ES2259792T3

ES2259792T3 - Vacuna para branhamella catarrhalis.

Info

Publication number: ES2259792T3
Application number: ES94930490T
Authority: ES
Inventors: Timothy F. Murphy
Original assignee: Research Foundation of State University of New York
Current assignee: Research Foundation of State University of New York
Priority date: 1993-09-29
Filing date: 1994-09-27
Publication date: 2006-10-16
Anticipated expiration: 2014-09-27
Also published as: EP0737085A1; JPH09503210A; EP0737085A4; FI117789B; US5712118A; DE69434681D1; WO1995009025A1; AU7959394A; FI961407A0; PT737085E; US5725862A; CA2172728A1; ATE321585T1; EP0737085B1; DK0737085T3; FI961407A; DE69434681T2; AU701340B2

Abstract

SE PRESENTAN COMPOSICIONES QUE COMPRENDEN "CD" DE LA PROTEINA DE LA MEMBRANA EXTERIOR, Y PEPTIDOS Y OLIGOPEPTIDOS DEL MISMO, DE LA "BRANHAMELLA CATARRHALIS". ADICIONALMENTE, SE HAN DESCUBIERTO SECUENCIAS DE NUCLEOTIDOS QUE CODIFICAN EL PEPTIDO DE LA PROTEINA O EL OLIGOPEPTIDOS, ASI COMO VECTORES RECOMBINANTES QUE CONTIENEN ESAS SECUENCIAS. LA PROTEINA, EL PEPTIDO O EL OLIGOPEPTIDO PUEDEN PRODUCIRSE A PARTIR DE SISTEMAS DE CELULAS ANFITRIONAS, QUE CONTIENEN ESOS VECTORES RECOMBINANTES. LOS PEPTIDOS Y LOS OLIGOPEPTIDOS TAMBIEN PUEDEN SINTETIZARSE QUIMICAMENTE. SE HAN DESCUBIERTO LOS USOS DE LA PROTEINA, LOS PEPTIDOS Y LOS OLIGOPEPTIDOS COMO ANTIGENOS PARA FORMULACIONES DE VACUNAS, Y COMO ANTIGENOS EN INMUNOENSAYOS DE DIAGNOSTICO. LAS SECUENCIAS DE NUCLEOTIDOS SON UTILES PARA LA CONSTRUCCION DE VECTORES PARA SU USO COMO VACUNAS PARA SU INSERCION EN EL INTERIOR DE BACTERIAS ATENUADAS EN LA CONSTRUCCION DE UNA VACUNA BACTERIANA RECOMBINANTE, Y PARA SU INSERCION EN EL INTERIOR DE UN VECTOR VIRALEN LA CONSTRUCCION DE UNA VACUNA VIRAL RECOMBINANTE. TAMBIEN SE DESCRIBE EL USO DE LAS SECUENCIAS DE NUCLEOTIDOS RELACIONADAS CON EL CD QUE CODIFICA EL GEN COMO INICIADORES Y/O SONDAS EN ENSAYOS DE DIAGNOSTICO MOLECULAR PARA LA DETECCION DE LA "B. CATARRHALIS".

Description

Vacuna para Branhamella catarrhalis.

Esta invención se realizó con el apoyo del gobierno bajo la concesión A128304 otorgada por the National Institutes of Health. El gobierno tiene ciertos derechos en esta invención.

Esta solicitud es una continuación en parte de la solicitud en tramitación junto con la presente previa del presente inventor Nº de Serie de los Estados Unidos 08/129.719, presentada el 29 de Septiembre de 1993, que se incorpora aquí mediante referencia.

Campo de la invención

La presente invención se refiere a composiciones que comprenden una proteína, y péptidos y oligopéptidos de la misma, asociada con la membrana externa de Branhamella catarrhalis. Más particularmente, la invención se dirige a composiciones de una proteína, y péptidos y oligopéptidos de la misma, relacionada con una proteína de membrana externa, "CD", de una masa molecular aparente de aproximadamente 55.000 a 60.000 daltons encontrada en B. catarrhalis. Además, se describen métodos para preparar CD y péptidos de CD usando técnicas de DNA recombinante y/o bioquímicas. En relación con esto, se describe la secuencia de DNA que codifica CD, y vectores recombinantes útiles para dirigir la expresión de CD y péptidos y oligopéptidos de CD, y células huésped transformadas con tales vectores recombinantes.

Las proteínas, los péptidos y los oligopéptidos se usan como inmunógenos en formulaciones de vacuna para inmunización activa; y pueden usarse para generar antisueros específicos para proteínas y específicos para péptidos útiles para inmunización pasiva, y como reactivos para ensayos diagnósticos. Las secuencias de nucleótidos descritas proporcionan la síntesis de oligonucleótidos correspondientes que pueden usarse como reactivos en ensayos diagnósticos dirigidos a la detección de material genético de B. catarrhalis, e incorporados en vectores de expresión para usar como formulaciones de vacuna genéticas.

Antecedentes de la invención

Branhamella catarrhalis (también conocida como Moraxella catarrhalis) es un patógeno importante del tracto respiratorio humano. B. catarrhalis es la tercera causa más común de otitis media en bebés y niños, después de Streptococcus pneumoniae y Haemophilus influenzae no tipificable, según se documenta en estudios en los que se ha usado la timpanocentesis para establecer el agente etiológico (Murphy, 1989, Pediatr. Infect. Dis. J. 8:S75-S77). B. catarrhalis es una causa común de sinusitis y conjuntivitis tanto en niños como en adultos (véanse, por ejemplo, Bluestone, 1986, Drugs 31:S132-S141; Brorson y otros, 1976, Scand. J. Infect. Dis. 8:151-155 y Romberger y otros, 1987, South. Med. J. 80:926-928); y es una causa importante de infecciones del tracto respiratorio inferior en adultos con bronquitis crónica y enfermedad pulmonar obstructiva crónica (Murphy y otros, 1992, Am. Rev. Respir. Dis. 146:1067-1083; Catlin, 1990, Clin. Microbiol. Rev. 3:293-320). Adicionalmente, B. catarrhalis puede provocar neumonía, endocarditis, septicemia y meningitis en huéspedes inmunocomprometidos (Cocchi y otros, 1968, Acta Paediatr. Scand. 57:451-3; Douer y otros, 1977, Ann. Intern. Med. 86:116-119; McNeely y otros, 1976, Am. Rev. Respir. Dis. 114:399-402).

Puesto que la otitis media recurrente está asociada con una morbidez substancial, existe interés en identificar estrategias para prevenir estas infecciones. Uno de tales enfoques es el desarrollo de vacunas. Una vacuna eficaz para prevenir la otitis media bacteriana necesitaría incluir antígenos que generaran protección contra infección por S. pneumoniae, H. influenzae no tipificable y B. catarrhalis. En efecto, el desarrollo de vacunas para los neumococos y H. influenzae no tipificable está progresando de modo que se han identificado antígenos potencialmente protectores y están sometiéndose a pruebas actualmente (véanse, por ejemplo, Murphy y otros, Patente de EE.UU. Nº 5.173.294 y Vella y otros, 1992, Infect. Immun. 60:4977-4983). Mientras estas vacunas se desarrollan y se usan más ampliamente, la importancia relativa de B. catarrhalis como una causa de otitis media se incrementará en la próxima década. Además de los bebés y los niños que se beneficien de una vacuna para prevenir la otitis media provocada por B. catarrhalis, los adultos con enfermedad pulmonar obstructiva crónica y los niños y adultos inmunocomprometidos se beneficiarían de una vacuna para prevenir infecciones provocadas por B. catarrhalis.

Componentes bacterianos que se han investigado como antígenos vacunales potenciales incluyen polisacáridos, lipopolisacáridos o modificadores de los mismos y proteínas de la membrana externa. En general, según se ejemplifica por el polisacárido capsular tipo b de H. influenzae, se ha observado que los antígenos polisacáricos son un inmunógeno pobre en niños por debajo de la edad de 18 meses. La inmunización activa con lipopolisacárido (LPS) es inaceptable debido a su toxicidad inherente. Los efectos patofisiológicos del LPS pueden incluir fiebre, leucopenia, leucocitosis, la reacción de Schwartzman, coagulación intravascular diseminada y, en grandes dosis, choque y muerte. En general, las proteínas son inmunogénicas en bebés de alrededor de 3 meses de edad. Así, las proteínas de la membrana externa se están investigando como posibles antígenos vacunales.

Aunque los estudios recientes han empezado a dirigirse a proteína de la membrana externa de B. catarrhalis, poco se sabe acerca de la estructura antigénica y molecular de estas proteínas. Estudios de membranas externas purificadas mediante SDS-PAGE han revelado un patrón bastante homogéneo entre cepas de la bacteria (Bartos y Murphy, 1988, J. Infect. Dis. 158:761-765). Se han identificado ocho proteínas de la membrana externa principales, denominadas mediante las letras A-H (Murphy y otros, 1989, Microbial Pathogen. 6:159-174; Bartos y otros, 1988, J. Infect. Dis. 158: 761-765). Las proteínas de la membrana externa C y D difieren ligeramente en la masa molecular aparente y así aparecen como un doblete en la electroforesis de SDS-PAGE. Se han desarrollado anticuerpos monoclonales para B. catarrhalis dando como resultado dos anticuerpos monoclonales, 7D6 y 5E8, que reconocen las proteínas tanto C como D (Sarwar y otros, 1992, Infect. Immun. 60:804-809). Antes del desarrollo de la presente invención, se desconocía si este doblete representaba una sola proteína (CD) con dos conformaciones estables o si C y D son dos proteínas estrechamente relacionadas codificadas por diferentes genes (Sarwar y otros, anteriormente). Las proteínas C y D son de interés, particularmente para el desarrollo de vacunas, debido a que estas proteínas expresan al menos un epítopo conservado sobre la superficie de B. catarrhalis intacta (Sarwar y otros, 1992,
anteriormente).

De ahí que con el reconocimiento creciente de B. catarrhalis como un patógeno bacteriano importante, exista una necesidad de una vacuna que sea inmunogénica en niños y adultos. Tal vacuna tendría que dirigirse a un componente bacteriano que tuviera un epítopo expuesto superficialmente sobre bacterias intactas, en donde el epítopo se conservaría entre cepas de B. catarrhalis.

Sumario de la invención

De acuerdo con un aspecto de la invención, se proporciona un método para producir un péptido, un oligopéptido o una proteína antigénicos aislados, que tienen uno o más epítopos de CD, en donde CD es una proteína de membrana externa de Branhamella catarrhalis de una masa molecular aparente de aproximadamente 55.000 a aproximadamente 60.000 daltons mediante SDS PAGE y que tiene una secuencia de aminoácidos como la representada en la Nº ID SEC 14, que comprende (1) formar dichos péptido, oligopéptido o proteína antigénicos recombinantemente o (2) formar dicho péptido u oligopéptido antigénicos mediante un método de síntesis de péptidos.

De acuerdo con otros aspectos de la invención, se proporcionan

-: un vector recombinante que comprende una secuencia de DNA que codifica uno o más determinantes antigénicos o epítopos de CD, en donde CD es una proteína de membrana externa de Branhamella catarrhalis de una masa molecular aparente de aproximadamente 55.000 a aproximadamente 60.000 daltons mediante SDS y PAGE y que tiene una secuencia de aminoácidos como la representada en la Nº ID SEC 14;

-: una composición útil para inmunizar pasivamente individuos que sufren una infección provocada por B. catarrhalis, comprendiendo dicha composición antisuero purificado que reconoce específicamente uno o más epítopos de CD, en donde CD es una proteína de membrana externa de B. catarrhalis de una masa molecular aparente de aproximadamente 55.000 a aproximadamente 60.000 daltons mediante SDS PAGE y que tiene una secuencia de aminoácidos como la representada en la Nº ID SEC 14 desde el residuo de aminoácido 1 al 427, produciéndose dicho antisuero contra un péptido, un oligopéptido o una proteína producidos de acuerdo con el método definido anteriormente.

-: una formulación de vacuna que comprende una molécula de ácido nucleico que codifica la proteína CD, o uno o más fragmentos génicos que codifican uno o más péptidos de CD u oligopéptidos de CD, dicha molécula de ácido nucleico está conectada operativamente con secuencias reguladoras, en donde CD es una proteína de membrana externa de Branhamella catarrhalis de una masa molecular aparente de aproximadamente 55.000 a aproximadamente 60.000 daltons mediante SDS PAGE y que tiene una secuencia de aminoácidos como la representada en el Nº ID SEC 14;

-: un microorganismo recombinante infeccioso capaz de expresar proteína CD, péptidos de CD u oligopéptidos de CD, de Branhamella catarrhalis, en donde CD es una proteína de membrana externa de Branhamella catarrhalis de una masa molecular aparente de aproximadamente 55.000 a aproximadamente 60.000 daltons mediante SDS PAGE y que tiene una secuencia de aminoácidos como la representada en el Nº ID SEC 14;

-: un método para la detección de antisueros específicos para B. catarrhalis en un fluido corporal obtenido de un individuo, que comprende producir un péptido o una proteína mediante el método definido anteriormente, obtener un fluido corporal de un individuo y usar el péptido o la proteína como un antígeno en un inmunoensayo para interactuar con y detectar antisueros específicos para B. catarrhalis en el fluido corporal, en donde CD es una proteína de membrana externa de Branhamella catarrhalis de una masa molecular aparente de aproximadamente 55.000 a aproximadamente 60.000 daltons mediante SDS PAGE y que tiene una secuencia de aminoácidos como la representada en el Nº ID SEC 14 según se define anteriormente;

-: oligonucleótidos útiles en la detección de B. catarrhalis, consistiendo dichos oligonucleótidos en secuencias de ácido nucleico que complementan y se hibridan específicamente a regiones conservadas del gen contenido dentro de la secuencia de nucleótidos del Nº ID SEC 14 o su correspondiente hebra complementaria;

\newpage

-: un método para detectar la presencia o ausencia de Branhamella catarrhalis en un espécimen clínico, en donde el método comprende las etapas de:

(a): someter a lisis las células del espécimen para liberar material genético bacteriano;

(b): poner en contacto el material genético con dos oligonucleótidos bajo condiciones adecuadas que permiten la hibridación de los oligonucleótidos al material genético, en donde un oligonucleótido se hibrida a una región de un gen contenido dentro de la secuencia de nucleótidos del Nº ID SEC 14 y el otro oligonucleótido se hibrida a una región en la correspondiente hebra complementaria;

(c): amplificar enzimáticamente una región específica de secuencia del material genético que comprende el gen y su hebra correspondiente usando los oligonucleótidos de la etapa (b) como cebadores; y

(d): detectar la presencia de secuencias amplificadas del gen y su correspondiente hebra, en donde la presencia de estas secuencias amplificadas se correlaciona con la presencia de B. catarrhalis en el espécimen; y

-: un método para la detección de Branhamella catarrhalis en un espécimen clínico, en donde el método comprende las etapas de:

(a): someter a lisis las células en un espécimen de fluido corporal para liberar material genético bacteriano;

(b): poner en contacto el material genético con una sonda oligonucleotídica sintetizada para corresponder a una región de un gen contenido dentro de la secuencia de nucleótidos de Nº ID SEC 14, o su correspondiente hebra complementaria, bajo condiciones adecuadas que permitan la hibridación del oligonucleótido al material genético; y

(c): detectar la interacción entre el espécimen y la sonda, siendo dicha interacción entre el material genético de B. catarrhalis y la sonda.

Más específicamente, la invención trata del suministro de una proteína y péptidos relacionados con una proteína de membrana externa que tiene una masa molecular aparente de aproximadamente 55.000 a 60.000 daltons de B. catarrhalis, en donde se pensaba primeramente que la proteína eran dos proteínas relacionadas, C y D, pero que a través de técnicas de DNA recombinante descritas aquí, se sabe ahora que es una proteína, CD, que es modificable térmicamente dando como resultado la apariencia de dos proteínas que difieren por migración en geles de SDS. La proteína CD y los péptidos (denominados aquí "péptidos de CD") y oligopéptidos (denominados aquí "oligopéptidos de CD") de la misma pueden usarse como inmunógenos en formulaciones de vacuna profilácticas y/o terapéuticas; o como un antígeno en inmunoensayos diagnósticos dirigidos a la detección de infección por B. catarrhalis midiendo un incremento en la concentración en suero de anticuerpo específico para B. catarrhalis. Además, la proteína CD, los péptidos de CD y los oligopéptidos de CD pueden usarse para generar anticuerpo específico para CD que puede ser útil para inmunización pasiva y como reactivos para ensayos diagnósticos dirigidos a detectar la presencia de B. catarrhalis en especímenes clínicos. Los péptidos de CD o los oligopéptidos de CD pueden obtenerse mediante síntesis química, purificación a partir de B. catarrhalis o producirse a partir de sistemas de expresión de vectores recombinantes usando las secuencias de ácido nucleico descritas aquí.

Una modalidad de la presente invención se dirige a la construcción de nuevas secuencias de DNA y vectores, incluyendo DNA plasmídico y DNA viral, tal como virus de seres humanos, virus de animales, virus de insectos o bacteriófagos, que pueden usarse para dirigir la expresión de proteína CD, péptidos de CD u oligopéptidos de CD en células huésped apropiadas a partir de las cuales pueden purificarse la proteína o los péptidos expresados.

Otra modalidad de la presente invención también proporciona métodos para la clonación molecular del gen que codifica CD y fragmentos génicos que codifican péptidos de CD u oligopéptidos de CD. Las secuencias de ácido nucleico de la presente invención pueden usarse en ensayos diagnósticos moleculares para material genético de B. catarrhalis a través de hibridación de ácidos nucleicos, e incluir la síntesis de oligonucleótidos específicos para la secuencia de CD para el uso como cebadores y/o sondas al amplificar ácidos nucleicos y detectar los amplificados.

