem_N kodująca białko E2 wirusa CSFV bez fragmentu transbłonowego. Fragment włączono do wektora pBluescript SK(-) w miejsca powstałe po trawieniu nukleazą restrykcyjną BamHl i Hindlll.

Na figurze 5 przedstawiona została sekwencja BresciaE2_Bez_Mem_N kodująca białko E2 wirusa CSFV bez fragmentu transbłonowego. Fragment włączono do wektora pIGCmT7 w miejsca powstałe po trawieniu nukleazą restrykcyjną Ndel i Hindlll.

Figura 6 prezentuje wyniki badań immunogenności antygenu E2 CSFV z transformowanego szczepu E. coli. Myszy (BALB/c) szczepiono podskórnie i domięśniowo 2 razy. Dawkę wzmacniającą zastosowano dożylnie. Każdorazowo podawano ~20 μg antygenu E2 z pełnym adiuwantem Freunda.

Figura 7 przedstawia wyniki testu na obecność przeciwciał klasy IgG w osoczu myszy karmionych ciałkami inkluzyjnymi zawierającymi ~10 μg antygenu E2 CSFV. Antygen podano w dniu 0 i 26 eksperymentu.

Figura 8 przedstawia wyniki testu na obecność przeciwciał klasy IgA w odchodach myszy karmionych ciałkami inkluzyjnymi zawierającymi ~10 μg antygenu E2 CSFV.

PL 199 190 B1

Figura 9 prezentuje wyniki testu na obecność przeciwciał klasy IgG w osoczu myszy karmionych ciałkami inkluzyjnymi zawierającymi ~50 μg antygenu E2 CSFV. Antygen podano w dniach 0 i 26 eksperymentu.

Figura 10 prezentuje wyniki testu na obecność przeciwciał klasy IgA w odchodach myszy karmionych ciałkami inkluzyjnymi zawierającymi ~50 μg antygenu E2 CSFV.

Poniżej zaprezentowano przykładowe realizacje zdefiniowanego powyżej wynalazku.

P r z y k ł a d 1. Otrzymywanie szczepu E. coli z ekspresją antygenów szczepionkowych

Plazmidy

Bakteryjny plazmid ekspresyjny pIGCmT7: Plazmid pIGCmT7 (4056 pz.) (fig. 1) powstał w pracowni prof. Andrzeja Płucienniczaka w Instytucie Biotechnologii i Antybiotyków w Warszawie w oparciu o plazmid pIGDM1 (Mikiewicz D. i wsp., Plasmid 1997), który jest plazmidem z grupy ColE1 Enterobacter agglomerans. Plazmid pIGCmT7 powstał przez dostawienie genu oporności na chloramfenikol, polilinkera wraz z promotorem RNA polimerazy z faga T7 oraz sekwencją kodującą kodon stop transkrypcji pochodzącą z faga T7.

Nieekspresyjne plazmidy bakteryjne: Do klonowania fragmentów DNA po powieleniu PCR używano plazmidu pBluescript SK(-) zakupionego od Stratagene (sekwencja dostępna w Banku Genów pod numerem X52324 S52394). Plazmid ten posiada: origin replikacji ColE1, promotory (dla RNA polimeraz fagowych) T3 i T7 flankujące polilinker oraz gen oporności na ampicylinę.

Wyjściowe Sekwencje wstawek

Sekwencja antygenu E2 wirusa pomoru świń szczepu Brescia

Sekwencję nukleotydową kodującą antygen E2 wirusa pomoru świń szczepu Brescia długości 1504 pz wklonowaną w miejsca Pstl, Kpnl w plazmidzie pEVhis13HCVE1 otrzymano od prof. Szewczyka z Uniwersytetu Gdańskiego. Sekwencja ta jest dostępna w Banku Genów pod numerem

M31768.

Schematy otrzymywania wstawek w wektorach.

Współrzędne podane w opisach otrzymywania fragmentów w włączanych w wektory, odnoszą się odpowiednio do współrzędnych w sekwencji antygenu E2 zdeponowanej w amerykańskim banku genów.

Schemat otrzymywania fragmentu BresciaE2_Bez_Mem_N włączonego do wektora ekspresyjnego pIGCmT7.

