CN103382480B - 一种Asia1型口蹄疫病毒抗原及其制备和应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种核苷酸序列opti-LTB-Asia1/VP1以及含有该序列的重组载体pC1300/opti-LTB-Asia1/VP1；本发明还公开了一种利用重组载体pC1300/opti-LTB-Asia1/VP1制备的融合表达黏膜免疫佐剂的Asia1型口蹄疫病毒抗原以及该抗原的应用。本发明制备的转基因番茄表达的抗原具有较好的免疫原性；转基因番茄只表达亚单位抗原，不含致病微生物或潜在的致病微生物，对人畜安全，无病原污染；用转基因植物生产免疫原无须提取纯化过程，具有工艺简单、免疫效果好和对动物保护力强等优点，适用于家畜的免疫使用。

Description

一种Asia1型口蹄疫病毒抗原及其制备和应用

技术领域

本发明涉及一种抗原，具体地，涉及一种融合表达黏膜免疫佐剂的Asia1型口蹄疫病毒抗原的制备和应用。

背景技术

口蹄疫(Foot-and-Mouth Disease,FMD)是由口蹄疫病毒(Foot-and-Mouth Disease Virus,FMDV)引起的一种急性、热性、高度接触性传染病，主要感染偶蹄兽(Snowdon et al,1968)，虽然该病的致死率不高，但引起动物生产性能下降，而且该病的暴发影响国际贸易，往往造成惨重的直接及间接经济损失。

目前对口蹄疫的防制主要采取免疫与扑杀相结合政策(Aggarwal et al,2002)，而安全有效的疫苗是成功防制乃至最终消灭口蹄疫的先决条件。口蹄疫弱毒疫苗有较好的免疫力，免疫持续时间长，疫苗接种量少，但弱毒疫苗存在散毒和毒力返祖现象，国际上已有多起由于使用弱毒疫苗而引发口蹄疫的报道(Beck et al,1987)，因此，许多国家已明文禁止使用弱毒疫苗。灭活疫苗虽克服了弱毒疫苗的一些缺点，但疫苗接种剂量较大，免疫持续期短；疫苗中未完全灭活的病毒可能引起疾病的新爆发；此外灭活疫苗诱导的抗病毒免疫机制的广谱性有限，其局限性日渐突出(Chan et al,2000)，因此，世界各国的相关研究室都在致力于研制安全、有效的新型口蹄疫疫苗。

近年来，基因工程技术及免疫学的快速发展为口蹄疫新型疫苗的研制提供了条件，新型疫苗主要指基因工程技术生产的疫苗，包括亚单位疫苗、多肽疫苗、基因缺失疫苗、活载体疫苗、核酸疫苗及抗独特型抗体疫苗，但是上述新型疫苗由于其免疫效果和生产成本远不及传统疫苗，迄今没有成熟的产品投放市场。而植物表达系统不仅能进行正确的翻译后加工，可直接食用，易获得多价疫苗，而且廉价安全不需特殊的运输和储藏条件，因此被认为是一个比微生物或动物更理想的蛋白生产系统 (Schuyler et al,2002; Lauterslager et al,2002)。

抗原表达量低是制约植物基因工程疫苗发展的瓶颈。对抗原基因的密码子按照植物密码子进行优化，表达包含病毒全部抗原位点是最普遍可行的提高蛋白免疫原性的办法。此外，研究表明大肠杆菌热敏肠毒素 ( LT ) 已被证实是强有力的黏膜免疫佐剂，但因其毒性而在应用上受到限制。完整的LT分子由1个A 亚单位(LTA) 和5个B 亚单位(LTB) 组成，A 亚单位具有ADP2核糖基化转移酶活性, 也是毒素毒性所在部位；B亚单位能与哺乳动物细胞表面神经节苷酯GM1结合, 具有粘膜佐剂活性，通过口服能使机体产生很高的抗体效价，可用于强化多糖和蛋白质等半抗原。大肠杆菌热敏肠毒素B亚单位（LTB）基因由375bp构成，LTB与其它抗原的融合蛋白是将佐剂和抗原连接起来，靶向性更强，可增强抗原的免疫原性，是理想的疫苗佐剂。因此，为了使FMDV抗原基因在真核植物体内有效表达，在不改变病毒抗原蛋白氨基酸序列的前提下优化改造密码子，人工合成了Asia1型FMDV VP1基因及LTB基因，将VP1基因片段置于LTB基因的3‘端，并保证同一阅读框架，构建了表达LTB-Asia1/VP1融合蛋白的重组质粒，作为连接的Linker，在LTB和VP1序列连接处设计了一个空间活动性较大的连接肽（linker序列），可保持LTB和VP1两个序列表达蛋白分子的天然构象，有利于二者功能的正常发挥。通过农杆菌介导法将重组质粒转化番茄子叶，筛选出能够表达目的蛋白的转基因植株，通过对豚鼠免疫后抗强毒攻击试验检测口蹄疫转基因疫苗的免疫效果，为将其应用于FMD基因工程疫苗的研究奠定基础。

