CN104277115B

CN104277115B - 一种融合蛋白及其疫苗组合物的制备与应用

Info

Publication number: CN104277115B
Application number: CN201410188776.0A
Authority: CN
Inventors: 张许科; 孙进忠; 王莹; 田克恭
Original assignee: Pulaike Biological Engineering Co Ltd
Current assignee: Pulaike Biological Engineering Co Ltd
Priority date: 2014-05-05
Filing date: 2014-05-05
Publication date: 2018-02-06
Anticipated expiration: 2034-05-05
Also published as: CN104277115A

Abstract

本发明提供了一种融合蛋白及含该融合蛋白的猪支原体肺炎疫苗组合物与应用。所述融合蛋白包括绿脓杆菌外毒素A结构域I与II、猪肺炎支原体抗原性蛋白及羧基末端部分，所述猪肺炎支原体抗原性蛋白包括NrdF蛋白、P102蛋白、P97R1蛋白、P97R2蛋白、P97R1‑NrdF蛋白、P97R2‑NrdF蛋白中的任一蛋白。本发明还公开了含免疫量的融合蛋白的疫苗组合物及其在制备预防和/或治疗猪支原体肺炎的药物中的应用。所述疫苗组合物可通过基因工程手段对疫苗组合物的组分进行大量重组表达，不仅耗时短，还可便于大规模生产；所述疫苗组合物既能产生体液免疫，也能产生细胞免疫，能获得较好的免疫效果。

Description

一种融合蛋白及其疫苗组合物的制备与应用

技术领域

本发明属于兽用生物制品技术领域，具体涉及一种猪肺炎支原体融合蛋白及含该融合蛋白的疫苗组合物的制备与应用。

背景技术

猪支原体肺炎(Mycoplasmal pneumonia of swine,MPS)又称猪气喘病(李彦明,张映.猪肺炎支原体生物学研究进展,动物医学进展,2003,24(3):25-27)或猪地方性流行性肺炎，是由猪肺炎支原体(Mycoplasmahyopneumoniae，Mhp)所引起的一种猪接触性慢性呼吸道疾病，分布十分广泛，以慢性、接触性、高度传染性、高发病率以及低死亡率等为特点，主要表现为咳嗽和呼吸困难，解剖可见肺组织呈肉变或大理石样病变。

衣阿华大学Ross研究发现：Mhp感染后淋巴细胞产生抗体的能力下降，细胞免疫力下降，肺泡巨噬细胞对病原的吞噬和清除能力亦下降，抑制性T细胞的活动增强，导致呼吸道免疫力减弱，抗病力下降，从而使其他病原体更容易侵入，可继发感染猪繁殖与呼吸综合征、猪圆环等，从而导致多种疫苗接种失败。Mhp可经空气传播，易与其他细菌性疾病如猪肺疫、传染性胸膜肺炎等并发(王茂文,猪肺炎支原体病的特点及其防制措施.畜禽业,2008(2):16-17；Dee S,Otake S,Oliveira S,et al.Evidence of long distance airbornetransport of porcine reproductive and respiratory syndrome virus andMycoplasma hyopneumoniae.Veterinary research,2009,40(4):39)，对养猪业造成重大的经济损失，是当前最常发生、最广流行、最难净化的重要疫病之一。

猪支原体肺炎亚单位疫苗不含全菌疫苗的核酸，不仅不存在灭活不彻底造成的安全隐患，而且由于其不含全菌的所有抗原，有利于疾病的净化。但目前猪支原体肺炎亚单位疫苗免疫效果不佳，不能给猪提供完全的保护(Fagan PK,Djordievic SP.Chin J,etal.Oral immunization of mice with attenuated Salmonella typhimurium aroAexpressing a recombinant Mycoplasma hyopeumoniae antigen(NrdF).Infection andimmunity,1997,65:2502-2507)。

发明内容

为了解决现有技术的不足，本发明提供了一种融合蛋白，以及含该融合蛋白的疫苗组合物与应用。该疫苗组合物既能产生细胞免疫，又能产生体液免疫，能获得较好的免疫保护。

本发明的主要目的在于提供一种融合蛋白，所述融合蛋白包含：

(1)假单胞杆菌外毒素A结构域I，

(2)假单胞杆菌外毒素A结构域II，

(3)猪肺炎支原体抗原性蛋白，以及

(4)羧基末端部分。

其中，所述猪肺炎支原体抗原性蛋白位于假单胞菌外毒素A结构域II与羧基末端部分之间，且假单胞杆菌外毒素A结构域II位于假单胞杆菌外毒素A结构域I与所述猪肺炎支原体抗原性蛋白之间。

本发明所用术语“假单胞杆菌外毒素A结构域I”是指与假单胞杆菌外毒素A(Pseudomonas exotoxin A，简称为PEA)的氨基末端细胞受体结构域具有相同序列或具有功能相当片段的肽片段。

本发明所用术语“假单胞杆菌外毒素A结构域II”是指与假单胞杆菌外毒素A的中间易位结构域具有相同序列或具有功能相当片段的肽片段。

本发明所用术语“猪肺炎支原体抗原性蛋白”包括任何猪肺炎支原体菌株中具有免疫原性的蛋白。优选地，所述猪肺炎支原体抗原性蛋白选自猪肺炎支原体J株(NCBI登录号为：AE017243.1)、232株(NCBI登录号为：AE017332.1)、7448株(NCBI登录号为：AE017244.1)、7422株(NCBI登录号为：CP003802.1)、168株(NCBI登录号为：CP002274.1)、168-L株(NCBI登录号为：CP003131.1)、P株或HN0613株中的免疫原性蛋白。

所述猪肺炎支原体抗原性蛋白包括NrdF蛋白、P102蛋白、P97R1蛋白、P97R2蛋白、P97R1-NrdF蛋白或P97R2-NrdF蛋白中的任一蛋白。

本发明所用术语“NrdF蛋白”为NrdF全蛋白中的具有免疫原性的蛋白片段，即NrdF全蛋白的R2亚基C端(Fagan PK,Djordjevic SP,Eamens GJ,et al.Molecularcharacterization of a ribonucleotide reductase (NrdF)gene fragment ofMycoplasma hyopneumoniae and assessment of the recombinant product as anexperimental vaccine for enzootic pneumonia.Infection and immunity,1996,64:1060-1064)。

