JP2024512103A - ワクチンプラットフォームとしての高弱毒化複製可能組換えポックスウイルスおよびその利用方法 - Google Patents

Abstract

重症急性呼吸器症候群コロナウイルス２の構造蛋白質およびウイルス様粒子を発現する組換えポックスウイルス、ならびに同上を作成する方法および同上を用いる方法について説明する。【選択図】図１

Description

関連出願の相互参照
本出願は、２０２１年３月３０日付けで出願された米国仮特許出願第６３／１６８，１４０号；２０２１年１０月１日付けで出願された米国仮特許出願第６３／２５１，３１９号；および２０２１年１２月７日付けで出願された米国仮特許出願第６３／２８６，９６１号に基づく優先権の利益を主張するものである。その優先出願の開示内容全体が参照として本明細書に組み入れられる。

米国連邦政府による研究助成についての説明
本発明は、米国国立衛生研究所から授与された研究助成金番号：Ｐ０１ ＡＩ０６０６９９およびＲＯ１ ＡＩ１２９２６９の下で政府援助によってなされたものである。連邦政府は本発明において一定の権利を有している。

配列表
本願はＥＦＳ－Ｗｅｂを介して電子出願したものであり、ｔｘｔ形式の配列表の電子提出を含む。このｔｘｔ形式のファイルは、２０２２年３月３０日作成のファイルサイズ９９，３２１バイトの「１１２６２４＿０１３２８＿ＳＴ２５．ｔｘｔ」というファイル名の配列表を含む。このｔｘｔ形式のファイルに含まれる配列表は、本明細書の一部であり、その全体が参照として本明細書に組み入れられる。

コロナウイルス（ＣｏＶ）は、様々な哺乳動物および鳥類に感染するウイルスであって、エンベロープを有するプラス鎖ＲＮＡウイルスの大型ファミリーを形成している。このウイルスは、主に呼吸器疾患および腸疾患を引き起こす。過去２０年間に、３種類の人畜共通感染ＣｏＶが新興してヒトに感染するようになった。世界中に拡散し続けているＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２はごく最近の出現したものだが、これによって多くの科学的問題、公衆衛生上の問題および課題がもたらされている。有効なワクチンおよび抗ウイルス治療薬の開発および迅速な展開の両方について差し迫った必要性が存在する。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２が拡散し続け、呼吸器系ウイルス疾患ランドスケープにおいて地域に特有の病気となる場合には、さらにもっと重要な優先事項となるであろう。最近興った他の２種類の新興病原性ヒトＣｏＶである重症急性呼吸器症候群（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ）および中東呼吸器症候群（ＭＥＲＳ－ＣｏＶ）に関する以前の研究は、このプロセスの迅速な推進を支援し得る見通しとプラットフォームを提供するが、いずれも初期試験段階を越えてその先へと進められている訳ではない。未だＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２およびそのヒト宿主との相互作用について多くのことが未知であり、また如何にして最も有効で安全なワクチン方略を得るべきかについても未知のままである。現在、ヒトに感染するＣｏＶ（ＨＣｏＶ）は７種類存在する：すなわち、上記の３種類の病原性ウイルスに加え、ＯＣ４３、２２９Ｅ、ＮＬ６３およびＨＫＵ１であり、これらは季節性の上気道感染を引き起こす。これらヒトウイルスは、人獣共通伝染病宿主から出現してヒトに感染するようになったと考えられている。ウイルスゲノムの分析は、これらヒトウイルスがコウモリＣｏＶに関連することを示唆している。ＳＡＲＳ－ＣｏＶの同定以来、コウモリの集団において、多種の新規ＣｏＶが同定されており、これらのウイルスがヒトへと波及し続けることが予想される。このことは、新興ＣｏＶに対するワクチン開発の必要性が高いことを示唆しているのである。

第１の局面においては、重症急性呼吸器症候群コロナウイルス２（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２）抗原をコードするポリヌクレオチド；Ｋ１Ｌをコードするポリヌクレオチド（配列番号：３）に隣接するＣ７Ｌをコードするポリヌクレオチド（配列番号：２）；および翻訳促進要素（ＴＥＥ）を含む組換えＮＹＶＡＣベクターを、本明細書に提供する。いくつかの実施態様においては、翻訳促進要素（ＴＥＥ）および重症急性呼吸器症候群コロナウイルス２（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２）抗原をコードするポリヌクレオチドの両方に制御可能に、プロモーターを連結する。いくつかの実施態様においては、該ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２抗原は、ＳＡＲＳ－Ｃｏｖ－２スパイク（Ｓ）蛋白質（配列番号：１）、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２受容体結合ドメイン（ＲＢＤ）（配列番号：６）、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２膜（Ｍ）蛋白質（配列番号：７）、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２エンベロープ（Ｅ）蛋白質（配列番号：８）、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ヌクレオカプシド（Ｎ）蛋白質（配列番号：９）、ｐｆｓ－ｓｐｉｋｅ（前融合状態のスパイク）ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２（配列番号：１７）、リストに示されている抗原のいずれかに少なくとも９０％同一である配列、およびその組み合わせまたはその断片から成る群から選択される。いくつかの実施態様においては、該ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２抗原は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓ蛋白質（配列番号：１）またはそれに少なくとも９０％同一の配列である。

いくつかの実施態様においては、該ベクターは、ＳＡＲＳ－Ｃｏｖ－２スパイク（Ｓ）蛋白質（配列番号：１）、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２受容体結合ドメイン（ＲＢＤ）（配列番号：６）、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２膜（Ｍ）蛋白質（配列番号：７）、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２エンベロープ（Ｅ）蛋白質（配列番号：８）、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ヌクレオカプシド（Ｎ）蛋白質（配列番号：９）、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のｐｆｓ－ｓｐｉｋｅ（配列番号：１７をコードするポリヌクレオチド）、およびリストに示されているポリヌクレオチドのいずれかに少なくとも９０％同一である配列から成る群から選択される少なくとも２種類のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２抗原をコードするポリヌクレオチドを含む。いくつかの実施態様においては、該ベクターは、ＳＡＲＳ－Ｃｏｖ－２スパイク（Ｓ）蛋白質（配列番号：１）、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２受容体結合ドメイン（ＲＢＤ）（配列番号：６）、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２膜（Ｍ）蛋白質（配列番号：７）、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２エンベロープ（Ｅ）蛋白質（配列番号：８）、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ヌクレオカプシド（Ｎ）蛋白質（配列番号：９）、ｐｆｓ－ｓｐｉｋｅ ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２（配列番号：１７）、およびそれに対して少なくとも９０％同一の配列から成る群から選択される少なくとも３種類のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２抗原をコードするポリヌクレオチドを含む。いくつかの実施態様においては、該ベクターは、ＳＡＲＳ－Ｃｏｖ－２スパイク（Ｓ）蛋白質（配列番号：１）、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２受容体結合ドメイン（ＲＢＤ）（配列番号：６）、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２膜（Ｍ）蛋白質（配列番号：７）、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２エンベロープ（Ｅ）蛋白質（配列番号：８）、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ヌクレオカプシド（Ｎ）蛋白質（配列番号：９）、ｐｆｓ－ｓｐｉｋｅ ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２（配列番号：１７）、およびそれに対して少なくとも９０％同一の配列から成る群から選択される少なくとも４種類のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２抗原をコードするポリヌクレオチドを含む。

いくつかの実施態様においては、該翻訳促進要素は配列番号：４を含む。いくつかの実施態様においては、該ＮＹＶＡＣベクターは、合成後期プロモーター（ＳＬＰ）をさらに含む。いくつかの実施態様においては、該ＳＬＰは配列番号：５を含む。いくつかの実施態様においては、該ＮＹＶＡＣベクターは、２種類以上の抗原性ポリペプチドの発現を可能にする内部リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）をさらに含む。いくつかの実施態様においては、該ＮＹＶＡＣベクターは少なくとも２つのＩＲＥＳを含む。いくつかの実施態様においては、該ＮＹＶＡＣベクターは自己開裂性蛋白質要素をさらに含む。いくつかの実施態様においては、該ＮＹＶＡＣは、少なくとも２つの自己開裂性蛋白質要素を含む。

第２の局面においては、本明細書に記載されるような組換えＮＹＶＡＣベクターおよび薬学的に許容可能な担体を含むワクチン組成物を本明細書に提供する。いくつかの実施態様においては、該ワクチン組成物はアジュバントをさらに含む。

第３の局面においては、対象においてＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２抗原に対する免疫応答を誘導する方法であって、本明細書に記載される有効量のワクチン組成物を該対象に投与することを含む方法を本明細書に提供する。いくつかの実施態様においては、該ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２抗原は、ＳＡＲＳ－Ｃｏｖ－２スパイク（Ｓ）蛋白質（配列番号：１）、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２受容体結合ドメイン（ＲＢＤ）（配列番号：６）、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２膜（Ｍ）蛋白質（配列番号：７）、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２エンベロープ（Ｅ）蛋白質（配列番号：８）、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ヌクレオカプシド（Ｎ）蛋白質（配列番号：９）、ｐｆｓ－ｓｐｉｋｅ ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２（配列番号：１７）、それに対して少なくとも９０％同一の配列、およびその断片またはそれらの組み合わせから成る群から選択される。いくつかの実施態様においては、該ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２抗原は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓ蛋白質（配列番号：１）またはそれに対して少なくとも９０％同一の配列である。いくつかの実施態様においては、該対象はヒトである。いくつかの実施態様においては、該組成物は注射によって投与する。

ＮＹＶＡＣ－ＫＣ－ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓｐｉｋｅの作成を示すものである。親ＮＹＶＡＣ－ＫＣは、クメルマイシン感受性（ｃｍｒ^Ｓ）であり、またＧＦＰを発現する；いずれもＴＫ遺伝子座に位置する。プラスミドＤＮＡは、ＴＫ組換えアームに挟まれるスパイク蛋白質をコードする。プラスミド形質転換およびＮＹＶＡＣ－ＫＣ感染の際には、相同組換えはまれにしか起こらない。しかし、組換えウイルスがｃｍｒ^Ｒであるため、スパイクを発現する希少組換えウイルスを選択することができる。正確な組換えは、緑色蛍光の消失によって確認される。 複製可能なＮＹＶＡＣ構築物の模式図を示す。相同組換えを用いて、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクをコードする改変遺伝子（ワシントン株）を、図１に示すような改変ＮＹＶＡＣ－ＫＣのＴＫ遺伝子座に挿入した。該スパイク遺伝子を改変して初期ワクシニアウイルス転写終結部位を除去し、またＴＫ遺伝子座からＧｙｒＢ－ＰＫＲが発現するようにＮＹＶＡＣ－ＫＣを改変した。 試験した７種類のＮＹＶＡＣ－ＫＣ－ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２－Ｓｐｉｋｅが全て、非切断スパイクに予想されるサイズの蛋白質および切断スパイクに予想されるサイズの第２の蛋白質を発現することを実証するゲルを示している。レーン１：陰性対照、すなわちＮＹＶＡＣ－ＫＣ－ＨＩＶ。レーン２～８：ＮＹＶＡＣ－ＫＣ－ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２－Ｓｐｉｋｅ候補１～７。レーン９：陽性対照、すなわち合成ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２－Ｓｐｉｋｅ。 スパイク遺伝子がウイルスのＴＫ遺伝子に挿入されていないことを示す増幅産物（ＧｙｒＢ－ＰＫＲ内部プライマーを用いて増幅した）のアガロースゲルを示す。 スパイク遺伝子がウイルスのＴＫ遺伝子に挿入されていることを示す増幅産物（ＧｙｒＢ－ＰＫＲ内部プライマーを用いて増幅した）のアガロースゲルを示す。 スパイク蛋白質を調べるウエスタンブロットを示す。この結果は、試験した７種類のウイルスがすべて未切断スパイクを発現することを示している。 ワクチン接種後およびマウス適応型ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルス負荷後のマウス体重の、元々の体重に対する割合（％）を示す。表示のワクチンを用いて、１回のプライムおよび２回のブーストによりマウスにワクチン接種し、ウイルス負荷後１０日間その体重を測定した。 図７の試験を行ったマウスの臨床スコアを示す。 植物由来ＶＬＰによるプライム、および複製可能ワクチンベクター（すなわち、Ｂ群）の２回のブーストで処置したマウスの血清の希釈を示す。 ワクチン接種マウスの血清において、５つの時点で検出したＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２中和抗体活性を示す：すなわち、プライム前、プライムから１か月後、第１回目のブーストから１か月後、第１回目のブーストから３か月後、および第２回目のブーストから２週間後である。 ＮＹＶＡＣ－ＫＣ－ｐｆｓＳｐｉｋｅを示す。ＮＹＶＡＣ－ＫＣは、ワクシニアウイルスのコペンハーゲン株の高弱毒化複製可能誘導体であり、１６個のオープンリーディングフレームが欠失している。ＮＹＶＡＣ－ＫＣ－ｐｆｓＳｐｉｋｅを生成させるために、合成初期／後期プロモーターの制御下にある融合前安定化スパイクをＮＹＶＡＣ－ＫＣのＴＫ遺伝子座に挿入した。 ＲＢＤ結合抗体を示す。表示の時点で採血した動物の血清を、金標識ワシントン株ＲＢＤのｈｕＡＣＥ２結合を阻害する阻害能に関してアッセイした。対照は、強力に中和する陽性対照、および弱く中和する陽性対照による結合阻害を示している。図１２Ａは皮下注射を示し、図１２Ｂは鼻腔内投与を示す。 マウス適応型ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２であるＳＡＲＳ２－Ｎ５０１ ＹＭＡ３０ウイルスを負荷した後の生存を示す。動物はＮＹＶＡＣ－ＫＣ－ｐｆｓＳｐｉｋｅによる免疫を行わなかった動物、あるいは免疫を行った動物であり、これら動物に対して、２ｘ１０^３ｐｆｕのマウス適応型ＳＡＲＳ２－Ｎ５０１ ＹＭＡ３０によるウイルス負荷を行った。最長で１０日まで毎日、盲検により動物の疾病率に関するモニターリングを実施した（図５を参照のこと）。臨床スコアが８以上の場合には、動物を安楽死させた。 ウイルス負荷動物の臨床スコアを示す。最長でウイルス負荷から１０日後まで動物の疾病率に関するモニターリングを実施した（体重減少、立毛、円背、活動低下；各パラメーターを０～３の範囲とし、０は無症状；１は症状が軽度であることを示し；２は中等度の症状；および３は重度の症状を示す）。総計スコアが８以上の動物は安楽死させた。Ａ：ＮＹＶＡＣ－ＫＣ－ｐｆｓＳｐｉｋｅによる免疫も、ウイルス負荷も実施しなかった動物。Ｂ：ＮＹＶＡＣ－ＫＣ－ｐｆｓＳｐｉｋｅによる免疫を実施せずに、マウス適応型ＳＡＲＳ２－Ｎ５０１ ＹＭＡ３０によるウイルス負荷を行った動物。Ｃ：ＮＹＶＡＣ－ＫＣ－ｐｆｓＳｐｉｋｅで免疫し、マウス適応型ＳＡＲＳ２－Ｎ５０１ＹＭＡ３０によるウイルス負荷を行った動物。Ｄ：ＮＹＶＡＣ－ＫＣ－ｐｆｓＳｐｉｋｅを乱切法で免疫し、マウス適応型ＳＡＲＳ２－Ｎ５０１ＹＭＡ３０によるウイルス負荷を行った動物。Ｅ：ＮＹＶＡＣ－ＫＣ－ｐｆｓＳｐｉｋｅを鼻腔内免疫し、マウス適応型ＳＡＲＳ２－Ｎ５０１ ＹＭＡ３０によるウイルス負荷を行った動物。

