ES2443094T3 - Vacuna contra la infección por Actinobacillus pleuropneumoniae que comprende la toxina ApxIV purificada - Google Patents

Abstract

Una vacuna sub-unitaria para la protección de animales contra la infección por una bacteria de la especieActinobacillus pleuropneumoniae, caracterizada porque dicha vacuna comprende toxina ApxIV purificada y unvehículo farmacéuticamente aceptable.

Description

Vacuna contra la infección por Actinobacillus pleuropneumoniae que comprende la toxina ApxIV purificada

La presente invención se refiere a bacterias vivas atenuadas del género Actinobacillus pleuropneumoniae, que tienen una mutación en el gen que codifica una toxina, a los procedimientos para la producción de tal bacteria, a las vacunas que comprenden tal bacteria, a los procedimientos para la producción de tales vacunas, a las vacunas que comprenden una toxina, a los procedimientos para la producción de tales vacunas y procedimientos para la protección de animales contra la infección por bacterias del género Actinobacillus pleuropneumoniae.

Las bacterias que pertenecen al género Actinobacillus producen todas las denominadas toxinas RTX (permanece RTX para repetirse en toxina).

La presencia de estas toxinas RTX es lo que contribuye sobre todo al carácter patógeno de estas bacterias.

Las toxinas RTX han sido extensamente revisadas por Braun y col. (Critical Rev. in Microbiol. 18(2): 115-158 (1991)). También se han revisado las toxinas RTX de las cepas Gram-negativas por Welch, R.A. (Molecular Microbiology 5/3: 521-528 (1991)) y por Welch y col. (Inf. Agents and Disease 4: 254-272 (1995)).

Todas las toxinas RTX conocidas muestran algún tipo de actividad citotóxica o citolítica. Sin embargo, las células diana y la especificidad del huésped difieren, dependiendo de la toxina y de las diferencias en la acilación (McWhinney y col.; J. Bact. 174: 291-297 (1992) and Hackett y col.; J. Biol. Chem. 270: 20250-20253 (1995)). Por el resultado en las diferentes células diana, las diferentes toxinas de la familia de las toxinas RTX se conocen por ejemplo como hemolisina, citolisina o citotoxina.

El género Actinobacillus comprende varias especies diferentes, entre ellas, Actinobacillus pleuropneumoniae, A. actinomycetemcomitans, A. suis, A. rossii, A. equuli y A. lignieresii.

El Actinobacillus pleuropneumoniae produce toxinas RTX dependientes del serotipo que son citotóxicas/citolíticas para los eritrocitos del cerdo, caballo, bovinos y ser humano, para los neutrófilos del conejo y porcinos y para los macrófagos alveolares porcinos. (Rosendal y col; Am. J. Vet. Res. 49: 1053-1058 (1988), Maudsley J.R. y Kadis S; Can. J. Microbiol. 32: 801-805 (1986), Frey J. y Nicolet J.; Inf. & Imm, 56:2570-2575 (1988), Bendixon y col; Inf. & Imm, 33: 673-676 (1981), Kamp, E.M. y van Leengoed, L.A.M.G.; J. Clin. Microbiol. 27: 1187-1191 (1989)).

Las infecciones por Actinobacillus en cerdos son la causa de enormes pérdidas económicas para la industria porcina, debido a la mortalidad aguda en cerdos jóvenes y a la reducción de la ganancia de peso en los mayores.

La organización genética de los operones implicados en la síntesis, activación y transporte de las toxinas RTX en bacterias Gram-negativas ha sido revisada recientemente por Coote, J.G. (FEMS Microbiology reviews 88: 137-162 (1992)). Frey ha revisado específicamente las tres toxinas RTX conocidas de Actinobacillus pleuropneumoniae en Bacterial Protein Toxins, Zbl Bakt. Suppl. 24, p. 322-, Freer y coll. (Eds.), Gustaf Fischer, Stutttgart, Jena, New York, 1994.

En el Actinobacillus pleuropneumoniae, este tipo de operón RTX contiene cuatro genes: el gen real de la toxina (A), un gen activador (C), y dos genes (B y D) que codifican las proteínas implicadas en la secreción de la toxina en el medio circundante. El primer producto de la traducción del gen real de la toxina (A) no es una proteína tóxica, la actividad tóxica se activa por un producto del gen-activador (C).

Hasta hace poco, se asumía que solamente existían tres toxinas RTX en las especies de Actinobacillus, y que todas ellas tenían la organización genética descrita anteriormente o al menos que tenían el gen de la toxina (A) y el gen activador (C).

Estas tres toxinas RTX, ApxI, Apx-II, y Apx-III tenían respectivamente, una pronunciada actividad hemolítica (ApxI), una actividad hemolítica media (Apx-II) o una actividad citotóxica para los macrófagos (Apx-III).

Las distintas actividades tóxicas están divididas más o menos aleatoriamente en los serotipos. Hay cuatro subgrupos:

un subgrupo A, representado por los serotipos 1, 5, 9 y 11, que producen ApxI y Apx-II,

un subgrupo B, representado por los serotipos 2, 3, 4, 6 y 8, que producen Apx-II y Apx-III,

un subgrupo C, representado por el serotipo 10, que produce solo ApxI

un subgrupo D, representado por los serotipos 7 y 12, que produce solamente Apx-II.

Se sabe que ApxI, -II y –III, son todas elementos esenciales de las vacunas universales contra la infección por Actinobacillus pleuropneumoniae: una vacuna que no comprende al menos Apxl, -II, y –III no proporcionará protección contra todos los serotipos de Actinobacillus pleuropneumoniae. Igualmente, una vacuna que no comprenda al menos las toxinas Apx de un serotipo específico ni siquiera inducirá protección contra ese único serotipo.

Se han descrito anteriormente subunidades vacunales basadas en toxinas RTX sintetizadas in vitro a partir de A. pleuropneumoniae que han perdido su toxicidad, por ejemplo en la Patente Europea EP Nº 0.354.628, en la que se desvelan subunidades vacunales que se basan en una hemolisina y una citotoxina de A. pleuropneumoniae y en la Patente Europea EP 0.453.024, en la que se desvelan subunidades vacunales de A. pleuropneumoniae basadas en

5 hemolisinas, citotoxinas y proteínas de la membrana externa.

Sin embargo hay cuatro desventajas importantes en las subunidades vacunales en general:

! se necesitan grandes cantidades de material antigénico para que se active adecuadamente del sistema inmunitario, ! normalmente, sólo se activa la inmunidad de células B, 10 ! varios agentes protectores solo se activan in vivo, y por tanto no pueden estar presentes en las subunidades vacunales.

! una bacteria patógena viva tiene muchas moléculas inmunogénicas importantes, tales como las Proteínas de Membrana Externa y polisacáridos capsulares, que son todas ellas potencialmente importantes para la protección y por tanto para incluirse en una vacuna sub-unitaria eficaz.

15 Como en los problemas obvios mencionados en los puntos uno y dos, especialmente el cuarto punto hace que sea difícil fabricar una vacuna sub-unitaria eficaz.

Esto está, por ejemplo, ilustrado para la vacuna sub-unitaria de A. pleuropneumoniae desvelada en la Patente Europea EP Nº 0.453.024, mencionada anteriormente, en la que se combinan cuatro subunidades distintas (tres toxinas RTX y una proteína de membrana externa) en una vacuna.

20 Está claro que, con el fin de superar las desventajas de las subunidades vacunales contra las infecciones por Pasteurellaceae, sería muy deseable una vacuna viva atenuada.

