KR20120066559A - 돼지 유행성 설사병 바이러스의 에피토프와 로타바이러스 유전자를 발현하는 형질전환체 및 이를 포함하는 백신 조성물 - Google Patents

돼지 유행성 설사병 바이러스의 에피토프와 로타바이러스 유전자를 발현하는 형질전환체 및 이를 포함하는 백신 조성물 Download PDF

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Abstract

본 발명은 신규한 PEDV(porcine epidemic diarrhea virus) 에피토프 단백질을 암호화하는 유전자 및 로타바이러스 유전자가 작동가능하게 연결된 재조합 벡터, 및 상기 재조합 벡터로 형질전환된 형질전환체, 상기 형질전환체를 포함하는 PEDV 백신 조성물, 및 이의 제조방법에 관한 것이다. 또한, 본 발명의 형질전환체는 경구 백신으로 사용하여 PEDV 및 로타바이러스에 대하여 중화활성을 가지는 항체형성을 유도할 수 있어 PEDV 및 로타바이러스 감염을 예방 또는 치료할 수 있으며 동시에 감염되었을 때 본 발명의 형질전환체 한가지로 해결 가능한 장점을 가지고 있다. 또한 본 발명의 경구 백신은 동물성 바이러스 오염 가능성이 낮아 안전하며, 식물 형질전환체의 장기간 보관 및 이동이 가능하여 백신 제조가 용이할 뿐만 아니라 경구투여로 주사접종으로 인한 비용소모를 대폭 절감시킬 수 있다.

Description

돼지 유행성 설사병 바이러스의 에피토프와 로타바이러스 유전자를 발현하는 형질전환체 및 이를 포함하는 백신 조성물{Transformants expressing epitope of porcine epidemic diarrhea virus and rotavirus and vaccine composition containing the same}
본 발명은 신규한 PEDV(porcine epidemic diarrhea virus) 에피토프 단백질을 암호화하는 유전자 및 로타바이러스 유전자가 작동가능하게 연결된 재조합 벡터, 상기 재조합 벡터로 형질전환된 형질전환체, 상기 형질전환체를 포함하는 백신 조성물 및 이의 제조방법에 관한 것이다.
돼지 유행성 설사병(PED)은 1978년에 벨기에와 영국에서 처음 보고된 후 돼지를 생산하는 많은 국가(유럽, 일본, 중국, 한국을 포함한 아시아)에서 발생되었으며 유럽 및 아시아에서 큰 경제적 손실을 일으켰다(Pensaert 1978; Chasey 1978). 돼지유행성설사병을 일으키는 PEDV는 주로 소장 융모세포에 증식하여 융모 상피세포를 변성 또는 괴사시켜 융모의 위축과 탈락을 동반하고, 흡수장애를 초래하여 지속적인 수양성 설사를 일으킨다(Straw 2006). 돼지의 연령에 상관없이 장염을 일으키며 심한 설사와 탈수현상을 동반하고 심지어 자돈에서의 치사율은 80~90%에 이른다(Jinghui 2005).
국내에서의 돼지 유행성 설사병은 1992년에 처음으로 PED 바이러스가 분리된 이래 2년간 크게 유행한 바 있으며, TGEV(Transmissible Gastroenteritis virus)와 임상적으로 감별되지 않아 막대한 경제적 피해를 초래했다(Duarte 1994). 최근에는 PED의 단독발생보다는 TGE와 혼합감염이 증가하고 계절에 관계없이 발생하나 겨울철에 주로 빈번하게 발생한다.
그리고 로타바이러스는 포유류와 조류에서 심한 장염을 일으키는 병원체로서 구토와 설사을 보이며 특히 영유아에게 감염되면 탈수 증상으로 인해 사망에 이르게 한다(Yuan 2002). 돼지에서의 로타바이러스 감염은 초기 일령에서 발병하고 2차 세균 감염에 의해 치명적으로 악화된다.
한편, 항생제는 미생물에 의해 생성되는 가용성 유기물질로서 다른 미생물의 성장을 억제, 파괴하는 물질이다. 원래 미생물에서만 생산되었으나 현재는 공업적으로 생산되는 화합물도 항생제작용을 나타낸다. 이러한 항생제는 병원균을 억제하기 위한 의학 및 수의학적 목적으로 개발되었으나 동물의 성장 촉진 및 사료효율 개선효과도 인정되어 사료첨가제로 사용되기도 한다(Sarmah 2006).
양돈 산업에 있어서 항생제의 사용은 성장률 개선 이외에도 어린 돼지의 폐사율을 감소시키는 효과와 위생상태가 불량한 환경에서 자돈 폐사율 감소 효과로 인해 사육밀도가 높은 농장일수록 사용 효과가 크게 나타난다. 그러나 가축에 대한 무분별한 항생제의 사용으로 항생제 잔류물, 세균의 내성 증가 및 동물에서 사람으로 세균의 내성 전이 등 인체에 미치는 안전문제가 제기됨에 따라 전세계적으로 가축에 대한 사료 첨가제용 항생제 사용이 금지되고 있는 추세이다.
최근 미국 FDA에서 가축 성장을 촉진하는 항생제에 한해 제한을 권고하고 인체에 영향을 줄 수 있는 강력한 항생제에 관해서는 금지 법안검토 중이다. 국내에서도 2011년 7월부터 사료에서의 항생제첨가가 전면 금지됨에 따라 인체에 무해하고 성장효율이 우수한 사료첨가제의 개발이 시급한 실정이다.
한편, 사람이나 가축의 질병을 예방하는 방법으로 생독백신, 사독백신, 재조합백신의 접종으로 이루어진다. 생독백신과 사독백신은 병원체를 약화시키거나 죽인 것으로 적절한 접종을 시행하지 못할 경우 부작용이 나타날 수 있다. 재조합백신은 유전적으로 조작된 박테리아, 효모 또는 포유류의 세포에서 병원균의 항원성을 갖는 유전자를 분리하여 발현시킨 것을 백신으로 사용하는 것이다. 대장균에서 생산된 재조합 백신의 경우 병원체 오염의 배제와 저렴한 대량 생산비용의 이점이 있으나 동식물 단백질의 경우 대장균과의 번역 후 변형체계의 차이로 인해 면역성이 저하되기도 하며, 재조합 대장균 백신의 경구 투여 시 장의 비우호적 조건에 의해 단백질이 파괴되기도 한다(Amanda and Charles 2000; Tacket 2005). 식물과 같은 고등생물의 단백질 발현 체계를 이용할 경우 면역성 저하 문제나 장의 비우호적 조건을 회피할 수 있다(Kong 2001; Youm 2007).
식물 경구백신은 투여 시 고통과 스트레스를 동반하지 않은 쉬운 접종과 생산비용 및 저온 운반에 대한 비용 발생하지 않는 장점으로 의료 활동이 어려운 지역에 손쉬운 공급이 가능하여 경제적으로나 의료적으로 큰 효과를 가져 올 수 있다(Lamphear 2004). 그러나 식물 백신은 유전자변형체(genetically modified organism)로서 박테리아, 바이러스 또는 동물에 있는 유전자를 삽입하여 새로운 종을 만들어내는 것에는 매우 유용하나 GMO를 섭취함으로 인한 인체에 대한 안전성과 GMO 재배로 인한 유전자오염으로 환경 위해성에 대한 문제가 제기되고 있다(Uzogara 2000; Conner 2003). GMO 재배로 인한 환경에 대한 위해성을 피하고자 세대진전을 할 수 없는 유전자 변형체 종을 만들거나 식물의 꽃가루가 발생할 수 없는 상태의 기내 배양된 조직을 이용하는 방법이 주된 추세이다(Wilkinson 2003).
이러한 배경하에 본 발명자들은 새로운 PEDV의 항원유전자에 로타바이러스 유전자를 융합하여 재조합 벡터를 제조하였으며, 상기 벡터가 형질전환된 식물 형질전환체를 PEDV에 감염된 돼지에 투여 시 돼지의 설사증이 개선됨을 확인함으로써 본 발명을 완성하기에 이르렀다.