参考文献の組み込み
本明細書において言及する全ての公開物、特許、および特許出願は、個々の公開物、特許、および特許出願が、参照として具体的かつ個々に本明細書に組み入れられているが如く、参照として本明細書に組み入れられるものである。

本開示では、重症急性呼吸器症候群コロナウイルス２（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２）ワクチン組成物、ならびに、同上を作成する方法および同上を用いる方法について説明する。

重症急性呼吸器症候群コロナウイルス２（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２）は、過去２０年の間に新興した第３の高病原性ヒトＣｏＶである。このウイルスは、重症呼吸器疾患ＣＯＶＩＤ－１９を引き起こし、その推定死亡率は２～３％である。２０１９年の終わり頃に始まった中国を越えて、ＣＯＶＩＤ－１９は急速に拡散し２０２０年の始め頃には全世界的なパンデミックと宣言されたのである。他のＣｏＶと同様に、そのスパイク（Ｓ）蛋白質が中和抗体の主要な標的と見なされている。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓ蛋白質は、受容体結合ドメイン（ＲＢＤ）を介してその受容体であるアンジオテンシン変換酵２（ＡＣＥ２）に結合する。他のＣｏＶのＲＢＤは免疫原性であり、また主要な中和決定基である。季節性のウイルス性呼吸器疾患として定着するであろうという重大な懸念がある。したがって、該ウイルスに対するより安全で有効なワクチンの開発が重要な優先事項である。このプロジェクトの長期的目標は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に対して安全で有効なワクチンを開発することである。ウイルス様粒子（ＶＬＰＳ）および弱毒化ワクシニアウイルスの作成には、標準的な分子生物学、生化学的アプローチ、ワクチン接種および免疫原性評価が用いられるであろう。この研究の目的は、ＶＬＰおよび弱毒化ワクシニアウイルスを最適に作成し、これらのＶＬＰまたは弱毒化ワクシニアウイルスでワクチン接種したマウスにおいて誘発された免疫応答を評価することである。

ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２は、膜（Ｍ）、スパイク（Ｓ）、エンベロープ（Ｅ）、およびヌクレオカプシド（Ｎ）構造蛋白質を含む。これらＭ、Ｓ、およびＥ蛋白質が、ウイルス外套エンベロープの構造を提供する。

Ｓ蛋白質は、受容体結合ならびに宿主細胞への侵入時の融合を媒介する糖蛋白質である。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＳ蛋白質は、配列番号：１の配列を有する。その受容体結合ドメイン（ＲＢＤ、配列番号：６）は、配列番号：１のアミノ酸３１８～５１０である。ＴＫ組換えアーム（配列番号：１４）によって挟まれるＳＡＲＳ－ＣｏＶ２－ＳｐｉｋｅをコードするＤＮＡ配列（注釈付き）を実施例２の末尾に示す。

いくつかの実施態様においては、本明細書に記載のワクチンによるＳ蛋白質発現を改善する目的で、天然Ｓ蛋白質に改変が施されている。例えば、発明者らは、フーリン開裂部位に突然変異（ｒｒａｒ＞ｇｓａｓ）を含み、また融合前Ｓ蛋白質を全体として安定化させる６つのプロリン変異（すなわち、Ｆ８１７Ｐ、Ａ８９２Ｐ、Ａ８９９Ｐ、Ａ９４２Ｐ、ＫＶ９８６／７＞ＰＰ）を含む改変Ｓ蛋白質（配列番号：１５）を作成した。

いくつかの実施態様においては、Ｓ蛋白質をコードするＤＮＡ配列は、特定の生物種での発現に関してコドン最適化される。例えば、いくつかの実施態様においては、Ｓ蛋白質は配列番号：１６によってコードされる。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＭ蛋白質は、配列番号：７の配列を有する。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＥ蛋白質は、配列番号：８の配列を有する。Ｎ蛋白質は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスゲノムを封入する内部構造成分である。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＮ蛋白質は、配列番号：９の配列を有する。

本明細書中の「ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２抗原」は、対象において免疫応答を引き起こすために用いてもよいＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２蛋白質、それに対して少なくとも９０％同一の配列、その断片、またはそれらの組み合わせを指す。該ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２抗原は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＳ蛋白質、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＭ蛋白質、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＥ蛋白質、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＮ蛋白質、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＳ蛋白質ＲＢＤ、それらに対する配列同一性が少なくとも９０％、９５％、９８％、または９９％である配列を有する蛋白質、またはそれらの組み合わせであってもよい。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスは過去２年間に進化し続け、Ｓｐｉｋｅ蛋白質に多くの変異が同定された。ＳＡＲＳ－ＣＯＶ－２のＳｐｉｋｅまたはＲＢＤにおけるこれらの変異のうちの複数の変異が、本明細書に記載のワクチンに含まれていてもよく、そのような変異としては、配列番号：１７、配列番号：１８、配列番号：１９、配列番号：２０、配列番号：２１、配列番号：２２、配列番号：２３、配列番号：２４、配列番号：２５、配列番号：２６、配列番号：２７、配列番号：２８、配列番号：２９、配列番号：３０、配列番号：３１、配列番号：３２、配列番号：３３、配列番号：３４、配列番号：３５、配列番号：３６、または配列番号：３７が挙げられる。本明細書に記載のワクチンにおける発現改善を可能にする目的で、上記の変異体Ｓｐｉｋｅ配列のそれぞれを、上記の改変と組み合わせて用いることができる。

注目すべきは、配列番号：２２～４１がＳ蛋白質において同定した個々の変異を含み、本明細書に記載のＶＬＰおよびワクチンを作成する目的で用いてもよい新規Ｓ蛋白質を生成させるためにこれら個々の変異を組み合わせてもよいことである。例えば、該ウイルスのデルタ変異体は、配列番号：３１および３３の変異の組み合わせを含む。したがって、上記のこれらの組み合わせならびに新規組み合わせもまた、本明細書において提供される。Ｓ蛋白質における変異の新規組み合わせが循環ウイルス集団に出現し続けるので、免疫原性を維持するために本明細書に記載のワクチンおよびＶＬＰは循環ウイルスを考慮する必要がある可能性が高い。

本明細書中の表現「配列同一性％」、「同一性パーセント」、または「同一性％」は、同義語として用いられ、標準化アルゴリズムを用いて整列化した少なくとも２種類のアミノ酸配列間の一致残基の割合（％）を指す。アミノ酸配列整列化法は周知である。一部の整列化法では、保存的アミノ酸置換を考慮に入れている。そのような保存的置換については以下でさらに詳細に説明するが、一般的に置換部位における電荷および疎水性が保持され、したがってポリペプチドの構造が保持される（したがって、その機能も保存される）。アミノ酸配列の同一性％は、当該技術分野において理解されるような方法で決定するのであってもよい。通常用いられる一連の配列比較アルゴリズムであって、自由に利用可能なアルゴリズムは、全米バイオテクノロジー情報センター（ＮＣＢＩ）の基本局所整列化探索ツール（ＢＬＡＳＴ（登録商標）整列化ツール）として提供され、ＮＣＢＩ（ベセスダ、メリーランド州）のウェブサイトを含む複数のソースから利用可能である。ＢＬＡＳＴ（登録商標）整列化ツールソフトウエアスイートは、既知アミノ酸配列を多様なデータベースの他のアミノ酸配列と共に整列化する目的に用いる「ｂｌａｓｔｐ」など各種の配列分析プログラムを含んでいる。

ポリペプチド配列同一性は、定義されるポリペプチド配列（例えば、特定の配列番号で規定されるような配列）の全長にわたって算出するのであってもよく、あるいは、例えば、より大型の規定のポリペプチド配列から得られるより短い長さ（例えば、連続する少なくとも１５、少なくとも２０、少なくとも３０、少なくとも４０、少なくとも５０、少なくとも７０または少なくとも１５０の残基の断片）について算出するのであってもよい。そのような長さは単に例示として挙げるのであって、同一性％を測定してもよい長さを説明するために、本明細書の表、図または配列表中に示される配列に対応する任意の断片長を用いてもよいことを理解されたい。

本明細書に記載されるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２抗原のうちのいずれかをコードするポリヌクレオチドを提供する。本明細書中の用語「ポリヌクレオチド」、「ポリヌクレオチド配列」、「核酸」、および「核酸配列」は、ヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、ポリヌクレオチド（これらの用語は同義語として用いられることがある）、またはその任意の断片を指す。これらの表現はまた、天然または合成に由来するＤＮＡまたはＲＮＡ（一本鎖または二本鎖として存在してもよく、またセンス鎖またはアンチセンス鎖であってもよい）を指す。該ポリヌクレオチドは、ｃＤＮＡであってもゲノムＤＮＡであってもよい。

本明細書に記載のポリヌクレオチドに相同なポリヌクレオチドもまた提供する。当業者であれば、遺伝子暗号の縮重についておよび様々なポリヌクレオチドが同一のポリペプチドをコードし得ることを理解するであろう。いくつかの実施態様においては、該ポリヌクレオチド（すなわち、本明細書に記載されるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２抗原をコードするポリヌクレオチド）は、植物細胞、哺乳動物細胞、昆虫細胞、細菌性細胞、または真菌細胞を含む非限定的な特定の細胞における発現についてコドン最適化するのであってもよい。本明細書では特定のポリヌクレオチド配列を開示するが、本明細書に記載のポリペプチドであって所望の形態のものをコードする任意のポリヌクレオチド配列を用いるのであってもよい。したがって、非天然の配列を用いることもできる。これらは、例えば、ポリペプチドまたは蛋白質の異種発現システムにおいて、発現を増強するために望ましいことがある。縮重コード配列を生成するコンピュータープログラムが利用可能であり、この目的に利用することができる。鉛筆、紙、遺伝子暗号、および人の手もまた、縮重コード配列生成に利用可能である。

