ES2330904B1 - Polinucleotidos de haemophilus parasuis y su uso. - Google Patents

Polinucleotidos de haemophilus parasuis y su uso. Download PDF

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Abstract

Polinucleótidos de Haemophilus parasuis y su uso.
La presente invención se refiere a polinucleótidos de Haemophilus parasuis obtenidos mediante tecnología recombinante. También se refiere a los polipéptidos que son expresados por dichos polinucleótidos y también a una vacuna contra H. parasuis que comprende dichos polipéptidos. En otro aspecto, la invención también se refiere al uso de los polinucleótidos para determinar si una cepa de H. parasuis es virulenta o avirulenta.

Description

Polinucleótidos de Haemophilus parasuis y su uso.
Campo de la técnica
La presente invención se encuadra en el campo del desarrollo de vacunas contra Haemophilus parasuis que comprenden polipéptidos obtenidos por tecnología recombinante.
Estado de la técnica anterior
La bacteria H. parasuis es el agente causante de la enfermedad de Glässer (poliserositis-artritis porcina) que tiene repercusiones económicas importantes en la industria porcina.
Se considera que la inmunidad materna aportada por el calostro es un factor determinante para la prevención de la enfermedad. La práctica del destete precoz de los lechones ha incrementado la frecuencia de esta enfermedad y ha aumentado la utilización de vacunas.
H. parasuis es una bacteria comensal del tracto respiratorio superior que sólo causa enfermedad cuando llega a colonizar el tracto respiratorio inferior y en particular los pulmones, provocando neumonías.
Ciertas cepas de alta virulencia cruzan la barrera pulmonar y colonizan tejidos séricos provocando serositis, pericarditis, artritis y en ciertas circunstancias meningitis. Consecuentemente, ciertas cepas de H. parasuis tienen el poder de colonizar e invadir eficazmente numerosos tejidos contrariamente a las cepas avirulentas que se quedan localizadas en el tracto respiratorio superior.
Una de las características primordiales de H. parasuis es su variabilidad antigénica, que reduce en gran medida la eficacia de las vacunas.
Existen por lo menos 15 serotipos, ya que un número importante de cepas no son tipificables, y cuando se procede a infecciones experimentales en cerdos el grado de virulencia es variable según la cepa.
Kielstein et al., J. Clin. Micro. 30: 4: 862 (1992) describe que existe una correlación entre serotipos y el grado de virulencia de la cepa. Se considera que las cepas de serotipo 1, 5, 10 y 12 son de gran virulencia mientras que las de serotipo 2, 4 y 15 son moderadamente virulentas y las de serotipo 3, 6, 7, 9 y 11 son avirulentas. Sin embargo, esta clasificación serológica no es absoluta y en la práctica se observan numerosas excepciones a esta regla.
No se conoce un método de diagnóstico comercial para clasificar las cepas de H. parasuis en virulentas y avirulentas, por lo que sería deseable disponer de un método que permitiera determinar si una cepa de H. parasuis es virulenta o no, sin tener que esperar a que se pusieran de manifiesto los síntomas de la enfermedad, y poder proceder al eventual tratamiento de la misma sin demora.
Para proteger cerdos contra H. parasuis se emplean vacunas que comprenden bacterias inactivadas (bacterinas), pero la eficacia es limitada porque inducen una respuesta inmune humoral dirigida esencialmente contra lipopolisacáridos que pueden variar de una cepa a otra.
En la solicitud de patente WO-A-00/01408 se describen vacunas contra las infecciones causadas por H. parasuis que utilizan un extracto celular de bacterias que tiene una actividad tóxica cuando se administra a cerdos por vía intraperitoneal, pero que ejerce una acción protectora cuando se administra por vía intramuscular en presencia de un adyuvante.
Por el momento no se ha caracterizado la naturaleza molecular de los antígenos responsables de la respuesta inmune y de la protección. Solamente se conoce que la actividad tóxica del extracto celular reside en una fracción proteica de alto peso molecular.
Esto se ha observado también en el caso de otra especie como es Haemophilus influenzae, ya que Hendrixson et al., Mol. Cell. 2: 841 (1998) describe que las moléculas responsables de la colonización e invasión de tejidos son glicoproteínas de membrana con propiedades de autotransporte, denominadas adhesinas, invasinas o hemaglutininas.
Para dicha especie H. influenzae, en la solicitud de patente WO-A-96/30519 se describen vacunas contra las infecciones causadas por dicha bacteria que contienen proteínas de adhesión obtenidas mediante tecnología recombinante.
No obstante, el principal inconveniente para desarrollar vacunas que confieran una buena protección inmunológica, reside en el desconocimiento existente sobre el genoma de H. parasuis, y en particular sobre los polinucleótidos que codifican las adhesinas, invasinas o hemaglutininas de H. parasuis.
Subsiste pues la necesidad de disponer de vacunas eficaces contra las infecciones causadas por H. parasuis.
Los autores de esta invención han desarrollado una vacuna contra las infecciones causadas por H. parasuis que incluye polipéptidos obtenidos mediante tecnología recombinante.
Objeto de la invención
El objeto de la presente invención es proporcionar polinucleótidos de H. parasuis.
En un segundo aspecto la invención tiene también por objeto los polipéptidos expresados por los polinucleótidos de la invención.
En un tercer aspecto la invención tiene también por objeto un vector de expresión que comprende al menos un polinucleótido de H. parasuis de la invención.
En un cuarto aspecto la invención tiene también por objeto una célula huésped transformada con un vector de expresión que comprende al menos un polinucleótido de H. parasuis de la invención.
En un quinto aspecto la invención tiene también por objeto un procedimiento para la preparación de los polipéptidos recombinantes de H. parasuis.
En un sexto aspecto la invención tiene también por objeto el uso de los polipéptidos de la invención para la preparación de vacunas y/o composiciones inmunogénicas.
En un séptimo aspecto la invención tiene también por objeto una vacuna contra las infecciones causadas por H. parasuis.
En un octavo aspecto la invención tiene también por objeto el uso de los polinucleótidos para determinar si una cepa de H. parasuis es virulenta o avirulenta.
En un noveno aspecto la invención tiene también por objeto un kit para determinar si una cepa de H. parasuis es virulenta o avirulenta.
Descripción de las figuras
Figura 1
En la Figura 1 se muestra un diagrama de las diferentes etapas técnicas que conducen a la secuenciación y anotación de los genes y proteínas codificante para polipéptidos considerados autotransportadores, adhesinas, invasinas o hemaglutininas de H. parasuis.
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Figura 2
En la Figura 2 se muestra la alineación múltiple de las partes 3' terminales de los polinucleótidos que codifican los polipéptidos de H. parasuis. Los polinucleótidos se pueden agrupar en tres grupos estructurales denominados grupo 1, grupo 2, y grupo 3. El grupo 1 comprende los nucleótidos SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 23, y SEQ ID NO: 25. El grupo 2 comprende los nucleótidos SEQ ID NO: 5, y SEQ ID NO: 11. El grupo 3 comprende los nucleótidos SEQ ID NO: 13, y SEQ ID NO: 17. El polinucleótido definido por la secuencia SEQ ID NO: 15 se considera que pertenece al grupo1, pero no se puede introducir en la alineación múltiple de todos los polinucleótidos porque le falta un fragmento de la parte 3' terminal. Las alineaciones múltiples se consiguen aplicando el programa CLUSTALX descrito en Thompson et al., Nucleic Acids Res. 25: 4876 (1997).
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Figura 3
En la Figura 3 se muestra la alineación múltiple de los polinucleótidos que codifican las partes 5' terminales de los polipéptidos de H. parasuis. Se observa una buena conservación en los 206 nucleótidos, y la identidad es completa para los 36 primeros nucleótidos.
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Figura 4
En la Figura 4 se muestra la alineación múltiple de los aminoácidos de los polipéptidos de H. parasuis. Los polipéptidos pueden agruparse en tres grupos estructurales denominados grupo1, grupo 2, y grupo 3. El grupo 1 comprende los polipéptidos SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 24 y SEQ ID NO: 26. El grupo 2 comprende los polipéptidos SEQ ID NO: 6, y SEQ ID NO: 12. El grupo 3 comprende los polipéptidos SEQ ID NO: 14, y SEQ ID NO: 18.
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Figura 5
En la Figura 5 se muestra la electroforesis por gel de agarosa de los productos de amplificación de los polinucleótidos de la invención de varias cepas virulentas y no virulentas de H. parasuis.
En la Figura 5A se presentan los productos de amplificación correspondientes a los polinucleótidos del grupo 1, definidos por las secuencias SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO 19, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 23.y SEQ ID NO: 25.
En la Figura 5B se presentan los productos de amplificación correspondientes a los polinucleótidos del grupo 2, definidos por las secuencias SEQ ID NO: 5, y SEQ ID NO: 11.
En la Figura 5C se presentan los productos de amplificación correspondientes a los polinucleótidos del grupo 3 definidos por las secuencias SEQ ID NO: 13, y SEQ ID NO: 17.
En el carril M se presenta una escalera de 1 kb (New England Biolabs), que se ha empleado como marcador de peso molecular.
En el carril a se presentan los productos de amplificación correspondientes a la cepa H. parasuis (Nagasaki), que es una cepa de referencia de serotipo 5 altamente virulenta reproduciendo experimentalmente la enfermedad de Glässer.
En las columnas b-e se presentan los productos de amplificación correspondientes a cepas aisladas de la cavidad nasal de cerdos que no presentaban ningún síntoma o lesión característica de la enfermedad de Glässer y/o procedentes de granjas sin historial de la enfermedad.
En las columnas f-k se presentan los productos de amplificación correspondientes a cepas aisladas de distintos órganos de cerdos con la enfermedad de Glässer confirmada.
En la Figura 5B, la flecha situada sobre una banda de la columna j indica el producto de PCR de la cepa virulenta HP2269 que se ha secuenciado con el cebador pADH-F (SEQ ID NO: 27), y que expresa un polipéptido denominado HP2269-2-j-1. La nomenclatura empleada identifica la cepa: HP2269, el grupo: 2, el carril de la electroforesis: j, y la posición de la banda empezando desde el peso molecular más bajo: 1.
Figura 6
En la Figura 6 se muestra el resultado de la comparación de la secuencia de aminoácidos correspondiente al polipéptido denominado HP2269-2-j-1. Dicho polipéptido es expresado por el producto de PCR perteneciente al polinucleótido de más bajo peso molecular del grupo 2 de la cepa HP2269 (banda señalada por una flecha en la Figura 5). La secuencia de polinucleótidos obtenida con el cebador pADH-F (SEQ ID NO: 27) se traduce in silico, y la secuencia del polipéptido resultante se compara con las secuencias de los polipéptidos de la invención mediante el programa blastX.
