FI117789B - Menetelmä rokotteen valmistamiseksi Branhamella catarrhalista vastaan - Google Patents

Description

117789 5

Menetelmä rokotteen valmistamiseksi Branhamella catarrhalista vastaan - Förfarande för att framställa ett vaccin mot Branhamella catarrhalis

Keksintö on tehty Yhdysvaltain hallituksen tuella National Institutes of Health -instituutin myöntämällä apurahalla A128 304. Yhdysvaltain hallituksella on tiettyjä oikeuksia tähän keksintöön.

10 Tämä patenttihakemusjulkaisu on jatkopatenttihakemusjulkaisu patentin hakijan aikaisemmalle haettavana olevalle US-patenttihakemusjulkaisulle nro 08/129 719, joka on jätetty 29. syyskuuta 1993 ja joka on liitetty tähän patentti-15 hakemusjulkaisuun siihen oikeuttavien säädösten nojalla.

Keksinnön ala

Keksintö liittyy koostumuksiin, jotka sisältävät Branhamella catarrhaliksen ulkomembraaniin liittyvää proteiinia sekä 20 tämän peptidejä ja oligopeptidejä. Tarkemmin sanottuna tämä keksintö kohdistuu koostumuksiin, jotka sisältävät proteiinia, sekä tämän peptidejä ja oligopeptidejä, jotka liittyvät B. catarrhaliksessa esiintyvään ulkomembraaniproteiiniin, .. "CD", jonka näennäinen suhteellinen moolimassa on noin • · · 25 55 000 - 60 000 daltonia. Tässä keksinnössä on esitetty myös • · *···* menetelmiä CD:n ja CD-peptidien valmistamiseksi yhdistelmä- • · · ···! DNA-menetelmillä sekä biokemiallisilla menetelmillä. Tähän liittyen tässä keksinnössä on esitetty CD:tä koodaava DNA-i,j4! sekvenssi ja CD:n ja CD-peptidien ja -oligopeptidien ilmensi*: 30 tämisen ohjaamisessa käyttökelpoisia yhdistelmävektoreita, sekä tällaisilla yhdistelmävektoreilla transformoituja . isäntäsoluja.

• · · • · · • · • ^ Näitä proteiineja, peptidejä ja oligopeptidejä käytetään • * 35 immunogeeneinä aktiiviseen immunisaatioon soveltuvissa ***· rokoteformulaatioissa; ja niitä voidaan käyttää passiiviseen • ·*. immunisaatioon soveltuvien käyttökelpoisten proteiini- • · · spesifisten ja peptidispesifisten antiseerumien muodostami- * * 'i 2 117789 ! ; , YL i seen sekä reagensseina diagnostisissa määrityksissä. Tässä keksinnössä kuvattujen nukleotidisekvenssien avulla on ' mahdollista syntetoida niitä vastaavia oligonukleotideja, ! joita voidaan käyttää reagensseina B. catarrhaliksen geneet- f; 5 tisen materiaalin havaitsemiseen suunnatuissa diagnostisissa määrityksissä, sekä liittää ilmentämisvektoreihin käytettäväksi geneettisinä rokoteformulaatioina. f

Keksinnön tausta 10 Branhamella catarrhalis (tästä käytetään myös nimitystä Moraxella catarrhalis) on merkittävä ihmisen hengitysteiden patogeeni. Streptococcus pneumoniaen ja kapselittoman Haemophilus influenzaen jälkeen B. catarrhalis on kolman- ? neksi yleisin välikorvantulehduksen aiheuttaja imeväis- * .1 15 ikäisillä ja lapsilla, mikä on osoitettu tutkimuksissa, ; joissa etiologinen agenssi on selvitetty tympanosenteesillä [Murphy, Pediatr. Infect. Dis. J. 8 (1989) S75 - S77] . B.

catarrhalis aiheuttaa usein sinuiittia ja konjuktiviittia sekä lapsilla että aikuisilla [tätä on käsitelty esimerkiksi 20 julkaisuissa Bluestone, Drugs 31 (1986) S132 - S141; <

Brorson, et ai., Scand. J. Infect. Dis. 8 (1976) 151 - 155; ja Romberger, et ai., South. Med. J. 80 (1987) 926 - 928]; ja kroonista bronkiittia ja kroonista obstruktiivista ]

··. keuhkosairautta sairastavilla aikuisilla se on merkittävä I

• ·· I

25 alempien hengitysteiden infektioiden aiheuttaja [Murphy, et | *·*:* ai., Am. Rev. Respir. Dis. 146 (1992) 1067 - 1083; Catiin, • · «

Clin. Microbiol. Rev. 3 (1990) 293 - 320] . Edellä mainittujen lisäksi B. catarrhalis voi aiheuttaa pneumoniaa, endo- I

kardiittia, sepsistä sekä meningiittiä potilailla, joiden ♦ * * : 30 immuunivaste on heikentynyt [Cocchi, et ai., Acta Paediatr.

Scand. 57 (1968) 451 - 3; Douer, et ai., Ann. Intern. Med. ; : 86 (1977) 116 - 119,- McNeely, et ai., Am. Rev. Respir. Dis.

* · · 114 (1976) 399 - 402] .

· I

J · · \ : 35 Koska toistuvan välikorvantulehduksen morbiditeetti on i * · ♦ · ? f · i huomattavan suuri, on haluttua identifioida strategioita = ♦;·♦· näiden infektioiden estämiseksi. Yksi tällainen lähestymis- • · • · · t • ·· . k 3 1 1 7789 ;< tapa on rokotteiden kehittäminen. Bakteerien aiheuttaman "s välikorvantulehduksen estämiseen tarkoitetun tehokkaan rokotteen täytyisi sisältää antigeenejä, jotka saisivat aikaan suojan S. pneumoniaen, kapselittoman H. influenzaen 5 ja B. catarrhaliksen aiheuttamia infektioita vastaan.

Pneumokokkia ja kapselitonta H. influenzaeta vastaan suun- Vj nattujen rokotteiden kehitys onkin jo siinä vaiheessa, että ' .1? i on tunnistettu potentiaalisesti suojaavia antigeenejä ja f' f1 näitä rokotteita tutkitaan parhaillaan [tätä on käsitelty 10 esimerkiksi julkaisuissa Murphy, et ai., US-patenttijulkaisu nro 5 173 294; ja Vella, et ai., Infect. Immun. 60 (1992) 4977 - 4983] . Näiden rokotteiden kehittämisen ja käytön laajentumisen myötä B. catarrhaliksen suhteellinen merkitys välikorvantulehduksen aiheuttajana kasvaa ensi vuosi- f

f I

15 kymmenellä. Sen lisäksi, että imeväisikäiset ja lapset Äi

-I

hyötyvät B. catarrhaliksen aiheuttamaa välikorvantulehdusta estävästä rokotteesta, niin B. catarrhaliksen aiheuttamia < infektioita estävästä rokotteesta hyötyisivät myös kroonista i obstruktiivista keuhkosairautta sairastavat aikuiset sekä 20 lapset ja aikuiset, joiden immuunivaste on heikentynyt.

Mahdollisina rokotteessa käytettävinä antigeeneinä tutkit- ' tuja bakteerien komponentteja ovat polysakkaridit, lipopoly- f ;·, sakkaridit tai niiden modifikaatiot sekä ulkomembraani - ] • · · 25 proteiinit. Polysakkaridiantigeenien on yleensä osoitettu 4, • * 'mi *** olevan huonoja immunogeenejä alle 18 kuukauden ikäisillä | • · · £' •••\ lapsilla, mistä on esimerkkinä H. influenzaen tyypin b f • · · · · . j * * kapselipolysakkaridi. Lipopolysakkaridin (LPS) avulla tehtä- vä aktiivinen immunisaatio ei ole hyväksyttävää, koska tämä 41 * ♦ · * 30 on luonnostaan toksinen. LPS:n patofysiologisia vaikutuksia voivat olla kuume, leukopenia, leukosytoosi, Schwartzmanin : reaktio, disseminoitunut intravaskulaarinen koagulopatia ja suurilla annoksilla sokki ja kuolema. Proteiinit ovat yleen- * "il . sä immunogeenisiä noin kolmen kuukauden ikäisillä imeväisil- i • » · ..'··$ •*: : 35 lä. Ulkomembraaniproteiineja ollaankin parhaillaan tutkimas- | I . ^ ...* sa mahdollisxna rokoteantigeeneina. = ·····.

·*'··' #··· • ·

Jr' J.

;1 4 1 1 7789 ?!

Vaikkakin viimeaikaisissa tutkimuksissa on painopiste alkanut siirtyä B. catarrhaliksen ulkomembraaniproteiineihin, ", niin näiden proteiinien antigeenisestä ja molekulaarisesta i rakenteesta tiedetään vasta vähän. SDS-PAGE:lla puhdiste- :?ί 5 tuille ulkomembraaneille tehdyissä tutkimuksissa on saatu jr, selville, että niiden rakenne on bakteerin eri kannoissa

. > I

melko homogeeninen [Bartos ja Murphy, J. Infect. Dis. 158 (1988) 761 - 765]. On tunnistettu kahdeksan ulkomembraanin t pääproteiinia, joiden nimitykseen on käytetty kirjaimia A - l 10 H [Murphy, et ai., Microbial Pathogen. 6 (1989) 159 - 174;

Bartos, et ai., J. Infect. Dis. 158 (1988) 761 - 765]. Ulko-membraaniproteiinien C ja D näennäiset suhteelliset mooli- > massat eroavat jonkin verran toisistaan, joten ne esiintyvät - SDS-PAGE-elektrof oreesissa omana vyöhykeparinaan. B.

15 catarrhalista vastaan on kehitetty monoklonaalisia vasta- ΐ aineita, minkä tuloksena on saatu kaksi monoklonaalista • if" vasta-ainetta 7D6 ja 5E8, jotka tunnistavat sekä proteiinin § C että proteiinin D [Sarwar, et ai., Infect. Immun. 60 : (1992) 804 - 809] . Ennen tätä keksintöä ei tiedetty, tar- $ 20 koittiko tämä vyöhykepari yhtä proteiinia (CD) , jolla on ·> kaksi pysyvää konformaatiota, vai ovatko C ja D kaksi eri geenien koodaamaa läheisesti toisiinsa liittyvää proteiinia (Sarwar, et ai., edellä). Proteiinit C ja D ovat kiinnostuk- \ sen kohteena erityisesti rokotteen kehittämisen kannalta, f • #* i/ *... 25 koska nämä proteiinit ilmentävät vähintään yhtä säilynyttä * : : ..... *

·*· epitooppia ehjän B. catarrhaliksen pinnalla [Sarwar, et ai. I

.·*·:·* (1992), edellä]. I

·»··· • * * . ..'.

Sen myötä, että B. catarrhalis tunnustetaan lisääntyvässä f : : : 30 määrin merkittäväksi bakteeripatogeeniksi, on siis olemassa \ tarve saada käyttöön rokote, joka on immunogeeninen lapsilla • ;*· ja aikuisilla. Tällaisen rokotteen täytyisi kohdistua bak- % ··· ’ teerin komponenttiin, joka sisältää ehjien bakteerien pin- j nalla esiintyvän epitoopin, joka epitooppi on säilynyt eri i • * · :¾ :.ί ί 35 B. catarrhalis -kannoissa. j • · * » :

• M

* ,.f • ' ψ 4 * * · *

• · M

4 * Ϊ • » * l • 4 · Ί • * ί 5 117789

Keksinnön yhteenveto

Tehdyt tutkimukset liittyvät proteiiniin ja peptideihin, liittyen B. catarrhaliksen ulkomenibraaniproteiiniin, jonka näennäinen suhteellinen moolimassa on noin 55 000 -5 60 000 daltonia ja jonka proteiinin arveltiin aikaisemmin olevan kaksi toisiaan muistuttavaa proteiinia, C ja D, mutta jonka tässä keksinnössä kuvattujen yhdistelmä-DNA-menetel-mien avulla tiedetään nykyisin olevan yksi proteiini, CD, joka on lämmön vaikutuksesta muuntuva, minkä seurauksena 10 SDS-geeleissä havaitaan kaksi eri nopeudella liikkuvaa proteiinia. Tässä esitetyn mukaista CD-proteiinia ja sen peptidejä (näitä käytetään tässä keksinnössä nimitystä "CD-peptidit") ja oligopeptidejä (näistä käytetään tässä keksinnössä nimitystä "CD-oligopeptidit") voidaan käyttää immuno-15 geeneinä profylaktisissa ja/tai terapeuttisissa rokoteformulaatioissa; tai antigeeninä diagnostisissa immunomäärityksissä, jotka on suunnattu B. catarrhalis -infektion havaitsemiseen määrittämällä seerumista B. catarrhalikselle spesifisen vasta-aineen tiitterin kohoami-20 nen. Tässä esitetyn mukaista CD-proteiinia ja sen mukaisia CD-peptidejä ja CD-oligopeptidejä voidaan käyttää myös sellaisen CD-spesifisen vasta-aineen muodostamiseen, joka voi olla käyttökelpoinen passiivisessa immunisaatiossa, sekä .. reagensseina diagnostisissa määrityksissä, jotka on suunnat- • « • 25 tu B. catarrhaliksen havaitsemiseen kliinisistä näytteistä. ··· • · CD-peptidejä tai CD-oligopeptidejä voidaan saada aikaan ..!!* syntetoimalla niitä kemiallisesti, puhdistamalla B.

catarrhaliksesta tai tuottamalla yhdistelmä-ilmentämis-ilj vektorijärjestelmillä käyttäen tässä keksinnössä kuvattuja 30 nukleiinihapposekvenssejä.

• . Yksi tämän keksinnön sovellutusmuoto kohdistuu menetelmään • · · .·’*, sellaisten uusien DNA-sekvenssien ja vektorien, kuten • · *1' plasmidi-DNA:n ja virus-DNA:n, kuten humaanivirusten, eläin- ***** 35 virusten, hyönteisvirusten tai bakteriofagien, konst- *:*’5 ruoimiseksi, joita voidaan käyttää ohjaamaan CD-proteiinin, . .*. CD-peptidien tai CD-oligopeptidien ilmentymistä sopivissa • · · ,")· isäntäsoluissa, joista • ♦ g 117789 ilmentynyt proteiini tai ilmentyneet peptidit voidaan puhdistaa. ,

Vastaavasti kuvataan myös menetelmiä CD:tä koodaavan geenin 5 ja CD-peptidejä tai CD-oligopeptidejä koodaavien geeni-fragmenttien molekulaariseksi kloonaamiseksi. Tämän keksinnön mukaisia nukleiinihapposekvenssejä voidaan käyttää molekulaarisissa diagnostisissa määrityksissä B.

catarrhaliksen geneettisen materiaalin määrittämiseksi 10 nukleiinihappohybridisäätiötä käyttäen, ja lisäksi sellaisten CD-sekvenssilie spesifisten oligonukleotidien synteesissä, joita voidaan käyttää alukkeina ja/tai koettimina nukleiinihappojen monistuksessa ja monistettujen nukleiinihappojen havaitsemisessa.

' 15 CD-proteiinia, CD-peptidejä ja CD-oligopeptidejä voidaan lisäksi käyttää immunogeeneinä profylaktisissa ja/tai terapeuttisissa rokoteformulaatioissa B. catarrhaliksen patogeenisiä kantoja vastaan katsomatta siihen, onko immunogeeni 20 syntetisoitu kemiallisesti, puhdistettu B. catarrhaliksesta vai puhdistettu yhdistelmä-ilmentämisvektorijärjestelmästä. CD:tä koodaava geeni tai yksi tai useampi CD-peptidejä tai CD-oligopeptidejä koodaava geenifragmentti voidaan vaihto-ehtoisesti liittää bakteeri- tai virusrokotteeseen, joka ♦ · • ** 25 sisältää sellaista yhdistelmä-bakteeria tai -virusta, jota ··· *...* on muunnettu siten, että se itse tuottaa CD:n yhtä tai useampaa immunogeeni s tä epitooppia, tai se voidaan liittää φ *:**; rokotteeseen yhdistelmänä muiden patogeenisten mikro-orga- : nismien immunogeenisten epitooppien kanssa. Toiminnallisesti ··· 30 yhteen tai useampaan säätely-yksikköön kytkettynä oleva CD:tä koodaava geeni tai yksi tai useampi CD-peptidejä tai φ m*t CD-oligopeptidejä koodaava geenifragmentti voidaan lisäksi i · · ”1 viedä suoraan ihmisiin ilmentämään CD-proteiinia, CD-pepti- • · ”* diä tai CD-oligopeptidejä suojaavan immuunivasteen aikaan- 35 saamiseksi.

* * *. Täsmällisemmin keksinnön kohde on kuvattu oheisissa « · · • · · ***. patenttivaatimuksissa.

• · >l' 7 117789

Piirrosten pääpiirteittäinen kuvaus t |

Kuvio 1 on kartta plasmidista pCD-1, joka on konstruoitu pETlib:stä ja CD:tä koodaavan geenin sisältävästä 2,4 ke:n h suuruisesta fragmentista. Varjostettu alue esittää DNA- f! 5 insertiosekvenssiä ja tummemmalla varjostettu alue esittää 1 CD-geeniä. Käytetyt lyhenteet ovat seuraavat: Ap: ampisil-liiniresistenssiä koodaava alue; Lac: lac-operoni, ep: emäspari. il 10 Kuvio 2 on kartta plasmidista pCD-2, joka on konstruoitu pGEMzf - : s ta ja CD: tä koodaavan geenin sisältävästä 1,5 ke:n fragmentista. Varjostettu alue esittää DNA-insertiosekvens- - siä ja tummemmalla varjostettu alue esittää CD-geeniä.

Käytetyt lyhenteet ovat seuraavat: Ap: ampisilliiniresis- 15 tenssiä koodaava alue; Lac: lac-operoni, ep: emäspari. .-j

Kuvio 3 on immunoblottimääritys, jossa on käytetty kokosolu- 1'· lysaatteja, jotka ovat: kanava a: pGEM7zf-:lla transformoitu

E. coli; kanava b: CD:tä koodaavan geenin sisältävällä pCD- -.V

20 2:11a transformoitu E. coli HB101; ja kanavat c ja d: B.

catarrhalis -kanta 25240. Kanavat b ja c sisältävät yhtä suuret määrät proteiinia (~ 20 μg) kun taas kanava d sisältää vähemmän proteiinia, minkä tarkoituksena on osoittaa li

• · ' Ϊ I

j*. CD: lie tyypillinen vyöhykepari. Näytteitä inkuboitiin 25 100 °C:ssa 10 minuutin ajan näytepuskurissa, jonka koostumus il m * $, oli 0,06 M Tris, 1,2 % natriumdodekyylisulfaattia, 12 % il ·«* •***# glyserolia ja 5,8 % /3-merkaptoetanolia. Immunoblottimääritys Sl kehitettiin vasta-aineella 5E8, joka tunnistaa CD-proteiinin pinnalla olevan epitoopin. Suhteellisten moolimassojen ♦ ·· *.· : 30 markkerit on esitetty vasemmalla puolella tuhansina dal- toneina.

. f f · · ' , „ . 11 • ♦ · • · ·

Kuvio 4 on Southern-blottimääritys, jossa 13 B. catarrhalis # ·, -kannan puhdistetut genomiset DNA-molekyylit pilkottiin * » k •*|/ 35 EcoRI:llä ja jossa koettimena käytettiin kahta leimalla ,.··* varustettua CD-geenisekvenssiä vastaavaa oligonukleotidia.

• j··· 3,7 ke:n vyöhykettä osoittava nuoli esittää fragmenttia, • · » »i ···.' 117789 8 joka sijaitsee vastasuuntaan CD:tä koodaavassa geenissä olevan EcoRI-kohdan suhteen, ja 325 emäsparin vyöhykettä osoittava nuoli esittää EcoRI-kohdasta myötäsuuntaan olevaa fragmenttia. Kanavat sisältävät DNA:ta kannoista, jotka 5 vasemmalta oikealle lueteltuina ovat: 105, 112, 135, 3, 5, 10, 20, 27, 31, 40, 42, 45, 56.

Kuvio 5 on Southern-blottimääritys, jossa 14 B. catarrhalis -kannan puhdistetut genomiset DNA-molekyylit pilkottiin 10 EcoRI:llä ja Pstl:llä ja jossa koettimena käytettiin leimalla varustettua oligonukleotidia, joka vastaa CD:ta koodaavan geenin EcoRI- ja Pstl-kohtien välissä olevaa sekvenssiä. Kanavat sisältävät DNA:ta kannoista, jotka vasemmalta oikealle lueteltuina ovat: 555, 556, 585, 3583, 4223, 4629, 15 5193, 6951, 9928, 25240, M3, M3, M9.

Kuvio 6 on coomassiesinellä värjätty tricine-natriumdo-dekyylisulfaattigeeli. Kanava A: puhdistettu CD. Kanava B: syanogeenibromidilla pilkottu puhdistettu CD. Nuolet osoit-20 tavat syanogeenibromidilla suoritetusta pilkkomisesta saatuja fragmentteja (näiden fragmenttien lasketut koot on esitetty taulukossa 2). Kanavassa B olevan suuren fragmentin alla oleva kaksoisvyöhyke on seurausta CD:n yhteydessä usein havaittavasta proteiinin epäspesifisestä proteolyyttisestä « · ! " 25 hajoamisesta. Suhteellisten moolimassojen markkerit on

»M

esitetty oikealla puolella tuhansina daltoneina.

* · · * * * * *:**: Keksinnön yksityiskohtainen kuvaus • ·*· Tämä keksintö kohdistuu menetelmään rokotteen • · · 30 valmistamiseksi, joka rokote sisältää B. catarrhalis • · · -bakteerin ulkomembraaniproteiinia, ja sen peptidejä, joissa proteiinille on annettu nimi "CD". CD-proteiini • * · liikkuu SDS-PAGE:a käyttäen tutkittuna lämmössä muokkau- • · ·;· tuvalle proteiinille luonteenomaisesti kahden vyöhykkeen *:*" 35 parina, jonka näennäinen suhteellinen moolimassa on noin ·♦··: 55 000 - 60 000 daltonia. CD:tä koodaavasta geenistä käy

yhden tämän keksinnön mukaisen nukleotidisekvenssin (SEQ ID

• · · ***. NO: 14) perusteella ilmi, että kypsän CD-proteiinin ennuste- • ψ • · .. * ' 1 1 7789 li 9 tun aminohapposekvenssin laskettu suhteellinen moolimassa on noin 45 788 daltonia. Tämän keksinnön mukaista CD-proteii- h nia, CD-peptidejä ja CD-oligopeptidejä voidaan valmistaa |i , tässä keksinnössä kuvatuilla yhdistelmä-DNA-menetelmillä tai f, '}· 5 niitä voidaan syntetisoida kemiallisesti tässä keksinnössä . : kuvatun aminohapposekvenssin perusteella. Peptidejä voidaan lisäksi valmistaa pilkkomalla kypsää proteiinia entsymaatti- 7, sesti tai kemiallisesti . Immunogeenisen(siä) epitoopin(peja) f sisältävää CD-proteiinia, CD-peptidejä ja CD-oligopeptidejä f 10 voidaan käyttää immunogeeneinä monissa erilaisissa rokote-

formulaatioissa B. catarrhaliksen aiheuttaman välikorvan- I

tulehduksen, sinuiitin, konjunktiviitin ja alempien ’ hengitysteiden infektioiden estämiseksi. Tämän keksinnön mukaisesti valmistettua CD-proteiinia ja CD-peptidejä voi-15 daan käyttää lisäksi sellaisten B. catarrhalista vastaan I, spesifisten antiseerumien muodostamiseen, jotka ovat käyttö- f kelpoisia passiivisessa immunisaatiossa B. catarrhaliksen \ aiheuttamia infektioita vastaan. i % y 20 Tästä keksinnöstä saadaan lisäksi käyttöön CD:tä koodaavan | geenin nukleotidisekvenssi sekä eristetystä geenistä päätel- f ty aminohapposekvenssi. Tämän keksinnön yhden sovellutus- muodon mukaisesti ilmentämisvektoriin liitetään yhdistelmä- ‘ ··, DNA-menetelmiä käyttäen CD;tä koodaava geeni tai yhden tai ) • · · *... 25 useamman immunogeenisen epitooppin sisältävää CD-peptidiä .

• · **t koodaavia geenifragmentteja, ja yhdistelmävektori liitetään ) ·;· i sopivaan isäntäsoluun, mikä siten ohjaa näiden sekvenssien | * 1 ilmentymistä juuri tässä isäntäsolussa. Isäntäsoluun liite- **.!/ tyn yhdistelmävektorin sisältävää ilmentämisjärjestelmää l • · · \ : 30 voidaan käyttää (a) sellaisen CD-proteiinin ja sellaisten CD-peptidien ja CD-oligopeptidien valmistamiseen, jotka * voidaan puhdistaa käytettäväksi immunogeeneinä rokote- i! *·· formulaatioissa; (b) sellaisen CD-proteiinin ja sellaisten t ·. CD-peptidien ja CD-oligopeptidien valmistamiseen, joita on * I I -h •1: · 35 tarkoitus käyttää antigeeninä diagnostisissa immuno- ί * 1 ....

...1 määrityksissä tai joita on tarkoitus käyttää sellaisten B. % ··1·· catarrhalista kohtaan spesifisten antiseerumien valmistuk- 4 • · ' ' Ϊ • ♦ · - • ·· .... · ' 1

1 I

10 1 1 7789 seen, joilla on terapeuttista ja/tai diagnostista käyttöä,- (c) tai jos ilmentämiseen käytetty yhdistelmävektori on elävä virus, kuten vacciniavirus, niin vektoria itsessään voidaan käyttää elävänä tai inaktivoituna rokotevalmisteena, j'

>I

5 joka on tarkoitus viedä isännän soluihin CD:n tai immuno- geenisten CD-peptidien tai CD-oligopeptidien ilmentämiseksi; (d) sen viemiseen eläviin heikennettyihin bakteerisoluihin, ^ joita käytetään CD-proteiinin, CD-peptidien tai CD-oligo- i peptidien ilmentämiseen; (e) tai sen viemiseen suoraan 10 potilaaseen sen koodaamaa ja ilmentämää CD-proteiinia, CD-peptidiä tai CD-oligopeptidiä vastaan suunnattua immunisaatiota varten.

Tämän keksinnön kuvaamistarkoituksissa valaistaan tämän 15 keksinnön mukaisia menetelmiä ja yhdisteitä seuraavissa sovellutusmuodoissa, jotka ovat: ; >1 f

Sovellutusmuoto A- CD:tä koodaavan geenin molekulaarinen =' kloonaus ja sekvensointi ja CD-epitooppeja ilmentävät vek- > 20 torit;

Sovellutusmuoto B- CD:tä koodaavan geenin säilyneisyys eri B. catarrhalis -kannoissa; «· i • ♦ s.