本発明の別の一局面においては、構築物を提供する。本明細書中の用語「構築物」は、非限定的に、ＤＮＡおよびＲＮＡを含む組換え体ポリヌクレオチドを指し、これは一本鎖であっても二本鎖であってもよく、またセンス鎖であってもアンチセンス鎖であってもよい。組換えポリヌクレオチドは、少なくとも２種類の異なる天然供給源に由来するポリヌクレオチド配列を含む、あるいは合成物であってもよい、実験法により作成されるポリヌクレオチドである。したがって、構築物は、内在性遺伝子に対して、例えば、ゲノム編集技術によって導入した新規改変を含むものであってもよい。構築物は、例えば、組換えＤＮＡの方法論を用いて作成した組換えポリヌクレオチドをも含み得る。

本明細書において提供される構築物は、当業者が利用可能な方法によって調製され得る。請求項に係わる構築物のそれぞれが組換え分子であって、そのようなものは天然には存在しないことに留意されたい。一般に、本明細書において用いる用語および本発明で用いる実験手段は、当該技術分野において公知の通常用いられる分子論的技術、生化学的技術、および組換えＤＮＡ技術を含む。当業者に利用可能な標準的技術を、クローニング、ＤＮＡおよびＲＮＡの単離、増幅および精製に用いるのであってもよい。そのような技術は、文献に詳細な説明がある。

本明細書において提供される構築物は本明細書に記載のポリヌクレオチドのいずれか１つに、制御可能に連結されたプロモーターを含み得る。本明細書中の記載においては、ポリヌクレオチドが第２のポリヌクレオチド配列との機能的関連において配置される場合に、ポリヌクレオチドは「制御可能に連結される（ｏｐｅｒａｂｌｙ ｃｏｎｎｅｃｔｅｄ）」、あるいは「制御可能に連結される（ｏｐｅｒａｂｌｙ ｌｉｎｋｅｄ）」のである。

本明細書中の用語「異種プロモーター」、「プロモーター」、「プロモーター領域」、または「プロモーター配列」は、一般的に、本明細書に記載のポリヌクレオチドの５’側あるいは３’側に存在するのであってもよい、あるいは該ポリヌクレオチドのコード領域内に存在するのであってもよい遺伝子転写制御領域を指す。典型的には、プロモーターは、細胞においてＲＮＡポリメラーゼに結合可能なＤＮＡ制御領域であって、下流の（３’方向）コード配列を転写開始することが可能なＤＮＡ制御領域である。典型的な５’プロモーター配列は、その３’末端に転写開始部位が連結されており、そこから上流（５’方向）に伸びた部分が、バックグラウンドを超える検出可能レベルの転写を開始するのに必要な最小数の塩基または要素を含むのである。プロモーター配列内には、転写開始部位（ヌクレアーゼＳ１マッピングによって便宜的に規定される）ならびにＲＮＡポリメラーゼが結合する蛋白質結合ドメイン（コンセンサス配列）が存在する。

本発明の実施に有用な異種プロモーターとしては、構成的、誘導性、時間制御性、発生制御性、化学的制御性、組織選択的、および組織特異的なプロモーターが挙げられるが、これらのみに限定されるものではない。該異種プロモーターは、植物、動物、細菌、真菌、または合成のプロモーターであってもよい。好適なプロモーターは、当該技術分野において公知であり、また記載が存在する。植物での発現に好適なプロモーターとしては、カリフラワーモザイクウイルス３５Ｓプロモーター、ユビキチン、ｔＣＵＰ潜在性構成的プロモーター、Ｒｓｙｎ７プロモーター、病原体誘導性プロモーター、トウモロコシＩｎ２－２プロモーター、タバコＰＲ－１ａプロモーター、グルココルチコイド誘導性プロモーター、エストロゲン誘導性プロモーターおよびテトラサイクリン誘導性、ならびにテトラサイクリン抑制性プロモーターが挙げられるが、これらのみに限定されるものではない。そのほかのプロモーターとしては、Ｔ３、Ｔ７およびＳＰ６プロモーター配列が挙げられるが、これらはＲＮＡのインビトロ転写に用いられることが多い。哺乳動物細胞では、典型的なプロモーターとして、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ－１）、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、ＳＶ４０ウイルスのプロモーターなど、ならびに翻訳伸長因子ＥＦ－１αプロモーターまたはユビキチンプロモーターが挙げられるが、これらのみに限定されるものではない。

いくつかの実施態様においては、該プロモーターはウイルス合成後期プロモーター（ＳＬＰ）である。いくつかの実施態様においては、該ＳＬＰは配列番号：５の配列を有する。様々な細胞種に用いられるさらなる様々なプロモーターが当業者に公知である。

本明細書において提供される構築物は、本明細書に記載のポリヌクレオチドのいずれか１つに制御可能に連結された翻訳促進要素（ＴＥＥ）を含んでいてもよい。

本明細書中の「翻訳促進要素（ＴＥＥ）」は、キャップ非依存性翻訳開始を媒介するポリヌクレオチド配列を指す。ＴＥＥポリヌクレオチドは、翻訳されるＲＮＡポリヌクレオチドおよび該ＲＮＡポリヌクレオチドをコードするＤＮＡポリヌクレオチドの両方を指す。ＴＥＥの同定については、米国特許公開第２０１３０２３０８８４号に記載があり、またＷｅｌｌｅｎｓｉｅｋらによる記載（「ヒトゲノムにおけるキャップ非依存性翻訳促進要素の全ゲノムプロファイリング（Ｇｅｎｏｍｅ－ｗｉｄｅ ｐｒｏｆｉｌｉｎｇ ｏｆ ｃａｐ－ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ ｅｎｈａｎｃｉｎｇ ｅｌｅｍｅｎｔｓ ｉｎ ｔｈｅ ｈｕｍａｎ ｇｅｎｏｍｅ）」、Ｎａｔ Ｍｅｔｈｏｄｓ、２０１３、１０（８）：７４７－７５０）も存在する。また、好適なＴＥＥについても米国特許公開第２０１４０２５５９９０号に記載があり、Ｗｅｌｌｅｎｓｉｅｋによる記載（「哺乳動物細胞においてＲＮＡ発現および蛋白質合成を促進可能なリーダー配列（Ａ ｌｅａｄｅｒ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｃａｐａｂｌｅ ｏｆ ｅｎｈａｎｃｉｎｇ ＲＮＡ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ａｎｄ ｐｒｏｔｅｉｎ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｉｎ ｍａｍｍａｌｉａｎ ｃｅｌｌｓ）」、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉ．、２０１３、２２（１０）： １３９２－１３９８）も存在する。いくつかの実施態様においては、該ＴＥＥは配列番号：４の配列を含む。いくつかの実施態様においては、該ＴＥＥは配列番号：１０の配列を含む。いくつかの実施態様においては、該ＴＥＥは配列番号：１１の配列を含む。いくつかの実施態様においては、該ＴＥＥは配列番号：１２の配列を含む。いくつかの実施態様においては、１つのポリヌクレオチド配列が、プロモーターおよびＴＥＥの両方として作用するのであってもよい。

本明細書に記載のいずれかの構築物またはポリヌクレオチドを含むベクターを提供する。用語「ベクター」は、連結されている別のポリヌクレオチドを輸送可能なポリヌクレオチドを指すことが意図される。いくつかの実施態様においては、該ベクターは、「プラスミド」であってもよい；プラスミドは、ライゲーションによって付加的ＤＮＡセグメントを連結してもよい環状二本鎖ＤＮＡループを指す。特定のベクターが、導入宿主細胞において自己複製することができる（例えば、細菌の複製開始点を有する細菌ベクターおよびエピゾーム型哺乳動物ベクター）。他のベクターは、宿主細胞への導入によって宿主細胞ゲノムに組み込まれ、それによって宿主ゲノムと共に複製する（一部のウイルスベクターまたはトランスポゾンなど）。ウイルスゲノムもまた、ベクターに含まれる（ウイルスゲノムを基盤とするベクターなどを含む）。ベクターは、遺伝的要素（特定の薬剤または化学物質に対する耐性を付与する要素など）を運搬するのであってもよい。

いくつかの局面においては、該ベクターは、ワクシニアウイルスゲノムを基盤とするワクシニアウイルス発現ベクターである。ワクシニアウイルス（ＶＡＣＶまたはＶＶ）は、ポックスウイルスファミリーに属するエンベロープを有する大型で複雑なウイルスである。おおよそ長さ１９０ｋｂの直鎖状二本鎖ＤＮＡゲノムを有しており、約２５０の遺伝子をコードする。そのゲノムはリポ蛋白質のコア膜に包まれている。ポックスウイルスは既知の中で最大のＤＮＡウイルスであり、宿主細胞の核外細胞質でその全体を複製可能である複製能によって他のウイルスから区別される。ＶＶは、２５ｋｂにも及ぶ外来性ＤＮＡを収容することが可能なため、大型遺伝子の発現に有用である。外来性遺伝子はそのウイルスゲノムに安定に組み込まれるので、効率的遺伝子発現が得られる。本発明に用いられる他のウイルス発現ベクターとしては、特定の高度弱毒化、宿主限定的、複製欠損または複製不良なポックスウイルス株が挙げられるが、これらのみに限定されるものではない；これらは、組換えワクチンの開発の基材として開発されたものである。これらの株としては、オルソポックスウイルス、改変ワクシニアアンカラ（ＭＶＡ）およびＮＹＶＡＣ（コペンハーゲンワクシニア株に由来する）、およびアビポックスウイルス、ＡＬＶＡＣおよびＴＲＯＶＡＣ（それぞれ、カナリア痘および鶏痘ウイルスに由来する）が挙げられる。いくつかの実施態様において、本明細書に記載のウイルス発現ベクターは、１種類以上のより望ましい特性を有するようには改変されていることもある。

いくつかの実施態様においては、該ウイルス発現ベクターは、複製可能となるように改変されており、送達抗原に対するＴ細胞応答および抗体反応が改善されたＮＹＶＡＣベクターである。本明細書中の「ＮＹＶＡＣ－ＫＣ」は、Ｋ１Ｌポリペプチド（配列番号：３）をコードするポリヌクレオチドに隣接するＣ７Ｌポリペプチド（配列番号：２）をコードするポリヌクレオチドを含むように改変されたＮＹＶＡＣベクターを指す。Ｃ７ＬおよびＫ１Ｌはいずれも、該ウイルスの複製能の定義に関与することが示されている。ＮＹＶＡＣ－ＫＣベクターについては、米国特許第９，６７０，５０６号により詳細な説明がある；本参考文献は、その内容全体が参照として本明細書に組み入れられる。

いくつかの実施態様においては、本明細書に記載のベクターは、内部リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）を含む。ＩＲＥＳは、真核リボソームを動員し、キャップ非依存性の翻訳開始を可能にするＲＮＡ要素である；ＩＲＥＳは５’ＵＴＲに位置することが多いが、ｍＲＮＡ中の別の部位に存在することもあり得る。いくつかの実施態様においては、本明細書に記載のベクターは少なくとも２つのＩＲＥＳを含む。いくつかの実施態様においては、本明細書に記載のベクターとしては、自己開裂性蛋白質要素が挙げられる。自己開裂ペプチドは、翻訳中にリボソームがペプチドを結合しないリボソームスキッピングを誘発する；このスキッピングによって、見かけの開裂が起こるのである。自己開裂ペプチドとしては、２Ａクラスのペプチドが挙げられる。いくつかの実施態様においては、本明細書に記載のベクターは、少なくとも２種類の自己開裂性蛋白質要素を含む。

いくつかの局面においては、本明細書に記載のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２抗原を取り込ませるウイルス様粒子（ＶＬＰ）または組換え免疫複合体を本明細書に提供する。

本明細書中の「ウイルス様粒子（ＶＬＰ）」は、１種類以上のウイルス蛋白質を含み、天然ウイルスの構造を模倣するがウイルスゲノムは欠損している粒子を指す。いくつかの実施態様においては、該ＶＬＰは少なくとも該Ｓ蛋白質を含む。いくつかの実施態様においては、該ＶＬＰは少なくとも該Ｍ蛋白質およびＥ蛋白質を含む。いくつかの実施態様においては、該ＶＬＰは少なくとも該Ｍ蛋白質、Ｅ蛋白質、およびＳ蛋白質を含む。いくつかの実施態様においては、該ＶＬＰは該Ｍ蛋白質、Ｅ蛋白質、Ｓ蛋白質、およびＮ蛋白質を含む。