En la Figura 6A se presenta la alineación obtenida con el polipéptido SEQ ID NO: 16 perteneciente al grupo 1, y en la Figura 6B la alineación obtenida con el polipéptido SEQ ID NO: 12, perteneciente al grupo 2. En ambos casos la secuencia de aminoácidos del polipéptido HP2269-2-j-1 presenta un 59% de identidad.
Descripción detallada de la invención Identificación de los polinucleótidos
La presente invención proporciona polinucleótidos que se han identificado después de secuenciar el genoma de la cepa H. parasuis (Nagasaki), que es una cepa de referencia de serotipo 5 altamente virulenta reproduciendo experimentalmente la enfermedad de Glässer (Takahashi et al., J. Vet. Med. Sci. 63: 487 (2001)).
Los polinucleótidos de la invención tienen en común que expresan polipéptidos que tienen una homología significativa con autotransportadores, adhesinas, invasinas, hemaglutininas, y proteínas de membrana externa presentes en diversas protobacterias, es decir, expresan polipéptidos que están expuestos en la superficie de la bacteria a los anticuerpos del sistema inmunitario del huésped, de modo que son apropiados para preparar vacunas contra las infecciones causadas por H. parasuis.
El objeto de la invención se refiere a un polinucleótido de H. parasuis que tiene una secuencia seleccionada entre el grupo formado por SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 23, y SEQ ID NO: 25.
El procedimiento empleado para la identificación de los polinucleótidos comprende la combinación de técnicas recombinantes con tratamientos informáticos, como se muestra en el esquema de la Figura 1.
Los métodos experimentales que se emplean en el procedimiento para la identificación de los polinucleótidos de la invención constituyen técnicas bien conocidas por el experto en la materia, y se encuentran bien descritos, por ejemplo, en el libro de Sambrook et al., op.cit.
El experto también dispone de una información complementaria que consiste en la documentación que acostumbra a acompañar los productos y equipos bioquímicos, en donde el fabricante sugiere procedimientos para el empleo de los productos y de los equipos.
De acuerdo con el esquema de la Figura 1, el procedimiento experimental que se sigue para la identificación de los polinucleótidos de la invención comprende las siguientes etapas:
1.- Cultivo de una cepa virulenta de H. parasuis
Para la purificación de ADN genómico y la realización de genotecas se escoge la cepa Nagasaki de H. parasuis, donación del Dr. Pat Blackall del Animal Research Institute (Queensland, Australia), que es una cepa virulenta de serotipo 5.
La cepa se cultiva en seis placas de 90 mm de diámetro sembradas a saturación en agar chocolate (Bio Mérieux) en estufa a 37ºC con 5% de CO_{2} durante 48 horas. Se obtienen 3x10^{10} unidades formadoras de colonias (UFCs).
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2.- Purificación del ADN genómico de H. parasuis
Las bacterias se recuperan de las placas por resuspensión en solución tampón PBS (Amresco) y se sedimentan por centrifugación a 3000 g. El sobrenadante se elimina, y el sedimento de bacterias se resuspende brevemente. A continuación se procede a la purificación del ADN genómico utilizando el kit Genomic-tip 100/G (Qiagen). Al finalizar el proceso de purificación se comprueba la integridad del ADN por electroforesis en gel de agarosa, obteniendo una banda única con un peso molecular superior a 30.000 pb (pares de bases).
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3.1- Fragmentación del ADN genómico por digestión enzimática
Se utilizan dos enzimas de restricción, Sau 3AI y Rsa I (New England Biolabs) para fragmentar el ADN genómico de H. parasuis con los tampones de reacción adecuados y la albúmina sérica bovina (BSA) proveídos por el fabricante. El enzima de restricción Sau 3AI genera fragmentos cohesivos en el ADN de H. parasuis, y el enzima Rsa I fragmentos romos. En ambos casos, los fragmentos tienen un tamaño mayoritariamente comprendido entre 300 y 1.200 pb que los hace apropiados para ser clonados en plásmidos.
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3.2.- Fragmentación del ADN genómico por sonicación
El tratamiento con ultrasonidos fragmenta el ADN genómico de manera aleatoria. La sonicación se efectúa sobre una solución de ADN de H. parasuis en un sonicador B. Braun Labsonic U. Se efectúan ciclos de sonicación a diferentes tiempos con diferente potencia según métodos convencionales bien conocidos por el experto.
Los fragmentos de ADN sonicados tienen un tamaño comprendido entre 100 y 1.500 pb, y la mayoría de ellos están comprendidos entre 400 y 900 pb, y se convierten en fragmentos con extremos romos mediante el empleo del enzima T4 polimerasa (New England Biolabs).
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4.- Purificación por gel de agarosa de fragmentos de ADN digeridos o sonicados
Los fragmentos de ADN genómico de H. parasuis digeridos o sonicados se purifican en un gel de agarosa.
Con el ADN digerido con Sau 3AI se recuperan los fragmentos de 300 a 600 pb; con el ADN digerido con Rsa I, se recuperan los fragmentos de 400 a 800 pb, y con el ADN sonicado, se recuperan los fragmentos de 400 a 1500 pb.
La extracción de los fragmentos de ADN contenidos en los trozos de gel se efectúa con el kit QIAquick Gel Extraction (Qiagen) o el kit MinElute Gel Extraction (Qiagen).
Los fragmentos de ADN purificados son cuantificados mediante la migración de una alícuota en gel de agarosa en el cual se ha migrado también un estándar de ADN cuantificado (pUC19 de New England Biolabs).
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5.- Clonación de fragmentos de ADN en el plásmido pUC19
El plásmido pUC19 (New England Biolabs) es un plásmido de alto número de copias con sitios de clonación múltiple en el gen de la beta-galactosidasa que permite insertar fragmentos de ADN con una alta eficacia.
Para poder insertar los fragmentos de ADN obtenidos por digestión y por sonicación se prepara el plásmido para que sea compatible con los extremos cohesivos o romos de los fragmentos de ADN obtenidos.
La preparación del plásmido consiste en cortar el mismo con los enzimas adecuados para generar extremidades cohesivas o romas, y en la desfosforilación de las extremidades del plásmido con una fosfatasa para evitar su ciclación.
Para preparar el plásmido pUC19 con el fin de insertar los fragmentos de ADN genómico de H. parasuis generados por el enzima de restricción Sau 3AI, se realizan dos ciclos que incluyen cada uno una digestión con BamHI (New England Biolabs), una purificación con el kit MinElute Reaction Cleanup (Qiagen), y una desfosforilación con la fosfatasa intestinal de ternera CIP (New England Biolabs), seguido de una purificación con el kit MinElute Reaction Cleanup (Qiagen).
Para insertar los fragmentos de ADN genómico de H. parasuis generados por el enzima de restricción Rsa I en el plásmido pUC19 se utiliza el enzima de restricción SmaI (New England Biolabs), y la desfosforilación de pUC19 se efectúa con la fosfatasa alcalina bacteriana BAP (Invitrogen) sin purificación previa del producto digerido. El plásmido desfosforilado, después de una migración en gel de agarosa se purifica con el kit MinElute Gel Extraction (Qiagen).
En el caso de la inserción de los fragmentos de ADN genómico de H. parasuis generados por sonicación se utiliza el enzima de restricción SmaI (New England Biolabs) para cortar el plásmido pUC19. En este caso la desfosforilación se efectúa con tres variantes para mejorar las capacidades de inserción de este plásmido:
a)
con la fosfatasa intestinal de ternera CIP (New England Biolabs),
b)
con la fosfatasa alcalina bacteriana BAP (Invitrogen), y
c)
con una etapa de purificación previa en gel de agarosa empleando el kit MinElute Gel Extraction (Qiagen), y a continuación se lleva a cabo la desfosforilación con la fosfatasa intestinal de ternera CIP (New England Biolabs)
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Finalmente, después de una migración por gel de agarosa, los plásmidos desfoforilados se purifican con el kit MinElute Gel Extraction (Qiagen), y cuantificados por migración de una alícuota en gel de agarosa en el cual se migra conjuntamente un estándar de ADN cuantificado (pUC19 de New England Biolabs).
Aunque se realizaron y se explotaron genotecas con todas las preparaciones descritas, el modo de preparación c) resulta ser el más efectivo.
La inserción de los fragmentos de ADN de H. parasuis (Nagasaki) en los plásmidos desfosforilados se realiza mediante la ligasa T4 (Quick Ligation Kit, New England Biolabs). Seguidamente se purifican los productos de la reacción con el kit MinElute Reaction Cleanup (Qiagen), realizando la elución con agua milliQ.
Se utilizan las bacterias electrocompetentes E. coli DH5\alpha o DH10B, que son defectivas en el gen lac Z de la beta galactosidasa y sensibles a la ampicilina. Dichas bacterias se transforman por electroporación con los productos de ligación purificados.
De este modo se obtienen bacterias recombinantes; la mayoría de ellas incorporan el plásmido pUC19 con inserciones de los fragmentos de ADN de H. parasuis.
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6.- Selección de clones recombinantes
Las colonias de las bacterias que incorporan pUC19 con una inserción de ADN de H. parasuis son de color blanco, mientras que las bacterias azules son las que contienen el plásmido pUC19 sin la inserción de un fragmento de ADN de H. parasuis. De este modo se pueden seleccionar los clones apropiados.
Cada genoteca contiene habitualmente decenas de miles de recombinantes. Los mejores resultados fueron obtenidos con el plásmido pUC19 cortado con SmaI desfosforilado y purificado según la variante c).
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7.- Purificación de los plásmidos recombinantes
Para purificar los plásmidos recombinantes se pueden utilizar los kits:
-
R.E.A.L Prep 96 BioRobot (Qiagen) y NucleoSpin 96 Flash (Macherey-Nagel) con un autómata (BioRobot 3000, Qiagen), o
-
NucleoSpin 96 Flash (Macherey-Nagel) si este proceso se realiza manualmente.
Estos kits utilizan el principio de la lisis alcalina de las bacterias seguido de una neutralización, clarificación del lisado, y precipitación de los plásmidos por la adición de isopropanol.
Típicamente la concentración del plásmido se sitúa entre 50 y 150 ng/\mul.
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8.- Secuenciación de los fragmentos de ADN de H. parasuis clonados en los plásmidos
La gran mayoría de los plásmidos purificados poseen insertado un fragmento de ADN de H. parasuis (Nagasaki) en el sitio de clonación de pUC19.
Los insertos se secuencian mediante uno u otro de dos cebadores universales situados a las dos extremidades del sitio de clonación por extensión con la Taq polimerasa en presencia de dNTPs (nucleótidos dATP, dGTP, dCTP, y dTTP) y ddNTPs; estos últimos marcados con fluorocromos diferentes.
Los cebadores universales que se emplean son de Eurogentec, y tienen las secuencias:
-
5'-GTAAAACGACGGCCAGT-3'
-
5'-AACAGCTATGACCATG-3'.
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Se realizan 23.676 secuencias con el kit BigDye Terminator v3.1 (Applied Biosystems) en placas de 96 pocillos (Applied Biosystems o Axygen) adaptables a termocicladores y secuenciadores del fabricante Applied Biosystems.
