PT703981E - Composições imunogénicas contra infecção por helicobacter, polipéptidos para utilização nas composições e sequências de ácidos nucleicos que codificam para estes polipéptidos - Google Patents

Composições imunogénicas contra infecção por helicobacter, polipéptidos para utilização nas composições e sequências de ácidos nucleicos que codificam para estes polipéptidos Download PDF

Info

Publication number
PT703981E
PT703981E PT94917653T PT94917653T PT703981E PT 703981 E PT703981 E PT 703981E PT 94917653 T PT94917653 T PT 94917653T PT 94917653 T PT94917653 T PT 94917653T PT 703981 E PT703981 E PT 703981E
Authority
PT
Portugal
Prior art keywords
gly
lys
glu
ala
ile
Prior art date
Application number
PT94917653T
Other languages
English (en)
Inventor
Agnes Labigne
Sebastien Suerbaum
Richard Ferrero
Jean-Michel Thiberge
Original Assignee
Pasteur Institut
Inst Nat Sante Rech Med
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Pasteur Institut, Inst Nat Sante Rech Med filed Critical Pasteur Institut
Publication of PT703981E publication Critical patent/PT703981E/pt

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6888—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms
    • C12Q1/689—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms for bacteria
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/195—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria
    • C07K14/205—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria from Campylobacter (G)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/78—Hydrolases (3) acting on carbon to nitrogen bonds other than peptide bonds (3.5)
    • C12N9/80—Hydrolases (3) acting on carbon to nitrogen bonds other than peptide bonds (3.5) acting on amide bonds in linear amides (3.5.1)
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)