また、本明細書に記載のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２抗原またはＶＬＰを含むワクチン組成物を提供する。本明細書中の「ワクチン」は、抗原を含む組成物を指す。またワクチンとしては、特定の疾患に対する免疫性または免疫応答を改善する生物学的調製物を挙げることができる。ワクチンは、典型的には疾患を引き起こす微生物（この場合は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２）に類似する、あるいはその微生物の一部である抗原とよばれる化学物質を含み、その化学物質は微生物の弱毒化または死滅したもの、その毒素またはその表面蛋白質の１つから得られるものであることが多い。該抗原は、該化学物質を外来性のものと認識する身体の免疫系を刺激してそれを破壊するが、さらにそれを「記憶」するので、後にこれらの微生物に遭遇した場合に、免疫系はそれをさらに容易に認識して破壊することができるのである。

ワクチンが予防的なこともある（例えば、天然または「野生」の病原体による将来の感染の影響を予防または低減する目的）；あるいは、ワクチンが治療的な場合もある（例えば、該疾患を治療する目的）。対象へのワクチン投与の結果として、一般的に、１種類以上の特定の疾患に対する免疫応答が引き起こされる。治療的に有効なワクチン量は、用いる特定のウイルスおよび患者の病状に応じて異なることがあり、医師によって決定され得る。該ワクチンは、筋肉内、静脈内、皮下、経口、口鼻、または鼻腔内の投与経路で直接的に該対象に投与するのであってもよい。

本明細書に記載のワクチン組成物はまた、好適な送達担体またはビヒクルをも含む。本明細書中の用語「担体」は、薬学的に許容可能な固形状または液状の充填剤、希釈剤または封入材料を指す。水含有液性担体は、酸性化剤、アルカリ性化剤、抗菌性保存剤、抗酸化剤、緩衝剤、キレート剤、錯化剤、可溶化剤、保湿剤、溶媒、懸濁剤および／または増粘剤、等張化剤、湿潤剤、または他の生体適合性材料などの薬学的に許容可能な添加剤を含み得る。上記のカテゴリーに列挙される成分の表が、１８５７～１８５９年の米国薬局方国民医薬品集（１９９０）に収載されている。

薬学的に許容可能な担体として用いることのできる材料の例としては、以下が挙げられる：
糖類（乳糖、グルコースおよびスクロースなど）；でんぷん類（コーンスターチおよびジャガイモでんぷんなど）；セルロースおよびその誘導体（カルボキシメチルセルロースナトリウム、エチルセルロースおよび酢酸セルロースなど）；粉末トラガカント；麦芽；ゼラチン；タルク；賦形剤（ココアバターおよび坐剤ワックス類など）；油類（落花生油、綿実油、ベニバナ油、ごま油、オリーブ油、コーンオイルおよび大豆油など）；グリコール類（プロピレングリコールなど）；ポリオール類（グリセリン、ソルビトール、マンニトールおよびポリエチレングリコールなど）；エステル類（オレイン酸エチルおよびラウリン酸エチルなど）；寒天；緩衝剤（水酸化マグネシウムおよび水酸化アルミニウムなど）；アルギン酸；発熱物質不含水；等浸透圧性食塩水；リンゲル液、エチルアルコールおよびリン酸緩衝液、ならびに医薬製剤に用いるその他の非毒性適合性物質。該組成物はまた、調製者の所望に応じて、湿潤化剤、乳化剤および滑沢剤（ラウリル硫酸ナトリウムおよびステアリン酸マグネシウムなど）、ならびに着色剤、放出剤、コーティング剤、甘味料、香味矯臭剤、防腐剤および抗酸化剤をも含有し得る。

薬学的に許容可能な抗酸化剤の例としては、以下が挙げられる：
水溶性抗酸化剤（アスコルビン酸、システイン塩酸塩、亜硫酸水素ナトリウム、メタ重亜硫酸ナトリウム、硫酸ナトリウムなど）；油脂可溶性抗酸化剤（パルミチン酸アスコルビル、ブチル化ヒドロキシアニソール（ＢＨＡ）、ブチル化ヒドロキシトルエン（ＢＨＴ）、レシチン、没食子酸プロピル、α－トコフェロールなど）；および金属キレート剤（クエン酸、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、ソルビトール、酒石酸、リン酸など）。

別の一実施態様においては、該製剤はまた、安定化送達ビヒクル、担体、支持体または複合体形成分子種などの他の好適な化学物質をも含み得る。本発明の協調投与法および組み合わせ製剤においては、本明細書に記載のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２抗原またはＶＬＰの送達のための改善された製剤を提供する目的で、有効な担体、処理剤、または送達担体を任意選択的に含めるのであってもよい。

ワクチン製剤は、中性に近いｐＨ（７．０～７．３）を維持する目的で生物学的に許容可能な緩衝液をさらに含んでいてもよい。そのような好ましく用いられる緩衝液は、典型的にはリン酸塩、カルボン酸塩、および重炭酸塩である。より好ましい緩衝剤は、リン酸ナトリウム、リン酸カリウム、クエン酸ナトリウム、乳酸カルシウム、コハク酸ナトリウム、グルタミン酸ナトリウム、重炭酸ナトリウム、および重炭酸カリウムである。緩衝液は、該ワクチン製剤の約０．０００１～５％（ｗ／ｖ）、より好ましくは約０．００１～１％（ｗ／ｖ）の量で含まれるのであってもよい。必要に応じて、他の添加剤を最終ワクチン製剤の一部として含めるのであってもよい。

いくつかの実施態様においては、該製剤はまたアジュバントも含み得る。アジュバントは、該製剤の奏効性または有効性を増加させる目的、またはワクチンに対する免疫応答を変化させる目的で用いる物質または物質の組み合わせである。アジュバントは、抗原と共に組み合わせて用いた場合に、抗原特異的免疫応答を加速、延長、または増強し得る。アジュバントは、カリウムミョウバン、水酸化アルミニウム、リン酸アルミニウムまたは水酸化燐灰石などの無機化合物であってもよい。アジュバントはまた、パラフィン油またはプロポリスなどの油脂、百日咳菌またウシ結核菌の死菌などの細菌産物あるいはそれらのトキソイド類、モノホスホリル脂質Ａまたは無毒化サルモネラ複数種のリポ多糖であってもよい。アジュバントはまた、キラヤ（ＱＳ－２１）、大豆またはセネガ（Ｐｏｌｙｇａｌａ ｓｅｎｅｇａ）のサポニン類などの植物由来のものであってもよい。ＩＬ－１、ＩＬ－２またはＩＬ－１２などのサイトカインもまたアジュバントとして働き得る。アジュバントとしてはまた、完全フロイントアジュバントまたは不完全フロイントアジュバントまたはスクアレン（ＡＳ０３またはＭＦ５９を含む）が挙げられる。

該ワクチン製剤の残りの部分は、水を含む許容可能な希釈剤で１００％にするのであってもよい。該ワクチン製剤はまた、油中水型または水中油型の乳剤の一部として製剤化することもできる。

該ワクチン製剤は、バイアルまたは他の好適な容器に分注するのであってもよい。次いで本明細書に記載のワクチン製剤を単回用量または複数回用量のアンプルに充填する、あるいは次いで単回用量または複数回用量のアンプルに充填する前に凍結乾燥するのであってもよい。本明細書において意図するワクチン製剤はまた、凍結乾燥形態を含む。該凍結乾燥ワクチン製剤は、周囲温度で生存率の低下なく長期間保存され得る。該凍結乾燥ワクチンは、末端ユーザーが再構成して患者に投与するのであってもよい。

本明細書中の用語「凍結乾燥（ｌｙｏｐｈｉｌｉｚａｔｉｏｎ）」または「凍結乾燥した」は、低温における材料の凍結後に、昇華（通常、高真空下）で脱水することを指す。凍結乾燥（ｌｙｏｐｈｉｌｉｚａｔｉｏｎ）は、凍結乾燥（ｆｒｅｅｚｅ ｄｒｙｉｎｇ）としても知られている。トレイ凍結、棚板式凍結、噴霧凍結、シェル凍結および液体窒素浸漬など、多くの凍結技術が凍結乾燥の技術分野で公知である。各技術において、凍結速度は異なるであろう。シェル凍結には自動化また用手的な方法があり得る。例えば、フラスコは、アルコールを含む冷蔵浴、アセトン、液体窒素、またはその他の適切な液体中で、モーター駆動型ローラーにより自動回転させることができる。産物が薄層被膜としてフラスコ内部「シェル」の周囲に均一に凍結するので、各凍結乾燥実施中により体積の多い材料を安全に処理することが可能になる。トレイ凍結は、例えば、試料を凍結乾燥機に設置し、０℃の棚温度で１時間平衡化してから、棚板を０．５℃／分で－４０℃まで冷却することによって実施するのであってもよい。噴霧凍結は、例えば、約２０μｌの液滴を液体窒素に落下させることによって液体中に噴霧凍結する、液体に蒸気を噴霧して凍結する、あるいは当該技術分野において公知の他の技術によって、実施するのであってもよい。

また、対象において免疫応答を誘導する方法も提供する。本明細書に記載のようなＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２抗原またはＶＬＰを含む本明細書に記載のようなワクチン組成物を対象に投与して免疫応答を誘導する。投与後、該対象の免疫応答を公知の方法を用いて試験してもよい。

対象へのワクチン接種を目的として、治療有効量の本明細書に記載のワクチン組成物を該対象に投与する。ワクチンの治療有効量は、典型的には１用量以上、用量当たり１～５００マイクログラムのワクチン製剤、最も好ましくは用量当たり１～１００マイクログラムのワクチン製剤を含む、好ましくは約０．０１～１０ｍＬの範囲、最も好ましくは０．１～１ｍＬの範囲である。該治療有効量はまた、ワクチン接種を受ける生物種によって異なることもある。例えば、マウスなどのより小型の動物では、好ましい用量が、抗原が１～５０マイクログラム溶液で約０．０１～１ｍＬ程度であり得る。ヒト患者の場合には、好ましい用量は、抗原が１～５０マイクログラム溶液で約０．１～１ｍＬ程度であり得る。該治療有効量はまた、患者の特徴を含む他の条件（年齢、体重、性別、健康状態など）などによって異なることもある。

本明細書中の用語「投与」は、ワクチンなどの物質を対象の身体に導入することを指す。該投与、例えば、非経口投与は、皮下投与、筋肉内投与、経皮投与、皮内投与、腹腔内投与、眼内投与、鼻腔内投与、経口投与、および静脈内投与を含み得る。

本発明のワクチンまたは組成物は、当該技術分野において公知の方法にしたがって個体に投与するのであってもよい。そのような方法は、例えば、非経口での適用（あらゆる注射経路または皮膚（例えば、筋肉内、静脈内、腹腔内、皮内、粘膜、粘膜下層、または皮下など）など）を含む。また、該ワクチンは、身体のいずれかの部位において、眼、鼻、口、肛門、または腟の粘膜上皮、あるいは皮膚表皮上に滴下、噴霧、ゲルまたは軟膏として局所適用によって用いるのであってもよい。

他の可能な投与経路は、吸入による気道への噴霧、エアロゾル、または粉末での適用が挙げられる。これらの最後の適用例では、用いる粒子サイズによって、粒子がどの程度まで気道の深部に到達するかが決まる。

あるいは、例えば、粉末、液体、または錠剤の形態で、食物、餌、または飲水と組み合わせて消化管経路で用いるのであってもよく、あるいは、液体、ゲル、錠剤、またはカプセルの形態で口中に直接的投与するのであってもよく、または坐剤として肛門に投与するのであってもよい。

本開示は一般的に哺乳動物に適用するが、その例としては、ヒト、ウシ、ウマ、ヒツジ、ブタ、ヤギ、ウサギ、イヌ、ネコ、コウモリ、マウスおよびラットが挙げられるが、これらのみに限定されるものではない。いくつかの実施態様においては、本開示は鳥類に適用することもできる。特定の実施態様においてはまた、実例を示す目的で、マウスおよびラットなどの非ヒト哺乳動物を利用するのであってもよい。獣医学的目的において、本発明を利用するのであってもよい。例えば、産業的に重要な家畜（ウシ、ウマ、ブタ、ウサギ、ヤギ、ヒツジなど）および鳥類（ニワトリなど）の治療が所望であってもよい。また、ペット動物（ネコおよびイヌなど）の治療が所望であってもよい。

他で特段に定義するのでない限り、本明細書中のすべての技術的用語および科学的用語は、本発明が関与する当該技術分野における当業者によって通常理解されるものと同一の意味を有する。本明細書において定義され、また用いられる全ての定義は、辞書的定義、参照として組み入れられる文書内の定義、および／または定義される用語の通常の意味よりも優先されることを理解されたい。

