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Die
vorliegende Erfindung betrifft immunogene Zusammensetzungen zum
Induzieren schützender
Antikörper
gegen Helicobacter spp.-Infektion. Sie betrifft ebenfalls von Helicobacter
abgeleitete proteinartige Materialien und Nukleinsäuresequenzen,
welche diese codieren. Antikörper
gegen diese proteinartigen Materialien sind ebenfalls in der Erfindung
eingeschlossen.
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H.
pylori ist ein Mikroorganismus, welcher menschliche Magenschleimhaut
infiziert und mit aktiver chronischer Gastritis assoziiert ist.
Es wurde gezeigt, dass es sich um ein ätiologisches Agens bei der
gastroduodenalen Ulzeration handelt (Peterson, 1991), und zwei Studien
aus jüngster
Zeit berichteten, dass mit H. pylori infizierte Personen ein höheres Risiko
hatten, Magenkrebs zu entwickeln (Nomura et al., 1991; Parsonnet
et al., 1991).
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In
vivo-Untersuchungen des Bakteriums und sich daraus ergebende Arbeiten über die
Entwicklung von geeigneten präventiven
oder therapeutischen Mitteln sind stark durch die Tatsache behindert
worden, dass Helicobacter pylori nur mit Epithel vom gastrischen
Typ von sehr wenigen Tierwirten vergesellschaftet ist, von denen
keiner für
die Verwendung als Labormodell geeignet ist.
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Ein
Mausmodell der gastrischen Besiedelung ist unter Verwendung eines
helikalen Bakteriums entwickelt worden, das von Katzenmagenschleimhaut
isoliert wurde (Lee et al., 1988, 1990), und als ein Vertreter der
Gattung Helicobacter identifiziert wurde. Es wurde H. felis genannt
(Paster et al., 1990).
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Bis
heute stehen nur begrenzte Informationen bezüglich H. felis und des Ausmaßes von
dessen Ähnlichkeiten
und Unterschieden mit/zu H. pylori zur Verfügung. Die Zuverlässigkeit
des Mausmodells für
die Entwicklung von Behandlungen für H. pylori-Infektion ist daher
ungewiss. Kürzlich
wurde gezeigt, dass H. pylori-Urease ein schützendes Antigen in dem H. felis/Maus-Modell ist (Davin
et al., 1993; Corthesy-Theulaz et al., 1993).
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Es
ist daher ein Ziel der vorliegenden Erfindung, therapeutische und
präventive
Zusammensetzungen für
die Verwendung bei Helicobacter-Infektion bereitzustellen, welche
darüber
hinaus in Labortieren getestet werden können.
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Es
ist bekannt, dass H. pylori Urease-Aktivität exprimiert und dass Urease
eine wichtige Rolle bei der bakteriellen Besiedelung und Vermittlung
bestimmter pathogener Prozesse spielt (Ferrero und Lee, 1991; Hazel
et al., 1991).
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Die
Gene, welche für
die Urease-Strukturpolypeptide von H. pylori (URE A, URE B) codieren,
wurden kloniert und sequenziert (Labigne et al., 1991; und französische Patentanmeldung
FR 8 813 135 ), wie die Gene,
welche für
die "akzessorischen" Polypeptide codieren,
die für
die Urease-Aktivität
in H. pylori erforderlich sind (Internationale Patentanmeldung
WO 93/07273 ).
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Es
wurden Versuche unternommen, Nukleinsäuresequenzen aus dem H. pylori-Urease-Gencluster als
Sonden zu verwenden, um Ureasesequenzen in H. felis zu identifizieren.
Allerdings war keiner dieser Versuche erfolgreich. Darüber hinaus
ist die Etablierung und der Erhalt von H. felis-Kulturen in vitro
extrem schwierig, und die großen
Mengen der in den Bakterien vorhandenen Nukleasen kompliziert die
Extraktion von DNA.
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Die
Erfinder der vorliegenden Anmeldung konnten jedoch die Gene der
Urease-Strukturpolypeptide von H. felis und der akzessorischen Polypeptide
erfolgreich klonieren und sequenzieren. Dies ermöglichte im Kontext der Erfindung
den Vergleich der Aminosäuresequenz-Daten
für die
H. felis-ure-Genprodukte mit denjenigen für Helicobacter pylori, und
es wurde ein hoher Konservierungsgrad zwischen den Urease-Untereinheiten
festgestellt. Es existiert eine immunologische Beziehung zwischen
den 2 Ureasen, und schützende
Antikörper
gegen Helicobacter-Infektion
können
unter Verwendung der Urease-Untereinheiten oder Fragmente davon
als Immungene induziert werden.
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Um
allerdings die Wirksamkeit einzelner Urease-Untereinheiten, als
mukosale Immungene zu fungieren, zu erklären, wurden die Gene, welche
die betreffenden Urease-Untereinheiten (UreA und UreB) von Helicobacter
pylori und Helicobacter felis codieren, in einem Expressionsvektor
(pMAL) kloniert und in Escherichia coli-Zellen als translationale
Fusionsproteine exprimiert. Die rekombinaten UreA- und UreB-Proteine
wurden durch Affinitäts-
und Anionenaustausch-Chromatographietechniken
gereinigt und besitzen vorhergesagte Molekulargewichte von ungefähr 68 bzw.
103 kDa. Western-Blotting-Untersuchungen wiesen darauf hin, dass die
Urease-Komponenten
der Fusionsproteine stark immunogen sind und spezifisch durch polyklonale
Kaninchen-Anti-Helicobacter-Seren erkannt werden. Die orogastrische
Immunisierung von Mäusen
mit 50 μg
rekombinantem H. felis-UreB, das in Kombination mit einem mukosalen
Adjuvans (Cholera-Toxin) verabreicht wird, schützte 60% (n = 7; p < 0,005) der Mäuse gegen
die gastrische Besiedelung durch H. felis-Bakterien nach über 4 Monaten.
Dies war vergleichbar mit einem Wert von 25% (n = 8; p > 0,05) für das heterologe
H. pylori-UreB-Antigen. Zum ersten Mal wurde gezeigt, dass ein Antigen
einer rekombinanten Untereinheit eine Immunschutzreaktion gegen
gastrische Helicobacter-Infektion induziert.
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Die
Erfinder identifizierten auch im Kontext der Erfindung neue Hitzeschockproteine
oder Chaperonine in Helicobacter, die eine verstärkende Wirkung auf die Urease-Aktivität besitzen.
Die Verwendung von Chaperoninen in einer immunogenen Zusammensetzung
kann daher eine Verstärkung
des Schutzes induzieren.
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Tatsächlich wurden
die Gene, welche jedes der HspA- und HspB-Polypeptide von Helicobacter
pylori codieren, kloniert, unabhängig
als Fusionsproteine mit dem Maltose-Eindungs-Protein (MBP) exprimiert
und im großen
Massstab gereinigt. Diese Proteine wurden als rekombinante Antigene
zur Immunisierung von Kaninchen und in Western-Immunoblotting-Assays
sowie bei ELISA zur Bestimmung ihrer Immunogenizität in mit HP
infizierten Patienten (HP+) verwendet. Die MBP-HspA- und MBP-HspB-Fusionsproteine,
so wurde gezeigt, behielten ihre antigenen Eigenschaften bei. Ein
Vergleich der humoralen Immunantwortreaktion gegen HspA und/oder
HspB in (HP+)-Patientenseren zeigte, dass nicht nur HspB, sondern
auch HspA durch (HP+)-Patientenseren
(29/38 bzw. 15/38) erkannt wurde. Keiner der 14 nicht infizierten
Patienten wies mit den Hsp's
reagierende Antikörper
auf.
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Die
vorliegende Erfindung betrifft eine immunogene Zusammensetzung,
die zum Induzieren von Antikörpern
gegen Helicobacter-Infektion fähig
ist, die dadurch gekennzeichnet ist, dass sie Folgendes umfasst:
- (i) das Hitzeschockprotein HSP A, das durch
das hsp A-Gen von Plasmid pILL689 (CNCM I- 1356) codiert wird, oder
- (ii) ein Fragment des HSP A mit mindestens 6 Aminosäuren, oder
- (iii) eine Polypeptidvariante des HSP A, in welcher Aminosäuren ersetzt,
inseriert oder deletiert wurden;
wobei die Polypeptidvariante
mindestens 75% Identität
mit dem HSP A aufweist,
wobei das Fragment oder die Polypeptidvariante
die Urease-Aktivität
in einem Mikroorganismus verstärkt,
welcher zum Exprimieren aktiver Urease fähig ist.
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Vorzugsweise
ist die immunogene Zusammensetzung zum Induzieren schützender
Antikörper
fähig.
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Die
Expression von "Urease-Strukturpolypeptid" bezeichnet im Kontext
der vorliegenden Erfindung das Enzym von Helicobacter pylori oder
Helicobacter felis, vermutlich ein Haupt-Oberflächenantigen, das aus zwei sich
wiederholenden monomeren Untereinheiten, einer größeren Untereinheit
(Produkt des ure B-Gens) und einer kleineren Untereinheit, Produkt
des ure A-Gens,
zusammensgesetzt ist, [und] welche, wenn sie durch das Vorhandensein
der Produkte der akzessorischen Gene des Urease-Genclusters komplementiert werden,
für die
Urease-Aktivität,
d. h. die Hydrolyse von Harnstoff zur Freisetzung von NH4 + in den zwei Helicobacter-Spezies, verantwortlich
sind. Es versteht sich, dass in Abwesenheit der akzessorischen Genprodukte die
Urease-Strukturpolypeptide keine enzymatische Aktivität zeigen,
aber von Antikörpern,
die mit H. felis- oder H. pylori-Urease reagieren, erkannt werden.
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Der
Ausdruck "immunogene
Zusammensetzung" bezeichnet
im Kontext der Erfindung eine Zusammensetzung, welche einen Hauptwirkstoff
zusammen mit jeglichen notwendigen Bestandteilen zur Sicherung oder
zur Optimierung einer immunogenen Antwortreaktion, zum Beispiel
Adjuvantien, wie mukosales Adjuvans etc., umfasst.
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Das
Helicobacter pylori-Urease-Strukturpolypeptid wurde von Labigne
et al., 1991, beschrieben und sequenziert. Das in diesem Dokument
beschriebene Polypeptid ist besonders für die Verwendung in der Zusammensetzung
der vorliegenden Erfindung geeignet. Jedoch können Varianten, welche eine
funktionelle Homologie mit dieser veröffentlichten Sequenz zeigen,
verwendet werden, welche Aminosäure-Substitutionen, Deletionen
oder Insertionen umfassen, unter der Massgabe, dass die immunologischen
Charakteristika des Polypeptids, was seine Kreuzreaktivität mit Anti-Helicobacter
felis-Urease-Antikörpern
angeht, beibehalten werden. Allgemein gesagt, zeigt die Polypeptidvariante
eine Homologie von mindestens 75% und vorzugsweise von etwa 90%
mit der eingeschlossenen Sequenz.
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Ein
Fragment des Helicobacter pylori-Urease-Strukturpolypeptids kann
auch in der immunogenen Zusammensetzung der Erfindung verwendet
werden, mit der Massgabe, dass die Fragmente von Antikörpern erkannt
werden, die mit Helicobacter felis-Urease reagieren. Ein solches
Fragment ist allgemein aus mindestens 6 Aminosäuren zusammengesetzt, zum Beispiel
aus 6 bis 100 Aminosäuren,
vorzugsweise etwa 20–25.
Vorteilhafterweise trägt
das Fragment für
Helicobacter einmalige Epitope.
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Nukleinsäure- und
Aminosäuresequenzen
können
im Kontext der vorliegenden Erfindung unter Bezug auf die 11 und 12 interpretiert
werden, welche den genetischen Code bzw. Aminosäure-Abkürzungen zeigen.
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Das
Helicobacter felis-Urease-Strukturpolypeptid, das für die Verwendung
in der vorliegenden Erfindung geeignet ist, ist vorzugsweise dasjenige,
das durch einen Teil des Plasmids pILL205 (hinterlegt bei der CNCM
am 25. August 1993, unter der Nummer: CNCM I-1355) codiert wird
und dessen Aminosäuresequenz in 3 gezeigt ist (Untereinheiten A und B).
Wiederum kann eine Variante dieses Polypeptids, welches Aminosäure-Substitutionen,
-Deletionen oder -Insertionen bezüglich der Sequenz von 3 umfasst, verwendet werden, mit der Massgabe,
dass die immunologische Kreuzbeziehung mit Helicobacter pylori-Urease
aufrechterhalten wird. Eine solche Variante zeigt normalerweise
mindestens 90% Homologie oder Identität mit der Sequenz von 3. Ein Beispiel für solche Varianten sind die
Urease-A- und -B-Unter einheiten von Helicobacter heilmannii (Solnick
et al., 1994), die, wie gezeigt wurde, 80% und 92% Identität mit den
H. felis-Urease-A- bzw. -B-Untereinheiten aufweisen.
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Fragmente
dieser Urease oder Varianten können
in der immunogenen Zusammensetzung verwendet werden, mit der Massgabe,
dass die Fragmente von Antikörpern
erkannt werden, die mit der Helicobacter pylori-Urease reagieren.
Wiederum betrug die Länge
eines solchen Fragments in der Regel 6, zum Beispiel 6 bis 100,
vorzugsweise etwa 20 bis 25 Aminosäuren. Vorzugsweise trägt das Fragment
für Helicobacter
einmalige Epitope.
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Wenn
Varianten oder Fragmente der nativen Ureasesequenzen in der immunogenen
Zusammensetzung der Erfindung verwendet werden, kann deren Kreuzreaktivität mit Antikörpern, die
mit Urease aus der anderen Helicobacter-Spezies reagieren, durch
Kontaktieren des Fragments oder der Variante mit Antikörpern getestet
werden, die vorzugsweise polyklonal gegen entweder die native oder
die rekombinante Urease oder alternativ gegen gesamten Helicobacter
herangezüchtet
wurden. Vorzugsweise führen
die Varianten und Fragmente zu Antikörpern, die ebenfalls in der
Lage sind, mit H. heilmannii-Urease zu reagieren. Ein Kreuzschutz gegen
Infektion durch H. heilmannii wird daher durch die immunogene Zusammensetzung
der Erfindung ebenfalls erhalten.
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Die
Verwendung von Fragmenten der Urease-Strukturgene ist besonders
bevorzugt, da die immunologischen Eigenschaften des gesamten Polypeptids
konserviert werden können
unter gleichzeitiger Minimierung des Risikos von Toxizität.
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Die
Urease-Komponente der immunogenen Zusammensetzung, ob nun die Untereinheit
A oder Untereinheit B, kann in der Form von translationalen Fusionsproteinen,
zum Beispiel mit dem Maltose-Eindungs-Protein (MBP) verwendet werden.
Andere geeignete Fusionen sind als Beispiele in der internationalen Patentanmeldung
WO 90/11360 angegeben. Ein
weiteres Beispiel eines geeigneten Fusionsproteins ist das "QIAexpress"-System, das von
QIAGEN, USA, vermarktet wird, welches es ermöglicht, dass die 6 × His-Tag-Sequenz
am 5'- oder 3'-Ende der Protein
codierenden Sequenz platziert wird. Die Verwendung der aktiven Bestandteile
in der Form von Fusionsproteinen ist jedoch völlig wahlfrei.
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Die
immunogene Zusammensetzung der Erfindung umfasst ein Hitzeschockprotein,
das auch als ein "Chaperonin" von Helicobacter
bekannt ist. Diese Chaperonin wurden durch die Erfinder im Kontext
der vorliegenden Erfindung aufgeklärt. Vorzugsweise stammt das
Chaperonin aus Helicobacter pylori. Ein solches HSP ist das Urease-assoziierte
HSP A oder eine Mischung von HSP A und HSP B, mit der in 6 veranschaulichten Aminosäuresequenz.
Diese Polypeptide werden durch das Plasmid pILL689 codiert (hinterlegt bei
der CNCM am 25. August 1993 unter der Nummer: CNCM I-1356). Besonders
bevorzugt ist das H. pylori-HSP-A-Protein, entweder allein oder
in Kombination mit Hsp-B.
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Es
ist auch möglich,
als HSP-Komponente gemäß der Erfindung
eine Polypeptidvariante zu verwenden, in welcher Aminosäuren der
Sequenz von 6 ersetzt, inseriert oder
deletiert wurden, wobei die genannte Variante normalerweise mindestens
75%, und vorzugsweise mindestens 85% Homologie mit dem nativen HSP
zeigt. Die Varianten zeigen vorzugsweise mindestens 75%, zum Beispiel
mindestens 85% Identität mit
dem nativen Hsp.
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Die
Varianten zeigen weiter funktionelle Homologie mit dem nativen Polypeptid.
Im Falle der HSP-Komponenten bedeutet "funktionelle Homologie" die Fähigkeit,
die Urease-Aktivität
in einem Mikroorganismus zu verstärken, welcher fähig ist,
aktive Urease zu exprimieren, und/oder die Fähigkeit, Infektion durch Helicobacter,
insbesondere H. felis und H. pylori, zu blocken. Die Eigenschaft
der Verstärkung
der Urease-Aktivität
kann mit Hilfe des nachstehend in den Beispielen beschriebenen quantitativen
Urease-Aktivitäts-Assays untersucht
werden. Fragmente von einem oder beiden aus den HSP A- und HSP B-Polypeptiden
mit vorzugsweise mindestens 6 Aminosäuren können in der Zusammensetzung
verwendet werden. Die Fragmente oder Varianten der in der immunogenen
Zusammensetzung der Erfindung verwendeten HSP-Komponente sind vorzugsweise
in der Lage, Antikörper
zu erzeugen, welche die Urease verstärkende Wirkung, die normalerweise von
den HSPs gezeigt wird, blocken. Diese Eigenschaft wird auch mit
Hilfe des in den Beispielen beschriebenen quantitativen Assays untersucht.
Das Vorhandensein der Chaperonine in der Zusammensetzung verstärkt den
Schutz gegen Helicobacter pylori und felis.
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Die
Hsp-Komponente der immunogenen Zusammensetzung, ob HspA oder HspB,
kann in der Form eines translationalen Fusionsproteins verwendet
werden, zum Beispiel mit dem Maltose-Bindungs-Protein (MBP). Was die Urease-Komponente
angeht, werden andere geeignete Fusionspartner in der internationalen Patentanmeldung
WO 90/11360 beschrieben.
Das "QIAexpress"-System von QIAGEN,
USA, kann ebenfalls verwendet werden. Wiederum ist die Verwendung
der Proteine in der Form von Fusionsproteinen völlig wahlfrei.
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Die
immunogene Zusammensetzung kann HspA und ein Urease-Strukturpolypeptid
wie oben definiert umfassen.
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Gemäß einer
bevorzugten Ausführungsform
umfasst die immunogene Zusammensetzung als Urease-Komponente sowohl
die A- als auch B-Untereinheiten sowohl von Helicobacter felis (d.
h. ohne H. pylori-Urease) zusammen mit dem HSP A und HSP B von Helicobacter
pylori.