본 발명의 목적은 서열번호 1의 PEDV(porcine epidemic diarrhea virus) 에피토프 단백질을 암호화하는 유전자 및 로타바이러스 유전자가 작동가능하게 연결된 재조합 벡터를 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 상기 재조합 벡터로 형질전환된 형질전환체를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 형질전환체, 상기 형질전환체의 단백질 추출물 또는 상기 형질전환체로부터 분리된 재조합 단백질을 포함하는 PEDV 또는 로타바이러스의 백신 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 형질전환체, 상기 형질전환체의 단백질 추출물 또는 상기 형질전환체로부터 분리된 재조합 PEDV 에피토프 단백질을 포함하는 PEDV 또는 로타바이러스 감염의 예방 또는 치료용 사료 조성물 및 사료 첨가용 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 (1) 서열번호 1의 PEDV(porcine epidemic diarrhea virus) 에피토프 단백질을 암호화하는 유전자 및 로타바이러스 유전자가 작동가능하게 연결된 재조합 벡터를 제조하는 단계; (2) 상기 단계 (1)의 발현벡터를 아그로박테리아에 도입시키는 단계; 및 (3) 상기 단계 (2)의 아그로박테리아와 식물세포를 형질전환시키는 단계를 포함하는 PEDV 또는 로타바이러스 백신 제조방법을 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위한 하나의 양태로서, 본 발명은 서열번호 1의 PEDV(porcine epidemic diarrhea virus) 에피토프 단백질을 암호화하는 유전자 및 로타바이러스 유전자가 작동가능하게 연결된 재조합 벡터에 관한 것이다.
본 발명에서 용어, "PEDV(porcine epidemic diarrhea virus)"는 코로나바이러스과(coronaviridae)에 속하며 단일 가닥 RNA를 게놈(genome)으로 가지며 길이는 약 28Kb이고 3개의 주요 구성 단백질 spike 단백질(180-220KDa)과 막단백질 또는 외피 단백질 (27-32KDa) 그리고 뉴클레오캡시드 단백질(55-58KDa)을 암호화 하고 있다(Shenyang 2007). 이는 같은 종인 SARS 코로나바이러스와 유사한 구조를 가지며 트립신이 첨가된 아프리카 녹색원숭이 신장세포(Vero cell)에서 배양된다(Kim 2003; Stadler 2003; 권 2009).
본 발명에서 용어, "Spike 단백질"은 PEDV의 주요 구성 단백질로서, 목표 세포를 인식하고 바이러스와 세포막(cellular membrane)를 융합시키는 생물학적으로 중요한 기능을 가지고 있다(Chang 2002). spike 단백질의 일부인 COE(CO-26K fragment equivalent) 유전자를 약독화 항원결정기(neutrali zation epitope)로 이용할 수 있다.
본 발명에서 용어, "에피토프"는 특정 항체에 의해 인식되는 항원결합부위의 아미노산 잔기 세트, 또는 T 세포에서는 T 세포 수용체 단백질 및/또는 주요 조직적합성 복합체 (Major Histocompatibility Complex, MHC) 수용체에 의해 인식되는 잔기이다. 에피토프는 항체, T 세포 수용체 또는 HLA 분자에 의해 인식되는 부위를 형성하는 분자로, 일차, 이차 및 삼차 펩티드 구조, 또는 전하를 의미한다.
본 발명에서 용어, "벡터"는 숙주 세포로 염기의 클로닝 및/또는 전이를 위한 임의의 매개물을 말한다. 벡터는 다른 DNA 단편이 결합하여 결합된 단편의 복제를 가져올 수 있는 복제단위 (replicon)일 수 있다. "복제단위"란 생체 내에서 DNA 복제의 자가 유닛으로서 기능하는, 즉, 스스로의 조절에 의해 복제가능한, 임의의 유전적 단위 (예를 들면, 플라스미드, 파지, 코스미드, 염색체, 바이러스)를 말한다. 용어 "벡터"는 시험관 내, 생체 외 또는 생체 내에서 숙주 세포로 염기를 도입하기 위한 바이러스 및 비 바이러스 매개물을 포함한다. 용어 "벡터"는 또한 미니구형 DNA를 포함할 수 있다. 예를 들면, 상기 벡터는 박테리아 DNA 서열을 갖지 않는 플라스미드일 수 있다. CpG 영역에서 풍부한 박테리아 DNA 서열의 제거는 전이유전자 발현 사일런싱을 감소시키고 플라스미드 DNA 벡터로부터 보다 지속적인 발현을 가져오기 위해 행해지고 있다. 용어 "벡터"는 또한 슬리핑 뷰티(Sleeping Beauty)같은 트랜스포존(Izsvak et al. J. MoI. Biol. 302:93-102 (2000)), 또는 인공 염색체를 포함할 수 있다.
본 발명에서 용어, "로타바이러스"는 Reoviridae에 속하며 11개 단편 이중 가닥 RNA를 게놈으로 갖고 6개의 구조 단백질과 6개의 비구조 단백질을 암호화 하고 있다. 2개의 외피 캡시드 단백질인 VP4와 VP7은 개별적으로 약독화 항체를 끌어내어 면역을 유도하며 P(단백질 분해효소 민감성)와 G(당단백질) 두 개의 항원형(serotype)으로 구분할 수 있다. 바이러스 분자 표면 있는 VP4는 세포와 결합하는 수용체와 세포에 침입을 포함한 바이러스와 세포간의 상호작용에 있어서 중요한 기능을 한다. VP4를 트립신 처리하면 특이적으로 VP5와 VP8로 나뉘며 VP8은 바이러스의 혈구응집소(hemagglutin)를 포함하며 VP5는 내부에 소수성(hydrophobic) 부분을 가지고 있어 바이러스가 세포에 침투할 수 있는 능력이 있다.
본 발명의 일 실시예에서는 PEDV spike 단백질의 일부이며 항원성이 있는 COE 유전자를 클로닝하기 위해서, 기존에 사용되는 Brl/27 strain이 아닌 KPEDV-9 strain에서 새로운 COE 유전자 즉, PEDV 에피토프를 얻었다.
상기 본 발명의 PEDV 에피토프 단백질은 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하며, 서열번호 2의 염기서열을 갖는 것이 바람직하다. 더욱 바람직하게 PEDV 에피토프 단백질을 암호화하는 유전자는 서열번호 2의 염기중 148번째 염기가 구아닌, 151번째 염기가 시토신으로 변형된 것인 서열번호 3으로 표시되는 염기서열일 수 있다.
또한, 상기 PEDV 에피토프 단백질을 암호화하는 유전자에는 spike 단백질의 c-말단에 존재하는 단백질의 일부를 암호화하는 유전자가 융합될 수 있으며, 바람직하게는 서열번호 4의 아미노산을 암호화하는 유전자가 융합되는 것이다. 보다 바람직하게는, 서열번호 5로 표시되는 염기서열이 융합되는 것이다
본 발명의 재조합 벡터에서 융합된 상기 로타바이러스 유전자는 VP8 유전자 또는 BVP5 유전자가 바람직하며, 더욱 바람직하게는 서열번호 6 또는 7의 염기서열을 갖는 유전자이다.
본 발명의 일 실시예에서는 서열번호 1의 PEDV 에피토프 COE 단백질을 암호화하는 유전자 및 로타바이러스의 VP8 유전자 및 COEGY가 결합된 항원을 PER08, BVP5 유전자 및 COEGY가 결합된 항원을 PER05로 표기하였다.
상기 PERO8은 서열번호 22, PERO5는 서열번호 23의 염기서열로 이루어진 것이 바람직하다.
또 다른 하나의 양태로서, 본 발명은 상기 재조합 벡터로 형질전환된 형질전환체에 관한 것이다.
보다 구체적으로, 서열번호 1의 PEDV 에피토프 단백질 및 로타바이러스 유전자가 발현되는 재조합 벡터가 형질전환된 형질전환체에 관한 것이다. 상기 PEDV 에피토프 단백질에는 서열번호 3의 아미노산이 융합될 수 있다. 즉, 서열번호 1과 서열번호 3의 아미노산을 암호화하는 유전자 및 서열번호 6 또는 7의 로타바이러스 유전자가 작동가능하게 연결된 재조합 벡터가 형질전환된 형질전환체를 포함한다. 바람직하게는 서열번호 22 또는 23의 유전자가 발현되는 형질전환체이다.
본 발명에서 용어, “형질전환”은 외부로부터 주어진 DNA에 의하여 생물의 유전적인 성질이 변하는 것으로, 즉 생물의 어떤 계통의 세포에서 추출된 핵산의 일종인 DNA를 다른 계통의 살아있는 세포의 주었을 때 DNA가 그 세포에 들어가서 유전형질이 변화하는 현상으로 형질변환?형전환 또는 형변환 등이라고도 한다.
본 발명에서 용어, “형질전환체”는 형질전환으로 인해 생성된 형질전환식물 또는 형질전환동물을 의미하며, 유전자 재조합 기술을 이용하여 특정 유전자의 변형 또는 변이가 유발되어 생성된 유전자재조합체를 포함한다. 바람직하게 본 발명의 형질전환체는 식물세포 유래의 형질전환체일 수 있다.