本明細書に開示される全ての参考文献、特許および特許出願は、それぞれ引用される主題（場合によっては、文書全体を含み得る）に関して、参照として組み入れられる。

本明細書および「特許請求の範囲」において用いられる不定冠詞「ａ」および「ａｎ」は、そうでないことが特段に明記されるのでない限り、「少なくとも１つの」を意味するものであることを理解されたい。

本明細書および「特許請求の範囲」において用いられる表現「および／または」は、組み合わせた要素、すなわち、一部の場合には結合性の要素、また別の場合には分離性の要素のうちの「いずれかまたは両方」を意味するものであることを理解されたい。「および／または」によって列挙される複数の要素は同様に見なすべきであり、すなわち、結合させた要素のうちの「１つ以上」と見なすべきである。「および／または」という表現で具体的に識別される該要素以外に、他の要素が具体的に識別されるそれらの要素に関連するものであっても、あるいは無関係なものであっても任意選択的に存在するのであってもよい。したがって、非限定的例ではあるが、「Ａおよび／またはＢ」と言う表現が「を含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」などのオープンエンド表現と共に用いられる場合には、一実施態様において、Ａのみ（任意選択的にＢ以外の要素を含む）を意味し得る；別の一実施態様においては、Ｂのみ（任意選択的にＡ以外の要素を含む）を意味し得る；さらなる別の一実施態様においては、ＡおよびＢの両方（任意選択的に他の要素を含む）を意味し得る、等々。

本明細書および「特許請求の範囲」において用いられる「または（ｏｒ）」は、上記で定義する「および／または（ａｎｄ／ｏｒ）」と同一の意味を有するものであると理解されたい。例えば、リストにおいて項目を分離する場合に、「または（ｏｒ）」または「および／または（ａｎｄ／ｏｒ）」は、包括的、すなわち、多数要素または要素リストのうちの少なくとも１つを包含するのみならず、２つ以上および、任意選択的に付加的な非列挙項目をも含むものと解釈されるであろう。それに対して明確に唯一であることが示される用語、すなわち「～のうちのただ一つ（ｏｎｌｙ ｏｎｅ ｏｆ）」または「～のうちのまさに一つ（ｅｘａｃｔｌｙ ｏｎｅ ｏｆ）」、あるいは、「特許請求の範囲」において用いられる場合の「～から成る（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｏｆ）」などの用語は、多数要素または要素リストのうちの正に唯一の要素のみを包含することを意味するであろう。一般的に、「いずれか（ｅｉｔｈｅｒ）」、「～のうちの一つ（ｏｎｅ ｏｆ）」、「～のうちの一つのみ（ｏｎｌｙ ｏｎｅ ｏｆ）」、または「～のうちのまさに一つ（ｅｘａｃｔｌｙ ｏｎｅ ｏｆ）」などの排他性の用語を伴う場合には、本明細書中の用語「または（ｏｒ）」は、排他的代替を示す（すなわち、「一方または他方であるが、両方ではない（ｏｎｅ ｏｒ ｔｈｅ ｏｔｈｅｒ ｂｕｔ ｎｏｔ ｂｏｔｈ）」）ものであるとのみ解釈されるであろう。「特許請求の範囲」において用いられる場合の「本質的に～から成る（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ ｏｆ）」は、特許法の分野において用いられるその通常の意味を有するものである。

数値に言及する場合の本明細書中の用語「おおよそ（ａｐｐｒｏｘｉｍａｔｅｌｙ）」または「約（ａｂｏｕｔ）」は、その数値について、他で特段に言及するのでない限り、あるいは文脈からそうでないことが明白でない限り（可能値の１００％を超えるそのような数値の場合を除く）、一般的に、いずれかの方向（より大きいまたはより小さい）において５％の範囲内に入る数値を含むものとする。範囲について言及する場合には、他で特段に言及するのでない限り、あるいは文脈からそうでないことが明白でない限り、その範囲の端点も含まれるものとする。

１種類以上の好ましい実施態様について本発明を説明するが、具体的に説明されるそれらに加えて、多くの同等物、代替物、変形、および変更が可能であり、それらは本発明の範囲内にあることを理解されたい。

実施例
以下の実施例では、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２蛋白質を発現する弱毒化複製可能組換えポックスウイルスワクチン組成物、ＶＬＰ、および免疫複合体を作成する方法および用いる方法について説明する。

実施例１：ワクチン設計
ＣｏＶはいずれも少なくとも３種類のエンベロープ構造蛋白質：すなわち、膜（Ｍ）蛋白質、スパイク（Ｓ）蛋白質、およびエンベロープ（Ｅ）蛋白質を有している。ヌクレオカプシド（Ｎ）蛋白質は、ウイルスゲノムを封入する内部構造成分である。Ｓ蛋白質は、受容体結合および宿主細胞への進入過程での融合を媒介する糖蛋白質である。アンジオテンシン変換酵２（ＡＣＥ２）は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の受容体であるが、またＳＡＲＳ－ＣｏＶについても同様である［２６～２８］。Ｓ蛋白質は中和抗体の主要な標的である［２９～３２］。鳥類および哺乳動物の多くのコロナウイルスでは、Ｓ蛋白質が開裂してＳ１およびＳ２になる［３３］。Ｓ蛋白質上の受容体結合ドメイン（ＲＢＤ）は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶを含む多くのＣｏＶのＳ蛋白質でマップされている［３４、３５］。ＳＡＲＳ－ＣｏＶおよびＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＳ蛋白質の配列比較によって、Ｓ蛋白質全体ではおおよそ７６％の配列同一性を示す。ＲＢＤは約７３％の同一性を示すが、ＲＢＤの受容体結合モチーフコア構造は約５０％程度の同一性しか示さない［２７］。

このことは、細胞への感染において両ウイルスが侵入にＡＣＥ２を利用するが、受容体相互作用は構造的に異なる可能性があるため、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に対する有効なワクチンの開発には特異的標的を必要とし得ることを示唆している。

このプロジェクトの背景となる根拠は以下である：すなわち、高度に弱毒化させた、複製可能生ワクシニアウイルスベクターワクチンであって、ＳＡＲＳコロナウイルス２抗原を発現するワクチンを利用することによって、多くの弱毒化生ワクチンに付随する有害反応および安全性の問題を回避しながら、弱毒化生ワクチンによる保護が得られるであろうということである。弱毒化生コロナウイルスを基盤とするワクチンは魅力的ではあるが、そのようなコロナウイルスの利用は復帰突然変異および安全性に関して懸念をもたらす［７６］。本発明者らは、その代替として複製可能高度弱毒化生ワクシニアウイルスベクターであるＮＹＶＡＣ－ＫＣ［２２］の利用を提案している；これは、本発明者らが高免疫原性であることを示している［２１］；また本発明者らは、ＳＡＲＳおよびＭＥＲＳの候補ワクチン作成に用いた複製欠損ＭＶＡを基盤とするワクチンベクターとの比較を行っている［７７］［７８］。本発明者らは、ＮＹＶＡＣ－ＫＣがＨＩＶ抗原に対する優れたＴ細胞応答および抗体反応を提供することを示し、またその複製欠損親株であるＮＹＶＡＣと比較している［２１］。このように、本発明者らは、複製欠損ＭＶＡと比較して、ＮＹＶＡＣ－ＫＣが優れた免疫応答を提供すると予想している。本発明者らは、本発明者らが同定した新規ポックスウイルスの転写／翻訳エンハンサー（ＴＥＥ）［７９］であって、対応する最適化ポックスウイルス後期プロモーターよりも１０～２０倍蛋白質発現を増加させることが可能なこのエンハンサー（ＴＥＥ）を含めることにより、これらのベクターの免疫原性を増強する予定である。その最終目標は、弱毒化ＳＡＲＳコロナウイルス２生ワクチンの復帰突然変異および安全性の問題を回避しながら、弱毒化生ＳＡＲＳコロナウイルス２ベクターによる免疫付与を模倣することを目的とした、複数種類のＳＡＲＳコロナウイルス２抗原と共に用い得るベクターを作成することである。

ＮＹＶＡＣ－ＫＣを工学的に改変して、遺伝子をＴＫ遺伝子座に迅速挿入することを可能にした［８０］。本発明者らは、ＮＹＶＡＣ－ＫＣのＴＫ遺伝子座に、ＧＦＰと共に抗生物質クメルマイシンに対する感受性をコードする陰性選択可能マーカーを挿入した（ＮＹＶＡＣ－ＫＣ－ＴＫ：ＧＦＰ／ｃｍｒＳ）。ＴＫのフランキングアームに挟まれる最適化ワクシニアウイルス初期／後期プロモーターから発現するＳＡＲＳコロナウイルス２抗原をコードするＤＮＡ構築物（取り出した後期ワクシニアウイルス転写終結部位を含む）を設計し（その構築について）発注している。本発明者らは、直鎖状ＤＮＡで形質転換を行い、ＮＹＶＡＣ－ＫＣ－ＴＫ：ＧＦＰ／ｃｍｒＳを感染させることでインビボ組換え［２２］を実施する予定である。ＴＫ遺伝子座のＧＦＰ／ｃｍｒＳカセットをＳＡＲＳコロナウイルス２カセットで置換したウイルスは、無色でかつｃｍｒＲであろう。候補のＧＦＰ－／ｃｍｒＲプラークを選択し、挿入物が意図通りであるかをＰＣＲで確認する。本発明者らのＧＬＰ（優良試験所基準）認証ワクチン室で、プラークをＰ２（第２継代）として増幅し、プレマスターシードストックを調製する。本発明者らは、ＤＮＡを受け取ってから１か月以内に１０１０ｐｆｕのＧＬＰ（優良試験所基準）プレマスターシードストックを調製することができる。ＧＭＰ製造向けに受け渡す前に、抗原発現（Ｐ２で抗原陽性プラーク％）、無菌性、マイコプラズマ汚染および挿入物の安定性（Ｐ２対Ｐ９の抗原陽性プラーク％）に関してプレマスターシードストックをアッセイする。本発明者らは５本のＧＬＰ（優良試験所基準）ＮＹＶＡＣ－ＫＣプレマスターシードストックの調製に成功しており、それはＧＭＰ製造向けに受け渡しが完了している。

本発明者らは同様に、ｃｍｒＳであり欠失１１からＧＦＰを発現するＭＶＡを工学的に作成する。本発明者らがこのウイルスを作成すれば、ＮＹＶＡＣ－ＫＣについて記載している方法で、ＳＡＲＳコロナウイルス２抗原を挿入する予定である。

本発明者らはまず、ＮＹＶＡＣ－ＫＣおよびＭＶＡからＳＡＲＳコロナウイルス２スパイク（Ｓ）を発現させる。ＳＡＲＳおよびＭＥＲＳのＳは、動物モデルのウイルス負荷試験において保護的である中和抗体を誘導することが示されている［８１］［８２］。しかし、微粒子抗原は、可溶性抗原または膜結合抗原よりも免疫原性が強いことが多い。そこで本発明者らは、真正ＳＡＲＳコロナウイルス２ＶＬＰの生成に必要であることが明らかにされているＳＡＲＳコロナウイルス２蛋白質（例えば、膜（Ｍ）蛋白質、エンベロープ（Ｅ）蛋白質、およびヌクレオカプシド（Ｎ）蛋白質）をもまた発現させる予定である。

ＶＬＰに必要な複数の蛋白質をＮＹＶＡＣ－ＫＣから発現させる目的で、本発明者らは転写を指令する逆方向タンデムプロモーターを用いる。一方向のＨＩＶ ｅｎｖおよびそれとは逆方向のＨＩＶ ｇａｇ－ｐｏｌ－ｎｅｆ融合蛋白質を発現させる目的で、本発明者らはこの設計を用いたことがある。このように本発明者らは、ＮＹＶＡＣ－ＫＣから７ｋＢの導入遺伝子を発現させることに成功しているのである。最適化ＩＲＥＳ［８３］［８４］を用いるか、あるいは自己開裂性蛋白質要素［８５］［８６］を用いるかのいずれかによって、本発明者らは、この構築物から発現する独立な蛋白質の数を増やすことが可能である。

全ての構築物について、単一サイクル感染後および複数回の感染後に、導入遺伝子発現をウエスタンブロッティングで分析する。複数回感染の分析によって、複製可能ベクターから予想し得る遺伝子発現増加の推定値が得られるであろう。ＶＬＰおよび免疫複合体抗原については、上清および細胞質抽出物を回収し、スクロースパッドを用いた超遠心分離で微粒子物質を精製した後、ウエスタンブロット分析および免疫顕微鏡法を実施する。