Adicionalmente, la proteína CD, los péptidos de CD y los oligopéptidos de CD pueden usarse como inmunógenos en formulaciones de vacuna profilácticas y/o terapéuticas contra cepas patógenas de B. catarrhalis, ya se sintetice químicamente el inmunógeno, se purifique a partir de B. catarrhalis o se purifique a partir de un sistema vectorial de expresión recombinante. Alternativamente, el gen que codifica CD o uno o más fragmentos génicos que codifican péptidos de CD u oligopéptidos de CD pueden incorporarse a una vacuna bacteriana o viral que comprende bacteria o virus recombinante que se manipula para producir uno o más epítopos inmunogénicos de CD por sí mismo, o en combinación con epítopos inmunogénicos de otros microorganismos patógenos. Además, el gen que codifica CD o uno o más fragmentos génicos que codifican péptidos de CD u oligopéptidos de CD, conectados operativamente a uno o más elementos reguladores, pueden introducirse directamente en seres humanos para expresar proteína CD, péptido de CD u oligopéptidos de CD para provocar una respuesta inmunitaria protectora.

Breve descripción de las figuras

La Fig. 1 representa un mapa del plásmido pCD-1, construido a partir de pET11b y un fragmento de 2,4 kb que contiene el gen que codifica CD. La región sombreada representa el inserto de DNA y la región sombreada más espesa representa el gen de CD. Las abreviaturas usadas son como sigue: Ap: región de codificación de resistencia a ampicilina; Lac: operón lac; pb: pares de bases.

La Fig. 2 representa un mapa del plásmido pCD-2, construido a partir de pGEM7zf- y un fragmento de 1,5 kb que contiene el gen que codifica CD. La región sombreada representa el inserto de DNA y la región sombreada más espesa representa el gen que codifica CD. Las abreviaturas usadas son como sigue: Ap: región de codificación de resistencia a ampicilina; Lac: operón lac; pb: pares de bases.

La Fig. 3 representa un ensayo de inmunotransferencia con lisados de células enteras de: carril a: E. coli HB101 transformada con pGEM7zf-; carril b: E. coli HB101 transformada con pCD-2 que contiene el gen que codifica CD; y carriles c y d: cepa de B. catarrhalis 25240. Los carriles b y c contienen cantidades similares de proteína (\sim20 \mug) mientras que el carril d contiene menos proteína para mostrar el doblete característico de CD. Las muestras se incubaron a 100ºC durante 10 minutos en tampón de muestra que contenía Tris 0,06 M, dodecilsulfato sódico al 1,2%, glicerol al 12% y \beta-mercaptoetanol al 5,8%. La inmunotransferencia se reveló con anticuerpo 5E8 que reconoce un epítopo sobre la proteína CD. Los marcadores de la masa molecular se apuntan a la izquierda en miles de daltons.

La Fig. 4 representa un ensayo de transferencia Southern en el que DNA genómico purificado de 13 cepas de B. catarrhalis se cortó con EcoRI y se sondeó con dos oligonucleótidos etiquetados correspondientes a la secuencia del gen de CD. La flecha que indica la banda de 3,7 kilobases representa un fragmento aguas arriba del sitio EcoRI dentro del gen que codifica CD y la flecha que indica la banda de 325 pares de bases representa el fragmento aguas abajo del sitio EcoRI. Los carriles contienen DNA de las siguientes cepas de izquierda a derecha: 105, 112, 135, ,3, 6, 10, 20, 27, 31, 40, 42, 45, 56.

La Fig. 5 representa un ensayo de transferencia Southern en el que DNA genómico purificado de 14 cepas de B. catarrhalis se cortó con EcoRI y PstI y se sondeó con un oligonucleótido etiquetado correspondiente a la secuencia entre los sitios EcoRI y PstI dentro del gen que codifica CD. Los carriles contienen DNA de las siguientes cepas de izquierda a derecha: 555, 556, 3583, 3614, 4223, 4629, 5193, 6951, 9925, 25240, M3, M3, M9.

La Fig. 6 representa un gel de tricina-dodecilsulfato sódico teñido con azul de Coomassie. Carril A: CD purificada. Carril B: CD purificada segmentada con bromuro de cianógeno. Las flechas indican los fragmentos resultantes de la segmentación con bromuro de cianógeno (los tamaños calculados de estos fragmentos aparecen en la Tabla 2). La banda doble por debajo del fragmento grande en el carril B es un resultado de la disociación proteolítica no específica de la proteína que se observa frecuentemente con CD. Los marcadores de la masa molecular se apuntan a la derecha en miles de daltons.

Descripción detallada de la invención

La presente invención se dirige a la producción y el uso de composiciones de una proteína de la membrana externa bacteriana, y péptidos de la misma, de B. catarrhalis en donde la proteína se ha denominado "CD". Usando SDS-PAGE, la proteína CD migra como un doblete de dos bandas, característico de una proteína modificable térmicamente, con una masa molecular aparente de aproximadamente 55.000 a 60.000 daltons. Según se indica por una secuencia de nucleótidos de la presente invención (Nº ID SEC 14), el gen que codifica CD revela que la secuencia de aminoácidos predicha de la proteína CD madura tiene una masa molecular calculada de aproximadamente 45.788 daltons. La proteína CD, los péptidos de CD y los oligopéptidos de CD de la presente invención pueden producirse usando métodos de DNA recombinante según se ilustra aquí, o pueden sintetizarse químicamente a partir de la secuencia de aminoácidos descrita en la presente invención. Adicionalmente, los péptidos pueden producirse a partir de segmentación enzimática o química de la proteína natural. La proteína CD, los péptidos de CD y los oligopéptidos de CD con un epítopo o epítopos inmunogénicos pueden usarse como inmunógenos en diversas formulaciones de vacuna en la prevención de otitis media, sinusitis, conjuntivitis e infecciones del tracto respiratorio inferior provocadas por B. catarrhalis. Adicionalmente, de acuerdo con la presente invención, la proteína CD y los péptidos de CD producidos pueden usarse para generar antisueros específicos para B. catarrhalis útiles para la inmunización pasiva contra infecciones provocadas por B. catarrhalis.

La presente invención proporciona además la secuencia de nucleótidos del gen que codifica CD, así como la secuencia de aminoácidos deducida del gen aislado. De acuerdo con una modalidad de la presente invención, usando técnicas de DNA recombinante, el gen que codifica CD, o los fragmentos génicos que codifican uno o más péptidos de CD que tienen un epítopo o epítopos inmunogénicos, se incorpora en un vector de expresión y el vector de expresión se introduce en una célula huésped apropiada dirigiendo de ese modo la expresión de estas secuencias en esa célula huésped particular. El sistema de expresión, que comprende el vector recombinante introducido en la célula huésped, puede usarse (a) para producir proteína CD, péptidos de CD y oligopéptidos de CD que pueden purificarse para usar como un inmunógeno en formulaciones de vacuna; (b) para producir proteína CD, péptidos de CD y oligopéptidos de CD para ser usados como un antígeno para inmunoensayos diagnósticos o para generar antisueros específicos para B. catarrhalis de valor terapéutico y/o diagnóstico; (c) o si el vector de expresión recombinante es un virus vivo tal como virus vacunal, el propio vector puede usarse como una preparación de vacuna viva o inactivada que ha de introducirse en las células huésped para la expresión de CD o péptidos de CD u oligopéptidos de CD inmunogénicos; (d) para la introducción en células bacterianas atenuadas vivas que se usan para expresar proteína CD, péptidos de CD u oligopéptidos de CD para vacunar individuos; (e) o para la introducción directamente en un individuo para inmunizar contra la proteína CD, el péptido de CD o el oligopéptido de CD codificados y expresados.

Para los propósitos de la descripción, los métodos y los compuestos de la presente invención se ilustrarán en las siguientes modalidades:

Modalidad A - Clonación molecular y secuenciación del gen que codifica CD y vectores que expresan epítopos de CD;

Modalidad B - Conservación del gen que codifica CD contra cepas de B. catarrhalis;

Modalidad C - Métodos para usar secuencias de nucleótidos específicas para CD en ensayos diagnósticos moleculares para la detección de B. catarrhalis;

Modalidad D - Caracterización de CD incluyendo generación de péptidos de CD;

Modalidad E - Métodos para usar CD o péptidos de CD en inmunoensayos diagnósticos;

Modalidad F - Métodos y compuestos para formulaciones de vacuna relacionadas con CD y péptidos de CD.

Modalidad A

Clonación molecular y secuenciación del gen que codifica CD, y vectores que expresan epítopos de CD

La estrategia usada era aislar DNA genómico de B. catarrhalis, segmentar el DNA aislado en fragmentos, construir una biblioteca genómica que comprende la inserción de los fragmentos en un vector de expresión, introducir los vectores recombinantes en la célula huésped apropiada e inmunorrastrear con respecto a clones de la célula huésped que expresan epítopos específicos para CD usando antisueros específicos para CD. Se usó Branhamella catarrhalis cepa 25240, obtenida de the American Type Culture Collection (ATCC), como la fuente de DNA genómico bacteriano. Se hizo crecer B. catarrhalis sobre placas de agar de chocolate a 37ºC en CO_{2} al 5% o en caldo de infusión de cerebro-corazón. Se usó Escherichia coli (E. coli) Y1090 como la cepa huésped para la biblioteca genómica del bacteriófago lambda gt11. Dependiendo de las circunstancias, E. coli se hizo crecer en caldo LB o sobre agar LB que contenía 50 \mug/ml de ampicilina. Anticuerpos monoclonales usados para inmunorrastrear clones incluían 5E8 y 7D6 que reconocen diferentes epítopos sobre la proteína de membrana externa CD de B. catarrhalis (Sarwar y otros, anteriormente). El anticuerpo 5E8 es una IgM y reconoce un epítopo que está expuesto sobre la superficie de la bacteria intacta. El anticuerpo 7D6 es una IgG2a y se une a un epítopo que no es accesible sobre la superficie bacteriana.

Se construyó una biblioteca de lambda gt11 con DNA genómico de B. catarrhalis 25240 usando métodos previamente descritos (Nelson y otros, 1988, Infect. Immun. 56:128-134). Fragmentos de DNA genómico de 2 a 8 kilobases (kb) de tamaño se eluyeron de un gel de agarosa y se ligaron a brazos del fago. Una porción de la biblioteca se introdujo en E. coli Y1090 y las calvas resultantes se transfirieron sobre discos de nitrocelulosa y se inmunorrastrearon con los anticuerpos monoclonales 5R8 y 7D6. Después de la incubación con los anticuerpos monoclonales durante la noche, los discos se incubaron con conjugado de proteína A-peroxidasa y anti-(IgM de ratón)-peroxidasa, con revelado de substrato subsiguiente, para identificar calvas inmunorreactivas. El rastreo de un total de aproximadamente 554.000 calvas daba un clon que contenía un inserto de 387 pares de bases que expresaba los epítopos reconocidos por los anticuerpos 7D6 y 5E8. El análisis de la secuencia de nucleótidos del inserto contenido dentro de este clon mostraba un marco de lectura abierto sin codones de inicio o parada (Nº ID SEC 1). La secuencia de nucleótidos de este clon corresponde a los nucleótidos 775-1160 del Nº ID SEC 14 que contiene toda la secuencia génica que codifica CD. El péptido producido por este clon, según se muestra en el Nº ID SEC 1, corresponde a los aminoácidos 203-331 en la proteína madura representada en el Nº ID SEC 14.

Puesto que varias rondas de rastro de la biblioteca genómica de lambda gt11 daban un pequeño fragmento del gen de CD, se construyó una biblioteca de EMBL3 con DNA genómico de B. catarrhalis 25240 con tamaños de inserto de aproximadamente 9 a 23 kb. Esta biblioteca se inmunorrastreó con los anticuerpos monoclonales 5E8 y 7D6. La biblioteca genómica de EMBL3 se construyó con métodos conocidos en la especialidad (Ausubel y otros, 1989, Current Protocols in Molecular Biology, publicado por John Wiley and Sons) y de acuerdo con las recomendaciones del fabricante (Stratagene, LaJolla, CA). Brevemente, DNA genómico de B. catarrhalis 25240 se purificó usando SDS, proteinasa K y CTAB. El DNA genómico purificado se digirió parcialmente con Sau3A para generar fragmentos de tamaño variable. Los fragmentos de DNA se separaron mediante centrifugación en gradiente de sacarosa sobre un gradiente de sacarosa del 10 al 40%. Las fracciones que contenían fragmentos de aproximadamente 0 a 23 kilobases de tamaño se desfosforilaron usando fosfatasa alcalina de ternero y se precipitaron con etanol para preparar para la ligazón a los brazos de EMBL3. Aproximadamente 0,7 \mug de estos fragmentos de DNA genómico se ligaron a 1 \mug de brazos de EMBL3 usando DNA ligasa de T4. Los brazos del fago y los insertos ligados se empaquetaron en el fago y la concentración de la biblioteca se determinó cultivando en placas sobre E. coli P2392, la cepa huésped para la biblioteca genómica de lambda EMBL3. La biblioteca genómica de EMBL3 se inmunorrastreó con los anticuerpos monoclonales 5E8 y 7D6 según se describe anteriormente.

El inmunorrastreo de aproximadamente 3500 calvas de la biblioteca de EMBL daba una sola calva reactiva, denominada clon 5. El clon purificado se ensayó con los anticuerpos 5E8 y 7D6 individualmente y era reactivo con ambos anticuerpos. Experimentos de control mostraban que los conjugados de peroxidasa con proteína A y anti-(IgM de ratón) no se unían a las calvas del clon 5.

El DNA fágico del clon 5 se purificó y se digirió con Sall para cortar el inserto. La electroforesis en gel de agarosa revelaba que el clon 5 tenía un inserto de 13 kb. El inserto se digirió con varias enzimas de restricción y se realizó un ensayo de transferencia Southern. La transferencia se sondeó con un oligonucleótido correspondiente a la secuencia de DNA del fragmento de 387 pb del gen de CD recuperado de la biblioteca de lambda gt11. Se determinó que el gen que codifica CD está situado hacia un fragmento Ncol-Sall de 2,4 kb. El fragmento de 2,4 kb se subclonó en el sitio BamH1 de pET11b (Novagen, Madison, WI) ligando conectores BamH1 en el inserto después de que sus extremos se hicieran romos con DNA polimerasa de Klenow. El plásmido resultante, que contenía un inserto de 2,4 kb, se denominó pCD1 (Fig. 1). El plásmido pET11b y el pCD1 recombinante se propagaron en E. coli HB101 sobre agar LB que contenía 50 \mug/ml de ampicilina. Un lisado de células enteras de transformantes que contenían pCD1 se sometió a SDS-PAGE y ensayo de inmunotransferencia con los anticuerpos 7D6 y 5E8. Los resultados indican que pCD1 codifica una proteína CD de longitud completa que es reactiva con ambos anticuerpos.

La secuenciación didesoxi de ambas hebras de 1727 pb del inserto de 2,4 kb de pCD1 se realizó con la ayuda de oligonucleótidos adicionales sintetizados para corresponder a la secuencia a intervalos apropiados dentro del inserto, tal como se representa mediante los Nº ID SEC 2-13. Se identificó (Nº ID SEC 14) un marco de lectura abierto de 453 aminoácidos, que representa una proteína de 48.277 daltons. Estaba presente un fuerte terminador transcripcional empezando 54 pb aguas abajo del codón de parada.

La masa molecular calculada de la proteína madura (45.788 daltons) difería significativamente de la masa molecular aparente de OMP CD observada en SDS-PAGE (60.000 ó 55.000 daltons en forma reducida o no reducida, respectivamente). Por lo tanto, se construyó un plásmido que contiene el marco de lectura abierto sin secuencia aguas abajo para determinar si la expresión del marco de lectura daría una proteína CD de tamaño completo. Un sitio Clal se sitúa 48 pb aguas abajo del marco de lectura abierto. Un fragmento de DNA BamHl-Clal de 1558 pb que contenía el gen de CD putativo se subclonó en pGEM7zf- (Promega Corp., Madison, WI) al construir el nuevo plásmido pCD2 (Fig. 2). Mediante ensayo de inmunotransferencia, mostrado en la Fig. 3 (carril b), transformantes de E. coli que contienen pCD2 expresan una proteína CD de tamaño completo. Además, el ensayo de inmunotransferencia muestra que el producto del gen de CD migra como un doblete (carril b), indicando que ambas bandas representan productos de un solo gen en lugar de representar dos proteínas relacionadas producidas mediante sus genes respectivos.

Así, esta secuencia ilustra que las secuencias de nucleótidos que codifican CD o porciones de la misma pueden insertarse en y expresarse mediante diversos vectores incluyendo vectores fágicos y plásmidos. La expresión satisfactoria de la proteína y los péptidos requiere que el inserto que comprende el gen o el fragmento génico, o el propio vector, contenga los elementos necesarios para la transcripción y la traducción que es compatible con y reconocida por el sistema huésped particular usado para la expresión. DNA que codifica proteína CD, péptidos de CD u oligopéptidos de CD puede sintetizarse o aislarse y someterse a secuenciación usando los métodos y las secuencias cebadoras que se ilustran de acuerdo con las presente Modalidades A, B y D. Puede utilizarse una variedad de sistemas huésped para expresar proteína CD, péptidos de CD u oligopéptidos de CD, que incluyen, pero no se limitan a, bacterias transformadas con un vector bacteriofágico, un vector plasmídico o DNA cosmídico; levaduras que contienen vectores de levadura, hongos que contienen vectores fúngicos; líneas de células de insecto infectadas con virus (por ejemplo, baculovirus); líneas celulares de mamífero transfectadas con vectores de expresión plasmídicos o virales o infectadas con virus recombinante (por ejemplo, virus vacunal, adenovirus, virus adenoasociado, retrovirus, etc.).

