MXPA97009557A - Miembros de proteinas de choque termico estreptococales de la familia hsp7o - Google Patents

Abstract

Se describen las proteinas de choque térmico (PCT) novedosas de Streptococcus pneumoniae, Streptococcus pyogenes y Streptococcus agalactiae que tienen masas moleculares evidentes de 70-72 kDa. Polipéptidos inmunológicamente relacionados, las secuencias de nucleótidos y aminoácidos derivados de HSP70 de S. pyogenes (SEC ID NO. 21;SEC ID NO. 22), anticuerpos que se unen a las PCT y métodos de ADN recombinantes para la producción de PCT y polipéptidos inmunológicamente relacionados. Los polipéptidos secuencias de ADN y anticuerpos de esta invención proveen nuevos medios para el diagnóstico, prevención y/o tratamiento de enfermedad Estreptococal.

Description

MIEMBROS DE PROTEÍNAS DE CHOQUE TÉRMICO ESTREPTOCOCALES DE LA FAMILIA ASP70 CAMPO TÉCNICO DE LA INVENCIÓN 5 Esta invención se refiere a proteínas de choque térmico novedosas de Streptococcus pneumomae, Streptococcus pyogenes y Streptococcus agalactiae y péptidos inmunológicamente relacionados, los cuales proveen la base para nuevos agentes inmunoterapéuticos, profilácticos y de diagnóstico, útiles en el tratamiento, prevención y diagnóstico de enfermedades Más particularmente, esta invención se refiere a proteínas de choque térmico de S pneumoniae, S pyogenes y S agalactiae, miembros de la familia HSP70, los cuales tienen una masa molecular evidente i*í de 70-72 kilodaltons, a las secuencias de nucleótido correspondiente y de aminoácido derivadas, a métodos de ADN recombinante para la producción de HSP70/HSP72 y pohpéptidos inmunológicamente relacionados, a anticuerpos para unirse a estos HSP, y a métodos y composiciones para el diagnóstico, prevención y tratamiento de 0 enfermedades causadas por S pneumoniae, y bacterias relacionadas, tales como Streptococcus pyogenes y Streptococcus agalactiae ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN La S pneumomae es un agente importante de enfermedad en seres humanos, enfermedad especialmente entre bebés, y personas de edad avanzada e inmunocomprometidas Es una bacteria frecuentemente aislada de pacientes con enfermedades invasivas tales como bactepoanemia/septicanemia, neumonía y meningitis con una alta morbidez y una producción de mortalidad en todo el mundo Aunque el caso de fármacos antimicrobianos ha reducido la mortalidad total de enfermedades neumococales, la presencia de organismos neumococales resistentes se ha vuelto un problema principal en el mundo en la actualidad Las vacunas neumococales efectivas pueden tener un impacto importante en la morbidez y la mortalidad asociadas con enfermedades de S pneumomae Tales vacunas también podrían ser potencialmente útiles para evitar otitis media en bebés y niños pequeños Es evidente que un numero de factores neumococales son potencialmente importantes en la patogénesis de enfermedades [G J Boulnois, J Gen Microbiol , 138, pp 249-259 (1992), C J Lee et al , Cnt Rev Microbio! , 18, pp 89-114 (1991)] La cápsula de los neumococos, a pesar de su falta de toxicidad, se considera que es sine qua non de virulencia neumococal Mas de 80 serotipos capsulares neumococales han sido identificados con base en las diferencias antigénicas Los anticuerpos son el mecanismo de protección y la importancia de anticuerpos anticapsulares es la defensa huésped contra S pneumomae y esta bien establecido [R Austpan, Am J Med , 67, pp 547-549 (1979)] Sin embargo, la vacuna neumococal actualmente disponible, que comprende 23 polisacapdos capsulares que muy frecuentemente causan enfermedad, tiene desventajas significativas tales como una pobre inmunogenecidad de polisacápdos capsulares, la diversidad de serotipos y las diferencias en la distribución de serotipos con el tiempo, áreas geográficas y grupos de edad En particular, la falla de las vacunas existentes para proteger niños pequeños contra la mayoría de los serotipos ha acelerado la evaluación de otros componentes de S pneumoniae La evidencia en incremento indica que ciertas proteínas neumococales pueden jugar un papel activo importante tanto en términos de protección como de patogenicidad [J C Patón, Ann Rev Microbiol 47, pp 89-115 (1993)] Sin embargo, solo se han estudiado muy pocas proteínas S pneumomae Esto puede ser el resultado de la falta de anticuerpos específicos de proteina los cuales hacen difícil el estudio del papel de los antígenos de proteína en la protección y en patogenicidad Se cree que los antigenos de protema neumococales no son muy inmungénicos y que la mayoría de las respuestas de anticuerpo son a la fosfocohna y a los polisacapdos capsulares [L S McDaniel et al , J Exp Med 160, pp 386-397 (1984) R M Drause Adv Immunol , 12 pp 1-56 (1970), D G Braun et al J Exp Med 129 pp 809-830 (1969)] En un estudio utilizando ratones inmunodeficientes enlazados a X, los cuales responden pobremente a antígenos de carbohidrato y a fosfocolina, pero presentan respuestas relativamente normales a antígenos de anticuerpo, la frecuencia para obtener los anticuerpos monoclonales reactivos con antígenos de proteína neumococal fue menor que 10%, sugiriendo así que las proteínas de S. pneumoniae son inmunógenos pobres [McDaniel et al., supral. Streptococcus agalactiae, también denominado Streptococcus grupo B (GBS), es la causa más común de sepsis (infección en la sangre) y meningitis en recién nacidos GBS también es una causa frecuente de neumonía en recién nacidos Aproximadamente 8,000 bebés en los Estados Unidos contraen la enfermedad de GBS cada año, 5 % - 15 % de estos bebés mueren Los bebés que sobreviven, particularmente aquellos quienes presentan meningitis tienen problemas a largo plazo, tales como pérdida de la audición o visión o incapacidad de aprendizaje En mujeres embarazadas, GBS puede causar infecciones en el tracto urinario, infecciones en el útero (amnionitis, endometptis), y un parto de feto muerto. Entre las mujeres quienes no están embarazadas y hombres, las enfermedades más comunes causadas por GBS son infecciones en la sangre, infecciones de la piel o tejido suave, y neumonía Aproximadamente 20% de los hombres y mujeres no embarazadas con la enfermedad de GBS mueren de la enfermedad Las infecciones de GBS tanto en recién nacidos como en adultos usualmente son tratadas con antibióticos (por ejemplo, penicilina o ampicilina) dados intravenosamente La mayoría de las enfermedades de GBS en recién nacidos pueden ser evitadas proporcionando ciertos antibióticos a las mujeres embarazadas en forma intravenosa durante el parto. Las vacunas para evitar la enfermedad de GBS están siendo desarrolladas. En el futuro, se espera que las mujeres quienes sean vacunadas formarán anticuerpos que cruzan la placenta y protejan al bebé durante el nacimiento y la etapa de la infancia. Ya que en la década de 1980 Streptococcus pyogenes, también denominado Streptococcus Grupo A (GAS) volvió a emerger I o como una causa de enfermedades severas, las cuales se podrían deber a un incremento en la virulencia del organismo GAS ocasiona faringitis, comúnmente denominada "garganta estreptocócica", e infecciones de la piel (impétigo, erisipela/celu tis) La "garganta estreptocócica" y el impétigo pueden conducir a glomerulonefptis (daño del riñon) Aproximadamente 3% de infecciones de "garganta estreptocócica" dan como resultado fiebre reumática (artritis de migración), cuyas complicaciones incluyen enfermedad de Corea (síntomas neuro lógicos) y, en un 50% de los casos, enfermedad del corazón reumática (daño de la válvula del corazón) con endocarditis 0 como una posible consecuencia a largo plazo Es importante tratar el impétigo y la "garganta estreptocócica" con antibióticos para evitar el desarrollo de complicaciones La infección con cepas productoras de toxinas puede dar como resultado escarlatina (salpullido difuso y fiebre) o en los síndromes de choque tóxico estreptococales 5 extremadamente severos (GSS, GAS ha sido denominado como "bacteria que come carne"), los cuales se caracterizan por un rápido desarrollo de choque y falla del sistema orgánico múltiple TSS tiene un régimen de fatalidad de 30 a 70% a pesar del tratamiento agresivo que implica la remoción del sitio de la infección bacteriana y terapia antibiótica. La incidencia de TSS es de 10 a 20 casos por 100,000 En la actualidad no existe ninguna vacuna contra GAS Las proteínas de choque térmico o de tensión ("HSPs") se encuentran entre las proteínas más altamente conservadas y abundantes encontradas en la naturaleza [F C Neidhartdt et al , Ann Rev Genet , 18, pp 295-329 (1984), S Lindquist, Ann Rev Biochem , 55, pp 1151-1191 (1986)] Estas son producidas a través de todas las células en respuesta a varios estímulos fisiológicos y no fisiológicos La respuesta de choque térmico, en donde un incremento repentino en la temperatura induce la síntesis de HSPs, es la respuesta mejor estudiada de las respuestas de tensión Otra condiciones ambientales tales como un pH bajo, deficiencia de fierro y peróxido de hidrogeno pueden conducir también a HSPs Las HSPs han sido definidas por su tamaño, y miembros de las familias hsp90, hsp70 y hsp60 se encuentran entre las HSPs principales encontradas en todos los procariotes y eucariotes Estas proteínas satisfacen una variedad de funciones de chaperon que ayudan al doblamiento de la proteína, y ensamble y membranas de cruce de traslocación de ayuda [C Georgopoulos y W J Welch, Ann Rev Cell Biol , 9, pp 601-634 (1993), D Ang et al , J Biol Chem 266, pp 24233-24236 (1991)] Como chaperones moleculares y posiblemente a través de otros mecanismos, las HSPs probablemente están involucradas en la protección de células contra los efectos dañinos de la tensión El hecho de que varios factores de virulencia son regulados por condiciones ambientales sugiere un papel para las HSPs en la patogenicidad microbiana [J J Mekalanos, J Bactepol , 174, pp 1-7 (1992), P J Murray y R A Young, J_ Bactepol , 174, pp 4193-4196 (1992)] A este respecto, estudios recientes en la especie Salmonella sugieren que la respuesta a la tensión puede estar críticamente unida a la capacidad de patógenos intracelulares para iniciar y sostener una infección [N A Buchmeír y F Heffron, Science, 248, pp 730-732 (1990), K Z Abshire y F C Neidhardt, J Bactepol , 175, pp 3734-3743 (1993), B B Fmlay et al , Science, 243, pp 940-943 (1989)] Otros han demostrado que la 11 stepol isina , un factor de virulencia esencial en el L monocytogenes, es inducida bajo condiciones de choque térmico [Z Sokolovic y W Goebel, Infect Immun , 57, pp 295-298 (1989)] Ahora la evidencia está acumulando que HSPs son antígenos principales de muchos patógenos Los miembros de la familia hspdO, también denominados proteínas relacionadas con GroEl por su similitud a la protema GroEl E coli son antigenos principales de una variedad de patógenos bacterianos incluyendo Mycobacterium leprae y Mycobacterium tuberculosis [D Young et al Proc Nati Acad Sci usa 85, pp 4267-4270 (1988)], Legionella pneumophila [B B Pl i ka y ti s et al , J Clin Microbiol , 25 pp 2080-2084 (1987)], Borrelia Burgdofen [B J Luft et al , J Immunol 146 pp 2776-2782 (1991)], y Chlamydia trachomatis [E A Wagar et al , J Infect Dis.. 162, pp 922-927 (1990)] Este antígeno es un homólogo del "antígeno común" ubiquitoso, y se cree que está presente en cada bacteria [J E Thole et al, Microb Pathogen , 4, pp 71-83 (1988)] Los anticuerpos a los miembros de la familia hsp70, o proteínas relacionadas con adnK, también han sido descritos por sus varias infecciones bacterianas y parásitas [Young, et al , supra, Luft et al , supra, D M Engman et al , J Immunol , 144, pp 3987-3991 (1990), N M Rothstem et al , Molec Biochem Parasitol , 33, Adv Immunol , 45, pp 283-334 (1989)] Las HSPs pueden producir respuestas fuertes de célula B y T y se ha mostrado que el 20% de los T-linfocitos CD4+ de ratones inoculados con M tuberculosis fueron reactivas solamente a la proteina hsp60 [S H E Kaufman et al , Eur J Immunol , 17, pp 351-357 (1987)] Similarmente, 7 de una colección de 24 anticuerpos monoclonales a proteínas M leprae reconocieron determinantes en hsp60 [H D Engers et al , Infect Immun . 48, pp 603-605 (1985)] Parece que la respuesta inmune a proteínas de estrés puede jugar un papel importante en la protección contra la infección Consistente con eso es la demostración de que los anticuerpos y las células T reactivas con HSPs microbianas pueden exhibir actividades de neutralización y de protección [A Noli et al , Infect Immun , 62, pp 2784-2791 (1994), y S L Danihtion et al , Infect Immun , 58, pp 189-196 (1990)] Las propiedades inmunológicas de proteínas de tensión las hacen atractivas como componentes de vacunas y varias HSPs actualmente se están considerando para evitar infecciones microbianas y para el tratamiento del cáncer Sin embargo, los estudios se han enfocado en patógenos intracelulares tales como Mycobactena, Salmonella, Chlamydia y diversos parásitos La información con respecto a los antígenos de proteína de choque térmico en bacterias gram-positivas extracelulares esta mucho menos documentado En S pneumomae, S pyogenes y S agalactiae, ni las proteínas de choque térmico ni sus estructuras de gen han sido identificadas DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN La presente invención dirige los problemas presentados anteriormente proveyendo proteínas de choque térmico novedosas de S pneumoniae, S pyogenes y S agalactiae y peptidos inmunologicamente relacionados También se proveen secuencias de ADN que codifican para los polipeptidos anteriores, vectores que contienen los pohpéptidos, huespedes unicelulares transformados con aquellos vectores, y un procedimiento para hacer polipeptidos recombinantes substancialmente puros También se proveen anticuerpos específicos a los polipeptidos anteriores Los polipeptidos, secuencias de ADN y anticuerpos de esta invención proveen la base de métodos y composiciones farmacéuticas novedosos para la detección prevención y el tratamiento de enfermedades Particularmente, esta invención provee una vacuna novedosa a base de fragmentos de estos polipéptidos que son específicos a cepas estreptococales La proteína de choque térmico novedosa es la proteína de choque térmico de aproximadamente 72 kDa de Strsptococcus pneumoniae ("HSP72") (SEC DE IDENT NO 5), la proteína de choque térmico de aproximadamente 70 kDa de Streptococcus pyogenes ("HSP70") (SEC DE IDENT NO 20) y la proteina de choque térmico de aproximadamente 70 kDa de Streptococcus agalactiae ("HSP70") (SEC DE IDENT NO 22), incluyendo análogos, homólogos y derivados de las mismas, y fragmentos de los polipeptidos anteriores que contienen por lo menos un epitope inmunogénico Los fragmentos preferidos de HSP70/72 incluyen la porción C-terminal de los pohpeptidos HSP70/72 Mas particularmente incluye el fragmento de 169 residuos de C-terminal ("C-169") (residuos 439-607, SEC DE IDENT NO 5) el fragmento de 151 residuos de C-terminal ("C-151") (residuos 457-607, SEC DE IDENT NO 5) y fragmentos mas pequeños que consisten de epítopes de peptido dentro de la región C-169 Los fragmentos particularmente preferidos dentro de la región C-169 de HSP72 incluyen las secuencias de peptido GFDAERDAAQAALDD (residuos 527-541 de la SEC DE IDENT NO 5) y AEGAQATG N AG DD VV (residuos 586-600 de la SEC DE IDENT NO 5) los cuales son exclusivos a HSP72 de Streptococcus pnßumoniae Aun muy preferidos son los fragmentos que producen una reacción inmune contra S pneumonías, S pyogenes y S agalactias, pero no provocan una reacción auto-inmune en un huésped humano Dichos fragmentos pueden ser seleccionados de los siguientes péptidos CD870, CS873, CS845, CS875, CS876, CS877, CS878, CS879, CS880, CS882, MAP1, MAP2, MAP3 y MAP4 (ver CUADRO 5, supra). Los anticuerpos preferidos de esta invención son los anticuerpos monoclonales F1-Pn3.1, F2-Pn32, F2-Pn3 3 y F2-Pn34 ("MAbs"), los cuales son específicos a HSP72 Los anticuerpos muy preferidos son los anticuerpos monoclonales F2-Pn3.2 y F2-Pn34 que son específicos a ambos HSP70 y HSP72 Aún muy preferidos son los anticuerpos F1-Pn3 1 que son específicos para Streptococcus pneumomae El polipéptidos y anticuerpos preferidos de esta invención proveen la base para métodos y composiciones farmacéuticas novedosos para la detección, prevención y tratamiento de enfermedades neumococales BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS La FIGURA 1 representa un fluorograma, el cual muestra el efecto del choque térmico en una síntesis de proteína de S pneumomae Los extractos de célula en el panel A son la cepa 64 del tipo 6 de S pneumonías Los extractos de célula en el panel B son la cepa 53 de tipo 4 de S pnsumonias Los extractos de célula en los carriles de números impares fueron incubados a 37°C Los extractos de célula en los carriles de números pares fueron incubados a 45°C durante 5 minutos Los extractos de célula después fueron marcados con [35S]met?on?na durante 10 minutos (carriles 1, 2 y 7, 8), 30 minutos (carriles 3, 4 y 9, 10), o 60 minutos (carriles 5, 6) Los marcadores de masa molecular en kilodaltons se muestran a la izquierda Las posiciones de HSP80, HSP72 y HSP62 se muestran a través de las flechas en el lado derecho de cada panel. La FIGURA 2 es una representación gráfica de una comparación de los perfiles electroforéticos de proteínas marcadas con [35s]metion?na en S pneumomae en presencia de ( ) o ausencia de ( ) de exposición a choque térmico Se determinaron las huellas densitometpcas midiendo la densidad óptica relativa (eje Y) contra la movilidad de las bandas de proteina marcadas (eje X) Las exploraciones densitometpcas de SDS-PAGE de la FIGURA 1, carriles 1 y 2, se muestran La FIGURA 3 representa un fluorograma, el cual muestra los antígenos de proteína S pneumonías inmunoprecipitados a través de sueros de ratones inmunizados con extracto de proteína S pneumomae soluble en detergente Las proteínas marcadas con [35s]met?on?na de S pneumomae se desarrollaron a 37 °C y se incubaron a 37°C (carriles 3, 5, 7 y 9) o se les aplicó choque térmico a 45°C (carriles 4, 6, 8 y 10), fueron inmunoprecipitadas con sueros de ratón 1 (carriles 3 a 6) o ratón 2 (carriles 7 a 10) y después se analizaron a través de SDS-PAGE y fluorografía Los sueros fueron probados después de la primera inmunización (carriles 3, 4 y 7, 8) y después de la segunda inmunización (carriles 5, 6 y 9,10). Los lisatos de célula de S. pneumoniae con choque térmico sin [ S]metionina y con choque térmico, se muestran en los carriles 1 y 2, respectivamente. La posición de las HSPs se indica a través de las flechas a la izquierda del fluorograma. La FIGURA 4 representa un fluorograma, el cual muestra los antígenos de proteína S. pneumomae inmunoprecipitados a través de sueros de ratones inmunizados con bacterias S pneumomae aniquiladas con calor Las proteínas marcadas con [ S]met?on?na de S. pneumoniae se desarrollaron a 37°C y se incubaron a 37°C (carriles 3, 5 y 7) o se les aplicó choque térmico a 45°C (carriles 4, 6 y 8), fueron inmunoprecipitadas con sueros de ratón 1 (carriles 3,4), ratón 2 (carriles 5,6) y ratón 3 (carriles 7,8) y después se analizaron a través de fluorografía y SDS-PAGE Los sueros fueron probados después de la segunda inmunización solamente Los lisatos de célula de S. pneumonías con choque 35 térmico y sin choque térmico marcadas con [ S]met?on?na, se muestran en los carriles 1 y 2, respectivamente Las posiciones de las HSPs se indican por las flechas a la izquierda del fluorograma La FIGURA 5 representa una fotografía la cual muestra los antígenos de S pnsumomae detectados mediante análisis de tinción Western Los extractos de célula completa fueron sondeados con sueros de 15 ratones (carriles 1-15) inmunizados con bacterias S pneumoniae aniquiladas con calor El carril 16 muestra la proteína HSP72 detectada a través de MAb F1-Pn3 1 En el panel A, los sueros fueron probados después de la segunda inmunización En el panel B, la reactividad de 4 de los 15 sueros probados después de la primera inmunización, es mostrada. Las posiciones de las bandas de proteína de 53.5 kDa y 47 kDa se indican a través de las barras a la izquierda. La posición de las HSP72 se muestra a través de las flechas a la derecha de cada panel La FIGURA 6 representa un fluorograma, que muestra el carácter específico de MAb 71-Pn3.1 para HSP72. Las proteínas 35 marcadas con [ S]met?on?na de S pneumomae en ausencia (carriles 1 , 3 y 5) o presencia (carriles 2, 4 y 6 de exposición a choque térmico, fueron inmunoprecipitadas con MAb de control lgG2a (carril 3,4) o F1-Pn3 1 (carril 5,6) y después se analizaron a través de SDS-PAGE y fluorografía En los carriles 1 y 2, respectivamente, se muestran los 11 satos de célula de S pneumomae sin choque térmico 35 y con choque térmico marcadas con [ S]met?on?na La posición de las HSPs (las tres) se muestra por las flechas a la izquierda del fluorograma La FIGURA 7, panel A, representa una inmunotinción la cual muestra la reacción de extractos de célula de S pneumonías con choque térmico y sin choque térmico marcadas con [ S]met?on?na con MAb F1-Pn3 1 El carril 1 contiene lisatos de célula de choque térmico (45°C) El carril 2 contiene satos de célula sin choque térmico (37°C) El panel B representa un fluorograma de la inmunotinción mostrada en el panel A La FIGURA 8 representa una tinción Western, la cual muestra la localización subcelular de HSP72 de S. pneumoniae Las muestran conteniendo 5 µg de proteína de fracción de membrana (carril 1) y fracción citoplásmica (carril 2) de S. pneumoniae fueron electroforeadas sobre SDS-PAGE transferidas a nitrocelulosa y con sonda con MAb F1-Pn3.1. La FIGURA 9 es una fotografía de una inmunotinción que muestra la reactividad de las proteínas de fusión recombinantes conteniendo la región C-169 de HSP72 de S pneumomae con MAb 71-Pn3.1. El carril 1 contiene extractos de célula completa de la cepa 64 de S. pneumoniae con sonda con MAb F1-Pn3 1 específico en HSP72. Los carriles 2 y 3 contienen lísatos de fago de E co infectado con ?JBD17 cultivados en presencia ( + ) o ausencia (-) de IPTG y se le aplicó sonda con MAb F1-Pn3 1 específico en HSP72 Los carriles 4 y 5 contienen satos de fago de E coli infectado con ?BD7 cultivado en presencia ( + ) o ausencia (-) de IPTG y con sonda con MAb F1-Pn3 1 específico en HSP72 Los marcadores de masa molecular se muestran a la izquierda Las posiciones de las proteínas reactivas de 74 kDa y 160 kDa se muestran a la izquierda y a la derecha, respectivamente La FIGURA 10 es una representación esquemática del mapa de restricción de HSP72 (DnaK) y del sitio Fue e insertos de clones recombmantes Las relaciones entre los fragmentos de ADN se muestran con respecto uno al otro Las FIGURAS 10A y 10C ilustran el mapa de restricción de los sitios HSP 72 (DnaK) y Fue respectivamente La FIGURA 10B ilustra los insertos de los varios fagos y plásmidos descritos en el Ejemplo 3. H(Hindlll), E(EcoRI), V(EcoRV); P(Pstl); y X(Xhol) indican las posiciones de sitios de endonucleasa de restricción. Los fragmentos de ADN en el sitio HSP72/DnaK (n); el sitio Luc {lll); y los fragmentos utilizados como sondas en los análisis de tinción Southern ( ), son indicados La FIGURA 11 representa los análisis de SDS-PAGE y tinción Western de la proteína de 74 kDa recombinante Los extractos de célula completa de E. co transformados con los plásmidos pKBD179 (carril 1), pJBDf51 (carriles 2 y 3) y pJBDf62 (carril 4 y 5) y se cultivaron en presencia ( + ) o ausencia (-) de IPTG fueron sometidos a electroforesis en gel de 10% de poliacplamida Las proteínas después fueron visualizadas a través de tinción de Azul Coomassie (A) o tinción Western (B) utilizando MAb F1-Pn3 1 específico en HSP Los marcadores de masa molecular en kilodaltons se muestran a la izquierda La flecha en el lado izquierdo de cada panel marca el marcador de proteína de 74 kDa La FIGURA 12 representa la detección de antígenos de HSP72 nativos y recombinantes a través del análisis de tinción Western Los hsatos de célula completa de E coli transformados con plásmidos pJBDk51 (carriles 1 y 3) y pJBD921 (carril 2) y lisatos de célula de la cepa 64 de S pneumonías (carril 4) fueron sometidos a electroforesis en gel de 10% de poliacplamida y se electrotransfieron a nitrocelulosa. La inmunotinción fue sondeada con MAb F1-Pn3 1 específico en HSP72 Las FIGURAS 13A-13D representan una comparación de la secuencia de aminoácido predicha del marco de lectura abierto de HSP72 de S. pneumoniae (HSP72 SPNEU) con aquellas reportadas para las siguientes proteínas HSP70/aDnK; ECOLI, Echerichia coli, BORBU, Borrelia burgdorferi; BRUOV, Brucella ovis; CHLPN, Chlamydia pneumonía; BACME, Bacillus megatorium; BACSU, Bacillus sbutilis, STAAU, Staphylococcus aureus, LACLA, Lactococcus lactis; y MYCTU, Mycobacterium tuberculosis Solamente se indican los aminoácidos desiguales Los aminoácidos idénticos y conservados se muestran en cajas y sombreados, respectivamente. La FIGURA 14 representa una fotografía de un SDS-PAGE, el cual muestra la HSP72 de S pneumomae recombinante purificada a través de cromatografía de afinidad Las fracciones del sobrenadante de los lisatos de E coli (pJBDk51) (carril 2) y 20 µg de HSP72 purificado mediante ipmunoafinidad (carril 3) fueron sometidos a electroforesis en gel de 10% de poliacplamida Las proteínas después fueron visualizadas a través de tinción de Azul Coomassie El carril 1 muestra la migración de los marcadores de masa molecular (106 kDa, 80 kDa, 49 5 kDa, 32 5 kDa, 27 5 kDa y 18 5 kDa). La FIGURA 15 representa una fotografía de SDS-PAGE, la cual muestra el fragmento C-169 de S pneumomae recombinante purificado a través de la solubilización de cuerpos de inclusión Varias cantidades de la proteína C-169 purificada (carril 1 5 µg, carril 2, 2 5 µg; y carril 3, 1 µg) y los lisatos de célula completa de E. coli transformado con los plásmidos pDELTAI (carril 4) y pJBD?I (carril 5) fueron sometidos a electroforesis en gel con 10% de poliacplamida. Las proteínas después fueron visualizadas a través de tinción de Azul Coomassie La FIGURA 16 es una representación gráfica de la curva de sobrevivencia de ratones Balb/c protegidos de infección por S. p ' neumoniae a través de la inmunización con HSP72 rec . Los datos son representados como el porcentaje (%) de sobrevivencia durante un periodo de 14 días para un total de 10 ratones por grupo experimental La FIGURA 17 es una representación gráfica de la curva de sobrevivencia de ratones Balb/c protegidos de infección por S p ' neumoniae a través de la inmunización con C-169 rec Los datos están presentados como el porcentaje (%) de sobrevivencia durante un periodo de 14 días para un total de 10 ratones por grupo experimental La FIGURA 18 es un mapa del plásmido pURV3 conteniendo C-151rec, la región de codificación para los 151 aminoácidos en el extremo carboxilo de la HSP72 de S pneumomae, R Ampí , región de codificación de resistencia a la ampicihna, ColEl orí, origen de replicación, cl857, bacteriófago ? cl857 de gen represor sensible a la temperatura, ? PL, promotor de transcripción del bacteriófago ?, y terminador de transcripción T1, T1 La dirección de transcripción está indicada por las flechas Bgl\\\ y Ba HI son los sitios de restricción utilizados para insertar la región de codificación p rara C-151 rec de HSP72 de S p ' neumomae La FIGURA 19 ilustra la distribución de titulaciones anti-S pneumonías en sueros de ratones Balb/c inmunizados con HSP72 rec Los sueros fueron recogidos después de las primera, segunda y tercera inyecciones con 1 µg (O) o 5 µg ( ) de HSP72rec y se evaluaron individualmente para el anticuerpo anti-S pneumoniae a través de ELISA Las titulaciones fueron definidas como la dilución mas alta a la cual los valores A410 estuvieron por arriba de 0 1 de los valores de antecedente Las lineas planas indican la reciprocidad media de las titulaciones de anticuerpo para cada grupo de ratones mientras que la linea desvanecida indica el valor medio para sueros preinmunes La FIGURA 20 ilustra la distribución de titulaciones anti-S pneumonías en sueros de ratones Balb/c inmunizados con C-169 Los sueros fueron recogidos después de las primera segunda y tercera inyecciones con 1 µg (O) o 5 µg ( ) de C-169 y se evaluaron individualmente para el anticuerpo apti-S pneumomae a través de ELISA Las titulaciones fueron definidas como la dilución mas alta a la cual los valores de A410 estuvieron por arriba de 0 1 de los valores de antecedente Las lineas planas indican la reciprocidad media de las titulaciones de anticuerpo para cada grupo de ratones, mientras que la linea desvanecida indica el valor medio para sueros preinmunes La FIGURA 21 ilustra la distribución de titulaciones anti S pneumomae en sueros de ratones Balb/c inmunizados con C 151 rec '-os sueros fueron recogidos después de las primera, segunda y tercera inyecciones con 0 5 µg de C-151rec y se evaluaron individualmente para el anticuerpo anti-S pneumomae mediante ELISA Las titulaciones fueron definidas como la dilución mas alta a la cual los valores de A410 estuvieron por arriba de 0 1 de los valores de antecedente Las lineas planas indican la reciprocidad media de titulaciones de anticuerpo para cada grupo de ratones, mientras que la linea desvanecida indica el valor medio para sueros preinmunes La FIGURA 22 ilustra la respuesta de anticuerpo de changos cynomolgus inmunizados con antigenos HSP72 recombinantes Se inmunizaron grupos de dos changos con la protema HSP72 rec o C-169 rec en el día 1 día 22 y ' día 77 Los sueros fueron recogidos regularmente durante el curso de la inmunización y se evaluaron individualmente para anticuerpo especifico de HSP72 neumococal a través de análisis de tinción Western Las titulaciones fueron definidas como la dilución mas alta a la cual se visualizo la banda HSP72 La FIGURA 23 ilustra la unión de sueros hipepnmunes a peptidos en una ELISA de fase solida Los sueros de conejo ratón y chango de animales inmunizados ya sea con la protema HSP72 rec o C-169rec fueron probados para su reactividad a peptidos Se obtuvieron valores de densidad óptica con los sueros probados a una dilución de 1 100 excepto para los valores que corresponden a la reactividad de sueros de conejo al peptido MAP2 y sueros de mupno a péptidos MAP2 y MAP4, los cuales fueron obtenidos con sueros diluidos a 1 1000 La FIGURA 24 representa la secuencia de concenso establecida de las secuencias de ADN de los marcos de lectura abierta de hsp70/dnak de Streptococcus pneumomae (spn-orf), Streptococcus pyogenes (sga-orf) y Streptococcus agalactiae (sgb-orf) e indica las substituciones e inserciones de nucleotidos específicos a cada especie La FIGURA 25 representa la secuencia de concenso establecida de las secuencias de proteina de Hsp70 de Streptococcus pneumomae (spn-prot), Strsptococcus pyogenss (sga-prot) y Strsptococcus agalactias (sgb-prot) e indica las substituciones e inserciones de aminoácidos específicos a cada especie La FIGURA 26 representa un fluorograma el cual muestra el efecto de choque térmico en la síntesis de proteina S agalactias y el antigeno de proteina S agalactias inmunoprecipitado a través de MAb F2-Pn34 Los lisatos de célula de proteínas marcadas con [ S]met?on?na de S agalactias desarrolladas a 37°C e incubadas a 37°C (carriles con números impares) o con choque térmico a 43°C (carriles con números pares) fueron analizadas a través de SDS-PAGE y fluorografía Los carriles 3 y 4 muestran los inmunoprecipitados obtenidos utilizando MAb F2-Pn3 4 DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN De acuerdo con un aspecto de la invención, se proveen proteínas de choque térmico novedosas de S pneumonías, S pyogenes y S agalactiae, y análogos, homólogos derivados y fragmentos de las mismas, conteniendo por lo menos un epitope inmunogénico Como se utiliza en la presente, una "proteina de choque térmico" es una proteína de existencia natural que exhibe transcripción preferencial durante condiciones de tensión térmica La proteína de choque térmico, de acuerdo con la invención puede ser de origen natural, o puede ser obtenida a través de la aplicación de técnicas de ADN recombinante, o técnicas de síntesis química convencionales Como se utiliza en la presente, "inmunogenico" significa que tiene la capacidad de producir una respuesta inmune Las proteínas de choque térmico novedosas de esta invención se caracterizan por su capacidad para producir una respuesta inmune protectora contra infecciones estreptococales, mas particularmente contra S pneumomae, S pyogenes y S agalactiae letales La invención particularmente provee una proteina de choque térmico de Strsptococcus pneumomae de aproximadamente 72 kKa ("HSP72") teniendo la secuencia de aminoácido deducida de SEC DE IDENT NO 5, y análogos homólogos derivados y fragmentos de la misma, conteniendo por lo menos un epitope inmunogénico Co o se utiliza en la presente, "análogos" de HSP72 son aquellas proteínas S. pneumoniae, en donde uno o más residuos de aminoácido en la secuencia de aminoácido HSP72 (SEC DE IDENT NO:5) es reemplazada por otro residuo de aminoácido, siempre que toda la funcionalidad y propiedades inmunogénicas de la proteína análoga se conserven Dichos análogos pueden ser de existencia natural, o pueden ser producidos sintéticamente o a través de tecnología de ADN recombinante, por ejemplo, a través de mutagénesis de la secuencia HSP72 Los análogos de HSP72 poseerán por lo menos un antígeno capaz de producir anticuerpos que reaccionen con HSP72, por ejemplo, Streptococcus pyogenes y Streptococcus agalactiae Como se utiliza en la presente, "homólogos" de HSP 72 son proteínas de especies Estreptocales diferentes a pneumonías, pyogenes o agalactiae, o géneros diferentes a estreptococos, en donde uno o más residuos de aminoácido en al secuencia de aminoácido en la secuencia de aminoácido HSP72 (SEC DE IDENT NO 5) es reemplazada por otro residuo de aminoácido, siempre que la funcionalidad total y las propiedades inmunogénicas de la proteína homologa se conserven Dichos homólogos pueden ser de existencia natural o pueden ser producidos sintéticamente o a través de tecnología de ADN recombinante Los homólogos de HSP72 poseerán por lo menos un antígeno capaz de producir anticuerpos que reaccionan con HSP72, por ejemplo Enterococcus faecalis Como se utiliza en la presente, un "derivado" es un poli peptido en el cual una o mas propiedades físicas, químicas o biológicas han sido alteradas Tales alteraciones incluyen, pero no se limitan a substituciones, modificaciones, adiciones o eliminaciones de aminoácido, alteraciones en el patrón de lipidacion, glicosilación o fosforilación, reacciones de grupos amino, carboxilo, o hidroxilo laterales libres de los residuos de aminoácido presentes en el polipeptido con otras moléculas orgánicas y no orgánicas, y otras alteraciones, cualquiera de las cuales puede dar como resultado cambios en la estructura primaria, secundaria o terciaria Los "fragmentos" de esta invención tendrán por lo menos un epitope inmunogenico un "epitope inmunogenico" es un epitope que es instrumental para producir una respuesta inmune Los fragmentos preferidos de esta invención producirán una respuesta inmune suficiente para evitar o reducir la severidad de la infección, por ejemplo, la infección por S pnsumomas Los fragmentos preferidos de HSP72 incluyen la región C-terminal de los polipeptidos Un fragmento muy preferido incluye el fragmento del residuo 169 C-terminal ("C-169") (SEC DE IDENT NO 5 residuos 439-607), el residuo 151 C-terminal ("C-151") (SEC DE IDENT NO 5), residuos 457-607) y fragmentos mas pequeños consistiendo de epitopes de peptido dentro de la región C-169 Los fragmentos particularmente preferidos dentro de la región C-169 de HSP72 incluyen las secuencias de peptido GFDAERDAAQAALDD (residuos 527-541 de SEC DE IDENT NO 5) y AEGAQATGN AG DD VV (residuos 586-600 de SEC DE IDENT NO 5) las cuales son exclusivas a HSP72 de Streptococcus pneumoniae, o fragmentos de degeneración correspondientes de S. pyogenes o S. agalactiae (ver FIGURA 25). Aún muy preferidos son los fragmentos que producen una reacción inmune específica contra cepas Estreptococales. Dichos fragmentos pueden ser seleccionados de los siguientes péptidos: CS870, CS873, CS874, CS875, CS876, CS877, CS878, CS879, CS880, CS882, MAP1, MAP2, MAP3 y MAP4 (ver TABLA 5, supra), u homólogos de los mismos. En un aspecto más de la invención, se proveen polipéptidos que están inmunológicamente relacionados con HSP70/72. Como se utiliza en la presente, polipéptidos "inmunológicamente relacionados" se caracterizan por una o más de las siguientes propiedades. (a) son inmunológicamente reactivos con anticuerpos generados por la infección de un huésped mamífero con células Streptococcus pneumoniae, tales anticuerpos son inmunológícamente reactivos con HSP72 (SEC DE IDENT NO 5) y HSP70 (SEC. DE IDENT. NO. 20 y SEC DE IDENT. NO.22), (b) son capaces de producir anticuerpos que son inmunológicamente reactivos con HSP72 (SEC. DE IDENT NO 5) y HSP70 (SEC. DE IDENT NO" 20 y SEC. DE IDENT. NO:22), (c) son inmunológicamente reactivos con anticuerpos producidos a través de la inmunización de un mamífero con HSP72 (SEC DE IDENT NO:5) Por definición, análogos, homólogos y derivados de HSP70/72 son polipéptidos inmunológicamente relacionados Además, todos los polipéptidos inmunológicamente relacionados contienen por lo menos un antígeno HSP70/72. Por consiguiente, "antígenos HSP70/72" pueden encontrarse en el mismo HSP70/72, o en polipéptidos inmunológicamente relacionados. En un aspecto más de la invención, se proveen polipéptidos que están inmunológicamente relacionados con HSP72 Como se utiliza en la presente "polipéptidos inmunológicamente relacionados" se caracterizan por una o más de las siguientes propiedades: (a) son inmunológicamente reactivos con anticuerpos generados por la infección de un huésped mamífero con células Streptococcus pneumoniae, tales anticuerpos son inmunológicamente reactivos con HSP72 (SEC DE IDENT NO 5)f, (b) son capaces de producir anticuerpos que son inmunológicamente reactivos con HSP72 (SEC DE IDENT NO 5), (c) son inmunológicamente reactivos con anticuerpos producidos a través de la inmunización de un mamífero con HSP72 (SEC. DE IDENT NO:5). Por definición, análogos, homólogos y derivados de HSP72 son pol i péptidos inmunológicamente relacionados Además, todos los polipéptidos inmunológicamente relacionados contienen por lo menos un antígeno HSP72 Por consiguiente, "antigenos HSP72" pueden encontrarse en el mismo HSP72, o en pohpéptidos inmunológicamente relacionados Como se utiliza en la presente, "bacterias relacionadas" son bacterias que poseen antígenos capaces de producir anticuerpos que reaccionan con HSP72 Ejemplos de bacterias relacionadas incluyen Streptococcus pneumomae, Streptococcus pyogenes Streptococcus mutans, Streptococcus sanguis, Streptococcus agalactiae y Enterococcus faecalis Se entenderá que los siguientes ejemplos de esta invención, un experto en la técnica puede determinar sin experimentación indebida si un análogo, homologo, derivado, péptido inmunologicamente relacionado, o fragmento, particulares pueden ser útiles en el diagnóstico, prevención o tratamiento de una enfermedad Los pohpeptidos y fragmentos útiles producirán anticuerpos que son inmunoreactivos con HSP72 (Ejemplo 4) Preferiblemente, los polipeptidos y fragmentos útiles demostraran ha capacidad de producir una respuesta inmunoprotectora contra una infección bacteriana letal (Ejemplo 5) También se incluyen formas polimepcas de los polipéptidos de esta invención, estas formas pohmepcas incluyen por ejemplo, uno o mas polipeptidos que han sido entrelazados con entrelazadores como avidma/biotina, gataraldehido o dimetilsubepmidato Dichas formas polimepcas también incluyen pohpeptidos que contienen dos o más secuencias de proteina contiguas en tándem o invertidas, producidas a partir de ARNms multicistronico generado por la tecnología de ADN recombinante Esta invención provee HSP72 substancialmente puro y polipéptidos inmunológicamente relacionados El termino "substancialmente puro" significa que los pohpeptidos, de acuerdo con la invención, y las secuencias de ADN de acuerdo con ellos, están susbstancialmente libres de otras proteínas de origen bacteriano Las preparaciones de proteínas substancialmente puras pueden ser obtenidas a través de una variedad de procedimientos convencionales, por ejemplo, los procedimientos descritos en los Ejemplos 3 y 5 En otro aspecto, esta invención provee, por primera vez, una secuencia de ADN que codifica para una proteina de choque térmico de S pneumomae, específicamente, HSP72 (SEC DE IDENT NO 4, nucleotidos 682-2502) Las secuencias de ADN de esta invención también incluyen secuencias de ADN que codifican para análogos de po peptido y homólogos de HSP72, las secuencias de ADN que codifican para pohpeptidos inmunologicamente relacionados, secuencias de ADN que se degeneran a cualquiera de las secuencias de ADN anteriores, y fragmentos de cualquiera de las secuencias de ADN anteriores Sera fácilmente apreciado que un experto en la técnica sera capaz de determinar la secuencia de ADN de cualquiera de los polipéptidos de esta invención, una vez que el polipeptido haya sido identificado y aislado utilizando técnicas de secuencia de ADN Los iniciadores de oligonucleotido y otras sondas de acido nucleico derivadas de los genes que codifican los polipeptidos de esta invención, también pueden ser utilizados para aislar y clonar otras proteínas relacionadas de S. pneumomae y bacterias relacionadas, las cuales pueden contener regiones de bacterias de ADN que son homologas a las secuencias de ADN de esta invención Además, las secuencias de ADN de esta invención pueden ser utilizadas en reacciones PCR para detectar la presencia de S pneumoniae o bacterias relacionadas en una muestra biológica Los polipéptidos de esta invención pueden ser preparados a partir de una variedad de procedimientos, por ejemplo, a través de fraccionamiento de proteína de extractos de célula apropiados, utilizando técnicas de ceparación convencionales tales como intercambio iónico y cromatografía en gel y electroforesis o a través del uso de técnicas de ADN recombinantes El uso de técnicas de ADN recombinantes es particularmente adecuado para preparar pohpéptidos substancialmente puros de acuerdo con la invención Asi, de acuerdo con un aspecto adicional de la invención, se provee un procedimiento para la producción de HSP72, polipeptidos inmunológicamente relacionados, y fragmentos de los mismos, que comprenden los pasos de (1) cultivar un organismo huésped unicelular transformado con un vector que contiene una secuencia de ADN que codifica para dicho pohpeptido o fragmento y una o más secuencias de control de expresión operativamente enlazadas a la secuencia de ADN, y (2) recuperar un polipeptido substancialmente puro o fragmento Como es bien conocido en la técnica, con el fin de obtener niveles de alta expresión de un gel transfectado en un huésped, el gen debe ser operativamente enlazado a secuencias de control de expresión transcppcional y translacional que son funcionales en el huésped de expresión elegido Preferiblemente, las secuencias de control de expresión, y el gen de interés, estarán contenidos en un vector de expresión que además comprende un marcador de selección bacteriano y origen de replicación Si el huésped de expresión es una célula eucariótica, el vector de expresión debe comprender ademas un marcador de expresión útil en el huésped de expresión eucariótica Las secuencias de ADN que codifican los polipéptidos de esta invención pueden o no pueden codificar una secuencia de señal Si el huésped de expresión es eucapotico, generalmente se prefiere que una secuencia de señal sea codificada, de manera que la proteína madura sea secretada del huésped eucapótico Una metionina animo terminal puede o no puede estar presente en los polipéptidos expresados de esta invención Si la metionina terminal no es desdoblada por el huésped de expresión, ésta puede ser, si se desea, químicamente removida a través de técnicas normales Una amplia variedad de combinaciones de huésped de expresión/vector pueden ser empleadas para expresar las secuencias de ADN de esta invención Los vectores de expresión útiles para huéspedes eucarióticos incluyen, por ejemplo, vectores que comprenden secuencias de control de expresión de SV40, virus de papiloma de bovino, adenovirus, virus adeno-asociado, citomegalovirus y retrovirus. Los vectores de expresión útiles para huéspedes bacterianos incluyen plásmidos bacterianos, tales como aquellos de E. coli, incluyendo pBluescript, pGEX2T, vectores pUC, col E1, pCR1, pBR322, pMB9, y sus derivados, plásmídos de escala huésped más amplia, tales como RP4, ADNs de fago, por ejemplo, los numerosos derivados de fago lambda, por ejemplo, ?gt10 y ?gt11, y otros fagos de ADN, tales como M13 y fagos de ADN de estructura individual filamentosa. Los vectores de expresión útiles para células de levadura incluyen el plásmido 2µ y sus derivados Los vectores útiles para células de insecto incluyen pVL 941 Además, se puede utilizar cualquier amplia variedad de secuencias de control de expresión en estos vectores para expresar las secuencias de ADN de esta invención Las secuencias de control de expresión útiles incluyen las secuencias de control de expresión asociadas con genes estructurales de los vectores de expresión anteriores Ejemplos de secuencias de control de expresión útiles incluyen, por ejemplo, los promotores tempranos y tardíos de SV40 o adenovirus, el sistema la_c, el sistema [tr, el sistema TAC o TRC, los promotores T3 y T7, el operador principal y regiones promotoras de fago lambda, las regiones de control de la proteína de revestimiento fd, el promotor para 3-fosfogl?cerato-qu?nasa y otras enzimas g I icol icas , los promotores de fosfatasa acida, por ejemplo, Pho5, los promotores del sistema alfa-coincidente de levadura y otras secuencias promotoras constitutivas e inducibles conocidas porque controlan la expresión de genes de células procarióticas o eucarióticas o sus virus, y varias combinaciones de los mismos El promotor de polimerasa de ARN T7 F10 es particularmente útil en la expresión de HSP72 en E coll (Ejemplo 3) Las células huésped transformadas con los vectores anteriores forman un aspecto más de esta invención Una amplia variedad de células huésped unicelulares son útiles para expresar las secuencias de ADN de esta invención Estos huespedes pueden incluir huéspedes eucarióticos y procarióticos conocidos, tales como las cepas de E coh, Pseudomonas, Bacillus, Streptomyces, hongos, levadura, células de insecto tales como Spodoptera frugiperda (SF9), células animales tales como células CHO y de ratón, célula de mono verde Africano tales como COS 1, COS 7, BSC 1, BSC 40, y BMT 1, células humanas, y células de plantas en cultivo de tejidos Los organismos huésped preferidos incluyen bacterias tales como E coli y B subtilis, y células de mamífero en cultivo de tejidos Claro que se debe entender que no todos los vectores y secuencias de control de expresión funcionaran igualmente bien para expresar las secuencias de ADN de esta invención Tampoco todos los huéspedes funcionan igualmente bien con el mismo sistema de expresión Sin embargo, un experto en la técnica puede hacer una selección entre estos vectores, secuencias de control de expresión y huéspedes sin experimentación indebida y sin apartarse del alcance de esta invención Por ejemplo para seleccionar un vector, el huésped debe ser considerado ya que el vector debe replicarse en el mismo. El número de copia de vector, la capacidad de controlar ese número de copia y la expresión de cualquier otra proteína codificada por el vector, tales como marcadores antibióticos, también deben ser considerados Al seleccionar una secuencia de control de expresión, también se deben considerar una variedad de factores Estos incluyen, por ejemplo, la resistencia relativa de la secuencia, su capacidad de control y su compatibilidad con las secuencias de ADN de esta invención, particularmente con respecto a estructuras secundarias potenciales Los huespedes unicelulares pueden ser seleccionados a través de la consideración de su compatibilidad con el vector elegido, la toxicidad del producto codificado por las secuencias de ADN de esta invención, sus características de secreción, su capacidad para doblar la protema correctamente, sus requerimientos de fermentación o de cultivo, y la facilidad de purificación a partir de las mismas de los productos codificados para las secuencias de ADN de esta invención Dentro de estos parámetros, un experto en la técnica puede seleccionar varias combinaciones de vector/secuencia de control de expresión/huésped que expresarán las secuencias de ADN de esta invención en bajo fermentación o en un cultivo animal a gran escala Los polipéptidos codificados por las secuencias de ADN de esta invención pueden ser aislados de la fermentación o cultivo de células y purificados utilizando cualquier variedad de métodos convencionales incluyendo cromatografía líquida tal como de fase normal o fase inversa, utilizando HPLC, FPLC y similares, cromatografía de afinidad (tal como con hgandos inorgánicos o anticuerpos monoclonales), cromatografía de exclusión de tamaño, cromatografía de quelato de metal inmovilizado, electroforesis en gel, y similares Un experto en la técnica puede seleccionar cualquiera de las técnicas de aislamiento y purificación más apropiadas sin apartarse del alcance de esta invención Además, los po péptidos de esta invención pueden ser generados a través de cualquiera de las varias técnicas químicas Por ejemplo, pueden ser preparados utilizando la técnica sintética de fase sólida originalmente descrita por R B Merpfield "Solid Phase Peptide Synthesis I The Synthesis Of A Tetrapeptide' J_ Am Chem Soc , 83, pp 2149-54 (1963), o pueden ser preparadas a través de síntesis en solución Un resumen de las técnicas de síntesis de péptido puede encontrarse en E Gross & H J Meinhofer, 4 The Peptides Analysis, Synthesis, Biology, Modern Techniques Of Peptide And Amino Acid Analysis, John Wiley & Sons, (1981) y M Bodanskky, Principies Of Peptide Synhesis, Sprmger-Verlag (1984) Las composiciones y métodos preferidos de esta invención comprenden polipeptidos que tienen inmunogenecidad mejorada Dichos polipeptidos pueden resultar cuando las formas nativas de los polipeptidos y sus fragmentos son modificadas o sometidas a tratamientos para mejorar su carácter inmunogenico en el recipiente pretendido Los polipéptidos preferidos son fragmentos que son específicos a especies estreptocales tales como fragmentos seleccionados de la porción C-termmal de polipeptidos nativos Numerosas técnicas están disponibles y son bien conocidas por aquellos expertos en la técnica, las cuales pueden ser utilizadas, sin experimentación indebida, para incrementar substancialmente la inmunogenicidad de los polipéptidos aquí descritos Por ejemplo, los polipéptidos pueden ser modificados acoplándose a grupos dinitrofenol o acido arsanilico o a través de la desnaturalización con calor y/o SDS Particularmente, si los polipeptidos son pohpeptidos pequeños sintetizados químicamente puede ser deseable acoplarlos a un vehículo inmunogenico El acoplamiento, por supuesto, no debe interferir con la capacidad del po peptido o el vehículo para funcionar apropiadamente Para una revisión de algunas consideraciones generales en las estrategias de acoplamiento, véase Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, ed E Harlow and D Lañe (1988) Los vehículos inmunogenicos útiles son bien conocidos en la técnica Ejemplos de tales vehículos son hemocianina de limpeto de clave (KLH), albúminas tales como albúmina de suero de bovino (BSA) y ovalbumina PPD (derivado de proteina purificada de tuberculina) células de glóbulos rojos, toxoide tetanoso, toxoide de colera, perlas de agarosa, carbón activado, o bentonita La modificación de la secuencia de aminoácido de los polipeptidos descritos aquí con el fin de alterar el estado de lipidacion también es un método que puede ser utilizado para mejorar sus propiedades de mmunogenicidad y bioquímicas Por ejemplo, los pohpéptidos o sus fragmentos pueden ser expresados con o sin las secuencias de señal que dirigen además las porciones de lípidos De acuerdo con esta invención, se pueden preparar derivados de los polipéptidos a través de una variedad de métodos, incluyendo, a través de manipulación m vitro del ADN que codifica los pohpéptidos nativos y la subsecuente expresión del ADN modificado, a través de síntesis química o secuencias de ADN depvatizadas, o a través de manipulación química o biológica de secuencias de aminoácido expresadas Por ejemplo, se pueden producir derivados a través de la sustitución de uno o mas aminoácidos con un aminoácido natural diferente, un derivado de aminoácido o un aminoácido no nativo, siendo preferida la substitución conservadora por ejemplo 3-metilhistidina puede ser substituida para histidt na, 4-h?drox?prol?na puede ser substituida para prohna, 5-h?drox?l?s?na puede ser substituida para hsina y similares Ocasionando las substituciones de aminoácido, las cuales son menos conservadoras, también puede dar como resultado derivados deseados, por ejemplo, ocasionando cambios en carga conformación y otras propiedades biológicas Tales substituciones podrían incluir, por ejemplo la substitución de un residuo hidrofihco para un residuo hidrofobico, la substitución de una cisterna o pro na para otro residuo, la substitución de un residuo que tiene una cadena lateral pequeña para un residuo que tiene una cadena lateral voluminosa o la substitución de un residuo que tiene una carga positiva neta para un residuo que tiene una carga negativa neta Cuando el resultado de una substitución dada no puede ser predictado con exactitud, los derivados puede ser analizados fácilmente, de acuerdo con los métodos descritos aquí para determinar la presencia o ausencia de las características deseadas Los polipéptidos también pueden ser preparados con el objeto de incrementar la estabilidad o hacer que las moléculas sean más manejables para purificación y preparación Una de estas técnicas es expresar los polipéptidos como proteínas de fusión que comprenden otras secuencias de S pneumoniae o sin-S pneumomae Se prefiere que las proteínas de fusión que comprenden los polipéptidos de esta invención, sean producidas al nivel de ADN, por ejemplo, construyendo una molécula de ácido nucleico que codifica la fusión, transformando células huésped con la molécula, induciendo las células para expresar la proteina de fusión y recuperando la proteína de fusión del cultivo de células Alternativamente, las proteínas de fusión pueden ser producidas después de la expresión del gen de acuerdo con métodos conocidos Un ejemplo de una proteína de fusión, de acuerdo con esta invención, es la proteína Fucl/HSP72 (C-169) del Ejemplo 3, infra Los pohpéptidos de esta invención también pueden ser parte de moléculas multiméricas más grandes, las cuales pueden ser producidas recombinantemente o pueden ser sintetizadas químicamente. Tales multímeros también pueden incluir los polipéptidos fusionados o acoplados a porciones diferentes a aminoácidos, incluyendo lípidos o carbohidratos. Los polipéptidos de esta invención son particularmente bien adecuados para la generación de anticuerpos y para el desarrollo de una respuesta protectora contra enfermedades Por consiguiente, en otro aspecto de esta invención se proveen anticuerpos y sus fragmentos, que son inmunológicamente reactivos con HSP72 Los anticuerpos de esta invención son ya sea producidos por la inmunización con HSP72 o un poli péptido inmunológicamente relacionado, o se identifican a través de su reactividad con HSP72 o un po péptido inmunológicamente relacionado Se debe entender que los anticuerpos de esta invención no pretenden incluir aquellos anticuerpos que son normalmente producidos en un animal bajo infección con S pneumonías de existencia natural y los cuales no han sido removidos de o alterados dentro del animal en donde fueron producidos Los anticuerpos de esta invención pueden ser moléculas de inmunoglobuhna intactas o sus fragmentos que contienen un sitio de unión de antígeno intacto, incluyendo aquellos fragmentos conocidos en la técnica como F(v), Fab, Fab' y F(ab')2 Los anticuerpos también pueden ser genéticamente diseñados por ingeniería o producidos sintéticamente El anticuerpo o fragmento puede ser de origen animal, específicamente de origen de mamífero y más específicamente de origen de mupno, rata, mono o ser humano. Puede ser un anticuerpo o fragmento natural, o si se desea, un anticuerpo o fragmento recombinante. El anticuerpo o fragmentos de anticuerpo pueden ser de origen policlonal, o preferiblemente de origen monoclonal. Estos pueden ser específicos para un número de epítopes, pero son preferiblemente específicos para uno. Especialmente preferidos son los anticuerpos monoclonales F1-Pn3.1, F2-Pn3.2, F2-Pn3.3 y F2-Pn3.4 del Ejemplo 2, infra. Un experto en la técnica puede utilizar los polipéptidos de esta invención para producir otros anticuerpos monoclonales, los cuales pueden ser clasificados por su capacidad para conferir protección contra S. pneumoniae, S. pyogenes S. agalactiae u otros Estreptococos relacionados con infecciones bacterianas cuando se utilizan para inmunizar animales sin afección. Una vez que se encuentra un anticuerpo monoclonal dado para conferir protección, el epítope particular, que es reconocido mediante el cual entonces puede ser Identificado el anticuerpo. Los métodos para producir anticuerpos policlonales y monoclonales son bien conocidos por aquellos expertos en la técnica. Para una revisión de dichos métodos, ver Antibodies, A Laboratory Manual, supra, y D.E. Yelton, et al., Ann. Rev. of Biochem., 50, pp. 657-80 (1981). La determinación de inmunorreactividad con un polipéptido de esta invención puede hacerse a través de varios métodos bien conocidos en la técnica, incluyendo el ensayo de inmunotinción y de ELISA. Un anticuerpo de esta invención también puede ser una molécula híbrida formada de secuencias de inmunoglobulina de diferentes especies (por ejemplo, ratón y ser humano) o de porciones de inmunoglobuhna de secuencias de cadena ligera y pesada de las mismas especies Esta puede ser una molécula que tenga caracteres específicos de unión múltiples, tales como un anticuerpo bifuncional preparado a través de cualquier numero de técnicas conocidas por aquellos expertos en el arte incluyendo la producción de hibpdomas híbridos, intercambio de disulfuro, entrelazamiento químico, adición de enlazadores peptidicos entre dos anticuerpos monoclonales, la introducción de dos grupos de cadenas pesada y ligera de inmunoglobulina a una linea celular particular, etcétera Los anticuerpos de esta invención también pueden ser de anticuerpos monoclonales humanos por ejemplo aquellos producidos a través de células humanas inmortalizadas a través de ratones SCID-hu u otros animales no seres humanos capaces de producir anticuerpos "humanos" o a través de la expresión de los genes de inmunoglobulina humana clonados En resumen, un experto en la técnica, provisto por las enseñanzas de esta invención, tenga disponible una variedad de métodos que pueden ser utilizados para alterar las propiedades biológicas de los anticuerpos de esta invención, incluyendo métodos que pueden incrementar o reducir la estabilidad o vida media inmunogenicidad, toxicidad, afinidad o rendimiento de una molécula de anticuerpo dada, o para alterarla en cualquier otra formar para hacerla mas adecuada a una aplicación particular Los polipeptidos secuencias de ADN y anticuerpos de esta invención son útiles en composiciones profilácticas, terapéuticas y de diagnóstico para evitar, tratar y diagnosticar enfermedades. Se pueden emplear técnicas inmunológicas normales con los polipéptidos y anticuerpos de esta invención con el fin de utilizarlos como inmunogenes y como vacunas En particular, se puede inyectar cualquier huésped adecuado con una cantidad farmacéuticamente efectiva del polipéptido para generar anticuerpos monoclonales o polivalente o para inducir el desarrollo de una respuesta inmunológica protectora contra la enfermedad Preferiblemente el polipéptido se selecciona del grupo que consiste de HSP72 (SEC DE IDENT NO 5), HSP70 (SEP ID NO 20 y SEC DE IDENT NO 22), o fragmentos del mismo Como se utiliza en la presente, una "cantidad farmacéuticamente efectiva" de un pol ipépti do o de un anticuerpo, significa que, cuando se administra a un paciente, produce una respuesta inmune que es efectiva para evitar o reducir la severidad de infecciones Estreptococales o de bacterias relacionadas La administración de los polipéptidos o anticuerpos de esta invención puede lograrse a través de cualquier método descrito en el Ejemplo 10, infra, o a través de una variedad de otros procedimientos normales Para una discusión detallada de tales técnicas, ver Antibodies, A Laboratory Manual Cold Spring Harbor Laboratory, ed E Harlow and D Lañe (1988) Preferiblemente, si se utiliza un poli péptid o , éste será administrado con un auxiliar farmacéuticamente aceptable, tal como un auxiliar completo o incompleto de Feund's, RIBI (dipéptidos muramílicos) o ISCOM (complejos inmunoestimulantes). Preferiblemente, la composición incluirá una emulsión de agua en aceite o hidróxido de aluminio como auxiliar y será administrada intramuscularmente. La composición de vacuna puede ser administrada al paciente una vez o durante una serie de tratamientos. El modo más efectivo de administración y régimen de dosis dependerá del nivel de inmunogenicidad, la composición particular y/o el auxiliar usado para el tratamiento, la severidad y curso de la infección esperada, la terapia previa, el estado de salud del paciente, y respuesta a la inmunización, y el juicio del médico que atiende. Por ejemplo, en un pariente inmunocompetente, entre más inmunogénico sea el polipéptido, menor será la dosis y el número necesario de inmunizaciones Similarmente, la dosis y el tiempo de tratamiento necesarios serán reducidos y el polipéptido es administrado con un auxiliar. Generalmente, la dosis consistirá de una inyección inicial, muy probablemente con el auxiliar, de aproximadamente 0 1 a 10 mg, y de preferencia de 0 1 a 1.0 mg, del antígeno de HSP72 por paciente, seguido muy probablemente por una o más inyecciones de refuerzo Preferiblemente, los reforzadores serán administrados aproximadamente 1 y 6 meses después de la inyección inicial Cualquiera de los polipéptidos de esta invención puede ser utilizado en la forma de una sal farmacéuticamente aceptable Los ácidos y bases adecuados que son capaces de formar sales con los polipéptidos de la presente invención son bien conocidos por aquellos expertos en la técnica e incluyen ácidos y bases inorgánicas y orgánicas Para clasificar los polipeptidos y anticuerpos de esta invención por su capacidad para conferir protección contra en enfermedades causadas por S pneumomae o bacterias relacionadas, o su capacidad para reducir la severidad de dicha infección, un experto en la técnica reconocerá que se pueden utilizar un número de modelos de animal Cualquier animal que sea susceptible a la infección con S pneumomae o bacterias relacionadas, puede ser util Los ratones balb/c del Ejemplo 5, infra, son el modelo de animal preferido para clasificación de inmunoproteccion activa, y los ratones inmunodeficientes combinados severos del ejemplo 5 son el modelo de animal preferido para clasificación pasiva De esta manera, administrando un polipeptido o anticuerpo particular a estos modelos de animal un experto en la técnica puede determinar sin experimentación indebida, si ese polipeptido o anticuerpo puede ser util en los métodos y composiciones reclamadas en la presente De acuerdo con otra modalidad de esta invención se describe un método que comprende los pasos de tratar un paciente con una vacuna que comprende una cantidad farmacéuticamente efectiva de cualquiera de los polipeptidos de esta invención en una forma suficiente para evitar o reducir la severidad, durante algún tiempo, de la infección Estreptococal o bacteria relacionada. Otra vez, el polipéptido preferido para utilizarse en dichos métodos es HSP70/HSP72, o sus fragmentos. Los polipéptidos, las secuencias de ADN y anticuerpos de esta invención también pueden formar la base de métodos de diagnóstico y equipos para la detección de organismos patogénicos Son posibles varios métodos de diagnóstico. Por ejemplo, esta invención provee un método para la detección de Streptococcus pneumoniae, Streptococcus pyogenes, Streptococcus agalactiae o bacterias relacionadas en una muestra biológica que comprende los pasos de: (a) aislar la muestra biológica de un paciente, (b) incubar un anticuerpo de esta invención, o fragmento del mismo con una muestra biológica para formar una mezcla, y (c) detectar el anticuerpo o fragmento específicamente unido en la mezcla que indica la presencia de Streptococcus pneumoniae, Streptococcus pyogenes, Streptococcus agalactias o bacterias relacionadas Los anticuerpos preferidos para utilizarse en este método incluyen anticuerpos monoclonales F1-Pn3 1, F2-Pn3 2, F2-Pn3 3 y F2-Pn34 Alternativamente, esta invención provee un método para la detección de anticuerpos específicos a Streptococcus pneumomae o bacterias relacionadas en una muestra biológica que comprende (a) aislar la muestra biológica de un paciente, (b) incubar un pol ipépti d o de esta invención o fragmento del mismo con la muestra biológica para formar una mezcla, y (c) detectar el polipéptido específicamente unido en la mezcla que indica la presencia de anticuerpos específicos a Streptococcus pneumomae o bacterias relacionadas HSP72 (SEC DE IDENT NO 5), su fragmento C-169 (residuos 439-607 de SEC DE IDENT NO 5), su fragmento C-151 (residuos 457-607 de SEC DE IDENT NO 5) y fragmentos del péptido GFDAERDAAQAALDD (residuos 527-541 de SEC DE IDENT NO 5) y AEGAQATGNAGDDVV (residuos 586-600 de SEC DE IDENT NO 5) son el polipeptido y fragmentos preferidos en el método anterior para la detección de anticuerpos Un experto en la técnica reconocerá que estas pruebas de diagnostico pueden tomar varias formas, incluyendo un ensayo inmunoabsorbente enlazado en enzima (ELISA), un radio inmunoensayo o un ensayo de aglutinación látex Los agentes de diagnóstico pueden ser incluidos en un equipo el cual también puede comprender instrucciones para utilizar y otros reactivos apropiados, preferiblemente medios para detectar cuando se une el pohpeptido o anticuerpo Por ejemplo el polipeptido o anticuerpo pueden ser marcados con medios de detección que permiten la detección de polipeptido cuando este es unido a un anticuerpo, o para la detección del anticuerpo cuando este se une a S pneumoniae o bacterias relacionadas Los medios de detección pueden ser un agente de marcación fluorescente tal como isocianato de fluorescema (FIC), isotiocianato de fluorescema (FITC) y similares, una enzima tal como peroxidasa de rábano (HRP), oxidasa de glucosa o similares, un elemento radiactivo tal como 125| 0 51 G que produce emisiones de rayos gamma, o un elemento radiactivo que emite positrones, los cuales producen rayos gamma después de encontrarse con electrones presentes en la solución de prueba, tales como ^C, ^O, o ^3N La unión también puede ser detectada a través de otros métodos, por ejemplo, a través de complejos de avidma-biotina El enlace de los medios de detección es bien conocido en la técnica Por ejemplo, las moléculas de anticuerpo monoclonal producidas por un hibpdoma pueden ser marcadas metabohcamente a través de la incorporación de aminoácidos que contienen radioisótopos en el medio de cultivo o los polipéptidos pueden ser conjugados o acoplados a los medios de detección a través de grupos funcionales activados Las secuencias de ADN de esta invención pueden ser utilizadas para diseñar sondas de ADN para utilizarse en la detección de la presencia de Streptococcus pneumoniae o bacterias relacionadas en una muestra biológica El método de detección a base de sonda de esta invención comprende los pasos de (a) aislar la muestra biológica de un paciente (b) incubar una sonda de ADN que tiene una secuencia de ADN de esta invención con la muestra biológica para formar una mezcla, y (c) detectar la sonda de ADN específicamente unida en la mezcla que indica la presencia de Streptococcus pneumomae o bacterias relacionadas Las sondas de ADN de esta invención también pueden ser utilizadas para detectar ácidos nucleicos en circulación en una muestra, por ejemplo, utilizando una reacción de cadena de polimerasa, como un método de diagnóstico de Streptococcus pneumomae o infecciones bacterianas relacionadas Las sondas pueden ser sintetizadas utilizando técnicas convencionales y pueden ser inmovilizadas en una fase sólida, o pueden ser marcadas con una marca detectable Una sonda de ADN preferida para esta aplicación es un oligómero que tiene una secuencia complementaria a por lo menos aproximadamente 6 nucleótidos contiguos de HSP72 (SEC DE IDENT NO 4, nucleótidos 682-2502) Los polipeptidos de esta invención también puede ser utilizadas para purificar anticuerpos dirigidos contra epitopes presentes en la proteína, por ejemplo, utilizando purificación de inmunoafinidad de anticuerpos en una columna de antigeno Los anticuerpos o fragmentos de anticuerpo de esta invención pueden ser utilizados para preparar proteínas substancialmente puras de acuerdo con la invención por ejemplo, utilizando purificación de inmunoafinidad de anticuerpos o una columna de antígeno EJEMPLOS Con el fin de que esta invención pueda ser mejor entendida se establecen los siguientes ejemplos. Estos ejemplos son solamente para propósitos de ilustración