ES2310776T3

ES2310776T3 - Composiciones de vacuna que comprenden proteinas omp de neisseria gonorrhoeae y de neisseria meningitidis.

Info

Publication number: ES2310776T3
Application number: ES05003039T
Authority: ES
Inventors: Ralph C. Judd; Scott D. Manning
Original assignee: University of Montana
Current assignee: University of Montana
Priority date: 1998-10-22
Filing date: 1998-10-22
Publication date: 2009-01-16
Anticipated expiration: 2018-10-22
Also published as: EP1535928B1; EP1535928A3; CY1108412T1; EP1535928A2; PT1535928E; ATE401341T1

Abstract

Una composición de vacuna para la protección de un sujeto contra la enfermedad Neisseriana, que comprende, en un portador farmacéuticamente aceptable, una cantidad efectiva de un polipéptido elegido en el grupo consistente en: (a) la proteína de SEQ ID NeM.: 2 (b) la proteína de SEQ ID NeM.: 4 (c) un fragmento de péptido de SEQ ID NeM.: 2 ó 4, consistente en ocho más aminoácidos consecutivos de la misma; (d) una proteína o péptido que comparte al menos un 80% de identidad con cualquiera de las secuencias (a)-(b); y (e) una secuencia de cualquiera de (a) - (d) fusionada con un segundo polipéptido o proteína.

Description

Composiciones de vacuna que comprenden proteínas Omp de Neisseria gonorrhoeae y de Neisseria meningitidis.

Esta invención ha sido soportada por los Institutos Nacionales de Salud, Concesiones núms. AI21235 y AI37777. El gobierno de los Estados Unidos tiene interés en esta invención.

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Campo de la invención

Esta descripción se refiere en general a la clonación e identificación de nuevas proteínas de membrana externa de varias cepas de Neisseria, y más específicamente a proteína útiles en la prevención, terapia y/o diagnosis de infección y enfermedades en los mamíferos causadas por esas cepas.

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Antecedentes de la invención

Las Neisseriae patógenas causan varias infecciones importantes no sintomáticas y enfermedades sintomáticas en los humanos. Las Neisseriae gonorrhoeae son el agente de infección gonocócica no sintomática o de enfermedad sintomática, es decir, la gonorrea. La Neisseria meningitidis es el agente de una meningitis espinal rápidamente progresiva, que puede tener también una etapa de infección no sintomática. La superficie de tales patógenos proporciona interfaces cruciales para las interacciones entre el patógeno y el anfitrión. Muchos factores de virulencia bacteriana son las proteínas de la membrana externa, y las proteínas de la superficie al descubierto son los objetivos principales reconocidos y atacados por el sistema inmune del anfitrión. De ese modo, el papel de las proteínas de la membrana externa es de particular importancia para la comprensión de la patogénesis de estos organismos. Las proteínas de la membrana externa más abundantes e inmunodominantes, de la Neisseriae patógena, han sido estudiadas intensivamente [Sparlin P.F. et al., Clin. Invest., 89: 1699-1705 (1992)]. Por ejemplo, se conoce el hecho de que los componentes inmunodominantes de la superficie gonocócica son antigénicamente variantes, lo que sugiere que este organismo es capaz de adaptarse a la variación de los entornos ambientales del anfitrión, mientras evita las respuestas inmunes del anfitrión. Aunque las mayores proteínas de la superficie gonocócica han sido estudiadas intensivamente, se conoce poco acerca de proteínas menos abundantes y de su contribución a la patogénesis.

La electroforesis de dos dimensiones (IEF y SDS-PAGE) de proteínas de la superficie gonocócica etiquetadas, por ejemplo radioyodadas o bioestañadas, sugirió que numerosas (> 20) de las proteínas de membrana externa gonocócica menos abundantes, permanecieron sin caracterizar (observaciones no publicadas). Entre éstas podrían estar las proteínas que juegan un papel importante en la infección.

Por ejemplo, las proteínas de membrana externa de superficie al descubierto de otros microorganismos, por ejemplo, el antígeno superficial Haemophilus influenzae D15 (D-15-Ag) y la Pasteurella multocida Oma87, han sido encontradas útiles en la deducción de los anticuerpos que fueron protectores contra el cambio infeccioso en modelos animales. La D-15-Ag en forma de Omp85, fue conservada tanto en cepas tipificables como no tipificables de H. influenzae, y fue reconocida por los sueros de pacientes convalecientes; el suero purificado de afinidad anti-D-15-Ag, resulto protector en el modelo de crías de rata (Thomas, W.R., et al., Infect. Immun., 58: 1909-1913 (1990); Flack, F.S. et al., Gene., 156: 97-99 (1995)]. Los serotipos a-f de H. Influenzae, de H. Influenzae no tipificable y de Haemophilus parainfluenzae son todas proteínas expresadas similares a la D-15-Ag, según se ha demostrado mediante análisis de inmuno-mancha. Los anticuerpos en D-15-Ag recombinante protegieron contra el tipo b de H. influenzae y la bacteremia de a, en el modelo de rata joven [Loosmore, S.M. et al., Infect. Immun., 65: 3701-3707
(1997)].

Al igual que la D-15-Ag de H. influenzae, la Oma87 de P. multocida fue altamente conservada entre cepas, y fue reconocida por el anticuerpo protector; estuvo presente en todos los 16 serotipos de P. multicida, y fue reconocida por el suero del animal convaleciente. Los anticuerpos generados respecto a la Oma87 recombinante, fueron protectores contra el reto homólogo en el modelo de ratón [Ruffolo, C.G. et al., Infect. Immun. 64: 3161-3167 (1996)]. A pesar de las diversas publicaciones que describen las propiedades inmunológicas de la D-15-Ag y de la Omag87, la función de estas proteínas sigue siendo desconocida.

Manning et al., Microbial Pathogenesis 25: 11-21 (1998), describe que las proteínas Omp 85 de Neisseria gonorrhoeae y de Neisseria meningitidis son similares a la D-15-Ag de Haemophilus influenzae y a la Oma87 de Pasteurella multocida.

Sigue existiendo por tanto una necesidad en el estado de la técnica de un desarrollo de proteínas a partir de la Neisseriae que sean útiles en la investigación, diagnosis y tratamiento de las infecciones, especialmente las infecciones no sintomáticas, y de las enfermedades causadas por estos patógenos.

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Sumario de la invención

De acuerdo con un primer aspecto de la invención, se proporciona una composición de vacuna para la protección de un sujeto contra la enfermedad Neisseriana que comprende, en un portador farmacéuticamente aceptable, una cantidad efectiva de polipéptido elegido en el grupo consistente en:

(a): la proteína de SEQ ID NÚM.: 2;

(b): la proteína de SEQ ID NÚM.: 4;

(c): un fragmento de péptido de SEQ ID NÚM.: 2 ó 4, consistente en ocho o más aminoácidos consecutivos del mismo;

(d): una proteína o péptido que comparte al menos un 90% de identidad con cualquiera de las secuencias de a-(b), y

(e): una secuencia de cualquiera de (a) - (d) fusionada en un segundo polipéptido o proteína.

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La composición puede comprender más de una proteína o péptido de cualquiera de (a) - (e). La composición puede comprender además al menos otro antígeno o fragmento del mismo, procedente de una especie bacteriana patógena heterólogo u homóloga. El otro antígeno puede estar fusionado en uno de (a) - (c). El polipéptido puede carecer de la secuencia de señal que abarca los aminoácidos 1-21 de SEQ ID NÚM.: 2 ó 4.

De acuerdo con un segundo aspecto de la invención, se proporciona un procedimiento de fabricación de una composición según se ha descrito en lo que antecede, que comprende las etapas de asilar un polipéptido recombinante que comprende al menos ocho aminoácidos consecutivos de SEQ ID NÚM.: 2 ó 4, cuyo polipéptido induce anticuerpos que reconocen SEQ ID NÚM.: 2 ó 4, y formular dicho polipéptido en una cantidad efectiva para inducir dichos anticuerpos en un mamífero, con un portador farmacéuticamente aceptable.

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De acuerdo con un tercer aspecto de la invención, se proporciona una composición de vacuna para la protección de un sujeto contra la enfermedad Neisseriana, que comprende, en un vehículo adecuado de suministro de ácido nucleico, una cantidad efectiva de secuencia de ácido nucleico seleccionada en el grupo consistente en:

(a): SEQ ID NÚM.: 1;

(b): SEQ ID NÚM.: 3

(c): un fragmento de SEQ ID NÚM.: 1 ó 3, que consiste en 15 o más ácidos nucleicos consecutivos del mismo;

(d): una secuencia que codifica un polipéptido que comparte al menos un 90% de identidad con cualquiera de SEQ ID NÚM.: 2 o SEQ ID NÚM.: 4; y

(e): una secuencia de cualquiera de (a) - (d) que codifica además un segundo polipéptido o proteína.

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La composición puede comprender más de una secuencia de ácido nucleico de cualquiera de (a) - (e).

La composición puede comprender además al menos otra secuencia de ácido nucleico que codifique un antígeno o fragmento del mismo a partir de especies bacterianas patógenas heterólogas u homólogas. El otro antígeno puede estar fusionado en uno de (a) - (c).

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De acuerdo con un cuarto aspecto de la invención, se proporciona una composición de vacuna para la protección de un sujeto contra la enfermedad Neisseriana, que comprende un anticuerpo asilado que enlaza con una proteína o un péptido elegido en el grupo consistente en:

(a): la proteína de SEQ ID NÚM.: 2

(b): la proteína de SEQ ID NÚM.: 4

(c): un fragmento de péptido de SEQ ID NÚM.: 2 ó 4, consistente en ocho o más aminoácidos consecutivos del mismo, y

(d): una proteína o un péptido que comparte al menos una identidad del 90% con cualquiera de las secuencias (a) - (b).

La composición puede comprender un único anticuerpo aislado o múltiples anticuerpos.

De acuerdo con un quinto aspecto de la invención, se proporciona el uso de una composición de acuerdo con la invención en la fabricación de un medicamento para la protección de un sujeto contra la enfermedad Neisseriana.

Breve descripción de los dibujos

La Figura 1 es una fotografía de un gel electroforético de poliacrilamida de sulfonato de dodecil sodio (SDS-PAGE), que ilustra la identificación de la Omp85 recombinante producida por E. coli DH5\alpha/pOmp85, según se describe en el Ejemplo 2. Los lisatos de células bacterianas fueron separados mediante SDS-PAGE, manchados con Coomassie Brilliant azul (CBB), o transferidos a membranas y sondados con suero anti-GC-OM. De izquierda a derecha están E. coliDH5\alpha, E. coliDH5\alpha/pOmp85, y la cepa FA19 de N. gonorrhoeae. Se ha indicado la posición de Omp85. Los marcadores de peso molecular (MW) premanchados, se indicaron en kilodaltons (kDa).

La Figura 2 ilustra la secuencia de ADN que codifica un marco de lectura abierto de la N. gonorrhoeae omp85 [SEQ ID NÚM.: 1] y la correspondiente secuencia deducida de aminoácido de la Omp85 (accesión Genbank #U81959) [SEQ ID NÚM.: 2], la cual va precedida de la secuencia no traducida 5' [SEQ ID NÚM.: 7], y seguida de una secuencia no traducida 3' [SEQ ID NÚM.: 8]. La secuencia de nucleótido empieza con el codón de terminación de un cuadro de lectura abierto precedente (ORF) que es similar al de la proteína HI0918 hipotética de H. influenzae, y termina con el codón de inicio de un gen similar corriente abajo respecto a ompH de de S. typhimurium [Kosk P. et al., J. Biol. Chem. 264: 18973-18980 (1989)]. Los nucleótidos del cuadro de lectura abierto omp85 están numerados por la izquierda. Un sitio de enlace de ribosoma (subrayado) precede el codón de inicio de la omp85 ORF. La omp85 ORF estuvo precedida y seguida de secuencias de terminación de transcripción rho-independientes (indicadas mediante líneas con flechas). El polipéptido precursor de Omp85 estaba compuesto por 792 aminoácidos. La secuencia de aminoácido se ha numerado por la derecha. Se identificó un sitio de segmentación de péptido de señal putativa (indicado mediante punta de flecha) [Von Heijne, G., Nucl. Acids Res., 14: 4683-4690 (1986)]. La segmentación en este sitio pudo producir una proteína madura que tenía un peso molecular pronosticado de 85,842 Da.

La Figura 3 es una fotografía de una mancha Western que ilustra la identificación de Omp85 en las cepas FA19, FA635, FA1090, JS1, F62 y MS11LosA de N. gonorrhoeae, y en las cepas MP78, MP3, MP81 y HH de N. meningitidis mediante análisis de mancha Western con suero anti-GC-OM. Se utilizaron E. coli DH5\alpha y E. coli DHS\alpha/pOmp85 como controles negativo y positivo. Los marcadores de peso molecular (MW) pre-manchados fueron indicados en kDa.

La Figura 4 es una fotografía de una mancha Southern que ilustra la identificación de omp85 en ADN genómico a partir de FA19 de manchas de N. gonorrhoeae y MP3, MP73, MP81 y HH de N. meningitidis, digeridas con endonucleasas de restricción (HincII, EcoRI, PstI, ClaI) y sondadas con un fragmento de 688 bp de omp85 gonocócica. Este fragmente fue utilizado como control positivo en el primer canal. Los marcadores de peso molecular se han indicado por la izquierda en kilobase. Se utilizó E. coli Dh5\alpha como control negativo.

