DE69434985T2 - Immunogene zusammensetzungen gegen eine helicobacterinfektion, verwendung von polypeptiden in diesen zusammensetzungen und nukleinsäuren die besagte polypeptide kodieren - Google Patents

Immunogene zusammensetzungen gegen eine helicobacterinfektion, verwendung von polypeptiden in diesen zusammensetzungen und nukleinsäuren die besagte polypeptide kodieren Download PDF

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Description

  • Die vorliegende Erfindung betrifft immunogene Zusammensetzungen zum Induzieren schützender Antikörper gegen Helicobacter spp.-Infektion. Sie betrifft ebenfalls von Helicobacter abgeleitete proteinartige Materialien und Nukleinsäuresequenzen, welche diese codieren. Antikörper gegen diese proteinartigen Materialien sind ebenfalls in der Erfindung eingeschlossen.
  • H. pylori ist ein Mikroorganismus, welcher menschliche Magenschleimhaut infiziert und mit aktiver chronischer Gastritis assoziiert ist. Es wurde gezeigt, dass es sich um ein ätiologisches Agens bei der gastroduodenalen Ulzeration handelt (Peterson, 1991), und zwei Studien aus jüngster Zeit berichteten, dass mit H. pylori infizierte Personen ein höheres Risiko hatten, Magenkrebs zu entwickeln (Nomura et al., 1991; Parsonnet et al., 1991).
  • In vivo-Untersuchungen des Bakteriums und sich daraus ergebende Arbeiten über die Entwicklung von geeigneten präventiven oder therapeutischen Mitteln sind stark durch die Tatsache behindert worden, dass Helicobacter pylori nur mit Epithel vom gastrischen Typ von sehr wenigen Tierwirten vergesellschaftet ist, von denen keiner für die Verwendung als Labormodell geeignet ist.
  • Ein Mausmodell der gastrischen Besiedelung ist unter Verwendung eines helikalen Bakteriums entwickelt worden, das von Katzenmagenschleimhaut isoliert wurde (Lee et al., 1988, 1990), und als ein Vertreter der Gattung Helicobacter identifiziert wurde. Es wurde H. felis genannt (Paster et al., 1990).
  • Bis heute stehen nur begrenzte Informationen bezüglich H. felis und des Ausmaßes von dessen Ähnlichkeiten und Unterschieden mit/zu H. pylori zur Verfügung. Die Zuverlässigkeit des Mausmodells für die Entwicklung von Behandlungen für H. pylori-Infektion ist daher ungewiss. Kürzlich wurde gezeigt, dass H. pylori-Urease ein schützendes Antigen in dem H. felis/Maus-Modell ist (Davin et al., 1993; Corthesy-Theulaz et al., 1993).
  • Es ist daher ein Ziel der vorliegenden Erfindung, therapeutische und präventive Zusammensetzungen für die Verwendung bei Helicobacter-Infektion bereitzustellen, welche darüber hinaus in Labortieren getestet werden können.
  • Es ist bekannt, dass H. pylori Urease-Aktivität exprimiert und dass Urease eine wichtige Rolle bei der bakteriellen Besiedelung und Vermittlung bestimmter pathogener Prozesse spielt (Ferrero und Lee, 1991; Hazel et al., 1991).
  • Die Gene, welche für die Urease-Strukturpolypeptide von H. pylori (URE A, URE B) codieren, wurden kloniert und sequenziert (Labigne et al., 1991; und französische Patentanmeldung FR 8 813 135 ), wie die Gene, welche für die "akzessorischen" Polypeptide codieren, die für die Urease-Aktivität in H. pylori erforderlich sind (Internationale Patentanmeldung WO 93/07273 ).
  • Es wurden Versuche unternommen, Nukleinsäuresequenzen aus dem H. pylori-Urease-Gencluster als Sonden zu verwenden, um Ureasesequenzen in H. felis zu identifizieren. Allerdings war keiner dieser Versuche erfolgreich. Darüber hinaus ist die Etablierung und der Erhalt von H. felis-Kulturen in vitro extrem schwierig, und die großen Mengen der in den Bakterien vorhandenen Nukleasen kompliziert die Extraktion von DNA.
  • Die Erfinder der vorliegenden Anmeldung konnten jedoch die Gene der Urease-Strukturpolypeptide von H. felis und der akzessorischen Polypeptide erfolgreich klonieren und sequenzieren. Dies ermöglichte im Kontext der Erfindung den Vergleich der Aminosäuresequenz-Daten für die H. felis-ure-Genprodukte mit denjenigen für Helicobacter pylori, und es wurde ein hoher Konservierungsgrad zwischen den Urease-Untereinheiten festgestellt. Es existiert eine immunologische Beziehung zwischen den 2 Ureasen, und schützende Antikörper gegen Helicobacter-Infektion können unter Verwendung der Urease-Untereinheiten oder Fragmente davon als Immungene induziert werden.
  • Um allerdings die Wirksamkeit einzelner Urease-Untereinheiten, als mukosale Immungene zu fungieren, zu erklären, wurden die Gene, welche die betreffenden Urease-Untereinheiten (UreA und UreB) von Helicobacter pylori und Helicobacter felis codieren, in einem Expressionsvektor (pMAL) kloniert und in Escherichia coli-Zellen als translationale Fusionsproteine exprimiert. Die rekombinaten UreA- und UreB-Proteine wurden durch Affinitäts- und Anionenaustausch-Chromatographietechniken gereinigt und besitzen vorhergesagte Molekulargewichte von ungefähr 68 bzw. 103 kDa. Western-Blotting-Untersuchungen wiesen darauf hin, dass die Urease-Komponenten der Fusionsproteine stark immunogen sind und spezifisch durch polyklonale Kaninchen-Anti-Helicobacter-Seren erkannt werden. Die orogastrische Immunisierung von Mäusen mit 50 μg rekombinantem H. felis-UreB, das in Kombination mit einem mukosalen Adjuvans (Cholera-Toxin) verabreicht wird, schützte 60% (n = 7; p < 0,005) der Mäuse gegen die gastrische Besiedelung durch H. felis-Bakterien nach über 4 Monaten. Dies war vergleichbar mit einem Wert von 25% (n = 8; p > 0,05) für das heterologe H. pylori-UreB-Antigen. Zum ersten Mal wurde gezeigt, dass ein Antigen einer rekombinanten Untereinheit eine Immunschutzreaktion gegen gastrische Helicobacter-Infektion induziert.
  • Die Erfinder identifizierten auch im Kontext der Erfindung neue Hitzeschockproteine oder Chaperonine in Helicobacter, die eine verstärkende Wirkung auf die Urease-Aktivität besitzen. Die Verwendung von Chaperoninen in einer immunogenen Zusammensetzung kann daher eine Verstärkung des Schutzes induzieren.
  • Tatsächlich wurden die Gene, welche jedes der HspA- und HspB-Polypeptide von Helicobacter pylori codieren, kloniert, unabhängig als Fusionsproteine mit dem Maltose-Eindungs-Protein (MBP) exprimiert und im großen Massstab gereinigt. Diese Proteine wurden als rekombinante Antigene zur Immunisierung von Kaninchen und in Western-Immunoblotting-Assays sowie bei ELISA zur Bestimmung ihrer Immunogenizität in mit HP infizierten Patienten (HP+) verwendet. Die MBP-HspA- und MBP-HspB-Fusionsproteine, so wurde gezeigt, behielten ihre antigenen Eigenschaften bei. Ein Vergleich der humoralen Immunantwortreaktion gegen HspA und/oder HspB in (HP+)-Patientenseren zeigte, dass nicht nur HspB, sondern auch HspA durch (HP+)-Patientenseren (29/38 bzw. 15/38) erkannt wurde. Keiner der 14 nicht infizierten Patienten wies mit den Hsp's reagierende Antikörper auf.
  • Die vorliegende Erfindung betrifft eine immunogene Zusammensetzung, die zum Induzieren von Antikörpern gegen Helicobacter-Infektion fähig ist, die dadurch gekennzeichnet ist, dass sie Folgendes umfasst:
    • (i) das Hitzeschockprotein HSP A, das durch das hsp A-Gen von Plasmid pILL689 (CNCM I- 1356) codiert wird, oder
    • (ii) ein Fragment des HSP A mit mindestens 6 Aminosäuren, oder
    • (iii) eine Polypeptidvariante des HSP A, in welcher Aminosäuren ersetzt, inseriert oder deletiert wurden; wobei die Polypeptidvariante mindestens 75% Identität mit dem HSP A aufweist,
    wobei das Fragment oder die Polypeptidvariante die Urease-Aktivität in einem Mikroorganismus verstärkt, welcher zum Exprimieren aktiver Urease fähig ist.
  • Vorzugsweise ist die immunogene Zusammensetzung zum Induzieren schützender Antikörper fähig.
  • Die Expression von "Urease-Strukturpolypeptid" bezeichnet im Kontext der vorliegenden Erfindung das Enzym von Helicobacter pylori oder Helicobacter felis, vermutlich ein Haupt-Oberflächenantigen, das aus zwei sich wiederholenden monomeren Untereinheiten, einer größeren Untereinheit (Produkt des ure B-Gens) und einer kleineren Untereinheit, Produkt des ure A-Gens, zusammensgesetzt ist, [und] welche, wenn sie durch das Vorhandensein der Produkte der akzessorischen Gene des Urease-Genclusters komplementiert werden, für die Urease-Aktivität, d. h. die Hydrolyse von Harnstoff zur Freisetzung von NH4 + in den zwei Helicobacter-Spezies, verantwortlich sind. Es versteht sich, dass in Abwesenheit der akzessorischen Genprodukte die Urease-Strukturpolypeptide keine enzymatische Aktivität zeigen, aber von Antikörpern, die mit H. felis- oder H. pylori-Urease reagieren, erkannt werden.
  • Der Ausdruck "immunogene Zusammensetzung" bezeichnet im Kontext der Erfindung eine Zusammensetzung, welche einen Hauptwirkstoff zusammen mit jeglichen notwendigen Bestandteilen zur Sicherung oder zur Optimierung einer immunogenen Antwortreaktion, zum Beispiel Adjuvantien, wie mukosales Adjuvans etc., umfasst.
  • Das Helicobacter pylori-Urease-Strukturpolypeptid wurde von Labigne et al., 1991, beschrieben und sequenziert. Das in diesem Dokument beschriebene Polypeptid ist besonders für die Verwendung in der Zusammensetzung der vorliegenden Erfindung geeignet. Jedoch können Varianten, welche eine funktionelle Homologie mit dieser veröffentlichten Sequenz zeigen, verwendet werden, welche Aminosäure-Substitutionen, Deletionen oder Insertionen umfassen, unter der Massgabe, dass die immunologischen Charakteristika des Polypeptids, was seine Kreuzreaktivität mit Anti-Helicobacter felis-Urease-Antikörpern angeht, beibehalten werden. Allgemein gesagt, zeigt die Polypeptidvariante eine Homologie von mindestens 75% und vorzugsweise von etwa 90% mit der eingeschlossenen Sequenz.
  • Ein Fragment des Helicobacter pylori-Urease-Strukturpolypeptids kann auch in der immunogenen Zusammensetzung der Erfindung verwendet werden, mit der Massgabe, dass die Fragmente von Antikörpern erkannt werden, die mit Helicobacter felis-Urease reagieren. Ein solches Fragment ist allgemein aus mindestens 6 Aminosäuren zusammengesetzt, zum Beispiel aus 6 bis 100 Aminosäuren, vorzugsweise etwa 20–25. Vorteilhafterweise trägt das Fragment für Helicobacter einmalige Epitope.
  • Nukleinsäure- und Aminosäuresequenzen können im Kontext der vorliegenden Erfindung unter Bezug auf die 11 und 12 interpretiert werden, welche den genetischen Code bzw. Aminosäure-Abkürzungen zeigen.
  • Das Helicobacter felis-Urease-Strukturpolypeptid, das für die Verwendung in der vorliegenden Erfindung geeignet ist, ist vorzugsweise dasjenige, das durch einen Teil des Plasmids pILL205 (hinterlegt bei der CNCM am 25. August 1993, unter der Nummer: CNCM I-1355) codiert wird und dessen Aminosäuresequenz in 3 gezeigt ist (Untereinheiten A und B). Wiederum kann eine Variante dieses Polypeptids, welches Aminosäure-Substitutionen, -Deletionen oder -Insertionen bezüglich der Sequenz von 3 umfasst, verwendet werden, mit der Massgabe, dass die immunologische Kreuzbeziehung mit Helicobacter pylori-Urease aufrechterhalten wird. Eine solche Variante zeigt normalerweise mindestens 90% Homologie oder Identität mit der Sequenz von 3. Ein Beispiel für solche Varianten sind die Urease-A- und -B-Unter einheiten von Helicobacter heilmannii (Solnick et al., 1994), die, wie gezeigt wurde, 80% und 92% Identität mit den H. felis-Urease-A- bzw. -B-Untereinheiten aufweisen.
  • Fragmente dieser Urease oder Varianten können in der immunogenen Zusammensetzung verwendet werden, mit der Massgabe, dass die Fragmente von Antikörpern erkannt werden, die mit der Helicobacter pylori-Urease reagieren. Wiederum betrug die Länge eines solchen Fragments in der Regel 6, zum Beispiel 6 bis 100, vorzugsweise etwa 20 bis 25 Aminosäuren. Vorzugsweise trägt das Fragment für Helicobacter einmalige Epitope.
  • Wenn Varianten oder Fragmente der nativen Ureasesequenzen in der immunogenen Zusammensetzung der Erfindung verwendet werden, kann deren Kreuzreaktivität mit Antikörpern, die mit Urease aus der anderen Helicobacter-Spezies reagieren, durch Kontaktieren des Fragments oder der Variante mit Antikörpern getestet werden, die vorzugsweise polyklonal gegen entweder die native oder die rekombinante Urease oder alternativ gegen gesamten Helicobacter herangezüchtet wurden. Vorzugsweise führen die Varianten und Fragmente zu Antikörpern, die ebenfalls in der Lage sind, mit H. heilmannii-Urease zu reagieren. Ein Kreuzschutz gegen Infektion durch H. heilmannii wird daher durch die immunogene Zusammensetzung der Erfindung ebenfalls erhalten.
  • Die Verwendung von Fragmenten der Urease-Strukturgene ist besonders bevorzugt, da die immunologischen Eigenschaften des gesamten Polypeptids konserviert werden können unter gleichzeitiger Minimierung des Risikos von Toxizität.
  • Die Urease-Komponente der immunogenen Zusammensetzung, ob nun die Untereinheit A oder Untereinheit B, kann in der Form von translationalen Fusionsproteinen, zum Beispiel mit dem Maltose-Eindungs-Protein (MBP) verwendet werden. Andere geeignete Fusionen sind als Beispiele in der internationalen Patentanmeldung WO 90/11360 angegeben. Ein weiteres Beispiel eines geeigneten Fusionsproteins ist das "QIAexpress"-System, das von QIAGEN, USA, vermarktet wird, welches es ermöglicht, dass die 6 × His-Tag-Sequenz am 5'- oder 3'-Ende der Protein codierenden Sequenz platziert wird. Die Verwendung der aktiven Bestandteile in der Form von Fusionsproteinen ist jedoch völlig wahlfrei.
  • Die immunogene Zusammensetzung der Erfindung umfasst ein Hitzeschockprotein, das auch als ein "Chaperonin" von Helicobacter bekannt ist. Diese Chaperonin wurden durch die Erfinder im Kontext der vorliegenden Erfindung aufgeklärt. Vorzugsweise stammt das Chaperonin aus Helicobacter pylori. Ein solches HSP ist das Urease-assoziierte HSP A oder eine Mischung von HSP A und HSP B, mit der in 6 veranschaulichten Aminosäuresequenz. Diese Polypeptide werden durch das Plasmid pILL689 codiert (hinterlegt bei der CNCM am 25. August 1993 unter der Nummer: CNCM I-1356). Besonders bevorzugt ist das H. pylori-HSP-A-Protein, entweder allein oder in Kombination mit Hsp-B.
  • Es ist auch möglich, als HSP-Komponente gemäß der Erfindung eine Polypeptidvariante zu verwenden, in welcher Aminosäuren der Sequenz von 6 ersetzt, inseriert oder deletiert wurden, wobei die genannte Variante normalerweise mindestens 75%, und vorzugsweise mindestens 85% Homologie mit dem nativen HSP zeigt. Die Varianten zeigen vorzugsweise mindestens 75%, zum Beispiel mindestens 85% Identität mit dem nativen Hsp.
  • Die Varianten zeigen weiter funktionelle Homologie mit dem nativen Polypeptid. Im Falle der HSP-Komponenten bedeutet "funktionelle Homologie" die Fähigkeit, die Urease-Aktivität in einem Mikroorganismus zu verstärken, welcher fähig ist, aktive Urease zu exprimieren, und/oder die Fähigkeit, Infektion durch Helicobacter, insbesondere H. felis und H. pylori, zu blocken. Die Eigenschaft der Verstärkung der Urease-Aktivität kann mit Hilfe des nachstehend in den Beispielen beschriebenen quantitativen Urease-Aktivitäts-Assays untersucht werden. Fragmente von einem oder beiden aus den HSP A- und HSP B-Polypeptiden mit vorzugsweise mindestens 6 Aminosäuren können in der Zusammensetzung verwendet werden. Die Fragmente oder Varianten der in der immunogenen Zusammensetzung der Erfindung verwendeten HSP-Komponente sind vorzugsweise in der Lage, Antikörper zu erzeugen, welche die Urease verstärkende Wirkung, die normalerweise von den HSPs gezeigt wird, blocken. Diese Eigenschaft wird auch mit Hilfe des in den Beispielen beschriebenen quantitativen Assays untersucht. Das Vorhandensein der Chaperonine in der Zusammensetzung verstärkt den Schutz gegen Helicobacter pylori und felis.
  • Die Hsp-Komponente der immunogenen Zusammensetzung, ob HspA oder HspB, kann in der Form eines translationalen Fusionsproteins verwendet werden, zum Beispiel mit dem Maltose-Bindungs-Protein (MBP). Was die Urease-Komponente angeht, werden andere geeignete Fusionspartner in der internationalen Patentanmeldung WO 90/11360 beschrieben. Das "QIAexpress"-System von QIAGEN, USA, kann ebenfalls verwendet werden. Wiederum ist die Verwendung der Proteine in der Form von Fusionsproteinen völlig wahlfrei.
  • Die immunogene Zusammensetzung kann HspA und ein Urease-Strukturpolypeptid wie oben definiert umfassen.
  • Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform umfasst die immunogene Zusammensetzung als Urease-Komponente sowohl die A- als auch B-Untereinheiten sowohl von Helicobacter felis (d. h. ohne H. pylori-Urease) zusammen mit dem HSP A und HSP B von Helicobacter pylori.
  • Die immunologische Kreuzreaktivität zwischen den Ureasen der zwei unterschiedlichen Helicobacter-Spezies ermöglicht die Verwendung von nur einer Urease in der Zusammensetzung, vorzugsweise derjenigen von Helicobacter felis. Die durch die gemeinsamen Epitope induzierten schützenden Antikörper sind jedoch sowohl gegen Helicobacter pylori als auch Helicobacter felis aktiv. Es ist auch möglich, dass die Zusammensetzung schützende Antikörper gegen andere Spezies von Helicobacter induziert, wenn das Urease-Polypeptid oder -Fragment Epitope trägt, die auch auf den anderen Spezies vorkommen.