Una vacuna viva atenuada tiene las siguientes ventajas

puede administrarse en dosis bajas (es autorreplicante) imita fielmente la infección por el natural / tipo silvestre

25 proporciona todos los antígenos posibles inmunológicamente importantes al mismo tiempo.

Sin embargo, a pesar de las claras ventajas, no hay disponible comercialmente ninguna vacuna viva basada en Actinobacillus pleuropneumoniae anterior a la presente invención.

La razón para ello está en la siguiente paradoja: como se mencionó antes, las ApxI, -II y -III, son todas elementos esenciales de las vacunas universales contra la infección por Actinobacillus pleuropneumoniae. Por tanto las

30 vacunas vivas tienen que producir estas tres toxinas RTX. Estas tres toxinas RTX sin embargo son factores de alta virulencia en todas las especies de Actinobacillus (véase por ejemplo, Coote, J.G.; FEMS Microbiology reviews 88: 137-162 (1992), Tascon y col.; Mol. Microbiol. 14: 207-216 (1994), Jansen y col.; Inf. & Imm. 63: 27-37 (1995)).

La deleción de las toxinas RTX con el fin de atenuar la virulencia de las cepas vivas de App es técnicamente posible, pero esto no proporciona una solución al dilema: tales cepas RTX negativas serían inútiles como cepas para una

35 vacuna viva atenuada puesto que no inducirían inmunidad a largo plazo en el huésped contra la actividad hemolítica/citotóxica de las cepas de Actinobacillus pleuropneumoniae de campo.

Sin embargo, no se conocen actualmente factores de virulencia que, aunque siendo importantes para la inducción de la inmunidad, tengan un papel menos importante en construir la inmunidad que ApxI, -II, y –III, y que por tanto se podrían eliminar.

40 Por tanto, sería muy deseable tener un sitio en el genoma de App que contribuyera a la virulencia y de esta manera al modificarse produjera una cepa de App atenuada, mientras que al mismo tiempo fuera, aunque útil para desencadenar inmunidad, prescindible desde el punto de vista de una vacuna. Sin embargo tales sitios no se conocen actualmente. Además, sería muy deseable que tal sitio estuviera presente universalmente en todas las cepas de App, en vez de estar restringido a ciertos serotipos. Tal sitio permitiría entonces atenuar todos los

45 diferentes serotipos por la deleción de ese mismo sitio.

Uno de los objetivos de la presente invención es proporcionar tal sitio de atenuación, presente universalmente en todas las cepas de Actinobacillus pleuropneumoniae independientemente de su serotipo.

Recientemente se encontró un nuevo gen en una cepa serotipo 1 de Actinobacillus pleuropneumoniae (Tesis T.J. Anderson Nov. 1995).

50 Aunque este gen no se parece a los genes conocidos de ApxI, -II, y –III, tiene parecido a los genes de toxinas RTX que se conocen de bacterias que pertenecen a Neisseria meningitidis, por esta razón es que se le llamó gen RTX apxIV. Sin embargo, el gen difiere en casi todos los aspectos de los tres genes de toxinas RTX conocidos apxI, -II, y -III presentes en las distintas especies de la familia Actinobacillus como se describió anteriormente. En primer lugar,

la organización genómica es completamente diferente. En segundo lugar, no hay un mecanismo activador como el que se encuentra en las toxinas Apx conocidas. En tercer lugar, hasta ahora no se pudo atribuir una actividad hemolítica o citotóxica in vivo al gen, o su posible producto génico.

Sorprendentemente, se ha descubierto ahora que este gen, totalmente al contrario que los tres genes RTX conocidos, está presente en todas las bacterias de las especies Actinobacillus pleuropneumoniae, independientemente de su serotipo. Esto se determinó por hibridación de una sonda que comprendía secuencias apxIV codificantes con fragmentos de restricción de ADN de Actinobacillus pleuropneumoniae de todos los serotipos como se describe en el Ejemplo 6 y el 7.

Se ha descubierto ahora, sorprendentemente, que los mutantes con deleción de apxIV eran viables, pero que eran menos virulentos cuando se comparaban con sus cepas parentales que poseían apxIV.

Por tanto, se determinó que el producto génico, la toxina ApxIV es un factor de virulencia en todas las cepas de Actinobacillus pleuropneumoniae. Esta es una conclusión inesperada ya que hasta ahora, no se había atribuido ningún efecto, considerando solo los efectos que influenciaran en la virulencia, al producto génico in vivo. De hecho, hasta ahora no había ninguna prueba de que el gen se expresara en Actinobacillus pleuropneumoniae de alguna manera, ni in vivo, ni in vitro.

Por lo tanto uno de los méritos de la invención es que se ha descubierto que:

! el gen apxIV está presente en todas las cepas de A. pleuropneumoniae independientemente del serotipo, ! el producto del gen apxIV es un factor de virulencia en todos los serotipos de A. pleuropneumoniae, ! las cepas de A. pleuropneumoniae con una deleción en el gen apxIV son aún viables pero tienen una virulencia

menor sin que se afecten significativamente las propiedades inmunológicas de las cepas,

Por lo tanto, por primera vez se proporcionan unas bacterias vivas atenuadas de la especie Actinobacillus pleuropneumoniae que no producen una toxina ApxIV funcional.

Una toxina ApxIV funcional se considera que es una proteína que tiene todas las características de la toxina ApxIV que se expresa en la bacteria silvestre, y que se expresa al nivel de la silvestre. Por tanto, una toxina ApxIV no funcional se considera que es una toxina que carece de alguna o todas las características de la toxina ApxIV que se expresa en una bacteria silvestre, y/o que se expresa al nivel insuficiente para obtener los efectos de la toxina ApxIV silvestre.

La incapacidad para producir toxina ApxIV, puede deberse, por ejemplo, a modificaciones en la secuencia codificante que codifica la toxina ApxIV. También puede ser por ejemplo, el resultado de modificaciones en regiones que se conoce que están implicadas en la trascripción del gen apxIV, tales como la región promotora, o de modificaciones en regiones que están implicadas en la traducción, tales como el sitio de unión al ribosoma.

La estructura completa del gen apxIV se muestra en la figura 1.

En esta figura, las regiones de repetición directa, características de la toxina ApxIV están indicadas por marcos de líneas discontinuas, mientras que las regiones nonapeptídicas ricas en glicina también específicas de ApxIV se indican por flechas negras. Las repeticiones se encuentran en la parte del extremo C de ApxIV. Estas imágenes características están presentes en todos los serotipos de Actinobacillus pleuropneumoniae. La secuencia de ácidos nucleicos y la secuencia aminoacídica de dos serotipos están representadas en la SEC. ID. Nº 1-4. La SEC. ID. Nº 1 muestra la secuencia de ácidos nucleicos del gen apxIV del serotipo 1 de App, y la SEC. ID. Nº 2 muestra la secuencia de aminoácidos de coincidencia de la toxina ApxIV del serotipo 1. La SEC. ID. Nº 3 muestra la secuencia de nucleótidos del gen apxIV del serotipo 3 de App, mientras que la SEC. ID. Nº 4 muestra la secuencia aminoacídica de coincidencia de la toxina ApxIV del serotipo 3. La figura 2 muestra el sorprendente alto nivel de conservación a nivel aminoacídico, especialmente en los 650 aminoácidos del extremo N, entre las toxinas Apx de los distintos serotipos de Actinobacillus pleuropneumoniae. Esto también es una característica remarcable de los genes apxIV. Está claro a la vista de la figura 1, que se puede producir una variación en el número de repeticiones en la parte del extremo C de la toxina, dependiendo del serotipo. Esta variación explica la diferencia de tamaño de los genes y las toxinas codificadas por los diferentes serotipos.