본 발명에서 용어, “식물세포”는 식물체를 구성하는 기본이 되는 단위로, 식물 조직의 배양 세포, 배양 조직, 배양기관 또는 전체 식물일 수 있으며, 바람직하게 배양 세포, 배양 조직 또는 배양 기관일 수 있고, 더욱 바람직하게는 배양 세포의 가능한 모든 형태일 수 있으며, 가장 바람직하게는 당근 유래의 세포일 수 있다.
본 발명에서 용어, “식물 조직”은 분화된 또는 미분화된 식물의 조직, 예를 들면 이에 한정되진 않으나, 뿌리, 줄기, 잎, 꽃가루, 종자, 암 조직 및 배양에 이용되는 다양한 형태의 세포들, 즉 단일 세포, 원형질체(protoplast), 싹 및 캘러스 조직을 포함한다. 식물 조직은 인 플란타(in planta)이거나 기관 배양, 조직 배양 또는 세포 배양 상태일 수 있다.
본 발명에서 용어, "재조합"은 세포가 이종의 핵산을 복제하거나, 상기 핵산을 발현하거나 또는 펩티드, 이종의 펩티드 또는 이종의 핵산에 의해 암호화된 단백질을 발현하는 세포를 지칭하는 것이다. 재조합 세포는 상기 세포의 천연 형태에서는 발견되지 않는 유전자 또는 유전자 절편을, 센스 또는 안티센스 형태 중 하나로 발현할 수 있다. 또한 재조합 세포는 천연 상태의 세포에서 발견되는 유전자를 발현할 수 있으며, 상기 유전자는 변형된 것으로써 인위적인 수단에 의해 세포 내 재도입된 것이다. 본 발명의 일 실시예에서는 PEDV 에피토프 단백질을 암호화하는 유전자 및 spike 단백질의 일부 서열을 암호화하는 유전자가 융합된 서열에 로타바이러스의 서열 중 일부가 결합된 항원을 작동가능하게 연결한 벡터를 제작하고, 상기 벡터를 형질전환한 형질전환체를 제작하였다. 본 발명의 형질전환체는 당업계에 공지된 형질전환에 이용될 수 있는 세포이면 제한없이 당업자에 의해 적절하게 선택되어 사용될 수 있으며, 본 발명의 형질전환체는 아그로박테리움, 대장균 또는 형질전환 식물일 수 있고, 바람직하게 상기 형질전환체는 식물세포일 수 있으며, 더욱 바람직하게는 담배, 애기장대, 감자, 상추, 무, 배추, 토마토, 콩, 쌀, 보리, 밀, 옥수수 및 당근으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 형질전환체 일 수 있으며, 가장 바람직하게 상기 형질전환체는 당근에 형질전환된 것이다.
또 다른 하나의 양태로서, 본 발명은 본 발명의 형질전환체, 상기 형질전환체의 단백질 추출물 또는 상기 형질전환체로부터 분리된 재조합 PEDV 에피토프 단백질을 포함하는 PEDV 또는 로타바이러스의 백신 조성물에 관한 것이다.
본 발명에서 용어, “형질전환체” 및 “PEDV 에피토프 단백질”은 상기에서 설명한 바와 같다.
본 발명에서 용어, “백신”은 생체에 면역을 주는 항원을 함유한 생물학적인 제제로서, 감염증의 예방을 위하여 사람이나 동물에 주사하거나 경구투여함으로써 생체에 면역이 생기게 하는 면역원 또는 항원성 물질을 말한다. 생체내 면역은 병원균의 감염 후에 생체내 면역력이 자동으로 얻어지는 자동면역과 외부에서 주입한 백신에 의하여 얻어지는 수동 면역으로 크게 나누어진다. 자동면역이 면역에 관계하는 항체의 생성 기간이 길고 지속적인 면역력의 특징이 있는 반면, 백신에 의한 수동 면역은 감염증 치료에 즉시 작용하나 지속력이 떨어지는 단점이 있다.
본 발명에서 용어, “면역원” 또는 “항원성 물질”은 펩티드, 폴리펩티드, 상기 폴리펩티드를 발현하는 유산균, 단백질, 상기 단백질을 발현하는 유산균, 올리고뉴클레오티드, 폴리뉴클레오티드, 재조합 박테리아 및 재조합 바이러스로 구성된 군에서 선택된 어느 하나인 것을 특징으로 할 수 있다. 구체적인 예를 들면, 상기 항원 물질은 불활성화된 전체 또는 부분 세포 제제 형태, 또는 통상적인 단백질 정제, 유전 공학 기법 또는 화학 합성에 의해 수득되는 항원 분자 형태일 수 있다. 바람직하게 본 발명의 항원성 물질은 돼지에서 유행성 설사병을 유발하는 PEDV일 수 있고, 더욱 바람직하게는 상기 PEDV 유래 COE 단백질을 암호화하는 유전자 서열 및 spike 단백질의 C-말단에 존재하는 유전자 서열이 융합된 항원에 로타바이러스의 항원성을 나타내는 VP8 및 BVP5의 서열이 작동가능하게 연결된 것일 수 있으며, 가장 바람직하게 서열번호 1의 아미노산 서열을 암호화하는 유전자 및 서열번호 3의 아미노산 서열을 암호화하는 유전자가 융합된 형태의 항원에 서열번호 5 또는 서열번호 6으로 표시되는 로타바이러스 서열이 융합된 항원이다.
상기 항원의 함량은 백신 조성물 총 중량에 대해서 1 내지 10 중량%일 수 있으며, 바람직하게는 5% 중량 이내일 수 있다.
본 발명에 따른 백신 조성물은 안정제, 유화제, 수산화알루미늄, 인산알루미늄, pH 조정제, 계면활성제, 리포솜, 이스콤(iscom) 보조제, 합성 글리코펩티드, 증량제, 카복시폴리메틸렌, 세균 세포벽, 세균 세포벽의 유도체, 세균백신, 동물 폭스바이러스 단백질, 서브바이랄(subviral) 입자 보조제, 콜레라 독소, N, N-디옥타데실-N',N'-비스(2-하이드록시에틸)-프로판디아민, 모노포스포릴 지질 A, 디메틸디옥타데실-암모늄 브로마이드 및 이의 혼합물로 구성된 군에서 선택된 어느 하나 이상의 제 2 보조제를 추가로 함유하는 것을 특징으로 할 수 있다.
또한, 본 발명의 백신 조성물은 수의학적으로 허용 가능한 담체를 포함할 수 있다. 본 발명에서 용어, "수의학적으로 허용 가능한 담체"란 임의의 및 모든 용매, 분산 매질, 코팅제, 항원보강제, 안정제, 희석제, 보존제, 항균제 및 항진균제, 등장성 작용제, 흡착지연제 등을 포함한다. 백신용 조성물에 포함될 수 있는 담체, 부형제, 희석제로는 락토즈, 덱스트로스, 슈크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 말티톨, 전분, 글리세린, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘포스페이트, 칼슘실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로즈, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 들 수 있다.
또한, 본 발명의 백신용 조성물은 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형 및 멸균 주사용액의 형태로 제형화하여 사용될 수 있다. 제제화할 경우에는 보통 사용되는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제할 수 있다. 경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 상기 레시틴 유사 유화제에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 칼슘카보네이트(calcium carbonate), 슈크로스(sucrose) 또는 락토오스(lactose), 젤라틴 등을 섞어 조제할 수 있다. 또한 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스티레이트 탈크 같은 윤활제들도 사용할 수 있다. 경구투여를 위한 액상제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등을 사용할 수 있으며, 흔히 사용되는 단순 희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비 경구투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수용성제, 현탁제, 유제, 동결건조제제가 포함된다. 비수용성제제, 현탁제로는 프로필렌글리콜(propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다.
또한 본 발명은, 상기 백신용 조성물을 인간을 제외한 동물에 주입하여 항원에 대한 항체 생성률을 높이는 방법에 관한 것이다.
본 발명에서 용어, "인간을 제외한 동물"은 포유류 또는 조류인 것을 특징으로 할 수 있고, 상기 "주입"은 피하주사, 근육내 주사, 피하내 주사, 복막내 주사, 비강투여, 구강투여, 경피투여 및 경구투여로 구성된 군에서 선택된 어느 하나의 방법으로 수행되는 것을 특징으로 할 수 있다. 바람직하게 본 발명의 백신은 경구용 백신일 수 있다.