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Die
immunologische Kreuzreaktivität
zwischen den Ureasen der zwei unterschiedlichen Helicobacter-Spezies
ermöglicht
die Verwendung von nur einer Urease in der Zusammensetzung, vorzugsweise
derjenigen von Helicobacter felis. Die durch die gemeinsamen Epitope
induzierten schützenden
Antikörper
sind jedoch sowohl gegen Helicobacter pylori als auch Helicobacter felis
aktiv. Es ist auch möglich,
dass die Zusammensetzung schützende
Antikörper
gegen andere Spezies von Helicobacter induziert, wenn das Urease-Polypeptid
oder -Fragment Epitope trägt,
die auch auf den anderen Spezies vorkommen.
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Die
Zusammensetzung der Erfindung wird vorteilhafterweise als eine immunogene
Zusammensetzung oder ein Impfstoff zusammen mit physiologisch annehmbaren
Exzipientien und Trägern
und gegebenenfalls mit Adjuvantien, Haptenen, Trägern, Stabilisatoren etc. verwendet.
Geeignete Adjuvantien schließen
Muranmyldipeptid (MDP), vollständige
und unvollständige
Freundsche Adjuvantien (CFA und IFA) und Alum bzw. Alaun ein. Die
Impfstoffzusammensetzungen werden normalerweise für die orale
Verabreichung formuliert.
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Die
Impfstoffe sind vorzugsweise für
die Verwendung beim Menschen bestimmt, können aber auch bei nicht-humanen
Tieren zum Beispiel zu veterinären
Zwecken oder für
die Verwendung in Labortieren, wie Mäusen, Katzen und Hunden, verabreicht
werden.
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Die
in Tiere injizierten immunogenen Zusammensetzungen erhöhen die
in vivo Synthese von spezifischen Antikörpern, welche für therapeutische
Zwecke, zum Beispiel bei passiver Immunität, verwendet werden können.
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"Proteinartiges Material" bedeutet jegliches
Molekül,
das aus Ketten von Aminosäuren
zusammengesetzt ist, z. B. Peptide, Polypeptide oder Proteine, Fusions-
oder gemischte Proteine (d. h. eine Assoziation von 2 oder mehr
proteinartigen Materialien, von denen alle oder einige immunogene
oder immunmodulatorische Eigenschaften besitzen), entweder gereinigt
oder in einer Mischung mit anderem proteinartigen oder nicht-proteinartigem
Material. "Polypeptid" bezeichnet eine
Kette von Aminosäuren
von beliebiger Länge
und beinhaltet den Ausdruck "Peptid". Der Ausdruck "Fragment" bedeutet jegliche
Aminosäuresequenz,
die um mindestens eine Aminosäure
kürzer
ist als die Stammsequenz und eine Länge von Aminosäuren, z.
B. mindestens 6 Reste, die in der Stammsequenz aufeinanderfolgen,
umfasst.
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Die
Peptidsequenzen der Erfindung können
zum Beispiel durch chemische Synthese unter Einsatz einer Technik,
wie der Merrifield-Technik, und einer Synthetisierer-Vorrichtung
des von Applied Biosystems vermarkteten Typs erhalten werden.
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Die
Erfindung betrifft auch das proteinartige Material, das dadurch
gekennzeichnet ist, dass es umfasst oder besteht aus:
- (i) dem Hitzeschockprotein HSP A von Helicobacter pylori mit
der folgenden Aminosäuresequenz:
- (ii) einem Fragment von HSPA, wie definiert in (i), wobei das
Fragment mindestens 6 aufeinander folgende Aminosäuren der
in (i) definierten Aminosäuresequenz
umfasst; oder
- (iii) einer Polypeptidvariante der in (i) definierten Aminosäuresequenz,
in welcher Aminosäuren
ausgetauscht, inseriert oder deletiert worden sind, wobei die Polypeptidvariante
mindestens 75% und vorzugsweise mindestens 80% Identität mit der
in (i) definierten Aminosäuresequenz
aufweist;
wobei das Fragment oder die Polypeptidvariante die
Urease-Aktivität
in einem Mikroorganismus verstärkt, der
fähig ist,
aktive Urease zu exprimieren.
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Ein
besonders bevorzugtes Fragment des Helicobacter pylori-HSP-A-Polypeptids
ist die C-terminale Sequenz:
G
S C C H T G N H D H K H A K E H E A C C H D H K K H
oder ein
Unterfragment dieser Sequenz mit mindestens 6 aufeinander folgenden
Aminosäuren.
Von dieser C-terminalen Sequenz wird angenommen, dass sie als eine
Metallbindungs-Domäne
fungiert, die das Binden beispielsweise von Nickel ermöglicht.
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Das
proteinartige Material der Erfindung kann auch ein Fusion- oder
gemischtes Protein, welches mindestens eine der Untereinheiten des
Urease-Strukturpolypeptids von H. pylori und/oder H. felis einschliesst, oder
Fragmente oder Varianten davon wie oben definiert umfassen oder
daraus bestehen. Besonders bevorzugte Fusionsproteine sind die Mal-E-Fusionsproteine
und QIAexpress-System-Fusionsproteine (QIAGEN, USA), wie weiter
oben detailliert angegeben. Das Fusions- oder gemischte Protein
kann, entweder an Stelle von oder zusätzlich zu der Urease-Untereinheit, ein
Hitzeschockprotein oder ein Fragment oder eine Variante davon, wie
oben definiert, einschließen.
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Die
Erfindung betrifft auch monoklonale oder polyklonale Antikörper gegen
die oben beschriebenen proteinartigen Materialien. Die Antikörper können auch
gegen ein Polypeptid mit mindestens 90% Homologie mit irgendeinem
der oben angeführten
Urease-Polypeptide oder ein Fragment davon mit vorzugsweise mindestens
6 Aminosäuren
gerichtet sein. Die Antikörper
der Erfindung können
spezifisch Helicobacter felis-Polypeptide erkennen, die durch den
Urease-Gencluster
exprimiert werden. In diesem Fall sind die durch die Antikörper erkannten
Epitope für
Helicobacter felis einmalig. Alternativ können die Antikörper Antikörper, die
gegen Epitope gerichtet sind, die Helicobacter felis-Urease-Polypeptiden
und Helicobacter pylori-Urease-Polypeptiden
gemeinsam sind, einschließen
oder aus diesen bestehen. Wenn die Antikörper die akzessorischen Genprodukte
erkennen, ist es besonders vorteilhaft, dass sie mit dem akzessorischen
Helicobacter pylori-Genprodukt kreuzreagieren. Auf diese Weise können die
Antikörper
in der therapeutischen Behandlung von Helicobacter pylori-Infektion
beim Menschen durch Blockieren des Urease-Reifungsprozesses eingesetzt
werden.
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Die
Erfindung betrifft auch monoklonale oder polyklonale Antikörper ggen
die HSPs oder Fragmente davon, insbesondere gegen das in 6 veranschaulichte HSP A- und/oder HSP
B-Protein. Polypeptide
mit mindestens 75%, und vorzugsweise mindestens 80% oder 90% Homologie
mit den HSPs können
ebenfalls zur Induzierung der Antikörperbildung verwendet werden.
Diese Antikörper
können
für die
Helicobacter pylori-Chaperonine spezifisch sein, oder alternativ
können
sie mit GroEL-artigen Proteinen oder GroES-artigen Proteinen von
anderen Bakterien als Helicobacter, abhängig von den erkannten Epitopen,
kreuzreagieren. Die 7 zeigt die homologen
Regionen von HSP A und HSP B mit GroES-artigen Proteinen bzw. GroEL-artigen Proteinen
von verschiedenen Bakterien. Besonders bevorzugte Antikörper sind
jene, die entweder für
die HSP A- oder HSP B-Chaperonine spezifisch sind, oder jene, die
spezifisch die C-terminale HSP A-Sequenz mit der Metallbindungsfunktion
erkennen. Wiederum stellt die Verwendung spezifischer Fragmente
für die
Induzierung der Antikörper
die Herstellung von Helicobacter-spezifischen Antikörpern sicher.
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Die
Antikörper
der Erfindung können
unter Anwendung klassischer Techniken hergestellt werden. Zum Beispiel
können
monoklonale Antikörper
durch die Hybridom-Technik oder durch bekannte Techniken für die Herstellung
von menschlichen Antikörpern
oder durch die von Marks et al. beschriebene Technik (Journal of Molecular
Biology, 1991, 222, S. 581–597)
gebildet werden.
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Die
Erfindung schliesst auch Fragmente von beliebigen der oben genannten
Antikörper
ein, die durch Enzymverdau gebildet werden. Von besonderem Interesse
sind die Fab- und F(ab')2-Fragmente.
Ebenfalls von Interesse sind die Facb-Fragmente.
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Die
Erfindung betrifft auch gereinigte Antikörper oder Serum, welche(s)
durch Immunisierung eines Tiers, z. B. eines Säugers, mit der immunogenen
Zusammensetzung, dem proteinartigen Material oder Fragment, oder
dem Fusions- oder gemischten Protein der Erfindung erhalten wird/werden,
gefolgt von der Reinigung der Antikörper oder von Serum. Sie betrifft
ebenfalls ein Reagens für
die in vitro-Detektion von H. pylori-Infektion, das mindestens diese
Antikörper
oder Serum, gegebenenfalls mit Reagenzien zum Markieren der Antikörper, z.
B. Anti-Antikörper etc.,
enthält.
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Die
Erfindung betrifft weiter Nukleinsäuresequenzen, die für ein beliebiges
der oben genannten proteinartigen Materialien, die Peptide einschließen, codieren.
Insbesondere betrifft die Erfindung eine Nukleinsäuresequenz,
die dadurch gekennzeichnet ist, dass sie Folgendes umfasst:
- i) eine Sequenz, welche für die Helicobacter felis-Urease
und akzessorische Polypeptide wie oben definiert codiert, und eine
Sequenz, welche für
das HSP von H. pylori wie oben definiert codiert;
- oder ii) eine Sequenz, welche komplementär zur Sequenz i) ist;
- oder iii) eine Sequenz, welche zum Hybridisieren an Sequenz
(i) oder (ii) unter stringenten Bedingungen in der Lage ist;
- oder iv) ein Fragment von einer beliebigen der Sequenzen (i),
(ii) oder (iii), welche mindestens 10 Nukleotide umfasst.
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Bevorzugte
Sequenzen sind jene, welche die Gesamtheit oder einen Teil der Sequenz
von Plasmid pILL689 (CNCM I-1356) umfassen, zum Beispiel die Sequenz
von 6, insbesondere jene, die für HSP A und/oder
HSP B oder eine zu dieser Sequenz komplementäre Sequenz codieren, oder eine
Sequenz, welche zum Hybridisieren an diese Sequenz unter stringenten
Bedingungen in der Lage ist.
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Hochstringente
Hybridisierungsbedingungen im Kontext der Erfindung sind die Folgenden:
- – 5 × SSC;
- – 50%
Formamid bei 37°C;
oder:
- – 6 × SSC;
- – Denhard-Medium
bei 68°C.
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Die
Sequenzen der Erfindung schließen
auch jene ein, die an beliebige der oben definierten Sequenzen (i),
(ii) und (iii) unter nicht-stringenten Bedingungen hybridisieren,
nämlich:
- – 5 × SSC;
- – 0,1%
SDS;
- – 30
oder 40% Formamid bei 42°C,
vorzugsweise 30%.
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Der
Ausdruck "komplementäre Sequenzen" im Kontext der Erfindung
bezeichnet "komplementäre" und "reverse" oder "inverse" Sequenzen.
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Die
Nukleinsäuresequenzen
können
DNA oder RNA sein.
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Die
Sequenzen der Erfindung können
als Nukleotid-Sonden in Verbindung mit passenden Markierungsmitteln
verwendet werden. Solche Mittel schließen radioaktive Isotope, Enzyme,
chemische oder chemisch-lumineszente Marker, Fluorochrome, Haptene
oder Antikörper
ein. Die Marker können
gegebenenfalls an einem festen Träger, zum Beispiel einer Membran
oder Teilchen, befestigt sein.
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Als
ein bevorzugter Marker wird radioaktiver Phosphor (32P)
am 5'-Ende der Sondensequenz
eingebaut. Die Sonden der Erfindung umfassen jegliches Fragment
der beschriebenen Nukleinsäuresequenzen
und können
eine Länge
von zum Beispiel mindestens 45 Nukleotiden, zum Beispiel 60, 80
oder 100 Nukleotiden oder mehr aufweisen. Bevorzugte Sonden sind
jene, die von den ure A-, ure B-, ure I-, HSP A- und HSP B-Genen
abgeleitet sind.
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Die
Sonden der Erfindung können
bei der in vitro-Detektion von Helicobacter-Infektion in einer biologischen
Probe, gegebenenfalls nach einer Genamplifikationsreaktion, verwendet
werden. Am vorteilhaftesten werden die Sonden zum Detektieren von
Helicobacter felis oder Helicobacter pylori, oder beiden, verwendet, je
nachdem, ob die als Probe gewählte
Sequenz für
den einen oder anderen spezifisch ist, oder ob sie an beide hybridisieren
kann. Allgemein sind die Hybridisierungsbedingungen bei der Durchführung einer
solchen Detektion stringent.
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Die
Erfindung betrifft auch ein Kit für die in vitro-Detektion von
Helicobacter-Infektion, das dadurch gekennzeichnet ist, dass es
Folgendes umfasst:
- – eine Nukleotid-Sonde gemäß der Erfindung,
wie oben definiert;
- – ein
passendes Medium zum Ausführen
einer Hybridisierungsreaktion zwischen der Nukleinsäure von
Helicobacter und der Sonde;
- – Reagenzien
für die
Detektion jeglicher gebildeter Hybride.
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Die
Nukleotidsequenzen der Erfindung können auch als Primer in einer
Nukleinsäure-Amplifikationsreaktion
dienen. Die Primer umfassen normalerweise mindestens 10 aufeinander folgende
Nukleotide der oben beschriebenen Sequenzen, und vorzugsweise mindestens
18. Typische Langen sind von 25 bis 30 und können bis zu 100 oder mehr aufeinanderfolgende
Nukleotide betragen. Solche Primer werden in Paaren verwendet und
sind so gewählt,
um mit den 5'- und
3'-Enden des zu
amplifizierenden Fragments zu hybridisieren. Eine solche Amplifikationsreaktion
kann zum Beispiel unter Anwendung der PCR-Technik durchgeführt werden
(europäische
Patentanmeldungen
EP 200 363 ,
201 184 und
229 701 ). Die Q-β-Replikase-Technik (Biotechno- logy, Bd. 6, Okt.
1988) kann ebenfalls in der Amplifikationsreaktion angewandt werden.
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Die
Erfindung betrifft auch Expressionsvektoren, die dadurch gekennzeichnet
sind, dass sie beliebige der Nukleinsäuresequenzen der Erfindung
enthalten. Ein besonders bevorzugter Expressionsvektor ist das Plasmid
pILL689 (CNCM I-1356). Die Expressionsvektoren enthalten normalerweise
geeignete Promotoren, Terminatoren und Markergene und jegliche anderen
regulatorischen Signale, die für
die effiziente Expression notwendig sind.
-
Die
Erfindung betrifft weiter prokaryontische oder eukaryontische Wirtszellen,
die durch die Nukleinsäuresequenzen
der Erfindung stabil transformiert wurden. Als Beispiele von Wirten
können
höhere
Eukaryoten, wie CHO-Zellen und Zelllinien; Hefe, Prokaryoten einschließlich Bakterien,
wie E. coli, z. B. E. coli HB 101; Mycobacterium tuberculosum; Viren
einschließlich
Baculovirus und Vaccinia, genannt werden. In der Regel werden die
Wirtszellen durch Vektoren transformiert. Allerdings ist es auch
innerhalb des Kontextes der Erfindung möglich, die Nukleinsäuresequenzen
durch homologe Rekombination unter Anwendung herkömmlicher Techniken
zu inserieren.
-
Durch
Kultivieren der stabil transformierten Wirte der Erfindung kann
das Helicobacter-Urease-Polypeptidmaterial
und zutreffendenfalls das HSP-Material durch rekombinante Mittel
hergestellt werden. Die rekombinanten proteinartigen Materialien
werden dann gesammelt und gereinigt. Pharmazeutische Zusammensetzungen
werden durch Kombinieren der rekombinanten Materialien mit geeigneten
Exzipienten, Adjuvantien und gegebenenfalls etwaigen anderen Zusatzstoffen
wie Stabilisatoren hergestellt.
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Verschiedene
Aspekte werden in den Figuren veranschaulicht:
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1:
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Transposon-Mutagenese
und Sequenzierung von pILL205.
-
Lineare
Restriktionskarten des rekombinanten Cosmids pILL199 und des rekombinanten
Plasmids pILL205 (und die jeweiligen Größenmaßstab-Marker) werden gezeigt.
Die Zahlen in Klammern geben die Größen von H. felis-DNA-Fragmenten an, die in einen
der Klonierungsvektoren (pILL575 bzw. pILL570) inseriert wurden.
Die "Plus"- und "Minus"-Zeichen innerhalb der
Kreise entsprechen den Insertionsstellen des MiniTn3-Km-Transposon
in pILL205; "Plus"-Zeichen geben an, dass das Transposon
die Urease-Expression nicht inaktivierte, wohingegen negative Vorzeichen
angeben, dass die Urease-Expression beseitigt wurde. Die Buchstaben
beziehen sich auf mutante Klone, die hinsichtlich der quantitativen
Urease-Aktivität
und der Synthese von Urease-Genprodukten weiter charakerisiert wurden.
Der Ort der Urease-Strukturgene (ure A und ure B) auf pILL205 ist
durch Kästchen
dargestellt, deren Längen
zu den Größen der
jeweiligen offenen Leserahmen proportional sind. Die Pfeile beziehen
sich auf die Orientierung der Transkription. Die Skala am unteren Ende
der Figur gibt die Größen (in
Kilobasen) der Rind III- und PstI-Restriktionsfragmente an. Restriktionsstellen
sind wie folgt angegeben: B, BamHI; Pv, PvuII; Bg, BgIII; E, EcoRI;
H, HindIII; C, ClaI; Ps, PstI. Buchstaben innerhalb von Klammern
geben an, dass die Stellen aus dem Klonierungsvektor stammten.
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2:
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Western-Blot-Analyse
von Ganzzellenextrakten von E. coli HB101-Zellen, die rekombinante
Plasmide beherbergen, wurden mit polyklonalem Kaninchen-Antiserum
(verdünnt
1:1, 1000) reagieren gelassen, das gegen H. felis-Bakterien gezüchtet wurde.