  • Die Zusammensetzung der Erfindung wird vorteilhafterweise als eine immunogene Zusammensetzung oder ein Impfstoff zusammen mit physiologisch annehmbaren Exzipientien und Trägern und gegebenenfalls mit Adjuvantien, Haptenen, Trägern, Stabilisatoren etc. verwendet. Geeignete Adjuvantien schließen Muranmyldipeptid (MDP), vollständige und unvollständige Freundsche Adjuvantien (CFA und IFA) und Alum bzw. Alaun ein. Die Impfstoffzusammensetzungen werden normalerweise für die orale Verabreichung formuliert.
  • Die Impfstoffe sind vorzugsweise für die Verwendung beim Menschen bestimmt, können aber auch bei nicht-humanen Tieren zum Beispiel zu veterinären Zwecken oder für die Verwendung in Labortieren, wie Mäusen, Katzen und Hunden, verabreicht werden.
  • Die in Tiere injizierten immunogenen Zusammensetzungen erhöhen die in vivo Synthese von spezifischen Antikörpern, welche für therapeutische Zwecke, zum Beispiel bei passiver Immunität, verwendet werden können.
  • "Proteinartiges Material" bedeutet jegliches Molekül, das aus Ketten von Aminosäuren zusammengesetzt ist, z. B. Peptide, Polypeptide oder Proteine, Fusions- oder gemischte Proteine (d. h. eine Assoziation von 2 oder mehr proteinartigen Materialien, von denen alle oder einige immunogene oder immunmodulatorische Eigenschaften besitzen), entweder gereinigt oder in einer Mischung mit anderem proteinartigen oder nicht-proteinartigem Material. "Polypeptid" bezeichnet eine Kette von Aminosäuren von beliebiger Länge und beinhaltet den Ausdruck "Peptid". Der Ausdruck "Fragment" bedeutet jegliche Aminosäuresequenz, die um mindestens eine Aminosäure kürzer ist als die Stammsequenz und eine Länge von Aminosäuren, z. B. mindestens 6 Reste, die in der Stammsequenz aufeinanderfolgen, umfasst.
  • Die Peptidsequenzen der Erfindung können zum Beispiel durch chemische Synthese unter Einsatz einer Technik, wie der Merrifield-Technik, und einer Synthetisierer-Vorrichtung des von Applied Biosystems vermarkteten Typs erhalten werden.
  • Die Erfindung betrifft auch das proteinartige Material, das dadurch gekennzeichnet ist, dass es umfasst oder besteht aus:
    • (i) dem Hitzeschockprotein HSP A von Helicobacter pylori mit der folgenden Aminosäuresequenz:
      Figure 00080001
    • (ii) einem Fragment von HSPA, wie definiert in (i), wobei das Fragment mindestens 6 aufeinander folgende Aminosäuren der in (i) definierten Aminosäuresequenz umfasst; oder
    • (iii) einer Polypeptidvariante der in (i) definierten Aminosäuresequenz, in welcher Aminosäuren ausgetauscht, inseriert oder deletiert worden sind, wobei die Polypeptidvariante mindestens 75% und vorzugsweise mindestens 80% Identität mit der in (i) definierten Aminosäuresequenz aufweist; wobei das Fragment oder die Polypeptidvariante die Urease-Aktivität in einem Mikroorganismus verstärkt, der fähig ist, aktive Urease zu exprimieren.
  • Ein besonders bevorzugtes Fragment des Helicobacter pylori-HSP-A-Polypeptids ist die C-terminale Sequenz:
    G S C C H T G N H D H K H A K E H E A C C H D H K K H
    oder ein Unterfragment dieser Sequenz mit mindestens 6 aufeinander folgenden Aminosäuren. Von dieser C-terminalen Sequenz wird angenommen, dass sie als eine Metallbindungs-Domäne fungiert, die das Binden beispielsweise von Nickel ermöglicht.
  • Das proteinartige Material der Erfindung kann auch ein Fusion- oder gemischtes Protein, welches mindestens eine der Untereinheiten des Urease-Strukturpolypeptids von H. pylori und/oder H. felis einschliesst, oder Fragmente oder Varianten davon wie oben definiert umfassen oder daraus bestehen. Besonders bevorzugte Fusionsproteine sind die Mal-E-Fusionsproteine und QIAexpress-System-Fusionsproteine (QIAGEN, USA), wie weiter oben detailliert angegeben. Das Fusions- oder gemischte Protein kann, entweder an Stelle von oder zusätzlich zu der Urease-Untereinheit, ein Hitzeschockprotein oder ein Fragment oder eine Variante davon, wie oben definiert, einschließen.
  • Die Erfindung betrifft auch monoklonale oder polyklonale Antikörper gegen die oben beschriebenen proteinartigen Materialien. Die Antikörper können auch gegen ein Polypeptid mit mindestens 90% Homologie mit irgendeinem der oben angeführten Urease-Polypeptide oder ein Fragment davon mit vorzugsweise mindestens 6 Aminosäuren gerichtet sein. Die Antikörper der Erfindung können spezifisch Helicobacter felis-Polypeptide erkennen, die durch den Urease-Gencluster exprimiert werden. In diesem Fall sind die durch die Antikörper erkannten Epitope für Helicobacter felis einmalig. Alternativ können die Antikörper Antikörper, die gegen Epitope gerichtet sind, die Helicobacter felis-Urease-Polypeptiden und Helicobacter pylori-Urease-Polypeptiden gemeinsam sind, einschließen oder aus diesen bestehen. Wenn die Antikörper die akzessorischen Genprodukte erkennen, ist es besonders vorteilhaft, dass sie mit dem akzessorischen Helicobacter pylori-Genprodukt kreuzreagieren. Auf diese Weise können die Antikörper in der therapeutischen Behandlung von Helicobacter pylori-Infektion beim Menschen durch Blockieren des Urease-Reifungsprozesses eingesetzt werden.
  • Die Erfindung betrifft auch monoklonale oder polyklonale Antikörper ggen die HSPs oder Fragmente davon, insbesondere gegen das in 6 veranschaulichte HSP A- und/oder HSP B-Protein. Polypeptide mit mindestens 75%, und vorzugsweise mindestens 80% oder 90% Homologie mit den HSPs können ebenfalls zur Induzierung der Antikörperbildung verwendet werden. Diese Antikörper können für die Helicobacter pylori-Chaperonine spezifisch sein, oder alternativ können sie mit GroEL-artigen Proteinen oder GroES-artigen Proteinen von anderen Bakterien als Helicobacter, abhängig von den erkannten Epitopen, kreuzreagieren. Die 7 zeigt die homologen Regionen von HSP A und HSP B mit GroES-artigen Proteinen bzw. GroEL-artigen Proteinen von verschiedenen Bakterien. Besonders bevorzugte Antikörper sind jene, die entweder für die HSP A- oder HSP B-Chaperonine spezifisch sind, oder jene, die spezifisch die C-terminale HSP A-Sequenz mit der Metallbindungsfunktion erkennen. Wiederum stellt die Verwendung spezifischer Fragmente für die Induzierung der Antikörper die Herstellung von Helicobacter-spezifischen Antikörpern sicher.
  • Die Antikörper der Erfindung können unter Anwendung klassischer Techniken hergestellt werden. Zum Beispiel können monoklonale Antikörper durch die Hybridom-Technik oder durch bekannte Techniken für die Herstellung von menschlichen Antikörpern oder durch die von Marks et al. beschriebene Technik (Journal of Molecular Biology, 1991, 222, S. 581–597) gebildet werden.
  • Die Erfindung schliesst auch Fragmente von beliebigen der oben genannten Antikörper ein, die durch Enzymverdau gebildet werden. Von besonderem Interesse sind die Fab- und F(ab')2-Fragmente. Ebenfalls von Interesse sind die Facb-Fragmente.
  • Die Erfindung betrifft auch gereinigte Antikörper oder Serum, welche(s) durch Immunisierung eines Tiers, z. B. eines Säugers, mit der immunogenen Zusammensetzung, dem proteinartigen Material oder Fragment, oder dem Fusions- oder gemischten Protein der Erfindung erhalten wird/werden, gefolgt von der Reinigung der Antikörper oder von Serum. Sie betrifft ebenfalls ein Reagens für die in vitro-Detektion von H. pylori-Infektion, das mindestens diese Antikörper oder Serum, gegebenenfalls mit Reagenzien zum Markieren der Antikörper, z. B. Anti-Antikörper etc., enthält.
  • Die Erfindung betrifft weiter Nukleinsäuresequenzen, die für ein beliebiges der oben genannten proteinartigen Materialien, die Peptide einschließen, codieren. Insbesondere betrifft die Erfindung eine Nukleinsäuresequenz, die dadurch gekennzeichnet ist, dass sie Folgendes umfasst:
    • i) eine Sequenz, welche für die Helicobacter felis-Urease und akzessorische Polypeptide wie oben definiert codiert, und eine Sequenz, welche für das HSP von H. pylori wie oben definiert codiert;
    • oder ii) eine Sequenz, welche komplementär zur Sequenz i) ist;
    • oder iii) eine Sequenz, welche zum Hybridisieren an Sequenz (i) oder (ii) unter stringenten Bedingungen in der Lage ist;
    • oder iv) ein Fragment von einer beliebigen der Sequenzen (i), (ii) oder (iii), welche mindestens 10 Nukleotide umfasst.
  • Bevorzugte Sequenzen sind jene, welche die Gesamtheit oder einen Teil der Sequenz von Plasmid pILL689 (CNCM I-1356) umfassen, zum Beispiel die Sequenz von 6, insbesondere jene, die für HSP A und/oder HSP B oder eine zu dieser Sequenz komplementäre Sequenz codieren, oder eine Sequenz, welche zum Hybridisieren an diese Sequenz unter stringenten Bedingungen in der Lage ist.
  • Hochstringente Hybridisierungsbedingungen im Kontext der Erfindung sind die Folgenden:
    • – 5 × SSC;
    • – 50% Formamid bei 37°C; oder:
    • – 6 × SSC;
    • – Denhard-Medium bei 68°C.
  • Die Sequenzen der Erfindung schließen auch jene ein, die an beliebige der oben definierten Sequenzen (i), (ii) und (iii) unter nicht-stringenten Bedingungen hybridisieren, nämlich:
    • – 5 × SSC;
    • – 0,1% SDS;
    • – 30 oder 40% Formamid bei 42°C, vorzugsweise 30%.
  • Der Ausdruck "komplementäre Sequenzen" im Kontext der Erfindung bezeichnet "komplementäre" und "reverse" oder "inverse" Sequenzen.
  • Die Nukleinsäuresequenzen können DNA oder RNA sein.
  • Die Sequenzen der Erfindung können als Nukleotid-Sonden in Verbindung mit passenden Markierungsmitteln verwendet werden. Solche Mittel schließen radioaktive Isotope, Enzyme, chemische oder chemisch-lumineszente Marker, Fluorochrome, Haptene oder Antikörper ein. Die Marker können gegebenenfalls an einem festen Träger, zum Beispiel einer Membran oder Teilchen, befestigt sein.
  • Als ein bevorzugter Marker wird radioaktiver Phosphor (32P) am 5'-Ende der Sondensequenz eingebaut. Die Sonden der Erfindung umfassen jegliches Fragment der beschriebenen Nukleinsäuresequenzen und können eine Länge von zum Beispiel mindestens 45 Nukleotiden, zum Beispiel 60, 80 oder 100 Nukleotiden oder mehr aufweisen. Bevorzugte Sonden sind jene, die von den ure A-, ure B-, ure I-, HSP A- und HSP B-Genen abgeleitet sind.
  • Die Sonden der Erfindung können bei der in vitro-Detektion von Helicobacter-Infektion in einer biologischen Probe, gegebenenfalls nach einer Genamplifikationsreaktion, verwendet werden. Am vorteilhaftesten werden die Sonden zum Detektieren von Helicobacter felis oder Helicobacter pylori, oder beiden, verwendet, je nachdem, ob die als Probe gewählte Sequenz für den einen oder anderen spezifisch ist, oder ob sie an beide hybridisieren kann. Allgemein sind die Hybridisierungsbedingungen bei der Durchführung einer solchen Detektion stringent.
  • Die Erfindung betrifft auch ein Kit für die in vitro-Detektion von Helicobacter-Infektion, das dadurch gekennzeichnet ist, dass es Folgendes umfasst:
    • – eine Nukleotid-Sonde gemäß der Erfindung, wie oben definiert;
    • – ein passendes Medium zum Ausführen einer Hybridisierungsreaktion zwischen der Nukleinsäure von Helicobacter und der Sonde;
    • – Reagenzien für die Detektion jeglicher gebildeter Hybride.
  • Die Nukleotidsequenzen der Erfindung können auch als Primer in einer Nukleinsäure-Amplifikationsreaktion dienen. Die Primer umfassen normalerweise mindestens 10 aufeinander folgende Nukleotide der oben beschriebenen Sequenzen, und vorzugsweise mindestens 18. Typische Langen sind von 25 bis 30 und können bis zu 100 oder mehr aufeinanderfolgende Nukleotide betragen. Solche Primer werden in Paaren verwendet und sind so gewählt, um mit den 5'- und 3'-Enden des zu amplifizierenden Fragments zu hybridisieren. Eine solche Amplifikationsreaktion kann zum Beispiel unter Anwendung der PCR-Technik durchgeführt werden (europäische Patentanmeldungen EP 200 363 , 201 184 und 229 701 ). Die Q-β-Replikase-Technik (Biotechno- logy, Bd. 6, Okt. 1988) kann ebenfalls in der Amplifikationsreaktion angewandt werden.
  • Die Erfindung betrifft auch Expressionsvektoren, die dadurch gekennzeichnet sind, dass sie beliebige der Nukleinsäuresequenzen der Erfindung enthalten. Ein besonders bevorzugter Expressionsvektor ist das Plasmid pILL689 (CNCM I-1356). Die Expressionsvektoren enthalten normalerweise geeignete Promotoren, Terminatoren und Markergene und jegliche anderen regulatorischen Signale, die für die effiziente Expression notwendig sind.
  • Die Erfindung betrifft weiter prokaryontische oder eukaryontische Wirtszellen, die durch die Nukleinsäuresequenzen der Erfindung stabil transformiert wurden. Als Beispiele von Wirten können höhere Eukaryoten, wie CHO-Zellen und Zelllinien; Hefe, Prokaryoten einschließlich Bakterien, wie E. coli, z. B. E. coli HB 101; Mycobacterium tuberculosum; Viren einschließlich Baculovirus und Vaccinia, genannt werden. In der Regel werden die Wirtszellen durch Vektoren transformiert. Allerdings ist es auch innerhalb des Kontextes der Erfindung möglich, die Nukleinsäuresequenzen durch homologe Rekombination unter Anwendung herkömmlicher Techniken zu inserieren.
  • Durch Kultivieren der stabil transformierten Wirte der Erfindung kann das Helicobacter-Urease-Polypeptidmaterial und zutreffendenfalls das HSP-Material durch rekombinante Mittel hergestellt werden. Die rekombinanten proteinartigen Materialien werden dann gesammelt und gereinigt. Pharmazeutische Zusammensetzungen werden durch Kombinieren der rekombinanten Materialien mit geeigneten Exzipienten, Adjuvantien und gegebenenfalls etwaigen anderen Zusatzstoffen wie Stabilisatoren hergestellt.
  • Verschiedene Aspekte werden in den Figuren veranschaulicht:
  • 1:
  • Transposon-Mutagenese und Sequenzierung von pILL205.
  • Lineare Restriktionskarten des rekombinanten Cosmids pILL199 und des rekombinanten Plasmids pILL205 (und die jeweiligen Größenmaßstab-Marker) werden gezeigt. Die Zahlen in Klammern geben die Größen von H. felis-DNA-Fragmenten an, die in einen der Klonierungsvektoren (pILL575 bzw. pILL570) inseriert wurden. Die "Plus"- und "Minus"-Zeichen innerhalb der Kreise entsprechen den Insertionsstellen des MiniTn3-Km-Transposon in pILL205; "Plus"-Zeichen geben an, dass das Transposon die Urease-Expression nicht inaktivierte, wohingegen negative Vorzeichen angeben, dass die Urease-Expression beseitigt wurde. Die Buchstaben beziehen sich auf mutante Klone, die hinsichtlich der quantitativen Urease-Aktivität und der Synthese von Urease-Genprodukten weiter charakerisiert wurden. Der Ort der Urease-Strukturgene (ure A und ure B) auf pILL205 ist durch Kästchen dargestellt, deren Längen zu den Größen der jeweiligen offenen Leserahmen proportional sind. Die Pfeile beziehen sich auf die Orientierung der Transkription. Die Skala am unteren Ende der Figur gibt die Größen (in Kilobasen) der Rind III- und PstI-Restriktionsfragmente an. Restriktionsstellen sind wie folgt angegeben: B, BamHI; Pv, PvuII; Bg, BgIII; E, EcoRI; H, HindIII; C, ClaI; Ps, PstI. Buchstaben innerhalb von Klammern geben an, dass die Stellen aus dem Klonierungsvektor stammten.
  • 2:
  • Western-Blot-Analyse von Ganzzellenextrakten von E. coli HB101-Zellen, die rekombinante Plasmide beherbergen, wurden mit polyklonalem Kaninchen-Antiserum (verdünnt 1:1, 1000) reagieren gelassen, das gegen H. felis-Bakterien gezüchtet wurde. A) Extrakte stammten von E. coli-Zellen, die Folgendes beherbergten: Plasmidvektor pILL570 (Spur 1); rekombinantes Plasmid pILL205 (Spur 2); und pILL205-Plasmidderivate, die an den Orten "a", "b", "c", "d" und "e" disruptiert waren (Spuren 3–7). B) Extrakte stammten von E. coli-Zellen, die Folgendes beherbergten: rekombinantes Plasmid pILL753, das die ure A- und ure B-Gene von H. pylori enthielt (Labigne et al., 1991) (Spur 1); und pILL205-Plasmidderivate, die an den Orten "f", "g", "h" und "i" disruptiert waren (Spuren 2–5). Die kleinen Pfeilspitzen geben Polypeptide von ungefähr 30 und 66 Kilodaltons an, welche vermeintliche Ure A- und Ure B-Genprodukte von H. felis repräsentieren. Die großen Pfeilspitzen in der Tafel B geben die entsprechenden Genprodukte von H. pylori an, welche mit dem Anti-H. felis-Serum kreuzreagierten. Die Zahlen geben die Molekulargewichte (in Tausendern) der Proteinstandards an.
  • 3:
  • Nukleotidsequenz der H. felis-Urease-Strukturgene. Die Zahlen über der Sequenz geben die Nukleotidpositionen sowie die Aminosäure-Position in jedem der zwei Ure A- und Ure B-Polypeptide an. Vorhergesagte Aminosäuresequenzen für Ure A (bp 43 bis 753) und Ure B (766 bis 2616) sind unter der Sequenz gezeigt. Die vermutliche Ribosomenbindungsstelle (Shine-Dalgarno-Sequenz, SD) ist unterstrichen.