또한, 본 발명에서 용어, "주사" 또는 "투여"는 투여대상의 나이, 성별, 체중 등에 따라 투여량이 달라질 수 있고, 투여경로, 질병의 정도, 성별, 체중, 나이 등에 따라서도 백신의 투여량이 달라질 수 있다. 본 발명의 백신용 면역증강제는 비경구, 점막(경구 및 비강 등) 및 경피성 경로에 의한 백신 투여시 함께 사용할 수 있다. 본 발명의 일 실시예에서는 본 발명의 항원으로 제조된 백신을 PEDV 감염된 돼지에 투여하고, 설사지수, 항체역가, 및 해부를 통한 PEDV 감염여부를 확인한 결과, 본 발명의 PEDV 항원을 포함하는 백신을 투여한 그룹에서 설사증이 완화되었으며, 항체 역가도 높았고, 해부를 통한 육안검사에서도 PEDV 감염 증상이 완화되는 것을 확인하였다. 이러한 효과는, 본 발명의 PEDV 백신의 투여 및 상기 항원으로 형질전환된 형질전환 당근을 동시에 투여한 경우, 더욱 강화되는 것을 확인할 수 있었다.
또 다른 하나의 양태로서, 본 발명은 본 발명의 형질전환체를 포함하는 PED V 또는 로타바이러스 감염의 예방 또는 치료용 사료 조성물에 관한 것이다.
본 발명에서 용어, “예방”은 본 발명의 PEDV 에피토프 단백질 및 로타바이러스를 발현하는 형질전환체 또는 상기 형질전환체를 유효성분으로 하는 조성물의 투여로 상기 PEDV 또는 로타바이러스의 감염을 억제 또는 지연시키는 모든 행위를 말한다.
본 발명에서 용어, “치료”는 본 발명의 PEDV 에피토프 단백질 및 로타바이러스를 발현하는 형질전환체 또는 상기 형질전환체를 유효성분으로 하는 조성물의 투여로 상기 PEDV 또는 로타바이러스의 감염 증상이 호전되거나 이롭게 되는 모든 행위를 말한다.
본 발명에서 사용한 사료 조성물은 본 발명에 따른 사료 첨가제를 유효성분으로 포함하는 한 당업계에 공지된 다양한 형태의 조성비로 당업자에 의해 적절하게 구성될 수 있으며, 바람직하게는 단백질 20%, 지방, 에테르 추출물 4.5%, 지방, 산 가수분해 5.4%, 조섬유질 4.7%, 회분 6%, 칼슘 0.80% 및 인산염 0.62%를 포함하는 사료 조성물일 수 있다.
또한, 본 발명은 본 발명의 본 발명의 형질전환체, 상기 형질전환체의 단백질 추출물 또는 상기 형질전환체로부터 분리된 재조합 단백질을 포함하는 PEDV 또는 로타바이러스 감염의 예방 또는 치료용 사료 첨가용 조성물에 관한 것이다.
본 발명의 사료 첨가용 조성물은 당업계에 공지된 다양한 형태로 제조될 수 있으며, 바람직하게는 PEDV 항원 및 로타바이러스 유전자의 일부가 형질전환된 형질전환체를 포함하는 것을 특징으로 하는 것인 사료 첨가제일 수 있다.
본 발명에 따른 사료 첨가제는 개별적으로 사용될 수 있고 종래 공지된 사료 첨가제와 병용하여 사용될 수 있고 종래의 사료첨가제와 순차적 또는 동시에 사용될 수 있다. 그리고 단일 또는 다중 투여될 수 있다. 상기 요소를 모두 고려하여 부작용 없이 최소한의 양으로 최대 효과를 얻을 수 있는 양을 투여하는 것이 중요하며, 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다.
본 발명의 사료용 조성물을 적용할 수 있는 개체는 특별히 한정되지 않고, 어떠한 형태의 것이든 적용 가능하다. 예를 들면, 닭, 돼지, 원숭이, 개, 고양이, 토끼, 모르모트, 래트, 마우스, 소, 양, 염소 등과 같은 동물에 제한없이 적용가능하며, 본 발명의 일 실시예에 따르면 상기 사료 조성물을 PEDV 감염 돼지의 사료 조성물로 첨가한 경우, 설사 지수가 완화되었으며, PEDV에 대한 항체 역가가 증가하였고, 해부를 통한 육안검사에서도 PEDV 감염 증세가 완화되는 것을 확인하였다.
또 다른 하나의 양태로서, 본 발명은 (1) 본 발명의 PEDV(porcine epidemic diarrhea virus) 에피토프 단백질을 암호화하는 유전자 및 로타바이러스 유전자가 작동가능하게 연결된 재조합 벡터를 제조하는 단계; (2) 상기 단계 (1)의 발현벡터를 아그로박테리아에 도입시키는 단계; 및 (3) 상기 단계 (2)의 아그로박테리아와 식물세포를 형질전환시키는 단계를 포함하는 PEDV 백신 제조방법에 관한 것이다.
본 발명에서 용어 “PEDV”, “에피토프 단백질” 및 “로타바이러스 유전자”는 상기에서 설명한 바와 같다.
또한, 본 발명에서 용어, “작동가능하게 연결된”은 상기에서 설명한 바와 같다.
상기 단계 (1)은 본 발명의 PEDV(porcine epidemic diarrhea virus) 에피토프 단백질을 암호화하는 유전자 및 로타바이러스 유전자가 작동가능하게 연결된 재조합 벡터를 제조하는 단계에 관한 것이다. PEDV(porcine epidemic diarrhea virus) 에피토프 단백질을 암호화하는 유전자는 PEDV 항원성을 가진 서열을 포함하는 부위이면 제한없이 선택될 수 있으며, 바람직하게는 서열번호 2로 표시되는 염기서열일 수 있고, 더욱 바람직하게 상기 유전자는 148번째 염기가 구아닌, 151번째 염기가 시토신으로 변형된 것일 수 있다. 또한, 상기 로타바이러스 유전자는 로타바이러스의 항원성을 갖는 서열이면 당업자에 의해 적절하게 변형되어 선택될 수 있으며, 바람직하게 로타바이러스 VP8 유전자 또는 BVP5 유전자일 수 있으며, 더욱 바람직하게 상기 VP8 유전자는 서열번호 5일 수 있고, 상기 BVP5 유전자는 서열번호 6인 염기서열을 포함할 수 있다.
상기 단계 (2) 및 단계 (3)은 단계 (1)의 발현벡터를 아그로박테리아에 도입시키는 단계; 및 아그로박테리아와 식물세포를 형질전환시키는 단계를 포함하는 PEDV 백신 제조방법에 관한 것이다.
본 발명의 발현벡터를 아그로박테리아에 형질도입시키는 방법은 당업계에 공지된 방법을 당업자에 의해 적절하게 변형되어 적용될 수 있으며, 바람직하게 본 발명에서는 아그로박테리아 튜머파시엔스 GV3101에 본 발명의 재조합 벡터를 freeze-thaw 방법을 이용하여 형질전환하였다. 또한, 상기 백신제조방법은 당업계에 공지된 백신의 제조방법에 따라, 본 발명의 항원 조성물을 적절한 중량 %로 첨가하여 제조할 수 있으며, 바람직하게 백신 조성물 총 중량에 대해서 1 내지 10 중량%일 수 있으며, 바람직하게는 5% 중량이내 일 수 있다.
본 발명의 PEDV 에피토프 단백질 및 로타바이러스 항원이 형질전환된 식물 형질전환체는 경구 백신으로 사용하여 PEDV와 로타바이러스에 대하여 중화활성을 가지는 항체형성을 유도할 수 있어 PEDV 또는 로타바이러스의 감염을 예방 할 수 있으며 동시에 감염되었을 때 설사 방제에 효율적으로 활용될 수 있다. 또한 아직 조직이 형성되기 전의 상태이기 때문에 도입된 외래유전자 발현에 의해 식물생장에 영향을 받을 수 있는 문제를 해결 할 수 있는 장점이 있다. 아울러 본 발명의 경구 백신은 동물성 바이러스 오염 가능성이 낮아 안전하며, 식물 형질전환체의 장기간 보관 및 이동이 가능하여 백신 제조가 용이할 뿐만 아니라 경구투여로 주사접종으로 인한 비용소모를 대폭 절감시킬 수 있다.
도 1은 PCR 반응으로 얻은 COE 항원 유전자(430bp) 산물을 전기영동으로 확인한 결과를 나타낸 것이다(A). 또한 Topo-vector에 PCR 산물이 삽입되었는지 여부를 나타낸 것이다(B).
도 2는 NCBI blast 검색을 통해 증폭된 COE 항원 유전자의 얼라이먼트(Alignmnet)를 나타낸 것이다.
도 3은 엑스파시(expasy)에 의한 PEDV 내 아미노 서열의 다중 얼라인먼트를 나타내는 도이다.