La lectura de las secuencias se efectúa de manera automática introduciendo en ficheros informáticos todos los parámetros necesarios para construir los electroferogramas.
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9.- Ensamblado de las secuencias
En la presente invención se utiliza la cadena de programas Phred (Ewing and Green, Genome research, 8: 175, 186(1998)), y Phrap y Consed (Gordon et al., Genome Research, 8: 195(1998)) para ensamblar los 23.676 polinucleótidos descritos en el apartado 8.
Un contig es el ensamblado de varias secuencias de polinucleótidos con un grado significativo de solapamiento.
En total se obtienen 721 contigs y 94 secuencias huérfanas (secuencias que no entran dentro de un contig). Sumando el tamaño en nucleótidos de todos los contigs y secuencias huérfanas se obtienen 2.139.054 pb. Si se tiene en cuenta que el tamaño estimado de H. parasuis (Nagasaki) es de aproximadamente 2.500.000 pb, se puede considerar que se ha cubierto más del 80% del genoma de H. parasuis (Nagasaki) con una buena calidad de secuenciación.
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10.- Anotación de los contigs e identificación de los polipéptidos de H. parasuis
La anotación de los polinucleótidos (contigs) obtenidos en el apartado 9 se realiza utilizando el programa de comparación de secuencias denominado blastX con la base de datos GenBank nr que se puede encontrar en la web del National Center for Biotechnology Information (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/).
El programa traduce in silico los polinucleótidos en polipéptidos, y se seleccionan aquellas alineaciones de polipéptidos que tienen una mayor probabilidad de ser homólogas con secuencias de polipéptidos del tipo adhesinas, invasinas, hemaglutininas y autotransportadores de otros microorganismos, que son unas proteínas consideradas responsables de la colonización e invasión de tejidos en numerosos microorganismos.
Los inventores han identificado secuencias de interés en 13 contigs de polinucleótidos, que han denominado SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 23, y SEQ ID NO: 25.
Las secuencias de los polipéptidos que se comparan, se corresponden con las traducciones in silico de los polinucleótidos de la invención, de modo que el polipéptido definido por la secuencia SEQ ID NO: 2 es la traducción in silico del polinucleótido definido por la secuencia SEQ ID NO: 1, y así sucesivamente hasta el polipéptido definido por la secuencia SEQ ID NO: 26, resultante de la traducción in silico del polinucleótido definido por la secuencia SEQ ID NO: 25.
No se ha identificado ninguna secuencia de ADN de otros organismos que presente una homología significativa con las secuencias de los polinucleótidos de la invención, cuando se comparan dichas secuencias con las secuencias presentes en la base de datos GenBank utilizando el programa blastN.
Por tanto, las secuencias de polinucleótidos de la invención son nuevas. Además presentan un buen grado de homología entre ellos, que se pone de manifiesto en la alineación múltiple de las extremidades 5' de todos los polinucleótidos de la invención (Figura 3). Dicha alineación múltiple muestra una buena conservación en los 206 primeros nucleótidos, siendo la identidad completa para los 36 primeros nucleótidos.
Como se muestra en la alineación múltiple de las partes 3' terminales de los polinucleótidos de H. parasuis de la Figura 2, los polinucleótidos se pueden agrupar en tres grupos estructurales denominados grupo 1, grupo 2, y grupo 3. El grupo 1 comprende los nucleótidos SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 19 SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 23 y SEQ ID NO: 25. El grupo 2 comprende los nucleótidos SEQ ID NO: 5, y SEQ ID NO: 11. El grupo 3 comprende los nucleótidos SEQ ID NO: 13, y SEQ ID NO: 17. El polinucleótido SEQ ID NO: 15 no se puede clasificar formalmente en ningún grupo porque le falta al menos un fragmento de la parte 3' terminal. Sin embargo, los últimos 198 nucleótidos de SEQ ID NO: 15, poseen una identidad comprendida entre el 98% y el 99% con las regiones correspondientes a todas las secuencias del grupo 1, por lo que se considera que SEQ ID NO: 15 pertenece al grupo 1.
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Procedimiento para la preparación de los polinucleótidos de la invención
A partir de los alineamientos múltiples de la parte 5' de los polinucleótidos SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 23, y SEQ ID NO: 25, que se muestran en la Figura 3, se deriva un oligonucleótido que hibrida con los primeros 27 nucleótidos a partir del codón de inicio de los polipéptidos.
Dicho oligonucleótido, que también se puede denominar cebador, tiene la siguiente secuencia:
pADH-F: 5'-ATGAATAAAATATTTAGAGTTATTTGG-3' (SEQ ID NO: 27) 
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Los oligonucleótidos que se mencionan en esta descripción se han obtenido de la empresa Eurogentec, que los prepara a escala comercial a partir de la secuencia que se le entrega.
De la misma manera, a partir del alineamiento múltiple de la extremidad 3' de los polinucleótidos (Figura 2), se derivan tres oligonucleótidos, que hibridan con los últimos 24 o 25 nucleótidos de los genes de los polipéptidos acabando en el codón del último aminoácido.
Las secuencias de estos oligonucleótidos (Eurogentec) son:
pADH-R1: 5'-CCACACAAAACCTACCCCTCCTCC-3' (SEQ ID NO: 28)
pADH-R2: 5'-CCACTGATAACCTACCCCCACAGAG-3' (SEQ ID NO: 29)
pADH-R3: 5'CCACTGTAATGCAATACCTGCACC-3' (SEQ ID NO: 30) 
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El oligonucleótido pADH-R1 hibrida con los polinucleótidos del grupo 1 (SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 23 y SEQ ID NO: 25). Asimismo el oligonucleótido pADH-R2 hibrida con los polinucleótidos del grupo 2 (SEQ ID NO: 5 y SEQ ID NO: 11) y el oligonucleótido pADH-R3 hibrida con los polinucleótidos del grupo 3 (SEQ ID NO: 13 y SEQ ID NO: 17).
Los oligonucleótidos aquí descritos se pueden emplear como cebadores para amplificar los polinucleótidos de la invención en una cepa de H. parasuis (Nagasaki) utilizando, por ejemplo, el sistema AccuPrime^{TM} Taq DNA Polymerase High Fidelity (Invitrogen).
El resultado de la amplificación se analiza por electroforesis en un gel de agarosa al 0.8% teñido por SybrGold (Molecular Probes).
En el carril a de la Figura 5 se muestran los productos de amplificación correspondientes a la cepa H. parasuis (Nagasaki).
En el carril M de la Figura 5 se presenta una escalera de 1 kb (New England Biolabs), que se ha empleado como marcador de peso molecular.
Se pueden distinguir los productos de amplificación correspondientes a las secuencias SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 19 SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 23 y SEQ ID NO: 25 del grupo 1 (Figura 5A, columna a); SEQ ID NO: 5 y SEQ ID NO: 11 del grupo 2 (Figura 5B, columna a); SEQ ID NO: 13 y SEQ ID NO: 17 del grupo 3 (Figura 5C, columna a) indicados por el signo < y su número correspondiente.
El polinucleótido SEQ ID NO: 15 se encuentra en la zona de los polinucleótidos definidos por las secuencias SEQ ID NO: 3 y SEQ ID NO:23.
Se puede comprobar que existe una buena correlación entre el tamaño expresado en pares de bases (pb) de las secuencias SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 23 y SEQ ID NO: 25, y los pesos moleculares aparentes de los productos de amplificación indicados en el gel.
Cada una de las bandas de polinucleótido se extrae y se puede amplificar posteriormente siguiendo técnicas convencionales como las mencionadas anteriormente en esta descripción, de modo que se obtienen productos de amplificación para cada uno de los polinucleótidos de la invención.
En el caso de los polinucleótidos que tienen pesos moleculares semejantes, y aparecen confundidos en el gel de la electroforesis, se separan posteriormente mediante una electroforesis realizada en unas condiciones que permita su separación, como es bien conocido por el experto, por ejemplo, aumentando la longitud del gel y/o el tiempo de desarrollo de la electroforesis, o clonando en vectores plasmídicos.
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Procedimiento para determinar si una cepa de H. parasuis es virulenta o avirulenta
Como ya se ha mencionado anteriormente, una de las características primordiales de H. parasuis es su variabilidad antigénica, y cuando se realizan infecciones experimentales en animales, el grado de virulencia es variable según la cepa. Por tanto, es deseable disponer de un procedimiento para identificar las cepas de H. parasuis que permita su clasificación entre virulentas y avirulentas.
En un aspecto de la invención, ésta tiene por objeto el uso de los polinucleótidos de la invención para determinar si una cepa de H. parasuis es virulenta o avirulenta.
Se ha encontrado que las cepas virulentas presentan productos de amplificación genómica correspondientes a uno o a varios polinucleótidos de la invención, mientras que las cepas avirulentas no los presentan.
El procedimiento para determinar si una cepa de H. parasuis es virulenta o avirulenta sigue substancialmente el protocolo experimental de amplificación genómica de los polinucleótidos descrito en el apartado anterior (Procedimiento para la preparación de los polinucleótidos de la invención).
En este caso se ensaya el ADN de una cepa cuyo genotipo de virulencia se desea determinar, y además se puede ensayar el ADN de la cepa H. parasuis (Nagasaki), que sirve de control.
En dicho procedimiento se emplea el cebador pADH-F, conjuntamente con uno de los cebadores pADH-R1, pADH-R2, y pADH-R3, ya mencionados anteriormente, para amplificar de forma selectiva los polinucleótidos del grupo 1, 2 y 3, respectivamente.
La amplificación se puede llevar a cabo empleando, por ejemplo, el sistema AccuPrime^{TM} Taq DNA Polymerase High Fidelity (Invitrogen).
El resultado se analiza por electroforesis en un gel de agarosa al 0.8% teñido por SybrGold (Molecular Probes).
En la Figura 5 se muestran los productos de amplificación correspondientes a la cepa H. parasuis (Nagasaki), carril a, y a varias cepas ensayadas, que como se verá en los Ejemplos, corresponden a distintos serotipos:
-
Los carriles b-e se presentan los productos de amplificación correspondientes a cepas aisladas de la cavidad nasal de cerdos que no presentaban ningún síntoma o lesión característica de la enfermedad de Glässer y/o procedentes de granjas sin historial de la enfermedad.
-
Los carriles f-k se presentan los productos de amplificación correspondientes a cepas aisladas de distintos órganos de cerdos con la enfermedad de Glässer confirmada.
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Se puede observar que las cepas avirulentas no presentan ningún producto de amplificación correspondiente a los polinucleótidos de la invención, mientras que los productos de amplificación de las cepas virulentas presentan correspondencias con uno o varios polinucleótidos de la invención.
Por tanto, se comprueba que el uso de los polinucleótidos de la invención permite determinar de forma sencilla si una cepa de H. parasuis es virulenta o avirulenta, con independencia de la variabilidad antigénica que presenta dicho microorganismo.