y no están construidos como limitantes del alcance de la invención en ninguna manera. El Ejemplo 1 describe la identificación de HSP72, una proteína de choque térmico inmunorreactiva de acuerdo con la invención. El Ejemplo 2 describe el aislamiento de anticuerpos monoclonales contra epítopes de HSP72. El Ejemplo 3 describe la preparación de HSP72 recombinante y fragmentos de HSP72 de acuerdo con la invención El Ejemplo 4 describe el carácter específico antigénico y la inmunorreactividad de anticuerpos monoclonales dirigidos contra HSP72, y la identificación de proteínas inmunológicamente relacionadas de acuerdo con la invención El Ejemplo 5 describe procedimientos para obtener HSP72 substancialmente puro y el uso de HSP72 o anticuerpos contra el mismo, para proteger contra infección S. pneumonías experimental El Ejemplo 6 describe la preparación del fragmento C-151 recombinante de HSP72 de acuerdo con la invención El Ejemplo 7 describe la inmuno respuesta humoral siguiendo la inmunización con HSP72 recombinante o fragmentos de HSP72 de acuerdo con la invención. El Ejemplo 8 describe la localización de epítopes de célula B lineal en la HSP72 El Ejemplo 9 describe los genes hsp70 y las proteínas HSP70 de S agalactias y S pyogenes El Ejemplo 10 describe el uso del antígeno HSP72 en una vacuna humana EJEMPLO 1 - Identificación de proteínas de choque térmico S pneumoniae inmunorreactivas A Procedimientos A menos que se especifique lo contrario, se utilizaron los siguientes procedimientos a través de todos los Ejemplos de la presente 1 Bacterias Se proveyeron cepas de S pneumoniae por el Laboratoire de la Santé Publique du Québec, Sainte-Anne de Bellevue Las cepas S pneumoniae incluyeron la cepa 53 de tipo 4 y la cepa 64 de tipo 6 Si no se especificó, se utilizo S pneumomae de cepa 64 tipo 6 Se desarrollaron cepas bacterianas durante la noche a 37°C en 5% CO2 en placas de agar de cocolato 2 Preparaciones de antígeno Se prepararon varios antígenos de S pneumomae para la inmunización e inmunoensayos Se obtuvieron antígenos de célula completa aniquilados con calor incubando suspensiones bacterianas en un baño de agua precalentado a 56°C durante 20 minutos Se extrajeron proteínas solubles en detergente de S pneumonías Se suspendieron bacterias aniquiladas con calor en 10 mM de regulador de pH (4-(2-H?drox?et?l)-1-p?peraz?netan-zulfonato) (Boehpnger Mannheim GmbH, Germany), a un pH de 74 y se le aplico sonido a ,000 Kz/segundo, cuatro veces durante 30 segundos Se removieron las células intactas y el desperdicio grande a través de centrifugación a 1,700 g durante 20 minutos El sobrenadante se recogió y se centrifugó a 100,000 g durante 60 minutos La pella se volvió a suspender en 1 ml de regulador de pH Hepes, y se añadieron 1 ml de 2% de N-lauroil sarcosina (Sigma Chemical Co , St Louis, Mo ) La mezcla se incubó durante 30 minutos a temperatura ambiente y la fracción soluble en detergente se cosechó a través de centrifugación a 100,000 g durante 60 minutos 3 Tratamiento de Choque Térmico Se volvieron a suspender bacterias S pneumomae (tipo 4, cepa 53 y tipo 6, cepa 64) en metionina carente de medio esencial mínimo Eagle (ICN Biomedicals Ine , Costa Mesa, CA) y se suplementaron con 1% de BIO-X® (Quelab Laboratories Montreal, Canadá) durante 15 minutos a 37°C y después se dividieron en fracciones de volumen igual Las muestras fueron incubadas ya sea a 37°C a 45°C durante 5 minutos y después se marcaron con 100 µCi/ml [35S]met?on?na (ICN) durante 10, 30 o 60 minutos a 37°C Las bacterias se cosecharon y los extractos de célula fueron preparados utilizando regulador de pH de hsis Tps-HCI como se describió anteriormente, o regulador de pH de muestra SDS-PAGE 4 Inmunización de Ratones Se inmunizaron ratones hembra Balb/c (Charles River Laboratories, St-Constant, Québec, Canadá) con antigenos S pneumoniae Se obtuvieron sueros inmunes a S pneumoniae, de la cepa 64 tipo 6 de ratones inmunizados, a intervalos de dos semanas a través de inyecciones subcutáneas de 107 bacterias aniquiladas con calor o 20 µg de proteínas neumococales solubles en detergente absorbidas al auxiliar de hidróxido de aluminio (Alhydrogel®, Cedarlane Laboratories Ltd , Horny, Ontario, Canadá) Se recogieron muestras sanguíneas antes de la inmunización y a los 7 días después de las primera y segunda inmunizaciones 5 SDS-PAGE e Inmunoensayos Se prepararon extractos de célula para SDS-PAGE, análisis de tinción Western y ensayo de radioinmunoprecipitación incubando suspensiones bacterianas en regulador de pH de lisis Tps-HCI (50mM Tris, 150 mM NaCI, 0 1% de dodecil sulfato de Na, 0 5% de desoxicolato de Na, 2% de Tritón® X-100, 100 µg/ml de fluoruro de f enilmetilsulf onilo , y 2µ/ml de aprotinina) a un pH de 8 0 durante 30 minutos sobre hielo Se aclararon células lisadas a través de centrifugación y los sobrenadantes se formaron en alícuotas y se mantuvieron congelados a -70°C Se realizaron SDS-PAGE en un gel de 10% de poliacplamida de acuerdo con el método de Laemmli [Nature, 227, pp 680-685 (1970)], utilizando el sistema Mini Protean® (Bio-Rad Laboratories Ltd , Mssissauga, Canadá) Las muestras fueron desnaturalizadas hirviendo durante 5 minutos en regulador de pH de muestra conteniendo 2% de 2-mercaptoetanol Las proteínas fueron resueltas mediante la tinción del gel de poliacplamida con PhastGel Blue® (Pharmacia Biotech Ine , Baie d'Urfé, Canadá) Los productos radiomarcados fueron visualizados a través de fluorografía Los fluorogramas fueron explorados utilizando un densitometro láser Se realizaron procedimientos de inmunotincion de acuerdo con el método de Towbín et al [Proc Nati Acad Sci USA, 76, pp 4350-4354 (1979)] La detección de los antígenos reactivos con anticuerpos se realizó a través de un inmunoensayo de anticuerpo indirecto utilizando inmunoglubulinas anti-ratón marcadas con peroxidasa y el substrato de color o-dianisidina Se realizaron ensayos de radioinmunoprecipitación como se describe por J A Wiley et al [J Virol , 66, pp 5744-5751 (1992)] En resumen, se añadieron sobrenadantes de cultivo de suero o de hibpdoma a las muestras radiomarcadas conteniendo cantidades iguales de [35S]met?on?na Las mezclas se dejaron incubar durante 90 minutos a 4°C con agitación constante Los inmunocomplejos fueron después precipitados con Sepharosa (Pharmacia) de proteína A tratada con albúmina de suero de bovino durante 1 hora a 4°C Se formaron en pellas las perlas y se lavaron tres veces en salina regulada con pH con Tris a un pH de 8 0, y los complejos de antígeno después fueron disasociados mediante ebullición en un regulador de pH de muestra Los antigenos fueron analizados a través de electroforesis sobre SDS-PAGE Los geles fueron fijados, mejorados para fluorografía utilizando Amplify® (Amersham Canadá Limited, Oakville, Ontario, Canadá), se secaron y después se expusieron a una película de rayos X B Caracterización de la Respuesta de Choque Térmico en S pneumoniae Se estudió la respuesta de choque térmico de S pneumoniae examinando el patrón de síntesis de protema antes y después de un desplazamiento de 37°C a 45°C La FIGURA 1 muestra los resultados cuando se desarrollaron S pneumomae de cepa 64 tipo 6 (panel A) y la cepa 53 tipo 4 (panel B) a 37°C, se incubaron a 37°C (carriles 1, 3, 5, 7 y 9) o a 45°C (carriles 2, 4 6, 8 y 10) durante 5 minutos y después se marcaron con [35S]met?on?na durante 10 minutos (carriles 1, 2 y 7, 8), 30 minutos (carriles 3, 4 y 9, 10), o 60 minutos (carriles 5, 6) El fluorograma derivado de SDS-PAGE indicó que la síntesis de por lo menos tres proteínas se incrementó aumentando la temperatura (FIGURA 1) La proteína inducida más prominente fue aproximadamente de 74 kDa (HSP72), mientras que las otras dos fueron aproximadamente 80 kDa (HSP80) y 62 kDa (HSP62) La síntesis de proteina incrementada fue ya evidente después de 10 minutos de la marcación (FIGURA 1 carriles 1, 2 y 7, 8) y se hizo mas importante cuando el periodo de marcación se prolongo a 30 minutos (FIGURA 1, carriles 3, 4 y 9 10) y 60 minutos (FIGURA 1 carriles 5, 6) El efecto de la temperatura elevada en el perfil de síntesis de protema de las dos diferentes cepas de S pneumomae fue similar con HSPs de masa molecular similar siendo sintetizada (comparar panel A (cepa 64 tipo 6) con el panel B (cepa 53 tipo 4) en la FIGURA 1) El análisis de las huellas densitometpcas de la exploración de los perfiles de síntesis de proteina permitió la estimación de las cantidades relativas de proteínas Por ejemplo con respecto a la cepa 64 tipo 6 de S pneumomae con choque térmico, después de 10 minutos de marcación, HSP80 y HSP62 se hicieron a 2 9% y 68% de las proteínas marcadas, respectivamente, comparado con menos de 0 1% a 37°C (FIGURA 2) Las proteínas marcadas teniendo una masa molecular aparente de 72 kDa fueron detectadas en condiciones tanto a 37°C como a 45°C (FIGURA 2) El análisis de radioinmunoprecipitación reveló, sin embargo, que HSP72 fue no detectable a 37°C (supra. y FIGURAS 3, 4 y 6) indicando así que el pico 9 de la FIGURA 2 corresponde a los componentes de proteína coemigrando con HSP72 Asumiendo que no existe ninguna variación en la marcación de este material, estos resultados podrían sugerir que número de HSP72 representa 8 7% de la proteína de célula marcada total después de tratamiento de choque térmico Una comparación de las huellas densitometpcas revelo que las proteína celulares que corresponden a los picos 4, 10, 13, 17, 19 y 21 fueron sintetizadas casi a la misma velocidad sin considerar el tratamiento de choque térmico (FIGURA 2) Sin embargo, la síntesis de varias proteínas (picos 1, 2, 3, 15, 20, 22, 24 y 26) declinó considerablemente en respuesta al choque térmico (FIGURA 2) C Respuestas Inmunes a HSPs de S pneumoniae Con el fin de determinar la respuesta de anticuerpo a HSPs neumococales, se analizaron primero sueros de ratón a través de radioinmunoprecipitación El repertorio de proteínas marcadas reconocido por los sueros de ratones inmunizados con las preparaciones de antígeno de S pneumomae se muestran en las FIGURAS 3 y 4 La FIGURA 3 se refiere a preparaciones de proteínas solubles en detergente. La FIGURA 4 se refiere a la preparación bacteriana aniquilada con calor Aunque muchas bandas fueron detectadas por la mayoría de los antisueros, HSP72 fue un producto de precipitación principal El carácter específico de los anticuerpos para HSP72 se demostró a través de la detección de proteínas entre los productos con choque térmico, solamente (FIGURA 3, carriles 4, 6, 8 y 10, FIGURA 4, carriles 4, 6 y 8) En forma interesante todos los ratones inmunizados consistentemente reconocieron HSP72 Los anticuerpos reactivos con la HSP72 no fueron específicos a la cepa utilizada durante la inmunización ya que se observaron reactividades fuertes con HSP72 de S pneumomae heterólogo Se debe observar que ademas de HSP72, un suero se precipitó coemigrando al producto marcado tanto a 37°C como a 45°C (FIGURA 4, carril 4) Este producto de 72 kDa probablemente corresponde al componente del pico 9 en la FIGURA 2, y no fue detectado en inmunotinciones HSP62 es otro objetivo inmune, el cual se precipito mediante algunos, pero no todos los sueros inmunes (FIGURA 3, carril 6 y, FIGURA 4, carriles 4 y 6) Ninguno de los sueros probados reaccionó con HSP80 Ninguna de las proteínas fueron precipitadas cuando se tomaron sueros preinmunes de los ratones utilizados en este estudio que fueron probados para la presencia de anticuerpos reactivos con los productos marcados Como se representa en las FIGURAS 3 y 5, los anticuerpos a HSP72 pueden ser detectados después de una inmunización ya sea con proteínas solubles en detergente o con extractos de células completas de S. pneumomae Además, un incremento marcado en la respuesta de anticuerpo a HSP72 se observó después de una segunda inmunización (FIGURA 3, comparar 4 y 6, y carriles 8 y 10) Los patrones de inmutinción de 15 ratones inmunizados con bacterias de S pneumomae aniquiladas con calor fueron remarcadamente consistentes con los resultados de la radiommuniprecipitación previamente descrita Aunque la variación de respuesta de anticuerpo ocurrió a una variedad de proteínas, HSP72 fue un antígeno inmunorreactivo mayor con 8 sueros positivos (53%) después de la primera inmunización (FIGURA 5) Los anticuerpos a HSP72 fueron detectados en 13 de 15 (87%) sueros inmunes tratados después de la segunda inmunización Los otros dos antigenos prominentes teniendo una masa molecular aparente de 53 5 y 47 kDa fueron detectados en 5 (33%) y 7 (47%) sueros, respectivamente (FIGURA 5) La banda reactiva a 72 kDa fue confirmada como la HSP72 neumococal utilizando antigenos HSP72 recombinantes (Ejemplo 3, infra) en un ensayo de inmunotincion Los sueros preinmunes fallaron para detectar cualquier proteina neumococal EJEMPLO 2 - Aislamiento de Anticuerpos Monoclonales contra Epítopes de HSP72 A Procedimientos 1 Inmunización de Ratones y Fusión Se inmunizaron ratones hembra Balb/c (Charles River Laboratories) con antígenos S. pneumoniae Un grupo de ratones (experimento de fusión 1) fueron inmunizados a través de inyección peptoneal con 107 de antígeno de célula completa aniquilada con formalina de la cepa MTL suspendida en auxiliar completo de Freund's, y se reforzaron a intervalos de dos semanas con el mismo antígeno y después se les aplicó sonido a partir de bacterias aniquiladas con calor en auxiliar incompleto de Freund's Un segundo grupo de ratones (experimento de fusión) fueron inmunizados tres veces a intervalos de tres semanas con 75µg de antígenos neumococales solubles en detergente extraídos de la cepa 64 (tipo 6) en 25 µg de auxiliar Quil A (Cedarlane Laboratories Ltd , Hornby, Ontario, Canadá) Tres días antes de la fusión, todos los ratones fueron inyectados intrapeptonealmente con el antigeno respectivo suspendido solo en PBS Se produjeron hibpdomas a través de la fusión de células de vaso con células de mieloma SP2/0 sin secretar como se describió previamente por J Hamel et al [J_ Med Microbiol , 23, pp 163-170 (1987)] Se clonaron los hibpdomas específicos a través de diluciones de limitación secuenciales, se expandieron y se congelaron en nitrógeno liquido La clase, subclase y tipo de cadena ligera de MAbs fueron determinados a través de ELISA como se describió por D Martin et al , [Eur J Immunol , 18, pp 601-606 (1988)] utilizando reactivos obtenidos de Southern Biotechnology Associates Ine (Birminghan AL) 2 Fraccionamiento Subcelular Se cepararon neumococos en fracciones subcelulares de acuerdo con la técnica descrita por Pearce et al [Mol Microbiol , 9, pp 1037-1050 (1993)] Brevemente, la cepa 64 de S pneumoniae (tipo 6) se desarrolló en caldo de Todd Hewitt suplementado con 0 5% (p/v) de extracto de levadura durante 6 horas a 37°C y se aislaron a través de centrifugación Las pellas de célula se suspendieron de nuevo en 25 mM de Tps-HCI pH 80, 1 mM de EDTA, 1 mM de fluoruro de fenilmetilsulfonilo (PMSF) y se le aplico sonido durante 4 minutos con 15 segundos de reventamientos Se removió el desperdicio celular a través de centrifugación Las membranas bacterianas y los contenidos citoplásmicos fueron ceparados a través de centrifugación a 98,000 g durante 4 horas Las fracciones citoplasmicas (sobrenadantes) y la membrana (pella) fueron ajustadas a 1 mg de proteína por ml y se sometieron a SDS-PAGE y análisis de inmunotinción B Identificación y Caracterización de Mabs a la HSP72 de S pneumoniae Se clasificaron micialmente sobrenadantes de cultivo de hibpdomas a través inmunoensayo de enzima de dot utilizando células completas de la cepa 65 de S pneumoniae (tipo 4) de acuerdo con los procedimientos descritos por D Martin et al (Supra) Después, se volvieron a probar los hibpdomas positivos mediante inmunotincion con el fin de identificar los hibpdomas que secretan Mabs reactivos con la HSP72 De los 26 hibpdomas con reactividad anti-S pneumoniae en la inmunotición se encontraron cuatro que reconocen epítopes presentes en una banda de proteína con una masa molecular evidente de 72 kDa Los cuatro hibridomas fueron designados F1-Pn3.1 (del experimento de fusión 1) y F2-Pn3.2, F2-Pn3.3 y F2-Pn3.4 (del experimento de fusión 2) El análisis de isotipo reveló que el hibridoma F1-Pn3.1 (del experimento de fusión 1) secretó inmunoglobulinas de lgG-2ak, mientras que los hibridomas F2-Pn3.2, F2-Pn3.3 y F2-Pn3 4 (del experimento de fusión 2) todas secretaron IgG 1 k El carácter específico de Mabs para HSP72 fue claramente demostrado por la falta de actividad de radioinmunoprecipitación contra proteínas S pneumoniae marcadas con [35S]met?on?na obtenidas de cultivos incubados a 37°C y la inmunoprecipitación de una proteína de 72kDa con lisatos derivados de choque térmico incubados a 45°C La FIGURA 6, (carriles 5 y 6) demuestra los resultados obtenidos para MAb F1-Pn3 1 Los mismos resultados fueron obtenidos con Mabs F2-Pn32, F2-Pn3 3 y F2-Pn34 Los lisatos marcados con [35S]met?on?na de células de S pneumoniae sin choque térmico y con choque térmico con sonda con Mabs fueron electroforeados sobre geles de SDS-PAGE y después se sometieron a análisis de tinción Western Las inmunotinciones resultantes revelaron la presencia del antígenos HSP72 en ambas muestras La FIGURA 7, panel A, muestra los resultados obtenidos para MAb F1-Pn3 1 Los mismos resultados fueron obtenidos con Mabs F2-Pn3 2, F2-Pn3 3 y F2-Pn3 4 Por consiguiente, la tensión de choque térmico no incrementó significativamente la reactividad de anticuerpos monoclonales ant?-HSP72 La fluorografía de las inmunotinciones, sin embargo, mostró claramente que la respuesta de choque térmico ocurrió (FIGURA 7, panel B) Estos experimentos revelaron que el régimen de síntesis de HSP72 de S pneumomae se incrementa la respuesta al choque térmico, pero aquel de las cantidades absolutas de HSP72 no se incrementa después del choque térmico C Localización celular de HSP72 Con el fin de investigar la locahzación celular de HSP72, se fraccionaron lisatos de célula de S pneumomae a través de centrifugación diferencial dando como resultado una fracción soluble y una fracción en partículas, enriquecidas en proteínas de membrana, supra Las muestras conteniendo 15 µg de proteína de fracción de membrana (carril 1) y fracción citoplasmica (carril 2) de S pneumomae fueron electroforeadas sobre SDS-PAGE, transferidas a nitrocelulosa y se les aplicó sonda con MAb F1-Pn3 1 En las tinciones Western resultantes, se encontró HSP72 en ambas fracciones, la mayoría de la proteína asociada con la fracción citoplásmica (FIGURA 8) EJEMPLO 3 - Clonación molecular, Secuenciación y Expresión de Genes que Codifican para Antíqenos HSP72 A Procedimientos 1 Cepas y Plásmidos Las cepas y plasmidos utilizados en este estudio se listan Cuadro 1. CUADRO 1: CEPAS BACTERIANAS, FAGOS Y PLASMIDOS CUADRO 1: CEPAS BACTERIALES, FAGOS Y PLASMIDOS Cepas, Fagos y Referencia o Plásmidos Características Relevantes Fuente Cepas de E. coli JM109 ?(Iac-proAfl) [F'traD proAB BRL lac I* Z?M1S] Y1090 rn-pik- Ion s pF [pMC9] Amersham BL2KDE3) lacUV5-T7 polimerasa de ARN Studier et al. (infra) Fagos ?gtll cI857 SlOO vector de clonación Amersham ? BD7 LacZ-HSP72 fusión ; 2.3 kb Este estudio fragmento de EcoRl en ?gtll ? BD17 Fuci-HSP72 quimérico; 2.4 Este estudio kb EcoRI y 2.3 kb EcoRl fragmentos en ?gtll Plásmidos pWSK29 Ampr; vector de clonación de Wang et al . número de copia bajo (infra) PWKS30 igual a pWSK 9 pero Wang et al . opuesto al sitio de clonación (infra) múltiple PJBD171 igual a ?JBD17 pero en Este estudio p SK 9 PJBD177; 2.8 kb Xhol-EcoRI Este estudio fragmento en pWKS30 no recombinante HSP72 proteína expresada PJBD179 FucI-HSP72 fusión; 2. kb Este estudio EcoRI andv?.8 kb EcoRI- EcoRV fragmentos en i pWS 29 pT7-5 Ampr; T7 promotor F10 Tabor et al. (infra) pT7-6 iguala pT7-5 pero Tabor et al. opuesto al sitio de clonación (infra) múltiple p BDfdl iguala pJBD179 pero en Este estudio pT7-5 pJBDf62 iguala pJBD179 pero en Este estudio pT7-6 pDELTAl Ampr; Tn 1000 BRL pJBD?l iguala pJBD179 pero en Este estudio pDELTAl PJBD291 HSP72; 3.2 lb HindlII Este estudio fragmento en pws?29 pJBDkSl iguala pJBD291 pero en Este estudio PT7-5 P BD?4 iguala ?JBD291 pero en Este estudio pDELTAl Se desarrollaron cepas E. coli en caldo L o en agar L a 37°C. Cuando fue necesario se añadió ampicilina a los medios a la concentración de 50µg/ml. Se aislaron los plásmidos utilizando el equipo Magic/Wisard® Mini-Preps (Promega, Fisher Scientific, Ottawa, Canadá). 2. Técnicas de ADN Recombinante General Las endonucleasas de restricción, ligasa de ADN T4 y estructuras de cadena de peso molecular de ADN se compraron en Boehringer Mannheim Canadá, Laval, Quebec or Pharmacia Biotech, Sweden. La digestión y ligación de la endonucleasa de restricción de ADN se realizaron como se describió por J. Sambrook et al. [Molecular cloning. A laboratory manual. Cold Spring Harbor Laboratory Press, N.Y. (1989)]. Se realizó la electroforesis en gel de agarosa de los fragmentos de ADN siguiente el procedimiento de J. Sambrook et al. (supra) utilizando el regulador de pH TAE (0.04 M de acetato de Tris; 0.02 M de EDTA), de Boehringer Mannheim. Los fragmentos de ADN fueron purificados del gel de agarosa utilizando el equipo de purificación Pre-A-Gene® DNA (Bio-Rad Laboratories Ltd., Mississauga, Ontario). La transformación se realizó a través de electroporación con el Gene Pulser® (Bio-Rad) siguiendo el protocolo provisto por el fabricante 3 Construcción y Clasificación de la Colección Genómica Se generó una colección de ADN de S pneumoniae genómico en el vector de expresión de bacteriófago ?gtll 1 (sistema de clonación de ?gt11, Amersham) de acuerdo con el procedimiento provisto por el fabricante Se preparó ADN cromosomal de la cepa 64 del tipo 6 de S pneumomae siguiendo el procedimiento de J C Patón et al flnfect Immun , 54, pp 50-55 (1986)] El ADN cromosomal de S pneumomae fue digerido parcialmente con EcoRI, y los fragmentos de 4 a 7 kb fueron fraccionados y purificados del gel de agarosa Los fragmentos fueron ligados a brazos de ?gt11, empacados y las mezclas de fago resultantes se utilizaron para infectar £ coli Y1090 Se realizo la inmunoclasificacion de placas que expresan antígenos HSP72 recombinante utilizando el anticuerpo monoclonal específico en HSP72 F1-Pn3 1, supra Los clones de placa que expresan peptidos reconocidos por MAb F1-Pn3 1 fueron aislados y purificados Se prepararon lisatos líquidos y el ADN se purificó a partir de un adsorbente de fago de Promega LambdaSorb de acuerdo con las direcciones del fabricante, seguido por procedimientos de purificación de ADN convencionales 4 Análisis de Tinción Southern Se utilizó el equipo de Marcación y Detección de ADN DIG no radiactivo, obtenido de Boehpnger Mannheim para realizar el análisis de tinción Southern en este Ejemplo Los fragmentos de ADN seleccionados para utilizarse como sondas (infra) fueron purificados a través de electroforesis en gel de agarosa y después se marcaron con digoxigenina (DIG)-11-dUTP El ADN cromosomal neumococal fue digerido con Hindlll y los productos digeridos fueron ceparados a través de electroforesis en un gel de 0 8% de SDS-PAGE y se transformaron a membranas de nylon cargadas positivamente (Boehpnger Mannheim) como se describe por J Sambrook et al (Supra) La membrana después fue teñida con las sondas de ADN marcadas con DIG de acuerdo con el protocolo del fabricante 5 Secuenciación de ADN y Análisis de Secuencia Los fragmentos de ADN secuenciados en este ejemplo primero fueron clonados al plásmido pDELTA 1 (GIBCO BRL Life Technologies, Burlington, Ontario) Una serie de eliminaciones anidadas fueron generadas de ambas cepas mediante eliminación m vivo mediada por transposición de transposon Tn 1000 (Deletion Factory System, GIBCO BRL), siguiendo los procedimientos provistos por el proveedor Estas eliminaciones fueron dimensionadas a través de electroforesis en gel de agarosa y se seleccionaron los derivados de eliminación apropiados para secuenciación a través del método de terminación de cadena de dideoxinucleótido de F Sanger et al fProc Nati Acad Sci USA, 74, pp 5463-5467 (1977)] Para secuenciar los huecos entre las plantillas de eliminación se sintetizaron oligonucleóticos a través del sintetizador de oligonucleótido 392 (ABI, Applied Biosystems Ine , Foster City, CONTENEDORES DE ALIMENTOS Y BEBIDAS) La reacción de secuenciación se realizó a través de PCR (DNA Thermal Cycler 480®, Perkm Elmer) utilizando el Equipo de Secuenciación de Ciclo Terminador Desoxicolorante Taq (ABI) y se realizó la electroforesis de ADN en el secuenciador de ADN automático 373A (ABI) 6 Expresión del Gen Clonado en el sistema de pol/ promotor de ARN T7 de E co Se logró la expresión de alto nivel del gen clonado en este ejemplo empleando el sistema de polimerasa/promotor de ARN de T7 de bacteriófago en £ coli El fragmento de ADN especificando la proteína recombinante se ligó a los plásmidos PT7-7 o Pt7-6 [S Tabor and C C Richardson, Proc Nati Acd Sci USA, 82, PP 1074-1078 (1985)], en una orientación apropiada en donde el gen que fue expresado fue colocado bajo el control del promotor específico de polimerasa ARN T7 de fago F10 El plásmido resultante fue transformado a la cepa de £ coli BL21(DE3) [F W Studier, and B A Mofatt, J Mol Biol , 189, pp 113-130 (1986)], que lleva el gen estructural de polimerasa de ARN T7 en su cromosoma bajo el control del promotor del promotor lacUC5 inducible Después de la inducción de IPTG, la pohmerasa de ARN T7 se indujo en los transformantes BL21(DE3) específicamente transcritos al gen bajo el control del promotor T7 F10 Las proteínas recombinantes sobreexpresadas fueron visualizadas ya sea a través de tinción Western o de tinción de Azul de Coomassie 7 Análisis de Secuencia de Aminoácido N-termmal de HSP72 Se purificó HSP72 neumococal mediante inmunoprecipitación utilizando MAb F1-Pn3 2 (supra) y se prepararon muestras de extractos de pared celular de la cepa 64 de S pneumomae preparada como se describió por L S Daniels et al [Microb Pathogen , 1, pp 519,531 (1986)] como antigeno Los inmunoprecipitados fueron resueltos a través de SDS-PAGE y después fueron transferidos a la membrana de difluoruro de polivinilideno (PVDF) a través del método de POLIPROPILENO Matsudaira U Biol Bhem , 262, pp 10035-10038 (1987)] La membrana PVDF se tino con Azul de Coomassie, la banda HSP72 se extirpo y después se analizo en un secuenciador de proteina automático (ABI), de acuerdo con los procedimientos normales B Construcción de Plasmidos Conteniendo Fragmentos del gen de HSP 72 de S Pneumonías que Corresponden a C-169 Se clasifico la colección de ADN genomico de S pnßumoniae ?gt11 con MAb F1-Pn3 1 especifico en HSP72 Se aislaron diecisiete clones inmunorreactivos y se purificaron de un total de 1500 fagos probados Para confirmar el carácter especifico de las proteínas expresadas por los fagos recombinantes se realizo el análisis de tinción Western de los hsatos de fago recombinante Dos grupos de clones fueron identificados entre los 17 clones positivos reconocidos por MAb F1-Pn3 1 y sus representantes fueron designados como ?JBD7 y ?JBD17 para caracterización adicional Como se muestra en la FIGURA 9, los extractos de célula completa de la cepa 64 de S pneumoniae (carril 1) y los lisatos de fago de £ coli infectado con ?JBD17 (carriles 2 y 3) o ?JBD7 (carriles 4 y 5) se cultivaron en presencia ( + ) o ausencia (-) de IPTG, y fueron sometidos a electroforesis en gel con 10% de poliacplamida y fueron electrotransferidos a nitrocelulosa La inmunotinción se le aplicó sonda con MAb F1-Pn3 1 específicos en HSP72 El clon ?JBD17 tuvo dos fragmentos de inserto EcoRI-EcoRI de 24 kb y 2 3 kb (FIGURA 10), y expresaron una proteína recombinante quimérica teniendo una masa molecular evidente de 74 kDa en gel de SDS-PAGE (FIGURA 9, carriles 2 y 3) Se encontró que el clon ?JBD7 contiene un fragmento de inserto EcoRI de 2 3 kb y produjo una proteína de fusión aparente consistiendo de LacZ y la proteína quimérica de 74 kDa expresada a partir del clon ?JBD7 La proteína de fusión tuvo una masa molecular evidente de 169 kDa según estimado por SDS-PAGE (FIGURA 9, carril 5) La expresión de la proteína recombinante quimérica codificada por el fago ?JBD7 fue independiente de la inducción de IPTG (FIGURA 9, carriles 2 y 3), mientras que la expresión de la proteína de fusión recombinante codificada por el fago ?JBD7 fue dependiente de la inducción del promotor lac (FIGURA 9, carriles 4 y 5) En un intento para subclonar el gen HSP72, el inserto de ADN neumococal del clon ?JBD7 fue extraído, purificado y ligado en un plásmido de copia baja pWSK29 [R F Wang and S R Kushner, Gene, 100, pp 195-199 (1991)] para generar el plásmido pJDB171 El inserto de pJBD171 fue caracterizado a través del diseño de mapa de restricción (Figura 10B), y se realizaron una serie inmunoclonaciones e inmunotinciones para definir los límites del gen que codifica para el gen reactivo con MAb F1-Pn3 1 La región responsable de la expresión de la proteína quimérica de 74 kDa se encontró que se localiza sobre el fragmento 32 kb EcoRI-EcoRV, el cual consiste del fragmento de 2 4 kb EcoRI-EcoRI intacto y de la porción de 08 kb EcoRI-EcoRV del fragmento de 2 3 kb EcoRI-EcoRI El plásmido que lleva el inserto de 32 kb de EcoRI-EcoRV fue designado como pJBD179 C Expresión y Análisis de Secuencia de ADN de un Gen Quimérico que Codifica para C-169 Para determinar adicionalmente la dirección transcppcional del gen que codifica para la proteina quimérica de 74 kDa en el fragmento de 32 kb de EcoRI-EcoRV, y para incrementar el rendimiento de la proteína quimérica de 74 kDa para estudio inmunológico, se decidió expresar la proteina quimérica de 74 kDa en el sistema promotor de ARN de T7 de £ coll y T7 El fragmento de 32 kb EcoRI-EcoRV, derivado de pJBD179, fue ligado a los plasmidos pT7-5 y pT7-6 en los cuales se colocaron sitios de clonación múltiples en una orientación opuesta con respecto al promotor de T7 específico de polimerasa de ARN de T7 F10 La mezcla de ligación se utilizo para transformar £ coli JM109 y transformantes positivos reactivos con MAb F1-Pn3 1 fueron identificados a través del método de elevación de colonia descrito por J Sambrook et al [supral Los plasmidos recombinantes resultantes, derivados de pT7-5 y pT7-6, fueron designados pJBDf51 y pJBDf62, respectivamente El inserto de 3 2 kb de EcoRI-EcoRV intacto en estos plasmidos recombinantes y su orientación fue determinado a través del trazado de mapas de restricción Para obtener la sobreexpresión de la proteína quimérica de 74 kDa, se transformaron pJBDf51 y pJBDf62, en forma ceparada a £ coli BL21(DE3) Los transformantes fueron inducidos con IPTG (1 mM) durante 3 horas a 37°C Las células fueron cosechadas, lavadas se volvieron a suspender en 1% de SDS e hirvieron durante 10 minutos Los lisatos después fueron utilizados para SDS-PAGE y análisis de inmunotincion Como se espero, ambos transformantes produjeron la proteina quimérica de 74 kDa fácilmente detectada mediante tinción Western con MAb F1-Pn3 1 (FIGURA 11) Sin embargo bajo la conducción de inducción de IPTG, solamente los transformantes BL21 (DE3)(pJBDf51 ) sobreexpresaron la proteina quimérica de 74 kDa (FIGURA 11A y 11B, carril 2) indicando que la dirección transcppcional de gen en el fragmento de 32 kb de EcoRI-EcoRV es del extremo de EcoRI hacia el extremo de EcoRV (FIGURA 10A) El fragmento de 32 kb de EcoRI-EcoRV fue clonado al plasmido pDELTA 1 para producir el plasmido pJBD?I Una serie de eliminaciones traslapantes fueron generadas y utilizadas como plantillas de secuenciacion de ADN La secuencia de ADN de todo el inserto de 32 kb de EcoRI-EcoRV es de SEC DE IDENT NO 1 Se encontraron dos marcos de lectura abiertos ("ORFs") y su orientación se indica en la FIGURA 10B ("ORF27" y "Fucl-HSP72 (C-169)") En frente de estos dos ORFs, se identificaron sitios de unión de ribosoma putativo (SEC DE IDENT NO 1), nucleótidos 18-21 y 760-763) No se detectaron secuencias de -10 y -35 promotoras obvias El ORF 27 extiende los nucleótidos 30-755 (SEC DE IDENT NO 1) y codifica una proteína de 242 aminoácidos con un peso molecular calculado de 27,066 daltons La secuencia de aminoácido deducida de esta proteína es SEC DE IDENT NO 2 Se designo este gen como orf27, y se comparó con otras secuencias conocidas No se encontró ningún gen o proteína homologo El ORF grande (nucleótidos 771-2912, SEC DE IDENT NO 1) especifica una proteína de 714 aminoácidos con una masa molecular predictada de 79,238 daltons La secuencia de aminoácido de deducida de esta proteína es SEC DE IDENT NO 3 Este ORF se comparo con otras secuencias conocidas para determinar su relación con otras secuencias de aminoácidos Este análisis revelo un alto grado de similitud de la proteina codificada con la secuencia de isomerasa de fucosa de £ coli (Fucl) y a varios miembros de la familia del gen HSP70, también conocidos como genes DnaK La alineación de SEC DE IDENT NO 3K y aquellos de la £ coli y proteínas HSP70 (Dnak) indicaron que la porción N-terminal que corresponde a los aminoácidos 1 a 545 (SEC DE IDENT NO 3) de la proteina quimérica de 74 kDa es altamente homologa a £ coll, mientras que la porción C-terminal que corresponde a los aminoácidos 546-714 (SEC. DE IDENT N03) es similar a las proteínas HSP70 (DnaK) Es notable que existe un sitio de restricción EcoRI que yace en la unión de estas dos porciones del gen que codifica para la proteína de 74 kDa (SEC DE IDENT NO 1, entre los nucleótidos 2404 y 2405) Otros sitios de restricción existen entre los nucleótidos 971 y 972 (Pst I), nucleótidos 1916 y 1917 (Pst I), nucleótidos 1978 y 1979 (Xho I), y nucleótidos 3164 y 3165 (EcoRV). A partir de estos datos se concluye que la proteína de 74 kDa fue una proteína quimérica codificada por dos piezas del ADN cromosomal de S pneumomae, un fragmento de 2 4 kb de EcoRI-EcoRI derivado del gen homólogo Fucl y un fragmento de 2 3 kb de EcoRI-EcoRI derivado del gen HSP 72 D Análisis de tinción Southern Se realizó la tinción Southern con el fin de confirmar que la proteína de 74 kDa es una proteína quimérica y de intentar clonar todo el gen de HSP72 neumococal El ADN neumococal de S pneumomae fue digerido con Hindlll para la terminación, se ceparo en 0 8% de gel de agarosa y se transfirió sobre dos membranas de nylon positivamente cargadas (Boehpnger Mannheim) Las membranas después fueron teñidas ya sea con una sonda de 08 kb de EcoRI-EcoRV derivado del fragmento de 2 3 kb de EcoRI-EcoRI, o la sonda de 1 kb de Pstl, Pstl obtenida del fragmento de 2 4 kb de EcoRI-EcoRI Ambas sondas fueron previamente marcadas con digoxigenina-dUTP Estas dos sondas se hibpdizaron dos fragmentos individuales de Hindlll de diferentes tamaños (FIGURAS 10B y 10C) La sonda de 08 kb de EcoRI-EcoRV reconoció el fragmento de 3 2 kb de Hindlll y la sonda de 1 kb de Pstl, Pstl reacciono con el fragmento de 4 kb de Hindlll Este resultado además indico que el gel responsable de la expresión de la proteína quimérica de 74 kDa fue generado a través de fusión, en marco, de dos piezas de los fragmentos EcoRI, uno originado del fragmento conteniendo la porción 5' del homólogo Fucl de S pneumoniae, el otro derivado del segmento que lleva el fragmento C-169 del gen HSP72 neumococal El hecho de que la sonda de 0 8 kb de EcoRI-EcoRV hibpdizo un fragmento individual de 32 kb sugiere que existe solamente un gen de copia de HSP individual en S pneumoniae E Producción de HSP72 Recombinante Una colección genomica neumococal parcial se genero a través de la ligación del vertido de las digestiones de Hindlll de ADN cromosomal, con tamaños que vanan de 2 8 a 3 7 kb al plasmido pWSK29/H?ndlll La mezcla de ligación fue utilizada para transformar la cepa JM 109 de £ coli y los transformantes fueron clasificados mediante hibridación con la sonda de 08 kb de EcoRI-EcoRV Un plasmido representativo de los cuatro clones de hibridación positivos fue nombrado como pJBD291 El análisis de restricción del insertor y la tinción Western y el hsato de célula de los transformantes fueron empleados para verificar que el plasmido pJBD291 en realidad lleva el fragmento de 3 2 kb Hindlll conteniendo el gen HSP72 expresando la proteina de HSP72 recombinante (FIGURA 10B) La proteina de HSP72 expresada por los transformantes (pJBD291) emigró sobre el gel SDS-PAGE a la misma posición como la proteína HSP72 nativa (FIGURA 12) Para secuencias todo el gen de HSP72 y para sobreexpresar la proteína HSP72 de longitud completa, se aisló el fragmento de 32 kb de Hindlll del plasmido pJBD291, y se subclonó a los plásmidos pDELTA 1 y pT7-5 para generar pJBD?4 y pJBDk51, respectivamente Todo el fragmento de ADN de 32 kb de Hindlll llevado en el plásmido pJBD?4 y el fragmento de ADN de 2 3 kb de EcoRI-EcoRI contenido en el plásmido pJBD177 fueron secuenciados En conjunto, la secuencia de nucleotido comprendió 4320 pares de base y reveló dos ORFs (SEC DE IDENT NO 4) El primer ORF empezando en el nucleotido 682 y terminando en el nucleotido 2502 (SEC DE IDENT NO 4), se identificó como el gen HSP72 neumococal, y el segundo ORF, extendiéndose desde el nucleotido 3265 al nucleótido 4320 (SEC DE IDENT NO 4), fueron localizados 764 pares de base corriente abajo del gen estructural de HSP72 y se identificaron como la porción 5' del gen adnJ neumococal El sitio de unión de ribosoma curativo ("AGGA") se localizo 9 pares de base corriente abajo desde el codón de inicio del gen estructural HSP72, mientras que el sitio de unión de ribosoma típico ("AGGA") se encontró 66 pares de base corriente arriba del codon de inicio del gen estructural adnJ No se identificó ninguna región reguladora 5 típica enfrente de estos dos genes Los sitios de restricción se ubicaron entre los nucleotidos 1 y 2 (Hindlll) nucleotidos 1318 y 1319 (EcoRI), nucleotidos 1994 y 1995 (EcoRI) nucleotidos 3343 y 3344 (Hindlll), y nucleótidos 4315 y 4316 (EcoRI). La organización del gen de HSP72 {DnaK) y DnaJ en S. pneumoniae en es similar a aquella de £. coli [Saito, H. And Uchida, Mol. Gen Genet. 