도 4는 위치-특이적 돌연변이 COE(mCOE) 항원 유전자의 1% 아가로스 겔 전기영동 및 pENTR/D/TOPO-COE 플라스미드 DNA에 의해 증폭된 후 GPRLQPY 아미노 서열(mCOEGY) 항원 유전자(469bp) 재조합체를 나타내는 도이다(A). BglⅡ 및 EcoRⅤ으로 절단된 2.7Kb 및 0.28Kb의 두 가지 산물의 Topo-벡터(게이트웨이) 내로 mCOE의 삽입을 나타내는 도이다(B). NotⅠ및 BglⅡ로 절단된 2.7Kb 및 0.32Kb의 두 가지 산물의 Topo-벡터(게이트웨이) 내로 mCOE의 삽입을 나타내는 도이다(C).
도 5는 PCR 반응으로 얻은 COE 항원 유전자(430bp) 산물을 전기영동으로 확인한 결과를 나타낸 것이다(A). 또한 Topo-vector에 PCR 산물이 삽입되었는지 여부를 나타낸 것이다(B).
도 6은 재조합 PCR로 증폭한 PER08(mCOEGY::VP8) 974bp 및 PER05(mCOEGY::BVP5)의 아가로스 겔 전기영동 결과를 나타낸다(A). BglⅡ 및 HindⅢ로 절단된 pENTR/D/TOPO-PER08의 0.47 및 3.1Kb DNA 단편을 나타낸다(B). M; 1Kb+DNA 마커, #1~10; TOP10 코로니에서pENTR/D/TOPO-PER08. TOP10 콜로니에서 PCR에 의한 pENTR/D/TOPO-PER05의 검출을 확인하였다. M; 1Kb+DNA 마커, #1~10; TOP10 코로니에서pENTR/D/TOPO-PER05. 붉은색 원(○)은 전체 서열을 나타낸다.
도 7은 제한효소 SpeⅠ을 처리하여 pK2GW7.0으로 PERO8이 삽입되었지를 확인한 결과를 나타낸 것이며, 0.6Kb 및 0.15Kb의 밴드를 확인하였다.
도 8은 아그로박테리움 튜머파시엔스 GV3101 구조 유전자의 콜로니 PCR 결과를 나타내는 도면이다. PER05(952bp)의 삽입 결과.
도 9는 대장균에서 mCOEGY 항원 발현의 구조를 나타내는 결과이다. 제한효소 Mlu Ι을 처리하여 4.2Kb 및 0.9Kb의 밴드를 pENTR/SD/D-topo(게이트웨이)에서 확인하였다.
도 10은 대장균의 pDEST 발현 시스템에서 mCOEGY의 발현을 확인한 결과이다(A). mCOEGY의 항혈청을 웨스턴 분석으로 확인하였다(B).
도 11은 대장균에서 VP4 항원 발현의 구조를 나타내는 결과이다. 제한효소 EcoRⅤ을 처리하여 3.8Kb 및 265bp의 밴드를 pENTR/SD/D-topo(게이트웨이)에서 확인하였다.
도 12는 대장균의 pDEST 발현 시스템에서 VP4의 발현을 확인한 결과이다(A). VP4의 항혈청을 웨스턴 분석으로 확인하였다(B).
도 13은 genomic DNA PCR에 의해 형질전환된 당근 캘러스에서 도입된 항원 유전자의 모형을 나타낸다. PER08(mCOEGY::VP8) 973bp.
도 14는 PERO8 (mCOEGY::VP8)로 형질전환된 당근 캘러스 유전자의 RT-PCR 분석을 나타내는 결과이다.
이하, 하기 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세하게 설명하기로 한다. 이들 실시예는 단지 본 발명을 예시하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지는 않는다.
실시예 1: PEDV 단일 항원유전자의 클로닝
1-1) Virus RNA 추출 및 cDNA 합성
PEDV의 생독백신(KPEDV-9, 고려비앤피 사)에서 QIAamp MinEluteVirus Spin Kit(Qiagen 사)를 이용하여 RNA를 추출하였다. 추출한 1㎍ RNA 및 50 pmol Anchored-oligo(dT)18 프라이머 2㎕와 멸균 증류수를 혼합하여 총 13㎕의 용액을 만든 후 65℃에서 10분간 반응시켰다. 그런 후, 5X 역전사 효소 반응 완충액 4㎕, 40U 단백질 분해효소 억제제 0.5㎕, 10mM dNTP(Deoxynucleotide) mix 2㎕, 20U 역전사 효소 0.5㎕(Transcriptor First Strand cDNA Synthesis Kit, Roche 사)을 더하여 50℃에서 1시간, 85℃에서 5분간 PCR을 이용하여 cDNA를 합성하였다.
1-2) 프라이머 합성
돼지 유행성 설사병 바이러스(PEDV) spike 단백질의 일부이며 항원성이 있다고 알려진 COE(CO-26K fragment equivalent, 15KDa)유전자와 spike 단백질의 c-terminal에 존재하는 아미노산서열(GPRLQPY)을 항원으로 선택하고 NCBI (National Center for Biotechnology Information, www.ncbi.nlm.gov/) 의 gene bank 검색을 토대로 프라이머(서열번호 8 내지 15)를 작성하였다(표 1).
Figure pat00001
1-3) PCR 클로닝
PEDV의 cDNA에서 COE(CO 26K equivalent) 유전자를 얻기 위하여 다음과 같은 조건에서 PCR을 수행하였다; 1ug PEDV cDNA, 10X pfu 반응 완충액 5㎕, 10mM dNTP 1㎕, 100pmol PEDs 5' 프라이머(서열번호 8) 1㎕, 100pmol PEDs 3' 프라이머(서열번호 9) 1㎕, 2.5U pfu 폴리머라제 0.5㎕(solgent 사); 95℃ 2분, 95℃ 20초, 60℃ 40초, 72℃ 2분, 72℃ 5분, 35cycle.
얻어진 PCR 산물은 1% TAE 아가로스젤을 이용한 전기영동을 통해 확인하였다(도 1A). 얻어진 밴드는 pENTRTM/D-TOPO(invitrogen 사)에 삽입하여 TOP10에 형질전환하였다. 플라스미드 DNA를 분리하고, Bgl II와 EcoR I 제한효소를 이용하여 3개의 콜로니에서 예상된 252bp와 2752bp크기의 밴드를 확인하였다(도 1B). 확인된 3개의 플라스미드 DNA를 염기서열 분석 의뢰하여 KPEDV-9 균주의 COE 유전자의 염기서열 정보를 확인하였다. KPEDV-9 COE 유전자의 염기서열 정보를 토대로 NCBI BLAST를 한 결과 다른 PEDV의 바이러스주들과 95% 이상의 상동성을 가짐을 알 수 있었다. 또한 KPEDV-9 COE 유전자와 다른 바이러스주의 spike 단백질 지역들의 아미노산서열을 alignment 비교분석하여 변이 지역(variable region)을 확인하였다(도 2 및 3).
또한 COE 유전자의 mRNA를 불안정하게 하는 ATTTA 염기서열을 당근 코돈 선호도에 맞춰 GTTCA로 위치-특이적 돌연변이하기 위하여 PCR을 다음과 같은 조건으로 수행하였다; 20ng pENTR/D /TOPO-COE, 10X fu 반응 완충액 5㎕, 10mM dNTP 1㎕, 100pmol PEDs 5' 프라이머(서열번호 8) 1㎕, 100pmol PEDs(mut) 5' 프라이머(서열번호 10) 1㎕, 100pmol PEDs(mut) 3' 프라이머(서열번호 9) 1㎕, 100pmol PEDs 3' 프라이머(서열번호 11) 1㎕ 및 2.5U pfu 폴리머라제 0.5㎕; 95℃ 2분, 95℃ 20초, 58℃ 40초, 72℃ 2분, 72℃ 5분, 35cycle.
mCOE(돌연변이된 COE) PCR 산물은 1% TAE 아가로스젤에 전기영동한 후 HiYieldTMGel/PCR DNA 추출 키트(RBC 사)를 이용하여 DNA를 얻었고, 이를 pENTR/D/TOPO (invitrogen사)에 라이게이션 후 Not I과 Bgl II 제한효소로 절단하여 전기영동으로 확인하였다. 그런 후 코스모진텍에 염기서열분석을 의뢰하여 돌연변이된 염기서열을 alignment (http://www.expasy.ch/)를 통해 확인하였다.