La Figura 5 ilustra la secuencia de aminoácido de la Omp85 de N. meningitidis (acceso #AF021045) [SEQ ID NÚM.: 4] en comparación con la Omp85 de N. gonorrhoeae [SEQ ID NÚM.: 2]. En la línea superior está la secuencia de aminoácido de Omp85 de N. meningitidis. Por debajo de la misma están los aminoácidos que son diferentes en la Omp85 de N. gonorrhoeae. Los aminoácidos que están ausentes en la Omp85 gonocócica se han señalado mediante estrellas. Los aminoácidos que son idénticos en los homólogos de N. meningitidis, N. gonorrhoeae, H. influenzae (D-15-Ag) y P. multocida (Oma87) están subrayados. Los aminoácidos de la Omp85 meningocócica están numerados a la derecha.

La Figura 6 es una fotografía de una mancha Western que ilustra la identificación de la Omp85 en las cepas FA19, FA635, FA1090, JS1, F62 y MS11LosA de N. gonorrhoeae, y las cepas MP78, MP3, MP81 y HH de N. meningitidis mediante análisis de mancha Western con anti-Omp85, según se describe en el Ejemplo 7. Se utilizaron E. coli DH5\alpha, E. coli DHS\alpha/pOmp85 y E. coli DH5\alpha/pMCOmp85 como controles negativo y positivo. Los marcadores de masa molecular (MW) pre-manchados, estaban indicados en kDa.

La Figura 7A es una fotografía de una mancha Western que ilustra la distribución de Omp85 en Neisseriae patogénica y comensal (en relación con áreas A, B, C y D) y la bacteria Gram negativa relacionada: FA19(A) de N. gonorrhoeae Neisseria pharyngis (A), Neisseria cinérea (A), Neisseria lactamica (B), Neisseria mucosae (B), Neisseria flavescens (C), Neisseria animalis (C), Neisseria denitrificans (C), Moraxella catarhalis (D), Klebsiella pneumoniae, Pseudomonas aeruginosa, y N. meningitidis HH (A), según se describe en el Ejemplo 7. Se utilizaron E. coli DH5\alpha, y E. coli DH5\alpha/pOmp85, como controles negativo y positivo. Los marcadores de masa molecular (MW) pre-manchados, estaban indicados en kDa.

La Figura 7B es una fotografía de una mancha Western que ilustra la distribución de Omp85 en cepas de FA19 N. gonorrhoeae, Salmonella typhimnrium, Shigelle flexneri, E. coli 35150 (enterohemorrágicas - EHEC), 35401 (enterotoxigénicas = ETEC), 43887 (entopatogénicas - EPEC), 43892 (entorinvasivas - EIEC) y N-meningitidis, según se describe en el Ejemplo 7. Se utilizaron E. coli DH5\alpha y E. coli DH5\alpha/Omp85 como controles negativo y positivo. Los marcadores de pasa molecular (MW) pre-manchados estaban indicados en kDa.

La Figura 8 es un gráfico de barras que muestra los resultados de un ensayo de adherencia de células gonocócicas realizado sin ningún anticuerpo (barras negras), y con fragmentos Fab preparados a partir de atisuero en: Ms11 Omp85, MS11 suero hiperinmune respecto a la albúmina del suero bovino (MS11BSA), suero hiperinmune MS11 respecto al suero normal de conejo (MS11NRS), FA19 Omp85, FA19BSA y FA19NRS, en concentraciones de 1, 10 y 100 \mug/ml (véanse las claves). El ensayo se llevó a cabo según se describe en el Ejemplo 8.

Descripción detallada de la invención

La presente invención proporciona composiciones de vacuna relacionadas con las proteínas de la membrana superficial externa, mencionadas como omp85, a partir de N. gonorrhoeae y de N. meningitidis. Estos antígenos, fragmentos de los mismos, desarrollados en los mismos, las secuencias de ácido nucleico que codifican a los mismos, y el uso de tales antígenos, anticuerpos y secuencias de ácido nucleico, proporcionan composiciones de vacuna y su uso para el tratamiento o la prevención de infecciones gonocócicas y meningocócicas, en particular infecciones no sintomáticas, y enfermedades.

I. Los Antígenos Omp85 de Uso en la Invención

Para identificar las proteínas de la membrana externa de N. gonorrhoeae, se seleccionó una librería genómica de N. gonorrhoeae con un antisuero preparado contra membranas externas gonocócicas aisladas purificadas. Se identificó el gen gonocócico, omp85, que codifica una proteína de membrana externa del aminoácido 792, la Omp85, de la N. gonorrhoeae que tenía un peso molecular aparente de 85 kDa, y caracterizada por la secuencia de aminoácido de la Figura 2 y por SEQ ID NÚM.: 2. La Omp85 tiene un péptido de señal típico y una característica de fenilalanina carboxi-terminal de proteínas de membrana externa. El análisis Southern demostró que el gen omp85 estaba presente como copia simple en la N. gonorrhoeae y en la N. meningitidis. Se utilizó amplificación PCR para obtener un clon del homólogo de omp85 de N. meningitidis. Los genes que codifican las proteínas Omp85 de N. gonorrhoeae y de N. meningitidis, han sido clonados y secuenciados. El gen omp85 y su producto tanto en N. gonorrhoeae como en N. meningitidis, se han caracterizado en las Figuras 2 y 5 que siguen [SEQ ID NÚMS.: 1-4].

Las secuencia de ácido nucleico que codifican las proteínas Omp85 y las estructuras de las propias proteínas, se describen en lo que sigue. Donde aparezcan en esta descripción, las proteínas y/olas secuencias de ADN están definidas por sus homologías o identidades en tanto por ciento respecto a las secuencias identificadas, donde los algoritmos utilizados para calcular el porcentaje de identidades o el porcentaje de similitudes incluyen los siguientes: algoritmo de Smith-Waterman [J.F. Collins et al., 1988, Comput. Appl. Biosci., 4: 67-72; J.F. Collins et al., Molecular Sequence Comparison and Alignment, (M. J. Bioshop et al., eds.) In Practical Approach Series: Nucleic Acid and Protein Sequence Analysis XVIII, IRL Press: Oxford, Inglaterra, UK (1987) pp. 417], y los programas BLAST y FASTA [E.G. Shpaer et al., 1996, Genomics, 38: 179-191], incluyendo el programa BLAST2 [S.D. Altschul et al., J. Mol. Biol., 215: 403-407 (1990)].

A. Secuencias de Ácido Nucleico

La presente invención utiliza secuencias de ácido nucleico bacteriano que codifican las secuencias omp85 de N. gonorrhoeae y de N. meningitidis. Las secuencias de ácido nucleico se aíslan a partir de materiales celulares que los que se asocian de forma natural. La secuencia de ADN del omp85 de N. gonorrhoeae [SEQ ID NÚM.: 1] y a correspondiente secuencia de aminoácido deducida de la Omp85 (acceso Genbank #U811959) [SEQ ID NÚM.: 2], se obtuvieron según se describe en el Ejemplo 2 y en la Figura 2. La secuencia de nucleótido empieza con el codón de terminación de una ORF precedente que es similar al de la hipotética proteína HI0918 de H. influenzae, y termina con el codón de iniciación de un gen corriente abajo similar al ompH de S. typhimurium [Kosk P., et al., J. Biol. Chem., 284: 18973-18980 (1989)]. Un sitio de enlace de ribosoma precede al codón de iniciación del omp85 ORF. El omp85 ORF estuvo precedido y seguido por secuencias de terminación transcripcional rho-independientes. El polipéptido precursor de Omp85 estaba compuesto por 792 aminoácidos. Se identificó un sitio de segmentación de de péptido de señal putativa (indicado mediante la punta de flecha) [Von Heijne, G. Nucl. Acids Res., 14: 4683-4690 (1986)]. La segmentación en este sitio produce una proteína madura que tiene un peso molecular pronosticado de 85,842 Da.

La secuencia de ADN del omp85 de N. meningitidis [SEQ ID NÚM.: 3] y la secuencia de aminoácido deducida correspondiente de la Omp85 [acceso Genbank #AF021045) [SEQ ID NÚM.: 5] fueron obtenidas según se describe en el Ejemplo 3. La Figura 5 muestra la comparación entre las secuencias de las dos proteínas Omp85, así como también las similitudes con los homólogos de Omp85 de N. meningitidis, N. gonorrhoeae, H. influenzae (D-15-Ag), y P. multocida Oma87).

Adicionalmente a las secuencias de ácido nucleico de longitud completa que codifican las proteínas Omp85 proporcionadas en las mismas, la especificación incluye también fragmentos de estos genes omp85. Con preferencia, tales fragmentos están caracterizados por codificar una porción biológicamente activa de Omp85, por ejemplo, un epítope. Alternativamente, otros fragmentos no epitópicos pueden resultar útiles como sondas en su utilización diagnóstica o de búsqueda. En general, estos fragmentos de oligonucleótido son de una longitud de al menos 10, o al menos 15 nucleótidos consecutivos. Sin embargo, se pueden seleccionar fragmentos de oligonucleótido de tamaños variables, según se desee. Tales fragmentos pueden ser utilizados para propósitos tales como llevar a cabo una reacción de cadena de polimerasa (PCR), por ejemplo, en una muestra de tejido obtenida por biopsia. Por ejemplo, los fragmentos útiles de ADN de omp85 y las secuencias correspondientes, comprenden secuencias que se producen entre los nucleótidos 2161 y 2208 de SEQ ID NÚM.: 1 y los nucleótidos 2161 y 2218 de SEQ ID NÚM.: 3. Otros fragmentos útiles pueden ser obtenidos fácilmente por un experto en la materia recurriendo a técnicas convencionales de secuenciamiento de ADN aplicadas a las secuencias aquí descritas.

Las secuencias de ADN de SEQ ID NÚMS.: 1 y 3 permiten que un experto en la materia obtenga fácilmente los filamentos anti-sentido de esas secuencias de ADN. Además, utilizando técnicas conocidas, un experto en la materia puede obtener fácilmente secuencias genómicas y de cADN adicionales que flanquean las secuencias ilustradas de ADN o las secuencia de ARN correspondientes, según se desee. De forma similar, la disponibilidad de las SEQ ID NÚMS.: 1 y 3 permite que un experto en la materia obtenga otras especies análogas de Omp85, y fragmentos de las mismas, mediante el uso de secuencias de ácido nucleico como sondas con una técnica convencional, por ejemplo reacción de cadena de polimerasa. Las variantes alélicas de esas secuencias dentro de una especie (es decir, secuencias que contienen algunas diferencias de nucleótido individual respecto a la secuencia que se produce de forma más común dentro de una especie, pero que no obstante codifican la misma proteína o una proteína con la misma función), tal como otras variantes de Omp85 [SEQ ID NÚMS.: 2 y 4], pueden ser obtenidas fácilmente dado el conocimiento de estas secuencias de ácido nucleico.

La presente invención puede incluir además secuencias de ácido nucleico para su uso en la invención, capaces de hibridación bajo condiciones estrictas [véase J. Sambrook et al., Molecular Clonign: A Laboratory Manual, 2ª ed., Cold Spring Harbor Laboratory (1989)] con las secuencias de SEQ ID NÚMS.: 1 y 3, sus filamentos anti-sentido, o los fragmentos biológicamente activos de las mismas. Un ejemplo de una condición de hibridación altamente severa es la hibridación en 2XSSC a 65ºC, seguida de un lavado en 0,1XSSC a 65ºC durante una hora. Alternativamente, un ejemplo de condición de hibridación altamente severa es en 50% de formamida, 4XSSC a 42ºC. Condiciones de severidad moderadamente alta pueden demostrar ser también útiles, por ejemplo hibridación en 4XSSC a 55ºC, seguido de lavado en 0,1XSSC a 37ºC durante una hora. Un ejemplo alternativo de condición de hibridación de severidad moderadamente alta es en 50% de formamida, 4XSCC a 30ºC.

Las secuencias de ácido nucleico pueden ser modificadas. Utilizando los datos de secuencia de la SEQ ID NÚMS.: 1 y 3, está dentro del alcance de un experto en la materia obtener otras secuencias de polinucleótido preparadas sintéticamente o recombinantemente, o secuencias de polinucleótido modificadas, que codifiquen proteínas de longitud completa o fragmentos útiles. Por ejemplo, un experto en la materia puede emplear codones preferidos o "de preferencia" para la expresión de la secuencia en células anfitrión seleccionadas; así, las SEQ ID NÚMS.: 1 y 3 pueden ser modificadas para que contengan diferentes tripletes de nucleótido que codifican el mismo aminoácido según se codifica mediante las SEQ m NÚMS.: 1 y 3. Tales modificaciones, realizadas a nivel de ácido nucleico, incluyen, por ejemplo, modificaciones en las secuencias de nucleótido que están silentes o que cambian los aminoácidos, por ejemplo, para mejorar la expresión o la secreción de la proteína. También están incluidas las variaciones alélicas, motivadas por la degeneración natural del código genético.

También resultan útiles en la presente invención los mutantes de las secuencias de omp85, incluyendo las supresiones 5', 3' o internas que codifican proteínas que conservan sustancialmente la antigenicidad de la Omp85 de longitud completa, u otras proteínas o fragmentos. Tales mutantes, truncados, o de supresión, pueden ser expresados mediante secuencias de ácido nucleico modificado a los efectos de afectar a la actividad de la proteína de longitud completa o de tipo silvestre.

Según se describe con mayor detalle en lo que sigue, estas secuencias de ácido nucleico son útiles en la invención. Las secuencias de ácido nucleico son también útiles en la producción de proteínas Omp85 y homólogas, así como también de una variedad de fusión o de otras proteínas sintéticas.