本发明所用术语“P102蛋白”为P102全蛋白中的具有免疫原性的蛋白片段。其中，所述P102全蛋白位于P97蛋白下游，并与P97蛋白相邻，且具有细胞粘附作用或辅助P97蛋白的细胞粘附作用；P102全蛋白分子量为102.3kD，由2700bp左右编码而成(Hsu T,ArtiushinS,Minion FC.Cloning and functional analysis of the P97swine cilium adhesiongene of Mycoplasma hyoneumoniae.Journal of Bacteriology,1997,179(4):1317-1323；Djordievic SP,Cordwell SJ,Djordjecic MA,et al.Proteolytic processing ofthe Mycoplasma hyopneumoniae cilium adhesin.Infection and immunity,2004,72(5):2791-2802)。

本发明所用术语“P97R1蛋白”是Mhp纤毛粘附因子P97蛋白编码的C端的两个重复序列区域之一，由15个连续的5AA(AAKPV/E)基元构成(Hsu T,Artiushin S,MinionFC.Cloning and functional analysis of the P97swine cilium adhesion gene ofMycoplasma hyoneumoniae.Journal of Bacteriology,1997,179(4):1317-1323)。

本发明所用术语“P97R2蛋白”是Mhp纤毛粘附因子P97蛋白编码的C端的两个重复序列区域之一，由4个连续的10AA(GTPNQGKKAE)基元构成(Hsu T,Artiushin S,MinionFC.Cloning and functional analysis of the P97swine cilium adhesion gene ofMycoplasma hyoneumoniae.Journal of Bacteriology,1997,179(4):1317-1323)。

优选地，所述NrdF蛋白为SEQ ID No.4编码的蛋白，所述P102蛋白为SEQ ID No.6编码的蛋白，所述P97R1蛋白为SEQ ID No.8编码的蛋白，所述P97R2蛋白为SEQ ID No.10编码的蛋白。

更优选地，所述NrdF蛋白的核苷酸序列为SEQ ID No.3，所述P102蛋白的核苷酸序列为SEQ ID No.5，所述P97R1蛋白的核苷酸序列为SEQ ID No.7，所述P97R2蛋白的核苷酸序列为SEQ ID No.9。

所述羧基末端部分为含有氨基酸序列KDEL的多肽，其氨基酸序列为SEQ IDNO.11、SEQ ID NO.12、SEQ ID NO.13、SEQ ID NO.14或SEQ ID NO.15。

本发明所述羧基末端部分为KDEL家族蛋白中的成员。所用术语“KDEL家族蛋白”是指一组蛋白质，其具有与细胞内质网膜结合的相似羧基端，并进一步具有可将该蛋白质留存于内质网腔中以实现醣基化作用的能力，以便融合抗原更接近外源蛋白的肽片段。通常，该羧基端的长度介于4-16个残基之间。根据针对存在于不同分子中且执行特定生物机能的相似序列所做的研究显示：一种可在内质网中留存新形成蛋白的序列为Lys Asp Glu Leu(KDEL)(SEQ ID NO.11)。从而说明：根据这一发明的融合抗原的羧基端上的序列可作为某种类型的识别序列，协助融合抗原从内吞区室易位至内质网内，并将其留置于内质网腔内。在一个较佳的实施方式中，该羧基末端部分包含KDEL的序列如SEQ ID NO.11所示。在一个更理想的实施方式中，该羧基末端部分包含KDEL-KDEL-KDEL(SEQ ID NO.12)或KKDL-RDEL-KDEL的序列(SEQ ID NO.13)、KKDELRDELKDEL的序列(SEQ ID NO.14)或KKDELRVELKDEL的序列(SEQ ID NO.15)，其中R为D或V。

本发明的另一目的在于提供一种制备所述猪肺炎支原体融合蛋白的方法，所述方法包括：通过基因工程手段分别获得所述PEA基因、所述猪肺炎支原体抗原性蛋白基因，将其分别连接至克隆载体以获得PEA克隆载体、猪肺炎支原体抗原性蛋白克隆载体；通过PCR方法在构建的所述猪肺炎支原体抗原性蛋白基因羧基末端添加含KDEL的多肽序列，并连接至克隆载体以获得抗原性蛋白-KDEL克隆载体；将构建的所述抗原性蛋白-KDEL克隆载体、所述PEA克隆载体通过酶切，构建同时包含PEA、抗原性蛋白-KDEL基因的克隆载体，即猪肺炎支原体融合蛋白的克隆载体；将构建的所述猪肺炎支原体融合蛋白的克隆载体、表达载体通过酶切，构建同时包含PEA、抗原性蛋白-KDEL基因的表达载体，即猪肺炎支原体融合蛋白的表达载体；将所述猪肺炎支原体融合蛋白的表达载体导入受体菌进行诱导表达，并对表达的猪肺炎支原体融合蛋白进行纯化和鉴定以获得猪肺炎支原体融合蛋白。

优选地，所述基因工程手段是指运用分子生物学方法获得所述PEA基因、所述猪肺炎支原体抗原性蛋白基因，进一步优选为通过PCR方法扩增PEA基因、通过RT-PCR方法扩增猪肺炎支原体抗原性蛋白基因；优选地，所述克隆载体为分子生物学可接受的克隆载体，进一步优选为pMD18-T、pGEM-T、pUC18/19、pBR322；优选地，所述表达载体为pET，进一步优选为pET-28a、pET-32a；所述受体菌为大肠杆菌，进一步优选为Bal21。

本发明的再一目的在于提供一种猪支原体肺炎疫苗组合物，包括免疫量的任一所述融合蛋白和/或其组合以及兽医学上可接受的佐剂。

本发明所用术语“猪支原体肺炎”在临床上的症状包括(但不限于)：呼吸症状(严重急性临床肺炎、咳嗽、呼吸困难、呼吸速迫)、发热、高度传染性、高发病率、低死亡率、坏死性细胞支气管炎及继发性细菌性呼吸道感染增加。

