ES2288753T3

ES2288753T3 - Composiciones inmunogeneticas contra infeccion por helicobacter, polipeptidos para su uso en las composiciones y secuencias de acido nucleico que codifican para dichos polipeptidos.

Info

Publication number: ES2288753T3
Application number: ES94917653T
Authority: ES
Inventors: Agnes Labigne; Sebastien Suerbaum; Richard Ferrero; Jean-Michel Thiberge
Original assignee: Institut Pasteur de Lille; Institut National de la Sante et de la Recherche Medicale INSERM
Current assignee: Institut Pasteur de Lille; Institut National de la Sante et de la Recherche Medicale INSERM
Priority date: 1993-05-19
Filing date: 1994-05-19
Publication date: 2008-01-16
Anticipated expiration: 2014-05-19
Also published as: DE69434985T2; DK0703981T3; JPH08510120A; CA2144307C; AU6929094A; ATE364083T1; CA2144307A1; WO1994026901A1; SG52480A1; JP2008086316A; JP2004337170A; US6248330B1; DE69434985D1; JPH08509873A; WO1995014093A1; JP3955317B2; AU689779B2; EP0703981A1; EP0703981B1

Abstract

LA INVENCION SE REFIERE A UNA COMPOSICION INMUNOGENICA CAPAZ DE INDUCIR ANTICUERPOS PROTECTIVOS CONTRA LA INFECCION HELICOBACTER, CARACTERIZADO POR QUE INCLUYE: (I) AL MENOS UNA SUBUNIDAD DE UN POLIPEPTIDO ESTRUCTURAL UREASA DE HELICOBACTER PILORI O UN FRAGMENTO DEL MISMO, SIENDO DICHO FRAGMENTO RECONOCIDO MEDIANTE LA REACCION DE ANTICUERPOS CON LA UREASA HELICOBACTER FELIS Y/O AL MENOS UNA SUBUNIDAD DE UN POLIPEPTIDO ESTRUCTURAL DE UREASA DE HELICOBACTER FELIS, O UN FRAGMENTO DEL MISMO, SIENDO DICHO FRAGMENTO RECONOCIDO MEDIANTE LA REACCION DE LOS ANTICUERPOS CON LA UREASA DE HELICOBACTER PILORI; (II) Y/O UNA PROTEINA DE IMPACTO DE CALOR (HSP) O CAPERONINA, DE HELICOBACTER, O UN FRAGMENTO DE DICHA PROTEINA. LA INVENCION TAMBIEN SE REFIERE A LA PREPARACION, MEDIANTE UN MECANISMO RECOMBINANTE DE TALES COMPOSICIONES INMUNOGENICAS.

Description

Composiciones inmunogenéticas contra infección por Helicobacter, polipéptidos para su uso en las composiciones y secuencias de ácido nucleico que codifican para dichos polipéptidos.

La presente invención se refiere a composiciones inmunogénicas para inducir anticuerpos protectores frente a infección por Helicobacter spp. También se refiere a material proteico derivado de Helicobacter y a secuencias de ácido nucleico que codifican para ellos. También se incluyen anticuerpos frente a estos materiales proteicos en la invención.

H. pylori es un microorganismo que infecta la mucosa gástrica humana y se asocia a gastritis crónica activa. Se ha demostrado que es un agente etiológico de la úlcera gastroduodenal (Peterson, 1991) y dos estudios recientes han notificado que las personas infectadas por H. pylori tienen un riesgo superior de desarrollar cáncer gástrico (Nomura et al, 1991; Parsonnet et al, 1991).

Los estudios in vivo de las bacterias y, por consiguiente, el trabajo en el desarrollo de agentes terapéuticos o preventivos apropiados se han visto gravemente dificultados por el hecho de que Helicobacter pylori sólo se asocia con el epitelio de tipo gástrico de muy pocos huéspedes animales, ninguno de los cuales son adecuados para su uso como modelos de laboratorio.

Se ha desarrollado un modelo de colonización gástrica de ratón usando una bacteria helicoidal aislada a partir de moco gástrico de gato (Lee et al, 1988, 1990) y que se identificó como miembro del género Helicobacter. Se ha denominado H. felis (Paster et al, 1990).

Hasta la fecha, sólo hay información limitada acerca de H. felis y el grado de sus similitudes y diferencias con H. pylori. Por tanto, la fiabilidad del modelo de ratón para el desarrollo de tratamientos para la infección por H. pylori es dudosa. Recientemente se ha demostrado que la ureasa de H. pylori es un antígeno protector en el modelo de H. felis/ratón (Davin et al, 1993; Corthesy-Theulaz et al, 1993).

Por tanto, es un objetivo de la presente invención proporcionar composiciones terapéuticas y preventivas para su uso contra la infección por Helicobacter, que además puede someterse a prueba en animales de laboratorio.

Se sabe que H. pylori expresa actividad ureasa y que la ureasa desempeña un papel importante en la colonización bacteriana y mediación de ciertos procesos patógenos (Ferrero y Lee, 1991; Hazel et al, 1991).

Se han clonado y secuenciado los genes que codifican para los péptidos estructurales de la ureasa de H. pylori (URE A, URE B) (Labigne et al, 1991; y solicitud de patente francesa FR 8813135), así como los genes que codifican para los polipéptidos "accesorios" necesarios para la actividad ureasa en H. pylori (solicitud de patente internacional WO 93/07273).

Se han realizado intentos de usar secuencias de ácido nucleico del conjunto génico de la ureasa de H. pylori como sondas para identificar secuencias de ureasa en H. felis. Sin embargo, ninguno de estos intentos ha sido satisfactorio. Además, el establecimiento y mantenimiento de cultivos de H. felis in vitro es extremadamente difícil, y las enormes cantidades de nucleasas presentes en las bacterias complica la extracción del ADN.

Sin embargo, los presentes inventores han tenido éxito en la clonación y secuenciación de los genes de los polipéptidos estructurales de la ureasa de H. felis y de los polipéptidos accesorios. Esto ha permitido, en el contexto de la invención, la comparación de los datos de la secuencia de aminoácidos para los productos del gen ure de H. felis con los de Helicobacter pylori, y se ha encontrado un alto grado de conservación entre las subunidades de ureasa. Existe una relación inmunológica entre las 2 ureasas, y pueden inducirse anticuerpos protectores frente a la infección por Helicobacter usando las subunidades de ureasa o fragmentos de las mismas como inmunógenos.

En efecto, para aclarar la eficacia de las subunidades de ureasa individuales para actuar como inmunógenos de mucosa, se han clonado los genes que codifican para las subunidades de ureasa respectivas (UreA y UreB) de Helicobacter pylori y Helicobacter felis en un vector de expresión (pMAL), y se expresaron en células de Escherichia coli como proteínas de fusión de la traducción. Se han purificado las proteínas UreA y UreB mediante técnicas de cromatografía de afinidad e intercambio iónico y tienen pesos moleculares previstos de aproximadamente 68 y 103 kDa, respectivamente. Los estudios por inmunotransferencia de tipo Western indican que los componentes de ureasa de las proteínas de fusión son fuertemente inmunogénicos y se reconocen específicamente mediante sueros anti-Helicobacter de conejo policlonales. La inmunización orogástrica de ratones con 50 \mug de UreB recombinante de H. felis, administrado en combinación con un adyuvante de mucosa (toxina del cólera), protegió al 60% (n = 7; p < 0,005) de los ratones de la colonización gástrica por bacterias de H. felis bacteria durante más de 4 meses. Esto se comparó con un valor del 25% (n = 8; p > 0,05) para el antígeno UreB heterólogo de H. pylori. Por primera vez, se ha demostrado que un antígeno
de subunidad recombinante induce una respuesta inmunoprotectora frente a la infección gástrica por Helicobacter.

También se han identificado, en el contexto de la invención, nuevas proteínas de choque térmico o chaperoninas, en Helicobacter, que tienen un efecto potenciador sobre la actividad ureasa. Por tanto, el uso de las chaperoninas en una composición inmunogénica puede inducir una potenciación de la protección.

En efecto, se han clonado los genes que codifican para cada uno de los polipéptidos Hsp A y HspB de Helicobacter pylori, se han expresado de manera independiente como proteínas fundidas a la proteína de unión a maltosa (MBP, Maltose-Binding-Protein) y se han purificado a gran escala. Se han usado estas proteínas como antígenos recombinantes para inmunizar conejos y en ensayos de inmunotransferencia de tipo Western así como en ELISA para determinar su inmunogenicidad en pacientes infectados por HP (HP+). Se ha demostrado que las proteínas de fusión MBP-HspA y MBP-HspB conservan sus propiedades antigénicas. La comparación de la respuesta inmunitaria humoral frente a HspA y/o HspB en sueros de pacientes (HP+) demostró que no sólo se reconocía HspB sino también HspA mediante sueros de pacientes (HP+) (29/38 y 15/38, respectivamente). Ninguno de los 14 pacientes no infectados tenía anticuerpos que reaccionaban con las Hsp.

La presente invención se refiere a una composición inmunogénica que puede inducir anticuerpos frente a la infección por Helicobacter caracterizada porque comprende:

(i): la proteína de choque térmico HSP A, codificada por el gen hsp A del plásmido pILL689 (CNCM I-1356), o

(ii): un fragmento de dicha HSP A que tiene al menos 6 aminoácidos, o

(iii): una variante de polipéptido de dicha HSP A, en la que se han sustituido, insertado o delecionado aminoácidos, mostrando dicha variante de polipéptido al menos el 75% de identidad con dicha HSP A,

en la que dicho fragmento o variante de polipéptido potencia la actividad ureasa en un microorganismo que puede expresar ureasa activa.

Preferiblemente, la composición inmunogénica puede inducir anticuerpos protectores. La expresión "polipéptido estructural de la ureasa" significa, en el contexto de la presente invención, la enzima de Helicobacter pylori o Helicobacter felis probablemente un antígeno de superficie principal compuesto de dos subunidades monoméricas de repetición, una subunidad principal (producto del gen ure B) y una subunidad menor, producto del gen ure A y que, cuando se complementan por la presencia de los productos de los genes accesorios de la agrupación de genes de la ureasa, son responsables de la actividad ureasa, es decir la hidrólisis de urea para liberar NH_{4}^{+} en las dos especies Helicobacter. Ha de entenderse que en ausencia de los productos génicos accesorios, los polipéptidos estructurales de la ureasa no muestran actividad enzimática, pero se reconocen por los anticuerpos que reaccionan con la ureasa de H. felis o H. pylori.

El término "composición inmunogénica" significa, en el contexto de la invención, una composición que comprende un principio activo principal, junto con cualquier componente necesario para garantizar u optimizar una respuesta inmunogénica, por ejemplo adyuvantes, tales como adyuvante mucosal, etc.

El polipéptido estructural de la ureasa de Helicobacter pylori se ha descrito y secuenciado por Labigne et al, 1991. El polipéptido descrito en este artículo es particularmente apropiado para su uso en la composición de la presente invención Sin embargo, pueden usarse las variantes que muestran homología funcional con esta secuencia publicada, que comprenden las sustituciones, deleciones o inserciones de aminoácidos siempre que se mantengan las características inmunológicas del polipéptido en tanto que se refiera a su reactividad cruzada con anticuerpos anti-ureasa de Helicobacter felis. Hablando de manera general, la variante de polipéptido mostrará una homología de al menos el 75% y de manera preferible aproximadamente el 90% con la secuencia incluida.

Un fragmento del polipéptido estructural de la ureasa de Helicobacter pylori también puede usarse en la composición inmunogénica de la invención, siempre que los fragmentos se reconozcan por anticuerpos que reaccionan con la ureasa de Helicobacter felis. Un fragmento de este tipo generalmente estará compuesto por al menos 6 aminoácidos, por ejemplo, desde 6 hasta 100 aminoácidos, de manera preferida aproximadamente 20-25. De manera ventajosa, el fragmento porta epítopos únicos frente a Helicobacter.

Las secuencias de aminoácidos y ácido nucleico pueden interpretarse en el contexto de la presente invención mediante referencia a las figuras 11 y 12, que muestran las abreviaturas del código genético y de aminoácidos, respectivamente.

El polipéptido estructural de la ureasa de Helicobacter felis adecuado para su uso en la presente invención es preferiblemente el que se codifica por parte del plásmido pILL205 (depositado en el CNCM el 25 de agosto de 1993, con el número: CNCM 1-1355), y cuya secuencia de aminoácidos se muestra en la figura 3 (subunidades A y B). De nuevo, puede usarse una variante de este polipéptido que comprende sustituciones, deleciones o inserciones de aminoácidos con respecto a la secuencia de la figura 3, siempre que se mantenga la relación cruzada inmunológica con la ureasa de Helicobacter pylori. Una variante de este tipo normalmente muestra al menos el 90% de homología o identidad con la secuencia de la figura 3. Un ejemplo de tales variantes son las subunidades A y B de la ureasa de Helicobacter heilmannii (Solnick et al, 1994), que han demostrado tener el 80% y el 92% de identidad con las subunidades A y B de la ureasa de H. felis, respectivamente.

Pueden usarse fragmentos de esta ureasa o variantes en la composición inmunogénica siempre que los fragmentos se reconozcan por anticuerpos que reaccionan con la ureasa de Helicobacter pylori. De nuevo, la longitud de un fragmento de este tipo es normalmente de al menos 6 aminoácidos, por ejemplo de desde 6 hasta 100, de manera preferida aproximadamente de 20 a 25. Preferiblemente, el fragmento porta epítopos únicos frente a Helicobacter.

Si se emplean variantes o fragmentos de las secuencias de la ureasa nativa en la composición inmunogénica de la invención, puede someterse a ensayo su reactividad cruzada con anticuerpos que reaccionan con la ureasa de las otras especies de Helicobacter poniendo en contacto el fragmento o la variante con anticuerpos, preferiblemente policlonales producidos frente a la ureasa o bien nativa o bien la recombinante o alternativamente frente a todo Helicobacter. Preferiblemente, las variantes y fragmentos dan origen a anticuerpos que también pueden reaccionar con la ureasa de H. heilmannii. La protección cruzada frente a la infección por H. heilmannii también se obtiene por tanto mediante la composición inmunogénica de la invención.

El uso de fragmentos de los genes estructurales de la ureasa se prefiere particularmente puesto que pueden conservarse las propiedades inmunológicas del polipéptido completo mientras que se minimiza el riesgo de toxicidad.

El componente de la ureasa de la composición inmunogénica, ya sea la subunidad A o subunidad B, puede usarse en forma de proteínas de fusión de la traducción, por ejemplo con la proteína de unión a maltosa (MBP). Otras fusiones adecuadas se muestran a modo de ejemplo en la solicitud de patente internacional WO 90/11360. Otro ejemplo de una proteína de fusión adecuada es el sistema "QIAexpress" comercializado por QIAGEN, EE.UU., que permite que la secuencia de etiqueta 6xHis se coloque en el extremo 5' o 3' de la secuencia que codifica para la proteína. El uso de los principios activos en forma de proteínas de fusión es, sin embargo, completamente opcional.

La composición inmunogénica de la invención comprende una proteína de choque térmico también conocida como una "chaperonina" de Helicobacter. Estas chaperoninas se han aclarado por los inventores en el contexto de la presente invención. Preferiblemente, la chaperonina es de Helicobacter pylori. Una HSP de este tipo, la HSP A asociada a la ureasa o una mezcla de HSPA y HSPB, que tienen la secuencia de aminoácidos ilustrada en la figura 6. Estos polipéptidos están codificados por el plásmido pILL689 (depositado en el CNCM el 25 de agosto de 1993, con el número: CNCM I-1356). Particularmente preferida es la proteína HSP-A de H. pylori, o bien sola o bien en combinación con Hsp-B.

También es posible usar, como componente HSP, según la invención, una variante de polipéptido en la que los aminoácidos de la secuencia de la figura 6 secuencia se han sustituido, insertado o delecionado, mostrando normalmente dicha variante al menos el 75% y preferiblemente al menos el 85% de homología con la HSP nativa. Preferiblemente las variantes muestran al menos el 75%, por ejemplo al menos el 85% de identidad con la Hsp nativa.

Las variantes muestran además homología funcional con el polipéptido nativo. En el caso de los componentes HSP, la "homología funcional" significa la capacidad de potenciar la actividad ureasa en un microorganismo que puede expresar ureasa activa, y/o la capacidad de bloquear la infección por Helicobacter, particularmente H. felis y H. pylori. Puede someterse a prueba la propiedad de potenciar la actividad ureasa usando el ensayo de actividad ureasa cuantitativo descrito posteriormente en los ejemplos. Los fragmentos de cualquiera o ambos de los polipéptidos HSP A y HSP B que tienen preferiblemente al menos 6 aminoácidos, pueden usarse en la composición. Los fragmentos o variantes del componente HSP usados en la composición inmunogénica de la invención pueden generar preferiblemente anticuerpos que bloquean el efecto de potenciación de la ureasa normalmente mostrado por los HSP. Esta propiedad también se somete a prueba usando el ensayo cuantitativo que se describe en los ejemplos. La presencia de las chaperoninas en la composición potencia la protección frente a Helicobacter pylori y
felis.

El componente Hsp de la composición inmunogénica, HspA o HspB puede usarse en forma de una proteína de fusión de la traducción, por ejemplo con la proteína de unión a maltosa (MBP). Tal como para el componente de la ureasa, se describen otros componentes de fusión adecuados en la solicitud de patente internacional WO 90/11360. También puede usarse el sistema "QIAexpress" de QIAGEN, EE.UU.. De nuevo, el uso de las proteínas en forma de proteínas de fusión es completamente opcional.

La composición inmunogénica puede comprender HspA y un polipéptido estructural de la ureasa tal como se definió anteriormente.

Según una realización preferida, la composición inmunogénica comprende, como componente de la ureasa, ambas subunidades A y B de Helicobacter felis ambas (es decir sin la ureasa de H. pylori) junto con la HSP A y HSP B de Helicobacter pylori.