• ·· - 4- • ··'··£ ,···. 25 Sovellutusmuoto C- Menetelmiä CD:lie spesifisten nukleotidi- v • · sekvenssien käyttämiseksi molekyylidiagnostisissa määri- | ♦ . 1 ’***. tyksissä B. catarrhaliksen havaitsemiseksi; %

»···· '»I

m J · · *·♦* Sovellutusmuoto D- CD:n luonnehtiminen CD-peptidien muodos- ?' *.· : 30 taminen mukaan luettuna;

Sovellutusmuoto E- Menetelmiä CD:n, tai CD-peptidien, käyt-tämiseksi diagnostisissa immunomäärityksissä; • 4

« # · . 'JL

*!!.* 35 Sovellutusmuoto F. Menetelmiä ja yhdisteitä, jotka on tar- · | * 'v: ·;·* koitettu CD:hen ja CD-peptideihin liittyviin rokoteformulaa- j ·:**: tioihin. r

%·.., V

• 4 4 -- • · Ί li 1 1 77 8 9 i

Sovellutusmuoto A

CD:tä koodaavan geenin molekulaarinen kloonaus ja sekven- v sointi ja CD-epitooppeja ilmentävät vektorit.

5 Käytettynä strategiana oli genomin DNA-.n eristäminen B. ΐ catarrhaliksesta, eristetyn DNA:n pilkkominen fragmenteiksi, sellaisen genomisen kirjaston konstruointi, johon kuuluu f

Ti fragmenttien liittäminen ilmentämisvektoriin, yhdistelmä- | vektorien liittäminen sopivaan isäntäsoluun ja CD:Ile spesi-10 fisiä epitooppeja ilmentävien isäntäsolukloonien immunologi nen seulonta CD:lie spesifisiä antiseerumeja käyttäen. Genomisen bakteeri-DNA:n lähtömateriaalina käytettiin B. catarrhalis -kantaa 25240, joka saatiin American Type Culture Collection -talletuslaitoksesta (ATCC) . B. ,‘f 15 catarrhalista kasvatettiin suklaa-agarmaljoilla 37 °C:ssa 5-%:isessa C02:ssa tai aivosydäninfuusiolihaliemessä. Bakteriofagi lambda-gtll:n genomisen kirjaston isäntäkantana 1 käytettiin Escherichia coli (E. coli) Yl090:aa. Olosuhteiden mukaan E. colia kasvatettiin LB-lihaliemessä tai 50 μg/ml ^ 20 ampisilliinia sisältävällä LB-agarilla. Kloonien immunologi- 1 sessa seulonnassa käytettyjä monoklonaalisia vasta-aineita i olivat 5E8 ja 7D6, jotka tunnistavat eri epitooppeja B. catarrhaliksen ulkomembraaniproteiini CD:n pinnalta (Sarwar, • et ai., edellä). Vasta-aine 5E8 on IgM-vasta-aine ja se | ,»1·, 25 tunnistaa ehjän bakteerin pinnalla esillä olevan epitoopin. - 1 • ♦

’]·, Vasta-aine 7D6 on IgG2a-vasta-aine ja se sitoutuu epitoop- J

* '-'ii |"t1. piin, joka ei ole reaktiokykyinen pinnalta käsin tutkittuna. f • 1 * t · ! B. catarrhalis 25240 :n genomin DNA:sta konstruoitiin lambda- |

Ti1 ·1 30 gt11-kirjasto käyttäen aikaisemmin kuvattuja menetelmiä [Nelson, et ai., Infect. Immun. 56 (1988) 128 - 134]. ; * :i

*t;.! Agaroosigeelistä eluoitiin 2-8 kiloemäksen (ke) kokoisia I

♦ 4 · SJ ·1 genomisen DNA:n fragmentteja ja ne liitettiin ligaasilla ; faagin käsivarsiin. Osa kirjastosta liitettiin E. coli ΐ * ♦ 1 vi} 35 Y1090:aan ja tästä saadut plakit siirrettiin nitro- i : ”1 selluloosakiekoille ja ne seulottiin immunologisesti käyt- ; •:1T täen monoklonaalisia vasta-aineita 5E8 ja 7D6. Kiekkoja i I . .

« 1 * · 1 · .

,·. ι

J

12 1 1 7789 inkuboitiin ensin yön yli monoklonaalisten vasta-aineiden kanssa, minkä jälkeen niitä inkuboitiin proteiini-A-peroksi-daasin ja anti-hiiri-IgM-peroksidaasikonjugaatin kanssa ja |!

ne kehitettiin seuraavaksi substraatilla immunologisesti I

5 reagoivien plakkien tunnistamiseksi. Yhteensä noin |

554 000 plakin seulonnan tuloksena saatiin 387 emäsparin J

insertiosekvenssin sisältävä klooni, joka ilmensi vasta- ?

C

aineiden 7D6 ja 5E8 tunnistamia epitooppeja. Tämän kloonin t sisältämälle insertiosekvenssille tehdyssä nukleotidi- ϊ 10 sekvenssianalyysissä havaittiin avoin lukukehys, jossa ei ollut lainkaan aloitus- eikä lopetuskodoneita (SEQ ID NO:l).

Tämän kloonin nukleotidisekvenssi vastaa nukleotidejä 775 -1160 SEKVENSSISSÄ ID NO 14, joka sisältää koko CD:tä koodaa- } van geenisekvenssin. Kuten SEKVENSSISTÄ ID N0:1 käy ilmi, 15 tämän kloonin muodostama peptidi vastaa SEKVENSSISSÄ ID f NO: 14 kuvatun kypsän proteiinin aminohappoja 203 - 331.

•i1

Koska genomista lambda-gtll-kirjastoa useaan kertaan seulo- ' . maila saatiin aikaan pieni CD-geenin fragmentti, niin B. f 20 catarrhalis 25240:n genomin DNA:sta konstruoitiin EMBL3- | kirjasto, jossa insertiosekvenssien koot olivat noin 9 - f 23 ke. Tätä kirjastoa seulottiin immunologisesti käyttäen monoklonaalisia vasta-aineita 5E8 ja 7D6. Genominen EMBL3- f j1. kirjasto konstruoitiin tällä alalla tunnetuilla menetelmillä j • #1 ?' 25 [Ausubel, et ai., Current Protocols in Molecular Biology f • · % (1989), kustantaja John Wiley and Sons] ja valmistajan 1 »♦« **·1, (Stratagene, LaJolla, CA) suositusten mukaisesti. Yksityis-

kohtiin puuttumatta, B. catarrhalis 25240:n genomin DNA

puhdistettiin SDS:llä, proteinaasi K:11a ja CTAB:lla. Puh- · ’·« ( *.1 : 30 distettu genomin DNA pilkottiin osittain Sau3A:lla, eri- :

Fx suuruisten fragmenttien aikaansaamiseksi. DNA-fragmentit : erotettiin sakkaroosigradienttisentrifugoinnilla 10 - # · · 40-%:isessa sakkaroosigradientissa. Noin 9-23 kiloemäksen j • 1.

fragmentteja sisältävät fraktiot defosforyloitiin vasikan I

• « · ί'ϊί **· ; 35 alkalisella f osf ataasilla ja saostettiin etanolilla, minkä 7

Iti ^ I · »··' tarkoituksena oli valmistella fragementit liitettäväksi ;·1· EMBL3 :n käsivarsiin. Noin 0,7 μg näitä genomin DNA:n frag- « · • 1 1 » »» ·

; i3 1 1 7789 I

mentteja liitettiin T4-DNA-ligaasilla 1 ^g:aan EMBL3-käsi-varsia. Ligaasilla toisiinsa liitetyt faagin käsivarret ja insertiosekvenssit pakattiin faagiin ja kirjaston tiitteri ; määritettiin maljaamalla se E. coli P2 392:een, joka on J! 5 genomisen lambda-EMBL3 kirjaston isäntäkanta. Genomista Λ ! EMBL3-kirjastoa seulottiin immunologisesti monoklonaalisillä :l

vasta-aineilla 5E8 ja 7D6 edellä kuvatulla tavalla. I

Kun noin 3 500 EMBL-kirjastosta saatua plakkia oli seulottu 10 immunologisesti, saatiin yksi reagoiva plakki, jolle annet- · tiin nimitys klooni 5. Puhdistettu klooni määritettiin erikseen vasta-aineilla 5E8 ja 7D6 ja se reagoi kummankin vasta-aineen kanssa. Kontrollitutkimukset osoittivat, ettei pro- ·’ teiini A eikä anti-hiiri-IgM-peroksidaasikonjugaatti sitou-15 tunut kloonin 5 plakkeihin.

• . *1

Kloonista 5 peräisin oleva faagi-DNA puhdistettiin ja se i

pilkottiin Sällillä insertiosekvenssin poistamiseksi. Agaroosigeelielektroforeesilla saatiin selville, että kloo- · J

20 nissa 5 oli 13 ke:n suuruinen insertiosekvenssi. Insertio- | £ sekvenssi pilkottiin useilla restriktioentsyymeillä ja sille ? tehtiin Southern-blottimääritys. Blottia käsiteltiin käyttäen koettimena oligonukleotidiä, joka vastaa lambda-gtll-kirjastosta saatua CD-geenin 387 ep:n fragmentin DNA-sek- l * 25 venssiä. CD:tä koodaava geeni paikallistuu suoritettujen f \j, määritysten mukaan 2,4 ke:n Ncol - Sali -fragmenttiin. Tämä | * Ί '*’*# 2,4 ke:n fragmentti jatkokloonattiin pETllb:n (Novagen, « * Ί , Madison, WI) BamHl-kohtaan tasoittamalla sen päät ensin t · * ;*·* Klenowin DNA-polymeraasilla ja liittämällä BamHl-kytkijä- |

·* ’ 30 sekvenssit sitten ligaasilla insertiosekvenssiin. Tulokseksi I

saadulle 2,4 ke:n insertiosekvenssin sisältävälle plasmidil-s,:.; le annettiin nimitys pCDi (kuvio 1) . Plasmidia pETllb sekä ί V f yhdistelmä-pCDl:tä kasvatettiin E. coli HB101:ssä agarilla,

ί joka sisälsi ampisilliinia 50 μg/ml. pCDl:tä sisältävistä I

* ♦ # . . S

j”/ 35 transformoiduista soluista tehdylle kokosolulysaatille ΐ tehtiin SDS-PAGE ja immunoblottimääritys vasta-aineilla 7D6 t . · · * Λ * f » * · f * v • « % 14 11 7789 1 ja 5E8. Tulokset osoittavat, että pCDl koodaa kummankin , vasta-aineen kanssa reagoivaa täysimittaista CD-proteiinia. (' pCDl:n 2,4 ke:n suuruisen insertiosekvenssin kumpikin li 5 1727 ep:n suuruinen juoste sekvensoitiin dideoksimenetelmäl- lä käyttäen apuna vielä muita oligonukleotideja, jotka oli || syntetisoitu siten, että ne vastasivat insertiosekvenssin : sekvenssiä sopivien välimatkojen päässä toisistaan, kuten >, SEKVENSSEISTÄ ID NO:2 - 13 käy ilmi. Tunnistettiin i 10 453 aminohapon mittainen avoin lukukehys (SEQ ID NO:14), 7 joka edustaa 48 277 daltonin suuruista proteiinia. Sekvens- i , , . i sissa havaittiin voimakas transkription teminaatton, joka alkoi 54 ep:n kohdalla lopetuskodonista myötäsuuntaan.

15 Kypsän proteiinin laskettu suhteellinen moolimassa ! (47 788 daltonia) poikkesi merkittävästi SDS-PAGE:ssa ha- 'li vaitusta OMP-CD:n näennäisestä suhteellisesta moolimassasta f

(pelkistyneenä 60 000 daltonia tai pelkistymättömänä ;L

55 000 daltonia). Tästä syystä konstruoitiin plasmidi, joka f 20 . sisälsi avoimen lukukehyksen ilman myötäsuuntaan sijaitsevaa f, sekvenssiä sen määrittämiseksi, saako tämän lukukehyksen .£ . . 1 ilmentyminen aikaan täysikokoisen CD-proteiinin. Avoimesta

lukukehyksestä 48 ep myötäsuuntaan sijaitsee Clal-kohta. I

Uutta plasmidia pCD2 (kuvio 2) konstruoitaessa jatkokloonat- | 25 tiin oletetun CD-geenin sisältävä 1558 ep:n BamHl - Clal | : *·· -DNA-fragmentti pGEM7zf-:een (Promega Corp., Madison, wi) . |

Kuviossa 3 (kanava b) esitetyn immunoblottimäärityksen | ··· .

.·· perusteella pCD2:n sisältävissä transformoiduissa E. coli ? ····.· -soluissa ilmentyy täysikokoista CD-proteiinia. Tämän lisäk- • · 30 si immunoblottimäärityksessä havaitaan, että CD-geenituote • · » !!* liikkuu vyöhykeparina (kanava b) , mikä osoittaa, että molem- f * * I ' "* * mat vyöhykkeet edustavat paremminkin yhden geenin tuotteita | kuin että ne edustaisivat vastaavien geeniensä tuottamaa *.:* kahta lähisukuista proteiinia.

* · * 4 : 35 | : Tässä sovellutusmuodossa on siten esitetty esimerkki siitä, | • * · · ,···. että CD:tä tai sen osia koodaavia nukleotidisekvenssej ä h • · * * · ···*· • · » · • ·· • · - t L^j 15 1 1 7789 voidaan liittää moniin erilaisiin vektoreihin, kuten faagei-hin ja plasmideihin, ja ilmentää niitä näiden avulla. Suotuisiin tuloksiin näiden proteiinien ja peptidien ilmentämisessä vaaditaan sitä, että joko geenin tai geenifragmentin 5 sisältävä insertiosekvenssi tai vektori itsessään sisältää f jonkin transkriptioon tai translaatioon tarvittavan elemen- f tin, joka on yhteensopiva tietyn nimenomaisen ilmentämiseen fi γ\ käytetyn isäntä j ärj estelmän suhteen ja jonka isäntä-järjestelmä tunnistaa. CD-proteiinia, CD-peptidejä tai CD- 10 oligopeptidejä koodaava DNA voidaan syntetisoida tai eristää .

ja sekvensoida käyttäen menetelmiä ja alukesekvenssej ä ·· esitetyssä muodossaan tämän keksinnön sovellutusmuotojen A, B ja D mukaisesti. CD-proteiinin, CD-peptidien ja CD-oligo-peptidien ilmentämiseen voidaan käyttää monia erilaisia 1 15 isäntäjärjestelmiä, joita ovat, mainittuihin kuitenkaan rajoittumatta, bakteriofagivektorilla, plasmidivektorilla | tai kosmidi-DNA:11a transformoidut bakteerit; hiiva- | vektoreita sisältävät hiivat; sienivektoreita sisältävät i; sienet; viruksella (esimerkiksi bakuloviruksella) infek- \ 20 toidut hyönteissolulinjat; ja plasmidi- tai virusilmentämis- ? vektorilla transf ektoidut tai yhdistelmäviruksella (esi- |: merkiksi vacciniaviruksella, adenoviruksella, adeno-associated-viruksella, retroviruksella ja niin edelleen) \ infektoidut nisäkässolulinjat. ΐ 25 : 1 • » ί • ’·. CD-aminohapposekvenssej ä, toisin sanoen yhdistelmä-uiko- membraaniproteiini-CD:tä, CD-peptidiä tai CD-oligopeptidiä, 1 ··· koodaavaan vektoriin tai DNA-sekvenssiin voidaan molekyyli- biologian alalla tunnettuja menetelmiä, edellä kuvatut I v , ,·. 30 menetelmät mukaan luettuna, käyttäen liittää monia erilaisia i • 1 1 • V·' promoottoreita ja käynnistäjiä CD-aminohapposekvenssin S · # i • ilmentymisen tehostamiseksi edellyttäen, että CD-aminohappo-sekvenssien tehostunut ilmentyminen on käytetyn nimenomaisen • · · *·:·1 isäntäsoluj ärj estelmän suhteen yhteensopivaa (esimerkiksi • 1 · V 1 35 ei-toksista). On merkittävää, että DNA-sekvenssi voi näin i • ? • ollen muodostua CD-proteiinia koodaavasta geenistä tai mistä ····.' .**·. tahansa tämän geenin segmentistä, joka koodaa CD-proteiinin 1 • · ♦ ····· • 1 • 1 * 1 1

: 16 1 1 7789 I

funktionaalista epitooppia. Tämä DNA voidaan lisäksi fuu- *' -ii sioida muita antigeenejä, kuten muiden bakteerien ulko-membraaniproteiineja tai muiden bakteerien, sienten, loisten tai virusten antigeenejä, koodaaviin DNA-molekyyleihin, Il 5 minkä tarkoituksena on muodostaa geneettisesti fuusioitu :: (yhteisen peptidirungon jakava) multivalenttinen antigeeni, jfi jota voidaan käyttää parannettuna rokotekoostumuksena. r il

Promoottorin valinta määräytyy käytetyn ilmentämis- Ji 10 järjestelmän mukaan. Promoottorien voimakkuus eli niiden 1 kyky edistää transkriptiota vaihtelee. Kloonattua geeniä ilmennettäessä on yleisesti ottaen haluttua käyttää voimakasta promoottoria, jotta geenin transkriptiotaso ja sen ilmentyminen geenituotteeksi saadaan suureksi. CD-amino-15 happosekvenssejä koodaavan liitetyn DNA-sekvenssin transkription aikaansaamiseen voidaan käyttää esimerkiksi tällä ,i

alalla tunnettuja bakteeri-, faagi- tai plasmidipromootto- J

reita, joiden yhteydessä on havaittu suuri transkriptiotaso E. colin sisältävässä isäntäsolujärjestelmässä ja joita ovat 20 lac-promoottori, trp-promoottori, recA-promoottori, ribo- | somaalisen RNA:n promoottori, PR- ja PL-promoottorit, lac, UV5, ompF, bla, lpp ja muut näitä vastaavat promoottorit.

Jos tämän lisäksi CD-proteiini, CD-peptidit tai CD-oligo- f % .. 25 peptidit sattuisivat olemaan letaaleja tai haitallisia ? • · « isäntäsoluille, niin isäntäsolukanta/linja ja ilmentämis- f X · · 'e ···* vektori voidaan valita siten, että promoottorin toiminta on t

estynyt spesifiseen induktioon asti. Liitetyn DNA:n tehok- I

• * kaan transkription aikaansaamiseksi tiettyihin operoneihin ? • r 30 on esimerkiksi tarpeen liittää spesifisiä induktoreja (esi- , j*: merkiksi laktoosin tai isopropyylitio-beeta-D-galaktosidin * lisääminen indusoi lac-operonin). Monet erilaiset operonit, . .·. kuten trp-operoni, ovat toisenlaisten säätelymekanismien alaisia. Trp-operoni indusoituu kun kasvatusliuoksessa ei • * · ' 35 ole tryptofaania. PL-promoottori voidaan indusoida kohot- * * : tamalla lämpötilaa isäntäsoluissa, joissa on lämpöherkkä if *...· lambda-repressori. Tällä tavoin yli 95 % promoottorin ohjaa- * • • · · « * • « 1 ' ; "ΐ • * · • · : i Λ;

ΐ7 1 1 7789 I

masta transkriptiosta pystytään estämään indusoitumattomissa soluissa. Näin ollen yhdistelmä-CD-proteiinin, CD-peptidien -j· tai CD-oligopeptidien ilmentymistä voidaan säädellä viljele-mällä transformoituja ja transfektoituja soluja sellaisissa 5 olosuhteissa, joissa CD-aminohapposekvenssejä koodaavasta <, DNA:sta tapahtuvaa ilmentymistä ohjaava promoottori ei | "ie indusoidu, ja promoottori voidaan indusoida liitetyn DNA:n ilmentämiseksi, kun solujen määrä kasvatusliuoksessa saavut- 1 taa sopivan tiheyden. . £, 10 % Muita geenin tehokkaan transkription tai lähettimolekyylien translaation säätely-yksikköjä ovat käynnistäjät ja säätely- j signaalit. Käynnistäjäsekvenssit ovat DNA-yksikköjä, jotka ' ilmeisesti lisäävät transkription tehokkuutta tavalla, joka 15 on suhteellisen riippumaton niiden sijainnista ja suuntautumisesta läheisen geenin suhteen. Niinpä käynnistäjä voidaan f <= käytetyn isäntäsoluilmentämisvektorin mukaan sijoittaa | transkription tehokkuuden lisäämiseksi joko CD-aminohappo- £ sekvenssejä koodaavien liitettyjen DNA-sekvenssien suhteen J, •i1 20 myötäsuuntaan tai vastasuuntaan. Kuten tässä sovellutus- | muodossa on aikaisemmin esitetty, on tunnistettu myös muita i spesifisiä säätelysekvenssejä, jotka saattavat vaikuttaa CD:tä koodaavan geenin ilmentymiseen. Näitä tai muita | säätelykohtia, kuten transkription tai translaation aloitus- | 25 signaaleja, voidaan käyttää ohjaamaan CD:tä koodaavan geenin | : 2· tai sen geenifragmenttien ilmentymistä. Tällaisia säätely- f

* # · X

yksikköjä voidaan liittää CD-aminohapposekvenssejä koodaa- ; * t ( Ί.

·;1 viin DNA-sekvensseihin tai niiden lähellä sijaitseviin ····· vektori-DNA-sekvensseihin käyttäen tässä keksinnössä DNA- f I 30 sekvenssien liittämisen yhteydessä kuvattuja yhdistelmä-DNA- i ··· .

menetelmiä.

I · · * v . Edellä kuvatun mukaisesti CD-proteiinia, CD-peptidejä tai .·; • · · "·. CD-oligopeptidejä koodaavia alueita sisältäviä B. j « · · · \’i *·' ‘ 35 catarrhaliksen nukleotidejä voidaan liittää ligaasilla 1 :spesifiseen kohtaan ilmentämisvektorissa suhteessa vektorin j ·· · · Γ2: promoottori-, ohjaus- ja säätely-yksikköihin niin, että B.

* · · * • · c · ? 2

* « · T

/ Λ ie 1 1 7789 catarrhaliksen CD: lie spesifiset DNA-sekvenssit pystyvät r,

ilmentymään isäntäsolussa, kun yhdistelmä-vektori viedään isäntäsoluun. Esimerkiksi CD:lie spesifiset DNA-sekvenssit, jotka sisältävät omat säätely-yksikkönsä, voidaan liittää 'T

5 ligaasilla ilmentämisvektoriin oikeassa suhteessa tai suun- ij tautuneena oikeaan suuntaan vektorin promoottoriin ja f! ohjausyksikköihin nähden, jotka mahdollistavat CD:n amino- t happosekvenssien ilmentymisen. Tämän jälkeen yhdistelmä- ' vektori liitetään sopiviin isäntäsoluihin ja isäntäsoluille £ 10 suoritetaan valinta ja niistä seulotaan esiin yhdistelmä- 1! vektorin sisältävät solut. Valinta ja seulonta voidaan tehdä tällä alalla tunnetuilla menetelmillä, mukaan luettuna plasmidissa olevan markkerigeenin (esimerkiksi lääke-aineresistenssimarkkerin) ilmentymisen havaitseminen, i\ . 'ai 15 immunologinen seulonta CD:lie spesifisten epitooppien muo- 1! dostumisen suhteen käyttäen CD:lie spesifisiä epitooppeja vastaan muodostettuja antiseerumeita ja isännän solujen ' DNA:n käsittely koettimilla CD:lle spesifisten nukleotidi-sekvenssien suhteen käyttäen yhtä tai useampaa tässä keksin- | 20 nössä kuvattua sovellutusmuodon C mukaista oligonukleotidia | ja menetelmää. ' CD-peptidien tai CD-proteiinin luonnehtimiseen, modifioin- f tiin ja/tai muokkaamiseen voidaan käyttää myös geenien f 25 muokkausmenetelmiä. Saattaa esimerkiksi olla haluttua muut- 1 * : 2 taa ulkomembraamproteiinin fragmenttia kohdemutageneesillä ^ • · · l...: suo jäävien rakennealueiden ulkopuolisilta alueilta osa- l <t|{’ fragmentin liukoisuuden parantamiseksi, minkä avulla tämä on •f: helpompi puhdistaa. Geenien muokkausmenetelmiä voidaan t 30 käyttää lisäksi sellaisten DNA-sekvenssien muodostamiseen, | ··· . >m l1:·. jotka koodaavat osaa CD:n aminohapposekvenssistä. Esimerkik- • Il si SEKVENSSISSÄ ID NO:14 esitetystä sekvenssistä voidaan määrittää, mitä restriktioentsyymiä tai restriktioentsyymien • « · yhdistelmää voidaan käyttää CD-peptidejä tai CD-oligo- ί • · · - :!· * 35 peptidejä koodaavien sekvenssien muodostamiseen. Restriktio- 4 . .

·,♦ · entsyymien avulla suoritettava valinta voidaan tehdä siten, S

··1 , , , , , , ...

i : ettei tulokseksi saatavan peptidin tai oligopeptidin immuno- • • · · · ♦ i · • · · 2 • ·· '1 19 1 1 7789 " loginen potentiaali häviä. Proteiinin antigeenisten kohtien koko saattaa vaihdella, mutta se voivat sisältää noin 7 -noin 14 aminohappoa. Niinpä CD:n kokoinen proteiini voi sisältää monia erillisiä antigeenisiä kohtia; tästä syystä f; 5 monet geenin osasekvenssit voivat koodata CD:n antigeenisiä 1

epitooppeja. Tästä seuraa, että esimerkiksi SEKVENSSIN ID

; . . t NO: 14 opastamana voidaan restriktioentsyymiyhdistelmiä f

'K I

käyttäen muodostaa DNA-sekvenssejä, jotka sopivaan vektoriin : liitettynä kykenevät ohjaamaan sellaisten CD:lie spesifisten 10 aminohapposekvenssien (proteiinin, peptidien tai oligo- f peptidien) tuotantoa, jotka sisältävät yhden tai useamman antigeenisen epitoopin.

Sovellutusmuoto B

15 CD:tä koodaavan geenin säilyneisyys B. catarrhalis -kannois- sa

Jotta tämän keksinnön mukaiset nukleotidisekvenssit olisivat käyttökelpoisia diagnostisissa määrityksissä, täytyy CD:tä

20 koodaavan geenin olla erittäin hyvin säilynyt eri B. I

'· ·> catarrhalis -kannoissa. Erittäin hyvin säilynyt geeni tar- ) koittaa lisäksi myös sitä, että myös proteiinisekvenssi on i hyvin säilynyt. Jotta bakteeriproteiini tai -peptidi olisi käyttökelpoinen antigeeninä B. catarrhaliksen aiheuttamia | i 25 infektioita vastaan suunnatuissa alayksikkörokoteformulaa- ΐ • * ' 4' J ** tioissa, täytyy proteiinin tai peptidin sisältää epitoop- ! • · peja, jotka ovat sekä immunogeenisia että säilyneitä eri B.

« .,)·* catarrhalis -kannoissa. Eri B. catarrhalis -kantojen CD- *:**: . geenin säilyneisyysasteen määrittämiseksi monista erilai- j t ;*: 30 sista kliinisistä ja maantieteellisistä lähteistä saaduista ; • · · { ,‘j’. 30 isolaatista puhdistettiin ja analysoitiin niiden genomi- ; nen DNA (taulukko 1) . Analyysiin kuului DNA:n pilkkominen ;. j t S, restriktioentsyymeillä fragmenteiksi ja näiden käsittely \ • · * oligonukleotidikoettimellä, jonka sekvenssi sisältää, mai-• · * ,, 35 nittuihin kuitenkaan rajoittumatta, SEKVENSSIEN ID NO: 2 - ΐ • * j#; · 23 edustamat sekvenssit. : • · · ' i : *·« 1 • .