Z plazmidu zawierającego pełną sekwencję nukleotydową antygenu E2 wirusa CSFV powielono w reakcji PCR z użyciem primerów BRESAMA i UBIBREK2 fragment o długości 1023 pz od pozycji 2428 do 3450. Primery BRESAMA i UBIBREK2 zaprojektowano na podstawie sekwencji genu kodującego białko E2 wirusa CSFV bez fragmentu transbłonowego. Primer wiodący BRESAMA wprowadza na końcu 5' cząsteczki DNA zmiany w sekwencji nukleotydowej, zmieniając guaninę w pozycji 2430 na tyminę. Wprowadzona zmiana w sekwencji nukleotydowej nie powoduje zmian w sekwencji aminokwasowej. Dodatkowo primer BRESAMA wydłuża koniec 5' cząsteczki DNA, wprowadzając kodon alaniny GCA oraz miejsca rozpoznawane przez nukleazy restrykcyjne Ndel i BamHl. Primer UBIBREK2 wydłuża koniec 3' cząsteczki DNA, wprowadzając kodon terminacyjny TAA oraz miejsca rozpoznawane przez nukleazy restrykcyjne HindlII i Xhol. Mieszaninę po reakcji PCR rozdzielono elektroforetycznie w żelu poliakryloamidowym. Powielony fragment DNA o długości 1058 pz wyeluowano z żelu poliakryloamidowego, a następnie trawiono nukleazami restrykcyjnymi BamHI i Hindlll, i odbiałczono. Otrzymany fragment ligowano z wektorem pBluescript SK(-) trawionym tymi samymi enzymami restrykcyjnymi i odbiałczonym po trawieniu. Produktem ligacji transformowano komórki E. coli szczep DH5a. Po izolacji DNA plazmidowego z transformowanych komórek E. coli potwierdzono w wyniku analizy restrykcyjnej obecność wstawki BresciaE2_Bez_Mem_N. Poprawność sekwencji fragmentu BresciaE2_Bez_Mem_N włączonego do wektora pBluescript SK(-) zweryfikowano przez sekwencjonowanie.

Z wektora pBluescript SK(-), zawierającego wklonowaną wstawkę wytrawiono fragment enzymami restrykcyjnymi Ndel i Hindlll. Mieszaninę po trawieniu rozdzielono elektroforetycznie w żelu poliakryloamidowym, z którego wycięto a następnie wyeluowano fragment odpowiadający wstawce BresciaE2_Bez_Mem_N trawionej enzymami restrykcyjnymi Ndel i HindIII. Otrzymany fragment DNA ligowano z wektorem ekspresyjnym pIGCmT7 trawionym enzymami restrykcyjnymi Ndel i Hindlll i odbiałczonym po trawieniu. Produktem ligacji transformowano komórki E. coli szczep DH5a. Po izolacji DNA plazmidowego z transformowanych komórek E. coli potwierdzono obecność wstawki BrePL 199 190 B1 sciaE2_Bez_Mem_N w wyniku analizy restrykcyjnej. Poprawność sekwencji fragmentu BresciaE2_Bez_Mem_N włączonego do wektora pIGCmT7 zweryfikowano przez sekwencjonowanie.

Plazmidem zawierającym sprawdzoną wstawkę transformowano komórki E. coli szczep BL21(DE3).

Transformacja komórek E. coli

Wykorzystywana była metoda transformacji kompetentnych komórek bakteryjnych E. coli opisana przez J. Sambrook i wsp.

Preparatyka ciałek inkluzyjnych i antygenów szczepionkowych

Ekspresja i izolacja ciałek inkluzyjnych

Bakterie E. coli szczep BL21(DE3) niosące odpowiedni zrekombinowny plazmid hodowano na pożywce LB zawierającej chloramfenikol (20 μg/ml) w 37°C przez 3 godziny, po czym rozcieńczono świeżym podłożem LB (1:100) i po trzech godzinach wytrząsania w 37°C indukowano ekspresję przez dodanie isopropyl-thio-e-D-galactoside (IPTG, do końcowego stężenie 0,1 μg/ml). Po 3 godzinach bakterie żwirowano. Osad komórek zawieszono w buforze do lizy (0,5 M NaCl, 0,05 M Tris HCl, pH 7,5, 0,01 M EDTA, 0,005 M 2-Mercaptoethanol, lizozym, 0,35 mg/ml) i inkubowano 30 minut w 20°C. Dodano Triton X-100 do uzyskania stężenia 1%. Zawiesinę sonifikowano i żwirowano. Osad ciałek inkluzyjnych dwukrotnie zawieszano w buforze PBS zawierającym 1% Triton X-100, sonifikowano i wirowano. Wyizolowane ciałka inkluzyjne dwukrotnie przemywano buforem PBS. Końcowo ciałka inkluzyjne zawieszono w buforze PBS.

Analiza oczyszczonych ciałek inkluzyjnych

Obecność czystej frakcji ciałek inkluzyjnych potwierdzono poddając próby rozdziałowi elektroforetycznemu w 15% żelu poliakryloamidowym (SDS-PAGE). Białka wizualizowano barwnikiem Coomassie blue.

Obrazy rozdziałów elektroforetycznych prób izolowanych ciałek inkluzyjnych przedstawiono na figurze 2.