  • 4:
  • Vergleich von Sequenzen für die Urease-Strukturgene von H. felis mit: a) der Sequenz der zwei Untereinheiten von H. pylori-Urease (Labigne et al., 1991); b) der Sequenz der drei Untereinhei ten von Proteus mirabilis-Urease (Jones and Mobley, 1989); c) der Sequenz der einzelnen Untereinheit von Jackbohnen-Urease. Lücken (durch Gedankenstriche dargestellt) wurden eingeführt, um die beste Alignierung sicherzustellen. *, Aminosäuren, die mit denjenigen der H. felis-Sequenz identisch sind; =, Aminosäuren, die den verschiedenen Ureasen gemeinsam sind; ·, Aminosäuren, die für die Helicobacter-Ureasen einmalig sind. Die Prozentangaben beziehen sich auf die Zahl von Aminosäuren, die mit denjenigen der H. felis-Urease-Untereinheiten identisch sind. H. f., Helicobacter felis; H. p., Helicobacter pylori; P. m., Proteus mirabilis; J. b., Jackbohne.
  • 5:
  • Restriktionskarte der rekombinanten Plasmide pILL689, pILL685 und pILL691. Die Konstruktion dieser Plasmide ist ausführlich in Tabelle 1 beschrieben. Km innerhalb der Dreicke stellt die Stelle der Insertion der Kanamycin-Kassette dar, welche zu der Konstruktion der Plasmide pILL687, pILL688 und pILL696 führte (Tabelle 2). Die Kästchen unterhalb der Karten geben die Position der drei genetischen Elemente an, die von der Nukleotidsequenz abgeleitet sind, nämlich IS5, Hsp A und Hsp B.
  • 6:
  • Nukleotidsequenz des Helicobacter pylori-Hitzeschockprotein-Genclusters. Die erste Zahl über der Sequenz gibt die Nukleotid-Positionen an, wohingegen die zweite die Aminosäurerest-Positionen für jedes der Hsp A- und Hsp B-Protein nummeriert. Die mutmaßlichen Ribosomenbindungssequenzen (Shine-Dalgarno[SD]-Stellen) sind unterstrichen.
  • 7:
  • Vergleich der abgeleiteten Aminosäuresequenz von Helicobacter pylori-Hsp A (A) oder -Hsp B (B) mit derjenigen anderer GroEL-artiger (A)- oder GroES-artiger (B)-Proteine. Sternchen markieren Aminosäuren, die mit denjenigen in den Helicobacter pylori-Hsp A- oder -Hsp B- Sequenzen identisch sind.
  • 8:
  • Expression der Helicobacter pylori-Hsp A-Hitzeschockproteine in E. coli-Minizellen. Die Proteinbanden mit apparenten Molekülmassen von 58 und 13 kDA, die den Helicobacter pylori Hsp A- und Hsp B-Hitzeschockproteinen entsprechen, sind in den Spuren, die den Plasmiden pILL689 und pILL692 entsprechen, deutlich sichtbar, und fehlen bei den Vektorkontrollen (pILL570 bzw. pACYC177).
  • 9:
  • Nukleotidsequenz des Helicobacter felis-ure I-Gens und abgeleitete Aminosäuresequenz.
  • 10:
  • Vergleich der Aminsosäuresequenz der ure I-Proteine, die aus der Nukleotidsequenz des ure I-Gens von Helicobacter felis und derjenigen von Helicobacter pylori abgeleitet sind.
  • 11:
  • Genetischer Code. Kettenterminierende oder "Nonsense"-Codons. Ebenfalls verwendet zur Spezifizierung der Starter-Formyl-Met-tRNAMet F. Das Val-Triplett GUG ist dahingehend "zweideutig", dass es sowohl Valin als auch Methionin codiert.
  • 12:
  • Bedeutung der einbuchstabigen und dreibuchstabigen Aminosäure-Abkürzungen
  • 13:
  • Reinigung von rekombinantem H. pylori-UreA-MBP-Protein unter Verwendung des pMAL-Expressionsvektorsystems. Extrakte von den verschiedenen Stufen der Proteinreinigung wurden auf einem 10%igen, auflösenden SDS-Polyacrylamidgel laufen gelassen. Im Anschluss an die Elektrophorese wurde das Gel mit Coomassie-Blau angefärbt. Die Extrakte waren: 1) nicht induzierte Zellen; 2) IPTG-induzierte Zellen; French-Press-Lysat von induziertem Zellextrakt; 5) Eluat von Amylose-Harzsäule; 6) Eluat von Anionenaustauschsäule (erster Durchgang); 7) Eluat von Anionenaustauschsäule (zweiter Durchgang); 8) SDS-PAGE-Standard-Markerproteine.
  • 14:
  • Erkennung von rekombinanten UreA-Fusionsproteinen durch polyklonale Kaninchen-Anti-Helicobacter-Seren. Proteinextrakte von Maltose-Bindungsprotein (MBP, Spur 1), H. felis-UreA-MBP (Spur 2), und H. pylori-UreA-MBP (Spur 3) wurden einem Western-Blotting-Test unter Verwendung von polyklonalen Kaninchen-Antiseren (verdünnt 1:5000) unterzogen, die gegen Ganzzellextrakte von H. pylori und H. felis gewonnen worden waren. Die gereinigten Fusionsproteine sind durch einen Pfeil angegeben. Putative Abbauprodukte der Proteine sind durch ein Sternchen angegeben.
  • 15:
  • Erkennung von rekombinanten UreB-Fusionsproteinen durch Kaninchen-Antiseren, die gegen gereinigte homologe und heterologe UreB-Proteine gezüchtet wurden. Nitrozellulose-Membranen wurden mit den folgenden Extrakten geblottet: 1) Standard-Proteinmarker; 2) H. felis-UreA-MBP; 3) MBP; 4) H. pylori-UreA-MBP. Die Membranen wurden mit polyklonalen Kaninchen-Antiseren (verdünnt 1 : 5000) reagieren gelassen, die gegen MBP-fusionierte H. pylori- bzw. H. felis-Ure B-Untereinheiten gewonnen worden waren. Die Molekulargewichte von Standard-Proteinen sind auf der linken Seite der Blots angegeben.
  • 16:
  • Western-Blot-Analyse von H. pylori- und H. felis-Ganzzellextrakten mit Antiseren, die gegen gereinigte rekombinante UreB-MBP-Fusionsproteine gewonnen worden waren. SDS-PAGE-Vollextrakte von H. felis- (Spur 1-) und H. pylori- (Spur 2-)Zellen wurden mit polyklonalen Kaninchen-Antiseren reagieren gelassen, die gegen gereinigte H. pylori-UreB- und H. felis-UreB-MBP-Fusionsproteine (Seren 1:5000 verdünnt) gewonnen worden waren. Der Unterschied in der Gelmobilität der jeweiligen nicht-rekombinanten UreB-Untereinheiten von H. felis und H. pylori ist zu sehen. Die Zahlen auf der linken Seite beziehen sich auf die Molekulargewichte von Standard-Markerproteinen.
  • 17:
  • Serum-IgG-Antwortreaktionen gegen MBP (unten), MBP-HspA (oben) und MBP-HspB (Mitte) von 28 mit H. pylori infizierten Patienten (Quadrate, links) und 12 nicht-infizierten Patienten (Kreise, rechts). Die optische Dichte jedes Serums in dem in den 'Experimentellen Verfahrensweisen' beschriebenen ELISA-Assay wurde bei 492 nm nach einer 30-minütigen Inkubation abgelesen. Die Größen der Symbole sind proportional zu der Anzahl der Seren, die den gleichen Wert für die optische Dichte ergeben.
  • 18:
  • SDS-PAGE-Analyse von Material, das von der Amylose-Säule (Spuren 2 und 3) oder von der Ni-NTA-Säule im Anschluss an die Elution eluiert wurde: mit Puffer E (pH-Wert 4,5), Spuren 4 und 5; oder Puffer C (pH-Wert 6,3), Spuren 6 und 7. Aus einem Lysat von MC1061 (PILL933) (Spuren 2, 3, 5 und 7) eluiertes Material und aus einem Lysat von MC1061 (PMAL-c2) (Spuren 4 und 6) eluiertes Material. Die Spur 3 enthält das gleiche Material wie in der Spur 2, mit der Ausnahme, dass es in Puffer E erneut suspendiert wurde, wodurch gezeigt wurde, dass der Puffer E für die Dimerbildung der MBP-HspA-Untereinheit verantwortlich ist, wie in den Spuren 3 und 5 zu sehen ist.
  • REFERENZBEISPIEL I
  • I – KLONIERUNG, EXPRESSION UND SEQUENZIERUNG DES H. FELIS-UREASE-GENS: EXPERIMENTELLE PROZEDUREN FÜR TEIL I:
  • Bakterienstämme und Kulturbedingungen:
  • H. felis (ATCC 49179) wurde auf der Blutagar-Basis Nr. 2 (Oxoid), ergänzt mit 5% (v/v) lysiertem Pferdeblut (BioMerieux) und einer Antibiotikum-Ergänzung, bestehend aus 10 ngml–1 Vancomycin (Lederle Laboratories), 2,5 μgml–1 Polymyxin B (Pfizer), 5 μgml–1 Trimethoprim (Sigma Chemical Co.) und 2,5 μgml–1 Amphotericin B (E. R. Squibb and Sons, Inc.), wachsen gelassen. Bakterien wurden auf frisch hergestellten Agarplatten kultiviert und inkubiert, mit Deckel in der höchsten Stellung, und zwar unter mikroaeroben Bedingungen bei 37°C während 2–3 Tagen. E. coli-Stämme HB 101 (Boyer und Roulland-Dussoix, 1969) und MC1061 (Maniatis et al., 1983), die in den Klonierungsexperimenten angewandt wurden, wurden routinemäßig in Luria-Nährbrühe ohne hinzugesetzter Glukose oder auf Luria-Agarmedium bei 37°C wachsen gelassen. Bakterien, die unter Stickstoff-begrenzenden Bedingungen wachsen gelassen wurden, wurden auf ein Stickstoff-begrenzendes festes Medium passagiert, das aus Ammonium-freiem M9-Minimalmedium (pH 7,4), ergänzt mit 0,4% (w/v) D-Glukose und 10 mM L-Arginin, bestand (Cussac et al., 1992).
  • DNA-Manipulationen:
  • Alle standardmäßigen DNA-Manipulationen und -Analysen wurden, wenn nicht anders angegeben, gemäß den von Maniatis et al. (1983) beschriebenen Prozeduren durchgeführt.
  • Isolierung von H. felis-DNA:
  • Genomische Gesamt-DNA wurde durch eine Sarkosyl-Proteinase K-Lyseprozedur (Labigne-Roussel et al., 1988) extrahiert. Zwölf Blutagarplatten, die mit H. felis inokuliert worden waren, wurden in einem aneroben Gefäß (BBL) mit einem anaeroben Gaspak (BBL 70304) ohne Katalysator 1–2 Tage lang bei 37°C inkubiert. Die Platten wurden in 50 ml einer 15% (v/v) Glycerol- 9% (w/v)-Sucrose-Lösung geerntet und bei 5 000 U/min (in einer Sorvall-Zentrifuge) 30 min lang bei 4°C zentrifugiert. Das Pellet wurde erneut in 0,2 ml 50 mM D-Glukose in 25 mM Tris – 10 mM EDTA (pH 8,0), das 5 mgml–1 Lysozym enthielt, suspendiert und in ein VTi65-Polyallomer-Schnellverschlussröhrchen überführt. Ein 0,2 ml großes Aliquot von 20 mgml–1 Proteinase K und 0,02 ml 5 M Natriumperchlorat wurden der Suspension hinzugesetzt. Zellen wurden lysiert, indem 0,65 ml an 0,5 M EDTA – 10% (w/v) Sarkosyl hinzugesetzt wurden und bei 65°C inkubiert wurde, bis die Suspension sich aufklärte (etwa 5 min). Das Volumen des Röhrchens wurde mit einer CsCl-Lösung komplettiert, die aus (pro 100 ml) 126 g CsCl, 1 ml Aprotinin, 99 ml TES-Puffer (30 mM Tris, 5 mM EDTA, 50 mM NaCl (pH 7,5)) bestand. Lysate wurden bei 45 000 U/min 15–18 h lang bei 18°C zentrifugiert. Gesamt-DNA wurde gesammelt und gegen TE-Puffer (10 mm Tris, 1 mM EDTA) bei 4°C dialysiert.
  • Cosmid-Klonierung:
  • Chromosomale DNA von H. felis wurde in den Cosmidvektor pILL575 kloniert, wie es früher beschrieben wurde (Labigne et al., 1991). Kurz gesagt, wurden DNA-Fragmente, die von einem partiellen Verdau mit Sau3A stammten, auf einem (10 bis 40%) Sucrose-Dichtegradienten der Größe nach sortiert und dann in eine BamHI-verdaute und dephosphorylierte pILL575-DNA-Präparation ligiert. Cosmide wurden in lambda-Phagenteilchen verpackt (Amersham, In-Vitro-Verpackungskit) und eingesetzt, um E. coli HB 101 zu infizieren. Um nach Ureaseexpression zu screenen, wurden Kanamycin-resistente Transduktanten auf festes Stickstoff-limitierendes Medium (siehe oben), das (20 μgml–1) Kanamycin enthielt, replika-plattiert, welches in einzelnen Mulden von Mikrotiterplatten (Becton Dickinson) ausgeteilt worden war. Die Mikrotiterplatten wurden aerob bei 37°C 2 Tage lang inkubiert, bevor 0,1 ml Urease-Reagens (Hazell et al., 1987) jeder Mulde hinzugesetzt wurde. Die Ureolyse wurde innerhalb von 5–6 h bei 37°C durch eine Farbänderung im Reagens nachgewiesen. Mehrere Urease-positive Cosmidklone wurden restriktionskartiert, und einer wurde zur Subklonierung ausgewählt.
  • Subklonierung von H. felis-DNA:
  • Eine CsCl-Plasmid-Präparation von Cosmid-DNA im großen Maßstab wurde durch Sau3A partiell verdaut. DNA-Fragmente (7–11 kb) wurden aus einem Agarosegel elektroeluiert und unter Anwendung von Phenol-Chloroform-Extraktionen gereinigt. Nach der Präzipitation in kaltem Ethanol wurden die Fragmente in Bg/III-verdautes Plasmid pILL570 ligiert (Labigne et al., 1991), und die rekombinanten Plasmide wurden verwendet, um kompetente E. coli-MC1061-Zellen zu transformieren. Spectinomycin-resistente Transformanten wurden selektiert und hinsichtlich Urease-Expression unter stickstoffreichen (Luria-Agar) und Stickstoff-limitierenden Bedingungen gescreent.
  • Quantitative Ureaseaktivität:
  • sEs wurden Kulturen, die aerob 2,5 Tage lang bei 37°C wachsen gelassen worden waren, geerntet und zweimal in 0,85%iger (w/v) NaCl gewaschen. Pellets wurden in PEB-Puffer (0,1 M Natriumphosphatpuffer (pH 7,4), enthaltend 0,01 M EDTA) resuspendiert und dann durch vier 30-s-Ausbrüche unter Verwendung eines Branson-Ultrabeschallers, Modell 450, ultrabeschallt, der auf 30 W, 50%-Zyklus, eingestellt war. Zelltrümmer wurden aus den Sonicaten durch Zentrifugation entfernt. Die Urease-Aktivitäten der Sonicate wurden in einer 0,05 M Harnstofflösung, hergestellt in PEB, gemessen, und zwar durch eine Modifizierung der Berthelot-Reaktion (Cussac et al., 1992). Die Urease-Aktivität wurde als μMol-Harnstoff min–1 mg–1 Bakterienprotein ausgedrückt.
  • Proteinbestimmung:
  • Proteinkonzentrationen wurden mit einer kommerziellen Version des Bradford-Assays (Sigma Chemicals) abgeschätzt.
  • Transposon-Mutagenese:
  • Statistische insertionelle Mutationen wurden innerhalb geklontem H. felis über ein MiniTn3-Km-Zuführsystem erzeugt (Labigne et al., 1992). Kurz gesagt, wurden E. coli HB 101-Zellen, die das Transposase-codierende Plasmid pTCA enthielten, mit dem Plasmid pILL570, das klonierte H. felis-DNA enthielt, transformiert. Die Transposition des MiniTn3-Km-Elementes in die pILL570-Derivatplasmide wurde mittels Konjugation ausgeführt. Die resultierenden Cointegrate wurden dann hinsichtlich aufgelöster Strukturen in Gegenwart von hohen Konzentrationen an Kanamycin (500 mgl–1) und Spectinomycin (300 mgl–1) selektiert.
  • SDS-PAGE und Western-Blotting:
  • Solubilisierte Zellextrakte wurden auf Flach-Gelen analysiert, welche ein 4,5%iges Acrylamid-Sammelgel und ein 12,5%iges Trenngel umfassten, und zwar gemäß der Prozedur von Laemmli (Laemmli, 1970). Eine Elektrophorese wurde bei 200 V auf einer Mini-Flachgel-Apparatur (Bio-Rad) durchgeführt.
  • Proteine wurden auf Nitrocellulosepapier (Towbin et al., 1979) in einer Mini-Trans-Blot-Transferzelle (Bio-Rad), die auf 100 V eingestellt war, 1 h lang (unter Kühlen) transferiert. Nitrocellulosemembranen wurden mit 5% (w/v) gereinigtem Casein (BDH) in Phosphat-gepufferter Kochsalzlösung (PBS, pH 7,4) bei Raumtemperatur 2 h lang blockiert (Ferrero et al., 1992). Membranen wurden bei 4°C über Nacht mit Antiseren umgesetzt, die in mit PBS hergestellten 1%igen (w/v) Casein verdünnt waren. Immunoreaktanten wurden dann unter Verwendung eines biotinylierten sekundären Antikörpers (Kirkegaard und Perry Lab.) in Kombination mit Avidin-Peroxidase (KPL) detektiert. Eine Substratlösung, die aus 0,3% (w/v) 4-Chlor-1-naphthol (Bio-Rad) bestand, wurde verwendet, um Reaktionsprodukte zu visualisieren.
  • DNA-Sequenzierung:
  • DNA-Fragmente, die zu sequenzieren waren, wurden in M13mp18- und M13mp19- (Meissing und Vieira, 1982) Bakteriophagen-Vektoren (Pharmacia) kloniert. Kompetente E. coli-JM101-Zellen wurden mit rekombinanter Phagen-DNA transfizert und auf Medien plattiert, die X-gal (5-Brom-4-chlor-3-indolyl-β-D-galactopyranosid) und Isopropyl-βD-thiogalactopyranosid enthielten. Plaques, die aus Bakterien entstanden, die mit rekombinanter Phagen-DNA infiziert waren, wurden für die Herstellung von einzelsträngigen DNA-Matrizen durch eine Polyethylenglykolbehandlung (Sanger et al., 1977) selektiert. Einzelsträngige DNA wurde gemäß der Didesoxynukleotid-Kettenabbruch-Methode unter Verwendung eines Sequenase-Kits (United States Biochemical Corp.) sequenziert.
  • Nukleotidsequenz-Zugangsnummer:
  • Die Nukleotid-Zugangsnummer ist X69080 (EMBL Data Library).
  • ERGEBNISSE DER EXPERIMENTE DES TEILS I:
  • Expression von Ureaseaktivität durch H. felis-Cosmidklone:
  • Das Klonieren von partiell verdauten Fragmenten (30 bis 45 kb Größe) von chromosomaler H. felis-DNA in den Cosmidvektor pILL575 führte zur Isolierung von etwa 700 Cosmidklonen. Die Klone wurden auf Stickstoff-limitierendem Medium subkultiviert, um eine Ureaseexpression zu induzieren (Cussac et al., 1992). Sechs von diesen wurden dahingehend identifiziert, dass sie nach einer Inkubation von 5–6 h Urease-positiv waren (wie in dem Abschnitt zu experimentellen Prozeduren beschrieben). Es wurden keine anderen Urease-positive Cosmidklone identifiziert, selbst nach einer weiteren Übernacht-Inkubation. Die Restriktionsenzymanalyse von 3 Klonen, welche die Urease-codierenden Cosmide beherbergten, enthüllte ein gemeinsames 28 kD-DNA-Fragment. Ein Cosmid (als pILL199 bezeichnet), welches DNA-Regionen an beiden Extremitäten des gemeinsamen Fragments enthielt, wurde zur Subklonierung ausgewählt.