Description

DESCRIÇÃO
COMPOSIÇÕES IMUNOGÉNICAS CONTRA INFECÇÃO POR HELICOBACTER, POLIPÉPTIDOS PARA UTILIZAÇÃO NAS COMPOSIÇÕES E SEQUÊNCIAS DE ÁCIDOS NUCLEICOS QUE CODIFICAM PARA ESTES POLIPÉPTIDOS A presente invenção refere-se a composições imunogénicas para a indução de anticorpos protectores contra infecção por Helicobacter spp. . Refere-se ainda a material proteico derivado de Helicobacter, e a sequências de ácidos nucleicos que as codificam. São também incluídos na invenção anticorpos para estes materiais proteicos. H, pylori é um microrganismo que infecta a mucosa gástrica humana e está associado a gastrite crónica activa. Demonstrou-se que é um agente etiológico na ulceração gastroduodenal (Peterson, 1991) e dois estudos recentes registaram que pessoas infectadas com H. pylori tinham um risco mais elevado de desenvolver cancro gástrico (Nomura e tal, 1991; Parsonnet e tal, 1991) .
Os estudos in vivo da bactéria e, consequentemente, o trabalho no desenvolvimento de agentes preventivos ou terapêuticos apropriados estiveram grandemente limitados pelo facto de Helicobacter pylori apenas se associar com epitélio do tipo gástrico de muito poucos hospedeiros animais, nenhum dos quais adequado à utilização como modelos laboratoriais.
Um modelo de colonização gástrica em ratinho foi desenvolvido utilizando uma bactéria helicoidal isolada de muco gástrico de gato (Lee e tal, 1988, 1990) e foi identificado como sendo membro do género Helicobacter. Foi denominada H. felis (Paster e tal, 1990). 1
Até à data, apenas está disponível informação limitada relativamente a H. felis e a extensão das suas semelhanças e diferenças com H. pylori. A fiabilidade do modelo em ratinho para desenvolvimento de tratamentos para a infecção por H. pylori é assim incerta. Recentemente, foi mostrado que a urease de H. pylori é um antigénio protector no modelo ratinho / H. felis (Davin e tal, 1993; Corthesy-Theulaz e tal, 1993).
Deste modo, constitui um objectivo da presente invenção proporcionar composições terapêuticas e preventivas para utilização na infecção por Helicobacter, que possa adicionalmente ser testada em animais de laboratório.
Sabe-se que H. pylori expressa actividade de urease e que a urease desempenha um papel importante na colonização bacteriana e na mediação de certos processos patogénicos (Ferrero e Lee, 1991; Hazel et al, 1991).
Os genes que codificam para os polipéptidos estruturais da urease de H. pylori (Pedido de patente internacional WO 93/07273).
Foram conduzidas tentativas para utilizar sequências de ácidos nucleicos do grupo de genes da urease de H. pylori como sondas para identificar sequências de urease em H. felis. No entanto, nenhuma destas tentativas teve sucesso. Além disso, o estabelecimento e a manutenção de culturas de H. felis in vitro é extremamente difícil, e as elevadas quantidades de nucleases presentes na bactéria complicam a extracção de ADN. 2
Os presentes inventores conseguiram, no entanto, clonar e sequenciar os genes estruturais da urease de H. felis, e dos polipéptidos acessórios. isto permitiu, no contexto da invenção, a comparação dos dados de sequência de aminoácidos para os produtos do gene ure de H. felis com aqueles de Helicobacter pylori, e verificou-se um elevado grau e conservação entre as subunidades da urease. Existe uma relação imunológica entre as 2 ureases, e podem ser induzidos anticorpos protectores contra a infecção por Helicobacter utilizando as subunidades da urease ou os seus fragmentos como imunogénios.
De facto, para se elucidar a eficácia de subunidades individuais da urease como imunogénios de mucosa, os genes que codificam para as respectivas subunidades da urease (UreA e UreB) de Helicobacter pylori e Helicobacter felis foram clonados num vector de expressão (pMAL) e expressos em células de Escherichia coli como proteínas de fusão. As proteínas recombinantes UreA e UreB foram purificadas por técnicas de cromatografia de afinidade e de permuta aniónica e possuem pesos moleculares médios de, respectivamente, aproximadamente 68 e 103 kDa. Estudos de "Western blotting" indicaram que os componentes urease das proteínas de fusão são fortemente imunogénicos e são especialmente reconhecidos por soro anti-Helicobacter policlonal de coelho. A imunização orogástrica de ratinhos com 50 pg de UreB recombinante de H. felis, administrada em combinação com um adjuvante mucosal (toxina da cólera), protegia 60 % (n = 7; p < 0, 005) dos ratinhos da colonização gástrica por bactérias H. felis ao longo de 4 meses. Este valor compara com 25 % (n = 8; p > 0,05) para o antigénio UreB heterólogo de H. pylori. Pela primeira vez, mostrou-se que uma subunidade recombinante do 3 antigénio induzia uma resposta imunoprotectora contra infecção gástrica por Helicobacter.
Os inventores também identificaram, no contexto da invenção, novas Proteínas de Choque Térmico ou chaperoninas, em Helicobacter, que têm um efeito potenciador na actividade da urease. A utilização de chaperoninas numa composição imunogénica pode assim induzir um aumento da protecção.
De facto, os genes que codificam para cada um dos polipéptidos HspA e HspB de Helicobacter pylori foram clonados, expressos independentemente como proteínas de fusão com a Proteína de Ligação à Maltose (MBP), e estas purificadas em larga escala. Estas proteínas foram usadas como antigénios recombinantes para imunizar coelhos, e em ensaios de "Western immunoblotting" assim como testes ELISA para determinar a sua imunogenicidade em pacientes infectados com HP (HP+) . Também se verificou que as proteínas de fusão MBP-HspA e MBP-HspB retinham as suas propriedades antigénicas. A comparação da resposta imunitária humoral contra HspA e/ou HspB em soros de pacientes (HP+) mostrou que não só HspB mas também HspA foram reconhecidas por soros de pacientes (respectivamente 29/38 e 15/38). Nenhum dos 14 pacientes não infectados apresentou anticorpos que reagissem com as Hsps. A presente invenção refere-se a uma composição imunogénica capaz de induzir anticorpos contra infecção por Helicobacter caracterizada por compreender: (i) a Proteína de Choque Térmico HSP A, codificada pelo gene hsp A do plasmídeo pILL689 (CNCM 1-1356), ou 4 (ii) um fragmento da referida HSP A com pelo menos 6 aminoácidos, ou (iii) uma variante de polipéptido da referida HSP A, na qual foram substituídos, inseridos ou removidos aminoácidos, exibindo esta variante pelo menos 75% de identidade com a referida HSP A,
Em que o referido fragmento ou variante de polipéptido aumenta a actividade de urease num microrganismo capaz de expressar uma urease activa.
Preferentemente, a composição imunogénica é capaz de induzir anticorpos protectores. A expressão "polipéptido estrutural de urease" significa, no contexto da presente invenção, a enzima de Helicobacter pylori ou Helicobacter felis provavelmente um antigénio de superfície major composto por duas subunidades monoméricas repetidas, uma subunidade principal (produto do gene ure B) e uma subunidade menor, produto do gene ure A e que, quando complementadas pela presença de produtos dos genes acessórios do conjunto de genes da urease, são responsáveis pela actividade de urease, isto é, a hidrólise de ureia para libertar NH4+ nas duas espécies de Helicobacter. Deve entender-se que na ausência dos produtos acessórios dos genes, os polipéptidos estruturais da urease não apresentam actividade enzimática, mas são reconhecidos por anticorpos que reagem com a urease de H. felis ou de H. pylori. 0 termo "composição imunogénica" significa, no contexto da invenção, uma composição compreendendo um ingrediente activo principal, em conjunto com quaisquer ingredientes necessários 5 para assegurar ou optimizar uma resposta imunogénica, por exemplo adjuvantes, tais como o adjuvante mucosal, etc... 0 polipéptido estrutural da urease de Helicobacter pylori foi descrito e sequenciado por Labigne e tal, 1991. 0 polipéptido descrito neste artigo é particularmente apropriado para utilização na composição da presente invenção. No entanto, podem ser utilizadas variantes que apresentem homologia funcional com esta sequência publicada, que compreendem substituições, deleções ou inserções de aminoácidos desde que as caracteristicas imunológicas do polipéptido no que respeite à sua reactividade cruzada com anticorpos anti-urease de Helicobacter felis, sejam mantidas. Em termos gerais, a variante de polipéptido apresentará uma homologia de pelo menos 75% e preferentemente cerca de 90% com a sequência incluída.
Um fragmento do polipéptido estrutural da urease de Helicobacter pylori pode também ser utilizado na composição imunogénica da invenção, desde que os fragmentos sejam reconhecidos por anticorpos que reajam com a urease de Helicobacter felis. Tal fragmento compreenderá geralmente pelo menos 6 aminoácidos, por exemplo, de 6 a 100 aminoácidos, preferentemente cerca de 20-25. Com vantagem, o fragmento contém epitopos únicos de Helicobacter.
As sequências de ácidos nucleicos e de aminoácidos podem ser interpretadas no contexto da presente invenção por referência às figuras 11 e 12, apresentando, respectivamente, o código genético e as abreviaturas dos aminoácidos. 6 0 polipéptido estrutural da urease de Helicobacter felis adequado para utilização na presente invenção é preferentemente aquele codificado por parte do plasmídeo pILL205 (depositado no CNCM a 25 de Agosto de 1993, com o número: CNCM 1-1355), e cuja sequência de aminoácidos é apresentada na figura 3 (subunidades A e B) . De novo, pode ser utilizada uma variante deste polipéptido compreendendo substituições, deleções ou inserções de aminoácidos em relação à sequência da figura 3 desde que a relação cruzada imunológica com a urease de Helicobacter pylori seja mantida. Tal variante normalmente apresente pelo menos uma homologia ou identidade de 90% com a sequência da figura 3. Um exemplo de tais variantes são as subunidades A e B da urease de Helicobacter heilmannii (Solnick e tal, 1994), que se mostrou ter 80% e 92% de identidade com, respectivamente, as subunidades A e B de H, felis.
Os fragmentos desta urease ou variantes podem ser utilizados na composição imunogénica desde que os fragmentos sejam reconhecidos pelos anticorpos que reagem com a urease de Helicobacter pylori. De novo, o comprimento de tal fragmento é geralmente de pelo menos 6 aminoácidos, por exemplo de 6 a 100, preferentemente cerca de 20 a 25. Preferentemente, o fragmento apresenta epitopos caracteristicos de Helicobacter.
Se são utilizadas variantes ou fragmentos das sequências de urease nativas na composição imunogéncia da invenção, pode-se testar a respectiva reactividade cruzada com anticorpos que reagem com a urease de outra espécie de Helicobacter contactando o fragmento ou a variante com anticorpos, preferentemente policlonais para a urease nativa ou recombinante ou, alternativamente para a Helicobacter 7 inteira. Preferentemente, as variantes e fragmentos originam anticorpos que são também capazes de reagir com a urease de H. helimannii. A protecção cruzada contra a infecção por H. heilmannii é assim também obtida pela composição imunogénica da invenção. A utilização de fragmentos dos genes estruturais da urease é particularmente preferida uma vez que as propriedades imunológicas do polipéptido inteiro podem ser conservadas minimizando o risco de toxicidade. 0 componente urease da composição imunogénica, seja a subunidade A ou a subunidade B, pode ser utilizado na forma de proteínas de fusão, por exemplo, com a Proteína de Ligação à Maltose (MBP). Outras fusões adequadas são exemplificadas no Pedido de Patente Internacional WO 90/11360. Outro exemplo de uma proteína de fusão adequada é o sistema "QIAexpress" comercializado pela QIAGEN, EUA, que permite a sequência de cauda de 6xHis seja colocada na terminação 5' ou 3' da sequência que codifica para a proteína. A utilização de ingredientes activos na forma de proteínas de fusão é, no entanto, inteiramente opcional. A composição imunogénica da invenção compreende uma Proteína de Choque Térmico (HSP) também conhecida como "chaperonina" de Helicobacter. Estas chaperoninas foram elucidadas pelos inventores no contexto da presente invenção. Preferentemente, a chaperonina é de Helicobacter pylori. Tal HSP pode ser a HSP A associada à urease ou uma mistura de HSP A e HSP B, com a sequência de aminoácidos ilustrada na figura 6. Estes polipéptidos são codificados pelo plasmídeo pILL689 (depositado em CNCM a 25 de Agosto de 1993, com o número: CNCM 1-1356). Prefere-se particularmente a proteína HSP-A de H. pylori, seja isoladamente ou em combinação com Hsp-B. É também possível utilizar, como componente HSP, de acordo com a invenção, uma variante de polipéptido na qual foram substituídos, inseridos ou deletados aminoácidos da sequência da figura 6, apresentando normalmente a referida variante pelo menos 75 %, e preferentemente pelo menos 85 % de homologia com a HSP nativa. As variantes preferentemente apresentam preferentemente pelo menos 75 %, por exemplo, pelo menos 85 % de identidade com a Hsp nativa.
As variantes apresentam ainda homologia funcional com o polipéptido nativo. No caso dos componentes HSP, "homologia funcional" significa a capacidade de aumentar a actividade de urease num microrganismo capaz de expressar a urease activa, e/ou a capacidade de bloquear a infecção por Helicobacter, particularmente H. felis e H. pylori. A propriedade de aumento da actividade da urease pode se testada utilizando o ensaio quantitativo da actividade de urease descrito abaixo nos exemplos. Os fragmentos de cada um ou de ambos os polipéptidos HSP A e HSP B tendo preferentemente 6 aminoácidos, podem ser utilizados na composição. Os fragmentos ou variantes do componente HSP utilizado na composição imunogénica da invenção são capazes de gerar anticorpos que bloqueiam 0 efeito potenciador da urease normalmente apresentado pelas HSPs. Esta propriedade é também testada utilizando o ensaio quantitativo descrito nos exemplos. A presença das chaperoninas na composição aumenta a protecção contra Helicobacter pylori e felis. 9 0 componente Hsp da composição imunogénica, seja HspA ou HspB pode ser usando na forma de uma proteína de fuso, por exemplo com a Proteína de Ligação à Maltose (PLM) . Tal como para a componente urease, são descritos outros parceiros de fusão adequados no Pedido de Patente Internacional WO 90/11360. Também pode ser utilizado o sistema "QIAexpress" da QIAGEN, EUA. De novo, a utilização de proteínas na forma de proteínas de fusão é opcional. A composição imunogénica pode compreender HspA e um polipéptido estrutural da urease tal como definido acima.
De acordo com uma realização preferida, a composição imunogénica compreende, como componente urease, ambas as subunidades A e B tanto de Helicobacter felis (isto é, sem urease H, pylori) em conjunto com a HSP A e HSP B de Helicobacter pylori. A reactividade imunológica cruzada entre as ureases duas espécies de Helicobacter diferentes possibilita a utilização de apenas uma urease na composição, preferentemente aquela de Helicobacter felis. Os anticorpos protectores induzidos pelos epitopos comuns serão no entanto activos tanto contra Helicobacter pylori como contra Helicobacter felis. É também possível que a composição induza anticorpos protectores contra outras espécies de Helicobacter, se o polipéptido ou fragmento de urease contem epitopos que ocorrem também noutras espécies. A composição da invenção é utilizada com vantagem como composição imunogénica ou uma vacina, em conjunto com excipientes fisiologicamente aceitáveis e veículos e, 10 opcionalmente, com adjuvantes, haptenos, veículos, estabilizantes, etc. Adjuvantes adequados incluem o dipéptido de muranmilo (MDP), os adjuvantes completo e incompleto de Freund (CFA e IFA) e alúmen. As composições da vacina são normalmente formuladas para administração oral.
As vacinas são preferivelmente utilizadas no ser humano, mas podem também ser administradas em animais não humanos, por exemplo para fins veterinários, ou para utilização em animais de laboratório tais como ratinhos, gatos e cães.
As composições imunogénicas injectadas nestes animais conduzem à síntese in vivo de anticorpos específicos, os quais podem ser utilizados para fins terapêuticos, por exemplo em imunidade passiva. "Material proteico" significa qualquer molécula significa qualquer molécula compreendida por cadeias de aminoácidos, por exemplo péptidos, polipéptidos ou proteínas, proteínas de fusão ou mistas (isto é, uma associação de 2 ou mais materiais proteicos, podendo todos ou alguns com propriedades imunogénicas ou imunomoduladoras), seja purificada ou numa mistura com outro material proteico ou não proteico. "Polipéptido" significa uma cadeia de aminoácidos de qualquer comprimento w engloba o termo "péptido". 0 termo "fragmento" significa qualquer sequência de aminoácidos mais curta em pelo menos um aminoácido do que a sequência original e compreendendo pelo menos 6 resíduos aminoácidos consecutivos da sequência original.
As sequências peptídicas da invenção podem, por exemplo, ser obtidas por síntese química, utilizando uma técnica tal como 11 a técnica Merrifield e um sintetizador do tipo comercializado pela Applied Biosystems. A invenção também se refere ao material proteico, caracterizado por compreender ou consistir em: (i) a Proteína de Choque Térmico HSPA de Helicobacter pylori , corr i a seguinte sequência de aminoácidos: met lys phe gin pro leu gly glu arg vai leu vai glu arg leu glu glu glu asn lys thr ser ser gly ile ile ile pro asp asn ala lys glu lys pro leu met gly vai vai lys ala. vai ser his lys ile ser glu gly cys lys cys vai lys glu giy asp vai ile ala phe gly lys tyx lys gly ala glu ile vai leu asp giy vai glu tyr met vai leu glu leu glu asp ile leu gly ile vai giy ser gly ser cys cys his thr gly asn his asp his lys his ala lys glu his glu ala cys cys his asp his' lys lys his (ii) um fragmento de HSPA tal como definida em (i), compreendendo o referido fragmento pelo menos 6 aminoácidos consecutivos da sequência de aminoácidos definida em (i); ou, (iii) uma variante de polipéptido da sequência de aminoácidos definida em (i), na qual foram substituídos, inseridos ou removidos aminoácidos, tendo a referida variante de polipéptido pelo menos 75%, e preferivelmente pelo menos 80% de identidade com a sequência de aminoácidos definida em (i), 12 em que o referido fragmento ou variante de polipéptido aumenta a actividade de urease num microrganismo capaz de expressar uma urease activa.
Um fragmento do polipéptido HSP A de Helicobacter pylori particularmente preferido é a sequência C-terminal:
GSCCHTGNHDHKHAKEHEACCHDHKKH ou um sub-fragmento desta sequência com pelo menos 6 aminoácidos consecutivos. Pensa-se que esta sequência C-terminal actua como um dominio de ligação a metais que permite a ligação, por exemplo, a niquel. 0 material proteico da invenção pode ainda compreender ou consistir de uma proteína de fusão ou mista incluindo pelo menos uma das subunidades do polipéptido estrutural da urease de H. pylori e/ou de H. felis, ou seus fragmentos ou variantes tal como definidos acima. A proteína de fusão ou mista pode incluir ou em alternativa ou em conjunto com a subunidade urease, uma Proteína de Choque Térmico, ou um seu fragmento ou variante, tal como definido acima. A invenção também se refere a anticorpos monoclonais ou policlonais para os materiais proteicos descritos acima. Os anticorpos podem também ser dirigidos para um polipéptido com pelo menos 90 % de homologia com qualquer dos polipéptidos urease acima ou com um seu fragmento tendo preferentemente 6 aminoácidos. Os anticorpos da invenção podem reconhecer especificamente polipéptidos Helicobacter felis expressos pelo conjunto de genes urease. Neste caso, os epitopos reconhecidos pelos anticorpos são únicos para Helicobacter 13 felis. Alternativamente, os anticorpos podem incluir ou consistir de anticorpos direccionados a epitopos comuns aos polipéptidos urease de Helicobacter felis e aos polipéptidos urease de Helicobacter pylori. Se os anticorpos reconhecem os produtos genéticos acessórios, é particularmente vantajoso que tenham uma reacção cruzada com o produto genético acessório de Helicobacter pylori. Deste modo, os anticorpos podem ser utilizados no tratamento terapêutico da infecção de Helicobacter pylori no ser humano, através do bloqueio do processo de maturação da urease. A invenção também se refere a anticorpos monoclonais ou policlonais para as HSPs ou seus fragmentos, particularmente para a proteína HSP A e/ou HSP B ilustrada na figura 6. Podem também ser utilizados polipéptidos com pelo menos 75 %, e preferentemente pelo menos 80 %, ou 90 % de homologia com as HSPs para induzir a formação de anticorpos. Estes anticorpos podem ser específicos para as chaperoninas de Helicobacter pylori ou, alternativamente, podem apresentar reacção cruzada com proteínas do tipo GroEL ou do tipo GroES de bactérias diferentes de Helicobacter, dependendo dos epitopos reconhecidos. A Figura 7 ilustra as regiões homólogas de HSP A e HSP B, respectivamente com proteínas do tipo GroES e proteínas do tipo GroEL de várias bactérias. Anticorpos particularmente preferidos são aqueles específicos para as chaperoninas HSP A ou HSP B ou aqueles que reconhecem especificamente a sequência c-terminal de HSP A com a função de ligação a metal. De novo, a utilização de fragmentos específicos para a indução dos anticorpos assegura a produção de anticorpos específicos de Helicobacter. 14
Os anticorpos da invenção podem ser preparados utilizando técnicas clássicas. Por exemplo, anticorpos monoclonais podem ser produzidos através da técnica do hibridoma ou através de técnicas conhecidas para a preparação de anticorpos humanos, ou pela técnica descrita por Marks et al (Journal of Molecular Biology, 1991, 222, p 581-597). A invenção inclui ainda fragmentos de qualquer dos anticorpos acima produzidos por digestão enzimática. São de particular interesse os fragmentos Fab e F(ab')2. São também de interesse os fragmentos Facb. A invenção também se refere a anticorpos purificados ou soro obtido por imunização de uma animal, por exemplo, um mamífero com a composição imunogénica, o material ou fragmento proteico, ou a proteína de fusão ou mista da invenção seguida pela purificação dos anticorpos ou do soro. Também é relevante um reagente para a detecção in vitro da infecção de H. pylori, contendo pelo menos estes anticorpos ou soro, opcionalmente com reagentes para a marcação dos anticorpos, por exemplo, anti-anticorpos, etc. A invenção refere-se ainda a sequências de ácidos nucleicos que codificam para qualquer dos materiais proteicos acima, incluindo péptidos. Em particular, a invenção refere-se a uma sequência de ácidos nucleicos caracterizada por compreender: (i) uma sequência que codifique para a urease de Helicobacter felis e polipéptidos acessórios tal como definida acima, e uma sequência que codifique para a HSP de H. pylori, tal como definida acima: ou (ii) uma sequência complementar à sequência (i); 15 ou (iii) uma sequência capaz de hibridar com a sequência (i) ou (ii) sob condições restringentes; ou (iv) um fragmento de qualquer das sequências (i), (ii) ou (iii) compreendendo pelo menos 10 nucleótidos.
As sequências preferidas são aquelas que compreendem a totalidade ou parte da sequência do plasmideo pILL689 (CNCM 1-1356), por exemplo a sequência da figura 6, em particular aquela que codifica para HSP A e/ou HSP B, ou uma sequência complementar a esta, ou uma sequência capaz de hibridar a esta sequência sob condições restringentes.
Condições de hibridação de elevada restringência no contexto da invenção são as seguintes:
- 5 x SSC - 50 % de formamida a 37°C; ou: - 6 x SSC: - Meio de Denhard a 68°C.
As sequências da invenção também incluem aquelas que hibridam a quaisquer das sequências (i), (ii) e (iii) definidas acima sob condições não restringentes, ou seja: - 5 x SSC; - 0,1 % SDS; - 30 ou 40 % formamida a 42°C, preferentemente 30 %. 16 0 termo "sequências complementares" no contexto da invenção significa sequências "complementares" e "reversas" ou "inversas".
As sequências de ácidos nucleicos podem ser ADN ou ARN.
As sequências da invenção podem ser utilizadas como sondas de nucleótidos em associação com métodos de marcação apropriados. Tais meios incluem isótopos radioactivos, enzimas, marcadores químicos ou quimioluminescentes, fluorocromos, haptenos, ou anticorpos. Os marcadores podem ser opcionalmente fixados a um suporte sólido, por exemplo uma membrana, ou a partículas.
Como marcador preferido, incorpora-se fósforo radioactivo 32 λ ( P) na ponte 5' da sequencia da sonda. As sondas da invenção compreendem qualquer fragmento das sequências de ácidos nucleicos descritas e podem ter um comprimento por exemplo de pelo menos 45 nucleótidos, por exemplo 60, 80 ou 100 nucleótidos ou mais. As sondas preferidas são aquelas derivadas dos genes ure A, ure B, ure I, HSP A e HSP B.
As sondas da invenção podem ser utilizadas na detecção in vitro da infecção por Helicobacter numa amostra biológica opcionalmente após uma reacção de amplificação de um gene. Vantajosamente, as sondas são utilizadas para detectar Helicobacter felis ou Helicobacter pylori, ou ambas, dependendo se a sequência escolhida como sonda é específica para uma ou para a outra, ou se pode hibridar com ambas. Geralmente, as condições de hibridação são restringentes quando se leva a cabo tal detecção. 17 A invenção também se refere a um kit para a detecção in vitro de infecção por Helicobacter, caracterizada por compreender: - uma sonda nucleotídica de acordo com a invenção, tal como definida acima; um meio apropriado para levar a cabo a reacção de hibridação entre o ácido nucleico de Helicobacter e a sonda; - reagentes para a detecção de qualquer híbrido formado.
As sequências nucleotídicas da invenção podem também servir como iniciadores numa reacção de amplificação de ácidos nucleicos. Os iniciadores normalmente compreendem pelo menos 10 nucleótidos consecutivos das sequências descritas acima e preferentemente pelo menos 18. Comprimentos típicos são desde 25 a 30 e podem ser tão elevados como 100 ou mais nucleótidos consecutivos. Tais iniciadores podem ser utilizados em pares e são escolhidos para hibridar com as terminações 5' e 3' do fragmento a ser amplificado. Tal reacção de amplificação pode ser realizada utilizando por exemplo a técnica de PCR (pedidos de patente europeia EP200363, 201184 e 229701) . A técnica da Ο-β-replicase (Biotechnoloqy, vol. 6, Out. 1988) pode também ser utilizada na reacção de amplificação. A invenção também se refere a vectores de expressão caracterizados por conterem qualquer uma das sequências de ácidos nucleicos da invenção. Um vector de expressão particularmente preferido é o plasmideo pILL689 (CNCM I-1356). OS vectores de expressão normalmente conterão promotores, terminadores e marcadores genéticos adequados, e quaisquer outros sinais de regulação necessários para uma expressão eficiente. 18 A invenção refere-se ainda a células hospedeiras procarióticas ou eucarióticas estavelmente transformadas pelas sequências de ácidos nucleicos da invenção. Como exemplos de hospedeiros, podem ser mencionados eucariotas superiores tais como células e linhas celulares CHO; leveduras, procariotas incluindo bactérias tais como E. coli, por exemplo E. coli HB 101; Mycobacterium tuberculosum; vírus incluindo baculovirus e vacínia. Geralmente, as células hospedeiras serão transformadas por vectores. No entanto, é também possível no contexto da invenção inserir sequências de ácidos nucleicos através de recombinação homóloga, utilizando técnicas convencionais.
Através da cultura dos hospedeiros da invenção estavelmente transformados, o material polipeptídico da urease de Helicobacter e, quando aplicável, o material HSP pode ser produzido por métodos recombinantes. Os materiais proteicos recombinantes são então recolhidos e purificados. As composições farmacêuticas são preparadas através da combinação dos materiais recombinantes com excipientes adequados, adjuvantes e opcionalmente, quaisquer outros aditivos tais como estabilizantes. São ilustrados aspectos são ilustrados nas figuras:
Figura 1:
Mutagénese por transposões e sequenciação de pILL205. São apresentados os mapas de restrição lineares do cosmídeo recombinante plLLl99 e do plasmídeo recombinante plLL205 (e os respectivos marcadores de escala). Os números entre parêntesis indicam as dimensões dos fragmentos de ADN de H. felis introduzidos num dos vectores de clonagem (pILL575 ou 19 pILL570, respectivamente). Os sinais "mais" e "menos" no interior de círculos correspondem aos locais de inserção do transposão MiniTn3-Km em pILL205: os sinais "mais" indicam que o transposão não inactivou a expressão da urease, enquanto que sinais negativos indicam que a expressão da urease foi abolida. As letras referem-se a clones mutantes que foram ainda caracterizados em relação à actividade quantitativa de urease e para a síntese de produtos genéticos de urease. A localização dos genes estruturais de urease (ure A e ure B) em plLL205 é representada por caixas, cujos comprimentos são proporcionais às dimensões das respectivas grelhas de leitura aberta. As setas referem-se à orientação da transcrição. A escala no fundo da figura indica as dimensões (em quilobases) dos fragmentos de restrição HindiII e PstI. Os locais de restrição são representados como se segue: B, BamHI; Pv, Pvuil; Bg, BglII; E, EcoRI; H, HindIII; C, Ciai; Ps, PstI. As letras no interior de parêntesis indicam que os locais são originários do vector de clonagem.
Figura 2: A análise por "Western blot" de extractos de células inteiras de células de E. coli HB101 contendo plasmídeos recombinantes foi feita reagir com antisoro policlonal de coelho (diluído 1:1, 1000) contra bactérias H, felis. A) Os extractos foram de células de E. coli contendo: vector plasmídico pILL570 (poço 1); plasmídeo recombinante plLL205 (poço 2); e plasmídeos derivados de pILL205 clivados nas posições "a", "b", "c", "d", e "e" (poços 3-7) . B) Os extractos foram de células de E. coli contendo: vector plasmídico recombinante plLL753 contendo os genes de H. pylori ure A e ure B (Labigne e tal., 1991) (poço 1); e plasmídeos derivados de pILL205 clivados nas posições "f", "g", "g", e "i" (poços 2-5) . As 20 setas pequenas indicam polipéptidos de aproximadamente 30 e 66 kDa que representam produtos genéticos putativos de Ure A e Ure B de H. felis. As setas grandes no painel B indicam os produtos genéticos correspondentes de H. pylori que realizou uma reacção cruzada com o soro anti-H. felis. Os números indicam os pesos moleculares (em milhares) dos padrões de proteína.
Figura 3:
Sequência de nucleótidos dos genes estruturais da urease. Os números acima da sequência indicam as posições nucleotidicas assim como as posições dos aminoácidos em cada um dos dois polipéptidos Ure A e Ure B, Apresentam-se por baixo da sequência as sequências de aminoácidos previstas para Ure A (pb 43 a 753) e Ure B (766 a 2616) . O local de ligação ribossomal putativo (sequência de Shine-Dalgarno, SD) está sublinhado.
Figura 4:
Comparação das sequências dos genes estruturais da urease de H. felis em relação a: a) a sequência das duas subunidades da urease de H. pylori (Labigne e tal, 1991); b) a sequência das três subunidades da urease de Proteus mirabilis (Jones e Mobley, 1989); c) a sequência da subunidade única da urease de feijão-de-porco. Foram introduzidos intervalos (ilustrados por traços) para assegurar o melhor alinhamento. *, aminoácidos idênticos àqueles da sequência de H. felis; =, aminoácidos comuns às várias ureases; ., aminoácidos únicos às ureases de Helicobacter. As percentagens referem-se ao número de aminoácidos que são idênticos àqueles das subunidades de urease de H. felis. H.f., Helicobacter felis; 21 Η.ρ·, Helicobacter pylori; P.m., Proteus mirabilis; J.b. feijão-de-porco.
Figura 5:
Mapa de restrição dos plasmideos recombinantes pILL689, pILL685, e pILL691. A construção destes plasmideos está descrita detalhadamente na Tabela 1. Km no interior de triângulos representa o local de inserção da cassete de canamicina que conduziu à construção dos plasmideos pILL687, plLL688 e pILL696 (tabela 2) . As caixas por baixo dos mapas indicam a posição dos três elementos genéticos deduzidos a partir da sequência nucleotidica, nomeadamente IS5, Hsp A e Hsp B.