Spektrofotometryczne oznaczanie stężenia białek

Stężenie białek oznaczano mierząc pochłanianie światła (absorbancję) przy długości fali λ 595 nm z użyciem odczynnika Bradforda.

Startery i oligonukleotydy reakcji PCR

Startery zastosowane do powielenia użytych fragmentów DNA zostały zamówione i wykonane w firmie Perkin Elmer.

Nazwa: BRESAMA

5' -GAG GGG ATC CAT ATG GCA CGT CTA GCC TGC AAG GAA GATNazwa: UBIBREK2

5' -AAA AGC TTC TCG AGT TAT TCT GCG AAG TAA TCT GAG TGAparatura i inne materiały:

Enzymy użyte do klonowań: Taq DNA polimeraza i bufor (Roche, zestaw Expand Long Template PCR System, Cat. No. 1 681 834; Ligaza DNA faga T4 i bufor (USB); T4 polinukleotydowa kinaza i bufor (USB)

Użyto komercyjnie dostępne nukleazy restrykcyjne.

PCR: Maszyna do PCR PTC-100™ Programmable Thermal Controller MJ Research, Inc. Sekwencjonowanie: maszyna do sekwencjonowania Visible Genetics, Inc.; zestaw do sekwencjonowania firmy Amersham Cat. No. US79840 (zgodnie z zaleceniami producenta); zestaw do oczyszczania DNA plazmidowego firmy Kucharczyk Techniki Elektroforetyczne.

Pomiar stężenia białka: spektrofotometr Philips PU 8730.

Dokumentacja: zestaw do dokumentacji żeli Sony Digital Graphics Printer UP 0890 oraz oprogramowanie Grab it.

Szczepy bakteryjne: szczepy E. coli użyte w pracy:

NM522 supE thiΔ (lac-proAB) hsd5 F'[proAB⁺ lac^q lacZA M15]

DH5a supE44 AlacU169 ((φ80 lacZAM15) hsdR17 recA1endA1 gyrA96 thi-1 relAI

BL21(DE3) hsdSgal (/.clts857 ind1 Sam7 nin5 lacUV5-T7 gene 1)

BZ37 dam^-dcm^-

Sekwencje wstawek włączonych do wektorów zostały zaprezentowane na figurach 4 i 5.

W sekwencjach podkreślono miejsca rozpoznawane przez enzymy restrykcyjne, po trawieniu którymi włączono daną wstawkę do wektora. Kodon startu i terminacji oznaczono pogrubioną czcionką.

PL 199 190 B1

P r z y k ł a d 2. Immunogenność antygenu E2 CSFV z transformowanego szczepu Escherichia coli

Oczyszczanie antygenu E2

Ciałka inkluzyjne zawierające antygen E2 wyizolowano z transformowanego szczepu Escherichia coli zgodnie z procedurą opisaną w przykładzie 1.

Wyizolowane ciałka inkluzyjne rozdzielono w 15% żelu poliakryloamidowym z dodatkiem SDS (SDS-PAGE). Wykonano 24 godzinny transfer białek z żelu na błonę PVDF (Immobilon TM-P firmy MILLIPORE), a następnie wycięto fragment błony PVDF ze związanym białkiem E2 wirusa CSFV bez fragmentu transbłonowego. Białko eluowano z błony w buforze do elucji (1% Triton X-100, 1% SDS w 50 mM Tris-HCl, pH 9,5), do którego dodano następnie 4 objętości acetonu na 1 objętość buforu elucyjnego. Całość pozostawiono w -20°C. Po 12 h preparat odwirowano, a powstały osad osuszono. W końcowym etapie białko zawieszono w roztworze soli fizjologicznej.

Czystość oraz stężenie preparatu białka podawanego iniekcyjnie myszom sprawdzano poddając próby rozdziałowi w żelu poliakryloamidowym w odniesieniu do roztworu albuminy o znanym stężeniu (fig. 3 ścieżki 2-7).

Immunizacja myszy

Badania przeprowadzono na 10-tygodniowych samicach szczepu wsobnego BALB/c (Zakład Genetyki i Hodowli Zwierząt, Centrum Onkologii, Warszawa). Trzy myszy szczepiono podskórnie i domięśniowo ~20 μg antygenu E2 z pełnym adiuwantem Freunda 2-krotnie, w odstępie 2 tygodni. Miesiąc po drugim szczepieniu, podano dożylnie dawkę wzmacniającą (~20 μg antygenu E2 + pełny adiuwant Freunda).

Analiza krwi na obecność antygenowo-specyficznych przeciwciał

Krew pobierano z żyły ogonowej 7 i 9 dni po podaniu dawki wzmacniającej, stosując heparynę (Sigma) jako antykoagulant. Osocza, uzyskane przez odwirowanie krwi, zamrażano w porcjach, w temp. -20°C.