  • Identifizierung von H. felis-Genen, die für die Urease-Expression bei Klonierung in E. coli-Zellen erforderlich waren:
  • Um die minimale DNA-Region zu definieren, die für eine Urease-Expression in E. coli-Zellen notwendig war, wurde das Urease-codierende Cosmid pILL199 partiell mit Sau3A verdaut, und die Fragmente wurden in das Plasmid pILL570 subkloniert. Die Transformanten wurden auf stickstoffreichen und Stickstoff-limitierenden Medien subkultiviert und hinsichtlich eines Urease-positiven Phänotyps gescreent. Fünf Transformanten exprimierten Urease-Aktivität, wenn sie unter Stickstoff-limitierenden Bedingungen wachsen gelassen wurden, wohingegen keine Aktivität nachgewiesen wurde nach dem Wachstum auf stickstoffreichem Medium. Die Restriktionskartierungsanalysen zeigten, dass die Urease-codierenden Plasmide Inserts von 7 bis 11 kb enthielten. Das als pILL205 bezeichnete Plasmid wurde für weitere Untersuchungen gewählt.
  • Eine statistische Mutagenese von klonierter H. felis-DNA wurde durchgeführt, um mutmaßliche Regionen zu untersuchen, welche für die Urease-Expression in E. coli essenziell sind, und um die Region von klonierter DNA zu lokalisieren, welche die strukturellen Ureasegene enthielt. Mutanten mit statistischer Insertion von dem Prototyp-Plasmid pILL205 wurden somit unter Verwendung des MiniTn3-Km-Elementes erzeugt (Labigne et al., 1992). Die Stelle der Insertion wurde für jede der mutierten Kopien von pILL205 restriktionskartiert, und Zellen, welche diese Plasmide beherbergten, wurden qualitativ auf Ureaseaktivität getestet (1). Eine Auswahl von E. coli-HB101-Zellen, die die mutierten Derivate von pILL205 beherbergten (bezeichnet als "a" bis "i") wurden dann sowohl für quantitative Ureaseaktivitätsbestimmungen als auch für den Nachweis der mutmaßlichen Ureaseuntereinheiten durch Western-Blotting verwendet.
  • Die Urease-Aktivität von E. coli-HB101-Zellen, welche pILL205 beherbergen, betrug 1,2 ± 0,5 μMol Harnstoff min–1mg–1 Bakterienprotein (Tabelle 1), was etwa einem Fünftel von derjenigen des H. felis-Elternstammes, der für das Klonieren verwendet wurde, entspricht. Die Insertion des Transposons an den Stellen "a", "c", "d", "f" und "g" führte zu einem negativen Phänotyp, während Mutationen an den Stellen "b", "e", "h" und "i" keinen signifikanten Effekt auf die Urease-Aktivitäten von Klonen, welche diese mutierten Kopien von pILL205 beherbergten, hatten (Tabelle 1). Somit identifizierte die Mutagenese von pILL205 mit dem MiniTn3-Km-Element drei Domänen als für die H. felis-Urease-Genexpression in E. coli-Zellen erforderlich.
  • Lokalisation der H. felis-Urease-Strukturgene:
  • Die Western-Blot-Analyse von Extrakten von E. coli-Zellen, welche pILL205 beherbergten, zeigte die Anwesenheit von zwei Polypeptiden von etwa 30 und 66 kDa an, welche mit polyklonalem H. felis-Kaninchen-Antiserum kreuzreagierten (2A). Diese Proteine wurden nicht durch Bakterien hergestellt, die den Vektor (pILL570) trugen. Von nativer H. felis-Urease wurde berichtet, dass sie aus wiederkehrenden monomeren Untereinheiten mit berechneten Molekulargewichten von 30 und 69 kDA bestand (Turbett et al., 1992). Somit dachte man, dass die 30- und 66 kDa-Proteine den ure A- bzw. ure B-Genprodukten entsprachen. Interessanterweise exprimierte ein Extrakt von E. coli-Zellen, welche das rekombinante Plasmid pILL763 beherbergten (Cussac et al., 1992), enthaltend die Helicobacter pylori-ure A- und -ure B-Gene, zwei Polypeptide mit ungefähren Molekülgrößen von 30 und 62 kDa, welche mit den Anti-H. -felis-Antiseren kreuzreagierten (2B). Tabelle 1. Mutagenese von E. coli-Klonen und Auswirkung auf die Ureaseaktivität
    Plasmidea Ureaseaktivitätb (μMol Harnstoff min–1mg–1 Protein)
    pILL205 1,2 ± 0,46c
    pILL205 :: a negd
    pILL205 :: b 0,74 ± 0,32
    pILL205 :: c neg
    pILL205 :: d neg
    pILL205 :: e 0,54 ± 0,15
    pILL205 :: f neg
    pILL205 :: g neg
    pILL205 :: h 1,05 ± 0,25
    pILL205 :: i 0,93 ± 0,35
    • a E. coli-Zellen beherbergten pILL205 und seine Derivate, konstruiert durch Transposon-Mutagenese. Die Buchstaben entsprechen den Insertionsstellen des MiniTn3-Transposons auf pILL205.
    • b Aktivitäten von Bakterien, die aerob 3 Tage lang bei 37°C auf festem M9-Minimalmedium, das mit 10 mM L-Arginin ergänzt war, wachsen gelassen worden waren. Die Werte entsprechen den Mittelwerten ± Standardabweichungen, die aus drei Bestimmungen berechnet wurden.
    • c Die Ureaseaktivität war etwa ein Fünftel zu groß wie die des H. felis-Wildtypstamms (ATCC 49179), d. h. 5,7 ± 0,1 μMol Harnstoff min–1mg–1 Protein (Ferrero und Lee, 1991).
    • d Es wurde keine Aktivität nachgewiesen (die Detektionsgrenze betrug < 1 nMol Harnstoff min–1mg–1 Bakterienprotein).
  • Klone, die die mutierten Derivate von pILL205 beherbergten, exprimierten alle, mit Ausnahme von einem Fall, die ure A- und ure B-Genprodukte (2A, B). Vor dem Hintergrund, dass mehrere der Mutanten (d. h. die Mutanten "c", "d", "f" und "g") die Ureaseuntereinheiten synthetisierten, jedoch kein aktives Enzym herstellten, ist es möglich, zu spekulieren, dass Hilfsfunktionen, die für die Ureaseaktivität essenziell sind, durch die Transposoninsertion zerstört worden sein könnten. Im Gegensatz dazu stellte die als pILL205::a bezeichnete Mutante nicht das ure B-Produkt her und war Urease-negativ. Somit nahm man an, dass die Stelle der Transposoninsertion in dem ure B-Gen lokalisiert ist. Es wurden Sequenzanalysen der DNA-Region, die der Insertionsstelle "a" entsprach, vorgenommen, um potenzielle offene Leserahmen, welche die strukturellen Polypeptide von H. felis-Urease codieren, aufzuklären.
  • Sequenzanalysen von H. felis-Urease-Strukturgenen:
  • Die Sequenzierung einer 2,4 kb großen Region von H. felis-DNA, die zu der Transposon-Insertionsstelle "a" benachbart war, führte zu der Identifizierung von zwei offenen Leserahmen (ORFs), die als ure A und ure B bezeichnet wurden, welche in der gleichen Richtung transkribiert werden (3). Es wurde bestätigt, dass das Transposon 240 bp stromaufwärts vom Ende von ure B lokalisiert war. Beide ORFs fingen mit einem ATG-Startcodon an, und es ging ihnen eine Stelle voraus, die zu der E. coli-Konsensus-Ribosomenbindungs-Sequenz ähnlich war (Shine und Dalgarno, 1974). Der intergenische Raum für die H. felis-Strukturgene bestanden aus drei Codons, welche sich mit den benachbarten offenen Leserastern in Phase befanden. Dies legt nahe, dass, wie bereits im Fall von Helicobacter pylori festgestellt worden war (Labigne et al., 1991), eine einzelne Mutation im Stoppcodon des ure A-Gens theoretisch zu einem fusionierten einzelnen Polypeptid führen würde.
  • Die H. felis-ure A- und ure B-Gene codieren Polypeptide mit berechneten Molekulargewichten von 26 074 kDa bzw. 61 663 Da, welche in starkem Maße homolog auf der Ebene der Aminosäuresequenz zu den ure A- und ure B-Genprodukten von H. pylori sind. Die Spiegel der Identität zwischen den entsprechenden ure A- und ure B-Genprodukten der zwei Helicobacter spp. wurde mit 73,5% bzw. 88,2% berechnet. Aus der Aminosäuresequenzinformation sind die vorausgesagten Molekulargewichte der Ure A- und Ure B-Polypeptide von H. felis und H. pylori (Labigne et al., 1991) sehr ähnlich. Nichtsdestotrotz besaß das ure B-Produkt von H. felis eine niedrigere Mobilität als das entsprechende Genprodukt aus Helicobacter pylori, wenn es einer SDS-Polyacrylamidgelelektrophorese unterzogen wurde (2B).
  • REFERENZBEISPIEL II
  • II – EXPRESSION VON REKOMBINANTEN UREASE-UNTEREINHEITEN-PROTEINEN AUS H. PYLORI UND H. FELIS: UNTERSUCHUNG DIESER PROTEINE ALS POTEN-ZIELLE MUKOSALE IMMUNOGENE IN EINEM MAUSMODELL:
  • Die Ziele der Untersuchung waren es, rekombinante Antigene zu entwickeln, die aus den Urease-Untereinheiten von H. pylori und H. felis abstammen, und die immunoprotektiven Wirksamkeiten dieser Antigene in dem H. felis/Maus-Modell zu bestimmen. Jedes der Strukturgene, die die jeweiligen Urease-Untereinheiten von H. pylori und H. felis codieren, wurde unabhängig in Escherichia coli kloniert und überexprimiert. Die resultierenden rekombinanten Urease-Antigene (welche an ein 42 kDa großes Maltose-Bindungsprotein von E. coli fusioniert waren) wurden in großen Mengen aus E. coli-Kulturen gereinigt und waren immunogen, jedoch enzymatisch inaktiv. Die Befunde zeigten die Durchführbarkeit der Entwicklung eines rekombinanten Impfstoffes gegen H. pylori-Infektion.
  • EXPERIMENTELLE PROZEDUREN FÜR TEIL II:
  • Bakterienstämme, Plasmide und Wachstumsbedingungen:
  • H. felis (ATCC 49179) wurde auf einem Blutagarmedium wachsen gelassen, welches Blutagar-Grundlage Nr. 2 (Oxoid), ergänzt mit 10% lysiertem Pferdeblut (BioMérieux) und einer Antibiotikum-Ergänzung, bestehend aus Vancomycin (10 μg/ml), Polymyxin B (25 ng/ml), Trimethoprim (5 μg/ml) und Amphotericin B (2,5 μg/ml), enthielt. Bakterien wurden unter mikroaeroben Bedingungen bei 37°C 2 Tage lang kultiviert, wie es vorausgehend beschrieben wurde. Die E. coli-Stämme MC1061 und JM101, welche in Klonierungs- und Expressionsexperimenten verwendet wurden, wurden routinemäßig bei 37°C in Luria-Medium wachsen gelassen, und zwar mit oder ohne hinzugesetztem Agar. Die Antibiotika Carbenicillin (100 μg/ml) und Spectinomycin (100 μg/ml) wurden nach Bedarf hinzugesetzt.
  • DNA-Manipulationen und Analysen:
  • Alle DNA-Manipulationen und -Analysen wurden, wenn es nicht anders angegeben ist, gemäß Standardprozeduren durchgeführt. Restriktion- und Modifizierungsenzyme wurden von Amersham (Frankreich) gekauft. Zu klonierende DNA-Fragmente wurden aus Agarosegelen elektroeluiert und dann durch die Passagierung auf Elutip-Minisäulen (Schleicher und Schull, Deutschland) gereinigt. Die Sequenzierung von einzelsträngiger DNA wurde unter Verwendung von M13mp18- und M13mp19-Bakteriophagen-Vektoren (Pharmacia, Frankreich) durchgeführt. Einzelsträngige DNA-Matrizen wurden aus rekombinanter Phagen-DNA durch Polyethylenglykolbehandlung hergestellt. Die Sequenzierung der Matrizen wurde gemäß der Didesoxynuldeo tid-Kettenabbruch-Methode unter Verwendung eines Sequenase-Kits (United States Biochemical Corp., USA) erreicht.
  • Herstellung von Inserts für die Klonierung unter Anwendung der Polymerasekettenreaktion (PCR):
  • Um die ureA-Gene von H. pylori und H. felis zu klonieren, wurden degenerierte 36-mer-Primer aus den veröffentlichten Ureasesequenzen erhalten (Labigne et al., 1991; Ferrero und Labigne, 1993) (Primersatz Nr. 1; siehe Tabelle 2). Gereinigte DNA von E. coli-Klonen, welche die Plasmide pILL763 und pILL207 beherbergten (Tabelle 3), die die Strukturgene von H. pylori- und H. felis-Ureasen codierten, wurden als Matrizenmaterial in PCR-Reaktionen verwendet. Reaktionsproben enthielten: 10–50 ng an denaturierter DNA; PCR-Puffer (50 mMol/l KCl in 10 mMol/l Tris-HCl [pH 8,3]); dATP, dGTP, dCTP und dTTP (jeweils in einer Endkonzentration von 1,25 mMol/l); 2,5 mMol/l MgCl2; 25 pMol von jedem Primer und 0,5 μl Taq-Polymerase. Die Proben wurden 30 Zyklen des folgenden Programms unterzogen: 2 min bei 94°C, 1 min bei 40°C.
  • Die Amplifikationsprodukte wurden in die kohäsiven Enden des pAMP-Vektors (1) gemäß dem vom Hersteller ("CloneAmp System", Gibco BRL; Cergy Pontoise, Frankreich) beschriebenen Protokoll kloniert. Kurz gesagt, wurden 60 ng Amplifikationsprodukt direkt in einen Puffer (bestehend aus 50 mMol/l KCl, 1,5 mMol/l MgCl2, 0,1% (w/v) Gelatine in 10 mMol/l Tris-HCl, pH 8,3) mit 50 ng der pAMP-1-Vektor-DNA und 1 Einheit Uracil-DNA-Glycolsylase eingemischt. Die Ligation wurde 30 min lang bei 37°C durchgeführt. Kompetente Zellen (200 μl) von E. coli MC1061 wurden mit 20 μl der Ligationsmischung transformiert. Inserts wurden anschließend aus dem Polylinker des pAMP-Vektors durch Doppelverdau mit BamH1 und Pst1 herausgeschnitten und dann in den Expressionsvektor pMAL (New England Biolabs Inc., Beverly, USA), der für die Herstellung von rekombinanten Antigenen gewählt wurde (pILL919 bzw. pILL920, 13) gewählt wurde, sowie in M13mp-Bakteriophagen zur Sequenzierung subkloniert.
  • Die Amplifikation eines Produktes, welches das ureB-Gen von H. pylori enthielt, wurde durch PCR unter Verwendung eines Paares von 35-mer-Primern erhalten (Satz Nr. 2, Tabelle 2). Die PCR-Reaktionsmischungen wurden zuerst 3 min lang bei 94°C denaturiert, dann 30 Zyklen des folgenden Programms unterzogen: 1 min bei 94°C, 1 min bei 55°C und 2 min bei 72°C. Das gereinigte Amplikationsprodukt (1850 bp) wurde mit EcoRI und PstI verdaut und dann in pMAL kloniert (pILL927, 2). Kompetente Zellen von E. coli-MC1061 wurden mit der Ligationsreaktion transformiert.
  • H. felis-ureB wurde in einer Zwei-Stufen-Prozedur kloniert, welche die Herstellung sowohl von kompletten als auch von trunkierten Versionen der UreB-Untereinheit ermöglichte. Das Plasmid pILL213 (Tabelle 3) wurde mit den Enzymen DraI, entsprechend der Aminosäurerest-Nummer 219 der UreB-Untereinheit, und HindIII verdaut. Das resultierende 1350 bp große Fragment wurde gereinigt und in pMAL kloniert, welches mit XmnI und HindIII verdaut worden war (pILL219, 2). Um einen Klon herzustellen, der zur Synthese eines vollständigen UreB-Proteins in der Lage war, wurden PCR-Primer entwickelt (Satz Nr. 3, Tabelle 2), welche ein 685 bp großes Fragment aus dem N-terminalen Teil des ureB-Gens (ausschließlich des ATG-Codons) amplifizierten, welches ebenfalls den Start des Inserts im Plasmid pILL219 überlappte. Das durch PCR amplifizierte Material wurde gereinigt und mit BamHI und HindIII verdaut und dann in pMAL kloniert (pILL221, 14). Ein 1350 bp großes PstI-PstI-Fragment, das den restlichen Teil des UreB-Genprodukts codierte, wurde anschließend aus pILL219 herausgeschnitten und in eine linearisierte Präparation von pILL221 kloniert (pILL222, 14).
  • Expression von rekombinanten Ureasepolypeptiden in dem Vektor pMAL:
  • Der Expressionsvektor pMAL ist unter der Steuerung eines induzierbaren Promotors (Plac) und enthält ein offenes Leseraster (ORF), welches die Herstellung von MalE codiert (Maltose-Bindungsprotein, MBP). Sequenzen, die in Phase mit dem letztgenannten ORF kloniert wurden, führten zur Synthese von MBP-fusionierten Proteinen, welche leicht auf Amyloseharz gereinigt wurden. Von den zwei Versionen von pMAL, welche im Handel verfügbar sind, synthetisierte die Version, welche eine Signalsequenz nicht codierte (d. h. pMAL-c2), größere Mengen an rekombinanten Proteinen und wurde somit durchweg verwendet.
  • E. coli-Klone, welche rekombinante Plasmide beherbergten, wurden hinsichtlich der Herstellung von Fusionsproteinen gescreent, und zwar vor der Durchführung von Reinigungsexperimenten im großen Maßstab.
  • Reinigung von rekombinanten Ureasepolypeptiden:
  • Frische 500 ml große Volumina an Luria-Nährbrühe, die Carbenicillin (100 μg/ml) und 2% (w/v) Glukose enthielten, wurden mit Übernachtkulturen (5 ml) von E. coli-Klonen inokuliert. Die Kulturen wurden bei 37°C inkubiert und bei 250 U/min geschüttelt, bis der A600-Wert = 0,5 war. Vor der Zugabe von 1 mMol/l (Endkonzentration) Isopropyl-βD-thiogalactopyranosid (IPTG) zu den Kulturen wurde eine 1,0 ml große Probe genommen (nicht-induzierte Zellen). Kulturen wurden für weitere 4 h inkubiert, zu welchem Zeitpunkt eine weitere 1,0 ml große Probe (induzierte Zellen) genommen wurde. Die nicht-induzierten und induzierten Zellproben wurden später mittels SDS-Page analysiert.