La reactividad cruzada inmunológica entre las ureasas de las dos especies diferentes de Helicobacter permite el uso de sólo una ureasa en la composición, preferiblemente la de Helicobacter felis. Sin embargo los anticuerpos protectores inducidos por los epítopos comunes serán activos contra tanto Helicobacter pylori como Helicobacter felis. También es posible que la composición induzca anticuerpos protectores frente a otras especies de Helicobacter, si el fragmento o polipéptido de la ureasa porta epítopos que se producen también en aquellas otras especies.

De manera ventajosa se usa la composición de la invención como una composición inmunogénica o una vacuna, junto con excipientes y vehículos fisiológicamente aceptables y opcionalmente, adyuvantes, haptenos, vehículos estabilizadores, etc. Los adyuvantes adecuados incluyen muramil dipéptido (MDP), adyuvantes de Freund completos e incompletos (CFA y IFA) y alumbre. Las composiciones de vacunas se formulan normalmente para la administración oral.

Las vacunas son preferiblemente para su uso en seres humanos, pero también pueden administrarse en animales no humanos, por ejemplo para fines veterinarios, o para su uso en animales de laboratorio tales como ratones, gatos y perros.

Las composiciones inmunogénicas que se inyectan en animales producen la síntesis in vivo de anticuerpos específicos, que pueden usarse para fines terapéuticos, por ejemplo en inmunidad pasiva.

"Material proteico" significa cualquier molécula compuesta por cadenas de aminoácidos, por ejemplo péptidos, polipéptidos o proteínas, proteínas de fusión o mixtas (es decir una asociación de 2 o más materiales proteicos, todos o algunos de los cuales pueden tener propiedades inmunogénicas o de inmunomodulación), o bien purificadas o bien en una mezcla con otros materiales proteicos o no proteicos. "Polipéptido" significa una cadena de aminoácidos cualquiera que sea su longitud y engloba el término "péptido". El término "fragmento" significa cualquier secuencia de aminoácidos más corta en al menos un aminoácido que la secuencia original y que comprende una longitud de aminoácidos, por ejemplo de al menos 6 residuos, consecutivos en la secuencia original.

Las secuencias peptídicas de la invención, pueden obtenerse por ejemplo mediante síntesis química, usando una técnica tal como la técnica Merrifield y sintetizadores del tipo comercializado por Applied Biosystems.

La invención también se refiere al material proteico, caracterizado porque comprende o consiste en:

(i): la proteína de choque térmico HSPA de Helicobacter pylori que tiene la siguiente secuencia de aminoácidos:

1

(ii): un fragmento de HSPA tal como se definió en (i), comprendiendo dicho fragmento al menos 6 aminoácidos consecutivos de la secuencia de aminoácidos definida en (i); o,

(iii): una variante de polipéptido de la secuencia de aminoácidos definida en (i), en la que se han sustituido, insertado o delecionado aminoácidos, teniendo dicha variante de polipéptido al menos el 75% y preferiblemente al menos el 80% de identidad con la secuencia de aminoácidos definida en (i),

en el que dicho fragmento o variante de polipéptido potencia la actividad ureasa en un microorganismo que puede expresar ureasa activa.

Un fragmento particularmente preferido de la HSP A de Helicobacter pylori es la secuencia C-terminal:

100

o un subfragmento de esta secuencia que tiene al menos 6 aminoácidos consecutivos. Se cree que esta secuencia C-terminal actúa como un dominio de unión a metal permitiendo la unión de, por ejemplo, níquel.

El material proteico de la invención también puede comprender o consistir en una proteína de fusión o mixta que incluye al menos una de las subunidades del polipéptido estructural de la ureasa de H. pylori y/o de H. felis, o fragmentos o variantes del mismo tal como se definió anteriormente. Las proteínas de fusión particularmente preferidas son las proteínas de fusión Mal-E y las proteínas de fusión del sistema QIAexpress (QIAGEN, EE.UU.) tal como se detalló anteriormente. La proteína de fusión o mixta puede incluir o bien en lugar o bien además de la subunidad de la ureasa, una proteína de choque térmico, o un fragmento o una variante de la misma, tal como se definió anteriormente.

La invención también se refiere a anticuerpos monoclonales o policlonales frente a los materiales proteicos descritos anteriormente. Los anticuerpos también pueden dirigirse frente a un polipéptido que tiene al menos el 90% de homología con cualquiera de los polipéptidos de la ureasa anteriores o frente a un fragmento de los mismos que tiene preferiblemente al menos 6 aminoácidos. Los anticuerpos de la invención pueden reconocer específicamente los polipéptidos de Helicobacter felis expresados por la agrupación génica de la ureasa. En este caso, los epítopos reconocidos por los anticuerpos son únicos para Helicobacter felis. Alternativamente, los anticuerpos pueden incluir o consistir en anticuerpos dirigidos frente a epítopos comunes a polipéptidos de la ureasa de Helicobacter felis y a polipéptidos de la ureasa de Helicobacter pylori. Si los anticuerpos reconocen los productos génicos accesorios, es particularmente ventajoso que reaccionen de manera cruzada con el producto génico accesorio de Helicobacter pylori. De esta manera, los anticuerpos pueden usarse en tratamiento terapéutico de infección por Helicobacter pylori en seres humanos, bloqueando el proceso de maduración de la ureasa.

La invención también se refiere a anticuerpos monoclonales o policlonales frente a las HSP o fragmentos de las mismas, particularmente frente a la proteína HSP A y/o HSP B ilustrada en la figura 6. También pueden usarse los polipéptidos que tienen al menos el 75%, y preferiblemente al menos el 80% o el 90% de homología con las HSP para inducir la formación de anticuerpos. Estos anticuerpos pueden ser específicos para las chaperoninas de Helicobacter pylori o, alternativamente, pueden reaccionar de manera cruzada con las proteínas de tipo GroEL o proteínas de tipo GroES de bacterias distintas de Helicobacter, dependiendo de los epítopos reconocidos. La figura 7 muestra las regiones homologas de HSP A y HSP B con proteínas de tipo GroES y proteínas de tipo GroEL respectivamente de diversas bacterias. Los anticuerpos particularmente preferidos son aquellos específicos para o bien las chaperoninas HSP A o bien HSP B o aquellos que reconocen específicamente la secuencia C-terminal de HSP A que tienen la función de unión a metal. De nuevo, el uso de fragmentos específicos para la inducción de los anticuerpos garantiza la producción de anticuerpos específicos para Helicobacter.

Los anticuerpos de la invención pueden prepararse usando técnicas clásicas. Por ejemplo, los anticuerpos monoclonales pueden producirse mediante la técnica de hibridoma o mediante técnicas conocidas para la preparación de anticuerpos humanos o mediante la técnica descrita por Marks et al (Journal of Molecular Biology, 1991, 222, págs. 581-597).

La invención también incluye fragmentos de cualquiera de los anticuerpos anteriores producidos mediante digestión enzimática. Son de particular interés los fragmentos Fab y F(ab')_{2}. También son de interés los fragmentos Facb.

La invención también se refiere a suero o anticuerpos purificados obtenidos mediante inmunización de un animal, por ejemplo un mamífero, con la composición inmunogénica, el material proteico o fragmento, o la proteína de fusión o mixta de la invención, seguido de purificación de los anticuerpos o suero. También se refiere a un reactivo para la detección in vitro de la infección por H. pylori, que contiene al menos estos anticuerpos o suero, opcionalmente con reactivos para marcar los anticuerpos por ejemplo anti-anticuerpos etc.

La invención se refiere además a secuencias de ácido nucleico que codifican para cualquiera de los materiales proteicos anteriores incluyendo péptidos. En particular, la invención se refiere a una secuencia de ácido nucleico caracterizada porque comprende:

i): una secuencia que codifica para los polipéptidos accesorios y de la ureasa de Helicobacter felis tal como se definió anteriormente, y una secuencia que codifica para la HSP de H. pylori tal como se definió anteriormente; o

ii): una secuencia complementaria a la secuencia (i); o

iii): una secuencia que puede hibridar con la secuencia (i) o (ii) en condiciones de rigurosidad; o

iv): un fragmento de cualquiera de las secuencias (i), (ii) o (iii) que comprende al menos 10 nucleótidos.

Las secuencias preferidas son aquellas que comprenden toda o parte de la secuencia del plásmido pILL689 (CNCM I-1356), por ejemplo la secuencia de la figura 6, en particular la que codifica para HSP A y/o HSP B, o una secuencia complementaria a esta secuencia, o una secuencia que puede hibridar con esta secuencia en condiciones de rigurosidad.

Las condiciones de hibridación de rigurosidad alta en el contexto de la invención son las siguientes:

-: 5 x SSC:

-: formamida al 50% a 37ºC;

o:

-: 6 x SSC;

-: medio Denhard a 68ºC.

Las secuencias de la invención también incluyen las que hibridan con cualquiera de las secuencias (i), (ii) y (iii) definidas anteriormente en condiciones no rigurosas, es decir:

-: 5 x SSC;

-: SDS al 0,1%;

-: formamida al 30 o al 40% a 42ºC, preferiblemente al 30%.

El término "secuencias complementarias" en el contexto de la invención significa secuencias "complementarias" e "inversas" o "inversas".

Las secuencias de ácido nucleico pueden ser ADN o ARN.

Las secuencias de la invención pueden usarse como sondas de nucleótidos junto con los medios de marcaje apropiados. Tales medios incluyen isótopos radiactivos, enzimas, marcadores químicos o quimioluminiscentes, fluorocromos, haptenos o anticuerpos. Los marcadores pueden fijarse opcionalmente a un soporte sólido, por ejemplo una membrana o partículas.

Como marcador preferido, se incorpora fósforo radiactivo (^{32}P) en el extremo 5' de la secuencia de la sonda. Las sondas de la invención comprenden cualquier fragmento de las secuencias de ácido nucleico descritas y pueden tener una longitud por ejemplo de al menos 45 nucleótidos, por ejemplo 60, 80 ó 100 nucleótidos o más. Las sondas preferidas son las derivadas de los genes ure A, ure B, ure I, HSP A y HSP B.

Las sondas de la invención pueden usarse en la detección in vitro de la infección por Helicobacter en una muestra biológica, opcionalmente tras una reacción de amplificación génica. De la manera más ventajosa, las sondas se usan para detectar Helicobacter felis o Helicobacter pylori, o ambas, dependiendo de si la secuencia elegida como sonda es específica para una o para la otra, o si puede hibridar con ambas. Generalmente, las condiciones de hibridación son rigurosas para llevar a cabo una detección de este tipo.

La invención también se refiere a un kit para la detección in vitro de la infección por Helicobacter, caracterizado porque comprende:

-: una sonda de nucleótidos según la invención, tal como se definió anteriormente;

-: un medio apropiado para llevar a cabo una reacción de hibridación entre el ácido nucleico de Helicobacter y la sonda;

-: reactivos para la detección de cualquier hibrido formado.

Las secuencias de nucleótidos de la invención también pueden servir como cebadores en una reacción de amplificación de ácidos nucleicos. Los cebadores comprenden normalmente al menos 10 nucleótidos consecutivos de las secuencias descritas anteriormente y preferiblemente al menos 18. Las longitudes típicas son desde 25 hasta 30 y pueden ser tan altas como 100 o más nucleótidos consecutivos. Tales cebadores se usan en parejas y se eligen para hibridar con los extremos 5' y 3' del fragmento que va a amplificarse. Una reacción de amplificación de este tipo puede realizarse usando por ejemplo la técnica de PCR (solicitudes de patentes europeas EP200363, 201184 y 229701). También puede usarse la técnica de la Q-\beta-replicasa (Biotechnology, volumen 6, octubre de 1988) en la reacción de amplificación.

La invención también se refiere a vectores de expresión caracterizados porque contienen cualquiera de las secuencias de ácido nucleico de la invención. El vector de expresión particularmente preferido es el plásmido pILL689 (CNCM I-1356). Los vectores de expresión contendrán normalmente promotores, terminadores y genes marcadores adecuados y cualquier otra señal reguladora necesaria para la expresión eficaz.

La invención se refiere además a células huésped procariotas o eucariotas transformadas de manera estable mediante las secuencias de ácido nucleico de la invención. Como ejemplos de huéspedes puede hacerse mención a eucariotas superiores tales como las células y las líneas de células CHO; levadura, procariotas incluyendo bacterias tales como E. coli por ejemplo E. coli HB 101; Mycobacterium tuberculosum; virus incluyendo baculovirus y vaccinia. Normalmente las células huésped se transformarán mediante vectores. Sin embargo también es posible dentro del contexto de la invención, insertar las secuencias de ácido nucleico mediante recombinación homologa, usando técnicas convencionales.

Mediante el cultivo de los huéspedes transformados de manera estable de la invención, el material de polipéptido de la ureasa de Helicobacter, y en caso que pueda aplicarse, el material de HSP pueden producirse por medios recombinantes. Después se recogen y se purifican los materiales proteicos recombinantes. Las composiciones farmacéuticas se preparan combinando los materiales recombinantes con excipientes, adyuvantes y opcionalmente cualquier otro aditivo, tales como estabilizadores, adecuados.

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Diferentes aspectos se ilustran en las figuras

Figura 1

Mutagénesis con transposón y secuenciación de pILL205. Se presentan los mapas de restricción lineales del cósmido pILL199 recombinante y plásmido pILL205 recombinante (y los marcadores de escala respectivos). Los números entre paréntesis indican los tamaños de los fragmentos de ADN de H. felis insertados en uno de los vectores de clonación (pILL575 o pILL570, respectivamente). Los signos "más" y "menos" dentro de los círculos corresponden a los sitios de inserción del transposón MiniTn3-Km en pILL205: los signos "más" indican que el transposón no inactivó la expresión de ureasa, mientras que los signos negativos indican que se suprimió la expresión de ureasa. Las letras se refieren a los clones mutantes que se caracterizaron además por la actividad ureasa cuantitativa y por la síntesis de productos génicos de ureasa. La ubicación de los genes estructurales de la ureasa (ure A y ure B) en pILL205 están representadas por cajas, las longitudes de las cuales son proporcionales a los tamaños de los respectivos marcos de lectura abiertos. Las flechas se refieren a la orientación de la transcripción. La escala en la parte inferior de la figura indica los tamaños (en kilobases) de los fragmentos de restricción HindIII y PstI. Los sitios de restricción están representados tal como sigue: B, BamHI: Pv, PvuII; Bg, BglII; E, EcoRI; H, HindIII; C, ClaI; Ps, PstI. Las letras sin paréntesis indican los sitios se originaron a partir del vector de clonación.

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Figura 2

Análisis de inmunotransferencia de tipo Western de extractos de célula completa de E. coli HB101. Se hicieron reaccionar células que albergaban plásmidos recombinantes con antisuero (diluido 1:1, 1000) policlonal de conejo producido frente bacterias H. felis. A) Los extractos eran de células de E. coli que albergaban: vector del plásmido pILL570 (carril 1); plásmido pILL205 recombinante (carril 2); y plásmidos derivados de pILL205 interrumpidos en los loci "a", "b", "c", "d" y "e" (carriles 3-7). B) Los extractos eran de células de E. coli que albergaban: plásmido pILL753 recombinante que contenía los genes ure A y ure B de H. pylori (Labigne et al., 1991) (carril 1); y plásmidos derivados de pILL205 interrumpidos en los loci "f", "g", "h" e "i" (carriles 2-5). Las cabezas de flecha pequeñas indican los polipéptidos de aproximadamente 30 y 66 kilodaltons que representan los productos génicos Ure A y Ure B supuestos de H. felis. Las cabezas de flecha grandes en el panel B indican los correspondientes productos génicos de H. pylori que reaccionan de manera cruzada con el suero anti-H. felis. Los números indican los pesos moleculares (en millares) de los patrones de proteína.

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Figura 3

Secuencia de nucleótidos de los genes estructurales de la ureasa de H. felis. Los números por encima de la secuencia indican las posiciones de nucleótidos así como las posiciones de los aminoácidos en cada uno de los dos polipéptidos Ure A y Ure B. Las secuencias de aminoácidos predichas para Ure A (de 43 a 753 pb) y Ure B (de 766 a 2616) se muestran por debajo de la secuencia. El supuesto sitio de unión a ribosoma (secuencia Shine-Dalgarno, SD) está subrayado.

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Figura 4

Comparación de las secuencias para los genes estructurales de la ureasa de H. felis con respecto a: a) la secuencia de las dos subunidades de ureasa de H. pylori (Labigne et al., 1991); b) la secuencia de las tres subunidades de ureasa de Proteus mirabilis (Jones y Mobley, 1989); c) la secuencia de la única subunidad de la ureasa de Jack bean (judía sable). Los huecos (mostrados por guiones) se han traducido para garantizar la mejor alineación. *, aminoácidos idénticos a los de la secuencia de H. felis; =, aminoácidos compartidos por las diversas ureasas; \cdot, aminoácidos únicos para las ureasas de Helicobacter. Los porcentajes se refieren al número de aminoácidos que son idénticos a los de las subunidades de ureasa de H. felis. H.f., Helicobacter felis; H.p., Helicobacter pylori; P.m., Proteus mirabilis; J.b., Jack bean.

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Figura 5

Mapa de restricción de los plásmidos pILL689, pILL685 y pILL691 recombinantes. La construcción de estos plásmidos se describe en detalle en la tabla 1. Km dentro de los triángulos representa el sitio de inserción del casete de kanamicina que conduce a la construcción de los plásmidos pILL687, pILL688 y pILL696 (tabla 2). Las cajas por debajo de los mapas indican la posición de los tres elementos genéticos deducidos a partir de la secuencia de nucleótidos, concretamente IS5, Hsp A y Hsp B.

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Figura 6

Secuencia de nucleótidos de la agrupación génica de la proteína de choque térmico de Helicobacter pylori. El primer número por encima de la secuencia indica las posiciones de nucleótidos, mientras que el segundo enumera las posiciones de residuos de aminoácidos para cada proteína Hsp A y Hsp B. las supuestas secuencias de unión a ribosoma (sitios Shine-Dalgarno [SD]) están subrayadas.