Las secuencias de nucleótido pueden ser fácilmente sintetizadas o pueden ser aisladas mediante usos convencionales o mediante técnicas de reacción de cadena de polimerasa o de clonación, tales como las descritas en textos convencionales tales como Sambrook et al., citado en lo que antecede. Por ejemplo, las secuencias de ácido nucleico del antígeno pueden ser preparadas o aisladas a partir de librerías genómicas utilizando imprimadores de ADN y técnicas de sonda y de PCR. Estas secuencias, fragmentos de las mismas, modificaciones en las mismas y secuencias de longitud completa, pueden ser construidas recombinantemente utilizando técnicas convencionales de ingeniería genética o de síntesis química, o PCR, y similares utilizando la información proporcionada en las mismas. Además, tales secuencias de ácido nucleico pueden ser etiquetas convencionalmente para uso diagnóstico. Alternativamente, para su uso como componentes terapéuticos o de vacuna, las secuencias de ácido nucleico pueden ser mezcladas con una diversidad de portadores farmacéuticamente aceptables, por ejemplo, solución salina, liposomas, etc., o incorporadas en moléculas de ácido nucleico, por ejemplo, plásmidos bajo el control regulador de secuencias que dirigen la expresión de la proteína codificada en una célula anfitrión seleccionada. Las secuencias de ácido nucleico pueden ser suministradas también a un anfitrión como ADN "desnudo" o en un vehículo de suministro de gen, tal como un virus recombinante, todo ello según se describe en detalle en lo que sigue.

B. Secuencias de Proteína

La presente invención hace también uso de proteínas Omp85 y de péptidos. Estas proteínas están libres de asociación con otras proteínas contaminantes o con materiales con los que se encuentran en la naturaleza. El antígeno de Neisseriae Omp85 tiene una masa molecular relativa de 85 kDa según se midió mediante inmuno-mancha Western (véase el Ejemplo 2 y la Figura 2). En una realización, la invención utilizan un polipéptido de antígeno de Omp85 gonocócica [SEQ ID NÚM.: 2] de alrededor de 792 aminoácidos, con un péptido simple, que tiene un peso molecular pronosticado de 85.842 daltons.

Se encontró que el omp85 meningocócico codifica un polipéptido de 797 aminoácidos, con un peso molecular pronosticado de 88,5 kDa (Figura 5). Entre los residuos 720 y 745 de aminoácido, la Omp85 meningocócica varió sustancialmente a partir de la Omp85 gonocócica, incluyendo la inserción de cinco aminoácidos adicionales. La secuencia reducida de aminoácido [SEQ ID NÚM.: 4] de la Omp85 de N. meningitidis fue revelada por el análisis de secuencia que era en un 95% idéntico al de la Omp85 de N. gonorrhoeae y en un 98% similar a la Omp85 gonocócica, utilizando el algoritmo BLAST2.

Las similitudes de estas dos proteínas Omp85 respecto a otros microorganismos, proporciona una evidencia del papel inmunológico jugado por esas proteínas, así como también otros papeles potenciales. El antígeno superficial protector D-15 (D-15-Ag) de Haemophilus influenzae y la Oma87 de Pasteurella multocida, son las únicas proteínas bacterianas, las cuales han sido descritas previamente, que son similares a la secuencia de aminoácido de Omp85 [SEQ ID NÚM.: 2]. Esta similitud sugirió que estas proteínas jugaban un importante papel en las interacciones anfitrión-patógeno, y tienen un importante función en la patogénesis. La importancia de estas proteínas Omp85 en la patogénesis y en la inmunobiología, quedó demostrada por el hecho de que el anticuerpo era protector respecto a proteínas similares en H. influenzae y en P. multocida. Las similitudes sugieren que las proteínas Omp85 de Neisseriae son probablemente objetivos inmunológicos importantes de la respuesta inmune del anfitrión.

El análisis de mancha Western demostró proteínas similares a la Omp85 en todas las Neisseriae probadas con anti-Omp85, y tres áreas relacionadas con Neisseriae. El área A contiene los patógenos naturales N. gonorrhoeae y N. meningitidis, y organismos oportunistas conocidos para causar severas enfermedades humanas, tales como N. pharyngis y N. cinérea. El área B contiene especies, tales como N. mucosae y N. lactamica, encontradas típicamente en la naso-faringe humana, que son susceptibles de ocasionar infecciones oportunistas en anfitriones debilitados. El área C consiste en organismos comensales/saprofíticos, tales como N. flavescens, N. animalis y N. denitricans, los cuales no causan generalmente infecciones humanas.

Todas las especies Neisseriae colonizan superficies de mucosas. La presencia de proteínas como la Omp85 en numerosos organismos patógenos y comensales, sugiere que la misma puede estar involucrada en el establecimiento o el mantenimiento de la colonización. La identificación de proteínas Omp85 en un número de organismos patógenos y comensales proporciona una evidencia de que las proteínas Omp85 proporcionan funciones involucradas en el establecimiento o el mantenimiento de la colonización.

Las investigaciones en las bases de datos identificaron genes en un número de patógenos que codifican las proteínas hipotéticas similares a la Omp85, incluyendo genes en B. abortus, H. pylori y B. burgdorferi. Las proteínas codificadas por estos genes no han sido aún caracterizadas. Una investigación de la secuencia de aminoácido de la Omp85 respecto a la base de datos GenBank, dio como resultado la identificación de una proteína de cianobacteria [Kaneto, T. et al., DNA Res., 3: 109-136 (1996)] con un 35% de similitud respecto a la Omp85 gonocócica. La proteína de cianobacteria fue denominada IAP75 debido a su similitud con la proteína asociada a la importación de cloroplasto de 75 kDa, el IAP75 [Schnell DU et al., Science, 266: 1007-1011 (1994)]. El cloroplasto IAP75 fue localizado en la membrana externa de cloroplastos y fue uno de cuatro componentes de membrana externa de un complejo que transporte polipéptidos. Esto sugirió que la Omp85 podía formar parte de un complejo similar de transporte.

Las secuencias de otras proteínas a partir del complejo asociado de importación de cloroplasto, fueron investigadas con relación a la Base de Datos de Proyecto de Secuenciamiento de Genoma Gonocócico (Dyer y Rowe, 1997). Se identificaron secuencias similares a la proteína IAP34 de cloroplasto [Kessler F. et al., Science, 266: 1035-1039 (1994)] en el genoma gonocócico. Se estimó que la IAP34 era la proteína de enlace GTP, y las secuencias de similitud más alta con el homólogo gonocócico estaban en regiones identificadas como motivos de proteína de enlace GTP. Se llevaron a cabo estudios de formación de enlace cruzado superficial para determinar si la Omp85 podía participar en un sistema análogo al complejo IAP (no se muestran los datos). Los estudios con la utilización de formadores de enlace cruzado DTBP reversibles, que forman enlace cruzado con proteínas que están cada una 11,9\ring{A} dentro de otra [Newhall WJ, et al., Infect. Immun., 28: 785-791 (1980)], mostraron que la Omp85 formaba enlace cruzado con hasta otras cinco proteínas de membrana externa, una de \approx34 kDa (homóloga de IAP34) (datos no mostrados). Estos datos, que confirmaban que la Omp85 estaba al descubierto sobre la superficie bacteriana, soportan el papel de que la Omp85 participa en un complejo análogo con el complejo de IAP de cloroplasto. Una caracterización adicional de proteínas asociadas a la Omp85 en la membrana externa, pueden proporcionar evidencia de funciones biológicas adicionales de estas proteínas Omp85.

Un experto en la materia que utilice técnicas convencionales, pude hacer uso fácilmente de las secuencias de Omp85 que aquí se proporcionan para identificar y aislar otras proteínas similares. Tales procedimientos son rutinarios y no se considera que requieran una experimentación indebida, dada la información que aquí se proporciona.

Los antígenos de uso en la invención, pueden estar caracterizados por mediciones inmunológicas que incluyen, sin limitación, mancha Western, determinaciones de masa micromolecular mediante determinaciones biofísicas, tales como SDS-PAGE/manchado, cromatografía de líquido a alta presión (HPLC) y similares, ensayos de reconocimiento de anticuerpos, ensayos de reconocimiento de células T, ensayos de enlace de complejo histológicamente importante (MHC), y ensayos para inferir protección inmune o patología inmune mediante transferencia adoptiva de células, proteínas o anticuerpos.

Los antígenos de membrana externa de Omp85 de uso en la invención (así como también sus variantes o análogos que se producen de forma natural en otras especies), pueden ser aislados en forma de proteína intacta completa, o en un polipéptido o fragmento de la misma. En una realización, la Omp85 se aísla mediante procedimientos de inmuno-mancha de acuerdo con su masa molecular respectiva, según se describe en lo que sigue en los ejemplos. Tal aislamiento proporciona el antígeno en una forma sustancialmente libre de otros materiales proteináceos y no proteináceos del microorganismo. Las moléculas que comprenden los polipéptidos y los antígenos de uso en la invención, pueden ser aisladas y además purificadas utilizando cualquiera de una diversidad de procedimientos convencionales que incluyen, aunque sin limitación, los siguientes: cromatografía de líquidos tal como de fase normal o inversa, utilizando HPLC, FPLC y similares; cromatografía de afinidad (tal como con ligandos inorgánicos o con anticuerpos monoclonales); cromatografía de exclusión de tamaño; cromatografía de quelato metálico inmovilizado; electroforesis de gel, y similares. Un experto en la materia puede seleccionar las técnicas de aislamiento y purificación más
apropiadas.

Alternativamente, las secuencias de aminoácido de las proteínas de uso en la invención puede ser producidas recombinantemente siguiente técnicas convencionales de ingeniería genética [véase, por ejemplo: Sambrook et al., citado en lo que antecede, y la descripción detallada de marcación de las proteínas que sigue].

i. Antígenos Análogos/Modificados

También útiles en la invención son los análogos, o versiones modificadas, de la proteína Omp85, o de los fragmentos aquí proporcionados. Los ejemplos incluyen polipéptidos con variaciones menores de aminoácido a partir de la secuencia de aminoácido parcial ilustrada de, por ejemplo, la Omp85 gonocócica (SEQ ID NÚM.: 2), en particular, sustituciones conservadoras de aminoácidos. Las sustituciones conservadoras son aquellas que tienen lugar dentro de una familia de aminoácidos que están relacionados mediante sus cadenas laterales y sus propiedades químicas. Los homólogos que tienen al menos un 90% de identidad con cualquiera de SEQ ID NÚM.: 2 o SEQ ID NÚM.: 4, son útiles en esta invención. Los homólogos que tienen una identidad de al menos un 95% con cualquiera de SEQ ID NÚM.: 2 o SEQ ID NÚM.: 4, son también útiles en esta invención.

Los algoritmos utilizados para estos cálculos, han sido identificados en lo que antecede. En base a la información de secuencia aquí proporcionada, un experto en la materia puede obtener fácilmente homólogos y análogos de longitud completa, a partir de otras especies bacterianas.

Un antígeno útil en la presente invención puede ser modificado también para incrementar su inmunogenicidad. Por ejemplo, el antígeno puede estar acoplado a compuestos químicos o a portadores inmunogénicos, siempre que el acoplamiento no interfiera con la actividad biológica deseada tanto del antígeno como del portador. Para una revisión de las consideraciones generales sobre las estrategias de acoplamiento, véase Antibodies. A Laboratory Manual Cold Spring Harbor Laboratory, ed. E. Harlow y D. Lane (1988). Portadores inmunogénicos útiles conocidos en el estado de la técnica, incluyen, aunque sin limitación, hemocianina de lapa keyhole (KLH); albúmina de suero bovino (BSA), ovalbumina, derivado proteínico purificado de tuberculina (PPD); glóbulos rojos de la sangre; toxoide del tétano, toxoide del cólera; perlas de agarosa; carbón activado o bentonita. Compuestos químicos útiles para el acoplamiento incluyen, aunque sin limitación, grupos dinitrofenol y ácido arsonílico. Un experto en la materia puede elegir fácilmente otros portadores inmunogénicos y agentes de acoplamiento apropiados.

El antígeno puede ser modificado también mediante otras técnicas, tal como mediante desnaturalización con calor y/o SDS.

ii. Mutantes de Fragmentación/Supresión

Útiles también en esta invención son los fragmentos adicionales de polipéptidos de Omp85 y de péptidos aquí identificados. Tales fragmentos están deseablemente caracterizados por tener una actividad biológica similar a la mostrada por la proteína completa, incluyendo, por ejemplo, la capacidad para inducir anticuerpos que pueden interferir con la formación de enlace del patógeno respecto a sus objetivos celulares (véase el Ejemplo 8). Estos fragmentos son de una longitud comprendida entre 8 aminoácidos y fragmentos que abarcan hasta muy cerca de la proteína completa. Tales fragmentos representan aminoácidos consecutivos en la secuencia de proteína. Tal fragmento puede representar un epítope de la proteína.

Las proteínas Omp85 [SEQ ID NÚMS.: 2 y 4] útiles en la invención, pueden ser modificadas para crear mutantes de supresión, por ejemplo, mediante truncamiento en los terminales amino o carboxi, o mediante eliminación de uno o más aminoácidos. Los mutantes de supresión son también útiles en esta invención, como lo son las secuencias de ADN que los codifican.