164, 1-8 (1978)], así como varías otras bacterias Gram positivas [Wetzstein, M. Et al., J. Bacteriol. 174, 3300-3310 (1992)]. Sin embargo, la región intragénica de S. pneumoniae es significativamente más grande y no se encontró ningún ORF para el gen grpE corriente arriba del gen estructural de HSP72 {DnaK). La proteína de HSP72 predictada tiene 607 aminoácidos y una masa molecular calculada de 64,755 daltons, según comparado con la masa molecular de 72 kDa estimada por SDS-PAGE. La proteína de HSP72 predictada es acida con un punto isoeléctrico (pl) de 4.35. La degradación de Edman automática de la proteína HSP72 nativa purificada extraída de la cepa 64 S. pneumoniae reveló SKIIGIDLGTTN-AVAVLE como la secuencia N-terminal de 19 aminoácidos de la proteína. La metionina amino-terminal no fue detectada, presumiblemente debido al procesamiento in situ el cual se sabe que ocurre en muchas proteínas. No se identificó ningún residuo de aminoácido en la posición 13. La secuencia N-terminal de 19 aminoácidos obtenida de la proteína HSP72 nativa está en completo acuerdo con la secuencia N-terminal de 19 aminoácidos deducida de la secuencia de nucleótido del gen HSP72 de S. pneumoniae recombinante (SEC. DE IDENT. NO:5) confirmando así la clonación. Esta secuencia N-termlnal mostró una identidad completa con la proteína de adnK de Lactococcus lactis y 68.4% de identidad con la proteína adnK de Eschenchia Coli Similarmente, la alineación de la secuencia de aminoácido predictada de HSP72 (SEQ ID NO 5) con aquella de otras proteínas bacterianas HSP70 (adnK) también reveló una alta homología (FIGURAS 13A-13D) Por ejemplo, HSP72 mostró un 54% de identidad con la proteína adnK de £ coli El valor de identidad más alto fue obtenido a partir de la comparación con Lactococcus lactis de la bacteria Gram positiva, mostrando 85% de identidad con HSP72 Como otras proteínas de HSP70 de bacterias Gram positiva, HSP72 carece de un estiramiento de 24 aminoácidos cerca del termino amino cuando se compara con proteínas de adnK de bacterias Gram negativas (FIGURAS 13a-13D) Aunque HSP72 comparte homología con proteínas HSP70 (adnK) de otros organismos, posee algunos aspectos únicos La divergencia de secuencia de las proteínas HSP70 (adnK) esta enormemente localizada en dos regiones (residuos 244 a 330 y 510 a 607, SEC DE IDENT NO 5) Más específicamente las secuencias de peptido GFDAERDAAQAALDD (residuos 527 a 541 SEC DE IDENT NO 5) y AEGAQATGNAGDDVV (residuos 586 a 600, SEC DE IDENT NO 5) son exclusivos a HSP72 El hecho de que la porción C-terminal de HSP72 es altamente variable sugiere que esta protema lleva determinantes antigenicos específicos a S pneumomae Consistente con esta hipótesis, los anticuerpos monoclonales dirigidos contra el fragmento C-169 de HSP72 (i nf ra) no fueron reactivos con £ coll y S aursus los cuales se sabe que expresan proteínas adnK similares a HSP72 La proteína adnJ truncada de S pneumomae (SEC DE IDENT NO 6) tiene 352 aminoácidos, los cuales muestran un alto grado de similitud con las porciones correspondientes de la proteína de adnJ de L lactis (72% de identidad) y la proteína de adnJ de £ coli (51% de identidad) La proteína de adnJ truncada predictada contiene un alto contenido de glicina (15%) Cuatro repeticiones ricas en Gly-Cys, cada una con motivos característicos de Gys,X-X-Cys-X-Gly-X-Gly de proteínas de adnJ [P A Silver and J C Way, Cell, 74, pp 5-6 (1993)], fueron identificadas entre los aminoácidos 148 y 212 de la proteína adnJ de S pneumomae (SEC DE IDENT NO 6) Se encontraron tres secuencias GGFGG repetidas (residuos 75-79, 81-85, y 90-94) cerca del termino N F Reactividad de MAbs Contra Antiqenos Recombinantes Los cuatro MAbs específicos de HSP72 F1-Pn3 1 F2- Pn32, F2-Pn3 3 y F2-Pn34, supra) fueron probados para su reactividad contra proteínas expresadas con £ coli infectado o transformado con fagos y plasmidos recombinantes conteniendo las secuencias de HSP72 Los cuatro individuos de MAbs reaccionaron con la proteina de fusión lacZ-HSP72 expresadas por el clon ?JBD7, localizando asi los epítopes reconocidos por estas MAbs a los residuos C-terminal 169 Sorprendentemente las proteínas codificadas por los insertos neumococales en ?JBD17 y PJBDA?1 fueron reconocidas solamente por 3 de 4 Mabs Estos resultados sugieren que aunque los fragmentos de C-169 sintetizados en £ coli e infectados con ?JBD7 y ?JBD17 tienen la misma estructura primaria, son de conformación distinta La falta de reactividad de MAb F2-Pn32 con algunas proteínas recombinantes surgió de la posibilidad de que MAb particular reconoce un epítope mas completo Aunque los epítopes F2-Pn32 complejos siguen siendo reconocibles en inmunotinciones Western La proteína HSP72rec completa expresada por £ coli conteniendo el plásmido recombinante pJBD?4 fue reactiva con los cuatro MAbs EJEMPLO 4 Carácter Específico Antigénico y Reactividad de Anticuerpos Monoclonales Específicos en HSP72 La reactividad de MAbs F1-Pn3 1, F2-32, F2-Pn33 y F2-Pn34 a una librería de cepas bacterianas incluyendo 20 cepas S pneumomae representando 16 serotipos capsulares (tipos 1, 2, 3, 4 5, 6, 8 9, 10, 11, 12, 14, 15, 19, 20 y 22) y las 17 cepas bacterianas no neumococales listadas en el Cuadro 2, se probo utilizando un inmunoensayo de enzima dot como se describe por D Martin et al , fsupra] e inmunotincion Para el inmunoensayo de enzima dot, las bacterias se desarrollaron durante de la noche sobre placas de agar de cocolato y después se suspendieron en PBS pH 74 Se aplico un volumen de 5 µl de una suspensión conteniendo aproximadamente 109 CFU/9ml a un papel de nitrocelulosa se bloquearon con PBS conteniendo 3% de albúmina de suero de bovino, y después se incubaron secuencialmente con MAbs y anticuerpo secundario marcado con preoxidasa Los extractos de célula completos fueron preparados para el análisis de tinción Western hirviendo las suspensiones bacterianas en una solución de pH de muestra, durante 5 minutos.

CUADRO 2: LISTA DE AISLADOS NO IMEU OCOCALES PROBADOS A TRAVÉS DEL IN UNOENSAYODE ENZIMA DOT Designación de Cepa Especie género Grupo o tipo C-2 Streptococcus pyogenes grupo A C-3 Streptococcus agalactiae grupo B C-7 Enterococcus faecalis grupo D C-9 Streptococcus bovis grupo D C-14 Streptococcus imitans C-15 Streptococcus salivarius C-19 Streptococcus sanguis r C-20 Streptococcus sanguis I C-21 Streptococcus sanguis I C-22 Streptococcus sanguis II C-23 Streptococcus sanguis p C-24 Streptococcus sanguis II C-25 Streptococcus sanguis II C-27 Gemella morbillorum C-30 Stap ylococcus aureus C-33 Bacillus C-36 Escherichia coli Cuando se probó mediante inmunoensayo de enzima dot, cada MAb reaccionó con cada una de las cepas de S pneumonías y ninguno de los aislados no neumococales. Estos resultados fueron inesperados, ya que los estudios de comparación revelaron que HSP72 es muy similar a otras proteínas HSP70 bacterianas (DnaK), por ejemplo aquellas de £ coll y S aureus.

Después, se realizaron inmunotinciones para investigar adicionalmente las inmunorreactividades de nuestros MAbs Como se muestra en el CUADRO 3, cada MAb exhibió algo de reactividad Aunque el porcentaje de identidad de la secuencia de aminoácido de £ coli y la secuencia de aminoácido de HSP72 (SEC DE IDENT NO 5) es de 54%, los cuadro MAbs específicos de HSP72 no reconocieron la proteína HSP70 de £ coli (DnaK) Similarmente, los MAbs específicos de HSP72 no reaccionaron con la proteína de HSP70 C trachomatis (adnK), la cual tiene un 56% de identidad de aminoácido con la secuencia de aminoácido de HSP72 La homología de secuencia de aminoácido alta se observó entre las proteínas HSP72 y HSP70 (adnK) de especies bacterianas gram positivas Sin embargo, otra vez ninguno de los MAbs específicos de HSP72 reacciono con las especies gram positivas de las especies S aureaus o Bacillus, las cuales exhiben 74% y 76% de homología de secuencia de aminoácido, respectivamente, con HSP72 A partir de estos datos, es evidente que aunque las proteínas de HSP70 (adnK) pueden estar estructuralmente estructuradas con HSP72 son inmunológicamente distintas Entre los aislados no neumococales que reaccionan con por lo menos un MAb, existe S pyogenes, Enterococcus faecalis, S mutans y S sanguis, los cuales pertenecen al genero Streptococcus o Strsptococcus relacionado con Entßrococcus Mas bien, ni la proteina HSP70 ni la estructura del gen han sido identificados en estas especies de Streptococcus o Enterococcus En conjunto, estas observaciones indican que las secuencias de aminoácido hipervariables o residuos dentro de las proteínas HSP70 (adnK) están implicadas en las antigenicidad. En forma interesante, el análisis de inmunotínción reveló que no se presentó ninguna variación significativa en la masa molecular de las proteínas de HSP70 (adnK) entre tanto los aislados de S. pneumoniae como los aislados no-neumococales inmunorreactivos CUADRO 3: REACTIVIDAD DE MABS CON AISLADOS NO NEUMOCOCALES EN INMUNOTINCION WESTERN Cepa Bacteriana Abs Designación género/especie tipo Pl- F2- P2- F3- WIJ.l Pn3.2 PH3.3 PnJ.4 C-2 Strtptococc s grupo A * •*•* pyogenes C3 Streptococcus grupo B agalactias C-7 Enterococcus grupo D - + - faecalis C-9 Streptococcus grupo D hovis C-14 Streptococcus + - mutans C-1S Streptococcus salivapus " C-19 Streptococcus I + -*- sajiguie C-2C Streptococcus I + •* + sanguxs C-21 Streptococcus I + * + * sanguis C-22 Streptococcue II + *+• -*- •4* sanguis C-23 Streptococcus II + + - sanguis C-24 Streptococcus II + -t- + + sanguis C-25 Streptococcus II + + •+• + san?ruis C-27 Centella . morbi 11 oruu " C-30 Stap yl ococcus — — — aureus " C-33 Bacillus - - " C-36 Eschep h^a - - coll C-RP Chltupydia 2 crachonacis* a t indica una señal débil comparada con la reactividad observada con antígenos de S. pneumoniae. Se probaron anticuerpos elementales purificados de C trachomatis EJEMPLO 5 - Purificación de HSP72 Y Su Uso Como Un Inmunogen para Proteger Contra Infección Letal de S Pneumomae A Procedimientos 1 Preparación de la Proteína HSP72 Recombinante Purificada y de C-169 Recombinante Se obtuvo la expresión exclusiva de alto nivel de del gen HSP72 empleando el sistema de pohmerasa de ARN T7/promotor T7 en £ coli El fragmento de 32 kb Hindlll se clono en ambas orientaciones enfrente del promotor T7 F10 en el plasmido pT7-5 El plásmido resultante pJBDk51 después fue transformado a la cepa BL21 de £ coll (DE3) La sobreexpresion de la protema HSP72 recombmante (HSP72rec) fue inducida cultivando en un caldo suplementado con antibióticos durante un periodo de 3 horas después de la adición de IPTG a una concentración final de 1 mM Los altos niveles de £ coli de HSP72rec fueron concentrados mediante centrifugación y se hsaron mediante la aplicación de sonido moderado en 50 mM Tps-CI (pH 8 0), 1 mM EDTA y 100 mM de regulador de pH de lisis de NaCI conteniendo 02 mg/ml de lisozíma Los lisatos de célula fueron centrifugados a 12,000 g durante 15 minutos y los sobrenadantes se recogieron HSP72rec fue purificado mediante inmunoafinidad utilizando el anticuerpo monoclonal F1-Pn3 1 inmovilizado sobre perlas se sepharosa 4B (Pharmacia) La pureza de los productos eluidos se determino en SDS-PAGE La proteína C-169 recombinante (C-169rec) fue expresada en la forma de cuerpos de inclusión insolubles en la cepa JM109 de E. coli transformada con el plásmido pJBD?I Los cuerpos de inclusión de proteína fueron recuperados de las células bacterianas en forma de pella interrumpidas por la aplicación de sonido como se describió anteriormente. Las pellas fueron lavadas en solución reguladora de pH de hsis conteniendo 1 mg/ml de desoxicolato para remover los materiales de contaminación, y los cuerpos de inclusión de proteína después fueron solubi zados en urea 6 M La solución de proteína fue centrifugada a 100,000 g y el sobrenadante transparente se recogió y se dializó contra una solución salina regulada en su pH con fosfato Después de la purificación, el contenido de proteína se determinó a través del ensayo de protema Bio-Rad (Bio-Rad Laboratories, Mississauga, Ontario, Canadá) 2. ESTUDIOS DE INMUNOPROTECCION ACTIVA Se imunizaron subcutáneamente dos grupos de 10 ratones hembra Balb/b (Charles River Laboratories) tres veces a intervalos de dos semanas con 0 1 ml de antígenos HSP72rec o C-169rec purificados, absorbidos a auxiliar Alhidrógel Se probaron dos dosis de antígeno, aproximadamente de 1 y 5 µg Un tercer grupo de 10 ratones de control fueron inmunizados idénticamente a través de la misma ruta con solamente auxiliares de Alhidrógel Se tomaron muestras sanguíneas del seno orbital antes de cada inmunización y cinco a siete días después de la tercera inyección Los ratones fueron atacados después con aproximadamente 10® CFU de la cepa WU2 de S pneumomae tipo 3 Las cepas del inoculo del ataque S pneumoniae fueron colocadas en placas sobre placas de agar de chocolate para exterminar el CFU y para verificar la dosis de ataque Las muertes fueron registradas a intervalos de 6 horas para los primeros 3-4 días después de la infección, y después a intervalos de 24 horas durante un periodo de 14 días En los días 14 o 15, los ratones sobrevivientes fueron sacrificados y se probaron las muestras sanguíneas para la presencia de organismos de S pneumomae Las respuestas del anticuerpo a los antigenos HSP72 recombinantes se describen en el Ejemplo 7 3. ESTUDIOS DE INMUNO PROTECCIÓN PASIVA Se inmunizo un conejo NZW (Charles River Laboratories) subcutáneamente en sitios múltiples con aproximadamente 50 µg de la protema C-169rec purificada absorbida a auxiliar Alhid rogel El conejo fue reforzado tres veces a intervalos de dos semanas con el mismo antígeno y se tomaron muestras sanguíneas en los días 7 y 14 después de la ultima inmunización Las muestras de suero fueron vaciadas y los anticuerpos fueron purificados a través de precipitación utilizando 40 % de sulfato de amonio saturado Se inyectaron ratones SCID inmunodeficietes combinados severos intrapeptonealmente con 025 ml de anticuerpos de conejo purificado una hora antes del ataque intravenoso con 5000 u 880 CFU de la cepa WU2 de S. pneumoniae de tipo 3. Los ratones SCID de control recibieron en solución reguladora de pH estéril o anticuerpos purificados de sueros de conejo no inmunes. Las muestras del inoculo de ataque de S. pneumoniae fueron colocadas en placas sobre placas de agar de chocolate para determinar CFU y para verificar la dosis de ataque. Los ratones SCID fueron elegidos debido a su alta suceptibilidad a infección de S. pneumoniae. Las muestras sanguíneas (20 µl de cada una) obtenidas 24 horas después del ataque fueron colocadas en placas en agar de chocolate y se probaron para la presencia de organismos de S. pneumoniae. El nivel de detección fue de 50 CFU/ml. Las muertes fueron registradas a intervalos de 24 horas durante un periodo de 5 días.

B) RESULTADOS La disponibilidad de los insertos de ADN de S. pneumoniae clonados que codifican la proteína HSP72 completa o parcial (C-169) y la expresión de proteínas recombinantes en E. coli permitió la obtención de proteínas purificadas útiles para investigación del potencial vacinogénico de la proteína HSP72. Las proteínas tanto HSP72rec como C-169rec fueron obtenidas en un estado relativamente puro, sin ningún contaminante detectado en los geles de poliacrilamina de SDS teñidos con azul de Coomassie (Figuras 14 y 15, respectivamente).

Para evaluar el potencial vacinogénico de HSP72, primero se examinó la capacidad de HSP72rec para producir una respuesta inmune protectora Los grupos de 10 ratones fueron inmunizados con HSP72rec de longitud completa (1 µg o 5 µg de dosis) y se atacaron con 42 millones CFU de cepa WU2 de S pneumomae de tipo 3 El ochenta por ciento (80%) de los ratones dosificados con 1 µg de HSP72rec sobrevivieron al ataque, así como un 50% de los ratones dosificados con 5 µg HSP72 Ninguno de los ratones de origen inmunizados con auxiliar Alhidrogel sólo sin antígeno sobrevivieron al ataque (Figura 16) No se detectaron organismos de S pneumomae en ninguna de las muestras sanguíneas recogidas en los días 14 o 15 de los ratones que sobrevivieron a la infección La observación de que HSP72rec produjo protección contra los neumococos de WU2 de tipo 3 indico que HSP72 derivado del ADN extraído de una cepa de tipo 6 contiene epítopes capaces de producir protección contra una cepa heteróloga teniendo un tipo capsular diferente Se examino adicionalmente la respuesta inmune a la proteína HSP72 utilizando fragmentos de proteina recombinante expresados de £ coli transformado con un gen fucl-HSP72 quimérico Los ratones inmunizados con C-169rec purificados fueron protegidos del ataque neumococal fatal, demostrando asi que algunos, sino es que todos los epitopes que producen protección están presentes en la región C-terminal de la molécula HSP72 comprendiendo los últimos 169 residuos Los grupos de 10 ratones fueron inmunizados con C-169rec (1 µg o 5 µg de dosis) y se atacaron con 6 millones CFU de la cepa de WU2 S. pneumomae de tipo 3. El sesenta por ciento (60%) de los ratones dosificados con 1 µg C-169rec sobrevivieron al ataque, así como el 70% de los ratones dosificados con 5 µg C-169rec (Figura 17) En contraste, todos los ratones de origen murieron 2 días después del ataque Por lo tanto, la porción C-terminal de HSP72 de S pneumomae, que incluye la región de divergencia máxima entre las proteínas adNK es un objetivo para la respuesta inmunoprotectora. Como se ilustra en el Cuadro 4 a continuación, dos experimentos independientes demostraron que los ratones SCID pasivamente transferidos con anticuerpos ant?-C-169rec de conejo fueron protegidos de infección fatal con WU2 S pneumomae En contraste, ninguno de los 15 ratones de control sobrevivieron Los ratones de control recibieron anticuerpos de sueros de conejo no inmune o recibieron solamente regulador de pH estéril Además, todos los ratones de los grupos de control tuvieron un homocultivo de S pneumomae positivo 24 horas después del ataque, mientras que se detectaron organismos de S pneumomae en solamente dos de un total de 10 ratones SCID inmunizados CUADRO 4: ESTUDIOS DE INMUNIZACIÓN PASIVA QUE MUESTRAN PROTECCIÓN DE RATONES SCID DE INFECCIÓN S. PNEUMONIAE EXPERIMENTAL A TRAVÉS DE ANTI CUERPOS DE CONEJO ANTI-C-169rec Experimento Invección No de ratones No de ratones que sobreviven de prueba po- al ataque después sitiva por de 5 días presencia de S. pneumoniae anti-C169rec 0/5 5/5 regulador de pH estéril 4/5 2/5 anticuerpos de control 0/5 5/5 anti-C-169rec 0/5 5/5 regulador de pH estéril 5/5 0/5 En los experimentos 1 y 2 (Cuadro 4), los ratones fueron atacados con 5000 y 880 CFU de la cepa WU2 de S pneumonías, respectivamente. Los resultados del cuadro 4 son expresados como el número de ratones que sobreviven al ataque, o positivos de prueba para la respuesta de S. pneumonías, comparado con el número total de ratones en cada grupo La desmostración del ant?-HSP72 específico del anticuerpo producido por inmunización con proteínas HSP72 o C-169 recombinanates viene de los análisis de tinción Western utilizando hsatos de célula de S pneumomae como antígenos Una banda individual correspondiendo a HSP72 se detectó para todos los antisueros de conejo y de ratón probados Estos resultados serológicos sugirieron que la protección después de la inmunización con proteínas recombinantes se debió a la producción de anticuerpos reactivos con HSP72 de S pneumomae EJEMPLO 6 Sistema de expresión inducible por calor para una producción de alto nivel de la porción Terminal C-151 de la Protema HSP72 A Construcción del plásmido pURV3 conteniendo la región de codificación C-151 terminal del HSP72 de S pneumonías La región de ADN que codifica para 151 aminoácidos en el extremo carboxilo del HSP72 de S pneumomae, fue insertado corriente abajo del promotor, ? PL al vetor de translación p629 [H J George et al , Bio/Technology 5, pp 600-603 (1987)] Este vector contiene un cásete del gen represor sensible a la temperatura ? cl867 del bacteriófago a partir del cual se ha eliminado el promotor PR funcional La inactivación del represor cl857 a través de un incremento de temperatura de las escalas de 30-37°C a 37-42°C da como resultado la inducción del gen bajo el control de ? PL La inducción de la expresión del gen en células E. coli a través de un desplazamiento de temperatura es ventajoso para la fermentación a gran escala, ya que puede ser obtenida fácilmente con fermentadores modernos. Sin embargo, se debe entender que ya que E. coli fue el microorganismo de elección en los experimentos descritos en la presente, otros organismos huésped, tales como levadura, pretenden ser incluidos dentro del alcance de está invención. Un fragmento de 457 nucleótidos, incluyendo la región de 457 bases entre 2050 a 2506 en el gen HSP72 de S. pneumonías (ver SEC. DE IDENT NO 4), fue amplificado mediante la reacción de cadena de polimerasa (PCR) del ADN genómico de cepas 64 de tipo 6 S. pneumonías utilizando los iniciadores de oligonucleótido OCRR26 (d'-GGCAGATCTATGAAGGCCAAAGACCTTGGAAC) y OCRR27 (5'-CGCGGATCCTTACTTTTCCGTAAACTCTCCGT) El ADN cromosomal fue preparado de un cultivo de 90 ml de células exponencialmente en crecimiento S pneumomae en caldo de infusión de corazón utilizando el método de Jayarao et al [J Clin Microbiol., 29, pp 2774-2778 (1991)] Se realizaron reacciones de amplificación de ADN utilizando un cic zador térmico de ADN Perkm Elmer, San José, CA En OCRR26, está presente un codón de inicio ATG en el marco justo corriente arriba de la región de codificación para la región amino-terminal del C-151 Los iniciadores OCRR26 y OCRR27 contiene, respectivamente, un sitio de reconocimiento de Bg 111 (AGATCT) y un BamHl (GGATCC) con el fin de facilitar la clonación del producto PCR a los sitios de restricción desfosfoplados Bg 11I y BamHl de p629 El producto de PCR fue purificado de geles de agarosa a través del método de congelación con fenol [S A Benson Biotechniques 2, pp 67-68 (1984)] y fue digerido con las enzimas de restricción Bg 111 y BamHl El fragmento Bg1ll-BamHI de 471 pares de base, después fue ligado a los sitios de reconocimiento de Bglll y BamHl desfosfoplados de p629 Un mapa parcial del plásmido resultante ?URV3 se muestra en la Figura 18 Este plásmido fue transformado a través del método de Simanis [Hanahan, D In D M Glover (ed ), DNA Cloning, pp 109-135, (1985)] a la cepa E coll XLI Blue MRF' (?(mcrA) 183 ?(mcrCB-hsdSMR-mrr) 173 endAl supE44 th?-1 recAl gyrA96 relAl lac [F' proAB laciqZ?MId Tn10 (Tetr)]c), que se obtuvo de Stratagene La Jolla CA Los transformantes se desarrollaron a 37°C fueron calcificados a través de inmunotencion de colonia [J Sambrook et al (supra)] utilizando MAb F1-Pn3 1 reactivo con C-169rec Se purifico el ADN de plasmido de un transformante seleccionado y el inserto de ADN fue secuenciado a través de PCR utilizando el equipo de secuenciacion de ciclo determinador de desoxi de colorante Taq de Ampphed Biosystems Ine (ABI) y se realizo la electroforesis de ADN en un secuenciador de ADN automático 373A (ABI) La secuencia de nucleotido del inserto perfectamente conocido con la secuencia de nucleotido de la región de codificación C-151 del gen HSP72. (ver SEC DE IDENT NO. 25 y secuencia de aminoácido correspondiente en SEC DE IDENT NO 26) El plásmido fue transformado a la cepa W3110 de £. coli prototrófica (ATCC 27325) para la producción de C-151rec B. EXPRESIÓN DE C-151rec Y PREPARACIÓN DEL ANTIGENO El C-151rec recombinante fue sintetizado con un residuo de metionina en su extremo de amino en la cepa W3110 E coh conteniendo el plásmido pURV3 Se desarrollaron células E coli a 30°C de caldo LB conteniendo 10 µg de ampicilina por ml hasta que A600 alcanzó un valor de 06 Después, las células fueron cultivadas a 40°C durante 18 horas para inducir la producción de la protema C-151rec Se preparó una proteína C-151rec semi-pupficada utilizando los siguientes procedimientos Las células bacterianas fueron cosechadas a través de centrifugación y la pella resultante se lavo y se volvió a suspender en solución salina regulada en su pH con fosfato Se añadió hsozíma y las células fueron incubadas durante 15 minutos en hielo antes del rompimiento por medio de impulsos de sonificación Los lisatos de célula fueron aclarados a través de centrifugación y los sobrenadantes fueron recogidos y sometidos a separación utilizando un equipo de u Itraf i Itra ción de Amicon (series de células agitadas 8000, Amicon Canadá Ltd Oakville, Ontario) El u Itraf i Itrado no retenido por una membrana YM30 fue recuperado, analizado a través de SDS-PAGE y teñido con azul de coomassie R-250 Se determinaron las concentraciones de protema comparando la intensidad de tinción de la proteína C-151rec con aquellas obtenidas con concentraciones definidas de inhibidor de tripsina de soya. C. REACTIVIDAD DE MAbs CONTRA C-151rec Un panel de 10 anticuerpos monoclonales seleccionados por su reactividad con la proteína HSP72 de S pneumoniae fueron probados para su reactividad de C-151rec a través de análisis de tinción Western utilizando ultrafiltrados YM30 preparados como se describe anteriormente. Los MAbs incluyeron una sene de 6 anticuerpos monoclonales desarrollados para la proteína HSP72rec (F3-Pn3 5 a F3-Pn3.10) y anticuerpos monoclonales F1-Pn3 1, F2-Pn3.2, F2-Pp3.3, F2-Pn34 Los 3 MAbs F1-Pn3 1, F2-Pn3 3, F2-Pn3.4 que fueron reactivos con C-169rec también reconocieron el fragmento C-151rec. Todos los otros MAbs solamente fueron reactivos con HSP72rec indicando así que pueden ser dirigidos con epítopes presentes en la región aminoterminal de la proteína HSP72 EJEMPLO 7 - RESPUESTA DE ANTICUERPOS DE RATONES Balb/c y MONOS MACACA-FASCICULARIS (CYNOMOLGUS) A LOS ANTIGENOS HSP72 RECOMBINANTES A PROCEDIMIENTOS 1 INMUNIZACIÓN DE ANIMALES Grupos de 10 ratones hembra Balb/c fueron inmunizados subcutáneamente ya sea con HSP72rec o C-169rec como se describe en el Ejemplo 5. Con el fin de determinar la respuesta del anticuerpo C-151rec, un grupo de 6 ratones fueron inmunizados 3 veces a intervalos de dos semanas con 0.5 µg de C-151rec absorbido en un auxiliar de hidrogel a través de inyección intraperitoneal. Los sueros de muestras sanguíneas tomadas antes de cada inmunización y cuatro a siete días después de la tercera inmunización fueron probados para reactividad de anticuerpo con S. pneumoniae a través de ELISA utilizando placas revestidas con extractos de célula de S pneumoniae Se inmunizaron monos sinómologus hembra ¡ntramuscularmente en los días 1, 22 y 77 con 0 5 ml conteniendo 150 µg de antígenos purificados de HSP72rec o C-169rec absorbidos en auxiliar al Hidrógel Se tomaron muestras sanguíneas regularmente antes y después de cada inmunización y los sueros fueron probados para reactividad de anticuerpo del antígeno HSP72 S. pneumoniae a través de análisis de tinción Western El carácter específico de los anticuerpos desarrollados para HSP72 S. pneumomae fue confirmado a través de análisis de tinción Western a los extractos de célula S pneumomae y antígenos recombinantes purificados B Resultados Los resultados previamente descritos en el Ejemplo 5 claramente demuestran la naturaleza protectora de la respuesta de anticuerpo producida después de la inmunización con antígenos de HSP72 recombinantes Aquí se verificó la apariencia de la respuesta de anticuerpo en el suero en ratones (Figuras 19, 20 y 21) y en monos (Figura 22) durante el programa de inmunización Ambas especies respondieron fuertemente a proteínas HSP72 recombinantes de longitud completa y truncadas utilizadas como inmunogenes con titulaciones promedio de 1 64000 después de la tercera inyección El análisis detallado de sueros individuales revelo que cada animal respondió a la inmunización en el desarrollo de anticuerpos con HSP72 S pneumomae En ratones inmunizados con C-169rec, las dos dosis probadas, es decir 1 y 5 µg fueron similarmente eficientes con la inducción de titulaciones de anticuerpos similares (Figura 20) se observó una fuerte respuesta de refuerzo después de la segunda inyección con C-169rec sin ningún incremento en las titulaciones de anticuerpo después de la tercera inyección En contraste a esto se observó que la respuesta inmune a HSP72rec fue dependiente de la dosis Los incrementos en las titulaciones del anticuerpo especifico fueron observadas después de una segunda y una tercera inyección ya sea con HSP72rec o con C-151rec (Figuras 19 y 21) El estudio de la respuesta inmune de monos claramente indicó que la inmunogeneicidad de los antígenos HSP72 recombinante no está restringida a roedores tales como conejos y ratones La respuesta humoral después de la segunda inyección con cualquier antigeno se caracterizo por un fuerte incremento en las titulaciones de anticuerpo específicas en HSP72 que pueden persitir durante varias semanas sin ninguna reducción detectable en las titulaciones del anticuerpo (Figura 22) Además, fueron detectables anticuerpos de suero específico en los sueros de cada mono después de una inyección individual de antígenos recombinantes EJEMPLO 8 - FORMACIÓN DE MAPA DE EPITOPE DE CÉLULA B DE PROTEINA DE TENSIÓN DE HSP72 En el Ejemplo 3, se mostró que la variabilidad importante en la secuencia primaria de las proteínas HSP70 fue ppcipalmete localizada en dos regiones correpondiendo a dos residuos de aminoácidos 244 a 330 y 510 a 607 de la proteína HSP72 S pneumomae Estas regiones variables pueden contener epitopes de célula B responsable para la hetereogeneicidad antigenica reportada en el Ejemplo 4 Para investigar esta posibilidad, la reactividad de los anticuerpos policlonales y monoclonales a HSP72 de S pneumomae fueron probadas contra 14 péptidos seleccionados para cubrir la mayoría de estas regiones A Procedimientos Catorce polipéptidos de 14 a 30 residuos de aminoácidos fueron sintetizados Las secuencias de pepíido y sus ubicaciones en la protema se resumen en el cuadro 5 Los peptidos CS870 CS873 CS874, CS875, CS876, CS877, CS878, CS879, CS880 Y CS882 fueron sintetizados mediante Biochem Immunosystem Ine (Montreal Canadá) utilizando un sintetizador de péptido automático Los péptidos MAP1, MAP2, MAP3 Y MAP4 fueron sintetizados sobre un núcleo de hsina de ramificación como Múltiple Antigenic Peptides (MAP) a través del 1' Est du Quebéc, Centre de recherche du Chul (Saite-foy, Canadá). Los péptidos fueron purificados a través de cromatografía en liquido de alta presión de fase inversa Los péptidos se solubihzaron en agua destilada excepto para los péptidos CS874 Y CS876, los cuales fueron solubilizados en un volumen pequeño ya sea de 6M guanidina - HCL o sulfoxido de dimetilo y después se ajustó a 1 mg/ml con agua destilada Se realizaron análisis de ELISA del peptido revistiendo los peptidos sintéticos sobre placas de mícrotitulación Immunolon (Dynatech Laboratories, Ine , Chanti I ly , VA) a una concentración de 50 µg/ml de acuerdo con los procedimientos descritos por J Hamel et al [supra] Para confirmar la reactividad de MAbs con peptidos, se determinó la capacidad de péptidos de fase fluida para inhibir MAB uniéndose a HSP72 solido Para el análisis de inhibición se revistieron placas de microtitulacion con extractos de pared de célula de S pneumonías Los sobrenadantes de cultivo de hibpdoma conteniendo MAbs específicos de HSP72 fueron incubados durante la noche a 4°C con varias concentraciones de péptidos Los peptidos tratados y los sobrenadantes de control, después fueron probados a través de ELISA como se describe anteriormente Los sueros inmunes fueron de animales inmunizados 3 veces con antigenos de HSP72 recombinantes Un conejo fue inmunizado con 37.5 µg de HSP72rec purificado de acuerdo con el protocolo de inmunización descrito en el Ejemplo 5. Los sueros de murino vertido, fueron de tres ratones Balb/c inmunizados con HSP72rec del Ejemplo 5 y los sueros del vertido de mono fueron de grupos de dos animales inmunizados ya sea HSP72 o de C-169rec.