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Figura 7

Comparación de la secuencia de aminoácidos deducida de Hsp A (A) o Hsp B (B) de Helicobacter pylori con la de las otras proteínas de tipo GraEL (A) o de tipo GroES (B). Los asteriscos marcan los aminoácidos idénticos con aquellos en las secuencias de Hsp A o Hsp B de Helicobacter pylori.

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Figura 8

Expresión de las proteínas de choque térmico Hsp A de Helicobacter pylori en minicélulas de E. coli. Las bandas proteicas con masas moleculares aparentes de 58 y 13 kDA, correspondientes a las proteínas de choque térmico Hsp A y Hsp B de Helicobacter pylori son claramente visibles en los carriles correspondientes a los plásmidos pILL689 y pILL692 y ausentes en los controles de vector (pILL570 y pACYC177, respectivamente)

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Figura 9

Secuencia de nucleótidos del gen ure I de Helicobacter felis y la secuencia de aminoácidos deducida.

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Figura 10

Comparación de la secuencia de aminoácidos de las proteínas ure I deducidas a partir de la secuencia de nucleótidos del gen ure I de Helicobacter felis y el de Helicobacter pylori.

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Figura 11

Código genético. Codones de terminación de cadena o "sin sentido". También se usa para especificar el iniciador formil-Met-ARNt^{Met}_{F}. El triplete Val GUG es por tanto "ambiguo" porque codifica tanto para valina como metionina.

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Figura 12

Significado de las abreviaturas de aminoácidos de una letra y de tres letras.

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Figura 13

Purificación de la proteína recombinante UreA-MBP de H. pylori usando el sistema de vector de expresión pMAL. Se hicieron migrar los extractos de las diversas etapas de la purificación de proteínas en un gel de poliacrilamida-SDS disuelto al 10%. Tras la electroforesis, se tiñó el gel con azul de Coomassie. Los extractos fueron: 1) células no inducidas; 2) células inducidas con IPTG; lisado en prensa francesa de extracto de células inducidas; 5) eluato de la columna de resina de amilosa; 6) eluato de la columna de intercambio aniónico (primer pase); 7) eluato de la columna de intercambio aniónico (segundo pase); 8) proteínas marcadoras convencionales con SDS-PAGE.

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Figura 14

Reconocimiento de las proteínas de fusión recombinantes UreA mediante sueros de conejo anti-Helicobacter. Se sometieron a inmunotransferencia de tipo Western los extractos de proteína de la proteína de unión a maltosa (MBP, carril 1), UreA-MBP de H. felis (carril 2), y UreA-MBP de H. pylori (carril 3) usando antisueros de conejo policlonales (diluidos 1:5000) producidos frente a extractos de células completas de H. pylori y H. felis. Las proteínas de fusión purificadas están indicadas por una flecha. Los supuestos productos de degradación de las proteínas se muestran mediante un asterisco.

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Figura 15

Reconocimiento de las proteínas de fusión recombinantes UreB mediante antisueros de conejo producidos frente a proteínas UreB homólogas y heterólogas purificadas. Se inmunotransfirieron las membranas de nitrocelulosa con los siguientes extractos: 1) marcadores proteicos convencionales; 2) UreA-MBP de H. felis; 3) MBP; 4) UreA-MBP de H. pylori. Se hicieron reaccionar las membranas con antisueros de conejo policlonales (diluidos 1:5000) producidos frente a subunidades UreB de H. pylori y H. felis unidas a MBP, respectivamente. Los pesos moleculares de las proteínas convencionales se presentan en el lado izquierdo de los diagramas.

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Figura 16

Análisis de inmunotransferencia de tipo Western de extractos de células completas de H. pylori y H. felis con antisueros producidos frente a proteínas recombinantes unidas a UreB MBP purificadas. Se hicieron reaccionar los extractos completos con SDS-PAGE de células de H. felis (carril 1) y H. pylori (carril 2) con antisueros de conejo policlonales producidos frente a proteínas purificadas unidas a UreB MBP de H. felis y UreB de H. pylori (sueros diluidos 1:5000). Puede observarse la diferencia de la movilidad en gel de las respectivas subunidades UreB no recombinantes de H. felis y H. pylori. Los números a la izquierda se refieren a los pesos moleculares de proteínas marcadoras convencionales.

Figura 17

Respuestas de IgG sérico frente a MBP (parte inferior), MBP-Hsp A (parte superior) y MBP-HspB (parte media) de 28 pacientes infectados por H. pylori (cuadrados, izquierda) y 12 pacientes no infectados (círculos, derecha). Se leyó la densidad óptica de cada suero en el ensayo ELISA descrito en los procedimientos experimentales a 492 nm, tras una incubación de 30 min. Los tamaños de los símbolos son proporcionales al número de sueros que dan el mismo valor de densidad óptica.

Figura 18

Análisis con SDS-PAGE del material eluido de la columna de amilosa (carriles 2 y 3) o de la columna de Ni-NTA tras la elución: con tampón E (pH 4,5), carriles 4 y 5; o tampón C (pH 6,3), carriles 6 y 7. El material eluido de un lisado de MC1061 (PILL933) (carriles 2, 3, 5 y 7) y el material eluido de un lisado de MC1061 (PMAL-c2) (carriles 4 y 6). El carril 3 contiene el mismo material que el carril 2 excepto que se resuspendió en tampón E, demostrando así que el tampón E es responsable de la formación de dímeros de la subunidad MBP-HspA, tal como se observa en los carriles 3 y 5.

Ejemplo de referencia I

I- Clonación, expresión y secuenciación del gen de la ureasa de H. felis Procedimientos experimentales para la parte I Cepas bacterianas y condiciones de cultivo

Se hizo crecer H. felis (ATCC 49179) en base de agar sangre nº 2 (Oxoid) complementada con sangre de caballo lisada al 5% (v/v) (BioMerieux) y un complemento de antibióticos que consistía en vancomicina 10 ng ml^{-1} (Lederle Laboratories), polimixina B 2,5 \mug ml^{-1} (Pfizer), trimetoprim 5 \mug ml^{-1} (Sigma Chemical Co.) y anfotericina B 2,5 \mug ml^{-1} (E.R Squibb and Sons, Inc.). Se cultivaron las bacterias en placas de agar recientemente preparadas y se incubaron, tapadas por la parte superior, en condiciones microaerobias a 37ºC durante 2-3 días. Se hicieron crecer de manera rutinaria las cepas HB101 (Boyer and Roulland-Dussoix, 1969) y MC1061 (Maniatis et al., 1983) de E. coli, usadas en los experimentos de clonación, en caldo de Luria sin añadir glucosa o sobre medio agar Luria, a 37ºC. Se hicieron pasar las bacterias que se hicieron crecer en condiciones limitantes de nitrógeno, en un medio sólido limitante de nitrógeno que consistía en medio mínimo M9 libre de amonio (pH 7,4) complementado con D-glucosa al 0,4% (p/v) y L-arginina 10 mM (Cussac et al., 1992).

Manipulaciones de ADN

Se realizaron todos los análisis y manipulaciones de ADN convencionales, a menos que se mencione lo contrario, según los procedimientos descritos por Maniatis et al. (1983).

Aislamiento de ADN de H. felis

Se extrajo el ADN genómico total mediante un procedimiento de lisis con sarcosil-proteinasa K (Labigne-Roussel et al., 1988). Se incubaron doce placas agar sangre inoculadas con H. felis en un bote anaerobio (BBL) con un gaspak anaerobio (BBL 70304) sin catalizador, durante 1-2 días a 37ºC. Se recogieron las placas en 50 ml de una disolución de glicerol al 15% (v/v) - sacarosa al 9% (p/v) y se centrifugó a 5.000 rpm (en una centrífuga Sorvall), durante 30 min. a 4ºC. Se resuspendió el sedimento en 0,2 ml de D-glucosa 50 mM en Tris 25 mM - EDTA 10 mM (pH 8,0) que contenía lisozima 5 mg ml^{-1} y se transfirió a un tubo de cierre rápido de polialomero VTi65. Se añadieron a la suspensión una alícuota de 0,2 ml de proteinasa K 20 mg ml^{-1} y 0,02 ml de perclorato de sodio 5 M. Se lisaron las células añadiendo 0,65 ml de EDTA 0,5 M - sarcosil al 10% (p/v), y se incubaron a 65ºC hasta que la suspensión se volvió transparente (aproximadamente 5 min.). Se completó el volumen del tubo con una disolución de CsCl que consistía (por 100 ml) en 126 g de CsCl, 1 ml de aprotinina, 99 ml de tampón TES (Tris 30 mM, EDTA 5 mM, NaCl 50 mM (pH 7,5)). Se centrifugaron los lisados a 45.000 rpm, durante 15-18 h a 18ºC. Se recogió el ADN total y se dializó frente a tampón TES (Tris 10 mM, EDTA 1 mM), a 4ºC.

Clonación del cósmido

Se clonó ADN cromosómico de H. felis en el vector de cósmido pILL575, tal como se describió previamente (Labigne et al, 1991). Brevemente, se clasificaron por tamaño los fragmentos de ADN que surgieron de una digestión parcial con Sau3A en un gradiente de densidad de sacarosa (del 10 al 40%) y después se ligaron en una preparación de ADN de pILL575 desfosforilado y digerido con BamHI. Se empaquetaron los cósmidos dentro de partículas lambda de fago (Amersham, kit de empaquetamiento in vitro) y se usaron para infectar E. coli HB101. Para examinar la expresión de ureasa, se colocaron en placa de nuevo los transductos resistentes a kanamicina sobre medio que imita a nitrógeno sólido (véase anteriormente) que contenía kanamicina (20 \mug ml^{-1}) que se había dispensado en los pocillos individuales de las placas de microtitulación (Becton Dickinson). Se incubaron aeróbicamente las placas de microtitulación, a 37ºC durante 2 días antes de añadir 0,1 ml de reactivo de ureasa (Hazell et al., 1987) a cada uno de los pocillos. Se detectó la ureolisis en el plazo de 5-6 h a 37ºC mediante un cambio de color en el reactivo. Se mapearon con restricción varios clones de cósmido positivos de ureasa y se seleccionó uno para la subclonación.

Subclonación de ADN de H. felis

Se digirió parcialmente con Sau3A una preparación de plásmido en CsCl a gran escala de ADN de cósmido. Se electroeluyeron los fragmentos de ADN (7-11 kb) de un gel de agarosa y se purificaron usando extracciones con fenol-cloroformo. Tras la precipitación en etanol frío, se ligaron los fragmentos en el plásmido pILL570 digerido con Bg/III (Labigne et al., 1991) y se usaron los plásmidos recombinantes para transformar las células MC1061 de E. coli competentes. Se seleccionaron los transformantes resistentes a espectinomicina y se examinaron para determinar la expresión de ureasa en condiciones limitantes de nitrógeno y ricas en nitrógeno (agar Luria).

Actividad ureasa cuantitativa

Se recogieron los cultivos que se hicieron crecer aeróbicamente durante 2,5 días a 37ºC y se lavaron dos veces en NaCl al 0,85% (p/v). Se resuspendieron los sedimentos en tampón PEB (tampón fosfato de sodio 0,1 M (pH 7,4) que contenía EDTA 0,01 M) y después se sonicaron mediante cuatro arranques de 30 s usando un Branson Sonifier modelo 450 fijado a 30 W, 50% de ciclo. Se eliminó el residuo celular de los sonicados mediante centrifugación. Se midieron las actividades ureasa de los sonicados en una disolución de urea 0,05 M preparada en PEB mediante una modificación de la reacción de Berthelot (Cussac et al., 1992). Se expresó la actividad ureasa como \mumol de urea min^{-1} mg^{-1} de proteína bacteriana.

Determinación de proteínas

Se estimaron las concentraciones de proteínas con una versión comercial del ensayo de bradford (Sigma Chemicals).

Mutagénesis de transposón

Se generaron las mutaciones de inserción aleatorias dentro de H. felis clonado por medio de un sistema de administración MiniTn3-Km (Labigne et al., 1992). En resumen, se transformaron las células HB101 de E. coli que contenían el plásmido pTCA que codifica para la transposasa con plásmido pILL570 que contenía ADN de H. felis clonado. Se realizó la transposición del elemento de MiniTn3-Km en los plásmidos derivados de pILL570 por medio de conjugación. Se seleccionaron entonces los cointegrados resultantes para determinar las estructuras resueltas en presencia de altas concentraciones de kanamicina (500 mgl^{-1}) y espectinomicina (300 mgl^{-1}).

SDS-PAGE e inmunotransferencia de tipo Western

Se analizaron los extractos celulares solubilizados en geles en bloque, que comprendían un gel de apilamiento de acrilamida al 4,5% y gel de resolución al 12,5%, según el procedimiento de Laemmli (Laemmli, 1970). Se realizó la electroforesis a 200 V en un aparato de gel en minibloque (Bio-Rad).

Se transfirieron las proteínas a papel de nitrocelulosa (Towbin et al., 1979) en una célula de transferencia Mini Trans-Blot (Bio-Rad) fijada a 100 V durante 1 h (con enfriamiento). Se bloquearon las membranas de nitrocelulosa con caseína purificada al 5% (p/v) (BDH) en solución salina tamponada con fosfato (PBS, pH 7,4) a temperatura ambiente, durante 2 h (Ferrero et al., 1992). Se hicieron reaccionar las membranas a 4ºC durante la noche con antisueros diluidos en la caseína al 1% (p/v) preparada en PBS. Se detectaron entonces los inmunorreactivos usando un anticuerpo secundario biotinilado (Kirkegaard and Perry Lab.) en combinación con avidina-peroxidasa (KFL). Se usó una disolución de sustrato compuesta de 4-cloro-1-naftol al 0,3% (p/v) (Bio-rad) para visualizar los productos de reacción.

Secuenciación de ADN

Se clonaron los fragmentos de ADN que van a secuenciarse en vectores de bacteriófagos M13mp18 y M13mp19 (Meissing y Vieira, 1982) (Pharmacia). Se transfectaron las células JM101 de E. coli competentes con ADN recombinante de fago y se colocaron en placa en medios que contenían X-gal (5-bromo-4-cloro-3-indolil-\beta-D-galactopiranósido) e isopropil-\beta-D-tiogalactopiranósido. Se seleccionaron las placas que surgieron de bacterias infectadas con ADN recombinante de fago para la preparación de moldes de ADN monocatenario mediante el tratamiento con polietilenglicol (Sanger et al., 1977). Se secuenciaron ADN monocatenarios según el método de terminación de cadena de didesoxinucleótidos usando un kit Sequenase (United States Biochemical Corp.).

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Número de registro de secuencia de nucleótidos

El número de registro de nucleótidos es X69080 (biblioteca de datos EMBL).

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Resultados de experimentos de la parte I Expresión de la actividad ureasa por clones de cósmido de H. felis

La clonación de fragmentos (de 30 a 45 kb de tamaño) parcialmente digeridos de ADN cromosómico de H. felis en el vector de cósmido pILL575 dio como resultado el aislamiento de aproximadamente 700 clones de cósmido. Se subcultivaron los clones en medio limitante de nitrógeno con el fin de inducir la expresión de ureasa (Cussac et al., 1992). Se identificaron seis de éstos como que eran positivos para ureasa tras una incubación de 5-6 h (tal como se describió en la sección de procedimientos experimentales). No se identificaron otros clones de cósmido positivos para ureasa, incluso tras una incubación adicional durante la noche. Los análisis con enzimas de restricción de 3 clones que albergaban los cósmidos que codifican para la ureasa desvelaron un fragmento de ADN de 28 kD común. Se seleccionó para la subclonación un cósmido (denominado pILL199) que contenía regiones de ADN en ambos extremos del fragmento común.

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Identificación de genes de H. felis requeridos para la expresión de ureasa cuando se clonan en células de E. coli

Para definir la región de ADN mínima necesaria para la expresión de ureasa en células de E. coli, se digirió parcialmente con Sau3A el cósmido pILL199 que codifica para la ureasa y se subclonaron los fragmentos en el plásmido pILL570. Se subcultivaron los transformantes en medios limitantes de nitrógeno y ricos en nitrógeno y se examinaron para determinar un fenotipo positivo para ureasa. Cinco transformantes expresaron actividad ureasa cuando se hicieron crecer en condiciones limitantes de nitrógeno, mientras que no se detectó actividad tras hacer crecer en medio rico en nitrógeno. Los análisis de mapeo de restricción indicaron que los plásmidos que codifican para la ureasa contenían insertos de entre 7 y 11 kb. Se eligió el plásmido denominado pILL205 para estudios adicionales.

Se realizó la mutagénesis aleatoria de ADN de H. felis clonado para investigar las supuestas regiones esenciales para la expresión de ureasa en E. coli y para localizar la región de ADN clonado que contenía los genes estructurales de la ureasa. Se generaron por tanto los mutantes de inserción aleatoria del plásmido pILL205 prototipo usando el elemento MiniTn3-Km (Labigne et al, 1992). Se mapeó con restricción el sitio de inserción para cada una de las copias mutadas de pILL205 y se evaluaron las células que albergaban estos plásmidos cualitativamente para determinar la actividad ureasa (figura 1). Se usó entonces una selección de células HB101 de E. coli que albergaban los derivados mutados de pILL205 (denominados "a" hasta "i") tanto para las determinaciones cuantitativas de la actividad ureasa, como para la detección de las supuestas subunidades de ureasa mediante inmunotransferencia de tipo
Western.

La actividad ureasa de células HB101 de E. coli que albergaban pILL205 era de 1,2 \pm 0,5 \mumol de urea min^{-1}mg^{-1} de proteína bacteriana (tabla 1), que es aproximadamente un quinto de la de la cepa original de H. felis usada para la clonación. La inserción del transposón en los sitios "a", "c", "d", "f" y "g" dio como resultado un fenotipo negativo, mientras que las mutaciones en los sitios "b", "e", "h" e "i" no tuvieron efecto significativo sobre las actividades ureasa de clones que albergaban estas copias mutadas de pILL205 (tabla 1). Por tanto, la mutagénesis de pILL205 con el elemento MiniTn3-Km identificó tres dominios como que se requerían para la expresión del gen de la ureasa de H. felis en células de E. coli.