Puede haber alguna variación en la secuencia de ácidos nucleicos incluso entre genes apxIV aislados de diferentes aislados de Actinobacillus pleuropneumoniae, pertenecientes al mismo serotipo. Esto es debido a la variación natural bien conocida en la técnica que existe en todos los organismos. Es posible que algunos aminoácidos de la toxina ApxIV codificada por el gen apxIV se sustituyan por otros de la toxina ApxIV de otro serotipo, sin que el polipéptido se altere en su función. Por ejemplo, un polipéptido que contenga Asp en un cierto sitio, y su variante que contenga Asn en el sitio comparable siguen teniendo las mismas propiedades. Este proceso en el cual un aminoácido se sustituye por un aminoácido funcionalmente análogo se llama desplazamiento funcional. En este caso las proteínas que varían se llaman variantes funcionales. Otra causa de variación es el fenómeno de degeneración del código genético. En resumen, significa, que por ejemplo el aminoácido ácido glutámico es codificado tanto por GAT como por GAA. Este fenómeno se mantiene en todos los aminoácidos, excepto en Met y Trp. Por tanto, es obvio, que por ejemplo, la toxina ApxIV del serotipo 1, como se da en la presente invención puede no solo codificarse por la secuencia de nucleótidos dada en SEC. ID. Nº 1, sino también por una gran variedad de otras secuencias, que siguen dando todas ellas los mismos o funcionalmente los mismos polipéptidos.

Por lo tanto, una variante de la secuencia apxIV que codifica un polipéptido que es funcionalmente comparable a la toxina ApxIV, se encuentra comprendida en el ámbito de la presente invención.

5 Las bacterias vivas atenuadas se pueden obtener de varias maneras. Una forma posible de obtención de tales bacterias es por medio de procedimientos clásicos tales como el tratamiento de bacterias del tipo silvestre de Actinobacillus pleuropneumoniae con agentes mutagénicos tales como análogos de bases, tratamiento con luz ultravioleta o tratamiento por temperatura. Las cepas que no producen una toxina ApxIV funcional no inducen anticuerpos anti-toxina ApxIV o los inducen en menor cantidad, y por tanto se pueden seleccionar fácilmente en

10 ensayos animales.

El antisuero necesario se puede obtener como se describe a continuación en el Ejemplo 3.

Otra posibilidad es introducir deliberadamente, utilizando tecnología de ADN recombinante, una mutación bien definida en el gen que codifica la toxina ApxIV. Tal mutación puede ser una inserción, una deleción, una sustitución de un nucleótido por otro o una combinación de las mismas, con la única previsión de que el gen mutado no

15 codificará ya una toxina ApxIV funcional.

Se puede apreciar fácilmente, que especialmente las mutaciones que introducen un codón de terminación en la fase de lectura abierta, o las mutaciones que producen un desplazamiento en la fase de lectura abierta son muy adecuadas para obtener una cepa que no codifique ya una toxina ApxIV funcional. Tales mutaciones pueden, por ejemplo, fabricarse por medio de mutagénesis dirigida al sitio in vitro utilizando el kit Transformer® que comercializa

20 Clontech. Se pueden aplicar, igualmente, muchas otras técnicas de referencia de ADN recombinante tales como digestión del gen con una enzima de restricción seguida de un tratamiento con endonucleasa y volviendo a unir.

Por tanto, en una forma preferida, esta realización se refiere a bacterias vivas atenuadas en las que el gen que codifica la toxina ApxIV comprende una mutación.

Las mutaciones bien definidas que implican la deleción de fragmentos del gen apxIV o incluso del gen entero, o la

25 inserción de fragmentos de ADN heterólogos, cuando se comparan con las mutaciones inducidas clásicamente, tienen la ventaja de que no revierten a la situación silvestre.

Así, en una forma más preferida, esta realización se refiere a bacterias vivas atenuadas en las que el gen que codifica la toxina ApxIV comprende una inserción y/o una deleción.

Dada la gran cantidad de vacunas que se ponen hoy en día a los cerdos, está claro que sería deseable la

30 administración combinada de varias vacunas, aunque solo sea por razonas de reducción de costes de vacunación. Por tanto es muy atractivo utilizar cepas vacunales atenuadas como vehículos recombinantes para genes heterólogos, que codifiquen antígenos seleccionados de otros microorganismos o virus patógenos. La administración de tal vehículo recombinante tiene la ventaja de que tras la administración de tal vehículo, se induce la inmunidad contra dos o más enfermedades al mismo tiempo. Las bacterias vivas atenuadas proporcionan un vehículo muy

35 adecuado para genes heterólogos, puesto que el gen que codifica la toxina ApxIV se puede utilizar como un sitio de inserción para tales genes heterólogos. El uso del gen apxIV como un sitio de inserción tiene la ventaja de que al mismo tiempo se inactiva el gen apxIV, y el nuevo gen heterólogo que se introduce puede expresarse conforme a los genes homólogos de Actinobacillus pleuropneumoniae. La construcción de tales vehículos recombinantes se puede hacer de manera rutinaria, utilizando las técnicas de referencia de biología molecular tales como la recombinación

40 homóloga. Por lo tanto, en una realización aún más preferida, la bacteria viva atenuada de la especie Actinobacillus pleuropneumoniae que no produce toxina ApxIV funcional, tiene un gen heterólogo insertado en el gen apxIV. Tal gen heterólogo puede, como se ha mencionado anteriormente, por ejemplo, ser un gen que codifica un antígeno seleccionado de otros microorganismos o virus patógenos. Otra posibilidad es insertar un gen que codifique una proteína implicada en la activación del sistema inmunitario, tales como una interleucina o un interferón.

45 En una forma aún incluso más preferida, el gen heterólogo codifica uno o más antígenos seleccionados de entre el grupo que consiste en virus del Síndrome Respiratorio Reproductivo Porcino (SRRP), virus de la Pseudorrabia, virus de la Influenza porcina, Parvovirus porcino, virus de la Gastroenteritis Transmisible, rotavirus, Escherichia coli, Erysipelothrix rhusiopathiae, Pasteurella multocida, Bordetella bronchiseptica, Haemophilus parasuis y Streptococcus suis.

50 Sin embargo hay un serio inconveniente en la expresión de genes heterólogos en vehículos recombinantes: se sabe que varias proteínas son tóxicas si se expresan en bacterias heterólogas. Por tanto, los genes que codifican tales proteínas nunca se introducen en los vehículos heterólogos, ya que los recombinantes satisfactorios eventualmente morirán como resultado de la expresión de cierta cantidad del gen heterólogo. La proteína P2 de Haemophilus influenzae, por nombrar un ejemplo, puede simplemente no expresarse en E. coli (Munson y col., Infect. & Immun.