또한 mCOE 유전자에 GPRLQPY (GGTCCTAGACTTCAACCTTAC; 서열번호 5)을 재조합하기 위하여 다음과 같은 조건에서 PCR하였다; 20ng pENTR/D/TOPO-mCOE, 10X fu 반응 완충액 5㎕, 10mM dNTP 1㎕, 100pmol COE(fus) 5' 프라이머(서열번호 12) 1㎕, 100pmol COE(fus) 3' 프라이머(서열번호 13) 1㎕, 100pmol COE(c-ter) 5' 프라이머(서열번호 14) 1㎕, 100pmol COE(c-ter) 3' 프라이머(서열번호 15) 1㎕ 및 2.5U pfu 폴리머라제 0.5㎕; 95 2분, 95℃ 20초, 58℃ 40초, 72℃ 2분, 72℃ 5분, 35cycle.
mCOEGY(돌연변이된 COE GPRLQPY 아미노산 염기서열) PCR 산물은 1% TAE 아가로스젤에 전기영동한 후 HiYieldTMGel/PCR DNA Extraction Kit(RBC 사)를 이용하여 DNA를 얻었고 이를 pENTR/D/TOPO (invitrogen사)에 ligation 후 Bgl II와 EcoR V 제한효소로 절단하여 전기영동으로 확인하였다(도 4A). 그런 후 코스모진텍에 염기서열 분석의뢰하여 GPRLQPY 아미노산 서열(서열번호 3)이 재조합된 것을 alignment (http://www.expasy.ch/)를 통해 확인하였다.
아가로스 젤에서 분리한 mCOE와 mCOEGY 유전자를 pENTR/D/TOPO 벡터에 삽입하여 TOP10에 형질전환하고 항생제 배지에서 선발된 콜로니에서 플라스미드 DNA를 추출하였고 pENTR/D/TOPO-mCOE는 BglII와 EcoRV 제한효소 처리 후 예상된 289bp와 2717bp 밴드를 확인하였고 염기서열 분석하여 9번을 최종선발하였다(도 4B).
pENTR/D/TOPO-mCOEGY는 NotI과 BglII 제한 효소를 처리하여 320bp와 2725bp의 예상된 밴드를 확인하였고 염기서열 분석결과 3번의 콜로니가 최종 선발되었다(도 4C).
실시예 2: PEDV와 로타바이러스 항원유전자 융합 및 클로닝
2-1) 프라이머 합성
돼지에 장염을 일으키는 PEDV와 로타바이러스의 융합경구백신을 만들기 위하여 mCOEGY 유전자와 로타바이러스의 항원인 VP8, BVP5(bridge VP5)를 재조합 PCR 법으로 각각 융합하기 위하여 프라이머(서열번호 16 내지 21)를 작성하였다(표 2).
Figure pat00002
2-2) 재조합 PCR 클로닝
mCOEGY와 VP8, mCOEGY와 BVP5를 융합하기 위하여 총 4번의 PCR을 다음과 같은 조건에서 수행하였다. 또한 항원과 항원단백질의 유연성을 가질 수 있도록 Hinge(GPGP)를 추가하였다.
① 20ng pENTR/D/TOPO-mCOEGY , 10X fu 반응 완충액 5㎕, 10mM dNTP 1㎕, 100pmol COE(fus) 5' 프라이머 1㎕, 100pmol mCOEGY::VP8 3' 프라이머 1㎕, 2.5U pfu 폴리머라제 0.5㎕.
② 20ng pENTR/D/TOPO-VP8 , 10X fu 반응 완충액 5㎕, 10mM dNTP 1㎕, 100pmol mCOEGY::VP8 5' 프라이머 1㎕, 100pmol syn::VP8 3' 프라이머 1㎕, 2.5U pfu 폴리머라제 0.5㎕.
③ 20ng pENTR/D/TOPO-mCOEGY , 10X fu 반응 완충액 5㎕, 10mM dNTP 1㎕, 100pmol COE(fus) 5' 프라이머 1㎕, 100pmol mCOEGY::BVP5 3' 프라이머 1㎕, 2.5U pfu 폴리머라제 0.5㎕.
④ 20ng pENTR/D/TOPO BVP5 , 10X fu 반응 완충액 5, 10mM dNTP 1㎕, 100pmol mCOEGY::BVP5 5' 프라이머 1㎕, 100pmol syn BVP5 3' 프라이머 1㎕ 2.5U pfu 폴리머라제 0.5㎕; 95℃ 2분, 95℃ 30초, 60℃ 30초, 72℃ 30초, 72℃ 5분, 30cycle. 얻어진 PCR 산물들은 1% TAE 아가로스 젤에 전기영동한 후 HiYieldTMGel/PCR DNA 추출 키트(RBC 사)를 이용하여 DNA를 얻어냈다.
젤에서 추출한 ①,②번 DNA를 주형으로 하여 10X fu 반응 완충액 5㎕, 100pmol COE(fus) 5' 프라이머 1㎕, 100pmol syn VP8 3' 프라이머 1㎕, 2.5U pfu 폴리머라제 0.5㎕; 95℃ 2분, 95℃ 30초, 60℃ 30초, 72℃ 30초, 72℃ 5분, 30cycle 하여 PERO8(mCOEGY::VP8)를 합성하였다.
젤에서 추출한 ③,④번의 DNA를 주형으로 하여 10X fu 반응 완충액 5㎕, 100pmol COE(fus) 5' 프라이머 1㎕, 100pmol syn BVP5 3' 프라이머 1㎕, 2.5U pfu 폴리머라제 0.5㎕; 95℃ 2분, 95℃ 30초, 60℃ 30초, 72℃ 30초, 72℃ 5분, 30cycle 하여 PERO5(mCOEGY::BVP5)를 합성하였다(도 5).
합성된 PERO8과 PERO5도 pENTR/D/TOPO에 라이게이션 하여 EcoR V, Hind III 로 확인하고 코스모진텍에 염기서열 분석의뢰하여 이를 alignment(http://www.expa sy . ch /) 통해 확인하였다.
전기영동을 통하여 PERO8은 974bp, PERO5는 952bp의 예상된 밴드를 확인하였다(도 6A). 확인된 밴드는 젤에서 분리하여 pENTR/D/TOPO에 삽입하고 TOP10에 형질전환하였다. 형질전환된 콜로니에서 플라스미드 DNA를 추출하였다. pENTR/D/TOPO-PERO8 DNA를 BglII와 HindIII 제한 효소를 처리하여 예상된 469bp와 3080bp의 밴드를 확인하였고 이를 염기서열 분석하여 8번을 최종선발하였다(도 6B).
pENTR/D/TOPO-PERO5로 형질전환된 TOP10 콜로니를 주형으로 하여 PCR을 수행한 결과 952bp의 PERO5 유전자가 삽입된 된 것을 확인하였고 염기서열 분석을 통해 최종적으로 2번 콜로니를 선발하였다(도 6C).
실시예 3: 식물형질전환용 벡터 구축 및 Agrobacteria 형질전환
당근에 형질전환하기 위해 pENTR/D/TOPO vector에 들어있는 항원 유전자들(PERO8, PERO5)을 LR reaction하여 pK2GW7.0 식물형질전환벡터에 삽입하고 TOP10에 형질전환하여 항생제 배지에서 선발하였다. 형성된 colony에서 plasmid DNa를 추출하고 이를 제한 효소 처리하여 클로닝 확인을 하였다(도 7). 제한 효소 처리에 의해 확인된 pK2GW7 clone vector를 Agrobacterium tumefaciens GV3101에 형질전환하고 항생제배지에서 선발된 colony를 50배 희석한 template로 이용하여 PCR로 삽입을 확인하였다(도 8A 및 B).
실시예 4: Agrobacteria 를 이용한 당근 형질전환
당근 형질전환을 위해 조춘 5촌(J종묘, H종묘), 춘홍 5촌(S종묘) 품종을 사용하였다. 당근 종자는 70% EtOH 로 3번 씻고 4% 유한락스로 30분간 소독한 후 멸균수를 이용하여 5~6번 씻어 준비하였다. 멸균 소독한 당근 종자를 0.8% Agar 배지에 치상하여 25℃ 암조건에서 7일간 발아 시킨 배축을 0.3~0.5㎝ 간격으로 자른 후 MS+배지 (4.4g/ℓ MS salt w/vitamin (Duchefa 사), 0.1mg/ℓ 2iP, 1mg/ℓ 2,4-D, 3% sucrose)에서 1~2일간 진탕배양 하였다. 2일간 M9배지 (6g/ℓ Na2HPO4, 3g/ℓ KH2PO4, 0.5g/ℓ NaCl, 1g/ℓ NH4Cl, 0.5g/ℓ MgSO4, 2g/ℓ 글루코스, 0.015g/ℓ CaCl2)에 항생제 (100㎍/㎖ 스펙티노마이신)를 첨가한 배지에서 키운 Agrobacteria를 MS+배지에 재현탁하여 2일간 배양한 당근 배축과 암조건에서 5~10분간 공동배양한 후 식물절편을 멸균된 종인에 옮겨 air dry한 후 액체 MS+배지에서 하루 현탁배양(25℃, 100rpm, 암조건)하여 카베니실린 400㎍/㎖와 카나마이신 100㎍/㎖이 포함된 고체 MS+배지에 옮긴 후 캘러스를 유도하였다.