Badanie osocza na obecność przeciwciał przeciwko antygenowi E2 przeprowadzono metodą ELISA. Do opłaszczania płytek stosowano antygen E2 szczepu Brescia CSFV pozbawiony fragmentu transbłonowego (TM-), uzyskiwany w systemie bakulowirusowym (Zakład Wirusologii Molekularnej, Uniwersytet Gdański). Płytki MaxiSorp (Nunc) opłaszczano antygenem w stężeniu 3 μg/ml. Osocza myszy immunizowanych testowano w rozcieńczeniu 1:10. Kontrolę negatywną stanowiły osocza myszy nie poddawanych immunizacji rozcieńczone 1:10. Kontrolę pozytywną stanowiły nadsącza hodowli hybrydom produkujących przeciwciała monoklonalne (Mab) przeciwko E2 (Zakład Bioinżynierii, Instytut Biotechnologii i Antybiotyków w Warszawie). Mab przeciwko antygenowi E2 uzyskano z użyciem produktu bakulowirusowego (Zakład Wirusologii Molekularnej, Uniwersytet Gdański).

Płytkę wywoływano przy użyciu przeciwciał przeciwko mysim IgG - specyficznych wobec łańcucha γ - znakowanych HRP (Sigma), rozcieńczonych 1:1000. TMB (Sigma) stosowano jako substrat peroksydazy chrzanowej. Reakcję hamowano 0,5 M roztworem H2SO4. Absorpcję prób odczytywano przy długości fali 450 nm.

Wyniki:

Antygen E2 CSFV wyizolowany z transformowanego szczepu E. coli podany parenteralnie wywołał u wszystkich szczepionych myszy odpowiedź odpornościową manifestującą się obecnością antygenowo-specyficznych przeciwciał klasy IgG w osoczu krwi (fig. 6). Wyniki uzyskane z zastosowaniem standardowej procedury szczepienia wskazują na to, że:

- antygen E2 produkowany metodą nadekspresji w E. coli, pozbawiony fragmentu transbłonowego jest aktywnym immunogenem, podobnie jak rozpuszczalny (TM-) antygen E2 produkowany w systemie bakulowirusowym (Ficińska J. i wsp. 1999),

- glikozylacja białka nie jest warunkiem koniecznym dla jego immunogenności (rekombinowane białka produkowane w systemach bakteryjnych nie są glikozylowane). Przeciwciała obecne w osoczu myszy immunizowanych parenteralnie antygenem E2 wyizolowanym z transformowanego szczepu E. coli reagują w teście ELISA z produktem bakulowirusowym, podobnie jak przeciwciała monoklonalne wyprodukowane przy użyciu produktu bakulowirusowego (fig. 6). Wykazana reaktywność przeciwciał sugeruje ich aktywność wobec natywnego antygenu E2 CSFV.

Przeprowadzony eksperyment udowodnił, że rekombinowany antygen E2 produkowany metodą nadekspresji w E. coli jest wartościowym immunogenem i może znaleźć zastosowanie jako antygen szczepionkowy.

PL 199 190 B1

P r z y k ł a d 3. Efektywność immunizacji doustnej przy uż yciu ~10 μ g antygenu E2 CSFV zawartego w ciałkach inkluzyjnych

Otrzymywanie ciałek inkluzyjnych

Ciałka inkluzyjne zawierające antygen E2 izolowano z transformowanego szczepu E. coli zgodnie z procedurą opisaną w przykładzie 1.

Immunizacja myszy

Grupę myszy (3 sztuki) - 10-tygodniowe samice szczepu wsobnego BALB/c (Zakład Genetyki i Hodowli Zwierzą t, Centrum Onkologii, Warszawa) - immunizowano przez podanie z pokarmem zawiesiny ciałek inkluzyjnych zawierającej 20 μο białka, z czego ~10 μg stanowił antygen E2. Zastosowano 2 dawki antygenu w odstępie 26 dni. Grupę kontrolną stanowiły 3 myszy nie poddawane immunizacji.

Wykrywanie antygenowo-specyficznych przeciwciał

Materiał do badań stanowiła krew oraz odchody pobierane równolegle w grupie myszy immunizowanych i kontrolnych. Krew pobierano z żyły ogonowej 2 dni przed immunizacją, 14 dni po pierwszym oraz 10, 20 i 30 dni po drugim karmieniu ciałkami inkluzyjnymi. Osocze otrzymywano przez odwirowanie części morfotycznych krwi z użyciem heparyny (Sigma) jako antykoagulantu. Do czasu analizy, próby przechowywano w porcjach, w temp. -20°C.