发明内容

本发明要解决的技术问题是克服现有的缺陷，提供一种通过直接食用FMD转基因植物对动物进行免疫的Asia1型口蹄疫病毒抗原。本研究将一种密码子优化的Asia1型口蹄疫病毒抗原基因及大肠杆菌热敏肠毒素B亚单位（LTB）基因组合，人工合成了一条全长为1095bp的LTB-Asia1/VP1优化基因，命名为opti-LTB-Asia1/VP1，利用该基因构建了表达Asia1型口蹄疫病毒抗原及黏膜免疫佐剂的高效植物表达载体pC1300/opti-LTB-Asia1/VP1，通过农杆菌介导方法转化番茄，获得融合表达黏膜免疫佐剂的Asia1型口蹄疫病毒VP1基因的转基因番茄，这是国内首次将密码子优化的融合表达黏膜免疫佐剂的Asia1型口蹄疫病毒VP1基因转到番茄中，具有极其重要的意义。

为了解决上述技术问题，本发明提供了如下的技术方案：

一种核苷酸序列opti-LTB-Asia1/VP1，其碱基序列如SEQ ID NO: 1所示。

一种重组载体pC1300/opti-LTB-Asia1/VP1，它包含核苷酸序列opti-LTB-Asia1/VP1。其构建线路图如图1所示。

一种融合表达黏膜免疫佐剂的Asai1型口蹄疫病毒抗原，通过以下方法制得：

（1）将权利要求2所述的重组载体pC1300/opti-LTB-Asia1/VP1导入根癌农杆菌EHA105，利用导入成功的根癌农杆菌侵染番茄；

（2）opti-LTB-Asia1/VP1基因在番茄中的转化与抗性植株的筛选；

（3）转基因番茄Asia1型口蹄疫病毒抗原及黏膜免疫佐剂基因的共表达。

融合表达黏膜免疫佐剂的Asai1型口蹄疫病毒抗原在制备Asia1型口蹄疫病毒疫苗中的应用。

本发明具有以下有益效果：

转基因番茄叶片蛋白提取液免疫豚鼠，同时设空载体及非转基因番茄叶片为阴性对照组，间接ELISA检测特异性抗体。结果表明，转基因番茄对豚鼠二免后10d，豚鼠抗FMDV特异性抗体水平较首免后10d有明显提高；三免后10d，特异性抗体没有明显变化，三免后21d，抗体水平显著升高，血清效价最高达到l:128，说明转基因番茄中表达的抗原蛋白具有良好的免疫原性。转基因番茄免疫组的抗病毒能力远远大于非转基因番茄免疫组，而空载体pC1300和非转基因番茄免疫组豚鼠全部发病。

附图说明

附图用来提供对本发明的进一步理解，并且构成说明书的一部分，与本发明的实施例一起用于解释本发明，并不构成对本发明的限制。在附图中：

图1是重组载体pC1300/opti-LTB-Asia1/VP1的构建路线图；

图2是重组质粒pC1300/opti-LTB-Asia1/VP1的酶切鉴定图；在图2中，1为DNA分子质量标准；2为质粒pC1300/opti-LTB-Asia1/VP1经BamHⅠ/ClaⅠ双酶切后；3为质粒pC1300/opti-LTB-Asia1/VP1；