55 57: 88-94 (1989)). Sorprendentemente se descubrió que aunque el gen apxIV se expresa eficazmente in vivo (véase el Ejemplo 5), no se expresa in vitro (véase el Ejemplo 4). Esto se concluyó por el fracaso al demostrar la presencia de toxina ApxIV en los cultivos en crecimiento in vitro de Actinobacillus pleuropneumoniae. Esto significa que la

expresión de ApxIV se activa o se desactiva, dependiendo del entorno en el que crece Actinobacillus pleuropneumoniae. Esta característica ofrece una ventaja inesperada sobre los vehículos vivos recombinantes conocidos: si la expresión del gen heterólogo se lleva a cabo bajo el control del promotor apxIV, el vehículo Actinobacillus pleuropneumoniae vivo atenuado de acuerdo con la invención puede cultivarse in vitro en altas cantidades, independientemente del gen heterólogo insertado, ya que el gen ajeno no se expresa bajo estas condiciones. Después de administrar una cantidad de bacterias al huésped, comenzará la expresión del gen heterólogo y durante el tiempo de replicación o tras la muerte de la bacteria estará disponible para el sistema inmunitario del huésped. El gen heterólogo que se va a expresar puede estar ligado funcionalmente al promotor apxIV por ejemplo sustituyendo la secuencia codificante del gen apxIV por la secuencia codificante del gen heterólogo. No es necesario sustituir todo el gen apxIV: es suficiente con sustituir el codón ATG del gen bajo influencia del promotor apxIV del gen heterólogo incluyendo su codón de terminación. También es posible expresar un gen heterólogo bajo la influencia del promotor apxIV haciendo una construcción de fusión. Esta puede hacerse insertando el gen heterólogo en fase con la fase de lectura apxIV corriente abajo del codón ATG apxIV.

La expresión “ligado funcionalmente al promotor apxIV” significa que la transcripción del gen heterólogo comienza en el promotor apxIV.

Ni que decir tiene que cada lugar en el que está insertado el gen heterólogo que está ligado funcionalmente al promotor apxIV se encuentra dentro del ámbito de la invención

Por lo tanto, la forma más preferida de esta realización se refiere a bacterias vivas atenuadas, que tienen un gen heterólogo que está ligado funcionalmente a la región promotora del gen apxIV.

El hallazgo sorprendente de que el promotor apxIV nativo es un promotor cambiable que se desactiva in vitro y se activa in vivo hace que sea una herramienta de expresión muy versátil en su huésped natural y como promotor heterólogo en otras bacterias. Cuando se utiliza como promotor heterólogo en otras bacterias, el ADN que comprende el promotor se puede aislar de su huésped y transferirse a una bacteria distinta de Actinobacillus pleuropneumoniae. Otra opción que ahora es factible, es la clonación de varias copias del promotor apxIV cada una de las cuales controla la expresión de otro gen. Esto puede hacerse en la bacteria huésped Actinobacillus pleuropneumoniae, pero este principio de múltiples copias es igualmente aplicable a otras bacterias. Como se ha mencionado anteriormente, el promotor se puede utilizar para la expresión selectiva in vivo de uno o más genes heterólogos que codifican antígenos seleccionados de otros microorganismos o virus patógenos. El promotor también puede utilizarse para la expresión de una secuencia de ADN heteróloga que codifique una citoquina tal como una interleucina, un Factor de Necrosis Tumoral o un interferón. Varias citoquinas, por ejemplo los interferones se sabe que tienen un papel importante como moduladores inmunitarios. Por tanto puede ser ventajoso expresar tal información genética bajo el control del promotor apxIV.

Por tanto, otra realización se refiere a una secuencia de nucleótidos que alberga el promotor que controla la expresión del gen apxIV.

Se ha descubierto ahora que el promotor cambiable que en la situación nativa controla la expresión del gen apxIV, está localizado en el fragmento de ADN entre la posición 451 y 1132 de la SEC. ID. Nº 5. Está claro, que las partes de este fragmento de ADN que no son elementos promotores esenciales, no necesitan necesariamente estar presentes en el fragmento. Por lo tanto, los fragmentos cortos de este fragmento de ADN en los que se retiene la actividad promotora, son igualmente adecuados para la expresión de genes heterólogos. Por lo tanto, una forma más preferida de esta realización se refiere a una secuencia de nucleótidos que comprende el fragmento de ADN de la posición 451 a 1132 de la SEC. ID. Nº 5 o un subfragmento del mismo que aún retenga la actividad promotora.

Todos los promotores bacterianos comparten dos regiones consenso, las denominadas región -10, y región -35. Aunque la secuencia que flanquea estas regiones consenso puede hasta cierto punto influenciar en la eficacia del promotor, puede ser ventajoso utilizar solamente la parte de la región promotora que comprende el fragmento de ADN entre la región -35 y el codón ATG. Este fragmento de ADN está localizado entre la posición 617 y la posición 641 de la SEC. ID. Nº 5. Por lo tanto, en una forma más preferida de esta realización la invención se refiere a una secuencia de nucleótidos que comprende el fragmento de ADN desde la posición 617 a la 641 de la SEC. ID. Nº 5.

La presente invención se refiere a la toxina ApxIV como un componente de una vacuna sub-unitaria.

Las subunidades vacunales comprenderán lo más probablemente las tres toxinas Apx conocidas. Esto se mencionó anteriormente. Como se descubrió inesperadamente sin embargo, que la toxina ApxIV está presente en todos los serotipos de A. pleuropneumoniae como se mencionó anteriormente, es deseable que sea un componente adicional de las subunidades vacunales: los anticuerpos neutralizadores que aparecen contra la toxina ApxIV proporciona protección contra la toxina ApxIV producida por todas y cada una de las cepas de Actinobacillus pleuropneumoniae, independientemente del serotipo. Por lo tanto, otra realización de la invención se refiere a subunidades vacunales para la protección de animales contra la infección con una bacteria de la especie Actinobacillus pleuropneumoniae, que comprende toxina purificada ApxIV. La toxina ApxIV se puede administrar sola, o en combinación con cualquiera de o todas las toxinas ApxI, -II, y -III mencionadas anteriormente y/o por ejemplo, en combinación con Proteínas de la Membrana Externa (PME) de Actinobacillus pleuropneumoniae. Tales vacunas se pueden preparar fácilmente mezclando toxina ApxIV en una cantidad suficiente para inducir una respuesta inmune, y un vehículo farmacéuticamente aceptable. La producción de toxina ApxIV es posible introduciendo el gen ApxIV en un vector de expresión adecuado, expresión del gen y aislamiento de la toxina. Se conocen muchos sistemas versátiles de expresión, tales como sistemas de expresión bacteriana, sistemas de expresión basados en baculovirus y sistemas

5 de expresión en células de mamíferos. En el Ejemplo 3 se describe como obtener la toxina ApxIV por expresión del gen en E. coli.

Otra realización más de la invención se refiere a vacunas vivas atenuadas que comprenden bacterias vivas atenuadas como se describió anteriormente para la protección de animales contra la infección por una bacteria de la especie Actinobacillus pleuropneumoniae. Tales vacunas se pueden obtener mezclando bacterias vivas atenuadas 10 con un vehículo farmacéuticamente aceptable. Estas vacunas comprenden al menos una cantidad inmunogénicamente eficaz de la bacteria viva atenuada que se produce de acuerdo con la invención. Inmunogénicamente eficaz significa que la cantidad de bacteria viva atenuada que se administra en el momento de la vacunación es suficiente para inducir en el huésped una respuesta inmune eficaz para las formas virulentas de bacteria que producen toxina RTX. La dosificación útil a administrarse variará dependiendo de la edad, el peso y el

15 animal vacunado, el modo de administración y el tipo de patógenos contra el que se desea vacunar. La vacuna puede comprender cualquier dosis de bacterias, suficiente para evocar una respuesta inmune. Dosis muy adecuadas son por ejemplo, las dosis que oscilan entre 103 y 1010 bacterias.