Odchody zbierano co 3-6 dni w ciągu 1 miesiąca po podaniu drugiej dawki antygenu. Do zawieszania odchodów stosowano bufor zawierający inhibitory proteaz (AEBSF, aprotynina, leupeptyna, bestatyna). Ilość użytego buforu była proporcjonalna do ilości zebranego kału. Po odwirowaniu prób, zbierano supernatant i zamrażano w porcjach, w temp. -20°C.

Próby osocza i kału badano na obecność przeciwciał przeciwko E2 metodą ELISA, stosując do opłaszczania płytek antygen E2 szczepu Brescia CSFV bez fragmentu transbłonowego uzyskiwany w systemie bakulowirusowym (Zakład Wirusologii Molekularnej, Uniwersytet Gdański). Osocza myszy immunizowanych i kontrolnych, rozcieńczone 1:10, testowano na płytkach MaxiSorp (Nunc) opłaszczonych antygenem w stężeniu 3 μg/ml. Kontrolę pozytywną stanowiło osocze myszy immunizowanej parenteralnie przy użyciu antygenu E2 wyizolowanego z ciałek inkluzyjnych (przykład 2) o najniższym poziomie przeciwciał (mysz 1, fig. 6). Do wykrywania przeciwciał związanych z antygenem, stosowano przeciwciała przeciwko mysim przeciwciałom klasy IgG - specyficzne wobec łańcucha γ - znakowane HRP (Sigma), rozcieńczone 1:500. Preparaty uzyskane z kału myszy immunizowanych i kontrolnych testowano w rozcieńczeniu 1:1 na płytkach opłaszczonych antygenem E2 w stężeniu 5 μg/ml. Płytkę wywoływano przy użyciu przeciwciał przeciwko mysim przeciwciałom klasy IgA (specyficzne wobec łańcucha α) sprzężonych z HRP (Sigma). Wtórne przeciwciała rozcieńczano 1:500. W obu testach ELISA stosowano TMB jako substrat peroksydazy, reakcję hamowano przy użyciu 0,5 roztworu H2SO4 a absorpcję prób odczytywano przy λ=450 nm.

Wyniki

Osocza myszy immunizowanych, uzyskane z krwi pobranej 14 dni po pierwszym oraz 10, 20 i 30 dni po drugim podaniu ~10 μg antygenu E2 zawartego w ciałkach inkluzyjnych drogą pokarmową, nie wykazują specyficznej reakcji wobec antygenu w teście ELISA na obecność antygenowo-specyficznych przeciwciał klasy IgG (fig. 7). W odchodach myszy karmionych ciałkami inkluzyjnymi również nie stwierdzono obecności przeciwciał, w tym wypadku klasy IgA, przeciw antygenowi E2 (fig. 8). Tak więc, w przeprowadzonym eksperymencie nie ujawniono odpowiedzi systemicznego układu odpornościowego na podany antygen ani też odpowiedzi układu odpornościowego związanego z błonami śluzowymi.

Warunkiem efektywnej immunizacji drogą pokarmową nie są tak ściśle określone jak w przypadku immunizacji parenteralnej, gdzie użycie standardowej procedury pozwala na wywołanie odpowiedzi układu odpornościowego, tak jak w eksperymencie opisanym w przykładzie 2. Zarówno do immunizacji parenteralnej jak i doustnej użyto antygen pochodzący z transformowanego szczepu E. coli. Zatem, przyczyną niepowodzenia nie był brak zdolności rekombinowanego antygenu E2 do wywołania odpowiedzi, ale zastosowanie nieskutecznego reżimu immunizacji.

P r z y k ł a d 4. Efektywność immunizacji doustnej przy użyciu -50 μg antygenu E2 CSFV zawartego w ciałkach inkluzyjnych

Otrzymywanie ciałek inkluzyjnych

Ciałka inkluzyjne zawierające antygen E2 izolowano z transformowanego szczepu E. coli identycznie jak w przykładzie 3 i zgodnie z opisaną procedurą izolacji.

PL 199 190 B1

Immunizacja myszy

Badania przeprowadzono na 10-tygodniowych samicach szczepu wsobnego BALB/c (Zakład Genetyki i Hodowli Zwierząt, Centrum Onkologii, Warszawa). Trzy myszy immunizowano 2-krotnie w odstępie 26 dni, podając każdorazowo wraz z pokarmem zawiesinę ciałek inkluzyjnych zawierających 100 μg białka, z czego ~50 μg stanowił antygen E2. Trzy myszy nie poddawane immunizacji stanowiły grupę kontrolną.

Wykrywanie antygenowo-specyficznych przeciwciał

Krew pobierano 2 dni przed immunizacją, 14 dni po pierwszym oraz 10, 20 i 30 dni po drugim karmieniu ciałkami inkluzyjnymi zawierającymi antygen E2. Odchody zbierano w ciągu 1 miesiąca po podaniu drugiej dawki antygenu, w odstępach 3-6 dniowych. Próby przygotowywano do badań i testowano na obecność antygenowo specyficznych przeciwciał zgodnie z protokołem opisanym w przykładzie 3. Statystyczną analizę danych przeprowadzono z zastosowaniem U-testu Manna-Whitneya.