CUADRO 5: SECUENCIAS Y UBICACIONES DE PEPTIDOS SINTÉTICOS CORRESPONDIENTES A RESIDUOS DE AMONOACIDOS HSP72 S. PNEUMONIAE B. Identificación y Localización de Epítopes de Célula B Lineal Los resultados presentados en la Figura 23 revelaron que la mayoría de la reactividad inmunológica fue observada con los péptidos localizados dentro de los residuos de aminoácidos 457 y 607, correspondiendo al fragmento C-151 de HSP72. El anticuerpo de los sueros de conejo, ratones y monos de animales inmunizados ya sea con HSP72rec recombinanate o C-169rec fueron reactivos con ambos, el péptido MAP2 y el péptido MAP4 En forma interesante, la secuencia de los péptidos MAP2 y MAP4 se extiende a la región carboxil terminal hipervapable conteniendo las secuencias GFDAERDAAQAALDD (residuos 527 a 541) y AEGAQATGNAGDDVV (residuos 586 a 600) definidos como exclusivos para HSP72 S. pneumoniae basado en la comparación de de las secuencias de proteína de HSP70 disponibles en los bancos de datos Los datos revelaron así que ambas secuencias de péptido contienen, epítopes de célula B lineales Además, el péptido MAP4 sólo fue reconocido también por MAb F1- Pn3 1 Esta reactividad se confirmó a través de un ensayo de inhibición de fase de fluido en los cuales 10 µg/ml de MAP4 causaron una inhibición completa de F1-Pn3 1 uniendo a HSP72 Los antisueros pohclonales de animales inmunizados con la proteína recombinante HSP72 completa también reconocieron epítopes de célula B localizados en los peptidos CS875, MAP1 y MAP3 En conjunto, estos datos indican que el fragmento terminal C-151 terminal hipervapable de HSP72 estimula la respuesta de la célula B y posiblemente constituye la porción inmunodominante de la proteína HSP72 La falta de reactividad de MAbs F2-Pn3 3 y F2-Pn34 con los péptidos sintéticos, sugiere que reacciona con determinantes conformacionales presentes en la región C-termmal del HSP72 La existencia de epitopes de protección en la región C-151 fue fuertemente sugerida en el Ejemplo 5, en donde los ratones inmunizados con C-169rec purificados fueron protegidos de inyección fatal con una cepa virulenta de S. pneumomae sugiriendo así que los fragmentos terminales carboxilo C-169 o C-151 de HSP72 S pneumomae o aún sus fragmentos más pequeños pueden probar ser muy útiles para el desarrollo de una vacuna futura. La región variable comprendida de los residuos de aminoácido 244 a 330 también constituye un dominio antigénico Los epítopes lineales ubicados en los péptidos traslapantes CS877 (aminoácidos 237 a 271) y CS878 (aminoácidos 268 a 281) péptidos CS880 (aminoácidos 286-299) y péptidos CS882 (aminoácidos 315-333) fueron identificados a través de sueros hipepnmunes Ejemplo 9 - HSP70 (ADNK) de Streptococcus pyogenes y Streptococcus agalactiae: clonación molecular y secuenciación de ADN de los genes hsp70; análisis de secuencia de nucleótido y de proteína; relación antigénica a S. pneumoniae; síntesis de Streptococcus agalactiae HSP70 incrementada a la respuesta al calor.

A Procedimientos 1 Cepas Béctepanas y Vector del Plásmido Se utilizaron las cepas de S pyogenes (Grupo A Streptococcus) y S agalatiae (Grupo B Streptococcus) en este estudio y fueron provistas por Labaratoire de la Sante Publique Du Québec (LSPQ), Sainte-Anne de Bellevue, Québec, Canadá La II cepa V8 S agalactiae corresponde a la cepa ATCC 12973 la cepa Bruno S pyogenes correspode a la cepa ATCC 19615 La cepa E coli XLI Blue MRF' se obtuvo de estratagene Se desarrollaron cepas estreptococales a 37°C en un incubador con 5% de CO2 Los estreptococos fueron rayados en placas de agar de soya tríptica conteniendo 5 % de suero de oveja (Les laboratopes Quélab, Montreal, Canadá), se hicieron cultivos líquidos en caldo de infusión de corazón (Difco Laboratories Detroit, Ml) sin agitación La cepa E coli se desarrollo a 37°C en caldo L con agitación a 250 rpm o en caldo L La pBluescppt KS(-) de fagémido de clonación general se compro de estratagene 2 Técnicas de ADN Recombinante Se utilizaron enzimas de restricción, ligasa de ADN T4 y fosfatasa intestinal de cabra, según fue recomendado por los proveedores (Pharmacia [Canadá] Ine , Baie D'Urfe, Canadá, and New England Biolaps Ltd , Mississauga, Canadá) La preparación de plasmidos a través de centrifugación de equilibrio en gradientes de bromuro de etidio Cscl, electroforesis en gel de agarosa en fragmentos de ADN, hibridación Sauter e hibridación de ADN de colonia fueron realizados como se describe por J Sambrook et al rsupral El ADN cromosomal de las bacterias estreptococales se preparo utilizando el procedimiento de B M Jayarao et al [J Clin Microbiol , 29 pp 2774-2778 (1991)] adaptado para cultivos bacterianos de 90 ml Se realizaron preparaciones de plásmido rápidas de acuerdo con D Ish-Horowicz et al [Nucí Acids Res 9, pp 2989-2998 (1981)] Los plásmidos utilizados para la secuenciación de ADN fueron purificados utilizando equipos de plásmido de Qiagen Ine (Chatsworth, CA) Los fragmentos de ADN fueron purificados de geles de agarosa a través del método de congelación con fenol [S A Benson, Biotechniques 2, pp 67-68 (1984)] Las sondas de ADN fueron marcadas a32p-dCTP o digoxigenina (DIG)-11-dUTP utilizando equipos de marcación de iniciador aleatorio de Boehpnger Mannheim (Laval, Canadá) Se realizaron transformaciones de plasmido a través del método de Simanis [Hanahan, D In D M Glover (ed ), DNA Cloning, pp 109-135, (1985)] La secuenciacion de los insertos de ADN genomico en los plásmidos se realizo utilizando ohglonucleotido sintético Las reacciones de secuenciacion se realizaron mediante la reacción de cadena de pohmerasa (PCR) utilizando el equipo de secuenciacion de ciclo determinador de desoxi de colorante Taq (ABI) y se realizo la electroforesis de ADN en un secuenciador de ADN automático 373A (ABI) El ensamble de la secuencia de ADN se realizo utilizando el secuenciador de programa 3 0 de Gene Code Corporation (Ann Arbor, Ml) El análisis de las secuencias de ADN y sus pohpeptidos predichos fueron realizadas con el programa de Gene Works versión 245 de I ntel I igen etics Ine (mountain view CA) Las reacciones de amplificación de ADN se hicieron utilizando un ciclizador térmico de ADN 480, Perkm Elmer Los oligonucleótidos fueron sintetizados a través de un sintetizador de oligonucleotido modelo 394 (ABI) 3 Clonación Molecular de los genes hso70/dnak de S agalactiae y S pyogenes El ADN cromosomal de S agalactiae y S pyogenes fue digerido para el completamiento de varias enzimas de restricción con secuencias de reconocimiento de hexanucleótido pahndromicos Las digestiones fueron analizadas a través de hibridación utilizando una sonda de ADN amplificada con PCR marcada correspondiendo a una región de 782 pares de base empezando en la base 332 corriente abajo del codón de iniciación ATG del gen HSP72 de S pneumomae (ver SEC DE IDENT NO 4) Esta región de ADN fue seleccionada, ya que esta relativamente bien conservada entre los genes hsp70 de las bacterias Gram positivas que han sido caracterizadas La amplificación de PCR se realizó en el ADN genómico S pneumomae utilizando los oligonucleotidos OCRR2 (5'- AAGCTGTTATCACAGTTCCGG) Y OCRR3 (5'-GATACCAAGTGACAATGGCG) Los fragmentos de restricción genomicos de hibridación de tamaño suficiente para codificar un polipeptido de 70 kDa (>1 8 kb) fueron parcialmente purificados a través de la extracción de fragmentos genomicos de tamaño correspondiente a partir de gel de agarosa La verificación de la presencia del gen hsp70 entre los fragmentos de restricción genómicos purificados se realizó a través de hibridación Southern utilizando la sonda de ADN de S. pneumoniae de 782-bp marcada Los fragmentos de restricción de ADN genómico purificados fueron clonados en sitios de restricción compatibles desfosfoplados de pBluescript KS(-) y transformados a la cepa E coli de XLI Blue MRF'. Las colonias fueron clasificadas a través de hibridación de ADN utilizando la sonda de ADN S. pneumomae de 782-bp marcada. Los plásmidos extraídos fueron digeridos con varias enzimas de restricción para evaluar el tamaño de los insertos y para verificar la presencia del gen hsp70 a través de hibridación Southern utilizando la sonda de ADN S pneumoniae de 782-bp marcada El plásmido pURV5 contiene un inserto Hindlll de 4 2-kb del ADN genómico de S agalactiae El plásmido pURV4 contiene un fragmento de Hindlll de 3 5 -kb de ADN genómico de S pyogenes 4 Choque Térmico y Marcación de Proteína La respuesta de tensión de S agalactiae a un choque térmico se analizó a través de marcación con pulso con [3^S] metionina como se describe anteriormente en el Ejemplo 1 Las bacterias S agalactiae desarrolladas durante la noche en SMAM (Medio de ensayo de Metionina suplumentado con 1 mg/l de metionina 1% (v/v) de Isolvitalex y 1 mg/l de cloruro de colma) se hicieron en pellas a través de centrifugación y después se volvieron a suspender en un medio de SMAM libre de metionina Las bacterias fueron incubadas a 37°C durante 1 hora y después se dividieron en dos fracciones de volumen igual Las muestras fueron ya sea incubadas a 37 o 43°C durante 10 minutos y después se marcaron con 100 µCi/ml [3^S] metionina durante 30 minutos a 37°C Las bacteria fueron extensamente lavadas con PBS y los extractos de célula fueron preparados a través del tratamiento con mutanolisma y hsozíma como se describe para el aislamiento de ADN (M Jayarao et al , supra) seguido por la aplicación de sonido Caracterización Inmunológica Una sene de seis anticuerpos monoclonales surgidos de la proteína HSP72rec (F3-Pn3 5 a F3-Pn3 10) y los anticuerpos monoclonales F1-Pn3 1, F2-Pn32, F2-Pn3 3, F2-Pn3 4 fueron probados para su reactividad a antigenos HSP70 de S pyogsnss y S __agalact?as a través de análisis de tinción Western Los lisatos de célula de S pyogenes y _S agalactias fueron obtenidos del tratamiento con el tratamiento con mutalonizina y lisozíma (M Jayarao et al , supra) , se aplico sonido e hirvieron en un regulador de pH de muestra SDS-PAGE Los lisatos de célula de E coh transformados con pURV4 o pURVd que produjeron antigenos HSP70 S pyogenes truncado fueron probados después de la ebullición en un regulador de pH de muestra de SDS-PAGE B Análisis de secuencia de ADN de hsp70/genes adnk de Streptococcus pyogenes, Streptococcus agalactiae y Streptococcus pneumomae Una región de 2438 bases en el inserto de Hindlll 4 2-kb del plásmido pURV5 fue secuenciada Esta secuencia contiene un marco de lectura abierto de (ORF) de 1830 nucleotidos codificando para un polipéptido de 609 aminoácidos con un peso molecular de 64907 (ver SEC DE IDENT NO 7) El ORF tiene un codon de inicio 5 ATG empezando en la posición 248 y un codon de tope TAA finalizando en la posición 2077 El codon de inicio ATG es precedido por la secuencia GAGG, empezando en la posición 237, la cual es complementaria a ARNr 16S y sirve como un sitio de unión de ribosoma en E co [G D Stormo et al , Nucleic Acids Res 10 pp 2971-2996 (1982)] El ORF y el pohpeptido del HSP70 de S agalactiae son, respectivamente idénticos en un 85 y 95% al ORF del polipeptido del HSP72 de S pneumomae Las comparaciones de secuencia preliminalres con el HSP72 de S pneumomae mostraron que el inserto de Hindlll de 3 5-kb en el plasmido pURV4 carecen de la región de codificación de extremo 3' y el hsp70 de S pyogenes Un intento para clonar un fragmento genómico Salí de 3 5-kb conteniendo la región de codificación completa de hsp70 de S pyogenes produjo el plasmido pURV6 conteniendo un inserto de 3 1 -kb carente de la región de 0 extremo 5' del gen El ensamble de las regiones del hsp70 presentes en los plasmidos pURV4 y pURV6 dio una región de 2183 nucleotidos conteniendo un ORF de 1824 bases codificando para un polipeptido de 608 aminoácidos con un peso molecular de 64847 (ver SEC DE IDENT NO 20) El codon de inicio de ATG empieza en la 5 posición 204 y el codon de tope TAA se extiende a la posición 2030 Símilarmente al hsp70 de S agactiae, el codón de inicio ATG es precedido por una secuencia de sitio de unión de ribosoma putativa GAGG empezando en la posición 193 [G D Stormo, supra) El ORF del pohpéptido deducido del hsp70 de S pyogenes son, respectivamente, idénticos en un 85 y 94% al ORF y pohpeptido de HSP72 de S pneumomae El ORF del plásmido pURV4 carece de 125 pares de base que codifican para 41 aminoácidos en el extremo carboxilo de HSP70 de S pyogenes, el ORF de esta manera codifica para los 567 aminoácidos del extremo de aminoácido de aquel HSP70 (N-567rec) El ORF del plasmido pURV6 carece de 114 pares de base que codifican para 38 aminoácidos en el extremo amino del HSP70 de S pyogenes, el ORF de esta manera codifica para los 570 aminoácidos del extremo carboxilo de HSP70 (C-570rec) La comparación global de los marcos de lectura abiertos de ADN (Figura 24) y las secuencias de aminoácido (Figura 25) del HSP70/adnK S pyogenes, S agalactiae, y S pneumomae dieron porcentajes de identidad de 82 y 93 %, respectivamente C Síntesis incrementada de HSP70 a través de S agalactiae en una respuesta al calor Un análisis electroforetico en gel de SDS-poliacplamida dimensional del extracto de célula de S agalactiae con choque térmico y de control marcado en impulso con [^s] metioanina revelaron que la síntesis de una protema de 70 kDa se incremento significativamente después de una tensión térmica (Figura 26 carriles 1 y 2) El análisis de radioinmunoprecipitacion revelo que la proteína de 70 kDa inducible con calor fue fácilmente detectada a 43°C utilizando F2-Pn3.4 de anticuerpo monoclonal, indicando así que la proteína pertenece a la familia de la proteína de choque térmico 70 (hsp70/adnK), (Figura 26 carriles 3 y 4). D. Relaciones Antigénicas de Proteínas HSP70 en S pneumoniae, _S. pyogenes y S. agalactiae En este estudio, un panel de Mabs se utiliza para investigar la relación antigénica de proteínas HSP70 de S. pyogenes, S. agalactiae y S. pneumoniae. Ocho de diez MAbs reaccionaron con las tres especies de Streptococcus indicando así que algunos epítopes de célula B fueron ampliamente distribuidos entre S pneumomae, S pyogenes y S agalactiae La MAbs F1-Pn3.1 la cual esta dirigida contra un epítope ubicado entre los residuos de aminoácidos 584 y 607 de HSP72 de S pneumoniae, no reaccionó con antígenos HSP70 ni de S. pyogenes o S agalactiae La comparación de está región entre las tres especies de Streptococcus reveló diferencias en 5 a 8 aminoácidos ubicados entre los aminoácidos 589 y 596 La MAbs F2-Pn3 3, la cual también se dirigió contra epítopes presentes en la región C-151 fue reactiva con S. agalactiae pero no con S pyogenes Estos datos claramente indican que las proteínas HSP70 de especies de Streptococcus están estructural e inmonológicamente relacionadas Sin embargo existe una distinción inmunológica El análisis de la reactividad de MAbs F3-Pn3 5, F3-Pn3 6 F3-Pn3 7 y F3-Pn3 10 con antígenos HSP70 de S pyogenes recombinantes truncados permitió la identificación de una región antigénica cerca del extremo amino-terminal en HSP72 de S. pneumoniae. Estos MAbs reaccionaron con construcciones expresando los residuos de 567 aminoácidos N-terminales pero fallaron para reaccionar con construcciones expresando el fragmento C-570. Estos datos localizaron los epítopes reconocidos por MAbs F3-Pn3.5, F3-Pn3.6, F3-Pn3.7 y F3-Pn3.10 entre los residuos 1 y 38 de la proteína HSP72.

EJEMPLO 10 - Uso de HSP70/HSP72 Como una Vacuna para Seres Humanos Para formular una vacuna para uso humano, se pueden seleccionar antígenos HSP72 apropiados a partir de los polipéptidos descritos en la presente. Por ejemplo, un experto en la técnica puede diseñar una vacuna con respecto al polipéptido HSP70/HSP72 o fragmentos del mismo conteniendo un epítope inmunogénico El uso de las técnicas de biología molecular es particularmente bien adecuado para la preparación de antígenos recombmantes substancialmente puros. La composición de vacuna puede tener una variedad de formas. Estas incluyen formas de dosis sólidas, semí sólidas y liquidas tales como polvos, soluciones liquidas o suspensiones y liposomas Basándose en la creencia de que los antígenos HSP70/HSP72 de está invención pueden producir una respuesta inmunoprotectora cuando se administran a un ser humano, las composiciones de está invención serán similares a aquellas utilizadas para inmunizar seres humanos con otras proteínas y polipéptidos, por ejemplo, tétanos y difteria Por lo tanto, las composiciones de está invención preferiblemente comprenderán un auxiliar farmacéuticamente aceptable tal como auxiliar de Fraund incompleto, Hidróxido de aluminio, péptido de muramilo, una emulsión de agua en aceite, un liposoma, un ISCOM o CTB, o una sub-unidad B no tóxica de toxina de cólera Muy preferiblemente las composiciones incluirán una emulsión de agua en aceite o hidroxido de aluminio como auxiliar La composición puede ser administrada al paciente en cualquier número de formas farmacéuticamente aceptables, incluyendo intramuscular, entradérmica, subcutánea o tópica Prefepblente, la vacuna será administrada intramuscularmente Generalmente la dosis consistirá de una inyección inicial, muy probablemente con auxiliar de aproximadamente 001 a 10 mg y muy preferiblemente de 0 1 a 1 0 mg del antigeno HSP72 por paciente, muy probablemente por una o más inyecciones de refuerzo Preferiblemente los refuerzos serán administrados aproximadamente de 1 y 6 meses después de la inyección inicial Una consideración importante con relación al desarrollo de la vacuna neumococal es la cuestión de la inmunidad mucosal La vacuna mucosal ideal será seguramente tomada en forma oral o intranasalmente como una o algunas dosis y podra producir anticuerpos protectores en las superficies apropiadas junto con inmunidad sistemática. La composición de vacuna mucosal puede incluir auxiliares, vehículos en partícula inertes o vectores vivos recombinantes. Los anticuerpos ant?-HSP72 de está invención son útiles para la inmunoterapia pasiva y la inmunoprofilaxis de seres humanos infectados con S. pneumoniae, S. pyogenes, S agalactias o bacterias relacionadas Las formas y regímenes de dosis para tal inmunización pasiva serán similares a aquellas de otras inmunoterapias pasivas Un anticuerpo de acuerdo con está invención es ilustrado a través de un híbpdoma que produce MAbs F1-Pn3 1 depositado en American Type Culture Collection in Rockville, Marylan, USA el 21 de julio de 1995 e identificado como línea de célula de hibpdoma de mupno, F1-Pn3 1 Este depósito se le asignó el número de acceso HB 11960 Ya que se ha descrito en la presente un numero de modalidades de está invención, es evidente que las modalidades básicas pueden ser alteradas para proveer otras modalidades que utilizan las composiciones y procedimientos de está invención Por lo tanto, se apreciará que el alcance de está invención incluye todas las modalidades alternativas y variaciones que son definidas en la especificación anterior y a través de la revindicaciones anexas y la invención no esta limitada por las modalidades especificas las cuales han sido presentadas en la presente a manera de ejemplo LISTA DE SECUENCIAS (1) INFORMACIÓN GENERAL: (i) SOLICITANTE: Ha el, Josee Brodeur , Bernard R Martin,Denis Rioux , Clement (ii) TITULO DE LA INVENCIÓN: (iii) NUMERO DE SECUENCIAS: 26 (iv) DIRIGIR LA CORRESPONDENCIA: (A) DESTINATARIO: Goudreau Gage Dubue & Martineau Wal er (B) CALLE: 800 Place Victoria, Suite 3400, Stock Exchange To er (C) CIUDAD: Montreal (D) ESTADO: Quebec (E) PAÍS: CANADÁ (F) C.P: H4Z1E9 (v) FORMA DE LECTURA EN LA COMPUTADORA: (A) TIPO DE MEDIO: disco blando (B) COMPUTADORA: compatible con una PC IBM (C) SISTEMA DE OPERACIÓN: PC-DOS/MS-DOS (D) SOFTWARE: Patentln Reléase #1.0, Versión #1.25 (vi) DATOS DE LA SOLICITUD ACTUAL: (A) NUMERO DE SOLICITUD: (B) FECHA DE PRESENTACIÓN: (C) CLASIFICACIÓN: (vii) FECHA DE LA SOLICITUD ANTERIOR: (A) NUMERO DE SOLICITUD: US 08/472,534 (B) FECHA DE PRESENTACIÓN: 07- JUNIO-1995 (vii) FECHA DE LA SOLICITUD ANTERIOR: (A) NUMERO DE SOLICITUD: US (PROVISIONAL) 60/001.805 (B) FECHA DE PRESENTACIÓN: 04 -AGOSTO-1995 (viii) INFORMACIÓN DEL APODERADO/AGENTE: (A) NOMBRE: Leclerc/Dubuc/Prince, Alain/Jean/Gaetan (C) EXPEDIENTE DEL APODERADO NO.: BIOVAC2-PCT (ix) INFORMACIÓN DE LA TELECOMUNICACIÓN: (A) TELEFONO: (514) 397-7400 (B) TELEFAX: (514) 397-4382 (2) INFORMACIÓN PARA LA SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NO: 1: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 3167 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) HEBRA :doble (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA:ADN (genómico) (iii) HIPOTÉTICA: NO (iv) ANTI- SENTIDO: NO (vi) FUENTE ORIGINAL: (A) ORGANISMO: Streptococcus pneumoniae (ix) CARACTERÍSTICA: (A) CLAVE/ NOMBRE: CDS (B) UBICACIÓN: 30..755 (ix) CARACTERÍSTICA: (A) CLAVE/ NOMBRE:CDS (B) UBICACIÓN: 771..2912 (D)OTRA INFORMACIÓN: /producto=*Fucl/HSP72 (C-169* (xi) DESCRIPCIÓN LA SECUENCIA: SEC. DE IDENT: NO: 1: GAACTTCATT TTTAGA??GG AGTGAGTTT ATG TCT CAA GAT GAA AAA TT? ATT 53 Mßt Ser Gln Asp Glu Lys Leu lie 1 5 CGT GAA CAG ATT TOT GAT GTT TGT CAT A?G ATG TGG CA? CTT GGT TGG 101 Arg Glu Gln lie Cys Asp Val Cya His Lys Met Trp Gin Leu Gly Trp 10 15 20 GTT GCT GCT AAC GAT GGG AAT GTA TCT GTT CG? TTA GAT G?G GAT ACC 149 Val ?la ?la ?sn Asp Gly Asn Val Ser Val ?rg Leu Asp Glu Asp Thr 25 30 35 40 ATT CTT GC? AC? CCT ?CT GGT ?TC AGC ?AA AGT TTT ATT ACÁ CCA GAA 197 lie Leu Ala "Hir Pro Thr Gly He Ser Lys Ser Phe lia Thr Pro Glu 45 50 55 A?G CTG GTG AAG TTA ??T CTT ?? GG? G?G ATT TTA GA? GC? GAA GGT 245 Lys Leu Val Lys Leu Asn Leu Lys Gly Glu He Leu Glu Ala Glu Gly 60 65 70 G?T TAC TGT CCT TCT AGT G?? ?TT AAA ?TG C?C ATT CGG TGC TAC GA? 293 ?sp Tyr Cys Pro Ser Ser Glu lie Lys Mßt His I • ?rg Cys Tyr Glu 75 80 85 GAA CGT G?G GAT GTT CGT TC? GTT GTT CAC GCG C?T CC? CCG ?TT GCA 341 Glu Arg Glu Asp Val Arg Ser Val Val His Ala Kis Pro Pro He Ala 90 95 100 ACÁ GGA TTT GCT CTT GCA CAC ATT CCT TTA GAT ACT TAT TCA CTA ATT 38? Thr Gly Phe Ala Leu Ala His He Pro Leu Asp Oir Tyr Ser Leu He 105 110 115 120 GAG AGC GCG ATT GTG GTT GGG GCA ATT CCT ATT ACC CCA TTT GGA GTA 437 Glu Ser Ala He Val Val Gly Ala He Pro He Thr Pro Phe Gly Val 125 130 13S CCG TCT ACÁ ATG GAA GTG CCA G?? GC? ATT AC? CCT TAT CTG CCC G?T 485 Pro Ser Thr Met Glu Val Pro Glu ?la He Thr Pro Tyr Leu Pro Asp 140 145 150 CAT GAT GTC ATG CTA TTA GAA AAT CAT GGA GCT CTG ACT GTC GGA AGC 533 His Asp Val Met Leu Leu Glu Asn His Gly Ala Leu Thz Val Gly Ser 155 160 165 G?T GTC ATT ?C? GC? T?C T?C CGT ?TG G?? ?CT TTA G?? TT? CTC GC? 581 ?sp Val llß Ttir ?la "IVr Tyr ?rg Met Glu Thr Leu Glu Leu Val ?la 170 175 180 A?G C? ?CC TTC C?C GG? ?G? ?TG TT? CTT TCT ?C? A?G GGC ?TT G?G 629 Lya Hir T?ir Phß Bis Gly ?rg Mßt Leu Leu Ser Tbr Lys Gly He Glu 185 190 1Í5 200 G?G C?? G?? ?TT GCT CGT CCG ACT TTA GAA CGT CTA TTC TC? ATG CGA 677 Glu Gln Glu He Ala Arg Pro Ihr Leu Glu Arg Leu Phe Ser Mßt Arg 205 210 215 GA? ??T TAT A?G GTT ?CA GGT CGT CAC CCA GGC TAC CGT A?? TAT ??T 725 Glu ?sn Tyr Lys Val Thr Gly Arg His Pro Gly Tyr Arg Lys Tyr Asn 220 225 230 GGC GAT GGT AGT ATA AAA GAA ACÁ AAA AAA TA?G?GG??A GTATT ATG ATC 776 Gly Asp Gly Ser He Lys Glu T?ir Lys Lys Mee He 235 240 1 CAA CAT CCA CGT ATT GGG ATT CGT CCG ACT ATT GAT GGT CGT CGT CAA 824 Gln His Pro Arg He Gly He Arg Pro ? r He st> Gly Ara ?rg Gln 5 10 15 GGT GTA CGC G?? TCA CTT GAA GT? CA? ACÁ ?TG ??C ?TG GCT AAA AGT T72 Gly Val ?rg Glu Ser Leu Glu Val Gln Thr Mßt Asn Mßt Ala Lys Ser 20 25 30 GTG GCA GAT TTG ATT TCA AGC ACÁ TTG AA TAT CCA GAT GGG G?? CCT 920 Val ?la Asp Leu Xle Seit: Ser Tixr Leu Lys Tyr Pro Asp Gly siu Pro 35 40 45 50 GTG GAA TGT GTG ATT TCT CCA TCT ACC ATT GGT CGT GTT CCA GAG GCT 968 Val Glu ys Val II* Ser Pro S»t «rhr He Gly Arg Val Pro Glu Ala 55 ßO 65 GCA GCT TCC CAT GAG TTG TTT AAA AAA TCA AAT GTT TGC GCA ACÁ ATT 1016 Ala Ala Ser His Glu Leu Pite Lys Lys Sex Asn Val Cys Ala Ttvr Ilß 70 7S 80 ACÁ GTT ACÁ CCA TGC TGG TCT TAT GGT AGT GAA ACT ATO GAT ATG TCT 1064 Ttir Val Thr Pro Cys Trp Cys Tyr Gly Ser Glu Thr Met Asp Met Ser 85 90 95 CCA GAT ATT CCT CAT GCT ATT TGG GGA TTT AAT GGG ACÁ GAA CGC CCA 1112 Pro Asp He Pro His Ala Xle Trp Gly Phß Asn Gly Tíir Glu Arg Pro 100 105 110 GGA OCT GTC TAT CTT GCA GCT GTA CTA GCT TCA C?T ?CT CA? 