형질전환된 Agrobacteria GV3101을 이용하여 2품종 당근의 절편과 공동배양한 후, 당근 절편에 남아있는 Agrobacteria를 제거하기 위하여 1차 선발배지에서 callus를 유도하고 2차 선발배지에서 총 53을 계통화 하였다(PERO8 26계통, PERO8 CT 27계통). 당근 품종별 형질전환 효율을 분석한 결과 조춘 품종의 형질전환이 높았다(표 3).
Figure pat00003
실시예 5: PEDV 항원단백질 ( mCOEGY ) 생산 및 항체 생산
5-1) 항원단백질 발현 벡터 구축
항원유전자인 mCOEGY를 리보솜 결합 부위(RBS)가 있는 게이트웨이 시스템(Gateway system)을 이용할 수 있는 pENTRTM/SD/D-TOPO(invitrogen 사)에 클로닝하고 LR clonase II(invitrogen사)를 사용하여 E. coli 발현 벡터인 GatewayDEST14TMvector에 삽입하고 이를 BL21-AlTM(invitrogen 사)에 형질전환 하고 제한효소로 확인하였다(도 9A). 확인된 콜로니에서 플라스미드 DNA를 추출하여 데스티네이션 벡터(destination vector)인 pDEST14 벡터에 LR 반응시켰다. 그런 후 TOP10과 BL21에 형질전환하여 항생제에서 선발된 콜로니에서 플라스미드를 추출하였고, 제한효소를 이용하여 클로닝을 확인하였다(도 9B 및 C).
5-2) 대장균 항원 발현 및 분리
pDEST14-mCOEGY가 있는 BL21의 단일 콜로니를 항생제(100㎍/㎕ 암피실린)가 있는 LB 5ml에 접종하여 밤새 키운 후 50ml LB배지에 1/25비율로 재접종하여 OD600nm=~0.4 될 때까지 키워 20% L-아라비노스를 최종 농도가 0.2% 되게 처리하고 4시간동안 키웠다. 4시간동안 키운 대장균을 5000rpm으로 원심분리하여 침전물만을 수확하여 40ml 의 2X 샘플 완충액을 넣고 10분간 끓인 후 SDS-PAGE로 확인하였다.
대량 생산한 단백질은 SDS-PAGE를 통하여 크기별로 분리한 후 16.6KDa 밴드를 막자사발을 이용하여 곱게 분쇄한 후 확산 버퍼(diffusion buffer)(50mM Tris-Cl pH8.0, 0.1% SDS)에 넣어서 4℃에서 2일간 진탕하여 젤로부터 단백질이 나오게 하였다. 4℃, 5000rpm, 30분간 원심분리하여 상층액만을 회수하였고 4배의 아세톤을 넣어 -20℃에서 3시간이상 침전시킨 후 다시 원심분리하여 침전물을 PBS(Phosphate-Buffer Saline) 완충액에 녹였다. 얻어진 단백질은 BCA방법(Bicinchoninic Acid Protein Assay Kit, Sigma사)에 의하여 정량하였다. 그 결과과 16.6KDa의 mCOEGY 단백질 발현을 확인할 수 있었다(도 10A).
5-3) Polyclonal 항체 생산
SDS-PAGE 겔로부터 순수 분리한 70㎍ mCOEGY 단백질과 Freud`s adjuvant와 1:1 부피로 섞은 뒤에 complete Freud`s adjuvant 1회 토끼에 근육주사와 피하주사를 시행하며 2회 incomplete Freud`s adjuvant를 동량으로 섞어 주사하였다. 2주 간격으로 3회 시행하며 접종하기 전에 미리 혈액을 채취하였다. 3회의 접종이 끝난 후 토끼를 마취하여 심장 채혈하였고 얻어진 혈액은 상온에 하루 둔 후 혈청만을 분리하고 동결건조하여 -70℃에 보관하였다.
접종 전 토끼의 항혈청과 접종 후 토끼의 항혈청을 이용하여 웨스턴 블롯 수행한 결과 접종 후 토끼의 항혈청에서만 16.6KDa크기에서 순수분리된 mCOEGY의 10ug, 1ug 농도에서 예상된 mCOEGY 단백질이 검출되었고 접종 전에 없었던 항체가 형성되었음을 확인하였다(도 10B).
실시예 6: 로타바이러스 항원단백질 생산 및 항체 생산
6-1) 항원단백질 발현 벡터 구축
항원유전자인 VP4(BVP5와 VP8를 모두 포함)를 ribosome binding site(RBS)가 있는 Gateway system을 이용할 수 있는 pENTRTM/SD/D-TOPO(invitrogen 사)에 클로닝하고 LR clonase II(invitrogen사)를 사용하여 E. coli expression vector인 GatewayDEST14TMvector에 삽입하고 이를 BL21-AlTM(invitrogen 사)에 형질전환 하고 제한효소로 확인하였다.
로타바이러스 항원단백질 VP4을 pENTR/SD/D-TOPO에 삽입하여 ligation 하여 TOP10에 형질전환하여 제한 효소로 클로닝 확인을 하였다(도 11A). 확인된 콜로니에서 plasmid DNA를 추출하여 destination vector인 pDEST14 vector에 LR reaction 후 BL21에 형질전환하여 항생제에서 선발된 콜로니에서 plasmid를 추출하여 제한효소를 이용하여 클로닝 확인하였다(도 11B).
6-2) 대장균 항원 발현 및 분리
pDEST14-VP4가 있는 BL21의 단일 콜로니를 항생제(100㎍/㎖ ampicillin)가 있는 LB 5㎖에 접종하여 밤새 키운 후 50㎖ LB배지에 1/25비율로 재접종하여 OD600nm=~0.4 될 때까지 키워 20% L-Arabinose를 final 농도가 0.2% 되게 처리하고 4시간동안 키웠다. 4시간동안 키운 대장균을 5000rpm으로 원심분리하여 침전물만을 수확하여 40ml 의 2× sample buffer를 넣고 10분간 끓인 후 SDS-PAGE로 확인하였다.
대량 생산한 단백질은 SDS-PAGE를 통하여 크기별로 분리한 후 16.6KDa 밴드를 막자사발을 이용하여 곱게 분쇄한 후 diffusion buffer(50mM Tris-Cl pH8.0, 0.1% SDS)에 넣어서 4℃에서 2일간 진탕하여 젤로부터 단백질이 나오게 하였다. 4℃, 5000rpm, 30분간 원심분리하여 상층액만을 회수하였고 4배의 acetone을 넣어 -20℃에서 3시간이상 침전시킨 후 다시 원심분리하여 침전물을 PBS(Phosphate-Buffer Saline)buffer에 녹였다. 얻어진 단백질은 BCA방법(Bicinchoninic Acid Protein Assay Kit, Sigma사)에 의하여 정량하였다.
6-3) Polyclonal 항체 생산
SDS-PAGE gel로부터 순수분리한 70㎍ VP4 단백질과 Freud`s adjuvant와 1:1 volume으로 섞은 뒤에 complete Freud`s adjuvant 1회 토끼에 근육주사와 피하주사를 시행하며 2회 incomplete Freud`s adjuvant를 동량으로 섞어 주사하였다. 2주 간격으로 3회 시행하며 접종하기 전에 미리 혈액을 채취하였다. 3회의 접종이 끝난 후 토끼를 마취하여 심장채혈하였고 얻어진 혈액은 상온에 하루 둔 후 혈청만을 분리하고 동결건조하여 -70℃에 보관하였다.
pDEST14-VP4 in BL21을 E.coli expression system을 이용하여 대장균에서 VP4 단백질을 발현시켰다. L-Arabinose 처리 후 3시간된 대장균의 단백질을 추출하고 SDS-PAGE하여 15, 30KDa의 VP4 단백질 발현을 확인하였다(도 12A).