W osoczach myszy, karmionych ciałkami inkluzyjnymi zawierającymi ~50 μg antygenu E2 CSFV, nie wykryto antygenowo-specyficznych przeciwciał klasy IgG (fig. 9). Reaktywność prób osocza z krwi pobranej 14 dni po pierwszym, jak również 10, 20 i 30 dni po drugim podaniu antygenu nie różniła się od reaktywności prób pobranych 2 dni przed immunizacją i od tej, jaką wykazywały osocza myszy kontrolnych.

Reaktywność preparatów uzyskanych z odchodów myszy immunizowanych, które zbierano od 6 do 20 dnia po podaniu drugiej dawki antygenu, była znamiennie (p < 0,001) wyższa niż ekstraktów z odchodów myszy kontrolnych (fig. 10). Podobnie, statystyczna analiza danych zastosowana do wyników uzyskanych dla każdej z immunizowanych myszy wykazała znamiennie zwiększoną reaktywność preparatów z kału myszy 1, 2, 3 (fig. 10) poddawanych immunizacji w stosunku do prób pobranych od trzech kontrolnych myszy (mysz 1, p = 0,025; mysz 2, p < 0,01; mysz 3, p = 0,001). Maksymalna reaktywność prób, obserwowana w próbach z kału pobranego 6 dni po podaniu II dawki była w przypadku poszczególnych myszy 1,8, 2,2 i 3,7 razy wyższa niż średnia reaktywność obserwowana w grupie kontrolnej. Zatem test ELISA wykazał obecność przeciwciał klasy IgA przeciwko antygenowi E2 CSFV w odchodach wszystkich immunizowanych zwierząt. Możliwość wykrycia tych przeciwciał z zastosowaniem płytek opłaszczonych antygenem E2 produkowanym w systemie bakulowirusowym sugeruje reaktywność wyprodukowanych przeciwciał z natywnym antygenem CSFV.

Uzyskane wyniki dowodzą, że w przewodzie pokarmowym każdej z immunizowanych myszy produkowane były przeciwciała klasy IgA, wykrywane później w odchodach. Produkcja tych przeciwciał miała charakterystyczny przebieg, podobny u wszystkich immunizowanych zwierząt (fig. 10). Pierwsze wyprodukowane przeciwciała pojawiły się w odchodach immunizowanych zwierząt między 3 a 6 dniem po podaniu II dawki antygenu. Po osiągnięciu maksimum, poziom przeciwciał w odchodach obniżał się tak, że 30 dni po immunizacji przeciwciała nie były już wykrywane testem ELISA.

Wyniki eksperymentu wskazują, że podanie dwóch 50 μg -owych dawek antygenu w ciałkach inkluzyjnych wywołuje odpowiedź układu odpornościowego związanego z błonami śluzowymi przewodu pokarmowego, manifestującą się produkcją wydzielniczych IgA (S-IgA). Brak wykrywalnych ilości przeciwciał klasy IgG w osoczu myszy nie jest jednoznaczny z brakiem stymulacji systemicznego układu odpornościowego przez antygen podany doustnie. Jak wynika z badań z zastosowaniem immunizacji parenteralnej, w wielu wypadkach zachodzi efektywne uczulanie tego układu, choć nie udaje się wykazać produkcji przeciwciał (Harlow E., Lane D. 1988). W odróżnieniu od przeciwciał krążących w systemicznym układzie odpornościowym, zasadniczą rolę w odporności na choroby przenoszone przez błony śluzowe, do których należy pomór świń, odgrywają przeciwciała produkowane przez komórki plazmatyczne związane z błonami śluzowymi. Wykazały to m.in. eksperymenty z doustną immunizacją antygenami Helicobacter pylori (opis wynalazku WO 95/22987, opublikowany 31.08.95), a także innymi antygenami bakteryjnymi (McGhee J.R., Kyono, H. 1993). Tak więc, w przeprowadzonym eksperymencie został osiągnięty główny cel immunizacji doustnej, nieosiągalny przez immunizację parenteralną, tj. stymulacja układu odpornościowego związanego z błonami śluzowymi, która może prowadzić do zapewnienia ochrony błon śluzowych przed zakażeniem. Mimo braku stwierdzonej odpowiedzi układu systemicznego, uzyskany efekt immunizacji antygenem E2 zawartym w ciałkach inkluzyjnych wydaje się być korzystniejszy niż np. w badaniach nad jadalną szczepionką przeciwko NV (ang. Norwalk virus). - wirusowi powodującemu u ludzi ostre zapalenie żołądka i jelit (Mason H. S. i wsp. 1996). Z jedenastu myszy, które zareagowały produkcją przeciwciał, wykrywanych we krwi, po podaniu bulw ziemniaka z ekspresją białka kapsydu NV (NVCP) tylko jedna mysz produkowała wykrywalne ilości jelitowych IgA.