• · « · · * · ··· • * · 117789 20 /

Taulukko 1

Branhamella catarrhalis -isolaattien läh-

teet S

'

Ml

Kliininen esiintymis- | 5 kohta_ Isolaattien määrä

Yskös 15

;J I

Välikorvaerite1 7 , ίί

Nenänielu 3 10 Silmä 2

Kitarisa 1

Veri 1 atcc2 i 15 1 Välikorvaerite kerättiin tympanosenteesillä.

2 . American Type Culture Collection i,

Genominen DNA puhdistettiin 30 B. catarrhalis -kannasta (mukaan luettuna 25240). Tilavuudeltaan 30 ml:aan aivosydän-20 infuusiolihalientä ympättiin yksi pesäke ja sitä inkuboitiin 37 °C:ssa ravistellen yön yli. Solut kerättiin sentrifugoi- f! maila 2 200 x g:n voimalla 10 minuutin ajan 4 °C:ssa. Solu- I, :t\ napit suspendoitiin 7 ml:aan TE-puskuria (0,01 M Tris, pH 8, 0,001 M EDTA, pH 8,0). EDTA:n konsentraatio kohotettiin i 25 0,005 M:ksi ja SDS:n konsentraatio kohotettiin 0,5 %:ksi.

Tätä suspensiota inkuboitiin 60 °:ssa 30 minuutin ajan. (1 j *·· Seokseen lisättiin sellainen määrä proteinaasi K:ta, että 1' t**': sen konsentraatioksi tuli 200 ug/ml, minkä jälkeen suspen- » * » ··· siota inkuboitiin 37 °C:ssa noin 24 tuntia. Näyte uutettiin • · ·· 30 peräkkäin fenolilla ja sen jälkeen fenolin ja kloroformin ·, suhteessa 1 : 1 valmistetulla seoksella ja sitten kloro- ' ; I · · .

'.V. formilla yhtä suuria tilavuuksia käyttäen. Seokseen lisät- » : : * tiin 10 tilavuus-% 3 M natriumasetaattia (pH 5,2) ja DNA saostettiin lisäämällä kylmää etanolia, jonka tilavuus • · · ΐ *"·* 35 vastasi 80 % seoksen tilavuudesta. Genomin DNA saostui ja se • · ·

V * poistettiin "kiertämällä" se pasteurpipetin ympärille. DNA I

• ; : pestiin 70-%:isessa etanolissa ja liuotettiin 0,05 M s * * * * j···. Tris: iin, jonka pH oli 8,0. Seokseen lisättiin sellainen i *·* määrä RNaasia, että tämän lopulliseksi konsentraatioksi tuli : «Hl*

* I

;; tl Ψ « « I * • * · 117789 1 21 40 /ig/ml, ja näytettä inkuboitiin 37 °C:ssa 30 minuutin ajan. Seokseen lisättiin sellainen määrä EDTA:ta, että sen konsentraatioksi tuli 0,001 M. Näyte uutettiin peräkkäin i; fenolilla ja kloroformilla ja seostettiin etanolilla. Puh- |

5 distettu DNA liuotettiin seokseen, joka sisälsi 0,01 M I

Λ

Tris’ia ja 0,1 mM EDTA;a ja jonka pH oli 8,0. 1 .1» DNA-näyte, joka vastasi suuruudeltaan 10 μ<3, pilkottiin |

EcoRIrllä tai Pstl:llä reaktiot il avuuden ollessa 0,5 ml.

10 Tästä saadut DNA-fragmentit erotettiin agaroosigeelielektro-foreesilla ja siirrettiin varatulle nitroselluloosa- membraanille Southern-blottaamalla. Southern-blotit käsi- ; teltiin kahdella oligonukleotidikoettimella, joiden sek- j venssit vastasivat CD:tä koodaavassa geenissä olevan EcoRI-15 kohdan suhteen vasta- ja myötäsuuntaan sijaitsevia sekvens- 1 sejä (tämä Eco Rl -kohta on kuvattu kuviossa 1) . Ennen kuin ,? i oligonukleotidejä käytettiin koettimina ne oli varustettu toisesta päästään [32P] ATP-leimalla T4-polynukleotidikinaasia käyttäen. Hybridisaatiot tehtiin 37 °C:ssa ja pesut suori- j 20 tettiin 48 °C:Ssa. Hybridisaatio- ja pesuliuokset on kuvattu | aikaisemmin (Nelson, et ai., edellä). Autoradiografia teh- : tiin -70 °C:Ssa.

Kaikista 30 kannasta saatiin identtinen vyöhykekoostumus, ' 25 mukaan luettuna 325 ke:n vyöhyke, joka edustaa fragmenttia, ;j • 1·· joka sijaitsee geenissä olevan EcoRI-kohdan ja geenistä j t2|: myötäsuuntaan sijaitsevan kohdan välissä. Lisäksi kaikissa | ··· 30 kannassa havaittiin 3,7 ke:n vyöhyke, joka edustaa CD- j • · 1 · f geenistä vastasuuntaan sijaitsevaa fragmenttia. Tästä koos- i *, 30 tumuksesta on esitetty esimerkki kuviossa 4, jossa on esi- f t ♦ · tetty 13 kannasta tehty Southern-blottimääritys.

t · ♦ CD-geenin molekulaarisen säilyneisyyden analysoimiseksi • · ♦ ♦5·1 tarkemmin pilkottiin näistä samoista 30 kannasta peräisin 1 ♦· · £ V : 35 oleva genominen DNA EcoRI:llä ja Pstl:llä ja käsiteltiin i i .1· oligonukleotidikoettimilla. Kuviosta 1 käy ilmi, että kan- • ♦ « · j···. nasta 25240 eristetyssä CD:tä koodaavassa geenissä on PstI- « · · • · · · · V' • ♦ · ' -i- · · 2 • · · • · u r r . > . . k "rt 22 1 1 7789 : kohta geenin keskikohdan läheisyydessä ja että pilkkomalla EcoRI.-llä ja Pstlrllä saadaan 337 emäsparin mittainen DNA-fragmentti. Southern-blottimäärityksistä havaittiin, että ; kaikista 30 B. catarrhalis -kannasta peräisin olevista i| 5 genomisista DNA-molekyyleistä saatiin identtinen 337 ep:n | fragmentti, joka hybridisoitui oligonukleotidiin, jonka (.j sekvenssi vastasi kannasta 25240 eristetyn CD:ta koodaavan " }\ geenin sekvenssiä. Tästä tuloksesta on esitetty esimerkki ?' kuviossa 5, jossa on esitetty 13 kannasta tehty Southern- $\ 10 blottimääritys. Nämä havainnot osoittavat, että CD:tä koo-daava geeni on erittäin hyvin säilynyt B. catarrhalis -kannoissa, ja näin ollen tässä keksinnössä esitetyillä nukleo- tidisekvensseillä on sovellutuksia diagnostiikassa ja rokot- ? /1 teissä. : 15

Sovellutusmuoto C ' ii

Menetelmiä CD:lie spesifisten nukleotidisekvenssien käyttä- i miseksi molekyylidiagnost isissä määrityksissä B. catarr- ti haliksen havaitsemiseksi. i|| 20 f

Koska CD:tä koodaava geeni on säilynyt, kuten sovellutus- v: muodossa B on kuvattu, niin tämän keksinnön mukaisia nuk- leiinihapposekvenssejä voidaan käyttää molekyylidiagnosti- sissa määrityksissä B. catarrhaliksen geneettisen materiaa-

.. 25 Iin havaitsemiseksi. Erityisesti voidaan syntetisoida CD:n I

* # • sekvenssille spesifisiä oligonukleotidejä, joita voidaan i käyttää alukkeina ja/tai koettimina B. catarrhaliksesta # . · peräisin olevien nukleiinihappojen monistamisessa ja näiden "**: monistettujen molekyylien havaitsemisessa. Viimeaikaisen , , "ii t : : 30 molekyylibiologian alalla tapahtuneen edistyksen ansiosta on i ··* saatu käyttöön useita keinoja nukleiinihapposekvenssien monistamiseksi entsymaattisesti. Nykyään tavallisimmin ^ käytetyssä menetelmässä, PCR™:ssä (polymeraasiketjureaktio, t * * IV, Cetus Corporation) , käytetään Taq-polymeraasia, alukkeina • · * 35 tunnettuja sekvenssejä ja lämpösyklikäsittelyä, jolla repii- ί · ·.· · koituvat deoksiribonukleiinihappo (DNA) -juosteet erotetaan Γ*]: ja haluttu geeni monistetaan eksponentiaalisesti. Muita • * • · · • ·* • · . 23 1 1 7789 parhaillaan kehitettävänä olevia monistusmenetelmiä ovat LCR™ (ligaasiketjureaktio, BioTechnica International), jossa käytetään hyväksi DNA-ligaasia ja koet intä, joka koostuu kahdesta sen DNA-segmentin puolikkaasta, joka on komplemen- fi

5 taarinen monistettavan DNA:n suhteen; entsyymi-QB-replikaasi V

(Gene-Trak Systems) ja ribonukleiinihappo (RNA) -sekvenssi-templaatti, joka on liitetty kopioitavan DNA: n suhteen komplementaariseen koettimeen ja jota käytetään sellaisen DNA-templaatin valmistukseen, joka on tarkoitettu komplemen-10 taarisen RNA:n valmistamiseksi eksponentiaalisesti; ja NASBA™ (nukleiinihapposekvenssiin perustuva monistus, Can- " gene Corporation), jossa monistettavana nukleiinihappo-sekvenssinä voi olla RNA:ta tai DNA:ta.

15 Spesifisiin geenisekvensseihin hybridisoitumaan kykeneviä nukleiinihappokoettimia on käytetty suotuisin tuloksin ·; spesifisten patogeenien havaitsemiseen biologisista näyt-teistä herkkyystasojen lähestyessä arvoa 103 - 104 organismia i; näytteessä (Gene Probes for Bacteria, toim. Macario ja t” 20 deMacario, Academic Press, 1990). Kun lajispesifiset >' ui nukleiinihappokoettimet yhdistetään menetelmään, jonka avulla spesifisiä kohde-DNA-sekvenssejä kyetään monistamaan, voidaan organismien havaitsemisherkkyyttä kliinisistä näyt-teistä lisätä huomattavasti. Näiden koettimien avulla saat- i 25 taa olla mahdollista havaita solut suoraan ennen havaitse- 7' * * « ·« mistä suoritettavaan viljelyyn ja/tai tavanomaisiin bio- t • · '··· kemiallisiin tunnistusmenetelmiin turvautumatta. Tämän ?l • t · ···’· keksinnön tämä sovellutusmuoto on suunnattu alukkeisiin, ; •*· joiden avulla voidaan monistaa B. catarrhaliksen CD:tä * , ,1 *,·/ 30 koodaavan geenin lajispesifisiä sekvenssejä, ja koettimiin, v t : : jotka hybridisoituvat spesifisesti näihin monistettuihin DNA-fragmentteihin. Tämän keksinnön mukaisia nukleiinihappo- j ja käyttämällä ja tämän keksinnön mukaisten menetelmien ··· mukaisesti voidaan havaita jopa vain yksi B. catarrhalis i1 ·' 35 -organismi, kun läsnä on 10 μg/ml vierasta DNA:ta.

• » t * * · • · · ♦ t : • ' l· ····· - i • · » * • · · • ·· • ♦ 1 1 77 89 Tämä sovellutusmuoto kohdistuu lajispesifisiin oligonukleo-tideihin, joita voidaan käyttää B. catarrhaliksen DNA-sek-venssien monistamiseen, mikäli tätä esiintyy, kliinisistä ’ näytteistä, kuten välikorvaeritteestä, ysköksestä, verestä 5 ja nenänielu-, silmä- ja kitarisaeritteestä, eristetystä DNA:sta; ja sen jälkeen sen määrittämiseen, onko monistumista tapahtunut. Yhdessä tämän keksinnön sovellutusmuodossa käytetään B. catarrhalikselle spesifistä oligonukleotidi-alukeparia, jotka hybridisoituvat B. catarrhaliksen genomin 10 DNA:hän, jos sitä on kliinisestä näytteessä eristetyssä DNA:ssa, ja joiden avulla näiden kahden reunustavan alukkeen välinen spesifinen genomisen DNA:n sekvenssi voidaan monistaa ensymaattisella synteesillä ja lämpösyklikäsittelyllä.

Kukin alukepari on suunniteltu siten, että ne hybridisoitu-15 vat ainoastaan niihin tämän keksinnön mukaisiin B. catarrhaliksen nukleotidisekvensseihin, joiden suhteen ne on 5 syntetisoitu komplementaarisiksi; kumpikin kuhunkin kaksi-juosteisen DNA:n juosteeseen. Tämä reaktio on näin ollen spesifinen vaikka näytteessä esiintyisi jopa mikrogramman 20 luokkaa olevia määriä heterologista DNA:ta. Tämän patentti- ί, selityksen tarkoituksia varten DNA-.n positiivisesta (geeni) juosteesta peräisin olevasta alukkeesta käytetään nimitystä "positiivinen aluke" ja juosteen negatiivisesta (komplemen-taarisesta) sekvenssistä peräsin olevasta alukkeesta käyte-25 tään nimitystä "negatiivinen aluke".

« «

♦ -V

* · · t *...· DNA:ta voidaan monistaa millä tahansa kaupallisesti saata- villa olevalla menetelmällä. DNA: n monistamiseen voidaan « ***** käyttää esimerkiksi polymeraasiketjureaktiota. Sitten kun t 30 alukkeet ovat hybridisoituneet kohde-DNA:n vastakkaisiin [ f * * juosteisiin, niin lämpötilaa nostetaan siten, että lämmön-kestävä DNA-polymeraasi pystyy replikoimaan kahden alukkeen välisellä alueella olevan spesifisen DNA-segmentin. Tämän Λ ♦ * ϊ.\ jälkeen reaktioseosta käsitellään lämpösykleillä niin, että 5 · · *. 35 jokaisen syklin aikana alukkeiden välisiä sekvenssejä edus- # · ·.· · tavan DNA .-n määrä kaksinkertaistuu ja tämän seurauksena B.

catarrhaliksen DNA-sekvenssit monistuvat spesifisesti, * ···*'-* * • * ϊ ·.: • · 25 117789 mikäli näitä esiintyy näytteessä. B. catarrhaliksen DNA:sta peräisin oleva monistettu DNA-fragmentti voidaan sitten t tunnistaa nestehybridisaatiolla. Tässä tutkimuksessa käyte- f tään koettimina yhtä tai useampaa leimalla varustettua / 5 oligonukleotidia, jotka hybridisoituvat spesifisesti B. ' catarrhaliksen DNA:n monistettuun segmenttiin. Sekvenssi-spesifisen monistetun DNA:n esiintyminen voidaan havaita millä tahansa monista tällä alalla tunnetuista menetelmistä, f

M

kuten geelissä suoritettavalla retardaatiomäärityksellä, Γ' 10 jossa käytetään autoradiografiaa. Tämän keksinnön mukaisista nukleotidisekvensseistä saadaan näin ollen käyttöön perusta sellaisten oligonukleotidien synteesille, joita voidaan soveltaa kaupallisesti B. catarrhaliksen havaitsemiseen tarkoitetuissa diagnostisissa testipakkauksissa. Tähän ji 15 liittyvässä sovellutusmuodossa alukkeina käytetyt oligo- nukleotidit voidaan varustaa suoraan leimalla tai synte- p tisoida siten, että niistä tulee leimalla varustettuja. Kun monistustuotteet ovat sitoutuneet affiniteettimatriksiin, ne voidaan sitten havaita käytetyn leiman mukaan isotooppi- ^ 20 menetelmällä tai kolorimetrisesti. ?.

Vi DNA voidaan uuttaa B. catarrhalista mahdollisesti sisältävistä kliinisistä näytteistä käyttäen tällä alalla tun- \ nettuja menetelmiä. Näytteen sisältämät solut voidaan esi-25 merkiksi pestä TE-puskurissa ja ne voidaan sentrifugoida \ • 9

•>#** napiksi. Tämän jälkeen solut voidaan suspendoida uudelleen I

*···* 100 μΐ-.aan monistusreaktiopuskuria, joka sisältää deter- .... . . ...... i gentteja ja proteinaasi K:ta. Kun käytetään polymeraasi- » ketjureaktiota, tulokseksi saatavan soluja sisältävän näyt- i ij]: 30 teen koostumus voi olla 10 mM Tris, pH 8,3, 50 mM KC1, *·': 1,5 mM MgCl2, 0,01 % gelatiini, 0,45 % NP40™, 0,045 % Tween i 20™ ja 60 μg/ml proteinaasi K:ta. Näytettä inkuboidaan * .*: 55 °C:ssa vesihauteessa 1 tunnin ajan. Inkubaation jälkeen #·* näytettä inkuboidaan 95 °C:ssa 10 minuutin ajan proteinaasi « .Ί 35 K:n inaktivoimiseksi. Tämän jälkeen näyte voidaan monistaa li * · ♦ ' 'n, h: ί jäljempänä esitettyjen polymeraasiketjureaktiolle soveltu- • 4 · ‘.,.* vien suoritusvaiheiden mukaisesti.

• : φ *···*' -j" • · . t . ..11 » » * * * • ·» • · ; . 1 26 1 1 7789 \ B. catarrhaliksen DNA voidaan monistaa käyttäen mitä tahansa monista menetelmistä, joita käytetään nukleiinihappojen ; 'M.

. E

monistuksessa polymeraasiketjureaktiolla. Yhdessä tämän 1 sovellutusmuodon suoritustavassa CD:tä koodaava geeni monis- f 5 tettiin 25 kliinisestä B. catarrhalis -isolaatista käyttäen f seuraavia olosuhteita. Monistettava DNA (»1 μg genomista ^ DNA:ta) jaettiin 0,5 ml:n mikrosentrifugikoeputkiin ja r tilavuus säädettiin 50 ^l:ksi lisäämällä reaktioseosta, | jonka koostumus oli 0,2 mM dNTP-molekyylejä (dATP:tä, 10 dCTP:tä, dGTP:tä, dTTP:tä), 0,25 μg kutakin positiivista ja - negatiivista oligonukleotidialuketta, 1 yksikkö Taql-poly-meraasia, 10 x TaqI-puskuria (5 μΐ) , 1 mM MgCl2 (lopullinen konsentraatio) ja steriiliä tislattua vettä seoksen säätämä- '1 seksi lopulliseen tilavuuteensa. TaqI-polymeraasi lisätään 15 reaktioseokseen juuri ennen käyttöä ja reaktioseosta sekoi- *> tetaan kevyesti eikä suurella voimalla. Kuhunkin koeputkeen | lisätään mineraaliöljykerros, noin kaksi pisaraa, ja tämän | jälkeen koeputket viedään lämpösyklilaitteeseen. Bakteeri- j

DNA:n monistukseen riittää yleensä 30 - 35 sykliä. Yhden J

4; 20 syklin aikana näyte on 1 minuutin ajan 95 °C:ssa, 1 minuutin l ajan 37 °C:ssa ja 1 minuutin ajan 72 °C:ssa. Ensimmäiseen 1 sykliin kuuluu 1,5 minuutin inkubaatio 95 °C:ssa, minkä tarkoituksena on varmistaa DNA:n täydellinen denaturoitumi- f

nen. I

..25 f • · -» *„** B. catarrhaliksen CD:tä koodaavaan geeniin spesifisesti • ’. j *»·* hybridisoituvina alukkeina tai koettimina käyttökelpoisia ja DNA: n monistuksessa ja/tai havaitsemisessa käytettäviä i oligonukleotideja voidaan syntetisoida biokemiallisesti täs- - 1,·^ 30 sä keksinnössä kuvattujen nukleotidisekvenssien perusteella f |T: tällä alalla tunnettuja menetelmiä käyttäen. Näiden oligo- ? nukleotidien spesifisyys B. catarrhalista kohtaan voidaan . tarkistaa etsimällä geenipankin tietokannasta (Genbank) ·«· kutakin yksittäistä sekvenssiä. Oligonukleotidit tulisi i • « · "fr 35 yleisesti ottaen valita siten, että niissä on vähän G-C- Ί i.l l ryhmiä. Niitä alukepareja, joita tässä sovellutusmuodossa on * ·« · käytetty koko CD:tä koodaavan geenin monistamiseen, ovat SEQ ί » ***** Jv' • * ·? V · » « · ♦ ** « * 27 117789 ID NO:15 (negatiivinen aluke) ja SEQ ID NO:16 (positiivinen aluke). Niitä alukepareja, joita on käytetty sen geenin osan monistukseen, joka koodaa epitooppeja 5E8 ja 7D6, ovat SEQ ID NO:17 (negatiivinen aluke) ja SEQ ID NO:18 (positiivinen f 5 aluke). i

Havaitsemista varten voidaan tämän keksinnön mukaiset oligo- , f\ nukleotidit varustaa toisesta päästään radioaktiivisella äj isotooppileimalla. Geenisekvenssin monistukseen käytettävien ; 10 kahden alukkeen sisältämät koetinsekvenssit voidaan varustaa toisesta päästä leimalla käyttäen T4-polynukleotidikinaasia ja gamma - 32P - ATP: ta. 2 0 pmol suuruinen määrä koetin-DNA: ta, joka on valmistettu kinaasipuskuriin (50 mM Tris, pH 7,6, .j 10 mM MgCl2, 5 mM ditiotreitoli, 0,1 mM spermidiini-HCl, i 15 0,01 mM EDTA, pH 8,0), yhdistetään 120 μΟί:η suuruiseen määrään gamma-32P-ATP:ta ja seosta inkuboidaan 37 °C:ssa | 1 tunnin ajan. Leimalla varustettu koetin erotetaan koetti- * meen liittymättömästä leimasta 8-%:isessa akryyliamidi-geelissä, jota ajetaan 1 tunnin ajan 200 voltin jännitteellä ΐ 20 Tris-boraatti-EDTA (TBE)-puskurissa huoneenlämmössä. Ensin f leimalla varustettu koetin paikannetaan valottamalla - röntgenfilmiä akryyliamidigeelin päällä kolmen minuutin : ajan. Tämän jälkeen tulokseksi saatu autoradiogrammi sijoi- tetaan geelin alle ja leimalla varustettua koetinta sisältä-··. 25 vä vyöhyke leikataan irti geelistä. Geeliviipale jauhetaan • * · -i'

hienoksi yhteen millilitraan steriiliä tislattua vettä ja I

* · f *” koetin eluoidaan inkuboimalla ravistimella yön yli »t# ·*·*, 37 °C:ssa. Eluoitu koetin erotetaan geelitragmenteista v *··*» sentrifugoimalla kromatografia preparatiivista kolonnia 30 käyttäen. Koettimen radioaktiivisuus määritetään laskemalla ί ·♦· *.*1 nestetuikelaskimella iskut lasikuitusuodattimella olevasta

yhdestä mikrolitrasta leimalla varustettua koetinta. Tällai-i :*· nen koetinsekvenssi voi olla mikä tahansa SEKVENSSEINÄ ID

pm € .*·*; NO:2 - 13 identifioitavissa oleva sekvenssi edellyttäen, • > . *, 35 että koetinsekvenssi sisältyy niihin kahteen alukkeeseen, i Λ f · “jy joita käytetään tässä keksinnössä kuvatun halutun nukleo- f * i ·«♦* tidisekvenssin monistukseen.

***** • * » » * m 9 * ·· • · ? Λ» 28 1 1 7789 k

Monistettujen kohdesekvenssien havaitsemista voidaan paran-

!> I

taa tällä alalla tunnetuilla vaihtoehtoisilla menetelmillä p tämän keksinnön mukaisten koostumusten ja menetelmien mukaisesti. Monistettujen DNA-sekvenssien havaitsemisherkkyyttä 5 voidaan parantaa tekemällä sekvensseille nestehybridisaatio.

Geelielektroforeesin ja Souther-hybridisaation ja auto- . I

radiografian kanssa tehtävän geelielektroforeesin lisäksi |

vaihtoehtoisia tällä alalla tunnettuja havaitsemis- I

menetelmiä, joita voidaan käyttää tämän keksinnön mukaisten 10 koostumusten ja menetelmien kanssa, ovat: pilkkominen restriktioentsyymeillä geelielektroforeesiin yhdistettynä; slot-blot-hybridisaatio, jossa käytetään leimalla varustettua oligonukleotidikoetinta; monistaminen radioaktiivisella ;!

leimalla varustetulla alukkeella yhdessä geelielektro- I

15 foreesin, Southern-hybridisaation ja autoradiografiän kans- T

sa; monistaminen oligonukleotideilla, jotka sisältävät affiniteettileiman (esimerkiksi biotiinin, tai toinen aluk-keista on biotiinia sisältävä aluke ja toisen alukkeen sekvenssi on spesifinen DNA:hän sitoutuvan proteiinin suh- j 20 teen) ja sen jälkeen havaitseminen affiniteettiin perustu- i valla määrityksellä (esimerkiksi ELISA:11a); ja monistaminen, jossa käytetään fluoroforeja sisältäviä oligonukleo- .

tidejä, jonka jälkeen tulos havaitaan fluoresenssin perus- ( teella.

25 j j*. Yhdessä sellaisessa havaitsemisen sovellutusmuodossa, joka Ϊ ♦ * · .? ei perustu isotooppien käyttöön, liitetään tämän keksinnön **· mukaisiin oligonukleotidialukkeisiin biotiinia. Alukkeiden • · * ..1 ···· 5'-pään aminoryhmä voidaan biotinyloida sulfo-NHS-biotii- • ♦ · · · * * 30 nilla tai biotiini voidaan liittää suoraan alukkeeseen syn- ; tetisoimalla aluke biotiinilla varustettujen dNTP-molekyy- • * · ·*.·’ ‘ lien läsnäollessa. Tämän jälkeen ei-isotooppileimalla varus- j tettuja alukkeita käytetään kliinisestä näytteestä peräisin • j*: olevan DNA:n monistamiseen. Monistettujen kohdesekvenssien · · 5 35 esiintyminen tai niiden puuttuminen voidaan havaita sieppaa- '% • maila monistetut kohdesekvenssit af f initeettimatriksiin, • · .

• · · ·* johon on sitoutunut avidiinia, ja tämän jälkeen matriksia ) s**’: i • · * ·* *····- < • * ♦ ♦ • * · • · · i ♦ · 29 I 1 1 7789 inkuboidaan sellaisen avidiinikonjugaatin kanssa, joka sisältää entsyymin, jota sitten voidaan käyttää kompleksin visualisoimiseen substraatin avulla kehittämällä. Monistetut kohdesekvenssit voidaan vaihtoehtoisesti immobilisoida |

5 hybridisoimalla ne kohdesekvenssiä vastaaviin matriksiin J

kiinnitettyihin koettimiin. Havaitseminen voi tapahtua \ käyttäen avidiinikonjugaattia, joka sisältää entsyymin, jota voidaan sitten käyttää kompleksin visualisoimiseen substraa- | tiliä kehittämällä.

10 ;

Sovellutusmuoto D

CD: n luonnehtiminen, CD-peptidien muodostaminen mukaan luettuna.