本发明所用术语“猪支原体肺炎疫苗组合物”是指能够用于预防和/或治疗由猪肺炎支原体感染所知病症或疾病的疫苗，该疫苗组合物可包括任何能够有效预防和/或治疗猪受猪肺炎支原体感染的疫苗，能够用于猪支原体肺炎疫苗组合物包括(但不限于)完全或部分猪支原体肺炎细胞制剂、灭活或改良活体疫苗、亚单位疫苗。

本发明所述的猪支原体肺炎疫苗组合物优选为亚单位疫苗，所述“亚单位疫苗”包含一个或多个猪肺炎支原体衍生的多肽或蛋白质，或所述多肽或蛋白质的免疫原性片段，或编码所述一个或多个猪肺炎支原体衍生多肽或蛋白质，或所述多肽或蛋白质免疫原性片段的一个或多个猪肺炎支原体基因或核酸，且所述基因或核酸能在猪体内进行表达。猪肺炎支原体多肽、蛋白质、所述多肽和蛋白质的免疫原性片段、或猪肺炎支原体基因或核酸可用于本领域公知技术合成或重组制备。

本发明所用术语“预防和/或治疗”在涉及猪肺炎支原体感染时是指抑制猪肺炎支原体细菌的复制、抑制猪肺炎支原体的传播或防止猪肺炎支原体在其宿主体内定居，以及减轻猪肺炎支原体感染所之疾病或病症的症状。若细菌荷载量减少、肺部感染减轻和/或摄食量和/或生长增加，那么就可以认为所述治疗达到了治疗效果。

本发明所用术语“猪”是指任何属于猪科(Suidae)成员的动物，如猪。

本发明所用术语“免疫量”是指提供针对猪支原体肺炎疫苗组合物的免疫剂量，主要取决于以下因素：被免疫动物的物种、品种、年龄、重量大小、健康状态以及动物之前是否接受过对抗同样病毒的疫苗。

在本发明的一种优选实施方式中，所述疫苗组合物，包括免疫量的所述融合蛋白至少任意两种的组合及兽医学上可接受的佐剂。

本发明所用术语“佐剂”可包括铝胶佐剂；皂苷(saponin)，如Quil A、QS-21(Cambridge Biotech Incorporation,Cambridge MA)、GPI-0100(GalenicaPharmaceuticals Incorporation，Birmingham AL)；油包水乳剂；水包油乳剂；水包油包水乳剂；丙烯酸或甲基丙烯酸的聚合物；顺丁烯二酸酐和链烯基(alkenyl)衍生物的共聚物选出的化合物。

本发明所用术语“乳剂”可尤其基于轻液体石蜡油(European Pharmacopea类型)；因烯烃寡聚产生的类异戊二烯油(isoprenoid oil)，如角鲨烷(squalane)或角鲨烯油(squalene oil)，尤其异丁烯或葵烯；酸或醇的含线性烷基的酯，更尤其植物油、油酸乙酯、丙二醇二-(辛酸酯/葵酸酯)、甘油三-(辛酸酯/葵酸酯)或丙二醇二油酸酯；支链脂肪酸或醇的酯，尤其异硬脂酸酯。油与乳化剂组合使用以便形成乳剂。乳化剂优选非离子表面活性剂，尤其山梨聚糖的酯、二缩甘露醇(mannide)的酯(如无水甘露醇油酸酯)、脂肪族二元醇(glycol)的酯、聚甘油(polyglycerol)的酯、丙二醇的酯以及油酸的酯、异硬脂酸的酯、蓖麻油酸的酯或羟基硬脂酸的酯，它们任选乙氧基化，还有聚氧丙烯-聚氧乙烯嵌段共聚物，尤其Pluronic产品，特别是L121。参见Hunter等编写的《The theory and practicalapplication of adjuvants》(Ed.by DES Stewart-Tull,John Wiley and Sons,NewYork,1995:51-94)和Todd等编写的《Vaccine》(1997,15:564-570)。例如，可使用Powell M和Newman M编写的《Vaccine design,the Subunit and adiuvant approach》(PlenumPress,1995)第147页描述的SPT乳剂及第183页描述的MF59乳剂。

本发明所用术语“丙烯酸或甲基丙烯酸的聚合物”优选为交联的丙烯酸或甲基丙烯酸聚合物，尤其是与糖(sugar)的聚链烯基醚或聚醇交联，这些化合物已知被称为卡波姆(Carbomer，商品名Carbopol)(Phameuropa,1996,8(2))。本领域技术人员还可参见美国专利US2909462，其描述了这类丙烯酸聚合物，其与聚羟基化的化合物交联，所述化合物具有至少3个羟基，优选不超过8个，其中至少3个羟基的氢原子被具有至少2个碳原子的不饱和脂烃基(aliphatic radical)取代。优选的基团是那些含有2-4个碳原子的基团，例如乙烯基、烯丙基和其它烯属不饱和基团(ethylenically unsaturated group)。所述不饱和基团自身可包含其它取代基，如甲基。这些产品以卡波普的名义出售，(BF Goodrich,Ohio,USA)特别合适。它们与烯丙基蔗糖或与烯丙基季戊四醇(allyl pentaerythritol)交联。这其中可提及卡波普974P、934P和971P，最优选使用卡波普971P。

本发明所用术语“顺丁烯二酸酐和链烯基衍生物的共聚物”也可考虑顺丁烯二酸酐与乙烯的共聚物EMA(Monsanto)，这些聚合物在水中溶解产生酸性溶液，经中和，优选中和至生理pH，以便产生佐剂溶液，能向其中掺入免疫原性、致免疫性或疫苗性组合物本身。

本发明所用术语“佐剂”还包括，但不限于，RIBI佐剂系统(Ribi Incorporation)、Block co-polymer(CytRx,Atlanta GA)、SAF-M(Chiron,Emeryville CA)、单磷酰脂质A(monophosphoryl lipid A)、Avridine脂质-胺佐剂、大肠杆菌不耐热肠毒素(重组或其它)、霍乱毒素、IMS1314、胞壁酰二肽、Gel佐剂等。