PL 199 190 B1

Uzyskane wyniki wskazują, że zastosowanie ciałek inkluzyjnych do immunizacji zwierząt przez układ pokarmowy nie wymaga użycia specjalnie wytworzonych nośników zwiększających pobieranie antygenu przez komórki nabłonka i/lub ochraniających antygen przed degradacją w przewodzie pokarmowym, ani też adiuwantów (czynniki często stosowane w eksperymentach nad immunizacją doustną), aby wywołać odpowiedź śluzówkowego układu odpornościowego. To wszystko czyni atrakcyjną koncepcję użycia ciałek inkluzyjnych zawierających antygen E2 jako jadalnej szczepionki weterynaryjnej przeciwko pomorowi świń.

Literatura

Ficińska J., Szymański P., Szewczyk B., Bieńkowska-Szewczyk K. Expression of CSFV E2 glycoprotein gene in baculovirus system. 1999. Medycyna weterynaryjna 55, 677-680 Harlow E., Lane D. 1988. Immunizations [w]: Antibodies. A laboratory manual. Cold Spring Harbor Laboratory, 53-138

Mason H. S., Ball J.M., Shi J.-J., Jiang X., Estes M.K., Arntzen C.J 1996. Expression of Norwalk virus capsid protein in transgenic tobacco and potato and its oral immunogenicity in mice. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93, 5335-5340.

McGhee J.R., Kyono, H. 1993. New perspectives in Vaccine Development: Mucosal immunity to infectios. Infect Agents Dis. 2, 55-73.

Claims

1. Polipeptyd produkowany w genetycznie zmodyfikowanym mikroorganizmie zawierający sekwencję aminokwasową pochodzącą z sekwencji białka E2 pestiwirusa, zwłaszcza wirusa CSFV.

2. Polipeptyd według zastrz. 1, znamienny tym, że jest w postaci ciałek inkluzyjnych.

3. Polipeptyd według zastrz. 1, znamienny tym, że zawiera sekwencję aminokwasową białka

E2 pestiwirusa, zwłaszcza wirusa CSFV, z którego usunięto fragment transbłonowy.

4. Polipeptyd według zastrz. 1, znamienny tym, że zawiera sekwencję kodowaną przez sekwencję przedstawioną na fig. 4 albo fig. 5.

5. Sekwencja kodują ca polipeptyd, znamienna tym, ż e zawiera sekwencję nukleotydową kodującą sekwencję aminokwasową pochodzącą z sekwencji białka E2 pestiwirusa, zwłaszcza wirusa CSFV.

6. Sekwencja według zastrz. 6, znamienna tym, że zawiera sekwencję nukleotydową kodującą sekwencję aminokwasową białka E2 pestiwirusa, zwłaszcza wirusa CSFV, z którego usunięto fragment transbłonowy.

7. Sekwencja według zastrz. 5, znamienna tym, ż e jest przedstawiona na fig. 4 albo fig. 5.

8. Konstrukt zawierający sekwencję kodującą polipeptyd, znamienny tym, że jako sekwencję kodującą polipeptyd zawiera sekwencję nukleotydową kodującą sekwencję aminokwasową pochodzącą z sekwencji białka E2 pestiwirusa, zwłaszcza wirusa CSFV.

9. Konstrukt według zastrz. 8, znamienny tym, że jako sekwencję kodującą polipeptyd zawiera sekwencję nukleotydową kodującą sekwencję aminokwasową białka E2 pestiwirusa, zwłaszcza wirusa CSFV, z którego usunięto fragment transbłonowy.

10. Konstrukt według zastrz. 8, znamienny tym, że jako sekwencję kodującą polipeptyd zawiera sekwencję przedstawioną na fig. 4 albo fig. 5.

11. Konstrukt według zastrz. 8, znamienny tym, że jest plazmidem powstałym poprzez włączenie sekwencji kodującej polipeptyd do plazmidu pIGDM1, korzystnie plazmidu pIGCmT7.

12. Komórka bakteryjna transformowana konstruktem ekspresyjnym zawierającym sekwencję kodującą polipeptyd, znamienna tym, że konstrukt jako sekwencję kodującą polipeptyd zawiera sekwencję nukleotydową kodującą sekwencję aminokwasową pochodzącą z sekwencji białka E2 pestiwirusa, zwłaszcza wirusa CSFV.