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GAG TTC GA? 1448 Phß Oir Arg Arg Met Asp Arg Gly Xlß Tyr Asp Pro Glu Glu Ph* Glu 215 220 225 CGT GCG CTC AAA TQG GTG AAA GAA AAC GTA AAA OAA GGA TTC GAC CAT 1496 Arg Ala Leu Lys Trp Val Lys Glu Asn Val Lys Glu Gly Phe ?sp His 230 235 240 AAC CGT GAA GAC CTT GTT TTA AGC CGT GAA OAA ??A GAT AGA CAA TGG 1544 Asn Arg Glu Asp Leu Val Leu Ser Arg Glu Glu Lys ?sp Arg Gln Trp 245 250 2SS GA? TTT GTT ATT AAG ATG TTC ATG ATT GGA CGT GAC TTA ATG GTT GGT 1592 Glu Phe Val lie Lys Met Phe Met He Gly Arg Asp Leu Met Val Gly 260 265 270 AAC CCA AGA CTT GCT GAA CTT GGT TTT GAG GAA GAA GCA GTT GGT CAC 1640 Asn Pro Arg Leu Ala Glu Leu Gly Phe Glu Glu Glu Ala Val Gly His 275 2B0 2T5 290 CAT GCT TTA GTA GCT GGT TTC CAA GGT CAA CGT CAG TGG ACÁ GAC CAT 1688 His Ala Leu Val Ala Gly Ph* Gln Gly Gln ?rg Gln Trp Thr Asp His 295 300 305 TTT CCA A?T GGG GAC TTT ATG GAA ACT TTC CTC AAT ACT CAG TTT GAC 1736 Phe Pro Asn Gly Asp Phe Met Glu Thr Phe Leu ?sn Thr Gln Phe Asp 310 315 320 TGG AAT GGT ATT CGA AAA CCA TTT GTA TTT GCG ?C? GAG AAT GAT TCA ~ 1784 Trp Asn Gly He Arg Lys Pro Phe Val Phe Ala Thr Glu Asn Asp Ser 325 330 335 CTA AAT GGT GTG TCT ATG CTC TTT AAT TAT CTA TTA ACÁ AAT ACT CCA 1832 Leu Asn Gly Val Ser Met Leu Phß Aßn Tyr Leu Leu Thr Asn Thr Pro 340 345 350 CAA ATC TTT GCT GAT GTG CGT ACT TAT TGG AGT CCA GAG GCT GTT GAA 1880 Gln lie Phe Ala Asp Val Arg Thr Tyr Tm Ser Pro Glu Ala Val Glu 355 360 365 370 CGT GTA ACÁ GGA TAT ACT TTA GAG GGT CGT GCT GCA GCT GGA TTC TTA 1928 Arg Val Thr Gly Tyr Thr Leu Glu Gly Axg Ala ?la Ala Gly Ph* Leu 375 380 385 CAT CTA ATC AAC TCT GGA TCT TGT ACÁ TTG GAT GGT AC OGT CAA GCT 1976 His Leu lie Asn Ser Gly Ser Cys Thr Leu Asp Gly Thr Gly Gln Ala 390 395 400 ACT CGA GAT GGC AAA CCT GTT ATG AAA CCA TTC TGG GAG TTG GAT GA? 2024 Thr Arg Asp Gly Lys Pro Val Met Lys Pro Ph* Txp Glu Leu Asp Glu 405 410 415 AGT GAA GTA CAG GCT ATG CTT GAA AAT ACÁ GAC TTC CCA CCA GCA AAC 2072 Ser Glu Val Gln Ala Met Leu Glu Asn Thr Asp Phe Pro Pro Ala Asn 420 425 430 CGC GAA TAC TTC CGT GGA GGA GGA TTC TC? ACT CGT TTC TTG ACG AAG 2120 Arg Glu Tyr Phe Arg Gly Gly Gly Phe Ser Thr Arg Phe Leu Thr Lys 435 440 445 450 GGG GAT ATG CCA GTA ACÁ ATG GTA CGT CTC AAT CTT TTA AAA GGG GTT 2168 Gly Asp Met Pro Val Thr Met Val Arg Leu Asn L«u L*u Lys Gly Val 455 460 465 GGT CCA GTG CTA CAA ATT GCA GA? GGT TAC ACÁ CTT GAA CTT CCT GAA 2216 Gly Pro Val Leu Gln He Ala Glu Gly Tyr Thr "Leu Glu Leu Pro Glu 470 475 480 GAT GTT C?C CAT ACT TTA GAT AAT CGT ACÁ GAT CCA GOA TGG CCA ACT 2264 Aßp Val Hiß Ris Thr Leu Asp Asn Arg ??r ?sp Pro Gly Trp Pro Thr 485 490 495 ACT TGG TTT GCT CCA CGT TTG ACÁ GGA AAA GGT GCT TTC AAG TCT GTC 2312 Thr Trp Phe Ala Pro Arg Leu Thx Gly Lys Gly Ala Phe Lys Ser Val 500 505 510 TAT GAC GTC ATG AAT AAT TGG GGA GCT AAT CAC GGA GCC ATA ACÁ TAT 2360 Tyr Asp Val Met Asn Asn Trp Gly Ala Aßn Kis Gly Ala lie Thr Tyr 515 520 525 530 GG? C?C ?TT GG? GC? G?C TTG ?TT ?CC TTG GCT TCT ?TG TTG ?GA ?TT 240B Gly His He Gly Ala ?sp Leu He Thr Leu Ala Ser Met Leu ?rg He S3S 540 545 CCT CAA ATC GAA GTA AC? TTT G?C ?TC G?C ??G ??C GGT ?TC GTG TCT 2456 Pro Gln He Glu Val Thr Phe ?sp He ?sp Lys ?sn Gly lie Val Ser SSO 555 560 GTT ??G GCC A?? G?C CTT GGA ?CT C?? ??? GAA CA? ?CT ?TT GTC ?TC 2504 Val Lys ?la Lys ?sp Leu Gly Thr Gln. Lys Glu sln Thr lie Val He S65 570 575 CAA TCG A?C TC? GGT TTG ?CT G?C G?? G?? ATC G?C CGC ?TG ?TG ??? 2552 Gln Ser ?sn Ser Gly Leu Thr Asp Glu Glu He ?sp ?rg Mßt Mßt Lys 580 585 590 G?T GC? GAA GCA AAC GCT GA? TCC G?T A?G ??? CGT ??? G?? GAA GTA 2600 Asp ?la Glu ?la Asn Ala Glu Ser Asp Lys Lys Arg Lys Glu Glu Val 595 600 605 610 GAC CTT CGT AAT GAA GTG GAC CAA GC? ?TC TTT GCG ?CT G?? ??G ?CA 2648 Asp Leu Arg Asn Glu Val Asp Gln Ala He Phe Ala Thr Glu Lys Thr 615 620 625 ATC AAG GAA ACT GAA GGT AAA GGC TTC GAC GC? G?? CGT G?C GCT GCC . 2696 He Lys Glu Thr Glu Gly Lys Gly Phe Asp Ala Glu ?rg ?sp ?la ?la 630 635 640 CAA GCT GCC CTT GAT GAC CTT A?G ??? GCT C?? OA? G?C ??C ??C TTG 2744 Gln ?la ?la Leu ?sp Asp Leu Lys Lys Ala Gin Glu ?sp ?sn ?sn Leu 645 650 655 G?C GAC ATG ??? GC? ??? CTT G?? GC? TTG ??C G?? ??? GCT C?? GG? 2792 Asp ?sp Met Lys ?la Lys Leu Glu ?la Leu ?sn Glu Lys ?la Gln Gly 660 665 670 CTT GCT GTT AAA CTC TAC GAA CAA GCC GCA GC? GCG C?? C?? GCT CA? 2840 Leu Ala Val Lys Leu Tyr Glu Gln ?la ?la Ala Ala Gln Gln Ala Gln 675 680 685 690 GAA GGA GCA GAA GGC GCA CAA GCA ACÁ GGA AAC GC? GGC GAT G?C GTC 2888 Glu Gly ?la Glu Gly Ala Gln Ala Thr Gly Asn ?la Gly ?sp Asp Val 695 700 705 GT? GAC GGA GAG TTT ACG GA? AAG T??G?TG?GT GT?TTGGATG ??GAGT?TCT 2942 Val ?sp Gly Glu Phe Thr Glu Lys 710 AAAAAATAC? CGAAAAGTTT ATAATG?TTT TTGTA?TC?? GCTa?T??CT ?T?G??C?TC 3 002 A??AGATTTT ATTGATAATA TTCCAATAGA ATATTT?GCT AGATATAGAG ?AATTATATT 3 062 AGCTGAGCAT GAT?GTTGTG TC?????TG? TGA?GCGGT? ?GG??TTTTG TT?CCTC?GT 3 122 ATTGTTGTCT GCATTTGTAT CGGCGATGGT ATCAGCT?TG AT?TC 3167 (2) INFORMACIÓN PARA LA SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NO: 2 (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 242 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: rotéina (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. DE IDENT NO.2 Ket Ser Gln ?sp Glu Lys Leu Xle ?rg Glu Gln lie Cy-s ?sp Val Cys 1 5 10 15 Hls Lys Met Trp sln Leu Gly Trp Val ?la Ala ?sn Asp Gly A=n Val 20 25 30 Ser Val ?rg Leu ?sp Glu Asp Thr He Leu ?la Thr Pro Thr Gly He 35 40 45 Ser Lys Ser Phe He Thr Pro Glu Lys Leu Val Lys Leu ?sn Leu Lys 50 SS 60 Gly Glu He Leu Glu ?la Glu Gly ?sp Tyr Cys Pro Ser Ser Glu He 65 70 75 80 Lys Het His He ?rg Cyß Tyr Glu Glu ?rg Glu ?sp Val ?rg Ser Val 85 90 95 Val His Ala His Pro Pro He ?la Thr Gly Phe Ala Leu ?la His II* 100 105 110 Pro Leu ?sp Hi Tyr S«t Leu He Glu Ser Ala He Val Val Gly ?la 115 120 125 He Pro He Thx Pro Phe Gly Val Pro Ser Thr Met Glu Val Pro Glu 130 135 140 Ala He Thr Pro Tyr Leu Pro ?sp His Asp Val Met Leu Leu Glu Asn 145 1S0 1SS 160 His Gly Ala Leu Thr Val Gly Ser ?sp Val He Thr Ala Tyr yr Arg 165 170 175 Mßt Glu Thr Leu Glu Leu Val Ala Lys Hir Thr Phe His Gly Arg Mßt 180 165 190 Leu Leu Ser Thr Lys Gly He Glu Glu Gln Glu He ?la ?rg Pro Thr 1S5 200 20S Leu Glu ?rg Leu Phß Ser Met ?rg Glu ?sn Tyr Lys Val Thr Gly ?rg 210 21S 220 His Pro Gly r Arg Lys Tyr Asn Gly Asp Gly Ser He Lys Glu Oir 225 230 235 240 Lys Lys (2) INFORMACIÓN PARA LA SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NO: 3 (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 714 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: roteína (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. DE IDENT NO.3 Met He Cln Hiß Pro ?rg He Gly He ?rg Pro Thr He ?sp Gly ?rg 1 S 10 15 ?rg sln Gly Val ?rg Glu Ser Leu Glu Val Gln Thr Met ?sn Met ?la 20 25 30 Lys Ser Val ?la ?sp Leu lie Ser Ser Thr Leu Lys Tyr Pro ?sp Gly 35 40 45 Glu Pro Val Glu Cys Val He Ser Pro Ser Ttir He Gly ?rg Val Pro 50 55 60 Glu Ale Ala. Ala Ser His Glu Leu Phe Lys L.ys Ser As Val Cys ?la 6S 70 7S 80 Thr lie Thr Val Thr- Pro Cys Trp cys TTyr Gly Ser Glu ?hr Met Asp 85 90 95 Met Ser Pro Aßp lie Pro His Ala lie Trp Gly Ph* Asn Gly Thr Glu 100 IOS l*Lß Arg Pro Gly ?la Val Tyr Le Ala Ala Val Leu Ala. Ser Kis Thr* Gln 115 120 125 Lys Gly lie Pro Ala Phe Gly II* Tyr Gly Arg Asp Vail Gln Glu ?la 130 135 140 Asn Asp Thr Ala lie Pro Glu Asp> Val Lys Glu Lys Leu Leu Arg TVr 145 ISO 1SS 1G0 Ala ?rg Ala Val Leu Ala Thr Gly Leu Met Arg Asp Tlir Ala Tyr Leu 165 170 175 Ser Met Gly Ser Val Ser Met Gly lie Gly Gly Ser lie Val Asm Pro 180 185 190 Asp Phe Phe Gln Glu Tyr Leu Gly Met Aro* Asn Glu Ser Val Asp Met 195 2O0 205 Thr Glu Phe Thr Ara Arg Met Asp Arg Gly lie Tyr ?sp Pro Glu Glu 210 215 220 Phe Glu Argr ?la Leu Lys Trp Val. Lys Glu Aßn Val Lys Glu Gly Phe 225 230 235 240 ?sp His Asn Arg Glu ?sp Leu Val Leu Sar Arg Glu Glu Lys Asp Arg 245 250 255 G n Trp Glu Phe Val lie Lys Mßt Phe Met He Gly Ajrg Asp Leu Met 260 265 270 Val Gly Asn Pro Are; Leu Ala Glu Leu Gly Fhe Glu Glu Glu Ala Val 275 2BO 285 Gly Hls Hls Ala Leu Val Ala Gly Phe Gln Gly G n Arg G n Trp Thr 290 295 300 Asp His Phe Pro Asn Gly Asp Phe Met Glu Ttvr Phe Leu Asn T* r Gln 305 310 315 320 Phe Asp Trp Asn Gly He Arg Lys Pro Phe VaJL Phe Ala Ttir Glu Asn 325 330 335 Asp Ser Leu Asn Gly Val Ser Mee Leu Phe Asn Tyr Leu Leu Ttir Asn 340 345 350 Thr Pro Gln lie Phe Ala Asp Val Arg Hi Tytc Trp Ser Pro Glu Ala 3S5 360 365 Val Glu Arg Val Thr Gly Tyr Thr Leu Glu Gly Arg Ale. Ala Ala ßly 370 375 3ßO Phe Leu His Leu llß Asn Ser Gly ser Cys Ttur Leu Asp Gly Thr Gly 385 390 395 400 Gln AJ.ß Ttir Arg Asp Gly Lys Pro Val Met Lys Pro Phe Trp Glu Leu 405 410 415 Asp Glu Ser Glu Val Gln ?la Met Liu Glu ?sn I r Ksjp Phe Pro Pro 420 425 430 ?la ?sn ?rg Glu Tyr Phe ?rg Gly Gly Gly Phß Ser Thr ?rg Phe Leu 435 440 445 Thr Lys Gly ?sp Met Pro Val Thr Met Val ?rg Leu ?sn Leu Leu Lys 450 455 460 Gly Val Gly Pro Val Leu Gln He ?la Glu Gly TVr Thr Leu Glu Leu 465 470 475 480 Pro Glu ?sp Val His His -I r Leu ?sp ?sn ?rg Ttir ?sp Pro Gly Trp 485 490 495 Pro Thr Thr Trp Phe ?la Pro ?rg Leu Oir Gly Lys Gly ?la Phe Lys 500 505 510 Ser Val Tyr ?sp Val Met ?sn ?sn Trp Gly ?la ?sn His Gly ?la He 515 520 S25 Thr Tyr Gly His He Gly ?la ?sp Leu He Thr Leu ?la Ser Met Leu 530 S3S 540 Arg He Pro Gln He Glu Val Thr Phe ?sp He ?sp Lys ?sn Gly He 545 550 55S 560 Val Ser Val Lys ?la Lys ?sp Leu Gly Thr Gln Lys Glu Gln Thr He 565 570 575 Val He Gln Ser ?sn Ser Gly Leu Thr Asp Glu Glu He Asp Arg Met S80 585 590 Met Lys ?sp ?la Glu ?la ?sn ?la Glu Ser ?sp Lys Lys ?rg Lys Glu 595 600 605 Glu Val ?sp Leu ?rg ?sn Glu Val ?sp Gln ?la He Phe ?la Thr Glu 610 615 620 Lys Thr He Lys Glu Thr Glu Gly Lys Gly Phe ?sp Ala Glu ?rg ?sp 625 630 635 640 ?la Ala Gln ?la ?la Leu ?sp ?sp Leu Lys Lys ?la Gln Glu ?sp ?sn 645 650 655 Asn Leu Asp ?sp Met Lys ?la Lys Leu Glu ?la Leu ?sn Glu Lys ?la 660 665 670 Gln Gly Leu ?la Val Lys Leu Tyr Glu Gln ?la ?la ?la ?la Gln Gln 675 680 685 Ala Gln Glu Gly ?la Glu Gly ?la Gln ?la Thr Gly Asn Ala Gly Aßp 690 695 700 Asp Val Val ?sp Gly Glu Phe Thr Glu Lys 705 710 (2) INFORMACIÓN PARA LA SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NO: 4: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 4320 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) HEBRA: doble (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA:ADN (genómico) (iii) HIPOTÉTICO: NO (iv) ANTI - SENTIDO: NO (vi) FUENTE ORIGINAL: (A) ORGANISMOS: streptococcus pneumoniae (ix) CARACTERÍSTICAS: (A) CLAVE/ NOMBRE: CDS (B) UBICACIÓN: 682...2502 (D) OTRA INFORMACIÓN: productos= **Heat-shoc protein 72** (ix) CARACTERÍSTICAS: (A) CLAVE/ NOMBRE: CDS (B) UBICACIÓN: 3265..4320 (D) OTRA INFORMACIÓN: productos= **NH2 -terminal portion of DNA J** (ix) CARACTERÍSTICAS: (A) CLAVE/ NOMBRE: éptido-maduro (B) UBICACIÓN: 682..2502 (xi ) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA : SEC . DE IDENT O . 4 AAGCTTGATT CACGCTTTG? AAGAAG??GG ??TTG??G?? ?TCGCAGC?G ?TGGCG?ATT 60 TGACCATAAC TACCAT?TCG CCATCCAAAC TCTCCC?GC? G?CGATG??C ACCCAGT?G? 120 TACCATCGCC C??GTCTTTC ?????GGCTA C???CTCC?T G?CCGC?TCC T?CGCCCAGC 180 ??TGGTAGTG GT3TATAACT A?G?T?C??? GCCCGTAAA? ?GCTCGCAGT ?????T?GGA 240 GATTGACGA? GTGTTCGATG A?CAC?AGA? A?TCT?TCTT TTITACTCAG AGCTTAGGGC 300 GTsTTCGATT CGGC?ATTCT GACGGTAGCT A?AGCAACTC GTCAGAAAAC GGCAGTCGCT 360 ?TGGOGTTTG TCTAGCTTCC TT?CT??CTC GTCGTCGAA? TA???TCG?T TTCG?CTCTT 420 sGTGTCGC?? TTT?C?T??T ?GAAA?CTTG TCCGA??CG? CAATA?ACTA TG??G???G? 480 T A?AT?TGT TTGGCTTTGT A?T?GTG?GC G??GCG??CC A??G?CGAT? CTCTTCGCTG 540 TGGCGCTATT TGCGCAAATT TTGAG?CCTT ?GGCTC???G TTTAGTCAAA GAGATTG?CA 600 AAGTC?AGCT CTGACGGCGT CGCC?CTTAA GA?G?GT?TC ?????G?AA? ?TAGAAAATT 660 AACTAACAAG GAGAAAAACA C ATG TCT ?AA ATT ?TC GGT ?TT GAC TT? GGT 711 Met Ser Lys lie lie Gly He ?sp Leu Gly 1 5 10 ?C? ?CA A?C TCA GCA GTT GCA GTT CTT G?? GGA ACT GA? ?GC AA? ATC 759 Thr T r ?sn Ser Ala Val Ala Val Leu Glu Gly Thr Gl? Ser Lys lie 15 20 25 ATC GCA A?C CC? GAA GGA A?C CGC ACÁ ACT CC? TCT GT? GTC TC? TTC 807 He ?la ?sn Pro Glu Gly ?sn ?rg Thr Thr Pro Ser Val Val Ser Phe 30 35 40 A?? AAC GG? G?? ?TC ATC GTT GGT GAT GCT GCA ??? CGT CAA GC? GTT 855 Lys ?sn Gly Glu lia lie Val Gly Asp Ala Ala Lys ?rg Gln ?la val 45 50 S5 ACÁ AAC CCA ß?T ?CA GTT ATC TCT ?TC ??A TCT A?G ATG GGA ACT TCT 903 Thr Asn Pro ?sp Thr Val He Ser lie Lys Ser Lys Mßt Gly lhr Ser 60 65 70 G?? A?? GTT TCT GC? AAT GGA AA? G?? TAC ACT CCA C?? GA? ?TC TC? 951 Glu Lys Vßl Ser ?l* ?sn Gly Lys Glu Tyr Thr Pro Gln Glu He Ser 75 80 85 90 GCT ATC ?TC CTT C?? TAC TTG ??? GGC TAC GCT GAA G?C T?C CTT GGT 999 GAG ??? GT? ?CC ??? GCT GTT ?TC ?CA GTT CCG GCT TAC TTC ??C G?C 1047 Glu Lys Val Tttr Lys ?la Val lie Tl r Val Pro ?la Tyr Phe ?sn ?ßp 110 115 120 GCT C?? CGT CAA GCA AC? ??? GAC CCT GGT AA? ?TT GCT GGT CTT GA? 109S Ala Gln ?rß Gln ?la ?hr Lys ?sp ?la Gly Lys lie Ala Gly Leu Glu 125 130 135 GTA GAA OGT ATT GTT AAC GAA CCA ACT GCA GC? GCT CTT GCT TAT GX3T 1143 Val Glu Ar?r l e Val Asn Glu Pro Oír Ala Ala ?la Leu ?la yr Gly 140 145 150 TTG G?C ??G ?CT GAC AA? ß?? GAA ??A ATC TTG GT? TTT GAC CTT OGT 1191 Lau ?sp Lys Uvr ?sp Lys Glu ßlu Lys lie Leu Val Ph* Asp Leu Oly 155 lßO lßS 170 GGT GGT AC? TTC GAC GTC TCT ATC CTT GA? TTG GGT GAC GGT GTC TTC 1239 Gly Gly Thx Phe ?sp Val S»? lie Leu Glu Leu Gly ?sp Gly Val he 175 180 185 GAC GTA TTG TCA ACT CCA GGG GAC A?C ?AA CTT GGT GGT GAC GAC TTT 1287 Asp Val Leu Ser Thr Ala Gly Asp Asn Lys Leu Gly Gly Asp Asp Phe 190 195 200 GAC CAA AAA ATC ATT GAC CAC TTG GTA GCA GAA TTC AAG AAA GAA A?C 1335 Asp Gln Lys lie lie Asp H s Leu Val Ala Glu Phe Lys Lys siu ?sn 205 210 215 GGT ATC GAC TTG TCT ACT GAC A?G ?TG GC? ?TG C?? CGT TTG AAA GAT 1383 Gly Xle Asp Leu Ser Thr ?sp Lys Kßt ?la Met G n ?rg Leu Lys Asp 220 225 230 GCG GCT GAA AA? GCG A?G ??? GAC CTT TCT GGT GTA ?CT TC? ?C? C?A 1431 ?la ?la Glu Lys Ala Lys Lys Asp Leu Ser aly Val Thr Ser Tl r Gln 235 240 245 250 ATC AGC TTG CCA TTT ATC ACT GC? GGT GAG GCT GGA CCT CTT CAC TTG 1479 lie SKX Leu Pro Phe lie Thr Ala Gly Glu Ala Gly Pro Leu His Leu 255 260 265 GAA ATG ACT TTA ACT CGT GCG ??? TTT GAT GAT TTG ACT CGT G?C CTT 1527 Glu Met Thr Leu Thr Arg Ala Lys Phe Asp Asp Leu Thr ?rg ?sp Leu 270 275 280 GTT GAA CGT ACÁ AAA GTT CCA GTT CGT CAA GCC CTT TCA GAT GCA GGT 1S75 Val Glu Arg Thr Lys Val Pro Val Arg Gln Ala Leu Ser Aßp Ala Gly 285 290 295 TTG AOC TTG TCA GAA ATC GAC GAA GTT ATC CTT GTT GGT GGT TCA ACT 1623 Leu Ser Leu Ser Glu He Asp Glu Val He Leu Val Gly Gly Ser Thr 300 305 310 CGT ATC CCT GCC GTT OTT GAA GCT GTT AAA GCT GAA ACT GOT A?? G?? 1€71 ?rg lie Pro Ala val Val Glu ?la Val Lys ?la Glu Thr aly Lyß Glu 315 320 325 330 CCA ??C AAA TCA GTA AAC CCT GAT G?? GTA ßTT GCT ATO GGT GCG GCT 1719 Pro ?sn Lys Ser Val ?sn Pro ?sp Glu Val Val ?la Ket Gly ?la ?la 335 340 345 ATC C?A GOT GGT GTG ATT ACT GGT GAT GTC ??G GAT ßTT GTC CTT CTT 1767 lie Gln Gly Gly Val He Thr Gly Asp Val Lys Asp Val Val Leu Leu 350 355 36ß GAT GTA ACG CCA. TTG TCA CTT GGT ATC GA? AC? ?TG GGT GGA GTA TTT 1815 ?sp Val Thr Pro I?U Ser Leu Gly lie Glu Thr Met Gly Gly Val Pbe 3G5 370 375 ACÁ AAA CTT ATC GAT CGC AAC ACT ACÁ ATC CCA ACÁ TCT AAA TCA CAA 18S3 Thr Lys Leu r e Asp Arg Asn Tlir Thr lie Pro Thr Ser Lys Ser Gln 3ßO 385 390 GTC TTC TCA ACÁ GCA GCA GAC -AAC CAA CCA GCC GTT GAT ATC CAC GTT 1911 Val Fhe Ser Thr Ala Ala Asp Asn Gln Pro Ala Val Asp Xle His Val 395 400 405 410 CTT CAA GGT GAA CGC CCA ATG OCA GCA GAT AAC AAG ACT CTT GGA CGC 1959 Leu G n Gly Glu Arg Pro Met Ala Ala ?sp ?sn Lys Thr Leu Gly Are 415 420 425 TTC CAA TTG ACT GAT ?TC CC? GCT GC? CCT CGT GG? ?TT CCT C?A ATC 2007 Phe Gln Leu Thr Asp He Pro Ala ?la Pro ?rg Gly lie Pro aln lie 430 435 440 GAA GTA ACÁ TTT GAC ATC GAC AAG AAC GGT ATC GTG TCT GTT AAG GCC 2055 Glu Val Thr Phe ?sp Xle Asp Lys Asn Gly lie Val Ser Val Lys Ala 445 450 455 AAA GAC CTT GGA ACT CAA A?? G?A C?? ?CT ?TT GTC ?TC CA? TCG AAC 2103 Lys ?sp Leu Gly Ttu: Gln Lys Glu Gln T?ir llß Val lie Gln Ser Asn 460 465 470 TCA GGT TTG ACT GAC GAA GAA ?TC GAC CGC ?TG ?TG ?AA GAT GCA G?A 2151 Ser Gly Leu TTir Asp Glu Glu He ?sp Arg Met Met Lys Asp Ala Glu 475 480 485 490 GCA A?C GCT GAA TCC GAT AAG AAA COT A?? G?? G?? GTA G?C CTT CGT 2199 Ala ?sn Ala Glu S^r As Lys Lys Arg Lys Glu Glu Val ?sp Leu Arg 495 500 505 AAT G?? GTG G?C CAA GCA ATC TTT GCG ACT GAA ??G ACÁ ATC ?AG G?? 2247 ?sn Glu Val ?sp Gln Ala He Phe Ala 'Ovr Glu Lys Thr He Lys Glu 510 515 520 ACT GAA GGT AAA GGC TTC GAC GCA GAA CGT GAC GCT GCC CAA GCT GCC 2295 Thr Glu Gly Lys Gly phe Asp Ala Glu Arg Asp Ala ?la Gln ?la Ala 525 530 535 CTT GAT GAC CTT AAG AAA GCT CAA GAA GAC AAC AAC TTG GAC GAC ATG 2343 Leu ?sp ?sp Leu Lys Lys Ala Gln Glu Asp Asn ?sn Leu ?sp ?sp Mee 540 54S 550 AA? GCA AA? CTT GAA GCA TTG A?C GA? A?A GCT CAA GGA CTT GCT GTT 2391 Lys ?la Lys Leu Glu ?la Leu ?sn Glu Lys Ala Gln Gly Leu ?la Val 5S5 560 565 570 AA? CTC T?C G?A CAA GCC GCA GCA GCG CAA CA? GCT C?A GA? GGA GCA 2439 Lys Leu Tyr Glu Gln Ala Ala ?la ?la Gln Gln ?la Gln Glu Gly Ala 575 S80 5B5 GA? GGC GCA CAA GC? ?CA GG? ?AC GC? GGC G?T G?C GTC GT? G?C OGA 2487 Glu Gly ?la G n Ala Ttir Gly ?sn Ala Gly ?sp ?sp Val Val ?sp Gly 590 595 600 GAß TTT ACG GAA AAG T?AG?TG?GT GTATTGß?TG ??G?GT?TCT ??????X?C? 2S42 Glu Elie Tlir Glu Lys eos CGAAAAGTTT ?TA?TGATTT TTGT??TCAA GCTGATAACT ATAGA?C?TC ????G?TTTT 2602 ?TTG?T?ATA TTCCAATAGA AT?TTTAGCT ÁGATATAG?G AAATT?T?TT AGC1GAGCAT 2662 G?T?GTTGTO TC?AAAATGA TGAAGCGGT? ?GG??TTTTO TTACCTC?GT ?TTGTTGTCT 2722 GC?TTTGT?T CGGCG?TGGT ?TCAGCTATG ?TATC?TTAG ???T?C???C ATATA?ATTT 2782 GTAAT?CCGT TCATAATTGG TATGATTTGG ?CAGT GTTG T?TTTCTT?T G?TCA?TTGG 2842 ??TTATATAG GCAA?TACTA AGA?G?GACA AAAATATATA AATATTTCTG TACTTATAGG 2 02 ATATTTAAAA TCCAAAT??A GTTAATTTAC TTATTTSC?G AGGTTGCAAC CC?GCCTCTG 2962 TTTTTCG?T? ?AAAGGGACG GAATCTCATT TGTTTGGGTT TTGTCTCATC AATAGAAAGG 3022 AACAAAGAGT GTTCGTA?CT GA?C?CGGGT TTCAGA?TTT CTTACT?AAT ATAAAAGA?? 3082 GGAATTGAAC CCGACCTAAA TCGTGGTTCG ?TTC?GAAC? TCAATAGA?? GGAAT??GGG 3142 TGTTCGTA?C TGAACACGGG CTACGGACTG TGCCAAAAAG ATAGTTTTTT CT?GGACGTA 3202 AGCGTCCGTC GTCAAAACTC CTAG?TGGCT GTGTCCGTTT GACGCCCTTT GTATCTTGA? 3262 TT ?TG AAC A?T ?CT GAA TTT TAT GAT CGT CTG GGG GTA TCC AA? AAC 3309 Met Asn ?en Thr Glu Phe Tyr Asp Arg Leu Oly Val Ser Lys Asn 1 5 10 15 GCT TCG GCA GAC GAA ATC AAA A?G GCT TAT CGT AAG CTT TCC AAA A?? 3357 ?la Ser ?la Asp Glu He Lys Lys Ala Tyr ?rg Lys Lau Ser Lys Lys 20 25 30 TAT CAC CCA G?T ATC AAC AAG GAG CCT GGT GCT GAG GAC AAG TAC AAG 3405 Tyr His Pro ?sp He Asn Lys Glu Pro Gly Ala Glu Asp Lys Tyr Lys 35 40 45 GAA GTT CAA GAA GCC TAT GAG ACT TTG AGT GAC GAC CAA AAA CGT GCT 3453 Glu Val Gln Glu Ala Tyr Glu Thr Leu Ser Asp Asp Gln Lys Arg Ala 50 55 60 GCC TAT GAC CAG TAT GGT GCT GCA GGC GCC AAT GGT GGT TTT GGT GGA 3501 ?la Tyr Asp Gln Tyr Gly Ala Ala Gly Ala Asn Gly Gly Phe Gly Gly 65 70 75 GCT GGT GGT TTC GGC GGT TTC AAT GGG GCA GGT GGC TTC GGT GGT TTT 3549 Ala Gly Gly Phe Gly Gly Phe Asn Gly Ala Gly Gly Phe Gly Gly Phe 80 85 90 95 GAG GAT ATT TTC TCA AGT TTC TTC GGC GGA GGC GGT TCT TCG CGC AAT 3597 Glu Asp He Phe Ser Ser Phe Phe Gly Gly Gly Gly Ser Ser Arg Asn 100 105 110 CCA AAC GCT CCT CGC CAA GGA G?T GAT CTC CAG TAT CGT GTC AAT TTG 3645 Pro Asn ?la Pro ?rg Gln Gly ?sp Asp Leu Gln Tyr Arg Val Asn Uu 115 120 125 ACC TTT GAA GAA GCT ATC TTC GGA ACT GAG A?G G?? GTT AAG TAT CAT 3693 Thr Phe Glu Glu Ala He Phe Gly Thr Glu Lyß Glu Val Lys Tyr His 130 135 140 CGT GAA GCT GGC TGT CGT AC? TGT ?AT GGA TCT GGT GCT A?G CC? GGG 3741 Arg Glu ?la Gly Cys Aro Thr Cys Asn Gly Ser Gly Ala Lys Pro Gly 145 150 155 AC? AGT CCA GTC ?CT TGT GGA CGC TGT CAT GGC GCT GßT OTC ATT AAC 3789 Thr Ser Pro Val Thr Cys Gly Arg Cys His Gly Ala ßly Val He Asn 160 165 170 175 GTC GAT ACG CAG ACT CCT CTT GCT ATG ATG CGT CGC CAA OTA ACC TGT 3837 Val Asp Thr aln Thr Pro Leu Gly Met Met ?rg Arg Gln Val Thr cys 180 185 190 GAT GTC TGT CAC GGT COA GGA AAA GAA ATC AAA TAT CC? TGT ACÁ ACC 388S Asp Val Cys Hls Gly Arg Gly Lys Glu He Lys Tyr Pro Cys Thr Thr 195 200 205 TGT CAT GGA ACÁ OGT CAT GAG A?? CAA GCT CAT AGC GTA CAT GTG AAA 3933 Cys His Gly Tt\r ßly His Glu Lyß Gln Ala His Ser Val His Val Lys 210 215 220 ?TC CCT GCT GGT GTG G?? ?C? GGT C?? C?? ?TT CGC CTC GCT GGT CAA 3981 lie Pro ?la Gly Val Glu Ttir Gly Gln Gln Il« ?rg Leu ?la Gly Gln 22S 230 235 GGT G?? GC? GGC TTT A?C GGT GG? CCT TAT GGT G?C TTG T?T GTA GT? 4029 Gly Glu ?la Gly Phe Asn Gly Gly Pro Tyr Gly ?sp Leu yr Val Val 240 245 250 255 GTT TCT GTG G?A GCT ?GT G?C ??G TTT GA? OGT GA? GG? ?CG ?CT ?TC 4077 Val Ser Val Glu ?la Ser ?sp Lyß Phß Glu ?rg Glu Gly Ttir Tfcr lie 260 265 270 TTC T?C ??T CTC A*C CTC ??C TTT GTC C?? GCG GCT CTT GGT GAT ACÁ 4125 Ph* Tyr ?sn Leu ?sn Leu ?sn Phe Val Gln ?la ?la Leu Gly ?sp Thr 27S 280 2B5 GTA GAT ATT CCA ACT GTT CAC GGT GAT GTT GA? TTG GTT ?TT CC? GAG 4173 Val ?sp lie Pro 1hr Val His Gly Asp Val Glu Leu Val lie Pro Glu 290 295 300 GGA ACT CAG ACT GGT AAG AA? TTC CGC CT? CGT ?GT ??G GGG GCA CCG 4221 Gly TTir Gln Thr Gly Lye Lys Phe ?rg Leu ?rg Ser Lys Gly Ala Pro 305 310 31S AGC CTT CGT GGC GGT GCA GTT GGT GAC CA? TAC GTT ?CT GTT AAT GTC 4269 Ser Leu Arg Gly Gly Ala Val Gly ?sp Gln Tyr Val Thr Val Asn Val 320 325 330 335 GTA AC? CCG ACÁ GGC TTG A?C G?C CGC C?? ??? GT? GCC TTG AAA GAA 4317 Val Thr Pro Thr Gly Leu Asn Asp Arg Gln Lys Val Ala Leu Lys Glu 340 345 350 (2) INFORMACIÓN PARA LA SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NO: 5: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 607 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA:proteína (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. DE IDENT NO.5 Met Ser Lys He llß Gly He ?sp Leu Gly Thr Ttir ?sn Ser Ala Val 1 5 10 15 ?la Val Leu Glu Gly Thr Glu Ser Lys ?le lie ?la ?sn Pro Glu Gly 20 25 30 ?sn ?rg Ttir Thr Pro Ser Val Val Ser Ph* Ly* ?sn Gly Glu II* He 35 40 45 Val Gly ?sp ?la ?la Lys ?rg Gln ?la Val Thr ?sn Pro ?sp Ttir Val 50 55 60 He Ser I * Lys Ser Lys Met Gly Thr Ser Glu Lys Val Ser ?la ?sn 65 70 75 80 Gly Lys Glu yr Thx Pro Gln Glu II* Ser ?la Mßt He L*u Gln Tyr T S 90 95 Leu Lys Gly Tyr ?la Glu ?sp Tyr Leu Gly Glu Lys Val Thr Lys ?la 100 105 110 Val llß T*vr Val Pro ?la T Phe Asn Asp Ala Gln Aro Gln Ala Thr 115 120 125 Lys ?sp ?la Gly Lys lie ?la Gly Leu Glu Val Glu Arg He Val ?sn 130 135 140 Glu Pro Thr ?la ?la Ala Leu ?la Tyr Gly Leu Asp Lya Thr ?sp ys 145 150 155 160 Glu Glu Lys llß Leu Val Phe ?sp Lau Gly Gly Gly Thr Phe ?sp Val 165 170 175 Ser lie Leu Glu Leu Gly ?sp Gly Val Fho ?sp Val Leu Ser Thr Ala 180 185 190 Gly ?sp ?sn Lys Leu Gly Gly ?sp ?sp Phe ?sp Gln Lyß He He Asp 195 200 20S His Leu Val Ala Glu Phe Lys Lys Glu ?sn Gly Xlß ?sp Leu Sar Thr 210 215 220 Asp Lys Met ? a Met Gln Arg Uu Lys ?sp ?la ?la Glu Lys ?la Lys 225 230 235 240 Lys ?sp Leu Ser Gly Val Thr Ser Thr Gln He Ser Leu Pr-o Phe He 245 250 255 Ttir Ala Gly Glu Ala Gly Pro Leu His Leu Glu Mßt Thr Lau Thr Arg 260 265 270 ?la Lys Fhe Asp ?sp Leu Thr Arg ?sp Leu Val Glu Arg Thr Lyß Val 275 280 285 Pro Val ?rg Gln ?la Leu Ser ?sp ?la Gly Le Ser Leu Ser G u He 290 295 300 ?sp Glu Val He Leu Val Gly Gly Ser T r Aro Xle Pro ATLa Val Val 305 310 315 320 Glu ?la Val Lys Ala Glu Thr Gly Lys Glu Pro Asn Lys Ser Val ?sn 325 330 335 Pro ?sp Glu Val Val ?la Met Gly Ala ?la lie Gln Gly Gly Val He 340 345 350 ?ir Gly ?sp Val Lys ?sp Val Val Leu Leu ?sp Val ti Pro Leu Ser 355 360 365 Leu Gly He Glu Thr Met Gly Gly Val Phe Thr Lys Leu He ?sp Aro 370 375 3ßO ?sn Thr Thr llß Pro Thr Ser Lys Ser G n Val Phe Ser Thr Ala Ala 385 390 39S 400 ?sp ^sa. Gln Pro ?la Val ?sp He His Val Leu Gln Gly Glu ?r?r Pro 405 410 415 Met: ?la Ala Asp ?ßn Lys Thr Leu Gly ?rg Phe Gln Leu Bir ?sp Xle 420 425 430 Pro Ala Ala Pro ?rg Gly He Pro Gln He Glu Val Thr Phe ?ßp He 435 440 445 ?sp Lys ?sn. Gly He Val Ser Val Lys ?la Lys ?sp Leu Gly Thr Gln 4S0 455 460 Lys Glu Gln Thr He Val He Gln Ser ?sn Ser Gly Leu Thr Asp Glu 465 470 475 480 Glu He ?sp ?rg Het Met Lys ?sp ?la Glu ?la ?sn Ala Glu Ser ?sp 485 490 495 Lys Lys ?rg Lys Glu Glu Val Asp Leu Arg Asn Glu Val ?sp Gln Ala 500 SOS SIO He Phe ?la Thr Glu Lys Thr lie Lys Glu Thr Glu Gly Lys Gly Phe 515 520 525 ?sp ?la Glu ?rg ?sp ?la ?la G n ?la ?la Leu Asp ?sp Leu Lys Lys 530 535 540 ?la Glp Glu ?sp ?sn ?