Figura 6:
Sequência nucleotidica do conjunto de genes da Proteína de Choque Térmico de Helicobacter pylori, 0 primeiro número acima da sequência indica as posições dos nucleótidos, enquanto a segunda numera as posições dos resíduos aminoácidos para cada uma das proteínas Hsp A e Hsp B. As sequências putativas de ligação as ribossoma (locais Shine-Dalgarno [SD]) são sublinhadas.
Figura 7:
Comparação da sequência de aminoácido de Helicobacter pylori Hsp A (A) ou Hsp B (B) com aquela de outras proteínas do tipo GraEL (A) ou do tipo GroES (B). Os asteriscos marcam aminoácidos idênticos àqueles nas sequências de Helicobacter pylori Hsp A ou Hsp B.
Figura 8: 22
Expressão das Proteínas de Choque Térmico Hsp A de Helicobacter pylori em minicélulas de E. coli. As bandas das proteínas com massas moleculares aparentes de 58 e 13 kDa, correspondendo às Proteínas de Choque Térmico Hsp A e Hsp B de Helicobacter pylori são claramente visíveis nos poços correspondentes aos plasmídeos plLL689 e pILL692 e ausentes nos vectores controlo (respectivamente, pILL570 e pACYC177).
Figura 9:
Sequência nucleotídica do gene ure I de Helicobacter felis e sequência de aminoácidos deduzida.
Figura 10:
Comparação da sequência de aminoácidos das proteínas ure I deduzida a partir da sequência de nucleótidos do gene ure I de Helicobacter felis e daquela de Helicobacter pylori.
Figura 11: Código genético. Codões de terminação de cadeia ou "nonsense". Também utilizados para especificar o iniciador formil-Met-tARNMetF. O tripleto Vai GUG é deste modo "ambíguo" por codificar tanto para a valina como para a metionina.
Figura 12:
Purificação da proteína recombinante UreA-MBP de H. pylori utilizando o sistema de vector de expressão pMAL. Extractos das várias fases da purificação de proteína foram migrados num gel de poliacrilamida-SDS 10%. Após a electroforese o gel foi corado com azul do Coomassie. Os extractos foram: 1) células não induzidas; células induzidas com IPTG; lisado obtido em prensa francesa do extracto celular não induzido; 5) eluato da coluna de resina amilose; 6) eluato da coluna de 23 permuta aniónica (primeira passagem); 7) eluato da coluna de permuta aniónica (segunda passagem); 8) proteínas marcadoras padrão de SDS-page.
Figura 14:
Reconhecimento das proteínas de fusão UreA através de soro anti-Helicobacter policlonal de coelho. Extractos de proteína de ligação à maltose (MBP, poço 1), UreA-MBP de H. felis (poço 2), e UreA-MPB de H. pylori (poço 3) foram analisados por "Western blot" utilizando antisoro policlonal de coelho (diluido 1:5000) produzido contra extractos celulares de H. pylori e H. felis. As proteínas de fusão purificadas são indicadas por uma seta. Os produtos de degradação putativos das proteínas são indicados por um asterisco.
Figura 15:
Reconhecimento das proteínas de fusão recombinantes UreB por antisoro de coelho produzido contra proteínas UreB homólogas e heterólogas purificadas. Os seguintes extractos foram transferidos para membranas de nitrocelulose: 1) marcadores de proteína padrão; 2) UreA-MBP de H. felis; 3) MBP; 4) UreA-MPB de H. pylori. Reagiram-se as membranas com antisoro policlonal de coelho (diluído 1:5000) produzido, respectivamente, contra subunidades de UreB de H, pylori e H. felis de fusão com MBP.
Figura 16:
Análise de "Western blot" de extractos de células inteiras de H. pylori e H. felis com antisoro produzido contra proteínas recombinantes purificadas UreB de fusão com MBP. Fez-se reagir os extractos de células inteiras de H. felis (poço 1) e de H, pylori (poço 2) com antisoro policlonal de coelho 24 produzido contra proteínas purificadas UreB de H. pylori e UreB de H. felis de fusão com MBP (soro diluído 1:5000). A diferença na mobilidade no gel das respectivas subunidades não recombinantes UreB de H. felis e H, pylori pode ser observada. Os números na esquerda referem-se aos pesos moleculares das proteínas padrão do marcador.
Figura 17:
Respostas de IgG do soro a MBP (baixo), MBP-HspA (topo) e MBP-HspB (meio) de 28 pacientes infectados com H. pylori (quadrados, esquerda) e de 12 pacientes não infectados (círculos, direita). A densidade óptica de cada soro no ensaio ELISA descrito nos procedimentos Experimentais foi lida a 492 nm, após 30 min de incubação. A dimensão dos símbolos é proporcional ao número de soros que apresentam o mesmo valor de densidade óptica.
Figura 18:
Análise por SDS-PAGE do material eluído da coluna de amilose (poços 2 e 3) ou da coluna de Ni-NTA após eluição: com tampão E (pH 4,5), poços 4 e 5; ou tampão C (pH 6,3), poços 6 e 7. Material eluído de um lisado de MC1061 (PILL933) (poços 2, 3, 5 e 7) e material eluído de um lisado de MC1061 (PMAL-c2) (poços 4 e 6). O poço 3 contém o mesmo material do que o poço 2, excepto que foi ressuspendido no tampão E, mostrando assim que o tampão E é responsável pela formação de um dímero da subunidade MBP-HspA, tal como observado nos poços 3 e 5.
EXEMPLO DE REFERÊNCIA I
I- CLONAGEM, EXPRESSÃO E SEQUENCIAÇAO DO GENE DA UEASE DE H. FELIS 25 PROCEDIMENTOS EXPERIMENTAIS PARA A PARTE I:
Estirpes bacterianas e condições de cultura:
Cresceu-se H. felis (ATCC 49179) em base de gelose de sangue no. 2 (Oxoid) suplementada com 5 % (v/v) de sangue de cavalo lisado (BioMerieux) e um suplemento de antibiótico que consiste em 10 ng mL-1 de vancomicina (Lederle laboratories), 2,5 pg mLT1 de polimixina B (Pfizer), 5 pg mL-1 de trimetoprim (Sigma Chemical Co.), e 2,5 pg mL-1 de anfotericina B (E.R Squibb and Sons, Inc.). As bactérias foram cultivadas em placas com agar preparadas de fresco e incubadas, com a tampa para cima, sob condições microaeróbicas a 37°C durante 2-3 dias. As estirpes de E. coli HB101 (Boyer e Roulland-Dussoix, 1969) e MC1061 (Maniatis e tal., 1983), utilizadas nas experiências de clonagem, foram crescidas rotineiramente em meio de Luria sem qualquer adição e glucose ou em agar de meio de Luria, a 37°C. As bactérias crescidas sob condições de limitação de azoto foram passadas para um meio sólido com limitação de azoto, consistindo em meio minimo M9 sem amónia (pH 7,4) suplementado com 0,4 % (p/V9 de D-glucose e 10 mM de L-arginina (Cussac e tal., 1992).
Manipulações de ADN:
Todas as manipulações e análises convencionais de ADN, excepto se mencionado de outro modo, foram lavadas a cabo de acordo com os procedimentos descritos por Maniatis et al. (1983) .
Isolamento de ADN de H. felis 26 0 ADN genómico total foi extraído através e um procedimento de lise de sarcosil-proteinase K (Labigne-Roussel et al., 1988). Doze placas com gelose de sangue inoculadas com H. felis foram incubadas num recipiente anaeróbico (BBL) do tipo gaspak anaeróbico (BBL 70304) sem catalisador, durante 1-2 dias a 37°C. As placas foram recolhidas em 50 mL de uma solução 15 % (v/v) - 9 % (p/V) sacarose e centrifugadas a 5000 rpm (numa centrífuga Sorvall), durante 30 min a 4°C. O sedimento foi ressuspendido em 0,2 mL de 50 mM de D-glucose em 25 mM Tris-10 mM EDTA (pH 8,0) contendo 5 mg mL-1 de lisozima e transferido para um tubo de polialómero VTi65 de selagem rápida. Adicionou-se à suspensão uma alíquota de 0,2 mL de 20 mg mL-1 de proteinase K e 0,02 mL de perclorato de sódio a 5M. As células foram lisadas através da adição de 0,65 mL de EDTA a 0,5M - 10 % (p/v) Sarcosil, e incubadas a 65°C até a suspensão se tornar translúcida (aproximadamente 5 min) . Perfez-se o volume do tubo com uma solução de CsCl consistindo em (por 100 mL) 126 g de CsCl, 1 mL aprotinina, 99 mL tampão TES (30 mM Tris, 5 mM EDTA, 5 0 mM NaCl (pH 7,5)). Os lisados foram centrifugados a 45 000 rpm durante 15-18 h a 18°C. O ADN total foi recolhido e dializado contra tampão TE (10 mM Tris, 1 mM EDTA), a 4°C.
Clonagem de cosmídeo: O ADN cromossómico de ADN de H. felis foi clonado num vector cosmídeo pILL575, tal como descrito anteriormente (Labigne et al, 1991). Resumidamente, os fragmentos de ADN provenientes de uma digestão parcial com Sa3A foram classificados por tamanhos num gradiente de densidades de sacarose (10 a 40 %) e depois ligados numa preparação de ADN pILL575 desfosforilada e digerida por BamHI. Os cosmídeos foram 27 empacotados em partículas de fagos lambda (Amersham, kit de empacotamento in vivo) e utilizados para infectar E. coli HB101. Para fazer um rastreio para a expressão de urease, procedeu-se a um plaqueamento por réplica das células resistentes a canamicina após transdução em meio sólido com limitação de azoto (ver acima) com canamicina (20 pg mL-1) que foi previamente fornecida em poços individuais de microplacas (Becton Dickinson). As microplacas foram incubadas aerobicamente, a 37°C durante 2 dias antes de se adicionar 0,1 mL de reagente urease (Hazell et al., 1987) a cada um dos poços. A ureólise foi detectada ao fim de 5-6 h a 37°C através de uma alteração de cor no reagente. Obteve-se o mapa de restrição de vários clones cosmídeos urease-positivos e um deles foi seleccionado para sub-clonagem.
Sub-clonagem de ADN de H. felis:
Uma preparação de plasmídeos CsCl em larga escala do ADN de cosmídeo parcialmente digerido Sau3A. Os fragmentos de ADN (7-11 kb) foram electroeluídos de um gel de agarose e purificados utilizando extracções de fenol-clorofórmio. Após a precipitação em etanol frio, os fragmentos foram ligados no plasmídeo pILL570 digerido com Bg/lll (Labigne et al., 1991) e os plasmídeos recombinantes foram utilizados para transformar células competentes E. coli MC1061. foram seleccionados transformantes resistentes à espectinomicina e rastreados relativamente à expressão de urease em condições ricas (agar de Luria) e limitantes de azoto.
Actividade quantitativa de urease: 28
As culturas crescidas aerobicamente durante 2,5 dias a 37°C foram recolhidas e lavadas duas vezes em 0,85% (p/v) de NaCl. Os sedimentos foram ressuspendidos em tampão peb (0,1 M tampão de fosfato de sódio (pH 7,4) contendo 0,01 M de EDTA) e depois sonicados através de quatro ciclos de 30 segundos utilizando um sonicador Branson, modelo 450, programado para 30 W, ciclo de 50%. Os detritos celulares foram removidos dos sonicados por centrifugação. As actividades de urease dos sonicados foi medida em solução de ureia a 0,05 M preparada em PEB através de uma modificação da reacção de Berthelot (Cssac et al., 1992). A actividade de urease foi expressa como pmol ureia min“1mg~1 de proteína bacteriana.
Determinação de proteína:
As concentrações de proteína foram estimadas com uma versão comercial do teste de Bradford (Sigma Chemicals).
Mutagénese por transposões:
Foram geradas mutações aleatórias por inserção no interior de H. felis clonado através de um sistema de administração MiniTn3-Km (Labinge et al., 1992). Resumidamente, células e E. coli HB101 contendo o plasmídeo pTCA que codifica para uma transposase foram transformadas com o plasmídeo pILL570 contendo ADN clonado de H. felis. A transposição do elemento MiniTn3-Km nos plasmídeos derivados de pILL570 foi conseguida através de conjugação. Os co-integrados resultantes foram então seleccionados para estruturas resolvidas na presença de elevadas concentrações de canamicina (500 rugir1) e espectinomicina (300 mglT1) . 29 SDS-PAGE e "Western blotting":
Extractos celulares solubilizados foram analisados em geles rectangulares, compreendendo um gel de concentração com 4,5 % de acrilamida e um gel de resolução com 12,5 %, de acordo com o procedimento de Laemmli (Laemmli, 1970). A electroforese foi levada a cabo a 200V num dispositivo para mini-geles (Bio-Rad).
As proteínas foram transferidas para papel de nitrocelulose (Towbin et al., 1979) numa célula de transferência Mini Trans-Blot (BioRad) ajustada para 100 V durante 1 h (com arrefecimento). As membranas de nitrocelulose foram bloqueadas com caseína purificada a 5 % (p/v) (BDH) em tampão fosfato salino (PBS, pH 7,4) à temperatura ambiente, durante 2 h (Ferrero et al., 1992) . Fez-se reagir as membranas a 4°C durante a noite com antisoro diluído em 1 % de caseína (p/v) preparada em PBS. Os imunorreagentes foram então detectados utilizando um anticorpo secundário biotinilado (Kirkegaard and Perry Lab.) em combinação com avidina-peroxidase (KFL). Foi utilizada uma solução de substrato composta de 0,3 % (p/v) 4-cloro-l-naftol (Bio-Rad) para visualizar os produtos de reacção.
Sequenciação de ADN:
Os fragmentos de ADN a serem sequenciados foram clonados em vectores bacteriófagos (Pharmacia) Ml3mpl8 e Ml3mpl9 (Meissing e Vieira, 1982). Células competentes E. coli JM101 foram transf ectadas com o ADN de fago recombinante e plaqueadas em meio contendo X-gal (5-bromo-4-cloro-3-indolil-β-galactopiranósido) e isopropil-p-D-tiogalactopiranósido. As 30 placas resultantes de bactérias infectadas com o ADN de fago recombinante foram seleccionadas para a preparação de moldes de adn de cadeia simples através de tratamento com polietileno glicol (Sanger et al., 1977) . Os ADN de cadeia simples foram sequenciados de acordo com o método de terminação de cadeia por didesoxinucleótido utilizando um kit Sequanase (United States Biochemical Corp.). Número de acesso da sequência nucleotídica: 0 número de acesso do nucleótido é X69080 (Base de Dados EMBL).
RESULTADOS DAS EXPERIÊNCIAS DA PARTE I
Expressão da actividade de urease pelos clones cosmídeos de H. felis A clonagem de fragmentos parcialmente diferidos (30 a 45 kb de tamanho) de ADN cromossómico de H. felis no vector cosmideo pILL575 resultou no isolamento de aproximadamente 700 clones cosmídeos. Os clones foram sub-cultivados em meio de cultura com limitação e azoto de modo a induzir a expressão de urease (Cussac et al., 1992). Seis destes foram identificados como sendo urease-positivos após 5-6 h de incubação (tal como descrito na secção dos procedimentos experimentais). Não foram identificados quaisquer outros clones cosmideo urease-positivos, mesmo após mais uma incubação de um dia para o outro. A análise com enzimas de restrição de 3 clones contendo os cosmídeos que codificam para a urease revelou um fragmento de ADN comum de 28 kd. Um cosmideo (designado pILLl99) contendo regiões de ADN em ambas 31 as extremidades do fragmento comum foi seleccionado para sub-clonagem.
Identificação de genes de H. felis necessários para a expressão de urease quando clonados em células de E. coli:
Para se definir a região de ADN mínima para a expressão de urease em células de E. coli, o cosmídeo que codifica para a urease pILLl99 foi parcialmente diferido com Sau3A e os fragmentos foram sub-clonados para o plasmideo plLL570. Os transformantes foram sub-cultivados em meio rico em azoto e em meio com limitação de azoto e foi feito o rastreio para fenótipo urease-positvo. Cinco transformantes expressaram actividade de urease quando crescidos sob condições de limitação de azoto, enquanto que não foi detectada qualquer actividade após crescimento num meio rico em azoto. A análise de mapas de restrição indicou que os plasmideos que codificam para a urease continham insertos entre 7 e 11 kb. 0 plasmideo designado pILL205 foi escolhido para a realização de estudos suplementares.
Realizou-se a mutagénese aleatória de ADN de H. felis clonado para investigar as regiões putativas para expressão de urease em E. coli e para localizar a região de ADN clonado que continha os genes estruturais de urease. Foram assim gerados mutantes de inserção aleatórios do plasmideo protótipo pILL205 utilizando o elemento MiniTn2-Km (Labigne et al, 1992). 0 local da inserção foi localizado através da realização de mapas de restrição de cada uma das cópias mutadas de plLL205 e células contendo estes plasmideos foram testadas qualitativamente em relação à actividade de urease (figura 1). Uma selecção de células de E, coli HB101 contendo 32 os derivados mutados de pILL205 (designadas "a" a "i") foi então utilizada tanto para determinações quantitativas de actividade de urease, como para a detecção e subunidades putativas de urease por "Western-blotting". A actividade da urease de células de E. coli HB101 contendo plLL25 foi de 1,2 ± 0,5 pmol ureia min^mg-1 de proteína bacteriana (tabela 1), o que é aproximadamente um quinto daquela da estirpe de H, felis original utilizada para a clonagem. A inserção dos transposões nas posições "a", "c", "d", "f", e "g" resultou num fenótipo negativo, enquanto as mutações nas posições "b", "e", "h" e "i" não apresentaram qualquer efeito significativo nas actividades de urease dos clones que apresentam estas cópias mutadas de plLL205 (tabela 1) . Assim, a mutagénese de pILL205 com o elemento MiniTn3-Km identificou três dominios como sendo necessários para a expressão genética da urease de H, felis em células de E. coli.
Localização dos genes estruturais da urease de H. felis: A análise por "Western blot" dos extractos de células apresentando plLL205 indicou a presença de dois polipéptidos de aproximadamente 30 a 66 kDa que realizam reacção cruzada com antisoro H. felis policlonal de coelho (Figura 2A). Estas proteinas não foram produzidas por bactérias com o vector (pILL570). Já foi divulgado que a urease nativa de H. felis era composta por subunidades monoméricas repetidas com pesos moleculares calculados de 30 e 69 kDa (Turbett et al, 1992). Assim pensou-se que as proteínas de 30 e 66 kDa correspondiam, respectivamente, aos produtos genéticos uer A e ure B. De modo interessante, um extracto de células de E. 33 coli com o plasmídeo recombinante pILL763 (Cussac et al, 1992) contendo os genes ure A e ure B de Helicobacter pylori, expressava dois polipéptidos com pesos moleculares aproximados de 30 e 62 kDa que participavam em reacções cruzadas com o antisoro anti-H. felis (figura 2B).
Tabela 1. Mutagénese de clones de E. coli e efeito na actividade de urease.
Plasmídeos a Actividade de urease b (pmol ureia min^mg-1 de proteína) pILL205 1,2 ± 0,46c pILL205 :: a negd pILL205 :: b 0,74 ± 0,32 pILL205 :: c neg PILL205 :: d neg plLL205 :: e 0,54 ± 0,15 pILL205 :: f neg pILL205 :: g neg pILL205 :: h 1,05 ± 0,25 pILL205 :: i 0,93 ± 0,35 a As células de E. coli apresentavam plLL205 e os seus derivados construídos através e mutagénese por transposões. As letras correspondem aos locais de inserção no transposão-MiniTn3 em pILL205. b Actividades das bactérias crescidas aerobicamente durante 3 dias a 37°C e meio mínimo M9 sólido suplementado com 10 mM de L-arginina. Os valores representam as médias ± desvios padrão calculados a partir de três determinações. 0 A actividade de urease era aproximadamente um quinto 34 daquela da estirpe nativa de H. felis (ATCC 49179), ou seja 5,7 + 0,1 pmol ureia min^mg^1 de proteína (Ferrero e Lee, 1991) . d Não se detectou qualquer actividade (o limite de detecção foi < 1 nmol ureia min xmg 1 de proteína bacteriana).
Em todos menos um caso, os clones contendo os derivados de pILL205 mutados expressaram os produtos genéticos ure A e ure B (Figuras 2A, B) . Dado que vários dos mutantes (isto é, mutantes "c", "d", "f" e "g") sintetizavam as subunidades da urease mas no entanto não produziam um enzima activo, é possível especular que funções acessórias essenciais para a actividade da urease foram anuladas através da inserção de transposões. Pelo contrário, o mutante designado por pILL205::a não produziu o produto ure B e era urease-negativo. Assim, presumiu-se que o local de inserção do transposão estava inserido no gene ure B. A análise da sequência de ADN da região correspondente ao local de inserção "a" foi levada a cabo para elucidar potenciais grelhas de leitura aberta que codifiquem para os polipéptidos estruturais da urease de H. felis .
Análise da sequência de genes estruturais da urease de H. felis [0095] A sequenciação de uma região de 2,4 kb de ADN de H, felis adjacente ao local de inserção de transposão "a" resultou na identificação de duas grelhas de leitura aberta (ORFs) designadas ure A e ure B que são transcritas na mesma direcção (figura 3) . Confirmou-se que o transposão se localizava a 240 pb a montante do final de ure B. Ambas as 35 ORFs começavam com um codão de iniciação ATG e eram precedidas por um local similar à sequência de ligação a ribossoma de consenso de E. coli (Shine e Dalgarno, 1974). 0 espaço intergénico para os genes estruturais de H. felis consistiu em três codões que estavam em fase com as grelhas de leitura aberta adjacentes. Tal sugere que, tal como foi já observado ser o caso para Helicobacter pylori (Labigne et al, 1991), uma única mutação no codão de paragem do gene ure A teoreticamente resultaria num único poliéptido fundido.
Os genes ure A e ure B de H. felis codificam para polipéptidos com pesos moleculares calculados de, respectivamente, 26 074 Da e 61 663 Da, que são altamente homólogos ao nivel da sequência de aminoácidos com os produtos genéticos ure A e ure B de H. pylori. Os niveis de identidade entre os produtos genéticos ure A e ure B correspondentes das duas Helicobacter spp. foram calculados como sendo, respectivamente, 73,5 % e 88,2 %. Da informação da sequência de aminoácidos, os pesos moleculares previstos dos polipéptidos ure A e ure B de H, felis e H. pylori (Labigne et al, 1991) são muito semelhantes. No entanto, o produto ure B de H. felis apresentava uma mobilidade inferior do que o produto genético correspondente de Helicobacter pylori quando sujeito a electroforese em gel de poliacrilamia-SDS (figura 2B).
EXEMPLO DE REFERÊNCIA II II - EXPRESSÃO DAS PROTEÍNAS DAS SUBUNIDADES DA UREASE RECQMBINANTE DE H. PYLORI E H. FELIS: AVALIAÇÃO DESTAS PROTEÍNAS COMO POTENCIAIS IMUNOGÉNIOS DA MUCOSA NUM MODELO MURINO: 36
Os objectivos do estudo foram desenvolver antigénios recombinantes derivados das subunidades de urease de H. pylori e H. felis, e avaliar as eficácias de imunoprotecção destes antigénios num modelo ratinho/H. felis. Cada um dos genes estruturais que codificam para as respectivas unidades urease de H. pylori e H. felis foi independentemente clonado e sobre-expresso em Escherichia coli. Os antigénios de urease recombinantes resultantes (que foram fundidos com uma proteína de ligação à maltose de 42 kDa de E. coli) foram purificados em elevadas quantidades de culturas de E. coli e eram imunogénicos, mas no entanto enzimaticamente inactivos. Estes resultados demonstraram que é fazível desenvolver uma vacina recombinante contra a infecção por H. pylori. PROCEDIMENTOS EXPERIMENTAIS PARA A PARTE II:
Estirpes bacterianas e condições de crescimento:
Cresceu-se H. felis (ATCC 49179) em base de gelose de sangue no. 2 (Oxoid) suplementada com 10 % (v/v) de sangue de cavalo lisado (BioMerieux) e um suplemento de antibiótico que consiste em vancomicina (10 pg/mL), polimixina B (25 ng/mL), trimetoprim (5 pg/mL), e anfotericina B (2,5 pg/mL). As bactérias foram cultivadas em condições microaeróbicas a 37°C durante 2 dias, tal como descrito anteriormente. As estirpes de E. coli MC1061 e JM101, utilizadas nas experiências de clonagem e de expressão, foram crescidas rotineiramente a 37°C em meio de Luria, com ou sem adição de agar. Os antibióticos carbenicilina (100 pg/mL) e espectinomicina (100 pg/mL) foram adicionados sempre que necessário.
Manipulações e análise de ADN: 37
Todas as manipulações e análises de ADN, excepto se mencionado de outro modo, foram lavadas a cabo de acordo com procedimentos convencionais. As enzimas de restrição e de modificação foram adquiridos a Amersham (França). Os fragmentos de ADN a ser clonados foram electroeluidos dos geles de agarose e depois purificados por passagem em mini-colunas Elutip (Schleicher and Schull, Alemanha). A sequenciação de ADN de cadeia simples foi levada a cabo utilizando vectores bacteriófagos Ml3mpl8 e Ml3mpl9 (Pharmacia, França) . Moldes de ADN de cadeia simples foram preparados a partir do ADN recombinante do fago através de tratamento com polietileno glicol. A sequenciação dos moldes foi realizada de acordo com o método de terminação de cadeia por didesoxinucleótido utilizando um kit Sequanase (United States Biochemical Corp.).
Preparação de insertos para clonagem utilizando reacção em cadeia da polimerase (PCR):
De modo a se clonar os genes ureA de H, pylori e H. felis, iniciadores degenerados de 36 nucleótidos foram concebidos a partir de sequências de urease publicadas (Labigne et al., 1991; Ferrereo e Labigne, 1993) (conjunto de iniciadores #1; refira-se à tabela 2). 0 ADN purificado de clones de E. coli contendo plasmideos pILL763 e pILL207 (tabela 3), que codificavam os genes estruturais das ureases de H. pylori e H. felis, foi utilizado como material molde nas reacções de PCR. As amostras de reacção continham: 10 - 50 ng de ADN desnaturado; tampão para PCR (50 mmol/L KC1 em 10 mmol/L Tris-HCl [pH 8,3]); dATP, dGTP, dCTP e dTTP (cada um numa concentração final de 1,26 mmol/L); 2,5 mmol7L MgCl2; 25 pmol de cada iniciador e 0,5 pL de Tag polimerase. As amostras 38 foram sujeitas a 30 ciclos do seguinte programa: 2 min a 94°C, 1 min a 40°C.
Os produtos de amplificação foram clonados em extremidades coesivas do vector pAMP (figura 1) de acordo com o protocolo descrito pelo fabricante ("CloneAmp System", Gibco BRL; Cergy Pontoise, França). Resumidamente, 60 ng de produto de amplificação foram directamente misturados num tampão (consistindo em 50 mmol/L KC1, 1,5 mmol/L MgCl2, 0,1 % (p/vol) gelatina em 10 mmol/L Tris-HCl, pH 8,3) com 50 ng do ADN do vector pAMP 1 e 1 unidade de uracilo ADN glicosilase. A ligação foi levada a cabo durante 30 min a 37°C. Transformaram-se células competentes de E, coli MC1061 (200 pL) com 20 pL da mistura de ligação. Os insertos foram subsequentemente excisados do "polylinker" do vector pAMP através de uma digestão dupla com BamHl e Pstl, e depois sub-clonados no vector de expressão pMAL (New England Biolabs Inc, Beverly, EUA) escolhido para a produção de antigénios recombinantes (respectivamente, plLL919 e plLL920, figura 13), assim como no bacteriófago Ml3mp para sequenciação. A amplificação de um produto contendo o gene ureB de H. pylori foi obtido por PCR utilizando um par de iniciadores com 35 nucleótidos (conjunto #2, tabela 2). As misturas de reacção de PCR foram primeiramente desnaturadas durante 3 min a 94°C, e depois submetidas a 30 ciclos do seguinte programa: 1 min a 94°C, 1 min a 55°C e 2min a 72°C. O produto de amplificação purificado (1850 pb) foi digerido com EcoRI e Pstl e depois clonado em pMAL (plLL927, figura 2). Células competentes de E. coli MC1061 foram transformadas com a reacção de ligação. 39
Clonou-se ureB de H. felis através de um procedimento de dois passos, que permitiu a produção de ambas as versões completa e truncada da subunidade UreB. 0 plasmídeo plLL213 (tabela 3) foi digerido com as enzimas Dral, correspondendo ao resíduo aminoácido número 219 da subunidade UreB e HindIII. 0 fragmento resultante de 1350 pb foi purificado e clonado em pMAL que tinha sido digerido com Xmnl e HindIII (pILL219, figura 2). De modo a produzir um clone capaz de sintetizar uma proteína UreB completa, desenvolveram-se iniciadores de PCR (conjunto #3, tabela 2) que amplificaram um fragmento de 685 pb da porção na extremidade N do gene ureB (excluindo o codão ATG), que também apresentava sobreposição relativamente ao início do inserto no plasmídeo pILL219. O material amplificado por PCR foi purificado e digerido com bamHI e HindIII, e depois clonado empMAL (pILL221, figura 14) . Um fragmento PstI-PstI de 1350 pb que codifica para a porção restante do produto genético UreB foi subsequentemente excisado de pILL219 e clonado numa preparação linearizada de pILL221 (pILL222, figura 14).
Expressão de polipéptidos urease recombinantes no vector pMAL: A expressão do vector pMAL está sob o controlo de um promotor induzível (Piac) e contém uma grelha de leitura aberta (ORF) que codifica para a produção de MalE (Proteína de ligação à maltose, MBP) . As sequências clonadas em fase com esta ORF resultaram na síntese de proteínas de fusão com MBP que eram facilmente purificadas numa resina de amilose. Das duas versões de pMAL que estão comercialmente disponíveis, a versão que não codifica para uma sequência sinal (ou seja, 40 pMAL-c2) sintetizou quantidades superiores de proteínas recombinantes e foi assim utilizada no que se segue.
Os clones de E. coli contendo os plasmídeos recombinantes foram submetidos a rastreio relativamente à produção de proteínas de fusão, antes de se levarem a cabo experiências de purificação em larga escala.
Purificação dos polipéptidos urease recombinantes:
Volumes de 500 mL de meio Luria fresco, contendo carbenicilina (100 pg/mL) e 2% (p/vol) de glucose, foram inoculados com culturas de uma noite (5 mL) de clones de E. coli. As culturas foram incubadas a 37°C e agitadas a 250 rpm, até A6oo = 0,5. Antes de se adicionar 1 mmol/L (concentração final) de isopropil-p-D-tiogalactopiranósido (IPTG) às culturas, foi recolhida uma amostra de 1,0 mL (células não induzidas). As culturas foram incubadas durante mais 4 h altura em que se recolheu outra amostra de 1,0 mL (células induzidas). As amostras das células induzidas e não induzidas foram mais tarde analisadas por SDS-PAGE.
As culturas induzidas por IPTG foram centrifugadas a 7000 rpm durante 20 min, a 4°C e o sobrenadante foi removido. Os sedimentos foram ressuspendidos em 50 mL de tampão de coluna (200 mmol/L NaCl, 1 mmol/L EDTA em 10 mmol/L Tris-HCl, pH 7,4), contendo os seguintes inibidores de protease (fornecidos pela Boehringer, Mannheim, Alemanha): 2 pmol/L de leupeptina, 2 pmol/L de pepstatina e 1 mmol/L de fluoreto de fenilmetilsulfonilo (PMSF). As células intactas foram lisadas através de uma passagem por uma prensa francesa (16000 lb/in2). Os detritos celulares foram removidos por 41 centrifugação e os lisados foram diluídos num tampão de coluna para resultar na concentração final de proteína de 2,5 mg de proteína/mL, antes da cromatografia numa coluna de resina amilose de 2,6 cm x 20 cm (New England Biolabs) . A resina foi lavada com um tampão de coluna a 0,5 mL/min até gue A28o estabilize. As proteínas recombinantes de fusão com MBP foram eluídas da coluna por lavagem com tampão de coluna contendo 10 mmol/L de 1-maltose.
As fracções contendo as proteínas recombinantes foram recolhidas e depois dializadas várias vezes a 4°C contra um tampão de baixa concentração salina (contendo 25 mmol/L de NaCl em 20 mmol/L de Tris-HCl, pH 8,0). A fracções recolhidas foram então carregadas a um caudal de 0,5 mL/min numa coluna de permuta aniónica de 1,6 x 10 com (HP-Sepharose, Pharmacia, Suécia) ligada a um sistema cromatográfico Hi-Load (Pharmacia). As proteínas foram eluídas da coluna utilizando um gradiente de sal (25 mmol/L a 500 mmol/L NaCl) . As fracções apresentando elevados níveis de A28o foram exaustivamente dializadas contra água destilada a 4°C e analisadas por SDS-PAGE.
Antisoro de coelho:
Preparou-se antisoro policlonal de coelho contra extractos celulares totais da estirpe 85P de H. pylori (Labigne et al., 1991) e H. felis (ATCC49179). O antisoro policlonal de coelho contra preparações de proteína recombinante de subunidades da urease de H. pylori e H. felis foi produzido através da imunização dos coelhos com 100 pg de proteínas recombinantes em adjuvante de Freund completo (Sigma). Quatro semanas mais tarde, os coelhos receberam um reforço de imunização com 100 42 pg de proteína no adjuvante de Freund incompleto. À semana 6, os animais foram sangrados terminalmente e o soro foi conservado a -20°C.
Análises de proteínas por SDS-PAGE e "Western blotting":
Extractos celulares solubilizados foram analisados em geles rectangulares, compreendendo um gel de concentração com 4,5 % de acrilamida e um gel de resolução com 10 %, de acordo com o procedimento de Laemmli. A electroforese foi levada a cabo a 200V num dispositivo para mini-geles (Bio-Rad, EUA).
As proteínas foram transferidas para papel de nitrocelulose numa célula de transferência Mini Trans-Blot (BioRad) ajustada para 100 V durante 1 h, com arrefecimento. As membranas de nitrocelulose foram bloqueadas com caseína purificada a 5 % (p/v) (BDH, Reino Unido) em tampão fosfato salino (PBS, pH 7,4) com agitação suave à temperatura ambiente, durante 2 h. Fez-se reagir as membranas a 4°C durante a noite com antisoro diluído em 1 % de caseína (p/v) preparada em PBS. Os imunorreagentes foram detectados utilizando anticorpos secundários biotinilados específicos e conjugado avidina-peroxidase (Kilkegaard and Parry Lab., Gaithersburg, EUA). Os produtos de reacção foram visualizados num filme autoradiográfico (Hyperfilm, Amersham, França) utilizando uma técnica quimioluminescente (sistema ECL, Amersham).