13. Komórka bakteryjna według zastrz. 12, znamienna tym, że zawiera konstrukt zawierający sekwencję nukleotydową kodującą sekwencję aminokwasową białka E2 pestiwirusa, zwłaszcza wirusa CSFV, z którego usunięto fragment transbłonowy.

14. Komórka bakteryjna według zastrz. 12, znamienna tym, że zawiera konstrukt zawierający sekwencję przedstawioną na fig. 4 albo fig. 5.

15. Komórka bakteryjna według zastrz. 12, znamienna tym, że zawiera plazmid powstały poprzez włączenie sekwencji kodującej polipeptyd do plazmidu pIGDM1, korzystnie plazmidu pIGCmT7.

16. Komórka bakteryjna według zastrz. 12, znamienna tym, że jest szczepem E. coli.

PL 199 190 B1

17. Ciałka inkluzyjne zawierające polipeptyd zawierający sekwencję aminokwasową pochodzącą z sekwencji białka E2 pestiwirusa, zwłaszcza wirusa CSFV.

18. Ciałka inkluzyjne według zastrz. 17, znamienne tym, że są produkowane w E. coli.

19. Ciałka inkluzyjne według zastrz. 17, znamienne tym, że wspomniany polipeptyd zawiera sekwencję aminokwasową białka E2 pestiwirusa, zwłaszcza wirusa CSFV, z którego usunięto fragment transbłonowy.

20. Ciałka inkluzyjne według zastrz. 17, znamienne tym, że wspomniany polipeptyd zawiera sekwencję kodowaną przez sekwencję przedstawioną na figurze 4 albo 5.

21. Sposób otrzymywania szczepionki doustnej przeciwko chorobie wywoływanej przez pestiwirusa, zwłaszcza przeciwko klasycznemu pomorowi świń, znamienny tym, że obejmuje transformację komórek E. coli wektorem ekspresyjnym, ekspresję polipeptydu kodowanego przez ten wektor, izolowanie ciałek inkluzyjnych zawierających produkowany polipeptyd służących do przygotowania szczepionki, przy czym wektor zawiera sekwencję nukleotydową kodującą sekwencję aminokwasową pochodzącą z sekwencji białka E2 pestiwirusa, zwłaszcza wirusa CSFV.

22. Sposób według zastrz. 21, znamienny tym, że wspomniana sekwencja nukleotydowa zawiera sekwencję nukleotydową kodującą sekwencję aminokwasową białka E2 pestiwirusa, zwłaszcza wirusa CSFV, z którego usunięto fragment transbłonowy.

23. Sposób według zastrz. 21, znamienny tym, że wspomniana sekwencja nukleotydowa jest przedstawiona na fig. 4 albo fig. 5.

24. Zastosowanie polipeptydu zawierającego sekwencję aminokwasową pochodzącą z sekwencji białka E2 pestiwirusa, zwłaszcza wirusa CSFV, do otrzymywania szczepionki przeciwko chorobie wywoływanej przez pestiwirusa, zwłaszcza przeciwko klasycznemu pomorowi świń.

25. Zastosowanie według zastrz. 24, znamienne tym, że polipeptyd jest w postaci ciałek inkluzyjnych.

26. Zastosowanie według zastrz. 24, znamienne tym, że polipeptyd zawiera sekwencję aminokwasową białka E2 pestiwirusa, zwłaszcza wirusa CSFV, z którego usunięto fragment transbłonowy.

27. Zastosowanie według zastrz. 24, znamienne tym, że polipeptyd zawiera sekwencję kodowaną przez sekwencję przedstawioną na fig. 4 albo fig. 5.

28. Szczepionka doustna przeciwko chorobie wywoływanej przez pestiwirusa, zwłaszcza przeciwko klasycznemu pomorowi świń zawierająca antygen i korzystnie farmaceutycznie dopuszczalny nośnik i/lub adiuwant, znamienna tym, że jako antygen zawiera polipeptyd zawierający sekwencję aminokwasową pochodzącą z sekwencji białka E2 pestiwirusa, zwłaszcza wirusa CSFV.

29. Szczepionka według zastrz. 28, znamienna tym, że polipeptyd jest w postaci ciałek inkluzyjnych.

30. Szczepionka według zastrz. 28, znamienna tym, że polipeptyd zawiera sekwencję aminokwasową białka E2 pestiwirusa, zwłaszcza wirusa CSFV, z którego usunięto fragment transbłonowy.

31. Szczepionka według zastrz. 28, znamienna tym, że polipeptyd zawiera sekwencję kodowaną przez sekwencję przedstawioną na fig. 4 albo fig. 5.

32. Zastosowanie ciałek inkluzyjnych według zastrz. 17-20 do wytwarzania szczepionki doustnej przeciwko chorobie wywoływanej przez pestiwirusa, zwłaszcza przeciwko klasycznemu pomorowi świń.