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Localización de los genes estructurales de la ureasa de H. felis

El análisis de inmunotransferencia de tipo Western de extractos de células de E. coli que albergaban pILL205 indicó la presencia de dos polipéptidos de aproximadamente 30 y 66 kDa que se hicieron reaccionar de manera cruzada con antisuero de conejo de H. felis policlonal (figura 2A). Estas proteínas no se produjeron por bacterias que portaban el vector (pILL570). Se ha informado que la ureasa nativa de H. felis está compuesta por subunidades monoméricas de repetición con pesos moleculares calculados de 30 y 69 kDa (Turbett et al, 1992). Por tanto se cree que las proteínas de 30 y 66 kDa corresponden a los productos génicos ure A y ure B, respectivamente. De manera interesante, un extracto de células de E. coli que albergaban el plásmido pILL763 recombinante (Cussac et al, 1992) que contenía los genes ure A y ure B de Helicobacter pylori, expresó dos polipéptidos con tamaños moleculares aproximados de 30 y 62 kDa que se hicieron reaccionar de manera cruzada con los antisueros anti-H. felis (figura 2B).

TABLA 1 Mutagénesis de clones de E. coli y efecto sobre la actividad ureasa

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2

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Los clones que albergaban los derivados mutados de pILL205, en todos menos un caso, expresaron los productos génicos ure A y ure B (figuras 2A, B). Dado que varios de los mutantes (es decir mutantes "c", "d", "f" y "g") sintetizaron las subunidades de ureasa pero no produjeron ninguna actividad enzimática, es posible especular que las funciones accesorias esenciales para la actividad ureasa pueden haberse interrumpido mediante la inserción de transposón. Por el contrario, el mutante denominado pILL205::a no produjo el producto ure B y era negativo para ureasa. Por tanto se supuso que el sitio de inserción de transposón está localizado en el gen ure B. Se realizaron los análisis de secuencia de la región de ADN correspondiente al sitio de inserción "a" para aclarar posibles marcos de lectura abiertos que codifican para los polipéptidos estructurales de la ureasa de H. felis.

Análisis de secuencia de los genes estructurales de la ureasa de H. felis

La secuenciación de una región de 2,4 kb de ADN de H. felis adyacente al sitio de inserción de transposón "a" dio como resultado la identificación de dos marcos de lectura abiertos (ORF) denominados ure A y ure B que se transcriben en la misma dirección (figura 3). Se confirmó que el transposón estaba localizado a 240 pb en el sentido de 5' del extremo de ure B. Ambos ORF comenzaron con un codón de inicio ATG y estaban precedidos por un sitio similar a la secuencia consenso de unión a ribozoma de E. coli (Shine y Dalgarno, 1974). El espacio intergénico para los genes estructurales de H. felis consistía en tres codones que estaban en fase con los marcos de lectura abiertos adyacentes. Esto sugiere, como ya se ha observado que es el caso para Helicobacter pylori (Labigne et al, 1991), que una única mutación en el codón de parada del gen ure A daría como resultado teóricamente un único polipéptido fusionado.

Los genes ure A y ure B de H. felis codifican para polipéptidos con pesos moleculares calculados de 26074 kA y 61663 Da, respectivamente, que son altamente homólogos en el nivel de secuencia de aminoácidos a los productos génicos ure A y ure B de H. pylori. Los niveles de identidad entre los productos génicos ure A y ure B correspondientes de las dos Helicobacter spp. se calcularon que eran del 73,5% y el 88,2% respectivamente. A partir de la información de la secuencia de aminoácidos, los pesos moleculares predichos de los polipéptidos ure A y ure B de H. felis y H. pylori (Labigne et al, 1991) son muy similares. Sin embargo el producto ure B de H. felis tenía una movilidad inferior que el producto génico correspondiente de Helicobacter pylori cuando se sometió a electroforesis en gel de SDS-poliacrilamida (figura 2B).

Ejemplo de referencia II

II- Expresión de proteínas de subunidad de la ureasa recombinante de H. pylori y H. felis: evaluación de estas proteínas como posibles inmunógenos mucosales en un modelo de ratón

Los objetivos de este estudio fueron desarrollar antígenos recombinantes derivados de las subunidades de ureasa de H. pylori y H. felis, y evaluar las eficacias inmunoprotectoras de estos antígenos en el modelo de ratón/H. felis. Se clonó de manera independiente cada uno de los genes estructurales que codifica para las subunidades de ureasa respectivas de H. pylori y H. felis y se sobreexpresó en Escherichia coli. Se purificaron los antígenos de ureasa recombinantes resultantes (que se fusionaron a una proteína de unión a maltosa de 42 kDa de E. coli) en grandes cantidades de cultivos de E. coli y fueron inmunogénicos, pero enzimáticamente inactivos. Los hallazgos demostraron la viabilidad para desarrollar una vacuna recombinante contra la infección por H. pylori.

Procedimientos experimentales para la parte II Cepas bacterianas, plásmidos y condiciones de crecimiento

Se hizo crecer H. felis (ATCC 49179) en un medio de agar sangre que contenía base de agar sangre nº 2 (Oxoid) complementado con sangre de caballo lisada al 10% (BioMérieux) y un complemento de antibióticos que consistía en vancomicina (10 \mug/ml), polimixina B (25 ng/ml), trimetoprim (5 \mug/ml) y anfotericina B (2,5 \mug/ml). Se cultivaron las bacterias en condiciones microaerobias a 37ºC durante 2 días, tal como se describió previamente. Se hicieron crecer de manera rutinaria las cepas MC1061 y JM101 de E. coli, usadas en los experimentos de clonación y de expresión, a 37ºC en medio Luria, con o sin agar añadido. Se añadieron los antibióticos carbenicilina (100 \mug/ml) y espectinomicina (100 \mug/ml) según se requería.

Análisis y manipulaciones de ADN

Se realizaron todos los análisis y manipulaciones de ADN, a menos que se mencione lo contrario, según los procedimientos convencionales. Se adquirieron las enzimas de modificación y de restricción de Amersham (Francia). Se electroeluyeron los fragmentos de ADN que van a ser clonados de geles de agarosa y después se purificaron mediante el pase en minicolumnas Elutip (Schleicher and Schull, Alemania). Se realizó la secuenciación de ADN monocatenario usando vectores de bacteriófagos M13mp18 y M13mp19 (Pharmacia, Francia). Se prepararon los moldes de ADN monocatenario a partir de ADN recombinante de fago mediante el tratamiento con polietilenglicol. Se consiguió la secuenciación de los moldes según el método de terminación de cadena de didesoxinucleótidos usando un kit Sequenase (United States Biochemical Corp., EE.UU.).

Preparación de insertos para clonación usando la reacción en cadena de la polimerasa (PCR)

Para clonar los genes ureA de H. pylori y H. felis, se concibieron cebadores 36 meros degenerados a partir de las secuencias de ureasa publicadas (Labigne et al., 1991; Ferrero y Labigne, 1993) (conjunto de cebadores nº 1; se refiere a la tabla 2). Se usaron como material de molde en las reacciones de PCR ADN purificado de los clones de E. coli que albergaban plásmidos pILL763 y pILL207 (tabla 3), que codificaban para los genes estructurales de ureasas de H. pylori y H. felis. Las muestras de reacción contenían: 10 - 50 ng de ADN desnaturalizado; tampón PCR (KCl 50 mmol/l en Tris-HCl 10 mmol/l [pH 8,3)]); dATP, dGTP, dCTP y dTTP (cada uno a una concentración final de 1,25 mmol/l); MgCl_{2} 2,5 mmol/l; 25 pmol de cada cebador y 0,5 ml de Tag polimerasa. Se sometieron las muestras a 30 ciclos del siguiente programa: 2 min. a 94ºC, 1 min. a 40ºC.

Se clonaron los productos de amplificación en los extremos cohesivos del vector pAMP (figura 1) según el protocolo descrito por el fabricante ("CloneAmp System", Gibco BRL; Cergy Pontoise, Francia). Brevemente, se mezclaron directamente en un tampón (que consistía en KCl 50 mmol/l, MgCl_{2} 1,5 mmol/l, gelatina al 0,1% (p/v) en Tris-HCl 10 mmol/l, pH 8,3) 60 ng de producto de amplificación con 50 ng del ADN de vector pAMP 1 y 1 unidad de uracil ADN glicolsilasa. Se realizó el ligamiento durante 30 min. a 37ºC. Se transformaron las células competentes (200 \mul) de E. coli MC1061 con 20 ml de la mezcla de ligamiento. Se escindieron posteriormente los insertos del poliligador del vector pAMP mediante digestión doble con BamH1 y Pst1, y después se subclonaron en el vector de expresión pMAL (New England Biolabs Inc., Beverly, EE.UU.) elegido para la producción de antígenos recombinantes (pILL919 y pILL920, respectivamente, figura 13), así como en bacteriófago M13mp para la secuenciación.

Se obtuvo la amplificación de un producto que contenía el gen ureB de H. pylori mediante PCR usando un par de cebadores de 35 meros (conjunto nº 2, tabla 2). En primer lugar se desnaturalizaron las mezclas de reacción de PCR durante 3 min. a 94ºC, después se sometieron a 30 ciclos del siguiente programa: 1 min. a 94ºC, 1 min. a 55ºC y 2 min. a 72ºC. Se digirió el producto de amplificación purificado (1850 pb) con EcoRI y PstI y después se clonó en pMAL (pILL927, figura 2). Se transformaron las células competentes de E. coli MC1061 con la reacción de ligamiento.

Se clonó ureB de H. felis en un procedimiento de dos etapas, que permitió la producción de las dos versiones completa y truncada de la subunidad UreB. Se digirió el plásmido pILL213 (tabla 3) con las enzimas DraI, correspondientes al residuo de aminoácido número 219 de la subunidad UreB y HindIII. Se purificó el fragmento de 1350 pb resultante y se clonó en pMAL que se había digerido con XmnI y HindIII (pILL219, figura 2). Con el fin de producir un clon que pueda sintetizar una proteína UreB completa, se desarrollaron cebadores de PCR (conjunto nº 3, tabla 2) que amplificaron un fragmento de 685 pb de la parte N-terminal del gen ureB (excluyendo el codón ATG), que también se solaparon al comienzo del inserto en el plásmido pILL219. Se purificó el material amplificado por PCR y se digirió con bamHI y HindIII, y después se clonó en pMAL (pILL221, figura 14). Se escindió posteriormente un fragmento PstI-PstI de 1350 pb que codificaba para la parte restante del producto génico UreB de pILL219 y se clonó en una preparación linealizada de pILL221 (pILL222, figura 14).

Expresión de polipéptidos de ureasa recombinantes en el vector pMAL

El vector de expresión pMAL está bajo el control de un promotor inducible (P_{lac}) y contiene un marco de lectura abierto (ORF) que codifica para la producción de MalE (proteína de unión a maltosa, MBP). Las secuencias clonadas en fase con el último ORF dieron como resultado la síntesis de proteínas fusionadas a MBP que se purificaron fácilmente en resina de amilosa. De las dos versiones de pMAL que están disponibles comercialmente, la versión que no codifica para una secuencia señal (es decir pMAL-c2) sintetizó cantidades superiores de proteínas recombinantes y por tanto se usó todo el tiempo.

Se examinaron los clones de E. coli que albergaban plásmidos recombinantes para la producción de proteínas de fusión, antes de realizar experimentos de purificación a gran escala.

Purificación de polipéptidos de ureasa recombinantes

Se inocularon volúmenes de 500 ml recientes de caldo Luria, que contenían carbenicilina (100 \mug/ml y glucosa al 2% (p/v) con cultivos (5 ml) durante la noche de clones de E. coli. Se incubaron los cultivos a 37ºC y se agitaron a 250 rpm, hasta que A_{600} = 0,5. Antes de añadir isopropil-\beta-D-tiogalactopiranósido (IPTG) 1 mmol/l (concentración final) a los cultivos, se tomó una muestra de 1,0 ml (células no inducidas). Se incubaron los cultivos durante 4 h adicionales, momento en el que se tomó otra muestra de 1,0 ml (células inducidas). Después se analizaron las muestras de las células no inducidas e inducidas con SDS-PAGE.

Se centrifugaron los cultivos inducidos con IPTG a 7000 rpm durante 20 min., a 4ºC y se descartó el sobrenadante. Se resuspendieron los sedimentos en 50 ml de tampón de columna (NaCl 200 mmol/l, EDTA 1 mmol/l en TrisHCl 10 mmol/l, pH 7,4), que contenía los siguientes inhibidores de proteasa (suministrados por Boehringer, Mannheim, Alemania): leupeptina 2 \mumol/l, pepstatina 2 \mumol/l y fluoruro de fenilmetilsulfonilo (PMSF) 1 mmol/l. Se lisaron las células intactas mediante el pase a través de una célula de prensa francesa (16000 lb/in^{2}). Se eliminó el residuo celular mediante centrifugación y se diluyeron los lisados en tampón de columna para dar una concentración final de 2,5 mg de proteína/ml, antes de realizar cromatografía en una columna de 2,6 cm x 20 cm de resina de amilosa (New England Biolabs). Se lavó la resina con tampón de columna a 0,5 ml/min hasta que los niveles se volvieron A_{280}. Se eluyeron las proteínas recombinantes unidas a MBP de la columna lavando con tampón de columna que contenía 1-maltosa 10 mmol/l.

Se combinaron las fracciones que contenían las proteínas recombinantes y después se dializaron varias veces a 4ºC frente a tampón de baja salinidad (que contenía NaCl 25 mmol/l en TrisHCl 20 mmol/l, pH 8,0). Después se cargaron las fracciones combinadas a una velocidad de flujo de 0,5 ml/min en una columna de intercambio aniónico de 1,6 x 10 cm (HP-Sepharose, Pharmacia, Suecia) conectada a un sistema de cromatografía Hi-Load (Pharmacia). Se eluyeron las proteínas de la columna usando un gradiente salino (NaCl de 25 mmol/l a 500 mmol/l). Se dializaron exhaustivamente las fracciones que daban lecturas de alta absorbancia a A_{280} frente a agua destilada a 4ºC y se analizaron con SDS-PAGE.

Antisueros de conejo

Se preparó antisuero de conejo policlonal frente a extractos de células totales de la cepa 85P de H. pylori (Labigne et al., 1991) y H. felis (ATCC49179). Se produjo antisuero de conejo policlonal frente a preparaciones de proteínas recombinantes de subunidades de ureasa de H. pylori y H. felis inmunizando conejos con 100 \mug de proteína recombinante purificada en adyuvante completo de Freund (Sigma). Cuatro semanas más tarde, se inmunizaron con administración de refuerzo los conejos con 100 \mug de proteína en adyuvante incompleto de Freund. En la semana 6, se extrajo sangre de los animales de manera terminal y se guardó el suero a -20ºC.

Análisis de proteína mediante SDS-PAGE e inmunotransferencia de tipo Western

Se analizaron los extractos celulares solubilizados sobre geles en bloque, que comprendían un gel de apilamiento de acrilamida al 4,5% y un gel de resolución al 10%, según el procedimiento de Laemmli. Se realizó la electroforesis a 200 V en un aparato de gel en minibloque (Bio-Rad, EE.UU.).

Se transfirieron las proteínas a papel de nitrocelulosa en una célula de transferencia Mini Trans-Blot (Bio-Rad) fijada a 100 V durante 1 h, con enfriamiento. Se bloquearon las membranas de nitrocelulosa con caseína al 5% (p/v) (BDH, Inglaterra) en solución salina tamponada con fosfato (PBS, pH 7,4) con agitación suave a temperatura ambiente, durante 2 h. Se hicieron reaccionar las membranas a 4ºC durante la noche con antisueros diluidos en caseína al 1% preparada en PBS. Se detectaron los inmunorreactivos usando anticuerpos secundarios biotinilados y conjugado de estreptavidina-peroxidasa (kilkegaard and Parry Lab., Gaithersburg, EE.UU.). Se visualizaron los productos de reacción en película autodiográfica (Hyperfilm, Amersham, Francia) usando una técnica de quimioluminiscencia (ECL system, Amersham).

Se determinaron las concentraciones de proteína mediante el ensayo de Bradford (sigma chemicals corp., St Louis, EE.UU.).

Experimentación animal

Se obtuvieron ratones Swiss libres de patógenos específicos (SPF, Specific Pathogen-Free) de seis semanas de edad, hembras (Centre d'Elevage R. Janvier, Le-Genest-St-Isle, Francia) y se mantuvieron con una dieta de gránulos comerciales con agua a voluntad. Se examinaron los intestinos de los animales para determinar la ausencia de Helicobacter muridarum. Para todas las administraciones orogástricas, se administraron a los ratones alícuotas de 100 \mul usando jeringas desechables de 1,0 ml, a las que se unieron catéteres de polietileno (Biotrol, Paris, Francia).

Preparación de extractos sonicados e inóculos de cultivos de H. felis

Se recogieron bacterias de H. felis en PBS y se centrifugaron a 5000 rpm, durante 10 min. en una centrífuga Sorvall RC-5 (Sorvall, EE.UU.) a 4ºC. Se lavaron los sedimentos dos veces y se resuspendieron en PBS. Se sonicaron las suspensiones bacterianas tal como se describió previamente y se sometieron a al menos un ciclo de congelación-descongelación. Se llevaron a cabo las determinaciones de proteína en los sonicados.

Para garantizar un cultivo virulento de H. felis para estudios de protección, se mantuvieron in vivo las bacterias de H. felis hasta que se requirieron. Brevemente, se inocularon tres veces los ratones (con 10^{10} bacterias/ml), durante un periodo de 5 días. Volvieron a aislarse las bacterias de biopsias de estómago en medio de agar sangre (incubación de 4-7 días en una atmósfera microaerobia a 37ºC). Se recogieron las bacterias que se hicieron crecer durante dos días en placas de agar sangre directamente en agua de peptona (Difco, EE.UU.). Se evaluó la viabilidad y la movilidad mediante microscopía de fase antes de la administración a los animales.