Usando métodos conocidos en la especialidad de la biología molecular, incluyendo los métodos descritos anteriormente, diversos promotores y potenciadores pueden incorporarse al vector o la secuencia de DNA que codifica secuencias de aminoácidos de CD, es decir proteína CD de la membrana externa, péptido de CD u oligopéptido de CD recombinantes, para incrementar la expresión de las secuencias de aminoácidos de CD, con tal de que la expresión incrementada de las secuencias de aminoácidos de CD sea compatible con (por ejemplo, atóxica para) el sistema de células huésped particular usado. Así y de forma importante, la secuencia de DNA puede consistir en el gen que codifica proteína CD o cualquier segmento del gen que codifica un epítopo funcional de la proteína CD. Además, el DNA puede fusionarse a DNA que codifica otros antígenos, tales como otras proteínas de la membrana externa bacterianas u otros antígenos bacterianos, fúngicos, parasíticos o virales para crear un antígeno multivalente genéticamente fusionado (que comparte una cadena principal peptídica común) para usar como una composición de vacuna
mejorada.

La selección del promotor dependerá del sistema de expresión usado. Los promotores pueden variar en intensidad, es decir, capacidad para facilitar la transcripción. Generalmente, con el propósito de expresar un gel clonado, es deseable usar un promotor fuerte para obtener un alto nivel de transcripción del gen y expresión como producto génico. Por ejemplo, promotores bacterianos, fágicos o plasmídicos conocidos en la especialidad de los que se ha observado un alto nivel de transcripción en un sistema que comprende E. coli incluyen el promotor lac, promotor trp, promotor recA, promotor de RNA ribosómico, los promotores P_{R} y P_{L}, lacUV5, ompF, bla, lpp y similares y pueden usarse para proporcionar transcripción de la secuencia de DNA insertada que codifica secuencias de aminoácidos de CD.

Adicionalmente, si la proteína CD, los péptidos de CD o los oligopéptidos de CD pueden ser letales o perjudiciales para las células huésped, la cepa/línea de células huésped y los vectores de expresión pueden elegirse de modo que la acción del promotor se inhiba hasta que se induzca específicamente. Por ejemplo, en ciertos operones la adición de inductores específicos es necesaria para la transcripción eficaz del DNA insertado (por ejemplo, el operón lac es inducido mediante la adición de lactosa o isopropiltio-beta-D-galactósido). Una variedad de operones tales como el operón trp está bajo diferentes mecanismos de control. El operón trp se induce cuando está ausente el triptófano en el medio de crecimiento. El promotor P_{L} puede inducirse mediante un incremento en la temperatura de las células huésped que contienen un represor lambda sensible a la temperatura. De este modo, más de 95% de la transcripción dirigida por promotor puede ser inhibido en células no inducidas. Así, la expresión de proteína CD, péptidos de CD u oligopéptidos de CD recombinantes pueden controlarse cultivando células transformadas o transfectadas bajo condiciones tales que no se induzca el promotor que controla la expresión a partir del DNA insertado que codifica secuencias de aminoácidos de CD, y cuando las células alcanzan una densidad adecuada en el medio de crecimiento, el promotor puede inducirse para la expresión a partir del DNA
insertado.

Otros elementos de control para la transcripción génica o la traducción de mensajes eficaz incluyen potenciadores y señales reguladoras. Secuencias potenciadoras son elementos de DNA que parecen incrementar la eficacia transcripcional de una manera relativamente independiente de su posición y orientación con respecto a un gen próximo. Así, dependiendo del sistema vectorial de expresión de células huésped usado, un potenciador puede ponerse aguas arriba o aguas abajo de las secuencias de DNA insertadas que codifican secuencias de aminoácidos de CD para incrementar la eficacia transcripcional. Según se ilustra previamente en esta modalidad, se han identificado otras secuencias reguladoras específicas que pueden efectuar la expresión a partir del gen que codifica CD. Estos y otros sitios reguladores, tales como señales de iniciación de la transcripción o la traducción, pueden usarse para regular la expresión del gen que codifica CD, o fragmentos génicos del mismo. Tales elementos reguladores pueden insertarse en secuencias de DNA que codifican secuencias de aminoácidos de CD o secuencias de DNA vectorial próximas usando métodos de DNA recombinante descritos aquí para la inserción de secuencias de DNA.

De acuerdo con esto, secuencias de nucleótidos de B. catarrhalis que contienen regiones que codifican para proteína CD, péptidos de CD u oligopéptidos de CD pueden ligarse en un vector de expresión en un sitio específico en relación con los elementos promotores, de control y reguladores del vector de modo que cuando el vector recombinante se introduzca en la célula huésped, las secuencias de DNA específicas para CD de B. catarrhalis puedan expresarse en la célula huésped. Por ejemplo, las secuencias de DNA específicas para CD que contienen sus propios elementos reguladores pueden ligarse en un vector de expresión en una relación u orientación con el promotor vectorial y los elementos de control que permitirán la expresión de secuencias de aminoácidos de CD. El vector recombinante se introduce a continuación en las células huésped apropiadas, y las células huésped se seleccionan y se rastrean con respecto a aquellas células que contienen el vector recombinante. La selección y el rastreo pueden efectuarse mediante métodos conocidos en la especialidad, incluyendo detectar la expresión de un gen marcador (por ejemplo, marcador de resistencia a fármacos) presente en el plásmido, inmunorrastreo para la producción de epítopos específicos para CD usando antisueros generados para epítopos específicos para CD y sondeo del DNA de las células del huésped con respecto a secuencias de nucleótidos específicas para CD usando uno o más oligonucleótidos y métodos descritos de acuerdo con la presente Modalidad C.

También pueden usarse técnicas de ingeniería genética para caracterizar, modificar y/o adaptar los péptidos de CD o la proteína CD codificados. Por ejemplo, la mutagénesis dirigida al sitio para modificar un fragmento de proteína de la membrana externa en regiones fuera de los dominios protectores puede ser deseable para incrementar la solubilidad del subfragmento para permitir una purificación más fácil. Además, pueden usarse técnicas de ingeniería genética para generar secuencias de DNA que codifican una porción de la secuencia de aminoácidos de CD. Por ejemplo, a partir de la secuencia descrita como Nº ID SEC 14, puede determinarse qué enzima de restricción o combinación de enzimas de restricción puede usarse para generar secuencias que codifican péptidos de CD u oligopéptidos de CD. La selección de enzimas de restricción puede realizarse a fin de no destruir la inmunopotencia del péptido u oligopéptido resultante. Los sitios antigénicos de una proteína pueden variar de tamaño pero pueden consistir en de aproximadamente 7 a aproximadamente 14 aminoácidos. Así, una proteína del tamaño de CD puede contener muchos sitios antigénicos discretos; por lo tanto, muchas secuencias génicas parciales podrían codificar epítopos antigénicos de CD. Por consiguiente, usando, por ejemplo, el Nº ID SEC 14 como una guía, pueden usarse combinaciones de enzimas de restricción para generar secuencias de DNA, que cuando se insertan en el vector apropiado son capaces de dirigir la producción de secuencias de aminoácidos específicas para CD (proteína, péptidos u oligopéptidos) que comprenden uno o más epítopos antigénicos.

Modalidad B

Conservación del gen que codifica CD entre cepas de B. catarrhalis

Para que las secuencias de nucleótidos de la presente invención sean útiles en ensayos diagnósticos, el gen que codifica CD debe estar altamente conservado entre cepas de B. catarrhalis. Además, un gen altamente conservado indica que la secuencia proteínica también está altamente conservada. Para que una proteína o un péptido bacteriano sean útiles como un antígeno en formulaciones de vacuna subunitarias contra la infección provocada por B. catarrhalis, la proteína o el péptido debe contener epítopos que tanto sean inmunogénicos como estén conservados entre cepas de B. catarrhalis. Para determinar el grado de conservación del gen de CD entre cepas de B. catarrhalis, DNA genómico se purificó y se analizó a partir de 30 aislados recuperados de diversas fuentes clínicas y geográficas (Tabla 1). El análisis implicaba restringir el DNA en fragmentos y sondear con un oligonucleótido de una secuencia que incluye, pero no se limita a, las representadas por los Nº ID SEC 2-13.

TABLA 1

Fuentes de aislados de Branhamella catarrhalis

Sitio Clínico	Número de Aislados

Esputo	15
fluido del oído medio^{1}	7
nasofaringe	6
ojo	2
adenoides	1
sangre	1
ATCC^{2}	1
1 El fluido del oído medio se obtuvo mediante timpanocentesis.
2 American Type Culture Collection.

El DNA genómico procedente de 30 cepas (incluyendo 25240) de B. catarrhalis se purificó. Un volumen de 30 ml de caldo de infusión de cerebro-corazón se inoculó con una sola colonia y se incubó a 37ºC con agitación durante la noche. Las células se recogieron mediante centrifugación a 2200 x g durante 10 minutos a 4ºC. Las células nodulizadas se suspendieron en 7 ml de tampón TE (Tris 0,01 M, pH 8, EDTA 0,001 M, pH 8,0). Se añadió EDTA hasta 0,005 M y se añadió SDS hasta 0,5%. La suspensión se incubó a 60ºC durante 10 minutos. Se añadió proteinasa K hasta 200 \mug/ml seguido por incubación a 37ºC durante aproximadamente 24 horas. La muestra se extrajo secuencialmente con volúmenes iguales de fenol, seguido por fenol/cloroformo en una relación 1:1, seguido por cloroformo. Se añadió un volumen de 10% de acetato sódico 3 M (pH 5,2) y el DNA se precipitó mediante la adición de etanol frío equivalente a 80% del volumen. El DNA genómico precipitaba y se retiró (sorbiendo) con una pipeta de Pasteur. El DNA se lavó en etanol al 70% y se disolvió en Tris 0,05 M, pH 8,0. Se añadió RNasa hasta una concentración final de 40 \mug/ml y la muestra se incubó a 37ºC durante 30 minutos. Se añadió EDTA hasta una concentración de 0,001 M. La muestra se extrajo secuencialmente con fenol y cloroformo y se precipitó con etanol. El DNA purificado se disolvió en Tris 0,1 M, EDTA 0,1 mM, pH 8,0.

Una parte alícuota equivalente a 10 \mug de DNA se digirió con EcoRI o PstI con un volumen de reacción de 0,5 ml. Los fragmentos de DNA resultantes se separaron mediante electroforesis en gel de agarosa y se transfirieron a una membrana de nitrocelulosa cargada mediante transferencia Southern. Las transferencias Southern se sondearon con dos sondas oligonucleotídicas correspondientes a secuencias aguas arriba y aguas abajo del sitio EcoRI dentro del gen que codifica CD (este sitio EcoRI se representa en la Fig. 1). Los oligonucleótidos se habían etiquetado en el extremo con [^{32}P]ATP usando polinucleótido quinasa de T4 antes de usarse como sondas. Las hibridaciones se llevaron a cabo a 37ºC y los lavados se realizaron a 48ºC. Los tampones de hibridación y lavado se describieron previamente (Nelson y otros, anteriormente). La autorradiografía se realizó a -70ºC.

Las 30 cepas producían un patrón de bandas idéntico, incluyendo una banda de 325 pb que representaba el fragmento entre el sitio EcoRI dentro del gen y el sitio justo aguas abajo del gen. Además, las 30 cepas mostraban una banda de 3,7 kb que representaba un fragmento aguas arriba del gen de CD. Este patrón se ejemplifica mediante la Fig. 4 que muestra el ensayo de transferencia Southern de 13 cepas.

Para analizar adicionalmente la conservación molecular del gen de CD, DNA genómico de las mismas 30 cepas se digirió con EcoRI y PstI y se sondeó con oligonucleótidos. La Figura 1 muestra que el gen que codifica CD, aislado de la cepa 25240, tiene un sitio PstI cerca del centro del gen y que la digestión con EcoRI y PstI dará un fragmento de DNA de 337 pares de bases. Los ensayos de transferencia Southern mostraban que el DNA genómico de las 30 cepas de B. catarrhalis daba un fragmento de 337 pb idéntico que se hibridaba con un oligonucleótido correspondiente a la secuencia en el gen que codifica CD aislado de la cepa 25240. Este patrón se ejemplifica mediante la Fig. 5 que muestra el ensayo de transferencia Southern de 13 cepas. Estos hallazgos indican que el gen que codifica CD está altamente conservado entre cepas de B. catarrhalis y por lo tanto las secuencias de nucleótidos descritas aquí tienen aplicaciones para uso diagnóstico y como vacuna.

\newpage

Modalidad C

Métodos para usar secuencias de nucleótidos específicas para CD en ensayos diagnósticos moleculares para la detección de B. catarrhalis

Debido a la conservación del gen que codifica CD, según se describe en la Modalidad B, las secuencias de ácidos nucleicos de la presente invención pueden usarse en ensayos diagnósticos moleculares para detectar material genético de B. catarrhalis. En particular, pueden sintetizarse oligonucleótidos específicos para secuencias de CD para usar como cebadores y/o sondas para amplificar ácidos nucleicos de B. catarrhalis y detectar los amplificados. Avances recientes en la biología molecular han proporcionado varios medios para amplificar enzimáticamente secuencias de ácido nucleico. Actualmente, el método más comúnmente usado, PCR™ (reacción en cadena de la polimerasa, Cetus Corporation) implica el uso de polimerasa de Taq, secuencias conocidas como cebadores y ciclos de calentamiento que separan las hebras de ácido desoxirribonucleico (DNA) replicantes y amplifican exponencialmente un gen de interés. Otros métodos de amplificación actualmente bajo desarrollo incluyen LCR™ (reacción en cadena de la ligasa, BioTechnica International) que utiliza DNA ligasa y una sonda que consiste en dos mitades de un segmento de DNA que es complementario a la secuencia del DNA que ha de amplificarse; enzima QB replicasa (Gene-Trak Systems) y una plantilla de una secuencia de ácido ribonucleico (RNA) enlazada a una sonda complementaria al DNA que ha de copiarse que se usa para elaborar una plantilla de DNA para la producción exponencial de RNA complementario; y NASBA™ (amplificación basada en secuencias de ácidos nucleicos, Cangene Corporation) que puede realizarse sobre RNA o DNA como la secuencia de ácido nucleico que ha de amplificarse.

Sondas de ácido nucleico que son capaces de hibridación con secuencias génicas específicas se han usado satisfactoriamente para detectar patógenos específicos en especímenes biológicos a niveles de sensibilidad que se aproximan a 10^{3}-10^{4} organismos por espécimen (1990, Gene Probes for Bacteria, eds. Macario y deMacario, Academic Press). Acopladas con un método que permite la amplificación de secuencias de DNA diana específicas, sondas de ácido nucleico específicas para una especie pueden incrementar mucho el nivel de sensibilidad para detectar organismos en un espécimen clínico. El uso de estas sondas puede permitir la detección directa sin basarse en técnicas de cultivo y/o identificación bioquímica convencional previas. Esta modalidad de la presente invención se dirige a cebadores que amplifican secuencias específicas para la especie del gen que codifica CD de B. catarrhalis, y a sondas que se hibridan específicamente con estos fragmentos de DNA amplificados. Usando las secuencias de ácido nucleico de la presente invención y de acuerdo con los métodos de la presente invención, tan poco como un organismo de B. catarrhalis puede detectarse en presencia de 10 \mug/ml de DNA extraño.

Esta modalidad se dirige a oligonucleótidos específicos para la especie que pueden usarse para amplificar secuencias de DNA de B. catarrhalis, si están presentes, a partir de DNA extraído de especímenes clínicos incluyendo fluido del oído medio, esputo, sangre y fluidos de la nasofaringe, el ojo y las adenoides; y para determinar subsiguientemente si se ha producido la amplificación. En una modalidad de la presente invención, un par de cebadores oligonucleotídicos de DNA específicos para B. catarrhalis se usa para hibiridarse a DNA genómico de B. catarrhalis que puede estar presente en DNA extraído de un espécimen clínico, y para amplificar el segmento específico de DNA genómico entre dos cebadores de flanqueo usando síntesis enzimática y ciclación de temperatura. Cada par de cebadores se diseña para hibiridarse solo a las secuencias de nucleótidos de B. catarrhalis de la presente invención para las que se han sintetizado para complementar; uno para cada hebra del DNA de doble hebra. Así, la reacción es específica incluso en presencia de cantidades de microgramos de DNA heterólogo. Para los propósitos de esta descripción, el cebador derivado de la secuencia de la hebra positiva (génica) positiva de DNA se denominará el "cebador positivo" y el cebador derivado de la secuencia negativa (complementaria) se denominará el "cebador negativo".