Todavía en otra realización, los péptidos o polipéptidos de Omp85 pueden estar en forma de construcción de péptido antigénico múltiple ("MAP", también mencionado como péptido de núcleo de lisina octamérica). Tal construcción puede estar diseñada con el empleo del sistema MAP descrito por Tam, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85: 5409-5413 (1988). Este sistema hace uso de una matriz de núcleo de residuos de lisina, sobre la que se sintetizan múltiples copias de la misma proteína o péptido útiles en la invención, según se ha descrito [D. Posnett, et al., J. Biol. Chem., 263(4): 1719-1725 (1988); J. Tam, "Chemically Defined Synthetic Immunogens and Vaccines by the Multiple Antigen Peptide Approach"), Vaccine Research and Developments, Vol. 1, ed. W. Koff y H. Six, pp. 51-87 (Marcel Deblau, Inc., Nueva York 1992)]. Cada MAP contiene múltiples copias de un péptido.

Todavía otros fragmentos modificados de Omp85 pueden ser preparados mediante cualquier número de técnicas ahora convencionales, para mejorar la producción de los mismos, para aumentar la estabilidad u otras características de la proteína, por ejemplo, la actividad de formación de enlace o la biodisponibilidad, o para conferir alguna otra propiedad deseada en la proteína. Otros fragmentos útiles de estos polipéptidos pueden ser preparados fácilmente por un experto en la materia utilizando técnicas conocidas, tales como mutagénesis de supresión y expresión.

iii. Fusión de Proteínas Multiméricas y Composiciones

La proteína Omp85 útil en la presente invención, o los fragmentos de la misma, pueden ser construidos también con utilización de técnicas convencionales de ingeniería genética como parte de una proteína más grande y/o multimérica o de composiciones de proteína. Los antígenos útiles en esta invención pueden estar en combinación con proteínas superficiales externas o con otras proteínas o antígenos de otros patógenos, tales como los que se han identificado en lo que antecede, o los diversos fragmentos de antígenos aquí descritos pueden estar en combinación unos con otros. En tales combinaciones, el antígeno puede estar en forma de proteína de fusión. El antígeno útil en la invención puede estar opcionalmente fusionado con un polipéptido seleccionado o con una proteína derivada de otros microorganismos. Por ejemplo, un antígeno o polipéptido útil en esta invención puede estar fusionado en su término N o en su término C, con un polipéptido procedente de otro patógeno, o con más de un polipéptido en secuencia. Los polipéptidos que pueden ser útiles a estos efectos incluyen los polipéptidos identificados por la técnica anterior.

Todavía otra proteína de fusión útil en la invención se proporciona por expresión de la molécula de ADN formada por la secuencia de ADN del omp85 o por un fragmento del mismo fusionado con fragmentos de ADN que son homólogos (entre alrededor del 25-95% de identidad) con la Omp85. Un ejemplo de dicha proteína comprende la secuencia de aminoácido de SEQ ID NÚM.: 2 en la que están fusionados los fragmentos de aminoácido que son idénticos hasta en un 95% con esa secuencia, por ejemplo, a partir de SEQ ID NÚM.: 4, o a partir de una cualquiera de las proteínas homólogas descritas en lo que antecede. Estos fragmentos pueden estar insertados en cualquier orden, y pueden contener secuencias repetidas. Los fragmentos fusionados pueden producir una gran molécula de ADN que exprese una proteína que pueda estimular una diversidad de especificidades de anticuerpo.

Estas proteínas de fusión que comprenden múltiples polipéptidos de esta descripción, están construidas para su uso en las composiciones de vacuna de esta invención. Estas proteínas de fusión o proteínas multiméricas, pueden ser producidas recombinantemente, o pueden ser sintetizadas químicamente. También pueden incluir los polipéptidos de esta descripción fusionados o acoplados a mitades diferentes de los aminoácidos, incluyendo los lípidos y los carbohidratos. Además, los antígenos útiles en esta invención pueden ser empleados en combinación con otros agentes de vacuna descritos en la técnica anterior, así como con otras especies de agentes de vacuna derivados de otros microorganismos. Tales proteínas son útiles en la prevención de enfermedades causadas por un amplio espectro de aislados de Neisseriae.

Una composición de proteína que puede ser una alternativa preferida a las proteínas de fusión descritas en l que antecede, es un cóctel (es decir, una mezcla simple) que contiene diferentes proteínas Omp85 o fragmentos, opcionalmente mezclados con diferentes proteínas antigénicas o péptidos de otros patógenos. Es probable que tales mezclas de esas proteínas o fragmentos antigénicos de las mismas sean útiles en la generación de anticuerpos deseados respecto a un amplio espectro de aislados de Neisseriae.

iv. Sales

Un antígeno útil en la presente invención, puede presentar forma de sal farmacéuticamente aceptable. Los ácidos y las bases adecuados, que son capaces de formar sales con los polipéptidos útiles en la presente invención, son bien conocidos por los expertos en la materia, e incluyen ácidos y bases de naturaleza orgánica e inorgánica.

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III. Procedimientos de Formación de Secuencia de Antígenos y de Ácido Nucleico útiles en la Invención A. Expresión In Vitro

Para producir Omp85 recombinante o fragmentos de péptido útiles en la invención, las secuencias de ADN útiles en la invención son insertadas en un sistema de expresión adecuado. Deseablemente, se construye una molécula recombinante o vector, en la que la secuencia de polinucleótido que codifica la proteína seleccionada, por ejemplo la Omp85, está enlazada operativamente con una secuencia de control de expresión heteróloga que permite la expresión de la proteína. Numerosos tipos de vectores de expresión apropiados son conocidos en el estado de la técnica para la expresión de proteína, mediante técnicas estándar de biología molecular. Tales vectores se eligen entre tipos de vectores convencionales que incluyen los insectos, por ejemplo, expresión de baculovirus, levadura, o en sistemas de expresión fungal, bacteriana o viral. Otros vectores de expresión apropiados, de los que se conocen numerosos tipos en el estado de la técnica, pueden ser utilizados también para este propósito. Los procedimientos para obtener tales vectores de expresión son bien conocidos. Véase, Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2ª edición, Cold Spring Harbor Laboratory, Nueva York (1989); Miller et al., Genetic Engineering, 8: 277-298 (Plenum Press 1986), y las referencias aquí en los mismos.

Células, o líneas celulares, de anfitrión adecuadas para la transfección mediante este método, incluye las células bacterianas. Por ejemplo, las diversas cepas de E. coli, por ejemplo HB101, MC1061, y las cepas utilizadas en los ejemplos que siguen, son bien conocidas como células anfitrión en el sector de la biotecnología. También pueden ser empleadas en este procedimiento varias cepas de B. subtillis, Pseudomonas, Streptomyces, y otros bacilos y similares.

Se utilizan células de mamíferos, tales como las células 293 humanas, las células de ovario de hámster chino (CHO), la línea celular COS-1 del mono o las células 3T3 de murino, derivadas del ratón Swiss, Balb-c o NIH. Otra línea celular de mamífero adecuada es la línea celular CV-1. Todavía otras células anfitrión de mamífero adecuadas, así como los métodos para la transfección, cultivo, amplificación, protección, producción y purificación, son conocidas en el estado de la técnica [véase, por ejemplo, Gething and Sambrook, Nature, 293: 620-625 (1981), o alternativamente, Kaufman et al., Mol. Cell. Biol., 5(7): 1750-1759 (1985), o Howley et al., Patente U.S. núm. 4.419.446].

Muchas cepas de células de levadura conocidas por los expertos en la materia, están también disponibles como células anfitrión para la expresión de polipéptidos útiles en la presente invención. Otras células fungales pueden ser empleadas también como sistemas de expresión. Alternativamente, las células de insectos tales como las células de Spodoplera frugipedera (S19), pueden ser utilizadas.

De ese modo, el procedimiento para la producción de proteínas Omp85 recombinantes incluye la transfección, por ejemplo mediante medios convencionales tales como electroporación, de una célula anfitrión con al menos un vector de expresión que contiene un polinucleótido útil en la invención, bajo el control de una secuencia regladora transcripcional. La célula anfitrión transfectada o transformada, es cultivada a continuación bajo condiciones que permiten la expresión de la proteína. La proteína expresada se recupera, se aísla, y opcionalmente se purifica a partir de la célula (o a partir del medio de cultivo, si se expresa extracelularmente), con medios apropiados conocidos por los expertos en la materia.

Por ejemplo, las proteínas son aisladas en forma soluble a continuación de la lisis celular, o extraídas con la utilización de técnicas conocidas, por ejemplo, en cloruro de guanidina. Si se desea, las proteínas o fragmentos útiles en la invención son producidas como proteínas de fusión. Tales proteínas de fusión son las que se han descrito en lo que antecede. Alternativamente, por ejemplo, puede ser deseable producir proteínas de fusión para aumentar la expresión de la proteína en una célula anfitrión seleccionada, para perfeccionar la purificación, o para su uso en la monitorización de presencia de la proteína deseada, por ejemplo, la Omp85, en tejidos, células o extractos de células. Los compañeros de fusión adecuados para las proteínas útiles en la invención, son bien conocidos por los expertos en la materia, e incluyen, entre otros, la \beta-galactosidasa, la glutationa-S-transferasa, la poli-histidina, y la proteína de enlace de la maltosa.

B. Expresión In Vivo

Alternativamente, cuando se desea que la Omp85 (ya sea de longitud completa o un fragmento) sea expresada in vivo, por ejemplo, para inducir anticuerpos, o alternativamente cuando el omp85 debe ser empleado como vacuna de ADN, un experto en la materia selecciona un vector apropiado para el suministro. Ejemplos de vectores para el suministro del gen in vivo están fácilmente disponibles a partir de una diversidad de fuentes académicas y comerciales, e incluyen por ejemplo, virus adeno-asociados (solicitud de Patente internacional núm. PCT/US91/03440), vectores de adenovirus [M. Kay et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 91: 2353 (1994); S. Ishibashi et al., J. Clin. Invest., 92: 883 (1993)] u otros vectores virales, por ejemplo, diversos poxvirus, vaccinia, etc. Procedimientos para la inserción de un gen deseado, por ejemplo, la Omp85, y obtener expresión in vivo de la proteína codificada, son bien conocidos por los expertos en la materia.

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IV. Anticuerpos útiles en la invención

La presente invención utiliza también anticuerpos capaces de reconocer y enlazar los antígenos aislados, o modificados, o multiméricos, descritos en lo que antecede, incluyendo los anticuerpos derivados de mezclas de tales antígenos o fragmentos de los mismos. Algunos de los anticuerpos útiles en la invención pueden ser específicos para las proteínas Omp85 de N. gonorhoeae o de N. meningitidis, enlazando con epítopes de las proteínas que difieren de las especies anteriores respecto a las especies posteriores. Por ejemplo, un anticuerpo específico para la N. gonorrhoeae, puede enlazar en un epítope en SEQ IND NÚM.: 2 que no esté presente en SEQ ID NÚM.: 4, o viceversa. Así, un anticuerpo específico de Omp85 de N. gonorrhoeae, se define aquí como un anticuerpo que enlaza con un antígeno de Omp85 de la N. gonorrhoeae solamente. Se define aquí un anticuerpo específico de Omp85 de N. meningitidis como un anticuerpo que enlaza con un antígeno de Omp85 de la N. meningitidis solamente. Alternativamente, ciertos anticuerpos para estas proteínas pueden enlazar con un epítope presente en ambas proteínas Omp85 de N. gonorrhoeae y de N. meningitidis. Todavía otros anticuerpos útiles en la invención pueden enlazar con un epítope de la Omp85 de N. gonorrhoeae y de N. meningitidis, y con el mismo epítope de las otras proteínas homólogas en especies homólogas o heterólogas de bacterias que tienen proteínas homólogas (descritas en la parte I, B que antecede).

Estos anticuerpos son útiles en composiciones pasivas de vacuna, cuyas vacunas pueden ser polivalentes, al contener anticuerpos frente a los antígenos de otros microorganismos, así como también anticuerpos respecto a las proteínas Omp85 útiles en la invención.

Los anticuerpos útiles en esta invención se generan con medios convencionales que utilizan los antígenos aislados, recombinantes o modificados útiles en esta invención, o mezclas de tales antígenos o de fragmentos antigénicos. Por ejemplo, los anticuerpos policlonales son generados por estimulación convencional del sistema inmune de un animal o humano seleccionado, permitiendo el antígeno aislado o mezcla de proteínas antigénicas o de péptidos, de esta descripción que el sistema inmune produzca anticuerpos naturales para el mismo, pudiendo ser producido un anticuerpo útil para la invención mediante administración a un anfitrión vertebrado de la composición antígena o antigénica útil en esta invención, por ejemplo, la Omp85. Con preferencia, una versión recombinante de la Omp85 (rOmp85), o una MAP de Omp85, se utiliza como inmunógeno. Un anticuerpo policlonal adecuado contra el antígeno de Omp85 puede ser generado a modo de anti-suero, tal como el anti-suero de Omp85 empleado en los ejemplos de la presente.

De ese modo, un anticuerpo útil en la invención es aislado por afinidad purificando anti-suero generado durante un infección de un mamífero, por ejemplo un ratón, con N. gonorrhoeae o con N. meningitidis, utilizando como inmunoabsorbente el antígeno de Omp85 aquí identificado. De manera similar, un anticuerpo útil en la invención es asilado por inmunización de un ratón con antígeno purificado, recombinante, útil en esta invención, o con proteína Omp85 aislada de origen natural.