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En otro aspecto de la invención, ésta tiene por objeto un kit para determinar si una cepa de H. parasuis es virulenta o avirulenta, caracterizado porque comprende:
a)
los productos de amplificación de los polinucleótidos que tienen las secuencias SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 23, y SEQ ID NO: 25,
b)
el oligonucleótido pADH-F (SEQ ID NO: 27),
c)
los oligonucleótidos pADH-R1 (SEQ ID NO: 28), pADH-R2 (SEQ ID NO: 29), y pADH-R3 (SEQ ID NO: 30), y
d)
los reactivos necesarios para llevar a cabo la reacción de amplificación mediante la técnica de PCR.
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Los productos de amplificación de los polinucleótidos de la invención son empleados como patrones al lado de la escalera de patrones de peso molecular, por ejemplo, la escalera de 1 kb (New England Biolabs).
Los oligonucleótidos que se incluyen en el kit, se emplean para amplificar los polinucleótidos homólogos de la invención eventualmente presentes en las cepas de ensayo mediante la técnica de PCR bien conocida por el experto en la materia, y determinar si la cepa es virulenta o avirulenta, siguiendo el método ya descrito en este mismo apartado.
En una realización preferida el kit puede comprender la cepa H. parasuis (Nagasaki) para que sirva de control, ya que en ella se amplifican todos los nucleótidos de la invención.
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Homología
El porcentaje de identidad entre dos secuencias de aminoácidos en esta invención designa el porcentaje de residuos de aminoácidos idénticos entre las dos secuencias que se comparan, que se obtiene después de conseguir la mejor alineación, y siendo el porcentaje puramente estadístico, y las diferencias entre las dos secuencias pueden estar distribuidas aleatoriamente y a lo largo de toda la secuencia. La mejor alineación se refiere a la alineación para la cual el porcentaje de identidad es el mayor.
La comparación entre dos secuencias de aminoácidos se puede hacer por ejemplo empleando el programa informático blastP que se encuentra disponible en la página web (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/) del National Center for Biotechnology Information.
El porcentaje de identidad entre dos secuencias de aminoácidos se calcula comparando en primer lugar las dos secuencias colocadas según la mejor alineación, y determinando el número de posiciones idénticas para las cuales el residuo del aminoácido es idéntico entre las dos secuencias.
El porcentaje de identidad entre las dos secuencias comparadas se calcula dividiendo este número de posiciones idénticas por el número total de posiciones comparadas, y multiplicando el resultado por 100.
Un polipéptido que tiene un cierto porcentaje de identidad con otro, habitualmente se designa como polipéptido homólogo.
El porcentaje de identidad entre secuencias de nucleótidos se puede calcular del mismo modo como con las secuencias de aminoácidos.
El grado de identidad entre polinucleótidos homólogos se puede determinar experimentalmente por ejemplo mediante la secuenciación de polinucleótidos que se encuentran en los carriles correspondientes a las cepas virulentas de la Figura 5.
En la electroforesis de la Figura 5 se puede observar que además de los polinucleótidos de la invención, al amplificar el ADN de las cepas virulentas con los cebadores pADH-F, y pADH-R1, pADH-R2, o pADH-R3, se amplifican además otros polinucleótidos, cuyos pesos moleculares no se corresponden con los pesos moleculares de los polinucleótidos de la invención.
Estos polinucleótidos que también se amplifican con los cebadores diseñados para amplificar los polinucleótidos de la invención son considerados polinucleótidos homólogos.
Se han extraído polinucleótidos homólogos del gel de electroforesis correspondientes a las cepas de los carriles g, j, i y k pertenecientes a los grupos 1 y 2, y polinucleótidos correspondientes a las cepas de los carriles f y h pertenecientes al grupo 2, y sus extremos se han secuenciado directamente con los cebadores p-ADH-F y pADH-R1 o p-ADH-R2, según pertenezcan al grupo 1 o al grupo 2.
Una vez seleccionadas las zonas de más alta calidad, las secuencias obtenidas se han comparado con los polinucleótidos de la invención utilizando el programa blastX, ya mencionado anteriormente. De la misma forma se comparan las secuencias de los polipéptidos homólogos, que se han obtenido mediante la traducción in silico de las secuencias de los polinucleótidos.
En la parte 3' terminal correspondiente a las secuencias realizadas con el cebador pADH-R1 o p-ADH-R2 se han obtenido homologías comprendidas entre el 95% y el 98%, y la pertenencia de los homólogos con los diferentes grupos es respetada.
Las secuencias obtenidas en la parte 5' terminal tienen homologías que varían entre el 59% y el 94%.
En la Figura 6 se muestra el resultado de la comparación de la secuencia de aminoácidos correspondiente al polipéptido denominado HP2269-2-j-1. Dicho polipéptido es codificado por el producto de PCR perteneciente al polinucleótido de más bajo peso molecular del grupo 2 de la cepa HP2269 que está en el carril j (banda señalada por una flecha en la Figura 5). La secuencia de polinucleótidos obtenida con el cebador pADH-F (SEQ ID NO: 27) se traduce in silico, y la secuencia del polipéptido resultante se compara con las secuencias de los polipéptidos de la invención mediante el programa blastX.
En la Figura 6A se presenta la alineación obtenida con el polipéptido SEQ ID NO: 16 perteneciente al grupo 1, y en la Figura 6B la alineación obtenida con el polipéptido SEQ ID NO: 12, perteneciente al grupo 2. En ambos casos la secuencia de aminoácidos del polipéptido HP2269-2-j-1 presenta un 59% de identidad, y es la mejor homología con los polipéptidos de la invención que se ha podido encontrar.
Por ello, también forma parte de la invención un polinucleótido de H. parasuis que expresa un polipéptido que presenta una identidad de al menos un 60% con un polipéptido definido por una secuencia seleccionada entre el grupo formado por SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 24, y SEQ ID NO: 26.
La identidad con las secuencias de aminoácidos de los polipéptidos es preferiblemente al menos un 70%, más preferiblemente al menos un 80%, más preferiblemente al menos un 90%, siendo especialmente preferido al menos un 95%.
El porcentaje de identidad entre secuencias de nucleótidos también se puede determinar mediante estudios de hibridación.
Preferiblemente el polinucleótido de la invención tiene una secuencia capaz de hibridar en condiciones de alta astringencia a una secuencia seleccionada entre el grupo formado por las secuencias SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 23, y SEQ ID NO: 25.
La hibridación en condiciones de alta astringencia significa que las condiciones de temperatura y fuerza iónica se seleccionan de modo que permiten que la hibridación se mantenga entre dos fragmentos de ADN complementarios. Estas condiciones son bien conocidas por el experto, y se encuentran descritas por ejemplo en el libro Sambrook, J., y Russell, R.W., Molecular cloning, a laboratory manual. Third Edition. CSHL press, Cold Spring Harbor, New York, 2001. Por ejemplo, unas condiciones de alta astringencia incluyen, pero no están limitadas, a lavados con 0,1XSSC a 65ºC, con lo que se consigue que solamente se hibriden polinucleótidos con al menos un 95% de identidad.
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Polipéptidos
En otro aspecto, la presente invención se refiere a un polipéptido de H. parasuis que presenta una identidad de al menos el 60% con un polipéptido definido por una secuencia seleccionada entre el grupo formado por SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 24, y SEQ ID NO: 26.
El porcentaje de identidad entre las secuencias de aminoácidos de los polipéptidos se determina de la misma forma como ya se ha explicado anteriormente.
Preferiblemente los polipéptidos homólogos presentan al menos un 70%, más preferiblemente al menos un 80%, más preferiblemente al menos un 90%, siendo especialmente preferido al menos un 95%, de identidad con las secuencias de aminoácidos de los polipéptidos de la invención.
Preferiblemente, el polipéptido tiene una secuencia seleccionada entre el grupo formado por SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 24, y SEQ ID NO: 26.
Como ya se ha dicho anteriormente, el polipéptido definido por la secuencia SEQ ID NO: 2 es la traducción in silico del polinucleótido definido por la secuencia SEQ ID NO: 1, y así sucesivamente.
Las características estructurales comunes que presentan estos polipéptidos los hacen candidatos a ser considerados con una elevada probabilidad como proteínas del tipo adhesinas, invasinas, hemaglutininas o autotransportadores.
Como se muestra en la alineación múltiple de las extremidades 3' de los polipéptidos de H. parasuis de la Figura 4, éstos pueden agruparse en tres grupos denominados grupo 1, grupo 2, y grupo 3.
El grupo 1 comprende los polipéptidos SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 24 y SEQ ID NO: 26. El grupo 2 comprende los polipéptidos SEQ ID NO: 6, y SEQ ID NO: 12. El grupo 3 comprende los polipéptidos SEQ ID NO: 14, y SEQ ID NO: 18. El polipéptido definido por la secuencia SEQ ID NO: 16 no puede clasificarse formalmente en ninguno de los grupos, pero al igual que el polinucleótido del que deriva, definido por la secuencia SEQ ID NO: 15, se considera que forma parte del grupo 1.
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Procedimiento para la preparación de los polipéptidos de la invención
En otro aspecto de la invención, ésta se refiere a un procedimiento para la preparación de los polipéptidos de la invención mediante tecnología recombinante, que comprende las siguientes etapas:
a)
cultivar una célula huésped transformada con un vector de expresión que comprende un polinucleótido que expresa un polipéptido que tiene una identidad de al menos el 60% con un polipéptido definido por una secuencia seleccionada entre el grupo formado por SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 24, y SEQ ID NO: 26,
b)
expresar dicho polinucleótido para producir dicho polipéptido.
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Preferiblemente en la etapa a) el polinucleótido tiene una secuencia capaz de hibridar en condiciones de alta astringencia a una secuencia seleccionada entre el grupo formado por las secuencias SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 23, y SEQ ID NO: 25.
Más preferiblemente en la etapa a) el polinucleótido tiene una secuencia seleccionada entre el grupo formado por SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 23, y SEQ ID NO: 25.
Para llevar a cabo dicho procedimiento se seleccionan células huésped transformadas con vectores de expresión que permiten la expresión de los polinucleótidos de H. parasuis de la invención en polipéptidos.
Entre las células huésped que se pueden emplear para expresar los polinucleótidos se encuentran, por ejemplo, cualquier cepa de E. coli, levaduras, y células eucariotas superiores. Preferiblemente se emplean las cepas de E. coli que presentan un alto rendimiento de expresión como por ejemplo la cepa E. coli BL21 (ED3) (Novagen).
En otro aspecto de la invención, ésta tiene por objeto una célula huésped transformada con un vector de expresión que comprende al menos un polinucleótido que expresa un polipéptido que tiene una identidad de al menos el 60% con un polipéptido definido por una secuencia seleccionada entre el grupo formado por SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 24, y SEQ ID NO: 26.