A) Extrakte stammten von E. coli-Zellen, die Folgendes beherbergten:
Plasmidvektor pILL570 (Spur 1); rekombinantes Plasmid pILL205 (Spur
2); und pILL205-Plasmidderivate, die an den Orten "a", "b", "c", "d" und "e" disruptiert waren (Spuren 3–7). B)
Extrakte stammten von E. coli-Zellen, die Folgendes beherbergten:
rekombinantes Plasmid pILL753, das die ure A- und ure B-Gene von
H. pylori enthielt (Labigne et al., 1991) (Spur 1); und pILL205-Plasmidderivate,
die an den Orten "f", "g", "h" und "i" disruptiert waren (Spuren 2–5). Die
kleinen Pfeilspitzen geben Polypeptide von ungefähr 30 und 66 Kilodaltons an,
welche vermeintliche Ure A- und Ure B-Genprodukte von H. felis repräsentieren.
Die großen
Pfeilspitzen in der Tafel B geben die entsprechenden Genprodukte
von H. pylori an, welche mit dem Anti-H. felis-Serum kreuzreagierten.
Die Zahlen geben die Molekulargewichte (in Tausendern) der Proteinstandards
an.
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3:
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Nukleotidsequenz
der H. felis-Urease-Strukturgene. Die Zahlen über der Sequenz geben die Nukleotidpositionen
sowie die Aminosäure-Position
in jedem der zwei Ure A- und Ure B-Polypeptide an. Vorhergesagte Aminosäuresequenzen
für Ure
A (bp 43 bis 753) und Ure B (766 bis 2616) sind unter der Sequenz
gezeigt. Die vermutliche Ribosomenbindungsstelle (Shine-Dalgarno-Sequenz,
SD) ist unterstrichen.
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4:
-
Vergleich
von Sequenzen für
die Urease-Strukturgene von H. felis mit: a) der Sequenz der zwei
Untereinheiten von H. pylori-Urease (Labigne et al., 1991); b) der
Sequenz der drei Untereinhei ten von Proteus mirabilis-Urease (Jones
and Mobley, 1989); c) der Sequenz der einzelnen Untereinheit von
Jackbohnen-Urease. Lücken
(durch Gedankenstriche dargestellt) wurden eingeführt, um
die beste Alignierung sicherzustellen. *, Aminosäuren, die mit denjenigen der
H. felis-Sequenz
identisch sind; =, Aminosäuren,
die den verschiedenen Ureasen gemeinsam sind; ·, Aminosäuren, die für die Helicobacter-Ureasen
einmalig sind. Die Prozentangaben beziehen sich auf die Zahl von
Aminosäuren,
die mit denjenigen der H. felis-Urease-Untereinheiten identisch
sind. H. f., Helicobacter felis; H. p., Helicobacter pylori; P.
m., Proteus mirabilis; J. b., Jackbohne.
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5:
-
Restriktionskarte
der rekombinanten Plasmide pILL689, pILL685 und pILL691. Die Konstruktion
dieser Plasmide ist ausführlich
in Tabelle 1 beschrieben. Km innerhalb der Dreicke stellt die Stelle
der Insertion der Kanamycin-Kassette dar, welche zu der Konstruktion
der Plasmide pILL687, pILL688 und pILL696 führte (Tabelle 2). Die Kästchen unterhalb
der Karten geben die Position der drei genetischen Elemente an,
die von der Nukleotidsequenz abgeleitet sind, nämlich IS5, Hsp A und Hsp B.
-
6:
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Nukleotidsequenz
des Helicobacter pylori-Hitzeschockprotein-Genclusters. Die erste
Zahl über
der Sequenz gibt die Nukleotid-Positionen an, wohingegen die zweite
die Aminosäurerest-Positionen für jedes
der Hsp A- und Hsp B-Protein nummeriert. Die mutmaßlichen
Ribosomenbindungssequenzen (Shine-Dalgarno[SD]-Stellen) sind unterstrichen.
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7:
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Vergleich
der abgeleiteten Aminosäuresequenz
von Helicobacter pylori-Hsp A (A) oder -Hsp B (B) mit derjenigen
anderer GroEL-artiger (A)- oder GroES-artiger (B)-Proteine. Sternchen
markieren Aminosäuren, die
mit denjenigen in den Helicobacter pylori-Hsp A- oder -Hsp B- Sequenzen identisch
sind.
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8:
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Expression
der Helicobacter pylori-Hsp A-Hitzeschockproteine in E. coli-Minizellen.
Die Proteinbanden mit apparenten Molekülmassen von 58 und 13 kDA,
die den Helicobacter pylori Hsp A- und Hsp B-Hitzeschockproteinen
entsprechen, sind in den Spuren, die den Plasmiden pILL689 und pILL692
entsprechen, deutlich sichtbar, und fehlen bei den Vektorkontrollen
(pILL570 bzw. pACYC177).
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9:
-
Nukleotidsequenz
des Helicobacter felis-ure I-Gens und abgeleitete Aminosäuresequenz.
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10:
-
Vergleich
der Aminsosäuresequenz
der ure I-Proteine, die aus der Nukleotidsequenz des ure I-Gens von Helicobacter
felis und derjenigen von Helicobacter pylori abgeleitet sind.
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11:
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Genetischer
Code. Kettenterminierende oder "Nonsense"-Codons. Ebenfalls
verwendet zur Spezifizierung der Starter-Formyl-Met-tRNAMet F. Das Val-Triplett
GUG ist dahingehend "zweideutig", dass es sowohl Valin
als auch Methionin codiert.
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12:
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Bedeutung
der einbuchstabigen und dreibuchstabigen Aminosäure-Abkürzungen
-
13:
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Reinigung
von rekombinantem H. pylori-UreA-MBP-Protein unter Verwendung des
pMAL-Expressionsvektorsystems.
Extrakte von den verschiedenen Stufen der Proteinreinigung wurden
auf einem 10%igen, auflösenden
SDS-Polyacrylamidgel laufen gelassen. Im Anschluss an die Elektrophorese
wurde das Gel mit Coomassie-Blau angefärbt. Die Extrakte waren: 1)
nicht induzierte Zellen; 2) IPTG-induzierte Zellen; French-Press-Lysat
von induziertem Zellextrakt; 5) Eluat von Amylose-Harzsäule; 6)
Eluat von Anionenaustauschsäule
(erster Durchgang); 7) Eluat von Anionenaustauschsäule (zweiter
Durchgang); 8) SDS-PAGE-Standard-Markerproteine.
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14:
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Erkennung
von rekombinanten UreA-Fusionsproteinen durch polyklonale Kaninchen-Anti-Helicobacter-Seren.
Proteinextrakte von Maltose-Bindungsprotein (MBP, Spur 1), H. felis-UreA-MBP (Spur 2),
und H. pylori-UreA-MBP (Spur 3) wurden einem Western-Blotting-Test
unter Verwendung von polyklonalen Kaninchen-Antiseren (verdünnt 1:5000)
unterzogen, die gegen Ganzzellextrakte von H. pylori und H. felis
gewonnen worden waren. Die gereinigten Fusionsproteine sind durch
einen Pfeil angegeben. Putative Abbauprodukte der Proteine sind
durch ein Sternchen angegeben.
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15:
-
Erkennung
von rekombinanten UreB-Fusionsproteinen durch Kaninchen-Antiseren,
die gegen gereinigte homologe und heterologe UreB-Proteine gezüchtet wurden.
Nitrozellulose-Membranen
wurden mit den folgenden Extrakten geblottet: 1) Standard-Proteinmarker;
2) H. felis-UreA-MBP; 3) MBP; 4) H. pylori-UreA-MBP. Die Membranen
wurden mit polyklonalen Kaninchen-Antiseren (verdünnt 1 :
5000) reagieren gelassen, die gegen MBP-fusionierte H. pylori- bzw.
H. felis-Ure B-Untereinheiten gewonnen worden waren. Die Molekulargewichte
von Standard-Proteinen sind auf der linken Seite der Blots angegeben.
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16:
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Western-Blot-Analyse
von H. pylori- und H. felis-Ganzzellextrakten mit Antiseren, die
gegen gereinigte rekombinante UreB-MBP-Fusionsproteine gewonnen
worden waren. SDS-PAGE-Vollextrakte
von H. felis- (Spur 1-) und H. pylori- (Spur 2-)Zellen wurden mit
polyklonalen Kaninchen-Antiseren reagieren gelassen, die gegen gereinigte
H. pylori-UreB- und H. felis-UreB-MBP-Fusionsproteine (Seren 1:5000 verdünnt) gewonnen worden
waren. Der Unterschied in der Gelmobilität der jeweiligen nicht-rekombinanten
UreB-Untereinheiten von H. felis und H. pylori ist zu sehen. Die
Zahlen auf der linken Seite beziehen sich auf die Molekulargewichte von
Standard-Markerproteinen.
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17:
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Serum-IgG-Antwortreaktionen
gegen MBP (unten), MBP-HspA (oben) und MBP-HspB (Mitte) von 28 mit
H. pylori infizierten Patienten (Quadrate, links) und 12 nicht-infizierten
Patienten (Kreise, rechts). Die optische Dichte jedes Serums in
dem in den 'Experimentellen
Verfahrensweisen' beschriebenen
ELISA-Assay wurde bei 492 nm nach einer 30-minütigen Inkubation abgelesen.
Die Größen der
Symbole sind proportional zu der Anzahl der Seren, die den gleichen
Wert für
die optische Dichte ergeben.
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18:
-
SDS-PAGE-Analyse
von Material, das von der Amylose-Säule (Spuren 2 und 3) oder von
der Ni-NTA-Säule
im Anschluss an die Elution eluiert wurde: mit Puffer E (pH-Wert
4,5), Spuren 4 und 5; oder Puffer C (pH-Wert 6,3), Spuren 6 und
7. Aus einem Lysat von MC1061 (PILL933) (Spuren 2, 3, 5 und 7) eluiertes Material
und aus einem Lysat von MC1061 (PMAL-c2) (Spuren 4 und 6) eluiertes
Material. Die Spur 3 enthält das
gleiche Material wie in der Spur 2, mit der Ausnahme, dass es in
Puffer E erneut suspendiert wurde, wodurch gezeigt wurde, dass der
Puffer E für
die Dimerbildung der MBP-HspA-Untereinheit verantwortlich ist, wie in
den Spuren 3 und 5 zu sehen ist.
-
REFERENZBEISPIEL I
-
I – KLONIERUNG,
EXPRESSION UND SEQUENZIERUNG DES H. FELIS-UREASE-GENS: EXPERIMENTELLE
PROZEDUREN FÜR
TEIL I:
-
Bakterienstämme und Kulturbedingungen:
-
H.
felis (ATCC 49179) wurde auf der Blutagar-Basis Nr. 2 (Oxoid), ergänzt mit
5% (v/v) lysiertem Pferdeblut (BioMerieux) und einer Antibiotikum-Ergänzung, bestehend
aus 10 ngml–1 Vancomycin
(Lederle Laboratories), 2,5 μgml–1 Polymyxin
B (Pfizer), 5 μgml–1 Trimethoprim
(Sigma Chemical Co.) und 2,5 μgml–1 Amphotericin
B (E. R. Squibb and Sons, Inc.), wachsen gelassen. Bakterien wurden
auf frisch hergestellten Agarplatten kultiviert und inkubiert, mit
Deckel in der höchsten
Stellung, und zwar unter mikroaeroben Bedingungen bei 37°C während 2–3 Tagen.
E. coli-Stämme
HB 101 (Boyer und Roulland-Dussoix, 1969) und MC1061 (Maniatis et
al., 1983), die in den Klonierungsexperimenten angewandt wurden,
wurden routinemäßig in Luria-Nährbrühe ohne
hinzugesetzter Glukose oder auf Luria-Agarmedium bei 37°C wachsen
gelassen. Bakterien, die unter Stickstoff-begrenzenden Bedingungen
wachsen gelassen wurden, wurden auf ein Stickstoff-begrenzendes festes
Medium passagiert, das aus Ammonium-freiem M9-Minimalmedium (pH
7,4), ergänzt
mit 0,4% (w/v) D-Glukose und 10 mM L-Arginin, bestand (Cussac et
al., 1992).
-
DNA-Manipulationen:
-
Alle
standardmäßigen DNA-Manipulationen
und -Analysen wurden, wenn nicht anders angegeben, gemäß den von
Maniatis et al. (1983) beschriebenen Prozeduren durchgeführt.
-
Isolierung von H. felis-DNA:
-
Genomische
Gesamt-DNA wurde durch eine Sarkosyl-Proteinase K-Lyseprozedur (Labigne-Roussel et al., 1988)
extrahiert. Zwölf
Blutagarplatten, die mit H. felis inokuliert worden waren, wurden
in einem aneroben Gefäß (BBL)
mit einem anaeroben Gaspak (BBL 70304) ohne Katalysator 1–2 Tage
lang bei 37°C
inkubiert. Die Platten wurden in 50 ml einer 15% (v/v) Glycerol-
9% (w/v)-Sucrose-Lösung
geerntet und bei 5 000 U/min (in einer Sorvall-Zentrifuge) 30 min
lang bei 4°C
zentrifugiert. Das Pellet wurde erneut in 0,2 ml 50 mM D-Glukose
in 25 mM Tris – 10
mM EDTA (pH 8,0), das 5 mgml–1 Lysozym enthielt,
suspendiert und in ein VTi65-Polyallomer-Schnellverschlussröhrchen überführt. Ein
0,2 ml großes
Aliquot von 20 mgml–1 Proteinase K und 0,02
ml 5 M Natriumperchlorat wurden der Suspension hinzugesetzt. Zellen
wurden lysiert, indem 0,65 ml an 0,5 M EDTA – 10% (w/v) Sarkosyl hinzugesetzt
wurden und bei 65°C
inkubiert wurde, bis die Suspension sich aufklärte (etwa 5 min). Das Volumen
des Röhrchens
wurde mit einer CsCl-Lösung
komplettiert, die aus (pro 100 ml) 126 g CsCl, 1 ml Aprotinin, 99
ml TES-Puffer (30 mM Tris, 5 mM EDTA, 50 mM NaCl (pH 7,5)) bestand.
Lysate wurden bei 45 000 U/min 15–18 h lang bei 18°C zentrifugiert.
Gesamt-DNA wurde gesammelt und gegen TE-Puffer (10 mm Tris, 1 mM
EDTA) bei 4°C
dialysiert.
-
Cosmid-Klonierung:
-
Chromosomale
DNA von H. felis wurde in den Cosmidvektor pILL575 kloniert, wie
es früher
beschrieben wurde (Labigne et al., 1991). Kurz gesagt, wurden DNA-Fragmente,
die von einem partiellen Verdau mit Sau3A stammten, auf einem (10
bis 40%) Sucrose-Dichtegradienten der Größe nach sortiert und dann in
eine BamHI-verdaute und dephosphorylierte pILL575-DNA-Präparation
ligiert. Cosmide wurden in lambda-Phagenteilchen verpackt (Amersham,
In-Vitro-Verpackungskit)
und eingesetzt, um E. coli HB 101 zu infizieren. Um nach Ureaseexpression
zu screenen, wurden Kanamycin-resistente Transduktanten auf festes
Stickstoff-limitierendes Medium (siehe oben), das (20 μgml–1)
Kanamycin enthielt, replika-plattiert, welches in einzelnen Mulden
von Mikrotiterplatten (Becton Dickinson) ausgeteilt worden war.
Die Mikrotiterplatten wurden aerob bei 37°C 2 Tage lang inkubiert, bevor
0,1 ml Urease-Reagens (Hazell et al., 1987) jeder Mulde hinzugesetzt
wurde. Die Ureolyse wurde innerhalb von 5–6 h bei 37°C durch eine Farbänderung
im Reagens nachgewiesen. Mehrere Urease-positive Cosmidklone wurden
restriktionskartiert, und einer wurde zur Subklonierung ausgewählt.
-
Subklonierung von H. felis-DNA:
-
Eine
CsCl-Plasmid-Präparation
von Cosmid-DNA im großen
Maßstab
wurde durch Sau3A partiell verdaut. DNA-Fragmente (7–11 kb)
wurden aus einem Agarosegel elektroeluiert und unter Anwendung von
Phenol-Chloroform-Extraktionen gereinigt. Nach der Präzipitation
in kaltem Ethanol wurden die Fragmente in Bg/III-verdautes Plasmid
pILL570 ligiert (Labigne et al., 1991), und die rekombinanten Plasmide
wurden verwendet, um kompetente E. coli-MC1061-Zellen zu transformieren. Spectinomycin-resistente
Transformanten wurden selektiert und hinsichtlich Urease-Expression
unter stickstoffreichen (Luria-Agar) und Stickstoff-limitierenden
Bedingungen gescreent.
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Quantitative Ureaseaktivität:
-
sEs
wurden Kulturen, die aerob 2,5 Tage lang bei 37°C wachsen gelassen worden waren,
geerntet und zweimal in 0,85%iger (w/v) NaCl gewaschen. Pellets
wurden in PEB-Puffer (0,1 M Natriumphosphatpuffer (pH 7,4), enthaltend
0,01 M EDTA) resuspendiert und dann durch vier 30-s-Ausbrüche unter
Verwendung eines Branson-Ultrabeschallers, Modell 450, ultrabeschallt,
der auf 30 W, 50%-Zyklus, eingestellt war. Zelltrümmer wurden
aus den Sonicaten durch Zentrifugation entfernt. Die Urease-Aktivitäten der
Sonicate wurden in einer 0,05 M Harnstofflösung, hergestellt in PEB, gemessen,
und zwar durch eine Modifizierung der Berthelot-Reaktion (Cussac
et al., 1992). Die Urease-Aktivität wurde als μMol-Harnstoff
min–1 mg–1 Bakterienprotein ausgedrückt.
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Proteinbestimmung:
-
Proteinkonzentrationen
wurden mit einer kommerziellen Version des Bradford-Assays (Sigma
Chemicals) abgeschätzt.
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Transposon-Mutagenese:
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Statistische
insertionelle Mutationen wurden innerhalb geklontem H. felis über ein
MiniTn3-Km-Zuführsystem
erzeugt (Labigne et al., 1992). Kurz gesagt, wurden E. coli HB 101-Zellen,
die das Transposase-codierende Plasmid pTCA enthielten, mit dem
Plasmid pILL570, das klonierte H. felis-DNA enthielt, transformiert. Die
Transposition des MiniTn3-Km-Elementes in die pILL570-Derivatplasmide
wurde mittels Konjugation ausgeführt.
Die resultierenden Cointegrate wurden dann hinsichtlich aufgelöster Strukturen
in Gegenwart von hohen Konzentrationen an Kanamycin (500 mgl–1) und
Spectinomycin (300 mgl–1)
selektiert.
-
SDS-PAGE und Western-Blotting:
-
Solubilisierte
Zellextrakte wurden auf Flach-Gelen analysiert, welche ein 4,5%iges
Acrylamid-Sammelgel
und ein 12,5%iges Trenngel umfassten, und zwar gemäß der Prozedur
von Laemmli (Laemmli, 1970). Eine Elektrophorese wurde bei 200 V
auf einer Mini-Flachgel-Apparatur (Bio-Rad) durchgeführt.