图3是转基因番茄目的基因的PCR分析图；在图3中，M为DNA 分子量标准；1为转基因番茄PCR产物；

图4 是转基因番茄表达蛋白的Western-blot检测图；在图4中，1-2为转基因番茄表达目的蛋白；3为非转基因番茄表达蛋白；M为蛋白分子量标准。

图5是豚鼠抗体水平动态变化折线图。

具体实施方式

以下结合附图对本发明的优选实施例进行说明，应当理解，此处所描述的优选实施例仅用于说明和解释本发明，并不用于限定本发明。

实验部分：

实验一、opti-LTB-Asia1/VP1基因的获得

（一）材料及来源

LTB基因的原始序列分别为GenBank中的序列AF242418。所用大肠杆菌菌株为DH52，；植物表达载体pC1300SOD及根癌农杆菌EHA105由四川农业大学作物研究所赠送。

（二）方法

1．基因的改造及合成

Asia 1型FMDV VP1基因的原始序列为Genbank 上公布的序列gi|122056477|，VP1基因全长633bp，黏膜免疫佐剂大肠杆菌热敏肠毒素B亚单位（LTB）全长375bp，根据Kazusa密码子使用数据库中植物密码子使用频率表，在不改变氨基酸序列的情况下，对野生型VP1基因及LTB基因的密码子进行了改造，设计合成一条全长1095bp的优化基因opti-LTB-Asia1/VP1，包括Kozak-LTB-linker-Asia/VP1，改造后序列由上海生工生物技术有限公司全基因合成，克隆到载体pUC57上，受体菌为大肠杆菌DH5a，命名为pUC/opti-LTB-Asia1/VP1，优化序列送大连宝生物公司进行序列测定。

（三）结果

获得的opti-LTB-Asia1/VP1基因（核苷酸序列LTB-Asia1/VP1）的碱基序列如SEQ ID NO: 1所示：

SEQ ID NO: 1

GGATCCGCCGCAACAATGGCCAACAAGGTGAAGTGCTACGTGCTGTTCACCGCCCTGCTGAGCAGCCTGTGCGCCTACGGCGCCCCGCAGAGCATCACCGAGCTGTGCAGCGAGTACCGCAACACCCAGATCTACACCATCAACGACAAGATCCTGAGCTACACCGAGAGCATGGCCGGCAAGCGCGAGATGGTGATCATCACCTTCAAGAGCGGCGCCACCTTCCAGGTGGAGGTGCCGGGCAGCCAGCACATCGACAGCCAGAAGAAGGCCATCGAGCGCATGAAGGACACCCTGCGCATCACCTACCTGACCGAGACCAAGATCGACAAGCTGTGCGTGTGGAACAACAAGACCCCGAACAGCATCGCCGCCATCAGCATGGAGAACGGTGGCGGTGGCTCCGGCGGTGGCGGGAGCGGTGGCGGCGGTTCCACCACCACCACCGGCGAGTCCGCCGACCCGGTGACCACCACCGTGGAGAACTACGGCGGCGAGACCCAGACCGCCCGCCGCCTGCACACCGACGTGGCCTTCGTGCTGGACCGCTTCGTGAAGCTGACCCAGCCGAAGAGCACCCAGACCCTGGACCTGATGCAGATCCCGAGCCACACCCTGGTGGGCGCCCTGCTGCGCAGCGCCACCTACTACTTCAGCGACCTGGAGGTGGCCCTGGTGCACACCGGCCCGGTGACCTGGGTGCCGAACGGCGCCCCGAAGACCGCCCTGAACAACCACACCAACCCGACCGCCTACCAGAAGCAGCCGATCACCCGCCTGGCCCTGCCGTACACCGCCCCGCACCGCGTGCTGAGCACCGTGTACAACGGCAAGACCACCTACGGCGAGGAGTCCAGCCGCCGCGGCGACCTGGCCGCCCTGGCCCGCCGCGTGAACAACCGCCTGCCGACCTCCTTCAACTACGGCGCCGTGAAGGCCGACACCATCACCGAGCTGCTGATCCGCATGAAGCGCGCCGAGACCTACTGCCCGCGCCCGCTGCTGGCCCTGGACACCACCCAGGACCGCCGCAAGCAGGAGATCATCGCCCCGGAGAAGCAGACCTGGAGCGAGAAGGACGAGCTGTGAATCGAT