  • IPTG-induzierte Kulturen wurden bei 7000 U/min 20 min lang bei 4°C zentrifugiert, und der Überstand wurde verworfen. Pellets wurden erneut in 50 ml Säulenpuffer (200 mMol/l NaCl, 1 mMol/l EDTA in 10 mMol/l Tris-HCl, pH 7,4), der die folgenden Proteaseinhibitoren (vertrieben von Boehringer, Mannheim, Deutschland) enthielt: 2 μMol/l Leupeptin, 2 μMol/l Pepstatin und 1 mMol/l Phenylmethylsulfonylfluorid (PMSF), erneut suspendiert. Intakte Zellen wurden durch die Passagierung durch eine French-Press-Zelle (16 000 lb/in2) lysiert. Zelltrümmer wur den durch Zentrifugation entfernt, und Lysate wurden in Säulenpuffer verdünnt, um eine Endkonzentration von 2,5 mg Protein/ml vor der Chromatographie auf einer 2,6 cm × 20 cm großen Säule aus Amyloseharz (New England Biolabs) zu erhalten. Das Harz wurde mit Säulenpuffer bei 0,5 ml/min so lange gewaschen, bis der A280-Wert zu den Werten zurückkehrte. Die MBP-fusionierten rekombinanten Proteine wurden von der Säule durch Waschen mit Säulenpuffer, der 10 mMol/l 1-Maltose enthielt, eluiert.
  • Fraktionen, welche die rekombinanten Proteine enthielten, wurden vereinigt und dann mehrere Male bei 4°C gegen einen Puffer mit niedrigem Salzgehalt (der 25 mMol/l NaCl in 20 mMol/l TrisHCl, pH 8,0, enthielt) dialysiert. Die vereinigten Fraktionen wurden dann bei einer Fließrate von 0,5 ml/min auf eine 1,6 × 10 cm große Anionen-Austauschsäule (HP-Sepharose, Pharmacia, Schweden), die an ein "Hi-Load"-Chromatographiesystem (Pharmacia) angeschlossen war, aufgetragen. Proteine wurden von der Säule unter Verwendung eines Salzgradienten (25 mMol/l bis 500 mMol/l NaCl) eluiert. Fraktionen, welche hohe Absorptionslesungen bei A280 ergaben, wurden gründlich gegen destilliertes Wasser bei 4°C dialysiert und mittels SDS-PAGE analysiert.
  • Kaninchen-Antiseren:
  • Polyklonale Kaninchen-Antiseren wurden gegen Gesamtzellextrakte des H. pylori-Stamms 85P (Labigne et al., 1991) und H. felis (ATCC49179) hergestellt. Polyklonale Kaninchen-Antiseren gegen rekombinante Proteinpräparationen von H. pylori- und H. felis-Urease-Untereinheiten wurden durch die Immunisierung von Kaninchen mit 100 μg an gereinigtem rekombinanten Protein in Freund'schem vollständigem Adjuvans (Sigma) hergestellt. Vier Wochen später erhielten Kaninchen eine Huffrisch-Immunisierung mit 100 μg Protein in unvollständigem Freund'schem Adjuvans. In der 6. Woche wurden die Tiere abschließend ausgeblutet, und die Seren wurden bei –20°C aufbewahrt.
  • Proteinanalysen durch SDS-PAGE und Western-Blotting:
  • Solubilisierte Zellextrakte wurden auf Flachgelen, die 4,5% Acrylamid-Sammelgel und ein 10%iges Trenngel umfassten, gemäß der Prozedur von Laemmli analysiert. Eine Elektrophorese wurde bei 200 V auf einer Mini-Flachgel-Apparatur (Bio-Rad, USA) durchgeführt.
  • Proteine wurden auf Nitrocellulosepapier in einer Mini-Trans-Blot-Transferzeile (Bio-Rad), die 1 h lang auf 100 V eingestellt worden war, unter Kühlung transferiert. Nitrocellulosmembranen wurden mit 5% (w/v) Casein (BDH, England) in Phosphat-gepufferter Kochsalzlösung (PBS, pH 7,4) unter sanftem Schütteln bei Raumtemperatur während 2 h blockiert. Membranen wurden bei 4°C über Nacht mit Antiseren, die in mit PBS hergestelltem 1%igen Casein verdünnt waren, umgesetzt. Immunoreaktanten wurden durch Verwendung von spezifischen biotinylierten sekundären Antikörpern und Streptavidin-Peroxidase-Konjugat (Kirkegaard und Party Lab., Gaithersburg, USA) detektiert. Reaktionsprodukte wurden auf Autoradiographie-Film (Hyperfilm, A mersham, Frankreich) unter Anwendung einer Chemilumineszenz-Technik (ECL-System, Amersham) visualisiert.
  • Die Proteinkonzentrationen wurden durch das Bradford-Assay (Sigma Chemicals Corp., St. Louis, USA) bestimmt.
  • Tierexperimente:
  • Sechs Wochen alte, weibliche "Swiss Specific" pathogenfreie (SPF) Mäuse wurden erhalten (Centre d'Elevage R. Janvier, Le-Genest-St-Isle, Frankreich) und auf einer kommerziellen Pellet-Diät mit Wasser ad libitum gehalten. Die Därme der Tiere wurden auf Abwesenheit von Helicobacter muridarum gescreent. Für alle orogastrischen Verabreichungen wurden 100 μl große Aliquots Mäusen unter Verwendung von 1,0 ml großen wegwerfbaren Spritzen zugeführt, an welchen Polyethylenkatheter (Biotrol, Paris, Frankreich) befestigt waren.
  • Herstellung von ultrabeschallten Extrakten und Inokula aus H. felis-Kulturen:
  • H. felis-Bakterien wurden in PBS geerntet und bei 5 000 U/min 10 min lang in einer Sorvall RC-5-Zentrifuge (Sorvall, USA) bei 4°C zentrifugiert. Die Pellets wurden zweimal gewaschen und in PBS erneut suspendiert. Bakteriensuspensionen wurden wie vorstehend beschrieben ultrabeschallt und mindestens einem Gefrier-Auftau-Zyklus unterzogen. Proteinbestimmungen wurden bezüglich der Sonicate durchgeführt.
  • Um eine virulente Kultur von H. felis für Schutzuntersuchungen sicherzustellen, wurden H. felis-Bakterien in vivo so lange gehalten, wie erforderlich. Kurz gesagt, wurden Mäuse dreimal (mit 1010 Bakterien/ml) über einen Zeitraum von 5 Tagen inokuliert. Die Bakterien wurden aus Magenbiopsien auf Blutagarmedium erneut isoliert (4- bis 7-tägige Inkubation in einer mikroaeroben Atmosphäre bei 37°C). Bakterien, die zwei Tage lang auf Blutagarplatten wachsen gelassen worden waren, wurden direkt in Peptonwasser geerntet (Difco, USA). Bakterielle Lebensfähigkeit und Motilität wurde durch Phasenmikroskopie vor der Verabreichung an Tiere bestimmt.
  • Maus-Schutzstudien:
  • Fünfzig μg an rekombinantem Antigen und 10 μg Cholera-Holotoxin (Sigma Chemical Corp.), die beide in HCO3 resuspendiert worden waren, wurden Mäusen orogastrisch in den Wochen 0, 1, 2 und 3 verabreicht. Mäuse, die mit ultrabeschallten H. felis-Extrakten (die 400–800 μg Gesamtprotein enthielten) immunisiert worden waren, wurde ebenfalls 10 μg Choleratoxin gegeben. In der 5. Woche wurde die Hälfte der Mäuse von jeder Gruppe mit einem Inokulum von virulenten H. felis herausgefordert. Der Rest der Mäuse erhielt eine zusätzliche "Boost"-Immunisierung in der Woche 15. In der Woche 17 wurden die letzteren mit einer Kultur von H. felis herausgefordert.
  • Bestimmung der H. felis-Kolonisierung der Maus:
  • Zwei Wochen nach dem Erhalt der Herausforderungsdosis (d. h. Woche 7 bzw. 19) wurden Mäuse durch spinale Dislokation getötet. Die Mägen wurden zweimal in sterilem 0,8%igen NaCl gewaschen, und ein Teil des gastrischen Antrums von jedem Magen wurde auf die Oberflächen von 12 cm × 12 cm großen Agarplatten gegeben, die ein Harnstoff-Indikatormedium (2% Harnstoff, 120 mg Na2HPO4, 80 mg KH2PO4, 1,2 mg Phenol-Rot, 1,5 g Agar, hergestellt in 100 ml) enthielten. Der Rest von jedem Magen wurde in Formal-Kochsalzlösung gegeben und solange gelagert, bis er für die Histologie verarbeitet wurde. Longitudinale Schnitte (4 μm) der Mägen wurden geschnitten und routinemäßig durch die Giemsa-Technik angefärbt. Sofern notwendig, wurden Schnitte zusätzlich durch die Hämatoxylin-Eosin- und Warthin-Starry-Silber-Anfärbungstechniken gefärbt.
  • Die Anwesenheit von H. felis-Bakterien in der Mäuse-Magenschleimhaut wurde durch den Nachweis von Ureaseaktivität (für bis zu 24 h) auf dem Indikatormedium bestimmt, sowie durch das Screenen von mit Giemsa-angefärbten Magen-Schnitten, welche codiert worden waren, um die Beeinflussung durch Beobachter zu eliminieren. Die Anzahl an Bakterien in Magen-Schnitten wurden halbquantitativ gemäß dem folgenden Schema bewertet: 0, in den gesamten Schnitten waren keine Bakterien ersichtlich; 1, überall waren wenige Bakterien (< 20) ersichtlich; 2, gelegentlich Hochauflösungs(H.P., high power)-Feld mit geringen Anzahlen (< 20) von Bakterien; 3, gelegentlich H.P.-Feld mit geringen bis mäßigen Anzahlen (< 50) von Bakterien; und 4, zahlreiche (> 5) H.P.-Felder mit hohen Anzahlen von Bakterien (> 50). Mononukleäre Zell-Infiltrate wurden wie folgend bewertet: 0, keine signifikante Infiltration; 1, Infiltration geringer Anzahlen von mononukleären Zellen, beschränkt auf die Submucosa und Muscularis mucosa; 2, Infiltration mäßiger Zahlen von mononukleären Zellen zur Submucosa und Muscularis mucosa, manchmal unter Bildung loser Aggregate; und 3, Infiltration großer Zahlen an mononukleären Zellen und Aufzeigen nodulärer Agglomerationen von Zellen.
  • ERGEBNISSE VON EXPERIMENTEN DES TEILS II:
  • Expression von Helicobacter-Urease-Polypeptiden in E. coli:
  • Fragmente, die die Sequenzen enthielten, die die jeweiligen UreA-Genprodukte von H. felis und H. pylori codierten, wurden mittels PCR amplifiziert und in Phase mit einem ORF, das das 42-kDa große MBP codierte, vorliegend auf dem Expressionsvektor pMAL, kloniert. Die Sequenzierung der PCR-Produkte enthüllte kleinere Nukleotidänderungen, welche jedoch nicht die abgeleiteten Aminosäuresequenzen der jeweiligen Genprodukte veränderten. E. coli-MC1061-Zellen, welche mit diesen rekombinanten Plasmiden (pILL919 bzw. pILL920) transformiert waren, exprimierten Fusionsproteine mit vorausgesagten Molekulargewichten von etwa 68 kDa. Nach der Chromatographie auf Affinitäts- (Amyloseharz) und Anionenaustausch-Gelmedien (Q-Sepharose) wurden diese Proteine bis zu einem hohen Reinheitsgrad gereinigt (1). Die Ausbeute aus 2-Liter-Kulturen von rekombinanten E. coli-Zellen betrug etwa 40 mg an gereinigtem Antigen.
  • In entsprechender Weise wurden große UreB-Untereinheiten von H. pylori- und H. felis-Ureasen in E. coli (Plasmide pILL927 bzw. pILL222) exprimiert und Fusionsproteine mit vorhergesagten Molekulargewichten von 103 kDa hergestellt. Die Ausbeute in diesen Fällen war deutlich niedriger als für die UreA-Präparationen (etwa 20 mg wurden aus 2 Liter Bakterienkultur gewonnen). Außerdem traf man auf Probleme, die mit der Abspaltung der UreB-Polypeptide von dem MBP-Teil der Fusionsproteine assoziiert waren. Diese Schwierigkeiten schrieb man den hohen Größen der rekombinanten UreB-Polypeptide zu.
  • Analyse der rekombinanten Urease-Polypeptide:
  • Westernblot-Analysen der Antigenpräparationen mit polyklonalen Kaninchen-Antiseren, die gegen Gesamtextrakte von H. pylori- und H. felis-Bakterien gezüchtet worden waren, zeigten, dass die Antigene Immunogenizität zu den homologen sowie zu den heterologen Antiseren beibehielten (14 und 15). Die Antiseren erkannten nicht die MBP-Komponente allein. Die Kreuzreaktivität zwischen den Ureasepolypeptiden von H. pylori und H. felis war konsistent mit den hohen Identitätsgraden zwischen den Aminosäurensequenzen von diesen Proteinen.
  • Polyklonale Kaninchen-Antiseren, die gegen gereinigte, aus H. pylori und H. felis hergestellte, rekombinante UreA- und UreB-Proteine, herangezogen worden waren, reagierten stark mit den Ureasepolypeptiden, die in Ganzzellextrakten der Bakterien vorlagen (16). Wie wir bereits festgestellt hatten, wanderte die UreB-Untereinheit von H. felis-Urease etwas höher auf SDS-PAGE-Gelen, als es jene von H. pylori tat (16).
  • Herstellung von H. felis-Inokula, die in Immunoschutzstudien verwendet wurden:
  • Um die Virulenz von H. felis-Bakterieninokula sicherzustellen, wurden Bakterien aus Mägen von mit H. felis infizierten Mäusen erneut isoliert (siehe Materialien und Methoden). Die Bakterien wurden eine minimale Anzahl von Malen in vitro passagiert. Vorratskulturen, die aus diesen Bakterien hergestellt worden waren und bei –80°C gelagert worden waren, wurden verwendet, um frische Inokula für andere Maus-Schutzstudien herzustellen. Diese Prozedur stellte sicher, dass die in aufeinanderfolgenden Experimenten verwendeten Inokula reproduzierbar waren.
  • Immunisierung von Mäusen gegen gastrische H. felis-Infektion:
  • Mäuse, welche drei Wochen lang mit den angegebenen Antigenpräparationen immunisiert worden waren, wurden in zwei Gruppen aufgeteilt, und eine Hälfte von diesen wurde zwei Wochen später mit einem H. felis-Inokulum, das 107 Bakterien/ml enthielt, herausgefordert. Eine Gruppe von Tieren, welche mit rekombinanter H. felis-UreA immunisiert worden war, wurde ebenfalls herausgefordert, aber wurde im Gegensatz zu den anderen Tieren erst in Woche 19 getötet.
  • a) Schutz in der Woche 5:
  • Fünfundachtzig % von Magen-Biopsieproben von der Kontrollgruppe von Mäusen, die mit H. felis-Sonicatpräparationen immunisiert worden waren, waren Urease-negativ und schienen deshalb vor einer H. felis-Infektion geschützt gewesen zu sein (Tabelle 4). Dies steht im Vergleich zu 20% von jenen der anderen Kontrollgruppe an Tieren, denen nur MBP allein gegeben worden war. Der Anteil von Urease-negativen Mägen für diese Gruppen von Mäusen, welchen die rekombinanten Urease-Untereinheiten gegeben worden waren, variierte von 70% (für H. pylori-UreB) bis 20% (für H. pylori-UreA).
  • Die Grade der Bakterienkolonisation durch H. felis wurde ebenfalls aus codierten histologischen Objektträgern, die aus gastrischem Gewebe hergestellt wurden, bestimmt. Aufgrund der auffälligen helikalen Morphologie von H. felis-Bakterien konnten die Organismen leicht auf den Schleimhautoberflächen sowohl von der Magengrube als auch den glandulären Regionen des Magens gesehen werden. Histologische Hinweise deuteten darauf hin, dass das Ausmaß des Schutzes in Mäusen niedriger war, als jenes, welches durch den Biopsie-Ureasetest festgestellt wurde: 25% bzw. 20% von gastrischem Gewebe aus Mäusen, die mit H. felis-Ultraschallpräparationen von H. pylori-UreB immunisiert worden waren, waren frei von H. felis-Bakterien.
  • Unter bestimmten Gruppen von diesen Mäusen legten das Vorherrschen von Urease-negativen Biopsien sowie die niedrigeren histologischen Werte für Bakterienkolonisation (nicht veröffentlichte Daten) nahe, dass eine immunoprotektive Antwortreaktion in den Tieren hervorgerufen worden war. Diese Antwortreaktion könnte jedoch unzureichend gewesen sein, um gegen das Inokulum zu schützen, das während der Herausforderungsprozedur verabreicht worden war.
  • b) Schutz in der Woche 17:
  • Die verbleibenden Mäuse von jeder Gruppe von Tieren wurden in der Woche 15 geboostet. Diese Mäuse wurden in der Woche 17 mit einem H. felis-Inokulum, das etwa 100-mal weniger Bakterien als das vorausgehend verwendete enthielt, herausgefordert. Zwei Wochen später waren alle Magenbiopsien von den MBP-immunisierten Mäusen Urease-positiv (Tabelle 4). Dagegen variierte die Ureaseaktivität für gastrische Biopsien von Mäusen, die mit den rekombinanten Urease-Untereinheiten immunisiert worden waren, von 50% für H. pylori-UreA bis 100% für H. felis-UreB. Das Letztere war vergleichbar zu dem Schutzgrad, der für die Gruppe von Tieren festgestellt worden war, die mit H. felis-Ultraschallextrakten immunisiert worden waren. Histologische Befunde zeigten, dass die UreB-Untereinheiten von H. felis und H. pylori 60% bzw. 25% von immunisierten Tieren schützten. Dies ist zu vergleichen mit einem Grad von 85%igen Schutz für Mäuse, die mit H. felis-Ultraschallextrakten immunisiert worden waren. Die Immunisierung von Mäusen mit rekombinanter H. pylori-UreA schützte die Tiere nicht. In entsprechender Weise waren die Mägen von allen H. felis-UreA-immunisierten Mäusen, die in der Woche 5 herausgefordert worden waren, in der Woche 19 stark mit H. felis-Bakterien kolonisiert (Tabelle 4).
  • Der Urease-Magenbiopsietest ergab, wenn er mit der histologischen Analyse von Magengewebeschnitten verglichen wurde, Empfindlichkeits- und Spezifitätswerte von 63% bzw. 95%. Somit stellte sich die Histologie als das genauere Vorhersagemedium einer H. felis-Infektion in der Maus heraus.
  • Zelluläre Immunantwort in immunisierten Mägen:
  • Zusätzlich zu der histologischen Bestimmung von H. felis-Kolonisation wurde das gastrische Mausgewebe ebenfalls beurteilt (von 0 bis 3) bezüglich der Anwesenheit einer mononukleären Zellantwort. In Mäusen, die mit MBP allein immunisiert worden waren, wurde eine milde chronische Gastritis mit kleinen Zahlen von mononukleären Zellen festgestellt, die auf die Muscularis mucosa und auf die Submucosa des gastrischen Epitheliums beschränkt waren. Im Gegensatz dazu gab es eine beträchtliche Anzahl von mononukleären Zellen, die in den Magenschleimhäuten von Tieren vorlagen, welche entweder mit den rekombinanten Urease-Polypeptiden oder mit H. felis-Ultraschallpräparationen immunisiert worden waren. Diese Entzündungszellen koaleszierten unter Bildung entweder von losen Aggregaten in den submukosalen Regionen des Gewebes oder nodulären Strukturen, welche sich zu den mukosalen Regionen der gastrischen Epithelien hin erstreckten. Die mononukleäre Zellantwort schien nicht mit der Anwesenheit von Bakterien im Zusammenhang zu stehen, da die Magenschleimhäute von den mit H. felis-UreA immunisierten Mäusen, welche stark mit H. felis-Bakterien kolonisiert waren, nur wenig oder keine mononukleären Zellen enthielten.