15 Sen varmistamiseksi, että CD:tä koodaava geeni oli identi- f fioitu, määritettiin CD-proteiinin aminoterminaalinen pää. j CD-proteiinin aminoterminaalisen pään identifioimiseksi B. ·1

catarrhalis 25240:n puhdistettua ulkomembraania käsiteltiin SDS-PAGE:lla ja se siirrettiin polyvinylideenidifluoridi- I

20 membraanille elektroforeettisesti blottaamalla. CD-vyöhyke i leikattiin irti ja proteiinin aminoterminaalinen sekvenssi määritettiin Edmundin hajottamisella siten, että aminohapot analysoitiin mikrosekvensointilaitteella. Aminoterminaalinen sekvenssi G-V-T-V-S-P-L-L-L-G vastasi pCDl:n avoimen luku- i 25 kehyksen aminohappoja 27 - 36, mikä osoittaa, että CDtssä on \ "... 26 aminohapon johtopeptidi. Hydrofobinen 26 aminohapon : φ .···. johtopeptidi on tyypillinen bakteerin OMP-molekyyleille, 1 joiden johtopeptidi pilkkoutuu signaalipeptidaasi l:n vaiku- 1 *“. tuksesta [Oliver, Ann. Rev. Microbiol. 39 (1985) 615 - 648]. 1 • · 30 • · f j.

*···1 Pitävien lisätodisteiden hankkimiseksi siitä, että CD:tä • · · *·1 ‘ koodaava geeni oli identifioitu, analysoitiin geenisekvens sistä päätellystä aminohapposekvenssistä metioniiniryhmät, i,·.1 minkä tarkoituksena oli ennustaa proteiinin syanogeeni- 35 bromidilla suoritettavan pilkkomisen tulos. Kypsää proteii- i . nia vastaavassa avoimessa lukukehyksessä on neljä metio- • 1 · Ί· niiniä, mikä osoittaa, että syanogeenibromidilla tehtävästä ‘ * · « • · • · 1 « ·« • · 117789 30 / pilkkomisesta saataisiin viisi fragmenttia. CD pilkottiin syanogeenibromidilla puhdistamalla ulkomembraani [Murphy, et ai., Infect. Immun. 57 (1989) 2938 - 2941] ja käsittelemällä m ulkomembraanipreparaatti SDS-PAGE:11a. Geeli värjättiin .

J I

5 amidomustalla CD-vyöhykkeen visualisoimiseksi ja sen leik- 5 kaamiseksi irti geelistä. Geeliviipaleet (pituudeltaan 3 - 4 mM) asetettiin elektroeluointilaitteen koeputkiin, joissa oli 0,05 M ammoniumvetykarbonaattia, 0,1 % SDS:ää. Proteiinia eluoitiin 10 mA:n virralla koeputkea kohti kunnes geeli- 10 viipaleissa ei ollut jäljellä yhtään amidomustaa (noin 5 tuntia). Eluoitu proteiini koottiin talteen ja siitä otettu 0,6 ml:n näyte saostettiin lisäämällä 2 ml kylmää etanolia. Näyte sentrifugoitiin ja nappi kuivattiin ilmassa.

Nappiin lisättiin 0,4 ml syanogeenibromidia (200 mg/ml) i, 15 70-%:isessa muurahaishapossa ja näytettä inkuboitiin yön yli r huoneenlämmössä pimeässä. Kontrollinäytettä inkuboitiin £ samanaikaisesti 70-%:isessa muurahaishapossa samanlaisissa v olosuhteissa. Seuraavana päivänä näytteisiin lisättiin 1 ml ^ vettä ja näytteet lyofilisoitiin. Lyofilisoidut peptidit ^ 20 suspendoitiin näytepuskuriin ja niille tehtiin tricine- f geelielektroforeesi. v; >!

Taulukossa 2 on esitetty avoimessa lukukehyksessä olevien metioniinikohtien perusteella ennustetut fragmenttien (CD-25 peptidien) koot. Kuviossa 6 on esitetty puhdistetun CD:n f syanogeenibromidikäsittelystä saadut todelliset fragmentit l! määritettynä Lessen, et ai., mukaisesti tehdyllä tricine- * 1 1 polyakryyliamidigeelijärjestelmällä [J. Immunol. Methods 126 * (1990) 109 - 117]. Syanogeenibromidilla pilkottujen frag- i • 1 . 30 menttien ennustetut ja todelliset koot sopivat hyvin yhteen f' **· ainoan poikkeuksen ollessa proteiinin aminoterminaaliselta t · 1 ·1 ’ alueelta peräisin oleva suuri fragmentti (taulukko 2).

• · · * 1 · *··.

* · · * · · • ^ • · • · · • · · • 1 · 1 • · · t : * · 1 ····'.

* · \ · * « · • · · · 3x 1 1 7789

Taulukko 2 '

Branhamella catarrhaliksen CD-ulkomembraaniproteiinin j1 syanogeenibromidilla suoritetusta pilkkomisesta saadut {

fragmentit J

'1 5 Geenisekvenssin2 perusteella SDS-PAGE:sta3 määritetty i1 ennustettu moolimassa1 moolimassa ; 34 919 -50 000 ' 10 4 408 4 900 ? 3 593 4 000 2 450 2 500 358 f 1 Suhteelliset moolimassat on esitetty daltoneina p 15 2 Nukleotidisekvenssi on esitetty SEKVENSSISSÄ ID NO: 14 Ί.

3 SDS-PAGE: Natriumdodekyylisulfaattipolyakryyliamidigeeli-elektroforeesi. Tricine-geelit on esitetty kuviossa 6.

Näin ollen pCDlrSsä identifioitu avoin lukukehys edustaa f 20 koko CD:tä koodaavaa geeniä ja proteiini käyttäytyy poik- t

, keavasti SDS-PAGE:ssa. Vaikuttaa siltä, että tämä ristiriita T

ennustetun suhteellisen moolimassan ja SDS-PAGE:ssa havaitun t ; suhteellisen moolimassan välillä johtuu suuressa syanogeeni- f bromidifragmentissa olevasta proliinipitoisesta alueesta 25 proteiinin aminoterminaalisella alueella, koska tämä on \ tyypillistä monille erilaisille proliinipitoisille proteii- f neille [Postle, et ai., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 50 (1983) f • ·ί 5235 - 5239; Woods, et ai., Mol. Microbiol. 3(1) (1989) 43 - ί 48; ja Thole, et ai., Infect. Immun. 58 (1990) 80 - 87] . | • «· j

30 S

* 1 * 1

Sekvenssitietokannoista tehty haku osoitti, että CD-geenillä i * ' « ί **", on yhteisiä homologisia alueita Pseudomonas-bakteerin OprF- [ geenien suhteen. CD-proteiinissa on alue (aminohapot 240 - j • 1 · ~ *·ϊ·1 280) , jossa on runsaasti proliinia, alaniinia ja valiinia. :·: * 1 1 *.1 · 35 Tällä sekvenssillä on yhteisiä homologisia alueita E. colin \ ja Serratia marcescensin TonB-proteiinin kanssa.

• · · Ä • · · . · ' f.

**· &

Sovellutusmuoto E i » 1 · -- . 1, Menetelmiä CD:n tai CD-peptidien käyttämiseksi diagnostisis- • · · ·;;/ 40 sa immunomäärityksissä Γ": • · · *···1 • · ' » 1 · • · · . .11 1 1 7789 ? 32 i CD-proteiini, CD-peptidit ja CD-oligopeptidit voidaan puh- . „ . .. i' distaa siten, että niitä voidaan käyttää immunogeeneina

*« I

rokoteformulaatioissa; sekä antigeeneinä diagnostisissa .;i'

, ’‘Vi I

määrityksissä tai sellaisten B. catarrhalikselle spesifisten | i 5 antiseerumien muodostamisessa, joilla on terapeuttista i ja/tai diagnostista käyttöä. B. catarrhaliksen CD-proteiinia | tai sen oligopeptidejä tai peptidejä tai ilmentämisvektori- f systeemissä valmistettuja yhdistelmä-CD-proteiinia, yhdis- | s telmä-CD-peptidejä tai yhdistelmä-CD-oligopeptidejä voidaan § 10 puhdistaa tällä alalla tunnetuilla menetelmillä, joita ovat :- uutto detergentillä, kromatografia (esimerkiksi ioninvaihto-, affiniteetti- tai immunoaffiniteettikolonnit tai koon mukaan erottelevat kolonnit), erottelusentrifugointi, erotteluliuotus, tai jollain muulla tavanomaisella proteii- 15 nien puhdistukseen käytetyllä menetelmällä. f i S.

1) Osittain puhdistettu valmiste, joka sisältää pääasiassa | bakteerin ulkomembraaniproteiineja, voidaan valmistaa esi- %

merkiksi seuraavalla tavalla. 30 suklaa-agarmaljalta peräi- J

20 sin olevat B. catarrhalis -viljelmät kaavittiin 25 ml:aan ·| • f- PBS:ää, pH 7,2 ja bakteerit koottiin talteen sentrifugoimal- ^ la näytteitä 12 000 x g1.n voimalla 20 minuutin ajan i

4 °C:ssa. Bakteennappi suspendoitiin uudelleen 10 ml:aan I

ψ.

seosta, jonka koostumus oli 1 M natriumasetaatti ja 0,001 M t ‘1 25 /S-merkaptoetanoli (pH 4,0). Näytteeseen lisättiin 90 ml ;

liuosta, joka sisälsi 5 % Zwittergent Z 3-14 :ää (Calbiochem- I

.·1·. Behring) ja 0,5 % CaCl2:ta, ja suspensiota sekoitettiin 1 1 tunnin ajan huoneenlämmössä. Nukleiinihapot saostettiin ί « 't

\[m\· lisäämällä 25 ml kylmää etanolia ja sen jälkeen sentrifugoi- J

• ·

. 30 maila 17 000 x g:n voimalla 10 minuutin ajan 4 °C:ssa. I

( 1 · l" Jäljelle jääneet proteiinit saostettiin lisäämällä 375 ml £ | · · .C; ·1 1 kylmää etanolia ja ne koottiin talteen sentrifugoimalla 17 000 x g:n voimalla 20 minuutin ajan 4 °C:ssa. Nappien ) annettiin kuivua, jonka jälkeen ne suspendoitiin 10 ml:aan j • · · , · 4.

ί,ί ί 35 detergenttipuskuria, jonka koostumus oli 0,05 % Zwitter- 1- • .·. gent’ia, 0,05 M Tris, 0,01 M EDTA:ta, pH 8,0, ja reaktio- \ • » · *it.1 seosta sekoitettiin 1 tunnin ajan huoneenlämmössä. Bakteerin » : . .5: * • · · · 1 • « 1 · ' v· ··1· • · · • · ‘ . .-4 117789 ? 33 ulkomembraaniproteiinit saadaan detergenttipuskurin liukoiseen fraktioon sen jälkeen, kun näytteitä on sentrifugoitu 12 000 x g:n voimalla 10 minuutin ajan 4 °C:ssa. S\ <5 '/fi! 5 CD-proteiini voidaan puhdistaa immunologisesti ulkomemb- i raaniproteiinivalmisteesta käyttäen tällä alalla immuno-affiniteettikromatografiän yhteydessä tunnettuja menetelmiä.

CD:lie spesifisiä monoklonaalisia vasta-aineita, kuten | 5E8:aa ja 7D6:a, voidaan kytkeä kromatografiamatriksiin, 10 mistä saadaan muodostettua affiniteettimatriksi. Tämän

jälkeen ulkomembraaniproteiinivalmistetta inkuboidaan af-finiteettimatriksin kanssa, jolloin vasta-aineet pystyvät sitoutumaan CD:hen. Tämän jälkeen affiniteettimatriksi pestään sitoutumattomien komponenttien poistamiseksi ja CD

15 eluoidaan sitten affiniteettimatriksista, mistä saadaan |l puhdistettu CD-proteiinivalmiste. Puhdistettua CD:tä voidaan käyttää antigeeninä diagnostisissa määrityksissä tai se f· voidaan pilkkoa kemiallisesti tai entsymaattisesti peptideiksi sovellutusmuodossa D kuvatulla tavalla. CD-peptidejä 20 voidaan vaihtoehtoisesti syntetisoida CD:tä koodaavasta i geenistä päätellyn aminohapposekvenssin avulla.

2) Tämän sovellutusmuodon toisessa esimerkissä yhdistelmä- " CD:tä puhdistettiin polyhistidiini-ilmentämisplasmidista. j i ! 25 Yhdistelmä-CD:n puhdistamiseksi tällä menetelmällä CD:tä - :*. koodaava geeni kloonattiin polyhistidiini-ilmentämis- : · · t*··, vektoriin, kuten pRSETA:aan (Invitrogen Corporation) , siten,

II

että CD-proteiinin ilmentyessä sen aminoterminaaliseen • · ψ ·**·, päähän kiinnittyy useita histidiiniryhmiä ("poly- 30 histidiinijatke") . CD:tä koodaavan geenin sisältävä BamHI- : e * * *·!.* fragmentti liitettiin ligaasilla ilmentämisvektoriin, joka • * · *,· · oli ensin pilkottu BamHI :llä ja sen jälkeen käsitelty vasi- 1 kan suolen fosfataasilla. Tätä ligaatioseosta käytettiin E. coli -kannan BL21(DE3) solujen elektroporaatioon ja trans- ;

;*·*: 35 formoidut solut analysoitiin sellaisten yhdistelmä-plasmi- V

* 1 i .*. dien suhteen, jotka sisältävät CD:tä koodaavan geenin suun-

I I I

**!/ tautuneena oikeaan suuntaan plasmidin promoottoriin nähden.

• · · * ' • · • « • · « • ·« • · 34 117789

Yksi tällainen klooni, jolle annettiin nimitys pCDSA, eristettiin ja sen osoitettiin isäntäsoluina käytettyihin E. coli -kannan soluihin liitettynä myös ilmentävän CD-proteii-nia. ,¾ s i

Yhdistelmä-CD puhdistettiin seuraavalla tavalla. 15 ml:n viljelmää, joka sisälsi pCDSA:ta sisältäviä transformoituja soluja, kasvatettiin yön yli LB-ampisilliinilihaliemessä | 37 °C:Ssa. Seuraavana aamuna yön yli viljelty viljelmä 10 ympättiin 135 ml:aan lihalientä ja sitä kasvatettiin l tun nin ajan 37 °C:ssa. Solut koottiin talteen sentrifugoimalla 5 000 x g:n voimalla 10 minuutin ajan 4 °C:ssa. Solut sus- j pendoitiin uudelleen 10 ml:aan guanidiniumhajotuspuskuriin ί (6 M guanidiniumhydroksidia, 20 mM natriumfosfaattia, 500 mM 15 natriumkloridia, pH 7,8) . Suspensiota sekoitettiin 10 minuu- f tin ajan huoneenlämmössä. Tämän jälkeen soluja käsiteltiin j ultraäänellä kolmella 5 sekunnin purskeella, joissa kussakin ' i ultraäänilaitetta käytettiin voimakkuudella 4. Seosta sent- rifugoitiin 3 000 x g:n voimalla 15 minuutin ajan 4 °C:ssa ,| 20 ja supernatantti säästettiin. Tämän jälkeen supernatanttia ?

sekoitettiin 10 minuutin ajan huoneenlämmössä 1,6 ml:n kanssa hartsia (esimerkiksi ProBond™, Invitrogen), joka sitoutuu hartsissa olevan nikkelin välityksellä yhdistelmä-CD-proteiinin polyhistidiinijatkeeseen. Tämän jälkeen hartsi J

25 eristettiin sentrifugoimalla.

• Φ • · · .**·. CD-proteiini eluoitiin hartsista pesemällä hartsi ensin } * 1 1 kahdesti 4 ml:11a denaturoivaa pesuliuosta (8 M urea, 20 mM j * \\\\· natriumf osf aatti, 500 mM natriumkloridi, pH 7,8). Tämän + . 30 jälkeen hartsi pestiin 2 kertaa 4 ml:n tilavuudella denatu- • 1 1 roivaa pesupuskuria pH-arvossa 6,0. Sitten kolonni pestiin j · · ** 1 kaksi kertaa 4 ml:n tilavuudella denaturoivaa pesupuskuria ; pH-arvossa 4,0. Reaktioseoksista koottiin 1 ml:n fraktioita *,·.· ja ne dialysoitiin fosfaatilla puskuroidulla fysiologisella i| * 1 · 3 : 35 suolaliuoksella (PBS) , joka sisälsi detergenttiä (0,1 % •1·, Triton X-100). Kun eluoitu CD-proteiini analysoitiin geeli- i • 1 1 elektroforeesilla ja coomassiesinivärjäyksellä, saatiin 1 · * « 1 ··1·· • f r . ·] · • I 1 • « · 35 1 1 7789 esille yksi vyöhyke. Tällä menetelmällä arvioidaan saatavan 95-%:isesti puhdas CD-proteiinivalmiste. Tulokseksi saatu puhdistettu yhdistelmä-CD-proteiini reagoi immunologisesti j sellaisten monoklonaalisten vasta-aineiden kanssa, jotka | _ . . . . _ ... ΐ 5 tunnistavat natuvin CD-protennin. | i 3) Toisessa tämän sovellutusmuodon kuvauksessa puhdistettiin ; natiivi CD-proteiini B. catarrhaliksesta. B. catarrhalis -ij -isolaattia 035E kasvatettiin Mueller-Hinton-lihaliemessä ; 10 24 tunnin ajan 36 °C:ssa. Tämän jälkeen bakteerit koottiin talteen sentrifugoimalla 4 000 x g:n voimalla 20 minuutin ajan. Bakteerinapit suspendoitiin pH-arvossa 7,0 olevaan j puskuriin, joka sisälsi 0,01 M fosfaattia ja 0,64 M natrium-kloridia. Uudelleensuspendoituja bakteereja sekoitettiin 15 voimakkaasti 2 minuutin ajan ja sen jälkeen niitä sentrifu-goitiin 30 000 x g:n voimalla 20 minuutin ajan. Ulko-membraanivesikkeleitä sisältävä supernatantti pantiin syrjään ja dialysoitiin liuoksella, joka sisälsi 10 mM Tris, 10 mM NaCl ja 1 mM EDTA:ta. Dialyysin jälkeen reaktio- § 20 seokseen lisättiin detergenttiä (Triton X-100) 1,0 %:n : ·' konsentraatioon ja sitten dialysaattia inkuboitiin 1 tunnin ajan huoneenlämmössä proteiinien solubilisoimiseksi. Liukenematon materiaali poistettiin sentrifugoimalla 10 000 x g:n voimalla 10 minuutin ajan. Supernatantti pipetoitiin i 25 ioninvaihtokolonniin. Kolonni pestiin puskurilla, joka f y," sisälsi 10 mM Tris:iä, 1 % Triton X-100:aa (pH 8,0), ja * ,···, proteiini eluoitiin puskuriliuoksella, joka sisälsi joko « "t\m 50 mM NaCl:a tai 100 mM NaCl:a. Kun eluoitu proteiini- t ****. valmiste käsiteltiin seuraavaksi puskuriliuoksella tasa- i ♦ · · · · 30 painotetussa geelisuodatuskolonnissa, saatiin proteiini- f; * · ♦ *··»' valmisteita, joissa ei ollut lainkaan muita proteiineja, • » » *.* * jotka olisi voitu havaita SDS-PAGE-geelien coomassie- briljanttisinivärjäyksellä, eikä lipo-oligosakkarideja, , jotka olisivat tulleet näkyviin värjäämällä SDS-PAGE-geelit | S*:’: 35 hopeavär j äyksellä. | • ; « » i < « • · · * · · ^" ; i : ·♦* ♦*··· ...

# * « · » » · • *· • · 36 1 1 7789 { a ' κ 4) Kaikkialla tässä patenttiselityksessä CD-oligopeptidit on j tässä keksinnössä määritelty joukoksi peptidejä, jotka f vastaavat osaa CD-proteiinin aminohapposekvenssistä, joka on .i 'i esitetty SEKVENSSISSÄ ID NO:14 ja jotka on syntetisoitu f 5 yhtenä kappaleena tai liitetty toisiinsa kemiallisesti. ; Tällaisia peptidejä tai oligopeptidejä voidaan syntetisoida käyttäen yhtä tällä alalla tunnetuista monista peptidi- 1 synteesimenetelmistä, mukaan luettuna tavanomainen kiinteä f peptidisynteesi käyttäen tert-butyylioksikarbonyyliamino- . i 10 happoja [Mitchell, et ai., J. Org. Chem. 43 (1978) 2845 - t 2852], polyamiditukimateriaalilla olevia 9-fluorenyyli- i metyylikarbonyyliaminohappoja [Dryland, et ai., J. Chem. So.

Perkin Trans. I (1986) 125 - 137]; pepscan-synteesillä [Geysen, et ai., J. Immunol. Methods 03 (1987) 259; Proc.

15 Natl. Acad. Sei. USA 81 (1984) 3998]; tavanomaisella neste- 1 faasipeptidisynteesillä; tai yhdistelmä-ilmentämisvektori- j

systeemeillä. Peptidien tai oligopeptidien muokkaaminen, S

..... f esimerkiksi aminohappoja substituoimalla tai deletoimalla -s (mukaan luettuna aminohappojen pidennykset ja additiot) tai |

20 jollain muulla tavalla, voidaan tehdä siten, etteivät pepti- I

din tai oligopeptidin immunologiset ominaisuudet olennaises- | ti muutu. Erityisesti CD-proteiinin, tai siitä peräisin olevan peptidin tai oligopeptidin, aminohapposekvenssiä voidaan muuttaa korvaamalla yksi tai useampi aminohappo tätä | 25 funktionaalisesti vastaavalla aminohapolla, mistä saadaan |

♦·. muutos, joka on vaikutukseton siinä mielessä, että proteii- I

« 1 · nin, peptidin tai oligopeptidin havaittu fysikaalis-kemial- 1 : ϊ i

Imen käyttäytyminen ei muutu. Tällä alalla funktionaalises- 1 ···

ti toisiaan vastaavat aminohapot ovat aminohappoja, jotka I

* 30 ovat samansukuisia ja/tai joilla on samanlainen polariteetti | 9 · ♦ tai varaus. Näin ollen aminohapposekvenssi, joka on olennai- !: ·1 ^ *.· · sesti samanlainen kuin tässä keksinnössä esitetyssä 1 sekvenssilistauksessa kuvatut aminohapposekvenssit, tarkoit- j taa aminohapposekvenssiä, joka sisältää substituutioita, v **· }.

35 joissa on käytetty funktionaalisesti toisiaan vastaavia ΐ f ,1, aminohappoja proteiinin, peptidin tai oligopeptidin ensi- • 1 · sijaista biologista funktiota muuttamatta.

tl y * t 1 *·»♦· f » 1 c « 1

t II

♦ 1

37 1 1 77 8 9 "I

5) CD: n epitooppeja sisältävien CD-peptidien valmistusta kuvaavassa esimerkissä CD-proteiinin määriteltyjä alueita 1 ilmennettiin ilmentämisjärjestelmässä, jossa plasmidi- | '<i ilmentämisvektori (pGEX2T) ohjaa E. colissa vieraiden poly-5 peptidien synteesiä sellaisina fuusiopeptideinä, jotka sisältävät glutationi-S-transferaasia (GST), joka on : ,i

Schistosoma japonicumista peräisin oleva 26 kilodaltonin '? suuruinen proteiini. Tässä sovellutusmuodon käyttötavassa, ^ jossa templaattina käytettiin pCD2:ta, CD:tä koodaavasta 10 geenistä monistettiin valikoituja alueita polymeraasiketjureaktiolla käyttäen oligonukleotidejä, jotka vastasivat taulukossa 3 esitettyjä sekvenssejä. Taulukossa 3 on esitet-ty myös näiden peptidien aminohappojen asemat suhteessa peptidikonstruktioiden koodaamaan kypsään CD-proteiiniin 15 SEKVENSSISSÄ id NO:14 kuvatulla tavalla. Oligonukleotidit suunniteltiin siten, että tulokseksi saadun monistetun i geenitragmentin 5'-päässä oli BamHl-restriktiokohta ja sen i, 3'-päässä oli EcoRl-restriktiokohta sijoitettuna siten, että monistettu fragmentti voitiin kloonata pGEX2T:hen oikeassa 20 suunnassa. Kunkin yhdistelmä-plasmidin sekvenssi varmistet- -Ä tiin dideoksisekvensoinnilla. Kunkin yhdistelmä-CD-peptidin 4

puhdistamiseksi geenifragmentin sisältävä vastaava yhdistelmäplasmidi transformoitiin E. coli JMi09:ään. Transformoituja soluja kasvatettiin 400 ml:ssa LB-lihalientä, I

25 joka sisälsi 25 μg/ml ampisilliinia, siten, että 40 ml yön ;1.>t yli viljeltyä viljelmää lisättiin 360 mitään lihalientä ja { ·1'. viljelmää inkuboitiin 1,5 tunnin ajan 37 °C:ssa sitä samalla ♦ · *’! ravistellen. Viljelmään lisättiin sellainen määrä IPTG:tä, “2, että sen pitoisuudeksi tuli 0,01 mM, ja viljelmää inkuboi- («···' 30 tiin vielä 3 tunnin ajan. Solut sentrifugoitiin 5 000 x g:n # · · Γ voimalla ja solunappi suspendoitiin uudelleen 5 ml:aan • ·# V 1 PBS:ää. Soluja käsiteltiin ultraäänellä ja seosta sentrifu goitiin 10 000 x g:n voimalla 10 minuutin ajan. Super-!|ί natanttiin sekoitettiin 0,5 ml esiturvotettuja glutationi- j **·’: 35 agaroosihelmiä. Seosta sekoitettiin ensin 2 minuutin ajan \ f i .1. huoneenlämmössä, minkä jälkeen helmet (joiden sisältämään • « · • « » ’2 1 glutationi m fuusiopeptidit olivat sitoutuneet) pestiin * • 1 · 2 • · .... t · * M * 0 38 1 1 7789 vielä kaksi kertaa PBS:llä, joka sisälsi 1 % Triton X-100:aa. Helmet pestiin tämän jälkeen kerran 0,05 M jii

Tris;illä, pH 8,0. CD-peptidin pilkkomiseksi glutationi-S- ’ transferaasista pestyjä helmiä inkuboitiin Tris-puskuriin 5 valmistetussa 0,25-%:isessa (lopullinen konsentraatio) \ humaanitrombiinissa huoneenlämmössä. Tämän jälkeen seokseen lisättiin sellainen määrä proteaasi-inhibiittoria, PMSF:ää, i

että sen konsentraatioksi saatiin 100 ^g/ml. Helmet poistet- I

tiin sentrifugoimalla ja supernatantti sisälsi puhdistettua | 10 CD-peptidiä. Immunoblottimäärityksillä varmistettiin, että fuusiopeptidit reagoivat immunologisesti kaniinin CD:lle spesifisen polyklonaalisen antiseerumin kanssa, mikä tosin i tapahtui vaihtelevalla voimakkuudella.