Preferiblemente el polinucleótido tiene una secuencia capaz de hibridar en condiciones de alta astringencia a una secuencia seleccionada entre el grupo formado por las secuencias SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 23, y SEQ ID NO: 25.
Más preferiblemente el polinucleótido tiene una secuencia seleccionada entre el grupo formado por SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 23, y SEQ ID NO: 25.
En otro aspecto adicional de la invención, ésta tiene por objeto un vector de expresión que comprende un polinucleótido que expresa un polipéptido que tiene una identidad de al menos el 60% con un polipéptido definido por una secuencia seleccionada entre el grupo formado por SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 24, y SEQ ID NO: 26.
Preferiblemente el polinucleótido tiene una secuencia capaz de hibridar en condiciones de alta astringencia a una secuencia seleccionada entre el grupo formado por las secuencias SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 23, y SEQ ID NO: 25.
Más preferiblemente el polinucleótido tiene una secuencia seleccionada entre el grupo formado por SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 23, y SEQ ID NO: 25.
El vector de expresión es una entidad que se utiliza para introducir un polinucleótido en una célula. Normalmente se emplean plásmidos y fagos.
En el estado de la técnica son bien conocidos numerosos tipos de vectores de expresión apropiados. Entre ellos se pueden mencionar, por ejemplo, los vectores de la serie pET (Novagen) o los de la serie pQE (Qiagen).
Cuando se emplean los vectores de la serie pET (Novagen), éstos permiten clonar de manera direccional los genes que estarán en 5' bajo el control del promotor T7lac y una secuencia de fijación de ribosomas. En la parte 3' del sitio múltiple de clonación de los vectores pET-24a(+) y pET-24d(+) se encuentran secuencias codificantes para 6 histidinas para facilitar la purificación del polipéptido recombinante.
Los enzimas de restricción NdeI y NcoI presentes en pET-24a(+) y pET-24d(+) respectivamente generan cortes en la parte 5' del sitio múltiple de clonación adecuados para la inserción de genes que empiezan con el triplete ATG de inicio de la traducción.
Habitualmente se clona el gen en su parte 3' lo más cerca posible de la cola de histidinas, para ello existe el sitio de restricción XhoI.
Generalmente los insertos no tienen secuencias reconocidas por los enzimas de restricción NdeI, NcoI y XhoI. En el caso de que esto suceda, se diseñan cebadores capaces de amplificar los extremos 5' y 3' de los polipéptidos, pero que incluyan los sitios de restricción adecuados en las extremidades de estos cebadores.
Otros enzimas de restricción pueden generar extremidades cohesivas compatibles con aquellas realizadas por NdeI, NcoI o XhoI. Esta propiedad es particularmente interesante cuando los genes que se tienen que clonar poseen sitios de restricción NdeI, NcoI o XhoI, pero no los de otros enzimas con extremidades compatibles. En ese caso, se diseñan cebadores con los sitios de restricción correspondientes a los enzimas compatibles con NdeI, NcoI o XhoI.
Las secuencias de los cebadores que se pueden emplear son las siguientes:
\dotable{\tabskip\tabcolsep#\hfil\+#\hfil\+#\hfil\tabskip0ptplus1fil\dddarstrut\cr}{
 - pADH-F-BsHI: \+ 5'
GACTGA TC   ATGA ATAAAATATTTAGAGTTATTTGG  3' \+ (SEQ
ID NO: 31),\cr \+\+\cr  -
pADH-F-NdeI: \+ 5'
GACTGA CAT   ATG AATAAAATATTTAGAGTTATTTGG  3' \+ (SEQ
ID NO: 32),\cr \+\+\cr  -
pADH-R1-XhoI: \+ 5'
TTA CTCGAG  CCACACAAAACCTACCCCTCCTCC  3' \+ (SEQ ID NO:
33),\cr \+\+\cr  - pADH-R2-SalI: \+
5' TAGTTA GTCGAC  CCACTGATAACCTACCCCCACAGAG  3' \+ (SEQ ID
NO: 34),    y\cr \+\+\cr  -
pADH  -  R3  -  XhoI: \+ 5'
TTA CTCGAG  CCACTGTAATGCAATACCTGCACC  3' \+ (SEQ ID NO:
35),\cr}
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Las secuencias de reconocimiento de los enzimas de restricción están subrayadas mientras que las secuencias codificantes para los polipéptidos están en negrita. Los nucleótidos adicionales en la parte 5' de los cebadores son aleatorios, pero son necesarios para el buen funcionamiento de los enzimas de restricción.
Las técnicas de tecnología recombinante que se emplean en el procedimiento para preparar los polipéptidos de la invención son bien conocidas por el experto en la materia, y se encuentran descritas, por ejemplo, en el libro de Sambrook et al., op.cit.
Informaciones complementarias para llevar a cabo dicho procedimiento también son facilitadas por las empresas que comercializan los vectores de expresión, y se pueden encontrar, por ejemplo, en la página web:
www.emdbiosciences.com.
A modo de ejemplo entre ellas se pueden mencionar:
1.
Preparación de los vectores (plásmidos pET-24a(+) (Novagen), y pET-24d(+) (Novagen)).
2.
Preparación de los insertos de ADN a partir de los polinucleótidos amplificados por PCR.
3.
Ligación de los insertos en los plásmidos preparados pET-24(+) y pET-24d(+) con la ligasa T4 (Quick Ligation Kit, New England Biolabs).
4.
Transformación de los productos de ligación en E. coli Novablue (Novagen).
5.
Caracterización de los plásmidos recombinantes por secuenciación, empleando los cebadores T7 promotor: 5'TAATACGACTCACTATAGG3' y T7 terminator: 5'GCTAGTTATTGCTCAGCGG3' que se encuentran a las extremidades del sitio de clonación.
6.
Transformación de los plásmidos recombinantes en E. coli BL21 (ED3) (Novagen).
7.
Producción y recuperación de los polipéptidos recombinantes de H. parasuis en E. coli BL21 (ED3).
8.
Purificación de los polipéptidos recombinantes a partir de corpúsculos de inclusión con el kit His Bind Resin Ni-charged (Novagen).
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Los polipéptidos de la invención se obtienen habitualmente con un grado de pureza muy elevado.
En otro aspecto la invención se refiere al uso de los polipéptidos de la invención para la preparación de vacunas y/o composiciones inmunogénicas para el tratamiento profiláctico o terapéutico de la infección causada por H. parasuis en un animal.
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Vacunas
La vacuna contra las infecciones causadas por H. parasuis, objeto de la invención, comprende una cantidad inmunológicamente efectiva de un polipéptido que tiene una identidad de al menos el 60% con un polipéptido que tiene una secuencia seleccionada entre el grupo formado por SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 24, o SEQ ID NO: 26, y un agente auxiliar.
La identidad con las secuencias de aminoácidos de los polipéptidos es preferiblemente al menos un 70%, más preferiblemente al menos un 80%, más preferiblemente al menos un 90%, siendo especialmente preferido al menos un 95%.
De forma más preferida la vacuna comprende una cantidad inmunológicamente efectiva de un polipéptido que tiene una secuencia seleccionada entre el grupo formado por SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 24, y SEQ ID NO: 26.
La vacuna puede comprender varios polipéptidos de la invención con el fin de aumentar la respuesta inmunológica.
En esta descripción se entiende por vacuna o composición inmunogénica un antígeno o compuesto que induce una respuesta inmunológica en un animal.
Como cantidad inmunológicamente efectiva se entiende aquella cantidad de antígeno que es capaz de inducir o contribuir a la generación de una respuesta inmunológica protectiva (total o parcialmente) frente a una infección con H. parasuis.
Una respuesta inmunológica protectiva se puede manifestar como cualquier reducción en la tasa de infección por el patógeno y/o cualquier reducción en los síntomas o la severidad de la infección provocada por el microorganismo patógeno.
La vacuna se puede administrar de forma profiláctica a un animal que no haya estado expuesto al antígeno, de manera que se prevenga una infección subsiguiente por H. parasuis. Alternativamente, la vacuna se puede administrar de forma terapéutica a un animal que haya estado expuesto o infectado previamente por H. parasuis. Aunque no se pueda evitar la infección, la respuesta inmunológica generada por el organismo del animal permite que el sistema inmunológico del mismo actúe más eficazmente contra la infección, y, por ejemplo, los síntomas asociados con la infección se presenten de forma más leve.
Las vacunas que contienen polipéptidos son generalmente bien conocidas en el estado de la técnica, por ejemplo se describen en las patentes EP-B-0074248, y EP-B-0155146.
También se pueden desarrollar vacunas que contienen una cantidad inmunológicamente efectiva de los polinucleótidos de H. parasuis de la invención.
La vacuna de la invención puede ser también una vacuna combinada con el fin de proteger a los animales frente a la infección por H. parasuis y por uno o más patógenos. El segundo componente de la vacuna combinada se selecciona con base en su capacidad de generar una respuesta protectiva frente a un patógeno y/o su capacidad de mejorar los síntomas o condición patológica del animal.
Estas composiciones inmunogénicas pueden contener, pero no están limitadas, a aquellas que además de proteger frente a la infección por H. parasuis también proporcionan protección frente a Actinobacillus pleuropneumoniae, Actinobacillus suis, Pasteurella multocida, Salmonella cholerasuis, Streptococcus suis, Erysipelothrix rhusiopathiae, Leptospira sp., Staphylococcus hyicus, Bordetella bronchiseptica, Mycoplasma hyopneumoniae, Lawsonia intracellularis, Escherichia coli, PRRS, influenza porcina, parvovirus porcino, coronavirus y circovirus.
Opcionalmente, el antígeno que forma parte del segundo componente de la vacuna puede estar unido covalentemente al primer componente formando una molécula quimérica. El antígeno del segundo componente puede también estar unido a un hapteno.
Las moléculas quiméricas que contienen el primer y el segundo componente de la vacuna combinada pueden ser sintetizadas utilizando diferentes técnicas bien descritas. Por ejemplo, pueden ser producidos sintéticamente utilizando sintetizadores peptídicos comerciales y procesos químicos estándar (Merrifield, Science, 232:341-347 (1985)). Alternativamente, los antígenos pueden ser sintetizados separadamente y después ser unidos covalentemente mediante una reticulación química.
La vacuna puede ser administrada por la vía apropiada como es por ejemplo la vía oral, intranasal, intramuscular, intradérmica, intraperitoneal, subcutánea, rectal, vaginal, o por una combinación de cualquiera de las rutas mencionada anteriormente.
La forma farmacéutica de las vacunas objeto de la invención depende de la forma de administración, y puede ser por ejemplo en forma de inyectables (soluciones, suspensiones, o emulsiones), pastillas, supositorios, cápsulas, formulaciones de liberación prolongada, o polvos.