El vehículo farmacéuticamente aceptable puede ser tan simple como el agua, pero también puede comprender, por ejemplo, fluido del cultivo en el que se cultivaron las bacterias. Otro vehículo aceptable es por ejemplo una solución

20 con una concentración salina fisiológica. Otros ejemplos de vehículos farmacéuticamente aceptables o diluyentes útiles en la presente invención incluyen estabilizadores tales como SPGA, carbohidratos (por ejemplo sorbitol, manitol, almidón, sacarosa, glucosa, dextrano), proteínas tales como albúmina o caseína, agentes que contienen proteína tales como suero bovino o leche desnatada y tampones (por ejemplo, tampón fosfato).

Opcionalmente, se pueden añadir a la vacuna uno o más compuestos que tienen actividad adyuvante. Los

25 adyuvantes son estimulantes no específicos del sistema inmunitario. Aumentan la respuesta inmune del huésped contra el patógeno invasor. Ejemplos de adyuvantes conocidos en la técnica son los adyuvantes Completo e Incompleto de Freund, la vitamina E, polímeros no iónicos en bloque, muramildipéptidos, ISCOM (complejos inmunoestimulantes, cf. por ejemplo, en la Patente Europea EP 109942), saponinas, aceite mineral, aceite vegetal, y Carbopol (un homopolímero). Adyuvantes especialmente adecuados para aplicación mucosa son, por ejemplo,

30 toxina termolábil de E. coli (TL) o toxina del Cólera (TC).

Otros adyuvantes adecuados son por ejemplo, hidróxido de aluminio, fosfato u óxido, emulsiones oleosas (por ejemplo de Bayol F®, o Marcol 52®, saponinas o solubilizado de vitamina E.

Por lo tanto, en una forma preferida, las vacunas de acuerdo con la presente invención comprenden un adyuvante.

Para la administración a los animales, la vacuna de acuerdo con la presente invención se puede dar entre otras, por 35 vía intranasal, intradérmica, subcutánea, por aerosol o por vía intramuscular.

Hay varias formas de almacenar tanto las subunidades como los organismos vivos. El almacenamiento en un refrigerador, por ejemplo, es un procedimiento bien conocido. También se utilizan a menudo almacenamientos a -70 ºC en un tampón que contenga glicerol. Las bacterias se pueden guardar también en nitrógeno líquido. La liofilización es otra forma de conservación. Las bacterias liofilizadas se pueden almacenar y mantener viables

40 durante muchos años. Las temperaturas de almacenamiento para las bacterias liofilizadas pueden estar bien por encima de los cero grados, sin que haya un perjuicio de su viabilidad. La liofilización es igualmente aplicable para las subunidades.

La liofilización se puede hacer según todos los procedimientos de liofilización de referencia bien conocidos. Se pueden añadir aditivos beneficiosos opcionales en el proceso de liofilización, tales como por ejemplo, la leche

45 desnatada, trehalosa, gelatina, o albúmina de suero bovino.

Por lo tanto, en una realización más preferida, la vacuna de acuerdo con la presente invención está en forma liofilizada.

En una forma más preferida de esta realización. La vacuna comprende adicionalmente uno o más antígenos seleccionados de entre otros microorganismos o virus patógenos.

50 Tal vacuna se puede obtener añadiendo uno o más antígenos seleccionados de entre otras bacterias o virus patógenos a la bacteria viva atenuada de acuerdo con la invención y un vehículo farmacéuticamente aceptable como se describió anteriormente.

Por supuesto, es posible añadir no solamente uno o más antígenos, sino también uno o más de los patógenos enteros tal cual, en forma viva o inactivada.

Se puede obtener alternativamente clonando la información genética que codifica uno o más antígenos seleccionados de otros microorganismos o virus patógenos en la bacteria viva atenuada, utilizando la tecnología de ADN recombinante conocida como se describió anteriormente.

Tales vacunas son por supuesto menos estresantes para el animal que se va a vacunar que las vacunaciones separadas con cada uno de los patógenos, tanto desde el punto de vista médico como físico.

En una forma más preferida, estos antígenos se seleccionan de entre el grupo que consiste en virus del Síndrome Respiratorio Reproductor Porcino (SRRP), virus de la Pseudorrabia, virus de la Influenza Porcina, Parvovirus Porcino, virus de la Gastroenteritis Transmisible, rotavirus, Escherichia coli, Erysipelothrix rhussiopathiae, Pasteurella multocida, Bordetella bronchiseptica, Haemophilus parasuis y Streptococcus suis.

La invención también describe procedimientos para la preparación de una bacteria viva atenuada de la especie Actinobacillus pleuropneumoniae que no es capaz de producir una toxina ApxIV funcional. Este procedimiento comprende la introducción de una mutación en el gen que codifica la proteína ApxIV. Son aplicables tanto las técnicas clásicas de mutación, que utilizan agentes mutagénicos, como las técnicas de ADN recombinante bien conocidas en la técnica para la inserción, sustitución o deleción de información genética en el gen apxIV.

En una forma preferida, los procedimientos mencionados anteriormente se utilizan para la introducción de una deleción.

También están descritos por la invención los procedimientos para la preparación de una vacuna viva atenuada, que comprende la mezcla de bacterias de acuerdo con la invención con un vehículo farmacéuticamente aceptable.

También se encuentran en el ámbito de la invención procedimientos para la preparación de una vacuna sub-unitaria. Tales procedimientos comprenden la mezcla de toxina ApxIV purificada y un vehículo farmacéuticamente aceptable.

Otro problema conocido generalmente en el campo de la vacunación con vacunas vivas es el siguiente: La presencia de anticuerpos contra ciertos patógenos en el suero de un animal huésped indica que el huésped ha sido infectado con el patógeno, sea en una forma virulenta o atenuada. Sin embargo es imposible discriminar entre los animales infectados por una cepa de campo y los animales vacunados con una cepa vacunal viva. El Actinobacillus pleuropneumoniae vivo atenuado de acuerdo con la presente invención ofrece una solución a este problema como se muestra a continuación:

Como se describe en el Ejemplo 3, el gen apxIV de Actinobacillus pleuropneumoniae serotipo 1 se ha aislado y expresado en una célula huésped heteróloga. Este producto de expresión se sometió a electroforesis en gel PAGE y luego se utilizó para transferencia de Western. Las transferencias se incubaron con el suero en fase de convalecencia obtenido de cerdos infectados con Actinobacillus pleuropneumoniae deliberadamente, y suero de cepas de campo. Se descubrió que el gen apxIV se expresa in vivo en todas las cepas de campo de Actinobacillus pleuropneumoniae ensayadas. Esto implica, que los cerdos infectados por Actinobacillus pleuropneumoniae siempre tendrán anticuerpos contra la cepa por la que fueron infectados, independientemente del serotipo de la cepa infecciosa.

Las bacterias vivas atenuadas de acuerdo con la presente invención pueden, debido a la deleción del gen apxIV, no producir más toxina ApxIV. Por lo tanto los animales vacunados con una cepa viva atenuada de Actinobacillus pleuropneumoniae de acuerdo con la invención no tendrán anticuerpos contra la toxina ApxIV en su suero.

En un ensayo comparativo, por ejemplo un ensayo ELISA, tales sueros por tanto reaccionarán con todas las proteínas inmunogénicas de Actinobacillus pleuropneumoniae tales como por ejemplo ApxI, -II, y -III, pero no con ApxIV. Los sueros de cerdos infectados con una cepa de campo de Actinobacillus pleuropneumoniae sin embargo reaccionarán con todas las proteínas inmunogénicas de Actinobacillus pleuropneumoniae, incluyendo la ApxIV. Por lo tanto, el Actinobacillus pleuropneumoniae vivo atenuado de acuerdo con la presente invención resulta ser una vacuna marcadora muy adecuada, es decir, una cepa vacunal que puede discriminarse de la cepa de campo.