La amplificación de DNA puede efectuarse mediante uno cualquiera de los métodos disponibles comercialmente. Por ejemplo, la reacción en cadena de la polimerasa puede usarse para amplificar el DNA. Una vez que los cebadores se han hibridado a hebras opuestas del DNA diana, la temperatura se eleva para permitir la replicación del segmento específico de DNA a través de la región entre los dos cebadores mediante una DNA polimerasa termoestable. A continuación, la reacción se termocicla de modo que en cada ciclo la cantidad de DNA que representa las secuencias entre los dos cebadores se doble y resulte la amplificación específica de las secuencias de DNA de B. catarrhalis, si están presentes. La identificación adicional del fragmento de DNA amplificado, que está derivado de DNA de B. catarrhalis, puede efectuarse mediante hibridación líquida. Esta prueba utiliza uno o más oligonucleótidos etiquetados como sondas para hibiridarse específicamente al segmento amplificado de DNA de B. catarrhalis. La detección de la presencia de DNA amplificado específico para la secuencia puede efectuarse usando uno cualquier de varios métodos conocidos en la especialidad tales como un ensayo de retardo en gel con autorradiografía. Así, la secuencia de nucleótidos de la presente invención proporciona una base para la síntesis de oligonucleótidos que tienen aplicaciones comerciales en estuches diagnósticos para la detección de B. catarrhalis. En una modalidad relacionada, los oligonucleótidos usados como cebadores pueden etiquetarse directamente o sintetizarse para incorporar la etiqueta. Dependiendo de la etiqueta usada, los productos de amplificación pueden detectarse a continuación, después de unirse sobre una matriz de afinidad, usando detección isotópica o colorimétrica.

El DNA puede extraerse de especímenes clínicos que pueden contener B. catarrhalis usando métodos conocidos en la especialidad, por ejemplo, las células contenidas en el espécimen pueden lavarse en tampón TE y nodulizarse mediante centrifugación. Las células pueden resuspenderse a continuación en 100 \mul de tampón de reacción de amplificación que contiene detergentes y proteinasa K. Usando la reacción en cadena de la polimerasa, la muestra resultante puede estar compuesta por las células en Tris 10 mM, pH 8,3, KCl 50 mM, MgCl_{2} 1,5 mM, gelatina al 0,01%, NP40™ al 0,45%, Tween 20™ al 0,045% y 60 \mug/ml de proteinasa K. La muestra se incuba en un baño de agua a 55ºC durante 1 hora. Después de la incubación, la muestra se incuba a 95ºC durante 10 minutos para inactivar térmicamente la proteinasa K. La muestra puede amplificarse a continuación de acuerdo con el protocolo para la reacción en cadena de la polimerasa según se indica posteriormente.

El DNA de B. catarrhalis puede amplificarse usando uno cualquiera de varios protocolos para amplificar ácidos nucleicos mediante la reacción en cadena de la polimerasa. En un modo de esta modalidad, el gen que codifica CD se amplificó a partir de 25 aislados clínicos de B. catarrhalis usando las siguientes condiciones: el DNA que había de amplificarse (\approx 1 \mug de DNA genómico) se distribuyó en tubos Microfuge de 0,5 ml y el volumen se ajustó hasta 50 \mul añadiendo una mezcla de reacción que comprendía dNTPs (dATP, dCTP, dGTP, dTTP) 0,2 mM, 0,25 \mug de cada cebador oligonucleotídico positivo y negativo, una unidad de polimerasa de TaqI, tampón TaqI 10x (5 \mul), MgCl_{2} 1 mM (concentración final) y agua destilada estéril para alcanzar el volumen total. La polimerasa de TaqI se añade a la mezcla de reacción justo antes del uso y se mezcla suavemente, sin turbulencia. Una capa de aceite mineral, aproximadamente 2 gotas, se añade a cada tubo y a continuación los tubos se ponen en el ciclador térmico. De treinta a y treinta y cinco ciclos son generalmente suficientes para la amplificación del DNA bacteriano. Un ciclo consiste en 1 minuto a 95ºC, 1 minuto a 37ºC y 1 minuto a 72ºC. El primer ciclo incluye una incubación de 1½ minuto a 95ºC para asegurar la desnaturalización completa.

Oligonucleótidos útiles como cebadores o sondas que se hibridan específicamente al gen que codifica CD de B. catarrhalis y se usan en la amplificación y/o la detección de DNA pueden sintetizarse bioquímicamente, usando métodos conocidos en la especialidad, a partir de las secuencias de nucleótidos descritas en la presente invención. La especificidad de los oligonucleótidos para B. catarrhalis puede verificarse mediante una búsqueda en una base de datos de un banco de genes (Genbank) para cada secuencia individual. En general, los oligonucleótidos deben seleccionarse con respecto a un bajo contenido de G-C. Pares de cebadores que se han usado para esta modalidad para amplificar el gen entero que codifica CD incluyen el Nº ID SEC 15 (cebador negativo) y el Nº ID SEC 16 (cebador positivo). Pares de cebadores usados para amplificar la porción del gen que codifica los epítopos 5E8 y 7D6 incluyen el Nº ID SEC 17 (cebador negativo) y el Nº ID SEC 18 (cebador positivo).

Con propósitos de detección, los oligonucleótidos de la presente invención pueden etiquetarse en el extremo con un radioisótopo. Secuencias de sonda, internas a los dos cebadores usados para la amplificación de la secuencia génica, pueden etiquetarse en el extremo usando polinucleótido quinasa de T_{4} y gamma-^{32}P-ATP. Veinte pmoles de DNA de sonda en tampón de quinasa (Tris 50 mM, pH 7,6, MgCl_{2} 10 mM, ditiotreitol 5 mM, espermidina 0,1 mM-HCl, EDTA 0,1 mM, pH 8,0) se mezclan con 120 \muCi de gamma-^{32}P-ATP y se incuban a 37ºC durante 1 hora. La sonda etiquetada se separa de la etiqueta no incorporada sobre un gel de acrilamida al 8% recorrido durante 1 hora a 200 voltios en tampón de Tris-borato-EDTA (TBE) a temperatura ambiente. La sonda etiquetada se localiza en primer lugar exponiendo el gel de acrilamida a película de rayos X durante tres minutos. El autorradiograma resultante se sitúa a continuación bajo el gel y la banda que contiene la sonda etiquetada se corta del gel. La tira de gel se pulveriza en un mililitro de agua destilada estéril y la sonda se eluye mediante incubación en agitador durante la noche a 37ºC. La sonda eluida se separa de los fragmentos de gel mediante centrifugación usando una columna preparativa de cromatografía. La radiactividad de la sonda se determina, contando un microlitro de la sonda etiquetada sobre un filtro de fibra de vidrio, mediante centelleo de líquidos. Tales secuencias de sonda pueden elegirse de cualquiera de las secuencias identificadas como Nº ID SEC 2-13 con tal de que la secuencia de la sonda sea interna a los dos cebadores usados para la amplificación de la secuencia de nucleótidos deseada descrita en la presente invención.

Métodos alternativos conocidos en la especialidad pueden usarse para mejorar la detección de secuencias diana amplificadas de acuerdo con las composiciones y los métodos de la presente invención. La sensibilidad de detección de las secuencias de DNA amplificadas puede mejorarse sometiendo las secuencias a hibridación líquida. Métodos alternativos de detección conocidos en la especialidad, además de la electroforesis en gel y la electroforesis en gel con hibridación Southern y autorradiografía, que pueden usarse con las composiciones y los métodos de la presente invención incluyen: digestión mediante enzimas de restricción con electroforesis en gel; hibridación por transferencia en forma de ranura con una sonda oligonucleotídica etiquetada; amplificación con un cebador radioetiquetado con electroforesis en gel, hibridación Southern y autorradiografía; amplificación con un cebador radioetiquetado con transferencia de gotas y autorradiografía; amplificación con oligonucleótidos que contienen etiquetas de afinidad (ejemplo biotina, o un cebador que incorpora biotina y el otro cebador con una secuencia específica para una proteína que se une a DNA) seguido por detección en un ensayo basado en afinidad (ejemplo, ELISA); y amplificación con oligonucleótidos que contienen fluoróforos seguido por detección de fluorescencia.

Una modalidad de detección no isotópica implica incorporar biotina en los cebadores oligonucleotídicos de la presente invención. El grupo 5'-amino de los cebadores puede biotinilarse con sulfo-NHS-biotina, o puede incorporarse biotina directamente en el cebador sintetizando el cebador en presencia de dNTPs etiquetados con biotina. Los cebadores etiquetados no isotópicos se usan a continuación al amplificar DNA a partir de un espécimen clínico. La detección con respecto a la presencia o ausencia de secuencias diana amplificadas puede efectuarse capturando las secuencias diana amplificadas usando una matriz de afinidad que tiene avidina unida a la misma, seguido por incubación con un conjugado de avidina que contiene una enzima que puede usarse para visualizar el complejo con revelado de substrato subsiguiente. Alternativamente, las secuencias diana amplificadas pueden inmovilizarse mediante hibridación a las sondas correspondientes de la secuencia diana en donde las sondas se han fijado a una matriz. La detección puede efectuarse usando un conjugado de avidina que contiene una enzima que puede usarse para visualizar el complejo con revelado del substrato subsiguiente.

Modalidad D

Caracterización de CD, incluyendo la generación de péptidos de CD

Para confirmar que se ha identificado el gen que codifica CD, se determinó el extremo amino de la proteína CD. Para identificar el extremo amino de la proteína CD, membrana externa purificada de B. catarrhalis 25240 se sometió a SDS-PAGE y se transfirió a membrana de poli(difluoruro de vinilideno) mediante transferencia electroforética. La banda de CD se cortó y la secuencia aminoterminal de la proteína se determinó mediante degradación de Edmund, analizándose los aminoácidos mediante un microsecuenciador. La secuencia aminoterminal, G-V-T-V-S-P-L-L-L-G, correspondía a los aminoácidos 27 a 36 del marco de lectura abierto de pCD1, indicando que CD tiene un péptido líder de 26 aminoácidos. Un péptido líder de 26 aminoácidos hidrófobo es característico de OMPs bacterianas cuyos péptidos líder son segmentados por peptidasa de señal I (Oliver, 1985, Ann. Rev. Microbiol. 39:615-648).

Para establecer adicionalmente que se había identificado el gen que codifica CD, la secuencia de aminoácidos deducida de la secuencia génica se analizó con respecto a la presencia de residuos de metionina para predecir el resultado de la segmentación de la proteína con bromuro de cianógeno. El marco de lectura abierto correspondiente a la proteína madura contiene 4 metioninas, indicando que la segmentación con bromuro de cianógeno daría 5 fragmentos. La segmentación con bromuro de cianógeno de CD se efectuó purificando membrana externa (Murphy y otros, 1989, Infect. Immun. 57:2938-2941) y sometiendo la preparación de membrana externa a SDS-PAGE. El gen es tiñó con negro de amido de modo que la banda de CD pudiera visualizarse y cortarse del gen. Las rodajas de gel (3-4 mm de longitud) se pusieron en los tubos de un electroeluidor con bicarbonato amónico 0,05 M, SDS al 0,1%. La proteína se eluyó, a 10 mA por tubo, hasta que las rodajas de gel estaban completamente libres de negro de amido (aproximadamente 5 horas). La proteína eluida se recogió y una parte alícuota de 0,6 ml se precipitó mediante la adición de 2 ml de etanol frío. La muestra se centrifugó y el nódulo se secó al aire. Un volumen de 0,4 ml de bromuro de cianógeno (200 mg/ml) en ácido fórmico al 70% se añadió al nódulo y la muestra y se incubó durante la noche a temperatura ambiente en la oscuridad. Una muestra de control simultánea se incubó en ácido fórmico al 70% bajo condiciones idénticas. Al día siguiente se añadió 1 ml de agua y las muestras se liofilizaron. Los péptidos liofilizados se suspendieron en tampón de muestra y se sometieron a electroforesis en gel de tricina.

La Tabla 2 muestra el tamaño de los fragmentos (péptidos de CD) predichos por los sitios de metionina en el marco de lectura abierto. La Figura 6 muestra los fragmentos reales obtenidos a partir del tratamiento con bromuro de cianógeno de CD purificada, según se determina mediante el sistema de gel de tricina-poliacrilamida de Lesse y otros (1990, J. Immunol. Methods 126:109-117). Los tamaños predicho y real de los fragmentos segmentados con bromuro de cianógeno están muy de acuerdo con la excepción del gran fragmento procedente de la región aminoterminal de la proteína.

TABLA 2 Fragmentos de segmentación con bromuro de cianógeno de proteína de membrana externa CD de Branhamella catarrhalis

\dotable{\tabskip\tabcolsep\hfil#\hfil\+#\hfil\+\hfil#\hfil\tabskip0ptplus1fil\dddarstrut\cr}{
 Masa molecular ^{1}  predicha \+  \hskip4cm  \+ Masa
molecular medida\cr   a partir de la secuencia génica ^{2}   \+
\+  a partir de SDS-PAGE ^{3}  \cr  34.919 \+
\+  \sim  50.000\cr  4.408 \+  \+ 4.900\cr  3.593 \+ \+ 4.000\cr 
2.450 \+ \+ 2.500\cr 
358\+\+\cr}


1	Las masas moleculares se apuntan en daltons.
2	Véase el Nº ID SEC 14 para la secuencia de nucleótidos.
3	\begin{minipage}[t]{145mm} SDS-PAGE: Electroforesis en gel de poliacrilamida en presencia de dodecilsulfato sódico. Véase la Figura 6 para los geles de tricina. \end{minipage}

Así, el marco de lectura abierto identificado en pCD1 representa todo el gen que codifica CD y la proteína se comporta aberrantemente en SDS-PAGE. Esta discrepancia entre la masa molecular predicha y la masa molecular observada en SDS-PAGE parece deberse a una región rica en prolina en el fragmento grande obtenido con bromuro de cianógeno en la región aminoterminal de la proteína ya que una variedad de otras proteínas ricas en prolina demuestran esta característica (Postle y otros, 1983, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 50:5235-5239; Woods y otros, 1989, Mol. Microbiol. 3(1):43-48 y Thole y otros, 1990, Infect. Immun. 58:80-87).

Una búsqueda de bases de datos de secuencias describía que la secuencia del gen de CD comparte homología con los genes de OprF de la especie Pseudomonas. La proteína CD contiene una región (aminoácidos 240-280) que es rica en prolina, alanina y valina. Esta secuencia comparte homología con la proteína TonB de E. coli y Serratia marcescens.

Modalidad E

Métodos para usar CD o péptidos de CD en inmunoensayos diagnósticos

La proteína CD, los péptidos de CD y los oligopéptidos de CD pueden purificarse para usar como inmunógenos en formulaciones de vacuna y como antígenos para ensayos diagnósticos o para generar antisueros específicos para B. catarrhalis de valor terapéutico y/o diagnóstico. La proteína CD de B. catarrhalis o los oligopéptidos o péptidos de la misma, o la proteína CD recombinante, los péptidos de CD recombinantes o los oligopéptidos de CD recombinantes producidos a partir de un sistema vectorial de expresión pueden purificarse con métodos conocidos en la especialidad, incluyendo extracción con detergente, cromatografía (por ejemplo, intercambio iónico, afinidad, inmunoafinidad o columnas de dimensionamiento), centrifugación diferencial, solubilidad diferencial u otras técnicas estándar para la purificación de proteínas.

1) Por ejemplo, una preparación parcialmente purificada, que contiene proteínas de membrana externa bacterianas, puede prepararse como sigue. Cultivos de B. catarrhalis procedentes de 30 placas de agar de chocolate se rascaron en 25 ml de PBS, pH 7,2, y se recogieron mediante centrifugación a 12.000 x g durante 20 minutos a 4ºC. El nódulo bacteriano se resuspendió en 10 ml de acetato sódico 1 M-\beta-mercaptoetanol 0,001 M (pH 4,0). Se añadió un volumen de 90 ml de una solución que contenía Zwittergent Z 3-14 (Calbiochem-Behring) al 5% y CaCl_{2} al 0,5% y la suspensión se mezcló durante 1 hora a temperatura ambiente. Los ácidos nucleicos se precipitaron mediante la adición de 25 ml de etanol frío y centrifugación subsiguiente a 17.000 x g durante 10 minutos a 4ºC. Las proteínas restantes se precipitaron mediante la adición de 375 ml de etanol frío y se recogieron mediante centrifugación a 17.000 x g durante 20 minutos a 4ºC. Los nódulos se dejaron secar y a continuación se suspendieron en 10 ml de tampón detergente que contenía Zwittergent al 0,05%, Tris 0,05 M, EDTA 0,01 M, pH 8,0, y se mezcló durante 1 hora a temperatura ambiente. Las proteínas de membrana externa bacterianas están presentes en la fracción soluble del tampón detergente después de la centrifugación a 12.000 x g durante 10 minutos a 4ºC.

La inmunopurificación de la proteína CD de una preparación de proteína de membrana externa puede efectuarse usando métodos conocidos en la especialidad para la cromatografía de inmunoafinidad. Anticuerpos monoclonales específicos para CD, tales como 5E8 y 7D6, pueden conectarse a una matriz cromatográfica para formar una matriz de afinidad. La preparación de proteína de membrana externa se incuba a continuación con la matriz de afinidad dejando que los anticuerpos se unan a CD. La matriz de afinidad se lava a continuación para retirar componentes no unidos y CD se eluye a continuación de la matriz de afinidad dando como resultado una preparación purificada de proteína CD. La CD purificada puede usarse como un antígeno para ensayos diagnósticos o puede segmentarse químicamente o enzimáticamente en péptidos, según se ilustra en la Modalidad D. Alternativamente, pueden sintetizarse péptidos de CD usando la secuencia de aminoácidos deducida del gen que codifica CD como una referencia.

2) En otra ilustración de esta modalidad, se purificó CD recombinante de un plásmido de expresión de polihistidina. Para purificar CD recombinante mediante este método, el gen que codifica CD se clonó en un vector de expresión de polihistidina tal como el plásmido pRSETA (Invitrogen Corporation), de modo que durante la expresión varios residuos de histidina ("cola de polihistidina") se enlacen al extremo amino de la proteína CD. Un fragmento BamHI que contiene el gen que codifica CD se ligó en el vector de expresión que se había restringido previamente con BamHI y subsiguientemente se trató con fosfatasa intestinal de ternero. La mezcla de ligación se usó para someter a electroporación células de E. coli cepa BL21 (DE3) y los transformantes se analizaron con respecto a plásmidos recombinantes que contenían el gen que codifica CD en la orientación apropiada con respecto al promotor plasmídico. Uno de tales clones, denominado pCDSA, se aisló y también se observó que expresaba proteína CD cuando se introducía en la cepa huésped de E. coli.