  • Tabelle 2: Die oligomeren Primer, die in der PCR-basierten Amplifizierung von Ureasecodierenden Nukleotidseauenzen verwendet wurden.
    Figure 00310001
    • * Degenerierte Nukleotide, in welchen alle möglichen Permutationen des genetischen Codes eingeschlossen waren (A, T, G, C).
    • G, C, T Die angeführten Nukleotide waren mit der bzw. den spezifischen Base(n) degeneriert.
    • V Restriktionsstellen, die in die amplifizierten Fragmente eingeführt wurden.
    Tabelle 3: Verwendete Plasmide
    Plasmid Vektor Relevanter Phänotyp oder Charakter Referenz
    pILL763 pILL570 9,5 kb großes Fragment (partieller Sau3a-Verdau vom H. pylori-Chromosom) (SpR) Cussac et al., 1991
    pILL199 pILL575 35 kb großes Fragment (partieller Sau3A-Verdau vom H. felis-Chromosom) Ferrero & Labigne, '93
    pILL207 pILL570 11 kb großes Fragment (partieller Sau3A-Verdau von pILL199) Diese Studie
    pILL919 pMAL-C2 0,8 kb großes BamHI-PstIa-Insert, welches ein das H. felis-ureA-Gen codierendes Nukleotidfragment enthält (ApR) Diese Studie
    pILL920 pMAL-C2 0,8 kb großes BamHI-PstIa-Insert, welches das H. pylori-ureA-Gen codierendes PCR-Produkt enthält Diese Studie
    pILL927 pMAL-C2 1,8 kb großes EcoRI-PstIa-PCR-Fragment, welches das H. pylori-ureB-Gen codiert Diese Studie
    pILL213 pUC19 2 kb großes Fragment, welches aus dem partiellen Sau3A-Verdau von pILL207 resultiert (ApR) Diese Studie
    pILL219 pMAL-C2 1,4 kb großes DraI-HindIIIb-Insert, welches H. felis-ureB enthält (Base 657-1707) Diese Studie
    pILL 221 pMAL-C2 0,7 kb großes BamHI-PstI-PCR-Fragment, welches H. felis-ureB codiert (Basen 4-667) Diese Studie
    pILL222 pMAL-C2 1,35 kb großes PstI-PstIc-Fragment, welches H. felis-ureB (Basen 667-1707) codiert, aus pILL219, kloniert in linearisiertes pILL221 Diese Studie
    Tabelle 4: Schutz von Mäusen durch Immunisierung mit rekombinanten Ureaseproteinen.
    Antigen Schutz(%)a
    Urease Histologie
    MBP 0% (0/10) 0% (0/10)
    UreA H. pylori 50 (4/8) 0 (0/10)
    UreA H. felisb 12,5 (1/8) 0 (0/10)
    UreB H. pylori 65 (5/8) 25 (2/8)
    UreB H. felis 100 (7/7) 60 (5/7)
    H. felis-Sonicat 100 (8/8) 85 (7/8)
    • a Die Herausforderungs-Inokulumdosis betrug 105 Bakterien/Maus
    • b Die Mäuse wurden in der Woche 5 herausgefordert (mit 107 Bakterien) und wurden in der Woche 19 getötet.
  • BEISPIEL I
  • III – HELICOBACTER PYLORI hspA-B-HITZESCHOCK-GENCLUSTER: NUKLEOTIDSEQUENZ; EXPRESSION UND FUNKTION:
  • Ein Homolog der Hitzeschockproteine (HSPs) der GroEL-Klasse, das eng mit der Urease von Helicobacter pylori (einem Nickel-Metalloenzym) assoziiert sein soll, wurde vor kurzem aus H. pylori-Zellen von Dunn et al. und Evans et al. (Infect. Immun. 60:1946, 1992, 1946 bzw. 2125) gereinigt. Auf Basis der berichteten N-terminalen Aminosäuresequenz dieses immundominanten Proteins wurden degenerierte Oligonukleotide synthetisiert, um auf das Gen (hspB), welches das GroEL-artige Protein in dem Chromosom des H. pylori-Stamms 85P codiert, zu zielen. Im Anschluss an die Gen-Amplifikation wurde ein 108 Basenpaare (bp) großes Fragment, welches die 36 ersten Aminosäuren des HspB-Proteins codiert, gereinigt und als eine Sonde zur Identifizierung eines rekombinanten Cosmids, welches das gesamte HspB codierende Gen beherbergt, in der genomischen H. pylori-Bank verwendet. Das hspB-Gen wurde auf ein 3,15 Kilobasen (kb) großes BglII-Restriktionsfragment des Cosmids pILL684 kartiert. Die Nuldeotidsequenz dieses in den pILL570-Plasmidvektor (pILL689) subklonierten Fragments enthüllte das Vorhandensein von zwei offenen Leserahmen (ORFs), die als hspA und hspB bezeichnet werden, deren Organisation sehr ähnlich mit bicistronischen groESL-Operons von anderen Bakterienspezies war. hspA und hspB codieren Polypeptide von 118 bzw. 545 Aminosäuren, was berechneten Molekülmassen von 13,0 bzw. 58,2 Kilodalton (kDa) entspricht. Aminosäuresequenz-Vergleichsstudien enthüllten i) dass das H. pylori HspA- und HspB-Protein sehr ähnlich zu ihren bakteriellen Homologen waren; ii) dass das HspA-H. pylori-Protein ein auffallendes Motiv am Carboxyl-Terminus aufzeigt, das anderen bakteriellen GroEs-Homologen fehlt; dieses einmalige Motiv besteht aus einer Reihe von acht Histidinresten, die einer Metall bindenden, wie etwa einer Nickel bindenden, Domäne ähneln. Überraschenderweise wurde unmittelbar stromaufwärts des Genclusters ein IS5-Insertionselement gefunden, das in dem H. pylori-Genom fehlte, und wurde positiv während des Cosmid-Klonierungsverfahrens selektioniert. Die IS5, so wurde herausgefunden, ist an der Expression der hspA- und hspB-Gene in pILL689 beteiligt. Die Expression der HspA- und HspB-Proteine von dem pILL689-Plasmid aus wurde in einem Minizellen produzierenden Stamm analysiert. Beide Polypeptide, so wurde gezeigt, werden konstitutiv in den E. coli-Zellen exprimiert. Wenn das rekombinante pILL689-Plasmid zusammen mit dem H. pylori-Urease-Gencluster in einen E. coli-Wirtsstamm eingeführt wurde, war ein Anstieg der Urease-Aktivität zu beobachten, was auf eine enge Wechselbeziehung zwischen den Hitzeschockproteinen und dem Ureaseenzym hindeutet. Das Konzept einer spezifischen Funktion für das HspA-Chaperon wurde durch die Tatsache gestützt, dass, während eine einzelne hspB-Kopie im H. pylori-Genom gefunden wurde, zwei Kopien des hspA in dem Genom gefunden wurden, eine gekoppelt mit dem hspB-Gen und eine nicht gekoppelt mit dem hspB-Gen. Versuche, isogene Mutanten von H. pylori hinsichtlich des hspA- und des hspB-Gens zu konstruieren, waren ohne Erfolg, was darauf hindeutet, dass diese Gene für das Überleben der Bakterien essentiell sind.
  • EXPERIMENTELLE PROZEDUREN FÜR TEIL III:
  • Bakterienstämme, Plasmide und Kulturbedingungen:
  • Die Klonierungsexperimente wurden mit genomischer DNA durchgeführt, die aus dem H. pylori-Stamm 85P hergestellt wurde. Der H. pylori-Stamm N6 wurde wegen seiner günstigen Transformierbarkeit als Empfengerstamm für die Elektroporationsexperimente verwendet. Der E. coli-Stamm HB101 oder der Stamm MC1061 wurden als ein Wirt für Cosmid-Klonierungs- bzw. -Subklonierungsexperimente verwendet. E. coli P678-54 wurde für die Herstellung von Minizellen verwendet. In dieser Studie verwendete Vektoren und rekombinante Plasmide sind in Tabelle 1 aufgeführt. H. pylori-Stämme wurden auf Pferdeblut-Agar-Platten wachsen gelassen, die mit Vancomycin (10 mg/l), Polymyxin B (2500 U/I), Trimethoprim (5 mg/l) und Amphotericin B (4 mg/l) ergänzt waren. Platten wurden bei 37°C unter mikroaeroben Bedingungen in einem anaeroben Gefäß mit einer Kohlendioxid-Generator-Hülle (BBL 70304) inkubiert. E. coli-Stämme wurden in L-Kulturlösung ohne Glucose (10 g Trypton, 5 g Hefeextrakt und 5 g NaCl pro Liter; pH-Wert 7,0) oder auf L-Agar-Platten (1,5% Agar) bei 37°C gezüchtet. Für die Messung der Urease-Aktivität bestand das verwendete Strickstoff-begrenzende Medium aus Ammoniumfreiem M9-Minimal-Agarmedium (pH-Wert 7,4), das 0,4% D-Glucose als Kohlenstoffquelle enthielt, und dem frisch zubereitetes filtersterilisiertes L-Arginin zu einer Endkonzentration von 10 mM zugegeben wurde. Die Antibiotika-Konzentrationen für die Selektion rekombinanter Klone waren wie folgt (in Milligramm pro Liter): Kanamycin, 20; Spectinomycin, 100; Carbenicillin, 100.
  • Herstellung von DNA:
  • Genomische DNA von H. pylori wurde wie zuvor beschrieben hergestellt. Cosmid- und Plasmid-DNAs wurden durch eine alkalische Lyse-Prozedur hergestellt, gefolgt von einer Reinigung in Cäsiumchlorid-Ethidiumbromid-Gradienten, wie früher beschrieben.
  • Cosmid-Klonierung:
  • Die Konstruktion der Cosmid-Genbank von H. pylori 85P in E. coli HB101, die für die Klonierung des H. pylori-hspA-B-Genclusters verwendet wurde, ist früher beschrieben worden.
  • DNA-Analyse und Klonierungsmethodik:
  • Restriktions-Endonuldeasen, T4 DNA-Ligase, das große DNA-Polymerase-I(Klenow)-Fragment und Taq-Polymerase wurden von Amersham, T4-DNA-Polymerase von Biolabs und Kälberdarm-Phosphatase von Pharmacia bezogen. Alle Enzyme wurden entsprechend den Anleitungen der Hersteller verwendet. DNA-Fragmente wurden auf Agarosegelen, die in Tris-Acetat-Puffer laufen gelassen wurden, separiert. Die 1-kb-Leiter von Bethesda Research Laboratories wurde als ein Fragmentgrößenstandard verwendet. Erforderlichenfalls wurden die DNA-Fragmente durch Elektroelution aus Agarosegelen wie früher beschrieben isoliert und aus dem Laufpuffer mittels einer Elutip-d-Minisäule (Schleicher und Schuell, Dassel, Deutschland) gewonnen. Grundlegende DNA-Manipulationen wurden gemäß den von Sambrook et al. beschriebenen Protokollen durchgeführt.
  • Hybridisierung:
  • Kolonie-Blots zum Screening der H. pylori-Cosmid-Bank und für die Identifizierung von Subklonen wurden auf Nitrozellulose-Membranen (Schleicher und Schuell, Dassel, Deutschland) gemäß dem Protokoll von Sambrook et al. (43) hergestellt. Die radioaktive Markierung von PCR-Produkten wurde durch Zufalls-Priming durchgeführt, wobei als Primer Zufalls-Hexamere von Pharmacia verwendet werden. Kolonie-Hybridisierungen wurden unter hochstringenten Bedingungen durchgeführt (5 × SSC, 0,1% SDS, 50% Formamid, 42°C) (1 × SSC; 150 mM NaCl, 15 mM Natriumcitrat, pH-Wert 7,0). Für Southern-Blot-Hybridisierungen wurden DNA-Fragmente aus Agarosegelen auf Nitrozellulose-Blätter übertragen (0,45 μm Porengröße; Schleicher & Schuell, Inc.), und unter niederstringenten Bedingungen hybridisiert (5 × SSC, 0,1% SDS, 30 oder 40% Formamid bei 42°C mit 32P-markierten Desoxyribonukleotid-Sonden. Die Hybridisierung wurde durch Autoradiographie mit Hilfe von Amersham Hyperfilm-MP offenbart.
  • DNA-Sequenzierung:
  • Geeignete Fragmente von Plasmid-DNA wurden in M13 mp 18/19-Vektoren subkloniert. Einsträngige DNA wurde durch Phageninfektion des E. coli-Stamms JM101 hergestellt. Die Sequenzierung erfolgte durch das Didesoxynukleotid-Kettenabbruchverfahren unter Verwendung des Sequenase-Kits von United States Biochemicals. Sowohl der M13-Universalprimer als auch zusätzliche spezifische Primer (1) wurden zur Sequenzierung sowohl der codierenden als auch der nicht-codierenden DNA-Stränge verwendet. Die Sequenzierung doppelsträngiger DNA erfolgte wie zuvor beschrieben. Eine direkte Sequenzierung von PCR-Produkt wurde im Anschluss an die Reinigung des amplifizierten, elektroeluierten PCR-Produkts durch eine Elutip-d-Minisäule (Schleicher & Schuell) durchgeführt. Das klassische Protokoll für die Sequenzierung mit Hilfe des Sequenase-Kits wurde dann mit den folgenden Modifizierungen verwendet: PCR-Produkt wurde durch Kochen von Annealing-Mischung, die 200 Pikomol des als Primer verwendeten Oligonukleotids und DMSO zu der Endkonzentration von 1% enthielt, während 3 Minuten denaturiert; die Mischung wurde dann sofort auf Eis gekühlt; der Markierungsschritt wurde in Gegenwart von Manganionen (mM) durchgeführt.
  • Elektroporation von H. pylori:
  • In dem Bestreben, H. pylori-Mutanten zu konstruieren, wurden passende Plasmidkonstruktionen, welche das angezielte Gen trugen, das durch eine ein Kanamycin-Resistenzgen (aph3'-III) enthaltende Kassette disruptiert war, in den H. pylori-Stamm N6 mittels Elektroporation wie zuvor beschrieben transformiert. Plasmid pSUS 10, welches das Kanamycin-disruptierte flaA-Gen beherbergte, wurde als Positivkontrolle der Elektroporation verwendet. Nach der Elektroporation wurden Bakterien auf nicht-selektiven Platten für einen Zeitraum von 48 h wachsen gelassen, um die Expression der Antibiotikum-Resistenz zu ermöglichen, und anschließend auf Kanamycin enthaltende Platten übertragen. Die Selektionsplatten wurden bis zu 6 Tage lang inkubiert.
  • Polymerase-Kettenreaktion (PCR):
  • PCRs wurden mit Hilfe eines Perkin-Elmer Cetus-Thermozyklergeräts unter Verwendung des GeneAmp-Kits (Perkin-Elmer Cetus) durchgeführt. Die klassische Amplifikationsreaktion beinhaltete 50 Pikomol (pmol) jedes Primers und mindestens 5 pmol der Ziel-DNA. Die Ziel-DNA wurde vor der Zugabe zu der Amplifikationsreaktion wärmedenaturiert. Die Reaktion bestand aus 25 Zyklen der folgenden drei Schritte: Denaturierung (94°C für 1 Minute), Annealing (bei Temperaturen im Bereich zwischen 42 und 55°C, in Abhängigkeit von den berechneten Schmelztemperaturen der Primer, während 2 min) und Verlängerung (72°C während 2 min). Wenn degenerierte Oligonuldeotide unter nicht-stringenten Bedingungen verwendet wurden, wurden bis zu 1000 pmol von jedem Oligonuldeotid zugegeben, 50 Zyklen wurden durchgeführt, und ein Annealing erfolgte bei 42°C.
  • Analyse von in Minizellen exprimierten Proteinen:
  • Minizellen, welche das geeignete Hybridplasmid beherbergten, wurden isoliert und mit [35S]-Methionin (50 μCi/ml) markiert. Ungefähr 100 000 cpm mit Aceton ausfällbares Material wurden einer Natriumdodecylsulfat(SDS)-Polyacrylamidgel-Elektrophorese in einem 12,5%igen Gel unterworfen. Standard-Proteine mit Molekulargewichten im Bereich von 94 000 bis 14 000 ("low <"-Molekulargewichte-Kit von Bio-Rad Laborstories) wurden parallel laufen gelassen. Das Gel wurde angefärbt und durch Fluorographie unter Verwendung von En3Hance (New England Nuclear) untersucht.
  • Urease-Aktivität:
  • Die Urease-Aktivität wurde durch die Berthelot-Reaktion unter Anwendung einer Modifizierung der Prozedur quantifiziert, die bereits beschrieben wurde. Urease-Aktivität wurde als Mikrocool Harnstoff, der pro Minute pro Milligramm bakterielles Protein hydrolysiert wurde, exprimiert.
  • RESULTATE DER TEIL-III-EXPERIMENTE:
  • Identifizierung eines rekombinanten Cosmids, welches das Helicobacter-pylori-GroEL-artige Hitzeschockprotein codierende Gen beherbergt:
  • Auf Basis der veröffentlichten N-terminalen Aminosequenz des gereinigten Hitzeschockproteins von H. pylori wurden zwei degenerierte Oligonukleotide synthetisiert, um auf das Gen von Interesse im Chromosom des H. pylori-Stamms 85P zu zielen. Das erste 5'-G C N A A R G A R A T H A A R T T Y T C N G-3', worin N für die vier Nukleotide steht, R = A und G, Y = T und C, H = T, C und A, ist von den ersten 8 Aminosäuren des Proteins (AKEIKFSD) abgeleitet; das zweite 5'–C R T T N C K N C C N C K N G G N C C C A T-3', worin K = G und T ist, entspricht den komplementären Codons, welche die Aminosäure von Position 29 bis Position 36 spezifizieren (MGPRGRNV, Ref.). Die erwartete Größe für das PCR-Produkt war 108 Basenpaare (bp). Die Amplifikationsreaktion wurden unter wenig stringenten Bedingungen durchgeführt, wie im Abschnitt "Materialien und Verfahren" beschrieben wird, und führte zu der Synthese von sechs Fragmenten mit einer Größe im Bereich von 400 bp bis 100 bp. Die drei kleinsten Fragmente wurden aus einem Acrylamidgel elektroeluiert und gereinigt. Die direkte Sequenzierung der PCR-Produkte ermöglichte die Identifizierung eines DNA-Fragments, welches eine Aminosäuresequenz, die der veröffentlichten Sequenz entspricht, codiert. Dieses Fragment wurde daher markiert und als Sonde bei der Kolonie-Hybridisierung eingesetzt, um rekombinante Cosmide zu identifizieren, welche Homologie zu einem 5'-Segment des H. pylori-GroEL-artigen codierenden Gens zeigen; dieses Gen wurde weiter als hspB bezeichnet. Die Gen-Bank besteht aus 400 unabhängigen Kanamycin-resistenten E. coli-Transduktanten, welche rekombinante Cosmide beherbergen. Von diesen hybridisierte ein einziger Klon mit der Sonde und beherbergte ein als pILL684 bezeichnetes rekombinantes Plasmid mit einer Größe von 46 kb. Die niedrige Frequenz, die beim Detektieren des hspB-Gens (1 von 400) beobachtet wurde, war unüblich im Vergleich mit derjenigen von mehreren klonierten Genen, die beständig in fünf bis sieben rekombinanten Cosmiden detektiert wurden. Um das hspB-Gen zu identifizieren, wurden Fragmente mit Größen von 3 bis 4 kb durch partielle Restriktions-Behandlung der pILL684-Cosmid-DNA mit Endonuklease Sau3A erzeugt, gereinigt und in die BgIII-Stelle von Plasmidvektor pILL570 ligiert. Von 100 Subklonen waren x positive Klone, und einer wurde weiter untersucht (pILL689); er enthält ein 3,15 kb großes Insert, flankiert von zwei BgIII-Restriktionsstellen, das im Detail kartiert wurde (5). Unter Verwendung der PCR-32P-markierten Sonde wurde herausgefunden, dass das 5'-Ende des hspB-Gens auf dem zentralen 632 bp großen HindIII-Sphl-Restriktionsfragment von pILL689 kartiert, was ein Hinweis darauf ist, dass man das Vorhandensein des gesamten hspB-Gens in dem rekombinanten Plasmid pILL689 erwarten könnte.