测序结果表明，人工合成的opti-LTB-Asia1/VP1与原设计的DNA序列完全相同，共1095bp。野生型VP1基因633bp中，改变了117bp，占全序列的18.3%，从而使G十C含量由59.5%提高到69.8%，211个密码子（Codon）中，改变104个密码子，优化密码子占49.3%。

实验二、重组表达载体pC1300/opti-LTB-Asia1/VP1的获得

（一）材料及来源

限制性内切酶BamHI、ClaI及T4连接酶均购自Promega公司，Taq酶、dNTP、DNA Marker DL2，000、DL15，000、Agarose Gel DNA Purification Kit、MiniBEST Plasmid Purification Kit购自大连宝生物公司。克隆载体pUC57由上海生工生物技术有限公司提供。

（二）方法

质粒pUC/opti-LTB-Asia1/VP1以BamHⅠ/ClaⅠ双酶切后的小片段，与经同样双酶切的植物表达载体pC1300SOD大片段连接、转化、碱裂解法提质粒，用电泳、酶切方法鉴定转化子，得到阳性重组质粒命名为pC1300/opti-LTB-Asia1/VP1。采用三亲交配法(参考王关林、方宏筠植物基因工程)将测序正确的pC1300/opti-LTB-Asia1/VP1导入根癌农杆菌EHA105。

（三）结果

重组质粒pC1300/opti-LTB-Asia1/VP1经酶切的片段与预计大小相符，说明密码子优化的LTB与VP1双基因的植物表达载体pC1300/opti-LTB-Asia1/VP1构建正确（如图2）。在pC1300/opti-LTB-Asia1/VP1载体中，BamHⅠ酶切位点、Kozak、LTB、Linker、VP1基因、内质网引导短肽SEKDEL、终止密码子、ClaⅠ酶切位点等共1095个核苷酸，编码365个氨基酸。

实验三、融合表达Asia1型口蹄疫病毒抗原的制备及检测：

（一）材料及来源

1．激素：吲哚乙酸(IAA)(0.05mg/mL)、6-苄基嘌呤(6-BA)(0.5mg/mL)、萘乙酸(NAA)(1mg/mL)、玉米素(ZT)(1mg/mL) 购自上海生工生物工程有限公司。

2. 抗生素：卡那霉素（Kan）、链霉素（Str）、羧苄青霉素（Carb）、头孢霉素（Cef）购自拜尔迪生物技术有限公司。

（二）方法

1. 目的基因在番茄中的转化与抗性植株的筛选：番茄种子消毒后播种于1/2MS培养基上，在光照培养箱中培养8～10d，取2/3子叶和带柄子叶于在MS+ZT1.0mg/L+IAA0.1mg/L的培养基上预培养2d，随后在活化的根癌农杆菌菌液里侵染3～5min，用滤纸吸干菌液后转到MS+ZT1.0mg/L+IAA0.1mg/L的培养基上暗培养2～3d后转到MS+ZT1.0mg/L+IAA0.1mg/L+Kan30mg/L+Carb500mg/L的选择培养基上，并逐渐提高卡那筛选浓度至50mg/L，2周左右更换新鲜选择培养基，当愈伤组织上的小苗生长到1～1.5cm时，将其切下，转入生根培养基中诱导生根，待植株长至5～6cm高时，练苗后移载于土壤；

2. 转基因番茄的PCR检测：取100mg叶片于液氮中研磨成粉末，用CTAB法(参考王关林、方宏筠植物基因工程)提取总DNA，PCR扩增检测外源基因的整合，同时以末转基因的叶片作阴性对照；