优选地，所述佐剂为铝胶佐剂、皂苷、油包水乳剂、水包油乳剂、水包油包水乳剂、丙烯酸、甲基丙烯酸的聚合物、顺丁烯二酸酐和链烯基(alkenyl)衍生物的共聚物、RIBI佐剂系统、Block co-polymer、SAF-M、单磷酰脂质A、Avridine脂质-胺佐剂、大肠杆菌不耐热肠毒素、霍乱毒素、IMS1314、胞壁酰二肽或Gel佐剂中的一种或几种。

更优选地，所述佐剂在所述疫苗组合物中的体积比为5％-30％。

优选地，所述疫苗组合物还包括其他抗原，所述其他抗原包括猪圆环病毒抗原、猪繁殖与呼吸综合征病毒抗原、副猪嗜血杆菌抗原、猪细小病毒抗原、大叶性肺炎放线杆菌抗原、大肠杆菌抗原、猪萎缩性鼻炎抗原、猪伪狂犬病病毒抗原、猪霍乱病原抗原、猪流感病毒抗原中的一种或多种；进一步优选地，所述其他抗原为猪圆环病毒抗原。

本发明又一目的在于提供所述疫苗组合物在制备预防和/或治疗猪支原体肺炎的药物中的应用。

本发明所用术语“猪肺炎支原体”与“Mhp”在本发明中可互换使用。

本发明所用术语“开放阅读框”或“ORF”是指编码不含插入的终止密码子的特定Mhp蛋白质所需的最小核苷酸序列。

本发明所用缩略语为：AA，氨基酸；bp，碱基对；kD，千道尔顿。

本发明具有以下突出的优点：

(1)所述疫苗组合物可通过基因工程手段对其组分进行大量重组表达，不仅耗时短，还可便于大规模生产；

(2)所述疫苗组合物既能产生细胞免疫，又能产生体液免疫，能获得较好的免疫保护。

序列表中：

序列1为假单胞杆菌外毒素A结构域I与II的核苷酸序列；

序列2为假单胞杆菌外毒素A结构域I与II的氨基酸序列；

序列3为NrdF蛋白的核苷酸序列；

序列4为NrdF蛋白的氨基酸序列；

序列5为P102蛋白的核苷酸序列；

序列6为P102蛋白的氨基酸序列；

序列7为P97R1蛋白的核苷酸序列；

序列8为P97R1蛋白的氨基酸序列；

序列9为P97R2蛋白的核苷酸序列；

序列10为P97R2蛋白的氨基酸序列；

序列11为羧基末端部分的氨基酸序列1；

序列12为羧基末端部分的氨基酸序列2；

序列13为羧基末端部分的氨基酸序列3；

序列14为羧基末端部分的氨基酸序列4；

序列15为羧基末端部分的氨基酸序列5；

序列16为羧基末端部分的核苷酸序列。

具体实施方式

下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。

本发明实施例中所用的猪肺炎支原体NrdF蛋白、P102蛋白、P97R1蛋白、P97R2蛋白的序列，来源于已报道的国际标准株J株，在NCBI中的登录号为AE017243.1。

本发明实施例中，以大肠杆菌表达载体为例进行表达，通过基因工程手段获得猪肺炎支原体NrdF蛋白、P102蛋白、P97R1蛋白、P97R2蛋白，但该实施方式无论在任何情况下均不构成对本发明的限定。

本发明实施例以Montanide^TMGel01(法国SEPPIC公司)作为佐剂，并以体积比为10％的佐剂，制备猪支原体肺炎疫苗组合物为例进行阐述，但该实施方式无论在任何情况下均不构成对本发明的限定。

本发明实施例中猪支原体肺炎疫苗组合物所含组分分别以：

(1)PEA-NrdF-KDEL；

(2)PEA-P102-KDEL；

(3)PEA-P97R1-KDEL；

(4)PEA-P97R2-KDEL；

(5)PEA-P97R1-NrdF-KDEL；

(6)PEA-P97R2-NrdF-KDEL；

(7)PEA-NrdF-KDEL、PEA-P102-KDEL；

(8)PEA-P102-KDEL、PEA-P97R1-KDEL；

(9)PEA-P102-KDEL、PEA-P97R2-KDEL；

(10)PEA-NrdF-KDEL、PEA-P102-KDEL、PEA-P97R1-KDEL；

(11)PEA-NrdF-KDEL、PEA-P102-KDEL、PEA-P97R2-KDEL；

(12)PEA-NrdF-KDEL、PEA-P102-KDEL、PEA-P97R1-KDEL、PEA-P97R2-KDEL；

(13)PEA-NrdF-KDEL、PEA-P102-KDEL、PEA-P97R1-KDEL、PEA-P97R2-KDEL、PEA-P97R1-NrdF-KDEL；和

(14)PEA-NrdF-KDEL、PEA-P102-KDEL、PEA-P97R1-KDEL、PEA-P97R2-KDEL、PEA-P97R1-NrdF-KDEL、PEA-P97R2-NrdF-KDEL为例进行阐述，但该实施方式无论在任何情况下均不构成对本发明的限定。

本发明实施例中所采用的攻毒毒株为猪肺炎支原体CVCC354株，该毒株的保藏号为CVCC354，保藏单位为国家兽医微生物菌种保藏管理中心。

本发明实施例中肺病变指数采用28分法进行评判。所述28分法是根据猪支原体肺炎的典型肺部眼观病变，对发病程度进行量化判定，包括肺尖叶、心叶、膈叶、中间叶出现的实质样病变，如“肉样变”、“胰样变”。肺炎病变评分标准为：2个尖叶、2个心叶、2个膈叶、1个中间叶共计7个肺叶，每个肺叶满分为4分，共计28分。根据发生实质病变的肺叶面积所占该叶的比例，分别对每个肺叶进行打分。无肺炎病变记为0分；病变面积比例为1％-25％，记为1分；病变面积比例26％-50％，记为2分；病变面积比例为51％-75％，记为3分；病变面积比例为76％-100％，记为4分。如肺叶正反两面均有病变，以病变面积大的一面进行记分。各个肺叶打分总和即为该发病株的肺炎病变得分。分别对免疫组猪和对照组猪进行记分后，按照以下公式计算免疫组猪的肺叶病变减少率：