実施例２：ワクチン作成
本発明者らは、図１に示すようなＮＹＶＡＣ－ＫＣ－ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２－Ｓｐｉｋｅの７候補クローンの作成に、本発明者らのワクシニアウイルス組換え体迅速作成システムを利用している。親ウイルスであるＮＹＶＡＣ－ＫＣは、ウイルスのＴＫ遺伝子座にクメルマイシン感受性（ｃｍｒＳ）／ＧＦＰカセットを有している。このカセットは、ＮＹＶＡＣ－ＫＣにおいてＴＫ欠失を挟む配列に相同的なアームを有しており、ウイルスゲノムとのインビボ組換えが可能である。また、このカセットはＥ／Ｌプロモーターも有している。本発明者らは、ＴＫ組換えアームに挟まれたＳＡＲＳ－ＣｏＶ２－ＳｐｉｋｅをコードするＤＮＡを取得した。ＮＹＶＡＣ－ＫＣ中のｃｍｒＳ／ＧＦＰカセットとＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のスパイクをコードするＤＮＡとの間の希な置換によって、選択性ｃｍｒＲ／非ＧＦＰ組換えウイルスが得られる。最初の相同組換え反応で、７つのｃｍｒＲ／非ＧＦＰプラークを選択した。プラーク１およびプラーク３の２つは、その後のプラーク精製において緑色プラークとならず、ＰＣＲによってｃｍｒＳ／ＧＦＰカセットを含んでいないことが判明した。残りの５つのプラークは、依然として少量の親ウイルスを含んでいると予想されたので、プラーク精製による除去処理を行っているところである。７候補はすべて、非切断スパイクに予想されるサイズの蛋白質および切断されたスパイクに予想されるサイズの第２の蛋白質を発現する（図３）。留意すべきは、昆虫細胞で合成スパイクが生成しているが、糖付加率が低い可能性が高いことから、ＮＹＶＡＣ－ＫＣから発現した合成スパイクと未切断スパイクとの間の電気泳動移動度における僅かの差異を説明するということである。この結果はウエスタンブロット分析によっても支持される（図６）。動物のワクチン接種に充分なウイルスを生成させるために、クローン１および３を増幅した。

ＮＹＶＡＣ－ＫＣ－ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２－Ｓｐｉｋｅのストックはすべて、優良試験所基準（ＧＬＰ）ワクチン室にて調製した。ＧＬＰ（優良試験所基準）材料が全て到着する前に、本発明者らはこのウイルスの作成を開始した。現在のストックは動物実験に用いる予定である。既存のウイルスで動物実験を進めながら、ＮＹＶＡＣ－ＫＣ－ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２－Ｓｐｉｋｅの新規ＧＬＰ（優良試験所基準）ストックを調製する予定である。

実施例３：ウイルス負荷実験
次いで、本発明者らは、本発明者らの候補複製可能ワクチンベクターが、マウス適応型ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスの負荷からマウスを保護する保護能について試験を行った。本発明者らの候補複製可能ワクチンをマウスに１回のプライムおよび２回のブーストでワクチン接種した：Ａ群（ワクチンベクターの皮下注射を３回受けたもの）、Ｃ群（本明細書に記載されるワクチンベクターを最初に鼻腔内投与、その後２回の皮下注射を受けたもの）、およびＤ群（３回のワクチンベクターの鼻腔内投与を受けたもの）；他方、Ｂ群のマウスでは、プライムとして筋肉内に植物由来ＶＬＰおよび複製可能ワクチンを皮下に２回のブーストでワクチン接種した。感染後少なくとも１０日間その体重が安定なままであったこと（図７）によって実証されるように、これらのマウスは全てウイルス負荷から保護されたのである。対照的に、ＶＬＰまたは複製欠損ワクチンベクターをプライムおよび２回のブーストでワクチン接種したＥ～Ｇ群のマウスでは、保護されることなく急速に体重低下した（図７）。試験のエンドポイント（すなわち、マウスを安楽死させる時点）を判定するために用いた臨床スコアに基づけば、保護されるマウスおよび保護されないマウスについての転帰間に大きな差異が見いだされる（図８）。複製可能ワクチンがＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２中和抗体を生成させる能力は、５つの時点でＡ～Ｄ群のマウスから採取した血清試料の中和活性をアッセイすることによって実証された；５つの時点とは、すなわち：プライム前、プライムから１か月後（第１ブーストの前）、第１ブーストから１か月後、第１ブーストから３か月後（第２ブーストの前）、および第２ブーストから２週間後（図１０）である。

実施例４：融合前安定化ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクを発現するワクシニアウイルスワクチンベクターによる鼻腔内免疫は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２が重度に変異したマウス適応型ＳＡＲＳ２－Ｎ５０１ＹＭＡ３０株による致死的負荷からマウスを完全に保護した
最近同定されたＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のオミクロン変異体は、その高度に変異したスパイク蛋白質から、懸念される変異体であるとみなされている（１）。とりわけ懸念されるのは、感染またはＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の初期ワシントン株に対する免疫のいずれかによって誘導される中和抗体を回避することに関連付けられる５部位の変異（Ｋ４１７、Ｎ４４０、Ｅ４８４、Ｑ４９３およびＮ５０１）を、オミクロンスパイクが有していることである（表１および配列番号：１８～３７を参照のこと）（２～４）。したがって、いずれも初期の非変異スパイク蛋白質に基づく現在のワクチンによる免疫を、オミクロンが少なくとも部分的には回避可能であるかもしれない。

米国において現在承認または認可されている非常時使用ワクチンは、デルタを含むＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の初期変異体に対して優れた保護を提供するが、広く全世界的な使用を妨げるような限界もある。大規模な低温流通体系を維持する必要があり、また投与が非経口的である；これらはいずれも広範な利用を困難なものにしている。

本発明者らは、高弱毒化複製可能ワクシニアウイルスベクターＮＹＶＡＣ－ＫＣを作成した（５）；これは、広範な低温流通体系を必要とせず、皮膚乱切法または鼻腔内のいずれかによって投与することが可能である（本稿）。ＮＹＶＡＣ－ＫＣは、初代ヒトケラチン生成細胞およびヒト初代皮膚線維芽細胞において完全複製可能である（５）。複製可能ではあるが、高感受性の新生仔頭蓋内マウスモデルならびに免疫欠損マウスにおいてＮＹＶＡＣ－ＫＣは高弱毒性である（５）。ＮＹＶＡＣ－ＫＣは、ウサギの皮膚に軽度の硬結を誘導するが、それが全身に広がる兆候は示さなかった（５）。ＮＹＶＡＣ－ＫＣは高免疫原性であり、その複製欠損性親ベクターＮＹＶＡＣと比較して、ＨＩＶインサートに対してより強いＴ細胞応答および抗体反応を誘導した（５～１０）。したがって、ＮＹＶＡＣ－ＫＣは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に対する全世界的な戦いにおいて有利となる特性を有し得る。

本稿において、本発明者らはＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のマウス適応型変異体であるＳＡＲＳ２－Ｎ５０１ＹＭＡ３０（１１）によるウイルス負荷に対する保護に関して説明する。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の初期株は、マウスにおいて病原性ではない。ＳＡＲＳ２－Ｎ５０１ＹＭＡ３０は、Ｎ５０１Ｙスパイク突然変異を有するワシントン株ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２をマウスで逐次継代することによって生成したものである。３０継代後に、このウイルスはマウスにおいて病原性となったが、これはマウスＡＣＥ２蛋白質に対する親和性の増強が関与していた（１１）。マウスでの継代中に、もともとのＮ５０１突然変異を維持しながら、スパイクに４変異が蓄積された（ｏｒｆｌａの３変異およびＴＲＳの１非コード突然変異）：すなわち、Ｋ４１７、Ｅ４８４、Ｑ４９３、Ｑ４９８である。ＳＡＲＳ２－Ｎ５０１ＹＭＡ３０において変異した５つのスパイク部位は全てオミクロンでの変異でもある；変異した場合に、５変異部位のうち４つが、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の初期株のスパイクで誘導される中和抗体を回避可能な残基位置であった（２～４）。このように、ＳＡＲＳ２－Ｎ５０１ ＹＭＡ３０は、高度に変異したスパイクを発現するので、現在のワクチンで誘導される中和抗体を回避可能であり得る。しかし、本発明者らは、高弱毒化複製可能ワクシニアウイルスベクターＮＹＶＡＣ－ＫＣで発現した融合前の安定化ワシントン株スパイクを鼻腔内免疫した場合に、ＳＡＲＳ２－Ｎ５０１ＹＭＡ３０による死および感染後疾患からマウスが完全に保護されたことを示している。乱切法による免疫は、軽症疾患ではなく死から完全に保護したのである。したがって、高弱毒化複製可能熱安定ポックスウイルスベクターで発現したワシントン株スパイクを、注射剤を用いずに投与することで、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の高変異マウス適応型ＳＡＲＳ２－Ｎ５０１ ＹＭＡ３０変異体による負荷に対して完全保護が可能である。

結果
ＮＹＶＡＣ－ＫＣ－ｐｆｓＳｐｉｋｅの作成
フーリン開裂部位の突然変異および６プロリン残基挿入により、融合後コンフォメーション（ｐｆｓＳｐｉｋｅ）へのコンフォメーション変化を防いで、ワクシニアウイルス最適化ワシントン株スパイクを融合前の状態に安定化した（１２）。ＴＫ遺伝子座相同性フランキングアームに挟まれるＰｆｓＳｐｉｋｅを、相同組換えによりＮＹＶＡＣ－ＫＣのＴＫ遺伝子座に挿入した（図１１）。ＴＫに挟まれるｐｆｓＳｐｉｋｅの相同組換え前に、ｐＧＮＲ－ｃｍｒ^Ｓカセットを挿入することにより、ＮＹＶＡＣ－ＫＣのＴＫ遺伝子座を改変した（１３）。ｐＧＮＲ－ｃｍｒ^Ｓは、ｐＧＮＲ－ｃｍｒ^Ｓを有するウイルスの選択と同定を可能にするｎｅｏ^ｒ遺伝子およびＧＦＰ遺伝子をコードし、また陰性選択可能マーカーとして作用するｃｍｒ^Ｓ遺伝子をもコードする（１４）。ＮＹＶＡＣ－ＫＣ－ｎｅｏ^Ｒ－ＧＦＰ－ｃｍｒ^Ｓを細胞に感染させ、ＴＫに挟まれたｐｆｓＳｐｉｋｅで形質転換を行った。ｐＧＮＲ－ｃｍｒ^ＳカセットがｐｆｓＳｐｉｋｅで置換された組換えウイルスをｃｍｒ^Ｒの非蛍光プラークとして選択した。個々のプラークについてＰＣＲおよびウエスタンブロットを実施することにより、ｐｆｓＳｐｉｋｅの挿入が確認された。この技術により、新規遺伝子をＮＹＶＡＣ－ＫＣに迅速挿入することが可能である（ＤＮＡを取得してからＰ２ストックが得られるまでおおよそ１か月）。

ＮＹＶＡＣ－ＫＣによる免疫
乱切法または鼻腔内投与のいずれかにより、１０^６ｐｆｕのＮＹＶＡＣ－ＫＣ－ｐｆｓＳｐｉｋｅでマウスを免疫した。免疫から１か月後、マウスにブースト（ブースター）を行い、３か月間休息させた後、第２回目のブーストを実施した。一次免疫から１か月後、第１回目のブーストから１か月後および３か月後、および第２回目のブーストから２週間後に、採血を行った。ワシントン株Ｓｐｉｋｅ蛋白質ＲＢＤのヒトＡＣＥ２結合を阻害する阻害能について、血清のアッセイを行った（１５）。乱切法によるＮＹＶＡＣ－ＫＣ－ｐｆｓＳｐｉｋｅの免疫によって、ｈｕＡＣＥ２へのＲＤＢ結合を阻害する弱い血清反応が得られた（図１２Ａ）。この応答はブーストで高レベルに増強されたが、３か月後には減弱した。第２のブーストによって血清反応が増強され、ＲＢＤのｈｕＡＣＥに対する結合が中程度レベルで阻害された。ＮＹＶＡＣ－ＫＣ－ｐｆｓＳｐｉｋｅによる単回鼻腔内免疫では、ｈｕＡＣＥ２へのＲＤＢ結合を阻害する強力な血清反応が誘導された（図１２Ｂ）。この応答は、第１回目のブースト後でも高レベルを維持し、第１回目のブーストから３か月後でもさほど減弱することはなく、第２回目のブースト後にも高レベルを保っていた。このように、鼻腔内免疫は強力な持続性血清ＲＢＤ結合反応を誘導することが可能であった。