15 Taulukko 3 :

Klooni Aminohappojen asemat_ Oligonukleotidit_

Pxl 1-105 (SEQ ID NO:19) SEKVENSSIT ID NO:20-21 PX106 106-202 (SEQ ID NO:22) SEKVENSSIT ID NO:23-24 ' 20 Px203 203-261 (SEQ ID NO:25) SEKVENSSIT ID NO:26-27 %

Px261L 261-331 (SEQ ID NO:28) SEKVENSSIT ID NO:29-30 :

Px261 261-301 (SEQ ID NO:31) SEKVENSSIT ID NO:29 & 32

Px286L 286-311 (SEQ ID NO:33) SEKVENSSIT ID NO:34-35 '

Px286 286-301 (SEQ ID NO:36) SEKVENSSIT ID NO:34 & 37 5 % 25 Px293 293-303 (SEQ ID NO:38) SEKVENSSIT ID NO:39-40 % l\ Px295 295-311 (SEQ ID NO:41) SEKVENSSIT ID NO:42-43 i • "r ,···. Px311 311-331 (SEQ ID NO-.44) SEKVENSSIT ID NO:45-46 • · '11, Px332 332-390 (SEQ ID N0.-47) SEKVENSSIT ID NO.-48-49 ***’. PX391 391-427 (SEQ ID NO:50) SEKVENSSIT ID NO:51-52 ***** * · 30 i . .1 2 3. Puhdistettua CD-proteiinia, puhdistettuja CD-peptidejä ja * · · puhdistettuja CD-oligopeptidejä voidaan käyttää antigeeneinä ί * · 1 ' ^ immunomäärityksissä sellaisten B. catarrhalikselle spesi- . fisten antiseerumien havaitsemiseen, joita esiintyy B.

* « · *···1 35 catarrhal iksen aiheuttaman infektion kantajaksi epäillyn • · 1 *.' 1 potilaan ruumiinnesteessä. Näitä ruumiinnesteitä ovat, mai- § : · nittuihin kuitenkaan rajoittumatta välikorvaerite, yskös, l • · 1 1 .··1. veri ja nenänielusta, silmästä ja kitarisasta peräisin l • · 1 ***··'. .f • 1 · 2 • · · 3 • · 39 1 1 7789 ? olevat eritteet. CT) tai CD-peptidit voidaan havaita antigeeneinä immunomäärityksissä, joita ovat mitkä tahansa tällä i alalla tunnetut immunomääritykset, kuten radioimmunomää-ritys, entsyymi välitteinen immunosorbenttimääritys (ELISA), 5 kerrosmääritys, presipitiinireaktio, agglutinaatiomääritys, >' fluoresenssi-immunomääritys ja kemiluminesenssiin perustuva immunomääritys. . i

Sovellutusmuoto F ·' 10 CD:hen ja peptideihin liittyviin rokoteformulaatioihin tarkoitettuja menetelmiä ja yhdisteitä Tämän keksinnön tällä sovellutusmuodolla on tarkoitus saat- > taa käyttöön CD-proteiini ja/tai sen peptidejä tai oligo-15 peptidejä, joita on määrä käyttää immunogeeneinä profylakti sessa tai terapeuttisessa rokotteessa, joka on tarkoitettu aktiiviseen immunisaatioon B. catarrhaliksen aiheuttamien infektioiden hoitoon tai suojaamiseen niiltä. Rokotekäytössä bakteeriproteiinin sisältävän B. catarrhaliksen antigeenin i 20 on oltava iramunogeeninen ja sen on indusoitava sellaista i yhtä tai useampaa ehjän bakteerin pinnalla esiintyvää epi-tooppia vastaan suunnattujen funktionaalisten vasta-aineiden muodostuminen, jossa epitooppi(it) on(vat) säilynyt(eet) samanlaisina eri B. catarrhaliksen kannoissa. i 25

Yhdessä sellaista CD-proteiinia koskevassa esimerkissä, jonka ominaisuudet ovat rokoteantigeenin haluttujen ominai- i ·*· suuksien mukaiset, puhdistettiin tämä proteiini B. catarr- * haliksesta käyttäen tämän keksinnön sovellutusmuodon E f . 30 esimerkissä 3 kuvattua menetelmää. Hiiriä immunisoitiin • · · *·;*. puhdistetulla CD-proteiinilla (25 μg) yhdessä adjuvantin • · *

*·’ * : kanssa (20 ^g QS21:tä) kaksi kertaa neljän viikon välein. I

Immunisoiduista hiiristä otettiin verinäytteitä 32 päivää viimeisen immunisaation jälkeen ja immuuniseerumit yhdistet- I

* · * : 35 tiin. Yhdistetyt immuuniseerumit tutkittiin ELISA-määrityk- \ • * : .*. sellä käyttäen kokonaisia bakteereja (B. catarrhalis -kantaa i * · · '1.

]*··. 035E) . Yli yön viljeltyjä bakteereja koottiin kokosolu- • * • · · ··*·· • * ♦ · » · · • *· • · : 40 1 1 77 89 ELISA:a varten pumpulipuikoilla ja ne suspendoitiin PBS tään siten, että absorbanssin arvoksi 600 nmtn kohdalta saatiin jj 0,1. Bakteerisuspensionäytteitä (100 μΐ) lisättiin 96-kuop-paisen mikrotiitterilevyn kuoppiin ja niitä kuivattiin yön 5 yli huoneenlämmössä. Levyjen reagoivat kohdat käsiteltiin reagoimattomiksi 100 /xltlla PBStään valmistettua 0,l-%:ista (w/v) gelatiinia. Ellei toisin ole mainittu, niin tämä ja || ’’i» i kaikki jäljellä olevat inkubaatiot kestivät yhden tunnin Ϊ ajan huoneenlämmössä. Reagoivien kohtien käsittelyliuos 10 poistettiin ja kuoppiin lisättiin 100 μΐ immuuniseerumia, joka oli laimennettu 0,1 % (w/v) gelatiinia sisältävällä PBS:llä, ja seoksia inkuboitiin. Levyt pestiin ensin kolme kertaa PBS:llä ja sitoutuneet vasta-aineet havaittiin sitten i inkuboimalla alkaliseen fosfataasiin konjugoidun yhdistelmä-15 proteiini G:n kanssa (1 : 5 000 PBStssä, jossa on 0,1 % (w/v) gelatiinia), jota käytettiin 100 μΐ. Levyt pestiin ja värin kehittämiseksi kuoppiin lisättiin kuoppaa kohti 100 μΐ p-nitrofenyylifosfaattia (dietanoliamiiniin valmistettu liuos, jonka konsentraatio oli 2 mg/ml). Reaktio pysäytet- i 20 tiin 3 0 minuutin kuluttua lisäämällä 50 μΐ 3 M NaOH:a. :

Absorbanssi luettiin 492 nm:n kohdalta ELISA-lukulaitetta \

V

käyttäen. Loppupistetiitterit määritettiin sinä laimennoksen käänteisarvona, jolla absorbanssin arvo ylitti nollakuopista saadun absorbanssin. Taulukossa 4 esitetyistä tuloksista käy f 25 ilmi, että CD-proteiinilla tehdyllä immunisaatiolla saadaan :aikaan vasta-aineita, jotka pystyvät sitoutumaan yhteen tai useampaan ehjän B. catarrhaliksen pinnalla esiintyvään f * · * .1.

.j. epitooppiin.

• · * · ·*·· v : 30 Taulukko 4. Kantaa 035E vastaan suunnatun seerumin tiit- *" teri • * • · *

Seerumi__ Loppupistetiitteri___ • · · ' *.ί.* 35 Esi-immuunikontrolli <50 ; *·* ' · ' £ • · · · · · « *·* * Immuno (anti-CD) -seerumi 7 800 ' #··'··.

*"_· CD-proteiinin immunogeenisyyttä tukevia lisätodisteita on • * *···* saatu tutkimuksesta, jossa tutkittiin ihmisen immuuni- ♦ * * · • · • · • · · * · ! £- 41 1 1 7789 vastetta Β. catarrhaliksen ulkomembraaniproteiineille ja jossa 11:llä 13 sellaisesta potilaasta, joilla oli hyvin r dokumentoitu B. catarrhaliksen aiheuttama infektio, oli | toipumisaikana otetussa seerumissa CD:ta vastaan suunnattua 5 lgG:tä (tuloksia ei ole julkaistu). Näistä 13 potilaasta oli f /1 6 potilasta välikorvantulehdusta sairastavia lapsia ja

7 potilasta aikuisia, joilla oli B. catarrhaliksen aiheuttamia bronkopulmonaarisia infektioita. J

10 Toisessa esimerkissä siitä, että CD-proteiinin ominaisuudet i: ovat rokoteantigeenin haluttujen ominaisuuksien mukaiset, osoitettiin, että CD-proteiinilla tehdyn immunisaation seurauksena muodostuneen bakterisidisen vasta-aineen vaikutus kohdistuu CD-proteiiniin. Esimerkiksi kaniinissa muodos-15 tettiin CD-proteiinia vastaan suunnattua polyklonaalista ’§ antiseerumia immunisoimalla se ihonalaisesti CD-proteiinil-la. B. catarrhaliksesta tehdyille ulkomembraanipreparaateil- 1 2 le tehtiin SDS-PAGE ja geelistä leikattiin irti CD:tä vas- .

taavat vyöhykkeet, minkä jälkeen CD-proteiini puhdistettiin | I· 20 eluoimalla se polyakryyliamidigeeliviipaleista. Päivänä 0 | kaniini immunisoitiin 40 μ9:1ΐ3 CD-proteiinia epätäydelli- j sessä Freundin adjuvantissa, päivänä 14 90 μ^-.ΙΐΆ CD-pro- ί teiinia epätäydellisessä Freundin adjuvantissa ja päivänä 28 i 60 ^g:lla CD-proteiinia epätäydellisessä Freundin adjuvan- | 25 tissa. Tulokseksi saadun antiseerumin bakterisidinen vaiku- ^ .. . i : ·.. tus B. catarrhaliksen 4223NC -kantaa vastaan tutkittiin. t • ·3; Bakteereita kasvatettiin logaritmiseen vaiheeseen aivo- | * ♦ 1 · i?.

sydän-infuusio (BHI) -lihaliemessä. Bakteeriviljelmästä ^ otettu näyte laimennettiin 5 x 104 pesäkettä muodostavaan 4 · 30 yksikköön (PMY) ml:ssa tasapainotettuun suolaliuokseen ‘ ♦ 1 ♦ ^ valmistettuun 10-%:iseen naudan seerumialbumiiniin. Bakte- v • 1 1 • · · * risidisen aktiivisuuden määritysseoksessa oli bakteereja, CD-proteiinia vastaan suunnattua polyklonaalista anti- ···..· *·”1 seerumia, komplementin lähtömateriaalia, joka koostui nor- ? ···'': ' §

: 35 maalista ihmisen seerumista, jota oli vasta-aineiden poista- B

• t’ • 1e. miseksi absorboitu proteiini G:llä, sekä tasapainotettua • · 1 · ,·1·. suolaliuosta. Kaikki reagenssit lisättiin reaktioseokseen, i • · .> . i • · ♦ φ · · ·( • · - · • · · 2 • ·· 3 • · 42 1 1 7789 ; jonka tilavuudeksi tuli 250 μΐ. Reaktioseoksesta otettiin 25 μ1:η näytteitä ja ne maljattiin kolmena rinnakkaisena näytteenä BHI-agarille 0 ja 60 minuutin kohdalla. Maljoja j

inkuboitiin ja pesäkkeet laskettiin seuraavana päivänä. J

5 Solujen tuhoutumis-% laskettiin käyttäen kolmesta erillises- i tä näytteestä saatujen arvojen keskiarvoa kyseisinä kahtena ;' ajankohtana. Taulukossa 5 on esitetty esimerkki näistä 1 bakterisidisyysmäärityksistä saaduista koetuloksista. Tulok-set osoittavat, että CD-protennia vastaan muodostettu 1 10 polyklonaalinen antiseerumi on bakterisidistä B. catarr- halista vastaan. Taulukon 5 mukaisesti kontrollit osoitta- 1 vat, että antiseerumi ei tapa bakteereita komplementin ' puuttuessa ja että komplementin lähtömateriaali ei tapa bakteereja antiseerumin puuttuessa, mikä osoittaa, että 15 bakterisidinen vaikutus on vasta-aineiden ohjaamaa ja komp- -Js

lementtivälitteistä. I

Taulukko 5. Anti-CD-vasta-aineen bakterisidinen aktiivi- · suu s 1

Soluj en ^

Anti- Kömpie- PMY het- PMY het- tuhou- | 20 Näyte seerumi mentti kellä 0 kellä 60 tumis-% - 1 10 μΐ 22 μΐ 225 5 97,8 % 2 10 μΐ 0 227 390 0 % | 3 0 22 μΐ 254 286 0 % ί 25 i

Vielä yhdessä esimerkissä siitä, että CD-proteiinin ominai- ' i • 1

**··’ suudet ovat niiden ominaisuuksien mukaiset, jollaiset S

• · » ...t rokoteantigeenillä halutaan olevan, osoitettiin, että kantaa « ' *·**· 035E vastaan muodostetut yhdistetyt immuuniseerumit risti- 30 reagoivat heterologisten kantojen kanssa. Edellä kuvatulla | ".j tavalla CD-proteiinia vastaan muodostetuista yhdistetyistä ϊ immuuniseerumeista tutkittiin niiden ristireagoivuus käyt- . täen yhdeksää B. catarrhalis -kantaa, jotka olivat peräisin ·1· erilaisista kliinisistä ja maantieteellisistä lähteistä.

· 1 35 Näitä kantoja oli eristetty sellaisista kliinisistä lähteis- * ♦ · ί.ί J tä, kuten välikorvasta ja ylähengitysteistä, sekä maan- ♦ ♦♦ *...· tieteellisistä lähteistä, kuten New Yorkin osavaltiosta, \ • i • · · » φ • · · 43 117789 ΐ

Massachusettsista ja Tennesseestä. Määritys suoritettiin viljelemällä näitä kantoja yön yli Mueller-Hinton-agarilla. Bakteerit kerättiin kustakin viljelmästä pumpulitikuilla ja ne suspendoitiin PBS:ään siten, että optiseksi absorbanssik- i 5 si 600 nm:n kohdalta tuli 1,0. Kustakin suspensiosta lisät- tiin mikrolitra suspensiota nitroselluloosamembraanille ja sen annettiin kuivua. Membraania inkuboitiin yhden tunnin £ ajan huoneenlämmössä liuoksessa, joka sisälsi 5 % rasvatonta f, kuivamaitoa PBSrSSä, membraanin jäljelle jääneiden 10 sitoutumiskohtien käsittelemiseksi reagoimattomiksi. Mem- braani pestiin kaksi kertaa PBS:llä, minkä jälkeen se pei- tettiin reagoivien kohtien käsittelyliuoksella, joka sisälsi { immuuniseerumia suhteessa 1 : 1 000 laimennettua. Membraania i inkuboitiin vasta-aineen kanssa yön yli 4 °C:ssa varovasti ' 15 ravistellen. Membraani pestiin kolme kertaa PBS:llä ja sitä inkuboitiin sitten 2 tunnin ajan huoneenlämmössä yhdessä alkaliseen fosfataasiin konjugoidun proteiini G.-n kanssa (1 : 1 500 PBS:ssä, jossa on 5 % rasvatonta kuivamaitoa).

Membraani pestiin kolme kertaa PBS:llä ja sitoutunut vasta- f £ 20 aine havaittiin lisäämällä substraattia (KPlm BCIP/NBT | -fosfataasisubstraattijärjestelmä; Kirkegaard and Perry, 1

Inc.) . Immuuniseerumit reagoivat kuuden kannan kanssa yhtä voimakkaasti tai voimakkaammin kuin kannan 035E kanssa; kun taas immuuniseerumit reagoivat jonkin verran heikommin f 25 kolmen kannan kanssa kuin kannan 035E kanssa. Näin ollen |

:·.. kannasta 035E eristetyllä CD-proteiinilla tehdystä immuuni- I

säätiöstä saadut vasta-aineet ristireagoivat kaikkien tut- • · · kittujen heterologisten kantojen kanssa. * t · * · * f _ - • « 30 Rokotteen kehittämistä varten voidaan CD:lle spesifisiä J: aminohapposekvenssejä puhdistaa B. catarrhaliksesta tai ne ? : : : * voidaan puhdistaa CD:tä tai CD-peptidejä ilmentävää yhdistelmävektoria sisältävästä isännästä. Tällaisia isäntiä ovat, mainittuihin kuitenkaan rajoittumatta, transformoidut i • * · 1.

V · 35 bakteerit, transformoidut hiivat, transformoidut sädesienet ί • ' . \ ; ,·, ia viljellyt solut, jotka on joko mfektoitu tai transfek- : • · · · . > ··, toitu CD:n aminohapposekvenssejä koodaavalla vektorilla. CD- ΐ • · * · · • ···* ····» • · » * ' * » * • #« • · 'tl 1 1 7789 44 proteiinin osia vastaavia peptidejä tai oligopeptideja voidaan valmistaa pilkkomalla CD-proteiinia kemiallisesti tai entsymaattisesti (tätä on käsitelty esimerkiksi sovellutusmuodossa D) ; tai niitä voidaan syntetisoida ke- .-1 5 miallisesti käyttäen tällä alalla tunnettuja menetelmiä CD:tä koodaavan geenin nukleotidisekvenssistä päätellyn ^ aminohapposekvenssin perusteella. Vaihtoehtoisesti CD -pepti- ; j- dejä voidaan valmistaa yhdistelmä-vektorista (tätä on käsi- | telty esimerkiksi sovellutusmuodossa A). Proteiini-, pepti-10 di- tai oligopeptidi-immunogeeni liitetään rokoteformulaa- +; tion asiaankuuluvaksi immunogeeniseksi materiaaliksi ja j terapeuttisesti tehokkaana määränä, jotta se indusoi j immuunivasteen. Tunnetaan monia menetelmiä rokoteformulaa- j tion viemiseksi rokotettavaan ihmiseen tai eläimeen. Näitä 15 ovat, mainittuihin rajoittumatta, intradermaalinen, intra- | muskulaarinen, intraperitoneaalinen, laskimonsisäinen, ? subkutaaninen, okulaarinen, intranasaalinen ja oraalinen annostelu. Rokote voi lisäksi sisältää jotakin fysiologista : kantaja-ainetta, kuten jotakin liuosta, jotakin polymeeriä 20 tai liposomeja; sekä adjuvantin tai jonkin näiden yhdistel- f män. ' t

Rokoteformulaatioiden yhteydessä käytetään monia erilaisia adjuvantteja. Adjuvantit auttavat säätelemällä immuuni- 25 vastetta ja niiden avulla saavutetaan kestävämpi ja voimak- j • · ·£ ί kaampi immuniteetti pienemmillä määrillä rokoteantigeeniä 1 tai vähemmillä annoksilla kuin siinä tapauksessa, että

rokoteantigeeniä annettaisiin yksinään. Adjuvantteja ovat J

• · 1 · esimerkiksi epätäydellinen Freundin adjuvantti, adjuvantti t»< 30 65 (joka sisältää maapähkinäöljyä, mannidimono-oleaattia ja j 1 · · aluminiummonostearaattia) , öljyemulsiot, Ribin adjuvantti, 1 lii * pluroniset polyolit, polyamiinit, avridiini, Quil A, sa-poniini, MPL, QS-21 ja mineraaligeelit, kuten aluminium- * 1 1 *.ί·1 hydroksidi, aluminiumfosfaatti ja niin edelleen. | • 1 · i t » A _ ·,· · 35 · s J?· : Vielä yhdessä tämän keksinnön tämän toteutustavan sovellutus- 1 • · « ^ * 1 · · v ··. muodossa CD: lie spesifisiä aminohapposekvenssejä valmis- £ « · • · »

• 1 . V

····1.

• · · • « · • · ♦ > « · 45 1 1 7789 tetaan hapteenina, toisin sanottuna molekyylinä, joka sellaisenaan ei pysty saamaan aikaan immuunivastetta. Tällaisessa tapauksessa hapteeni voidaan kiinnittää kovalenttises-ti kantaja-aineeseen tai johonkin muuhun immunogeeniseen ; ji 5 molekyyliin, joka tekee siihen liitetystä hapteenista Ϊ i

immunogeenisen silloin, kun se joutuu esitettäväksi immuuni-järjestelmälle. Näin ollen kantaja-aineeseen kytketty CD:lie spesifinen hapteeni voi olla immunogeeni rokoteformulaatios- I

sa.

10 ’ vielä yhdestä tämän sovellutusmuodon käyttötavasta saadaan käyttöön joko elävä yhdistelmä-virusrokote, yhdistelmä- j bakteerirokote, heikennetty yhdistelmä-bakteerirokote tai , inaktivoitu yhdistelmä-virusrokote, jota käytetään antamaan 15 suoja B. catarrhaliksen aiheuttamia infektioita vastaan.

Vacciniavirus on paras tällä alalla tunnettu esimerkki J

infektoivasta viruksesta, joka on suunniteltu ilmentämään f; muista organismeista peräsin olevia rokoteantigeeneja.

Isännän immunisaatioon käytetään elävää yhdistelmä-vaccinia- I

ί 20 virusta, joka on heikennetty tai muutoin käsitelty siten, % ettei se itsessään aiheuta tautia. Tämän jälkeen yhdistelmä-viruksen replikoituminen isännässä stimuloi jatkuvasti immuunijärjestelmää rokoteantigeeneillä, kuten CD-pro-teiinilla tai CD-peptideillä, minkä ansiosta saadaan pitkä-25 kestoinen immuniteetti. | • « ' I1' • 1 ♦ # s'"· Muita eläviä virusvektoreita ovat: adenovirus, sytomegalo- : : ·1· virus ja edullisesti poxvirukset, kuten vaccinia (Paoletti ja Panicali, US-patenttijulkaisu nro 4 603 801) ja heiken- « · 'f 30 netyt Salmonellakannat [Stocker, et ai., US-patentti- \ "I julkaisut nro 5 210 035; 4 837 151; ja 4 735 801; ja ** 1 ^ Curtiss, et ai., Vaccine 6 (1988) 155 - 160]. Elävät rokot- 1 teet ovat erityisen edullisia, koska ne stimuloivat jatku-• / vasti immuunijärjestelmää, millä pystytään saamaan aikaan 1 • · · if VJ 35 pitkäkestoinen immuniteetti. Kun immuunivaste suojaa myö- j : .·. hemmältä B. catarrhalis -infektiolta, niin elävää rokotetta « · · ···- * · · i : ··1 • Λ ···«« • · · • · · .

» ·» ♦ · 46 117789 ' voidaan itsessään käyttää ehkäisevässä rokotteessa B.

catarrhal is ta vastaan. I, ;'ii

'jjJ I

Esimerkkinä tämän sovellutusmuodon tästä toteutustavasta f! 5 CD:tä koodaava geeni tai yhtä tai useampaa CD-peptidiä koodaava geenitragmentti voidaan liittää esimerkiksi sovellutusmuodossa A kuvattuja molekyylibiologisia mene- i, telmiä käyttäen vacciniaviruksen genomin DNA:hän sellaiseen ?' kohtaan, joka mahdollistaa CD-epitooppien ilmentymisen mutta 10 ei vaikuta haitallisesti vacciniavirusvektorin kasvuun tai replikaatioon. Tästä saatavaa yhdistelmävirusta voidaan käyttää immunogeeninä rokoteforraulaatiossa. Näitä samoja ? menetelmiä voidaan käyttää inaktivoidun yhdistelmävirus- !, rokoteformulaation konstruoimiseen sillä poikkeuksella, että 15 yhdistelmävirus inaktivoidaan esimerkiksi tällä alalla ' tunnetulla kemiallisella keinolla ennen sen käyttöä immuno-geenina ja ilmentyneen immunogeenin immunogeenisyyteen olennaisesti vaikuttamatta. Multivalentissa inaktivoidussa i rokoteformulaatiossa voidaan käyttää sellaista inaktivoitu- 1 20 jen virusten seosta, jotka ilmentävät erilaisia epitooppeja. 1

Kummassakin tapauksessa inaktivoitu yhdistelmä-rokote tai inaktivoitujen virusten seos voidaan formuloida sopivan ] adjuvantin kanssa rokoteantigeenejä vastaan suunnatun immu- ί nologisen vasteen tehostamiseksi. | -¾ 25 1 Tämän sovellutusmuodon toisessa muunnelmassa geneettistä ma- f **"· teriaalia käytetään sellaisenaan rokoteformulaationa. CD- * 1 1 proteiinia, CD-peptidiä tai CD-oligopeptidiä koodaavia sek-venssejä sisältävää nukleiinihappoa (DNA:ta tai RNA:ta), j 30 joka on toiminnallisesti kytketty yhteen tai useampaan sää- ; i 1 » **! tely-yksikköön, voidaan antaa sellaisenaan potilaan rokot- ί *’ tamiseksi ("suora geeninsiirto") B. catarrhaliksen patogee- t nisiä kantoja vastaan. Käyttämällä tällä alalla tunnettuja J.i.: menetelmiä, kuten injektoimalla ilmentärnisplasmidin ja 1 • · · ' ^ V 1 35 kationisten liposomien muodostamaa kompleksia suonen- s ♦ .·, sisäisesti, on osoitettu, että geenejä voidaan siirtää « · · • ••# suoraan rokotettuun potilaaseen, minkä seurauksena geneetti- I 1 · % ♦ · • f: • i.

♦ ♦ ♦ · ♦ • 1 ·'··;; ♦ ♦ · · • 1« • · ' \ ί 47 1 1 77 89 nen materiaali ilmentyy rokotetun potilaan soluissa, kuten suonten endoteelisoluissa tai tärkeiden elinten kudoksessa [Zhu, et ai., Science 261 (1993) 209 - 211] . Tällä alalla :y

tunnetaan muitakin tehokkaita menetelmiä vektori-DNA:n J

5 kuljettamiseksi kohdesoluun. Yhdessä esimerkissä rokotetta- ί via henkilöitä on rokotettu (parenteraalisesti, limakalvojen kautta tai immunisoimalla geenitykillä) käyttämällä virus- | geenejä sisältävää puhdistettua yhdistelmä-plasmidi-DNA:ta 7’ suojaavan immuunivasteen indusoimiseksi [Fynan, et ai., 10 Proc. Natl. Acad. Sei USA 90 (1993) 11478 - 11482] . Toisessa :- esimerkissä potilaasta poistettuja soluja voidaan trans- ; fektoida tai niille voidaan suorittaa elektroporaatio tällä alalla tunnetuilla vakiomenetelmillä, minkä seurauksena yhdistelmä-vektori-DNA liittyy kohdesoluun. Tämän jälkeen 15 yhdistelmä-vektori-DNA:ta sisältävät solut voidaan valita tällä alalla tunnetuilla menetelmillä, kuten vektorin ilmen- ί .. ; tämän valintamarkkerin avulla, ja valitut solut voidaan ...

sitten siirtää takaisin potilaaseen CD-proteiinin, CD-pepti- din tai CD-oligopeptidin ilmentämiseksi. | 20 :

Yksi edullinen geneettisellä materiaalilla tehtävään rokottamiseen käytetty menetelmä sisältää vaiheen, jossa potilaalle annetaan nukleiinihappomolekyyliä, joka sisältää yhtä tai useampaa CD-proteiinia, CD-peptidiä tai CD-oligopeptidiä | 25 koodaavan nukleiinihapposekvenssin ja jossa nukleiinihappo- ·**., molekyyli on kytketty toiminnallisesti yhteen tai useampaan » ilmentämiseen tarvittavaan säätely-yksikköön. Nukleiini- * » · happomolekyyliä voidaan antaa sellaisenaan tai se voidaan * » * * ensin liittää virusvektoriin ja antaa vektorin välityksellä.