本发明实施例统计分析方法为：统计7个肺叶的肺病变指数，确定病变程度。用SPSS计算机软件进行ANOVA分析，比较各组间差异，确定病变差异的有效性。

本发明中所用的pH7.2PBS液配方为：1000mL蒸馏水中加入NaCl9g、Na₂HPO₄·12H₂O6g、NaH₂PO₄·2H₂O0.4g，本发明中所用到的化学试剂均为分析纯，购自国药集团。

为使本发明更加容易理解，下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于本发明而不用于限制本发明的范围。本发明所述的实验方法，若无特殊说明，均为常规方法；所述的生物材料，若无特殊说明，均可从商业途径获得。

实施例1融合蛋白PEA-NrdF-KDEL的表达、鉴定与纯化

根据NCBI(http://www.ncbi.nlm.nih.gov)报道的假单胞杆菌外毒素A(Pseudomonas aeruginosa PAO1，登录号：AE004091)、猪肺炎支原体J株(登录号：AE017243.1)中的NrdF蛋白中的基因序列(见SEQ ID No.3)，用PCR方法扩增假单胞杆菌外毒素A(PEA)结构域I与II，用RT-PCR方法扩增猪肺炎支原体NrdF蛋白；并用连续PCR的方法扩增羧基末端部分含KDEL多肽的基因(SEQ ID NO.16)。克隆完成后，通过基因工程手段将它们串联起来，作为融合蛋白。

1.1PEA结构域I与II、NrdF基因克隆载体的构建及鉴定

根据选取的PEA结构域I与II基因(见SEQ ID No.1)序列、NrdF基因(见SEQ IDNO.3)序列，使用Primer Premier5.0软件设计引物，用PCR方法扩增相应的目的基因。其中，PEA基因引物设计如下：

上游引物：5'-GCCGAGGAAGCCTTCGAC-3'，

下游引物：5'-GCCGTCGCCGAGGAACT-3'，

PCR扩增程序：95℃预变性5min，94℃变性45s，52℃复性30s，72℃延伸60s，35个循环，最后72℃延伸10min。

NrdF基因引物设计如下：

上游引物：5'-CGGGATCCTTAAAACTCCCAATCTT-3'，

下游引物：5'-CCCAAGCTTGATCTATTATATAAACTAAT-3'，

PCR扩增程序：95℃预变性5min，94℃变性45s，52℃复性30s，72℃延伸30s，35个循环，最后72℃延伸10min。

将获得的PCR扩增产物用1％琼脂糖凝胶进行电泳，检测结果显示：分别在1200bp、290bp附近出现相应的目的条带，与PEA结构域I与II片段、NrdF片段的大小相符。

将目的片段分别使用DNA凝胶回收试剂盒回收，并将回收后的目的基因片段分别连接至pMD18-T载体，以构建pMD18-T-PEA、pMD18-T-NrdF克隆载体。连接体系为：目的基因20μL、pMD18-T载体0.5μL、连接酶缓冲液2.0μL、T4DNA连接酶1.0μL、灭菌双蒸水8.5μL；反应条件为：16℃、30min。将连接产物加入DH5α感受态细胞，冰上放置30min，然后42℃加热45s，置冰上1min，加入890μL的LB液体培养基，37℃振荡培养60min，将培养物接种含100μg/mL氨苄青霉素的LB琼脂培养板，37℃培养过夜。观察结果显示：LB固体培养基均出现白色小菌落。挑白色典型菌落，分别接种于含有100μg/mL氨苄青霉素的LB液体培养基，200rpm培养10h。使用质粒回收试剂盒提取各转化菌质粒，分别命名为pMD18-T-PEA、pMD18-T-NrdF，并进行酶切鉴定。酶切鉴定结果显示：pMD18-T-PEA酶切后，出现2600bp左右的载体片段和1200bp左右的PEA片段；pMD18-T-NrdF酶切后，出现2600bp左右的载体片段和290bp左右的NrdF片段。

将酶切正确的质粒送基因公司测序，测序结果表明：扩增序列分别为PEA基因和NrdF基因，并且目的基因和载体连接正确。

1.2pMD18-T-NrdF-KDEL克隆载体的构建及鉴定

通过连续的PCR，将SEQ ID NO.16(编码KKDELRVELKDEL，即SEQ ID NO.15)中的基因连接至NrdF基因末端，构建SphI位点-KKDELRVELKDEL-终止密码子-HindIII序列的多核苷酸，并将扩增产物连接至pMD18-T载体，连接产物转化至大肠杆菌DH5α感受态细胞并进行培养。使用质粒提取试剂盒提取质粒后，使用SphI、HindIII双酶切鉴定并送基因公司进行测序。

酶切鉴定和测序结果表明：pMD18-T-NrdF-KDEL构建正确。

1.3pMD18-T-PEA-NrdF-KDEL克隆载体的构建和鉴定

构建的pMD18-T-PEA、pMD18-T-NrdF-KDEL载体分别使用SalI和HindIII双酶切，酶切产物电泳后，使用DNA凝胶回收试剂盒，分别回收pMD18-T-PEA、NrdF-KDEL片段，并使用DNA连接试剂盒连接，构建pMD18-T-PEA-NrdF-KDEL。将构建载体使用BamHI、HindIII双酶切鉴定，鉴定结果显示：酶切后，出现2600bp的载体片段和1500bp左右的目的条带。将阳性质粒送基因公司进行测序分析，测序结果表明：融合蛋白pMD18-T-PEA-NrdF-KDEL连接成功。

1.4pET-28a-PEA-NrdF-KDEL表达载体的构建及鉴定

将pMD18-T-PEA-NrdF-KDEL克隆载体、pET-28a表达载体，分别使用BamHI、HindIII双酶切，酶切产物电泳后使用DNA回收试剂盒回收PEA-NrdF-KDEL、pET-28a基因片段，使用DNA连接试剂盒，将PEA-NrdF-KDEL、pET-28a基因连接，构建pET-28a-PEA-NrdF-KDEL表达载体。将pET-28a-PEA-NrdF-KDEL载体导入Bal21感受态细胞并使用LB培养基培养过夜。使用质粒提取试剂盒提取培养菌质粒，并使用BamHI、HindIII双酶切鉴定，鉴定结果显示：酶切后，出现5300bp左右的载体片段和1500bp左右的目的条带。将阳性质粒送基因公司进行测序分析，测序结果表明：pET-28a-PEA-NrdF-KDEL构建正确。