La cantidad de antígeno/s que se incluye en la vacuna depende de diferentes factores como son la edad, el peso, la salud y las características físicas generales del animal que va a ser vacunado, así como de la vacuna en particular que va a ser administrada. La determinación de la dosis óptima de vacunación para cada uno de los componentes, puede ser evaluada mediante técnicas rutinarias como es el análisis de seroconversión.
Habitualmente dichas vacunas contienen entre un 10-95% en peso de los polipéptidos objeto de la invención, y generalmente comprenden sustancias auxiliares que se seleccionan en función de la forma farmacéutica y del modo de administración.
Los agentes auxiliares que acompañan a los polipéptidos en las vacunas de la invención se seleccionan entre los excipientes farmacéuticamente aceptables que se describen, por ejemplo, en el libro de R.C. Rowe et al., Handbook of Pharmaceutical Excipients, Pharmaceutical Press, 4th Edition, Londres, 2003 (ISBN: 0-85369-472-9).
En el caso de formulaciones líquidas, los agentes auxiliares pueden ser entre otros: agentes humectantes, agentes emulsionantes, soluciones tampón para control de pH, agua, solución salina, glicerina, etanol, agentes conservantes, y/o vehículos oleosos.
En el caso de vacunas en forma sólida, las formulaciones pueden incluir entre otros: agentes aglutinantes, agentes lubricantes, agentes edulcorantes, cargas, y/o agentes disgregantes.
Las vacunas objeto de la invención también pueden incluir agentes adyuvantes con el fin de incrementar la inmunogeneicidad de las mismas, y con ello su eficacia.
Como agentes adyuvantes se pueden emplear por ejemplo fosfato de aluminio, sulfato de aluminio, hidróxido de aluminio, extracto de Quillaja saponaria (QS21), saponina purificada (Quil A), complejos inmunoestimulantes (ISCOMs), fosfato cálcico, hidróxido cálcico, hidróxido de zinc, CARBOPOL, muramil dipéptido y/o cualquier combinación entre ellos.
Además, la vacuna puede contener cualquier agente inmunomodulador como por ejemplo citoquinas.
La vacuna también puede ser formulada con sistemas de liberación controlada del antígeno, por ejemplo, aquellas en las que se combina el antígeno con polímeros biocompatibles como el ácido poliláctico, ácido poli(láctico-glicólico), metilcelulosa, ácido hialurónico o colágeno. Alternativamente, el antígeno puede ser microencapsulado con el fin de mejorar su administración y/o aumentar su eficacia.
En algunos casos puede ser conveniente almacenar la vacuna en forma liofilizada que se reconstituye con un diluyente estéril antes de su administración.
Las vacunas de la invención presentan una alta eficacia en cerdos tanto cuando la vacunación se realiza de forma profiláctica, como en el caso de una vacunación terapéutica cuando el animal ya manifiesta los síntomas de la infección por H. parasuis.
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Los ejemplos que siguen a continuación se exponen a efectos de proporcionar al experto en la materia una explicación suficientemente clara y completa de la presente invención, pero no deben ser considerados como limitaciones a los aspectos esenciales del objeto de la misma, tal y como han sido expuestos en los apartados anteriores de esta descripción.
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Ejemplos Ejemplo 1 Preparación de los polinucleótidos de H. parasuis de la invención
En primer lugar se aísla y purifica el ADN de H. parasuis (Nagasaki) empleando los métodos convencionales descritos en Sambrook y Russell, (Molecular cloning, a laboratory manual. Third Edition. CSHL press, Cold Spring Harbor, New York, 2001) o con kits de purificación de ADN genómico como los propuestos por Qiagen o Macherey-Nagel.
Para la preparación de los polinucleótidos de la invención se emplea la tecnología PCR de amplificación genómica del sistema AccuPrime^{TM} Taq DNA Polymerase High Fidelity (Invitrogen), siguiendo las indicaciones sugeridas por el fabricante.
Se preparan tres tubos de reacción de 200 \mul adaptables a termocicladores (Axygen), que contienen una dilución del ADN de H. parasuis (Nagasaki) en H_{2}O MilliQ, y los oligonucleótidos que se emplean para llevar a cabo la amplificación, y se mantienen siempre todos los reactivos en hielo.
Cada uno de los tres tubos de reacción incluye el oligonucleótido pADH-F (SEQ ID NO: 27) (Eurogentec), y además, cada tubo contiene un oligonucleótido específico para amplificar los grupos 1, 2 y 3 de polinucleótidos.
Para amplificar el grupo 1 de polinucleótidos se emplea el oligonucleótido pADH-R1 (SEQ ID NO: 28) (Eurogentec), para el grupo 2 el oligonucleótido pADH-R2 (SEQ ID NO: 29) (Eurogentec), y para el grupo 3 el oligonucleótido pADH-R3 (SEQ ID NO: 30) (Eurogentec).
Los volúmenes que se introducen en cada tubo de reacción son los siguientes:
1
La reacción de amplificación se lleva a cabo en un termociclador Applied Biosystems (Axygen) programado con los parámetros siguientes:
-
1 ciclo de 2 min a 94ºC, seguido de
-
30 ciclos de 30 sec a 94ºC, 30 sec a 60ºC y 15 min a 68ºC, y
-
1 ciclo final de 15 min a 68ºC.
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Posteriormente, a los productos de amplificación de los polinucleótidos del grupo 1 se les añadió 0,05 \mul de AccuPrime^{TM} Taq DNA Polymerase High Fidelity y se incubaron durante 1 h 30 min a 68ºC.
Los productos de amplificación de los polinucleótidos de los grupos 2 y 3 se incubaron durante 3 h a 37ºC.
Estos tratamientos permitieron eliminar bandas accesorias correspondientes a productos de amplificación incompletos aprovechando el hecho que esta polimerasa tiene una actividad de exonucleasa.
El resultado se analiza por electroforesis en un gel de agarosa al 0.8% teñido por SybrGold (Molecular Probes), migrando 10 \mul del producto de la reacción de amplificación.
Los resultados de la electroforesis se muestran en la Figura 5. En el carril M se presenta una escalera de 1 kb (New England Biolabs), que se emplea como marcador de peso molecular.
En el carril a se encuentran los polinucleótidos de la invención que se han amplificado empleando la cepa H. parasuis (Nagasaki).
En el carril a de la Figura 5A se pueden distinguir los productos de amplificación correspondientes a los polinucleótidos del grupo 1 definidos por las secuencias SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 19 SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 23, y SEQ ID NO: 25.
En el carril a de la Figura 5B se pueden distinguir los productos de amplificación correspondientes a los polinucleótidos del grupo 2 definidos por las secuencias: SEQ ID NO: 5 y SEQ ID NO: 11.
En el carril a de la Figura 5C se pueden distinguir los productos de amplificación correspondientes a los polinucleótidos del grupo 3 definidos por las secuencias: SEQ ID NO: 13 y SEQ ID NO: 17.
El polinucleótido SEQ ID NO: 15 se encuentra en la zona de los polinucleótidos definidos por las secuencias SEQ ID NO: 3 y SEQ ID NO: 23.
Se puede comprobar que existe una buena correlación entre el tamaño expresado en pares de bases (pb) de las secuencias SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 23, y SEQ ID NO: 25, y los pesos moleculares aparentes de los productos de amplificación indicados en el gel.
Cada una de las bandas de polinucleótido se extrae y se puede amplificar posteriormente siguiendo técnicas convencionales como las mencionadas anteriormente en esta descripción, de modo que se obtienen productos de amplificación para cada uno de los polinucleótidos de la invención.
En el caso de los polinucleótidos que tienen pesos moleculares semejantes, y aparecen confundidos en el gel de la electroforesis, se separan posteriormente mediante una electroforesis realizada en unas condiciones que permita su separación, como es bien conocido por el experto, por ejemplo, aumentando la longitud del gel y/o el tiempo de desarrollo de la electroforesis, o clonando en vectores plasmídicos.
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(Tabla pasa a página siguiente)
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Ejemplo 2 Clasificación de cepas de H. parasuis
Para la clasificación de cepas de H. parasuis entre cepas virulentas y avirulentas se emplea el procedimiento descrito en el Ejemplo 1 para la cepa H. parasuis (Nagasaki) para cada cepa que se desea clasificar.
En la Tabla I se presentan las características de las cepas ensayadas que pertenecen a varios serotipos distintos:
TABLA I
3
_{(1)} Carril de la electroforesis de la Figura 5 en el que se visualizan los polinucleótidos amplificados para cada cepa.
_{(2)} NT: cepa no tipificable.
_{(3)} ND: no documentado.
_{(4)} Las cepas identificadas con el signo * son cepas avirulentas de referencia, cuya no virulencia se ha comprobado experimentalmente mediante infecciones en cerdos.
_{(5)} Cepa aislada en la facultad veterinaria de la Universidad Autónoma de Barcelona.
_{(6)} Cepas aisladas por los laboratorios HIPRA. La cepa HP-3123 ha sido aislada de un cerdo procedente de una granja sin historial de enfermedad de Glässer.
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Las cepas correspondientes a los carriles b-e corresponden a cepas aisladas de la cavidad nasal de cerdos que no presentaban ningún síntoma o lesión característica de la enfermedad de Glässer, y/o procedentes de granjas sin historial de la enfermedad, por lo que se pueden considerar como cepas avirulentas.
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Las cepas correspondientes a los carriles f-k corresponden a cepas aisladas de distintos órganos de cerdos con la enfermedad de Glässer confirmada, por tanto son cepas virulentas.
El resultado del análisis por PCR del panel de cepas virulentas y avirulentas se muestra en la Figura 5.
Se puede observar que las cepas SW114 (b), F9 (c), D74 (d) y HP3123 (e), procedentes de cerdos que no presentaban ningún síntoma o lesión característica de la enfermedad de Glässer, no muestran amplificación alguna en las zonas correspondientes a los polinucleótidos de la invención.
En cambio, todas las cepas que proceden de órganos de cerdos con la enfermedad de Glässer confirmada presentan al menos una amplificación correspondiente a los polinucleótidos de la invención. Como se puede comprobar en la Figura 5, la mayoría de las cepas virulentas HP1205 (f), HP1302 (g), HP1319 (h), HP2163 (i), HP2269 (j) y HP33 (k), presentan varias amplificaciones correspondientes a los polinucleótidos de la invención.
Por tanto, el empleo de los polinucleótidos de la invención permite la clasificación de las cepas de H. parasuis entre virulentas y avirulentas con independencia de la variabilidad antigénica que presenta dicho microorganismo.
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Ejemplo 3 Preparación de los polipéptidos de H. parasuis de la invención 1.- Preparación de los vectores
El plásmido pET-24a(+) (Novagen) se digiere añadiendo en un tubo estéril de 1,5 ml los componentes siguientes:
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5 
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El plásmido pET-24d(+) se digiere añadiendo en un tubo estéril de 1,5 ml los componentes siguientes:
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6
Las reacciones se llevan a cabo en un baño a 37ºC durante 2 horas. Después, los plásmidos digeridos se purifican por gel de agarosa siguiendo técnicas convencionales, como ya se ha mencionado en esta descripción.