3. 转基因番茄Western-blot检测：取100mg叶片，液氮研磨，加150μl蛋白抽提缓冲液混匀，4℃ 12000r/min离心20min，上清加入等体积的上样缓冲液，煮沸5min，按常规法电泳、转印、封闭、漂洗，FMD阳性牛血清37℃孵育2h，漂洗后以碱性磷酸酶（AKP）标记的兔抗牛IgG于37℃孵育1h，漂洗后加入显色液NBT/BCIP，条带清晰后终止显色反应；

（三）结果

1. 转基因番茄的获得： 外植体在选择培养基上约3～4周后有少数绿色芽分化，在生根培养基上，大多数小苗出现粗而壮的根，有一小部分则无根发生，并逐渐发黄。而未转化的对照组在选择培养基上没有明显的愈伤组织和不定芽分化，4周后，颜色逐渐变黄，最后死亡。

2. 转基因番茄的PCR检测：  提取番茄基因组DNA进行PCR检测，转化植株可扩增出目的片段，非转化的对照植株没有扩增出任何条带（附图3）。

3. 转基因番茄的Western-blot检测：  转基因植株叶片蛋白提取液经电泳和转膜杂交后，结果显示：表达蛋白能被口蹄疫病毒阳性牛血清抗体识别，转基因的植株在约24KD处可见较微弱的特异性免疫反应条带，而未转化的对照植株无此杂交带（图4）。说明VP1基因在转基因番茄中已表达，且所表达的蛋白具有免疫反应活性。

实验四、动物免疫试验：

（一）材料及来源

健康豚鼠(300-500g)由本所实验动物养殖场提供。弗氏完全佐剂和弗氏不完全佐剂为Sigma公司产品。包被抗原、辣根过氧化物酶（HRP）标记的兔抗豚鼠IgG、OPD、双氧水等试剂为ELISA诊断试剂盒所配备。

（二）实验方法

取0.5g转基因或非转基因番茄叶片于液氮中研磨，以1:4(W/V)加入PBST(pH7.4)混匀；4℃ 12 000rpm离心20min，上清与佐剂按1:1混匀乳化(首免用弗氏完全佐剂乳化，加强免疫用弗氏不完全佐剂乳化)；首免每只豚鼠注射0.4ml，加强免疫每只豚鼠注射0.8ml；将豚鼠随机分为三组(5只/组)，A组：转基因番茄；B组：空载体pC1300的转基因番茄；C组：未转基因番茄，用乳化好的疫苗接种于豚鼠股内侧，分别于0d、15d、30d各免疫一次，间接ELISA法测定血清抗体；第三次免疫后28d攻毒，豚鼠后跖部皮内穿刺攻毒，每只豚鼠接种100ID50/0.2mL的O型FMDV China99株强毒，连续观察7d，以病变出现的严重程度作为保护效果的判定：完全保护为不出现任何病变；部分保护为病变仅发生于攻毒接种的单只脚；不保护为两只及以上脚均出现病变。

（三）实验结果

转基因番茄叶片蛋白提取液免疫豚鼠，同时设空载体及非转基因番茄叶片为阴性对照组，间接ELISA检测特异性抗体。结果表明，转基因番茄对豚鼠二免后10d，豚鼠抗FMDV特异性抗体水平较首免后10d有明显提高；三免后10d，特异性抗体没有明显变化，三免后21d，抗体水平显著升高（图5），血清效价最高达到l:128。说明转基因番茄中表达的抗原蛋白具有良好的免疫原性。转基因番茄免疫组的抗病毒能力远远大于非转基因番茄免疫组，而空载体pC1300和非转基因番茄免疫组豚鼠全部发病。

最后应说明的是：以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

序列表

 

<110>  中国农业科学院兰州兽医研究所

       

<120>  一种Asia1型口蹄疫病毒抗原及其制备和应用

 

<160>  1    

 

<170>  PatentIn version 3.5

 

<210>  1

<211>  1095

<212>  DNA

<213>  opti-LTB-Asia1/VP1

 

<400>  1

 

GGATCCGCCG CAACAATGGC CAACAAGGTG AAGTGCTACG TGCTGTTCAC CGCCCTGCTG       60

 

AGCAGCCTGT GCGCCTACGG CGCCCCGCAG AGCATCACCG AGCTGTGCAG CGAGTACCGC       120

 