La CD recombinante se purificó como sigue. Un volumen de 15 ml de un cultivo de transformantes que contienen pCDSA se hizo crecer durante la noche en caldo de LB-ampicilina a 37ºC. A la mañana siguiente, 135 ml de caldo se inocularon con el cultivo nocturno y se hicieron crecer durante 1 hora a 37ºC. Las células se recuperaron mediante centrifugación a 5.000 x g durante 10 minutos a 4ºC. Las células se resuspendieron en 10 ml de tampón de lisis de guanidinio (hidróxido de guanidina 6 M, fosfato sódico 20 mM, cloruro sódico 500 mM, pH 7,8). La suspensión se mezcló durante 10 minutos a temperatura ambiente. Las células se sometieron a sonicación a continuación con 3 impulsos de 5 segundos cada uno usando un sonificador en la graduación Nº 4. La mezcla se centrifugó a 3.000 x g durante 15 minutos a 4ºC y el sobrenadante se apartó. El sobrenadante se mezcló a continuación durante 10 minutos a temperatura ambiente con 1,6 ml de una resina (por ejemplo, ProBond™, Invitrogen) que, a través de níquel sobre la resina, se une a la cola de polihistidina de la proteína CD recombinante. La resina se aisló a continuación mediante centrifugación.

La proteína CD se eluyó de la resina lavando en primer lugar la resina dos veces con 4 ml de tampón de lavado desnaturalizante (urea 8 M, fosfato sódico 20 mM, cloruro sódico 500 mM, pH 7,8). La resina se lavó a continuación 2 veces con volúmenes de 4 ml de tampón de lavado desnaturalizante a pH 6,0. Esto fue seguido por lavado de la columna dos veces con volúmenes de 4 ml de tampón de lavado desnaturalizante a pH 4,0. Se recogieron fracciones de 1 ml cada una y se dializaron frente a solución salina tamponada con fosfato (PBS) que contenía un detergente (Triton X-100 al 0,1%). El análisis de la proteína CD eluida mediante electroforesis en gel y tinción con azul de Coomassie revelaba una sola banda. Se estima que este método da como resultado una preparación de proteína CD que está purificada al 95%. La proteína CD recombinante purificada resultante es inmunorreactiva con anticuerpos monoclonales que reconocen proteína CD natural.

3) En otra ilustración de esta modalidad, proteína CD natural se purificó de B. catarrhalis. Aislado O35E de B. catarrhalis se hizo crecer en caldo de Mueller-Hinton durante 24 horas a 36ºC. Las bacterias se recogieron a continuación mediante centrifugación a 4.000 x g durante 20 minutos. Los nódulos bacterianos se suspendieron en tampón de pH 7,0 que contenía fosfato 0,01 M y cloruro sódico 0,64 M. Las bacterias resuspendidas se sometieron a turbulencia vigorosamente durante 2 minutos y a continuación se centrifugaron a 30.000 x g durante 20 minutos. El sobrenadante, que contenía vesículas de membrana externa, se apartó y se dializó frente a una solución que contenía Tris 10 mM, NaCl 10 mM y EDTA 1 mM. Después de la diálisis, se añadió un detergente (Triton X-100) hasta una concentración de 1,0% y el dializado se incubó a continuación durante 1 hora a temperatura ambiente para solubilizar las proteínas. El material insoluble se retiró mediante centrifugación a 10.000 x g durante 10 minutos. El sobrenadante se cargó en una columna de intercambio iónico. La columna se lavó con un tampón de Tris 10 mM, Triton X-100 al 1% (pH 8,0) y la proteína se eluyó con el tampón que contenía NaCl 50 mM o NaCl 100 mM. El paso subsiguiente de la preparación de proteína eluida sobre una columna de filtración en gel, que se había equilibrado con el tampón, daba preparaciones de proteína que estaban libres de otras proteínas detectables mediante tinción con azul brillante de Coomassie de geles de SDS-PAGE, y libres de lipooligosacáridos mediante tinción con plata de geles de SDS-PAGE.

4) Según se usa a lo largo de la memoria descriptiva, los oligopéptidos de CD se definen aquí como una serie de péptidos correspondientes a una porción de la secuencia de aminoácidos de la proteína CD según se describe en el Nº ID SEC 14 que se sintetizan como uno o se conectan químicamente. Tales péptidos u oligopéptidos pueden sintetizarse usando uno de los varios métodos de síntesis de péptidos conocidos en la especialidad, incluyendo síntesis de péptidos sólida estándar usando terc-butiloxicarbonil-aminoácidos ((Mitchell y otros, 1978, J. Org. Chem. 43:2845-2852), usando 9-fluorenilmetiloxicarbonil-aminoácidos sobre un soporte de poliamida (Dryland y otros, 1986, J. Chem. So. Perkin Trans. I, 125-137); mediante síntesis de pepscano (Geysen y otros, 1987, J. Immunol. Methods 03:259; 1984, Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 81:3998); mediante síntesis de péptidos en fase líquida estándar; o mediante sistemas de vectores de expresión recombinantes. La modificación de los péptidos u oligopéptidos, tal como mediante deleción y substitución de aminoácidos (e incluyendo extensiones y adiciones a aminoácidos) y de otros modos, puede realizarse a fin de no restar valor a las propiedades inmunológicas del péptido u oligopéptido. En particular, la secuencia de aminoácidos de la proteína CD, o el péptido u oligopéptido de la misma, puede alterarse reemplazando uno o más aminoácidos con aminoácidos funcionalmente equivalentes dando como resultado una alteración que es silenciosa en términos de una diferencia observada en el comportamiento fisicoquímico de la proteína, el péptido o el oligopéptido. Los aminoácidos funcionalmente equivalentes se conocen en la especialidad como aminoácidos que están relacionados y/o tienen polaridad o carga similar. Así, una secuencia de aminoácidos que es substancialmente aquella de las secuencias de aminoácidos representadas en el presente Listado de Secuencias se refiere a una secuencia de aminoácidos que contiene substituciones con aminoácidos funcionalmente equivalentes sin cambiar la función biológica primaria de la proteína, el péptido o el oligopéptido.

5) En una ilustración de la producción de péptidos de CD que contienen epítopos de CD, regiones definidas de la proteína CD se expresaron en un sistema de expresión en el que el vector de expresión plasmídico (pGEX2T) dirige la síntesis de polipéptidos extraños en E. coli como péptidos de fusión con glutationa-S-transferasa (GST), una proteína de 26 kilodaltons procedente de Schistosoma japonicum. En este modo de la modalidad, y usando pCD2 como la plantilla, regiones seleccionadas del gen que codifica CD se amplificaron mediante la reacción en cadena de la polimerasa usando oligonucleótidos correspondientes a las secuencias mostradas en la Tabla 3. La Tabla 3 también muestra las posiciones de aminoácidos de los péptidos, con relación a la proteína CD madura según se ilustra en el Nº ID SEC 14, según se codifica mediante los constructos peptídicos. Los oligonucleótidos se diseñaron de modo que el fragmento génico amplificado resultante contuviera un sitio de restricción BamH1 en su extremo 5' y un sitio de restricción EcoR1 en el extremo 3' de modo que el fragmento amplificado pudiera clonarse direccionalmente en pGEX2T. La secuencia de cada plásmido recombinante se confirmó mediante secuenciación didesoxi. Para purificar cada péptido de CD recombinante, el plásmido recombinante respectivo que contenía el fragmento génico se transformó en E. coli JM109. El transformante se hizo crecer en 400 ml de caldo LB que contenía 25 \mug/ml de ampicilina añadiendo 40 ml de un cultivo nocturno a 360 ml de caldo e incubando durante 1,5 horas a 37ºC con agitación. Se añadió IPTG hasta 0,01 mM y el cultivo se incubó durante 3 horas adicionales. Las células se centrifugaron a 5.000 x g y el nódulo celular se resuspendió en 5 ml de PBS. Las células se sometieron a sonicación y la mezcla se centrifugó a 10.000 x g durante 10 minutos. El sobrenadante se mezcló con 0,5 ml de cuentas de glutationa-agarosa prehinchadas. Después de mezclar durante 2 minutos a temperatura ambiente, las cuentas (con péptido de fusión unido a la glutationa) se lavaron dos veces adicionales con PBS que contenía Triton-X-100 al 1%. Las cuentas se lavaron a continuación una vez en Tris 0,05 M, pH 8,0. Para segmentar el péptido de CD de la glutationa-S-transferasa, las cuentas lavadas se incubaron en trombina humana al 0,25% (concentración final) en tampón de Tris durante 1 hora a temperatura ambiente. Un inhibidor de proteasa, PMSF, se añadió a continuación hasta una concentración de 100 \mug/ml. Las cuentas se retiraron mediante centrifugación y el sobrenadante contenía péptido de CD purificado. Los ensayos de inmunotransferencia afirmaban que los péptidos de fusión eran inmunorreactivos, aunque en grados variables, con antisuero policlonal de conejo específico para CD.

TABLA 3

Clon	Posiciones de aminoácidos	Oligonucleótidos
Px1	1-105 (Nº ID SEC 19)	Nº ID SEC 20-21
Px106	106-202 (Nº ID SEC 22)	Nº ID SEC 23-24
Px203	203-261 (Nº ID SEC 25)	Nº ID SEC 26-27
Px261L	261-331 (Nº ID SEC 28)	Nº ID SEC 29-30
Px261	261-301 (Nº ID SEC 31)	Nº ID SEC 29 y 32
Px286L	286-311 (Nº ID SEC 33)	Nº ID SEC 34-35
Px286	286-301 (Nº ID SEC 36)	Nº ID SEC 34 y 37
Px293	293-303 (Nº ID SEC 38)	Nº ID SEC 39-40
Px295	295-311 (Nº ID SEC 41)	Nº ID SEC 42-43
Px311	311-331 (Nº ID SEC 44)	Nº ID SEC 45-46
Px332	332-390 (Nº ID SEC 47)	Nº ID SEC 48-49
Px391	391-427 (Nº ID SEC 50)	Nº ID SEC 51-52

Pueden usarse proteína CD, péptidos de CD y oligopéptidos de CD purificados como antígenos en inmunoensayos para la detección de antisueros específicos para Branhamella catarrhalis presentes en el fluido corporal de un individuo que se sospecha que tiene una infección provocada por B. catarrhalis. Los fluidos corporales incluyen, pero no se limitan a, fluido del oído medio, esputo, sangre y fluidos de la nasofaringe, el ojo y las adenoides. La detección de CD o péptidos de CD como un antígeno en inmunoensayos incluye cualquier inmunoensayo conocido en la especialidad, incluyendo, pero no limitados a, radioinmunoensayo, ensayo de inmunoabsorción con enzimas ligadas (ELISA), ensayo tipo "sándwich", reacción con precipitina, ensayo de aglutinación, inmunoensayo fluorescente e inmunoensayo basado en quimioluminiscencia.

Modalidad F

Métodos y compuestos para formulaciones de vacuna relacionadas con CD y péptidos

Esta modalidad de la presente invención es para proporcionar proteína CD y/o péptidos u oligopéptidos de la misma, que han de usarse como inmunógenos en una vacuna profiláctica y/o terapéutica para inmunización activa para proteger contra o tratar infecciones provocadas por B. catarrhalis. Con propósitos de vacuna, un antígeno de B. catarrhalis que comprende una proteína bacteriana debe ser inmunogénico e inducir anticuerpos funcionales dirigidos a uno o más epítopos expuestos superficialmente sobre bacterias intactas, en donde el epítopo o los epítopos se conservan entre cepas de B. catarrhalis.

En una ilustración de la proteína CD que tiene las propiedades deseables de un antígeno vacunal, la proteína se purificó a partir de B. catarrhalis usando el método descrito aquí en la Modalidad E, Ejemplo 3. Se inmunizaron ratones con la proteína CD purificada (25 \mug) con adyuvante (20 \mug de QS21) dos veces a intervalos de cuatro semanas. Sangre de los ratones inmunizados se extrajo 32 días después de la última inmunización y los sueros inmunes se reunieron. Los sueros inmunes reunidos se ensayaron contra bacterias enteras (B. catarrhalis cepa O35E) mediante un ensayo de inmunoabsorción con enzimas ligadas (ELISA). Para el ELISA de células enteras, cultivos nocturnos de bacterias se recogieron mediante una torunda de algodón y se suspendieron en PBS hasta una absorbancia de 0,1 a 600 nm. Partes alícuotas (100 \mul) de la suspensión bacteriana se añadieron a los pocillos de una placa de microvaloración de 96 pocillos y se secaron durante la noche a temperatura ambiente. Las placas se bloquearon con 100 \mul de gelatina al 0,1% (p/v) en PBS. Esta, y todas las incubaciones restantes, eran durante 1 hora a temperatura ambiente a no ser que se especifique otra cosa. La solución de bloqueo se retiró y 100 \mul de los sueros inmunes, diluidos en PBS con gelatina al 0,1% (p/v), se añadieron a los pocillos y se incubaron. Después de lavar tres veces con PBS, los anticuerpos unidos se detectaron incubando con 100 \mul de proteína G recombinante conjugada con fosfatasa alcalina (1:1500 en PBS con gelatina al 0,1% (p/v)). Las placas se lavaron y el revelado del color se facilitó mediante la adición de 100 \mul/pocillo de fosfato de p-nitrofenilo (2 mg/ml en dietanolamina). Después de 30 minutos, la reacción se detuvo añadiendo 50 ml de NaOH 3 M. La absorbancia se leyó a 492 nm usando un lector de ELISA. Las valoraciones de los puntos finales se determinaron como la inversa de la dilución a la que la absorbancia era mayor que la de los pocillos del blanco. Los resultados, dados en la Tabla 4, demuestran que la inmunización con proteína CD puede promover anticuerpos que pueden unirse a uno o más epítopos expuestos superficialmente sobre B. catarrhalis intacta.

TABLA 4 Valoración de suero contra la cepa O35E

Suero	Valoración del punto final
control preinmune	<50
sueros inmunes (anti-CD)	7.800

Una evidencia adicional que apoya la inmunogenicidad de la proteína CD viene de un estudio de la respuesta inmunitaria humana a proteínas de la membrana externa de B. catarrhalis, en el que 11 de 13 pacientes con infecciones bien documentadas provocadas por B. catarrhalis tenía IgG para CD en sus sueros convalecientes (no publicado). Los 13 pacientes incluían 6 niños con otitis media y 7 adultos con infecciones broncopulmonares debidas a B. catarrhalis.

En otra ilustración de que la proteína CD posee propiedades deseables de un antígeno vacunal, se demostró que la proteína CD es la diana de anticuerpos bactericidas generados a partir de la inmunización con proteína CD. Por ejemplo, se produjo antisuero policlonal para proteína CD en un conejo inmunizando con proteína CD subcutáneamente. Preparaciones de membrana externa de B. catarrhalis se sometieron a SDS-PAGE y las bandas del gel correspondientes a CD se cortaron y a continuación la proteína CD se purificó mediante elución desde las rodajas de gel de poliacrilamida. Un conejo se inmunizó el día 0 con 40 \mug de proteína CD en adyuvante incompleto de Freund, el día 14 con 90 mg de proteína CD en adyuvante incompleto de Freund y el día 28 con 60 \mug de proteína CD en adyuvante incompleto de Freund. El antisuero resultante se probó con respecto a su actividad bactericida contra la cepa 4223NC de B. catarrhalis. Las bacterias se hicieron crecer hasta la fase logarítmica en caldo de infusión de cerebro-corazón (BHI). Una parte alícuota del cultivo bacteriano se diluyó hasta 5 x 10^{4} unidades formadoras de colonias (CFU) por ml en albúmina de suero bovino al 10% en una solución salina equilibrada. La reacción del ensayo bactericida contenía bacterias, antisuero policlonal para proteína CD, una fuente de complemento que consistía en suero humano normal que estaba absorbido con proteína G para retirar anticuerpos, y la solución salina equilibrada. Todos los reaccionantes se añadieron a la reacción para dar un volumen de 250 \mul. Partes alícuotas de 25 \mul de la reacción se retiraron y se cultivaron en placa por triplicado sobre agar de BHI a los tiempos 0 y 60 minutos. Las placas se incubaron y las colonias se contaron al día siguiente. El porcentaje de muerte se calculó usando el promedio de los tres valores por triplicado en los dos momentos. Un ejemplo representativo de datos generados por los ensayos bactericidas se muestra en la Tabla 5. Los resultados indican que el antisuero policlonal producido para la proteína CD es bactericida para B. catarrhalis. Según se ilustra mediante la Tabla 5, los controles muestran que el antisuero no mata las bacterias en ausencia de complemento y que la fuente de complemento no mata las bacterias en ausencia del antisuero, indicando que la actividad bactericida está dirigida por el anticuerpo y mediada por el complemento.