De esta forma se obtiene un plásmido lineal que presenta dos extremidades incompatibles.
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2.- Preparación de los insertos
1 ng de los polinucleótidos de la invención preparados según el Ejemplo 1 se amplifican individualmente siguiendo el procedimiento experimental descrito en dicho ejemplo, empleando los oligonucleótidos siguientes:
\dotable{\tabskip\tabcolsep#\hfil\+#\hfil\+#\hfil\tabskip0ptplus1fil\dddarstrut\cr}{
 - pADH-F-BsHI: \+ 5'
GACTGA TC   ATGA ATAAAATATTTAGAGTTATTTGG  3' \+ (SEQ
ID NO: 31),\cr \+\+\cr  -
pADH-F-NdeI: \+ 5'
GACTGA CAT   ATG AATAAAATATTTAGAGTTATTTGG  3' \+ (SEQ
ID NO: 32),\cr \+\+\cr  -
pADH-R1-XhoI: \+ 5'
TTA CTCGAG  CCACACAAAACCTACCCCTCCTCC  3' \+ (SEQ ID NO:
33),\cr \+\+\cr  - pADH-R2-SalI: \+
5' TAGTTA GTCGAC  CCACTGATAACCTACCCCCACAGAG  3' \+ (SEQ ID
NO: 34),    y\cr \+\+\cr  -
pADH  -  R3  -  XhoI: \+ 5'
TTA CTCGAG  CCACTGTAATGCAATACCTGCACC  3' \+ (SEQ ID NO:
35),\cr}
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Las secuencias de reconocimiento de los enzimas de restricción están subrayadas mientras que las secuencias codificantes para los polipéptidos están en negrita. Los nucleótidos adicionales en la parte 5' de los cebadores son aleatorios pero necesarios para el buen funcionamiento de los enzimas de restricción.
La amplificación sigue el procedimiento experimental del Ejemplo 1, excepto que sólo se realizan 22 ciclos de amplificación, en lugar de 30.
En la Tabla II se indica la presencia o ausencia de los sitios de restricción NdeI, NcoI, XhoI, BspHI (compatible con NcoI) y SalI (compatible con XhoI) en los polinucleótidos de la invención, el par de cebadores utilizados para amplificar estos polinucleótidos, y el vector en el cual se clonan.
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(Tabla pasa a página siguiente)
TABLA II
8
Después de la amplificación, se purifican los productos obtenidos con el kit MinElute Reaction Cleanup (Qiagen) siguiendo las indicaciones del fabricante, excepto que la etapa de elución se hace con 40 \mul de tampón de elución.
La digestión de las extremidades de los productos de amplificación se realiza en función del grupo al cual pertenecen los polipéptidos.
Para los productos de amplificación procedentes de SEQ ID NO: 1, 3, 7, 9, 13, 15, 17, 19, 21, 23 y 25 en un tubo de 1,5 ml estéril se añade:
10 
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Para los productos de amplificación procedente de SEQ ID NO: 5 y 11, en un tubo de 1,5 ml estéril se añade
11
Las reacciones se llevan a cabo a 37ºC en un baño durante 2 horas. La purificación de los productos de amplificación doblemente digeridos se realiza en gel de agarosa siguiendo el procedimiento descrito en el kit MinElute Reaction Cleanup de Qiagen.
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3.- Ligación de los insertos en pET-24a(+) y pET-24d(+)
Se procede a la ligación con la ligasa T4 (Quick Ligation Kit, New England Biolabs) siguiendo las recomendaciones del fabricante. Previamente se ajustan con H_{2}O milliQ las concentraciones de plásmido e inserto a 50 ng/\mul. En tubo estéril de 1,5 ml se añade lo siguiente:
12
La incubación se realiza a una temperatura comprendida entre 22ºC y 25ºC durante 15 min.
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4.- Transformación de los productos de ligación en E. coli Novablue
No es necesario purificar los productos de ligación para transformar las bacterias competentes E. coli Novablue (Novagen). Esta cepa de E. coli no permite la expresión de proteínas recombinantes y sirve para expandir el plásmido recombinante antes de transformar las cepas apropiadas.
En un tubo de 1,5 ml estéril previamente enfriado en hielo se añaden 20 \mul de células competentes y 1 \mul de producto de ligación. Después de una incubación de 5 min en hielo, se introduce el tubo en un baño a 42ºC durante 30 s. Seguidamente, se vuelve a incubar en hielo durante 2 min. Después de este choque térmico, se añaden 80 \mul de medio SOC (Novagen) y se incuban las bacterias transformadas a 37ºC bajo agitación (250 rpm).
La selección y clonación de las bacterias recombinantes se efectúa en placas de LB-agar en presencia de kanamicina (30 \mug/\mul).
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5.- Caracterización de los plásmidos recombinantes
Los clones recombinantes se hacen crecer en placas de 96 pocillos con capacidad de 2 ml/pocillo, y el plásmido se purifica con cualquiera de los siguientes kits:
-
R.E.A.L Prep 96 BioRobot (Qiagen) y NucleoSpin 96 Flash (Macherey-Nagel) con un autómata (BioRobot 3000, Qiagen), o
-
NucleoSpin 96 Flash (Macherey-Nagel) si este proceso se realiza manualmente.
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Para cada preparación se obtienen unos 500 nanogramos de plásmido superenrollado.
Cada inserto se caracteriza por secuenciación con el kit BigDye Terminator v3.1 (Applied Biosystems) en placas de 96 pocillos (Applied Biosystems o Axygen) adaptables a termocicladores y secuenciadores del fabricante Applied Biosystems.
Los cebadores utilizados flanquean los sitios de clonación del plásmido y tienen las secuencias siguientes:
T7 promoter: 5'TAATACGACTCACTATAGG3'
T7 terminator: 5'GCTAGTTATTGCTCAGCGG3' 
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6.- Transformación de los plásmidos recombinantes en E. coli BL21 (ED3)
La cepa E. coli BL21 (ED3) (Novagen) es una cepa especialmente diseñada para la expresión de grandes cantidades de proteínas recombinantes bajo el mando del T7.
La transformación con los plásmidos recombinantes pET-24a(+) y pET-24d(+) se efectúa añadiendo 20 \mul de bacterias competentes y 1 \mul de producto de ligación en un tubo de 1,5 ml estéril previamente enfriado en hielo.
Después de una incubación de 5 min en hielo, se introduce el tubo en un baño a 42ºC durante 30 s. Seguidamente, se vuelve a incubar en hielo durante 2 min. Después de este choque térmico, se añaden 80 \mul de medio SOC (Novagen) y se incuban las bacterias transformadas a 37ºC bajo agitación a 250 rpm.
La selección y clonación de las bacterias recombinantes se efectúa en placas de LB-agar en presencia de kanamicina (30 \mug/\mul).
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7.- Producción de polipéptidos recombinantes de H. parasuis en E. coli BL21 (ED3)
Para la producción de cada polipéptido recombinante, se siembra una colonia en 50 ml de medio LB que tiene 30 \mug/\mul de kanamicina. El crecimiento de la bacteria se efectúa a 37ºC en un agitador orbital con ventilación hasta obtener un valor de 0,6 de densidad óptica a 600 nm.
Se añade IPTG a 1mM en concentración final y se sigue la incubación a 37ºC durante 3 h. Seguidamente las bacterias se enfrían en hielo durante 5 min y se procede a una centrifugación de 5000 g durante 5 min a 4ºC. Se resuspende el precipitado bacteriano con 12,5 ml de 20 mM Tris-HCl pH 8 frío, y se vuelve a centrifugar en las mismas condiciones.
\newpage
Los polipéptidos recombinantes se encuentran en forma de corpúsculos de inclusión en el citoplasma de la bacteria, y se recuperan utilizando el método preconizado por Novagen de tratamiento por los productos BugBuster Benzonase y rLysozyme (pET system manual, www.emdbiosciences.com/html/NVG/User-protocols.html) añadiendo inhibidores de proteasas (pefabloc, Roche Diagnostic).
El método consiste en una solubilización suave de la bacteria, digestión del péptidoglicano y del ADN, seguido de una serie de centrifugaciones destinadas a eliminar las impurezas de los corpúsculos de inclusión.
La presencia y cantidad relativa de polipéptidos recombinantes se aprecia por electroforesis en gel de poliacrilamida (Laemmli, Nature, 227:680-685, (1970)).
Típicamente, cada polipéptido recombinante representa entre 30 a 50% del total de los polipéptidos de E. coli BL21-(ED3) transformada y el 90% de los polipéptidos encontrados en los corpúsculos de inclusión.
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8.- Purificación de los polipéptidos recombinantes a partir de corpúsculos de inclusión
Se utiliza el kit His Bind Resin Ni-charged en condiciones desnaturalizantes según el método especificado por el fabricante (Novagen).
En primer lugar se disuelven los corpúsculos de inclusión en un tampón conteniendo urea 6M. Esta solución se aplica a una columna conteniendo 2,5 ml de resina acoplada con el metal Ni^{2+}.
Las polihistidinas tienen una fuerte afinidad con este ión metálico y los polipéptidos recombinantes se adsorben en la columna. Después de los correspondientes lavados, se procede a la elución de la proteína recombinante con un tampón conteniendo urea 6M e imidazol 1M.
Seguidamente, se procede a la renaturalización de las proteínas por diálisis utilizando el kit Protein Refolding (Novagen) siguiendo las instrucciones del fabricante.
Se obtiene cada uno de los polipéptidos de la invención con un grado de pureza superior al 99%, que es apropiado para que se puedan formular en composiciones inmunogénicas y/o vacunas contra las infecciones causadas por H. parasuis.
<110> LABORATORIOS HIPRA, S.A.