También son generados los anticuerpos monoclonales (MAbs) dirigidos contra la Omp85. Las líneas celulares Hybridoma que expresan MAbs deseables, son generadas con técnicas convencionales bien conocidas, por ejemplo Kohler y Mistein, y con muchas medicaciones conocidas. De manera similar, se generan anticuerpos deseables de alto título mediante aplicación de técnicas recombinantes conocidas a los anticuerpos monoclonales o policlonales desarrollados respecto a estos antígenos [véase, por ejemplo, la solicitud de Patente PCT núm. PCT/GB85/00392; la Publicación de Patente británica núm. GB2188638A; Amit et al., Science, 233: 747-753 (a986); Queen et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86: 10029-10033 (1989); solicitud de Patente PCT núm. WO90/07861; y Riechmann et al., Nature, 332: 323-327 (1988); Huse et al., Science, 246: 1275-1281 (1988)a].

Dada la descripción aquí contenida, un experto en la material puede generar anticuerpos imaginarios, humanizados o completamente humanos, dirigidos contra la Omp85 o los fragmentos antigénicos de la misma, recurriendo a técnicas conocidas manipulando las regiones de determinación complementaria de anticuerpos animales o humanos respecto al antígeno útil en la invención. Véase, por ejemplo, E. Mark y Padlin, "Humanization of Monoclonal Antibodies", Capítulo 4, The Handbook of Experimental Pharmacology, Vol. 113, The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, Springer-Verlag (Junio de 1994).

Alternativamente, los anticuerpos están ensamblados a modo de complejos multi-antigénicos (véase, por ejemplo, la solicitud de Patente Europea núm. 0339695, publicada el 2 de Noviembre de 1989], o como simples mezclas de proteínas/péptidos antigénicos, y empleados para deducir anticuerpos de alto título capacitados para enlazar con el (los) antígeno(s) seleccionado(s) según aparece en los fluidos biológicos de un animal o un humano infectado.

También útiles en la presente invención son los anticuerpos anti-idiotipo (Ab3). Los Ab2 son específicos para el objetivo respecto al que enlazan los anticuerpos anti-Omp85 útiles en a invención, y los Ab3 son similares a los anticuerpos (Ab1) de la Omp85 en en sus especificidades de enlace y en sus actividades biológicas [véase, por ejemplo, M. Wettendorff et al., "Modulation of anti-tumor immunity by anti-idiotypic antibodies", en Idiotypic Network and Diseases, ed. por J. Cerny y H. Hiernaux J. Am. Soc. Microbiol., Washington DC, pp. 203-229 (1990)]. Estos anticuerpos anti-idiotipo y anti-anti-idiotipo, son producidos utilizando técnicas bien conocidas por los expertos en la materia. Tales anticuerpos anti-idiotipo (Ab2) pueden llevar la imagen interna de la Omp85 o de los fragmentos de la misma, y de ese modo son útiles para los mismos propósitos que la Omp85 o que los fragmentos.

En general, antisueros policlonales, anticuerpos monoclonales y otros anticuerpos, que pueden enlazar con el antígeno seleccionado (Ab1), son útiles para identificar epítopes de Omp85 para separar la Omp85 y los análogos de la misma, respecto a los contaminantes del tejido vivo (por ejemplo, en columnas cromatográficas y similares), y en general como herramientas de búsqueda y como material de partida esencial para el desarrollo de otros tipos de anticuerpos descritos en lo que antecede. Los anticuerpos anti-idiotipo (Ab2) son útiles para enlazar con el mismo objetivo, y de ese modo pueden ser usados en lugar del antígeno original, por ejemplo, la Omp85, para inducir una respuesta inmune. Los anticuerpos Ab3 son útiles por la misma razón que son útiles los Ab1. También se han contemplado otros usos para los anticuerpos descritos anteriormente, como herramientas de búsqueda y como componentes para la separación de la Omp85 respecto a otros contaminantes, por ejemplo.

Para su utilización en ensayos diagnósticos, los anticuerpos están asociados a etiquetas convencionales que son capaces, por sí solos o en asociación con otras composiciones u otros compuestos, de proporcionar una señal detectable. Cuando se emplea más de un anticuerpo en un procedimiento diagnóstico, las etiquetas son deseablemente interactivas para producir una señal detectable. Más deseablemente, la etiqueta es detectable visualmente, por ejemplo colorimétricamente. Una diversidad de sistemas de enzimas han sido descritos en la técnica, los cuales actuarán para poner de relieve una señal colorimétrica en un ensayo. Como ejemplo, la oxidasa de glucosa (que utiliza glucosa como substrato), libera peróxido como producto. La peroxidasa, que reacciona con el peróxido y con un donante de hidrógeno tal como la tetrametil bencidina (TMB) produce una TMB oxidizada que se ve como color azul. Otros ejemplos incluyen la peroxidasa de rábano picante (HRP) o la fosfatasa alcalina (AP), y la hexoquinasa en conjunción con la deshidrogenasa de glucosa-6-fosfato que reacciona con la ATP, la glucosa y la NAD^{+}, para producir, entre otros productos, NADH que es detectada como absorbencia incrementada a una longitud de onda de 340 nm. Otros sistemas de etiqueta que pueden ser utilizados en los procedimientos aquí descritos, detectables con otros medios, por ejemplo micropartículas de látex coloreadas [Bangs Laboratories, Indiana), en las que se ha incrustado un tinte, pueden ser utilizados en lugar de las enzimas para formar conjugados con los anticuerpos y proporcionar una señal visual indicativa de la presencia del complejo resultante en los ensayos aplicables. Todavía otras etiquetas incluyen compuestos fluorescentes, compuestos o elementos radiactivos. Las etiquetas detectables para su fijación a los anticuerpos útiles en ensayos de diagnóstico de esta descripción, pueden ser seleccionadas fácilmente entre numerosas composiciones conocidas y fácilmente disponibles para un experto en la técnica de los ensayos de diagnóstico. Los procedimientos y los anticuerpos no están limitados a la etiqueta o al sistema de etiqueta detectable particular
empleado.

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V. Composiciones Terapéuticas y de Vacuna A. Composiciones Terapéuticas y de Vacuna que Contienen Proteína

Los antígenos y anticuerpos útiles en la invención, solos o en combinación con otros antígenos y anticuerpos de, o dirigidos a, otros microorganismos patógenos, pueden ser utilizados en composiciones de vacuna y en procedimientos para el tratamiento de los humanos con infección no sintomática o con enfermedad sintomática causada por N. gonorrhoeae, N. meningitidis o por otros patógenos identificados en lo que antecede.

Por ejemplo, una composición terapéutica de ese tipo pueden estar formulada de modo que contenga un portador o diluyente y uno o más anticuerpos anti-Omp85. En composiciones que contienen el antígeno o los anticuerpos de Omp85 en las mismas, es decir, componentes de proteína, se pueden emplear portadores farmacéuticamente aceptables que faciliten la administración de las proteínas, pero que sean fisiológicamente inertes y/o no peligrosos.

Un a diversidad de tales portadores de proteína farmacéuticamente aceptables, y/o de componentes adecuados para su administración con la misma, incluyen aunque sin limitación, solución salina estéril, lactosa, sacarosa, fosfato de calcio, gelatina, dextrano, agar, pectina, aceite de cacahuete, aceite de oliva, aceite de sésamo, y agua. Adicionalmente, el portador o diluyente puede incluir un material de retardo de tiempo, tal como monoestearato de glicerol o diestearato de glicerol, solo o con una cera. Adicionalmente, se puede utilizar formulaciones de polímero de liberación lenta. También se pueden emplear liposomas o vehículos similares a los liposomas.

Opcionalmente, estas composiciones pueden contener ingredientes farmacéuticos convencionales, tales como conservantes, o estabilizadores químicos. Ingredientes adecuados que pueden ser utilizados en una composición terapéutica conjuntamente con los anticuerpos incluyen, por ejemplo, casamino ácidos, sacarosa, gelatina, rojo fenol, amina N-Z, difosfato de monopotasio, lactosa, hidrosilato de lactalbúmina, y leche seca.

Alternativamente, o adicionalmente a los antígenos o anticuerpos útiles en la invención, otros agentes útiles en el tratamiento de la enfermedad en cuestión, por ejemplo, antibióticos o agentes inmunoestimulatorios, se espera que sean útiles para la reducción o eliminación de los síntomas de la enfermedad. Tales agentes pueden operar en asociación con las composiciones de vacuna de esta invención. El desarrollo de composiciones de vacuna que contienen estos agentes, está dentro del alcance de un experto a la vista de las enseñanzas de esta invención.

Adicionalmente, las composiciones de vacuna pueden ser polivalentes. Tales composiciones pueden contener composiciones terapéuticas procedentes de otros patógenos bacterianos o virales, por ejemplo, componentes de especies bacterianas homólogas a las Neisseriae o heterólogas de éstas, y/o antígenos de un virus causante de enfermedad. Dependiendo de la compatibilidad de los componentes, los anticuerpos o antígenos de Omp85 útiles en la invención pueden así formar parte de una composición de vacuna multi-componente dirigida a más de una enfermedad única.

Un procedimiento terapéutico incluye tratar un humano respecto a la infección con N. gonorrhoeae o N. meningitidis mediante administración de una cantidad efectiva de tal composición terapéutica. Una "cantidad efectiva" de una composición proteinácea puede estar comprendida entre alrededor de 0,05 y alrededor de 1000 \mug/ml de un anticuerpo o de un antígeno. Una dosificación adecuada puede ser de aproximadamente 0,1 ml de esa cantidad efectiva. Tal composición puede ser administrada 1 - 3 veces por día durante un período de 1 día a 12 semanas. Sin embargo, se pueden realizar ajustes adecuados de la dosificación en las composiciones que contienen proteína o ácido nucleico por parte del médico o veterinario que realice la atención, dependiendo de la edad, el sexo, el peso y la salud general del paciente humano. Con preferencia, tal composición es administrada parenteralmente, con preferencia intramuscularmente o subcutáneamente. Sin embargo, también puede estar formulada para ser administrada mediante cualquier otra vía adecuada, incluyendo oralmente o tópicamente. La selección de la vía de suministro y dosificación de tales composiciones terapéuticas está dentro del alcance de un experto.

En una realización, los antígenos de Omp85, anticuerpos y fragmentos utilizados en la invención, por sí solos o en combinación con otros antígenos, anticuerpos y fragmentos de otros microorganismos, pueden ser utilizados adicionalmente en composiciones dirigidas a inducir una respuesta inmune protectora en un sujeto frente al patógeno. Estos compuestos de la presente invención son también útiles para inducir una respuesta inmune protectora en los humanos contra la infección N. gonorrhoeae, N. meningitidis o con los otros patógenos identificados en lo que antecede.

En una realización, se proporciona una vacuna basada en antígeno de proteína de membrana externa, para la prevención de la infección gonocócica no sintomática o de la enfermedad sintomática, de la infección meningocócica no sintomática y de la enfermedad sintomática, y de otras enfermedades, que contiene una cantidad efectiva de antígeno de Omp85, útil en la invención, y un portador o diluyente farmacéuticamente aceptable. Esta composición de vacuna puede comprender una o más de las formas aisladas, recombinantes, modificadas o multiméricas del antígeno de Omp85 útil en la invención, o mezclas de las mismas. De forma similar, se pueden emplear sales de las proteínas antigénicas en tales composiciones.

En otra realización de esta invención, una composición de vacuna polivalente puede incluir, no solo el antígeno de Omp85 o el fragmento inmunogénico del mismo, sino que también puede incluir antígenos de otros agentes causantes de enfermedad. Esos otros agentes pueden ser antígenos de otras cepas Neisseriae. Esos otros agentes pueden ser antígenos de patógenos bacterianos completamente distintos o de patógenos virales. Las combinaciones del (de los) antígeno(s) de esta descripción, con otros antígenos o fragmentos de los mismos, son también abarcadas por esta invención a los efectos de inducir una respuesta inmune protectora en el sujeto vacunado frente a más de un solo patógeno. La selección de los componentes de vacuna no es una limitación de la presente invención, y se puede dejar en manos del experto en la materia.

Tales vacunas proteináceas pueden incluir ejemplos de portadores como los descritos en lo que antecede, para las composiciones terapéuticas. Opcionalmente, las composiciones de vacuna pueden contener adyuvantes, conservantes, estabilizadores químicos, así como también otros aditivos de vacuna convencionalmente empleados. Típicamente, los estabilizadores, adyuvantes y conservantes están optimizados para determinar la mejor formulación en cuanto a eficacia en el humano objetivo. Ejemplos adecuados de conservantes incluyen el clorobutanol, sorbato de potasio, ácido sórbico, dióxido de azufre, propil galadio, los parabens, etil vanilina, glicerina, fenol, y paraclorofenol.

Con relación al adyuvante, uno o más de los componentes de vacuna descritos en lo que antecede pueden ser mezclados o adsorbidos con un adyuvante convencional. El adyuvante se utiliza para atraer leucocitos o aumentar la respuesta inmune. Tales adyuvantes incluyen, entre otros, adyuvante RIBI, aceite mineral y agua, hidróxido de aluminio, adyuvante AMPHIGEN, adyuvante ADJUVAX, adyuvante AVRIDINE, L121/escualeno, D-láctido-poliláctido/glicósido, polioles plurónicos, dipéptido de muramilo, Bordatella muerta, y sapónicos, tal como el Quil A.