TABLA 5 Actividad bactericida del anticuerpo anti-CD

Muestra	Antisuero	Complemento	CFU en el tiempo 0	CFU en el tiempo 60	Porcentaje de Muerte
1	10 \mul	22 \mul	225	5	97,8%
2	10 \mul	0	227	390	0%
3	0	22 \mul	254	286	0%

Para ilustrar adicionalmente que la proteína CD posee propiedades deseables de un antígeno vacunal, se observó que los sueros inmunes reunidos producidos para la cepa O35E tenían reactividad cruzada con cepas heterólogas. Los sueros inmunes reunidos, preparados contra la proteína CD según se describe anteriormente, se examinaron con respecto a la reactividad cruzada con 9 cepas de B. catarrhalis procedentes de diversas fuentes clínicas y geográficas. Estas incluyen cepas aisladas de fuentes clínicas tales como oído medio y del tracto respiratorio superior, y de fuentes geográficas tales como el estado de Nueva York, Massachusetts y Tennessee. El ensayo se realizó cultivando las cepas durante la noche en agar de Mueller-Hinton. Las bacterias de cada cultivo se recogieron mediante torundas de algodón y se suspendieron en PBS hasta una absorbancia óptica de 1,0 a 600 nm. Un microlitro de cada suspensión se aplicó a una membrana de nitrocelulosa y se dejó secar. La membrana se incubó una hora a temperatura ambiente en una solución de leche seca desnatada al 5% en PBS para bloquear los sitios de unión residuales de la membrana. La membrana se lavó dos veces con PBS y a continuación se sumergió en la solución de bloqueo que contenía los sueros inmunes diluidos hasta 1:1000. La membrana se incubó con el anticuerpo durante la noche a 4ºC con agitación suave. La membrana se lavó tres veces con PBS y a continuación se incubó durante 2 horas a temperatura ambiente con proteína G recombinante conjugada a fosfatasa alcalina (1:1500 en PBS con leche seca desnatada al 5%). La membrana se lavó tres veces con PBS y el anticuerpo unido se detectó mediante la adición de substrato (KPI BCIP/NBT phosphatase substrate system; Kirkegaard y Perry, Inc.). Los sueros inmunes reaccionaban con seis cepas tan fuertemente como, o hasta una extensión mayor que, la cepa O35E; mientras que los sueros inmunes mostraban una reactividad ligeramente más débil para tres cepas que la cepa O35E. Así, los anticuerpos promovidos mediante inmunización de proteína CD aislada de la cepa O35E reaccionaban cruzadamente con todas las cepas heterólogas probadas.

Para el desarrollo de vacunas, secuencias de aminoácidos específicas para CD pueden purificarse de B. catarrhalis o pueden purificarse de un huésped que contiene un vector recombinante que expresa CD o péptidos de CD. Tales huéspedes incluyen, pero no se limitan a, transformantes bacterianos, transformantes de levadura, transformantes de hongos filamentosos y células cultivadas que se han infectado o transfectado con un vector que codifica secuencias de aminoácidos de CD. Los péptidos u oligopéptidos correspondientes a porciones de la proteína CD pueden producirse a partir de segmentación química o enzimática de proteína CD (véase, por ejemplo, la Modalidad D); o sintetizarse químicamente usando métodos conocidos en la especialidad y con la secuencia de aminoácidos deducida de la secuencia de nucleótidos del gen que codifica CD como una referencia. Alternativamente, los péptidos de CD pueden producirse a partir de un vector recombinante (véase, por ejemplo, la Modalidad A). El inmunógeno proteínico, peptídico u oligopeptídico se incluye como el material inmunogénico pertinente en la formulación de vacuna, y en cantidades terapéuticamente eficaces, para inducir una respuesta inmunitaria. Se conocen muchos métodos para la introducción de una formulación de vacuna en el ser humano o el animal que ha de vacunarse. Estos incluyen, pero no se limitan a, administración intradérmica, intramuscular, intraperitoneal, intravenosa, subcutánea, ocular, intranasal y oral. La vacuna puede comprender además un portador fisiológico tal como una solución, un polímero o liposomas; y un adyuvante, o una combinación de los mismos.

Diversos adyuvantes se usan junto con formulaciones de vacuna. Estos adyuvantes ayudan modulando la respuesta inmunitaria y para alcanzar un nivel más durable y superior de inmunidad usando cantidades menores de antígeno vacunal o dosis inferiores que si el antígeno vacunal se administrara solo. Ejemplos de adyuvantes incluyen adyuvante incompleto de Freund, Adjuvant 65 (que contiene aceite de cacahuete, monooleato de mánido y monoestearato de aluminio); emulsiones de aceite; adyuvante de Ribi, los polioles Pluronic, poliaminas, Avridine, Quil A, saponina, MPL, QS-21 y geles minerales tales como hidróxido de aluminio, fosfato de aluminio, etc.

Otra modalidad de este modo de la invención implica la producción de secuencias de aminoácidos específicas para CD como un hapteno, es decir una molécula que no puede promover por sí misma una respuesta inmunitaria. En tal caso, el hapteno puede unirse covalentemente a un portador u otra molécula inmunogénica que conferirá inmunogenicidad al hapteno acoplado cuando se expongan al sistema inmunitario.

Así, tal hapteno específico para CD conectado a una molécula portadora puede ser el inmunógeno en una formulación de vacuna.

Otro modo de esta modalidad proporciona una vacuna viral recombinante viva, una vacuna bacteriana recombinante, una vacuna bacteriana atenuada recombinante o una vacuna viral recombinante inactivada que se usa para proteger contra infecciones provocadas por B. catarrhalis. El virus vacunal es el ejemplo mejor conocido, en la especialidad, de un virus infeccioso que se manipula para expresar antígenos vacunales derivados de otros organismos. El virus vacunal vivo recombinante, que se atenúa o se trata de otro modo de manera que no provoque enfermedad por sí mismo, se usa para inmunizar un huésped. La replicación subsiguiente del virus recombinante dentro del huésped proporciona una estimulación continua del sistema inmunitario con los antígenos vacunales tal como la proteína CD o los péptidos de CD, proporcionando de ese modo inmunidad a largo plazo.

Otros vectores vacunales vivos incluyen: adenovirus, citomegalovirus y preferiblemente los poxvirus tales como vaccinia (Paoletti y Panicali, Patente de EE.UU. Nº 4.603.112) y cepas de Salmonella atenuadas (Stocker y otros, Patente de EE.UU. Nº 5.210.035; 4.837.151 y 4.735.801 y Curtiss y otros, 1988, Vaccine 6:155-160). Las vacunas vivas son particularmente ventajosas debido a que estimulan continuamente el sistema inmunitario lo que puede conferir inmunidad substancialmente prolongada. Cuando la respuesta inmunitaria es protectora contra infección por B. catarrhalis subsiguiente, la propia vacuna viva puede usarse en una vacuna preventiva contra B. catarrhalis.

Para ilustrar este modo de la modalidad, usando técnicas de biología molecular tales como las ilustradas en la Modalidad A, el gen que codifica CD, o un fragmento génico que codifica uno o más péptidos de CD, puede insertarse en el DNA genómico del virus vacunal en un sitio que permita la expresión de epítopos de CD pero no afecte negativamente al crecimiento o la replicación del vector de virus vacunal. El virus recombinante resultante puede usarse como el inmunógeno en una formulación de vacuna. Los mismos métodos pueden usarse para construir una formulación de vacuna de virus recombinante inactivada, excepto que el virus recombinante se inactiva, tal como a través de medios químicos conocidos en la especialidad, antes de usar como inmunógeno y sin afectar substancialmente a la inmunogenicidad del inmunógeno expresado. Una mezcla de virus inactivados que expresan diferentes epítopos puede usarse en la formulación de una vacuna inactivada multivalente. En cualquier caso, la vacuna recombinante inactivada o la mezcla de virus inactivados pueden formularse con un adyuvante adecuado para mejorar la respuesta inmunológica a los antígenos vacunales.

En otra variación de esta modalidad, se usa directamente material genético como la formulación de vacuna. Ácido nucleico (DNA o RNA) que contiene secuencias que codifican proteína CD, péptido de CD u oligopéptido de CD, conectadas operativamente a uno o más elementos reguladores, pueden introducirse directamente para vacunar al individuo ("transferencia génica directa") contra cepas patógenas de B. catarrhalis. La transferencia génica directa a un individuo vacunado, que da como resultado la expresión del material genético mediante las células del individuo vacunado tales como células endoteliales vasculares así como el tejido de los órganos principales, se ha demostrado mediante técnicas de la especialidad tales como inyectando intravenosamente un complejo de plásmido de expresión:liposoma catiónico (Zhu y otros, 1993, Science 261:209-211). Otros métodos eficaces para aportar DNA vectorial a una célula diana se conocen en la especialidad. En un ejemplo, DNA plasmídico recombinante purificado que contiene genes virales se ha usado para inocular (ya sea parenteralmente, mucosalmente o a través de inmunización con pistola génica) vacunas para inducir una respuesta inmunitaria protectora (Fynan y otros, 1993, Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 90:11478-11482). En otro ejemplo, células extraídas de un individuo pueden transfectarse o someterse a electroporación mediante procedimientos estándar conocidos en la especialidad, dando como resultado la introducción del DNA vectorial recombinante en la célula diana. Las células que contienen el DNA vectorial recombinante pueden seleccionarse a continuación para usar métodos conocidos en la especialidad, tales como a través de un marcardor de selección expresado en el vector, y las células seleccionadas pueden reintroducirse a continuación en el individuo para expresar proteína CD, péptido de CD u oligopéptido de CD.

Un método de vacunación preferido con material genético comprende la etapa de administrar al individuo la molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica para uno o más de la proteína CD, los péptidos de CD o los oligopéptidos de CD, en donde la molécula de ácido nucleico está conectada operativamente a una o más secuencias reguladoras necesarias para la expresión. La molécula de ácido nucleico puede administrarse directamente o producirse en primer lugar en un vector viral y administrarse a través del vector. La molécula de ácido nucleico puede administrarse en un portador o diluyente farmacéuticamente aceptable y puede contener compuestos que pueden mejorar la eficacia de la vacuna. Estos compuestos adicionales incluyen, pero no se limitan, adyuvantes que mejoran la respuesta inmunitaria y compuestos que se dirigen a modular la respuesta inmunitaria, por ejemplo citoquinas, denominados colectivamente "inmunomoduladores"; u otros compuestos que incrementan la captación de ácido nucleico por las células, denominados "potenciadores de la captación de ácido nucleico". La inmunización por la molécula de ácido nucleico puede ser a través de cualquier ruta parenteral (intravenosa, intraperitoneal, intradérmica, subcutánea o intramuscular) o a través de contacto con superficies mucosales de la nasofaringe, la tráquea o el tracto gastrointestinal.

Como una alternativa a la inmunización activa, tal como cuando un individuo inmunocomprometido sufre una infección que amenaza potencialmente la vida, provocada por B. catarrhalis, la inmunización puede ser pasiva, es decir inmunización que comprende la administración de inmunoglobulina humana purificada que contiene anticuerpo contra epítopos de CD.

Debe entenderse que aunque la invención se ha descrito con detalle aquí, los ejemplos solo tenían propósitos ilustrativos. Otras modificaciones de las modalidades de la presente invención que son obvias para los expertos en la especialidad de la biología molecular, el diagnóstico médico y disciplinas relacionadas pretenden estar dentro del alcance de las reivindicaciones adjuntas.

(1) INFORMACIÓN GENERAL

\vskip0.800000\baselineskip

(i): SOLICITANTE: Timothy F. Murphy

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TÍTULO DE LA INVENCIÓN: Vacuna para Branhamella Catarrhalis

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): NÚMERO DE SECUENCIAS: 52

\vskip0.800000\baselineskip

(iv): DIRECCIÓN DE CORRESPONDENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): DESTINATARIO: Hodgson, Russ, Andrews, Woods y Goodyear

\vskip0.500000\baselineskip

(B): CALLE: 1800 One M&T Plaza

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CIUDAD: Buffalo

\vskip0.500000\baselineskip

(D): ESTADO: Nueva York

\vskip0.500000\baselineskip

(E): PAÍS: Estados Unidos

\vskip0.500000\baselineskip

(F): ZIP: 14203-2391

\vskip0.800000\baselineskip

(iv): FORMA LEIBLE POR COMPUTADORA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): TIPO DE MEDIO: Disco flexible, 3,5 pulgadas, capacidad 1,4 Mb

\vskip0.500000\baselineskip

(B): ORDENADOR: Compatible con IBM

\vskip0.500000\baselineskip

(C): SISTEMA OPERATIVO: MS-DOS/Microsoft Windows 3.1

\vskip0.500000\baselineskip

(D): SOPORTE LÓGICO: Wordperfect para Windows 5.1

\vskip0.800000\baselineskip

(vi): DATOS DE SOLICITUD PREVIOS:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): NÚMERO DE SOLICITUD: U.S. 08/129.719

\vskip0.500000\baselineskip

(B): FECHA DE PRESENTACIÓN: 29 de Septiembre de 1993

\vskip0.800000\baselineskip

(vi): DATOS DE SOLICITUD ACTUALES:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): NÚMERO DE SOLICITUD: 08/306.871

\vskip0.500000\baselineskip

(B): FECHA DE PRESENTACIÓN: 20 de Septiembre de 1994

\vskip0.800000\baselineskip

(viii): INFORMACIÓN DEL ABOGADO/AGENTE

\vskip0.500000\baselineskip

(A): NOMBRE: Nelson, M. Bud

\vskip0.500000\baselineskip

(B): NÚMERO DE REGISTRO: 35.300

\vskip0.500000\baselineskip

(C): REFERENCIA/NÚMERO DE EXPEDIENTE: 11520.0053

\vskip0.800000\baselineskip

(viii): INFORMACIÓN DE TELECOMUNICACIONES:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): TELÉFONO: (716) 856-4000

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TELEFAX: (716) 849-0349

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA Nº ID SEC1:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 387 nucleótidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE HEBRA: doble hebra

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: DNA genómico

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): HIPOTÉTICO: sí

\vskip0.800000\baselineskip

(iv): FUENTE INMEDIATA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): BIBLIOTECA: genómica

\vskip0.500000\baselineskip

(B): CLON: clon lambda gt11

\vskip0.800000\baselineskip

(v): FUENTE ORIGINAL:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): ORGANISMO: Branhamella catarrhalis

\vskip0.500000\baselineskip

(B): CEPA: 25240

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE CÉLULA: bacteria

\vskip0.800000\baselineskip

(vi): RASGO:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): SITUACIÓN: región de gen de CD, 775-1160

\vskip0.500000\baselineskip

(B): MÉTODO DE IDENTIFICACIÓN: mediante experimento

\vskip0.500000\baselineskip

(C): OTRA INFORMACIÓN: contiene la secuencia que codifica epítopos reconocidos por anticuerpos monoclonales específicos para CD 5E8 y 7D6

\vskip0.800000\baselineskip

(vii): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: Nº ID SEC 1:

\vskip1.000000\baselineskip

1

2

\vskip1.000000\baselineskip

(3) INFORMACIÓN PARA LA Nº ID SEC 2:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 20 nucleótidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE HEBRA: doble hebra

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): FUENTE ORIGINAL:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): ORGANISMO: Branhamella catarrhalis

\vskip0.500000\baselineskip

(B): CEPA: 25240

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): RASGO:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): SITUACIÓN: región de gen de CD, 1116-1135

\vskip0.500000\baselineskip

(B): MÉTODO DE IDENTIFICACIÓN: mediante experimento

\vskip0.500000\baselineskip

(C): OTRA INFORMACIÓN: se hibrida a la región génica de Branhamella catarrhalis

\vskip0.800000\baselineskip

(iv): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: Nº ID SEC 2:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

CCGTGAAGAA GTTGCTAAGG

\hfill

20

\vskip1.000000\baselineskip

(4) INFORMACIÓN PARA LA Nº ID SEC 3:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 15 nucleótidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE HEBRA: una sola hebra

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): FUENTE ORIGINAL:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): ORGANISMO: Branhamella catarrhalis

\vskip0.500000\baselineskip

(B): CEPA: 25240

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): RASGO:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): SITUACIÓN: región de gen de CD, 206-220

\vskip0.500000\baselineskip

(B): MÉTODO DE IDENTIFICACIÓN: mediante experimento

\vskip0.500000\baselineskip

\vskip0.800000\baselineskip

(iv): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: Nº ID SEC 3:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

CTGACGAAGT CCACA

\hfill

15

\vskip1.000000\baselineskip

(5) INFORMACIÓN PARA LA Nº ID SEC 4:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 16 nucleótidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE HEBRA: una sola hebra

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): FUENTE ORIGINAL:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): ORGANISMO: Branhamella catarrhalis

\vskip0.500000\baselineskip

(B): CEPA: 25240

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): RASGO:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): SITUACIÓN: región de gen de CD (hebra complementaria) 316-331

\vskip0.500000\baselineskip

(B): MÉTODO DE IDENTIFICACIÓN: mediante experimento

\vskip0.500000\baselineskip

\vskip0.800000\baselineskip

(iv): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: Nº ID SEC 4:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

CACCAGTCCA TAGCTC

\hfill

16

\vskip1.000000\baselineskip

(6) INFORMACIÓN PARA LA Nº ID SEC 5:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 16 nucleótidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE HEBRA: una sola hebra

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): FUENTE ORIGINAL:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): ORGANISMO: Branhamella catarrhalis

\vskip0.500000\baselineskip

(B): CEPA: 25240

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): RASGO:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): SITUACIÓN: región de gen de CD, 468-483

\vskip0.500000\baselineskip

(B): MÉTODO DE IDENTIFICACIÓN: mediante experimento

\vskip0.500000\baselineskip

\vskip0.800000\baselineskip

(iv): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: Nº ID SEC 5:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GATTGGTACT GAGCAG

\hfill

16

\vskip1.000000\baselineskip

(7) INFORMACIÓN PARA LA Nº ID SEC 6:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 18 nucleótidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE HEBRA: una sola hebra