1.5融合蛋白PEA-NrdF-KDEL的表达、鉴定

将含pET-28a-PEA-NrdF-KDEL质粒的Bal21菌，按1％(V/V)接种量接种含50μg/mL卡那霉素的LB液体培养基，37℃、180rpm培养6-8h，使细菌OD₆₀₀在0.6-1.0之间，加入IPTG，使终浓度为1mmol/L，继续培养5h，取样进行SDS-PAGE电泳，使用抗猪肺炎支原体阳性血清进行Western blot鉴定。

结果显示：相对于对照，含pET-28a-PEA-NrdF-KDEL质粒的Bal21菌经IPTG诱导5h，在66KDa附近出现相应的目的条带，主要存在于包涵体中。Western blot结果表明：该重组蛋白可与抗猪肺炎支原体阳性血清发生特异性结合反应。

1.6融合蛋白PEA-NrdF-KDEL的纯化

使用Ni⁺亲和层析柱对上述表达产物进行纯化。将含pET-28a-PEA-NrdF-KDEL质粒的Bal21菌，按1％(V/V)接种量接种含50μg/mL卡那霉素的LB液体培养基，37℃、180rpm培养6-8h，使细菌OD₆₀₀在0.6-1.0之间，加入IPTG使其终浓度为1mmol/L，继续培养5h后，收集细菌进行超声破碎，8000rpm离心30min，收集沉淀，使用包涵体溶解液溶解后，使用Ni⁺亲和层析柱进行纯化，纯化蛋白使用生理盐水进行透析，使用SDS-PAGE对其进行鉴定。鉴定结果表明：纯化产物经SDS-PAGE电泳后，目的蛋白片段与预期大小相符。

将鉴定合格的融合蛋白PEA-NrdF-KDEL纯化、透析后进行浓缩，浓缩蛋白含量为1mg/mL，于-20℃冻存。

实施例2融合蛋白PEA-P97R1-NrdF-KDEL的表达、鉴定与纯化

2.1pMD18-T-PEA-P97R1-NrdF-KDEL克隆载体的构建及鉴定

根据NCBI(http://www.ncbi.nlm.nih.gov)报道的PEA(登录号：AE004091)、猪肺炎支原体J株(登录号：AE017243.1)中的P97R1蛋白中的基因序列(见SEQ ID No.7)，使用Primer Premier5.0软件设计引物，分别扩增PEA基因、P97R1基因，引物序列如下：

PEA上游引物：5'-GCCGAGGAAGCCTTCGAC-3'，

PEA下游引物：5'-GCCGTCGCCGAGGAACT-3'，

P97R1上游引物：5'-GGTATATTACCTCAGCCCCCA-3'，

P97R1下游引物：5'-TTCCGGTGTTTTTAGGCTTAA-3'，

将PEA基因、P97R1基因的扩增产物回收，-20℃保存。

将纯化的P97R1基因和PEA基因作为模板，通过重叠延伸PCR技术将两片段连接，PCR扩增程序：95℃预变性5min，94℃变性45s，52℃复性45s，72℃延伸60s，40个循环，最后72℃延伸10min。

将PCR产物进行电泳，并回收相应1500bp左右的的PCR片段，回收产物与pMD18-T进行连接，构建pMD18-T-PEA-P97R1，并转化DH5α，在LB培养基培养后，提取质粒，并测序，将测序正确的质粒命名为pMD18-T-PEA-P97R1。

将测序正确的pMD18-T-PEA-P97R1载体与构建的pMD18-T-NrdF-KDEL分别使用SalI和HindIII双酶切，酶切产物进行电泳。使用DNA凝胶回收试剂盒回收pMD18-T-PEA-P97R1片段及NrdF-KDEL片段，使用DNA连接试剂盒进行连接，连接产物按实施例1转化DH5α大肠杆菌，经培养后，提取质粒，并测序，阳性质粒命名为pMD18-T-PEA-P97R1-NrdF-KDEL。

2.2pET-28a-PEA-NrdF-KDEL表达载体的构建及鉴定

将pMD18-T-PEA-P97R1-NrdF-KDEL克隆载体、pET-28a表达载体，分别使用BamHI、HindIII双酶切，酶切产物电泳后使用DNA回收试剂盒回收PEA-P97R1-NrdF-KDEL、pET-28a基因片段，使用DNA连接试剂盒，将PEA-P97R1-NrdF-KDEL、pET-28a基因连接，构建pET-28a-PEA-P97R1-NrdF-KDEL表达载体。将pET-28a-PEA-P97R1-NrdF-KDEL载体导入Bal21感受态细胞并使用LB培养基培养过夜，使用质粒提取试剂盒提取培养菌质粒，并使用BamHI、HindIII双酶切鉴定。

鉴定结果显示：酶切后，出现5300bp左右的载体片段和1600bp左右的目的条带。将阳性质粒送基因公司进行测序分析，测序结果表明：融合蛋白PEA-P97R1-NrdF-KDEL构建正确。

将鉴定合格后的融合蛋白PEA-P97R1-NrdF-KDEL纯化、透析后进行浓缩，浓缩蛋白含量为1mg/mL，于-20℃冻存。

实施例3融合蛋白PEA-P102-KDEL、PEA-P97R1-KDEL、PEA-P97R2-KDEL、PEA-P97R2-NrdF-KDEL的制备

3.1融合蛋白PEA-P102-KDEL、PEA-P97R1-KDEL、PEA-P97R2-KDEL的制备

根据NCBI(http://www.ncbi.nlm.nih.gov)报道的PEA(登录号：AE004091)，并依次参照猪肺炎支原体J株中的P102蛋白、P97R1蛋白、P97R2蛋白中的基因序列(依次见SEQID NO.5、SEQ ID NO.7、SEQ ID NO.9)，按照实施例1的方法构建克隆载体、表达载体并进行双酶切，将酶切后鉴定正确的融合蛋白依次命名为PEA-P102-KDEL、PEA-P97R1-KDEL、PEA-P97R2-KDEL。