As concentrações das proteínas foram determinadas através do teste de Bradford (Sigma Chemicals Corp., St. Louis, EUA).
Experimentação Animal: 43
Seis ratinhos Swiss "Specific Pathogen-Free" fêmea de seis semanas de idade foram obtidos (Centre d'Elevage R. Janvier, LeGenest-St-lsle, França) e mantidos com uma dieta de ração comercial com água ad libitum. Fez-se o rastreio dos intestinos dos animais para a ausência de Helicobacter muridarum. Para todas as administrações orogástricas, foram administradas alíquotas de 100 pL aos ratinhos, utilizando seringas descartáveis de 1,0 mL, aos quais estavam ligados cateteres de polietileno (Biotrol, Paris, França).
Preparação de extractos sonicados e inóculos de culturas de H. felis:
As bactérias H. felis foram recolhidas em PBS e centrifugadas a 5000 rpm, durante 10 min numa centrífuga Sorvall RC-5 (Sorvall, EUA) a 4°C. Os sedimentos foram lavados por duas vezes e ressuspendidos em PBS. As suspensões bacterianas foram sonicadas como descrito anteriormente e foram sujeitas a pelo menos um ciclo de congelação-descongelação. Levaram-se a cabo determinações das proteínas nos sonicados.
Para assegurar uma cultura virulenta de H. felis para estudos de protecção, as bactérias H. felis foram mantidas in vivo até necessário. Resumidamente, os ratinhos foram inoculados três vezes (com 1010 bactérias/mL), ao longo de um período de 5 dias. As bactérias foram re-isoldadas de biopsias de estômago em meio de gelose de sangue (4-7 dias de incubação numa atmosfera microaeróbica a 37°C). As bactérias crescidas durante dois dias em placas de gelose de sangue foram recolhidas directamente em água de peptona (Difco, EUA). A viabilidade e a mobilidade bacteriana foram determinadas por microscopia de fase antes da administração aos animais. 44
Estudos de protecgão dos ratinhos:
Cinquenta pg de antigénio recombinante e 10 pg de holotoxina de cólera (Sigma Chemical Corp.), ambos ressuspendidos em HC03, foram administrados orogastricamente a ratinhos nas semanas 0, 1, 2 e 3. Também se forneceu 10 pg de toxina de cólera a ratinhos imunizados com extractos sonicados de H. felis (contendo 400 - 800 pg de proteína total). Na semana 5, metade dos ratinhos de cada grupo foram testados com um inoculo de H. felis virulento. Os restantes ratinhos receberam um "reforço" de imunização adicional na semana 15. Na semana 17 estes foram testados com uma cultura de fL_ felis .
Avaliação da colonização do ratinho por H. felis:
Duas semanas após receber a dose de teste (ou seja, respectivamente semanas 7 e 19) os ratinhos foram sacrificados por deslocamento da espinha. Os estômagos foram lavados duas vezes com solução estéril de NaCl a 0,8% e uma porção do antro gástrico de cada estômago foi colocada sobre as superfícies de placas de agar 12 cm x 12 cm contendo um meio indicador de ureia (2% ureia, 120 mg Na2HP04, 80 mg KH2P04, 1,2 mg de vermelho de fenol, 1,5 g de agar preparado em 100 mL) . O restante de cada estômago foi colocado em formal-solução salina e armazenado até processado para histologia. Cortaram-se secções longitudinais (4 pm) dos estômagos e foram coradas rotineiramente pela técnica Giemsa. Quando necessário, as secções foram adicionalmente coradas pelas técnicas de coloração pela Hematoxilina-Eosina e pela coloração de prata de Warthin-Starry. 45 A presença de bactérias H. felis na mucosa gástrica dos ratinhos foi avaliada através da detecção da actividade de urease (até cerca de 24 h) no meio indicador, assim como pelo rastreio das secções gástricas coradas com coloração de Giesma que foram codificadas de modo a eliminar a influência do observador. Os números de bactérias nas secções gástricas foram classificados semi-quantitativamente de acordo com o seguinte esquema: 0, nenhuma bactéria observada através das secções; 1, poucas bactérias (< 20) observadas no total; 2, campos de grande ampliação (G.A.) ocasionais com números de bactérias baixos (<20); 3, campos G.A. ocasionais com números de bactérias baixos a moderados (<50); e 4, numerosos campos G.A, (>5) com elevados números de bactérias (> 50). Os infiltrados de células mononucleares foram classificados como se segue: 0, infiltração não significativa; 1, infiltração de baixos números de células mononucleares limitadas à submucosa e à mucosa muscular; 2, infiltração de números moderados de células mononucleares para a submucosa e a mucosa muscular, por vezes formando agregados soltos; e 3, infiltração de elevados números de células mononucleares e apresentando aglomerações de células nodulares.
RESULTADO DAS EXPERIÊNCIAS DA PARTE II
Expressão de polipéptidos urease de Helicobacter em E. coli:
Fragmentos contendo as sequências que codificam para os respectivos produtos genéticos UreA de H. felis e H. pylori foram amplificados por PCR e clonados em fase com uma ORF que codifica para uma mbp de 42 k:Da, presente no vector de expressão pmAL. A sequenciação dos produtos de PCR revelou alterações nucleotidicas menores que, no entanto, não 46 alteraram as sequências de aminoácidos dos respectivos produtos genéticos. As células de E. coli MC1061 transformadas com estes plasmídeos recombinantes (respectivamente, pILL919 e pILL920) expressavam proteínas de fusão com pesos moleculares previstos de aproximadamente 68 kDa. Após cromatografia num meio de gel de cromatografia de afinidade (resina de amilose) e permuta aniónica (Q-Sepharose), estas proteínas foram purificadas até elevados graus de pureza (figura 1) . 0 rendimento de culturas de 2 L de células de E. coli recombinantes foi de aproximadamente 40 mg de antigénio purificado.
Do mesmo modo, as grandes subunidades UreB das ureases de H. pylori e H. felis foram expressas em E. coli (respectivamente, plasmídeos pILL927 e pILL222) e produziram proteínas de fusão com pesos moleculares previstos de 103 kDa. O rendimento nestes casos foi significativamente inferior para as preparações UreA (recuperou-se aproximadamente 20 mg da cultura bacteriana de 2 L) . Além disso, encontraram-se problemas associados com a clivagem dos polipéptidos UreB da porção MBP das proteínas de fusão. Estas dificuldades foram atribuídas às elevadas dimensões dos polipéptidos recombinantes UreB.
Análise dos polipéptidos urease recombinantes:
As análises por "Western blot" das preparações do antigénio com antisoro policlonal de coelho produzido contra extractos inteiros de bactérias H. pylori e H. felis demonstraram que os antigénios retinham imunogenicidade aos antisoros homólogo e heterólogo (figuras 14 e 15). O antisoro não reconheceu o componente MBP isolado. A reactividade cruzada entre os 47 polipéptidos urease de H. pylori e de H. felis foi consistente com os elevados graus de identidade entre as sequências de aminoácidos destas proteínas.
Os antisoros policlonais de coelho produzidos contra proteínas recombinantes purificadas UreA e UreB preparadas a partir de H. pylori e H. felis reagiram fortemente com polipéptidos de urease presentes nos extractos de células inteiras das bactérias (figura 16). Como já se tinha observado, a subunidade UreB da urease de H. felis migrou ligeiramente mais para cima nos geles de SDS-PAGE do que aquela de H. pylori (figura 16).
Preparação de inóculos de H. felis utilizados nos estudos de imunoprotecção:
De modo a assegurar a virulência dos inóculos bacterianos de H. felis, as bactérias foram re-isoladas de estômagos de ratinhos infectados com H. felis (ver Materiais e Métodos).
As bactérias foram passadas um número mínimo de vezes in vitro. Foram usadas culturas de armazenagem destas bactérias, armazenadas a -80°C, para preparar inóculos frescos para outros estudos de protecção de ratinhos. Este procedimento assegurou que o inoculo usado em experiências sucessivas é reprodutível.
Imunização de ratinhos contra infecção gástrica por H. felis:
Os ratinhos que foram imunizados durante três semanas com as referidas preparações de antigénios foram divididos em dois lotes e metade destes foram testados duas semanas depois com um inoculo de H, felis contendo 107 bactérias/mL. Um grupo de 48 animais que tinha sido imunizado com UreA recombinante de H. f elis foi também testado, mas, contrariamente aos outros animais, não foram sacrificados até à semana 19. a) Protecgão à semana 5:
Oitenta e cinco % das amostras de biopsia de estômago do grupo controlo de ratinhos imunizados com preparações sonicadas de H. felis eram urease-negativas pelo que parece terem sido protegidas da infecção por H. felis (tabela 4) . Este valor compara com os 20% daqueles do outro grupo controlo de animais aos quais apenas se administrou MBP. A proporção dos estômagos urease-negativos para os grupos de ratinhos aos quais se administraram subunidades de urease recombinante variou de 70% (para UreB de H. pylori) a 20% (para UreA de H. pylori).
Os niveis de colonização bacteriana por H. felis foram também avaliados a partir de lâminas histológicas codificadas preparadas a partir de tecido gástrico. Devido à surpreendente morfologia das bactérias H. felis, os organismos puderam ser facilmente identificados nas superfícies das mucosas tanto da boca gástrica como das regiões glandulares do estômago. Evidências histológicas indicaram que os niveis de protecção em ratinhos foram inferiores àqueles observados pelo teste de urease em biopsia: 25% e 20% do tecido gástrico de ratinhos imunizados, respectivamente, por preparações de sonicado de H. felis e UreB de H. pylori, estavam livres de bactérias H. felis.
Entre certos grupos destes ratinhos a preponderância de biopsias urease-negativas, assim como as classificações 49 histológicas mais baixas relativamente à colonização bacteriana (dados não publicados), sugeriu que se tinha provocado uma resposta imunoprotectora. No entanto, esta resposta pode ter sido insuficiente para proteger contra o inoculo administrado durante o procedimento de teste. b) Protecção na semana 17:
Os restantes ratinhos, de cada grupo de animais, levou um reforço na semana 15. Estes ratinhos foram testados à semana 17 com um inoculo de H. felis contendo aproximadamente 100 vezes menos bactérias do que a quantidade anteriormente utilizada. Duas semanas mais tarde, todas as biopsias de estômago dos ratinhos imunizados por MBP eram urease-positivos (tabela 4) . Pelo contrário, a actividade de urease para as biopsias gástricas de ratinhos imunizados com as subunidades de urease recombinante variaram de 50% para UreA de H. pylori até 100% para UreB de H. felis. Este último é comparável com o nível de protecção observado para o grupo de animais imunizados com extractos sonicados de H. felis. Evidências histológicas mostram que as subunidades UreB de H. felis e H. pylori protegeram, respectivamente, 60% e 25% dos animais imunizados. Tal compara com um nível de 85% de protecção para os ratinhos imunizados com extractos sonicados de H. felis. A imunização de ratinhos com UreA recombinante de H. pylori não protegeu os animais. Do mesmo modo, os estômagos de todos os ratinhos imunizados com UreA de H. felis, que tinham sido testados na semana 5, estavam profusamente colonizados com bactérias H. felis na semana 19 (tabela 4) . 50 0 teste da urease em biopsia gástrica, quando comparado com a análise histológica de tecidos gástricos, forneceu valores de sensibilidade e de especificidade, respectivamente, de 63% e 95%. Assim, a histologia provou ser um modo de previsão mais preciso da infecção de H. felis em ratinho.
Resposta imunitária celular em estômagos imunizados:
Além da avaliação histológica da colonização de H, felis, o tecido gástrico dos ratinhos foi também classificado (de 0 a 3) para a presença de resposta de células mononucleares. Em ratinhos imunizados apenas com MPB, observou-se uma gastrite ligeira crónica com baios números de células mononucleares restritas à mucosa muscular e à submucosa do epitélio gástrico. Pelo contrário, verificaram-se elevados números de células mononucleares presentes nas mucosas gástricas em animais imunizados ou com os polipéptidos de urease recombinantes, ou comas preparações de sonicados de H. felis. Estas células inflamatórias coalesciam de modo a formar ou agregados soltos, nas regiões submucosais do tecido, ou estruturas nodulares que estendiam para as regiões mucosais do epitélio gástrico. A resposta das células mononucleares não pareceu estar relacionada com a presença de bactérias dado que a mucosa gástrica dos ratinhos imunizados com a UreA de H. felis, que estavam profusamente colonizados com bactérias H. felis, continham poucas ou nenhumas células mononucleares.
Tabela 2. Iniciadores oligoméricos utilizados na amplificação por PCR das sequências nucleotídicas que codificam para urease. 51
Conjunto de iniciadores Sequência de nucleótidos (5' -> 3') # 1 directo ...CAU CCT* AAAg GAAg TcTA* gatc aaag tcta* atg reverso TcTC CtTT a*cg a*CG A*GcAT Ag,tAT CtTT CtTT cat cua... # 2 directo CC GGA GAA TTC ATT AGC AGA ΑΑΑ GAA TAT GTT TCT ATG EcoRI* reverso AC GTT CTG CAG CTT ACG AAT AAC TTT TGT TGC TTG AGC Pst I* # 3 directo GGA TCC AAA AAG ATTTCA CG BamHI¥ reverso GGA AGC TT C TGC AGG TGT GCT TCC CCA GTC fíindIII¥ PstI¥ * Nucleótidos degenerados nos quais todas as permutas possíveis do código genético foram incluídas (A, T, G, C) . G, C, T Os nucleótidos dados foram degenerados com a(s) base(s) especifica(s) ilustrada(s). ¥ Locais de restrição introduzidos nos fragmentos amplificados.
Tabela 3. Plasmídeos utilizados Plasmídeo Vector Fenótipo ou caracteristica relevante Referência pILL763 pILL570 fragmento de 9,5 kb (digesto parcial por Sau3a do cromossoma de H. pylori) Cussac et al., 1991 PILL199 pILL575 fragmento de 35 kb (digesto parcial por Sau3a do cromossoma de H. felis) Ferrero & Labigne, '93 pILL207 pILL570 fragmento de 11 kb (digesto parcial por Sau3a de pILL199) Este estudo pILL919 pMAL-C2 inserto BamHI-PstIa de 0,8 kb contendo um fragmento nucleotídico que codifica para o gene ureA de H. felis Este estudo 52 PILL920 PILL927 PILL213 PILL219 PILL221 pILL222 (ApR) pMAL-C2 inserto BamRI-PstIa de 0,8 kb contendo um produto de PCR que codifica para o gene ureA de H. pylori pMAL-C2 fragmento de PCR £coRI-PstIa de 1,8 kb que codifica para o gene ureB de H. pylori pMAL-C2 Fragmento de 2 kb resultante do digesto parcial de Sau3A de pILL207 (ApR) PMAL-C2 inserto Dral-Hindlllb de 1,4 kb contendo ureB de H. felis (bases 657 - 1707) pMAL-C2 fragmento de PCR PamHI-Pstl de 0,7 kb que codifica para ureB de H. felis (bases 4 -667) pMAL-C2 fragmento Pstl-Pstlc de 1,35 kb que codifica para ureB de H. felis (bases 667 - 1707) de pILL219 clonado em pILL221 linearizado
Este estudo
Este estudo
Este estudo
Este estudo
Este estudo
Este estudo
Tabela 4. Protecção dos ratinhos por imunização com proteínas urease recombinantes.
Antigénio Protecção (%) a Urease Histologia MBP 0 % (0/10) 0 % (0/10) UreA de H. pylori 50 (4/8) 0 (0/10) UreA de H. felis b 12, 5 (1/8) 0 (0/10) UreB de H. pylori 65 (5/8) 25 (2/8) UreB de H. felis 100 (7/7) 60 (5/7) 53
Sonicado de H. felis 100 (8/8) 85 7/8) a A dose do inoculo para o bactérias/ratinho teste foi “dê Γ03" b Os ratinhos foram testados na semana 5 (com 107 bactérias) e foram sacrificados na semana 19
EXEMPLO I III- GRUPO DE GENES DE CHOQUE TÉRMICO hspA-B DE HELICOBACTER PYLORI: SEQUÊNCIA NUCLEOTÍDICA, EXPRESSÃO E FUNÇÃO:
Foi recentemente purificado de células de H. pylori um homólogo das proteínas de choque térmico (HSPs) da classe GroEL, registadas como tendo uma associação próxima com a urease de Helicobacter pylori (um metaloenzima de níquel), por Dunn et al, e Evans et al. (respectivamente Infectimmun. 60: 1946, 1992, 1946 e 2125). Com base na sequência de aminoácidos da extremidade N desta proteína imunodominante, foram sintetizados oligonucleótidos degenerados de modo a dirigir o gene alço (hspB) que codifica para a proteína do tipo GroEL no cromossoma da estirpe 85P de H. pylori. Após a amplificação genética, um fragmento de 108 pares de bases (pb) que codifica para os 36 primeiros aminoácidos da proteína HspB foi purificado, e utilizado como uma sonda para identificar o banco genómico de H. pylori um cosmídeo contendo a totalidade do gene que codifica para HspB. O gene hspB foi mapeado num fragmento de restrição BglII de 3,15 quilobases (kb) do cosmídeo plLL684. A sequência nucleotídica daquele fragmento subclonado no vector plasmídico pILL570 (pILL689) revelou a presença de duas grelhas de leitura abertas (ORFs) designadas hspA e hspB, cuja organização era muito similar aos operões bicistrónicos groESL de outras 54 espécies bacterianas. hspA e hspB codificam para polipéptidos, respectivamente, de 118 e 545 aminoácidos, correspondendo às massas moleculares calculadas de, respectivamente, 13,0 e 58,2 quilodaltons (kDa). Estudos de comparação de sequência de aminoácidos revelaram i) que as proteínas HspA e HspB de H. pylori eram bastante similares às dos seus homólogos bacterianos; ii) que a proteína HspA de H. pylori apresenta um padrão surpreendente na extremidade carboxilo que outras bactérias homólogas GroES não possuem; este padrão único consiste numa série e oito resíduos histidina parecidos com um domínio de ligação a metal, tal como ligação a níquel. Surpreendentemente, imediatamente a montante do grupo de genes encontrou-se um elemento de inserção IS5 que estava ausente no genoma de H. pylori e foi seleccionado positivamente durante o processo de clonagem dos cosmídeos. Verificou-se que o IS5 estava envolvido na expressão dos genes hspA e hspB em pILL689. A expressão das proteínas HspA e HspB do plasmídeo pILL689 foi analisada numa estirpe produtora de mini-células. Verificou-se que ambos os polipéptidos eram expressos constitutivamente nas células de E. coli. Quando o plasmídeo recombinante pILL.689 foi introduzido em conjunto com um grupo de genes da urease de H. pylori numa célula hospedeira de E. coli, observou-se um aumento da actividade de urease, sugerindo uma interacção próxima entre as proteínas de choque térmico e a enzima urease. O conceito de suporte de uma função específica para a chaperona HspA, foi o facto de que enquanto se encontrou uma única cópia de hspB no genoma de H. pylori, encontraram-se duas cópias de hspA no genoma, uma ligada ao gene hspB e outra desligada do gene hspB. Tentativas de construir mutantes isogénicos de h. pylori no gene hspA e hspB não 55 tiveram sucesso sugerindo que estes genes são essenciais para a sobrevivência da bactéria. PROCEDIMENTOS EXPERIMENTAIS PARA A PARTE III:
Estirpes bacterianas, plasmídeos, e condições de cultura:
As experiências de clonagem foram levadas a cabo com ADN genómico preparado a partir da estirpe 85P de H. pylori. A estirpe N6 de H. pylori foi utilizada como estirpe receptora para as experiências de electroporação devido à sua facilidade de transformação. A estirpe HB101 ou a estirpe MC1061 de E. coli foram utilizadas como hospedeiro para, respectivamente, as experiências de clonagem do cosmideo e de subclonagem. A E. coli P678-54 foi utilizada para preparação de mini-células. Os vectores e plasmídeos recombinantes utilizados neste estudo estão listados na Tabela 1. As estirpes de H. pylori foram crescidas em placas de gelose de sangue de cavalo, suplementadas com vancomicina (10 mg/L), polimixina B (2500 U/L), trimetoprim (5 mg/L), e anfotericina B (4 mg/L). As placas foram incubadas a 37çC sob condições microaeróbicas num recipiente anaeróbico com um invólucro gerador de dióxido de carbono (BBL 70304). As estirpes de E. coli foram crescidas em meio Luria sem glucose (10 g de triptona, 5 g de extracto de levedura, e 5 g de NaCl por litro; pH 7,0) ou em placas de agar de meio Luria (1,5 % de agar) a 37°C. Para a medição da actividade de urease, o meio limitante em azoto utilizado consistiu num agar de meio mínimo M9 sem amónia (pH 7,4) contendo 0,4 % D-glucose como fonte de carbono, e L-arginina preparada de fresco e esterilizada com filtro adicionada até perfazer a concentração final de 10 mM. As concentrações de antibiótico 56 para a selecção dos clones recombinantes foram as seguintes (em miligramas por litro) : canamicina, 20; espectinomicina, 100; carbenicilina, 100.
Preparação do ADN: O ADN genómico de H. pylori foi preparado como descrito anteriormente. Os ADNs de cosmideo e de plasmideo foram preparados através de um procedimento de lise alcalina seguido de purificação em gradientes de cloreto de césio-brometo de etídio tal como descrito anteriormente.
Clonagem do cosmideo: A construção do banco genómico de cosmideo de H. pylori 85P em HB101, que foi utilizado para a clonagem do grupo de genes hspA-B de H. pylori foi descrita anteriormente.
Análise de ADN e metodologia de clonagem:
As endonucleases de restrição, ADN ligase de T4, grande fragmento (de Klenow) da ADN polimerase I, e a Taq polimerase foram compradas à Amersham, a ADN polimerase de T4 à Biolabs, e a fosfatase intestinal de vitelo à Pharmacia. Todas as enzimas foram utilizadas de acordo com as instruções dos fabricantes. Os fragmentos de ADN foram separados em geles de agarose corridos em tampão Tris-Acetato. A escala de 1-kb de Bethesda Research Laboratories foi utilizada como padrão da dimensão dos fragmentos. Quando necessário, os fragmentos de ADN foram isolados por electroeluição de geles de agarose tal como descrito anteriormente e recuperados do tampão de migração por intermédio de uma minicoluna Elutip-d 57 (Schleicher e Schuell, Dassel, Alemanha) . As manipulações básicas de ADN foram levadas a cabo de acordo com protocolos descritos por Sambrook et al.
Hibridação:
Prepararam-se "blots" de colónias, para o rastreio do banco genómico de cosmídeos de H. pylori e para a identificação de subclones, em membranas de nitrocelulose (Schleicher e Schuell, Dassel, Alemanha) de acordo com o protocolo de Sambrook et al. (43). A marcação radioactiva dos produtos de PCR foi levada a cabo por iniciação aleatória, utilizando como iniciadores hexâmeros aleatórios da Pharmacia. As hibridações das colónias foram levadas a cabo sob condições de elevada restringência (5 x SSC. 0,1 % SDS, 50 % formamida, 42°C) (1 x SSC : 150 mM NaCl, 15 mM citrato de sódio, pH 7,0). Para as hibridações de "Southern blot", os fragmentos de ADN foram transferidos dos geles de agarose para folhas de nitrocelulose (diâmetro de poro de 0,45 pm; Schleicher & Schell, Inc.), e hibridados sob condições de baixa restringência (5 x SSC, 0,1 % SDS, 30 ou 40 % formamida, a 42°C com sondas de desoxirribonucleótidos marcadas com 32P) . A hibridação foi revelada por autoradiografia utilizando Hyperfilm-MP da Amersham.
Sequenciação de ADN:
Fragmentos de ADN plasmidico foram subclonados em vectores ml3mp 18/19. O ADN de cadeia simples foi preparado por infecção fágica da estirpe de E. coli JM101. A sequenciação foi realizada através do método de terminação da cadeia de didesoxinucleótido utilizando o kit Sequanase da United 58
States Biochemicals. Tanto o iniciador universal Ml 3 como iniciadores adicionais específicos (Fig. 1) foram usados para sequenciar tanto as cadeias de adn codificante como não codificante. A sequenciação do ADN de cadeia dupla foi realizada tal como descrito anteriormente. A sequenciação directa do produto de PCR foi levada a cabo após purificação do produto de PCR amplificado, electroeluído através de uma mini-coluna Elutip-d (Schleicher & Schuell); 0 protocolo clássico para a sequenciação utilizando o kit Sequanase foi então utilizado com as seguintes modificações: o produto de PCR foi desnaturado fervendo a mistura de emparelhamento contendo 200 picomoles do oligonucleótido utilizado como iniciador e DMSO à concentração final de 1 % durante 3 minutos; a mistura foi então imediatamente arrefecida em gelo; o passo de marcação foi levado a cabo na presença de iões manganês (Mn).
Electroporagão de H. pylori:
Na tentativa de construir mutantes de H. pylori, as construções plasmídicas apropriadas contendo o gene alvo interrompido por uma cassete contendo um gene de resistência à canamicina (aph3'-lll), foram transformadas na estirpe N6 de H. pylori por intermédio de electroporação tal como previamente descrito. O plasmídeo pSUSIO com o gene flaA interrompido por canamicina foi utilizado como controlo positivo da electroporação. Após a electroporação, as bactérias foram crescidas em placas não-selectivas durante um período de 48 h de modo a permitir a expressão da resistência ao antibiótico e depois transferidas para placas contendo canamicina. As placas selectivas foram incubadas durante até 6 dias. 59
Reacção em cadeia da polimerase (PCR):
As reacções de PCR foram realizadas utilizando um termociclador Perkin-Elmer Cetus utilizando o kit GeneAmp (Perkin-Elmer Cetus). A reacção de amplificação clássica envolveu 50 picomoles (pmoles) de cada iniciador e pelo menos 5 pmols do ADN alvo. O ADN alvo foi desnaturado pelo calor antes da adição à reacção de amplificação. A reacção consistiu de 25 ciclos dos seguintes três passos: desnaturação (94°C durante 1 minuto), emparelhamento (a temperaturas na gama de entre 42 e 55°C, dependendo das temperaturas de fusão calculadas para os iniciadores, durante 2 min), e extensão (72°C durante 2 min). Quando são utilizados oligonucleótidos degenerados em condições não restringentes, adicionou-se até 1000 pmoles de cada oligonucleótido, levaram-se a cabo 50 ciclos, e o emparelhamento foi levado a cabo a 42°C.
Análise de proteínas expressas em mini-células:
Mini-células contendo o plasmídeo híbrido apropriado foram isoladas e marcadas com [35S] metionina (50 pCi/mL). Aproximadamente 100000 cpm de material passivel de precipitação com acetona foi sujeito a electroforese em gel de dodecil sulfato de sódio (SDS)-poliacrilamida num gel a 12,5 %. Correram-se em paralelo proteínas com pesos moleculares na gama de 94000 a 14000 (kit de baixos pesos moleculares da Bio-Rad Laboratories) . O gel foi corado e examinado por fluorografia, utilizando En3Hance (New England Nuclear).
Actividade da urease: 60 A actividade da urease foi quantificada pela reacção de Berthelot utilizando uma modificação do procedimento que já foi descrito. A actividade de urease foi expressa como micromoles de ureia hidrolisada por minuto por miligrama de proteína bacteriana.
RESULTADOS DAS EXPERIÊNCIAS DA PARTE III
Identificação de um cosmídeo recombinante contendo o gene que codifica para a proteína de choque térmico do tipo GroEL de Helicobacter pylori:
Com base na sequência de aminoácidos da extremidade N da proteína de choque térmico de H. pylori, foram sintetizados dois oligonucleótidos degenerados para detectar o gene de interesse no cromossoma da estirpe 85P de H. pylori. 0 primeiro 5' -GCNAARGARATHAARTTYTCNG-3' em que N se refere aos quatro nucleótidos, R = A e G, Y = T e C, Η = T, C e A, é derivado dos primeiros 8 aminoácidos da proteína (AKEIKFSD); o segundo 5' -CRTTNCKNCCN CKNGGNCCCAT- 3', em que K = G e T, corresponde aos codões complementares que especificam o aminoácido da posição 29 à posição 36 (MGPRGRNV, ref). 0 comprimento esperado para o produto de PCR era 108 pares de bases (pb) . A reacção de amplificação foi levada a cabo sob condições de baixa restringência tal como descrito na secção de "Materiais e Métodos", e conduziu à síntese de seis fragmentos com comprimentos na gama de 400 pb a 100 pb. Os três fragmentos mais pequenos foram electroeluídos de um gel de acrilamida, e purificados. A sequenciação directa dos produtos de PCR permitiu a identificação de um fragmento de ADN que codifica para uma sequência de aminoácidos correspondente à sequência 61 publicada. Este fragmento foi deste modo marcado e utilizado como sonda na hibridação de colónias para identificar cosmídeos recombinantes que exibem homologia a um segmento 5' do gene que codifica para uma proteína do tipo GroEL de H. pylori; este gene foi designado hspB. 0 banco genómico consiste em 400 E. coli transduzidas resistentes à canamicina contendo cosmídeos recombinantes. Destes, um único clone hibridou com a sonda, e continha um plasmídeo recombinante designado pILL684, com um comprimento de 46 kb. A baixa frequência observada na detecção do gene hspB (1 em 400) foi pouco usual quando comparada com aquela de vários genes clonados que eram consistentemente detectados em cinco a sete cosmídeos recombinantes. De modo a identificar o gene hspB, foram gerados fragmentos com comprimentos de 3 a 4 kb por restrição parcial do ADN do cosmídeo pILL684 com a endonuclease Sau3A, purificados, e ligados à posição BglII do vector plasmídico pILL570. Dos 100 subclones, x foram clones positivos, e um foi estudado em mais detalhe (plLL689); contém um inserto de 3,15 kb, flanqueado por dois locais de restrição BglII, que foi mapeado em detalhe (Fig. 5). Utilizando a sonda de PCR marcada com P, verificou-se que a extremidadeõ' do gene hspB mapeava o fragmento de restrição central Hindlll-Sphl de 632 pb de plLL689, indicando que poder-se-ia esperar a presença do gene hspB inteiro no plasmídeo recombinante pILL689.
Sequência de ADN e sequência de aminoácidos deduzida do grupo de genes hspA-B de H. pylori
Os 3200 pb de plLL689 apresentados na Fig. 5 foram sequenciados através da clonagem em Ml3mpl8 e Ml3mpl9, os fragmentos de restrição assimétricos BglII-Sphl, Sphl- 62
HindIII, HindIII-BglII; cada fragmento clonado foi sequenciado independentemente em ambas as cadeias 16 oligonucleótidos iniciadores (Fig. 1) foram sintetizados para confirmar a leitura e/ou gerar sequências que se sobrepõem aos fragmentos sequenciados independentemente; estes foram usados como iniciadores em análises de sequenciação de ADN em cadeia dupla. A análise da sequência revelou dois elementos genéticos distintos. Primeiro, a presença de duas grelhas de leitura abertas (ORFs), representadas na Figura 5, transcrita na mesma direcção, que foram designadas hspA e hspB; A sequência nucleotidica e a sequência deduzida de aminoácidos das duas ORFs são apresentadas na Fig. 6. O primeiro codão de hspA inicia-se 323 pb a montante do local HindIII mais à esquerda de pILL698 (Fig. 5) e é precedido por um local de ligação de ribossoma de Shine-Dalgarno (RBS) (GGSGSS). A ORF hspA codifica para um polipéptido de 118 aminoácidos. 0 codão de iniciação para a ORF hspB começa 25 nucleótidos a jusante do codão de terminação de hspA; é precedido por um local RBS (AAGGA) . A ORF hspB codifica para um polipéptido de 545 aminoácidos e é terminada por um codão TAA seguido de uma sequência palindrómica semelhante a um terminador de transcrição rho-independente (energia livre, AG = -19,8 kcal/mol) (Fig. 6). A sequência de aminoácidos da extremidade N da proteína deduzida HspB foi idêntica à sequência da extremidade N da proteína de choque térmico purificada de H. pylori anteriormente publicada, com a excepção que a metionia da extremidade N que está ausente da proteína purificada e que poderá ser removida após a tradução, resulta numa proteína madura de 544 aminoácidos. 63
As sequências deduzidas de aminoácidos de HspA e HspB de H. pylori foram comparadas com várias sequências de HSPs da classe GroES e GroEL (Fig. 7) . A HspB exibia uma elevada homologia ao nivel dos aminoácidos com a proteína HtpB de Legionella penumophila (82,9 % de homologia), com a proteína GroEL de Escherichia coli (81,0 % de homologia), com a proteína Hyp B de Chlamydia psittaci ou C. trachomatis (79,4 % de homologia), com a proteína Hsp60 de Clostridium perfringens (80,7 % de homologia), e em menor grau com as proteínas do tipo GroEL de Mycobacterium. No entanto, tal como quase todos os homólogos GroEL, HspB de H. pylori apresentou o padrão conservado glicina-metionina da extremidade carboxilo (MGGMGGMGGMGGMM) que recentemente se mostrou ser dispensável na chaperonina GroEL de E. coli. O grau de homologia ao nível dos aminoácidos entre a proteína HspA de H. pylori e as outras proteínas do tipo GroEL é apresentado na Fig. 7. O alinhamento apresentado revela um padrão singular na extremidade carbonilo da proteína HspA de h. pylori que outros homólogos GroES bacterianos não apresentam. Esta unidade única altamente carregada consiste em 27 aminoácidos adicionais capazes de formar uma volta entre dois duplos resíduos cisteína; dos 27 aminoácidos, 8 são resíduos histidina altamente reminiscentes de um domínio de ligação a um metal. O segundo elemento genético revelado pela análise de sequência foi a presença de uma sequência de inserção (IS5) 84 pb a montante do gene hspA. A sequência nucleotídica deste elemento coincide perfeitamente com aquela anteriormente descrita para IS5 em E. coli, com a presença de uma sequência de 16 nucleótidos (CTTGTTCGCACCTTCC) que corresponde a um dos dois elementos repetidos invertidos que flanqueiam o elemento IS5. Dado que se trata de uma correspondência perfeita ao nivel do ADN, suspeita-se que o IS5 não estava inicialmente presente no cromossoma de H. pylori, mas foi inserido a montante do grupo de genes hspA-HspB durante o processo de clonagem, uma hipótese que tem de ser confirmada por outras análises .