  • DNA-Sequenz und abgeleitete Aminosäuresequenz des H. pylori-hspA-B-Genclusters:
  • Die 3200 bp von pILL689, veranschaulicht in 5, wurden durch Klonieren der asymmetrischen Restriktionsfragmente BglI-SphI, SphI-HindIII, HindIII-BglII in M13mp18 und M13mp19 sequenziert; jedes klonierte Fragment wurde unabhängig auf beiden Strängen sequenziert, 16 Oligonukleotid-Primer (1) wurden synthetisiert, um die Ablesung zu bestätigen und/oder um Sequenzen zu erzeugen, welche die unabhängig sequenzierten Fragmente überlappen; diese wurden als Primer in Doppelstrang-DNA-Sequenzierungsanalysen verwendet.
  • Die Analyse der Sequenz enthüllte zwei unterschiedliche genetische Elemente. Erstens das Vorliegen von zwei offenen Leserahmen (ORFs), in 5 dargestellt, die in der gleichen Richtung transkribiert werden, die mit hspA und hspB bezeichnet wurden. Die Nukleotidsequenz und die abgeleitete Aminosäuresequenz der zwei ORFs sind in 6 gezeigt. Das erste Codon von hspA beginnt 323 bp stromaufwärts der links gelegenen HindIII-Stelle von pILL689 (5) und diesem geht eine Shine-Dalgarno-Ribosomenbindungsstelle (RBS) (GGAGAA) voraus. Der hspA-ORF codiert für ein Polypeptid von 118 Aminosäuren. Das Initiations-Codon für den hspB-ORF beginnt 25 Nukleotide stromabwärts des hspA-Stopp-Codons; diesem geht eine RBS-Stelle (AAGGA) voraus. Der hspB-ORF codiert ein Polypeptid von 545 Aminosäuren und wird durch ein TAA-Codon terminiert, gefolgt von einer palindromischen Sequenz, die einem Rhounabhängigen Transkriptons-Terminator ähnelt (freie Energie, ΔG = –19,8 kcal/Mol) (6). Die N-terminae Aminosäuresequenz des abgeleiteten Proteins HspB war identisch mit der N-terminalen Sequenz des gereinigten H. pylori-Hitzeschockproteins, das zuvor mit der Ausnahme des N-terminalen Methionins veröffentlicht wurde, welches bei dem gereinigten Protein fehlt und posttranslational entfernt werden könnte, was zu einem reifen Protein von 544 Aminosäuren führt.
  • Die abgeleiteten Aminosäuresequenzen von H. pylori-HspA und HspB wurden mit mehreren Aminosäuresequenzen von HSPs der GroES- und GroEL-Klasse verglichen (7). HspB zeigte eine hohe Homologie auf der Aminosäureebene mit dem Legionella pneumophilia-HtpB-Protein (82,9% Ähnlichkeiten), mit dem Escherichia coli-GroEL-Protein (81,0% Ähnlichkeiten), mit dem Chlamydia psittaci- oder C. trachomatis-HypB-Protein (79,4% Ähnlichkeiten), mit Clostridium perfringens-Hsp60-Protein (80,7% Ähnlichkeiten) und in einem geringeren Maße mit den GroEL-artigen Proteinen von Mycobacterium. Allerdings zeigte wie nahezu alle GroEL-Homologa H.pylori-HspB das konservierte Carboxyl-Terminus-Glycin-Methionin-Motiv (MGGMGGMGGMGGMM), welches, wie vor kurzem gezeigt wurde, in dem E. coli-GroEL-Chaperonin verzichtbar ist. Der Homologiegrad auf der Aminosäureebene zwischen dem H. pylori-HspA-Protein und den anderen GroES-artigen Proteinen ist in 7 gezeigt. Die gezeigte Alignierung weist ein auffallendes Motif am Carboxyl-Terminus des H. pylori-HspA-Proteins auf, das anderen bakteriellen GroES-Homologa fehlt. Dieses einmalige, stark geladene Motiv besteht aus 27 zusätzlichen Aminosäuren, die zur Bildung einer Schleife zwischen zwei doppelten Cystein-Resten fähig sind; von den 27 Aminosäuren sind 8 Histidin-Reste, die in hohem Maße an eine Metall bindende Domäne erinnern.
  • Das zweite genetische Element, das durch die Sequenzanalyse enthüllt wurde, war das Vorhandensein einer Insertionssequenz (IS5) 84 bp stromaufwärts des hspA-Gens. Die Nuldeotidsequenz dieses Elements passte perfekt zu der zuvor für IS5 in E. coli beschriebenen, mit dem Vorhandensein einer 16-Nukleotid-Sequenz (CTTGTTCGCACCTTCC), die einer der zwei invertierten Repeats entspricht, welche das IS5-Element flankieren. Aufgrund der perfekten Übereinstimmung auf DNA-Ebene vermuteten wir, dass IS5 anfänglich nicht in dem H. pylori-Chromosom vorhanden war, sondern vielmehr stromaufwärts des hspA-HspB-Genclusters während des Klonierungsverfahrens inseriert worden war, eine Hypothese, die durch weitere Analysen bestätigt werden musste.
  • Identifizierung der stromaufwärts gelegenen Sequenz des hspA-B-Genclusters im H. pylori-Chromosom:
  • Das Vorhandensein des IS5 wurde durch Gen-Amplifikation unter Verwendung von zwei Oligonuldeotiden überprüft, wobei eines sich innerhalb des IS5-Elements befand und das andere sich stromabwärts des IS5-Elements befand (Oligo #1 und #2, 6), um auf eine putative Sequenz i) im Chromosom vom H. pylori-Stamm 85P, ii) in dem anfänglichen Cosmid pILL684 und iii) in den 100 Subklonen, die aus der partiellen Sau3A-Restriktion des rekombinanten Cosmids pILL684 resultieren, zu zielen. IS5 fehlte bei dem Chromosom von H. pylori und lag in den allerersten Subkulturen des E. coli-Stamms vor, welcher das Cosmid pILL684 beherbergte. Unter den 100 pILL684-Subklon-Derivaten, die die gesamte oder einen Teil der IS5-Sequenz zu enthalten schienen, suchten wir dann nach einem Subklon, welcher die linke Endseite des IS5 plus die ursprüngliche stromaufwärtsgelegene Sequenz des hspA-hspB-Genclusters beherbergte. Die ses Screening erfolgte durch Restriktionsanalyse der verschiedenen durch partielle Sau3A-Behandlung erzeugten Subklone. Die Resktriktionskarte von einem (pILL694) der Plasmide, welches diese Kriterien erfüllt, ist in 5 gezeigt. Die linke Endseite der 155-Nukleotidsequenz wurde bestimmt; das Vorhandensein einer 4-bp-Duplikation CTAA auf beiden Seiten der invertierten 16-bp-Repeats des IS5-Elements (6) ermöglichte uns den Nachweis des kürzlich erfolgten Erwerbs des IS5-Elements durch Transposition. Eine 245-Nukleotid-Sequenz wurde danach bestimmt, die unmittelbar stromaufwärts des IS5-Elements kartiert wurde (in 6 gezeigt). Diese Sequenz besteht aus einer nicht-codierenden Region, in welcher das Vorhandensein einer putativen Consensus-Hitzschock-Promotorsequenz detektiert wurde; sie zeigt eine perfekt konservierte – 35-Region (TAACTCGCTTGAA) und eine weniger übereinstimmende – 10-Region (CTCAATTA). Zwei Oligonukleotide (#3 und #4, in 2 gezeigt) wurden synthetisiert, welche auf Sequenzen, die auf beiden Seiten des in dem rekombinanten Cosmid vorhandenen IS5-Elements gelegen waren, kartierten; diese zwei Oligonukleotide sollten zu der Amplifikation eines X) (bp-Fragments, wenn die IS5-Sequenz vorhanden ist, und eines Fragment in Abwesenheit des IS5 führen. Die Resultate der PCR-Reaktion, in der als Ziel-DNA das pILL684-Cosmid, das pILL694-Plasmid und das H. pylori 85P-Chromosom verwendet wurden, stimmen mit den Vorhersagen überein (Ergebnisse nicht gezeigt). Darüber hinaus wurde eine direkte Sequenzierung des von dem H. pylori-Chromosom erhaltenen PCR-Produkts durchgeführt und bestätigte die stromaufwärts gelegene rekonstruierte hspA-hspB-Sequenz, die in 6(B) gezeigt ist. Um die genetische Organisation der gesamten sequenzierten Region weiter zu bestätigen, wurden zwei Sonden durch Gen-Amplifikation des pILL689-Plasmids unter Verwendung der Oligonukleotide #5 und #6, und #7 und #8 hergestellt (6); diese wurden als Sonden in Southern-Hybridisierungsexperimenten unter wenig stringenten Bedingungen gegen einen HindIII-Verdau des H. pylori-85P-Chromosoms verwendet. Die Ergebnisse zeigen, dass keine andere detektierbare Neuanordnung während des Klonierungsvorgangs aufgetreten ist (Daten nicht gezeigt). Diese Experimente gaben uns die Möglichkeit, nachzuweisen, dass obgleich eine einzelne Kopie des hspB-Gens in dem Chromosom vom H. pylori-Stamm 85 vorlag, doch zwei Kopien des hspA-Gens durch Southern-Hybridisierung detektiert wurden.
  • Analyse von in Minizellen exprimierten Polypeptiden:
  • Die rekombinanten Plasmide pILL689 und die pILL692 und die jeweiligen Klonierungsvektoren pILL570 und pACYC177 wurden durch Transformation in E. coli P678-54, einen Minizellen erzeugenden Stamm, eingeführt. Die Plasmide pILL689 und pILL692 (5) enthalten das gleiche 3,15 kb große Insert, das in die zwei Vektoren kloniert wurde. pILL570 enthält stromaufwärts der Mehrfachklonierungsstelle einen Stopp der Transkription und der Translation; die Orientierung des Inserts in pILL689 erfolgte auf solche Weise, dass der Transkription-Stopp stromaufwärts des IS5-Fragments und damit stromaufwärts der hspA- und hspB-Gene lokalisiert war. Zwei Polypeptide, die mit Polypeptiden mit apparenten Molekulergewichten von 60 kDa und 14 kDa migrierten, wurden klar in Minizellenexperimenten von pILL689 und pILL692 detektiert (Ergebnisse nicht gezeigt), wohingegen sie bei den entsprechenden Vektoren fehlten; diese Resultate waren ein Hinweis darauf, dass die hspA- und hspB-Gene konstitutiv von einem innerhalb des IS5-Elements befindlichen Promotors exprimiert wurden. Außerdem stimmte zwar die Menge der auf dem SDS-Gel visualisierten Polypeptide gut mit der Kopienzahl der jeweiligen Vektoren überein, doch deutete die Intensität der zwei Polypeptid-Banden auf eine polycistronische Transkription der zwei Gene hin.
  • Versuche, die Rolle der HspA- und HspB-Proteine zu verstehen:
  • Zwei Disruptionen von Genen wurden in E. coli durch Inserieren der zuvor beschriebenen Km-Kassette innerhalb des hspA- oder des hspB-Gens der Plasmide pILL686 und pILL691 erreicht. Dies erfolgte, um die disruptierten Gene in H. pylori durch Elektroporation rückzuführen und hinsichtlich eines allelischen Austauschs zu selektieren. Das resultierende Plasmid pILL696 codierte eine trunkierte Form des HspA-Proteins, was der Deletion der C-terminalen Endaminosäuresequenz entspricht; in diesem Plasmid war die Km-Kassette so inseriert, dass der Promotor des Km-Gens als Promotor für das stromabwärts gelegene hspB-Gen dienen konnte. Die pILL687- und pILL688-Plasmide resultierten aus der Insertion der Km-Kassette in jeder Orientierung innerhalb des hspB-Gens. Keines dieser Konstrukte führte zur Isolierung von Kanamycin-Transformanten des H. pylori-Stamms N6, als gereinigte pILL687-, pILL688-, pILL696-Plasmide (Tabelle 2, 5) in Elektroporationsexperimenten verwendet wurden, wohingegen dies bei dem als Positivkontrolle verwendeten pSUS 10-Plasmid immer der Fall war. Diese Ergebnisse deuten daraufhin, dass das H. pylori-HspA- und -HspB-Protein essentielle Proteine für das Überleben von H. pylori sind.
  • Aufgrund von i) der beständigen Beschreibung in der Literatur einer engen Assoziation des HspB-Proteins mit den Urease-Untereinheiten; ii) der einmaligen Struktur des HspA-Proteins, wobei die C-terminale Sequenz an eine Nickel-bindende Domäne erinnert, und iii) des Fehlens von lebensfähigen hspA- und/oder hspB-Mutanten von H. pylori versuchten wir, eine Rolle der H. pylori-Hsp-Proteine in Beziehungen mit der H. pylori-Urease durch funktionelle Komplementierungsexperimente in E. coli nachzuweisen. Plasmide pILL763 oder pILL753 (beides pILL570-Derivate, Tabelle 5), welche den Urease-Gencluster codieren, wurden mit dem kompatiblen pILL692-Plasmid (pACYC177-Derivat) eingeführt, das konstitutiv die HspA- und HspB-Polypeptide exprimiert, wie in Minizellen sichtbar gemacht wurde. In beiden Komplementierungen erlaubt die Expression der HspA- und HspB-Proteine in derselben E. coli-Zelle eine dreifache Zunahme der Urease-Aktivität im Anschluss an die Induzierung der Ureasegene auf Minimalmedium, das mit 10 mM L-Arginin als begrenzende Stickstoffquelle ergänzt wurde.
    Tabelle 5: In dieser Studie verwendete Vektoren und Hybridplasmide
    Plasmid Vektor Größe (kb) Charakteristika (a) Quelle oder Referenz
    pILL575 10 Mob, Cos, Km –
    pILL570 5,3 Mob, Sp –
    pACYC 177 3,9 Ap, Km –
    pILL600 pBR322 5,7 Ap, Km, Quelle von Km-Kassette –
    pILL684 pILL575 46 Mob, Km, Cosmid, enthaltend H. pylori hspA-B Partieller Sau3A-Verdau von H. pylori 85P DNA
    pILL685 pILL570 9,29 Mob, Sp, Plasmid, enthaltend H. pylori hspB Partieller Sau3A-Verdau von pILL684
    pILL686 pUC19*c* 4,5 Ap, Plasmid, enthaltend H. pylori hspB 1,9-kb-BglII-Cla pILL685, kloniert in pUC19*
    pUC19*(c) 5,9 Ap, Km, H. pylori hspB Ω Km-Orientierung A(b) 1.4-kb-SmaI-SmaI pILL600, kloniert in pILL686
    pILL688 pUC19*(c) 5,9 Ap, Km, H. pylori hspB Ω Km-Orientierung B(b) 1.4-kb-SmaI-SmaI pILL600, kloniert in pILL686
    pILL689 pILL570 8,45 Mob, Sp, Plasmid, enthaltend H. pylori hspA-B Partieller Sau3A-Verdau von pILL684
    pILL691 pUC19**(c) 3,9 Ap, Plasmid, enthaltend H. pylori hspA 1,3-kb SphI-SphI pILL689, kloniert in pUC19**
    pILL692 pACYC177 7,05 Ap, Km, Plasmid, enthaltend H. pylori hspA-B 3,15-kbBglII pILL689, kloniert in pACYC177
    pILL694 pILL570 8,7 Sp, Plasmid, enthaltend linkes Ende von IS5 Partieller Sau3A-Verdau von pILL684
    pILL696 pUC19**(c) 5,3 Ap, Km, H. pylori hspA Ω Km-Orientierung A(b) 1,4-kb SmaI-SmaI pILL600, kloniert in pILL691
    pSUS 10 pIC20R2 7,7 Ap, Km H. pylori flaA Ω Km –
    pILL753 pILL570 16,5 Sp, Plasmid, enthaltend ureA, B, C, D, E, F, G, H, I –
    pILL763 pILL570 14,75 Sp, Plasmid, enthaltend ureA, B, E, F, G, H, I –
    (a) Mob, konjugatives Plasmid infolge des Vorhandenseins von OriT; Ap, Km und Sp, Resistenz gegen Ampicillin, Kanamycin bzw. Spectinomycin; Cos, Vorhandensein von Lambda cos-Stelle (b) Orientierung A gibt an, dass der Kanamycin-Promotor die Transkription bei der gleichen Orientierung wie diejenige des Gens, wo die Kassette inseriert wurde, initiiert; Orientierung B, das Gegenteil. (c) pUC19* und pUC19**: Derivate von pUC19-Vektor, in welchem die SphI bzw. HindIII-Stelle endgefüllt wurden unter Verwendung derKlenow-Polymerase und selbst-religiert wurden.
  • BEISPIEL II
  • IV – EXPRESSION, REINIGUNG UND IMMUNOGENE EIGENSCHAFTEN VON H. PYLORI-HSPA UND -HSPB:
  • EXPERIMENTELLE PROZEDUR FÜR TEIL IV:
  • Expression und Reinigung von rekombinanten Fusionsproteinen:
  • Die MaIE-HspA- und MalE-HspB-Fusionsproteine wurden, nach der Klonierung der zwei Gene innerhalb des pMAL-c2-Vektors wie im Abschnitt "Ergebnisse" beschrieben unter Verwendung der folgenden Primer, exprimiert:
    Figure 00430001
  • Zwei Liter Luria-Medium, das Glucose (30%) und Ampicillin (100 μg/ml) enthielt, wurden mit 20 ml einer Übernachtkultur von Stamm MC1061 inokuliert, welche das Fusionsplasmid enthielt, und unter Schütteln bei 37°C inkubiert. Als die OD600 der Kultur 0,5 erreichte, wurde IPTG (bei einer Endkonzentration von 10 mM) zugegeben, und die Zellen wurden für weitere 4 Stunden inkubiert. Zellen wurden durch Zentrifugation (5000 U/min während 30 min bei 4°C) geerntet, in 100 ml Säulenpuffer, bestehend aus 10 mM Tris-HCl, 200 mM NaCl, 1 mM EDTA, ergänzt mit Proteaseinhibitoren [(Leupeptin (2 μM) – Peptstatin (2 μm) – PMSF (1 mM) – Aprotinin (1:1000-Verdünnung)], erneut suspendiert und durch eine French-Press laufen gelassen. Nach der Zentrifugation (10 000 U/min während 20 min bei 4°C) wurde der Überstand rückgewonnen und verdünnt (2-fach) mit Säulenpuffer. Das Lysat wurde durch einen 0,2-μm-Nitrocellulosefilter filtriert, bevor das Auftragen auf ein voräquilibriertes Amyloseharz (22 × 2,5 cm) erfolgte. Die Fusionsproteine wurden mit einer 10-mM-Maltoselösung, die in Säulenpuffer hergestellt wurde, eluiert, und die Fraktionen, welche die Fusionsproteine enthielten, wurden vereinigt, gegen destilliertes Wasser dialysiert und lyophilisiert. Fusionsproteine wurden erneut in destilliertem Wasser bei einer Endkonzentration von 2 mg lyophilisiertem Material/ml suspendiert und bei –20°C aufbewahrt. Die Konzentration und Reinheit der Präparate wurden durch das Bradford-Protein-Assay (Sigma Chemicals) und SDS-PAGE-Analysen kontrolliert.