Estudios de protección de ratón

Se administraron por vía orogástrica a los ratones en las semanas 0, 1, 2 y 3, cincuenta \mug de antígeno recombinante y 10 \mug de holotoxina de cólera (Sigma Chemical Corp.), ambos resuspendidos en HCO_{3}. También se les administraron a los ratones inmunizados con extractos de H. felis sonicados (que contenían 400-800 \mug de proteína total) 10 \mug de toxina de cólera. En la semana 5, se expuso la mitad de los ratones de cada grupo a un inóculo de H. felis virulento. El resto de los ratones recibieron una inmunización de "administración de refuerzo" adicional en la semana 15. En la semana 17, se expusieron los últimos a un cultivo de H. felis.

Evaluación de colonización de H. felis del ratón

Se sacrificaron los ratones dos semanas tras recibir la dosis de exposición (es decir las semanas 7 y 19, respectivamente) mediante dislocación espinal. Se lavaron los estómagos dos veces en NaCl al 0,8% estéril y se colocó una parte del antro pilórico de cada estómago en las superficies de las placas de agar de 12 cm x 12 cm que contenían un medio indicador de urea (urea al 2%, 120 mg de Na_{2}HPO_{4}, 80 mg de KH_{2}PO_{4}, 1,2 mg de rojo fenol, 1,5 g de agar preparado en 100 ml). Se colocó el resto de cada estómago en solución salina - formal y se almacenó hasta que se procesó para la histología. Se cortaron secciones longitudinales (4 mm) de los estómagos y se tiñeron de manera rutinaria mediante la técnica de Giemsa. Cuando fue necesario, se tiñeron las secciones adicionalmente mediante las técnicas de tinción de plata Warthin-Starry y Hematoxilina-Eosina;

Se evaluó la presencia de bacterias H. felis en la mucosa gástrica de ratón mediante la detección de la actividad ureasa (durante hasta 24 h) en el medio indicador, así como mediante la examinación de secciones gástricas teñidas mediante Giemsa que se habían codificado de tal modo para eliminar el sesgo del observador. Se puntuaron semicuantitativamente los índices de bacterias en las secciones gástricas según el siguiente esquema: 0, no se observan bacterias en ninguna de las secciones: 1, se observan pocas bacterias (< 20) en todas partes; 2, campo de alta energía (H.P., "high power") ocasional con bajos índices de bacteria (< 20); 3, campo H.P. ocasional con de bajos a moderados índices de bacteria (< 50); y 4, numerosos campos (> 5) H.P. con altos índices de bacteria (> 50). Se puntuaron los infiltrados celulares mononucleares tal como sigue: 0, ninguna infiltración significativa; 1, infiltración de bajos índices de células mononucleares limitadas a la submucosa y a la mucosa muscular; 2, infiltración de índices moderados de células mononucleares a la submucosa y la mucosa muscular, algunas veces formando agregados laxos; y 3, infiltración de grandes índices de células mononucleares y que caracterizan aglomeraciones nodulares de
células.

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Resultados de los experimentos de la parte II Expresión de polipéptidos de ureasa de Helicobacter en E. coli

Se amplificaron mediante PCR fragmentos que contenían las secuencias que codifican para los productos génicos UreA respectivos de H. felis y H. pylori y se clonaron en fase con un ORF que codificaba para la MBP de 42 kDa, presente en el vector de expresión pMAL. La secuenciación de los productos de PCR reveló cambios nucleotídicos menores que sin embargo no alteraron las secuencias de aminoácidos deducidas de los productos génicos respectivos. Las células MC1061 de E. coli transformadas con estos plásmidos recombinantes (pILL919 y pILL920, respectivamente), expresaron proteínas de fusión con pesos moleculares predichos de aproximadamente 68 kDa. Se purificaron estas proteínas hasta altos grados de pureza (figura 1) tras la cromatografía en medio de gel de intercambio aniónico y afinidad (resina de amilosa) (Q-Sepharose). El rendimiento de los cultivos de 2 l de células de E. coli recombinantes fue aproximadamente de 40 mg de antígeno purificado.

De manera similar, se expresaron las subunidades grandes UreB de ureasas de H. pylori y H. felis en E. coli (plásmidos pILL927 y pILL222, respectivamente) y produjeron proteínas de fusión con pesos moleculares predichos de 103 kDa. El rendimiento en estos casos era apreciablemente inferior que para las preparaciones de UreA (aproximadamente se recuperaron 20 mg a partir del cultivo bacteriano de 2 l). Además, se encontraron problemas asociados con la escisión de los polipéptidos UreB de la parte de MBP de las proteínas de fusión. Estas dificultades se atribuyeron a los grandes tamaños de los polipéptidos UreB recombinantes.

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Análisis de los polipéptidos de ureasa recombinantes

Los análisis de inmunotransferencia de tipo Western de las preparaciones de antígeno con antisuero policlonal de conejo producidos frente a los extractos completos de bacterias H. pylori y H. felis demostraron que los antígenos conservaron la inmunogenicidad con respecto al antisuero de homólogos así como de heterólogos (figuras 14 y 15). El antisuero no reconoció el componente MBP solo. La reactividad cruzada entre los polipéptidos de ureasa de H. pylori y H. felis era consecuente con los altos grados de identidad entre las secuencias de aminoácidos de estas
proteínas.

El antisuero policlonal de conejo producido frente a proteínas UreA y UreB recombinantes purificadas preparadas a partir de H. pylori y H. felis reaccionaron fuertemente con los polipéptidos de ureasa presentes en los extractos de células completas de la bacteria (figura 16). Tal como ya se ha observado, la subunidad UreB de ureasa de H. felis migró de manera ligeramente superior en geles de SDS-PAGE que lo que hizo la de H. pylori (figura 16).

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Preparación de incóculos de H. felis usados en estudios de inmunoprotección

Para garantizar la virulencia de los inóculos bacterianos de H. felis, se volvieron a aislar bacterias de estómagos de ratón infectados por H. felis (véase Materiales y métodos). Se pasaron las bacterias un mínimo número de veces in vitro. Se usaron cultivos de solución madre preparados a partir de estas bacterias, y almacenados a -80ºC, para preparar inóculos recientes para otros estudios de protección de ratón. Este procedimiento garantizó que los inóculos usados en los experimentos sucesivos fueron reproducibles.

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Inmunización de ratones contra la infección gástrica por H. felis

Se dividieron en dos lotes los ratones que se habían inmunizado durante tres semanas con las preparaciones de antígeno administradas y la mitad de estos se expusieron dos semanas después a un inóculo de H. fellis que contenía 10^{7} bacteria/ml. También se expuso un grupo de los animales que se habían inmunizado con UreA de H. felis recombinante pero, a diferencia de los otros animales no

a) Protección en la semana 5

Ochenta y cinco t de muestras de biopsia de estómago del grupo control de los ratones inmunizados con preparaciones sonicadas de H. felis fueron negativos para ureasa y por lo tanto parecían que se habían protegido de la infección por H. felis (tabla 4). Esto comparado con el 20% de los del otro grupo control de animales administrados con MBP solo. La proporción de estómagos negativos para ureasa para aquellos grupos de ratones a los que se administraron subunidades de ureasa recombinantes varió desde el 70% (para UreB de H. pylori) hasta el 20% (para ureA de H. pylori).

También se evaluaron los niveles de colonización bacteriana por H. felis a partir de portaobjetos histológicamente codificados preparados de tejidos gástricos. Debido a la sorprendente morfología de hélice de las bacterias de H. felis, pudieron observarse fácilmente los microorganismos sobre las superficies mucosales de las dos regiones gástricas glandular y epigástrica del estómago. Los datos histológicos indicaron que los niveles de protección en ratones eran inferiores que los observados por las pruebas de ureasa de biopsia: el 25% y el 20% de tejidos gástricos de ratones inmunizados con preparaciones sonicadas de H. felis de UreB de H. pylori, respectivamente, estaban libres de bacterias H. felis.

Entre ciertos grupos de estos ratones la preponderancia de las biopsias negativas para ureasa, así como las puntuaciones histológicas inferiores para la colonización bacteriana (datos no publicados), sugieren que se ha obtenido una respuesta inmunoprotectora en los animales. Esta respuesta, sin embargo, puede haber sido insuficiente para proteger frente al inóculo administrado durante el procedimiento de exposición.

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b) Protección en la semana 17

Se inmunizaron con administración de refuerzo los ratones restantes, de cada grupo de animales, en la semana 15. Se expusieron estos ratones en la semana 17 a un inóculo de H. felis que contenía aproximadamente 100 veces menos de bacterias que los usados previamente. Dos semanas después, todas las biopsias de los estómagos de los ratones inmunizados con MBP eran positivos para la ureasa (tabla 4). En cambio, la actividad ureasa para las biopsias gástricas de ratones inmunizados con las subunidades de ureasa recombinantes varió desde el 50% para UreA de H. pylori hasta el 100% para UreB de H. felis. Lo último era comparable al nivel de protección observado para el grupo de animales inmunizado con extractos sonicados de H. felis. Las pruebas histológicas demostraron que las subunidades de UreB de H. felis y de H. pylori protegían el 60% y el 25% de los animales inmunizados, respectivamente. Esto se comparó con un nivel del 85% de protección para ratones inmunizados con extractos sonicados de H. felis. La inmunización de ratones con UreA de H. pylori recombinante no protegió a los animales. De manera similar, los estómagos de todos los ratones inmunizados con UreA de H. felis, que se habían expuesto en la semana 5, estaban fuertemente colonizados con bacterias de H. felis en la semana 19 (tabla 4).

La prueba de biopsia gástrica de la ureasa, cuando se comparó con los análisis histológicos de las secciones de tejido gástrico, proporcionó valores de sensibilidad y especificidad del 63% y del 95%, respectivamente. Por tanto, la histología probó que predecía más exactamente la infección por H. felis en el ratón.

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Respuesta inmunitaria celular en estómagos inmunizados

Además de la valoración histológica de la colonización por H. felis, también se puntuó el tejido gástrico de ratón (desde 0 hasta 3) para la presencia de una respuesta celular mononuclear. En ratones inmunizados con MBP solo, se observó una gastritis crónica suave con índice pequeño de células mononucleares restringidas a la mucosa muscular y a la submucosa del epitelio gástrico. En cambio, había índice considerable de células mononucleares presentes en la mucosa gástrica de animales inmunizados con o bien los polipéptidos de ureasa recombinantes, o bien con preparaciones sonicadas de H. felis. Estas células inflamatorias se fusionaban para formar o bien agregados laxos, en las regiones submucosales del tejido, o bien estructuras nodulares que se extendían en las regiones mucosales del epitelio gástrico. La respuesta de células mononucleares no parecía estar relacionada con la presencia de bacterias cuando la mucosa gástrica de los ratones inmunizados con UreA de H. felis, que estaba fuertemente colonizada con bacterias de H. felis, contenía pocas o ninguna célula mononuclear.

TABLA 2 Los cebadores oligoméricos usados en la amplificación basada en PCR de las secuencias de nucleótidos que codifican para la ureasa

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4

TABLA 3 Plásmidos usados

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TABLA 4 Protección de ratones mediante inmunización con proteínas ureasas recombinantes

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Ejemplo 1

III- Agrupación génica de choque térmico hspa-b de Helicobacter pylori: secuencia de nucleótidos, expresión y función

Se ha purificado recientemente un homólogo de las proteínas de choque térmico (HSP) de la clase GroEl, del que se ha notificado que está estrechamente asociado con la ureasa de Helicobacter pylori (una metaloenzima de níquel), a partir de células de H. pylori por Dunn et al, y Evans et al. (Infect Immun. 60: 1946, 1992, 1946 y 2125, respectivamente). Basándose en la secuencia de aminoácidos N-terminal notificada de esta proteína inmunodominante, se sintetizaron oligonucleótidos degenerados con el fin de seleccionar como diana el gen (hspB) que codifica para la proteína de tipo GroEL en el cromosoma de la cepa 85P de H. pylori. Tras la amplificación génica, se purificó un fragmento de 108 pares de base (pb) que codificada para los 36 primeros aminoácidos de la proteína HspB, y se usó como una sonda para identificar en el banco genómico de H. pylori un cósmido recombinante que alberga el gen completo que codifica para HspB. Se mapeó el gen hspB en un fragmento de restricción de BglII de 3,15 kilobases (kb) del cósmido pILL684. La secuencia de nucleótidos de ese fragmento subclonado en el vector del plásmido pILL570 (pILL689) reveló la presencia de dos marcos de lectura abiertos (OFR) designados como hspA y hspB, cuya organización era muy similar para ser operones bicistrónicos groESL de otras especies bacterianas. hspA y hspB codifican para polipéptidos de 118 y 545 aminoácidos respectivamente, correspondientes a masas moleculares calculadas de 13,0 y 58,2 kilodaltons (kDa), respectivamente. Los estudios de comparación de la secuencia de aminoácidos revelaron i) que las proteínas HspA y NspB de H. pylori eran sumamente similares a sus homólogos bacterianos; ii) que la proteína HspA de H. pylori muestra un motivo llamativo en el extremo carboxilo del que carecen otros homólogos de GroEs bacterianos; este motivo único consiste en una serie de ocho residuos de histidina que se asemejan al dominio de unión a metales, tal como una unión a níquel. De manera sorprendente, inmediatamente en sentido 5' de la agrupación génica, se encontró un elemento de inserción IS5 que estaba ausente en el genoma de H. pylori, y se seleccionó positivamente durante el proceso de clonación del cósmido. Se encontró que IS5 estaba implicado en la expresión de los genes hspA y hspB en pILL689. Se analizó la expresión de las proteínas HspA y HspB a partir del plásmido pILL689 en una cepa que producía minicélulas. Se mostró que ambos polipéptidos se expresaban constitutivamente en las células de E. coli. Cuando se introdujo el plásmido pILL689 recombinante junto con la agrupación génica de la ureasa de H. pylori en una cepa huésped de E. coli, se observó un aumento de la actividad ureasa, sugiriendo una interacción estrecha entre las proteínas de choque térmico y la enzima ureasa. Apoyando el concepto de una función específica para la chaperona HspA, estaba el hecho de que mientras que se encontró una única copia de hspB en el genoma de H. pylori, se encontraron dos copias de hspA en el genoma, una unida al gen hspB y una no unida al gen hspB. Los intentos de construir mutantes isogénicos de H. pylori en el gen hspA y hspB fueron infructuosos, sugiriendo que estos genes son esenciales para la supervivencia de la bacterias.

Procedimientos experimentales para la parte III Cepas bacterianas, plásmidos y condiciones de cultivo

Se realizaron los experimentos de clonación con ADN genómico preparado a partir de la cepa 85P de H. pylori. Se usó la cepa N6 de H. pylori como la cepa destinataria para los experimentos de electroporación debido a su transformabilidad favorable. Se usaron la cepa HB101 o la cepa MC1061 de E. coli como un huésped para los experimentos de clonación y subclonación de cósmidos, respectivamente. Se usó E. coli P678-54 para la preparación de minicélulas. Se enumeran los vectores y plásmidos recombinantes usados en este estudio en la tabla 1. Se hicieron crecer las cepas de H. pylori sobre placas de agar en sangre de caballo, complementadas con vancomicina (10 mg/l), polimixina B (2.500 U/l), trimetoprim (5 mg/l) y anfotericina B (4 mg/l). Se incubaron las placas a 37ºC en condiciones microaerobias en un bote anaerobio con una envoltura generadora de dióxido de carbono (BBL 70304). Se hicieron crecer las cepas de E. coli en caldo L sin glucosa (10 g de triptona, 5 g de extracto de levaduras, y 5 g de NaCl por litro; pH 7,0) o sobre placas de agar L (agar al 1,5%) a 37ºC. Para la medición de la actividad ureasa, el medio limitante de nitrógeno usado consistía en medio de agar mínimo M9 libre de amonio (pH 7,4) que contenía D-glucosa al 0,4% como fuente de carbono, y L-arginina esterilizada por filtración recién preparada añadida hasta la concentración final de 10 mM. Las concentraciones de antibióticos para la selección de clones recombinantes fueron las siguientes (en miligramos por litro): kanamicina, 20; espectinomicina, 100; carbenicilina, 100.

Preparación del ADN

Se preparó ADN genómico de H. pylori tal como se describió previamente. Se prepararon ADN de cósmidos y plásmidos mediante un procedimiento de lisis alcalina seguido por purificación en gradientes de cloruro de cesio-bromuro de etidio tal como se describió previamente.

Clonación de cósmidos

Se ha descrito previamente la construcción del banco génico de cósmidos de H. pylori 85P en E. coli HB101, que se usó para la clonación de la agrupación génica hspA-B de H. pylori.

Metodología de clonación y análisis de ADN

Las endonucleasas de restricción, ligasa de ADN T4, fragmento (Klenow) grande de la ADN polimerasa I, y Taq polimerasa se adquirieron de Amersham, la ADN polimerasa T4 de Biolabs, y la fosfatasa intestinal de ternero de Pharmacia. Se usaron todas las enzimas según las instrucciones de los fabricantes. Se separaron los fragmentos de ADN sobre geles de agarosa procesados en tampón Tris-acetato. Se usó la escala de 1 kb de Bethesda Research. Laboratories como un patrón del tamaño de fragmento. Cuando era necesario, se aislaron los fragmentos de ADN mediante electroelución de geles de agarosa tal como se describió previamente y se recuperaron del tampón de migración por medio de una minicolumna Elutip-d (Schleicher y Schuell, Dassel, Alemania). Se realizaron las manipulaciones básicas del ADN según los protocolos descritos por Sambrook et al.