Identificação da sequência a montante do grupo de genes hspA-B no cromossoma de H. pylori: A presença de IS5 foi examinada por amplificação genética utilizando dois oligonucleótidos, um deles interno ao elemento IS5 e o outro a jusante do elemento IS5 (oligo #1 e #2, Fig. 6), de modo a visar uma sequência putativa i) no cromossoma da estirpe 85P de H. pylori, ii) no cosmideo inicial pILL684, e iii) nos 100 sub-clones resultantes da restrição parcial de Sau3A do cosmideo recombinante pILL684. IS5 estava ausente do cromossoma de H. pylori e estava presente nas primeiras sub-culturas da estirpe de E. coli contendo o cosmideo pILL684. Entre os 100 sub-clones derivados de pILL684 que aparentavam conter toda ou parte da sequência IS5, procurou-se então um sub-clone contendo a extremidade esquerda de IS5 e a sequência original a montante do grupo de genes hspA-hspB. Este rastreio foi realizado por análise de restrição dos diferentes sub-clones Sau3A parciais gerados. O mapa de restrição de um dos plasmideos (piLL694) que satisfazia estes critérios é apresentado na Fig. 5. A extremidade esquerda da sequência nucleotidica IS5 foi determinada; a presença de um duplicação de 4 pb CTAA em ambos os lados das repetições de 16 pg invertidas do elemento IS5 (Fig. 6) permitiu confirmar a aquisição recente do elemento IS5 por transposição. Uma sequência de 254 65 nucleótidos foi então determinada que mapeou imediatamente a montante do elemento IS5 (apresentado na Fig. 6). Esta sequência consiste numa região não codificante na qual foi detectada a presença de uma sequência putativa de consenso promotora de choque térmico; apresenta uma região -35 perfeitamente conservada (TAACTCGCTTGAA) e uma região -10 menos consentânea (CTCAATTA). Foram sintetizados dois oligonucleótidos (#3 e #4, apresentados na Fig. 2) que mapearam sequências localizados em ambos os lados do elemento IS5 presente no cosmideo recombinante; estes dois oligonucleótidos deveriam conduzir à amplificação de um fragmento de XXXX pb quando a sequência IS está presente e um fragmento na ausência da IS5. OS resultados da reacção de PSR utilizando com AND alvo o cosmideo pILL684, o plasmídeo pILL694, e o cromossoma de H. pylori 85P ajustam-se às previsões (resultados não ilustrados). Além disso, a sequenciação directa do produto de PCR obtido do cromossoma de H. pylori foi levada a cabo e confirmou a sequência reconstruída hspA-hspB apresentada na Fig. 6 (B). Para confirmar ainda mais a organização genética de toda a região sequenciada, foram preparadas duas sondas por amplificação genética do plasmideo pILL689 utilizando os oligonucleótidos #5 e #6, e #7 e #8 (Fig. 6); foram usados como sondas nas experiências de hibridação de "Southern" sob condições de baixa restringência contra um digerido de HindIII do cromossoma de H. pylori 85P. Os resultados demonstram que não ocorreu qualquer outro rearranjo detectável durante o processo de clonagem (dados não apresentados). Estas experiências permitiram-nos demonstrar que apesar de estar presente uma única cópia do gene hspB no cromossoma da estirpe 85 de H. pylori, duas cópias do gene hspA foram detectadas por hibridação "Southern". 66
Análise dos polipéptidos expressos em mini-células: [0148] Os plasmídeos recombinantesplLL689 e plL692 e os respectivos vectores de clonagem pILL570 e pACTC177 foram introduzidos por transformação em E. coli P678-54, uma estirpe produtora de mini-células. OS plasmídeos pILL689 e plLL692 (Fig. 6) contêm o mesmo inserto de 3,15 kb clonado em dois vectores. pILL570 contém a montante do local de policlonagem uma terminação de transcrição e de tradução; a orientação do inserto em plLL689 foi feita de tal modo que a terminação da transcrição foi colocada a montante do fragmento IS5 e por isso a montante dos genes hspA e HspB. Foram claramente detectados dois polipéptidos que migraram com polipéptidos com pesos moleculares aparentes de 60 kDa e 14 kDa nas experiências de minicélulas de plLL689 e plLL692 (resultados não apresentados), enquanto que estavam ausentes dos vectores correspondentes; estes resultados indicaram que os genes hspA e hspB eram constitutivamente expressos por um promotor localizado no interior do elemento IS5. Além disso, enquanto que a quantidade de polipéptidos visualizada no gel de SDS estava em concordância com o número de cópias dos vectores respectivos, a intensidade das duas bandas polipeptídicas sugeriu uma transcrição policicstrónica dos dois genes.
Tentativas de perceber o papel das proteínas Hspa e Hspb:
Conseguiram-se duas interrupções de genes em E. coli inserindo a cassete de Km previamente descrita no interior do gene de hspA ou de hspB dos plasmídeos piLL686 e plLL691. Tal foi realizado de modo a resultar nos genes interrompidos em H. pylori por electroporação, e seleccionar a substituição de 67 alelos. 0 plasmídeo pILL696 resultante codificava para uma forma truncada da proteína HspA, correspondente à deleção da sequência de aminoácidos da extremidade C; nesse plasmídeo a cassete Km foi inserida de tal modo que o promotor do gene Km poderia servir como promotor para o gene hspB a jusante. Os plasmídeos pILL687 e pILL688 resultaram da inserção da cassete Km em qualquer uma das orientações no interior do gene hspB. Nenhuma destas construções conduziu ao isolamento dos transformantes de canamicina da estirpe N6 de H. pylori quando foram utilizados nas experiências de electroporação os plasmídeos plLL687, plLL688, plL696 (Tabela 2, Fig. 5) purificados, enquanto que o plasmídeo pSUSIO utilizado como controlo positivo sempre o fez. Estes resultados sugerem que a proteínas HspA e HspB são proteínas essenciais para a sobrevivência de H. pylori.
Devido à i) descrição constante na literatura de uma associação próxima d proteína HspB com as subunidades urease; -ii) estrutura única da proteína HspA com a sequência C-terminal reminiscente de um domínio de ligação ao níquel, e iii) ausência de mutantes hspA e/ou hspB de H. pylori viáveis, tentou-se demonstrar um papel das proteínas Hsps de H. pylori em relação à urease de H. pylori através de experiências de complementação funcional em E. coli. Os plasmídeos pILL763 ou pILL753 (ambos derivados de pILL570, Tabela 5) que codificam para o grupo de genes da urease foram introduzidos com o plasmídeo compatível pILL692 (derivado de pACYC177) que expressa constitutivamente os polipéptidos HspA e HspB, tal como visualizados em mini-células. Em ambas as complementações, a expressão das proteínas HspA e HspB na mesma célula de E. coli permite a observação de um aumento em três vezes da actividade de urease após a indução dos genes 68 de urease em meio mínimo suplementado com 10 mM de L-arginina como fonte de azoto limitante.
Tabela 5: estudo. Vectores e plasmídeos híbridos utilizados neste Plasmídeo Vector Tamanho (kb) Características (a) Origem ou Referência pILL575 10 Mob, Cos, Km - pILL570 53 Mob, Sp - pACYC177 3,9 Ap, Km - pILL600 pBH322 5,7 Ap, Km, fonte da cassete Km pILL684 pILL575 46 Mob, Km, cosmídeo contendo hspA-B de H. pylori Digesto parcial de H. pylori 85P por Sau3A pILL685 pILL570 9,29 Mob, Sp, plasmídeo contendo hspB de H. pylori Digesto parcial de pILL684 por Sau3A pILL686 pUC19'c 45 Ap, plasmídeo contendo hspB de H. pylorí BglII-Clat com 1,9 kb de pILL685 clonado em pUC19° pUC19'(c) 5,9 Ap, Km, H. pylori hspB Ω orientação Km A(b) Smal-Smal com 1,4 kb de pILL600 clonado em pILL686 pILL688 pUC19'(c) 5,9 Ap, Km, H. pylori hspB Ω orientação Km B (b) Smal-Smal com 1,4 kb de pILL600 clonado em pILL686 pILL689 pILL570 8, 45 Mob, Sp, plasmídeo contendo hspA-B de H. pylori Digesto parcial de pILL684 por Sau3A pILL691 pUC19"(c) 3,9 Ap, plasmídeo contendo hspA de H. Sphl-Sphl de pILL689 clonado 69 pylori com 1,3 kb em pUC19" pILL692 pACYC177 7, 05 Ap, Km, plasmideo BglII com 3,15 kb contendo Aspa-B de de PILL689 H. pylori clonado em pACYC177 pILL684 pILL570 8,7 Sp, plasmideo Digesto parcial contendo a de pILL684 por extremidade esquerda Sau3A de 155 pILL696 pUC19"(c) 5, 3 Ap, Km, H. pylori Smal-Smal com 1,4 hspA Ω orientação Km kb de pILL600 A(b) clonado em pILL686 pSUSIO pIC20R2 7,7 Ap, Km, H. pylori - hspA Ω orientação Km pILL753 pILL570 16,5 Sp, plasmideo - contendo ureA,B,C,D , E, Fr G, Hr I pILL763 pILL570 14, 75 Sp, plasmideo - contendo
ureA, B, C, D, E, F, G, Η, I (a) Mob, plasmídeo conjugativo devido à presença de OriT, Ap, Km, e
Sp, resistência à ampicilina, canamicina, e espectinomicina, respectivamente; Cós, presença do local cós lambda. (b) Orientação A indica que o promotor da canamicina inicia a transcrição na mesma orientação que aquela do gene no qual a cassete foi inserida; orientação B, o oposto. (c) pUC19' e pUC19"; derivados do vector pUC nos quais, respectivamente, os locais Sphl e HindiII foram preenchidos pela extremidade utilizando a polimerase de Klenow e auto-religados.
EXEMPLO II IV - EXPRESSÃO, PURIFICAÇÃO E PROPRIEDADES IMUNOGÉNICAS DE HSPA E HSPB DE H. PYLORI: 70 PROCEDIMENTO EXPERIMENTAL PARA A PARTE IV:
Expressão e Purificação de proteínas de fusão recombinantes:
As proteínas de fusão MalE-HspA, e MalE-HspB foram expressas após a clonagem dos dois genes no interior do vector pMAL-c2 tal como descrito na secção de "Resultados" utilizando os seguintes iniciadores:
oligo #1 ccggagaattcAAGTTTCAACCATTAGGAGAAAGGGTC oligo #2 acgttCtgcagTTTAGTGTTTTTTGTGATCATGAÇAGC oligo #3 ccggagaattcGCAAAAGAAATCAAATTTTCAGATAGC oligo #4 acgttctgcagATGATACCAAAAAGCAAGGGGGCTTAC
Dois litros de meio Luria contendo glucose (30%) foram inoculados com 20 mL de uma cultura cultivada durante a noite da estirpe MC1061 contendo o plasmídeo de fusão e incubados com agitação a 37°C. Quando a DO600 da cultura atingiu 0,5, adicionou-se IPTG (a uma concentração final de 10 mM), e as células foram incubadas durante mais 4 horas. As células foram recolhidas por centrifugação (5000 rpm durante 30 min a 4°C), ressuspendidas em 100 mL de tampão de coluna consistindo em 10 mM Tris-HCl, 200 mM NaCl, 1 mM suplementado com inibidores de protease [(Leupeptina (2 μΜ) - Pepstatina (2 μΜ) - PMSF (1 μΜ) - Aprotinina (diluição de l:1000),e passadas por uma prensa francesa. Após centrifugação (10000 rpm durante 20 min a 4°C), os sobrenadantes foram recuperados e diluídos (para metade da concentração) com tampão de coluna. O lisado foi filtrado através de um filtro de nitrocelulose de 0,2 pm antes de ser carregado numa resina de amilose pré-equilibrada (22 x 2,5 cm). As proteínas de fusão foram eluídas com solução de 10 mM de maltose preparada em 71 tampão de coluna, e as fracções contendo as proteínas de fusão foram separadas, dializadas contra água destilada, e liofilizadas. As proteínas de fusão foram ressuspendidas em água destilada a uma concentração final de 2 mg de material liofilizado/ml, e armazenadas a -20°C. A concentração e a pureza das preparações foram controladas através do teste para proteínas de Bradford (Sigma Chemicals) e análises de SDS-PAGE.
Propriedades de ligação ao níquel recombinantes: das proteínas
As células de E. coli MC1061 contendo ou o vector pMAL-c2 ou plasmídeos recombinantes dele derivado, foram crescidos em 100 mL de meio Luria na presença de carbenicilina (100 pg/mL). A expressão dos genes foi induzida com IPTG durante quatro horas. As células foram centrifugadas e o sedimento ressuspendido em 2 mL de Tampão A (hidrocloreto de guanidina a 6 M, NaH2P04 a 0,1 M, 0,01 Tris, pH 8,0). Após se agitar suavemente durante uma hora à temperatura ambiente, as suspensões foram centrifugadas a 10000 g durante 15 min a 4°C. Uma alíquota de 1,6 mL de resina Níquel-Nitrilo-Tri-Acética (Nickel-NTA, qia Express), previamente equilibrada em Tampão A, foi adicionada ao sobrenadante e esta mistura foi agitada à mistura ambiente durante uma hora antes de se carregar numa coluna. A coluna foi lavada com 20 mL de tampão A, e depois 30 mL de tampão B (8 M de ureia, 0,1 M de fosfato de Na, 0,01 M de Tris-HCl, pH 8,0)- As proteínas foram eluídas sucessivamente com o mesmo tampão que o tampão B ajustado a pH 6,3 (Tampão C), pH 5,9 (Tampão D) e pH 4,5 (Tampão E) e Tampão F (6 M de hidrocloreto de guanidina, 02 M de ácido acético). Cinquenta pL de cada fracção foram 72 misturados com 50 pL de tampão SDS e carregados em geles de SDS.
Soro Humano:
As amostras de soro foram obtidas de 40 indivíduos, 28 foram pacientes infectados por H. pylori tal como confirmado por uma cultura positiva de H. pylori e por exame histológico da biopsia, e 12 foram pacientes não infectados. Os soros foram gentilmente cedidos por R. J. Adamek (Universidade de Bochum, Alemanha). "Immunoblotting":
Após se terminar as corridas de SDS-PAGE numa célula de electroforese Mini-Protean II, as proteínas foram transferidas para papel de nitrocelulose numa célula de transferência Mini Trans-Blot (BioRad) fixada a 100 V durante 1 h (com arrefecimento). A imunocoloração foi realizada tal como anteriormente descrito (Ferrero et al., 1992), excepto que o sistema de detecção de "Western blotting" ECL (Amersham) foi utilizado para visualizar os produtos de reacção. Soro humano e anti-soro de coelho, produzido contra um extracto de células inteiras da estirpe 85P de H. pylori, foram diluídos 1:1000 e 1:5000, respectivamente, em 1% (p/v) de caseína preparada em tampão fosfato salino (PBS, pH 7,4). Métodos serológicos ["Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay", (ELISA)]:
As seguintes quantidades de antigénios foram absorvidas em placas de 96 poços (Falcon 3072): 2,5 pg de proteína MalE, 5 73 pg de MalE-HspA, ou 2,5 pg de MalE-HspB. As placas foram deixadas durante a noite a 4°C, depois lavadas 3 vezes com solução de lavagem ELISA (EWS) [1% PBS contendo 0,05% (v/v) de Tween 20] . A saturação foi conseguida através da incubação das placas durante 90 min a 37°C em EWS suplementada por 1% de leite em pó. Os poços foram de novo lavados 3 vezes com EWS e então depois suavemente agitados durante 90 min a 37°C na presença de soro humano (diluído 1:500 em EWS com 0,5% de leito em pó), sob agitação. As imunoglobulinas ligadas foram detectadas por incubação durante 90 min a 37°C com um anticorpo secundário biotinilado (igG, igA ou igM de cabra anti-humano, diluído [1:1000] em EWS suplementada com 0,5% de leite em pó) em combinação com estreptavidina-peroxidase (1:500) (Kirkegaard and Perry Lab.). A peroxidase ligada foi detectada por reacção com o substrato citrato e peróxido de hidrogénio. As placas foram incubadas no escuro, à temperatura ambiente, e a densidade óptica a 492 nm foi medida a intervalos de 5, 15 e 30 min num leitor de placas ELISA. Após 30 min, a reacção foi parada através da adição de ácido clorídrico até uma concentração final de 0,5M. RESULTADOS DAS EXPERIÊNCIAS DA PARTE IV:
Construção de plasmídeos recombinantes que produzem proteínas de fusão induzíveis HspB e MalE-HspA:
Os oligonucleótidos #1 e #2 (hspA) e #3 e #4 (hspB) foram utilizados para amplificar por PCR, respectivamente, os genes hspA e hspB na sua totalidade. Os produtos de PCR foram electroeluídos, purificados e restringidos com EcoRl e Psti. Os fragmentos restringidos (respectivamente 360 pb e 1600 pg) foram então ligados no vector pMAL-c2 restringido pró EcoRI- 74
PstI para gerar plasmídeos designados, respectivamente, pILL933 e pILL934. Após a indução com IPTG, e a purificação da proteína solúvel em colunas de amilose, foram visualizadas as proteínas de fusão da dimensão esperada (55 kDa para pILL933 [figura 17], e 100 kDA para pILL9334) em geles de SDS-PAGE. Cada uma destas correspondeu à fusão da proteína MalE (42-7 kDa) com um segundo aminoácido de cada um dos polipéptidos Hsp. O rendimento da expressão das proteínas de fusão foi de 100 mg para MalE-HspA e 20 mg para MalE-HspB quando preparadas a partir de 2 litros de meio de cultura.
Estudo da antigenicidade das proteínas de fusão HspA e HspB, e da imunogenicidade de HspA e HspB em pacientes infectados com H. pylori:
De modo a se determinar se as proteínas de fusão eram ainda antigénicas, cada uma foi analisada por "Western blot" com anti-soro de coelho produzido contra a proteína MalE e um extracto de células inteiras da estirpe 85P de H. pylori. Ambas as proteínas de fusão foram imunorreactivas com o anticorpo para MalE (não apresentado) e com o anti-soro anti-H. pylori. O anti-soro anti-H. pylori não reconheceu a proteína MalE purificada (figura 18) . Estes resultados demonstraram que as proteínas de fusão retiveram as suas propriedades antigénicas; além disso, enquanto se sabia que a proteína HspB era imunogénica, esta é a primeira demonstração que HspA per se é imunogénica em coelhos.
Do mesmo modo, de modo a se determinar se os polipéptidos HspA e HspB eram imunogénicos em humanos, a resposta imunitária humoral contra HspA e/ou HspB em pacientes infectados com H, pylori foi analisada e comparada com aquela 75 de pessoas não infectadas utilizando ensaios de "Western immunoblotting" e testes ELISA. Nenhum dos 12 soros de pessoas negativas para H. pylori resultou num sinal positivo com as proteínas MalE, MalE-HspA, ou MalE-HspB (figura 18). Pelo contrário, dos 28 soros de pacientes H, pylori positivos, 12 (42,8%) reagiram com a proteínas HspA enquanto que 20 (71,4%) reconheceram a proteína HspB. Todos os soros que reconheceram HspA também reconheceram a proteína HspB. Não foi observada qualquer associação entre a resposta imunitária e a apresentação clínica da infecção de H. pylori apesar de tal conclusão poder ser prematura dado o baixo número de estirpes analisado.
Propriedades de ligação ao níquel da proteína de fusão MalE-HspA: A proteína recombinante MBP-HspA expressada após indução com IPTG, foi purificada a partir de um extracto de células inteiras através de uma purificação de um passo numa coluna de afinidade de níquel enquanto que nem a MBP isolada, nem a MBP-HspB apresentou esta propriedade. A Figura 18 ilustra a purificação num passo da proteína MBP-HspA que foi eluída como um monómero a pH 6,3, e como um monómero a +H 4,5. A única banda observada no painel 7 e as duas bandas observadas no painel 5 foram ambas reconhecidas especificamente com o soro de coelho anti-HspA. Tal sugeriu que a propriedade de ligação ao níquel da proteína de fusão MBP-HspA poderá ser atribuída à sequência C-terminal de HspA que é rica em resíduos Histidina e Cisteína.
Referências 76
Boyer, H. W., e Roulland-Dussoix, D (1969) A complementation analysis of the restriction and modification of dna in Escherichia coli. J Mol Biol 41: 459-472.
Chen, M., Lee, A., e Hazell, S. L. (1992) Immunisation against gastric hellcobacter_infectlon in a mouse/Helicobacter felis model. Lancet 339: 1120-1121.
Corthesy-Theulaz, I. et al (1993), Acta Gastro Enterol. Bélgica Suppl., vol. 56, p 64 (Vlth Workshop on
Gastroduodenal pathology and H. pylori).
Cover, T. L., Puryear, W.; Perez-Perez, G.J., e Blaser, M. (1991) Effect of urease on HeLa cell vacuolation induced by Helicobacter pylori cytotoxin. Infect Immun 59: 1264-1270.
Cussac, V., Ferrero, R. L., e Labigne, A. (1992) Expression of Helicobacter pylori urease genes in Escherichia coli grown under nitrogen-limiting conditions. J Bacteriol 174: 2466— 2473.
Davin, C. et al., Abstract A-304, Gastroenterology 1993 (Suplemento de resumos).
Dick-Hegedus, E., e Lee, A. (1991) The use of a mouse model to examine anti-Helicobacter pylori agents. Scand J Gastroenterol 26: 909-915.
Dick E., Lee A., Watson G., e 0'Rourke J. (1989) Use of the mouse for the isolation and investigation of stomach-associated, spiral-helical shaped bactéria from man and other animais. J Med Microbiol 29: 55-62.
Dunn, B. E., R.M., Roop II, C.-C. Sung, S.A. Sharma, G.I.
Perez-Perez, e M.J. Blaser, 1992.Identification and purification of acan60 heat shock protein homolog from Helicobacter pylori. Infect Immun. 60: 1946-1951.
Eaton, K. A., Brooks, C. L., Morgan, D. R., e Krakowka, S. (1991) Essential role of urease in pathogenesis of gastritis induced by Helicobacter pylori in gnotobiotic piglets. Infect Immun 59: 2470-2475.
Evans, D. J., Evans, D. G., Engstrand, L. e Graham, D. Y. (1992) heat shock protein of Helicobacter pylori. Infect Immun 60: 2125-2127. 77
Ferrero, R. L., e Lee, A. (1991) The importance of urease in acid protection for the gastric colonising bactéria Helicobacter pylori and Helicobacter felis sp. nov. Microb Ecol Hlth Pis 4:121-134.
Ferrero, R. L., Cussac, V., Courcoux, P. e Labigne, A. (1992) Construction of isogenic urease negative mutants of Helicobacter pylori by allelic exchange. J Bacteriol 174:4212-4217.
Ferrero, R. L. e Labigne, A. (1993) Molec. Microbiol. 9, 323-333.
Freedburg, A. S., e Barron, L. E. (1940) The presence of spirochetes in human gastric mucosa. American Journal of Digestive Diseases 7:443-445.
Goodwin, C. S., Zrmstrong, J. A., Chilvers, T., Peters,M., Collins, M. D., Sly, L., McConnell, W., e Harper, W. E. S.(1989) Transfer of Campylobacter pylori comb. nov. and Helicobacter mustelae comb. nov., respectively. Int J Syst Bacteriol 39: 397-405.
Hazell, S. L., e Lee, A. (1986) Campylobacter pyloridis, urease, hydrogen ion back diffusion, and gastric ulcers. Lancet ii: 15-17.
Hazell, S. L., Borody, T. J., Gal, A., e Lee, A. (1987) Campylobacter pyloridis gastritis I: Detection of urease as a marker of bacterial colonization and gastritis. Am J
Gastroenterol 82: 292-296.
Hu, L-T, Foxall, P. A., Russell, R., e Mobley, H. L. T. (1992) Purification of recombinant Helicobacter pylori urease apoenzyme encoded by ureA and ureB. Infectlmmun. 60:2657-2666 .
Jones, B. D., e Mobley, H. L. T. (1989) Proteus mirabilis urease : nucleotide sequence determination and comparison with jack bean urease. J Bacteriol 171:6414-6422.
Krakowka, S., Morgan D. R., Kraft W. G., e Leunk R. D.(1987) Establishment of gastric Campylobacter pylori infection in the neonatal gnotobiotic piglet. Infect Immun 55:2789-2796.
Labigne-Roussel, A., Courcoux, P., e Tompkins, L. (1988) Gene disruption and replacement as a feasible approach for 78 mutagenesis of Campylobacter Je~juni. J Bacteriol 170:1704-1708.
Labigne, A., Cessac, V., e Courcoux, P. (1991) Shuttle cloning and nucleotide sequences of Helicobacter pylori genes responsible for urease activity. J Bacteriol 173:1920-1931.
Labigne, A., Courcoux, P., e Tompkins, L. (1992) Cloning of Campylobacter -jejuni genes required for leucine biosynthesis, and construction of leu-negative mutant of C. jejuni by shuttle transposon mutagenesis. Res Microb 143: 15-26.
Laemmli, E. K. (1970) Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature 227: 680-685.
Lee, A., Hazell, S. L., 0'Rourke, J., e Kouprach, S. (1988) Isolation of a spiral-shaped bacterium from the cat stomach. Infect Immun 56: 2843-2850.
Lee, A., Fox, J. G., Otto, G., e Murphy, J. (1990) A small animal model of human Helicobacter pylori active chronic gastritis. Gastroenterol 99: 1315-1323.
Lee, Μ. H., Mulrooney, S. B., Renner, M. J., Marckowicz, Y., e Hausinger, R. P. (1992) Klebsiella aerogenes urease gene cluster: Sequence of ure D and demonstration that four accessory genes (ure D, ure E, ure F, and ure G) are involved in nikel metallocenter biosynthesis. J Bacteriol 174: 4324-4330.
Luger, A., e Neuberger, H. (1921) Uber spirochatenbefunde im magensaft und der diagnostische Bedeutung fur das carcinoma ventriculi. Zeit Klin Med 92: 54.
Mai, U. E. H., Perez-Perez, G. I., Allen, J. B., Wahl, S. M., Blaser, M. J., e Smith, P. D. (1992) Surface proteins from Helicobacter pylori exhibit chemotactic activity for human leukocytes and are present in gastric mucosa. J Exp Med 175: 517-525.
Maniatis, T., Fritsch, E., e Sambrook, J. (1983) Molecular cloning : a laboratory manual. Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor N.Y.
Marshall, B. J., Royce, H., Annear, D. I., Goodwin, C. D., Pearman, J. W., Warren, J. R., e Armstrong, J. A. (1984) 79
Original isolation of Campylobacter pyloridis from human gastric mucosa. Microbios Lett 25: 83-88.
Marshall, B. J., Barrett, L. J., Prakash, C., McCallem, R. W., e Guerrant, R. L. (1990) Urea protects Helicobacter (Campylobacter) pylori from the bactericidal effect of acid. Gastroenterol 99: 697-702.
Meissing, J., e Vieira, J. (1982) A new pair of M13 vectors for selecting either DNA strand of double-digest restriction fragments. Gene 19: 269-276.
Mobley, H. L. T., e Hausinger, R. P. (1989) Microbial ureases: significance, regulation, and molecular characterisation. Microbiol Rev 53: 85-108.
Newell, D. G., Lee, A., Hawtin, P. R., Hudson, M. J., Stacey, A. R., e Fox, J. (1989) Antigenic conservation of the ureases of spiral-and helical-shaped bactéria colonising the stomachs of man and animais. FEMS Microbiol Lett 65:183-186.
Nomura, A., Stermmermann, G. N., Ghyou, P-H., Kato, I., Perez-Perez, G. I., e Blaser, M. J. (1991) Helicobacter pylori infection and gastric carcinoma among Japanese Americans in Hawaii. N Eng J Med 325: 1132-1136.
Parsonnet, J., Friedman, G. D., Vanderstee, D. P., Chang, Y., Vogelman, J. H., Orentreich, N., e R. Sibley (1991) Helicobacter pylori infection and the risk of gastric carcinoma. N Eng J Med 325: 1127-1131.
Paster, B. J., Lee, A., Dewhirst, F. E., Fox, J. G., Tordoff, L. A., Fraser, G. J., 0'Rourke, J. L., Taylor, N. S., e Ferrero, R. (1990) The phylogeny of Helicobacter felis sp. nov., Helicobacter mustalae, and related bactéria. Int J Syst Bacteriol 41: 31-38.
Peterson, W. L. (1991) Helicobacter pylori and peptic ulcer disease. N Engl J Med 324: 1043-1047.
Radin, J. M., Eaton, K. A., Krakowka, S., Morgan, D. R., Lee, A., Otto, G., e Fox, J. G. (1990) Helicobacter pylori infection in gnotobiotic dogs. Infect Immun 58: 2606-2612.
Salomon, H. (1896) Ueber das Spirillem des Saugetiermagens und sein Verhalten zu den Belegzellen. Zentral Bakteriol Parasiten Infektion 19: 433-442. 80
Sanger, F., Nicklen, S., e Coulson, A. R. (1977) DNA sequencing with Chain terminating inhibitors. Proc Natl Acad Sei USA 74: 5463-5467.
Shine, J., e Dalgarno, L. (1974) The 3'-terminal sequence of Escherichia coli 16S ribosomal RNA: complementarity to nonsense triplets and ribosome binding sites. Proc Natl Acad Sei USA 71: 1342-1346.
Sidebotham, R. L., e Baron, J. H. (1990) Hypothesis : Helicobacter pylori, urease, mucus, and gastric ulcer. Lancet 335: 193-195.
Smoot, D. T., Mobley, H. L. T., Chippendale, G. R., Lewinson, J. F., e Resau, J. H. (1990) Helicobacter pylori urease activity is toxic to human gastric epithelial cells. Infect Immun 58: 1992-1994.
Solnick, J.V., et al, Infec. and Immunity, Maio de 1994, p 1631-1638.
Towbin, H., Staehelin, T., e Gordon, J. (1979) Electrophoretic transfer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets: procedure and some applications. Proc Natl Acad Sei 76: 4350-4354.
Turbett, G. R., Nandapalan, N., Campbell, I. G., Nikoletti, S. M., e Mee, B. J. (1991) Characterization of the urease from Helicobacter pylori and comparison with the ureases from related spiral gastric bactéria. FEMS Microbiol Immunol 76: 19-24.
Turbett, G. R., Hoj, P., Horne, R., e Mee, B. J. (1992) Purification and characterization of the urease enzymes of Helicobacter species from humans and animais. Infect Immun 60: 5259-5266. 81 LISTAGEM DAS SEQUÊNCIAS (1) INFORMAÇÃO GERAL: (i) REQUERENTE:
(A) NOME: INSTITUT PASTEUR (B) RUA: 25-28 rue du Dr Roux (C) CIDADE: PARIS CEDEX 15
(E) PAÍS: FRANÇA (F) CÓDIGO POSTAL (ZIP): 75724 (G) TELEFONE: 45.68.80.94 (H) TELEFAX: 40.61.30.17
(A) NOME: INSTITUT NATIONAL DE LA SANTE ET DE LA RECHERCHE MEDICALE (B) RUA: 101 rue de Tolbiac (C) CIDADE: PARIS CEDEX 13
(E) PAÍS: FRANÇA (F) CÓDIGO POSTAL (ZIP): 75654 (G) TELEFONE: 44.23.60.00 (H) TELEFAX: 45.85.07.66 (ii) TÍTULO DA INVENÇÃO: COMPOSIÇÕES IMUNOGÉNICAS CONTRA INFECÇÃO POR HELICOBACTER, POLIPÉPTIDOS PARA UTILIZAÇÃO NAS COMPOSIÇÕES E SEQUÊNCIAS DE ÁCIDOS NUCLEICOS QUE CODIFICAM PARA ESTES POLIPÉPTIDOS. (iii) NÚMERO DE SEQUÊNCIAS: 8 (iv) FORMA LEGÍVEL EM COMPUTADOR: (A) TIPO DE MEIO: Disquete (B) COMPUTADORR: IBM PC compatível 82
(C) SISTEMA OPERATIVO: PC-DOS/MS-DOS (D) PROGRAMA: Patentln Emissão #1.0, Versão #1.25 (EPO) (v) DADOS DO PEDIDO CORRENTE: NÚMERO DE PEDIDO: PCT/EP 94/01625 (vi) DADOS DE PEDIDOS ANTERIORES: (A) NÚMERO DE PEDIDO: EP 93401309.5 (B) DATA DE SUBMISSÃO: 19 DE MAIO DE 1993 (vi) DADOS DE PEDIDOS ANTERIORES: (A) NÚMERO DE PEDIDO: PCT/EP 93/03259 (B) DATA DE SUBMISSÃO: 19 DE NOVEMBRO DE 1993 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO: 1: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 2619 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico) (ix) CARACTERÍSTICA: (A) NOME/CHAVE: caracteristicas diversas (B) LOCALIZAÇÃO: 31..36 (D) OUTRA INFORMAÇÃO: /nome_comum= "sequência de Shine-Dalgarno" 83 (ix) CARACTERÍSTICA: (A) NOME/CHAVE: caracteristicas diversas (B) LOCALIZAÇÃO: 756..759 (D) OUTRA INFORMAÇÃO: /nome_comum= "sequência de Shine-Dalgarno" (ix) CARACTERÍSTICA:
(A) NOME/CHAVE: CDS (B) LOCALIZAÇÃO: 43..753 (D) OUTRA INFORMAÇÃO: /nome_comum= "URE A" (ix) CARACTERÍSTICA:
(A) NOME/CHAVE: CDS (B) LOCALIZAÇÃO: 766..2475 (D) OUTRA INFORMAÇÃO: /nome_comum= "URE B - FIGURA 3" (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 1: TGATAGCTTG GCTACCAATA GAAATTCAAT AAGGAGTTTA GG ATG AAA CTA ACG 54