  • Nickel bindende Eigenschaften von rekombinanten Proteinen:
  • E. coli MC1061-Zellen, die entweder den pMAL-c2-Vektor oder rekombinante Plasmidderivate enthielten, wurden in 100 ml Luria-Kulturlösung in Gegenwart von Carbenicillin (100 μg/ml) wachsen gelassen. Die Expression der Gene wurde mit IPTG vier Stunden lang induziert. Die Zellen wurden zentrifugiert und das Pellet wurde in 2 ml Puffer A (6 M Guanidirihydrochiorid, 0,1 M NaH2PO4, 0,01 Tris, pH-Wert 8,0) resuspendiert. Nach leichtem Rühren während einer Stunde bei Raumtemperatur wurden die Suspensionen mit 10 000 g während 15 min bei 4°C zentrifugiert. Ein 1,6-ml-Aliquot von Nickel-Nitrilo-Triessigsäureharz (Nickel-NTA, QIA express), das zuvor in Puffer A äquilibriert wurde, wurde dem Überstand zugegeben, und diese Mischung wurde vor dem Laden auf eine Säule bei Raumtemperatur eine Stunde lang gerührt. Die Säule wurde mit 20 ml Puffer A, danach mit 30 ml Puffer B (8 M Harnstoff, 0,1 M Naphosphat, 0,01 M Tris-HCl, pH-Wert 8,0) gewaschen. Die Proteine wurden nacheinander mit dem gleichen Puffer wie Puffer B, der auf einen pH-Wert 6,3 (Puffer C), pH-Wert 5,9 (Puffer D) und pH-Wert 4,5 (Puffer E) eingestellt war, und Puffer F (6 M Guanidinhydrochlorid, 0,2 M Essigsäure) eluiert. Fünfzig μl von jeder Fraktion wurden mit 50 μl SDS-Puffer gemischt und auf SDS-Gele geladen.
  • Human-Seren:
  • Serumproben wurden von 40 Personen erhalten, 28 waren mit H. pylori infizierte Patienten, wie durch eine positive Kultur für H. pylori und histologische Untersuchung der Biopsie bestätigt, und 12 waren nicht infizierte Patienten. Die Seren wurden freundlicherweise von R. J. Adamek (Universität Bochum, Deutschland) zur Verfügung gestellt.
  • Immunblotting:
  • Nach der Vollendung von SDS-PAGE-Läufen in einer Mini-PROTEAN II-Elektrophorese-Kammer wurden Proteine auf Nitrocellulosepapier in einer Min-Trans-Blot-Transferzelle (Bio-Rad), die 1 h lang auf 100 V eingestellt war, übertragen (unter Kühlen). Eine Immunfärbung wurde wie zuvor beschrieben durchgeführt (Ferrero et al., 1992), mit der Ausnahme, dass das ECL-Western-Blotting-Detektionssystem (Amersham) zur Sichtbarmachung von Reaktionsprodukten eingesetzt wurde. Human-Seren und das Kaninchen-Antiserum, die gegen einen Ganzzellenextrakt vom H. pylori-Stamm 85P gezüchtet worden waren, wurden 1:1000 bzw. 1:5000 in 1% (w/v) Casein, das in Phosphat-gepufferter Kochsalzlösung (PBS, pH-Wert 7,4) zubereitet worden war, verdünnt.
  • Serologische Verfahren [Enzym-gebundener Immunosorbens-Assay, (ELISA)]:
  • Die folgenden Mengen von Antigenen wurden auf 96-Mulden-Platten (Falcon 3072) absorbiert: 2,5 μg Protein MalE, 5 μg MalE-HspA oder 2,5 μg MalE-HspB. Die Platten wurden über Nacht bei 4°C stehen gelassen, danach 3 Mal mit ELISA-Waschlösung (EWS) gewaschen [1% PBS, enthaltend 0,05% (v/v) Tween 20]. Die Sättigung wurde durch Inkubieren der Platten für 90 min bei 37°C in EWS, ergänzt mit 1% Milchpulver, erreicht. Die Mulden wurden erneut 3 Mal mit EWS gewaschen und danach 90 min lang bei 37°C in Gegenwart von Human-Seren (verdünnt 1:500 in EWS mit 0,5% Milchpulver) unter Bewegen leicht gerührt. Gebundene Immunoglobu line wurden durch Inkubation während 90 min bei 37°C mit biotinyliertem sekundärem Antikörper (anti-humanes Ziegen-IgG, IgA oder IgM, verdünnt [1:1000] in EWS, ergänzt mit 0,5% Milchpulver) in Kombination mit Streptavidinperoxidase (1:500) (Kirkegaard and Perry Lab.) detektiert. Gebundene Peroxidase wurde durch Reaktion mit dem Citrat-Substrat und Wasserstoffperoxid detektiert. Platten wurden im Dunklen bei Raumtemperatur inkubiert, und die optische Dichte bei 492 nm wurde in Intervallen von 5, 15 und 30 min in einem ELISA-Plattenlesegerät abgelesen. Nach 30 min wurde die Reaktion durch die Zugabe von Chlorwasserstoffsäure auf eine Endkonzentration von 0,5 M gestoppt.
  • RESULTATE DER TEIL-IV-EXPERIMENTE
  • Konstruktion von rekombinanten Plasmiden, welche induzierbare MalE-HspA und HspB-Fusionsproteine produzieren:
  • Die Oligonukleotide #1 und #2 (hspA) und #3 und #4 (hspB) wurden zur Amplifizierung durch PCR der gesamten hspA- bzw. der hspB-Gene verwendet. Die PCR-Produkte wurden elektroeluiert, gereinigt und mit EcoRI und PstI restringiert. Die restringierten Fragmente (von 360 bp bzw. 1600 bp Größe) wurden danach in den restringierten EcoRI-PstI-pMAL-c2-Vektor ligiert zur Erzeugung von Plasmiden, die mit pILL933 bzw. pILL934 bezeichnet wurden. Im Anschluss an die Induzierung mit IPTG und die Reinigung des löslichen Proteins auf Amylose-Säulen wurden Fusionsproteine mit der erwarteten Größe (55 kDa für pILL933 [17] und 100 kDa für pILL9334) auf SDS-PAGE-Gelen sichtbar gemacht. Jedes von diesen entsprach der Fusion des MalE-Proteins (42,7 kDa) mit der zweiten Aminosäure von jedem der Hsp-Polypeptide. Die Ausbeute der Expression der Fusionsproteine war 100 mg für MalE-HspA und 20 mg für MalE-HspB bei einer Herstellung aus 2 Litern Kulturlösung.
  • Studie der Antigenizität der HspA- und HspB-Fusionsproteine und der Immunogenizität von HspA und HspB bei mit H. pylori infizierten Patienten:
  • Um zu bestimmen, ob die Fusionsproteine noch antigen waren, wurde jedes durch Western-Blot mit Kaninchen-Serum, das gegen das MalE-Protein und ein Ganzzellextrakt vom H. pylori-Stamm 85P gezüchtet worden war, analysiert. Beide Fusionsproteine waren immunreaktiv mit Antikörper gegen MalE (nicht gezeigt) und mit dem Anti-H. pylori-Antiserum. Das Anti-H. pylori-Antiserum erkannte nicht das gereinigte MalE-Protein (18). Diese Ergebnisse zeigten, dass die Fusionsproteine ihre antigenen Eigenschaften beibehielten; außerdem ist das HspB-Protein zwar bekanntermaßen immunogen, doch ist dies der erste Nachweis, dass HspA per se bei Kaninchen immunogen ist.
  • Auf die gleiche Weise wurde zur Bestimmung, ob die HspA- und HspB-Polypeptide bei Menschen immunogen waren, die humorale Immunantwortreaktion gegen HspA und/oder HspB bei mit H. pylori infizierten Patienten analysiert und mit derjenigen von nicht infizierten Personen unter Verwendung von Western-Immunoblotting-Assays und Enzym-gebundenen Immunosorbens-Assays (ELISA) verglichen. Keines der 12 Seren der H. pylori-negativen Personen ergab ein positives Immunoblot-Signal mit MalE-, MalE-HspA- oder MalE-HspB-Proteinen (18). Demgegenüber reagierten von 28 Seren von H. pylori-positiven Patienten 12 (42,8%) mit dem HspA-Protein, während 20 (71,4%) das HspB-Protein erkannten. Alle Seren, die HspA erkannten, reagierten auch mit dem HspB-Protein. Es war kein Zusammenhang zwischen der Immunantwort und der klinischen Darstellung der H. pylori-Infektion festzustellen, obwohl eine derartige Schlussfolgerung wegen der geringen Anzahl an analysierten Stämmen verfrüht sein könnte.
  • Nickel bindende Eigenschaften des MalE-HspA-Fusionsproteins:
  • Rekombinantes MBP-HspA-Protein, das im Anschluss an Induktion mit IPTG exprimiert wurde, wurde aus einem Ganzzellextrakt durch einstufige Reinigung auf einer Nickel-Affinitätssäule gereinigt, wohingegen weder das MBP allein noch MBP-HspB diese Eigenschaft zeigte. Die 18 veranschaulicht die einstufige Reinigung des MBP-HspA-Proteins, das als ein Monomer bei einem pH-Wert 6,3 und als ein Monomer bei einem pH-Wert 4,5 eluiert wurde. Die einmalige Bande, die im Feld 7 zu sehen ist, und die zwei Banden, die im Feld 5 zu sehen sind, wurden beide spezifisch mit Anti-HspA-Kaninchen-Seren erkannt. Dies deutete darauf hin, dass die Nickel bindende Eigenschaft des MBP-HspA-Fusionsproteins auf die C-terminale Sequenz von HspA zurückzuführen sein dürfte, die reich an Histidin- und Cystein-Resten ist.
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Claims (22)

  1. Immungene Zusammensetzung, die zum Induzieren von Antikörpern gegen Helicobacter in der Lage ist, dadurch gekennzeichnet, dass sie entweder (i) das Hitzeschockprotein HSP A, welches von dem hspA-Gen von Plasmid pILL689 (CNCM I-1356) codiert wird, oder (ii) ein Fragment des HSP A, welches mindestens 6 Aminosäuren aufweist, oder (iii) eine Polypeptidvariante des HSP A, in der Aminosäuren ausgetauscht, inseriert oder deletiert worden sind, umfasst, wobei die Polypeptidvariante mindestens 75% Identität mit dem HSP A aufweist, wobei das Fragment oder die Polypeptidvariante die Urease-Aktivität in einem Mikroorganismus verstärkt, der fähig ist, aktive Urease zu exprimieren.
  2. Immungene Zusammensetzung gemäß Anspruch 1, die fähig ist zur Induzierung von Antikörpern, welche gegen eine Infektion mit Helicobacter spp. schützen.
  3. Pharmazeutische Zusammensetzung zur Verwendung als Impfstoff beim Schutz gegen Helicobacter-Infektion, insbesondere gegen Helicobacter pylori und Helicobacter felis, dadurch gekennzeichnet, dass sie die immunogene Zusammensetzung von einem beliebigen der Ansprüche 1 und 2 in Kombination mit (einem) physiologisch annehmbaren Exzipient(en) und möglicherweise Adjuvantien umfasst.
  4. Proteinartiges Material, dadurch gekennzeichnet, dass es umfasst oder besteht aus (i) dem Hitzeschockprotein HSP A von Helicobacter pylori mit der folgenden Aminosäuresequenz:
    Figure 00790001
    (ii) einem Fragment von HSPA, wie definiert in (i), wobei das Fragment mindestens 6 aufeinanderfolgende Aminosäuren der in (i) definierten Aminosäuresequenz umfasst; oder (iii) eine Polypeptidvariante der in (i) definierten Aminosäuresequenz, in welcher Aminosäuren ausgetauscht, inseriert oder deletiert worden sind, wobei die Polypeptidvariante mindestens 75% und vorzugsweise mindestens 80% Identität mit der in (i) definierten Aminosäuresequenz aufweist, wobei das Fragment oder die Polypeptidvariante die Urease-Aktivität in einem Mikroorganismus verstärkt, der fähig ist, aktive Urease zu exprimieren.
  5. Proteinartiges Material gemäß Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, dass es die C-terminale Sequenz von HSP A: G S C C H T G N H D H K H A K E H E A C C H D H K K H oder ein Fragment, umfassend mindestens 6 aufeinander folgende Aminosäuren dieser Sequenz, umfasst oder daraus besteht.
  6. Nukleinsäuresequenz, dadurch gekennzeichnet, dass sie besteht aus: (i) einer Sequenz, welche das proteinartige Material von einem beliebigen der Ansprüche 4 bis 5 codiert; oder (ii) einer Sequenz, welche komplementär zur Sequenz (i) ist; oder (iii) einer Sequenz, welche zum Hybridisieren an Sequenz (i) oder (ii) unter stringenten Bedingungen in der Lage ist, wobei die stringenten Bedingungen wie folgt definiert sind: –5 × SSC; 50% Formamid bei 37°C, oder –6 × SSC, Denhardt-Medium bei 68°C; oder (iv) einem Fragment von einer beliebigen der Sequenzen (i), (ii) oder (iii), geeignet zur Verwendung als eine spezifische Sonde für die in vitro-Detektion von Helicobacter-Infektion, welches mindestens 45 Nukleotide umfasst.
  7. Nukleinsäuresequenz gemäß Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, dass sie aus der Gesamtheit oder einem Teil der Sequenz von Plasmid pILL689 (CNCM I-1356), insbesondere derjenigen Sequenz, welche HSP A codiert, oder einer zu dieser Sequenz komplementären Sequenz, oder einer Sequenz, die zum Hybridisieren an diese Sequenz unter stringenten Bedingungen in der Lage ist, besteht, wobei die stringenten Bedingungen wie folgt definiert sind: –5 × SSC; 50% Formamid bei 37°C, oder –6 × SSC, Denhardt-Medium bei 68°C.
  8. Expressionsvektor, dadurch gekennzeichnet, dass er eine Nukleinsäuresequenz gemäß Anspruch 6 oder 7 enthält.
  9. Plasmid pILL689 (CNCM I-1356).
  10. Oligonukleotid, geeignet zur Verwendung als Primer in einer Nukleinsäure-Amplifikationsreaktion eines HSP A-Fragmentes, dadurch gekennzeichnet, dass es 10 bis 100 aufeinanderfolgende Nukleotide der Sequenz von Anspruch 6 oder 7 umfasst und dass es mit dem 5'- oder 3'-Ende von zu amplifizierenden HSPA-Fragmenten hybridisiert.
  11. Nukleotidsonde, dadurch gekennzeichnet, dass sie eine Sequenz gemäß mindestens einem von Anspruch 6 oder 7 mit einem geeigneten Markierungs-Mittel umfasst.
  12. Mikroorganismus, stabil transformiert mit einem Expressionsvektor gemäß Anspruch 8 oder einem Plasmid gemäß Anspruch 9.
  13. Monoklonale oder polyklonale Antikörper oder Fragmente davon, gerichtet gegen das proteinartige Material von mindestens einem der Ansprüche 4 bis 5, dadurch gekennzeichnet, dass sie entweder für das Helicobacter pylori-Material spezifisch sind oder, alternativ dazu, immunologisch mit GroES-artigen Proteinen aus von Helicobacter pylori verschiedenen Bakterien kreuzreagieren.
  14. Monoklonale oder polyklonale Antikörper gemäß Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, dass sie spezifisch die C-terminale Sequenz von HSP A erkennen.
  15. Verwendung der immunogenen Zusammensetzung von Anspruch 1 für die Herstellung eines Impfstoffs, der zur Verwendung in Menschen und Tieren gegen Helicobacter-Infektion, insbesondere gegen Helicobacter pylori und Helicobacter felis, geeignet ist.
  16. Verwendung der Antikörper der Ansprüche 13 bis 14 für die Herstellung einer therapeutischen Zusammensetzung zur Behandlung einer Infektion mit Helicobacter, insbesondere Helicobacter pylori, Helicobacter heilmannii und Helicobacter felis, in Menschen oder Tieren.
  17. Verfahren zur Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung nach Anspruch 3, gekennzeichnet durch Kultivieren eines transformierten Mikroorganismus gemäß Anspruch 12, Sammeln und Reinigen des Helicobacter-HSP-Materials und Kombinieren dieser Materialien mit geeigneten Exzipienten, Adjuvantien und gegebenenfalls anderen Zusatzstoffen.
  18. Verwendung von Nukleotidsequenzen von Anspruch 11 für die in vitro-Detektion einer Infektion durch Helicobacter, gegebenenfalls im Anschluß an eine Gen-Amplifikationsreaktion, in einer biologischen Probe.
  19. Kit für die in vitro-Detektion von Helicobacter-Infektion, dadurch gekennzeichnet, dass es umfasst: – eine Nukleotidsonde gemäß Anspruch 11; – ein passendes Medium zum Ausführen einer Hybridisierungsreaktion zwischen der Nukleinsäure von Helicobacter und der Sonde; – Reagenzien für die Detektion jeglicher gebildeten Hybride.
  20. Proteinartiges Material, dadurch gekennzeichnet, dass es ein Fusion- oder gemischtes Protein umfasst, einschließlich mindestens einer Untereinheit des Hitzeschockproteins HSP A aus Helicobacter oder einem Fragment davon, wie in mindestens einem der Ansprüche 4 bis 5 definiert.
  21. Gereinigte Antikörper oder Serum, dadurch gekennzeichnet, dass es erhalten wird durch Immunisieren eines Tieres mit der immunogenen Zusammensetzung gemäß mindestens einem der Ansprüche 1 bis 2, oder mit der pharmazeutischen Zusammensetzung gemäß Anspruch 3, oder mit dem proteinartigen Material oder Fragment von mindestens einem der Ansprüche 4 bis 5 oder mit dem Fusion- oder gemischten Protein von Anspruch 20, wobei die gereinigten Antikörper oder das Serum spezifisch für das HSP-A-Chaperonin sind, welches die folgende Aminosäuresequenz aufweist:
    Figure 00820001
  22. Kit, umfassend mindestens die gereinigten Antikörper oder Serum gemäß Anspruch 21 und gegebenenfalls passende Medien oder Exzipienten für die Verabreichung der Antikörper oder Markierungs- oder Detektions-Mittel für die Antikörper.
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