Hibridación

Se prepararon inmunotransferencias de colonias para la selección del banco de cósmidos de H. pylori y para la identificación de subclones sobre membranas de nitrocelulosa (Schleicher y Schuell, Dassel, Alemania) según el protocolo de Sambrook et al. (43). Se realizó el marcaje radiactivo de los productos de PCR mediante cebado aleatorio, usando como cebadores los hexámeros aleatorios de Pharmacia. Se realizaron las hibridaciones de colonias en condiciones de alta rigurosidad (5 x SSC, SDS al 0,1%, formamida al 50%, 42ºC) (1 x SSC:NaCl 150 mM, citrato de sodio 15 mM, pH 7,0). Para las hibridaciones de inmunotransferencia de tipo Southern, se transfirieron fragmentos de ADN desde geles de agarosa hasta láminas de nitrocelulosa (tamaño de poro de 0,45 \mum; Schleicher y Schuell, Inc.), y se hibridaron en condiciones de baja rigurosidad (5 x SSC, SDS al 0,1%, formamida al 30 o al 40%, a 42ºC con sondas desoxirribonucleotídicas marcadas con ^{32}P). Se reveló la hibridación mediante autoradiografía usando Amersham Hyperfilm-MP.

Secuenciación del ADN

Se subclonaron fragmentos apropiados de ADN de plásmido en los vectores M13 mp 18/19. Se preparó ADN monocatenario mediante infección por fagos de la cepa JM101 de E. coli. Se realizó la secuenciación mediante el método de terminación de la cadena de didesoxinucleótidos usando el kit Sequenase de United States Biochemicals. Se usaron tanto el cebador universal M13 como cebadores específicos adicionales (fig. 1) para secuenciar tanto las cadenas de ADN codificante como no codificante. Se realizó la secuenciación del ADN bicatenario tal como se describió previamente. Se llevó a cabo la secuenciación directa del producto de PCR tras la purificación del producto de PCR amplificado, electroeluido a través de una minicolumna Elutip-d (Schleicher y Schuell); se usó entonces el protocolo clásico para la secuenciación usando el kit Sequenase con las siguientes modificaciones: se desnaturalizó el producto de PCR hirviendo la mezcla de hibridación que contenía 200 picomoles del oligonucleótido usado como cebador y DMSO a la concentración final del 1% durante 3 minutos; se enfrió entonces inmediatamente la muestra en hielo; se realizó la etapa de marcaje en presencia de iones manganeso (mM).

Electroporación de H. pylori

En el intento por construir mutantes de H. pylori, se transformaron construcciones de plásmido apropiadas que portaban el gen seleccionado como diana alterado mediante un casete que contenía un gen de resistencia a kanamicina (aph3'-III), dentro de la cepa N6 de H. pylori por medio de electroporación tal como se describió previamente. Se usó como control positivo de la electroporación el plásmido pSUS10 que albergaba el gen flaA alterado por kanamicina. Tras la electroporación, se hicieron crecer las bacterias sobre placas no selectivas durante un periodo de 48 h con el fin de permitir la expresión de la resistencia a antibióticos y entonces se transfirieron sobre placas que contenían kanamicina. Se incubaron las placas selectivas durante hasta 6 días.

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Reacción en cadena de la polimerasa (PCR)

Se llevaron a cabo las PCR usando un termociclador Perkin-Elmer Cetus usando el kit GeneAmp (Perkin-Elmer Cetus). La reacción de amplificación clásica implicaba 50 picomoles (pmoles) de cada cebador y al menos 5 pmoles del ADN diana. Se desnaturalizó con calor el ADN diana antes de la adición a la reacción de amplificación. La reacción consistió en 25 ciclos de las siguientes tres etapas: desnaturalización (94ºC durante 1 minuto), hibridación (a temperaturas que oscilaban entre 42 y 55ºC, dependiendo de las temperaturas de fusión calculadas de los cebadores, durante 2 min) y extensión (72ºC durante 2 min). Cuando se usaron oligonucleótidos degenerados en condiciones no rigurosas, se añadieron hasta 1000 pmoles de cada oligonucleótido, se llevaron a cabo 50 ciclos, y la hibridación se realizó a 42ºC.

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Análisis de las proteínas expresadas en minicélulas

Se aislaron minicélulas que albergaban el plásmido híbrido apropiado y se marcaron con metionina [^{35}S] (50 \mu Ci/ml). Se sometieron aproximadamente 100.000 cpm de material precipitable con acetona a electroforesis en gel de dodecilsulfato de sodio (SDS)-poliacrilamida en un gel al 12,5%. Se procesaron en paralelo proteínas convencionales con pesos moleculares que osciblaban desde 94.000 hasta 14.000 (kit low< molecular-weights de Bio-Rad Laboratories). Se tiñó el gel y se examinó mediante fluorografía, usando En^{3}Hance (New England Nuclear).

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Actividad ureasa

Se cuantificó la actividad ureasa mediante la reacción de Berthelot usando una modificación del procedimiento que ya se ha descrito. Se expresó la actividad ureasa como micromoles de urea hidrolizados por minuto por kilogramo de proteína bacteriana.

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Resultados de los experimentos de la parte III Identificación de un cósmido recombinante que alberga el gen que codifica para la proteína de choque térmico de tipo GroEL de Helicobacter pylori

Basándose en la secuencia del extremo amino terminal de la proteína de choque térmico purificada de H. pylori, se sintetizaron dos oligonucleótidos degenerados para seleccionar como diana el gen de interés en el cromosoma de la cepa 85P de H. pylori. El primero, 5'-GCNAARGARATHAARTTYTCNG-3', en el que N significa los cuatro nucleótidos, R = A y G, Y = T y C, H = T, C, y A, se deriva de los primeros 8 aminoácidos de la proteína (AKEIKFSD); el segundo 5'-CRTTNCKNCCNCKNGGNCCCAT-3', en el que K = G y T, corresponde a los codones complementarios que especifican los aminoácidos desde la posición 29 hasta la posición 36 (MGPRGRNV, ref). El tamaño esperado para el producto de PCR era de 108 pares de bases (pb). Se realizó la reacción de amplificación en condiciones de baja rigurosidad tal como se describió en la sección "materiales y métodos", y condujo a la síntesis de seis fragmentos con un tamaño que oscilaba desde 400 pb hasta 100 p. Los tres fragmentos más pequeños se electroeluyeron de un gel de acrilamida, y se purificaron. La secuenciación directa de los productos de PCR permitió la identificación de un fragmento de ADN que codificaba para una secuencia de aminoácidos correspondiente a la secuencia publicada. Por tanto, se marcó este fragmento y se usó como sonda en la hibridación de colonias para identificar cósmidos recombinantes que mostraban homología con el segmento 5' del gen codificante de tipo GroEL de H. pylori; este gen se designó además como hspB. El banco génico consiste en 400 transductantes de E. coli resistentes a kanamicina independientes que albergan cósmidos recombinantes. De ellos, un único clon hibridó con la sonda, y albergaba un plásmido recombinante designado pILL684, de 46 kb de tamaño. La baja frecuencia observada cuando se detecta el gen hspB (1 de 400) era inusual comparada con la de varios genes clonados que se detectaron consecuentemente en de cinco a siete cósmidos recombinantes. Con el fin de identificar el gen hspB, se generaron fragmentos con tamaños de 3 a 4 kb mediante restricción parcial del ADN del cósmido pILL684 con la endonucleasa Sau3A, se purificaron y se ligaron en el sitio BglII del vector de plásmido pILL570. De 100 subclones, x fueron clones positivos, y uno se estudió adicionalmente (pILL689); contiene un inserto de 3,15 kb, flanqueado por dos sitios de restricción de BglII, que se mapeó en detalle (Fig. 5). Usando la sonda de PCR marcada con ^{32}P, se encontró que el extremo 5' del gen hspB se mapeaba en el fragmento de restricción central de HindIII-SphI de 632 pb de pILL689, indicando que podría esperarse la presencia del gen hspB completo en el plásmido recombinante pILL689.

Secuencia de ADN y secuencia de aminoácidos deducida de la agrupación génica hspA-B de H. pylori

Se secuenciaron las 3200 pb de pILL689 representado en la figura 5 clonando en M13mp18 y M13mp19 los fragmentos de restricción asimétricos BglII-SphI, SphI-HindIII, HindIII-BglII; cada fragmento clonado se secuenció independientemente en ambas cadenas y se sintetizaron 16 cebadores oligonucleotídicos (figura 1) para confirmar la lectura y/o generar secuencias que se solapan con los fragmentos secuenciados independientemente; estos se usaron como cebadores en los análisis de secuenciación del ADN bicatenario.

Los análisis de la secuencia revelaron dos elementos genéticos distintos. En primer lugar, la presencia de dos marcos de lectura abiertos (OFR), representados en la figura 5, transcritos en la misma dirección, que se designaron hspA y hspB; la secuencia de nucleótidos y la secuencia de aminoácidos deducida de los dos ORF se presentan en la figura 6. El primer codón de hspA comienza 323 pb en sentido 5' del sitio HindIII hacia la izquierda de pILL689 (figura 5) y está precedido por un sitio de unión a ribosomas de Shine-Dalgarno (RBS) (GGAGAA). El ORF de hspB codifica para un polipéptido de 118 aminoácidos. El codón de inicio para el ORF de hspB comienza 25 nucleótidos en el sentido de 3' del codón de parada de hspA; está precedido por un sitio RBS (AAGGA). El ORF de hspB codifica para un polipéptido de 545 aminoácidos y termina en un codón TAA seguido por una secuencia palindrómica que se asemeja a un terminador de trascripción independiente de rho (energía libre, \DeltaG = -19,8 kcal/mol) (figura 6). La secuencia de aminoácidos N-terminal de la proteína HspB deducida era idéntica a la secuencia N-terminal de la proteína de choque térmico de H. pylory purificada publicada previamente con la excepción de la metionina N-terminal, que está ausente de la proteína purificada y puede eliminarse después de la traducción, dando como resultado una proteína madura de 544 aminoácidos.

Se compararon las secuencias de aminoácidos deducidas de HspA y HspB de H. pylory con varias secuencias de aminoácidos de HSP de la clase GroES y GroEL (figura 7). HspB mostró una alta homología al nivel de los aminoácidos con la proteína HtpB de Legionella pneumophila (82,9% de semejanzas), con la proteína GroEl de Escherichia coli (81,0% de semejanzas), con la proteína HypB de Chlamydia psittaci o C. trachomatis (79,4% de semejanzas), con la proteína Hsp60 de Clostridium perfringens (80,7% de semejanzas), y en un menor grado con las proteínas de tipo GroEL de Mycobacterium. Sin embargo, como casi todos los homólogos de GroEL, HspB de H. pylori mostró el motivo de glicina-metionina (MGGMGGMGGMGGMM) del extremo carboxilo conservado que se mostró recientemente que era indispensable en la chaperonina GroEl de E. coli. Se muestra en la figura 7 el grado de homología al nivel de aminoácidos entre la proteína HspA de H. pylori y las otras proteínas de tipo GroES. El alineamiento mostrado muestra un motivo llamativo en el extremo carboxilo de la proteína HspA de H. pylori del que carecen otros homólogos bacterianos de GroES. Este motivo único sumamente cargado consiste en 27 aminoácidos adicionales que pueden formar un bucle entre dos residuos dobles de cisteína; de los 27 aminoácidos, 8 son residuos de histidina sumamente reminiscentes de un dominio de unión a metales.

El segundo elemento genético revelado por el análisis de la secuencia, fue la presencia de una secuencia de inserción (IS5) 84 pb en sentido 5' del gen hspA. La secuencia de nucleótidos de este elemento se aparea perfectamente con la descrita previamente para IS5 en E. coli, con la presencia de una secuencia de 16 nucleótidos (CTTGTTCGCACCTTCC) que corresponde a una de las dos repeticiones invertidas que flanquean al elemento IS5. Debido al apareamiento perfecto al nivel del ADN, se sospecha que el IS5 no estaba presente inicialmente en el cromosoma de H. pylori, sino que se había insertado más bien en sentido 5' de la agrupación génica hspA-HspB durante el proceso de clonación, una hipótesis que necesita confirmarse mediante análisis adicionales.

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Identificación de la secuencia en sentido 5' de la agrupación génica hspA-B en el cromosoma de H. pylori

Se examinó la presencia del IS5 mediante amplificación génica usando dos oligonucleótidos, siendo uno interno respecto al elemento IS5 y el otro en sentido 3' del elemento IS5 (oligo Nº 1 y Nº 2, figura 6), para seleccionar como diana una secuencia supuesta i) en el cromosoma de la cepa 85P de H. pylori, ii) en el cósmido inicial pILL684 y iii) en los 100 subclones resultantes de la restricción parcial con Sau3A del cósmido recombinante pILL684. IS5 estaba ausente del cromosoma de H. pylori, y estaba presente en los subcultivos más tempranos de la cepa de E. coli que albergaba el cósmido pILL684. Entre los 100 derivados del subclón pILL684 que parecían contener toda o parte de la secuencia de IS5, los inventores buscaron entonces un subclón que albergase el lado del extremo izquierdo de IS5 más la secuencia en sentido 5' original de la agrupación génica hspA-hspB. Se realizó esta exploración mediante análisis de restricción de los diferentes subclones generados parciales de Sau3A. Se muestra el mapa de restricción de uno de los plásmidos (pILL694) que satisfacía estos criterios en la figura 5. Se determinó el lado del extremo izquierdo de la secuencia de nucleótidos de IS5; la presencia de una duplicación de 4 pb de CTAA en ambos lados de las repeticiones invertidas de 16 pb del elemento IS5 (figura 6) permitió a los inventores confirmar la reciente adquisición del elemento IS5 mediante transposición. Se determinó entonces una secuencia de 245 nucleótidos que se mapeó inmediatamente en sentido 5' del elemento IS5 (mostrado en la figura 6). Esta secuencia consiste en una región no codificante en la que se detectó la presencia de una supuesta secuencia consenso de promotor de choque térmico; muestra una región -35 perfectamente conservada (TAACTCGCTTGAA) y una región -10 menos consensuada (CTCAATTA). Se sintetizaron dos oligonucleótidos (Nº 3 y Nº 4, mostrados en la figura 2) que se mapearon en secuencias localizadas en ambos lados del elemento IS5 presente en el cósmido recombinante; estos dos oligonucleótidos deben conducir a la amplificación de un fragmento de XXXX pb cuando la secuencia de IS5 está presente y de un fragmento en ausencia de IS5. Los resultados de la reacción de PCR usando como ADN diana el cósmido pILL684, el plásmido pILL694 y el cromosoma 85P de H. pylori se ajustan a las predicciones (resultados no mostrados). Además, se realizó la secuenciación directa del producto de PCR obtenido del cromosoma de H. pylori y se confirmó la secuencia reconstruida hspA-hspB en sentido 5' mostrada en la figura 6 (B). Para confirmar adicionalmente la organización genética de la región secuenciada completa, se prepararon dos sondas mediante amplificación génica del plásmido pILL689 usando los oligonucleótidos Nº 5, y Nº 6 y el Nº 7 y Nº 8 (figura 6); se usaron como sondas en los experimentos de hibridación de tipo Southern en condiciones de baja rigurosidad frente a un digesto de HindIII del cromosoma 85P de H. pylori. Los resultados demuestran que no se habían producido otras redisposiciones detectables durante los procesos de clonación (datos no mostrados). Estos experimentos permitieron a los inventores demostrar que mientras que estaba presente una única copia del gen hspB en el cromosoma de la cepa 85P de H. pylori, se detectaron dos copias del gen hspA mediante hibridación de tipo Southern.

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Análisis de los polipéptidos expresados en minicélulas

Se introdujeron mediante transformación los plásmidos recombinantes pILL689 y pILL692 y los respectivos vectores de clonación pILL570 y pACYC177, en E. coli P678-54, una cepa productora de minicélulas. Los plásmidos pILL689 y pILL692 (figura 5) contienen el mismo inserto de 3,15 kb clonado en los dos vectores. pILL570 contiene en sentido 5' del sitio de clonación una parada de transcripción y de traducción; la orientación del inserto en pILL689 se hizo de tal forma que la parada transcripcional se localizaba en sentido 5' del fragmento IS5 y por lo tanto en sentido 5' de los genes hspA y HspB. Se detectaron claramente dos polipéptidos que migraron con polipéptidos que tenían pesos moleculares aparentes de 60 kDa y 14 kDa en los experimentos de minicélulas a partir de pILL689 y pILL692 (resultados no mostrados), mientras que estaban ausentes en los vectores correspondientes; estos resultados indicaron que los genes hspA y hspB se expresaban constitutivamente a partir de un promotor ubicado dentro del elemento IS5. Además, mientras que la cantidad de polipéptidos visualizados sobre el gel de SDS concordaba bien con el número de copias de los vectores respectivos, la intensidad de las dos bandas polipeptídicas sugería una transcripción policistrónica de los dos genes.

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Intentos por entender el papel de las proteínas HspA y HspB

Se lograron dos alteraciones de genes en E. coli insertando el casete Km descrito previamente dentro del gen hspA o hspB de los plásmidos pILL686 y pILL691. Se realizó esto con el fin de devolver los genes alterados en H. pylori mediante electroporación, y para seleccionar para la sustitución alélica. El plásmido resultante pILL696 codificaba para una forma truncada de la proteína HspA, correspondiente a la deleción de la secuencia de aminoácidos del extremo C-terminal; en ese plásmido se insertó el casete Km de tal forma que el promotor del gen de Km pudo servir como promotor para el gen hspB en sentido 3'. Los plásmidos pILL687 y pILL688 resultaron de la inserción del casete Km en cualquier orientación dentro del gen hspB. Ninguno de estos constructos condujo al aislamiento de transformantes de kanamicina de la cepa N6 de H. pylori, cuando se usaron los plásmidos pILL687, pILL688, pILL696 purificados (tabla 2, figura 5) en experimentos de electroporación, mientras que el plásmido pSUS10 usado como control positivo siempre condujo a ello. Estos resultados sugieren que las proteínas HspA y HspB de H. pylori son proteínas esenciales para la supervivencia de H. pylori.