La invención puede así ser usada en un procedimiento profiláctico que conlleve la administración a un humano de una cantidad efectiva de esa composición. Las composiciones antigénicas de proteína son administradas en una "cantidad efectiva", es decir, una cantidad de antígeno que sea efectiva por una vía de administración que proporcione un beneficio de vacuna, es decir, inmunidad protectora. Las cantidades adecuadas del antígeno pueden ser determinadas por un experto en la materia en base al nivel de respuesta inmune deseada. En general, sin embargo, la composición de vacuna contiene entre 1 ng y 1000 mg de antígeno, y más preferiblemente, entre 0,05 \mug y 1 mg por ml de antígeno. Las dosis adecuadas de la composición de vacuna de la invención pueden ser determinadas fácilmente por un experto en la materia. En general, una dosis adecuada está comprendida entre 0,1 y 5 ml de la composición de vacuna. Además, dependiendo del paciente humano que se esté tratando, es decir, de su peso, edad, y de su estado de salud en general, la dosificación puede ser determinada fácilmente por un experto en la materia.

En general, la vacuna puede ser administrada una vez; y opcionalmente, se pueden administrar después dosis de refuerzo periódicamente. La vacuna puede ser administrada por cualquier vía adecuada. Sin embargo, la administración parenteral, en particular la intramuscular, y la subcutánea, constituyen la vía preferida. También se prefiere la vía de administración oral. Las vías de administración pueden ser combinadas, si se desea, o ajustadas.

Todavía en otra realización de vacuna, la invención incluye una composición que suministra protección pasiva contra la infección por el patógeno. Para esta composición, los anticuerpos contra las proteínas Omp85 aquí descritas son útiles para proporcionar al sujeto una protección inmune pasiva, a corto plazo, frente a la infección. Estas composiciones de vacuna de inmunidad pasiva pueden contener anticuerpos frente a otros patógenos y aditivos de vacuna adecuados, según se ha descrito anteriormente, por ejemplo adyuvantes, etc. Estas composiciones pueden ser administradas en dosis similares a las descritas en lo que antecede para las composiciones que inducen activamente protección inmune en el sujeto vacunado.

B. Composiciones que Contienen Ácido Nucleico

Las secuencias de ácido nucleico o secuencias anti-sentido, útiles en la invención, por sí solas o en combinación con otras secuencias de ácido nucleico, codifican antígenos o anticuerpos de, o dirigidas a, otros microorganismos patogénicos, pueden ser utilizadas además en composiciones terapéuticas y en procedimientos para el tratamiento de humanos con enfermedad causada por infección con N. gonorrhoeae, N. meningitidis o con los otros patógenos identificados en lo que antecede. En otra realización, las secuencias de ácido nucleico útiles en la invención, solas o en combinación con secuencias de ácido nucleico que codifican otros antígenos o anticuerpos de otros microorganismos patogénicos, pueden ser utilizadas en composiciones dirigidas a inducir activamente una respuesta inmune protectora en un sujeto frente al patógeno. Estos componentes de la presente invención son útiles en la inducción de una respuesta inmune protectora en los humanos contra la infección por N. gonorrhoeae, N. meningitidis o por los otros patógenos identificados en lo que antecede.

Para su utilización en la preparación de composiciones de vacuna, son útiles las composiciones y procedimientos de suministro de ácido nucleico, lo que conocen bien los expertos en la materia. Las secuencias de omp85 o los fragmentos del mismo, pueden ser empleados en los usos de esta invención, o en las composiciones descritas en la misma como secuencias de ADN, ya sea administradas como ADN desnudo, o asociado a un portador farmacéuticamente aceptable, y proporcionar expresión in vivo de la proteína de Omp85 o el péptido. El llamado "ADN desnudo" puede ser utilizado para expresar la proteína de Omp85 o el fragmento de péptido (o secuencias anti-sentido) in vivo en un paciente. [Véase, por ejemplo, J. Cohen, Science 259: 1691-1692 (19 de Marzo de 1993); E. Fynan et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 90: 11478-11482 (Diciembre de 1993); J.A. Wolff et al., Biotechniques, 11: 474-485 (1991), que describen usos similares de "ADN desnudo". Por ejemplo, el ADN de omp85 "desnudo" (o secuencias anti-sentido) asociado a secuencias regulatorias, puede ser administrado terapéuticamente o como parte de una composición de vacuna, por ejemplo por inyección.

Alternativamente, el ADN de omp85 o el ADN anti-sentido puede ser administrado como parte de un vector o como un casete que contiene las secuencias de ADN de codificación de Omp85 o los fragmentos o secuencias anti-sentido de los mismas, enlazados a una secuencia promotora y a otras secuencias de plásmido. Brevemente, el ADN que codifica la proteína Omp85 (o secuencia anti-sentido) o el fragmento deseado de la misma, puede ser insertada en un casete de ácido nucleico. Este casete puede estar diseñado para contener, adicionalmente a la secuencia de omp85 que va a ser expresada (o secuencia anti-sentido), otras secuencias opcionales de flanqueo que permiten su inserción en un vector. Este casete puede ser insertado a continuación en un vector de ADN apropiado, corriente debajo de un promotor, una secuencia líder de mARN, un sitio de iniciación, y otras secuencias regulatorias capacitadas para direccionar la replicación y la expresión de esa secuencia in vivo. Este vector permite la infección de células vacunadas y la expresión del omp85 (o secuencia anti-sentido) in vivo.

Se conocen numerosos tipos de vectores apropiados en el estado de la técnica para expresión de la proteína, y pueden estar diseñados mediante técnicas estándar de biología molecular. Tales vectores se eligen entre tipos convencionales de vectores que incluyen a los insectos, por ejemplo, sistemas baculovirus, o sistemas de levadura, fungales, bacterianos o virales. Los procedimientos para la obtención de tales vectores, son conocidos. Véase, Sambrook et al., Molecular Cloning. A Laboratory Manual, 2ª edición, Cold Spring Harbor Laboratory, Nueva York (1989); Miller et al., Genetic Engineering, 8: 277-298 (Plenum Press 1986) y las referencias citadas en la misma. Los vectores virales recombinantes, tales como los retrovirus o los adenovirus, son los preferidos para la integración del ADN exógeno en el cromosoma de la célula.

También donde se desee, las secuencias regulatorias en tal vector que controlan y dirigen la expresión del producto de gen omp85 o secuencia anti-sentido en la célula transfectada, incluyen un promotor inducible. Los promotores inducibles son aquellos que "conectan" la expresión del gen cuando están en presencia de un agente inductor. Ejemplos de promotores inducibles adecuados incluyen, sin limitación, el promotor de metalotionina de oveja (MT), el virus de tumor mamario de ratón (MMTV), el promotor tet, etc. Los agentes de inducción pueden ser un glucocorticoide tal como la dexametasona, por ejemplo el promotor MMTV, o un metal, por ejemplo el zinc, para el promotor MT; o un antibiótico, tal como la tetraciclina para el promotor tet. Aún pueden ser seleccionados otros promotores inducibles por un experto en la materia, tal como los identificados en la solicitud de Patente internacional núm. WO95/13392, publicada el 18 de Mayo de 1995. La identidad del promotor no constituye una limitación de esta
invención.

Cuando se emplean secuencias de ácido nucleico de omp85 o secuencias anti-sentido, como agente terapéutico, o agente de vacuna como "ADN desnudo" enlazado operativamente a una secuencia de promotor seleccionada, en vez de la propia proteína, las cantidades de ADN que han de ser suministradas y las vías de suministro pueden ser paralelas con las cantidades de proteína para la vacuna o el suministro terapéutico descrito en lo que antecede, y pueden ser también determinadas fácilmente por un experto en la materia.

De ese modo, como ejemplo preferido, se puede formular una composición terapéutica que contenga un portador o diluyen y uno o más plásmidos o moléculas de ADN o virus recombinantes que contengan una secuencia de ácido nucleico que sea anti-sentido respecto a la secuencia de gen omp85 [SEQ ID NÚM.: 1 ó 3], un fragmento del mismo, bajo el control de una secuencia adecuada que regule la expresión del mismo. En composiciones que contengan secuencias de ácido nucleico de omp85, se pueden emplear vehículos adecuados para el suministro de ADN.

Adicionalmente, estas composiciones terapéuticas pueden ser polivalentes. Tales composiciones pueden contener componentes terapéuticos que sean secuencias anti-sentido o de otro origen bacteriano o viral, por ejemplo, la secuencia anti-sentido de componentes de especies bacterianas homólogas a las Neisseriae o heterólogas de éstas, y/o una secuencia anti-sentido derivada de antígenos procedentes de un virus causante de enfermedad. Dependiendo de la compatibilidad de los componentes, las secuencias anti-sentido respecto a los antígenos de Omp85 útiles en la invención, pueden formar parte de una composición terapéutica multi-componente dirigida a más de una sola enfermedad.

Un procedimiento terapéutico incluye el tratamiento de un humano respecto a infección con N. gonorrhoeae o con N. meningitidis mediante administración de una cantidad efectiva de tal composición terapéutica contenedora de ácido nucleico. Una "cantidad efectiva" de una composición de ácido nucleico puede ser calculada como aquella cantidad que es capaz de expresar in vivo las cantidades efectivas anteriores de proteínas suministradas exógenamente. Tales cantidades pueden ser determinadas por un experto en la materia. Con preferencia, una composición de ese tipo se administra parenteralmente, con preferencia intramuscularmente o subcutáneamente. Sin embargo, puede ser formulada también de modo que sea administrada a través de cualquier otra vía adecuada, incluyendo oralmente o tópicamente. La selección de la vía de suministro y la dosificación de tales composiciones está al alcance de los expertos en la materia.

A modo de otro ejemplo, una composición de vacuna de esta invención puede ser una vacuna de ADN, que incluya la secuencia de ADN de omp85 [SEQ ID NÚM.: 1 ó 3], o un fragmento de la misma que codifica una proteína inmunogénica o un péptido, opcionalmente bajo el control de secuencias regulatorias. En una realización, esta composición de vacuna puede contener una secuencia de ácido nucleico que codifica una o más de las formas aislada, recombinante, modificada o multimérica del antígeno de Omp85 útil en la invención, o mezclas de las
mismas.

En otra realización de esta invención, las composiciones de vacuna polivalente pueden incluir, no solo la secuencia de ácido nucleico que codifica el antígeno de Omp85 o un fragmento inmunogénico de la misma, sin que también puede incluir secuencias de ácido nucleico que codifican antígenos de otros agentes causantes de enfermedad. Esos otros agentes pueden ser antígenos de otras cepas Neisseriae. Esos otros agentes pueden ser secuencias de ácido nucleico que codifican antígenos a partir de patógenos bacterianos o de patógenos virales completamente distintos. Las combinaciones de las secuencias codificadoras de antígeno útiles en esta invención con otras secuencias de ácido nucleico que codifican antígenos o fragmentos de los mismos a partir de otros patógenos, están también abarcados por esta invención, a los efectos de inducir una respuesta inmune protectora en el sujeto vacunado respecto a más de un único patógeno. La selección de estos otros componentes de vacuna no constituye una limitación de la presente invención, puede dejarse en manos de los expertos en la materia.

Tales vacunas de "ADN" o de ácido nucleico, pueden incluir portadores como los descritos en lo que antecede para las composiciones terapéuticas y, cuando sea adecuado, los componentes o aditivos descritos anteriormente con referencia a las composiciones proteináceas, por ejemplo, adyuvantes, conservantes, estabilizadores químicos, etc., así como también otros aditivos de vacuna empleados convencionalmente. Los aditivos adecuados para su uso en composiciones de ácido nucleico son conocidos por los expertos en la materia, e incluyen ciertos lípidos y liposomas, entre otros componentes conocidos.

En general, un tratamiento adecuado a base de ácido nucleico contiene entre 1x10^{-3} unidades de formación de placa (pfu) y 1x10^{12} pfu por dosis, en caso de que el vector de suministro sea un virus. En otro caso, la dosis se ajusta de modo que proporcione la misma cantidad de proteína expresada según se proporciona mediante las vacunas de proteína. Sin embargo, la dosis, el momento y el modo de administración de estas composiciones pueden ser determinados por un experto en la materia. Factores tales como la edad y la condición física del vacunado, pueden ser tenidos en cuenta para la determinación de la dosis, el momento y el modo de administración de la composición inmunogénica o vacuna de la invención.

Los ejemplos que siguen se proporcionan a efectos de ilustrar la invención, y no limitan el alcance de la misma.

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Ejemplo 1

Cepas Bacterianas, Células, Procedimientos y Condiciones de Cultivo

Cepas FA19, F!635, F!1090, JS1, F62 y MS11LosA de N. gonorrhoeae, utilizadas en los ejemplos que siguen, fueron proporcionadas por el Dr. William M. Shafe (Universidad de Enroy, Atlanta, GA), el Dr. John Swanson (Laboratorios Rocky Mountain, Hamilton, MT), o la American Type Culture Collection (Rockville, MD). Cepas Mp78, MP3, MP81 y HH de N. meningitidis, fueron proporcionadas por el Dr. Mark S. Peppler (Universidad de Alberta, Edmonton, Alberta, Canadá) y el Dr. Zell McGee (Universidad de Utah, Salt Lake City). Todas las demás cepas fueron adquiridas a partir de la American Type Culture Collection.

Cepas Moraxella catarrhalis (ATCC# 8193) y Neisseriae, fueron cultivadas en un medio de impresión gonocócica libre [Swanson, J., Infect. Immun., 19: 320-331 (1978)]. Cepas E. coli y otras Gram negativas, fueron cultivadas en Luria broth.

Se obtuvieron células E. coli XL1-Hilue y SOLR a partir de Stratagene Cloning Systems (La Jolla, CA). Se purificaron fragmentos de ADN procedentes de geles de agarosa con la utilización de Gene Clean II (Bio101, La Jolla, CA). Se purificaron plásmidos con la utilización del kit de giro rápido AIAprep (Qiagen, Chatsworth, CA). El inmuno-manchado se realizó con Millipore (Bedford, MA) Immobilon PVDF. A menos que se indique lo contrario, todos los reactivos mencionados en los ejemplos que siguen fueron obtenidos en Sigma Chemical Co. (St. Louis,
MO).