Met Lys Leu Thr CCT AAA GAA CTA GAC AAG TTA ATG CTC CAT TAT GCG 1 GGC AGA TTG GCA 102 Pro Lys Glu Leu Asp Lys Leu Met Leu His Tyr Ala Gly Arg Leu Ala 5 10 15 20 GAA GAA CGC TTG GCG CGT GGT GTG AAA CTC AAT TAC ACC GAA GCG GTC 150 Glu Glu Arg Leu Ala Arg Gly Vai Lys Leu Asn Tyr Thr Glu Ala Vai 25 30 35 GCG CTC ATT AGC GGG CGT GTG ATG GAA AAG GCG CGT GAT GGT AAT AAA 198 Ala Leu Ile Ser Gly Arg Vai Met Glu Lys Ala Arg Asp Gly Asn Lys 40 45 50 AGC GTG GCG GAT TTG ATG CAA GAA GGC AGG ACT TGG CTT AAA AAA GAA 246 Ser Vai Ala Asp Leu Met Gin Glu Gly Arg Thr Trp Leu Lys Lys Glu 55 60 65 84 ΑΑΤ GTG ATG GAC GGC GTA GCA AGC ATG ATT CAT GAA GTG GGG ATT GAA 294 Asn Vai Met Asp Gly Vai Ala Ser Met Ile His Glu Vai Gly Ile Glu 70 75 80 GCT AAC TTC CCC GAT GGA ACC AAG CTT GTA ACT ATC CAC ACT CCG GTA 342 Ala Asn Phe Pr© Asp Gly Thr Lys Leu Vai Thr Ile His Thr Pro Vai 85 90 95 100 GAG GAT AAT GGC AAA TTA GCC CCC GGC GAG GTC TTC TTA AAA AAT GAG 390 Glu Asp Asn Gly Lys Leu Ala Pro Gly Glu Vai Phe Leu Lys Asn Glu 105 110 115 GAC ATT ACT ATT AAC GCC GGC AAA GAA GCC ATT AGC TTG AAA GTG AAA 438 Asp Ile Thr Ile Asn Ala Gly Lys Glu Ala Ile Ser Leu Lys Vai Lys 120 125 130 AAT AAA GGC GAT CGT CCT GTG CAG GTG GGA TCA CAT TTC CAC TTC TTC 486 Asn Lys Gly Asp Arg Pro Vai Gin Vai Gly Ser His Phe His Phe Phe 135 140 145 GAA GTG AAT AAG CTC TTG GAC TTC GAT CGC GCA AAA AGC TTT TGC AAA 534 Glu Vai Asn Lys Leu Leu Asp Phe Asp Arg Ala Lys Ser Phe Cys Lys 150 155 160 CGC CTA GAC ATT GCA TCT GGA ACA GCG GTG CGC TTT GAA CCC GGG GAG 582 Arg Leu Asp Ile Ala Ser Gly Thr Ala Vai Arg Phe Glu Pro Gly Glu 165 170 175 180 GAA AAA AGT GTG GAA CTC ATT GAC ATC GGC GGG AAT AAG CGC ATC TAT 630 Glu Lys Ser Vai Glu Leu Ile Asp Ile Gly Gly Asn Lys Arg Ile Tyr 185 190 195 GGC TTT AAT TCT TTG GTG GAT CGC CAA GCC GAT GCC GAT GGT AAA AAA 678 Gly Fhe Asn Ser Leu Vai Asp Arg Gin Ala Asp Ala Asp Gly Lys Lys 200 205 210 CTC GGC TTA AAA CGC GCT AAA GAA AAA GGT TTT GGG TCT GTA AAC TGC 726 Leu Gly Leu Lys Arg Ala Lys Glu Lys Gly Phe Gly Ser Vai Asn Cys 215 220 225 GGT TGT GAA GCG ACT AAA GAT AAA CAA TAAGGAAAAA CC ATG AAA AAG 774 Gly Cys Glu Ala Thr Lys Asp Lys Gin Met Lys Lys 230 235 1 ATT TCA CGA AAA GAA TAT GTT TCT ATG TAT GGT CCC ACT ACC GGG GAT 822 Ile Ser Arg Lys Glu Tyr Vai Ser Met Tyr Gly Pro Thr Thr Gly Asp 5 10 15 CGT GTT AGA CTC GGC GAC ACT GAT TTG ATC TTA GAA GTG GAG CAT GAT 870 Arg Vai Arg Leu Gly Asp Thr Asp Leu Ile Leu Glu Vai Glu His Asp 20 25 30 35 TGC ACC ACT TAT GGT GAA GAG ATC AAA TTT GGG GGC GGT AAA ACT ATC 918 Cys Thr Thr Tyr Gly Glu Glu Ile Lys Phe Gly Gly Gly Lys Thr Ile 40 45 50 85 CGT GAT GGG ATG AGT CAA ACC AAT AGC CCT AGC TCT TAT GAA TTA GAT 966 Arg Asp Gly Met Ser Gin Thr Asn Ser Pro Ser Ser Tyr Glu Leu Asp 55 60 65 TTG GTG CTC ACT AAC GCC CTC ATT GTG GAC TAT ACG GGC ATT TAC AAA 1014 Leu Vai Leu Thr Asn Ala Leu Ile Vai Asp Tyr Thr Gly Ile Tyr Lys 70 75 80 GCC GAC ATT GGG ATT AAA GAC GGC AAG ATT GCA GGC ATT GGC AAG GCA 1062 Ala Asp Ile Gly Ile Lys Asp Gly Lys Ile Ala Gly Ile Gly Lys Ala 85 90 95 GGC AAT AAG GAC ATG CAA GAT GGC GTA GAT AAT AAT CTT TGC GTA GGT 1110 Gly Asn Lys Asp Met Gin Asp Gly Vai Asp Asn Asn Leu Cys Vai Gly 100 105 110 115 CCT GCT ACA GAG GCT TTG GCA GCT GAG GGC TTG ATT GTA ACC GCT GGT 1158 Pro Ala Thr Glu Ala Leu Ala Ala Glu Gly Leu Ile Vai Thr Ala Gly 120 125 130 GGC ATC GAT ACG CAT ATT CAC TTT ATC TCT CCC CAA CAA ATC CCT ACT 1206 Gly Ile Asp Thr His Ile His Phe Ile Ser Pro Gin Gin Ile Pro Thr 135 140 145 GCT TTT GCC AGC GGG GTT ACA ACC ATG ATT GGA GGA GGC ACA GGA CCT 1254 Ala Phe Ala Ser Gly Vai Thr Thr Met Ile Gly Gly Gly Thr Gly Pro 150 155 160 GCG GAT GGC ACG AAT GCG ACC ACC ATC ACT CCC GGA CGC GCT AAT CTA 1302 Ala Asp Gly Thr Asn Ala Thr Thr Ile Thr Pro Gly Arg Ala Asn Leu 165 170 175 AAA AGT ATG TTG CGT GCA GCC GAA GAA TAC GCC ATG AAT CTA GGC TTT 1350 Lys Ser Met Leu Arg Ala Ala Glu Glu Tyr Ala Met Asn Leu Gly Phe 180 185 190 195 TTG GCT AAG GGG AAT GTG TCT TAC GAA CCC TCT TTA CGC GAT CAG ATT 1398 Leu Ala Lys Gly Asn Vai Ser Tyr Glu Pro Ser Leu Arg Asp Gin Ile 200 205 210 GAA GCA GGG GCG ATT GGT TTT AAA ATC CAC GAA GAC TGG GGA AGC ACA 1446 Glu Ala Gly Ala Ile Gly Phe Lys Ile His Glu Asp Trp Gly Ser Thr 215 220 225 CCT GCA GCT ATT CAC CAC TGC CTC AAT GTC GCC GAT GAA TAC GAT GTG 1494 Pro Ala Ala Ile His His Cys Leu Asn Vai Ala Asp Glu Tyr Asp Vai 230 235 240 CAA GTG GCT ATC CAC ACC GAT ACC CTT AAC GAG GCG GGC TGT GTA GAA 1542 Gin Vai Ala Ile His Thr Asp Thr Leu Asn Glu Ala Gly Cys Vai Glu 245 250 255 GAC ACC CTA GAG GCG ATT GCC GGG CGC ACC ATC CAT ACC TTC CAC ACT 1590 Asp Thr Leu Glu Ala Ile Ala Gly Arg Thr Ile His Thr Phe His Thr 260 265 270 275 86 CAA GGG GCT GGG GGT GGA CAC GCT CCA GAT GTT ATC AAA ATG GCA GGG 1638 Glu Gly Ala Gly Gly Gly His Ala Pro Asp Vai Ile Lys Met Ala Gly 280 285 290 GAA TTT AAC ATT CTA CCC GCC TCT ACT AAC CCG ACC ATT CCT TTC ACC 1686 Glu Phe Asn Ile Leu Pro Ala Ser Thr Asn Pro Thr Ile Pro Phe Thr 295 300 305 AAA AAC ACT GAA GCC GAG CAC ATG GAC ATG TTA ATG GTG TGC CAC CAC 1734 Lys Asn Thr Glu Ala Glu His Met Asp Met Leu Met Vai Cys His His 310 315 320 TTG GAT AAA AGT ATC AAG GAA GAT GTG CAG TTT GCC GAT TCG AGG ATT 1782 Leu Asp Lys Ser Ile Lys Glu Asp Vai Gin Phe Ala Asp Ser Arg Ile 325 330 335 CGC CCC CAA ACT ATC GCG GCT GAA GAC CAA CTC CAT GAC ATG GGG ATC 1830 Arg Pro Gin Thr Ile Ala Ala Glu Asp Gin Leu His Asp Met Gly Ile 340 345 350 355 TTT TCT ATC ACC AGC TCC GAC TCT CAG GCT ATG GGA CGC GTA GGC GAG 1878 Phe Ser Ile Thr Ser Ser Asp Ser Gin Ala Met Gly Arg Vai Gly Glu 360 365 370 GTG ATC ACA CGC ACT TGG CAG ACA GCA GAC AAA AAC AAA AAA GAG TTT 1926 Vai Ile Thr Arg Thr Trp Gin Thr Ala Asp Lys Asn Lys Lys Glu Phe 375 380 385 GGG CGC TTG AAA GAG GAA AAA GGC GAT AAC GAC AAC TTC CGC ATC AAA 1974 Gly Arg Leu Lys Glu Glu Lys Gly Asp Asn Asp Asn Phe Arg Ile Lys 390 395 400 CGC TAC ATC TCT AAA TAC ACC ATC AAC CCC GGG ATC GCG CAT GGG ATT 2022 Arg Tyr Ile Ser Lys Tyr Thr Ile Asn Pro Gly Ile Ala His Gly Ile 405 410 415 TCT GAC TAT GTG GGC TCT GTG GAA GTG GGC AAA TAC GCC GAC CTC GTG 2070 Ser Asp Tyr Vai Gly Ser Vai Glu Vai Gly Lys Tyr Ala Asp Leu Vai 420 425 430 435 CTT TGG AGT CCG GCT TTC TTT GGC ATT AAG CCC AAT ATG ATT ATT AAG 2118 Leu Trp Ser Pro Ala Phe Phe Gly Ile Lys Pro Asn Met Ile Ile Lys 440 445 450 GGC GGA TTT ATT GCG CTC TCT CAA ATG GGC GAT GCC AAT GCG TCT ATT 2166 Gly Gly Phe Ile Ala Leu Ser Gin Met Gly Asp Ala Asn Ala Ser Ile 455 460 465 CCC ACC CCT CAG CCC GTC TAT TAC CGT GAA ATG TTT GGA CAC CAT GGG 2214 Pro Thr Pro Gin Pro Vai Tyr Tyr Arg Glu Met Phe Gly His His Gly 470 475 480 AAA AAC AAA TTC GAC ACC AAT ATC ACT TTC GTG TCC CAA GCG GCT TAC 2262 Lys Asn Lys Phe Asp Thr Asn Ile Thr Phe Vai Ser Gin Ala Ala Tyr 485 490 495 87
AAG GCA GGG ATC AAA GAA GAA CTA GGG CTA GAT CGC GCG GCA CCG CCA Lys Ala Gly Ile Lys Glu Glu Leu Gly Leu Asp Arg Ala Ala Pro Pro 500 505 510 515 GTG AAA AAC TGT CGC AAT ATC ACT AAA AAG GAC CTC AAA TTC AAC GAT Vai Lys Asn Cys Arg Asn Ile Thr Lys Lys Asp Leu Lys Phe Asn Asp 520 525 530 GTG ACC GCA CAT ATT GAT GTC AAC CCT GAA ACC TAT AAG GTG AAA GTG Vai Thr Ala His Ile Asp Vai Asn Pro Glu Thr Tyr Lys Vai Lys Vai 535 540 545 GAT GGC AAA GAG GTA ACC TCT AAA GCA GCA GAT GAA TTG AGC CTA GCG Asp Gly Lys Glu Vai Thr Ser Lys Ala Ala Asp Glu Leu Ser Leu Ala 550 555 560 CAA CTT TAT AAT TTG TTC TAGGAGGCTA AGGAGGGGGA TAGAGGGGGT Gin Leu Tyr Asn Leu Phe 565 570 TTATTTAGAG GGGAGTCATT GATTTACCTT TGCTAGTTTA TAATGGATTT AAGAGAGGTT TTTTTTCGTG TTTTATACCG CGTTGAAACC CTCAAATCTT TACCAAAAGG ATGGTAA 2310 2358 2406 2454 2502 2562 2619 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO: 2: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 237 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) CADEIA: desconhecida (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: proteína (vi) FONTE ORIGINAL: (A) ORGANISMO: Helicobacter felis (ix) CARACTERÍSTICA: (A) NOME/CHAVE: Proteína 88 (B) LOCALIZAÇÃO: 1..237 (D) OUTRA INFORMAÇÃO: /nota= "Corresponde à figura 3, linha 1 (ure A)." (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:2:
Met Lys Leu ' Thr Pro Lys Glu Leu Asp Lys Leu Met Leu His Tyr Ala 1 5 10 15 Gly Arg Leu Ala ' Glu Glu Arg Leu Ala Arg Gly Vai Lys Leu Asn Tyr 20 25 30 Thr Glu Ala ’ Vai , Ala Leu Ile Ser Gly Arg Vai Met Glu Lys Ala Arg 35 40 45 Asp Gly Asn Lys Ser Vai Ala Asp Leu Met Gin Glu Gly Arg Thr Trp 50 55 60 Leu Lys Lys Glu Asn Vai Met Asp Gly Vai Ala Ser Met Ile His Glu 65 70 75 80 Vai Gly Ile Glu Ala Asn Phe Pro Asp Gly Thr Lys Leu Vai Thr Ile 85 90 95 His Thr Pro Vai Glu Asp Asn Gly Lys Leu Ala Pro Gly Glu Vai Phe 100 105 110 Leu Lys Asn Glu Asp Ile Thr Ile Asn Ala Gly Lys Glu Ala Ile Ser 115 120 125 Leu Lys Vai Lys Asn Lys Gly Asp Arg Pro Vai Gin Vai Gly Ser His 130 135 140 Phe His Phe Phe Glu Vai Asn Lys Leu Leu Asp Phe Asp Arg Ala Lys 145 150 155 160
Ser Phe Cys Lys Arg Leu Asp Ile Ala Ser Gly Thr Ala Vai Arg Phe 165 170 175 Glu Pro Gly Glu Glu Lys Ser Vai Glu Leu Ile Asp Ile Gly Gly Asn 180 185 190 Lys Arg Ile Tyr Gly Phe Asn Ser Leu Vai Asp Arg Gin Ala Asp Ala 195 200 205 89
Asp Gly Lys Lys Leu Gly Leu Lys Arg Ala Lys Glu Lys Gly Phe Gly 210 215 220
Ser Vai Asn Cys Gly Cys Glu Ala Thr Lys Asp Lys Gin 225 230 235 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO: 3: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 569 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) CADEIA: desconhecida (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: proteína (vi) FONTE ORIGINAL: (A) ORGANISMO: Helicobacter felis (ix) CARACTERÍSTICA: (A) NOME/CHAVE: Proteína (B) LOCALIZAÇÃO: 1..569 (D) OUTRA INFORMAÇÃO: /nota= "Corresponde à figura 4, linha 1 (ure B)." (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:3: 90
Met Lys Lys Ile Ser Arg Lys Glu Tyr Vai Ser Met Tyr Gly Pro Thr 1 5 10 15 Thr Gly Asp Arg Vai Arg Leu Gly Asp Thr Asp Leu Ile Leu Glu Vai 20 25 30 Glu His Asp Cys Thr Thr Tyr Gly Glu Glu Ile Lys Phe Gly Gly Gly 35 40 45 Lys Thr Ile Arg Asp Gly Met Ser Gin Thr Asn Ser Pro Ser Ser Tyr 50 55 60 Glu Leu Asp Leu Vai Leu Thr Asn Ala Leu Ile Vai Asp Tyr Thr Gly 65 70 75 80 Ile Tyr Lys Ala Asp Ile Gly Ile Lys Asp Gly Lys Ile Ala Gly Ile 85 90 95 Gly Lys Ala Gly Asn Lys Asp Met Gin Asp Gly Vai Asp Asn Asn Leu 100 105 110 Cys Vai Gly Pro Ala Thr Glu Ala Leu Ala Ala Glu Gly Leu Ile Vai 115 120 125 Thr Ala Gly Gly Ile Asp Thr His Ile His Phe Ile Ser Pro Gin Gin 130 135 140 Ile Pro Thr Ala Phe Ala Ser Gly Vai Thr Thr Met Ile Gly Gly Gly 145 150 155 160 Thr Gly Pro Ala Asp Gly Thr Asn Ala Thr Thr Ile Thr Pro Gly Arg 165 170 175 Ala Asn Leu Lys Ser Met Leu Arg Ala Ala Glu Glu Tyr Ala Met Asn 180 185 190 Leu Gly Phe Leu Ala Lys Gly Asn Vai Ser Tyr Glu Pro Ser Leu Arg 195 200 205 Asp Gin Ile Glu Ala Gly Ala Ile Gly Phe Lys Ile His Glu Asp Trp 210 215 220 Gly Ser Thr Pro Ala Ala Ile His His Cys Leu Asn Vai Ala Asp Glu 225 230 235 240 Tyr Asp Vai Gin Vai Ala Ile His Thr Asp Thr Leu Asn Glu Ala Gly 245 250 255 Cys Vai Glu Asp Thr Leu Glu Ala Ile Ala Gly Arg Thr Ile His Thr 260 265 270 Phe His Thr Glu Gly Ala Gly Gly Gly His Ala Pro Asp Vai Ile Lys 275 280 285
Met Ala Gly Glu Phe Asn Ile Leu Pro Ala Ser Thr Asn Pro Thr Ile 290 295 300 Pro Phe Thr Lys Asn Thr Glu Ala Glu His Met Asp Met Leu Met Vai 305 310 315 320 Cys His His Leu Asp Lys Ser Ile Lys Glu Asp Vai Gin Phe Ala Asp 325 330 335 Ser Arg Ile Arg Pro Gin Thr Ile Ala Ala Glu Asp Gin Leu His Asp 340 345 350 Met Gly Ile Phe Ser Ile Thr Ser Ser Asp Ser Gin Ala Met Gly Arg 355 360 365 Vai Gly Glu Vai Ile Thr Arg Thr Trp Gin Thr Ala Asp Lys Asn Lys 370 375 380 Lys Glu Phe Gly Arg Leu Lys Glu Glu Lys Gly Asp Asn Asp Asn Phe 385 390 395 400 Arg Ile Lys Arg Tyr Ile Ser Lys Tyr Thr Ile Asn Pro Gly Ile Ala 405 410 415 Hls Gly Ile Ser Asp Tyr Vai Gly Ser Vai Glu Vai Gly Lys Tyr Ala 420 425 430 Asp Leu Vai Leu Trp Ser Pro Ala Phe Phe Gly Ile Lys Pro Asn Met 435 440 445 Ile Ile Lys Gly Gly Phe Ile Ala Leu Ser Gin Met Gly Asp Ala Asn 450 455 460 Ala Ser Ile Pro Thr Pro Gin Pro Vai Tyr Tyr Arg Glu Met Phe Gly 465 470 475 480 Hls His Gly Lys Asn Lys Phe Asp Thr Asn Ile Thr Phe Vai Ser Gin 485 490 495 Ala Ala Tyr Lys Ala Gly Ile Lys Glu Glu Leu Gly Leu Asp Arg Ala 500 505 510 Ala Pro Pro Vai Lys Asn Cys Arg Asn lie Thr Lys Lys Asp Leu Lys 515 520 525 Phe Asn Asp Vai Thr Ala His Ile Asp Vai Asn Pro Glu Thr Tyr Lys 530 535 540 92
Vai Lys Vai Asp Gly Lys Glu Vai Thr Ser Lys Ala Ala Asp Glu Leu 545 550 555 560
Ser Leu Ala Gin Leu Tyr Asn Leu Phe 565 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO: 4: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 2284 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico) (ix) CARACTERÍSTICA:
(A) NOME/CHAVE: CDS (B) LOCALIZAÇÃO: 124..477 (D) OUTRA INFORMAÇÃO: /nome_comum= "H. pylori - Hsp A" (ix) CARACTERÍSTICA:
(A) NOME/CHAVE: CDS (B) LOCALIZAÇÃO: 506..2143 (D) OUTRA INFORMAÇÃO: /nome_comum= " H. pylori - Hsp B" (ix) CARACTERÍSTICA: (A) NOME/CHAVE: caracteristicas diversas (B) LOCALIZAÇÃO: 1..2284 (D) OUTRA INFORMAÇÃO: /nota= "Corresponde à figura 6." 93 (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 4: ACAAACATGA TCTCATATCA GGGACTTGTT CGCACCTTCC CTAAAAATGC GCTATAGTTG 60 TGTCGCTTAA GAATACTAAG CGCTAAATTT CTATTTTATT TATCAAAACT TAGGAGAACT 120 GAA ATG AAG TTT CAA CCA TTA GGA GAA AGG GTC TTA GTA GAA AGA CTT 168 Met Lys Phe Gin Pro Leu Gly Glu Arg Vai Leu Vai Glu Arg Leu 1 5 10 15 GAA GAA GAG AAC AAA ACC AGT TCA GGC ATC ATC ATC CCT GAT AAC GCT 216 Glu Glu Glu Asn Lys Thr Ser Ser Gly Ile Ile Ile Pro Asp Asn Ala 20 25 30 AAA GAA AAG CCT TTA ATG GGC GTA GTC AAA GCG GTT AGC CAT AAA ATC 264 Lys Glu Lys Pro Leu Met Gly Vai Vai Lys Ala Vai Ser His Lys -Ile 35 40 45 AGI GAG GGT TGC AAA TGC GTT AAA GAA GGC GAT GTG ATC GCT TTT GGC 312 Ser Glu Gly Cys Lys Cys Vai Lys Glu Gly Asp Vai Ile Ala Phe Gly 50 55 60 AAA TAC AAA GGC GCA GAA ATC GTT TTA GAT GGC GTT GAA TAC ATG GTG 360 Lys Tyr Lys Gly Ala Glu Ile Vai Leu Asp Gly Vai Glu Tyr Met Vai 65 70 75 CTA GAA CTA GAA GAC ATT CTA GGT ATT GTG GGC TCA GGC TCT TGC TGT 408 Leu Glu Leu Glu Asp Ile Leu Gly Ile Vai Gly Ser Gly Ser Cys Cys 80 85 90 95 CAT ACA GGT AAT CAT GAT CAT AAA CAT GCT AAA GAG CAT GAA GCT TGC 456 Hls Thr Gly Asn Hls Asp Hls Lys His Ala Lys Glu His Glu Ala Cys 100 105 110 TGT CAT GAT CAC AAA AAA CAC TAAAAAACAT TATTATTAAG GATACAAA ATG 508 Cys His Asp Hls Lys Lys Hls Met 115 1 GCA AAA GAA ATC AAA TTT TCA GAT AGC GCA AGA AAC CTT TTA TTT GAA 556 Ala Lys Glu Ile Lys Phe Ser Asp Ser Ala Arg Asn Leu Leu Phe Glu 5 10 15 GGC GTA AGA CAA CTC CAT GAC GCT GTC AAA GTA ACC ATG GGG CCA AGA 604 Gly Vai Arg Gin Leu Hls Asp Ala Vai Lys Vai Thr Met Gly Pro Arg 20 25 30 GGC AGG AAC GTG TTG ATC CAA AAA AGC TAT GGC GCT CCA AGC ATC ACC 652 Gly Arg Asn Vai Leu Ile Gin Lys Ser Tyr Gly Ala Pro Ser Ile Thr 35 40 45 94 AAA GAC GGC GTG AGC GTG GCT AAA GAG ATT GAA TTA AGT TGC CCC GTG 700 Lys Asp Gly Vai Ser Vai Ala Lys Glu Ile Glu Leu Ser Cys Pro Vai 50 55 60 65 GCT AAC ATG GGC GCT CAG CTC GTT AAA GAA GAT GCG AGC AAA ACC GCT 748 Ala Asn Met Gly Ala Gin Leu Vai Lys Glu Asp Ala Ser Lys Thr Ala 70 75 80 GAT GCC GCC GGC GAT GGC ACG ACC ACA GCG ACC GTG CTG GCT TAT AGC 796 Asp Ala Ala Gly Asp Gly Thr Thr Thr Ala Thr Vai Leu Ala Tyr Ser 85 90 95 ATT TTT AAA GAG GGC TTG AGG AAT ATC ACG GCT GGG GCT AAC CCT ATT 844 Ile Phe Lys Glu Gly Leu Arg Asn Ile Thr Ala Gly Ala Asn Pro Ile 100 105 110 GAA GTG AAA CGA GGC ATG GAT AAA GCG CCT GAA GCG ATC ATT AAT GAG 892 Glu Vai Lys Arg Gly Met Asp Lys Ala Pro Glu Ala Ile Ile Asn Glu 115 120 125 CTT AAA AAA GCG AGC AAA AAA GTG GGC GGT AAA GAA GAA ATC ACC CAA 940 Leu Lys Lys Ala Ser Lys Lys Vai Gly Gly Lys Glu Glu Ile Thr Gin 130 135 140 145 GTA GCG ACC ATT TCT GCA AAC TCC GAT CAC AAT ATC GGG AAA CTC ATC 988 Vai Ala Thr lie Ser Ala Asn Ser Asp Hls Asn Ile Gly Lys Leu Ile 150 155 160 GCT GAC GCT ATG GAA AAA GTG GGT AAA GAC GGC GTG ATC ACC GTT GAA 1036 Ala Asp Ala Met Glu Lys Vai Gly Lys Asp Gly Vai Ile Thr Vai Glu 165 170 175 GAA GCT AAG GGC ATT GAA GAT GAA TTA GAT GTC GTA GAA GGC ATG CAA 1084 Glu Ala Lys Gly Ile Glu Asp Glu Leu Asp Vai Vai Glu Gly Met Gin 180 185 190 TTT GAT AGA GGC TAC CTC TCC CCT TAC TTT GTA ACC AAC GCT GAG AAA 1132 Phe Asp Arg Gly Tyr Leu Ser Pro Tyr Phe Vai Thr Asn Ala Glu Lys 195 200 205 ATG ACC GCT CAA TTG GAT AAC GCT TAC ATC CTT TTA ACG GAT AAA AAA 1180 Met Thr Ala Gin Leu Asp Asn Ala Tyr Ile Leu Leu Thr Asp Lys Lys 210 215 220 225 ATC TCT AGC ATG AAA GAC ATT CTC CCG CTA CTA GAA AAA ACC ATG AAA 1228 Ile Ser Ser Met Lys Asp Ile Leu Pro Leu Leu Glu Lys Thr Met Lys 230 235 240 GAG GGC AAA CCG CTT TTA ATC ATC GCT GAA GAC ATT GAG GGC GAA GCT 1276 Glu Gly Lys Pro Leu Leu Ile Ile Ala Glu Asp Ile Glu Gly Glu Ala 245 250 255 95 ΤΤΑ ACG ACT CTA GTG GTG AAT AAA TTA AGA GGC GTG TTG AAT ATC GCA 1324 Leu Thr Thr Leu Vai Vai Asn Lys Leu Arg Gly Vai Leu Asn Ile Ala 260 265 270 GCG GTT AAA GCT CCA GGC TTT GGG GAC AGG AGA AAA GAA ATG CTC AAA 1372 Ala Vai Lys Ala Pro Gly Phe Gly Asp Arg Arg Lys Glu Met Leu Lys 275 280 285 GAC ATC GCT GTT TTA ACC GGC GGT CAA GTC ATT AGC GAA GAA TTG GGC 1420 Asp Ile Ala Vai Leu Thr Gly Gly Gin Vai Ile Ser Glu Glu Leu Gly 290 295 300 305 TTG AGT CTA GAA AAC GCT GAA GTG GAG TTT TTA GGC AAA GCG AAG ATT 1468 Leu Ser Leu Glu Asn Ala Glu Vai Glu Phe Leu Gly Lys Ala Lys Ile 310 315 320 GTG ATT GAC AAA GAC AAC ACC ACG ATC GTA GAT GGC AAA GGC CAT AGC 1516 Vai Ile Asp Lys Asp Asn Thr Thr Ile Vai Asp Gly Lys Gly His Ser 325 330 335 CAT GAC GTC AAA GAC AGA GTC GCG CAA ATC AAA ACC CAA ATT GCA AGC 1564 His Asp Vai Lys Asp Arg Vai Ala Gin Ile Lys Thr Gin Ile Ala Ser 340 345 350 ACG ACA AGC GAT TAC GAC AAA GAA AAA TTG CAA GAA AGA TTG GCC AAA 1612 Thr Thr Ser Asp Tyr Asp Lys Glu Lys Leu Gin Glu Arg Leu Ala Lys 355 360 365 CTC TCT GGC GGT GTG GCT GTG ATT AAA GTG GGC GCT GCG AGT GAA GTG 1660 Leu Ser Gly Gly Vai Ala Vai Ile Lys Vai Gly Ala Ala Ser Glu Vai 370 375 380 385 GAÃ ATG AAA GAG AAA AAA GAC CGG GTG GAT GAC GCG TTG AGC GCG ACT 1708 Glu Met Lys Glu Lys Lys Asp Arg Vai Asp Asp Ala Leu Ser Ala Thr 390 395 400 AAA GCG GCG GTT GAA GAA GGC ATT GTG ATT GGG GGC GGT GCG GCC CTC 1756 Lys Ala Ala Vai Glu Glu Gly Ile Vai Ile Gly Gly Gly Ala Ala Leu 405 410 415 ATT CGC GCG GCC CAA AAA GTG CAT TTG AAT TTA CAC GAT GAT GAA AAA 1804 Ile Arg Ala Ala Gin Lys Vai His Leu Asn Leu His Asp Asp Glu Lys 420 425 430 GTG GGC TAT GAA ATC ATC ATG CGC GCC ATT AAA GCC CCA TTA GCT CAA 1852 Vai Gly Tyr Glu Ile Ile Met Arg Ala Ile Lys Ala Pro Leu Ala Gin 435 440 445 ATC GCT ATC AAT GCC GGT TAT GAT GGC GGT GTG GTC GTG AAT GAA GTA 1900 Ile Ala Ile Asn Ala Gly Tyr Asp Gly Gly Vai Vai Vai Asn Glu Vai 450 455 460 465 GAA AAA CAC GAA GGG CAT TTT GGT TTT AAC GCT AGC AAT GGC AAG TAT 1948 Glu Lys His Glu Gly His Phe Gly Phe Asn Ala Ser Asn Gly Lys Tyr 470 475 480 96 GTG GAC ATG TTT AAA GAA GGC ATT ATT GAC CCC TTA AAA GTA GAA AGG 1996 Vai Asp Met Phe Lys Glu Gly Ile Ile Asp Pro Leu Lys Vai Glu Arg 485 490 495 ATC GCT TTA CAA AAT GCG GTT TCG GTT TCA AGC CTG CTT TTA ACC ACA 2044 Ile Ala Leu Gin Asn Ala Vai Ser Vai Ser Ser Leu Leu Leu Thr Thr 500 505 510 GAA GCC ACC GTG CAT GAA ATC AAA GAA GAA AAA GCG GCC CCA GCA ATG 2092 Glu Ala Thr Vai His Glu Ile Lys Glu Glu Lys Ala Ala Pro Ala Met 515 520 525 CCT GAT ATG GGT GGC ATG GGC GGA ATG GGA GGC ATG GGC GGC ATG ATG 2140 Pro Asp Met Gly Gly Met Gly Gly Met Gly Gly Met Gly Gly Met Met 530 535 540 545 TAAGCCCCCT TGCTTTTTGG TATCATCTGC TTTTAAAATC CATCTTCTAG AATCCCCCCT 2200 TCTAAAATCC CTTTTTTGGG GGGTGCTTTT GGTTTGATAA AACCGCTCGC TTTTAAAAAC 2260 GCGCAAGAAA AAACTCTGTT AAGC 2284 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO: 5: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 545 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: proteína (vi) FONTE ORIGINAL: (A) ORGANISMO: Helicobacter pylori (ix) CARACTERÍSTICA: (A) NOME/CHAVE: Proteína (B) LOCALIZAÇÃO: 1..545 (D) OUTRA INFORMAÇÃO: /nota= "Corresponde à figura 7A" 97 (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:5:
Met Ala Lys Glu Ile Lys Phe Ser Asp Ser Ala Arg Asn Leu Leu Phe 1 5 10 15 Glu Gly Vai Arg Gin Leu His Asp Ala Vai Lys Vai Thr Met Gly Pro 20 25 30 Arg Gly Arg Asn Vai Leu Ile Gin Lys Ser Tyr Gly Ala Pro Ser Ile 35 40 45 Thr Lys Asp Gly Vai Ser Vai Ala Lys Glu Ile Glu Leu Ser Cys Pro 50 55 60 Vai Ala Asn Met Gly Ala Gin Leu Vai Lys Glu Asp Ala Ser Lys Thr 65 70 75 80 Ala Asp Ala Ala Gly Asp Gly Thr Thr Thr Ala Thr Vai Leu Ala Tyr 85 90 95 Ser Ile Phe Lys Glu Gly Leu Arg Asn Ile Thr Ala Gly Ala Asn Pro 100 105 110 Ile Glu Vai Lys Arg Gly Met Asp Lys Ala Pro Glu Ala Ile Ile Asn 115 120 125 Glu Leu Lys Lys Ala Ser Lys Lys Vai Gly Gly Lys Glu Glu Ile Thr 130 135 140 Gin Vai Ala Thr Ile Ser Ala Asn Ser Asp Hls Asn Ile Gly Lys Leu 145 150 155 160 Ile Ala Asp Ala Met Glu Lys Vai Gly Lys Asp Gly Vai Ile Thr Vai 165 170 175 Glu Glu Ala Lys Gly Ile Glu Asp Glu Leu Asp Vai Vai Glu Gly Met 180 185 190 Gin Phe Asp Arg Gly Tyr Leu Ser Pro Tyr Phe Vai Thr Asn Ala Glu 195 200 205 Lys Met Thr Ala Gin Leu Asp Asn Ala Tyr Ile Leu Leu Thr Asp Lys 210 215 220 Lys Ile Ser Ser Met Lys Asp Ile Leu Pro Leu Leu Glu Lys Thr i Met 225 230 235 240 98
Lys Glu Gly Lys Pro Leu Leu 245
Ala Leu Thr Thr Leu Vai Vai 260
Ala Ala Vai Lys Ala Pro Gly 275
Lys Asp Ile Ala Vai Leu Thr 290 295
Gly Leu Ser Leu Glu Asn Ala 305 310
Ile Vai Ile Asp Lys Asp Asn 325
Ser His Asp Vai Lys Asp Arg 340
Ser Thr Thr Ser Asp Tyr Asp 355
Lys Leu Ser Gly Gly Vai Ala 370 375
Vai Glu Met Lys Glu Lys Lys 385 390
Thr Lys Ala Ala Vai Glu Glu 405
Leu Ile Arg Ala Ala Gin Lys 420
Lys Vai Gly Tyr Glu Ile Ile 435
Gin Ile Ala Ile Asn Ala Gly 450 455
Vai Glu Lys His Glu Gly His 465 470
Tyr Vai Asp Met Phe Lys Glu 485
Arg Ile Ala Leu Gin Asn Ala 500
Ala Glu Asp Ile Glu Gly Glu 250 255
Leu Arg Gly Vai Leu Asn Ile 270 Asp Arg Arg Lys Glu Met Leu 285 Gin Vai Ile Ser Glu Glu Leu 300 Glu Phe Leu Gly Lys Ala Lys 315 320 Ile Vai Asp Gly Lys Gly His 330 335 Gin Ile Lys Thr Gin Ile Ala 350 Lys Leu Gin Glu Arg Leu Ala 365 Lys Vai Gly Ala Ala Ser Glu 380 Vai Asp Asp Ala Leu Ser Ala 395 400 Vai Ile Gly Gly Gly Ala Ala 410 415 Leu Asn Leu His Asp Asp Glu 430 Ala Ile Lys Ala Pro Leu Ala 445 Gly Gly Vai Vai Vai Asn Glu 460 Phe Asn Ala Ser Asn Gly Lys 475 480 Ile Asp Pro Leu Lys Vai Glu 490 495 Vai Ser Ser Leu Leu Leu Thr 510
Thr Glu Ala Thr Vai His Glu Ile Lys Glu Glu Lys Ala Ala Pro Ala 515 520 525
Het Pro Asp Met Gly Gly Met Gly Gly Met Gly Gly Met Gly Gly Met 530 535 540
Met 545 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO: 6: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 118 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: proteína (vi) FONTE ORIGINAL: (A) ORGANISMO: Helicobacter pylori (ix) CARACTERÍSTICA: (A) NOME/CHAVE: Proteína (B) LOCALIZAÇÃO: 1..569 (D) OUTRA INFORMAÇÃO: /nota= "Corresponde à figura 7B." (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:6:
Met Lys Phe Gin Pro Leu Gly Glu Arg Vai Leu Vai Glu Arg Leu Glu 1 5 10 15
Glu Glu Asn Lys Thr Ser Ser Gly Ile Ile Ile Pro Asp Asn Ala Lys 20 25 30 100
Glu Lys Pro Leu Met Gly Vai Vai Lys Ala Vai Ser His Lys Ile Ser 35 40 45 Glu Gly Cys Lys Cys Vai Lys Glu Gly Asp Vai Ile Ala Phe Gly Lys 50 55 60 Tyr Lys Gly Ala Glu Ile Vai Leu Asp Gly Vai Glu Tyr Met Vai Leu 65 70 75 80 Glu Leu Glu Asp Ile Leu Gly Ile Vai Gly Ser Gly Ser Cys Cys His 85 90 95 Thr Gly Asn His Asp Hls Lys His Ala Lys Glu His Glu Ala Cys Cys 100 105 110 His Asp Hls Lys Lys His 115 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO: 7: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 591 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico) (vi) FONTE ORIGINAL: (A) ORGANISMO: H. felis (ix) CARACTERÍSTICA:
(A) NOME/CHAVE: CDS (B) LOCALIZAÇÃO: 1..591 (D) OUTRA INFORMAÇÃO: /nome_comum= "URE I" 101 (ix) CARACTERÍSTICA: (A) NOME/CHAVE: características diversas (B) LOCALIZAÇÃO: 1..591 (D) OUTRA INFORMAÇÃO: /nota= "Corresponde à figura 9." (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 7: ATG TTA GGT CTT GTG TTA TTG TAT GTT GCG GTC GTG CTG ATC AGC AAC 48 Met Leu Gly Leu Vai Leu Leu Tyr Vai Ala Vai Vai Leu Ile Ser Asn 1 5 10 15 GGA GTT AGT GGG CTT GCA AAT GTG GAT GCC AAA AGC AAA GCC ATC ATG 96 Gly Vai Ser Gly Leu Ala Asn Vai Asp Ala Lys Ser Lys Ala Ile Met 20 25 30 AAC TAC TTT GTG GGG GGG GAC TCT CCA TTG TGT GTA ATG TGG TCG CTA 144 Asn Tyr Phe Vai Gly Gly Asp Ser Pro Leu Cys Vai Met Trp Ser Leu 35 40 45 TCA TCT TAT TCC ACT TTC CAC CCC ACC CCC CCT GCA ACT GGT CCA GAA 192 Ser Ser Tyr Ser Thr Phe His Pro Thr Pro Pro Ala Thr Gly Pro Glu 50 55 60 GAT GTC GCG CAG GTG TCT CAA CAC CTC ATT AAC TTC TAT GGT CCA GCG 240 Asp Vai Ala Gin Vai Ser Gin His Leu Ile Asn Phe Tyr Gly Pro Ala 65 70 75 80 ACT GGT CTA TTG TTT GGT TTT ACC TAC TTG TAT GCT GCC ATC AAC AAC 288 Thr Gly Leu Leu Phe Gly Phe Thr Tyr Leu Tyr Ala Ala Ile Asn Asn 85 90 95 ACT TTC AAT CTC GAT TGG AAA CCC TAT GGC TGG TAT TGC TTG TTT GTA 336 Thr Phe Asn Leu Asp Trp Lys Pro Tyr Gly Trp Tyr Cys Leu Phe Vai 100 105 110 ACC ATC AAC ACT ATC CCA GCG GCC ATT CTT TCT CAC TAT TCC GAT GCG 384 Thr Ile Asn Thr Ile Pro Ala Ala Ile Leu Ser His Tyr Ser Asp Ala 115 120 125 CTT GAT GAT CAC CGC CTC TTA GGA ATC ACT GAG GGC GAT TGG TGG GfcT 432 Leu Asp Asp His Arg Leu Leu Gly Ile Thr Glu Gly Asp Trp Trp Ala 130 135 140 TTC ATT TGG CTT GCT TGG GGT GTT TTG TGG CTC ACT GGT TGG ATT GAA 480 Phe Ile Trp Leu Ala Trp Gly Vai Leu Trp Leu Thr Gly Trp Ile Glu 145 150 155 160 TGC GCA CTT GGT AAG AGT CTA GGT AAA TTT GTT CCA TGG CTT GCC ATC 528 Cys Ala Leu Gly Lys Ser Leu Gly Lys Phe Vai Pro Trp Leu Ala Ile 165 170 175 102 576 GTC GAG GGC GTG ATC ACC GCT TGG ATT CCT GCT TGG CTA CTC TTT ATC Vai Glu Gly Vai Ile Thr Ala Ttp Ile Pro Ala Trp Leu Leu Phe Ile 180 185 190 CAA CAC TGG TCT TGA 591
Gin His Trp Ser 195 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO: 8: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 199 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) CADEIA: desconhecida (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: proteína (vi) FONTE ORIGINAL: (A) ORGANISMO: H. felis (ix) CARACTERÍSTICA: (A) NOME/CHAVE: Proteína (B) LOCALIZAÇÃO: 1..199 (D) OUTRA INFORMAÇÃO: /nota= "Corresponde à figura 10." (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:8:
Lys Gly Trp Met Leu Gly Leu Vai Leu Leu Tyr Vai Ala Vai Vai Leu 15 10 15
Ile Ser Asn Gly Vai Ser Gly Leu Ala Asn Vai Asp Ala Lys Ser Lys 20 25 30 103
Ala Ile Met Asn Tyr Phe Vai Gly Gly Asp Ser Pro Leu Cys Vai Met 35 40 45 Trp Ser Leu Ser Ser Tyr Ser Thr Phe His Pro Thr Pro Pro Ala Thr 50 55 60 Gly Pro Glu Asp Vai Ala Gin Vai Ser Gin His Leu Ile Asn Phe Tyr 65 70 75 80 Gly Pro Ala Thr Gly Leu Leu Phe Gly Phe Thr Tyr Leu Tyr Ala Ala 85 90 95 Ile Asn Asn Thr Phe Asn Leu Asp Trp Lys Pro Tyr Gly Trp Tyr Cys 100 105 110 Leu Phe Vai Thr Ile Asn Thr Ile Pro Ala Ala Ile Leu Ser His Tyr 115 120 125 Ser Asp Ala Leu Asp Asp His Arg Leu Leu Gly Ile Thr Glu Gly Asp 130 135 140 Trp Trp Ala Phe Ile Trp Leu Ala Trp ' Gly - Vai Leu i Trp Leu Thr Gly 145 150 155 160 Trp Ile Glu Cys Ala Leu Gly Lys Ser Leu Gly Lys í Phe Vai Pro Trp 165 170 175 Leu Ala Ile Vai Glu Gly Vai Ile Thr Ala Trp Ile : Pro Ala Trp Leu 180 185 190 Leu Phe Ile Gin His Trp Ser 195 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO: 9: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 27 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) CADEIA: desconhecida (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: proteína 104 (v) TIPO DE FRAGMENTO: C-terminal (vi) FONTE ORIGINAL: (A) ORGANISMO: H. pylori (ix) CARACTERÍSTICA: (A) NOME/CHAVE: Proteína (B) LOCALIZAÇÃO: 1..27 (D) OUTRA INFORMAÇÃO: /nota= "Corresponde à sequência mencionada na página 13 da descrição." (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:9:
Gly Ser Cys Cys His Thr Gly Asn His Asp His Lys His Ala Lys Glu 1 5 10 15
His Glu Ala Cys Cys His Asp His Lys Lys His 20 25 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO: 10: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 27 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) CADEIA: dupla (D) TOPOLOGIA: desconhecida (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico) (ix) CARACTERÍSTICA: 105 (A) NOME/CHAVE: características diversas (B) LOCALIZAÇÃO: 1..27 (D) OUTRA INFORMAÇÃO: /nota= "Corresponde ao iniciador 1D da tabela 2 (página 51). " (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 10: CAUCCTNAARG ARYTNGAYAA RYTNATG 27 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO: 11: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 30 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) CADEIA: dupla (D) TOPOLOGIA: desconhecida (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico) (ix) CARACTERÍSTICA: (A) NOME/CHAVE: caracteristicas diversas (B) LOCALIZAÇÃO: 1..27 (D) OUTRA INFORMAÇÃO: /nota= "Corresponde ao iniciador IR da tabela 2 (página 51). " (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 11: YTCYTTNCGN GGNSWDATYT TYTTCATCUA 30 106 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO: 12: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 38 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) CADEIA: dupla (D) TOPOLOGIA: desconhecida (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico) (ix) CARACTERÍSTICA: (A) NOME/CHAVE: caracteristicas diversas (B) LOCALIZAÇÃO: 1..38 (D) OUTRA INFORMAÇÃO: /nota= "Corresponde ao iniciador 2D da tabela 2 (página 51 da descrição)." (ix) CARACTERÍSTICA: (A) NOME/CHAVE: caracteristicas diversas (B) LOCALIZAÇÃO: 6..11 (D) OUTRA INFORMAÇÃO: /nota= "Local de restrição introduzido no fragmento amplificado (EcoRI)" (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 12: CCGGAGAATT CATTAGCAGA AAAGAATATG TTTCTATG 38 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO: 13: (i) CARACTERISTICAS DA SEQUÊNCIA: 107 (A) COMPRIMENTO: 38 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) CADEIA: dupla (D) TOPOLOGIA: desconhecida (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico) (ix) CARACTERÍSTICA: (A) NOME/CHAVE: caracteristicas diversas (B) LOCALIZAÇÃO: 1..38 (D) OUTRA INFORMAÇÃO: /nota= "Corresponde ao iniciador 2R da tabela 2 (página 51)." (ix) CARACTERISTICA: (A) NOME/CHAVE: caracteristicas diversas (B) LOCALIZAÇÃO: 6..11 (D) OUTRA INFORMAÇÃO: /nota= "Local de restrição introduzido no fragmento amplificado (PstI)." (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 13: ACGTTCTGCA GCTTACGAAT AACTTTTGTT GCTTGAGC 38 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO: 14: (i) CARACTERISTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 20 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico 108 (C) CADEIA: dupla (D) TOPOLOGIA: desconhecida (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico) (ix) CARACTERÍSTICA: (A) NOME/CHAVE: características diversas (B) LOCALIZAÇÃO: 1..20 (D) OUTRA INFORMAÇÃO: /nota= "Corresponde ao iniciador 3D da tabela 2 (página 51)." (ix) CARACTERÍSTICA: (A) NOME/CHAVE: características diversas (B) LOCALIZAÇÃO: 1..6 (D) OUTRA INFORMAÇÃO: /nota= "Local de restrição introduzido no fragmento amplificado (BamHI)." (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 14: GGATCCAAAA AGATTTCACG 20 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO: 15: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 30 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) CADEIA: dupla (D) TOPOLOGIA: desconhecida 109 (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico) (ÍX) CARACTERÍSTICA: (A) NOME/CHAVE: características diversas (B) LOCALIZAÇÃO: 1..30 iniciador (D) OUTRA INFORMAÇÃO: /nota= "Corresponde ao 3R da tabela 2 (página 51)." (ix) CARACTERÍSTICA: (A) NOME/CHAVE: características diversas (B) LOCALIZAÇÃO: 3..8 restrição (D) OUTRA INFORMAÇÃO: /nota= "Local de introduzido no fragmento amplificado (Hindlll)." (ix) CARACTERÍSTICA: (A) NOME/CHAVE: características diversas (B) LOCALIZAÇÃO: 9..14 restrição (D) OUTRA INFORMAÇÃO: /nota= "Local de introduzido no fragmento amplificado (PstI)." (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 15: GGAAGCTTCT GCAGGTGTGC TTCCCCAGTC 30 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO: 16: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 38 pares de bases 110 (B) TIPO: ácido nucleico (C) CADEIA: dupla (D) TOPOLOGIA: desconhecida (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico) (ix) CARACTERÍSTICA: (A) NOME/CHAVE: características diversas (B) LOCALIZAÇÃO: 1..38 (D) OUTRA INFORMAÇÃO: /nota= "Corresponde ao oligo 1 da página 69." (ix) CARACTERÍSTICA: (A) NOME/CHAVE: caracteristicas diversas (B) LOCALIZAÇÃO: 6..11 (D) OUTRA INFORMAÇÃO: /nota= "Local de restrição EcoRI" (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 16: CCGGAGAATT CAAGTTTCAA CCATTAGGAG AAAGGGTC 38 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO: 17: (i) CARACTERISTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 38 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) CADEIA: dupla (D) TOPOLOGIA: desconhecida 111 (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico) (ix) CARACTERÍSTICA: (A) NOME/CHAVE: características diversas (B) LOCALIZAÇÃO: 1..38 (D) OUTRA INFORMAÇÃO: /nota= "Corresponde ao oligo 2 da página 69." (ix) CARACTERÍSTICA: (A) NOME/CHAVE: caracteristicas diversas (B) LOCALIZAÇÃO: 6..11 (D) OUTRA INFORMAÇÃO: /nota= "Local de restrição PstI" (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 17: ACGTTCTGCA GTTTAGTGTT TTTTGTGATC ATGACAGC 38 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO: 18: (i) CARACTERISTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 38 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) CADEIA: dupla (D) TOPOLOGIA: desconhecida (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico) (ix) CARACTERÍSTICA: 112 (A) NOME/CHAVE: características diversas (B) LOCALIZAÇÃO: 1..38 (D) OUTRA INFORMAÇÃO: /nota= "Corresponde ao oligo 3 da página 69." (ix) CARACTERÍSTICA: (A) NOME/CHAVE: caracteristicas diversas (B) LOCALIZAÇÃO: 6..11 (D) OUTRA INFORMAÇÃO: /nota= "Local de restrição EcoRI" (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 18: CCGGAGAATT CGCAAAAGAA ATCAAATTTT CAGATAGC 38 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO: 19: (i) CARACTERISTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 38 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) CADEIA: dupla (D) TOPOLOGIA: desconhecida (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico) (ix) CARACTERÍSTICA: (A) NOME/CHAVE: caracteristicas diversas (B) LOCALIZAÇÃO: 1..38 113 (D) OUTRA INFORMAÇÃO: /nota= "Corresponde ao oligo 4 da página 69." (ix) CARACTERÍSTICA: (A) NOME/CHAVE: características diversas (B) LOCALIZAÇÃO: 6..11 (D) OUTRA INFORMAÇÃO: /nota= "Local de restrição PstI" (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 19: ACGTTCTGCA GATGATACCA AAAAGCAAGG GGGCTTAC 38 30-08-2007 114