« « < 30 Nukleiinihappomolekyyli voidaan antaa farmaseuttisesti t i t ·-’ hyväksyttävässä kantaja-aineessa tai laimentimessa ja se voi · *’ ’ sisältää yhdisteitä, jotka voivat parantaa rokotteen tehok kuutta. Tällaisia muita yhdisteitä ovat, mainittuihin kui-tenkaan rajoittumatta, immuunivastetta tehostavat adjuvantit V '· 35 sekä yhdisteet, jotka on suunnattu immuunivasteen säätelyyn, Ϊ esimerkiksi sytokiinit, joista käytetään yhteisnimitystä • · · .···. "immunomodulaattorit"; tai muita yhdisteitä, jotka lisäävät • # * * »««*« • · * · ♦ * · « · ' "!t

48 1 1 7789 I

nukleiinihappojen sisäänottoa soluihin ja joista käytetään nimitystä "nukleiinihappojen sisäänoton tehostajat". f

Nukleiinihappomolekyylillä tehtävä immunisaatio voidaan | ... . ί1 suorittaa minkä tahansa parenteraalisen annostelutien kautta % \ 5 (suonensisäisesti, intraperitoneaalisesti, intradermaalises- ti, subkutaanisesti tai intramuskulaarisesti) tai saattamalla materiaali kosketukseen nenänielun, trakean tai ruuan- s, sulatuskanavan limakalvojen kanssa. ji 10 Vaihtoehtona aktiiviselle immunisaatiolle esimerkiksi sil loin, kun immuunipuutteisella potilaalla on potentiaalisesti hengenvaarallinen B. catarrhaliksen aiheuttama infektio, voi ; immunisaatio olla passiivinen, toisin sanottuna immunisaatio * . tehdään antamalla CD-epitooppeja vastaan suunnattua vasta-15 ainetta sisältävää puhdistettua humaani-immunoglobuliinia.

,{·

On selvää, että vaikka tätä keksintöä on tässä patentti- j

selityksessä kuvattu yksityiskohtaisesti, niin esimerkkien tarkoituksena on ainoastaan valaista tätä keksintöä. Muiden J

20 tämän keksinnön sovellutusmuotojen modifikaatioiden, jotka I

·* ovat ilmeisiä molekyylibiologian, lääketieteellisen diagnos- ’ tilkan ja näihin liittyvien tieteenalojen alan ammatti- ;;; kokemuksen perusteella, on tarkoitettu kuuluvan oheistettu- i

jen patenttivaatimusten suojapiiriin. I

t • * t · · ♦ · li »·· · j* % · • * kff v ;~ f 9 m 9 f»··'·· · £ * a · · · • a ψ ' ' 'Γ f to · "i « 9 Ψ •·· *; i » · » · t to V to * · 9 • t ;·$ to * * V ' ' , ;i

; /. I

i » 9 l

* · « V

f * · * ; • f » ♦ • •«•to • « f to to to • ft • * 49 1 1 7789

SEKVENSSILISTAUS

(1) YLEISET TIEDOT:

(1) HAKIJA: _Timothy P. Murphy \V

(ii) KEKSINNÖN NIMITYS: Rokote Branhamella catarrhalista vastaan S

(iii) SEKVENSSIEN LUKUMÄÄRÄ: 52 (iv) KIRJEENVAIHTO-OSOITE: l, (A) VASTAANOTTAJA: Hodgson, Russ, Andrews, Woods & Goodyear (B) KATU: 1800 One M&T Plaza | (C) KAUPUNKI: Buffalo ">! (D) OSAVALTIO TAI LÄÄNI: New York (E) MAA: Yhdysvallat (F) POSTINUMERO tai-KOODI: 14203-2391 (v) KONEKOODIMUOTO: , fj (A) VÄLINETYYPPI: Levyke, 3,5-tuumainen, tallennuskapasiteetti 1,4 Mb (B) TIETOKONE: iBM-yhteensopiva (C) KÄYTTÖJÄRJESTELMÄ: MS-DOS/ Microsoft Windows 3.1 - (D) OHJELMISTO: Wordperfect for Windows 5.1 (vi) ETUOIKEUSHAKEMUKSEN TIEDOT: (A) HAKEMUSNUMERO: U.S. 08/306,871 1' (B) JÄTTÖPÄIVÄMÄÄRÄ: 20. syyskuuta 1994 ? (vi) NYKYISEN HAKEMUKSEN TIEDOT: ζ (A) HAKEMUSNUMERO: PCT/US94/10932 t (B) JÄTTÖPÄIVÄMÄÄRÄ: 27. syyskuuta 1994 f (vii) ASIAMIEHEN TIEDOT: (A) NIMI: Nelson, M. Bud /

(B) REKISTERINUMERO: 35 300 I

(C) VIITE/LUETTELONUMERO: 11520.0053 $

(viii) TIETOLIIKENNEYHTEYSTIEDOT: I

(A) PUHELIN: (716) 856-4000 " (B) TELEFAX: (716) 849-0349

(2) SEKVENSSIN ID NO:l TIEDOT: I

(i) SEKVENSSIN OMINAISPIIRTEET: : (A) PITUUS: 387 nukleotidia s (B) TYYPPI: nukleiinihappo ^ (C) JUOSTEISUUS: kaksisäikeinen / (D) TOPOLOGIA: lineaarinen :

(ii) MOLEKYYLITYYPPI: Perimän DNA

(iii) HYPOTEETTINEN (kyllä/ei): kyllä (iv) VÄLITÖN LÄHDE: (A) KIRJASTO: Perimän | (B) KLOONI: lambda gtll -klooni | :·, (v) ALKUPERÄ: -¾ ; ** (A) ORGANISMI: Branhamella catarrhalls $ .···. (B) KANTA: 25240 1 (C) SOLUTYYPPI: bakteeri .1 (Vi) OMINAISPIIRTEET: :ϊ ...J (A) ASEMA: CD-geenialue, 775 - 1160 (B) IDENTIFIOIMISMENETELMÄ: kokeellisesti ,i * 1 (C) LISÄTIEDOT: sisältää sekvenssin, joka koodaa CD-spesifisten mono- f . .·, klonaalisten 5E8- ja 7D6-vasta-aineiden tunnistamia epitooppeja ΐ • · • · · ♦ · · ♦ · · • .--1 • · · • · ♦ • · · • · Φ • 1 · ί : : : . ί • · « ♦ :1 • 1 1 • 1 • · • · 1 ~ · * 1 · · 1 γ.

• · · • · 50 1 1 7789 (vii) SEKVENSSIN KUVAUS: SEQ ID N0:1: GCT GGT TTA GAG GTA ACT TTG GGT GGT CGT TTG GCA GCT GCA 42

Ala Gly Leu Glu Vai Thr Leu Gly Gly Arg Leu Ala Pro Ala 1 5 10 GTA CC A GTA GCA CCA GTG GCA GAA CCT GTT GCT GAA CCA GTT 84

Vai Pro Vai Ala Pro Vai Ala Glu Pro Vai Ala Glu Pro Vai Ä 15 20 25 Ä GTT GCT CCA GCA CCT GTG ATC CTT CCT AAA CCA GAA CCT GAG 126

Vai Ala Pro Ala Pro Vai Ile Leu Pro Lys Pro Glu Pro Glu :: 30 35 40 ' CCT GTC ATT GAG GAA GCA CCA GCT GTA ATT GAA GAT ATT GTT 168

Pro Vai Ile Glu Glu Ala Pro Ala Vai Ile Glu Asp Ile Vai 45 50 55 GTT GAT TCA GAC GGA GAT GGT GTG CCT GAT CAT CTG GAT GCC 210

Vai Asp Ser Asp Gly Asp Gly Vai Pro Asp His Leu Asp Ala 60 65 70 ,, TGC CCA GGA ACT CCA GTA AAC ACT GTT GTT GAT CCA CGC GGT 252 ti

Cys Pro Glu Thr Pro Vai Asn Thr Vai Vai Asp Pro Arg Gly ' ·- 75 80 TGC CCA GTA CAG GTT AAT TTG GTA GAA GAG CTT CGC CAA GAG 294

Cys Pro Vai Gin Vai Asn Leu Vai Glu Glu Leu Arg Gin Glu 85 90 95 TTG CGT GTA TTC TTT GAT TAT GAT AAA TCA ATC ATC AAA CCA 336 .

Leu Arg Vai Phe Phe Asp Tyr Asp Lys Ser Ile Ile Lys Pro 100 105 110 I! CAA TAG CGT GAA GAA GTT GCT AAG GTT GCT GCG CAA ATG CGT 378 '

Gin Tyr Arg Glu Glu Vai Ala Lys Vai Ala Ala Gin Met Arg i 115 120 125 GAA TTC CCA 387

Glu Phe Pro 129 (3) SEKVENSSIN ID NO:2 TIEDOT: ^ ;·, (i) SEKVENSSIN OMINAISPIIRTEET: ' ; ** (A) PITUUS: 20 nukleotidia .

,···, (B) TYYPPI: nukleiinihappo b (C) JUOSTEISUUS: yksisäikeinen ;l (D) TOPOLOGIA: lineaarinen (ii) ALKUPERÄ: (A) ORGANISMI: Branhamella catarrhalis * 1 (B) KANTA: 25240 . (iii) OMINAISPIIRTEET:

(A) ASEMA: CD-geenialue, 1116 - 1135 Y

(B) IDENTIFIOIMISMENETELMÄ: kokeellisesti 1 * 1 1 Λ · ♦ * ♦ ♦ • · · • · « * 1 · * 1 · * • · 1; * ·

·♦·.· , . J

·····

• · · · . .M

♦ · · • ♦ • · • · · *:· ···1· • 1 · • · · ♦ ·· ♦ · '

51 1 1 7789 I

‘f (C) LISÄTIEDOT: hybridisoituu Branhamella catarrhaliksen geenialueeseen ' (iv) SEKVENSSIN KUVAUS: SEQ ID NO:2: CCGTGAAGAA GTTGCTAAGG 20 iil

(4) SEKVENSSIN ID NO:3 TIEDOT: -S

(i) SEKVENSSIN OMINAISPIIRTEET: f, (A) PITUUS: 15 nukleotidia (B) TYYPPI: nukleiinihappo (C) JUOSTEISUUS: yksisäikeinen > (D) TOPOLOGIA: lineaarinen · 1 1 f (ii) ALKUPERÄ: (A) ORGANISMI: Branhamella catarrhalis . (B) KANTA: 2524 0 S, (lii) OMINAISPIIRTEET: ' '' (A) ASEMA: CD-geenialue, 206 - 220 (B) IDENTIFIOIMISMENETELMÄ: kokeellisesti (C) LISÄTIEDOT: hybridisoituu Branhamella catarrhaliksen geenialueeseen (iv) SEKVENSSIN KUVAUS: SEQ ID NO:3: |' CTGACGAAGT CCACA 15 fj (5) SEKVENSSIN ID N0:4 TIEDOT: 7- (i) SEKVENSSIN OMINAISPIIRTEET: (A) PITUUS; 16 nukleotidia (B) TYYPPI: nukleiinihappo >' (C) JUOSTEISUUS: yksisäikeinen %, (D) TOPOLOGIA: lineaarinen (ii) ALKUPERÄ: (A) ORGANISMI: Branhamella catarrhalis (B) KANTA: 25240 ·: , (iii) OMINAISPIIRTEET: 7;! (A) ASEMA: CD-geenialue (Ruosteen komplementti), 316 -331 |i

(B) IDENTIFIOIMISMENETELMÄ: kokeellisesti M

(C) LISÄTIEDOT: hybridisoituu Branhamella catarrhaliksen i geenialueeseen (iv) SEKVENSSIN KUVAUS: SEQ ID NO:4: CACCAGTCCA TAGCTC 16 (6) SEKVENSSIN ID NO:5 TIEDOT: ΐ (i) SEKVENSSIN OMINAISPIIRTEET: | (A) PITUUS: 16 nukleotidia ", (B) TYYPPI: nukleiinihappo : ** (C) JUOSTEISUUS: yksisäikeinen . . > .1··, (D) TOPOLOGIA: lineaarinen |! *...1 (ii) ALKUPERÄ: .·?; (A) ORGANISMI: Branhamella catarrhalis ΐ (B) KANTA: 2524 0 I1 ....I (iii) OMINAISPIIRTEET: , (A) ASEMA: CD-geenialue, 468-483 , (B) IDENTIFIOIMISMENETELMÄ: kokeellisesti *·!·" (C) LISÄTIEDOT: hybridisoituu Branhamella catarrhaliksen geenialueeseen 7¾ Φ 1 1 jri ♦ ··.- • · · > ··· • · · ♦ · · « · · • ..lit • Λ • · • Λ ♦ I I » ... ·, Μ· · • · · - • · • · · ····1.

♦ · · • · · • · « • f ' 52 1 1 7789 1 (iv) SEKVENSSIN KUVAUS: SEQ ID NO:5: GATTGGTACT GAGCAG 16 (7) SEKVENSSIN ID NO:6 TIEDOT: (i) SEKVENSSIN OMINAISPIIRTEET: j (A) PITUUS: 18 nukleotidia ί (B) TYYPPI: nukleiinihappo f (C) JUOSTEISUUS: yksisäikeinen (D) TOPOLOGIA: lineaarinen (ii) ALKUPERÄ: ^ (A) ORGANISMI: Branhamella catarrhalis % (B) KANTA: 25240 | (lii) OMINAISPIIRTEET: f (A) ASEMA: CD-geenialue (Ruosteen komplementti), 561-578 % . (B) IDENTIFIOIMISMENETELMA: kokeellisesti t (C) LISÄTIEDOT: hybridisoituu Branhamella catarrhaliksen | geenialueeseen : (iv) SEKVENSSIN KUVAUS: SEQ ID NO:6: ' GTATAACCAT CAATTGCA 18 (8) SEKVENSSIN ID NO:7 TIEDOT: ί (i) SEKVENSSIN OMINAISPIIRTEET: | (A) PITUUS: 15 nukleotidia ; (B) TYYPPI: nukleiinihappo ; (C) JUOSTEISUUS: yksisäikeinen (D) TOPOLOGIA: lineaarinen (ii) ALKUPERÄ: (A) ORGANISMI: Branhamella catarrhalis (B) KANTA: 25240 : (iii) OMINAISPIIRTEET: (A) ASEMA: CD-geenialue, 724 - 738 ; (B) IDENTIFIOIMISMENETELMA: kokeellisesti : (C) LISÄTIEDOT: hybridisoituu Branhamella catarrhaliksen .4 geenialueeseen i (iv) SEKVENSSIN KUVAUS: SEQ ID NO:7: * GCCCGTGCTA TCCAT 15 ' (9) SEKVENSSIN ID NO:8 TIEDOT: ^ (i) SEKVENSSIN OMINAISPIIRTEET: 1 (A) PITUUS: 17 nukleotidia 1 (B) TYYPPI: nukleiinihappo ΐ (C) JUOSTEISUUS: yksisäikeinen ί (D) TOPOLOGIA: lineaarinen : f. ^ (ii) ALKUPERÄ: j • ** (A) ORGANISMI: Branhamella catarrhalis Ϊ .**·. (B) KANTA: 25240 f *··* (iii) OMINAISPIIRTEET: ;.

(A) ASEMA: CD-geenialue (Ruosteen komplementti), 826 - 842 ···· (B) IDENTIFIOIMISMENETELMA: kokeellisesti ..... (C) LISÄTIEDOT: hybridisoituu Branhamella catarrhaliksen geenialueeseen . (iv) SEKVENSSIN KUVAUS: SEQ ID NO:8: j ♦ · ♦ • « · t : : ί • · · • · · ί « · · ... ί • · * • · * • · w • f • · ··! • · · ···.· • · · · • ♦ # t : ···..- • « « * · • · « · ♦ ♦ · • *« • ·

: I

i ’ . s · . J5 ; . ? . ’ · ':ή

53 I

117789 GGTTCTGCCA CTGGTGC 17 ;! (10) SEKVENSSIN ID NO: 9 TIEDOT: j! (i) SEKVENSSIN OMINAISPIIRTEET: |‘ (A) PITUUS: 15 nukleotidia ί (B) TYYPPI: nukleiinihappo (C) JUOSTEISUUS: yksisäikeinen >.

(D) TOPOLOGIA: lineaarinen s (11) ALKUPERÄ: (A) ORGANISMI: Branhamella catarrhalis (B) KANTA: 25240 g (iii) OMINAISPIIRTEET: c (A) ASEMA: CD-geenialue (juosteen komplementti), 1211 - 1225 i (B) IDENTIFIOIMISMENETELMA: kokeellisesti f (C) LISÄTIEDOT: hybridisoituu Branhamella catarrhaliksen | geenialueeseen i (iv) SEKVENSSIN KUVAUS: SEQ ID NO:9: ΐ TGTAGCGTGC ACTTG 15 ' '

(11) SEKVENSSIN ID NO;10 TIEDOT; I

(i) SEKVENSSIN OMINAISPIIRTEET: (A) PITUUS: 18 nukleotidia £ (B) TYYPPI: nukleiinihappo ΐ (C) JUOSTEISUUS: yksisäikeinen .

(D) TOPOLOGIA: lineaarinen l (ii) ALKUPERÄ: f (A) ORGANISMI: Branhamella catarrhalis

(B) KANTA: 25240 I

(iii) OMINAISPIIRTEET: 1 (A) ASEMA: CD-geenialue, 1387 - 1404 (B) . IDENTIFIOIMISMENETELMA: kokeellisesti | (C) LISÄTIEDOT: hybridisoituu Branhamella catarrhaliksen | geenialueeseen | (iv) SEKVENSSIN KUVAUS: SEQ ID NO:10: 5- GCAGTAATCA CTGGTAGC 18 ?-

•I

(12) SEKVENSSIN ID NO:ll TIEDOT: f (i) SEKVENSSIN OMINAISPIIRTEET: ΐ (A) PITUUS: 15 nukleotidia ; ; (B) TYYPPI: nukleiinihappo f (C) JUOSTEISUUS: yksisäikeinen .

(D) TOPOLOGIA: lineaarinen |

(ii) ALKUPERÄ: J

l '1 (A) ORGANISMI: Branhamella catarrhalis .1·1. (B) KANTA: 25240 · *···’ (iii) OMINAISPIIRTEET: ΐ (A) ASEMA: CD-geenialue (juosteen komplementti)( 1483 - 1497 | ••♦ϊ (B) IDENTIFIOIMISMENETELMA: kokeellisesti i

(C) LISÄTIEDOT: hybridisoituu Branhamella catarrhaliksen J

geenialueeseen { . (iv) SEKVENSSIN KUVAUS: SEQ ID NO:11: ! *·Σ·1 TCGATAAGGC TTGAG 15 1 • ·· i lii « ΐ • · 1 * · 1 ··· • · « • · ·

··1· A

* ·' • · ' • · · • · · « · · ♦ ; * ♦ · 1 X ί > • · · • ;

» · · · A

m · · • · · ·; • · · • · 54 117789 (13) SEKVENSSIN ID NO:12 TIEDOT: } (i) SEKVENSSIN OMINAISPIIRTEET: ; (A) PITUUS: 18 nukleotidia (B) TYYPPI: nukleiinihappo : (C) JUOSTEISUUS: yksisäikeinen (D) TOPOLOGIA: lineaarinen (ii) ALKUPERÄ: (A) ORGANISMI: Branhamella catarrhalis (B) KANTA: 25240 (iii) OMINAISPIIRTEET: v (A) ASEMA: CD-geenialue, 1665 - 1682 ji (B) IDENTIFIOIMISMENETELMÄ: kokeellisesti f (C) LISÄTIEDOT: hybridisoituu Branhamella catarrhaliksen 1 geenialueeseen (iv) SEKVENSSIN KUVAUS: SEQ ID NO: 12: CGGGCATATC GCACGACT 18 (14) SEKVENSSIN ID NO:13 TIEDOT: (i) SEKVENSSIN OMINAISPIIRTEET: 1 (A) PITUUS: 20 nukleotidia 1 (B) TYYPPI: nukleiinihappo (C) JUOSTEISUUS: yksisäikeinen | (D) TOPOLOGIA: lineaarinen ( (ii) ALKUPERÄ: i (A) ORGANISMI: Branhamella catarrhalis '% (B) KANTA: 25240 ' . 't (iii) OMINAISPIIRTEET: ^ (A) ASEMA: CD-geenialue, 941 - 960 | (B) IDENTIFIOIMISMENETELMÄ: kokeellisesti 1 (C) LISÄTIEDOT: hybridisoituu Branhamella catarrhaliksen geenialueeseen > (iv) SEKVENSSIN KUVAUS: SEQ ID NO:13: 1 TTGTTGATTC AGACGGAGAT 20 ; (15) SEKVENSSIN ID NO:14 TIEDOT: f (i) SEKVENSSIN OMINAISPIIRTEET:

(A) PITUUS: 1727 nukleotidia T

(B) TYYPPI: nukleiinihappo (C) JUOSTEISUUS: yksisäikeinen (D) TOPOLOGIA: lineaarinen 3 (ii) MOLEKYYLITYYPPI: Perimän DNA ; (iii) HYPOTEETTINEN (kyllä/ei): kyllä f (iv) ALKUPERÄ: $ ί 2 (A) ORGANISMI: Branhamella catarrhalis k .1·1. (B) KANTA: 25240 . ΐ *...1 (v) VÄLITÖN LÄHDE: (A) KIRJASTO: Perimän ···' (B) KLOONI: EMBL3-klooni 5; jatkoklooni pCDl (vi) OMINAISPIIRTEET: !: * 1 (A) ASEMA: CD-geenialue s J .·. (B) IDENTIFIOIMISMENETELMÄ: kokeellisesti ; ·ί·1 (C) NIMI/SELITYS: koodatun proteiinin signaalisekvenssi i j1:1. (D) ASEMA: -26 - -1 ! ’ (vii) SEKVENSSIN KUVAUS: SEQ ID NO:14: • · ♦ • · · • · ♦ «♦· :l • 1 ♦ 4 4« * 1 ♦ /¾ • · ."· ♦ · · li1 • 1 · · • · · jj t : « ♦ ♦ ♦ ·····- • · 1 · ♦ · · * · · 2 ♦ · · 117789 ' GGATCCCGTC GACCTGCAGG TCAACGGATC GCTATGCTAA AATAGGTGCG 50 GTAATCTTGA AAAACCAACC ATTCCTTGGA GGAATTT ATG AAA TTT 96

Met Lys Phe -26

j I

AAT AAA ATC GCT CTT GCG GTC ATC GCA GCC GTT GCA GCT CCA 138 !

Asn Lys He Ala Leu Ala Vai Ile Ala Ala Val Ala Ala Pro -1.5 GTT GCA GCT CCA GTT GCT GCT CAA GCT GGT GTG ACA GTC AGC 180 ,,

Val Ala Ala Pro Val Ala Ala Gin Ala Gly Val Thr Val Ser 7; -5 -11 5 ,-: CCA CTA CTA CTT GGC TAT CAT TAC ACT GAC GAA GCC CAC AAT 222

Pro Leu Leu Leu Gly Tyr His Tyr Thr Asp Glu Ala His Asn 10 15 GAT CAA CGC AAA ATC TTA CGC ACT GGC AAG AAG CTA GAG CTA 264 ^

Asp Gin Arg Lys He Leu Arg Thr Gly Lys Lys Leu Glu Leu ' 20 25 30 " GAT GCT ACT AAT GCA CCT GCA CCA GCT AAT GGC GGT GTC GCA 306

Asp Ala Thr Asn Ala Pro Ala Pro Ala Asn Gly Gly Val Ala 35 40 45 CTG GAC AGT GAG CTA TGG ACT GGT GCT GCG ATT GGT ATC GAA 348

Leu Asp Ser Glu Leu Trp Thr Gly Ala Ala Ile Gly Ile Glu L

50 55 60 ^ CTT ACG CCA TCA ACT CAG TTC CAA GTT GAA TAT GGT ATC TCT 390

Leu Thr Pro Ser Thr Gin Phe Gin Val Glu Tyr Gly He Ser ; 65 70 75 ϊ, AAC CGT GAT GCA AAA TCT TCA GAC AAA TCT GCA CAT CGC TTT 432

Asn Arg Asp Ala Lys Ser Ser Asp Lys Ser Ala His Arg Phe ,, 80 85 GAT GCT GAG CAA GAA ACC ATC AGC GGT AAC TTT TTG ATT GGT 474 ;

Asp Ala Glu Gin Glu Thr He Ser Gly Asn Phe Leu He Gly t 90 95 100 ii

K

ACT GAG CAG TTC AGC GGC TAC AAT CCA ACA AAT AAA TTC AAG 516 : ** Thr Glu Gin Phe Ser Gly Tyr Asn Pro Thr Asn Lys Phe Lys ,·1·. 105 HO 115 • 1 * · · .:, CCC TAT GTC TTG GTT GGT GCA GGT CAA TCT AAA ATT AAA GTA 558 1

Pro Tyr Val Leu Val Gly Ala Gly Gin Ser Lys He Lys Val ,...: 120 125 130 '' » · ,·. AAT GCA ATT GAT GGT TAT ACA GCA GAA GTA GCC AAT GGG CAA 600 .:/ Asn Ala He Asp Gly Tyr Thr Ala Glu Val Ala Asn Gly Gin 135 140 145 r I · ·

* · ·, I

• 1 1 ♦ · · • · m • · · ·1· • · a • -1 y * -¾ • · ’1 ' • · · • ♦ · ' , ··1» : : ' • # • a • · · 56 1 1 7789 ί AAC ATT GCA AAA GAT CAA GCT GTA AAA GCA GGT CAA GAA GTT 642

Asn Ile Ala Lys Asp Gin Ala Vai Lys Ala Gly Gin Glu Val 11 150 155 " GCT GAG TCT AAA GAC ACC ATC GGT AAC CTA GGT CTT GGT GCT 684 'hi

Ala Glu Ser Lys Asp Thr He Gly Asn Leu Gly Leu Gly Ala i±l 160 165 170 '* CGC TAC TTA GTC AAT GAT GCC CTT GCA CTT CGT GGT GAA OCC 726

Arg Tyr Leu Val Asn Asp Ala Leu Ala Leu Arg Gly Glu Ala 175 180 185 " CGT GCT ATC CAT AAT TTT GAT AAC AAA TGG TGG GAA GGC TTG 768 -i

Arg Ala He His Asn Phe Asp Asn Lys Trp Trp Glu Gly Leu 190 195 200 j; GCG TTG GCT GGT TTA GAG GTA ACT TTG GGT GGT CGT TTG GCA 810

Ala Leu Ala Gly Leu Glu Val Thr Leu Gly Gly Arg Leu Ala 205 210 215 ä j*j CCT GCA GTA CCA GTA GCA CCA GTG GCA GAA CCT GTT GCT GAA 852 1

Pro Ala Val Pro Val Ala Pro Val Ala Glu Pro Val Ala Glu 220 225 CCA GTT GTT GCT CCA GCA CCT GTG ATC CTT CCT AAA CCA GAA 894

Pro Val Val Ala Pro Ala Pro Val He Leu Pro Lys Pro Glu 230 235 240 „ CCT GAG CCT GTC ATT GAG GAA GCA CCA GCT GTA ATT GAA GAT 936

Pro Glu Pro Val He Glu Glu Ala Pro Ala Val He Glu Asp 245 250 255 ATT GTT GTT GAT TCA GAC GGA GAT GGT GTG CCT GAT CAT CTG 978 ’

He Val Val Asp Ser Asp Gly Asp Gly Val Pro Asp His Leu i 260 265 270 f1 GAT GCC TGC CCA GGA ACT CCA GTA AAC ACT GTT GTT GAT CCA 1020

Asp Ala Cys Pro Glu Thr Pro Val Asn Thr Val Val Asp Pro 275 280 285 ' -{· • , ΐ CGC GGT TGC CCA GTA CAG GTT AAT TTG GTA GAA GAG CTT CGC 1062 5

Arg Gly Cys Pro Val Gin Val Asn Leu Val Glu Glu Leu Arg I*. 290 295 • ** j»! .·*. CAA GAG TTG CGT GTA TTC TTT GAT TAT GAT AAA TCA ATC ATC 1104 f *···* Gin Glu Leu Arg Val Phe Phe Asp Tyr Asp Lys Ser He He - .:. 300 305 310 , Vl I f • · · · ....: AAA CCA CAA TAC CGT GAA GAA GTT GCT AAG GTT GCT GCG CAA 1146

Lys Pro Gin Tyr Arg Glu Glu Val Ala Lys Val Ala Ala Gin r I·*· 315 320 325 * * * J*:*. ATG CGT GAA TTC CCA AAT GCA ACT GCA ACC ATT GAA GGT CAC 1188 " • Met Arg Glu Phe Pro Asn Ala Thr Ala Thr He Glu Gly His -: 330 335 340 « » · • · · • * * ··· ♦ · * .