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): FUENTE ORIGINAL:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): ORGANISMO: Branhamella catarrhalis

\vskip0.500000\baselineskip

(B): CEPA: 25240

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): RASGO:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): SITUACIÓN: región de gen de CD (hebra complementaria) 561-578

\vskip0.500000\baselineskip

(B): MÉTODO DE IDENTIFICACIÓN: mediante experimento

\vskip0.500000\baselineskip

\vskip0.800000\baselineskip

(iv): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: Nº ID SEC 6:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GTATAACCAT AATTGCA

\hfill

18

\vskip1.000000\baselineskip

(8) INFORMACIÓN PARA LA Nº ID SEC 7:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 15 nucleótidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE HEBRA: una sola hebra

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): FUENTE ORIGINAL:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): ORGANISMO: Branhamella catarrhalis

\vskip0.500000\baselineskip

(B): CEPA: 25240

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): RASGO:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): SITUACIÓN: región de gen de CD, 724-738

\vskip0.500000\baselineskip

(B): MÉTODO DE IDENTIFICACIÓN: mediante experimento

\vskip0.500000\baselineskip

(C): OTRA INFORMACIÓN: se híbrida a la región génica de Branhamella catarrhalis

\vskip0.800000\baselineskip

(iv): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: Nº ID SEC 7:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GCCCGTGCTA TCCAT

\hfill

15

\vskip1.000000\baselineskip

(9) INFORMACIÓN PARA LA Nº ID SEC 8:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 17 nucleótidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE HEBRA: una sola hebra

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): FUENTE ORIGINAL:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): ORGANISMO: Branhamella catarrhalis

\vskip0.500000\baselineskip

(B): CEPA: 25240

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): RASGO:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): SITUACIÓN: región de gen de CD (hebra complementaria)

\vskip0.500000\baselineskip

(B): MÉTODO DE IDENTIFICACIÓN: mediante experimento

\vskip0.500000\baselineskip

\vskip0.800000\baselineskip

(iv): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: Nº ID SEC 8:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GGTTCTGCCA CTGGTGC

\hfill

17

\vskip1.000000\baselineskip

(10) INFORMACIÓN PARA LA Nº ID SEC 9:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 15 nucleótidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE HEBRA: una sola hebra

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): FUENTE ORIGINAL:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): ORGANISMO: Branhamella catarrhalis

\vskip0.500000\baselineskip

(B): CEPA: 25240

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): RASGO:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): SITUACIÓN: región génica de CD (hebra complementaria), 1211-1225

\vskip0.500000\baselineskip

(B): MÉTODO DE IDENTIFICACIÓN: mediante experimento

\vskip0.500000\baselineskip

\vskip0.800000\baselineskip

(iv): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: Nº ID SEC 9:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

TGTAGCGTGC ACTTG

\hfill

15

\vskip1.000000\baselineskip

(11) INFORMACIÓN PARA LA Nº ID SEC 10:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 18 nucleótidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE HEBRA: una sola hebra

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): FUENTE ORIGINAL:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): ORGANISMO: Branhamella catarrhalis

\vskip0.500000\baselineskip

(B): CEPA: 25240

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): RASGO:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): SITUACIÓN: región génica de CD, 1387-1404

\vskip0.500000\baselineskip

(B): MÉTODO DE IDENTIFICACIÓN: mediante experimento

\vskip0.500000\baselineskip

\vskip0.800000\baselineskip

(iv): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: Nº ID SEC 10:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GCAGTAATCA CTGGTAGC

\hfill

18

\vskip1.000000\baselineskip

(12) INFORMACIÓN PARA LA Nº ID SEC 11:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 15 nucleótidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE HEBRA: una sola hebra

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): FUENTE ORIGINAL:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): ORGANISMO: Branhamella catarrhalis

\vskip0.500000\baselineskip

(B): CEPA: 25240

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): RASGO:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): SITUACIÓN: región génica de CD (hebra complementaria) 1483-1497

\vskip0.500000\baselineskip

(B): MÉTODO DE IDENTIFICACIÓN: mediante experimento

\vskip0.500000\baselineskip

\vskip0.800000\baselineskip

(iv): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: Nº ID SEC 11:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

TCGATAAGGC TTGAG

\hfill

15

\vskip1.000000\baselineskip

(13) INFORMACIÓN PARA LA Nº ID SEC 12:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 18 nucleótidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE HEBRA: una sola hebra

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): FUENTE ORIGINAL:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): ORGANISMO: Branhamella catarrhalis

\vskip0.500000\baselineskip

(B): CEPA: 25240

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): RASGO:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): SITUACIÓN: región génica de CD, 1665-1682

\vskip0.500000\baselineskip

(B): MÉTODO DE IDENTIFICACIÓN: mediante experimento

\vskip0.500000\baselineskip

\vskip0.800000\baselineskip

(iv): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: Nº ID SEC 12:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

CGGGCATATC GCACGACT

\hfill

18

\vskip1.000000\baselineskip

(14) INFORMACIÓN PARA LA Nº ID SEC 13:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 20 nucleótidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE HEBRA: una sola hebra

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): FUENTE ORIGINAL:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): ORGANISMO: Branhamella catarrhalis

\vskip0.500000\baselineskip

(B): CEPA: 25240

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): RASGO:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): SITUACIÓN: región génica de CD, 941-960

\vskip0.500000\baselineskip

(B): MÉTODO DE IDENTIFICACIÓN: mediante experimento

\vskip0.500000\baselineskip

\vskip0.800000\baselineskip

(iv): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: Nº ID SEC 13:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

TTGTTGATTC AGACGGAGAT

\hfill

20

\vskip1.000000\baselineskip

(15) INFORMACIÓN PARA LA Nº ID SEC 14:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 1727 nucleótidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE HEBRA: una sola hebra

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: DNA genómico

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): HIPOTÉTICO: sí

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): FUENTE ORIGINAL:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): ORGANISMO: Branhamella catarrhalis

\vskip0.500000\baselineskip

(B): CEPA: 25240

\vskip0.800000\baselineskip

(v): FUENTE INMEDIATA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): BIBLIOTECA: genómica

\vskip0.500000\baselineskip

(B): CLON: clon 5 EMBL3

\vskip0.500000\baselineskip

(C): SUBCLÓN: pCD1

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): RASGO:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): SITUACIÓN: región génica de CD

\vskip0.500000\baselineskip

(B): MÉTODO DE IDENTIFICACIÓN: mediante experimento

\vskip0.500000\baselineskip

(C): NOMBRE/CLAVE: secuencia de señal de proteína codificada

\vskip0.500000\baselineskip

(C): SITUACIÓN: -26 a -1

\vskip0.800000\baselineskip

(vii): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: Nº ID SEC 14:

\vskip1.000000\baselineskip

3

4

5

\vskip1.000000\baselineskip

(16) INFORMACIÓN PARA LA Nº ID SEC 15:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 17 nucleótidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE HEBRA: una sola hebra

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): FUENTE ORIGINAL:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): ORGANISMO: Branhamella catarrhalis

\vskip0.500000\baselineskip

(B): CEPA: 25240

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): RASGO:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): SITUACIÓN: región génica de CD (cepa complementaria), 1430-1446

\vskip0.500000\baselineskip

(B): MÉTODO DE IDENTIFICACIÓN: mediante experimento

\vskip0.500000\baselineskip

\vskip0.800000\baselineskip

(iv): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: Nº ID SEC 15:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

TTGAACAATC ATATCTT

\hfill

17

\vskip1.000000\baselineskip

(17) INFORMACIÓN PARA LA Nº ID SEC 16:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 18 nucleótidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE HEBRA: una sola hebra

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): FUENTE ORIGINAL:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): ORGANISMO: Branhamella catarrhalis

\vskip0.500000\baselineskip

(B): CEPA: 25240

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): RASGO:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): SITUACIÓN: región génica de CD, 166-183

\vskip0.500000\baselineskip

(B): MÉTODO DE IDENTIFICACIÓN: mediante experimento

\vskip0.500000\baselineskip

\vskip0.800000\baselineskip

(iv): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: Nº ID SEC 16:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GGTGTGACAG TCAGCCCA

\hfill

18

\vskip1.000000\baselineskip

(18) INFORMACIÓN PARA LA Nº ID SEC 17:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 17 nucleótidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE HEBRA: una sola hebra

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): FUENTE ORIGINAL:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): ORGANISMO: Branhamella catarrhalis

\vskip0.500000\baselineskip

(B): CEPA: 25240

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): RASGO:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): SITUACIÓN: región génica de CD (cepa complementaria), 1081-1097

\vskip0.500000\baselineskip

(B): MÉTODO DE IDENTIFICACIÓN: mediante experimento

\vskip0.500000\baselineskip

\vskip0.800000\baselineskip

(iv): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: Nº ID SEC 17:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GATTTATCAT AATCAAA

\hfill

17

\vskip1.000000\baselineskip

(19) INFORMACIÓN PARA LA Nº ID SEC 18:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 17 nucleótidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE HEBRA: una sola hebra

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): FUENTE ORIGINAL:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): ORGANISMO: Branhamella catarrhalis

\vskip0.500000\baselineskip

(B): CEPA: 25240

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): RASGO:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): SITUACIÓN: región génica de CD, 1048-1064

\vskip0.500000\baselineskip

(B): MÉTODO DE IDENTIFICACIÓN: mediante experimento

\vskip0.500000\baselineskip

\vskip0.800000\baselineskip

(iv): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: Nº ID SEC 18:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GTAGAAGAGC TTCGCCA

\hfill

17

\vskip1.000000\baselineskip

(20) INFORMACIÓN PARA LA Nº ID SEC 19:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 105 residuos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): FUENTE ORIGINAL:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): ORGANISMO: Branhamella catarrhalis

\vskip0.500000\baselineskip

(B): CEPA: 25240

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): RASGO:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): SITUACIÓN: posiciones de aminoácidos de CD 1-105

\vskip0.800000\baselineskip

(iv): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: Nº ID SEC 19:

\vskip1.000000\baselineskip

6

\vskip1.000000\baselineskip

(21) INFORMACIÓN PARA LA Nº ID SEC 20:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 31 nucleótidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE HEBRA: una sola hebra

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): FUENTE ORIGINAL:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): ORGANISMO: Branhamella catarrhalis

\vskip0.500000\baselineskip

(B): CEPA: 25240

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: Nº ID SEC 20:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GCGCGCGGAT CCGGTGTGAC AGTCAGCCCA C

\hfill

31

\vskip1.000000\baselineskip

(22) INFORMACIÓN PARA LA Nº ID SEC 21:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 29 nucleótidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE HEBRA: una sola hebra

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): FUENTE ORIGINAL:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): ORGANISMO: Branhamella catarrhalis

\vskip0.500000\baselineskip

(B): CEPA: 25240

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: Nº ID SEC 21:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ATATATGAAT TCCTCAGTAC CAATCAAAA

\hfill

29

\vskip1.000000\baselineskip

(23) INFORMACIÓN PARA LA Nº ID SEC 22:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 97 residuos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): FUENTE ORIGINAL:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): ORGANISMO: Branhamella catarrhalis

\vskip0.500000\baselineskip

(B): CEPA: 25240

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): RASGO:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): SITUACIÓN: posiciones de aminoácidos de CD 106-202

\vskip0.800000\baselineskip

(iv): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: Nº ID SEC 22:

\vskip1.000000\baselineskip

7

\vskip1.000000\baselineskip

(24) INFORMACIÓN PARA LA Nº ID SEC 23:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 29 nucleótidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE HEBRA: una sola hebra

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): FUENTE ORIGINAL:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): ORGANISMO: Branhamella catarrhalis

\vskip0.500000\baselineskip

(B): CEPA: 25240

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: Nº ID SEC 23:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GCGCGCGGAT CCCAGTTCAG CGGCTACAA

\hfill

29

\vskip1.000000\baselineskip

(25) INFORMACIÓN PARA LA Nº ID SEC 24:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 30 nucleótidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE HEBRA: una sola hebra

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): FUENTE ORIGINAL:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): ORGANISMO: Branhamella catarrhalis

\vskip0.500000\baselineskip

(B): CEPA: 25240

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: Nº ID SEC 24:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ATATATGAAT TCCGCCAAGC CTTCCCACCA

\hfill

30

\vskip1.000000\baselineskip

(26) INFORMACIÓN PARA LA Nº ID SEC 25:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 59 residuos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): FUENTE ORIGINAL:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): ORGANISMO: Branhamella catarrhalis

\vskip0.500000\baselineskip

(B): CEPA: 25240

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): RASGO:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): SITUACIÓN: posiciones de aminoácidos de CD 203-261

\vskip0.800000\baselineskip

(iv): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: Nº ID SEC 25:

\vskip1.000000\baselineskip

8

\vskip1.000000\baselineskip

(27) INFORMACIÓN PARA LA Nº ID SEC 26:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 31 nucleótidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE HEBRA: una sola hebra

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): FUENTE ORIGINAL:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): ORGANISMO: Branhamella catarrhalis

\vskip0.500000\baselineskip

(B): CEPA: 25240

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: Nº ID SEC 26:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GCGCGCGGAT CCTTGGCTGG TTTAGAGGTA A

\hfill

31

\vskip1.000000\baselineskip

(28) INFORMACIÓN PARA LA Nº ID SEC 27:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 32 nucleótidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE HEBRA: una sola hebra

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): FUENTE ORIGINAL:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): ORGANISMO: Branhamella catarrhalis

\vskip0.500000\baselineskip

(B): CEPA: 25240

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: Nº ID SEC 27:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ATATATGAAT TCAACAACAA TATCTTCAAT TA

\hfill

32

\vskip1.000000\baselineskip

(29) INFORMACIÓN PARA LA Nº ID SEC 28:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 71 residuos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): FUENTE ORIGINAL:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): ORGANISMO: Branhamella catarrhalis

\vskip0.500000\baselineskip

(B): CEPA: 25240

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): RASGO:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): SITUACIÓN: posiciones de aminoácidos de CD 261-331

\vskip0.800000\baselineskip

(iv): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: Nº ID SEC 28:

\vskip1.000000\baselineskip

9

\vskip1.000000\baselineskip

(30) INFORMACIÓN PARA LA Nº ID SEC 29:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 29 nucleótidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE HEBRA: una sola hebra

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): FUENTE ORIGINAL:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): ORGANISMO: Branhamella catarrhalis

\vskip0.500000\baselineskip

(B): CEPA: 25240

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: Nº ID SEC 29:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GCGCGCGGAT CCGATTCAGA CGGAGATGG

\hfill

29

\vskip1.000000\baselineskip

(31) INFORMACIÓN PARA LA Nº ID SEC 30:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 29 nucleótidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE HEBRA: una sola hebra

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): FUENTE ORIGINAL:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): ORGANISMO: Branhamella catarrhalis

\vskip0.500000\baselineskip

(B): CEPA: 25240

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: Nº ID SEC 30:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ATATATGAAT TCGAATTCAC GCATTTGCG

\hfill

29

\vskip1.000000\baselineskip

(32) INFORMACIÓN PARA LA Nº ID SEC 31:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 41 residuos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): FUENTE ORIGINAL:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): ORGANISMO: Branhamella catarrhalis

\vskip0.500000\baselineskip

(B): CEPA: 25240

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): RASGO:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): SITUACIÓN: posiciones de aminoácidos de CD 261-301

\vskip0.800000\baselineskip

(iv): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: Nº ID SEC 31:

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Asp Ser Asp Gly Asp Gly Val Pro Asp His Leu Asp Ala Cys Pro}

\sac{Glu Thr Pro Val Asn Thr Val Val Asp Pro Arg Gly Cys Pro Val}

\sac{Gln Val Asn Leu Val Glu Glu Leu Arg Gln Glu}

\vskip1.000000\baselineskip

(33) INFORMACIÓN PARA LA Nº ID SEC 32:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 29 nucleótidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE HEBRA: una sola hebra

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): FUENTE ORIGINAL:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): ORGANISMO: Branhamella catarrhalis

\vskip0.500000\baselineskip

(B): CEPA: 25240

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: Nº ID SEC 32:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ATATATGAAT TCATCCAGAT GATCAGGCA

\hfill

29

\vskip1.000000\baselineskip

(34) INFORMACIÓN PARA LA Nº ID SEC 33:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 26 residuos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): FUENTE ORIGINAL:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): ORGANISMO: Branhamella catarrhalis

\vskip0.500000\baselineskip

(B): CEPA: 25240

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): RASGO:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): SITUACIÓN: posiciones de aminoácidos de CD 286-311

\vskip0.800000\baselineskip

(iv): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: Nº ID SEC 33:

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Arg Gly Cys Pro Val Gln Val Asn Leu Val Glu Glu Leu Arg Gln}

\sac{Glu Leu Arg Val Phe Phe Asp Tyr Asp Lys Ser}

\vskip1.000000\baselineskip

(35) INFORMACIÓN PARA LA Nº ID SEC 34:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 29 nucleótidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE HEBRA: una sola hebra

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): FUENTE ORIGINAL:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): ORGANISMO: Branhamella catarrhalis

\vskip0.500000\baselineskip

(B): CEPA: 25240

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: Nº ID SEC 34:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GCGCGCGGAT CCCGCGGTTG CCCAGTACA

\hfill

29

\vskip1.000000\baselineskip

(36) INFORMACIÓN PARA LA Nº ID SEC 35:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 29 nucleótidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE HEBRA: una sola hebra

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): FUENTE ORIGINAL:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): ORGANISMO: Branhamella catarrhalis

\vskip0.500000\baselineskip

(B): CEPA: 25240

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: Nº ID SEC 35:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ATATATGAAT TCGATTTATC ATAATCAAA