Claims (22)

  1. REIVINDICAÇÕES 1. Composição imunogénica capaz de induzir anticorpos contra Helicobacter, caracterizada por compreender ou (i) a Proteína de Choque Térmico HSP A, codificada pelo gene hsp A do plasmídeo plLL689 (CNCM 1-1356), ou (ii) um fragmento da referida HSP A com pelo menos 6 aminoácidos, ou (iii) uma variante de polipéptido da referida HSP A, na qual os aminoácidos foram substituídos, inseridos ou deletados, exibindo a referida variante de polipéptido pelo menos 75% de identidade com a referida HSP A, em que o referido fragmento de variante de polipéptido aumenta a actividade de urease num microrganismo capaz de expressar uma urease activa.
  2. 2. Composição imunogénica e acordo com a Reivindicação 1 capaz de induzir anticorpos que protegem contra infecção por Helicobacter spp.
  3. 3. Composição farmacêutica para utilização como vacina na protecção contra infecção por Helicobacter, particularmente contra Helicobacter pylori e Helicobacter felis, caracterizada por compreender a composição imunogénica de qualquer das Reivindicações 1 e 2, em combinação com excipiente (s) fisiologicamente aceitáveis e possivelmente adjuvantes .
  4. 4. Material proteico, caracterizado por compreender ou consistir em 1 (i) A Proteína de Choque Térmico HSPA de Helicobacter pylori com a seguinte sequência de aminoácidos: met lys phe gin pro leu gly glu arg vai leu vai glu arg leu glu glu glu asn lys thr ser ser gly ile ile ile pro asp asn ala lys glu lys pro leu met gly vai vai lys ala vai ser his lys ile ser glu gly cys lys cys vai lys glu gly asp vai ile ala phe gly lys tyr lys gly ala glu ile vai leu asp gly vai glu tyr met vai leu glu leu glu asp ile leu gly ile vai gly ser gly ser cys cys his thr gly asn his asp his lys his ala lys glu his glu ala cys cys his asp his lys lys his (ii) um fragmento de HSPA tal como definida em (i), compreendendo o referido fragmento pelo menos 6 aminoácidos consecutivos da sequência de aminoácidos definida em (i) ; ou, (iii) uma variante de polipéptido da sequência de aminoácidos definida em (i), na qual foram substituídos, inseridos ou removidos aminoácidos, tendo a referida variante de polipéptido pelo menos 75%, e preferivelmente pelo menos 80% de identidade com a sequência de aminoácidos definida em (i), em que o referido fragmento ou variante de polipéptido aumenta a actividade de urease num microrganismo capaz de expressar uma urease activa.
  5. 5. Material proteico de acordo com a Reivindicação 4, caracterizado por compreender ou consistir em sequência C-terminal de HSP A: GSCCHTGNHDHKHAKEHEACCHDHKKH 2 ou um fragmento compreendendo pelo menos 6 aminoácidos desta sequência.
  6. 6. Sequência de ácidos nucleicos, caracterizada por consistir em: (i) uma sequência que codifique para o material proteico de qualquer uma das Reivindicações 4 a 5; ou (ii) uma sequência complementar à sequência (i); ou (iii) uma sequência capaz de hibridar com a sequência (i) ou (ii) sob condições restringentes, sendo as referidas condições restringentes definidas como se segue: - 5 x SSC; 50 % de formamida a 37°C ou - 6 x SSC, meio de Denhard a 6 8 0 C; ou (iv) um fragmento de qualquer das sequências (i), (ii) ou (iii) apropriado para utilização como sonda específica para a detecção in vivo da infecção por Helicobacter, compreendendo pelo menos 45 nucleótidos.
  7. 7. Sequência de nucleótidos de acordo com a Reivindicação 6 caracterizada por consistir na totalidade ou parte da sequência do plasmídeo pILL689 (CNCM 1-1356), em particular a sequência que codifica para HSP A, ou uma sequência complementar a esta, ou uma sequência capaz de hibridar a esta sequência sob condições restringentes, sendo as referidas condições restringentes definidas como se segue: -5 x SSC; 50 % de formamida a 37°C ou - 6 x SSC, meio de Denhard a 68°C.
  8. 8. Vector de expressão caracterizado por conter uma sequência de ácido nucleico de acordo com a Reivindicação 6 ou 7. 3
  9. 9. Plasmídeo pILL689 (CNCM 1-1356).
  10. 10. Oligonucleótido adequado para utilização como iniciador numa reacção de amplificação de ácidos nucleicos de um fragmento HSP A, caracterizado por compreender de 10 a 100 nucleótidos consecutivos da sequência da Reivindicação 6 ou 7, e por hibridar com a extremidade 5' ou 3' dos fragmentos HSPA a serem amplificados.
  11. 11. Sonda nucleotídica, caracterizada por compreender uma sequência de acordo com qualquer uma das Reivindicações 6 ou 7, com um meio de marcação apropriado.
  12. 12. Microrganismo, estavelmente transformado por um vector de expressão de acordo com a reivindicação 8 ou um plasmideo de acordo com a Reivindicação 9.
  13. 13. Anticorpos monoclonais ou policlonais ou seus fragmentos, dirigidos ao material proteico das Reivindicações 4 a 5, caracterizados por serem ou específicos para o material de Helicobacter pylori ou, alternativamente apresentarem reacção cruzadas imunológicas com proteínas do tipo GroES de bactérias diferentes de Helicobacter pylori.
  14. 14. Anticorpos monoclonais ou policlonais de acordo com a Reivindicação 13 caracterizados por reconhecerem especificamente a sequência C-terminal de HSP A.
  15. 15. Utilização da composição imunogénica da Reivindicação 1 para a preparação de uma vacina adequada para utilização no ser humano e em animais contra a infecção por Helicobacter, 4 particularmente contra Helicobacter pylori, e Helicobacter felis.
  16. 16. Utilização dos anticorpos das Reivindicações 13 a 14 para a preparação de uma composição terapêutica para o tratamento de infecção por Helicobacter, em particular Helicobacter pylori, Helicobacter heilmannii e Helicobacter felis em seres humanos ou animais.
  17. 17. Método para a produção de uma composição farmacêutica de acordo com a Reivindicação 3, caracterizada pela cultura de um microrganismo transformado de acordo com a Reivindicação 12, recolha e purificação do material HSP de Helicobacter, e combinação destes materiais com excipientes, adjuvantes e, opcionalmente, outros aditivos adequados.
  18. 18. Utilização de sequências nucleotidicas da Reivindicação 11 para a detecção in vitro numa amostra biológica, de uma infecção por Helicobacter, opcionalmente logo após uma reacção de amplificação de genes.
  19. 19. Kit para a detecção in vitro de infecção por Helicobacter, caracterizado por compreender: - uma sonda nucleotidica de acordo com a Reivindicação 11; - um meio apropriado para levar a cabo a reacção de hibridação entre o ácido nucleico de Helicobacter e a sonda; - reagentes para a detecção dos híbridos formados.
  20. 20. Material proteico caracterizado por compreender uma proteína de fusão ou mista incluindo pelo menos uma subunidade da proteína de choque térmico HSP A de 5 Helicobacter ou um seu fragmento, tal como definida em qualquer uma das Reivindicações 4 a 5.
  21. 21. Anticorpos purificados em soro caracterizado por ser obtido por imunização de um animal com a composição imunogénica de acordo com qualquer uma das Reivindicações 1 a 2, ou com a composição farmacêutica de acordo com a reivindicação 3, ou com o material proteico ou fragmento de qualquer uma das Reivindicações 4 a 5 ou com a proteína de fusão ou mista da Reivindicação 20, sendo os referidos anticorpos purificados específicos para a chaperonina de HSP A, com a seguinte sequência de aminoácidos: met lys phe gin pro leu gly glu arg vat leu vai glu arg leu glu glu glu asn lys thr ser ser gly ile ile ile pro asp asn ala lys glu lys pro leu met gly vai vai lys ala vai ser his lys ile ser glu gly cys lys cys vai lys glu gly asp vai ile ala phe gly lys tyr lys gly ala glu ile vai leu asp gly vai glu tyr met vai leu glu leu glu asp ile leu gly ile vai gly ser gly ser cys cys his thr gly asn his asp his lys his ala lys glu his glu ala cys cys his asp his lys lys his
  22. 22. Kit compreendendo pelo menos os anticorpos purificados ou soro de acordo com a Reivindicação 21, e opcionalmente, meio apropriado ou excipientes para a administração dos anticorpos, ou métodos de marcação ou detecção para os anticorpos . 30-08-2007 6
PT94917653T 1993-05-19 1994-05-19 Composições imunogénicas contra infecção por helicobacter, polipéptidos para utilização nas composições e sequências de ácidos nucleicos que codificam para estes polipéptidos PT703981E (pt)