· · 4 · • * · 4 · ♦ ··· ·

♦ ·· V

: : « · 4 · · • · * • * 57 1 17789 f h GCA TCA CGC GAT TCA GCA CGC TCA AGT GCA CGC TAC AAC CAG 1230 f!

Ala Ser Arg Asp Ser Ala Arg Ser Ser Ala Arg Tyr Asn Gin 345 350 355 i i t

CGT CTA TCT GAA GCT CGT GCT AAT GCT GTT AAA TCA ATG CTA 1272 A

Arg Leu Ser Glu Ala Arg Ala Asn Ala Vai Lys Ser Met Leu 360 365 1

II

TCT AAC GAA TTT GGT ATC GCT CCA AAC CGC CTA AAT GCA GTT 1314

Ser Asn Glu Phe Gly Ile Ala Pro Asn Arg Leu Asn Ala Vai 370 375 380 GGT TAT GGC TTT GAT CGT CCT ATC GCT CCA AAT ACT ACT GCT 1356 i

Gly Tyr Gly Phe Asp Arg Pro Ile Ala Pro Asn Thr Thr Ala I

385 390 395 ΐ ίι GAA GGT AAA GCG ATG AAC CGT CGT GTA GAA GCA GTA ATC ACT 1398 ^

Glu Gly Lys Ala Met Asn Arg Arg Vai Glu Ala Vai Ile Thr 400 405 410 } GGT AGC AAA ACA ACG ACT GTT GAT CAA ACC AAA GAT ATG ATT 1440 f

Gly Ser Lys Thr Thr Thr Vai Asp Gin Thr Lys Asp Met Ile 1' 415 420 425 GTT CAA TAATTGCACA TGAGTATTTG GTAATCAGCT TGAATTCTCA 1486 i

Vai Gin 3 427 f AGCCTTATCG ATAAAAAAGC CACCTTTTTG GTGGCTTTTT TATTTGGTGT 1536 i AAATTTTTGG TTCAGTTAGA CTGATTTATG TTATAATAAG CGGTTTTCTT 1586 \ AGCTTTTGAA TAAATCAGAT GAGTTAAGCC AACTGACTGA TTTTATCAAT 1636 i 4 TGAGTTATTT TTAAGCCTTT TATCAGTTCG GGCATATCGC ACGACTATTA 1686 '1 ATCTTTATAT GAGTATTTAT GGCAGACGAC ATTAAGCATT T 1727 1 f (16) SEKVENSSIN ID NO:15 TIEDOT»

(i) SEKVENSSIN OMINAISPIIRTEET: J

(A) PITUUS: 17 nukleotidia f (B) TYYPPI: nukleiinihappo i t*. (C) JUOSTEISUUS: yksisäikeinen |

* ** (D) TOPOLOGIA: lineaarinen J

(ii) ALKUPERÄ: \ *··♦* (A) ORGANISMI: Branhamella catarrhalis . 1 • I. (B) KANTA: 25240 i ···’ (iii) OMINAISPIIRTEET: i ··»·* (A) ASEMA: CD-geenialue (Ruosteen komplementti), 1430 - 1446 i (B) IDENTIFIOIMISMENETELMA: kokeellisesti - ί • · * Ψ m * I * « * * * * · · • · · * * * • f « *····; • · · Ψ * \ e p · ψ * · • · · · * · · ? i : ····..· * ψ ψ · · · • ♦ « · 9 · · • # »

' 1 X

,ΐ $ 58 1 1 7789 f

H

(C) LISÄTIEDOT: hybridisoituu Branhamella catarrhaliksen geenialueeseen (iv) SEKVENSSIN KUVAUS: SEQ ID NO:15: 1

TTGAACAATC ATATCTT 17 1 I

ij1 I

(17) SEKVENSSIN ID NO:16 TIEDOT: | (i) SEKVENSSIN OMINAISPIIRTEET: ‘ii (A) PITUUS: 18 nukleotidia ’ & (B) TYYPPI: nukleiinihappo (C) JUOSTEISUUS: yksisäikeinen (D) TOPOLOGIA: lineaarinen f! (ii) ALKUPERÄ: | (A) organismi: Branhamella catarrhalis | (B) KANTA: 25240 > (iii) OMINAISPIIRTEET: (A) ASEMA: CD-geenialue, 166 - 183 (B) IDENTIFIOIMISMENETELMÄ: kokeellisesti (C) LISÄTIEDOT: hybridisoituu Branhamella catarrhaliksen geenialueeseen (iv) SEKVENSSIN KUVAUS: SEQ ID NO:16: | GGTGTGACAG TCAGCCCA 18 ? •I., (18) SEKVENSSIN ID NO:17 TIEDOT: f (i) SEKVENSSIN OMINAISPIIRTEET: li (A) PITUUS: 17 nukleotidia | (B) TYYPPI: nukleiinihappo £,' (C) JUOSTEISUUS: yksisäikeinen ξ (D) TOPOLOGIA: lineaarinen ΐ, (ii) ALKUPERÄ: | (A) ORGANISMI: Branhamella catarrhalis (B) KANTA: 25240 i (iii) OMINAISPIIRTEET: i (A) ASEMA: CD-geenialue (juosteen komplementti), 1081 - 1097 (B) IDENTIFIOIMISMENETELMÄ: kokeellisesti i (C) LISÄTIEDOT: hybridisoituu Branhamella catarrhaliksen v geenialueeseen % (iv) SEKVENSSIN KUVAUS: SEQ ID NO: 17: :;- GATTTATCAT AATCAAA 17 i .1'

(19) SEKVENSSIN ID NO:18 TIEDOT: I

(i) SEKVENSSIN OMINAISPIIRTEET: 1'

(A) PITUUS: 17 nukleotidia I

• 2>t (B) TYYPPI: nukleiinihappo f,

* (C) JUOSTEISUUS: yksisäikeinen J

·3; (D) TOPOLOGIA: lineaarinen f ··· (ii) ALKUPERÄ: | ·;· (A) ORGANISMI: Branhamella catarrhalis (B) KANTA: 25240 |

·;··· (iii) OMINAISPIIRTEET: I

(A) ASEMA: CD-geenialue, 1048 - 1064 \ j j1· (B) IDENTIFIOIMISMENETELMÄ: kokeellisesti 5' *·· (C) LISÄTIEDOT: hybridisoituu Branhamella catarrhaliksen \ jT;1; geenialueeseen | * t • ♦ · • · · · \ • · 1 . . v ♦ · · r: • 1 ♦ li • . ; :¾ • · • t f • ♦ I 'i »·· · 4 • # · ^ ) : ··1 * s • · : · · ·.· 2 • Ί 3 • · 59 1 1 7789 ί

(iv) SEKVENSSIN KUVAUS: SEQ ID NO:18: I

GTAGAAGAGC TTCGCCA 17 f (20) SEKVENSSIN ID NO:19 TIEDOT: ? (i) SEKVENSSIN OMINAISPIIRTEET: :f (A) PITUUS: 105 aminohappojäännöstä |

(B) TYYPPI: aminohappo I

(C) TOPOLOGIA: lineaarinen ί (ii) ALKUPERÄ; - (A) ORGANISMI: Branhamella catarrhalis i (B) KANTA: 25240 1 (iii) OMINAISPIIRTEET: % (A) ASEMA: CD:n aminohappoasemat 1 - 105 1 (iv) SEKVENSSIN KUVAUS: SEQ ID NO:19: ' . ;

Gly Vai Thr Vai Ser Pro Leu Leu Leu Gly Tyr His Tyr Thr Asp '* 1 5 10 15

Glu Ala His Asn Asp Gin Arg Lys Ile Leu Arg Thr Gly Lys Lys Ϊ 20 25 30 ; 5

Leu Glu Leu Asp Ala Thr Asn Ala Pro Ala Pro Ala Asn Gly Gly 35 40 45 f

Vai Ala Leu Asp Ser Glu Leu Trp Thr Gly Ala Ala Ile Gly Ile f 50 55 60 '

Glu Leu Thr Pro Ser Thr Gin Phe Gin Vai Glu Tyr Gly Ile Ser > 65 70 75 :'t

Asn Arg Asp Ala Lys Ser Ser Asp Lys Ser Ala His Arg Phe Asp | 80 85 90 t

P

Ala Glu Gin Glu Thr Ile Ser Gly Asn Phe Leu Ile Gly Thr Glu ί 95 100 105 ‘5

•T

(21) SEKVENSSIN ID NO:20 TIEDOT: r (i) SEKVENSSIN OMINAISPIIRTEET: (A) PITUUS: 31 nukleotidia ;< (B) TYYPPI: nukleiinihappo I.

(C) JUOSTEISUUS: yksisäikeinen | (D) TOPOLOGIA: lineaarinen f ί*. (ii) ALKUPERÄ: f * ** (A) ORGANISMI: Branhamella catarrhalis f (B) KANTA: 25240 $ (iii) SEKVENSSIN KUVAUS: SEQ ID NO:20: >.

• k ...5 GCGCGCGGAT CCGGTGTGAC AGTCAGCCCA C 31 ;· * * (22) SEKVENSSIN ID NO:21 TIEDOT: * .*. (i) SEKVENSSIN OMINAISPIIRTEET: * ·ϊ·* (A) PITUUS: 29 nukleotidia (B) TYYPPI: nukleiinihappo ; V * (C) JUOSTEISUUS: yksisäikeinen

. I

* « · # · · » « » • · * * « * f

** -A

* ψ .''>?· * ♦ · \

’’· * J

* * * ' '7 i ; < 4«».

* 1 * ·««·* • f Λ · % · · » rl Ψ » 1 1 7789 ]! 'v 60 (D) TOPOLOGIA: lineaarinen (ii) ALKUPERÄ: (A) ORGANISMI: Branhamella catarrhalis , (B) KANTA: 25240 (iii) SEKVENSSIN KUVAUS: SEQ ID NO:21: ATATATGAAT TCCTCAGTAC CAATCAAAA 29 (23) SEKVENSSIN ID NO:22 TIEDOT: '! (i) SEKVENSSIN OMINAISPIIRTEET: ?ι (A) PITUUS: 97 aminohappojäännöstä (B) TYYPPI: aminohappo r! (C) TOPOLOGIA: lineaarinen ;.

(ii) ALKUPERÄ: y (A) ORGANISMI: Branhamella catarrhalis (B) KANTA: 25240 (iii) OMINAISPIIRTEET: (A) ASEMA: CD:n aminohappoasemat 106 - 202 (iv) SEKVENSSIN KUVAUS: SEQ ID NO: 22: :·

% I

Gin Phe Ser Gly Tyr Asn Pro Thr Asn Lys Phe Lys Pro Tyr Vai L

1 5 10 15 ii

Leu Vai Gly Ala Gly Gin Ser Lys Ile Lys Vai Asn Ala Ile Asp 20 25 30

Gly Tyr Thr Ala Glu Vai Ala Asn Gly Gin Asn Ile Ala Lys Asp 35 4 0 45

Gin Ala Vai Lys Ala Gly Gin Glu Vai Ala Glu Ser Lys Asp Thr .·’

50 55 60 .· N

Ile Gly Ash Leu Gly Leu Gly Ala Arg Tyr Leu vai Asn Asp Ala 65 70 75 |i

Leu Ala Leu Arg Gly Glu Ala Arg Ala Ile His Asn Phe Asp Asn · 80 85 90 -

S I

Lys Trp Trp Glu Gly Leu Ala 95 || (24) SEKVENSSIN ID NO:23 TIEDOT: f! (i) SEKVENSSIN OMINAISPIIRTEET: h (A) PITUUS: 29 nukleotidia ; ·.. (B) TYYPPI: nukleiinihappo (C) JUOSTEISUUS: yksisäikeinen j***: (D) TOPOLOGIA: lineaarinen ·;, **; (ii) ALKUPERÄ: ··· (A) ORGANISMI: Branhamella catarrhalis *··1. (B) KANTA: 25240 ·:·1: (iii) SEKVENSSIN KUVAUS: SEQ ID NO:23: : gcgcgcggat cccagttcag cggctacaa 29 ··· * · · • · · ft · · 11 ft 1·1 • • ft 1 ft·1' • ft ft ,i ft ♦ · ' ' '.'i

• · 1 : V

• · · ·1 • • 4 1 ft · • ft · ft ft · ft1·· ft · • « ft · ft ft « . ’1 • ft · ft · ft · * * • ft1 ft 1 61 11 7789 (25) SEKVENSSIN ID NO:24 TIEDOT: (i) SEKVENSSIN OMINAISPIIRTEET: (A) PITUUS: 30 nukleotidia

(B) TYYPPI: nukleiinihappo T

(C) JUOSTEISUUS: yksisäikeinen 'f' (D) TOPOLOGIA: lineaarinen t (ii) ALKUPERÄ: (A) ORGANISMI: Branhamella catarrhalis ;; (B) KANTA: 25240 il (iii) SEKVENSSIN KUVAUS: SEQ ID NO:24: Ί ATATATGAAT TCCGCCAAGC CTTCCCACCA 30 t| (26) SEKVENSSIN ID NO:25 TIEDOT: (i) SEKVENSSIN OMINAISPIIRTEET: (A) PITUUS: 59 aminohappojäännöstä (B) TYYPPI: aminohappo (C) TOPOLOGIA: lineaarinen (ii) ALKUPERÄ: i (A) ORGANISMI: Branhamella catarrhalis ί (B) KANTA: 25240 rfi (iii) OMINAISPIIRTEET: ? (A) ASEMA: CD:n aminohappoasemat 203 - 261 (iv) SEKVENSSIN KUVAUS: SEQ ID NO:25: , „

M

Leu Ala Gly Leu Glu Vai Thr Leu Gly Gly Arg Leu Ala Pro Ala o 1 5 10 15

Vai Pro Vai Ala Pro Vai Ala Glu Pro Vai Ala Glu Pro Vai Vai 20 25 30

Ala Pro Ala Pro Vai Ile Leu Pro Lys Pro Glu Pro Glu Pro Vai 35 40 45

Ile Glu Glu Ala Pro Ala Vai Ile Glu Asp Ile Vai Vai Asp 1 50 55 59 t! (27) SEKVENSSIN ID NO:26 TIEDOT: (i) SEKVENSSIN OMINAISPIIRTEET: (A) PITUUS: 31 nukleotidia (B) TYYPPI: nukleiinihappo . > (C) JUOSTEISUUS: yksisäikeinen j>, (D) TOPOLOGIA: lineaarinen ij (ii) ALKUPERÄ: |! : ·,. (A) ORGANISMI: Branhamella catarrhalis -f! •tii (B) KANTA: 25240

Ϊ2: (iii) SEKVENSSIN KUVAUS: SEQ ID NO:26: O

·3 ·1· GCGCGCGGAT CCTTGGCTGG TTTAGAGGTA A 31 « · · « *:1·: (28) SEKVENSSIN ID NO: 27 TIEDOT: , (i) SEKVENSSIN OMINAISPIIRTEET: ϊ : : (A) PITUUS: 32 nukleotidia ::: (B) TYYPPI: nukleiinihappo • 1 * · « *·1 • 1 I • 1 · ··1 -dl

• · 1 'G

• · · hl • " • · • · · • « · ··1· 2 • · · 3 • · • 1 · * • 1 • · f • 1 · J.

62 117789 (C) JUOSTEISUUS: yksisäikeinen 1ι (D) TOPOLOGIA: lineaarinen fi (ii) ALKUPERÄ: 1! (A) ORGANISMI: Branhamella catarrhalis if! (B) KANTA: 25240 ΐι (iii) SEKVENSSIN KUVAUS: SEQ ID NO:27: ΪΙ ATATATGAAT TCAACAACAA TATCTTCAAT TA 32 :1 (29) SEKVENSSIN ID NO:28 TIEDOT: ί1 (i) SEKVENSSIN OMINAISPIIRTEET: 1 (A) PITUUS: 71 aminohappo jäännöstä 'f (B) TYYPPI: aminohappo 5· (C) TOPOLOGIA: lineaarinen S· (ii) ALKUPERÄ: Ϊ! (A) ORGANISMI: Branhamella catarrhalis (B) KANTA: 25240 i (iii) OMINAISPIIRTEET: (A) ASEMA: CD:n aminohappoasemat 261 - 331 (iv) SEKVENSSIN KUVAUS: SEQ ID NO:28:

Asp Ser Asp Gly Asp Gly Vai Pro Asp His Leu Asp Ala Cys Pro 15 10 15 v

Glu Thr Pro Vai Asn Thr Vai Vai Asp Pro Arg Gly Cys Pro Vai · 20 25 30 f

Gin Vai Asn Leu Vai Glu Glu Leu Arg Gin Glu Leu Arg Vai Phe $· 35 40 45

Phe Asp Tyr Asp Lys Ser Ile Ile Lys Pro Gin Tyr Arg Glu Glu 50 55 60 |

Vai Ala Lys Vai Ala Ala Gin Met Arg Glu Phe i 65 70 ?.

(30) SEKVENSSIN ID NO:29 TIEDOT: (i) SEKVENSSIN OMINAISPIIRTEET: i (A) PITUUS: 29 nukleotidia (B) TYYPPI: nukleiinihappo : (C) JUOSTEISUUS: yksisäikeinen i

(D) TOPOLOGIA: lineaarinen I

(ii) ALKUPERÄ: ! (A) ORGANISMI: Branhamella catarrhalis >; (B) KANTA: 25240 ί (iii) SEKVENSSIN KUVAUS: SEQ ID NO:29: • · C- **··/ GCGCGCGGAT CCGATTCAGA CGGAGATGG 29 ;i • ♦ · *··1. (31) SEKVENSSIN ID NO:30 TIEDOT: ·:1·; (i) SEKVENSSIN OMINAISPIIRTEET: : (A) PITUUS: 29 nukleotidia ·: f : J (B) TYYPPI: nukleiinihappo *** (C) JUOSTEISUUS: yksisäikeinen i * 1 · i • « · · i • · · - >i • · 1 · Ϊ ··· ? # 1 1 ? t · · • i * 1 • · · • 1 1 ♦ ·1· .... · 1 • · · .

* · • « • · 1 ·«··· • · 1 · • I · • 1

: ; I

x 63 1 1 7 7 8 9 ί (D) TOPOLOGIA! lineaarinen (ii) ALKUPERÄ: I: (A) ORGANISMI: Branhamella catarrhalis i' (B) KANTA: 25240 f (iii) SEKVENSSIN KUVAUS: SEQ ID NO:30: i ATATATGAAT TCGAATTCAC GCATTTGCG 29 ί (32) SEKVENSSIN ID NO:31 TIEDOT: (i) SEKVENSSIN OMINAISPIIRTEET: (A) PITUUS: 41 aminohappojäännöstä . ^ (B) TYYPPI: aminohappo (C) TOPOLOGIA: lineaarinen (ii) ALKUPERÄ: (A) ORGANISMI: Branhamella catarrhalis (B) KANTA: 25240 (iii) OMINAISPIIRTEET: (A) ASEMA: CD:n aminohappoasemat 261 - 301 1' (iv) SEKVENSSIN KUVAUS: SEQ ID NO: 31: >' .in

Asp Ser Asp Gly Asp Gly Vai Pro Asp His Leu Asp Ala Cys Pro t 15 10 15 1'

Glu Thr Pro Vai Asn Thr Vai Vai Asp Pro Arg Gly Cys Pro Vai

20 25 30 J

Gin Vai Asn Leu Vai Glu Glu Leu Arg Gin Glu 35 40 | (33) SEKVENSSIN ID NO:32 TIEDOT: (i) SEKVENSSIN OMINAISPIIRTEET: >! (A) PITUUS: 29 nukleotidia -1' (B) TYYPPI: nukleiinihappo ? (C) JUOSTEISUUS: yksisäikeinen ‘1

(D) TOPOLOGIA; lineaarinen I

(ii) ALKUPERÄ: , 1 (A) ORGANISMI: Branhamella catarrhalis (B) KANTA: 25240 : (iii) SEKVENSSIN KUVAUS: SEQ ID NO:32: f ATATATGAAT TCATCCAGAT GATCAGGCA 29 f 'h1 (34) SEKVENSSIN ID NO:33 TIEDOT: | .. (i) SEKVENSSIN OMINAISPIIRTEET: f l 1.. (A) PITUUS: 26 aminohappojäännöstä i (B) TYYPPI: aminohappo ! i I (C) TOPOLOGIA: lineaarinen

**’. (ii) ALKUPERÄ: I

*!’ (A) ORGANISMI: Branhamella catarrhalis · ' **". (B) KANTA: 25240 (iii) OMINAISPIIRTEET: ? . (A) ASEMA: CD:n aminohappoasemat 286 - 311 i *t:#: (iv) SEKVENSSIN KUVAUS: SEQ ID NO: 33: ♦ · · ' ' ' 1·’ f · 1 4 · · ·ν • % ··· • · 1 » · · • 1 1 * · · 1 • · #

H

• 1 * » « « · · • · · · • 1 · ' ' • · • · « • • · » 1 · « # ·, .1 · • · · ji » · 1 • 1 • 1) 64 1 1 77 89 f

Arg Gly Cys Pro Vai Gin Vai Asn Leu Vai Glu Glu Leu Arg Gin ,'i 15 10 15

Glu Leu Arg Vai Phe Phe Asp Tyr Asp Lys Ser . P

20 25 ίί (35) SEKVENSSIN ID NO:34 TIEDOT: (i) SEKVENSSIN OMINAISPIIRTEET: (A) PITUUS: 29 nukleotidia (B) TYYPPI: nukleiinihappo (C) JUOSTEISUUS: yksisäikeinen (D) TOPOLOGIA: lineaarinen f

(ii) ALKUPERÄ: I

(A) ORGANISMI: Branhamella catarrhalis (B) KANTA: 25240 (iii) SEKVENSSIN KUVAUS: SEQ ID NO:34: : GCGCGCGGAT CCCGCGGTTG CCCAGTACA 29 -;f (36) SEKVENSSIN ID NO:35 TIEDOT: *

(i) SEKVENSSIN OMINAISPIIRTEET: S

(A) PITUUS: 29 nukleotidia (B) TYYPPI: nukleiinihappo ’ (C) JUOSTEISUUS: yksisäikeinen (D) TOPOLOGIA: lineaarinen ?j (ii) ALKUPERÄ: ί (A) ORGANISMI: Branhamella catarrhalis (B) KANTA: 25240 (iii) SEKVENSSIN KUVAUS: SEQ ID NO: 35: r" f1 ATATATGAAT TCGATTTATC ATAATCAAA 29 n (37) SEKVENSSIN ID NO:36 TIEDOT: (i) SEKVENSSIN OMINAISPIIRTEET: »i (A) PITUUS: 16 aminohappojäännöstä f (B) TYYPPI: aminohappo ‘ (C) TOPOLOGIA: lineaarinen (ii) ALKUPERÄ: n (A) ORGANISMI: Branhamella catarrhalis (B) KANTA: 25240 (iii) OMINAISPIIRTEET: i

(A) ASEMA: CD:n aminohappoasemat 286 - 301 I

(iv) SEKVENSSIN KUVAUS: SEQ ID NO:36: | 5 aa : Arg Gly Cys Pro Vai Gin Vai Asn Leu Vai Glu Glu Leu Arg Gin *... 1 5 10 15 f a 4 . . ς

’·*:* giu I

• · · Hi (38) SEKVENSSIN ID NO:37 TIEDOT: ·;··: (i) SEKVENSSIN OMINAISPIIRTEET: , (A) PITUUS: 30 nukleotidia t : : (B) TYYPPI: nukleiinihappo | (C) JUOSTEISUUS: yksisäikeinen .f t : : • f • · · • · · • · · * ♦ · . . i • · • t · • · · . » • · * · ; * * · ' a · « * » *: • » a a a a a • a · ·„:

. . ’I

• a · • aa « a 65 1 1 7789 (D) TOPOLOGIA: lineaarinen (ii) ALKUPERÄ: (A) ORGANISMI: Branhaiuella catarrhalis ,.