Debido a i) la descripción constante en la bibliografía de una estrecha asociación de la proteína HspB con las subunidades de la ureasa; ii) la estructura única de la proteína HspA con la secuencia C-terminal reminiscente de un dominio de unión a níquel, y iii) la ausencia de mutantes de hspA y/o hspB de H. pylori viables, los inventores intentaron demostrar un papel de las proteínas Hsp de H. pylori en relaciones con la ureasa de H. pylori mediante experimentos de complementación funcional en E. coli. Se introdujeron los plásmidos pILL763 o pILL753 (ambos derivados de pILL570, tabla 5) que codifican para la agrupación génica de la ureasa con el plásmido pILL692 compatible (derivado de pACYC177) que expresa constitutivamente los polipéptidos HspA y HspB tal como se visualiza en minicélulas. En ambas complementaciones, la expresión de las proteínas HspA y HspB en la misma célula de E. coli permite observar un aumento de tres veces en la actividad de la ureasa tras la inducción de los genes de la ureasa en medio mínimo complementado con L-arginina 10 mM como fuente limitante de nitrógeno.

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Ejemplo II

IV- Expresión, purificación y propiedades inmunogénicas de Hspa y Hspb de H. pylori Procedimiento experimental para la parte IV Expresión y purificación de proteínas de fusión recombinantes

Se expresaron las proteínas de fusión MalE-HspA y MalE-HspB tras la clonación de los dos genes dentro del vector pMAL-c2 tal como se describe en la sección "Resultados" usando los siguientes cebadores:

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Se inocularon dos litros de medio Luria que contenía glucosa (30%) y ampicilina (100 \mug/ml) con 20 ml de un cultivo de toda la noche de la cepa MC1061 que contenía el plásmido de fusión y se incubó con agitación a 37ºC. Cuando la DO600 del cultivo alcanzó 0,5, se añadió IPTG (a una concentración final de 10 mM) y se incubaron las células durante unas 4 horas adicionales. Se recogieron las células por centrifugación (5000 rpm durante 30 min a 4ºC), se resuspendieron en 100 ml de tampón de columna que consistía en Tris-HCl 10 mM, NaCl 200 mM, EDTA 1 mM complementado con inhibidores de proteasa [(Leupeptina (2 \muM) - Pepstatina (2 \mum) - PMSF (1 mM) - Aprotinina (dilución 1:1000)], y se pasaron a través de una prensa francesa. Tras la centrifugación (10.000 rpm durante 20 min a 4ºC), se recuperó el sobrenadante y se diluyó (2 veces) con tampón de columna. Se filtró el lisado a través de un filtro de nitrocelulosa de 0,2 \mum antes de cargarlo sobre una resina de amilosa preequilibrada (22 x 2,5 cm). Se eluyeron las proteínas de fusión con una disolución de maltosa 10 mM preparada en tampón de columna y se agruparon las fracciones que contenían las proteínas de fusión, se dializaron frente agua destilada y se liofilizaron. Se resuspendieron las proteínas de fusión en agua destilada a una concentración final de 2 mg de material liofilizado/ml, y se almacenaron a -20ºC. Se controlaron la concentración y pureza de las preparaciones mediante el ensayo de proteínas Bradford (Sigma Chemicals) y análisis por SDS-PAGE.

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Propiedades de unión a níquel de las proteínas recombinantes

Se hicieron crecer células MC1061 de E. coli, que contenían o bien el vector pMAL-c2 o bien plásmidos recombinantes derivados, en 100 ml de caldo Luria en presencia de carbenicilina (100 \mug/ml). Se indujo la expresión de los genes con IPTG durante cuatro horas. Se centrifugaron las células y se resuspendió el sedimento en 2 ml de tampón A (clorhidrato de guanidina 6 M, NaH_{2}PO_{4} 0,1 M, Tris 0,01, pH 8,0). Tras agitar suavemente durante una hora a temperatura ambiente, se centrifugaron las suspensiones a 10.000 g durante 15 min a 4ºC. Se añadió al sobrenadante una alícuota de 1,6 ml de resina de níquel-nitrilo-triacético (Nickel-NTA, QIA express), equilibrada previamente en tampón A, y se agitó esta mezcla a temperatura ambiente durante una hora antes de cargar sobre una columna. Se lavó la columna con 20 ml de tampón A, luego 30 ml de tampón B (urea 8 M, fosfato de Na 0,1 M, Tris-HCl 0,01 M, pH 8,0). Se eluyeron las proteínas sucesivamente con el mismo tampón que el tampón B ajustado a pH 6,3 (tampón C), pH 5,9 (tampón D) y pH 4,5 (tampón E) y tampón F (clorhidrato de guanidina 6 M, ácido acético 02 M). Se mezclaron cincuenta \mul de cada fracción con 50 \mul de tampón SDS y se cargaron sobre geles de SDS.

Sueros humanos

Se obtuvieron muestras de suero de 40 individuos, 28 eran pacientes infectados por H. pylori tal como se confirmó mediante un cultivo positivo de H. pylori y el examen histológico de la biopsia, y 12 eran pacientes no infectados. Los sueros los proporcionó amablemente R. J. Adamek (Universidad de Bochum, Alemania).

Inmunotransferencias

Tras la conclusión de los procesamientos por SDS-PAGE en una célula de electroforesis Mini-PROTEAN II, se transfirieron las proteínas a papel de nitrocelulosa en una célula de transferencia Mini Trans-Blot (Bio-Rad) ajustada a 100 V durante 1 hora (con refrigeración). Se realizó la inmunotinción tal como se describió previamente (Ferrero et al., 1992), excepto que se usó el sistema de detección por inmunotransferencia de tipo Western ECL (Amersham) para visualizar los productos de reacción. Se diluyeron a 1:1000 y 1:5000, respectivamente, los sueros humanos y el antisuero de conejo, provocados contra un extracto celular completo de la cepa 85P de H. pylori, en caseína al 1% (w/v) preparada en solución saina tamponada con fosfato (PBS, pH 7,4).

Métodos serológicos [ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas, (ELISA)]

Se absorbieron las siguientes cantidades de antígenos sobre placas de 96 pocillos (Falcon 3072): 2,5 \mug de proteína MaIE, 5 \mug de MaIE-HspA, o 2,5 \mug de MaiE-HspB. Se dejaron las placas durante toda la noche a 4ºC, se lavaron entonces 3 veces con disolución de lavado de ELISA (DLE) [PBS al 1% que contiene Tween 20 al 0,05% (v/v)]. Se logró la saturación incubando las placas durante 90 min a 37ºC en DLE complementado con leche en polvo al 1%. Se lavaron de nuevo los pocillos 3 veces con DLE y se agitaron entonces suavemente durante 90 min a 37ºC en presencia de suero humano (diluido 1:500 en DLE con leche en polvo al 0,5%), en agitación. Se detectaron las inmunoglobulinas unidas mediante incubación durante 90 min a 37ºC con anticuerpo secundario biotinilado (IgG, IgA o IgM de cabra anti-humana diluido [1:1000] en DLE complementado con leche en polvo al 0,5%) en combinación con estreptavidina-peroxidasa (1:500) (kirkegaard y Perry Lab.). Se detectó la peroxidasa unida mediante reacción con el sustrato de citrato y peróxido de hidrógeno. Se incubaron las placas en la oscuridad, a temperatura ambiente, y se leyó la densidad óptica a 492 nm a intervalos de 5, 15 y 30 min en un lector de placas de ELISA. Tras 30 min, se paró la reacción mediante la adición de ácido clorhídrico hasta una concentración final de 0,5 M.

Resultados de los experimentos de la parte IV Construcción de plásmidos recombinantes que producen las proteínas de fusión MaIE-HspA y HspB inducibles

Se usaron los oligonucleótidos Nº 1 y Nº 2 (hspA) y Nº 3 y Nº 4 (hspB) para amplificar por PCR los genes completos hspA y hspB, respectivamente. Se electroeluyeron los productos de PCR, se purificaron y se restringieron con EcoRI y PstI. Se ligaron entonces los fragmentos restringidos (360 pb y 1600 pb en tamaño, respectivamente) en el vector pMAL-c2 restringido por EcoRI-PstI para generar los plásmidos designados como pILL933 y pIll934, respectivamente. Tras la inducción con IPTG, y la purificación de la proteína soluble sobre columnas de amilosa, se visualizaron las proteínas de fusión del tamaño esperado (55 kDa para pILL933 [figura 17] y 100 kDa para pILL9334) sobre geles de SDS-PAGE. Cada una de éstas correspondía a la fusión de la proteína MaIE (42-7 kDa) con el segundo aminoácido de cada uno de los polipéptidos Hsp. El rendimiento de la expresión de las proteínas de fusión fue de 100 mg para MaIE-HspA y de 20 mg para MaIE-HspB cuando se prepararon a partir de 2 litros de cultivo de
caldo.

Estudio de la antigenicidad de las proteínas de fusión HspA y HspB, y de la inmunogenicidad de HspA y HspB en pacientes infectados con H. pylori

Con el fin de determinar si las proteínas de fusión eran todavía antigénicas, se analizó cada una mediante inmunotransferencia de tipo Western con antisuero de conejo provocado contra la proteína MaIE y un extracto celular completo de la cepa 85P de H. pylori. Ambas proteínas de fusión eran inmunoreactivas con el anticuerpo frente a MaIE (no mostrado) y con el antisuero anti-H. pylori. El antisuero anti-H. pylori no reconoció la proteína MaIE purificada (figura 18). Estos resultados demuestran que las proteínas de fusión conservaban sus propiedades antigénicas; además, mientras que la proteína HspB se sabía que era inmunogénica, esta es la primera demostración de que HspA es per se inmunogénica en conejos.

De la misma manera, con el fin de determinar si los polipéptidos HspA y HspB eran inmunogénicos en seres humanos, se analizó la respuesta inmunitaria humoral frente HspA y/o HspB en pacientes infectados con H. pylori y se comparó con la de personas no infectadas usando ensayos por inmunotransferencia de tipo Western y ensayos inmunoabsorbentes ligados a enzimas (ELISA). Ninguno de los 12 sueros de las personas negativas para H. pylori dio una señal de inmunotransferencia positiva con las proteínas MaIE, MaIE-hspA, o MaIE-HspB (figura 18). En cambio, de 28 sueros de pacientes positivos para H. pylori, 12 (42,8%) reaccionaron con la proteína HspA mientras que 20 (71,4%) reconocieron la proteína HspB. Todos los sueros que reconocieron HspA reaccionaron también con la proteína HspB. No se observó asociación entre la respuesta inmunitaria y la presentación clínica de la infección por H. pylori, aunque una conclusión de ese tipo podría ser prematura debido al pequeño número de cepas
analizadas.

Propiedades de unión a níquel de la proteína MaIE-HspA fusionada

Se purificó la proteína recombinante HBP-HspA expresada tras la inducción con IPTG, a partir de un extracto celular completo mediante purificación en una etapa sobre una columna de afinidad por níquel mientras que ni MBP sola, ni MBP-HspB mostraron esta propiedad. La figura 18 ilustra la purificación en una etapa de la proteína HBP-HspA que se eluyó como un monómero a pH 6,3 y como un monómero a pH 4,5. La única banda observada en el panel 7 y las dos bandas observadas en el panel 5 eran ambas reconocidas específicamente con un suero de conejo anti-HspA. Esto sugiere que la propiedad de unión a níquel de la proteína HBP-BspA fusionada podría atribuirse a la secuencia c-terminal de HspA que es rica en residuos de histidina y cisteína.

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(1) INFORMACIÓN GNERAL:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): SOLICITANTE:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): NOMBRE: INSTITUTO PASTEUR

\vskip0.500000\baselineskip

(B): CALLE: 25-28 rue du Dr Roux

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CIUDAD: PARIS CEDEX 15

\vskip0.500000\baselineskip

(E): PAÍS: FRANCIA

\vskip0.500000\baselineskip

(F): CÓDIGO POSTAL (ZIP): 75724

\vskip0.500000\baselineskip

(G): TELÉFONO: 45.68.80.94

\vskip0.500000\baselineskip

(H): TELEFAX: 40.61.30.17

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.500000\baselineskip

(A): NOMBRE: INSTITUT NACIÓNAL DE LA SANTE ET DE LA RECHERCHE MEDICALE

\vskip0.500000\baselineskip

(B): CALLE: 101 rue de Tolbiac

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CIUDAD: PARIS CEDEX 13

\vskip0.500000\baselineskip

(E): PAÍS: FRANCIA

\vskip0.500000\baselineskip

(F): CÓDIGO POSTAL (ZIP): 75654

\vskip0.500000\baselineskip

(G): TELÉFONO: 44.23.60.00

\vskip0.500000\baselineskip

(H): TELEFAX: 45.85.07.66

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TÍTULO DE LA INVENCIÓN: COMPOSICIONES INMUNOGÉNICAS CONTRA LA INFECCIÓN POR HELICOBACTER, POLIPÉPTIDOS SU USO EN LAS COMPOSICIONES Y SECUENCIAS DE ÁCIDOS NUCLEICOS QUE CODIFICAN PARA DICHOS POLIPÉPTIDOS.

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): NÚMERO DE SECUENCIAS: 19

\vskip0.800000\baselineskip

(iv): FORMA LEGIBLE POR ORDENADOR:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): TIPO DE MEDIO: Disquete

\vskip0.500000\baselineskip

(B): ORDENADOR: PC compatible IBM

\vskip0.500000\baselineskip

(C): SISTEMA OPERATIVO: PC-DOS/MS-DOS

\vskip0.500000\baselineskip

(D): SOFTWARE: PatentIn Release Nº 1.0, versión N1 1.25 (EPO)

\vskip0.800000\baselineskip

(v): DATOS DE SOLICITUD ACTUALES: NÚMERO DE SOLICITUD: PCT/EP 94/01625

\vskip0.800000\baselineskip

(vi): DATOS DE SOLICITUD ANTERIORES:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): NÚMERO DE SOLICITUD: EP 93401309.5

\vskip0.500000\baselineskip

(B): FECHA DE PRESENTACIÓN: 19-MAY-1993

\vskip0.800000\baselineskip

(vi): DATOS DE SOLICITUD ANTERIORES:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): NÚMERO DE SOLICITUD: PCT/EP 93/03259

\vskip0.500000\baselineskip

(B): FECHA DE PRESENTACIÓN: 19-NOV-1993

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 1:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 2619 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácidos nucleicos

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CADENA: única

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADN (geonómico)

\vskip0.800000\baselineskip

(ix): CARACTERÍSTICA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): NOMBRE/CLAVE: misc_feature

\vskip0.500000\baselineskip

(B): UBICACIÓN: 31..36

\vskip0.500000\baselineskip

(D): OTRA INFORMACIÓN: /nombre_convencional = "secuencia Shine-Dalgarno"

\vskip0.800000\baselineskip

(ix): CARACTERÍSTICA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): NOMBRE/CLAVE: misc_feature

\vskip0.500000\baselineskip

(B): UBICACIÓN: 756..759

\vskip0.500000\baselineskip

(D): OTRA INFORMACIÓN: /nombre_convencional = "Shine-Dalgarno secuencia"

\vskip0.800000\baselineskip

(ix): CARACTERÍSTICA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): NOMBRE/CLAVE: CDS

\vskip0.500000\baselineskip

(B): UBICACIÓN: 43 .. 753

\vskip0.500000\baselineskip

(D): OTRA INFORMACIÓN: /nombre_convencional - "URE A - FIGURA 3"

\vskip0.800000\baselineskip

(ix): CARACTERÍSTICA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): NOMBRE/CLAVE: CDS

\vskip0.500000\baselineskip

(B): UBICACIÓN: 766 .. 2475

\vskip0.500000\baselineskip

(D): OTRA INFORMACIÓN: /nombre_convencional = "URE B - FIGURA 3"

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 1:

\vskip1.000000\baselineskip

13

14

15

16

17

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 2:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 237 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CADENA: desconocida

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(vi): FUENTE ORIGINAL:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): ORGANISMO: Helicobacter felis

\vskip0.800000\baselineskip

(ix): CARACTERÍSTICA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): NOMBRE/CLAVE: Proteína

\vskip0.500000\baselineskip

(B): UBICACIÓN: 1..237

\vskip0.500000\baselineskip

(D): OTRA INFORMACIÓN: /nota = "Corresponde a la figura 4, línea 1 (ure A)."

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 2:

\vskip1.000000\baselineskip

18

19

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 3:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 569 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CADENA: desconocida

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(vi): FUENTE ORIGINAL:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): ORGANISMO: Helicobacter felis

\vskip0.800000\baselineskip

(ix): CARACTERÍSTICA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): NOMBRE/CLAVE: Proteína

\vskip0.500000\baselineskip

(B): UBICACIÓN: 1..569

\vskip0.500000\baselineskip

(D): OTRA INFORMACIÓN: /nota = "Corresponde a la figura 4, línea 1 (ure B)."

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 3:

20

21

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 4:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 2284 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácidos nucleicos

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CADENA: única

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: linear

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADN (geonómico)

\vskip0.800000\baselineskip

(ix): CARACTERÍSTICA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): NOMBRE/CLAVE: CDS

\vskip0.500000\baselineskip

(B): UBICACIÓN: 124 .. 477

\vskip0.500000\baselineskip

(D): OTRA INFORMACIÓN: /nombre_convencional = "H. pylori - Hsp A" 15

\vskip0.800000\baselineskip

(ix): CARACTERÍSTICA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): NOMBRE/CLAVE: CDS

\vskip0.500000\baselineskip

(B): UBICACIÓN: 506 .. 2143

\vskip0.500000\baselineskip

(D): OTRA INFORMACIÓN: /nombre_convencional =. "H. pylori - Hsp B"

\vskip0.800000\baselineskip

(ix): CARACTERÍSTICA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): NOMBRE/CLAVE: misc_feature

\vskip0.500000\baselineskip

(B): UBICACIÓN: 1 .. 2284

\vskip0.500000\baselineskip

(D): OTRA INFORMACIÓN: /nota = "Corresponde a la figura 6."