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Ejemplo 2

Clonación y Apantallamiento Inmunológico de una Librería Genómica Gonocócica

Se produjo una librería de ADN genómico purificando la el ADN genómico de la cepa FA19 de N. gonorrhoeae, y digiriendo parcialmente el ADN en fragmentos con la endonucleasa de restricción TSp509 [New England Biolabs]. Estos fragmentos de ADN fueron ligados con el sitio de restricción T4 de ligasa de ADN [New England Biolabs] del vector bacteriófago lambda ZapII [Stratagene Cloning Systems, La Jolla, CA]. El ADN del fago ligado, fue empaquetado, y colocado sobre células anfitrión de E. coli/DH5\alpha [Gibco BRL, Gaithersburg, MD]. La librería resultante fue apantallada inmunológicamente para la expresión las proteínas de la superficie gonocócica de acuerdo con protocolos proporcionados con el sistema de vector Lambda ZapII. Las placas de la librería fueron apantalladas con un anti-GC-OM, un antisuero extraído de las membranas externas gonocócicas aisladas.

El ADN de plásmido fue rescatado de las placas inmuno-reactivas productoras de fago. El plásmido, pDR4, contenía un inserto de ADN gonocócico de 2,6 kpb. El ADN gonocócico en el pDR4 fue sub-clonado en pUP 1 [Elkins C., J. Bacteriol., 173: 3911-3913 (1991)], generosamente suministrado por el Dr. Chris Elkins (Universidad de Carolina del Norte, Chapel Hill, NC)], produciendo pOmg85.

El fragmento de ADN gonocócico clonado en pOmg85, fue caracterizado mediante análisis de enzima de restricción. El fragmento contenía tres sitios de restricción Hincll internos, que permitieron la sub-clonación de tres fragmentos en pBluescript [Stratagene Cloning Systems La Jolla, CA]. Estos fragmentos y el pDR4, fueron secuenciados por la Molecular Biology Facility de la Universidad de Montana. Se utilizó una estrategia de gen caminante para secuenciar aquellas regiones que no pudieron ser secuenciadas con imprimadores de vector universales. La longitud completa del fragmento de ADN gonocócico fue secuenciada al menos dos veces, y la mayor parte del ADN fue secuenciado a partir de ambas hebras. La secuencia de aminoácido deducida y las comparaciones de los homólogos de Omp85, fueron obtenidas con el paquete de software MacVector (Eastman Chemical Co, New Haven, CT).

Se encontró que el ADN gonocócico de 2,6 kb presente en la pOmp85 contenía un gran marco de lectura abierto (ORF) que codificó un polipéptido de 792 aminoácidos con un peso molecular pronosticado de 87,8 kDa (Figura 2) [SEQ ID NÚM.: 2]. El polipéptido contenía un péptido de señal putativa [Von Heijne G., Nuc. Acids Res., 14: 4683-4690 (1986)]. La retirada de ese péptido de señal produjo un polipéptido maduro con un peso molecular pronosticado de 85,8 kDa. El polipéptido posee también un residuo de fenilalanina carboxi-terminal, característico de las proteínas de membrana externa [Struyve M. et al., J. Mol. Biol., 218: 141-148 (1991)]. Una secuencia de enlace de ribosoma precedió al codón de inicio del ORF. Las secuencias potenciales de promotor no resultaron fácilmente evidentes. El ORF estuvo precedido y seguido por sitios de detención de transcripción rho-independientes. La proteína gonocócica de aproximadamente 85 kDa expresada mediante pOmp85, fue designada como Omp85 y el que la codifica fue designado como omp85.

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Ejemplo 3

Clonación y Secuenciamiento de omp85 Meningocócico

El omp85 meningocócico se obtuvo por amplificación PCR utilizando el sistema PCR de Alta Fidelidad Expandida de Boehringer Mannheim (Indianápolis IN). El diseño de imprimadores PCR estuvo basado en omp85 gonocócico y en secuencias flanqueadoras. El imprimador PCR de omp85 de sentido positivo, contenía los cinco primeros codones del omp85 gonocócico con un sitio de restricción EcoRI y dos nucleótidos extra añadidos al extremo 5' (CG
GAATCATGAAACTGAAACAG) [SEQ ID NÚM.: 5]. El imprimador PCR de omp85 de sentido negativo contenía el complemento reverso de seis codones (TTGCAGTTTTTGCAATTC) [SEQ ID NÚM.: 6] de la secuencia ompH gonocócica situada 244 parees de base 3' del codón de terminación de omp85. Estos imprimadores fueron utilizados en una reacción PCR con ADN purificado de N. meningitidis HH como plantilla. El producto PCR de omp85 meningocócico estuvo ligado en pUP1 para producir pMCOmp85. La secuencia del omp85 meningocócico fue obtenida esencialmente como se ha descrito para el omp85 gonocócico.

Se encontró que el omp85 meningocócico codificada un polipéptido de 797 aminoácidos con un peso molecular pronosticado de 88,5 kDa (Figura 5). El Omp85 meningocócico era un 95% idéntico y un 98% similar al Omp85 gonocócico. Entre los residuos 720 y 745 de aminoácido, el Omp85 meningocócico varió sustancialmente respecto al Omp85 gonocócico, incluyendo la inserción de cinco aminoácidos adicionales.

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Ejemplo 4

Presencia de Omp85 en Cepas de N. gonorrhoeae y N. meningitidis A. Análisis Western

Los análisis Western fueron realizados como sigue. Las proteínas bacterianas separadas por SDS-PAGE (12,5%) [Laemmli UK, Nature, 227: 680-695 (1970)]. Las proteínas separadas fueron transferidas electreoforéticamente sobre PVDF como se ha descrito previamente [Judd RC., Anal. Biochem., 173: 307-316 (1988)]. Se llevó a cabo el manchado en 20 mM de regulador de fosfato de sodio, pH 8, durante 2 horas a 600 mA. La membrana PVDF fue bloqueada durante 1 hora con PBS Tween a temperatura ambiente, incubada durante la noche en sueros anti-GC-OM o anti-Omp85 a 4ºC, se lavó varias veces, se incubó con conjugado de proteína A-peroxidasa de rábano picante (Boehringer Mannheim, Indianápolis, IN), y se reveló con 4-cloro-1-naftol.

Los análisis de mancha Western de las proteínas de E. coli DH5\alpha/pOmp85 se llevaron a cabo separando los lisatos de células bacterianas mediante SDS-PAGE, manchando con azul de Coomassie Brilliant (CBB) o transfiriendo los lisatos a las membranas y sondando con suero anti-GC-OM. Los resultados pusieron de relieve la expresión de un polipéptido de aproximadamente 85 kDa que era reactivo con el suero anti-GC-OM (Figura 1).

El suero anti-GC-OM se hizo reaccionar en el análisis de mancha Western con proteínas celulares totales procedentes de seis manchas representativas de N. gonorrhoeae y cuatro manchas de N. meningitidis. El conjunto de lisatos celulares de E. coli DH5\alpha/pOmp85, y las cepas FA19, FA635, FA1090, JS1, F62 y MS11LosA de N. gonorrhoeae y las cepas MP78, MP3, MP81 y HH de N. meningitidis, fueron separadas mediante un 12,5% de SDS-PAGE, manchadas y sondadas con el suero anti-GC-OM. Se detectó una banda inmuno-reactiva de aproximadamente 85 kDa en todas las cepas de N. gonorrhoeae y de N. meningitidis (Figura 3), pero no en E. coli DH5\alpha de control.

B. Análisis Southern

Los análisis Southern se llevaron a cabo como sigue. Se obtuvo ADN cromosómico mediante extracción de fenol [Moore D., "Preparación y análisis de ADN", en: Ausubel FM, et al., eds. Protocolos Actuales en Biología Molecular. Nueva York: John Wiley and Sons, (1997): 2.1.1-2.1.3] y a continuación fue digerido con varias endonucleasas. El ADN digerido fue separado electroforéticamente en un 1% de gel de agarosa, y el ADN fue transferido a nitrocelulosa con el Bio-Rad Modelo 785 Vacuum Blotter, de acuerdo con las instrucciones y el Southern [Southern E., J. Mol. Biol., 98: 503-510 (1975)]. El ADN de sonda fue extraído a partir geles de agarosa utilizando Bio 101 glassmilk (Vista, CA). La sonda fue etiquetada y la mancha sondada con el sistema Amersham ECL (Arlington Heights, IL).

Una mancha Southern (Figura 4) ilustró la identificación de omp85 en N. gonorrhoeae y en N. meningitidis mediante análisis Southern. El ADN genómico de DH5\alpha de E. coli, de la cepa FA19 de N. gonorrhoeae, y de las cepas MP3, MP73, MP81 y HH de N. meningitidis, fue digerido con endonucleasas de restricción (HincII, EcoRI, Pstl, Clal). Las manchas de las digestiones de ADN separadas fueron sondadas con un fragmento de 688 bp de omp85 gonocócico que se extendía desde el sito más 3' de HincII hasta un sitio HincII en el vector cercano al extremo 3' del gen clonado. Este fragmento fue utilizado como control positivo.

En la cepa FA19 de N. gonorrhoeae y en todas las cepas de N. meningitidis, la sonda de omp85 hibridizó con una sola banda de ADN. También fue identificada una única banda de ADN en las cepas gonocócicas FA635, FA1090, JS1, y MS11 (datos no representados). Esos resultados sugirieron que el omp85 se conservó como copia simple en la Neisseriae. Los datos de secuencia indicaron que el HincII segmentó el omp85 internamente en los tres sitios. La sonda hibridizó en un segmento más grande que el propio en la digestión de HincII del ADN gonocócico (FA19 - HincII). El fragmento genómico resultó de una segmentación interna y externa de HincII, la sonda carecía de la secuencia gonocócica flanqueadora que contenía el sitio HincII externo. La banda genómica de HincII que hibridizó respecto a la sonda, fue derivada probablemente de una copia única del gen omp85, puesto que es improbable que las copias duplicadas del gen pudieran tener sitios HincII situados de forma idéntica, generando fragmentos de idéntico tamaño.

La enzima Pstl fragmentó 309 pares de base a partir del extremo 5' del omp85. El fragmento simple del ADN genómico gonocócico digerido de Pstl (FA19 - pstl) que hibridizó con la sonda contenía probablemente una sola copia del gen. Es posible, aunque improbable, que los fragmentos Pstl contuvieran segmentos de aproximadamente 2 kbp de omp85 en orientaciones invertidas en cada extremo del fragmento de aproximadamente 8 kbp. Los datos de secuencia indicaron que las enzimas ClaI y EcoRI no se fragmentaron dentro del omp85. La sonda de omp85 hibridizó en bandas simples de tamaño similar en el ADN digerido de ClaI de ambas N. gonorrhoeae y N. meningitidis. Estas bandas sugirieron una copia simple de omp85, puesto que es improbable que esta pequeña banda (<6 kbp) contuviera dos copias del gen de aproximadamente 2,3 kbp, y es improbable que las bandas representen fragmentos de idéntico tamaño a partir de copias duplicadas del gen. Resultados similares se obtuvieron para las manchas FA635, FA1090, JS1, F62 y MS11 gonocócicas (datos no representados). Estos resultados soportan la conclusión de que el omp85 se conservó como copia simple en la Neisseira patogénica.

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Ejemplo 5

Similitud con Proteínas Conocidas

Se investigó la base de datos Genbank CDS no redundante [Altchul SD et al., J. Mol. Biol., 215: 403-407 (1990)] en cuanto a proteínas similares a la Omp85 gonocócica. El D-15-Ag de H. influenzae era un 31,5% idéntico y un 61,4% similar (idéntico más conservado) a la Omp85 gonocócica. La Oma87 de P. multocida era un 31,6% idéntica y un 61,3% similar a la Omp85. Varias proteínas hipotéticas con similitud respecto a la Omp85, fueron identificadas. Una proteína hipotética de Brucella abortus (acceso #U51683 de Genbank, Beraden, et al., sin publicar) era un 24,3% idéntica y un 54,2% similar. Una proteína hipotética de E. coli (acceso #U70214 de Genbank, Schramm, et al., sin publicar) era un 33% idéntica y un 62% similar a la Omp85. La Omp85 gonocócica era también similar a las proteínas hipotéticas de Helicobacter pylori (acceso #AE001178 de Genbank - [Tomb JF, et al., Nature, 388: 539-547 (1997)]), 23% idéntica y 51% similar, y Borrella burgdorferi (acceso #AE001178 de Genbank - [Fraser CM, et al., Nature, 390: 580-586 (1997)]), 18% idéntica y 46% similar.

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Ejemplo 6

Organización de Gen y Genes Flanqueadores

Varios cientos de pares de base del ADN que flanquea los ORFs del omp85 de ambas N. gonorrhoeae y N. meningitidis, fueron secuenciados. Para ambas N. gonorrhoeae y N. meningitidis, se identificó un gen similar al ompH de la Salmonella typhimurium [Kosk P., et al., J. Biol. Chem., 264: 1897e-18980 (1989)] aproximadamente a 65 pares 3' de base del ORF de omp85. Un gen similar al ompH ha sido también identificado en la posición relativa de la H. influenzae [Fleischmann, RD et al., Science, 269: 496-512 (1995)] y de la P. multocida. En la H. influenzae, un gen que codifica una proteína hipotética, la HI0198, fue localizado en 5' del gen D-15-Ag [Fleischmann, RD et al., Science, 269: 496-512 (1995)]. Un gen homólogo al gen HI0918 fue identificado en la misma posición en la N. gonorrhoeae. Estos resultados indicaban que la disposición del gen en torno a los homólogos de omp85 se mantuvo considerablemente.