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<120> Polinucleótidos de Haemophilus parasuis y su uso
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<130> 23476sec
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<140> P200502296
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<141> 2005-09-21
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<160> 35
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<170> PatentIn version 3.3
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<210> 1
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<211> 2859
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<212> DNA
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<213> Haemophilus parasuis 
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<400> 1
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19
20
21 
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<210> 2
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<211> 953
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<212> PRT
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<213> haemophilus parasuis 
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<400> 2
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22
23
24
25
26 
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<210> 3
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<212> DNA
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<213> Haemophilus parasuis 
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28
29 
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<210> 4
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<211> 1225
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<212> PRT
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<213> haemophilus parasuis 
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<400> 4
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30
31
32
33
34
35 
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<213> Haemophilus parasuis 
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37
38
39 
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<212> PRT
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<213> haemophilus parasuis 
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40
41
42
43
44
45
46
47 
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<212> PRT
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<213> haemophilus parasuis 
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53
55
56
57
58
59
60
61
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63
64
65 
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<211> 3024
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<212> DNA
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<213> Haemophilus parasuis 
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<400> 9
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66
67
68 
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<210> 10
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<211> 1008
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<212> PRT
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<213> haemophilus parasuis 
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<400> 10
69
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72
73 
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<211> 4944
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<212> DNA
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75
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77 
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<212> PRT
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<213> haemophilus parasuis 
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81
82
83
84
85
86 
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87
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89
90 
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<212> PRT
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<213> haemophilus parasuis 
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91
92
93
94
95
96
97 
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<213> Haemophilus parasuis 
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98
99
100 
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<212> PRT
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<213> haemophilus parasuis 
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101
103
104
105
106 
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<211> 5043
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107
108
109
110 
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<211> 1681
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<212> PRT
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<213> haemophilus parasuis 
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111
112
113
114
115
116
117
118 
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<213> Haemophilus parasuis 
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122
123
124
125 
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<211> 3297
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<212> DNA
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<213> Haemophilus parasuis 
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126
127 
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<211> 1099
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<212> PRT
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<213> haemophilus parasuis 
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<400> 22
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129
130
131
132
133
134 
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<211> 3549
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<212> DNA
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135
136
137 
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<211> 1183
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<212> PRT
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<213> haemophilus parasuis 
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<400> 24
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138
139
140
141
142
143 
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<210> 25
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<211> 3072
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<212> DNA
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<213> Haemophilus parasuis 
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144
145 
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<211> 1024
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<212> PRT
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<213> haemophilus parasuis 
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<400> 26
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146
147
148
149
150 
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<210> 27
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<212> DNA
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\hskip-.1em\dddseqskip
atgaataaaa tatttagagt tatttgg 
\hfill
27 
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\vskip0.400000\baselineskip
<210> 28
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<211> 24
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<212> DNA
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<213> Synthetic
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\vskip0.400000\baselineskip
<400> 28
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
ccacacaaaa cctacccctc ctcc 
\hfill
24 
\newpage
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<210> 29
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<211> 25
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<212> DNA
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<213> Synthetic
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<400> 29
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\hskip-.1em\dddseqskip
ccactgataa cctaccccca cagag 
\hfill
25 
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<210> 30
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 24
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
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<213> Synthetic
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\vskip0.400000\baselineskip
<400> 30
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
ccactgtaat gcaatacctg cacc 
\hfill
24 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 31
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 35
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
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<213> Synthetic
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\vskip0.400000\baselineskip
<400> 31
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\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
gactgatcat gaataaaata tttagagtta tttgg 
\hfill
35 
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\vskip0.400000\baselineskip
<210> 32
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 36
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<212> DNA
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<213> Synthetic
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<400> 32
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\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
gactgacata tgaataaaat atttagagtt atttgg 
\hfill
36 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 33
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 33
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Synthetic
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 33
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
ttactcgagc cacacaaaac ctacccctcc tcc 
\hfill
33 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 34
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 37
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Synthetic
\vskip1.000000\baselineskip
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<400> 34
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
tagttagtcg acccactgat aacctacccc cacagag 
\hfill
37 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 35
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 33
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Synthetic
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 35
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
ttactcgagc cactgtaatg caatacctgc acc 
\hfill
33

Claims (52)

1. Polinucleótido relacionado con la virulencia de Haemophilus parasuis caracterizado por que expresa un polipéptido que presenta una identidad de al menos el 60% con un polipéptido definido por una secuencia seleccionada entre el grupo formado por SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 24, y SEQ ID NO: 26.
2. Polinucleótido según la reivindicación 1, caracterizado por que tiene una secuencia capaz de hibridar en condiciones de alta astringencia a la secuencia SEQ ID NO: 1.
3. Polinucleótido según la reivindicación 1, caracterizado por que tiene una secuencia capaz de hibridar en condiciones de alta astringencia a la secuencia SEQ ID NO: 3.
4. Polinucleótido según la reivindicación 1, caracterizado por que tiene una secuencia capaz de hibridar en condiciones de alta astringencia a la secuencia SEQ ID NO: 5.
5. Polinucleótido según la reivindicación 1, caracterizado por que tiene una secuencia capaz de hibridar en condiciones de alta astringencia a la secuencia SEQ ID NO: 7.
6. Polinucleótido según la reivindicación 1, caracterizado por que tiene una secuencia capaz de hibridar en condiciones de alta astringencia a la secuencia SEQ ID NO: 9.
7. Polinucleótido según la reivindicación 1, caracterizado por que tiene una secuencia capaz de hibridar en condiciones de alta astringencia a la secuencia SEQ ID NO: 11.
8. Polinucleótido según la reivindicación 1, caracterizado por que tiene una secuencia capaz de hibridar en condiciones de alta astringencia a la secuencia SEQ ID NO: 13.
9. Polinucleótido según la reivindicación 1, caracterizado por que tiene una secuencia capaz de hibridar en condiciones de alta astringencia a la secuencia SEQ ID NO: 15.
10. Polinucleótido según la reivindicación 1, caracterizado por que tiene una secuencia capaz de hibridar en condiciones de alta astringencia a la secuencia SEQ ID NO: 17.
11. Polinucleótido según la reivindicación 1, caracterizado por que tiene una secuencia capaz de hibridar en condiciones de alta astringencia a la secuencia SEQ ID NO: 19.
12. Polinucleótido según la reivindicación 1, caracterizado por que tiene una secuencia capaz de hibridar en condiciones de alta astringencia a la secuencia SEQ ID NO: 21.
13. Polinucleótido según la reivindicación 1, caracterizado por que tiene una secuencia capaz de hibridar en condiciones de alta astringencia a la secuencia SEQ ID NO: 23.
14. Polinucleótido según la reivindicación 1, caracterizado por que tiene una secuencia capaz de hibridar en condiciones de alta astringencia a la secuencia SEQ ID NO: 25.
15. Polinucleótido según la reivindicación 1, caracterizado por que tiene la secuencia SEQ ID NO: 1.
16. Polinucleótido según la reivindicación 1, caracterizado por que tiene la secuencia SEQ ID NO: 3.
17. Polinucleótido según la reivindicación 1, caracterizado por que tiene la secuencia SEQ ID NO: 5.
18. Polinucleótido según la reivindicación 1, caracterizado por que tiene la secuencia SEQ ID NO: 7.
19. Polinucleótido según la reivindicación 1, caracterizado por que tiene la secuencia SEQ ID NO: 9.
20. Polinucleótido según la reivindicación 1, caracterizado por que tiene la secuencia SEQ ID NO: 11.
21. Polinucleótido según la reivindicación 1, caracterizado por que tiene la secuencia SEQ ID NO: 13.
22. Polinucleótido según la reivindicación 1, caracterizado por que tiene la secuencia SEQ ID NO: 15.
23. Polinucleótido según la reivindicación 1, caracterizado por que tiene la secuencia SEQ ID NO: 17.
24. Polinucleótido según la reivindicación 1, caracterizado por que tiene la secuencia SEQ ID NO: 19.
25. Polinucleótido según la reivindicación 1, caracterizado por que tiene la secuencia SEQ ID NO: 21.
26. Polinucleótido según la reivindicación 1, caracterizado por que tiene la secuencia SEQ ID NO: 23.
27. Polinucleótido según la reivindicación 1, caracterizado por que tiene la secuencia SEQ ID NO: 25.
28. Polipéptido relacionado con la virulencia de Haemophilus parasuis caracterizado por que presenta una identidad de al menos el 60% con un polipéptido definido por una secuencia seleccionada entre el grupo formado por SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 24, y SEQ ID NO: 26.
29. Polipéptido según la reivindicación 28, caracterizado por que tiene la secuencia SEQ ID NO: 2.
30. Polipéptido según la reivindicación 28, caracterizado por que tiene la secuencia SEQ ID NO: 4.
31. Polipéptido según la reivindicación 28, caracterizado por que tiene la secuencia SEQ ID NO: 6.
32. Polipéptido según la reivindicación 28, caracterizado por que tiene la secuencia SEQ ID NO: 8.
33. Polipéptido según la reivindicación 28, caracterizado por que tiene la secuencia SEQ ID NO: 10.
34. Polipéptido según la reivindicación 28, caracterizado por que tiene la secuencia SEQ ID NO: 12.
35. Polipéptido según la reivindicación 28, caracterizado por que tiene la secuencia SEQ ID NO: 14.
36. Polipéptido según la reivindicación 28, caracterizado por que tiene la secuencia SEQ ID NO: 16.
37. Polipéptido según la reivindicación 28, caracterizado por que tiene la secuencia SEQ ID NO: 18.
38. Polipéptido según la reivindicación 28, caracterizado por que tiene la secuencia SEQ ID NO: 20.
39. Polipéptido según la reivindicación 28, caracterizado por que tiene la secuencia SEQ ID NO: 22.
40. Polipéptido según la reivindicación 28, caracterizado por que tiene la secuencia SEQ ID NO: 24.
41. Polipéptido según la reivindicación 28, caracterizado por que tiene la secuencia SEQ ID NO: 26.
42. Vector de expresión caracterizado por que comprende un polinucleótido de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 27.
43. Vector según la reivindicación 42, caracterizado por que comprende un polinucleótido de una cualquiera de las reivindicaciones 2 a 14.
44. Vector según la reivindicación 42, caracterizado por que comprende un polinucleótido de una cualquiera de las reivindicaciones 15 a 27.
45. Célula huésped transformada con un vector de expresión que comprende un polinucleótido de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 27.
46. Célula huésped según la reivindicación 45, caracterizada por que el vector de expresión comprende un polinucleótido de una cualquiera de las reivindicaciones 2 a 14.
47. Célula huésped según la reivindicación 45 caracterizada por que el vector de expresión comprende un polinucleótido de una cualquiera de las reivindicaciones 15 a 27.
48. Procedimiento para la preparación de los polipéptidos de las reivindicaciones 28 a 41, caracterizado por que comprende las siguientes etapas:
a)
cultivar una célula huésped transformada con un vector de expresión de la reivindicación 42, y
b)
expresar dicho polinucleótido para producir dicho polipéptido.
49. Procedimiento según la reivindicación 48, caracterizado por que la célula huésped de la etapa a) se transforma con un vector de expresión de la reivindicación 43.
50. Procedimiento según la reivindicación 48, caracterizado por que la célula huésped de la etapa a) se transforma con un vector de expresión de la reivindicación 44.
51. Uso de los polinucleótidos de las reivindicaciones 1 a 27 para determinar si una cepa de H. parasuis es virulenta o avirulenta.
52. Kit para determinar si una cepa de H. parasuis es virulenta o avirulenta, caracterizado por que comprende:
a)
los productos de amplificación de los polinucleótidos de las reivindicaciones 15 a 27,
b)
el oligonucleótido pADH-F (SEQ ID NO: 27),
c)
los oligonucleótidos pADH-R1 (SEQ ID NO: 28), pADH-R2 (SEQ ID NO: 29), y pADH-R3 (SEQ ID NO: 30), y
d)
los reactivos necesarios para llevar a cabo la reacción de amplificación mediante la técnica de PCR.
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