-
Proteine
wurden auf Nitrocellulosepapier (Towbin et al., 1979) in einer Mini-Trans-Blot-Transferzelle (Bio-Rad),
die auf 100 V eingestellt war, 1 h lang (unter Kühlen) transferiert. Nitrocellulosemembranen
wurden mit 5% (w/v) gereinigtem Casein (BDH) in Phosphat-gepufferter
Kochsalzlösung
(PBS, pH 7,4) bei Raumtemperatur 2 h lang blockiert (Ferrero et
al., 1992). Membranen wurden bei 4°C über Nacht mit Antiseren umgesetzt,
die in mit PBS hergestellten 1%igen (w/v) Casein verdünnt waren.
Immunoreaktanten wurden dann unter Verwendung eines biotinylierten
sekundären
Antikörpers
(Kirkegaard und Perry Lab.) in Kombination mit Avidin-Peroxidase (KPL)
detektiert. Eine Substratlösung,
die aus 0,3% (w/v) 4-Chlor-1-naphthol (Bio-Rad) bestand, wurde verwendet, um Reaktionsprodukte
zu visualisieren.
-
DNA-Sequenzierung:
-
DNA-Fragmente,
die zu sequenzieren waren, wurden in M13mp18- und M13mp19- (Meissing
und Vieira, 1982) Bakteriophagen-Vektoren (Pharmacia) kloniert.
Kompetente E. coli-JM101-Zellen
wurden mit rekombinanter Phagen-DNA transfizert und auf Medien plattiert,
die X-gal (5-Brom-4-chlor-3-indolyl-β-D-galactopyranosid) und Isopropyl-βD-thiogalactopyranosid
enthielten. Plaques, die aus Bakterien entstanden, die mit rekombinanter
Phagen-DNA infiziert waren, wurden für die Herstellung von einzelsträngigen DNA-Matrizen durch
eine Polyethylenglykolbehandlung (Sanger et al., 1977) selektiert.
Einzelsträngige
DNA wurde gemäß der Didesoxynukleotid-Kettenabbruch-Methode
unter Verwendung eines Sequenase-Kits (United States Biochemical
Corp.) sequenziert.
-
Nukleotidsequenz-Zugangsnummer:
-
Die
Nukleotid-Zugangsnummer ist X69080 (EMBL Data Library).
-
ERGEBNISSE DER EXPERIMENTE DES TEILS I:
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Expression von Ureaseaktivität durch
H. felis-Cosmidklone:
-
Das
Klonieren von partiell verdauten Fragmenten (30 bis 45 kb Größe) von
chromosomaler H. felis-DNA in den Cosmidvektor pILL575 führte zur
Isolierung von etwa 700 Cosmidklonen. Die Klone wurden auf Stickstoff-limitierendem
Medium subkultiviert, um eine Ureaseexpression zu induzieren (Cussac
et al., 1992). Sechs von diesen wurden dahingehend identifiziert,
dass sie nach einer Inkubation von 5–6 h Urease-positiv waren (wie
in dem Abschnitt zu experimentellen Prozeduren beschrieben). Es
wurden keine anderen Urease-positive Cosmidklone identifiziert,
selbst nach einer weiteren Übernacht-Inkubation.
Die Restriktionsenzymanalyse von 3 Klonen, welche die Urease-codierenden
Cosmide beherbergten, enthüllte
ein gemeinsames 28 kD-DNA-Fragment.
Ein Cosmid (als pILL199 bezeichnet), welches DNA-Regionen an beiden
Extremitäten
des gemeinsamen Fragments enthielt, wurde zur Subklonierung ausgewählt.
-
Identifizierung von H. felis-Genen, die
für die
Urease-Expression bei Klonierung in E. coli-Zellen erforderlich waren:
-
Um
die minimale DNA-Region zu definieren, die für eine Urease-Expression in
E. coli-Zellen notwendig war, wurde das Urease-codierende Cosmid
pILL199 partiell mit Sau3A verdaut, und die Fragmente wurden in
das Plasmid pILL570 subkloniert. Die Transformanten wurden auf stickstoffreichen
und Stickstoff-limitierenden Medien subkultiviert und hinsichtlich
eines Urease-positiven Phänotyps
gescreent. Fünf
Transformanten exprimierten Urease-Aktivität, wenn sie unter Stickstoff-limitierenden
Bedingungen wachsen gelassen wurden, wohingegen keine Aktivität nachgewiesen
wurde nach dem Wachstum auf stickstoffreichem Medium. Die Restriktionskartierungsanalysen
zeigten, dass die Urease-codierenden Plasmide Inserts von 7 bis
11 kb enthielten. Das als pILL205 bezeichnete Plasmid wurde für weitere
Untersuchungen gewählt.
-
Eine
statistische Mutagenese von klonierter H. felis-DNA wurde durchgeführt, um
mutmaßliche
Regionen zu untersuchen, welche für die Urease-Expression in
E. coli essenziell sind, und um die Region von klonierter DNA zu
lokalisieren, welche die strukturellen Ureasegene enthielt. Mutanten
mit statistischer Insertion von dem Prototyp-Plasmid pILL205 wurden
somit unter Verwendung des MiniTn3-Km-Elementes erzeugt (Labigne
et al., 1992). Die Stelle der Insertion wurde für jede der mutierten Kopien
von pILL205 restriktionskartiert, und Zellen, welche diese Plasmide
beherbergten, wurden qualitativ auf Ureaseaktivität getestet
(1). Eine Auswahl von E. coli-HB101-Zellen, die
die mutierten Derivate von pILL205 beherbergten (bezeichnet als "a" bis "i")
wurden dann sowohl für
quantitative Ureaseaktivitätsbestimmungen
als auch für
den Nachweis der mutmaßlichen
Ureaseuntereinheiten durch Western-Blotting verwendet.
-
Die
Urease-Aktivität
von E. coli-HB101-Zellen, welche pILL205 beherbergen, betrug 1,2 ± 0,5 μMol Harnstoff
min–1mg–1 Bakterienprotein
(Tabelle 1), was etwa einem Fünftel
von derjenigen des H. felis-Elternstammes, der für das Klonieren verwendet wurde,
entspricht. Die Insertion des Transposons an den Stellen "a", "c", "d", "f" und "g" führte
zu einem negativen Phänotyp,
während
Mutationen an den Stellen "b", "e", "h" und "i" keinen signifikanten Effekt auf die
Urease-Aktivitäten
von Klonen, welche diese mutierten Kopien von pILL205 beherbergten,
hatten (Tabelle 1). Somit identifizierte die Mutagenese von pILL205
mit dem MiniTn3-Km-Element
drei Domänen
als für
die H. felis-Urease-Genexpression in E. coli-Zellen erforderlich.
-
Lokalisation der H. felis-Urease-Strukturgene:
-
Die
Western-Blot-Analyse von Extrakten von E. coli-Zellen, welche pILL205
beherbergten, zeigte die Anwesenheit von zwei Polypeptiden von etwa
30 und 66 kDa an, welche mit polyklonalem H. felis-Kaninchen-Antiserum
kreuzreagierten (
2A). Diese Proteine wurden nicht
durch Bakterien hergestellt, die den Vektor (pILL570) trugen. Von
nativer H. felis-Urease wurde berichtet, dass sie aus wiederkehrenden
monomeren Untereinheiten mit berechneten Molekulargewichten von
30 und 69 kDA bestand (Turbett et al., 1992). Somit dachte man,
dass die 30- und 66 kDa-Proteine den ure A- bzw. ure B-Genprodukten
entsprachen. Interessanterweise exprimierte ein Extrakt von E. coli-Zellen,
welche das rekombinante Plasmid pILL763 beherbergten (Cussac et
al., 1992), enthaltend die Helicobacter pylori-ure A- und -ure B-Gene,
zwei Polypeptide mit ungefähren
Molekülgrößen von
30 und 62 kDa, welche mit den Anti-H. -felis-Antiseren kreuzreagierten
(
2B). Tabelle 1. Mutagenese von E. coli-Klonen
und Auswirkung auf die Ureaseaktivität
Plasmidea | Ureaseaktivitätb (μMol
Harnstoff min–1mg–1 Protein) |
pILL205 | 1,2 ± 0,46c |
pILL205
:: a | negd |
pILL205
:: b | 0,74 ± 0,32 |
pILL205
:: c | neg |
pILL205
:: d | neg |
pILL205
:: e | 0,54 ± 0,15 |
pILL205
:: f | neg |
pILL205
:: g | neg |
pILL205
:: h | 1,05 ± 0,25 |
pILL205
:: i | 0,93 ± 0,35 |
- a E. coli-Zellen
beherbergten pILL205 und seine Derivate, konstruiert durch Transposon-Mutagenese. Die Buchstaben
entsprechen den Insertionsstellen des MiniTn3-Transposons auf pILL205.
- b Aktivitäten von Bakterien, die aerob
3 Tage lang bei 37°C
auf festem M9-Minimalmedium, das mit 10 mM L-Arginin ergänzt war,
wachsen gelassen worden waren. Die Werte entsprechen den Mittelwerten ± Standardabweichungen,
die aus drei Bestimmungen berechnet wurden.
- c Die Ureaseaktivität war etwa ein Fünftel zu
groß wie
die des H. felis-Wildtypstamms (ATCC 49179), d. h. 5,7 ± 0,1 μMol Harnstoff
min–1mg–1 Protein
(Ferrero und Lee, 1991).
- d Es wurde keine Aktivität nachgewiesen
(die Detektionsgrenze betrug < 1
nMol Harnstoff min–1mg–1 Bakterienprotein).
-
Klone,
die die mutierten Derivate von pILL205 beherbergten, exprimierten
alle, mit Ausnahme von einem Fall, die ure A- und ure B-Genprodukte
(2A, B). Vor dem Hintergrund, dass mehrere der
Mutanten (d. h. die Mutanten "c", "d", "f" und "g") die Ureaseuntereinheiten synthetisierten,
jedoch kein aktives Enzym herstellten, ist es möglich, zu spekulieren, dass
Hilfsfunktionen, die für
die Ureaseaktivität
essenziell sind, durch die Transposoninsertion zerstört worden
sein könnten.
Im Gegensatz dazu stellte die als pILL205::a bezeichnete Mutante
nicht das ure B-Produkt
her und war Urease-negativ. Somit nahm man an, dass die Stelle der
Transposoninsertion in dem ure B-Gen lokalisiert ist. Es wurden
Sequenzanalysen der DNA-Region, die der Insertionsstelle "a" entsprach, vorgenommen, um potenzielle
offene Leserahmen, welche die strukturellen Polypeptide von H. felis-Urease
codieren, aufzuklären.
-
Sequenzanalysen von H. felis-Urease-Strukturgenen:
-
Die
Sequenzierung einer 2,4 kb großen
Region von H. felis-DNA, die zu der Transposon-Insertionsstelle "a" benachbart
war, führte
zu der Identifizierung von zwei offenen Leserahmen (ORFs), die als
ure A und ure B bezeichnet wurden, welche in der gleichen Richtung
transkribiert werden (3). Es wurde
bestätigt, dass
das Transposon 240 bp stromaufwärts
vom Ende von ure B lokalisiert war. Beide ORFs fingen mit einem ATG-Startcodon
an, und es ging ihnen eine Stelle voraus, die zu der E. coli-Konsensus-Ribosomenbindungs-Sequenz ähnlich war
(Shine und Dalgarno, 1974). Der intergenische Raum für die H.
felis-Strukturgene bestanden aus drei Codons, welche sich mit den
benachbarten offenen Leserastern in Phase befanden. Dies legt nahe,
dass, wie bereits im Fall von Helicobacter pylori festgestellt worden
war (Labigne et al., 1991), eine einzelne Mutation im Stoppcodon
des ure A-Gens theoretisch zu einem fusionierten einzelnen Polypeptid
führen
würde.
-
Die
H. felis-ure A- und ure B-Gene codieren Polypeptide mit berechneten
Molekulargewichten von 26 074 kDa bzw. 61 663 Da, welche in starkem
Maße homolog
auf der Ebene der Aminosäuresequenz
zu den ure A- und ure B-Genprodukten von H. pylori sind. Die Spiegel
der Identität
zwischen den entsprechenden ure A- und ure B-Genprodukten der zwei
Helicobacter spp. wurde mit 73,5% bzw. 88,2% berechnet. Aus der
Aminosäuresequenzinformation
sind die vorausgesagten Molekulargewichte der Ure A- und Ure B-Polypeptide von
H. felis und H. pylori (Labigne et al., 1991) sehr ähnlich.
Nichtsdestotrotz besaß das
ure B-Produkt von H. felis eine niedrigere Mobilität als das
entsprechende Genprodukt aus Helicobacter pylori, wenn es einer SDS-Polyacrylamidgelelektrophorese
unterzogen wurde (2B).
-
REFERENZBEISPIEL II
-
II – EXPRESSION
VON REKOMBINANTEN UREASE-UNTEREINHEITEN-PROTEINEN AUS H. PYLORI UND
H. FELIS: UNTERSUCHUNG DIESER PROTEINE ALS POTEN-ZIELLE MUKOSALE IMMUNOGENE IN EINEM
MAUSMODELL:
-
Die
Ziele der Untersuchung waren es, rekombinante Antigene zu entwickeln,
die aus den Urease-Untereinheiten von H. pylori und H. felis abstammen,
und die immunoprotektiven Wirksamkeiten dieser Antigene in dem H.
felis/Maus-Modell zu bestimmen. Jedes der Strukturgene, die die
jeweiligen Urease-Untereinheiten von H. pylori und H. felis codieren,
wurde unabhängig
in Escherichia coli kloniert und überexprimiert. Die resultierenden
rekombinanten Urease-Antigene (welche an ein 42 kDa großes Maltose-Bindungsprotein
von E. coli fusioniert waren) wurden in großen Mengen aus E. coli-Kulturen
gereinigt und waren immunogen, jedoch enzymatisch inaktiv. Die Befunde
zeigten die Durchführbarkeit
der Entwicklung eines rekombinanten Impfstoffes gegen H. pylori-Infektion.
-
EXPERIMENTELLE PROZEDUREN FÜR TEIL II:
-
Bakterienstämme, Plasmide und Wachstumsbedingungen:
-
H.
felis (ATCC 49179) wurde auf einem Blutagarmedium wachsen gelassen,
welches Blutagar-Grundlage
Nr. 2 (Oxoid), ergänzt
mit 10% lysiertem Pferdeblut (BioMérieux) und einer Antibiotikum-Ergänzung, bestehend
aus Vancomycin (10 μg/ml),
Polymyxin B (25 ng/ml), Trimethoprim (5 μg/ml) und Amphotericin B (2,5 μg/ml), enthielt.
Bakterien wurden unter mikroaeroben Bedingungen bei 37°C 2 Tage
lang kultiviert, wie es vorausgehend beschrieben wurde. Die E. coli-Stämme MC1061
und JM101, welche in Klonierungs- und Expressionsexperimenten verwendet
wurden, wurden routinemäßig bei
37°C in
Luria-Medium wachsen gelassen, und zwar mit oder ohne hinzugesetztem
Agar. Die Antibiotika Carbenicillin (100 μg/ml) und Spectinomycin (100 μg/ml) wurden
nach Bedarf hinzugesetzt.
-
DNA-Manipulationen und Analysen:
-
Alle
DNA-Manipulationen und -Analysen wurden, wenn es nicht anders angegeben
ist, gemäß Standardprozeduren
durchgeführt.
Restriktion- und Modifizierungsenzyme wurden von Amersham (Frankreich)
gekauft. Zu klonierende DNA-Fragmente wurden aus Agarosegelen elektroeluiert
und dann durch die Passagierung auf Elutip-Minisäulen (Schleicher und Schull,
Deutschland) gereinigt. Die Sequenzierung von einzelsträngiger DNA
wurde unter Verwendung von M13mp18- und M13mp19-Bakteriophagen-Vektoren
(Pharmacia, Frankreich) durchgeführt.
Einzelsträngige
DNA-Matrizen wurden aus rekombinanter Phagen-DNA durch Polyethylenglykolbehandlung
hergestellt. Die Sequenzierung der Matrizen wurde gemäß der Didesoxynuldeo tid-Kettenabbruch-Methode
unter Verwendung eines Sequenase-Kits (United States Biochemical
Corp., USA) erreicht.
-
Herstellung von Inserts für die Klonierung
unter Anwendung der Polymerasekettenreaktion (PCR):
-
Um
die ureA-Gene von H. pylori und H. felis zu klonieren, wurden degenerierte
36-mer-Primer aus den veröffentlichten
Ureasesequenzen erhalten (Labigne et al., 1991; Ferrero und Labigne,
1993) (Primersatz Nr. 1; siehe Tabelle 2). Gereinigte DNA von E.
coli-Klonen, welche die Plasmide pILL763 und pILL207 beherbergten
(Tabelle 3), die die Strukturgene von H. pylori- und H. felis-Ureasen
codierten, wurden als Matrizenmaterial in PCR-Reaktionen verwendet.
Reaktionsproben enthielten: 10–50
ng an denaturierter DNA; PCR-Puffer (50 mMol/l KCl in 10 mMol/l
Tris-HCl [pH 8,3]); dATP, dGTP, dCTP und dTTP (jeweils in einer
Endkonzentration von 1,25 mMol/l); 2,5 mMol/l MgCl2;
25 pMol von jedem Primer und 0,5 μl
Taq-Polymerase.
Die Proben wurden 30 Zyklen des folgenden Programms unterzogen:
2 min bei 94°C,
1 min bei 40°C.
-
Die
Amplifikationsprodukte wurden in die kohäsiven Enden des pAMP-Vektors
(1) gemäß dem vom
Hersteller ("CloneAmp
System", Gibco BRL;
Cergy Pontoise, Frankreich) beschriebenen Protokoll kloniert. Kurz
gesagt, wurden 60 ng Amplifikationsprodukt direkt in einen Puffer
(bestehend aus 50 mMol/l KCl, 1,5 mMol/l MgCl2,
0,1% (w/v) Gelatine in 10 mMol/l Tris-HCl, pH 8,3) mit 50 ng der
pAMP-1-Vektor-DNA und 1 Einheit Uracil-DNA-Glycolsylase eingemischt.
Die Ligation wurde 30 min lang bei 37°C durchgeführt. Kompetente Zellen (200 μl) von E.
coli MC1061 wurden mit 20 μl
der Ligationsmischung transformiert. Inserts wurden anschließend aus
dem Polylinker des pAMP-Vektors durch Doppelverdau mit BamH1 und
Pst1 herausgeschnitten und dann in den Expressionsvektor pMAL (New
England Biolabs Inc., Beverly, USA), der für die Herstellung von rekombinanten
Antigenen gewählt
wurde (pILL919 bzw. pILL920, 13)
gewählt
wurde, sowie in M13mp-Bakteriophagen zur Sequenzierung subkloniert.
-
Die
Amplifikation eines Produktes, welches das ureB-Gen von H. pylori
enthielt, wurde durch PCR unter Verwendung eines Paares von 35-mer-Primern
erhalten (Satz Nr. 2, Tabelle 2). Die PCR-Reaktionsmischungen wurden
zuerst 3 min lang bei 94°C
denaturiert, dann 30 Zyklen des folgenden Programms unterzogen:
1 min bei 94°C,
1 min bei 55°C
und 2 min bei 72°C.