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Ejemplo 7

Presencia de Neisseriae y de Otras Especies

Se utilizó el análisis de mancha Western para determinar si se produjeron proteínas similares a la Omp85 mediante Neisseriae comensal y mediante otras especies Gram negativas. Para permitir un análisis inmunológico más específico, se produjo un suero de conejo polivalente específico de la Omp85 mediante el uso de una proteína de fusión en la que los 200 primeros aminoácidos de la Omp85 gonocócica fueron fusionados genéticamente con la proteína de enlace de maltosa (MBP).

A. Producción de proteína de fusión MBP/Omp85

Fragmentos de Omp85 gonocócica fueron fusionados genéticamente con MBP, purificados en afinidad, y utilizados para producir antisuero específico de Omp85. El Tsp509I que digirió el omp85 de la Omp85, fue ligado en el EcoRI digerido, vector de fusión de proteína de enlace de maltosa, pMAL-c2 [New England Biolabs, Beverly, MA]. El análisis de secuencia reveló que esto podría dar como resultado la fusión de varios fragmentos diferentes de omp85 en un cuadro con maE en pMAL-c2. El ADN ligado fue transformado en E. coli DH5\alpha, y los transformantes fueron apantallados para la expresión de antígenos de Omp85 con el suero anti-OM. Un número de clores inmuno-reactivos fueron identificados y caracterizados. El plásmido del más inmuno-reactivo de éstos, fue designado como pMO4, y determinado análisis de secuencia para expresar una fusión de MBP con los primeros 181 aminoácidos de la Omp85. La proteína de fusión de MBP/Omp85 fue purificada en afinidad a partir de E. coli DH5\alpha/pMO4 según se ha descrito anteriormente [Marchion DC et al., Mol. Microbiol., 6: 231-240 (1997)].

B. Generación de Anti-sueros

La MSB/Omp85 purificada fue utilizada para generar un suero anti-Omp85 en conejos blancos de Nueva Zelanda. Los conejos fueron inmunizados inicialmente con 1 mg de proteína en adyuvante completo de Freund, administrado subcutáneamente. Dos semanas más tarde, se administró 1 mg subcutáneamente en adyuvante incompleto de Freund. Los conejos recibieron después inyecciones intravenosas de 0,1 mg cada dos semanas, durante ocho semanas. Se recogió y absorbió el suero (1:1) con un cultivo lisado de E. coli/Mal-c2 inducido con 1 mM de IPTG durante 1 hora. El suero de conejo resultante fue designado como anti-Omp85.

C. Análisis Western de cepas representativas de N. gonorrhoeae y de N. meningitidis

El suero anti-Omp85 fue utilizado para sondar manchas Western que contenían lisatos celulares de E. coli DH5\alpha, E. coli DH5\alpha/pOmp85, y cepas representativas de N. gonorrhoeae y N. meningitidis (Figura 6). Los lisatos celulares completos de E. coli DH5\alpha, E. coli DH5\alpha/pOmp85, cepas FA19, FA635, FA1090, JS1, F62 y MS11LosA de N. gonorrhoeae y cepas MP78, MP3, MP81 y HH de N. meningitidis, y de E. coli DH5\alpha/pMCOmp85 fueron separados mediante 12,5% de SDS-PAGE, manchados y sondados con el suero anti-Omp85.

El suero anti-Omp85 reacciono con la Omp85 recombinante producida por E. coli DH5\alpha/pOmp85, y con proteínas de aproximadamente 85 kDA en todas las cepas de N. gonorrhoeae y de N. meningitidis probadas. Estos resultados indicaban que la Omp85 se conservó en la Neisseriae patogénica. La presorción del antisuero extrajo la mayor parte de anticuerpos no específicos, pero la extracción completa de todo el anticuerpo reactivo no es posible, de modo que, se pueden ver algunas bandas reactivas en los canales de E. coli de la Figura 6. Las bandas reactivas de la gama de 35 kDa-42 kDa en los anales de N. gonorrhoeae son las proteínas Por, las cuales enlazan de forma no específica con la proteína-A. La Pors meningocócica no enlaza con la proteína-A tan fuertemente (datos no representados).

D. Análisis Western de Nesseriae Comensal y de Otras Especies Gram Negativas

La Omp85 fue utilizada también para sondar manchas Western que contenían lisatos celulares de Neisseriae Comensal y de otras varias especies Gram negativas. Los lisatos celulares completos de E. coli DH5\alpha/pOmp85, N. gonorrhoeae FA19 (A), Neisseriae pharyngis (A), Neisseriae cinérea (A), Neisseriae lactamica (B), Neisseriae mucosae (B), Neisseriae flavescens (C), Neisseriae animalis (C), Neisseriae denitrificans (C), Moraxella catarrhalis (D), Klebsiella pneumoniae, Pseudomonas aeriginosa, y N. meningitidis HH (A) fueron separados en un gel al 12,5% de SDS\alphaPAGE, manchaos y sondados con anti-Omp85. En un experimento separado, los lisatos celulares completos de cepas de E. coli DH5\alpha/pOmp85, N. gonorrhoeae FA19, Salmonella typhimitritim, Shigella flexneri, E. coli 35150 (enterohemorrágica - EHEC), 35401 (enterotoxigénica - ETEC), 43887 (enteropatogénica - EPEC), 43892 (enteroinvasiva - EIEC), y N. meningitidis, fueron separados en un gel al 12,5% de SDS-PAGE, manchado y sondado con un anti-Omp85.

Dos SDS-PAGE (Figuras 7A y 7B) ilustran la distribución de la Omp85 en Neisseria patogénica y comensal (relación de áreas A, B, C y D), y en relación con la bacteria Gram negativa. Los homólogos de la Omp85 fueron identificados en todas las especies de Neisseriae comensal probadas. Esto sugirió que la Omp85 se conservó en todas las especies Neisserianas. El suero anti-Omp85 falló en cuanto a la identificación de cualquier homólogo de Omp85 en la Moraxella catarrhalis, la cual está relacionada de forma muy próxima con la Neisseriae [Rossau R. et al., Int. J. Syst. Bacteriol., 39: 185-198 (1989)]. El análisis Southern confirmó la ausencia de un homólogo de omp85 en esta especie (datos no mostrados). El suero falló en cuanto a la identificación de cualesquiera homólogos de la Omp85 en la Klebsiella pneumoniae, la Pseudomonas aeruginosa, la Salmonella Typhimurium, la Shigella flexneri, y cuatro cepas patogénicas de E. coli probadas.

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Ejemplo 8

Ensayo de Adherencia de Células Gonocócicas

Se llevaron a cabo ensayos de adherencia de células gonocócicas para evaluar el efecto del antisuero específico para la proteína 85 de membrana externa (la Omp85) sobre la capacidad de las cepas gonocócicas MS11LOSA (MS11) y FA19 para enlazar con células epitelianas de Chang. Se prepararon fragmentos Fab a partir de antisuero respecto a los primeros 178 aminoácidos de la Omp85 [SEQ ID NÚM.: 2], antisuero híper-inmune respecto a la albúmina de suero bovino (BSA), y suero normal de conejo (NRS), y se añadieron a razón de 1 \mug, 10 \mug o 100 \mug por ml, a pocillos que contenían una capa confluente de células conjuntivas de Chang. Se añadieron aproximadamente 2x10^{5} bacterias (cepa MS 11 o FA19 de N. gonorrhoeae) a cada pocillo, y se permitió la adherencia durante 3 horas. A continuación de la fijación y del manchado de inmuno-oro/plata, se determinó el número de gonococos adherentes para 22 células. Los números más bajos y más altos fueron descartados, y se determinó el número promedio de bacterias/célula. Los datos resultantes se han registrado en el gráfico de barras de la Figura 8, el cual indica que los anticuerpos específicos de Omp85 estaban capacitados para enlazar con la superficie de las bacterias e interferir con la capacidad de las bacterias para adherirse a las células epiteliales de Chang.

<110> La Universidad de Montana

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<120> Proteínas Omp85 de Neisseria gonorrhoeae y de Neisseria meningitidis, Composiciones que Contienen las Mismas y Procedimientos de Uso de las Mismas

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<130> UM/S8C147:DIVE

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<140>

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<141>

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<160> 8

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<170> PatentIn Vers. 2.0

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<210> 1

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<211> 2379

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<212> AND

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<213> Neisseria gonorrhoeae

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<220>

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<222> (1)..(2376)

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<221> CDS

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<400> 1

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1

2

3

4

5

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<210> 2

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<211> 792

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<212> PRT

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<213> Neisseria gonorrhoeae

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<400> 2

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6

7

8

9

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<210> 3

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<211> 2394

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<212> DNA

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<213> Neisseria meningitidis

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<220>

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<221> CDS

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<222> (1)..(2391)

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<400> 3

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11

12

13

14

15

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<214> 4

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<211> 797

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<212> PRT

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<213> Neisseria meningitidis

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<400> 4

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16

17

18

19

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<210> 5

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<211> 23

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<212> AND

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<213> imprimador PCR

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<400> 5

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\hskip1cm

20

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<210> 6

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<211> 18

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<212> AND

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<213> imprimador PCR

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<400> 6

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\hskip1cm

21

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<210> 7

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<211> 59

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<212> AND

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<213> Neisseria gonorrhoeae

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<400> 7

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\hskip1cm

22

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<210> 8

Claims

1. Una composición de vacuna para la protección de un sujeto contra la enfermedad Neisseriana, que comprende, en un portador farmacéuticamente aceptable, una cantidad efectiva de un polipéptido elegido en el grupo consistente en:

(a) la proteína de SEQ ID NÚM.: 2

(b) la proteína de SEQ ID NÚM.: 4

(c) un fragmento de péptido de SEQ ID NÚM.: 2 ó 4, consistente en ocho más aminoácidos consecutivos de la misma;

(d) una proteína o péptido que comparte al menos un 80% de identidad con cualquiera de las secuencias (a)-(b); y

(e) una secuencia de cualquiera de (a) - (d) fusionada con un segundo polipéptido o proteína.

2. Una composición de acuerdo con la reivindicación 1, que comprende más de una proteína o péptido de cualquiera de (a) - (e).

3. Una composición de acuerdo con la reivindicación 1 ó 2, que comprende además al menos otro antígeno o fragmento del mismo procedente de una especie bacteriana heteróloga u homóloga.

4. Una composición de acuerdo con la reivindicación 3, en la que dicho otro antígeno está fusionado con uno de (a) - (c).

5. Una composición de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en la que dicho polipéptido carece de la secuencia de señal que abarca los aminoácidos 1-21 de SEQ ID NÚM.: 2 ó 4.

6. Un procedimiento de fabricación de una composición de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, que comprende las etapas de aislar un polipéptido recombinante que comprende al menos ocho aminoácidos consecutivos a partir de la secuencia de aminoácido de SEQ ID NÚM.: 2 ó 4, cuyo polipéptido induce anticuerpos que reconocen la SEQ ID NÚM.: 2 ó 4, y formular el citado polipéptido en una cantidad efectiva para inducir los citados anticuerpos en un sujeto mamífero, con un portador farmacéuticamente aceptable.

7. Una composición de vacuna para la protección de un sujeto contra la enfermedad Neisseriana, que comprende, en un vehículo adecuado de suministro de ácido nucleico, una cantidad efectiva de secuencia de ácido nucleico elegida en el grupo consistente en:

(a) SEQ ID NÚM.: 1;

(b) SEQ ID NÚM.: 3

(c) un fragmento de SEQ ID NÚM.: 1 ó 3, consistente en 15 o más aminoácidos consecutivos de la misma;

(d) una secuencia que codifica un polipéptido que comparte al menos un 90% de identidad con cualquiera de SEQ ID NÚM.: 2 ó SEQ ID NÚM.: 4, y

(e) una secuencia de cualquiera de (a) - (d), que codifica además un segundo polipéptido o proteína.

8. Una composición de acuerdo con la reivindicación 7, que comprende más de una secuencia de ácido nucleico de cualesquiera de (a) - (e).

9. Una composición de acuerdo con la reivindicación 7 u 8, que comprende además al menos otra secuencia de ácido nucleico que codifica un antígeno o fragmento del mismo procedente de una especie bacteriana patogénica heteróloga u homóloga.

10. Una composición de acuerdo con la reivindicación 9, en la que dicho otro antígeno está fusionado con una de (a) - (c).

11. Una composición de vacuna para la protección de un sujeto contra la enfermedad Neisseriana, que comprende un anticuerpo aislado que enlaza con una proteína o péptido seleccionado en el grupo consistente en:

(a) la proteína de SEQ ID NÚM.: 2;

(b) la proteína de SEQ ID NÚM.: 4;

(c) un fragmento de péptido de SEQ ID NÚM.: 2 ó 4, consistente en ocho o más aminoácidos consecutivos del mismo, y

(d) una proteína o un péptido que comparte al menos un 90% de identidad con cualquiera de las secuencias (a) - (b).

12. Una composición de acuerdo con la reivindicación 11, que comprende un solo anticuerpo aislado.

13. Una composición de acuerdo con la reivindicación 11, que comprende múltiples anticuerpos.

14. Uso de una composición de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13, en la fabricación de un medicamento para la protección de un sujeto contra la enfermedad Neisseriana.