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 4:

\vskip1.000000\baselineskip

22

23

24

25

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 5:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 545 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(vi): FUENTE ORIGINAL:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): ORGANISMO: Helicobacter pylori

\vskip0.800000\baselineskip

(ix): CARACTERÍSTICA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): NOMBRE/CLAVE: Proteína

\vskip0.500000\baselineskip

(B): UBICACIÓN: 1..545

\vskip0.500000\baselineskip

(D): OTRA INFORMACIÓN: /nota = "Corresponde a la figura 7A"

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 5:

26

27

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 6:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 118 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: linear

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(vi): FUENTE ORIGINAL:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): ORGANISMO: Helicobacter pylori

\vskip0.800000\baselineskip

(ix): CARACTERÍSTICA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): NOMBRE/CLAVE: Proteína

\vskip0.500000\baselineskip

(B): UBICACIÓN: 1..118

\vskip0.500000\baselineskip

(D): OTRA INFORMACIÓN: /nota = "Corresponde a la figura 7B."

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 6:

28

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 7:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 591 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácidos nucleicos

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CADENA: única

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADN (geonómico)

\vskip0.800000\baselineskip

(vi): FUENTE ORIGINAL:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): ORGANISMO: H. felis

\vskip0.800000\baselineskip

(ix): CARACERÍSTICA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): NOMBRE/CLAVE: CDS

\vskip0.500000\baselineskip

(B): UBICACIÓN: 1..591

\vskip0.500000\baselineskip

(D): OTRA INFORMACIÓN: /nombre_convencional = "URE I"

\vskip0.800000\baselineskip

(ix): CARACTERÍSTICA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): NOMBRE/CLAVE: misc_feature

\vskip0.500000\baselineskip

(B): UBICACIÓN: 1..591

\vskip0.500000\baselineskip

(D): OTRA INFORMACIÓN: /nota = "Corresponde a la figura 9."

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 7:

29

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 8:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 199 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CADENA: desconocida

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: linear

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(vi): FUENTE ORIGINAL:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): ORGANISMO: H. felis

\vskip0.800000\baselineskip

(ix): CARACTERÍSTICA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): NOMBRE/CLAVE: Proteína

\vskip0.500000\baselineskip

(B): UBICACIÓN: 1..199

\vskip0.500000\baselineskip

(D): OTRA INFORMACIÓN: /nota- "Corresponde a la figura 10."

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 8:

30

31

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 9:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 27 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CADENA: desconocida

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: linear

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(v): TIPO DE FRAGMENTO: C-terminal

\vskip0.800000\baselineskip

(vi): FUENTE ORIGINAL:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): ORGANISMO: H. pylori

\vskip0.800000\baselineskip

(ix): CARACTERÍSTICA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): NOMBRE/CLAVE: Proteína

\vskip0.500000\baselineskip

(B): UBICACIÓN: 1..27

\vskip0.500000\baselineskip

(D): OTRA INFORMACIÓN: /nota = "Corresponda a la secuencia mencionada en la página 13 de la descripción."

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 9:

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Gly Ser Cys Cys His Thr Gly Asn His Asp His Lys His Ala Lys Glu}

\sac{His Glu Ala Cys Cys His Asp His Lys Lys His}

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 10:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 27 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácidos nucleicos

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CADENA: doble

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: desconocida

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADN (geonómico)

\vskip0.800000\baselineskip

(ix): CARACTERÍSTICA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): NOMBRE/CLAVE: misc_feature

\vskip0.500000\baselineskip

(B): UBICACIÓN: 1..27

\vskip0.500000\baselineskip

(D): OTRA INFORMACIÓN: /nota- "Corresponde al cebador 1F de la tabla 2 (página 51)."

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 10:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

CAUCCNAARG ARYTNGAYAA RYTNATG

\hfill

27

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 11:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 30 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácidos nucleicos

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CADENA: doble

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: desconocida

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADN (geonómico)

\vskip0.800000\baselineskip

(ix): CARACTERÍSTICA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): NOMBRE/CLAVE: misc_feature

\vskip0.500000\baselineskip

(B): UBICACIÓN: 1..30

\vskip0.500000\baselineskip

(D): OTRA INFORMACIÓN: /nota = "Corresponde al cebador 1R de la tabla 2 (página 51)."

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 11:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

YTCYTTNCGN GGNSWDATYT TYTTCATCUA

\hfill

30

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 12:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 38 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TYPE: ácidos nucleicos

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CADENA: doble

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: desconocida

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADN (geonómico)

\vskip0.800000\baselineskip

(ix): CARACTERÍSTICA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): NOMBRE/CLAVE: misc_feature

\vskip0.500000\baselineskip

(B): UBICACIÓN: 1..38

\vskip0.500000\baselineskip

(D): OTRA INFORMACIÓN: /nota = "Corresponde al cebador 2F de la tabla 2 (página 51 de la descripción)."

\vskip0.800000\baselineskip

(ix): CARACTERÍSTICA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): NOMBRE/CLAVE: misc_feature

\vskip0.500000\baselineskip

(B): UBICACIÓN: 6..11

\vskip0.500000\baselineskip

(D): OTRA INFORMACIÓN: /nota = "Sitio de restricción introducido en el fragmento amplificado (Corrí)"

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 12:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

CCGGAGAATT CATTAGCAGA AAAGAATATG TTTCTATG

\hfill

38

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 13:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 38 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácidos nucleicos

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CADENA: doble

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: desconocida

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADN (geonómico)

\vskip0.800000\baselineskip

(ix): CARACTERÍSTICA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): NOMBRE/CLAVE: misc_feature

\vskip0.500000\baselineskip

(B): UBICACIÓN: 1..38

\vskip0.500000\baselineskip

(D): OTRA INFORMACIÓN: /nota = "Corresponde al cebador 2R de la tabla 2 (página 51)."

\vskip0.800000\baselineskip

(ix): CARACTERÍSTICA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): NOMBRE/CLAVE: misc_feature

\vskip0.500000\baselineskip

(B): UBICACIÓN: 6..11

\vskip0.500000\baselineskip

(D): OTRA INFORMACIÓN: /nota = "Sitio de restricción introducido en el fragmento amplificado (PST)."

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 13:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ACGTTCTGCA GCTTACGAAT AACTTTTGTT GCTTGAGC

\hfill

38

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 14:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 20 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácidos nucleicos

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CADENA: doble

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: desconocida

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADN (geonómico)

\vskip0.800000\baselineskip

(ix): CARACTERÍSTICA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): NOMBRE/CLAVE: misc_feature

\vskip0.500000\baselineskip

(B): UBICACIÓN: 1..20

\vskip0.500000\baselineskip

(D): OTRA INFORMACIÓN: /nota = "Corresponde al cebador 3F de la tabla 2 (página 51)."

\vskip0.800000\baselineskip

(ix): CARACTERÍSTICA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): NOMBRE/CLAVE: misc_feature

\vskip0.500000\baselineskip

(B): UBICACIÓN: 1..6

\vskip0.500000\baselineskip

(D): OTRA INFORMACIÓN: /nota - "Sitio de restricción introducido en el fragmento amplificado (BamHI)"

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 14:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GGATCCAAAA AGATTTCACG

\hfill

20

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 15:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 30 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácidos nucleicos

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CADENA: doble

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: desconocida

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADN (geonómico)

\vskip0.800000\baselineskip

(ix): CARACTERÍSTICA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): NOMBRE/CLAVE: misc_feature

\vskip0.500000\baselineskip

(B): UBICACIÓN: 1..30

\vskip0.500000\baselineskip

(D): OTRA INFORMACIÓN: /nota= "Corresponde al cebador 3R de la tabla 2 (página 51)."

\vskip0.800000\baselineskip

(ix): CARACTERÍSTICA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): NOMBRE/CLAVE: misc_feature

\vskip0.500000\baselineskip

(B): UBICACIÓN: 3..8

\vskip0.500000\baselineskip

(D): OTRA INFORMACIÓN: /nota = "Sitio de restricción introducido en el fragmento amplificado (HindIII)"

\vskip0.800000\baselineskip

(ix): CARACTERÍSTICA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): NOMBRE/CLAVE: misc_feature

\vskip0.500000\baselineskip

(B): UBICACIÓN: 9..14

\vskip0.500000\baselineskip

(D): OTRA INFORMACIÓN: /nota = "Sitio de restricción introducido en el fragmento amplificado (PstI)."

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 15:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GGAAGCTTCT GCAGGTGTGC TTCCCCAGTC

\hfill

30

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 16:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 38 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácidos nucleicos

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CADENA: doble

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: desconocida

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADN (geonómico)

\vskip0.800000\baselineskip

(ix): CARACTERÍSTICA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): NOMBRE/CLAVE: misc_feature

\vskip0.500000\baselineskip

(B): UBICACIÓN: 1..38

\vskip0.500000\baselineskip

(D): OTRA INFORMACIÓN: /nota= "Corresponde al oligo 1 de la página 69."

\vskip0.800000\baselineskip

(ix): CARACTERÍSTICA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): NOMBRE/CLAVE: misc_feature

\vskip0.500000\baselineskip

(B): UBICACIÓN: 6..11

\vskip0.500000\baselineskip

(D): OTRA INFORMACIÓN: /nota = "sitio de restricción de EcoRI"

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 16:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

CCGGAGAATT CAAGTTTCAA CCATTAGGAG AAAGGGTC

\hfill

38

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 17:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 38 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácidos nucleicos

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CADENA: doble

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: desconocida

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADN (geonómico)

\vskip0.800000\baselineskip

(ix): CARACTERÍSTICA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): NOMBRE/CLAVE: misc_feature

\vskip0.500000\baselineskip

(B): UBICACIÓN: 1..38

\vskip0.500000\baselineskip

(D): OTRA INFORMACIÓN: /nota = "Corresponde al oligo 2 de la página 69."

\vskip0.800000\baselineskip

(ix): CARACTERÍSTICA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): NOMBRE/CLAVE: misc_feature

\vskip0.500000\baselineskip

(B): UBICACIÓN: 6..11

\vskip0.500000\baselineskip

(D): OTRA INFORMACIÓN: /nota = "Sitio de restricción de PstI."

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 17:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ACGTTCTGCA GTTTAGTGTT TTTTGTGATC ATGACAGC

\hfill

38

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 18:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 38 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácidos nucleicos

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CADENA: doble

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: desconocida

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADN (geonómico)

\vskip0.800000\baselineskip

(ix): CARACTERÍSTICA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): NOMBRE/CLAVE: misc_feature

\vskip0.500000\baselineskip

(B): UBICACIÓN: 1..38

\vskip0.500000\baselineskip

(D): OTRA INFORMACIÓN: /nota- "Corresponde al oligo 3 de la página 69."

\vskip0.800000\baselineskip

(ix): CARACTERÍSTICA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): NOMBRE/CLAVE: misc_feature

\vskip0.500000\baselineskip

(B): UBICACIÓN: 6..11

\vskip0.500000\baselineskip

(D): OTRA INFORMACIÓN: /nota = "Sitio de restricción de EcoRI."

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 18:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

CCGGAGAATT CGCAAAAGAA ATCAAATTTT CAGATAGC

\hfill

38

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 19:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 38 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácidos nucleicos

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CADENA: doble

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: desconocida

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADN (geonómico)

\vskip0.800000\baselineskip

(ix): CARACTERÍSTICA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): NOMBRE/CLAVE: misc_feature

\vskip0.500000\baselineskip

(B): UBICACIÓN: 1..38

\vskip0.500000\baselineskip

(D): OTRA INFORMACIÓN: /nota = "Corresponde al oligo 4 de la página 69."

\vskip0.800000\baselineskip

(ix): CARACTERÍSTICA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): NOMBRE/CLAVE: misc_feature

\vskip0.500000\baselineskip

(B): UBICACIÓN: 6..11

\vskip0.500000\baselineskip

(D): OTRA INFORMACIÓN: /nota = "Sitio de restricción de PstI."

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 19:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ACGTTCTGCA GATGATACCA AAAAGCAAGG GGGCTTAC

\hfill

38

Claims

1. Composición inmunogénica que puede inducir anticuerpos frente a Helicobacter, caracterizada porque comprende o bien

(ii): un fragmento de dicha HSP A que tiene al menos 6 aminoácidos, o

2. Composición inmunogénica según la reivindicación 1, que puede inducir anticuerpos que protegen frente a infección por Helicobacter spp.

3. Composición farmacéutica para su uso como vacuna para proteger frente a infección por Helicobacter, particularmente frente a Helicobacter pylori y Helicobacter felis, caracterizada porque comprende la composición inmunogénica según cualquiera de las reivindicaciones 1 y 2, en combinación con excipiente(s) fisiológicamente aceptable(s) y posiblemente adyuvantes.

4. Material proteico, caracterizado porque comprende o consiste en

\vskip1.000000\baselineskip

32

\vskip1.000000\baselineskip

(ii): un fragmento de HSPA tal como se define en (i), comprendiendo dicho fragmento al menos 6 aminoácidos consecutivos de la secuencia de aminoácidos definida en (i); o,

(iii): una variante de polipéptido de la secuencia de aminoácidos definida en (i), en la que se han sustituido, insertado o delecionado aminoácidos, teniendo dicha variante de polipéptido al menos el 75%, y preferiblemente al menos el 80% de identidad con la secuencia de aminoácidos definida (i),

5. Material proteico según la reivindicación 4, caracterizado porque comprende o consiste en la secuencia C-terminal de HSP A:

101

o un fragmento que comprende al menos 6 aminoácidos consecutivos de esta secuencia

6. Secuencia de ácido nucleico caracterizada porque consiste en:

(i): una secuencia que codifica para el material proteico según una cualquiera de las reivindicaciones 4 a 5; o

(ii): una secuencia complementaria a la secuencia (i); o

(iii): una secuencia que puede hibridar con la secuencia (i) o (ii) en condiciones de rigurosidad, definiéndose dichas condiciones de rigurosidad de la siguiente forma: - 5 x SSC; formamida al 50% a 37ºC o - 6 x SSC, medio de Denhardt a 68ºC; o,

(iv): un fragmento de cualquiera de las secuencias (i), (ii) o (iii), apropiado para su uso como sonda específica para la detección in vitro de infección por Helicobacter, que comprende al menos 45 nucleótidos.

7. Secuencia de ácido nucleico según la reivindicación 6, caracterizada porque consiste en toda o parte de la secuencia del plásmido pILL689 (CNCM I-1356), en particular aquella secuencia que codifica para HSP A, o una secuencia complementaria a esta secuencia, o una secuencia que puede hibridar con esta secuencia en condiciones de rigurosidad, definiéndose dichas condiciones de rigurosidad de la siguiente forma: - 5 x SSC; formamida al 50% a 37ºC o - 6 x SSC, medio de Denhardt a 68ºC.

8. Vector de expresión, caracterizado porque contiene una secuencia de ácido nucleico según la reivindicación 6 ó 7.

9. Plásmido pILL689 (CNCM I-1356).

10. Oligonucleótido adecuado para su uso como cebador en una reacción de amplificación de ácidos nucleicos de un fragmento de HSP A, caracterizado porque comprende desde 10 hasta 100 nucleótidos consecutivos de la secuencia según la reivindicación 6 ó 7, y porque hibrida con el extremo 5' o 3' de los fragmentos de HSPA que van a amplificarse.

11. Sonda de nucleótidos, caracterizada porque comprende una secuencia según una cualquiera de las reivindicaciones 6 ó 7, con un medio de marcaje apropiado.

12. Microorganismo, transformado de forma estable mediante un vector de expresión según la reivindicación 8 o un plásmido según la reivindicación 9.

13. Anticuerpos monoclonales o policlonales o fragmentos de los mismos, dirigidos frente al material proteico según cualquiera de las reivindicaciones 4 a 5, caracterizado porque son o bien específicos frente al material de Helicobacter pylori o bien, alternativamente, presentan reacción cruzada de manera inmunológica con las proteínas similares a GroES de bacterias distintas de Helicobacter pylori.

14. Anticuerpos monoclonales o policlonales según la reivindicación 13, caracterizados porque reconocen específicamente la secuencia C-terminal de HSP A.

15. Uso de la composición inmunogénica según la reivindicación 1 para la preparación de una vacuna adecuada para su uso en seres humanos y animales contra la infección por Helicobacter, particularmente contra Helicobacter pylori y Helicobacter felis.

16. Uso de los anticuerpos según las reivindicaciones 13 a 14 para la preparación de una composición terapéutica para tratar la infección por Helicobacter, en particular Helicobacter pylori, Helicobacter heilmannii y Helicobacter felis en seres humanos o animales.

17. Método para la producción de una composición farmacéutica según la reivindicación 3, caracterizado por cultivar un microorganismo transformado según la reivindicación 12, recoger y purificar el material HSP de Helicobacter, y combinar estos materiales con excipientes, adyuvantes y, opcionalmente, otros aditivos adecuados.

18. Uso de secuencias de nucleótidos según la reivindicación 11 para la detección in vitro en una muestra biológica, de una infección por Helicobacter, opcionalmente tras una reacción de amplificación génica.

19. Kit para la detección in vitro de infección por Helicobacter, caracterizada porque comprende:

-: una sonda de nucleótidos según la reivindicación 11;

-: reactivos para la detección de cualquier híbrido formado.

20. Material proteico, caracterizado porque comprende una proteína de fusión o mixta que incluye al menos una subunidad de la proteína de choque térmico HSP A de Helicobacter o fragmento de la misma, tal como se define en una cualquiera de las reivindicaciones 4 a 5.

21. Suero o anticuerpos purificados, caracterizados porque se obtienen mediante inmunización de un animal con la composición inmunogénica según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 2, o con la composición farmacéutica según la reivindicación 3, o con el material proteico o fragmento según cualquiera de las reivindicaciones 4 a 5 o con la proteína de fusión o mixta según la reivindicación 20, siendo dicho suero o anticuerpos purificados específicos para la chaperonina HSP A, que tiene la siguiente secuencia de aminoácidos:

33

22. Kit que comprende al menos el suero o anticuerpos purificados según la reivindicación 21, y opcionalmente, medios o excipientes apropiados para la administración de los anticuerpos, o medios de marcaje o de detección de los anticuerpos.