Das gereinigte Amplikationsprodukt (1850 bp) wurde mit EcoRI und
PstI verdaut und dann in pMAL kloniert (pILL927, 2).
Kompetente Zellen von E. coli-MC1061 wurden mit der Ligationsreaktion
transformiert.
-
H.
felis-ureB wurde in einer Zwei-Stufen-Prozedur kloniert, welche
die Herstellung sowohl von kompletten als auch von trunkierten Versionen
der UreB-Untereinheit ermöglichte.
Das Plasmid pILL213 (Tabelle 3) wurde mit den Enzymen DraI, entsprechend
der Aminosäurerest-Nummer 219
der UreB-Untereinheit, und HindIII verdaut. Das resultierende 1350
bp große
Fragment wurde gereinigt und in pMAL kloniert, welches mit XmnI
und HindIII verdaut worden war (pILL219, 2).
Um einen Klon herzustellen, der zur Synthese eines vollständigen UreB-Proteins in der Lage
war, wurden PCR-Primer entwickelt (Satz Nr. 3, Tabelle 2), welche
ein 685 bp großes
Fragment aus dem N-terminalen Teil des ureB-Gens (ausschließlich des
ATG-Codons) amplifizierten,
welches ebenfalls den Start des Inserts im Plasmid pILL219 überlappte.
Das durch PCR amplifizierte Material wurde gereinigt und mit BamHI
und HindIII verdaut und dann in pMAL kloniert (pILL221, 14). Ein 1350 bp großes PstI-PstI-Fragment, das
den restlichen Teil des UreB-Genprodukts codierte, wurde anschließend aus
pILL219 herausgeschnitten und in eine linearisierte Präparation
von pILL221 kloniert (pILL222, 14).
-
Expression von rekombinanten Ureasepolypeptiden
in dem Vektor pMAL:
-
Der
Expressionsvektor pMAL ist unter der Steuerung eines induzierbaren
Promotors (Plac) und enthält ein offenes
Leseraster (ORF), welches die Herstellung von MalE codiert (Maltose-Bindungsprotein,
MBP). Sequenzen, die in Phase mit dem letztgenannten ORF kloniert
wurden, führten
zur Synthese von MBP-fusionierten Proteinen, welche leicht auf Amyloseharz
gereinigt wurden. Von den zwei Versionen von pMAL, welche im Handel
verfügbar
sind, synthetisierte die Version, welche eine Signalsequenz nicht
codierte (d. h. pMAL-c2), größere Mengen
an rekombinanten Proteinen und wurde somit durchweg verwendet.
-
E.
coli-Klone, welche rekombinante Plasmide beherbergten, wurden hinsichtlich
der Herstellung von Fusionsproteinen gescreent, und zwar vor der
Durchführung
von Reinigungsexperimenten im großen Maßstab.
-
Reinigung von rekombinanten Ureasepolypeptiden:
-
Frische
500 ml große
Volumina an Luria-Nährbrühe, die
Carbenicillin (100 μg/ml)
und 2% (w/v) Glukose enthielten, wurden mit Übernachtkulturen (5 ml) von
E. coli-Klonen inokuliert. Die Kulturen wurden bei 37°C inkubiert
und bei 250 U/min geschüttelt,
bis der A600-Wert = 0,5 war. Vor der Zugabe
von 1 mMol/l (Endkonzentration) Isopropyl-βD-thiogalactopyranosid (IPTG)
zu den Kulturen wurde eine 1,0 ml große Probe genommen (nicht-induzierte
Zellen). Kulturen wurden für
weitere 4 h inkubiert, zu welchem Zeitpunkt eine weitere 1,0 ml große Probe
(induzierte Zellen) genommen wurde. Die nicht-induzierten und induzierten
Zellproben wurden später
mittels SDS-Page analysiert.
-
IPTG-induzierte
Kulturen wurden bei 7000 U/min 20 min lang bei 4°C zentrifugiert, und der Überstand wurde
verworfen. Pellets wurden erneut in 50 ml Säulenpuffer (200 mMol/l NaCl,
1 mMol/l EDTA in 10 mMol/l Tris-HCl, pH 7,4), der die folgenden
Proteaseinhibitoren (vertrieben von Boehringer, Mannheim, Deutschland) enthielt:
2 μMol/l
Leupeptin, 2 μMol/l
Pepstatin und 1 mMol/l Phenylmethylsulfonylfluorid (PMSF), erneut
suspendiert. Intakte Zellen wurden durch die Passagierung durch
eine French-Press-Zelle (16 000 lb/in2)
lysiert. Zelltrümmer
wur den durch Zentrifugation entfernt, und Lysate wurden in Säulenpuffer
verdünnt,
um eine Endkonzentration von 2,5 mg Protein/ml vor der Chromatographie
auf einer 2,6 cm × 20
cm großen
Säule aus Amyloseharz
(New England Biolabs) zu erhalten. Das Harz wurde mit Säulenpuffer
bei 0,5 ml/min so lange gewaschen, bis der A280-Wert
zu den Werten zurückkehrte.
Die MBP-fusionierten
rekombinanten Proteine wurden von der Säule durch Waschen mit Säulenpuffer,
der 10 mMol/l 1-Maltose enthielt, eluiert.
-
Fraktionen,
welche die rekombinanten Proteine enthielten, wurden vereinigt und
dann mehrere Male bei 4°C
gegen einen Puffer mit niedrigem Salzgehalt (der 25 mMol/l NaCl
in 20 mMol/l TrisHCl, pH 8,0, enthielt) dialysiert. Die vereinigten
Fraktionen wurden dann bei einer Fließrate von 0,5 ml/min auf eine
1,6 × 10
cm große
Anionen-Austauschsäule
(HP-Sepharose, Pharmacia, Schweden), die an ein "Hi-Load"-Chromatographiesystem (Pharmacia) angeschlossen
war, aufgetragen. Proteine wurden von der Säule unter Verwendung eines Salzgradienten
(25 mMol/l bis 500 mMol/l NaCl) eluiert. Fraktionen, welche hohe
Absorptionslesungen bei A280 ergaben, wurden
gründlich
gegen destilliertes Wasser bei 4°C
dialysiert und mittels SDS-PAGE analysiert.
-
Kaninchen-Antiseren:
-
Polyklonale
Kaninchen-Antiseren wurden gegen Gesamtzellextrakte des H. pylori-Stamms
85P (Labigne et al., 1991) und H. felis (ATCC49179) hergestellt.
Polyklonale Kaninchen-Antiseren gegen rekombinante Proteinpräparationen
von H. pylori- und H. felis-Urease-Untereinheiten wurden durch die
Immunisierung von Kaninchen mit 100 μg an gereinigtem rekombinanten
Protein in Freund'schem
vollständigem
Adjuvans (Sigma) hergestellt. Vier Wochen später erhielten Kaninchen eine
Huffrisch-Immunisierung mit 100 μg
Protein in unvollständigem
Freund'schem Adjuvans.
In der 6. Woche wurden die Tiere abschließend ausgeblutet, und die Seren
wurden bei –20°C aufbewahrt.
-
Proteinanalysen durch SDS-PAGE und Western-Blotting:
-
Solubilisierte
Zellextrakte wurden auf Flachgelen, die 4,5% Acrylamid-Sammelgel
und ein 10%iges Trenngel umfassten, gemäß der Prozedur von Laemmli
analysiert. Eine Elektrophorese wurde bei 200 V auf einer Mini-Flachgel-Apparatur
(Bio-Rad, USA) durchgeführt.
-
Proteine
wurden auf Nitrocellulosepapier in einer Mini-Trans-Blot-Transferzeile
(Bio-Rad), die 1 h lang auf 100 V eingestellt worden war, unter
Kühlung
transferiert. Nitrocellulosmembranen wurden mit 5% (w/v) Casein
(BDH, England) in Phosphat-gepufferter Kochsalzlösung (PBS, pH 7,4) unter sanftem
Schütteln
bei Raumtemperatur während
2 h blockiert. Membranen wurden bei 4°C über Nacht mit Antiseren, die
in mit PBS hergestelltem 1%igen Casein verdünnt waren, umgesetzt. Immunoreaktanten
wurden durch Verwendung von spezifischen biotinylierten sekundären Antikörpern und
Streptavidin-Peroxidase-Konjugat (Kirkegaard und Party Lab., Gaithersburg,
USA) detektiert. Reaktionsprodukte wurden auf Autoradiographie-Film
(Hyperfilm, A mersham, Frankreich) unter Anwendung einer Chemilumineszenz-Technik
(ECL-System, Amersham) visualisiert.
-
Die
Proteinkonzentrationen wurden durch das Bradford-Assay (Sigma Chemicals
Corp., St. Louis, USA) bestimmt.
-
Tierexperimente:
-
Sechs
Wochen alte, weibliche "Swiss
Specific" pathogenfreie
(SPF) Mäuse
wurden erhalten (Centre d'Elevage
R. Janvier, Le-Genest-St-Isle, Frankreich) und auf einer kommerziellen
Pellet-Diät mit Wasser
ad libitum gehalten. Die Därme
der Tiere wurden auf Abwesenheit von Helicobacter muridarum gescreent.
Für alle
orogastrischen Verabreichungen wurden 100 μl große Aliquots Mäusen unter
Verwendung von 1,0 ml großen
wegwerfbaren Spritzen zugeführt,
an welchen Polyethylenkatheter (Biotrol, Paris, Frankreich) befestigt waren.
-
Herstellung von ultrabeschallten Extrakten
und Inokula aus H. felis-Kulturen:
-
H.
felis-Bakterien wurden in PBS geerntet und bei 5 000 U/min 10 min
lang in einer Sorvall RC-5-Zentrifuge (Sorvall, USA) bei 4°C zentrifugiert.
Die Pellets wurden zweimal gewaschen und in PBS erneut suspendiert.
Bakteriensuspensionen wurden wie vorstehend beschrieben ultrabeschallt
und mindestens einem Gefrier-Auftau-Zyklus unterzogen. Proteinbestimmungen
wurden bezüglich
der Sonicate durchgeführt.
-
Um
eine virulente Kultur von H. felis für Schutzuntersuchungen sicherzustellen,
wurden H. felis-Bakterien
in vivo so lange gehalten, wie erforderlich. Kurz gesagt, wurden
Mäuse dreimal
(mit 1010 Bakterien/ml) über einen Zeitraum von 5 Tagen
inokuliert. Die Bakterien wurden aus Magenbiopsien auf Blutagarmedium
erneut isoliert (4- bis 7-tägige
Inkubation in einer mikroaeroben Atmosphäre bei 37°C). Bakterien, die zwei Tage lang
auf Blutagarplatten wachsen gelassen worden waren, wurden direkt
in Peptonwasser geerntet (Difco, USA). Bakterielle Lebensfähigkeit
und Motilität
wurde durch Phasenmikroskopie vor der Verabreichung an Tiere bestimmt.
-
Maus-Schutzstudien:
-
Fünfzig μg an rekombinantem
Antigen und 10 μg
Cholera-Holotoxin (Sigma Chemical Corp.), die beide in HCO3 resuspendiert worden waren, wurden Mäusen orogastrisch
in den Wochen 0, 1, 2 und 3 verabreicht. Mäuse, die mit ultrabeschallten
H. felis-Extrakten (die 400–800 μg Gesamtprotein
enthielten) immunisiert worden waren, wurde ebenfalls 10 μg Choleratoxin
gegeben. In der 5. Woche wurde die Hälfte der Mäuse von jeder Gruppe mit einem
Inokulum von virulenten H. felis herausgefordert. Der Rest der Mäuse erhielt
eine zusätzliche "Boost"-Immunisierung in der Woche 15. In der
Woche 17 wurden die letzteren mit einer Kultur von H. felis herausgefordert.
-
Bestimmung der H. felis-Kolonisierung
der Maus:
-
Zwei
Wochen nach dem Erhalt der Herausforderungsdosis (d. h. Woche 7
bzw. 19) wurden Mäuse durch
spinale Dislokation getötet.
Die Mägen
wurden zweimal in sterilem 0,8%igen NaCl gewaschen, und ein Teil
des gastrischen Antrums von jedem Magen wurde auf die Oberflächen von
12 cm × 12
cm großen
Agarplatten gegeben, die ein Harnstoff-Indikatormedium (2% Harnstoff,
120 mg Na2HPO4,
80 mg KH2PO4, 1,2
mg Phenol-Rot, 1,5 g Agar, hergestellt in 100 ml) enthielten. Der
Rest von jedem Magen wurde in Formal-Kochsalzlösung gegeben und solange gelagert,
bis er für
die Histologie verarbeitet wurde. Longitudinale Schnitte (4 μm) der Mägen wurden
geschnitten und routinemäßig durch
die Giemsa-Technik angefärbt.
Sofern notwendig, wurden Schnitte zusätzlich durch die Hämatoxylin-Eosin-
und Warthin-Starry-Silber-Anfärbungstechniken gefärbt.
-
Die
Anwesenheit von H. felis-Bakterien in der Mäuse-Magenschleimhaut wurde
durch den Nachweis von Ureaseaktivität (für bis zu 24 h) auf dem Indikatormedium
bestimmt, sowie durch das Screenen von mit Giemsa-angefärbten Magen-Schnitten,
welche codiert worden waren, um die Beeinflussung durch Beobachter zu
eliminieren. Die Anzahl an Bakterien in Magen-Schnitten wurden halbquantitativ gemäß dem folgenden Schema
bewertet: 0, in den gesamten Schnitten waren keine Bakterien ersichtlich;
1, überall
waren wenige Bakterien (< 20)
ersichtlich; 2, gelegentlich Hochauflösungs(H.P., high power)-Feld
mit geringen Anzahlen (< 20)
von Bakterien; 3, gelegentlich H.P.-Feld mit geringen bis mäßigen Anzahlen
(< 50) von Bakterien;
und 4, zahlreiche (> 5)
H.P.-Felder mit hohen Anzahlen von Bakterien (> 50). Mononukleäre Zell-Infiltrate wurden wie folgend
bewertet: 0, keine signifikante Infiltration; 1, Infiltration geringer
Anzahlen von mononukleären
Zellen, beschränkt
auf die Submucosa und Muscularis mucosa; 2, Infiltration mäßiger Zahlen
von mononukleären
Zellen zur Submucosa und Muscularis mucosa, manchmal unter Bildung
loser Aggregate; und 3, Infiltration großer Zahlen an mononukleären Zellen
und Aufzeigen nodulärer
Agglomerationen von Zellen.
-
ERGEBNISSE VON EXPERIMENTEN DES TEILS
II:
-
Expression von Helicobacter-Urease-Polypeptiden
in E. coli:
-
Fragmente,
die die Sequenzen enthielten, die die jeweiligen UreA-Genprodukte
von H. felis und H. pylori codierten, wurden mittels PCR amplifiziert
und in Phase mit einem ORF, das das 42-kDa große MBP codierte, vorliegend
auf dem Expressionsvektor pMAL, kloniert. Die Sequenzierung der
PCR-Produkte enthüllte kleinere
Nukleotidänderungen,
welche jedoch nicht die abgeleiteten Aminosäuresequenzen der jeweiligen Genprodukte
veränderten.
E. coli-MC1061-Zellen,
welche mit diesen rekombinanten Plasmiden (pILL919 bzw. pILL920)
transformiert waren, exprimierten Fusionsproteine mit vorausgesagten
Molekulargewichten von etwa 68 kDa. Nach der Chromatographie auf
Affinitäts-
(Amyloseharz) und Anionenaustausch-Gelmedien (Q-Sepharose) wurden diese Proteine bis
zu einem hohen Reinheitsgrad gereinigt (1). Die Ausbeute
aus 2-Liter-Kulturen von rekombinanten E. coli-Zellen betrug etwa
40 mg an gereinigtem Antigen.
-
In
entsprechender Weise wurden große
UreB-Untereinheiten von H. pylori- und H. felis-Ureasen in E. coli
(Plasmide pILL927 bzw. pILL222) exprimiert und Fusionsproteine mit
vorhergesagten Molekulargewichten von 103 kDa hergestellt. Die Ausbeute
in diesen Fällen
war deutlich niedriger als für
die UreA-Präparationen (etwa
20 mg wurden aus 2 Liter Bakterienkultur gewonnen). Außerdem traf
man auf Probleme, die mit der Abspaltung der UreB-Polypeptide von
dem MBP-Teil der
Fusionsproteine assoziiert waren. Diese Schwierigkeiten schrieb
man den hohen Größen der
rekombinanten UreB-Polypeptide zu.
-
Analyse der rekombinanten Urease-Polypeptide:
-
Westernblot-Analysen
der Antigenpräparationen
mit polyklonalen Kaninchen-Antiseren, die gegen Gesamtextrakte von
H. pylori- und H. felis-Bakterien gezüchtet worden waren, zeigten,
dass die Antigene Immunogenizität
zu den homologen sowie zu den heterologen Antiseren beibehielten
(14 und 15).
Die Antiseren erkannten nicht die MBP-Komponente allein. Die Kreuzreaktivität zwischen
den Ureasepolypeptiden von H. pylori und H. felis war konsistent
mit den hohen Identitätsgraden
zwischen den Aminosäurensequenzen von
diesen Proteinen.
-
Polyklonale
Kaninchen-Antiseren, die gegen gereinigte, aus H. pylori und H.
felis hergestellte, rekombinante UreA- und UreB-Proteine, herangezogen
worden waren, reagierten stark mit den Ureasepolypeptiden, die in
Ganzzellextrakten der Bakterien vorlagen (16).
Wie wir bereits festgestellt hatten, wanderte die UreB-Untereinheit
von H. felis-Urease etwas höher
auf SDS-PAGE-Gelen,
als es jene von H. pylori tat (16).
-
Herstellung von H. felis-Inokula, die
in Immunoschutzstudien verwendet wurden:
-
Um
die Virulenz von H. felis-Bakterieninokula sicherzustellen, wurden
Bakterien aus Mägen
von mit H. felis infizierten Mäusen
erneut isoliert (siehe Materialien und Methoden). Die Bakterien
wurden eine minimale Anzahl von Malen in vitro passagiert. Vorratskulturen,
die aus diesen Bakterien hergestellt worden waren und bei –80°C gelagert
worden waren, wurden verwendet, um frische Inokula für andere
Maus-Schutzstudien herzustellen. Diese Prozedur stellte sicher,
dass die in aufeinanderfolgenden Experimenten verwendeten Inokula reproduzierbar
waren.
-
Immunisierung von Mäusen gegen gastrische H. felis-Infektion:
-
Mäuse, welche
drei Wochen lang mit den angegebenen Antigenpräparationen immunisiert worden
waren, wurden in zwei Gruppen aufgeteilt, und eine Hälfte von
diesen wurde zwei Wochen später
mit einem H. felis-Inokulum, das 107 Bakterien/ml
enthielt, herausgefordert. Eine Gruppe von Tieren, welche mit rekombinanter
H. felis-UreA immunisiert worden war, wurde ebenfalls herausgefordert,
aber wurde im Gegensatz zu den anderen Tieren erst in Woche 19 getötet.