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
EP93401309 1993-05-19

Publications (1)

Publication Number Publication Date
PT703981E true PT703981E (pt) 2007-09-11

Family

ID=8214711

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PT94917653T PT703981E (pt) 1993-05-19 1994-05-19 Composições imunogénicas contra infecção por helicobacter, polipéptidos para utilização nas composições e sequências de ácidos nucleicos que codificam para estes polipéptidos

Country Status (1)

Country Link
PT (1) PT703981E (pt)

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US6258359B1 (en) Immunogenic compositions against helicobacter infection, polypeptides for use in the compositions, and nucleic acid sequences encoding said polypeptides
CA2144307C (en) Immunogenic compositions against helicobacter infection, polypeptides for use in the compositions and nucleic acid sequences encoding said polypeptides
US5527678A (en) CagB and CagC genes of helicobacter pylori and related compositions
EP0650527B1 (en) Improvement in borrelia burgdorferi diagnosis and prophylaxis
JP5349070B2 (ja) Ｐｏｒｐｈｏｒｙｍｏｎａｓｇｉｎｇｉｖａｌｉｓポリペプチドおよびヌクレオチド
US5916558A (en) Recombinant polypeptides and peptides, nucleic acids coding for the same and use of these polypeptides and peptides in the diagnostic of tuberculosis
JP5209163B2 (ja) Ｐ．ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ抗原組成物
Ferrero et al. Cloning, expression and sequencing of Helicobacter felis urease genes
JP2006166919A (ja) 空胞形成毒素欠損Ｈ．ｐｙｌｏｒｉおよび関連する方法
JP4358909B2 (ja) 歯周炎の診断および治療用のポルフィロモナス・ジンジバリス抗原
US6669940B2 (en) Recombinant fusobacterium necrophorum leukotoxin vaccine and preparation thereof
AU2001259138B2 (en) Recombinant fusobacterium necrophorum leukotoxin vaccine and preparation thereof
WO1996034624A1 (en) Immunogenic compositions against helicobacter infection, polypeptides for use in the compositions, and nucleic acid sequences encoding said polypeptides
Ho et al. Cloning and characterization of fxp, the flexible pilin gene of Aeromonas hydrophila
PT703981E (pt) Composições imunogénicas contra infecção por helicobacter, polipéptidos para utilização nas composições e sequências de ácidos nucleicos que codificam para estes polipéptidos
CA2253244A1 (en) A vaccine composition comprising helicobacter pylori flagellin polypeptide
AU724584B2 (en) Immunogenic compositions against helicobacter infection, polypeptides for use in the compositions and nucleic acid sequences encoding said polypeptides
WO1994020536A1 (en) Methods, compositions, and kits for diagnosing lyme disease
AU704821B2 (en) New 17-KDA brucella abortus antigen, recombinant polypeptides, nucleic acids coding for the same and use thereof in diagnostic and prophylactic methods and kits
CA2227171A1 (en) Icea gene and related methods
AU2007231821A1 (en) Porphyromonas gingivalis polypeptides and nucleotides