(B) KANTA: 25240 | (iii) SEKVENSSIN KUVAUS: SEQ ID NO:37: f ATATATGAAT TCCTCTTGGC GAAGCTCTTC 3 0 ;; (39) SEKVENSSIN ID NO:38 TIEDOT; (i) SEKVENSSIN OMINAISPIIRTEET: ( (A) PITUUS: 11 aminohappo j äännöstä (B) TYYPPI: aminohappo Ä (C) TOPOLOGIA: lineaarinen (ii) ALKUPERÄ: (A) ORGANISMI: Branhaiuella catarrhalis (B) KANTA: 25240 ? (iii) OMINAISPIIRTEET: (A) ASEMA: CD:n aminohappoasemat 293 - 303 ' (iv) SEKVENSSIN KUVAUS: SEQ ID NO:38: jS;

Asn Leu Vai Glu Glu Leu Arg Gin Glu Leu Arg f l 5 10 (40) SEKVENSSIN ID NO:39 TIEDOT; (i) SEKVENSSIN OMINAISPIIRTEET: r (A) PITUUS: 29 nukleotidia (B) TYYPPI; nukleiinihappo (C) JUOSTEISUUS: yksisäikeinen (D) TOPOLOGIA: lineaarinen v

(ii) ALKUPERÄ: I

(A) ORGANISMI: Branhaiuella catarrhalis ϊ (B) KANTA: 25240 i (iii) SEKVENSSIN KUVAUS: SEQ ID NO:39: GCGCGCGGAT CCAATTTGGT AGAAGAGCT 29 | (41) SEKVENSSIN ID NO:40 TIEDOT: (i) SEKVENSSIN OMINAISPIIRTEET; (A) PITUUS: 29 nukleotidia (B) TYYPPI: nukleiinihappo

(C) JUOSTEISUUS: yksisäikeinen J

(D) TOPOLOGIA: lineaarinen I

(ii) ALKUPERÄ: f tt (A) ORGANISMI: Branhaiuella catarrhalis (B) KANTA: 25240 * (iii) SEKVENSSIN KUVAUS: SEQ ID NO:40: 5 * · ·...1 ATATATGAAT TCACGCAACT CTTGGCGAA 2 9 | * 1 1 } (42) SEKVENSSIN ID NO:41 TIEDOT: ·;·1: (i) SEKVENSSIN OMINAISPIIRTEET: ! t (A) PITUUS: 17 aminohappojäännöstä .

t : ; (B) TYYPPI: aminohappo ( *** (C) TOPOLOGIA: lineaarinen f · · v · i • · 1 * · 1 • · I . .. tr • 1 1 Λ 'i * ‘Ί • · » i i · · «»·.

• · · 1 • 1 • · *·· . ] • · · « ·· • · 66 1 1 7789 (ii) ALKUPERÄ: ; (A) ORGANISMI: Branhamella catarrhalis (B) KANTA: 25240 . Ϊ (iii) OMINAISPIIRTEET: .i

(A) ASEMA: CD:n aminohappoasemat 295 - 311 I

(iv) SEKVENSSIN KUVAUS: SEQ ID NO:41: I

' I

Vai Glu Glu Leu Arg Gin Glu Leu Arg Vai Phe Phe Asp Tyr Asp ' 1 5 10 15 ί

Lys Ser j 17 ! (43) SEKVENSSIN ID NO:42 TIEDOT: (i) SEKVENSSIN OMINAISPIIRTEET: (A) PITUUS: 29 nukleotidia . . \ (B) TYYPPI: nukleiinihappo .

(C) JUOSTEISUUS: yksisäikeinen (D) TOPOLOGIA: lineaarinen jj (ii) ALKUPERÄ: ' \ (A) ORGANISMI: Branhamella catarrhalis | (B) KANTA: 25240 1 (iii) SEKVENSSIN KUVAUS: SEQ ID NO: 42: ’i GCGCGCGGAT CCGTAGAAGA GCTTCGCCA 29 ' ¢.

(44) SEKVENSSIN ID NO143 TIEDOT: | (i) SEKVENSSIN OMINAISPIIRTEET: . i (A) PITUUS: 29 nukleotidia \ (B) TYYPPI: nukleiinihappo ί (C) JUOSTEISUUS: yksisäikeinen ; il (D) TOPOLOGIA: lineaarinen ΐ (ii) ALKUPERÄ: ' ·| (A) ORGANISMI: Branhamella catarrhalis (B) KANTA: 25240 Ä (iii) SEKVENSSIN KUVAUS: SEQ ID NO:43: i ATATATGAAT TCGATTTATC ATAATCAAA 29 i (45) SEKVENSSIN ID NO:44 TIEDOT: (i) SEKVENSSIN OMINAISPIIRTEET: ί (A) PITUUS: 21 aminohappojäännöstä (B) TYYPPI: aminohappo ·! (C) TOPOLOGIA: lineaarinen ί : ·.. (ii) ALKUPERÄ: " (A) ORGANISMI: Branhamella catarrhalis I : (B) KANTA: 25240 **·. (iii) OMINAISPIIRTEET: ^ ·” (A) ASEMA: CD:n aminohappoasemat 311 - 331 1 "2. (iv) SEKVENSSIN KUVAUS: SEQ ID NO:44: , * · 1 · · • · ' . Ser Ile Ile Lys Pro Gin Tyr Arg Glu Glu Vai Ala Lys Vai Ala

i : : i 5 ίο is I

• · · * ·1 • · · i *" } • · · • 1 « • 1 · •«· • · # * * · Λ • · · • · 1 it· · .

• 1 1 1 • · • · · • · ***·Φ • · » ί » « 2 • · · 67 1 1 7789 1

Ala Gin Met Arg Glu Phe 20 i (46) SEKVENSSIN ID NO:45 TIEDOTt 3 (i) SEKVENSSIN OMINAISPIIRTEET: ' (A) PITUUS: 29 nukleotidia

(B) TYYPPI: nukleiinihappo O

(C) JUOSTEISUUS: yksisäikeinen * (D) TOPOLOGIA: lineaarinen ; (ii) ALKUPERÄ: j (A) ORGANISMI: Branhamella catarrhalis (B) KANTA: 25240 (iii) SEKVENSSIN KUVAUS: SEQ ID NO:45: GCGCGCGGAT CCTCAATCAT CAAACCCCA 29 (47) SEKVENSSIN ID NO:46 TIEDOT: (i) SEKVENSSIN OMINAISPIIRTEET: (A) PITUUS: 29 nukleotidia (B) TYYPPI: nukleiinihappo (C) JUOSTEISUUS: yksisäikeinen (D) TOPOLOGIA: lineaarinen % (ii) ALKUPERÄ: (A) ORGANISMI: Branhamella catarrhalis (B) KANTA: 25240 (iii) SEKVENSSIN KUVAUS: SEQ ID NO:46: ; ATATATGAAT TCGAATTCAC GCATTTGCG 29 (48) SEKVENSSIN ID NO:47 TIEDOT: (i) SEKVENSSIN OMINAISPIIRTEET: (A) PITUUS: 59 aminohappojäännöstä i

(B) TYYPPI: aminohappo I

(C) TOPOLOGIA: lineaarinen ! (ii) ALKUPERÄ: i (A) ORGANISMI: Branhamella catarrhalis (B) KANTA: 25240 3 (iii) OMINAISPIIRTEET: ' \ (A) ASEMA: CD:n aminohappoasemat 332-390 | (XV) SEKVENSSIN KUVAUS: SEQ ID NO:47: * 7

Pro Asn Ala Thr Ala Thr Ile Glu Gly His Ala Ser Arg Asp Ser 1 5 10 15 - i \ ·*·., Ala Arg Ser Ser Ala Arg Tyr Asn Gin Arg Leu Ser Glu Ala Arg .; • 2 0 2 5 3 0 • f · ί i : *** Ala Asn Ala Vai Lys Ser Met Leu Ser Asn Glu Phe Gly Ile Ala *·' 35 40 45 ·;··; Pro Asn Arg Leu Asn Ala Vai Gly Tyr Gly Phe Asp Arg Pro ί 50 55 59 . ( | · · **** (49) SEKVENSSIN ID NO:48 TIEDOT: j ti’: • ** * -i #·· • * * 1 • · · • i‘ •

• · J

• · · • · • · * · ··· : , .-¾ : : ·*· * * i * i ····* • · » ·· 9 · i 68 \ 117789 (i) SEKVENSSIN OMINAISPIIRTEET: ί

(A) PITUUS: 29 nukleotidia I

(B) TYYPPI: nukleiinihappo ? (C) JUOSTEISUUS: yksisäikeinen (D) TOPOLOGIA: lineaarinen ' f (ii) ALKUPERÄ: (A) ORGANISMI: Branhamella catarrhalis | ; (B) KANTA: 25240 ! (lii) SEKVENSSIN KUVAUS: SEQ ID NO:48: GCGCGCGGAT CCCCAAATGC AACTGCAAC 29 ί

(50) SEKVENSSIN ID NO:49 TIEDOT: T

(i) SEKVENSSIN OMINAISPIIRTEET: f (A) PITUUS: 29 nukleotidia } (B) TYYPPI: nukleiinihappo (C) JUOSTEISUUS: yksisäikeinen (D) TOPOLOGIA: lineaarinen 11 (ii) ALKUPERÄ: (A) ORGANISMI: Branhamella catarrhalis (B) KANTA: 25240 .'# (iii) SEKVENSSIN KUVAUS: SEQ ID NO:49: ! ATATATGAAT CCAGGACGAT CAAAGCCAT 29 ί s •J? (51) SEKVENSSIN ID NO: 50 TIEDOT: f- (i) SEKVENSSIN OMINAISPIIRTEET: ' (A) PITUUS: 37 aminohappojäännöstä :f (B) TYYPPI: aminohappo f (C) TOPOLOGIA: lineaarinen | (ii) ALKUPERÄ: f (A) ORGANISMI: Branhamella catarrhalis (B) KANTA: 25240 i.

(iii) OMINAISPIIRTEET: . if (A) ASEMA: CD:n aminohappoasemat 391 - 427 t (iv) SEKVENSSIN KUVAUS: SEQ ID NO:50:

Ile Ala Pro Asn Thr Thr Ala Glu Gly Lys Ala Met Asn Arg Arg 7 1 5 10 15 ' )

Vai Glu Ala Vai Ile Thr Gly Ser Lys Thr Thr Thr Vai Asp Gin 1 20 25 30 | ,. Thr Lys Asp Met Ile Vai Gin : ·.. 35 37 * (52) SEKVENSSIN ID NO:51 TIEDOT: i "t (i) SEKVENSSIN OMINAISPIIRTEET: ί "* (A) PITUUS: 29 nukleotidia ***', (B) TYYPPI: nukleiinihappo i *ϊ**ί (C) JUOSTEISUUS: yksisäikeinen i , (D) TOPOLOGIA: lineaarinen ί t : Ϊ (ii) ALKUPERÄ: ϊ (A) ORGANISMI: Branhamella catarrhalis - lii 'j % • 1 • * * • · · *·· i* * * · ' · • :-2 • * Λ • · » • · · ···· *·· * i : ···..

• > • * f t · ·. ·: "ϊ € -¾ 69 ' 1

117789 I

(Β) KANTA: 25240 ä (iii) SEKVENSSIN KUVAUS: SEQ ID NO:51:

GCGCGCGGAT CCATCGCTCC AAATACTAC 29 J

(53) SEKVENSSIN ID NO: 52 TIEDOT: f (i) SEKVENSSIN OMINAISPIIRTEET: (A) PITUUS: 33 nukleotidia (B) TYYPPI: nukleiinihappo - (C) JUOSTEISUUS: yksisäikeinen (D) TOPOLOGIA: lineaarinen (ii) ALKUPERÄ: | (A) ORGANISMI: Branhamella ca.tarrha.lis jf (B) KANTA: 25240 . :| (iii) SEKVENSSIN KUVAUS: SEQ ID NO:52: ATATATGAAT TCTTGAACAA TCATATCTTT GGT 33 . 1 '1- : f f- ;jir . i V '1 .·.£ § • · t 1 • ·· »1 1 » 1 » » • · 1 * ·2'

» . A

» - * · 1 · · • · « ,'p1 f · 1 * 1 · » · · • t1 i : : ti···.· • · » • 1 1 * 1 1 .J'' • 1 1 • · 1 * - » · l· • · · *** 1 : : 1 « ':f * · · 1 · • 1 · • · · 2 r ii * »

Claims (25)

70 117789

1. Menetelmä rokotteen valmistamiseksi, joka käsittää immu-nologisesti tehokkaan määrän olennaisesti puhdasta CD:n yhtä 5 tai useampaa epitooppia sisältävää proteiinia, peptidiä tai oligopeptidiä, tunnettu siitä, että proteiini, peptidi tai oligopeptidi tuotetaan rekombinanttisesti, jolloin viljellään isäntäsoluja, joissa on nukleotidi-sekvenssin sisältävä vektori, joka nukleotidisekvenssi sää-10 telee CD-proteiinin tai CD-peptidin tai CD-oligopeptidin epitooppeja koodaavien DNA-sekvenssien tai yhden tai useamman geenifragmentin ilmentymistä ja jossa CD on Branhamella catarrhaliksen ulkomembraaniproteiini, jonka näennäinen suhteellinen moolimassa on noin 55 000 - noin 15 60 000 daltonia ja jota koodaa SEKVENSSISSÄ ID NO: 14 avoimena lukukehyksenä esitetty nukleotidisekvenssi,

2. Förfarande enligt patentkrav 1, kännetecknat av att proteinet som innehäller en eller flera CD-epitoper bestär av en aminosyrasekvens som väsentligt motsvarar den sekvens som beskrivs i SEKVENS ID NR: 14 och som sträcker sig frän 15 aminosyragrupp 1 till aminosyragrupp 427.

2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnet-t u siitä, että yhtä tai useampaa CD-epitooppia sisältävä 20 proteiini koostuu aminohapposekvenssistä, joka on olennaisesti SEKVENSSISSÄ ID NO:14 kuvatun ja aminohapporyhmästä 1 aminohapporyhmään 427 ulottuvan sekvenssin mukainen. • · • · «M j**'. 3. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnet- • · · 25. u siitä, että yhtä tai useampaa CD-epitooppia sisältävä proteiini koostuu aminohapposekvenssistä, joka on olennai- • * sesti SEKVENSSISSÄ ID N0:14 kuvatun ja aminohapporyhmästä I" -26 aminohapporyhmään 427 ulottuvan sekvenssin mukainen. • · · * · * *

3. Förfarande enligt patentkrav 1, kännetecknat av att proteinet som innehäller en eller flera CD-epitoper bestär av en aminosyrasekvens, som är väsentligt motsvarar den 20 sekvens som beskrivs i SEKVENS ID NR:14 och som sträcker sig frän aminosyragrupp -26 till aminosyragrupp 427.

4. Förfarande enligt patentkrav 1, kännetecknat av att .. peptiden, oligopeptiden eller proteinet är framställt med • · ' m'' 25 rekombinant-DNA-förfaranden genom att använda odlade celler ; • · ’···* som härstammar frän ett pä dylikt vis genetiskt bearbetat ...: värdcellssystem, att systemet innehäller en vektor, .f m innefattande en nukleotidsekvens som reglerar expression av DNA-sekvenser som kodar CD-epitoper, och nämnda :*Γ: 30 värdcellsystem kan vara en bakterie, jäst, en trädformig ♦ svamp, en insektscellslinje eller en däggdjurscellinje. # · · ·«·. • · · ,···, 5. Förfarande enligt patentkrav 1, kännetecknat av att » · *" peptiden eller oligopeptiden framstallts genom att spjälka * ***: 35 ett CD-protein kemiskt eller enzymatiskt. « • · . 6. Förfarande enligt patentkrav 1, kännetecknat av att • · · • · · peptiden eller oligopeptiden framstallts genom att • · 75 1 1 7789 syntetisera denna kemiskt.

4. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnet- t u siitä, että peptidi, oligopeptidi tai proteiini on ···>'. ·,,,· valmistettu yhdistelmä-DNA-menetelmillä käyttäen viljeltyjä , soluja, jotka ovat peräisin sillä tavoin geneettisesti • Φ * .···. muokatusta isäntäsolujär jestelmästä, että järjestelmä si- * · V 35 sältää vektorin, johon kuuluu CD-epitooppeja koodaavien • · : '** DNA-sekvenssi en ilmentymistä säätelevä nukleotidisekvenssi, | ja mainittu isäntäsolujärjestelmä voi olla bakteeri, hiiva, sädesieni, hyönteissolulinja tai nisäkässolulinja. : ' I 7i 1 1 7789

5. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnet-t u siitä, että peptidi tai oligopeptidi on valmistettu pilkkomalla CD-proteiinia kemiallisesti tai entsymaat- 5 tisesti.

6. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että peptidi tai oligopeptidi on valmistettu syntetisoimalla tätä kemiallisesti. iO

7. Förfarande enligt patentkrav 1, kännetecknat av att det dessutom innefattar en farmaceutiskt godtagbar bärare eller 5 ett farmaceutiskt godtagbart spädningsmedel.

7. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnet-t u siitä, että se sisältää lisäksi farmaseuttisesti hyväksyttävää kantaja-ainetta tai laimenninta.

8. Förfarande enligt patentkrav 7, kännetecknat av att det dessutom innehäller en immunmodulator. 10 9. Förfarande enligt patentkrav 1, kännetecknat av att peptiden eller oligopeptiden som innehäller en eller flera CD-epitoper är SEQ ID NR:1, SEQ ID NR:19, SEQ ID NR:22, SEQ ID NO :25, SEQ ID NR:28, SEQ ID NR:31, SEQ ID NR:33, SEQ ID NR:36, SEQ ID NR:38, SEQ ID NR:41, SEQ ID NR:44, SEQ ID 15 NR:47 eller SEQ ID NR:50.

8. Patenttivaatimuksen 7 mukainen menetelmä, tunnet- t u siitä, että se sisältää lisäksi immunomodulaattoria.

9. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että yhden tai useamman CD-epitoopin 20 sisältävä peptidi tai oligopeptidi on SEQ ID NO:l, SEQ ID V NO: 19, SEQ ID NO:22, SEQ ID NO:25, SEQ ID NO:28, SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO:33, SEQ ID NO:36, SEQ ID NO:38, SEQ ID : *** NO: 41, SEQ ID NO:44, SEQ ID NO:47 tai SEQ ID NO:50. , * · · * · • · • · · -ji

10. Förfarande enligt patentkrav 4, kännetecknat av att nukleotidsekvensen som kodar CD-epitoper är SEQ ID NR:1 eller SEQ ID NR:14. 20

10 Branhamella catarrhaliksen ulkomembraaniproteiini, jonka näennäinen suhteellinen moolimassa on noin 55 000 - noin 60 000 daltöniä ja jonka aminohapposekvenssi on olennaisesti SEKVENSSISSÄ ID NO:14 kuvatun sekvenssin mukainen. 15

10. Patenttivaatimuksen 4 mukainen menetelmä, t u n - *:**: n e t t u siitä, että CD-epitooppeja koodaava nukleotidi- : sekvenssi on SEQ ID NO:l tai SEQ ID NO: 14. ··* • ·φ I « Φ Φ · · •

11. Förfarande enligt patentkrav 4, kännetecknat av att den odlade cellen är en bakterie.

;·# 12. Förfarande enligt patentkrav 4, kännetecknat av att den • ·· 25 odlade cellen är jäst. • * • · f • · ψ * • · * ·**: 13. Förfarande enligt patentkrav 4, kännetecknat av att den ; ···*· • * odlade cellen är en trädformad svamp. * • · * • · · • · · * « » ϊ 30 14. Förfarande enligt patentkrav 4, kännetecknat av att den odlade cellen är en insektcellslinje. • · · * ♦ · ··· . . , .***. 15. Förfarande enligt patentkrav 4, kännetecknat av att den ·«· •φ odlade cellen är en däggdjurscellinje. 35 ' * 16. Rekombinantvektor, kännetecknad av att den innehäller ; en DNA-sekvens som kodar en eller flera antigena • · · determinanter eller epitoper av CD, varvid CD är ett yttre 76 1 1 7 7 89 membranprotein av Branhamella catarrhalis, vars uppenbara relativa molmassa är ca 55 000 - ca 60 000 dalton och vars aminosyrasekvens väsentligt motsvarar den sekvens som beskriver SEKVENS ID NR:14. 5

11. Patenttivaatimuksen 4 mukainen menetelmä, tunnet- , m·' 30 t u siitä, että viljelty solu on bakteeri. * « · * * * • vt • · • · *;* 12. Patenttivaatimuksen 4 mukainen menetelmä, t u nn e t - • » :.V t u siitä, että viljelty solu on hiiva. * · · • * • · * * * ...

13. Patenttivaatimuksen 4 mukainen menetelmä, tunnet- • φ · t u siitä, että viljelty solu on sädesieni. • * 72 t 117789

14. Patenttivaatimuksen 4 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että viljelty solu on hyönteissolulinja.

15. Patenttivaatimuksen 4 mukainen menetelmä, tunnet-5 t u siitä, että viljelty solu on nisäkässolulinja.

16. Yhdistelmävektori, tunnettu siitä, että se sisältää DNA-sekvenssin, joka koodaa yhtä tai useampaa CD:n antigeenistä determinanttia tai epitooppia, jossa CD on

17. Rekombinantvektor enligt patentkrav 16, kännetecknad av att CD bildas av en aminosyrasekvens enligt en sekvens som framställs i SEKVENS ID NR: 14 och som sträcker sig frän aminosyragruppen 1 till aminosyragruppen 427. 10

17. Patenttivaatimuksen 16 mukainen yhdistelmävektori, tunnettu siitä, että CD muodostuu olennaisesti SEKVENSSISSÄ ID NO:14 kuvatun ja aminohapporyhmästä 1 aminohapporyhmään 427 ulottuvan sekvenssin mukaisesta 20 aminohapposekvenssistä.

18. Rekombinantvektor enligt patentkrav 16, kännetecknad av att proteinet som innehäller en eller flera CD-epitoper bestär av en aminosyrasekvens, som väsentligt motsvarar den sekvens som beskrivs i SEKVENS ID NR:14 och som sträcker 15 sig frän aminosyragrupp -26 till aminosyragrupp 427.

18. Patenttivaatimuksen 16 mukainen yhdistelmävektori, ·· :**· tunnettu siitä, että yhden tai useamman CD:n epitoo- ··· ϊ.,.ϊ pin sisältävä proteiini muodostuu olennaisesti SEKVENSSISSÄ 4>*j· 25 ID NO: 14 kuvatun ja aminohapporyhmästä -26 aminohapporyhmään ·;··· 427 ulottuvan sekvenssin mukaisesta aminohapposekvenssistä. • « « • · · • · ♦

19. Reombinantvektor enligt patentkrav 16, kännetecknad av att vektorn är en plasmidvektor, en fagimidvektor, en kosmidvektor eller en virusvektor. 20

19. Patenttivaatimuksen 16 mukainen yhdistelmävektori, • · · tunnettu siitä, että vektori on plasmidivektori, . 30 fagimidivektori, kosmidivektori tai virusvektori. ♦ · · • · · *♦· ··· • · '*♦·* 20. Eristetty geeni tai jokin sen fragmentti, tunnet- t u siitä, että se koodaa Branhamella catarrhaliksen uiko- * * membraaniprotei inia CD, jonka näennäinen suhteellinen » * · ,,* 35 moolimassa on noin 55 000 - noin 60 000 daltonia, ja siitä, • « * " että mainittu geeni sisältää SEKVENSSIN ID NO:14 mukaisen • * · · · * ' 1359 emäsparin suuruisen avoimen lukukehyksen. 73 1 1 77 89

20. En isolerad gen eller dess fragment, kännetecknad av att den kodar yttre membranprotein CD av Branhamella catarrhalis, vars uppenbara relativa molmassa är ca 55 000 .. - ca 60 000 dalton och av att nämnda gen innehäller en i • · * · · *... 25 öppen läsram med en storlek av 1359 baspar enligt SEKVENS j • · ’*··' ID NR: 14. * · * • Φ · · ’ * 21. Infekterande rekombinant mikro-organism, kännetecknad av att den förmär uttrycka CD-protein av B. Catarrhalis, • * · ϊ 30 vars uppenbara relativa molmassa är ca 55 000 - ca 60 000 dalton, CD-peptider eller CD-oligopeptider. • · - -• * * • · · • * · .**·. 22. Mikro-organism enligt patentkrav 21, kännetecknad av • · · • # att den är ett vaccinvirus, ett adenovirus eller ett ···*· 35 sytomegalovirus. • * · *· • ♦ j ;*; 23. Mikro-organism enligt patentkrav 21, kännetecknad av ··· ....: att den är en bakterie av släkten Salmonella. • · I ’ 77 1 1 7789

21. Infektoiva yhdistelmämikro-organismi, tunnettu siitä, että se kykenee ilmentämään B. catarrhaliksen CD-proteiinia, jonka näennäinen suhteellinen moolimassa on noin 55 000 - noin 60 000 daltonia, CD-peptidejä tai CD- 5 oligopeptidejä.

22. Patenttivaatimuksen 21 mukainen mikro-organismi, tunnettu siitä, että se on vacciniavirus, adenovirus tai sytomegalovirus. 10

23. Patenttivaatimuksen 21 mukainen mikro-organismi, tunnettu siitä, että se on Salmonella-suvun bakteeri.

24. Oligonukleotid användbar vid detektering av B. Catarrhalis, kännetecknad av att nänvnda oligonukletider bestir väsentligt av nukleinsyrasekvenser, som fungerar som 5 ett komplement och hybridiseras specifikt till omräden som bevarats i en gen som ingär i en nukleotidsekvens enligt SEQ ID NR:14 eller dess motsvarande komplementara sträng.

24. Jokin B. catarrhaliksen havaitsemisessa käyttökelpoinen oligonukleotidi, tunnettu siitä, että mainitut oligonukleotidit koostuvat olennaisesti nukleiinihappo-sekvensseistä, jotka toimivat komplementtina ja hybridi-soituvat spesifisesti sellaisen geenin säilyneisiin aluei-20 siin, jotka sisältyvät SEQ ID NO:14:n mukaiseen nukleotidi sekvenssi in tai sitä vastaavaan komplementaariseen juosteeseen.

25. Jokin patenttivaatimuksen 24 mukainen oligonukleotidi, • · *..7 25 tunnettu siitä, että oligonukleotidit koostuvat • · *···* olennaisesti nukleiinihapposekvensseistä, jotka ovat SEQ ID « ...T NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO:12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 15, SEQ ID :T: 30 NO:16, SEQ ID NO:17 tai SEQ ID NO:18. • ♦ *·· • ♦ · • · · .···, Patentkrav ♦ · • · « • ^ 35 1. Förfarande för att framställa ett vaccin, innefattande ett protein, en peptid eller en oligopeptid som innehäller ♦ . en eller flera epitoper av en immunologt effektiv mangd • · · väsentligt ren CD, kännetecknat av att proteinet, peptiden • · 74 1 1 7789 eller oligopeptiden frams tails med rekombinantmedel, varvid man odlar värdceller, innefattande en vektor innehällande en nukleotidsekvens som reglerar expression av DNA-sekvenser som kodar epitoper av CD-protein eller CD-peptid 5 eller CD-oligopeptid eller ett eller flera genfragment, och varvid CD är ett yttre membranprotein av Branhamella catarrhalis, vars uppenbara relativa molmassa är ca 55 000 - ca 60 000 dalton och som kodas av en nukleotidsekvens framställd som en öppen läsram i SEKVENS ID NR:14. 10

25. Oligonukleotid enligt patentkrav 24, kännetecknad av 10 att oligonukleotiderna bestär väsentligt av nukleotidsyra- sekvenser, vilka är SEQ ID NR:2, SEQ ID NR:3, SEQ ID NR:4, SEQ ID NO:5, SEQ ID NR:6, SEQ ID NR:7, SEQ ID NR:8, SEQ ID NR: 9, SEQ ID NR:10, SEQ ID NR:11, SEQ ID NR:12, SEQ ID NR:13 eller SEQ ID NR:15, SEQ ID NR:16, SEQ ID NR:17 eller 15 SEQ ID NR:18. ·· · • «· • Φ · • · • * • · · • · · Φ * · · · **···' • · • · · * * · ·*· »·· * * * * · # * • · · ··· • f · ♦ ·· :: ··· ··«·* • · »»··· • · • · ♦ • · ♦ »·· ····· • ·