-
a) Schutz in der Woche 5:
-
Fünfundachtzig
% von Magen-Biopsieproben von der Kontrollgruppe von Mäusen, die
mit H. felis-Sonicatpräparationen
immunisiert worden waren, waren Urease-negativ und schienen deshalb
vor einer H. felis-Infektion geschützt gewesen zu sein (Tabelle
4). Dies steht im Vergleich zu 20% von jenen der anderen Kontrollgruppe
an Tieren, denen nur MBP allein gegeben worden war. Der Anteil von
Urease-negativen Mägen
für diese
Gruppen von Mäusen,
welchen die rekombinanten Urease-Untereinheiten gegeben worden waren,
variierte von 70% (für
H. pylori-UreB)
bis 20% (für
H. pylori-UreA).
-
Die
Grade der Bakterienkolonisation durch H. felis wurde ebenfalls aus
codierten histologischen Objektträgern, die aus gastrischem Gewebe
hergestellt wurden, bestimmt. Aufgrund der auffälligen helikalen Morphologie
von H. felis-Bakterien konnten die Organismen leicht auf den Schleimhautoberflächen sowohl
von der Magengrube als auch den glandulären Regionen des Magens gesehen
werden. Histologische Hinweise deuteten darauf hin, dass das Ausmaß des Schutzes
in Mäusen
niedriger war, als jenes, welches durch den Biopsie-Ureasetest festgestellt
wurde: 25% bzw. 20% von gastrischem Gewebe aus Mäusen, die mit H. felis-Ultraschallpräparationen
von H. pylori-UreB immunisiert worden waren, waren frei von H. felis-Bakterien.
-
Unter
bestimmten Gruppen von diesen Mäusen
legten das Vorherrschen von Urease-negativen Biopsien sowie die
niedrigeren histologischen Werte für Bakterienkolonisation (nicht
veröffentlichte
Daten) nahe, dass eine immunoprotektive Antwortreaktion in den Tieren
hervorgerufen worden war. Diese Antwortreaktion könnte jedoch
unzureichend gewesen sein, um gegen das Inokulum zu schützen, das
während
der Herausforderungsprozedur verabreicht worden war.
-
b) Schutz in der Woche 17:
-
Die
verbleibenden Mäuse
von jeder Gruppe von Tieren wurden in der Woche 15 geboostet. Diese Mäuse wurden
in der Woche 17 mit einem H. felis-Inokulum, das etwa 100-mal weniger
Bakterien als das vorausgehend verwendete enthielt, herausgefordert.
Zwei Wochen später
waren alle Magenbiopsien von den MBP-immunisierten Mäusen Urease-positiv
(Tabelle 4). Dagegen variierte die Ureaseaktivität für gastrische Biopsien von Mäusen, die
mit den rekombinanten Urease-Untereinheiten immunisiert worden waren,
von 50% für
H. pylori-UreA bis 100% für
H. felis-UreB. Das Letztere war vergleichbar zu dem Schutzgrad,
der für
die Gruppe von Tieren festgestellt worden war, die mit H. felis-Ultraschallextrakten
immunisiert worden waren. Histologische Befunde zeigten, dass die
UreB-Untereinheiten von H. felis und H. pylori 60% bzw. 25% von
immunisierten Tieren schützten.
Dies ist zu vergleichen mit einem Grad von 85%igen Schutz für Mäuse, die
mit H. felis-Ultraschallextrakten immunisiert worden waren. Die
Immunisierung von Mäusen
mit rekombinanter H. pylori-UreA schützte die Tiere nicht. In entsprechender
Weise waren die Mägen
von allen H. felis-UreA-immunisierten Mäusen, die in der Woche 5 herausgefordert
worden waren, in der Woche 19 stark mit H. felis-Bakterien kolonisiert
(Tabelle 4).
-
Der
Urease-Magenbiopsietest ergab, wenn er mit der histologischen Analyse
von Magengewebeschnitten verglichen wurde, Empfindlichkeits- und
Spezifitätswerte
von 63% bzw. 95%. Somit stellte sich die Histologie als das genauere
Vorhersagemedium einer H. felis-Infektion in der Maus heraus.
-
Zelluläre
Immunantwort in immunisierten Mägen:
-
Zusätzlich zu
der histologischen Bestimmung von H. felis-Kolonisation wurde das
gastrische Mausgewebe ebenfalls beurteilt (von 0 bis 3) bezüglich der
Anwesenheit einer mononukleären
Zellantwort. In Mäusen, die
mit MBP allein immunisiert worden waren, wurde eine milde chronische
Gastritis mit kleinen Zahlen von mononukleären Zellen festgestellt, die
auf die Muscularis mucosa und auf die Submucosa des gastrischen
Epitheliums beschränkt
waren. Im Gegensatz dazu gab es eine beträchtliche Anzahl von mononukleären Zellen, die
in den Magenschleimhäuten
von Tieren vorlagen, welche entweder mit den rekombinanten Urease-Polypeptiden
oder mit H. felis-Ultraschallpräparationen
immunisiert worden waren. Diese Entzündungszellen koaleszierten
unter Bildung entweder von losen Aggregaten in den submukosalen
Regionen des Gewebes oder nodulären
Strukturen, welche sich zu den mukosalen Regionen der gastrischen
Epithelien hin erstreckten. Die mononukleäre Zellantwort schien nicht
mit der Anwesenheit von Bakterien im Zusammenhang zu stehen, da die
Magenschleimhäute
von den mit H. felis-UreA immunisierten Mäusen, welche stark mit H. felis-Bakterien kolonisiert
waren, nur wenig oder keine mononukleären Zellen enthielten.
-
Tabelle
2: Die oligomeren Primer, die in der PCR-basierten Amplifizierung
von Ureasecodierenden Nukleotidseauenzen verwendet wurden.
- *
Degenerierte Nukleotide, in welchen alle möglichen Permutationen des genetischen
Codes eingeschlossen waren (A, T, G, C).
- G, C, T Die angeführten Nukleotide waren mit
der bzw. den spezifischen Base(n) degeneriert.
- V Restriktionsstellen, die in die amplifizierten
Fragmente eingeführt
wurden.
Tabelle 3: Verwendete Plasmide Plasmid | Vektor | Relevanter
Phänotyp oder
Charakter | Referenz |
pILL763 | pILL570 | 9,5
kb großes
Fragment (partieller Sau3a-Verdau vom
H. pylori-Chromosom) (SpR) | Cussac
et al., 1991 |
pILL199 | pILL575 | 35
kb großes
Fragment (partieller Sau3A-Verdau
vom H. felis-Chromosom) | Ferrero & Labigne, '93 |
pILL207 | pILL570 | 11
kb großes
Fragment (partieller Sau3A-Verdau
von pILL199) | Diese
Studie |
pILL919 | pMAL-C2 | 0,8
kb großes
BamHI-PstIa-Insert, welches ein das H. felis-ureA-Gen
codierendes Nukleotidfragment enthält (ApR) | Diese
Studie |
pILL920 | pMAL-C2 | 0,8
kb großes
BamHI-PstIa-Insert, welches das H. pylori-ureA-Gen codierendes
PCR-Produkt enthält | Diese
Studie |
pILL927 | pMAL-C2 | 1,8
kb großes
EcoRI-PstIa-PCR-Fragment, welches das H. pylori-ureB-Gen codiert | Diese
Studie |
pILL213 | pUC19 | 2
kb großes
Fragment, welches aus dem partiellen Sau3A-Verdau von pILL207 resultiert
(ApR) | Diese
Studie |
pILL219 | pMAL-C2 | 1,4
kb großes
DraI-HindIIIb-Insert, welches H. felis-ureB
enthält
(Base 657-1707) | Diese
Studie |
pILL
221 | pMAL-C2 | 0,7
kb großes
BamHI-PstI-PCR-Fragment, welches
H. felis-ureB codiert (Basen 4-667) | Diese
Studie |
pILL222 | pMAL-C2 | 1,35
kb großes
PstI-PstIc-Fragment, welches H. felis-ureB
(Basen 667-1707) codiert, aus pILL219, kloniert in linearisiertes
pILL221 | Diese
Studie |
Tabelle 4: Schutz von Mäusen durch
Immunisierung mit rekombinanten Ureaseproteinen. Antigen | Schutz(%)a |
Urease | Histologie |
MBP | 0% | (0/10) | 0% | (0/10) |
UreA
H. pylori | 50 | (4/8) | 0 | (0/10) |
UreA
H. felisb | 12,5 | (1/8) | 0 | (0/10) |
UreB
H. pylori | 65 | (5/8) | 25 | (2/8) |
UreB
H. felis | 100 | (7/7) | 60 | (5/7) |
H.
felis-Sonicat | 100 | (8/8) | 85 | (7/8) |
- a Die Herausforderungs-Inokulumdosis
betrug 105 Bakterien/Maus
- b Die Mäuse wurden in der Woche 5 herausgefordert
(mit 107 Bakterien) und wurden in der Woche
19 getötet.
-
BEISPIEL I
-
III – HELICOBACTER
PYLORI hspA-B-HITZESCHOCK-GENCLUSTER: NUKLEOTIDSEQUENZ; EXPRESSION
UND FUNKTION:
-
Ein
Homolog der Hitzeschockproteine (HSPs) der GroEL-Klasse, das eng
mit der Urease von Helicobacter pylori (einem Nickel-Metalloenzym)
assoziiert sein soll, wurde vor kurzem aus H. pylori-Zellen von
Dunn et al. und Evans et al. (Infect. Immun. 60:1946, 1992, 1946
bzw. 2125) gereinigt. Auf Basis der berichteten N-terminalen Aminosäuresequenz
dieses immundominanten Proteins wurden degenerierte Oligonukleotide synthetisiert,
um auf das Gen (hspB), welches das GroEL-artige Protein in dem Chromosom
des H. pylori-Stamms 85P codiert, zu zielen. Im Anschluss an die
Gen-Amplifikation wurde ein 108 Basenpaare (bp) großes Fragment,
welches die 36 ersten Aminosäuren
des HspB-Proteins codiert, gereinigt und als eine Sonde zur Identifizierung
eines rekombinanten Cosmids, welches das gesamte HspB codierende
Gen beherbergt, in der genomischen H. pylori-Bank verwendet. Das
hspB-Gen wurde auf ein 3,15 Kilobasen (kb) großes BglII-Restriktionsfragment
des Cosmids pILL684 kartiert. Die Nuldeotidsequenz dieses in den
pILL570-Plasmidvektor (pILL689) subklonierten Fragments enthüllte das
Vorhandensein von zwei offenen Leserahmen (ORFs), die als hspA und
hspB bezeichnet werden, deren Organisation sehr ähnlich mit bicistronischen
groESL-Operons von anderen Bakterienspezies war. hspA und hspB codieren
Polypeptide von 118 bzw. 545 Aminosäuren, was berechneten Molekülmassen
von 13,0 bzw. 58,2 Kilodalton (kDa) entspricht. Aminosäuresequenz-Vergleichsstudien
enthüllten
i) dass das H. pylori HspA- und HspB-Protein sehr ähnlich zu
ihren bakteriellen Homologen waren; ii) dass das HspA-H. pylori-Protein
ein auffallendes Motiv am Carboxyl-Terminus aufzeigt, das anderen bakteriellen
GroEs-Homologen fehlt; dieses einmalige Motiv besteht aus einer
Reihe von acht Histidinresten, die einer Metall bindenden, wie etwa
einer Nickel bindenden, Domäne ähneln. Überraschenderweise
wurde unmittelbar stromaufwärts des
Genclusters ein IS5-Insertionselement gefunden, das in dem H. pylori-Genom fehlte,
und wurde positiv während
des Cosmid-Klonierungsverfahrens selektioniert. Die IS5, so wurde
herausgefunden, ist an der Expression der hspA- und hspB-Gene in
pILL689 beteiligt. Die Expression der HspA- und HspB-Proteine von
dem pILL689-Plasmid aus wurde in einem Minizellen produzierenden
Stamm analysiert. Beide Polypeptide, so wurde gezeigt, werden konstitutiv
in den E. coli-Zellen exprimiert. Wenn das rekombinante pILL689-Plasmid
zusammen mit dem H. pylori-Urease-Gencluster in einen E. coli-Wirtsstamm
eingeführt
wurde, war ein Anstieg der Urease-Aktivität zu beobachten, was auf eine
enge Wechselbeziehung zwischen den Hitzeschockproteinen und dem
Ureaseenzym hindeutet. Das Konzept einer spezifischen Funktion für das HspA-Chaperon
wurde durch die Tatsache gestützt,
dass, während
eine einzelne hspB-Kopie im H. pylori-Genom gefunden wurde, zwei
Kopien des hspA in dem Genom gefunden wurden, eine gekoppelt mit dem
hspB-Gen und eine nicht gekoppelt mit dem hspB-Gen. Versuche, isogene
Mutanten von H. pylori hinsichtlich des hspA- und des hspB-Gens
zu konstruieren, waren ohne Erfolg, was darauf hindeutet, dass diese Gene
für das Überleben
der Bakterien essentiell sind.
-
EXPERIMENTELLE PROZEDUREN FÜR TEIL III:
-
Bakterienstämme, Plasmide und Kulturbedingungen:
-
Die
Klonierungsexperimente wurden mit genomischer DNA durchgeführt, die
aus dem H. pylori-Stamm 85P hergestellt wurde. Der H. pylori-Stamm
N6 wurde wegen seiner günstigen
Transformierbarkeit als Empfengerstamm für die Elektroporationsexperimente
verwendet. Der E. coli-Stamm
HB101 oder der Stamm MC1061 wurden als ein Wirt für Cosmid-Klonierungs-
bzw. -Subklonierungsexperimente verwendet. E. coli P678-54 wurde
für die
Herstellung von Minizellen verwendet. In dieser Studie verwendete
Vektoren und rekombinante Plasmide sind in Tabelle 1 aufgeführt. H.
pylori-Stämme
wurden auf Pferdeblut-Agar-Platten wachsen gelassen, die mit Vancomycin
(10 mg/l), Polymyxin B (2500 U/I), Trimethoprim (5 mg/l) und Amphotericin
B (4 mg/l) ergänzt
waren. Platten wurden bei 37°C
unter mikroaeroben Bedingungen in einem anaeroben Gefäß mit einer
Kohlendioxid-Generator-Hülle
(BBL 70304) inkubiert. E. coli-Stämme wurden in L-Kulturlösung ohne
Glucose (10 g Trypton, 5 g Hefeextrakt und 5 g NaCl pro Liter; pH-Wert
7,0) oder auf L-Agar-Platten (1,5% Agar) bei 37°C gezüchtet. Für die Messung der Urease-Aktivität bestand
das verwendete Strickstoff-begrenzende Medium aus Ammoniumfreiem
M9-Minimal-Agarmedium (pH-Wert 7,4), das 0,4% D-Glucose als Kohlenstoffquelle
enthielt, und dem frisch zubereitetes filtersterilisiertes L-Arginin
zu einer Endkonzentration von 10 mM zugegeben wurde. Die Antibiotika-Konzentrationen
für die
Selektion rekombinanter Klone waren wie folgt (in Milligramm pro
Liter): Kanamycin, 20; Spectinomycin, 100; Carbenicillin, 100.
-
Herstellung von DNA:
-
Genomische
DNA von H. pylori wurde wie zuvor beschrieben hergestellt. Cosmid-
und Plasmid-DNAs wurden
durch eine alkalische Lyse-Prozedur hergestellt, gefolgt von einer
Reinigung in Cäsiumchlorid-Ethidiumbromid-Gradienten,
wie früher
beschrieben.
-
Cosmid-Klonierung:
-
Die
Konstruktion der Cosmid-Genbank von H. pylori 85P in E. coli HB101,
die für
die Klonierung des H. pylori-hspA-B-Genclusters verwendet wurde,
ist früher
beschrieben worden.
-
DNA-Analyse und Klonierungsmethodik:
-
Restriktions-Endonuldeasen,
T4 DNA-Ligase, das große
DNA-Polymerase-I(Klenow)-Fragment und Taq-Polymerase wurden von
Amersham, T4-DNA-Polymerase von Biolabs und Kälberdarm-Phosphatase von Pharmacia
bezogen. Alle Enzyme wurden entsprechend den Anleitungen der Hersteller
verwendet. DNA-Fragmente wurden auf Agarosegelen, die in Tris-Acetat-Puffer
laufen gelassen wurden, separiert. Die 1-kb-Leiter von Bethesda
Research Laboratories wurde als ein Fragmentgrößenstandard verwendet. Erforderlichenfalls wurden
die DNA-Fragmente durch Elektroelution aus Agarosegelen wie früher beschrieben
isoliert und aus dem Laufpuffer mittels einer Elutip-d-Minisäule (Schleicher
und Schuell, Dassel, Deutschland) gewonnen. Grundlegende DNA-Manipulationen
wurden gemäß den von
Sambrook et al. beschriebenen Protokollen durchgeführt.
-
Hybridisierung:
-
Kolonie-Blots
zum Screening der H. pylori-Cosmid-Bank und für die Identifizierung von Subklonen wurden
auf Nitrozellulose-Membranen (Schleicher und Schuell, Dassel, Deutschland)
gemäß dem Protokoll von
Sambrook et al. (43) hergestellt. Die radioaktive Markierung von
PCR-Produkten wurde durch Zufalls-Priming durchgeführt, wobei
als Primer Zufalls-Hexamere von Pharmacia verwendet werden. Kolonie-Hybridisierungen
wurden unter hochstringenten Bedingungen durchgeführt (5 × SSC, 0,1%
SDS, 50% Formamid, 42°C) (1 × SSC; 150
mM NaCl, 15 mM Natriumcitrat, pH-Wert 7,0). Für Southern-Blot-Hybridisierungen
wurden DNA-Fragmente
aus Agarosegelen auf Nitrozellulose-Blätter übertragen (0,45 μm Porengröße; Schleicher & Schuell, Inc.),
und unter niederstringenten Bedingungen hybridisiert (5 × SSC, 0,1%
SDS, 30 oder 40% Formamid bei 42°C
mit 32P-markierten Desoxyribonukleotid-Sonden.
Die Hybridisierung wurde durch Autoradiographie mit Hilfe von Amersham
Hyperfilm-MP offenbart.
-
DNA-Sequenzierung:
-
Geeignete
Fragmente von Plasmid-DNA wurden in M13 mp 18/19-Vektoren subkloniert.
Einsträngige DNA
wurde durch Phageninfektion des E. coli-Stamms JM101 hergestellt.
Die Sequenzierung erfolgte durch das Didesoxynukleotid-Kettenabbruchverfahren
unter Verwendung des Sequenase-Kits von United States Biochemicals.