将鉴定合格后的融合蛋白PEA-P102-KDEL、PEA-P97R1-KDEL、PEA-P97R2-KDEL分别纯化、透析后进行浓缩，浓缩蛋白含量为1mg/mL，于-20℃冻存。

3.2融合蛋白PEA-P97R2-NrdF-KDEL的制备

根据NCBI(http://www.ncbi.nlm.nih.gov)报道的PEA(登录号：AE004091)，并依次参照猪肺炎支原体J株中的P97R2蛋白、NrdF蛋白中的基因序列(依次见SEQ ID NO.9、SEQID NO.3)，按照实施例2的方法构建克隆载体、表达载体并进行双酶切，将酶切后鉴定正确的融合蛋白依次命名为PEA-P97R2-NrdF-KDEL。

将鉴定合格后的融合蛋白PEA-P97R2-NrdF-KDEL分别纯化、透析后进行浓缩，浓缩蛋白含量为1mg/mL，于-20℃冻存。

实施例4猪支原体肺炎疫苗组合物的制备

将实施例1-3分别制备的融合蛋白PEA-NrdF-KDEL、PEA-P102-KDEL、PEA-P97R1-KDEL、PEA-P97R2-KDEL、PEA-P97R1-NrdF-KDEL、PEA-P97R2-NrdF-KDEL，使用pH7.2PBS溶液稀释，将稀释后的融合蛋白溶液与Montanide^TMGel01佐剂按表1中猪支原体肺炎疫苗组合物所含组分及比例混合在一起，以500-800r/min的转速搅拌10-15min，在终止搅拌前加入1％(体积比)硫柳汞溶液，使其终浓度不超过万分之一，充分振荡混匀，分装后2-8℃保存备用。

表1猪支原体肺炎疫苗组合物所含组分及比例

实施例5不同组分的猪支原体肺炎疫苗组合物效力试验

将实施例4所制备的疫苗组合物，分别免疫选14-21日龄仔猪80头(排除猪繁殖与呼吸综合征、猪圆环2型和猪瘟)，共8组，5头/组，1mL/头份，同时设置J株参考疫苗对照(即灭活疫苗对照组)及阴性对照组。首次免疫后14天，按照相同剂量和途径进行二免，二免后28天，对所有猪气管注射猪肺炎支原体济南系强毒CVCC354株，100MID/头，观察28天后解剖，并观察肺部病变，按照28分法对肺部病变进行评分。

试验结果如下：

(1)免疫及攻毒后的临床症状

攻毒后大约10天左右，阴性对照组猪只(其中4只)陆续出现咳嗽、气喘等症状，皮毛不光滑；其他组别没有猪只出现气喘病的类似症状。

(2)肺炎病变评分

攻毒后28天，剖杀所有的猪只，按照28分计分法，对每只猪的肺病变进行评分，结果见表2。

表2猪支原体肺炎疫苗组合物效力检验结果

注1：第7组为灭活疫苗对照组，所选用的疫苗为现有产品中的猪支原体肺炎灭活疫苗(J株)，即安百克(M+PAC)。

注2：差异性统计分析中，组间比较，字母相同者表示差异不显著，字母不同者表示差异显著(p＜0.05)。

由表2可知：

(1)第1-4组(即免疫疫苗1-4组)分别使用含一种融合蛋白(依次为PEA-NrdF-KDEL、PEA-P102-KDEL、PEA-P97R1-KDEL、PEA-P97R2-KDEL)的疫苗组合物免疫后进行攻毒，免疫猪只的肺炎病变减少率均＞60％，与第15组(即灭活疫苗对照组)相比，差异不显著(p＞0.05)；但与第16组(阴性对照组)相比，差异显著(p＜0.05)。

(2)第5-6组(即免疫疫苗5-6组)分别使用含融合蛋白PEA-P97R1-NrdF-KDEL、PEA-P97R2-NrdF-KDEL的疫苗组合物免疫后进行攻毒，免疫猪只的肺炎病变减少率均＞66％，效果均优于第1-4组，且与第1-4组中的任一组相比，差异均不显著(p＞0.05)；与第15组(即灭活疫苗对照组)相比，差异也不显著(p＞0.05)；但与第16组(阴性对照组)相比，差异显著(p＜0.05)。

(3)第7-9组(即免疫疫苗7-9组)分别使用含两种融合蛋白的疫苗组合物免疫后进行攻毒，免疫猪只的肺炎病变减少率均＞70％，效果优于第1-6组，且与第1-6组中的任一组相比，差异均不显著(p＞0.05)；与第15组(即灭活疫苗对照组)相比，差异也不显著(p＞0.05)；但与第16组(阴性对照组)相比，差异显著(p＜0.05)。

(4)第10-11组(即免疫疫苗10-11组)分别使用含三种融合蛋白的疫苗组合物免疫后进行攻毒，免疫猪只的肺炎病变减少率均＞72％，效果优于第1-9组，且与第1-9组中的任一组相比，差异均不显著(p＞0.05)；与第15组(即灭活疫苗对照组)相比，差异也不显著(p＞0.05)；但与第16组(阴性对照组)相比，差异显著(p＜0.05)。

(5)第12组(即免疫疫苗12组)使用含四种融合蛋白的疫苗组合物免疫后进行攻毒，免疫猪只的肺炎病变减少率＞75％，效果优于第1-11组，且与第1-11组中的任一组相比，差异均不显著(p＞0.05)；与第15组(即灭活疫苗对照组)相比，差异也不显著(p＞0.05)；但与第16组(阴性对照组)相比，差异显著(p＜0.05)。

(6)第13组(即免疫疫苗13组)使用含五种融合蛋白的疫苗组合物免疫后进行攻毒，免疫猪只的肺炎病变减少率＞76％，效果优于第1-12组，且与第1-12组中的任一组相比，差异均不显著(p＞0.05)；与第15组(即灭活疫苗对照组)相比，免疫效果相当，且差异也不显著(p＞0.05)；但与第16组(阴性对照组)相比，差异显著(p＜0.05)。