ßn Leu Asp Asp Met Lys ?la Lys Leu Glu ?la 545 550 555 560 Leu ?sn Glu Lys ?l* Gln Gly Leu ?la Val Lys Leu Tyr Glu Gln ?la 565 570 575 Ala ?la ?la Gln Gln Ala Gln Glu Gly ?la Glu Gly ?la Gln Ala Thr 580 585 590 Gly Asn Ala Gly Asp Asp Val Val Asp Gly Glu Phe ltir Glu Lys 595 €00 605 (2) INFORMATION FOR SEQ ID NO: 6: (2) INFORMACIÓN PARA LA SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NO: 6: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 352 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: proteína (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. DE IDENT NO.6 Met ?sn Asn Thr Glu Phe Tyr Asp Arg Leu Gly Val Ser Lys Asn Ala 1 5 10 15 Ser Ala Asp Glu He Lys Lys ?la Tyr Arg Lys Leu Ser Lys Lys Tyr 20 2S 30 His Pro Asp He Asn Lys Glu Pro Gly ?la Glu ?sp Lyß Tyr Lys Glu 35 40 45 Val Gln Glu Ala Tyr Glu Thr Leu Ser Asp Asp Gln Lys Arg Ala Ala 50 55 60 Tyr ?sp Gln Tyr Gly Ala Ala Gly Ala Asn Gly Gly Phe Gly Gly Ala 65 70 75 80 Gly Gly Phe Gly Gly Phe Asn Gly Ala Gly Gly Phß Gly Gly Phß Glu 85 90 95 ?sp He Phe Ser Ser Phe Phe Gly Gly Gly Gly Ser Ser ?rg ?sn Pro 100 105 110 ?sn ?la Pro ?rg Gln Gly ?sp ?sp Leu Gln Tyr ?rg Val Asn Leu T z 115 120 125 Phß Glu Glu ?la He Phe Gly Thr Glu Lyß Glu Val Lys Tyr His Arg 130 135 140 Glu ?la Gly Cys Arg Thr Cys Asn Gly Ser Gly Ala Lys Pro Gly Ttir 145 150 155 160 Ser Pro Val T?ir Cys Gly Arg Cys His Gly Ala Gly Val He ?sn Val 165 170 175 Asp Thx Gln Thr Pro Leu Gly Met Met Arg Arg Gln Val Thr Cys A=p 180 185 190 Val Cys His Gly Arg Gly Lys Glu He Lys TVr Pro Cys Thr Thr cys 195 200 205 His Gly Thr Gly His Glu Lys Gln Ala His Ser Val His Val Lys He 210 215 220 Pro Ala Gly Val Glu Trur Gly Gln Gln He Arg Leu Ala Gly Gln Gly 225 230 235 240 Glu Ala Gly Phe Asn Gly Gly Pro Tyr Gly Asp Leu Tyr Val Val Val 245 250 255 Ser Val Glu Ala Ser Asp Lys Phe Glu Arg Glu Gly Ttir Txir lie Phe 260 265 270 Tyr Asn Leu Asn Leu Asn Phe Val Gln Ala Ala Leu Gly Asp Oir Val 275 280 285 Asp He Pro Thr Val His Gly Asp Val Glu Leu Val He Pro Glu Gly 290 295 300 Thr Gln Thx Gly Lys Lys Phe Arg Leu Arg Ser Lys Gly Ala Pro Ser 305 310 315 320 Leu Arg Gly Gly Ala Val Gly Asp Gln Tyr Val Thr Val Asn Val Val 325 330 335 Oir Pro Thr Gly Leu Asn Asp Arg Gln Lys Val Ala Leu Lys Glu Phe 340 345 350 (2) INFORMACIÓN PARA LA SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NO: 7: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 15 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: péptido (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. DE IDENT NO.7 Thr Ser Thr Gln He Ser Leu Pro Phe lie Thr Ala Gly Glu Ala 1 S 10 15 (2) INFORMACIÓN PARA LA SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NO: 8: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 15 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA:péptido (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. DE IDENT NO.8 Thr ?la Gly Glu ?la Gly Pro Leu His Leu Glu Met Thr Leu Thr 1 5 10 15 (2) INFORMACIÓN PARA LA SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NO: 9: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 14 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA:péptido (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. DE IDENT NO.9 Met Thr Leu Tr Arg Ala Ly* Phe Asp Asp Leu Thr Arg Asp 1 5 10 (2) INFORMACIÓN PARA LA SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NO: 10 (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 15 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: éptido (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. DE IDENT NO.10 A=p ?sp Leu Thr ?rg ?sp Leu Val Glu ?rg Thr Lys Val Pro Val 1 5 10 15 (2) INFORMACIÓN PARA LA SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NO: 11 (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 14 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA:péptido (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. DE IDENT NO.11 Thr Lys Val Pro Val Arg Gln Ala Leu Ser Asp Ala Gly Leu 1 5 10 (2) INFORMACIÓN PARA LA SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NO: 12 (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 15 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA:péptido (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: IDENT NO.12 Lys Ala Lys Aßp Leu Gly Thr Gln Lys Glu Gln Thr He Val He 1 5 10 15 (2) INFORMACIÓN PARA LA SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NO: 13 (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 14 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA:péptido (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. DE IDENT NO .13 Leu Thr Asp Glu He Asp Arg Met Met Lys Asp Ala Glu Ala 1 5 10 (2) INFORMACIÓN PARA LA SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NO: 14 (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 24 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA:péptido (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. DE IDENT NO.14 Lys Asp Ala Glu Ala Asn Ala Glu Ser Asp Lys Lys Arg Lys Glu Glu 1 5 10 15 Val Asp Leu Arg Asn Glu Val Asp 20 (2) INFORMACIÓN PARA LA SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NO: 15 (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 15 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLECULA:péptido (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. DE IDENT NO.15 Asn Glu Val Asp Gln ?la He Phe ?la Thr Glu Lys Thr He Lys 1 5 10 15 (2) INFORMACIÓN PARA LA SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NO: 16 (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 28 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA:péptido (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. DE IDENT NO.16 Glu Lys Thr llß Lys Glu Thr Glu Gly Lyß Gly Phe Asp Ala Glu ?r{ 1 5 10 15 ?sp ?la Ala Gln ?la ?la Leu ?ßp ?sp Leu Lyß Lys 20 25 (2) INFORMACIÓN PARA LA SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NO: 17 (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 30 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA:péptido (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. DE IDENT NO.17 Lys Ala Gln Glu Asp Asn Asn Leu Asp Asp Met Lys Ala Lys Leu Glu 1 5 10 15 Ala Leu Asn Glu Lys Ala Gln Gly Leu Ala Val Lys Leu Tyr 20 25 30 (2) INFORMACIÓN PARA LA SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NO: 18 (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 25 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA:péptido (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. DE IDENT NO.18 (2) INFORMACIÓN PARA LA SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NO: 18 (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 25 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA:péptido (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. DE IDENT NO.18 Gln Glu Gly Ala Glu Gly Ala Gln Ala Thr Gly Asn Ala Gly Asp Asp 1 5 10 is Val Val Asp Gly Glu Phe Thr Glu Lys 20 25 (2 ) INFORMACIÓN PARA LA SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NO : 19 ( i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD : 2183 pares de bases (B) TIPO : ácido nucleico (C) HEBRA: doble (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA:ADN (genómico) (iii) HIPOTÉTICA: NO (iv) ANTI- SENTIDO:NO (vi) FUENTE ORIGINAL: (A) ORGANISMO: Streptococcus pyogenes (ix) CARACTERÍSTICAS: (A) CLAVE/ NOMBRE : CDS (B) UBICACIÓN: 204..2030 (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. DE IDENT NO.19 (2) INFORMACIÓN PARA LA SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NO: 19 (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 2183 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) HEBRA: doble (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA:ADN (genómico) (iii) HIPOTÉTICA: NO (iv) ANTI- SENTIDO: NO (vi) FUENTE ORIGINAL: (A) ORGANISMO: Streptococcus pyogenes (ix) CARACTERÍSTICAS: (A) CLAVE/ NOMBRE : CDS (B) UBICACIÓN: 204..2030 (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. DE IDENT NO.19 CAGCGATGGT AGTTGTTTAT AACTAAGGTA A?TGAGT?TT CGTTTTTGTC CGTAATOACA 60 GTAAACTAGA TAGCAAGTTA GAAGCTATTT CGCTTGCTG? TTAAACTATA GTGATTGCTT 120 AGA?TTGG?? GTAAAATAAT TCGAGTGCTT ACTAAGATAA ATTGAAATAA AAAGTAA AA 180 AG ATAAAAT AAGAGGTATT AAC ATG TCT AAA ATT ATT GGT ATT GAC TTA 230 Het Ser Lys lie He Gly lie Asp Leu 1 5 GGT ACÁ ACÁ AAC TCA GCA GTA GCA GTT CTT GAA QGG ACT GAA TCA AAA 278 Gly Thr ?hr ?sn er Ala Val Ala Val Lau Glu Gly Thr Glu Ser Lys 10 15 20 25 ATC ATT GCT AAC CCA GAA GGC AAT CGT ACÁ ACT CCT TCA GTA GTA TCA 326 He He Ala Asn Pro Glu Gly Asn Arg Thr Thr Pro Ser Val Val Ser 30 35 40 TTC AAA AAT GGT GAA ATT ATC GTG GGT GAT GCT GCA AAA CGC CAA GCA 374 Phe Lys Asn Gly Glu He llß Val Gly Asp Ala ?la Lys Arg Gln Ala 45 50 S5 GGG ACÁ AAC CCA GAA ACÁ GTA ATC TCT ATT AAA TCT AAA ATO GGA ACT 422 Val T r Asn Pro Glu Thr Val lie Ser lie Lys Ser Lys Met Gly ti?r ßO 65 70 TCT GAA AAA GTT TCT GCA AAT GGT AAA GAA TAT ACT CCT CAA GAA ATT 470 Ser Glu Lys Val Ser Ala Asn Gly Lys Gl Tyr Ttvr Pro Gln Glu lie 75 80 as TCA GCA ATG ATT CTT CAA TAC CTT AAA GGT TAT GCT GAA CAC TAT CTT 518 S r Ala Met lie Leu Gln r Leu Ij s Gly Tyr Ala Glu Asp Tyx Leu 90 95 100 105 GGA GAA AAA OTA GAA AAA GCA GTT ATT ACT GTT CCA GCT TAT TTC AAC 566 Gly Glu Lys Val Glu Lys Ala Val lie Ttir Val Pro Ala y Plie Aßn 110 115 120 OAT GCA CAA CGT CAA OCA ACT AAA GAC GCT GGT AAA ATT GCA GGT CTT 614 Asp Ala Gln Ara Gln Ala TTir Lys Asp Ala Gly Lys Tie Ala Gly Leu 125 130 135 GAA GTA GAA CGT ATC GTT AAT GAA CCA ACÁ GCA GCT GCA CTT GCT TAT 6S2 Glu Val Glu Arg lie Val Asn Glu Pro Thr Ala Ala Ala Leu Ala yr 1-40 14S 150 GGT ATG GAC AAG ACT GAC AAG GAT GAA AAA ATC TTA GTT TTT GAC CTT 710 Gly Met Asp Lys Thr Asp Lys Asp Glu Lys lie Leu Val Phe A=p Leu 15S lßO 165 GGT GGT GOT ACÁ TTT GAC GTA TCA ATC CTT CAA TTA GGT GAT GGT GTC 758 Gly Gly Gly Thr Phe Asp Val Ser 11* Leu Glu Leu Gly Asp Gly Val 170 175 180 185 TTC GAC GTT CTT GCA ACÁ GCA 8T GAT AAC AAA CTT GGT GGT GAC GAC 806 Phe Asp Val Leu Ala Thx Ala Gly Asp Asn Lya Leu Gly Gly Asp Asp 190 195 20O TTT GAC CAA AAA ATT ATT GAT TTC TTA GTG GCT GAA TTT AAG AAA GAA B54 Phe Asp Gln Lys lie lie Asp Phe Leu Val ?la Glu Phe Lys Lys Glu 205 210 215 AAT GGT ATT GAC TTA TCA CAA GAT AAG ATG GC? CTT CAA CGC TTG AAA 902 Asn Gly Xle Asp Leu Ser Gln ?sp Lys Met Ala Leu G n Arg Leu Lys 220 225 230 GAT GCT GCT GAA AAA GCT AAA AAA GAT CTT TCA GGT GTG ACÁ CAA ACÁ 950 Asp Ala Ala Glu Lys Ala Lys Lys Asp Leu Ser Gly Val Thr G n Thr 235 240 245 CAA ATT TCA TTA CCG TTC ATC ACT GCT GGT TCT GCT GGT CCT CTT CAC 99 B Gln Xle Ser Leu Pro Phe lie Tvr Ala Gly Ser Ala Gly Pro Leu His 250 255 260 265 TTA GAG ATG AGC TTA TCT CGT GCT AAA TTT OAC GAT CTC ACT CGT GAC 1046 Leu Glu Met Ser Leu Ser Arg ?la Lys Phe Aip ?sp Leu Thr Ara Asp 270 275 280 CTT GTT GAA CGT ACG AA? ACT CCA GTT CGT CAA GCT CTT TCA GAT GCA 1094 Leu Val Glu ?rg Thx Lys Thr Pro Val Arg G n ?la Leu Ser ?ap ?la 285 290 295 GG? TTG TCA TTG TCA G?A ATT GAT GAA GTT ATC CTT GTT ßGT GSA TCA 1142 Gly Leu Ser Leu Ser Glu Xle ?sp Glu Val Xle Leu Val Gly Gly Ser 300 305 310 ACT CGT ?TC CCJy GCA GTT GTC GAA GCT GTA AA? GCT GAA ACT GGT ??? 1190 Thr ?rg lie Pro ?la Val Val Glu Ala Val Lys ?la Glu Thr ßly Lys 315 320 325 GAA CCA A?T ??? TCT GT? ??C CCT GAT G?? GTG GTT GCT ATC GGT GCT 1238 Glu Pro Asn Lys Ser Val Asn Pro Asp Glu Val val ?la Met Gly Ala 330 335 340 345 GCT ATC CAA GGT GGG GTT ATC ACT GGG GAT GTG AAA GAC GTT GTC CTT 1286 Ala lie Gln Gly Gly Val lie Thr Gly Asp Val Ly* Asp Val Val Leu 350 3S5 360 CTT G?C GTA AC? CC? TTG TC? CTT GGT ?TT GAA ACÁ ATG GGT GGT GTC 1334 Leu Asp Val Thr Pro Leu Ser Leu Gly lie Glu hr Met sly Gly Val 365 370 375 TTC ACT AAA TTG ATC GAC CGC ??T ?C? ?CT ?TC CCA ACÁ TCT AA? TC? 13 B2 Phe Thr Lys Leu lie ?sp Arg Asn Thr Thr Xle Pro Thr Ser Lys Ser 380 385 390 CA? GTC TTC TC? ACÁ GCA GCA GAC A?C C?A CCA GCC GTT GAT ?TC C?T 1430 G n Val Phe Ser Thr ?la ?la ?ap ?sn G n Pro ?la Val ?sp Xle His 395 4O0 405 GTT CTT CAA GGT GAA CGC CCA ATG GC? GCA GAT A?C ??G ACT CTT GGT 1478 Val Leu Gln Gly Glu Arg Pro Met Ala ?la Asp Asn Lys Thr Leu Gly 410 415 420 425 CGC TTC CAA TTG ACT GAT ATC CCA GCT GCA CCT CGT GGA ATC CCA CAA 1526 Arg Phe sln Leu Thr Asp lie Pro Ala Ala Pro Arg Gly lie Pro Gln 430 435 440 ATT GAA GTA ACÁ TTT GAT ATC G?T ??? AAC GGT ATT GTT TCT GTA AAA 1574 lie Glu Val Thr Phe A* lie Asp Ly» Asn Gly Xlß Val Ser Val Lys 445 450 455 GCT ??A G?C CTT GGT ?CG C?? ??C G?? C?? C?C ?TC OTT ?TC A?? TC? 1622 ?la Lys Asp Leu Gly Thr Gln Lys Glu Gln Ki* lie Val lie Lys Ser 460 465 470 AAC GAC GGA CTT TCT GAA GAA GAA ATT GAT CGC ATG ATG AAA GAC GCT 167 D Asn Asp Gly Leu Ser Glu Glu Glu lie Asp Arg Met Met Lys Asp Ala 475 4T0 485 GAA GCT AAT GCC GAA GCC GAT GCG AAA CGT AA? GAA GA? GTT GAC CTT 1718 Glu ?la Asn ?la Glu Ala ?sp Ala Lys Arg Lya Glu Glu Val Asp Leu 490 495 500 505 AAA AAC G?A GTT GAC CAA GCT ATC TTT GCT ACT G?? ??? ACÁ ATC A?? 1766 Lys Asn Giu Val Asp Gln Ala lie Phe Ala Thr Glu Lys Thr Ha Lys 510 515 520 GAA ACT GAA GGT AAA GGC TTT GAC ACÁ GAA CGC GAT GCA GCG CAA TCA 1814 Glu Thr Glu Gly Lys Gly Phe Asp Thr Glu Arg Asp ?la ?la aln Ser 525 530 535 GCT CTT GAC GAG TTA A?? GCT CCG C?A GAA TCT OGC AAC CTT GAC G?C 1862 ?la Leu ?sp Glu Leu Lye ?la ?la Gln Glu Ser sly Asn Leu Asp Asp 540 545 550 ?TG ??? GCT ??? CTT G?? GC? TT? AAT GAA AAA GCC C?? GCT TTG GCT 1910 Het Lys ?la Lys Leu Glu ?la Leu Asn Glu Lys ?la Sin ?la Leu ?la 555 560 S65 GTT A?? ?TG TAC G?G C?? GCT GC? GC? GCT C?? C?? GC? GC? CAA GGT 1958 Val Lys Met Tyr Glu Gln Ala Ala ?la Ala Gln sln Ala Ala Gln ßly 570 575 580 585 GCA GA? GGT GCA CAA GCT A?T GAT TCA GCA A?T AAT G?T GAT GTT GTA 2006 Ala Glu Gly Ala Gln Ala Asn Asp Ser ?la Aan Aen Asp Asp Val Val 590 595 600 GAT GGC GAA TTT ACÁ GAA AAG TA?TGATTTA GTTATCTAGT AACATTAATA 2057 Asp Gly Glu Phe Thr Glu Lys eos TCCX?AATTCA GAGGTTGTAC CAAACCTCTG TTTTTGGCTA AATAAAATGT AAAAATGCTG 2117 ACGTCAAAAT ATTTTAAGAA AGGAATACAA GTTCGATTAT TCGAACACAG GCTAAAGCGT 2177 GTAAAG 2183 (2) INFORMACIÓN PARA LA SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NO: 20 (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 608 aminoácidos (B) TIPO: aminoácidos (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: proteína (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. DE IDENT NO.20 Met Ser Lys lie lie Gly lie Asp Leu Gly Thr Thr Asn Ser Ala Val 1 5 10 15 ?la Val Leu Glu Gly Thr Glu Ser Lys lie lie ?la ?sn Pro Glu Gly 20 25 30 Asn ?rg Thr Thr Pro Ser Val Val Ser Phe Lys ?sn Gly Glu lie lie 35 40 45 Val Gly ?sp ?la ?la Lys ?rff Gln ?la Val Oir Asn Pro Glu Thr Val 50 55 60 lie Ser lie Lys Ser Lys Met Gly T*hr Ser Glu Lys Val Ser ?la Asn 65 70 75 80 Gly Lys Glu Tyr Thr Pro Gln Glu lie Ser Ala Met lie Leu Gln Tyr 85 90 95 Leu Lys Gly Tyr Ala Glu Asp Tyr Leu Gly Glu Lys Val Glu Lys Ala 100 105 110 Val He Ttir Val Pro Ala Tyr Phe ?sn ?sp Ala Gln Arjj Gln Ala Thr 115 120 125 Lys Asp ?la Gly Lys lie Ala Gly Leu Glu Val Glu Arg lie Val Asn 130 135 140 Glu Pro Thr Ala Ala Ala Leu Ala TVr Gly Met Asp Lys Thr Asp Lys 145 150 155 160 ?sp Glu Lys He Leu Val Phe ?sp Leu Gly Gly Gly Thr Fhe ?sp Val 165 170 175 Ser lie Leu Glu Leu Gly ?sp Gly Val Phe ?sp Val Leu ?la Thr ?la 1B0 1B5 190 Gly ?ßp ?sn Lys Leu Gly Gly ?sp hsp Phe ?sp G n Lys He He ?sp 195 200 205 Phe Leu Val ?la Glu Phe Lys Lys Glu ?sn Gly He Asp Leu Ser Gln 210 215 220 Asp Lys Met Ala Leu Gn Ars Leu Lys Asp ?la ?la Glu Lys Ala Lys 225 230 235 240 Lys Asp Leu Ser Gly Val Thr Gln Thr Gln He Ser Leu Pro Phe He 24S 250 255 Thar Ala Gly Sar Ala Gly Pro Leu Mis Leu Glu Met Ser Leu Ser ?rg 260 265 270 Ala Lys Pile Asp Asp Leu Thr Aro Asp Leu Val Glu Arg Thr Lys TTir 275 280 285 Pro Val A o Gln Ala Leu Ser Asp Ala Gly Leu Ser* Leu Sex Glu He 290 295 300 Asp Glu Val He Leu Val Gly Gly Ser Ttvr Arg lie Pro Ala Val Val 305 310 315 320 Glu Ala Val Lys Ala Glu Thr Gly Lys Glu Pro Asn Lys Ser Val Asn 325 330 335 Pro Asp Glu Val Val Ala Mee. Gly Ala Ala lie Gln Gly Gly Val lie 340 345 350 Tti? Gly Asp Val Lys s Val Val Leu Leu Asp Val "Hir Pro Leu Ser 355 360 365 Leu Gly He Glu Thx Mee Gly Gly Val Phe Thr Lyß Leu He Asp Axg 370 375 3ß0 Asn Thr Thr He Pro ?hx Ser Lys Ser Glll Val Phe Ser T?ir Ala Ala 3BS 390 395 400 Asp Asp Gln Pro Ala Val Asp He Hls Val Leu Gln Gly Glu Arg Pro 405 410 415 Met Ala Ala Asp ?ßn Lys Thr Leu Gly Arg Phß Gln Leu "Rir Aap He 420 425 430 Pro Ala Ala Pro Arg Gly He Pro Gln II* Glu Val "Ihr Fti* Aßp He 435 440 44S Asp Lys Asn Gly He Val Ser Val Lys Ala Lys Asp Leu Gly Ttvr Gln 450 455 460 Lys Glu Gln His lie Val He Lys Ser Asn Asp Gly Leu Ser Glu Glu 465 470 475 480 Glu He Asp Ara Met MeC Lys Asp Ala Glu Ala ?an ?la Glu Ala Aap 485 490 495 Ala Lys ?rg Lys Glu Glu Val Asp Leu Lys Asn Glu Val Asp Gln Ala 500 SOS 510 He Phe Ala Thr Glu Lys Thr He Lys Glu Thr Glu Gly Lys Gly Phe 515 520 525 Asp Thr Glu Arg Asp Ala Ala Gln Ser Ala Leu Asp Glu Leu Lys Ala S30 535 540 Ala Gln Glu Ser Gly Asn Leu Asp Asp Met Lys Al* Lys Leu Glu Ala 545 SSO 555 560 Leu Asn Glu Lys Ala Gln Ala L*u Ala Val Ly* Mßt Tyr Glu Gln Ala 565 570 575 Ala Ala Ala Glp Gln Ala Ala G n Gly Ala Glu Gly Ala Gln Ala ?sn 580 5ß5 590 Asp Ser Ala Asn Asn Asp Asp Val Val ?sp Gly Glu Ph* Ttvr Glu Lys 595 600 ßOS (2) INFORMACIÓN PARA LA SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NO: 21 (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 2438 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) HEBRA: doble (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLECULA:ADN (genómico) (iii) HIPOTÉTICA: NO (iv) ANTI- SENTIDO:NO (vi) FUENTE ORIGINAL: (A) ORGANISMO: Streptococcus agalactiae (ix) CARACTERÍSTICAS: (A) CLAVE/ NOMBRE : CDS (B) UBICACIÓN: 248..2077 (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. DE IDENT NO.21 CTTTCAAAAG GGATATAAAT TGCACGAGCG TCTGCTAAGA CCAGCGATGG TAGTTGTCTA 60 TAAC AAGGT AAATGACTGG TCGTTT TGT CCGGAATOAC AGGA?ACTAG ATAGCAAGTT 120 AGAAGCTATT CAGCTTG TG ATT?AACT?T AGTGATTGCT AGAATTGGA AG ?A?ATA? 1T0 TTCG?GTGCT TACTAAGATA AATTGAAATA AA??Gt?AT? AAGTATT?T? A??T??GAGG 240 TAT AAC ATG TCT A? ATT ATT OGT ATT G?C TEA GGT ACÁ ACÁ AAC TC? 289 Met Ser Lys II* lie Gly l e ?sp Leu Gly Oir Thr Asn Ser 1 5 10 GCA GTA GCA GTT CTT GAA GGG ACT GAA TCA AAA ATC ATT GCT AAC CCA 337 Ala Val Ala Val Leu Glu Gly Thr Glu Ser Lys lie lie Ala Asn Pro 15 20 25 30 GAA GGC AAT CGT ACÁ ACT CCT TCA GTA GTA TCA TTC AAA AAT GGT GAA 3TS Glu Gly Asp Arg Ttir Thr Pro Ser Val Val Ser Phe Lys Asn Gly Glu 35 40 45 ATT ATC GTG GGT GAT GCT GCA AAA CGT CAA GCG GTA ACÁ AAT CCA GAT 433 He II* Val Gly Asp Ala Ala Lys Arg Gln Ala V*l Thr Asn Pro Asp 50 55 60 ACT GTT ATC TCT ATC AAA TCA AAG ATG GGA ACT TCT GAA AAA GTT TCT 481 Tttr Val He Ser He Lys S«r Lys Mßt Gly Thr Ser Glu Lys Val Ser 65 70 75 GCA AAT GGT AAA GAA TAT ACT CCT CAA GAA ATT TCA GCA ATG ATT CTT 529 Ala ?cn Gly Lys Glu Tyr Thr Pro Gln Glu II* S«r ?la Mßt He Leu 80 85 90 CAA TAC CTT AAA GGT TAT GCT GAA GAC TAT CTT GGA GAA AAA GTA GAA 577 Gln r Leu Lys Gly Tyr Ala Glu Aßp Tyr L*u Gly Glu Lys Val Glu 95 100 105 110 AAA GCA GTT ATT ACT OTT CCA GCT TAC TTC AAC GAT GCA CAA CGT CAG 625 Lys Ala Val He Thr Val Pro Ala Tyr Phß Asa Asp Ala Gln Ara Gln 115 120 125 GCA ACT AAA GAC GCT GGT AAA ATT GCA GGT CTT GAA GTA GAA CGT ATC 673 Ala I?ir Lys Asp Ala Gly Lys He Ala Gly Leu Glu Val Glu Arg lie 130 135 140 GTT AAC GAA CCA ACÁ GCA GCC GCA CTT GCT TAT GGT ATG GAC AAG ACT 72J Val Asn Glu Pro Ttir Ala Ala Ala Leu Ala Tyr Gly Met Asp Lyß Thr 14S 150 1S5 GAC AAG GAT GAA AAA ATC TTA GTT TTT GAC CTT GGT GGT GGT ACÁ TTT 76S Asp Lys Asp Glu Lys lie Leu Val Phe Asp Leu Gly Gly Gly T Phe lßO 165 170 GAC GTA TCA ATC CTT GAA TTA GOT GAT GGT GTC TTC GAC GTT CTT GCA 81" Asp Val Ser Xle Leu Glu Leu Gly Aap Gly Val Phe Asp Val Leu Ala 175 1T0 lßS 190 ACÁ GCA GGT GAT AAC AAA CTT GGT GST GAC GAC TTT OAC CAG AAA ATT 86 í Ttir Ala Gly Asp Asn Lys Leu Gly Gly Asp Asp Phß Asp Gln L s l e 195 200 205 ATT GAT TTC TTG GTA GAA GAA TTC AAß AAA GAA AAT OßT ATT GAT CTT 913 lie Asp Phe Leu Val Glu Glu Phe Lys Lys Glu ?sn Gly Xlß ?sp Leu 210 215 220 TCT CAA GAC AAA ATß GCT CTT CAA CGC TTG AAA GAT GCT GCT GAA AAA 96*1 Se Gln Asp Lys Mee Ala Leu G p ?rg Leu Lys Asp Ala Ala Glu Lys 225 230 235 GCT AAA AAA GAC CTT TCA GGT GTA ACT CAA ACT CAA ATT TCA TTA CCG 100 S Ala Lys Lys Asp Leu Ser Gly Val Thr Gln Thx Gln lie Ser Leu Pro 240 245 250 TTC ATC ACT GCT GGT TCT GCT GGT CCT CTT CAC TTG GAG ATG AGC TT? 105*7 Phe lie Ttir Ala Gly Ser Ala Gly Pro Leu Ble Leu Glu Het Ser Leu 255 260 265 2*70 TCA CGT GCT AAA TTT GAC GAT CTC ACT CGT GAC CTT GTT GAA OOT ACG 1105 Ser Arg Ala Lyß Ph* Asp Asp Leu Ttvr Are Asp Leu Val Glu Ar? Thr 275 280 285 AAA ACT CCA GTT CGT CAA GCT CTT TCA GAT GCA GGC TTG TCA TTG TCA 1153 Lys Thr Pro Val Aro Gln Ala Leu Ser- Asp Ala aly Leu Ser Leu Ser 290 295 300 GAA ATT GAT GAA GTT ATC CTC GTT GGT GGA TCA ACÁ CGT ATC CCA GCA 1201 Glu II» Aep Glu Val lie Leu Val Gly Gly Ser Thr Arg lie Piro Ala 305 310 315 GTT GTT GAA GCT GTA AAA GCT GAA ACT GGT AAA GAA CCA AAT AAA TCT 12-49 Val Val Glu Ala Val Lys Ala Glu T?xr Gly Ly* Glu Pro Am Lys Ser 320 32S 330 GTT AAC CCT GAT GAA GTG GTT GCC ATG GGT GCT GCT ATC CAA GGT GGT 1297 Val ?sn Pro Asp Glu Val Val Ala Met Gly Ala Ala lie aln Gly Gly 335 340 345 350 GTT ATC ACT GGG GAT GTG AAA GAC GTT GTA CTT CTT GAC OTA ACÁ CCA 134 S Val He Thr Gly Asp Vel Lys Asp Val Val Leu Leu Asp Val « r Pro 355 360 365 TTG TCA CTT GGT ATT GAA ACÁ ATG GGT GGT GTC TTC ACT AAA TTG ATC 1393 Leu Ser Leu Gly lie Glu Thr Met Gly Gly Val Phe Thr Lys Leu lie 370 375 380 GAC CGC AAC ACÁ ACT ATC CCA ACÁ TCT AAA TCA CAA GTC TTC TCA ACÁ 1441 Asp ?r?r Asn tir Thr lie Pro Thr Ser Lys Ser Gln Vßl Phe Ser Thr 385 390 395 GCA GCA G?C AAC CAA CCA GCC GTT GAT ATC CAT GTT CTT CAA GGT GAA 1489 Ala Ala Asp ?sn Gln Pro Ala Val Asp lie H±s Val Leu Gln Gly Glu 400 405 410 CGC CCA ATG GCA GCA GAT AAC AAA ACÁ CTC GGT CGC TTC CAA TTG ACT 1537 Arg Pro Met Ala Ala Asp Asn Lys Thr Leu Gly Arg Phe Gln Leu Thr 415 420 425 430 GAT ATC CCA GCT GCA CCT CGT GGA ATC CCA CAA ATT GAA GTA ACÁ TTT 15B5 Asp Xle Pro Ala Ala Pro Arg Gly lie Pro Gln Xle Glu Val Thr Phe 435 440 445 GAT ATC GAT ??A AAT GGT ATT GTA TCT GTT ?AA GCT AAA GAT CTC GGT 1633 Asp Tie Aßp Lys ?sn Gly Xle Val Ser Val Lys ?la Lys ?sp Leu Gly 450 455 460 ?CT C?A A?? G?? C?? C?C ?TT GTT ?TC C?A TCT AAT TC? Gß? TTA ACT 1681 Thr Gln Lys Glu Gln Hls Xle Val Xle Gln Ser ?sn Ser Gly Leu T r 465 470 47S GAT GAA ßAA ATT GAT A?? ?TG ?TG AA? G?T GCT G?A GCA ??T GCT GAA 1729 Asp Glu Glu Xle ?sp Lys Met Mee Lys Asp Ala Glu Ala Asn Ala Glu 4T0 485 490 GCA GAT GCA AAA CGT A? G?? GAA GTT GAT CTT AAA AAT GA? GTT G?C 1777 Ala Asp Ala Lye Arg Lys Glu Glu Val Asp Leu Lys Asn Glu Val Asp 495 500 505 510 CAA GCC ATC TTT GCA ACÁ GAA A?? ?CT ATT AAA GAA ACT GAA GGC AAA 1325 Gln Ala lie Phß Ala Thr Glu Lys Thr lie Lys Glu Thr Glu Gly Lys 515 S20 525 GGT TTT GAT ACÁ GAA CGC GAT GCA GCG CAA TCA GCA CTT GAT GAG TTG 1873 Gly Phe ?sp Thr Glu ?rg ?sp Ala Ala Gln Ser Ala Leu Asp Glu Leu 530 535 540 A?? ??? GCT CA? GAA TCA GGT ?C CTT GAC GAC ATG AAA GCT ?AA CTT 1921 Lys Lys Ala Gln Glu Ser Gly ?sn Leu ?sp ?sp Met Lys ?la Lys Leu 545 550 555 GAA GCT CTT A?C G?A A?A GCA CAA GCT CTT GCA GTT AAA CTT TAC GAA 1969 Glu Ala Leu Asn Glu Lys Ala Gln Ala Leu Ala Val Lys Leu Tyr Glu 560 S6S 570 CAA GCG GCT GCA GCA CAA CAA GCA GCT C?? GGG GCT GAA GGT GC? C?A 2017 Gln Ala Ala ?la Ala Gln Gln ?la ?la Gln Gly ?la Glu Gly ?la Gln 575 580 585 590 TCA GCT GAT TCA TC? ?GC ?AG GGT GAT GAT GTT GT? GAT GGC GAA TTC 2065 Ser Ala Asp Ser Ser Ser Lys Gly Asp Asp Val Val Asp Gly Glu Phe 595 600 605 ACT GAG ??? TAATTATTAA TATTGTTCAG ?TTC?TTTCA ATATAAGCAT 211 Thr Glu Lys 610 GAAAACTATA CTAGCATAGT ??AGTTCTTC GTGAT?GGGA TTGCTCAATA ATCTAGAT?A 2174 GTTTCAGATT AC?T??GCT? ?TTTCGCT?T CACTAA?TAA AAAC?T?TT? ?T?AT???T? 2234 GGCGOGGCGC CTCGCTCCGT CTGTTTTATT AAGTGTCATA TATATOTTAA CT?TTTAGAG 2294 CTGT??CTGG GC??G??T?? TTGTTAATCT CTTC??GTGT AGTATATG?? C???AT?T?? 23 S4 