Sowohl der M13-Universalprimer als auch zusätzliche spezifische Primer
(1) wurden zur Sequenzierung sowohl der codierenden
als auch der nicht-codierenden DNA-Stränge verwendet. Die Sequenzierung
doppelsträngiger
DNA erfolgte wie zuvor beschrieben. Eine direkte Sequenzierung von
PCR-Produkt wurde im Anschluss an die Reinigung des amplifizierten,
elektroeluierten PCR-Produkts durch eine Elutip-d-Minisäule (Schleicher & Schuell) durchgeführt. Das
klassische Protokoll für
die Sequenzierung mit Hilfe des Sequenase-Kits wurde dann mit den
folgenden Modifizierungen verwendet: PCR-Produkt wurde durch Kochen von Annealing-Mischung,
die 200 Pikomol des als Primer verwendeten Oligonukleotids und DMSO
zu der Endkonzentration von 1% enthielt, während 3 Minuten denaturiert;
die Mischung wurde dann sofort auf Eis gekühlt; der Markierungsschritt
wurde in Gegenwart von Manganionen (mM) durchgeführt.
-
Elektroporation von H. pylori:
-
In
dem Bestreben, H. pylori-Mutanten zu konstruieren, wurden passende
Plasmidkonstruktionen, welche das angezielte Gen trugen, das durch
eine ein Kanamycin-Resistenzgen (aph3'-III) enthaltende Kassette disruptiert
war, in den H. pylori-Stamm N6 mittels Elektroporation wie zuvor
beschrieben transformiert. Plasmid pSUS 10, welches das Kanamycin-disruptierte
flaA-Gen beherbergte, wurde als Positivkontrolle der Elektroporation
verwendet. Nach der Elektroporation wurden Bakterien auf nicht-selektiven
Platten für
einen Zeitraum von 48 h wachsen gelassen, um die Expression der
Antibiotikum-Resistenz zu ermöglichen,
und anschließend auf
Kanamycin enthaltende Platten übertragen.
Die Selektionsplatten wurden bis zu 6 Tage lang inkubiert.
-
Polymerase-Kettenreaktion (PCR):
-
PCRs
wurden mit Hilfe eines Perkin-Elmer Cetus-Thermozyklergeräts unter
Verwendung des GeneAmp-Kits (Perkin-Elmer Cetus) durchgeführt. Die
klassische Amplifikationsreaktion beinhaltete 50 Pikomol (pmol)
jedes Primers und mindestens 5 pmol der Ziel-DNA. Die Ziel-DNA wurde
vor der Zugabe zu der Amplifikationsreaktion wärmedenaturiert. Die Reaktion
bestand aus 25 Zyklen der folgenden drei Schritte: Denaturierung
(94°C für 1 Minute),
Annealing (bei Temperaturen im Bereich zwischen 42 und 55°C, in Abhängigkeit von
den berechneten Schmelztemperaturen der Primer, während 2
min) und Verlängerung
(72°C während 2 min).
Wenn degenerierte Oligonuldeotide unter nicht-stringenten Bedingungen
verwendet wurden, wurden bis zu 1000 pmol von jedem Oligonuldeotid
zugegeben, 50 Zyklen wurden durchgeführt, und ein Annealing erfolgte
bei 42°C.
-
Analyse von in Minizellen exprimierten
Proteinen:
-
Minizellen,
welche das geeignete Hybridplasmid beherbergten, wurden isoliert
und mit [35S]-Methionin (50 μCi/ml) markiert. Ungefähr 100 000
cpm mit Aceton ausfällbares
Material wurden einer Natriumdodecylsulfat(SDS)-Polyacrylamidgel-Elektrophorese
in einem 12,5%igen Gel unterworfen. Standard-Proteine mit Molekulargewichten
im Bereich von 94 000 bis 14 000 ("low <"-Molekulargewichte-Kit
von Bio-Rad Laborstories) wurden parallel laufen gelassen. Das Gel
wurde angefärbt
und durch Fluorographie unter Verwendung von En3Hance
(New England Nuclear) untersucht.
-
Urease-Aktivität:
-
Die
Urease-Aktivität
wurde durch die Berthelot-Reaktion unter Anwendung einer Modifizierung
der Prozedur quantifiziert, die bereits beschrieben wurde. Urease-Aktivität wurde
als Mikrocool Harnstoff, der pro Minute pro Milligramm bakterielles
Protein hydrolysiert wurde, exprimiert.
-
RESULTATE DER TEIL-III-EXPERIMENTE:
-
Identifizierung eines rekombinanten Cosmids,
welches das Helicobacter-pylori-GroEL-artige Hitzeschockprotein codierende
Gen beherbergt:
-
Auf
Basis der veröffentlichten
N-terminalen Aminosequenz des gereinigten Hitzeschockproteins von H.
pylori wurden zwei degenerierte Oligonukleotide synthetisiert, um
auf das Gen von Interesse im Chromosom des H. pylori-Stamms 85P
zu zielen. Das erste 5'-G
C N A A R G A R A T H A A R T T Y T C N G-3', worin N für die vier Nukleotide steht,
R = A und G, Y = T und C, H = T, C und A, ist von den ersten 8 Aminosäuren des Proteins
(AKEIKFSD) abgeleitet; das zweite 5'–C
R T T N C K N C C N C K N G G N C C C A T-3', worin K = G und T ist, entspricht
den komplementären
Codons, welche die Aminosäure
von Position 29 bis Position 36 spezifizieren (MGPRGRNV, Ref.).
Die erwartete Größe für das PCR-Produkt
war 108 Basenpaare (bp). Die Amplifikationsreaktion wurden unter
wenig stringenten Bedingungen durchgeführt, wie im Abschnitt "Materialien und Verfahren" beschrieben wird,
und führte
zu der Synthese von sechs Fragmenten mit einer Größe im Bereich
von 400 bp bis 100 bp. Die drei kleinsten Fragmente wurden aus einem
Acrylamidgel elektroeluiert und gereinigt. Die direkte Sequenzierung
der PCR-Produkte ermöglichte
die Identifizierung eines DNA-Fragments, welches eine Aminosäuresequenz,
die der veröffentlichten
Sequenz entspricht, codiert. Dieses Fragment wurde daher markiert
und als Sonde bei der Kolonie-Hybridisierung eingesetzt, um rekombinante
Cosmide zu identifizieren, welche Homologie zu einem 5'-Segment des H. pylori-GroEL-artigen
codierenden Gens zeigen; dieses Gen wurde weiter als hspB bezeichnet.
Die Gen-Bank besteht aus 400 unabhängigen Kanamycin-resistenten
E. coli-Transduktanten, welche rekombinante Cosmide beherbergen.
Von diesen hybridisierte ein einziger Klon mit der Sonde und beherbergte
ein als pILL684 bezeichnetes rekombinantes Plasmid mit einer Größe von 46
kb. Die niedrige Frequenz, die beim Detektieren des hspB-Gens (1
von 400) beobachtet wurde, war unüblich im Vergleich mit derjenigen
von mehreren klonierten Genen, die beständig in fünf bis sieben rekombinanten
Cosmiden detektiert wurden. Um das hspB-Gen zu identifizieren, wurden
Fragmente mit Größen von
3 bis 4 kb durch partielle Restriktions-Behandlung der pILL684-Cosmid-DNA mit Endonuklease Sau3A
erzeugt, gereinigt und in die BgIII-Stelle von Plasmidvektor pILL570
ligiert. Von 100 Subklonen waren x positive Klone, und einer wurde
weiter untersucht (pILL689); er enthält ein 3,15 kb großes Insert,
flankiert von zwei BgIII-Restriktionsstellen, das im Detail kartiert
wurde (5). Unter Verwendung der PCR-32P-markierten Sonde wurde herausgefunden,
dass das 5'-Ende
des hspB-Gens auf dem zentralen 632 bp großen HindIII-Sphl-Restriktionsfragment
von pILL689 kartiert, was ein Hinweis darauf ist, dass man das Vorhandensein
des gesamten hspB-Gens in dem rekombinanten Plasmid pILL689 erwarten
könnte.
-
DNA-Sequenz und abgeleitete Aminosäuresequenz
des H. pylori-hspA-B-Genclusters:
-
Die
3200 bp von pILL689, veranschaulicht in 5, wurden
durch Klonieren der asymmetrischen Restriktionsfragmente BglI-SphI,
SphI-HindIII, HindIII-BglII in M13mp18 und M13mp19 sequenziert;
jedes klonierte Fragment wurde unabhängig auf beiden Strängen sequenziert,
16 Oligonukleotid-Primer (1) wurden synthetisiert,
um die Ablesung zu bestätigen
und/oder um Sequenzen zu erzeugen, welche die unabhängig sequenzierten
Fragmente überlappen;
diese wurden als Primer in Doppelstrang-DNA-Sequenzierungsanalysen
verwendet.
-
Die
Analyse der Sequenz enthüllte
zwei unterschiedliche genetische Elemente. Erstens das Vorliegen von
zwei offenen Leserahmen (ORFs), in 5 dargestellt,
die in der gleichen Richtung transkribiert werden, die mit hspA
und hspB bezeichnet wurden. Die Nukleotidsequenz und die abgeleitete
Aminosäuresequenz
der zwei ORFs sind in 6 gezeigt. Das
erste Codon von hspA beginnt 323 bp stromaufwärts der links gelegenen HindIII-Stelle
von pILL689 (5) und diesem geht eine Shine-Dalgarno-Ribosomenbindungsstelle
(RBS) (GGAGAA) voraus. Der hspA-ORF
codiert für
ein Polypeptid von 118 Aminosäuren.
Das Initiations-Codon für den
hspB-ORF beginnt 25 Nukleotide stromabwärts des hspA-Stopp-Codons;
diesem geht eine RBS-Stelle (AAGGA) voraus. Der hspB-ORF codiert
ein Polypeptid von 545 Aminosäuren
und wird durch ein TAA-Codon terminiert, gefolgt von einer palindromischen
Sequenz, die einem Rhounabhängigen
Transkriptons-Terminator ähnelt
(freie Energie, ΔG
= –19,8
kcal/Mol) (6). Die N-terminae Aminosäuresequenz
des abgeleiteten Proteins HspB war identisch mit der N-terminalen Sequenz
des gereinigten H. pylori-Hitzeschockproteins, das zuvor mit der
Ausnahme des N-terminalen Methionins veröffentlicht wurde, welches bei
dem gereinigten Protein fehlt und posttranslational entfernt werden
könnte,
was zu einem reifen Protein von 544 Aminosäuren führt.
-
Die
abgeleiteten Aminosäuresequenzen
von H. pylori-HspA und HspB wurden mit mehreren Aminosäuresequenzen
von HSPs der GroES- und GroEL-Klasse verglichen (7).
HspB zeigte eine hohe Homologie auf der Aminosäureebene mit dem Legionella
pneumophilia-HtpB-Protein
(82,9% Ähnlichkeiten),
mit dem Escherichia coli-GroEL-Protein (81,0% Ähnlichkeiten), mit dem Chlamydia
psittaci- oder C. trachomatis-HypB-Protein (79,4% Ähnlichkeiten),
mit Clostridium perfringens-Hsp60-Protein (80,7% Ähnlichkeiten)
und in einem geringeren Maße
mit den GroEL-artigen Proteinen von Mycobacterium. Allerdings zeigte
wie nahezu alle GroEL-Homologa H.pylori-HspB das konservierte Carboxyl-Terminus-Glycin-Methionin-Motiv (MGGMGGMGGMGGMM),
welches, wie vor kurzem gezeigt wurde, in dem E. coli-GroEL-Chaperonin verzichtbar
ist. Der Homologiegrad auf der Aminosäureebene zwischen dem H. pylori-HspA-Protein
und den anderen GroES-artigen Proteinen ist in 7 gezeigt.
Die gezeigte Alignierung weist ein auffallendes Motif am Carboxyl-Terminus
des H. pylori-HspA-Proteins auf, das anderen bakteriellen GroES-Homologa
fehlt. Dieses einmalige, stark geladene Motiv besteht aus 27 zusätzlichen
Aminosäuren,
die zur Bildung einer Schleife zwischen zwei doppelten Cystein-Resten
fähig sind;
von den 27 Aminosäuren
sind 8 Histidin-Reste, die in hohem Maße an eine Metall bindende
Domäne
erinnern.
-
Das
zweite genetische Element, das durch die Sequenzanalyse enthüllt wurde,
war das Vorhandensein einer Insertionssequenz (IS5) 84 bp stromaufwärts des
hspA-Gens. Die Nuldeotidsequenz dieses Elements passte perfekt zu
der zuvor für
IS5 in E. coli beschriebenen, mit dem Vorhandensein einer 16-Nukleotid-Sequenz
(CTTGTTCGCACCTTCC), die einer der zwei invertierten Repeats entspricht,
welche das IS5-Element flankieren. Aufgrund der perfekten Übereinstimmung
auf DNA-Ebene vermuteten wir, dass IS5 anfänglich nicht in dem H. pylori-Chromosom vorhanden
war, sondern vielmehr stromaufwärts
des hspA-HspB-Genclusters während
des Klonierungsverfahrens inseriert worden war, eine Hypothese,
die durch weitere Analysen bestätigt
werden musste.
-
Identifizierung der stromaufwärts gelegenen
Sequenz des hspA-B-Genclusters im H. pylori-Chromosom:
-
Das
Vorhandensein des IS5 wurde durch Gen-Amplifikation unter Verwendung
von zwei Oligonuldeotiden überprüft, wobei
eines sich innerhalb des IS5-Elements befand und das andere sich
stromabwärts
des IS5-Elements befand (Oligo #1 und #2, 6),
um auf eine putative Sequenz i) im Chromosom vom H. pylori-Stamm
85P, ii) in dem anfänglichen
Cosmid pILL684 und iii) in den 100 Subklonen, die aus der partiellen Sau3A-Restriktion
des rekombinanten Cosmids pILL684 resultieren, zu zielen. IS5 fehlte
bei dem Chromosom von H. pylori und lag in den allerersten Subkulturen
des E. coli-Stamms vor, welcher das Cosmid pILL684 beherbergte.
Unter den 100 pILL684-Subklon-Derivaten, die die gesamte oder einen
Teil der IS5-Sequenz zu enthalten schienen, suchten wir dann nach
einem Subklon, welcher die linke Endseite des IS5 plus die ursprüngliche
stromaufwärtsgelegene
Sequenz des hspA-hspB-Genclusters beherbergte. Die ses Screening
erfolgte durch Restriktionsanalyse der verschiedenen durch partielle
Sau3A-Behandlung
erzeugten Subklone. Die Resktriktionskarte von einem (pILL694) der
Plasmide, welches diese Kriterien erfüllt, ist in 5 gezeigt.
Die linke Endseite der 155-Nukleotidsequenz wurde bestimmt; das
Vorhandensein einer 4-bp-Duplikation CTAA auf beiden Seiten der
invertierten 16-bp-Repeats des IS5-Elements (6)
ermöglichte
uns den Nachweis des kürzlich
erfolgten Erwerbs des IS5-Elements durch Transposition. Eine 245-Nukleotid-Sequenz
wurde danach bestimmt, die unmittelbar stromaufwärts des IS5-Elements kartiert
wurde (in 6 gezeigt). Diese Sequenz
besteht aus einer nicht-codierenden Region, in welcher das Vorhandensein
einer putativen Consensus-Hitzschock-Promotorsequenz detektiert
wurde; sie zeigt eine perfekt konservierte – 35-Region (TAACTCGCTTGAA)
und eine weniger übereinstimmende – 10-Region (CTCAATTA).
Zwei Oligonukleotide (#3 und #4, in 2 gezeigt)
wurden synthetisiert, welche auf Sequenzen, die auf beiden Seiten
des in dem rekombinanten Cosmid vorhandenen IS5-Elements gelegen
waren, kartierten; diese zwei Oligonukleotide sollten zu der Amplifikation
eines X) (bp-Fragments, wenn die IS5-Sequenz vorhanden ist, und
eines Fragment in Abwesenheit des IS5 führen. Die Resultate der PCR-Reaktion,
in der als Ziel-DNA das pILL684-Cosmid, das pILL694-Plasmid und
das H. pylori 85P-Chromosom verwendet wurden, stimmen mit den Vorhersagen überein (Ergebnisse
nicht gezeigt). Darüber
hinaus wurde eine direkte Sequenzierung des von dem H. pylori-Chromosom
erhaltenen PCR-Produkts durchgeführt
und bestätigte
die stromaufwärts
gelegene rekonstruierte hspA-hspB-Sequenz, die in 6(B) gezeigt
ist. Um die genetische Organisation der gesamten sequenzierten Region
weiter zu bestätigen,
wurden zwei Sonden durch Gen-Amplifikation des pILL689-Plasmids
unter Verwendung der Oligonukleotide #5 und #6, und #7 und #8 hergestellt
(6); diese wurden als Sonden in Southern-Hybridisierungsexperimenten
unter wenig stringenten Bedingungen gegen einen HindIII-Verdau des H.
pylori-85P-Chromosoms verwendet. Die Ergebnisse zeigen, dass keine
andere detektierbare Neuanordnung während des Klonierungsvorgangs
aufgetreten ist (Daten nicht gezeigt). Diese Experimente gaben uns die
Möglichkeit,
nachzuweisen, dass obgleich eine einzelne Kopie des hspB-Gens in
dem Chromosom vom H. pylori-Stamm 85 vorlag, doch zwei Kopien des
hspA-Gens durch Southern-Hybridisierung detektiert wurden.
-
Analyse von in Minizellen exprimierten
Polypeptiden:
-
Die
rekombinanten Plasmide pILL689 und die pILL692 und die jeweiligen
Klonierungsvektoren pILL570 und pACYC177 wurden durch Transformation
in E. coli P678-54, einen Minizellen erzeugenden Stamm, eingeführt. Die
Plasmide pILL689 und pILL692 (5) enthalten
das gleiche 3,15 kb große
Insert, das in die zwei Vektoren kloniert wurde. pILL570 enthält stromaufwärts der
Mehrfachklonierungsstelle einen Stopp der Transkription und der
Translation; die Orientierung des Inserts in pILL689 erfolgte auf
solche Weise, dass der Transkription-Stopp stromaufwärts des
IS5-Fragments und damit stromaufwärts der hspA- und hspB-Gene lokalisiert
war. Zwei Polypeptide, die mit Polypeptiden mit apparenten Molekulergewichten
von 60 kDa und 14 kDa migrierten, wurden klar in Minizellenexperimenten
von pILL689 und pILL692 detektiert (Ergebnisse nicht gezeigt), wohingegen
sie bei den entsprechenden Vektoren fehlten; diese Resultate waren
ein Hinweis darauf, dass die hspA- und hspB-Gene konstitutiv von
einem innerhalb des IS5-Elements befindlichen Promotors exprimiert
wurden. Außerdem
stimmte zwar die Menge der auf dem SDS-Gel visualisierten Polypeptide
gut mit der Kopienzahl der jeweiligen Vektoren überein, doch deutete die Intensität der zwei
Polypeptid-Banden auf eine polycistronische Transkription der zwei
Gene hin.