Un ensayo diagnóstico para la discriminación entre cepas vacunales y cepas de campo puede ser un simple ensayo ELISA en el que la toxina ApxIV purificada recubre la pared de los pocillos de una placa de ELISA. La incubación con suero de los cerdos que se van a ensayar, seguido por, por ejemplo, incubación con un anticuerpo anti-cerdo marcado puede entonces revelar la presencia o ausencia de anticuerpos contra la toxina ApxIV.

Otro ejemplo de un sistema de ensayo diagnóstico es por ejemplo, la incubación de una transferencia de Western que comprende toxina ApxIV purificada con suero de cerdos a ser ensayados, seguido por la detección de los anticuerpos específicos anti-ApxIV.

Por tanto, el ensayo diagnóstico para la discriminación entre sueros de cerdos infectados con cepas de campo de Actinobacillus pleuropneumoniae y de cerdos vacunados con una vacuna que comprende una vacuna viva atenuada de cepas de Actinobacillus pleuropneumoniae de acuerdo con la invención, que comprende la toxina ApxIV purificada, también se encuentra dentro del ámbito de la invención.

Otro problema más que se ha visto en sanidad porcina es el siguiente: Es difícil determinar de manera rápida y no ambigua si un cerdo está infectado por Actinobacillus pleuropneumoniae o por A. suis, o posiblemente por una combinación de ambos. Los ensayos diagnósticos para la detección de A. suis no están disponibles actualmente. Esto es principalmente debido al hecho de que Actinobacillus pleuropneumoniae y A. suis comparten demasiados antígenos. Como ejemplo puede servir, que dos toxinas Apx altamente antigénicas: la ApxI y ApxII tienen homologos altamente conservados en por ejemplo A. suis (Van Ostaayen y col., enviado para publicación).

Los genes RTX conocidos, que codifican toxinas ApxI, -II, y -III o sus homólogos se encuentran en prácticamente todos los miembros del género Actinobacillus, tales como A. pleuropneumoniae, A. suis, A. rossi y A. equuli. Por tanto, se asumió inicialmente por los inventores, que la nueva toxina RTX ApxIV también sería común a todos los miembros del género Actinobacillus.

Si embargo se descubrió después de ensayar un Actinobacillus patógeno porcino, de nuevo sorprendentemente al contrario que los tres genes RTX conocidos, que este nuevo gen RTX apxIV solamente está presente en el patógeno porcino Actinobacillus pleuropneumoniae. Está ausente en todas las otras especies patógenas porcinas de Actinobacillus, y por tanto también está ausente en Actinobacillus suis. Véanse los Ejemplos 6 y 7.

Por lo tanto, se apreció sorprendentemente que la presencia de anticuerpos contra ApxIV en el suero de un cerdo es una prueba rápida y no ambigua de que el cerdo ha sido infectado con A. pleuropneumoniae y no con A. suis o cualquier otra especie patógena porcina de Actinobacillus.

0087 Por tanto la presente invención también proporciona un ensayo diagnóstico basado en la presencia o ausencia de anticuerpos contra ApxIV, y por tanto un ensayo discriminatorio para distinguir específicamente una infección por

A. pleuropneumoniae de una infección por A. suis. Tal ensayo puede ser por ejemplo, un ensayo ELISA que comprende en pocillos separados las toxinas ApxI y -II, presentes tanto en A. pleuropneumoniae como en A. suis y la toxina ApxIV purificada. El suero de animales infectados con A. suis reaccionará solamente con los pocillos que comprendan la ApxI y -II, mientras que los animales infectados por A. pleuropneumoniae también reaccionarán con el pocillo que comprende la toxina ApxIV purificada.

Ejemplo 1:

Clonación y análisis del gen apxIV del serotipo 1 de A. pleuropneumoniae

Se llevaron a cabo los procedimientos biológicos moleculares de referencia (aislamiento de plásmido ADN, digestión por restricción, electroforesis en gel de agarosa, transferencia de Southern, unión, transformación, electroporación), a menos de que se establezca otra cosa, esencialmente como se describe en Sambrook y col. (Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, N.Y., 1989) o Ausubel y col., (Current Protocols in Molecular Biology. John Wiley & Sons, N.Y., 1987). La PCR se llevó a cabo esencialmente como se describe en Innis y col., (PCR protocols, A guide to Methods and Applications, Academic Press Inc., San Diego, 1990). El aislamiento de ADN cromosómico se llevó a cabo de acuerdo con Pitcher y col., (Lett. Appl. Microbiol., 8;151-156, 1989). El origen de todas las cepas de A. pleuropneumoniae de referencia serotipo 1: cepa 4074; serotipo 2: cepa S1536: serotipo 3: S1421; serotipo 4 M62; serotipo 5a: K17; serotipo 5b: L20; serotipo 6: femø; serotipo 7: WF83; serotipo 8: 405; serotipo 9: CVI13261; serotipo 10: 13039; serotipo 11: 56153 and serotipo 12: 8329) se describen en Frey y Nicolet, (J. Clin. Microbiol., 28;232-236, 1990). La cepa HV114 del serotipo 3 es un aislado de campo (es decir una de las cepas del serotipo 3 ensayados en Beck y col., J. Clin. Microbiol., 32;2749-2754, 1994). Otras cepas de Actinobacillus que se utilizaron fueron; A.rossii: ATCC 27072; A. equuli: ATCC 19392; A. suis: ATCC 15558. Se utilizó también la cepa de Pasteurella haemolytica tipo 1 cepa ATCC 14003.

Las cepas huésped E. coli que se utilizaron: XL1-blue (Stratagene, La Yolla, Ca; genotipo: recA1 endA1 gyrA96 thi-1 hsdR17supE44 relA1 lac [F’ proAB laclqZDM15 Tn10 (Tetr)]) y HMS174(DE3) (AMS Biotechnology Ltd, Suiza; genotipo: F-recA (rK12-mK12+) rifr IDE3).

Basándose en los datos de la secuencia preliminar obtenida de la tesis de T.J. Anderson (University of Guelph, 1995), se sintetizaron dos cebadores designados APXIVA-1L (5’-TGGCACTGACGGTGATGA-3’) y APXIVA-1R (5’-GGCCATCGACTCAACCAT-3’). Estos cebadores se utilizaron en una amplificación PCR, con ADN cromosómico del serotipo 3 de A. pleuropneumoniae cepa HV114 y el serotipo 1 de referencia cepa 4074 como matriz. Con ambas cepas se amplificó un fragmento de 442 pb. El fragmento derivado del ADN cromosómico del serotipo 3 se marcó con Digoxigenina-11-dUTP (Boehringer Mannheim) de acuerdo con el protocolo del fabricante (este fragmento se designó sonda APXIVA, véase fig. 4). La sonda marcada se utilizó posteriormente para hibridar una transferencia Southern que contenía ADN cromosómico digerido por ClaI de la cepa 4074. La sonda se hibridó con un fragmento de aproximadamente 8,0 kb. El gen apxIV de la cepa 4074 serotipo 1 se aisló uniéndolo con el ADN cromosómico digerido por ClaI en el pBluescript II SK-con el digerido por ClaI (Stratagene EE.UU.). La cepa de E. coli XL-1-blue se transformó con el ADN unido y se seleccionaron los transformantes en una placa LB con 100 mg/ml de ampicilina. Los clones que albergaban el apxIV se seleccionaron por hibridación de la colonia con una réplica de nitrocelulosa de la placa con la sonda APXIVA. Así, se aisló un plásmido designado pROK7 y se demostró que albergaba un ClaI insertado de aproximadamente 8 kb. Las primeras 6736 pb de la inserción ClaI se secuenció (SEC. ID. 1) y se identificó una fase de lectura abierta de 4971 nucleótidos que codificaba una proteína de 1657 de

restos aminoacídicos (SEC. ID 2) con un tamaño predicho de aproximadamente 186 kD. El gen se denominó apxIV_var1 (véase fig.3).