(7)第14组(即免疫疫苗14组)使用含六种融合蛋白的疫苗组合物免疫后进行攻毒，免疫猪只的肺炎病变减少率均＞77％，效果优于第1-13组，且与第1-13组中的任一组相比，差异均不显著(p＞0.05)；与第15组(即灭活疫苗对照组)相比，差异也不显著(p＞0.05)，且免疫效果较优；但与第16组(阴性对照组)相比，差异显著(p＜0.05)。

综上所述：

(1)含一种猪肺炎支原体融合蛋白PEA-NrdF-KDEL、PEA-P102-KDEL、PEA-P97R1-KDEL、PEA-P97R2-KDEL、PEA-P97R1-NrdF-KDEL或PEA-P97R2-NrdF-KDEL的疫苗组合物免疫猪只后，未发生临床症状，肺炎病变减少率均＞60％，均能获得免疫保护；而且，含PEA-P97R1-NrdF-KDEL或PEA-P97R2-NrdF-KDEL的疫苗组合物的免疫效果优于含PEA-NrdF-KDEL、PEA-P102-KDEL、PEA-P97R1-KDEL或PEA-P97R2-KDEL疫苗组合物的免疫效果；

(2)含两种猪肺炎支原体融合蛋白的疫苗组合物免疫猪只后，未发生临床症状，猪只的肺炎病变减少率均＞70％，均能获得免疫保护，且免疫效果优于含一种融合蛋白的疫苗组合物的。

(3)含三种猪肺炎支原体融合蛋白的疫苗组合物免疫猪只后，未发生临床症状，猪只的肺炎病变减少率均＞72％，均能获得免疫保护，且免疫效果优于含一种或两种融合蛋白的疫苗组合物的。

(4)含四种猪肺炎支原体融合蛋白的疫苗组合物免疫猪只后，未发生临床症状，猪只的肺炎病变减少率＞75％，能获得免疫保护，且免疫效果优于含一种、两种或三种的疫苗组合物的。

(5)含五种猪肺炎支原体融合蛋白的疫苗组合物免疫猪只后，未发生临床症状，猪只的肺炎病变减少率＞76％，能获得免疫保护，且免疫效果与现有灭活疫苗的相当，并优于含一种、两种、三种或四种的疫苗组合物的。

(6)含六种猪肺炎支原体融合蛋白的疫苗组合物免疫猪只后，未发生临床症状，猪只的肺炎病变减少率＞77％，能获得免疫保护，且免疫效果略优于现有灭活疫苗的，也优于含一种、两种、三种、四种或五种的疫苗组合物的。

以上所述仅是本发明的优选实施例而已，并非对本发明做任何形式上的限制，虽然本发明已以优选实施例揭露如上，然而并非用以限定本发明，任何熟悉本专业的技术人员，在不脱离本发明技术方案的范围内，当可利用上述揭示的技术内容作出些许更动或修饰为等同变化的等效实施例，但凡是未脱离本发明技术方案的内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与修饰，均仍属于本发明技术方案的范围内。

Claims

1.一种融合蛋白，所述融合蛋白包含：

(1)假单胞杆菌外毒素A结构域I，

(2)假单胞杆菌外毒素A结构域II，

(3)猪肺炎支原体抗原性蛋白，以及

(4)羧基末端部分；

其中，猪肺炎支原体抗原性蛋白为NrdF蛋白、P102蛋白、P97R1蛋白、P97R2蛋白、P97R1-NrdF蛋白或P97R2-NrdF蛋白；

所述NrdF蛋白为SEQ ID No.4所示的蛋白，所述P102蛋白为SEQ ID No.6所示的蛋白，所述P97R1蛋白为SEQ ID No.8所示的蛋白，所述P97R2蛋白为SEQ ID No.10所示的蛋白；

所述猪肺炎支原体抗原性蛋白位于假单胞菌外毒素A结构域II与羧基末端部分之间，且假单胞杆菌外毒素A结构域II位于假单胞杆菌外毒素A结构域I与所述猪肺炎支原体抗原性蛋白之间。

2.根据权利要求1所述融合蛋白，其特征在于，所述羧基末端部分为含有氨基酸序列KDEL的多肽，其氨基酸序列为SEQ ID NO.11、SEQ ID NO.12、SEQ ID NO.13、SEQ ID NO.14或SEQ ID NO.15。

3.一种制备如权利要求1所述融合蛋白的方法，其特征在于，所述方法包括：通过基因工程手段，依次构建所述融合蛋白的克隆载体、表达载体，并对所述融合蛋白进行表达、纯化及鉴定。

4.一种猪支原体肺炎疫苗组合物，其特征在于，所述疫苗组合物包括免疫量的如权利要求1-2任一项所述融合蛋白和/或其组合以及兽医学上可接受的佐剂。

5.根据权利要求4所述疫苗组合物，其特征在于，所述佐剂为铝胶佐剂、皂苷、油包水乳剂、水包油乳剂、水包油包水乳剂、丙烯酸、甲基丙烯酸的聚合物、顺丁烯二酸酐和链烯基(alkenyl)衍生物的共聚物、RIBI佐剂系统、Block co-polymer、SAF-M、单磷酰脂质A、Avridine脂质-胺佐剂、大肠杆菌不耐热肠毒素、霍乱毒素、IMS 1314、胞壁酰二肽或Gel佐剂中的一种或几种。

6.根据权利要求5所述疫苗组合物，其特征在于，所述佐剂为Gel佐剂。

7.根据权利要求4-6任一项所述疫苗组合物，其特征在于，所述疫苗组合物还包括其他抗原，所述其他抗原包括猪圆环病毒抗原、猪繁殖与呼吸综合征病毒抗原、副猪嗜血杆菌抗原、猪细小病毒抗原、大叶性肺炎放线杆菌抗原、大肠杆菌抗原、猪萎缩性鼻炎抗原、猪伪狂犬病病毒抗原、猪霍乱病原抗原、猪流感病毒抗原中的一种或多种。

8.根据权利要求7所述疫苗组合物，其特征在于，所述其他抗原为猪圆环病毒抗原。

9.权利要求4-8任一项所述疫苗组合物在制备预防和/或治疗猪支原体肺炎的药物中的应用。