-
Versuche, die Rolle der HspA- und HspB-Proteine
zu verstehen:
-
Zwei
Disruptionen von Genen wurden in E. coli durch Inserieren der zuvor
beschriebenen Km-Kassette
innerhalb des hspA- oder des hspB-Gens der Plasmide pILL686 und
pILL691 erreicht. Dies erfolgte, um die disruptierten Gene in H.
pylori durch Elektroporation rückzuführen und
hinsichtlich eines allelischen Austauschs zu selektieren. Das resultierende
Plasmid pILL696 codierte eine trunkierte Form des HspA-Proteins, was
der Deletion der C-terminalen Endaminosäuresequenz entspricht; in diesem
Plasmid war die Km-Kassette so inseriert, dass der Promotor des
Km-Gens als Promotor für
das stromabwärts
gelegene hspB-Gen dienen konnte. Die pILL687- und pILL688-Plasmide resultierten aus
der Insertion der Km-Kassette in jeder Orientierung innerhalb des
hspB-Gens. Keines dieser Konstrukte führte zur Isolierung von Kanamycin-Transformanten des
H. pylori-Stamms N6, als gereinigte pILL687-, pILL688-, pILL696-Plasmide (Tabelle
2, 5) in Elektroporationsexperimenten verwendet wurden,
wohingegen dies bei dem als Positivkontrolle verwendeten pSUS 10-Plasmid
immer der Fall war. Diese Ergebnisse deuten daraufhin, dass das
H. pylori-HspA- und -HspB-Protein essentielle Proteine für das Überleben
von H. pylori sind.
-
Aufgrund
von i) der beständigen
Beschreibung in der Literatur einer engen Assoziation des HspB-Proteins
mit den Urease-Untereinheiten; ii) der einmaligen Struktur des HspA-Proteins,
wobei die C-terminale Sequenz an eine Nickel-bindende Domäne erinnert,
und iii) des Fehlens von lebensfähigen
hspA- und/oder hspB-Mutanten von H. pylori versuchten wir, eine
Rolle der H. pylori-Hsp-Proteine in Beziehungen mit der H. pylori-Urease
durch funktionelle Komplementierungsexperimente in E. coli nachzuweisen.
Plasmide pILL763 oder pILL753 (beides pILL570-Derivate, Tabelle
5), welche den Urease-Gencluster codieren, wurden mit dem kompatiblen
pILL692-Plasmid (pACYC177-Derivat) eingeführt, das konstitutiv die HspA-
und HspB-Polypeptide
exprimiert, wie in Minizellen sichtbar gemacht wurde. In beiden
Komplementierungen erlaubt die Expression der HspA- und HspB-Proteine
in derselben E. coli-Zelle eine dreifache Zunahme der Urease-Aktivität im Anschluss
an die Induzierung der Ureasegene auf Minimalmedium, das mit 10
mM L-Arginin als begrenzende Stickstoffquelle ergänzt wurde.
Tabelle
5: In dieser Studie verwendete Vektoren und Hybridplasmide |
Plasmid | Vektor | Größe (kb) | Charakteristika
(a) | Quelle oder Referenz |
| pILL575 | 10 | Mob,
Cos, Km | – |
| pILL570 | 5,3 | Mob,
Sp | – |
| pACYC
177 | 3,9 | Ap,
Km | – |
pILL600 | pBR322 | 5,7 | Ap,
Km, Quelle von Km-Kassette | – |
pILL684 | pILL575 | 46 | Mob,
Km, Cosmid, enthaltend H. pylori hspA-B | Partieller Sau3A-Verdau
von H. pylori 85P DNA |
pILL685 | pILL570 | 9,29 | Mob,
Sp, Plasmid, enthaltend H. pylori hspB | Partieller Sau3A-Verdau
von pILL684 |
pILL686 | pUC19*c* | 4,5 | Ap,
Plasmid, enthaltend H. pylori hspB | 1,9-kb-BglII-Cla pILL685,
kloniert in pUC19* |
| pUC19*(c) | 5,9 | Ap,
Km, H. pylori hspB Ω Km-Orientierung A(b) | 1.4-kb-SmaI-SmaI pILL600,
kloniert in pILL686 |
pILL688 | pUC19*(c) | 5,9 | Ap,
Km, H. pylori hspB Ω Km-Orientierung B(b) | 1.4-kb-SmaI-SmaI pILL600,
kloniert in pILL686 |
pILL689 | pILL570 | 8,45 | Mob,
Sp, Plasmid, enthaltend H. pylori hspA-B | Partieller Sau3A-Verdau
von pILL684 |
pILL691 | pUC19**(c) | 3,9 | Ap,
Plasmid, enthaltend H. pylori hspA 1,3-kb | SphI-SphI pILL689, kloniert
in pUC19** |
pILL692 | pACYC177 | 7,05 | Ap,
Km, Plasmid, enthaltend H. pylori hspA-B | 3,15-kbBglII pILL689,
kloniert in pACYC177 |
pILL694 | pILL570 | 8,7 | Sp,
Plasmid, enthaltend linkes Ende von IS5 | Partieller Sau3A-Verdau
von pILL684 |
pILL696 | pUC19**(c) | 5,3 | Ap,
Km, H. pylori hspA Ω Km-Orientierung A(b) | 1,4-kb SmaI-SmaI pILL600,
kloniert in pILL691 |
pSUS
10 | pIC20R2 | 7,7 | Ap,
Km H. pylori flaA Ω Km | – |
pILL753 | pILL570 | 16,5 | Sp,
Plasmid, enthaltend ureA, B, C, D, E, F, G, H, I | – |
pILL763 | pILL570 | 14,75 | Sp,
Plasmid, enthaltend ureA, B, E, F, G, H, I | – |
(a) Mob,
konjugatives Plasmid infolge des Vorhandenseins von OriT; Ap, Km
und Sp, Resistenz gegen Ampicillin, Kanamycin bzw. Spectinomycin;
Cos, Vorhandensein von Lambda cos-Stelle
(b) Orientierung A
gibt an, dass der Kanamycin-Promotor die Transkription bei der gleichen
Orientierung wie diejenige des Gens, wo die Kassette inseriert wurde,
initiiert; Orientierung B, das Gegenteil.
(c) pUC19* und pUC19**:
Derivate von pUC19-Vektor, in welchem die SphI bzw. HindIII-Stelle
endgefüllt wurden
unter Verwendung derKlenow-Polymerase und selbst-religiert wurden. |
-
BEISPIEL II
-
IV – EXPRESSION,
REINIGUNG UND IMMUNOGENE EIGENSCHAFTEN VON H. PYLORI-HSPA UND -HSPB:
-
EXPERIMENTELLE PROZEDUR FÜR TEIL IV:
-
Expression und Reinigung von rekombinanten
Fusionsproteinen:
-
Die
MaIE-HspA- und MalE-HspB-Fusionsproteine wurden, nach der Klonierung
der zwei Gene innerhalb des pMAL-c2-Vektors wie im Abschnitt "Ergebnisse" beschrieben unter
Verwendung der folgenden Primer, exprimiert:
-
Zwei
Liter Luria-Medium, das Glucose (30%) und Ampicillin (100 μg/ml) enthielt,
wurden mit 20 ml einer Übernachtkultur
von Stamm MC1061 inokuliert, welche das Fusionsplasmid enthielt,
und unter Schütteln bei
37°C inkubiert.
Als die OD600 der Kultur 0,5 erreichte, wurde IPTG (bei einer Endkonzentration
von 10 mM) zugegeben, und die Zellen wurden für weitere 4 Stunden inkubiert.
Zellen wurden durch Zentrifugation (5000 U/min während 30 min bei 4°C) geerntet,
in 100 ml Säulenpuffer,
bestehend aus 10 mM Tris-HCl, 200 mM NaCl, 1 mM EDTA, ergänzt mit
Proteaseinhibitoren [(Leupeptin (2 μM) – Peptstatin (2 μm) – PMSF (1
mM) – Aprotinin
(1:1000-Verdünnung)],
erneut suspendiert und durch eine French-Press laufen gelassen.
Nach der Zentrifugation (10 000 U/min während 20 min bei 4°C) wurde
der Überstand
rückgewonnen
und verdünnt (2-fach)
mit Säulenpuffer.
Das Lysat wurde durch einen 0,2-μm-Nitrocellulosefilter
filtriert, bevor das Auftragen auf ein voräquilibriertes Amyloseharz (22 × 2,5 cm)
erfolgte. Die Fusionsproteine wurden mit einer 10-mM-Maltoselösung, die
in Säulenpuffer
hergestellt wurde, eluiert, und die Fraktionen, welche die Fusionsproteine
enthielten, wurden vereinigt, gegen destilliertes Wasser dialysiert
und lyophilisiert. Fusionsproteine wurden erneut in destilliertem
Wasser bei einer Endkonzentration von 2 mg lyophilisiertem Material/ml
suspendiert und bei –20°C aufbewahrt.
Die Konzentration und Reinheit der Präparate wurden durch das Bradford-Protein-Assay (Sigma
Chemicals) und SDS-PAGE-Analysen kontrolliert.
-
Nickel bindende Eigenschaften von rekombinanten
Proteinen:
-
E.
coli MC1061-Zellen, die entweder den pMAL-c2-Vektor oder rekombinante
Plasmidderivate enthielten, wurden in 100 ml Luria-Kulturlösung in
Gegenwart von Carbenicillin (100 μg/ml)
wachsen gelassen. Die Expression der Gene wurde mit IPTG vier Stunden
lang induziert. Die Zellen wurden zentrifugiert und das Pellet wurde
in 2 ml Puffer A (6 M Guanidirihydrochiorid, 0,1 M NaH2PO4, 0,01 Tris, pH-Wert 8,0) resuspendiert. Nach
leichtem Rühren
während
einer Stunde bei Raumtemperatur wurden die Suspensionen mit 10 000
g während
15 min bei 4°C
zentrifugiert. Ein 1,6-ml-Aliquot von Nickel-Nitrilo-Triessigsäureharz
(Nickel-NTA, QIA express), das zuvor in Puffer A äquilibriert
wurde, wurde dem Überstand
zugegeben, und diese Mischung wurde vor dem Laden auf eine Säule bei
Raumtemperatur eine Stunde lang gerührt. Die Säule wurde mit 20 ml Puffer
A, danach mit 30 ml Puffer B (8 M Harnstoff, 0,1 M Naphosphat, 0,01
M Tris-HCl, pH-Wert 8,0) gewaschen. Die Proteine wurden nacheinander
mit dem gleichen Puffer wie Puffer B, der auf einen pH-Wert 6,3 (Puffer
C), pH-Wert 5,9 (Puffer D) und pH-Wert 4,5 (Puffer E) eingestellt
war, und Puffer F (6 M Guanidinhydrochlorid, 0,2 M Essigsäure) eluiert.
Fünfzig μl von jeder
Fraktion wurden mit 50 μl
SDS-Puffer gemischt und auf SDS-Gele
geladen.
-
Human-Seren:
-
Serumproben
wurden von 40 Personen erhalten, 28 waren mit H. pylori infizierte
Patienten, wie durch eine positive Kultur für H. pylori und histologische
Untersuchung der Biopsie bestätigt,
und 12 waren nicht infizierte Patienten. Die Seren wurden freundlicherweise
von R. J. Adamek (Universität
Bochum, Deutschland) zur Verfügung
gestellt.
-
Immunblotting:
-
Nach
der Vollendung von SDS-PAGE-Läufen
in einer Mini-PROTEAN II-Elektrophorese-Kammer wurden Proteine auf Nitrocellulosepapier
in einer Min-Trans-Blot-Transferzelle (Bio-Rad), die 1 h lang auf 100 V eingestellt
war, übertragen
(unter Kühlen).
Eine Immunfärbung
wurde wie zuvor beschrieben durchgeführt (Ferrero et al., 1992),
mit der Ausnahme, dass das ECL-Western-Blotting-Detektionssystem
(Amersham) zur Sichtbarmachung von Reaktionsprodukten eingesetzt
wurde. Human-Seren und das Kaninchen-Antiserum, die gegen einen
Ganzzellenextrakt vom H. pylori-Stamm 85P gezüchtet worden waren, wurden
1:1000 bzw. 1:5000 in 1% (w/v) Casein, das in Phosphat-gepufferter
Kochsalzlösung
(PBS, pH-Wert 7,4) zubereitet worden war, verdünnt.
-
Serologische Verfahren [Enzym-gebundener
Immunosorbens-Assay, (ELISA)]:
-
Die
folgenden Mengen von Antigenen wurden auf 96-Mulden-Platten (Falcon
3072) absorbiert: 2,5 μg Protein
MalE, 5 μg
MalE-HspA oder 2,5 μg
MalE-HspB. Die Platten wurden über
Nacht bei 4°C
stehen gelassen, danach 3 Mal mit ELISA-Waschlösung (EWS) gewaschen [1% PBS,
enthaltend 0,05% (v/v) Tween 20]. Die Sättigung wurde durch Inkubieren
der Platten für
90 min bei 37°C
in EWS, ergänzt
mit 1% Milchpulver, erreicht. Die Mulden wurden erneut 3 Mal mit
EWS gewaschen und danach 90 min lang bei 37°C in Gegenwart von Human-Seren
(verdünnt
1:500 in EWS mit 0,5% Milchpulver) unter Bewegen leicht gerührt. Gebundene Immunoglobu line
wurden durch Inkubation während
90 min bei 37°C
mit biotinyliertem sekundärem
Antikörper (anti-humanes
Ziegen-IgG, IgA oder IgM, verdünnt
[1:1000] in EWS, ergänzt
mit 0,5% Milchpulver) in Kombination mit Streptavidinperoxidase
(1:500) (Kirkegaard and Perry Lab.) detektiert. Gebundene Peroxidase
wurde durch Reaktion mit dem Citrat-Substrat und Wasserstoffperoxid
detektiert. Platten wurden im Dunklen bei Raumtemperatur inkubiert,
und die optische Dichte bei 492 nm wurde in Intervallen von 5, 15
und 30 min in einem ELISA-Plattenlesegerät abgelesen.
Nach 30 min wurde die Reaktion durch die Zugabe von Chlorwasserstoffsäure auf
eine Endkonzentration von 0,5 M gestoppt.
-
RESULTATE DER TEIL-IV-EXPERIMENTE
-
Konstruktion von rekombinanten Plasmiden,
welche induzierbare MalE-HspA und HspB-Fusionsproteine produzieren:
-
Die
Oligonukleotide #1 und #2 (hspA) und #3 und #4 (hspB) wurden zur
Amplifizierung durch PCR der gesamten hspA- bzw. der hspB-Gene verwendet.
Die PCR-Produkte wurden elektroeluiert, gereinigt und mit EcoRI
und PstI restringiert. Die restringierten Fragmente (von 360 bp
bzw. 1600 bp Größe) wurden
danach in den restringierten EcoRI-PstI-pMAL-c2-Vektor ligiert zur
Erzeugung von Plasmiden, die mit pILL933 bzw. pILL934 bezeichnet
wurden. Im Anschluss an die Induzierung mit IPTG und die Reinigung
des löslichen
Proteins auf Amylose-Säulen
wurden Fusionsproteine mit der erwarteten Größe (55 kDa für pILL933
[17] und 100 kDa für pILL9334) auf SDS-PAGE-Gelen
sichtbar gemacht. Jedes von diesen entsprach der Fusion des MalE-Proteins
(42,7 kDa) mit der zweiten Aminosäure von jedem der Hsp-Polypeptide.
Die Ausbeute der Expression der Fusionsproteine war 100 mg für MalE-HspA
und 20 mg für
MalE-HspB bei einer
Herstellung aus 2 Litern Kulturlösung.
-
Studie der Antigenizität der HspA- und HspB-Fusionsproteine
und der Immunogenizität
von HspA und HspB bei mit H. pylori infizierten Patienten:
-
Um
zu bestimmen, ob die Fusionsproteine noch antigen waren, wurde jedes
durch Western-Blot mit Kaninchen-Serum, das gegen das MalE-Protein
und ein Ganzzellextrakt vom H. pylori-Stamm 85P gezüchtet worden war, analysiert.
Beide Fusionsproteine waren immunreaktiv mit Antikörper gegen
MalE (nicht gezeigt) und mit dem Anti-H. pylori-Antiserum. Das Anti-H.
pylori-Antiserum erkannte nicht das gereinigte MalE-Protein (18). Diese Ergebnisse zeigten, dass die Fusionsproteine
ihre antigenen Eigenschaften beibehielten; außerdem ist das HspB-Protein zwar bekanntermaßen immunogen,
doch ist dies der erste Nachweis, dass HspA per se bei Kaninchen
immunogen ist.
-
Auf
die gleiche Weise wurde zur Bestimmung, ob die HspA- und HspB-Polypeptide
bei Menschen immunogen waren, die humorale Immunantwortreaktion
gegen HspA und/oder HspB bei mit H. pylori infizierten Patienten
analysiert und mit derjenigen von nicht infizierten Personen unter
Verwendung von Western-Immunoblotting-Assays und Enzym-gebundenen
Immunosorbens-Assays (ELISA) verglichen. Keines der 12 Seren der
H. pylori-negativen Personen ergab ein positives Immunoblot-Signal
mit MalE-, MalE-HspA- oder MalE-HspB-Proteinen (18). Demgegenüber
reagierten von 28 Seren von H. pylori-positiven Patienten 12 (42,8%)
mit dem HspA-Protein, während
20 (71,4%) das HspB-Protein erkannten. Alle Seren, die HspA erkannten,
reagierten auch mit dem HspB-Protein. Es war kein Zusammenhang zwischen
der Immunantwort und der klinischen Darstellung der H. pylori-Infektion
festzustellen, obwohl eine derartige Schlussfolgerung wegen der
geringen Anzahl an analysierten Stämmen verfrüht sein könnte.
-
Nickel bindende Eigenschaften des MalE-HspA-Fusionsproteins:
-
Rekombinantes
MBP-HspA-Protein, das im Anschluss an Induktion mit IPTG exprimiert
wurde, wurde aus einem Ganzzellextrakt durch einstufige Reinigung
auf einer Nickel-Affinitätssäule gereinigt,
wohingegen weder das MBP allein noch MBP-HspB diese Eigenschaft
zeigte. Die 18 veranschaulicht die einstufige Reinigung
des MBP-HspA-Proteins, das als ein Monomer bei einem pH-Wert 6,3
und als ein Monomer bei einem pH-Wert 4,5 eluiert wurde. Die einmalige
Bande, die im Feld 7 zu sehen ist, und die zwei Banden, die im Feld
5 zu sehen sind, wurden beide spezifisch mit Anti-HspA-Kaninchen-Seren
erkannt. Dies deutete darauf hin, dass die Nickel bindende Eigenschaft
des MBP-HspA-Fusionsproteins auf die C-terminale Sequenz von HspA
zurückzuführen sein
dürfte,
die reich an Histidin- und Cystein-Resten ist.
-
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