Ejemplo 2:

Clonación y análisis del gen apxIV del serotipo 3 de A. pleuropneumoniae

La sonda marcada APXIVA (mencionada en el Ejemplo 1) se utilizó para hibridar una transferencia de Southern que contenía el ADN cromosómico digerido por ClaI de la cepa HV114. La sonda se hibridó con un fragmento de aproximadamente 7,0 kb. El ADN cromosómico aislado de HV114 se digirió con ClaI, y se unió con el pBluescript II SK-(Stratagene EE.UU.) digerido con ClaI. La cepa de E. coli XL-1-blue se transformó con el ADN unido y los transformantes se seleccionaron en una placa LB con 100 mg/ml de ampicilina. Los clones que albergaban el apxIV se seleccionaron por hibridación de la colonia con una réplica de nitrocelulosa de la placa con la sonda APXIVA. Así, se aisló un plásmido denominado pROK5 y se demostró que albergaba un ClaI insertado de aproximadamente 7 kb. La inserción se analizó por análisis de la secuencia (SEC. ID. 3). Se identificó una fase de lectura abierta de 4146 pb que codificaba una proteína de 1382 restos aminoacídicos (SEC. ID. 4), con un tamaño predicho de aproximadamente 154 kD. El gen se designó apxIV_var3 (véase la fig. 3).

Ejemplo 3

Expresión de las proteínas de fusión ApxIV-polihistidina en E. coli

A partir del plásmido pROK5, se fabricó un clon de deleción que contenía el extremo 3’ del gen apxIV, empezando en el sitio BamHI (nucleótido Nº 2747 de la SEC. ID. Nº 3) hasta el sitio ClaI al final de la inserción corriente abajo del gen apxIV. Este plásmido se designó pROK1. Utilizando los oligonucleótidos APXIVAHIS1-L (5’-AGCCATATGGGCGATTTAAATTTCAG-3’) y APXIVAHIS1-R (5’-TATGGATCCTCCGTGCTTCTGAGC-3’) y el ADN del plásmido pROK1 como matriz, se amplificó un fragmento de ADN de 2,1 kb (véase fig. 4) que contenía la región desde la 3520 a 5643 pb en apxIV_var3 (SEC. ID. 3) flanqueado por los sitios de restricción NdeIy BamHI en los extremos 5’ y 3’, respectivamente. Después de la clonación del fragmento PCR digerido NdeI/BamHI en el vector de expresión pETHIS-1, digerido con las mismas enzimas, se obtuvo un plásmido designado pJFFapxIV6/10his-1. El plásmido pETHIS-1 es un derivado del pET14b (Novagen Inc., Madison, Wi.) en el que se ha extendido el sitio de clonación múltiple y se ha insertado una región que codifica un decámero de histidina. En consecuencia, el plásmido pJFFapxIV6/10his-1 contiene una fusión traduccional que codifica un hexámero de histidina, seguido por los restos 653 a 1360 de la SEC. ID. 4, seguido por un decámero histidina, bajo el control de un promotor T7. El plásmido se transfirió a la cepa HMS174(DE3) de E. coli con el pLysS, el cual contiene un gen T7 ARN polimerasa inducible por IPTG, así como el gen T7 de la lisozima para aumentar la estabilidad. La cepa se cultivó en medio LB que contenía 25 mg/ml de cloranfenicol y 100 mg/ml de ampicilina, hasta una DO650 de 0,5, se indujo con isopropil-b-Dtiogalactopiranósido a una concentración de 10 mM. Después de la adición de IPTG, las células se incubaron a 37 ºC durante 2,5 horas, las células se recolectaron por centrifugación, y se aisló la proteína esperada de 80 kD en forma de cuerpos de inclusión. Los cuerpos de inclusión se solubilizaron en una solución de hidrocloruro de guanidina, ClNa 300 mM y NaH2PO4 a pH 8,0 y posteriormente se purificó la proteína de fusión de 80 kD por Cromatografía de Afinidad por Metales Inmovilizados (IMAC) (Schmitt y col., Molecular Biology Reports 18;223-230, 1993) utilizando columnas de Ni2+ quelado (Qiagen AG, Basel). La proteína pura se eluyó de la columna a pH 5,0. Las fracciones agrupadas se dializaron contra una solución de NaCl 300 mM y NaH2PO4 50 mM a pH 8,0. Se inmunizó un conejo con 500 mg del producto polihistidina de fusión, mezclado con 1 volumen de adyuvante completo de Freund (Difco Labs, Detroit, MI). Se aplicó una dosis de refuerzo de la misma cantidad, mezclada con adyuvante incompleto de Freund 3 semanas más tarde. Cuatro semanas después del refuerzo se sacó la sangre del conejo y se obtuvo un suero hiperinmune que comprendía anticuerpos anti-toxina ApxIV, que se denominó suero 522-409.

Ejemplo 4:

Expresión de los genes apxIV en crecimiento in vitro de A. pleuropneumoniae

La cepa de A. pleuropneumoniae de referencia del serotipo 1 se cultivó en caldo Columbia suplementado con 10 mg/ml de b-NAD y se recolectó como se había descrito (Beck y col., J. Clin. Microbiol., 32;2749-2754, 1994). Adyacente a los carriles que comprendían proteínas de fusión ApxIA, ApxIIA, y ApxIVA-polihistidina se separó el sobrenadante del cultivo concentrado por electroforesis de gel de poliacrilamida (Laemmli, Nature 227:680-685, 1970) y se sometió a un procedimiento de transferencia de Western (Towbin y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 76:4350-4354, 1979). La transferencia de Western reaccionó con los anticuerpos monoclonales anti-ApxIA y antiApxIIA como describe Beck y col., (J. Clin. Microbiol., 32;2749-2754, 1994), y con el suero anti-ApxIV 522-409 (véase el Ejemplo 3). La fracción de toxina RTX del serotipo 1 contenía claramente ApxIA y ApxIIA. La presencia de ApxIVA no se pudo demostrar (véase la fig. 5).

Ejemplo 5:

Expresión de los genes apxIV en A. pleuropneumoniae in vivo durante la infección

Un gel de poliacrilamida que contenía la proteína de fusión polihistidina-ApxIV_var3 de 80kD (véase el ejemplo 3) se transfirió a una membrana de nitrocelulosa. La membrana se dividió en tiras que se hicieron reaccionar con 5 (diluciones de 100 veces de) sueros de convalecientes de serotipo 1 de campo, o sueros de un cerdo infectado con la cepa de referencia del serotipo 1 (Frey y Nicolet, Vet. Microbiol., 28;61-73, 1991). La reacción se visualizó utilizando un conjugado marcado de fosfatasa alcalina contra la IgG de conejo (Kirkegaard Perry Inc., Gaithers-burg, Md.) y el desarrollo de color de NBT (cloruro de 4-Nitrotetrazolio azul) y BCIP (5-Bromo-4-chloro-3-indolil-fosfato) (véase la fig. 6). Los sueros del serotipo 1 de campo, así como el suero del cerdo infectado experimentalmente

10 reaccionaron con la proteína polihistidina-ApxIV_var3 de 80 kD. Esto indicaba que la proteína ApxIV que se expresaba en ese momento, es antigénica e induce anticuerpos anti toxina ApxIV durante la infección por A. pleuropneumoniae en cerdos.