대량 발현 시킨 mCOEGY 단백질을 gel elution하여 PBS에 녹인 후 BCA 정량을 하였고 70ug의 mCOEGY 단백질과 Freud' adjuvant를 혼합하여 2주 간격으로 총 3번의 토끼 피하와 근육에 주사하여 혈액을 얻었다. 혈액에서 antiserum만 채취하였다. 접종 전 토끼의 antiserm과 접종 후 토끼의 antiserum을 이용하여 western 수행한 결과 접종 후 토끼의 aniserum에서만 15와 30KDa크기에서 순수분리된 VP4 에서 예상된 VP4 15KDa 또는 VP4 30KDa 단백질이 검출되었고 접종 전에 없었던 항체가 형성되었음을 확인하였다(도 12B).
실시예 7: PEDV 와 로타바이러스 항원유전자 융합 유전자 형질전환체 당근 분석
7-1) 당근 캘러스 genomic DNA 추출
항생제 저항성을 통해 선발된 캘러스 조직을 1.5㎖ tube에 0.5cm2의 조직을 넣고 플라스틱 pestle을 이용하여 상온에서 분쇄한 후 DNA extraction buffer(0.1M Tris-HCl. pH7.5, 0.5M NaCl, 50mM EDTA, 0.5% SDS)를 이용한 방법으로 genomic DNA를 추출하였다(Kang et al., 2004).
항생제 선발배지에서 계통화된 세포주 중 유전자의 도입을 확인하기 위해 genomic DNA를 추출하고 각 유전자에 해당하는 프라이머를 사용(재료 및 방법 참고)하여 PCR을 수행하였다. 그 결과 총 11개의 세포주에서 중 4개의 세포주에서 유전자가 삽입되었음을 확인하였다(도 13).
7-2) 당근 캘러스 RNA 추출 및 cDNA 합성
캘러스 조직 50~100mg을 homogenization 후 1㎖ TRI REAGENT(MRC사)를 넣고 5분간 실온에서 반응시킨 후 0.2㎖ chloroform을 넣고 15초 동안 세게 흔들어 15분동안 실온에서 반응시킨 다음 4℃, 13,000rpm에서 10분간 원심분리하였다. 상층액을 새 튜브에 옮긴 후 0.5㎖ isopropanol을 더해 10분간 반응한 다음 4℃, 13,000rpm에서 10분간 원심분리하고 침전물을 얻어냈다. 1㎖ 75% EtOH를 넣고 4℃, 12,000rpm에서 5분간 원심분리 후 에탄올을 제거 하고 5분간 air-dry하였고 DEPC 처리된 water에 녹였다.
Genomic DNA PCR 분석을 통해 선발된 당근 형질전환체에서 RNA를 추출하고 cDNA를 합성하였고 RT-PCR을 수행하여 전사체 수준에서의 분석을 하였다. 그 결과 총 4개의 세포주에서 2개의 세포주가 전사체 수준에서도 발현이 됨을 확인하였다(도 14).
<110> Industry-Academic Cooperation Foundation, Dankook University <120> Trnasformants expressing epitope of porcine epidemic diarrhea virus and rotavirus and vaccine composition containing the same <130> PA100829KR <160> 23 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 142 <212> PRT <213> porcine epidemic diarrhea virus <400> 1 Thr Met Val Thr Leu Pro Ser Phe Asn Asp His Ser Phe Val Asn Ile 1 5 10 15 Thr Val Ser Ala Ala Phe Gly Gly His Ser Gly Ala Asn Leu Ile Ala 20 25 30 Ser Asp Thr Thr Ile Asn Gly Phe Ser Ser Phe Cys Val Asp Thr Arg 35 40 45 Gln Phe Thr Ile Thr Leu Phe Tyr Asn Val Thr Asn Ser Tyr Gly Tyr 50 55 60 Val Ser Lys Ser Gln Asp Ser Asn Cys Pro Phe Thr Leu Gln Ser Val 65 70 75 80 Asn Asp Tyr Leu Ser Phe Ser Lys Phe Cys Val Ser Thr Ser Leu Leu 85 90 95 Ala Gly Ala Cys Thr Ile Asp Leu Phe Gly Tyr Pro Glu Phe Gly Ser 100 105 110 Gly Val Lys Phe Thr Ser Leu Tyr Phe Gln Phe Thr Lys Gly Glu Leu 115 120 125 Ile Thr Gly Thr Pro Lys Pro Leu Glu Gly Ile Thr Asp Val 130 135 140 <210> 2 <211> 430 <212> DNA <213> porcine epidemic diarrhea virus <400> 2 caccatggtt actttgccat cattcaatga tcattctttt gttaatatta ctgtctctgc 60 ggcttttggt ggtcatagtg gtgccaacct cattgcatct gacactacta tcaatgggtt 120 tagttctttc tgtgttgaca ctagacaatt taccattaca ctgttttata acgttacaaa 180 cagttatggt tatgtgtcta agtcacagga tagtaattgc cctttcacct tgcaatctgt 240 taatgattac ctgtctttta gcaaattttg tgtttcaacc agccttttgg ctggtgcttg 300 taccatagat ctttttggtt accctgagtt cggtagtggt gttaagttta cgtcccttta 360 ttttcaattc acaaagggtg agttgattac tggcacgcct aaaccacttg aaggtatcac 420 agacgtttaa 430 <210> 3 <211> 430 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> mutant of COE gene <400> 3 caccatggtt actttgccat cattcaatga tcattctttt gttaatatta ctgtctctgc 60 ggcttttggt ggtcatagtg gtgccaacct cattgcatct gacactacta tcaatgggtt 120 tagttctttc tgtgttgaca ctagacagtt caccattaca ctgttttata acgttacaaa 180 cagttatggt tatgtgtcta agtcacagga tagtaattgc cctttcacct tgcaatctgt 240 taatgattac ctgtctttta gcaaattttg tgtttcaacc agccttttgg ctggtgcttg 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Claims (13)

  1. 서열번호 1의 PEDV(porcine epidemic diarrhea virus) 에피토프 단백질을 암호화하는 유전자 및 로타바이러스(Rotavirus) 유전자가 작동가능하게 연결된 재조합 벡터.
  2. 제1항에 있어서, 상기 로타바이러스는 VP8 유전자 또는 BVP5 유전자인 것인 재조합 벡터.
  3. 제1항에 있어서, 상기 로타바이러스 유전자는 서열번호 6 또는 서열번호 7로 표시되는 염기서열을 갖는 것인 재조합 벡터.
  4. 제1항에 있어서, 상기 에피토프 단백질을 암호화하는 유전자는 서열번호 2로 표시되는 염기서열을 갖는 것인 재조합 벡터.
  5. 제1항에 있어서, 상기 에피토프 단백질을 암호화하는 유전자는 서열번호 3으로 표시되는 염기서열을 갖는 것인 재조합 벡터.
  6. 제1항에 있어서, 서열번호 1의 PEDV(porcine epidemic diarrhea virus) 에피토프 단백질을 암호화하는 유전자에 서열번호 4의 아미노산을 암호화하는 유전자가 융합된 것인 재조합 벡터.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항의 재조합 벡터로 형질전환된 형질전환체.
  8. 제7항에 있어서, 상기 형질전환체는 아그로박테리움, 대장균 또는 형질전환 식물인 것인 형질전환체.
  9. 제8항에 있어서, 상기 식물세포는 담배. 애기장대, 감자, 상추, 무, 배추, 토마토, 콩, 쌀, 보리, 밀, 옥수수 및 당근으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 형질전환체.
  10. 제7항 내지 제9항 중 어느 한 항의 형질전환체, 상기 형질전환체의 단백질 추출물 또는 상기 형질전환체로부터 분리된 재조합 단백질을 포함하는 PEDV 또는 로타바이러스의 백신 조성물.

  11. 제7항 내지 제9항 중 어느 한 항의 형질전환체, 상기 형질전환체의 단백질 추출물 또는 상기 형질전환체로부터 분리된 재조합 단백질을 포함하는 PEDV 또는 로타바이러스 감염의 예방 또는 치료용 사료 조성물.
  12. 제7항 내지 제9항 중 어느 한 항의 형질전환체, 상기 형질전환체의 단백질 추출물 또는 상기 형질전환체로부터 분리된 재조합 단백질을 포함하는 PEDV 또는 로타바이러스 감염의 예방 또는 치료용 사료 첨가용 조성물.
  13. (1) 제1항의 PEDV(porcine epidemic diarrhea virus) 에피토프 단백질을 암호화하는 유전자 및 로타바이러스 유전자가 작동가능하게 연결된 재조합 벡터를 제조하는 단계;
    (2) 상기 단계 (1)의 발현벡터를 아그로박테리아에 도입시키는 단계; 및
    (3) 상기 단계 (2)의 아그로박테리아와 식물세포를 형질전환시키는 단계를 포함하는 PEDV 또는 로타바이러스 백신의 제조방법.
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