AACACCCAGA TCTACACCAT CAACGACAAG ATCCTGAGCT ACACCGAGAG CATGGCCGGC       180

 

AAGCGCGAGA TGGTGATCAT CACCTTCAAG AGCGGCGCCA CCTTCCAGGT GGAGGTGCCG       240

 

GGCAGCCAGC ACATCGACAG CCAGAAGAAG GCCATCGAGC GCATGAAGGA CACCCTGCGC       300

 

ATCACCTACC TGACCGAGAC CAAGATCGAC AAGCTGTGCG TGTGGAACAA CAAGACCCCG       360

 

AACAGCATCG CCGCCATCAG CATGGAGAAC GGTGGCGGTG GCTCCGGCGG TGGCGGGAGC       420

 

GGTGGCGGCG GTTCCACCAC CACCACCGGC GAGTCCGCCG ACCCGGTGAC CACCACCGTG       480

 

GAGAACTACG GCGGCGAGAC CCAGACCGCC CGCCGCCTGC ACACCGACGT GGCCTTCGTG       540

 

CTGGACCGCT TCGTGAAGCT GACCCAGCCG AAGAGCACCC AGACCCTGGA CCTGATGCAG       600

 

ATCCCGAGCC ACACCCTGGT GGGCGCCCTG CTGCGCAGCG CCACCTACTA CTTCAGCGAC       660

 

CTGGAGGTGG CCCTGGTGCA CACCGGCCCG GTGACCTGGG TGCCGAACGG CGCCCCGAAG       720

 

ACCGCCCTGA ACAACCACAC CAACCCGACC GCCTACCAGA AGCAGCCGAT CACCCGCCTG       780

 

GCCCTGCCGT ACACCGCCCC GCACCGCGTG CTGAGCACCG TGTACAACGG CAAGACCACC       840

 

TACGGCGAGG AGTCCAGCCG CCGCGGCGAC CTGGCCGCCC TGGCCCGCCG CGTGAACAAC       900

 

CGCCTGCCGA CCTCCTTCAA CTACGGCGCC GTGAAGGCCG ACACCATCAC CGAGCTGCTG       960

 

ATCCGCATGA AGCGCGCCGA GACCTACTGC CCGCGCCCGC TGCTGGCCCT GGACACCACC       1020

 

CAGGACCGCC GCAAGCAGGA GATCATCGCC CCGGAGAAGC AGACCTGGAG CGAGAAGGAC       1080

 

GAGCTGTGAA TCGAT                                                        1095

Claims (5)

1.一种核苷酸序列opti-LTB-Asia1/VP1，其碱基序列如SEQ ID NO: 1所示。

2.一种重组载体pC1300/opti-LTB-Asia1/VP1，它包含权利要求1所述的核苷酸序列opti-LTB-Asia1/VP1。

3.一种融合表达黏膜免疫佐剂的Asia1型口蹄疫病毒抗原，其特征在于，通过以下方法制得：

（1）将权利要求2所述的重组载体pC1300/opti-LTB-Asia1/VP1导入根癌农杆菌EHA105，利用导入成功的根癌农杆菌EHA105侵染番茄；

（2）opti-LTB-Asia2/VP1基因在番茄中的转化与抗性植株的筛选；

（3）融合表达黏膜免疫佐剂的Asai1型口蹄疫病毒抗原。

4.权利要求3所述的融合表达黏膜免疫佐剂的Asia1型口蹄疫病毒抗原的制备方法，包括以下步骤：

（1）将权利要求2所述的重组载体pC1300/opti-LTB-Asia1/VP1导入根癌农杆菌EHA105，利用导入成功的根癌农杆菌EHA105侵染番茄；

（2）opti-LTB-Asia2/VP1基因在番茄中的转化与抗性植株的筛选；

（3）融合表达黏膜免疫佐剂的Asai1型口蹄疫病毒抗原。

5.权利要求3所述的融合表达黏膜免疫佐剂的Asia1型口蹄疫病毒抗原在制备Asia1型口蹄疫病毒疫苗中的应用。