\hfill

29

\vskip1.000000\baselineskip

(37) INFORMACIÓN PARA LA Nº ID SEC 36:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 16 residuos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): FUENTE ORIGINAL:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): ORGANISMO: Branhamella catarrhalis

\vskip0.500000\baselineskip

(B): CEPA: 25240

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): RASGO:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): SITUACIÓN: posiciones de aminoácidos de CD 286-301

\vskip0.800000\baselineskip

(iv): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: Nº ID SEC 36:

\newpage

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Arg Gly Cys Pro Val Gln Val Asn Leu Val Glu Glu Leu Arg Gln}

\sac{Glu}

\vskip1.000000\baselineskip

(38) INFORMACIÓN PARA LA Nº ID SEC 37:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 30 nucleótidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE HEBRA: una sola hebra

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): FUENTE ORIGINAL:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): ORGANISMO: Branhamella catarrhalis

\vskip0.500000\baselineskip

(B): CEPA: 25240

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: Nº ID SEC 37:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ATATATGAAT TCCTCTTGGC GAAGCTCTTC

\hfill

30

\vskip1.000000\baselineskip

(39) INFORMACIÓN PARA LA Nº ID SEC 38:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 11 residuos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): FUENTE ORIGINAL:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): ORGANISMO: Branhamella catarrhalis

\vskip0.500000\baselineskip

(B): CEPA: 25240

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): RASGO:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): SITUACIÓN: posiciones de aminoácidos de CD 293-303

\vskip0.800000\baselineskip

(iv): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: Nº ID SEC 38:

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Asn Leu Val Glu Glu Leu Arg Gln Glu Leu Arg}

\vskip1.000000\baselineskip

(40) INFORMACIÓN PARA LA Nº ID SEC 39:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 29 nucleótidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE HEBRA: una sola hebra

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): FUENTE ORIGINAL:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): ORGANISMO: Branhamella catarrhalis

\vskip0.500000\baselineskip

(B): CEPA: 25240

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: Nº ID SEC 39:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GCGCGCGGAT CCAATTTGGT AGAAGAGCT

\hfill

29

\vskip1.000000\baselineskip

(41) INFORMACIÓN PARA LA Nº ID SEC 40:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 29 nucleótidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE HEBRA: una sola hebra

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): FUENTE ORIGINAL:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): ORGANISMO: Branhamella catarrhalis

\vskip0.500000\baselineskip

(B): CEPA: 25240

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: Nº ID SEC 40:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ATATATGAAT TCACGCAACT CTTGGCGAA

\hfill

29

\vskip1.000000\baselineskip

(42) INFORMACIÓN PARA LA Nº ID SEC 41:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 17 residuos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): FUENTE ORIGINAL:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): ORGANISMO: Branhamella catarrhalis

\vskip0.500000\baselineskip

(B): CEPA: 25240

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): RASGO:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): SITUACIÓN: posiciones de aminoácidos de CD 295-311

\vskip0.800000\baselineskip

(iv): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: Nº ID SEC 41:

50

\vskip1.000000\baselineskip

(43) INFORMACIÓN PARA LA Nº ID SEC 42:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 29 nucleótidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE HEBRA: una sola hebra

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): FUENTE ORIGINAL:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): ORGANISMO: Branhamella catarrhalis

\vskip0.500000\baselineskip

(B): CEPA: 25240

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: Nº ID SEC 42:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GCGCGCGGAT CCGTAGAAGA GCTTCGCCA

\hfill

29

\vskip1.000000\baselineskip

(44) INFORMACIÓN PARA LA Nº ID SEC 43:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 29 nucleótidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE HEBRA: una sola hebra

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): FUENTE ORIGINAL:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): ORGANISMO: Branhamella catarrhalis

\vskip0.500000\baselineskip

(B): CEPA: 25240

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: Nº ID SEC 43:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ATATATGAAT TCGATTTATC ATAATCAAA

\hfill

29

\vskip1.000000\baselineskip

(45) INFORMACIÓN PARA LA Nº ID SEC 44:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 21 residuos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): FUENTE ORIGINAL:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): ORGANISMO: Branhamella catarrhalis

\vskip0.500000\baselineskip

(B): CEPA: 25240

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): RASGO:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): SITUACIÓN: posiciones de aminoácidos de CD 311-331

\vskip0.800000\baselineskip

(iv): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: Nº ID SEC 44:

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Ser Ile Ile Lys Pro Gln Tyr Arg Glu Glu Val Ala Lys Val Ala}

\sac{Ala Gln Met Arg Glu Phe}

\vskip1.000000\baselineskip

(46) INFORMACIÓN PARA LA Nº ID SEC 45:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 29 nucleótidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE HEBRA: una sola hebra

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): FUENTE ORIGINAL:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): ORGANISMO: Branhamella catarrhalis

\vskip0.500000\baselineskip

(B): CEPA: 25240

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: Nº ID SEC 45:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GCGCGCGGAT CCTCAATCAT CAAACCCCA

\hfill

29

\vskip1.000000\baselineskip

(47) INFORMACIÓN PARA LA Nº ID SEC 46:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 29 nucleótidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE HEBRA: una sola hebra

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): FUENTE ORIGINAL:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): ORGANISMO: Branhamella catarrhalis

\vskip0.500000\baselineskip

(B): CEPA: 25240

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: Nº ID SEC 46:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ATATATGAAT TCGAATTCAC GCATTTGCG

\hfill

29

\vskip1.000000\baselineskip

(48) INFORMACIÓN PARA LA Nº ID SEC 47:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 59 residuos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): FUENTE ORIGINAL:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): ORGANISMO: Branhamella catarrhalis

\vskip0.500000\baselineskip

(B): CEPA: 25240

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): RASGO:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): SITUACIÓN: posiciones de aminoácidos de CD 332-390

\vskip0.800000\baselineskip

(iv): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: Nº ID SEC 47:

10

\vskip1.000000\baselineskip

(49) INFORMACIÓN PARA LA Nº ID SEC 48:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 29 nucleótidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE HEBRA: una sola hebra

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): FUENTE ORIGINAL:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): ORGANISMO: Branhamella catarrhalis

\vskip0.500000\baselineskip

(B): CEPA: 25240

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: Nº ID SEC 48:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GCGCGCGGAT CCCCAAATGC AACTGCAAC

\hfill

29

\vskip1.000000\baselineskip

(50) INFORMACIÓN PARA LA Nº ID SEC 49:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 29 nucleótidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE HEBRA: una sola hebra

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): FUENTE ORIGINAL:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): ORGANISMO: Branhamella catarrhalis

\vskip0.500000\baselineskip

(B): CEPA: 25240

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: Nº ID SEC 49:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ATATATGAAT CCAGGACGAT CAAAGCCAT

\hfill

29

\vskip1.000000\baselineskip

(51) INFORMACIÓN PARA LA Nº ID SEC 50:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 37 residuos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): FUENTE ORIGINAL:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): ORGANISMO: Branhamella catarrhalis

\vskip0.500000\baselineskip

(B): CEPA: 25240

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): RASGO:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): SITUACIÓN: posiciones de aminoácidos de CD 391-427

\vskip0.800000\baselineskip

(iv): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: Nº ID SEC 50:

60

\vskip1.000000\baselineskip

(52) INFORMACIÓN PARA LA Nº ID SEC 51:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 29 nucleótidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE HEBRA: una sola hebra

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): FUENTE ORIGINAL:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): ORGANISMO: Branhamella catarrhalis

\vskip0.500000\baselineskip

(B): CEPA: 25240

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: Nº ID SEC 51:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GCGCGCGGAT CCATCGCTCC AAATACTAC

\hfill

29

\vskip1.000000\baselineskip

(53) INFORMACIÓN PARA LA Nº ID SEC 52:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 33 nucleótidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE HEBRA: una sola hebra

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): FUENTE ORIGINAL:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): ORGANISMO: Branhamella catarrhalis

\vskip0.500000\baselineskip

(B): CEPA: 25240

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: Nº ID SEC 52:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ATATATGAAT TCTTGAACAA TCATATCTTT GGT

\hfill

33

Claims

1. Un método para producir un péptido, un oligopéptido o una proteína antigénicos aislados que tienen uno o más epítopos de CD, en donde CD es una proteína de membrana externa de Branhamella catarrhalis de una masa molecular aparente de aproximadamente 55.000 a aproximadamente 60.000 daltons mediante SDS-PAGE y que tiene una secuencia de aminoácidos como la representada en el Nº ID SEC 14, que comprende (1) formar dichos péptido, oligopéptido o proteína antigénicos recombinantemente o (2) formar dicho péptido u oligopéptido antigénicos mediante un método de síntesis de péptidos.

2. Un método de acuerdo con la reivindicación 1, en el que la proteína que tiene uno o más epítopos de CD consiste en una secuencia de aminoácidos como la representada en el Nº ID SEC 14 desde el residuo de aminoácido 1 hasta el 427.

3. Un método de acuerdo con la reivindicación 1, en el que la proteína que tiene uno o más epítopos de CD consiste en una secuencia de aminoácidos como la representada en el Nº ID SEC 14 desde el residuo de aminoácido -26 hasta el 427.

4. Un método de acuerdo con la reivindicación 1, en el que el péptido u oligopéptido que tiene uno o más epítopos de CD se selecciona del grupo que consiste en los Nº ID SEC 1, Nº ID SEC 19, Nº ID SEC 22, Nº ID SEC 25, Nº ID SEC 28, Nº ID SEC 31, Nº ID SEC 33, Nº ID SEC 36, Nº ID SEC 38, Nº ID SEC 41, Nº ID SEC 44, Nº ID SEC 47 y Nº ID SEC 50.

5. Un método de acuerdo con la reivindicación 1, en el que el péptido, el oligopéptido o la proteína se producía recombinantemente a partir de células cultivadas de un sistema de células huésped genéticamente manipulado para incluir un vector que contiene una secuencia de nucleótidos que regula la expresión de secuencias de DNA que codifican epítopos de CD.

6. Un método de acuerdo con la reivindicación 5, en el que la célula cultivada es una bacteria, una levadura, un hongo filamentoso, una línea celular de insecto o una línea celular de mamífero.

7. Un método para producir una formulación de vacuna, que comprende producir un péptido, un oligopéptido o una proteína aislados, mediante un método como el definido en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, e incorporar una cantidad inmunológicamente eficaz de los mismos a dicha formulación.

8. Un método de acuerdo con la reivindicación 7, en el que el péptido u oligopéptido aislado se produce mediante síntesis química.

9. Un método de acuerdo con la reivindicación 7 o la reivindicación 8, que comprende además un portador o diluyente farmacéuticamente aceptable.

10. Un método de acuerdo con la reivindicación 7 o la reivindicación 8, que comprende además un inmunomodulador.

11. Un vector recombinante que comprende una secuencia de DNA que codifica uno o más determinantes antigénicos o epítopos de CD, en donde CD es una proteína de membrana externa de Branhamella catarrhalis de una masa molecular aparente de aproximadamente 55.000 a aproximadamente 60.000 daltons mediante SDS-PAGE y que tiene una secuencia de aminoácidos como la representada en el Nº ID SEC 14.

12. El vector recombinante de acuerdo con la reivindicación 11, en el que la CD consiste en una secuencia de aminoácidos como la representada en el Nº ID SEC 14 desde el residuo de aminoácido 1 hasta el 427.

13. El vector recombinante de acuerdo con la reivindicación 12, en el que la proteína que tiene uno o más epítopos de CD consiste en una secuencia de aminoácidos como la representada en el Nº ID SEC 14 desde el residuo de aminoácido -26 hasta el 427.

14. El vector recombinante de acuerdo con la reivindicación 11, en el que el vector se selecciona del grupo que consiste en un vector plasmídico, un vector fagemídico, un vector cosmídico y un vector viral.

15. Una composición útil para inmunizar pasivamente individuos que sufren una infección provocada por B. catarrhalis, comprendiendo dicha composición antisuero purificado que reconoce específicamente uno o más epítopos de CD, en donde CD es una proteína de membrana externa de B. catarrhalis de una masa molecular aparente de aproximadamente 55.000 a aproximadamente 60.000 daltons mediante SDS PAGE y que tiene una secuencia de aminoácidos como la representada en la Nº ID SEC 14 desde el residuo de aminoácido 1 hasta el 427, produciéndose dicho antisuero contra un péptido, un oligopéptido o una proteína producidos de acuerdo con el método de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6.

16. Un gen aislado o fragmentos del mismo que codifican epítopos de proteína CD de membrana externa de Branhamella catarrhalis que tiene una masa molecular aparente de aproximadamente 55.000 a aproximadamente 60.000 daltons mediante SDS-PAGE, en donde dicho gen comprende el marco de lectura abierto de 1359 pares de bases del Nº ID SEC 14.

17. Una formulación de vacuna que comprende una molécula de ácido nucleico que codifica la proteína CD, o uno o más fragmentos génicos que codifican uno o más péptidos de CD u oligopéptidos de CD, dicha molécula de ácido nucleico está conectada operativamente con secuencias reguladoras, en donde CD es una proteína de membrana externa de Branhamella catarrhalis de una masa molecular aparente de aproximadamente 55.000 a aproximadamente 60.000 daltons mediante SDS PAGE y que tiene una secuencia de aminoácidos como la representada en el Nº ID
SEC 14.

18. La formulación de vacuna de acuerdo con la reivindicación 17, que comprende además un portador o diluyente farmacéuticamente aceptable.

19. La formulación de vacuna de acuerdo con la reivindicación 18, que comprende además un inmunomodulador.

20. La formulación de vacuna de acuerdo con la reivindicación 18, que comprende además un mejorador de la captación de ácidos nucleicos.

21. Un microorganismo recombinante infeccioso capaz de expresar proteína CD, péptidos de CD u oligopéptidos de CD de Branhamella catarrhalis, en donde CD es una proteína de membrana externa de Branhamella catarrhalis de una masa molecular aparente de aproximadamente 55.000 a aproximadamente 60.000 daltons mediante SDS PAGE y que tiene una secuencia de aminoácidos como la representada en el Nº ID SEC 14.

22. Un microorganismo de acuerdo con la reivindicación 21, que es un virus vacunal, adenovirus o citomegalovirus.

23. Un microorganismo de acuerdo con la reivindicación 21, que es una bacteria del género Salmonella.

24. Un método para la detección de antisueros específicos para B. catarrhalis en un fluido corporal obtenido de un individuo, que comprende producir un péptido o una proteína mediante el método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, obtener un fluido corporal de un individuo y usar el péptido o la proteína como un antígeno en un inmunoensayo para interactuar con y detectar antisueros específicos para B. catarrhalis en el fluido corporal, en donde CD es una proteína de membrana externa de Branhamella catarrhalis de una masa molecular aparente de aproximadamente 55.000 a aproximadamente 60.000 daltons mediante SDS PAGE y que tiene una secuencia de aminoácidos como la representada en el Nº ID SEC 14.

25. El método de acuerdo con la reivindicación 24, en el que el inmunoensayo es un ensayo seleccionado del grupo que consiste en un radioinmunoensayo, un ensayo de inmunoabsorción con enzimas ligadas, un ensayo tipo "sándwich", la reacción de precipitina, un ensayo de aglutinación, un inmunoensayo basado en fluorescencia y un inmunoensayo basado en quimioluminiscencia.

26. Oligonucleótidos útiles en la detección de B. catarrhalis, consistiendo dichos oligonucleótidos en secuencias de ácido nucleico que complementan y se hibridan específicamente a regiones conservadas del gen contenido dentro de la secuencia de nucleótidos del Nº ID SEC 14 o su correspondiente hebra complementaria.

27. Los oligonucleótidos de acuerdo con la reivindicación 26, en donde los oligonucleótidos consisten en secuencias de ácido nucleico seleccionadas del grupo que consiste en los Nº ID SEC 2, Nº ID SEC 3, Nº ID SEC 4, Nº ID SEC 5, Nº ID SEC 6, Nº ID SEC 7, Nº ID SEC 8, Nº ID SEC 9, Nº ID SEC 10, Nº ID SEC 11, Nº ID SEC 12, Nº ID SEC 13, Nº ID SEC 15, Nº ID SEC 16, Nº ID SEC 17 y Nº ID SEC 18.

28. Un método para detectar la presencia o ausencia de Branhamella catarrhalis en un espécimen clínico, en donde el método comprende las etapas de:

(d): detectar la presencia de secuencias amplificadas del gen y su correspondiente hebra, en donde la presencia de estas secuencias amplificadas se correlaciona con la presencia de B. catarrhalis en el espécimen.

29. El método de acuerdo con la reivindicación 28, en el que la detección se facilita adicionalmente mediante hibridación de secuencias amplificadas con una sonda oligonucleotídica etiquetada que consiste en una secuencia de nucleótidos correspondiente a una región en la región específica de secuencia que ha de amplificarse, dicha etiqueta es una etiqueta que se sabe que se incorpora en oligonucleótidos, seleccionada particularmente de entre una etiqueta radiactiva, tal como ^{32}P, y una etiqueta enzimática, tal como biotina.

30. El método de acuerdo con la reivindicación 28, en el que el espécimen es un fluido corporal seleccionado del grupo que consiste en fluido del oído medio; esputo; sangre; y fluidos de la nasofaringe o el ojo o las adenoides.

31. Un método para la detección de Branhamella catarrhalis en un espécimen clínico, en donde el método comprende las etapas de:

32. El método de acuerdo con la reivindicación 31, en el que el espécimen es un fluido corporal seleccionado del grupo que consiste en fluido del oído medio; esputo; sangre; y fluidos de la nasofaringe o el ojo o las adenoides.