ＳＡＲＳ２－Ｎ５０１ＹＭＡ３０によるウイルス負荷
ＮＹＶＡＣ－ＫＣ－ｐｆｓＳｐｉｋｅで免疫した動物に対して、第２ブーストから２週間後におおよそ２ｘｌ０^３ｐｆｕのＳＡＲＳ２－Ｎ５０１ ＹＭＡ３０を用いてウイルス負荷を行った（１１）。動物のモニターを行い、各基準の重症度にしたがい０～３のスコア付けを行った：すなわち、体重減少、立毛、円背、および活動性消失である。全ての動物を盲検によりスコア付けした。臨床スコアが総計８になった場合に、安楽死のエンドポイントとした。ＮＹＶＡＣ－ＫＣ－ｐｆｓＳｐｉｋｅで免疫していない１７個体の動物のうち１５個体が、感染から４日後に臨床スコア８に達したため、安楽死させた（図１３、赤い線）。ＮＹＶＡＣ－ＫＣ－ｐｆｓ－Ｓｐｉｋｅ免疫動物では、安楽死が全く必要なかった（図１３、青い線）。図１４は、ウイルス負荷から０～９日後の全群における各動物の臨床スコアを示している。モック負荷動物では、実験経過全体を通じてそのスコアが０～１であった（図１４Ａ）。ＮＹＶＡＣ－ＫＣ－ｐｆｓＳｐｉｋｅで免疫していない動物にＳＡＲＳ２－Ｎ５０１ＹＭＡ３０をウイルス負荷した場合には、全動物がウイルス負荷から２～３日後までに疾病の兆候を示し、１７個体の動物のうち１５個体において安楽死が必要となるほど重篤な症状となった（図１４Ｂ）。ＮＹＶＡＣ－ＫＣ－ｐｆｓＳｐｉｋｅで免疫した動物は全て、重篤な疾患へ進行することがなかった（図１４Ｃ）；これらの動物では２個体が軽症疾患で、最大臨床スコアが２および４であった。軽症の疾患を示したこれら２個体の動物は、乱切法で免疫したコホートに属するものであった（図１４Ｄ）。鼻腔内免疫した動物は、ＳＡＲＳ２－Ｎ５０１ＹＭＡ３０のウイルス負荷後に無症候であり、その臨床スコアは０～１であった（図１４Ｅ）；これは、モック負荷動物と同等であった（図１４Ａ）。

材料と方法
ウイルス
マウス適応型ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＳＡＲＳ２－Ｎ５０１ＹＭＡ３０をＡ５４９－ｈｕＡＣＥ２細胞で増殖させた（１１）。外来遺伝子のＮＹＶＡＣ－ＫＣゲノムへの挿入に関して、本発明者らは、クメルマイシン（ｃｍｒ）感受性およびｎｅｏＲ遺伝子を付与し（１４）、ＧＦＰを発現する（１３）大腸菌ジャイレース／ＰＫＲ融合蛋白質をコードするカセット（ｐＧＮＲ－ｃｍｒＳ）を構築した。このカセットは、ＮＹＶＡＣ－ＫＣにおいてＴＫ欠失を挟む配列に相同的なアームを有しているので、ウイルスゲノムとのインビボ組換えが可能である。ＢＳＣ－４０細胞におけるインビボ組換え（１７）でｐＧＮＲ－ｃｍｒＳカセットをＮＹＶＡＣ－ＫＣに付加した；リポフェクタミン２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用い製品使用説明書にしたがい、直鎖状カセットＤＮＡで細胞を形質転換した。ＮＹＶＡＣ－ＫＣ感染はＭＯＩ＝０．０５で行った。４８時間後に、感染細胞をかき取って培地（グルタミンおよび１％ＦＢＳを含む１．２ｍｌのＯｐｔｉ－Ｐｒｏ（Ｇｉｂｃｏ））に入れた。凍結／解凍を２回行った後、細胞上清を用いて、ＩＶＲストックの１：１０希釈、１：１００希釈、および１：１０００希釈で１００ｍｍディッシュのＢＳＣ－４０細胞に感染させた。感染のためのインキュベーション後に、２％のＦＢＳおよび１ｍｇ／ｍｌのＧ４１８を含むＤＭＥＭを加えた。感染４８時間後に、重層アガロースを加えてから緑色のＧ４１８Ｒプラークを選択した。６穴プレートで、プラークをｃｍｒ感受性スクリーニングした；ＢＳＣ－４０細胞によるプラーク精製において、次の段階に用いるため、最大感受性を示す２プラークを選択した。この段階のプラークであって、最大ｃｍｒ感受性を示したプラークを６０ｍｍディッシュで増幅させた。このウイルス（ＮＹＶＡＣ－ＫＣ－ｎｅｏＲ－ＧＦＰ－ｃｍｒＳ）を用い、ＩＶＲにおいてワクシニアウイルス合成初期／後期プロモーター（１８）の制御下にある最適化ワクシニアウイルス融合前安定化ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ワシントン株スパイク蛋白質のコード配列（１２）で、ｐＧＮＲ－ｃｍｒＳカセットを置換した；これによってｃｍｒＲの非蛍光ウイルスが得られた。この選択では、ＩＶＲの感染から２４時間後に１００ｎｇ／ｍｌのｃｍｒを添加し、最終プラークが選択されるまで、ｃｍｒ存在下でさらなる感染を実施した。ＰＣＲおよびウエスタンブロッティングにより、挿入物が正しいものであることの確認を行った。プラークを２回増幅して、マウスの免疫に用いるＰ２ストックを得た（５）。

細胞株
１０％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）、１００Ｕ／ｍｌペニシリン、１００μｇ／ｍｌストレプトマイシン、５０μｇ／ｍゲンタマイシン、１ｍＭピルビン酸ナトリウム、および１０ｍＭ ＨＥＰＥＳを添加したダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ；Ｇｉｂｃｏカタログ番号１１９６５）にて、アフリカミドリザル腎臓Ｖｅｒｏ細胞（Ｅ６）または（ＣＣＬ８１）（ＡＴＣＣから取得した）を培養した。ヒトＡ５４９細胞（ＡＴＣＣより確認された）は、１０％ＦＢＳ、１００Ｕ／ｍｌペニシリン、および１００μｇ／ｍｌストレプトマイシンを添加したＲＰＭＩ１６４０（Ｇｉｂｃｏカタログ番号１１８７５）で培養した。Ａ５４９－ＡＣＥ２細胞の作成については以前に報告がある（１９）。

プラークアッセイ
簡単に説明すると、ウイルス上清を１０倍段階希釈し、３７℃で１時間接種材料をＶｅｒｏ細胞に吸収させた。接種材料をＤＭＥＭ＋０．７％アガロースと共に重層し、３７℃で３日間インキュベートした。４％パラホルムアルデヒドで細胞を固定し、１％クリスタルバイオレットで染色してプラークの計数を行った。感染およびウイルス操作は全て、適切なＩＢＣ承認個人用防護装備およびプロトコルを用い生物安全性レベル３（ＢＳＬ－３）実験室で実施した。

免疫
７週齢のＢＡＬＢ／ｃマウスを１０^６ｐｆｕのＮＹＶＡＣ－ＫＣ－ｐｆｓＳｐｉｋｅで免疫した。鼻腔内投与（１０μＬを用いた）または尾乱切法（２０μＬ）のいずれかにより、３７．５ｍｇ／ｋｇケタミン、７．５ｍｇ／ｋｇキシラジン、および２．５ｍｇ／ｋｇアセプロマジンを含むカクテルを用いて麻酔下で免疫を実施した。ワクチン接種後に、マウスを加温パッド上で回復させ、歩行時までモニターした；歩行時にはマウスを動物ケージに収容した。最初のワクチン接種から１か月後および４か月後にマウスにブースト接種を実施した。試験経過中を通じて、ウイルス負荷までの間、毎週マウスの体重を測定し、２週単位で採血を実施した。

ＲＢＤ／ｈｕＡＣＥ２相互作用の阻害
半定量的に測定するラテラルフローアッセイを用いて、以前に報告されている方法（１５）により、ワシントン株ＲＢＤのＡＣＥ２への結合を阻害する中和抗体のレベルを評価した。簡単に説明すると、３μｌの血清をＰＢＳで６μｌに希釈してラテラルフローストリップに載せた；このストリップは、可溶性金標識ワシントン株ＲＢＤおよび結合ｈｕＡＣＥ２を含むものであった。チェイス緩衝液を用い、ストリップで血清および金標識ＲＢＤのチェイスを行った（１５）。２０分後に、結合ＡＣＥ２の部位における青色をデンシトメトリーで定量した。以前に報告されている方法（２０）により、以下の式を用いて、阻害％を算出した：
ｌ－（被検試料ライン密度／検出限界、ＬｏＤ）＊１００
ここで、迅速試験の非中和血清に関するＬｏＤは、５７０，２２９であった。

ＳＡＲＳ２－Ｎ５０１ＹＭＡ３０のウイルス負荷
ＮＹＶＡＣ－ＫＣ－ｐｆｓＳｐｉｋｅで免疫した、あるいは免役していないマウスを、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルス負荷のためにＡＢＳＬ３に移動させた。ＳＡＲＳ２－Ｎ５０１ＹＭＡ３０を２ｘｌ０^３ｐｆｕ／動物の用量（容量５０μｌ）で鼻腔内投与した。接種のため、５０ｍｇ／ｋｇケタミンおよび７．５ｍｇ／ｋｇキシラジンのカクテルを用いて腹腔内経路でマウスを麻酔した。接種後に、加温パッドの上に設置したケージでマウスを回復させ、歩行時までマウスをモニターした。体重が元々の体重の８５％未満になるまで毎日マウスの体重計測を行った；８５％未満になった時点で、毎日２回モニターした。盲検により症状（立毛、円背、および活動性）のスコア付けを行った：１０日間、０～３（０＝正常、３＝重症）でスコア付けし、承認ＩＡＣＵＣプロトコルに詳細が説明されるように、臨床スコア（体重減少のスコア０～３を含む）の総計が８に達した場合にマウスを安楽死させた。回復したマウスまたは無症候のマウスについては、１０日間モニターした。