AGGATT?GAT AATGAACAAT ?CAG??TTTT ?TGATCGTCT TCGCGTTTCA AAAGATGCTT 2414 CTCAGGACG? ??T??????? GCTT 2438 (2) INFORMACIÓN PARA LA SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NO.: 22: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 609 aminoácidos (B) TIPO: aminoácidos (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: proteína 5 (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. DE IDENT , NO: 22: Thr Gly Asp Val Lys Asp Val Val Leu Leu Asp Val Thr Pro Leu Ser 355 360 365 Leu Gly lie Glu T?ir Met Gly Gly Val Phe Th Lys Leu lie Asp Ara 370 37S 380 Asn Ttir Tftr He Pro Thr S*tt Lys Ser Gln Val Phe Ser Thr Ala Ala 385 390 395 400 Asp Asn Gln Pro Ala Val Asp II* His Val Leu Gln Giy Glu Arg Pro 405 410 415 Met Ala Ala Asp Asn Lys Thr Leu Gly Arg Phe Gln Leu ?ir Asp He 15 420 425 430 Pro Ala Ala Pro Arg Gly He Pro Gln He Glu Val Thr Phe Asp He 435 440 445 20 Asp Lys Asn Gly He Val Ser Val Lys Ala Lys Asp Leu Gly T r Gln 450 455 460 Lys Glu Gln His He Val He Gln Ser Asn Ser Gly Leu -hr Asp Glu 465 470 475 480 Glu He Asp Lys Mee Met Lys Aap Ala Glu Ala ?sn Ala Glu Ala Asp 485 490 495 Ala Lys Arg Lys Glu Glu Val Asp Leu Lys Asn Glu Val Asp Gln Ala 30 SOO 505 510 He Phe Ala Thr Glu Lys Ttir He Lys Glu Thr Glu Gly Lys Gly Phe 515 S20 525 35 ?sp Thr Glu ?rg Asp ?la Ala Gln Ser Ala Leu Aßp Glu Leu Lys Lys 530 535 540 Ala Gln Glu Ser Gly Asn Leu Asp Asp Met Lyß Ala Lys Leu Glu Ala 545 550 555 560 40 Leu Asn Glu Lys Ala Gln. Ala Leu Ala Val Lys Leu Tyr Glu Gln Ala 565 570 575 Ala Ala Ala Gln Gln Ala Ala Gln Gly Ala Glu Gly Ala Gln Ser Ala 45 580 585 590 Asp Ser Ser Ser Lys Gly Asp Asp Val Val Asp Gly Glu Phe Thr Glu 595 600 605 50 Lys (2) INFORMACIÓN PARA LA SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NO.: 23 (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 19 aminoácidos (B) TIPO: aminoácidos (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: péptido (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC . DE IDENT. O : 23 ?rg He Pro ?la Val Val Glu ?la Val Lys ?la Glu Thr Gly Lys Glu 1 5 10 15 Pro ?sn Lys (2) INFORMACIÓN PARA LA SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NO: 24 (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 15 aminoácidos (B) TIPO: aminoácidos (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: péptido (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. DE IDENT. NO: 24 Gln Thr He Val He Gln Ser Asn Ser Gly Leu Thr Asp Glu Glu 1 5 10 15 (2) INFORMACIÓN PARA LA SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NO: 25 (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 460 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) HEBRA: doble (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLECULA:ADN (genómico) (iii) HIPOTÉTICA: NO (iv) ANTI- SENTIDO:NO (vi) FUENTE ORIGINAL: (A) ORGANISMO: Streptococcus pneumoniae (ix) CARACTERÍSTICAS: (A) CLAVE/ NOMBRE : CDS (B) UBICACIÓN: 1..456 (D) OTRA INFORMACIÓN : /producto=*C- terminal residuos - 151 fragmentos (C-151 ) de HSP72 * (xi ) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA : SEC . DE IDENT . NO : 25 ATG AAG GCC AAA GAC CTT GGA ACT CAA AAA GAA CAA ACT ATT GTC ATC 4 B Met Lya Al a Lys Asp Leu Gly Thr Gln Lys Glu Gln Thx lie Val lie 1 5 10 15 CAA TCG AAC TCA GGT TTG ACT GAC GAA GAA ATC GAC CGC ATG ATG AAA 96 Gln Ser A=n Ser Gly Leu Thr Asp Glu Glu lie Aap Árff Mee Mßt Lyß 20 25 30 G?T GCA GAA GCA AAC GCT GAA TCC GAT A?G AAA CGT AA? GAA GA? GTA 144 Asp Ala Glu Ala ?sn Ala Glu Ser ?sp Lys Lys ?rg Lys Glu Glu Val 35 40 45 G?C CTT CGT ?AT GAA GTG G?C CAA GCA ATC TTT QCG ACT GAA ??G ACÁ 192 Asp Leu ?rg ?sn Glu Val ?sp Gln ?la He Phß ?la tu: Glu Lys ??ir 50 55 60 ATC AAG G?? ACT G?? GGT AAA GGC TTC GAC GC? G?? COT G?C GCT OCC 240 lie Lyß Glu T- r Glu Gly Lys Gly Phe Asp ?la Glu Arg ?ap ?la ?la 65 70 75 60 C?A GCT GCC CTT GAT G?C CTT ?AG ??? GCT C?? GAA GAC ??C ??C TTG 288 Gln ?la Ala Leu Asp ?sp Leu Lys Lys ?la Gln Glu Asp ?sn Asn L«u 85 90 95 G?C G?C ATG A?? GCA AA? CTT G?? GCA TTG ??C G?? ??? GCT CA? GGA 336 Asp Asp Mee Lys ?la Lys Leu Glu Ala Leu ?sn Glu Lys ?la Gln Gly 100 105 110 CTT GCT GTT AAA CTC TAC G?? CAA GCC GC? GCA GCG CAA CAA GCT CAA 384 Lau Ala Val Lys Leu Tyr Glu Gln Ala Ala Ala Ala Gln Gln ?la Gln 115 120 125 GAA GGA GCA GAA GGC GCA CA? GC? ?CA GGA ??C GC? GGC GAT GAC GTC 432 Glu Gly ?la Glu Gly Ala Gln Ala Thr Gly Asn Ala Gly Asp ?sp Val 130 135 140 GTA GAC GGA GAG TTT ACG GAA AAG TAAG 460 Val Asp Gly Glu JPhß Thr Glu Lys 145 150 (2) INFORMACIÓN PARA LA SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NO: 26: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 150 pares de bases (B) TIPO: aminoácidos (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: pro eína (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SECUENCIA DE IDENT: NO.26 Met Lys Ala Lys Asp Leu Gly Thr GID Lys Glu Gln Thjr lie Val lie 1 5 10 15 Gln Ser Asn Ser Gly Leu T r Asp Glu Glu lie Asp ?r? Mßt Met Lye 20 25 30 Asp Ala Glu Ala Asn Ala Glu Ser ?sp Lys Lys Ar?r Ly* Glu Glu Val 35 40 45 ?sp Leu Aro Aßn Glu Val ?sp Gl_n Ala He Pbe Ala Thjr Glu Lys Ttir SO 55 eo lie Lys Glu Thr Glu Gly Lys Gly Phe Asp Ala Glu Ar?j Asp Al» Ala 65 70 75 80 Gln Ala Ala Leu Asp Asp Leu Lys Lys Ala Gln Glu Asp Asn Asn Leu 85 90 95 ?sp Asp Mßt Lys Ala Lys Leu Glu Ala Leu Asn Glu Lys Ala Gln Gly 10O 105 110 Leu Ala Val Lys Leu Tyr Glu Gln Ala Ala Ala Ala Gln aln. Ala Gln 115 120 125 Glu Gly Ala Glu Gly Ala Gln Ala Th.r Gly Asn Ala Gly Asp Asp Val 130 135 140 Val Asp Gly Glu Phß Thr Glu Lys 145 1S0

Claims (1)

1. REIVINDICACIONES 1 Un polipéptido seleccionado del grupo que consiste de (a) el polipéptido HSP72 que tiene la secuencia de aminoácido de SEC DE IDENT NO 5, (b) el polipéptido HSP70 (Dnak) que tiene la secuencia de aminoácido de SEC DE IDENT NO 20, (c) el polipéptido HSP70 (Dnak) que tiene la secuencia de aminoácido SEC DE IDENT NO 22, y (d) fragmentos de la porción C-terminal de los polipéptidos HSP70/72 2 El polipeptido de acuerdo con la reivindicación 1, en donde los fragmentos del párrafo (d) se seleccionan del grupo que consiste de los aminoácidos 439-607 de SEC DE IDENT NO 5 (C-169, aminoácidos 457-607 de SEC DE IDENT NO 5 (C-151), aminoácidos 527-541 de SEC DE IDENT NO 5 y aminoácidos 586-600 de SEC DE IDENT NO 5 3 Un polipeptido de acuerdo con la reivindicación 1 que tiene la secuencia de aminoácido de SEC DE IDENT NO 5 o análogos o derivados del mismo 4 Un polipeptido de acuerdo con la reivindicación 1 que tiene la secuencia de aminoácido de SEC DE IDENT NO 20 o análogos o derivados del mismo 5 Un polipéptido de acuerdo con la reivindicación 1, que tiene la secuencia de aminoácido de SEC DE IDENT NO 22, o análogos o derivados del mismo 6 Un polipéptido de acuerdo con la reivindicación 1, que tiene la secuencia de aminoácido de SEC DE IDENT NO 26, o análogos o derivados del mismo 7 Un polipéptido de acuerdo con la reivindicación 1, que tiene la secuencia de aminoácido de SEC DE IDENT NO 7, o análogos o derivados del mismo 8 Un polipéptido de acuerdo con la reivindicación 1, que tiene la secuencia de aminoácido de SEC DE IDENT NO 8, o análogos o derivados del mismo 9 Un polipéptido de acuerdo con la reivindicación 1, que tiene la secuencia de aminoácido de SEC DE IDENT NO 9, o análogos o derivados del mismo 10 Un pol ipéptido de acuerdo con la reivindicación 1, que tiene la secuencia de aminoácido de SEC DE IDENT NO 10, o análogos o derivados del mismo 11 Un polipéptido de acuerdo con la reivindicación 1, que tiene la secuencia de aminoácido de SEC DE IDENT NO 11, o análogos o derivados del mismo 12 Un pol ipéptid o de acuerdo con la reivindicación 1, que tiene la secuencia de aminoácido de SEC DE IDENT NO 12, o análogos o derivados del mismo 13 Un poli péptido de acuerdo con la reivindicación 1, que tiene la secuencia de aminoácido de SEC DE IDENT NO 13, o análogos o derivados del mismo 14 Un polipéptido de acuerdo con la reivindicación 1, que tiene la secuencia de aminoácido de SEC DE IDENT NO 14, o análogos o derivados del mismo 15 Un polipéptido de acuerdo con la reivindicación 1, que tiene la secuencia de aminoácido de SEC DE IDENT NO 15, o análogos o derivados del mismo 16 Un po péptido de acuerdo con la reivindicación 1, que tiene la secuencia de aminoácido de SEC DE IDENT NO 16, o análogos o derivados del mismo 17 Un pohpeptido de acuerdo con la reivindicación 1, que tiene la secuencia de aminoácido de SEC DE IDENT NO 17, o análogos o derivados del mismo 18 Un polipeptido de acuerdo con la reivindicación 1, que tiene la secuencia de aminoácido de SEC DE IDENT NO 18, o análogos o derivados del mismo 19 Un polipeptido de acuerdo con la reivindicación 1, que tiene la secuencia de aminoácido de SEC DE IDENT NO 23 o análogos o derivados del mismo 20 Un polipeptido de acuerdo con la reivindicación 1, que tiene la secuencia de aminoácido de SEC DE IDENT NO 24 o análogos o derivados del mismo 21 El polipéptido de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 20, en donde el polipéptido produce una reacción inmune que es específica a cepas Estreptococales 22 Un pohpéptido de acuerdo con la reivindicación 1, seleccionado del grupo que consiste de (a) el polipéptido HSP72 que tiene la secuencia de aminoácido de SEC DE IDENT NO 5, (b) fragmentos del polipéptido anterior, ya sea solos o en combinación con otros polipéptidos para formar una proteina de fusión 23 El polipeptido de acuerdo con la reivindicación 22, en donde los fragmentos del párrafo (b) se seleccionan del grupo que consiste de los aminoácidos 439-607 de SEQ ID No 5 (C-169), aminoácidos 527-541 de SEC DE IDENT NO 5, y aminoácidos 586-600 de SEC DE IDENT NO 5 24 El polipeptido de acuerdo con la reivindicación 22, en donde la proteina la proteina de fusión del párrafo (b) es la Isomerasa Fucosa-HSP72 (C-169) que tiene la secuencia de aminoácido de SEC DE IDENT NO 3 25 Una secuencia de ADN que es seleccionada del grupo que consiste de (a) la secuencia de ADN de HSP72 de SEC DE IDENT NO 4 (b) la secuencia de ADN de HSP70 (Dnak) SEC DE IDENT NO 21, (c) la secuencia de ADN de HSP70 (Dnak) SEC DE IDENT. NO"21, (d) las secuencias de ADN que son degeneradas a cualquiera de las secuencias de ADN anteriores, y (e) fragmentos de cualquiera de ADN anteriores, ya sea solas o en combinación con otras secuencias de ADN para formar una secuencia de ADN de fusión 26 Una secuencia de ADN de acuerdo con la reivindicación 25, que comprende la fórmula de SEC DE IDENT NO 4 del nucleótido 682 al nucleótido 2502 27 Una secuencia de ADN de acuerdo con la reivindicación 25, que comprende la fórmula de SEC DE IDENT NO 4 del nucleótido 1996 al nucleótido 2502 28 Una secuencia de ADN de acuerdo con la reivindicación 25, que comprende la fórmula de SEC DE IDENT NO 4 del nucleótido 2050 al nucleótido 2502 29 Una secuencia de ADN de acuerdo con la reivindicación 25, que comprende la fórmula de SEC DE IDENT NO 4 del nucleótido 2260 al nucleótido 2304 30 Una secuencia de ADN de acuerdo con la reivindicación 25, que comprende la fórmula de SEC DE IDENT NO 4 del nucleótido 2437 al nucleotido 2481 31 Una secuencia de ADN de acuerdo con la reivindicación 25, que comprende la formula de SEC DE IDENT NO 19 del nucleótido 204 al nucleótido 2027 32 Una secuencia de ADN de acuerdo con la reivindicación 25, que comprende la fórmula de SEC DE IDENT NO 21 del nucleótido 248 al nucleótido 2074 33 Una secuencia de ADN de acuerdo con la reivindicación 25, que comprende la fórmula de SEC DE IDENT NO 25 del nucleótido 4 al nucleótido 456 34 Una secuencia de ADN que codifica para un péptido de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-20 35 Un secuencia de ADN de acuerdo con la reivindicación 25, seleccionada del grupo que consiste de (a) la secuencia de ADN de HSP72 de SEC DE IDENT NO 4, (b) secuencias de ADN que se degeneran a las secuencia de AND anterior, (c) fragmento de cualquiera de las secuencias de AFN anteriores, ya sea solas o en combinación con otras secuencias de ADN para formar una secuencia de ADN de fusión 36 La secuencia de ADN de acuerdo con la reivindicación 35, en donde los fragmentos del párrafo (c) se seleccionan del grupo que consiste de nucleótidos 1996-2502 (aminoácidos 439-607) de SEC DE IDENT NO 4 (C-169), nucleótidos 1996-2502 (aminoácidos 439-607) de SEC DE IDENT NO 4 (C-169), nucleótidos 2260-2304 (aminoácidos 527-541) de SEC DE IDENT NO 4, y nucleotidos 2437-2481 (aminoácidos 586-600) de SEC DE IDENT NO 4 37 La secuencia de ADN de acuerdo con la reivindicación 25, en donde la secuencia de ADN de fusión del párrafo (c) es la secuencia de ADN de Isomerasa Fucosa-HSP72 (C-169) de SEC DE IDENT NO 1 (nucleótidos 771-2912) 38 Un vector de expresión que incluye por lo menos una secuencia de ADN de acuerdo con la reivindicación 35 operativamente enlazado a un promotor 39 Una molécula de ADN recombinante que comprende una secuencia de ADN de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 25 a 34, y una o más secuencias de control de expresión operativamente enlazadas a la secuencia de ADN 40 La molécula de ADN recombinante de acuerdo con la reivindicación 39, en donde la secuencia de control de expresión es un vector de expresión inducible 41 La molécula recombinante de acuerdo con la reivindicación 40, en donde el vector de expresión comprende al promotor ? PL 42 Una molécula recombinante de acuerdo con la reivindicación 39, que comprende un plasmido seleccionado a partir del grupo que consiste de pURV3, pURV4, pURV5 pURV6, PJBD291, pJBD?4, pJBDk51, pJBD171, pJBD177 pJBD179 pJBD?l, pJBDf51 y pJBDf62 43 Un huésped unicelular transformado con un vector de expresión de la reivindicación 38 44 Un huésped unicelular transformado con una molécula de ADN recombinante de la reivindicación 39 45 Un huésped unicelular de acuerdo con la reivindicación 44, en donde el huésped se selecciona del grupo que consiste de E coll cepas KLI Blue MRF', W3110 JM109, Y1090 y BL21(DE3) 46 Un método para producir un polipéptido o fragmento del mismo que comprende los pasos de cultivar el huésped unicelular de cualquiera de las reivindicaciones 43-45 y aislar el polipeptido o fragmento 47 Un polipéptido en una forma sustancialmente pura según obtenido a través del método de la reivindicación 46 48 Un anticuerpo o fragmento del mismo que específicamente se une a un polipeptido de cualquiera de las reivindicaciones 1-20 49 Un anticuerpo fragmento del mismo que se une específicamente al epitope reconocido por el anticuerpo monoclonal F1-Pn3 1 50 El anticuerpo o fragmento de acuerdo con la reivindicación 48, el cual es un anticuerpo monoclonal 51 El anticuerpo monoclonal o fragmento de la reivindicación 50, el cual es de origen mupno 52 El anticuerpo monoclonal o fragmento de acuerdo con la reivindicación 51 el cual es del tipo IgG 53 El anticuerpo monoclonal F1-Pn3 1 54. Un método para aislar el anticuerpo de acuerdo con la reivindicación 48, que comprende: (a) introducir una preparación del polipéptido de cualquiera de las reivindicaciones 1-20 a un mamífero; y (b) aislar el suero del mamífero que contiene dicho anticuerpo. 55. Un método para aislar el anticuerpo monoclonal de acuerdo con la reivindicación 50, que comprende: (a) introducir una preparación del polipéptido de cualquiera de las reivindicaciones 1-20 a las células de producción de anticuerpo de un mamífero; (b) fusionar las células de producción de anticuerpo con células de mieloma, para formar células de hibridoma; y (c) aislar el anticuerpo monoclonal de las células de hibridoma. 56. Una composición farmacéutica que comprende un polipéptido de cualquiera de las reivindicaciones 1-20. 57. La composición farmacéutica de acuerdo con la reivindicación 56, la cual es una vacuna. 58. La composición farmacéutica de acuerdo con la reivindicación 56, que comprende además uno o más excipientes farmacéuticamente aceptables. 59. Una composición farmacéutica que comprende uno o más anticuerpos o fragmentos del mismo de acuerdo con la reivindicación 48. 60. La composición farmacéutica de acuerdo con la reivindicación 59, la cual es una vacuna. 61. La composición farmacéutica de acuerdo con la reivindicación 60, que comprende además un excipiente farmacéuticamente aceptable 62. La composición farmacéutica de acuerdo con la reivindicación 60 ó 61, en donde el anticuerpo es F1-Pn3 1 63. Un método para evitar infección de un paciente a través de Streptococcus pneumoniae o bacteria relacionada que comprende la administración de una cantidad farmacéuticamente efectiva de la vacuna de las reivindicaciones 57, 60 ó 61 64 Un método para evitar la infección de un paciente por Streptococcus pneumoniae, Streptococcus pyogenes o Streptococcus agalactiae que comprende la administración de una cantidad farmacéuticamente efectiva de la vacuna de las reivindicaciones 57, 60 ó 61 65 Un método para tratar un paciente infectado con o con sospecha de ser infectado con Streptococcus pneumomae o bacteria relacionada que comprende la administración de una cantidad farmacéuticamente efectiva de la vacuna de las reivindicaciones 60 ó 61 66 Un método para la detección de Streptococcus pneumomae o bacteria relacionada en una muestra biológica, que comprende (a) incubar el anticuerpo o fragmento de la reivindicación 48 con la muestra biológica para formar una mezcla, y (b) detectar el anticuerpo específicamente unido o fragmento en la mezcla que indica la presencia de Streptococcus pneumoniae o bacteria relacionada. 67. El método de acuerdo con la reivindicación 66, en donde el anticuerpo es F1-Pn3.1. 68 Un método para la detección de anticuerpos específicos Streptococcus pneumomae o bacteria relacionada en una muestra biológica, que comprende: (a) incubar un pohpéptido de la reivindicación 2 o 22, con la muestra biológica para formar una mezcla, y (b) detectar el polipéptido específicamente unido a en la mezcla que indica la presencia de anticuerpos específicos a Streptococcus pneumomae o bacterias relacionadas 69 Un método para la detección de Streptococcus pneumoniae o bacteria relacionada en una muestra biológica, que comprende (a) incubar una sonda de ADN que tiene la secuencia de ADN de la reivindicación 35 con la muestra biológica para formar una mezcla, y (b) detectar la sonda de ADN específicamente unido en la mezcla que indica la presencia de Streptococcus pneumoniae y bacterias relacionadas 70. El método de acuerdo con la reivindicación 69, en donde la sonda de ADN es un oligómero que tiene una secuencia complementaria que tiene por lo menos 6 nucleótidos continuos de una secuencia de ADN de la reivindicación 35 71 El método de acuerdo con la reivindicación 70, que comprende además (a) proveer un juego de oligómeros, los cuales son iniciadores para el método de reacción de cadena de polimerasa y los cuales flanquean la región objetivo, y (b) amplificar la región objetivo a través del método de reacción de cadena de polimerasa 72 Un método para la detección de Streptococcus pneumoniae o Streptococcus agalactiae en una muestra biológica, que comprende (a) incubar el anticuerpo o fragmento de la reivindicación 48 con la muestra biológica para formar una mezcla, y (b) detectar el anticuerpo específicamente unido o fragmento en la mezcla que indica la presencia de Streptococcus pneumoniae, Streptococcus pyogenss o Streptococcus agalactiae 73 Un método para la detección de anticuerpos específicos Streptococcus pneumomae, Streptococcus pyogenes o Streptococcus agalactiae, en una muestra biológica que comprende (a) incubar un polipéptido de la reivindicación 1 ó 21 con una muestra biológica para formar una mezcla, y (b) detectar el polipéptido específicamente unido en la mezcla, que indica la presencia de anticuerpos específicos a Streptococcus pneumoniae, Streptococcus pyogenes o Streptococcus agalactiae 74 Un método para la detección de Streptococcus pneumomae, Streptococcus pyogenes o Streptococcus agalactiae, en una muestra biológica que comprende' (a) incubar una sonda de ADN que tiene la secuencia de ADN de la reivindicación 25 a 34 con la muestra biológica para formar una mezcla, y (b) detectar la sonda de ADN específicamente unido a la mezcla, al cual indica la presencia de Streptococcus pneumomae Streptococcus pyogenes o Streptococcus agalactiae 75 El método de acuerdo con la reivindicación 74, en donde la sonda de ADN es un oligómero que tiene la secuencia complementaria a por lo menos aproximadamente 6 nucleótidos contiguos de una secuencia de ADN de la reivindicación 25 o 34 76 El método de acuerdo con la reivindicación 75, que compren además (a) un grupo de oligómeros los cuales son iniciadores para un método de reacción de cadena de pohmerasa los cuales flanquean la región objetivo, y (b) amplificar la región objetivo de un método de reacción de cadena de pohmerasa 77 El uso de un pohpéptido de la reivindicación 1 ó 21 para propósitos profilácticos, de diagnóstico, inmunoterapeúticos o terapéuticos 78 El uso de una cantidad farmacéuticamente efectiva de un polipéptido de la reivindicación 1 ó 21 para la prevención de infección Estreptococal en seres humanos 79 El uso de un pol ipéptido de acuerdo con la reivindicación 1 ó 21, para la fabricación de un medicamento para la prevención de infecciones Estreptococal en seres humanos 80 El uso de un pohpéptido de acuerdo con la reivindicación 1 ó 21, para la fabricación de una vacuna para la prevención de infecciones Estreptococal en seres humanos 81 El uso de un pol ipéptido de acuerdo con la reivindicación 1 ó 21, para la fabricación de un equipo para la detección y el diagnóstico de infecciones Estreptococal en seres humanos 82 El uso del método de acuerdo con la reivindicación 46, para la fabricación de una vacuna para la prevención de infecciones Estreptococal en seres humanos 83 El uso del método de acuerdo con la reivindicación 46, para la fabricación de un equipo para la detección y diagnostico de infección Estreptococal en seres humanos 84 El uso de un anticuerpo de acuerdo a la reivindicación 48 ó 53 para propósitos profilácticos, de diagnostico inmunoterapeutico o terapéuticos 85 El uso de una cantidad farmacéuticamente efectiva de un anticuerpo de acuerdo con la reivindicación 48 o 53, para la prevención de infección Estreptococal en seres humanos 86 El uso de un anticuerpo de acuerdo con la reivindicación 48 ó 53, para la fabricación de un medicamento para la prevención de infección Estreptococal en seres humanos 87 El uso de un anticuerpo de acuerdo con la reivindicación 48 ó 53 para la fabricación de una vacuna para la prevención de infección Estreptococal en seres humanos 88 El uso de un anticuerpo de acuerdo con la reivindicación 48 ó 53, para la fabricación de un equipo para la detección y el diagnostico de infección Estreptococal en seres humanos 89 El uso del método de acuerdo con la reivindicación 54 o 55, para la fabricación de una vacuna para la prevención de infecciones Estreptococal en seres humanos 90 El uso de método de acuerdo con la reivindicación 54 o 55, para la fabricación de un equipo para la detección y el diagnostico de infecciones Estreptococal en seres humanos 91 El uso de una cantidad farmacéuticamente efectiva de un anticuerpo de la reivindicación 48 o 53 para el tratamiento de infección Estreptococal en seres humanos 92 El uso de un anticuerpo de acuerdo con la reivindicación 48 o 53, para la fabricación de un medicamento para el tratamiento de infección Estreptococal en seres humanos 93. El uso de una secuencia de ADN de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 25 a 34 para propósitos profilácticos, de diagnóstico, inmunoterapéuticos o terapéuticos. 94. El uso de una secuencia de ADN de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 25 a 34 para la fabricación de un equipo para la detección y el diagnóstico de infección Estreptococal en seres humanos. 95. El uso de cualquiera de las reivindicaciones 77 a 94, en donde la infección Estreptococal es causada por Streptococcus pneumoniae, Streptococcus pyogenes o Streptococcus agalactias.