参考文献

実施例４の参考文献

本発明の実施態様
［実施態様１］
翻訳促進要素（ＴＥＥ）および重症急性呼吸器症候群コロナウイルス２（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２）抗原をコードするポリヌクレオチドを制御可能に連結したプロモーター；
および
Ｋ１Ｌをコードするポリヌクレオチド（配列番号：３）に隣接するＣ７Ｌをコードするポリヌクレオチド（配列番号：２）、
を含む、組換えＮＹＶＡＣベクター。
［実施態様２］実施態様１の組換えＮＹＶＡＣベクターであって、ここで該ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２抗原が、
配列番号：１、配列番号：６、配列番号：７、配列番号：８、配列番号：９；
または
配列番号：１７、配列番号：１８、配列番号：１９、配列番号：２０、配列番号：２１、配列番号：２２、配列番号：２３、配列番号：２４、配列番号：２５、配列番号：２６、配列番号：２７、配列番号：２８、配列番号：２９、配列番号：３０、配列番号：３１、配列番号：３２、配列番号：３３、配列番号：３４、配列番号：３５、配列番号：３６、または配列番号：３７の変異体ＳＡＲＳ－ＣＯＶ－２スパイクまたはＲＢＤ、
および
それらに対して少なくとも９０％同一である配列、ならびにそれらの組み合わせ、
から成る群から選択される、
組換えＮＹＶＡＣベクター。
［実施態様３］
実施態様１または２の組換えＮＹＶＡＣベクターであって、ここで該ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２抗原が、配列番号：１またはそれに対して少なくとも９０％同一の配列である、
組換えＮＹＶＡＣベクター。
［実施態様４］
実施態様１～３のいずれかの組換えＮＹＶＡＣベクターであって、ここで該ベクターが、
配列番号：１、配列番号：６、配列番号：７、配列番号：８、配列番号：９、配列番号：１７、
または
配列番号：１７、配列番号：１８、配列番号：１９、配列番号：２０、配列番号：２１、配列番号：２２、配列番号：２３、配列番号：２４、配列番号：２５、配列番号：２６、配列番号：２７、配列番号：２８、配列番号：２９、配列番号：３０、配列番号：３１、配列番号：３２、配列番号：３３、配列番号：３４、配列番号：３５、配列番号：３６、または配列番号：３７の変異体ＳＡＲＳ－ＣＯＶ－２スパイクまたはＲＢＤ、
および
それらに対して少なくとも９０％同一である配列、ならびにそれらの組み合わせ、
から成る群から選択される少なくとも２種類のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２抗原をコードするポリヌクレオチドを含む、
組換えＮＹＶＡＣベクター。
［実施態様５］
実施態様１～４のいずれかの組換えＮＹＶＡＣベクターであって、ここで該ベクターが、
配列番号：１、配列番号：６、配列番号：７、配列番号：８、配列番号：９、配列番号：１７
または
配列番号：１７、配列番号：１８、配列番号：１９、配列番号：２０、配列番号：２１、配列番号：２２、配列番号：２３、配列番号：２４、配列番号：２５、配列番号：２６、配列番号：２７、配列番号：２８、配列番号：２９、配列番号：３０、配列番号：３１、配列番号：３２、配列番号：３３、配列番号：３４、配列番号：３５、配列番号：３６、または配列番号：３７の変異体ＳＡＲＳ－ＣＯＶ－２スパイクまたはＲＢＤ、
および
それらに対して少なくとも９０％同一である配列、ならびにそれらの組み合わせ、
から成る群から選択される少なくとも３種類のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２抗原をコードするポリヌクレオチドを含む、
組換えＮＹＶＡＣベクター。
［実施態様６］
実施態様１～５のいずれかの組換えＮＹＶＡＣベクターであって、ここで該ベクターが、
配列番号：１、配列番号：６、配列番号：７、配列番号：８、配列番号：９、配列番号：１７、
または、
配列番号：１７、配列番号：１８、配列番号：１９、配列番号：２０、配列番号：２１、配列番号：２２、配列番号：２３、配列番号：２４、配列番号：２５、配列番号：２６、配列番号：２７、配列番号：２８、配列番号：２９、配列番号：３０、配列番号：３１、配列番号：３２、配列番号：３３、配列番号：３４、配列番号：３５、配列番号：３６、または配列番号：３７の変異体ＳＡＲＳ－ＣＯＶ－２スパイクまたはＲＢＤ、
および
それらに対して少なくとも９０％同一である配列、ならびにそれらの組み合わせ、
から成る群から選択される少なくとも４種類のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２抗原をコードするポリヌクレオチドを含む、
組換えＮＹＶＡＣベクター。
［実施態様７］
実施態様１～６のいずれかの組換えＮＹＶＡＣベクターであって、内部リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）をさらに含む、組換えＮＹＶＡＣベクター。
［実施態様８］
実施態様１～７のいずれかの組換えＮＹＶＡＣベクターであって、少なくとも２つのＩＲＥＳを含む、組換えＮＹＶＡＣベクター。
［実施態様９］
実施態様１～８のいずれかの組換えＮＹＶＡＣベクターであって、ここで該翻訳促進要素が、配列番号：４、配列番号：１０、配列番号：１１または配列番号：１２を含む、組換えＮＹＶＡＣベクター。
［実施態様１０］
実施態様１～９のいずれかの組換えＮＹＶＡＣベクターであって、合成後期プロモーター（ＳＬＰ）をさらに含む、組換えＮＹＶＡＣベクター。
［実施態様１１］
実施態様１０の組換えＮＹＶＡＣベクターであって、ここで該ＳＬＰが配列番号：５を含む、組換えＮＹＶＡＣベクター。
［実施態様１２］
実施態様１～１１のいずれかの組換えＮＹＶＡＣベクターであって、自己開裂性蛋白質要素をさらに含む、組換えＮＹＶＡＣベクター。
［実施態様１３］
実施態様１～１２のいずれかの組換えＮＹＶＡＣであって、少なくとも２種類の自己開裂性蛋白質要素を含む、組換えＮＹＶＡＣ。
［実施態様１４］
実施態様１～１３のいずれかの組換えＮＹＶＡＣベクターおよび薬学的に許容可能な担体を含む、ワクチン組成物。
［実施態様１５］
実施態様１４のワクチン組成物であって、アジュバントをさらに含む、ワクチン組成物。
［実施態様１６］
対象においてＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２抗原に対する免疫応答を誘導する方法であって、有効量の実施態様１４または１５のワクチン組成物を該対象に投与することを含む、方法。
［実施態様１７］
実施態様１６の方法であって、ここで該ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２抗原が、
配列番号：１、配列番号：６、配列番号：７、配列番号：８、配列番号：９、配列番号：１７、
または
配列番号：１７、配列番号：１８、配列番号：１９、配列番号：２０、配列番号：２１、配列番号：２２、配列番号：２３、配列番号：２４、配列番号：２５、配列番号：２６、配列番号：２７、配列番号：２８、配列番号：２９、配列番号：３０、配列番号：３１、配列番号：３２、配列番号：３３、配列番号：３４、配列番号：３５、配列番号：３６、または配列番号：３７の変異体ＳＡＲＳ－ＣＯＶ－２スパイクまたはＲＢＤ、
および
それらに対して少なくとも９０％同一である配列、ならびにそれらの組み合わせ、
から成る群から選択される、方法。
［実施態様１８］
実施態様１６または１７の方法であって、ここで該ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２抗原が、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓ蛋白質（配列番号：１）、それに対して少なくとも９０％同一である配列、または配列番号：１の一部分である、方法。
［実施態様１９］
実施態様１６～１８のいずれかの方法であって、ここで該対象が、ヒト、シカ、ネコ、イヌ、ウシ、ミンク、フェレット、またはブタである、方法。
［実施態様２０］
実施態様１６～１９のいずれかの方法であって、ここで該組成物が注射によって投与される、方法。
［実施態様２１］
実施態様１６～１９のいずれかの方法であって、ここで該組成物が該対象に少なくとも２回投与される、方法。
［実施態様２２］
実施態様１６～１９のいずれかの方法であって、ここで該組成物が該対象に少なくとも３回投与される、方法。

Claims (22)

1. 翻訳促進要素（ＴＥＥ）および重症急性呼吸器症候群コロナウイルス２（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２）抗原をコードするポリヌクレオチドを制御可能に連結したプロモーター；
   および
   Ｋ１Ｌをコードするポリヌクレオチド（配列番号：３）に隣接するＣ７Ｌをコードするポリヌクレオチド（配列番号：２）、
   を含む、組換えＮＹＶＡＣベクター。
2. 請求項１の組換えＮＹＶＡＣベクターであって、ここで該ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２抗原が、
   配列番号：１、配列番号：６、配列番号：７、配列番号：８、配列番号：９、
   または
   配列番号：１７、配列番号：１８、配列番号：１９、配列番号：２０、配列番号：２１、配列番号：２２、配列番号：２３、配列番号：２４、配列番号：２５、配列番号：２６、配列番号：２７、配列番号：２８、配列番号：２９、配列番号：３０、配列番号：３１、配列番号：３２、配列番号：３３、配列番号：３４、配列番号：３５、配列番号：３６、または配列番号：３７の変異体ＳＡＲＳ－ＣＯＶ－２スパイクまたはＲＢＤ、
   および
   それらに対して少なくとも９０％同一である配列、ならびにそれらの組み合わせ、
   から成る群から選択される、
   組換えＮＹＶＡＣベクター。
3. 請求項２の組換えＮＹＶＡＣベクターであって、ここで該ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２抗原が配列番号：１またはそれに対して少なくとも９０％同一の配列である、組換えＮＹＶＡＣベクター。
4. 請求項２の組換えＮＹＶＡＣベクターであって、ここで該ベクターが、
   配列番号：１、配列番号：６、配列番号：７、配列番号：８、配列番号：９、配列番号：１７、
   または
   配列番号：１７、配列番号：１８、配列番号：１９、配列番号：２０、配列番号：２１、配列番号：２２、配列番号：２３、配列番号：２４、配列番号：２５、配列番号：２６、配列番号：２７、配列番号：２８、配列番号：２９、配列番号：３０、配列番号：３１、配列番号：３２、配列番号：３３、配列番号：３４、配列番号：３５、配列番号：３６、または配列番号：３７の変異体ＳＡＲＳ－ＣＯＶ－２スパイクまたはＲＢＤ、
   および
   それらに対して少なくとも９０％同一である配列、およびそれらの組み合わせ、
   から成る群から選択される少なくとも２種類のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２抗原をコードするポリヌクレオチドを含む、
   組換えＮＹＶＡＣベクター。
5. 請求項４の組換えＮＹＶＡＣベクターであって、ここで該ベクターが、
   配列番号：１、配列番号：６、配列番号：７、配列番号：８、配列番号：９、配列番号：１７、
   または
   配列番号：１７、配列番号：１８、配列番号：１９、配列番号：２０、配列番号：２１、配列番号：２２、配列番号：２３、配列番号：２４、配列番号：２５、配列番号：２６、配列番号：２７、配列番号：２８、配列番号：２９、配列番号：３０、配列番号：３１，配列番号：３２、配列番号：３３、配列番号：３４、配列番号：３５、配列番号：３６、または配列番号：３７の変異体ＳＡＲＳ－ＣＯＶ－２スパイクまたはＲＢＤ、
   および
   それらに対して少なくとも９０％同一である配列、ならびにそれらの組み合わせ
   から成る群から選択される少なくとも３種類のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２抗原をコードするポリヌクレオチドを含む、
   組換えＮＹＶＡＣベクター。
6. 請求項５の組換えＮＹＶＡＣベクターであって、ここで該ベクターが、
   配列番号：１、配列番号：６、配列番号：７、配列番号：８、配列番号：９、配列番号：１７、
   または
   配列番号：１７、配列番号：１８、配列番号：１９、配列番号：２０、配列番号：２１、配列番号：２２、配列番号：２３、配列番号：２４、配列番号：２５、配列番号：２６、配列番号：２７、配列番号：２８、配列番号：２９、配列番号：３０、配列番号：３１、配列番号：３２、配列番号：３３、配列番号：３４、配列番号：３５、配列番号：３６、または配列番号：３７の変異体ＳＡＲＳ－ＣＯＶ－２スパイクまたはＲＢＤ、
   および
   それらに対して少なくとも９０％同一である配列、ならびにそれらの組み合わせ
   から成る群から選択される少なくとも４種類のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２抗原をコードするポリヌクレオチドを含む、
   組換えＮＹＶＡＣベクター。
7. 請求項４～６の組換えＮＹＶＡＣベクターであって、内部リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）をさらに含む、組換えＮＹＶＡＣベクター。
8. 請求項５～６の組換えＮＹＶＡＣベクターであって、少なくとも２つのＩＲＥＳを含む、組換えＮＹＶＡＣベクター。
9. 請求項１の組換えＮＹＶＡＣベクターであって、ここで該翻訳促進要素が、配列番号：４、配列番号：１０、配列番号：１１または配列番号：１２を含む、組換えＮＹＶＡＣベクター。
10. 請求項１の組換えＮＹＶＡＣベクターであって、合成後期プロモーター（ＳＬＰ）をさらに含む、組換えＮＹＶＡＣベクター。
11. 請求項１０の組換えＮＹＶＡＣベクターであって、ここで該ＳＬＰが配列番号：５を含む、組換えＮＹＶＡＣベクター。
12. 請求項１の組換えＮＹＶＡＣベクターであって、自己開裂性蛋白質要素をさらに含む、組換えＮＹＶＡＣベクター。
13. 請求項１２の組換えＮＹＶＡＣであって、少なくとも２種類の自己開裂性蛋白質要素を含む、組換えＮＹＶＡＣ。
14. 請求項１の組換えＮＹＶＡＣベクターおよび薬学的に許容可能な担体を含む、ワクチン組成物。
15. 請求項１４のワクチン組成物であって、アジュバントをさらに含む、ワクチン組成物。
16. 対象においてＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２抗原に対する免疫応答を誘導する方法であって、有効量の請求項１４の組成物を該対象に投与することを含む、方法。
17. 請求項１６の方法であって、ここで該ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２抗原が、
    配列番号：１、配列番号：６、配列番号：７、配列番号：８、配列番号：９、配列番号：１７、
    または
    配列番号：１７、配列番号：１８、配列番号：１９、配列番号：２０、配列番号：２１、配列番号：２２、配列番号：２３、配列番号：２４、配列番号：２５、配列番号：２６、配列番号：２７、配列番号：２８、配列番号：２９、配列番号：３０、配列番号：３１，配列番号：３２、配列番号：３３、配列番号：３４、配列番号：３５、配列番号：３６、または配列番号：３７の変異体ＳＡＲＳ－ＣＯＶ－２スパイクまたはＲＢＤ、
    および
    それらに対して少なくとも９０％同一である配列、ならびにそれらの組み合わせ、
    から成る群から選択される、
    方法。
18. 請求項１７の方法であって、ここで該ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２抗原が、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓ蛋白質（配列番号：１）、それに対して少なくとも９０％同一である配列、または配列番号：１の一部分である、方法。
19. 請求項１６の方法であって、ここで該対象が、ヒト、シカ、ネコ、イヌ、ウシ、ミンク、フェレット、またはブタである、方法。
20. 請求項１６の方法であって、ここで該組成物が、注射、経口投与、または鼻腔内投与によって投与される、方法。
21. 請求項１６の方法であって、ここで請求項１４の組成物が該対象に少なくとも２回投与される、方法。
22. 請求項２１の方法であって、ここで請求項１４の組成物が該対象に少なくとも３回投与される、方法。
    
    

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