Ejemplo 6:

Presencia de genes apxIV en todos los serotipos de A. pleuropneumoniae y ausencia de los mismos en cepas de 15 Actinobacillus no pleuropneumoniae utilizando transferencia de Southern

Para investigar la presencia del gen apxIV en los distintos serotipos de A. pleuropneumoniae y bacterias relacionadas, se hicieron tres sondas (véase la fig. 4). La sonda APXIVA se describe en el ejemplo 1. La sonda APXIVA2 contiene el fragmento de ADN de 2015 pb entre los sitios BamHI y NruI. Se construyó la sonda APPIVA1 de 758 pb por amplificación PCR con los oligonucleótidos APPIV1-L (5’-GGGACAGTGGCTCAATTAAG-3’) y 20 APPIV1-R (5’-AGCTGTAAACTCCACCAACG-3’). Todas las sondas se marcaron con Digoxigenina-11-dUTP (Boehringer Mannheim) de acuerdo con el protocolo del fabricante y se hibridaron con las transferencias de Southern del ADN cromosómico digerido con ClaI de todas las cepas de A. pleuropneumoniae de referencia y la cepa de campo HV114, Actinobacillus suis (ATCC 15558), Actinobacillus rossii (ATCC 27072) y Actinobacillus equuli (ATCC 19392). Las tres sondas reaccionaron similarmente (véase la fig. 7 para los resultados con la sonda

25 APXIVA2). Todas las cepas de A. pleuropneumoniae reaccionaron, mientras que no se observó hibridación con las cepas de A. suis, A. equuli y A. rossii.

Ejemplo 7:

Presencia de genes apxIV en A. pleuropneumoniae y cepas relacionadas utilizando amplificación PCR

Se llevó a cabo la amplificación PCR con 50 ng de ADN cromosómico de distintos serotipos de A.

30 pleuropneumoniae, otras especies de Actinobacillus y P. haemolytica como matrices, y los cebadores APXIVA-1 L (5’-TGGCACTGACGGTGATGA-3’) y APXIVA-1R (5’-GGCCATCGACTCAACCAT-3’). Después de los análisis de los productos en gel de agarosa, se observaron los productos con el tamaño esperado de 442 pb en todas las muestras de A. pleuropneumoniae, pero en ninguna de las otras especies de Actinobacillus (fig. 8). Esto indica que además de los resultados del ejemplo 6, la PCR también se podía utilizar para discriminar A. pleuropneumoniae de otras

35 especies de Actinobacillus.

Ejemplo 8:

Sobre-expresión de la proteína de fusión ApxIV-var1 polihistidina

Se amplificó un fragmento por PCR comenzando con el plásmido pROK-7 (véase el ejemplo 1) como matriz y los oligonucleótidos APX4/115-L (5’-CGCCATATGACAAAATTAACTATGCAAG) y APX4116-R (5’-CGCGAAT 40 TCAGCGACACAAGAGATAT) como cebadores de PCR. Se digirió entonces una cantidad suficiente de este fragmento con las enzimas de restricción NdeI y EcoRI y se clonó en el vector de expresión pETHIS-1, digerido con las mismas enzimas que las descritas en el Ejemplo 3. A partir del plásmido resultante, designado pJFFApxIVA1His1, se sobre-expresó en E. coli una proteína de fusión polihistidina de 206 kD (PM determinado por PAGE) de 1841 restos aminoacídicos como se describe en el Ejemplo 3. La proteína se codifica en la región

45 codificante que abarca desde el ácido nucleico nº 1132 al 6546 como se presenta en la SEC. ID Nº 5. La secuencia aminoacídica de la proteína se da en la SEC. ID. Nº 6. Se demostró en la transferencia de Western que este producto reacciona con suero específico anti-ApxIV 522-409 (el antisuero descrito en el ejemplo 3).

Ejemplo 9:

Protección de ratones contra el desafío con APP por vacunación con ApxIV

50 La proteína de fusión polihistidina-ApxIV de 206 kD que se describe en el Ejemplo 8 y una proteína de fusión polihistidina ApxIA de 108 kD comparable, ambas derivadas de material genómico de la cepa 4074 serotipo 1 de referencia, se sobre-expresaron como se describió en el ejemplo 3. El aglomerado celular de las células E. coli inducidas se resuspendió en tampón PBS (1 g. de aglomerado celular en 6 ml de tampón) y se sonicó en hielo durante dos veces de 45 segundos para la destrucción de las células. Después de la centrifugación durante 20

minutos a 22.000x g a 4 ºC, se descargó el sobrenadante y el aglomerado resultante se lavó con una solución de urea 3 M (pH 6,3). La urea se eliminó tras la centrifugación durante 20 minutos a 22.000x g. y se solubilizó el aglomerado resultante en HCl de guanidinio 6 M (pH 8,0). Las muestras de proteínas se normalizaron según su contenido de proteína específica tras la densitometría de los geles de PAGE. Las muestras se disolvieron en PBS y se formularon con un adyuvante oleoso.

Se inmunizaron por vía intaperitoneal tres grupos de 15 ratones cada uno, con el antígeno ApxIV (36,3 microgramos), el antígeno ApxIA (36,3 microgramos), o el adyuvante solo. Las vacunas se administraron con un volumen de 0,4 ml. Veinticuatro días después de la primera vacunación, cada grupo de ratones se dividió en dos grupos de 7 y 8 ratones a los que se les hizo un refuerzo con la mitad de dosis de antígeno. A los grupos de 7 ratones se les reforzó por vía intraperitoneal con un volumen de 0,2 ml y los grupos de 8 ratones se vacunaron por vía intramuscular en la pata trasera con 0,1 ml cada uno. Trece días después del refuerzo, los ratones se desafiaron por vía intraperitoneal con 1,5 108 ufc del serotipo 1 de una cepa virulenta.

Ejemplo 10:

Capacidad de formación de poros de ApxIV;

Se utilizaron células de E. coli recién inducidas que expresaban ApxIV como fuente de proteínas para ensayar la formación de poros en bicapas lipídicas artificiales como describen Maier y col., Infect. Immun., 64; 44154423(1996). Los procedimientos utilizados por los experimentos en bicapa lipídica negra se habían descrito anteriormente (Benz t col.; Biochim. Biophys. Acta 511: 305-319 (1978)). Se formaron membranas a partir de una solución de asolectina al 1% (lecitina de soja tipo IV-S de Sigma, St. Louis, MO) en n-decano. Se midieron los potenciales de membrana cero en ese momento con un electrómetro Keithley 610 C después de que se estableciera un gradiente de sal de 10 veces a través de las membranas (Benz y col.; Biochim. Biophys. Acta 551: 238-247 (1979)). La presencia de ApxIV dio como resultado en una alta frecuencia de formación de poros en presencia de colesterol al 0,5%, con una media de conductancia de único canal (G) de 4 ns.

Estos resultados indican que la ApxIV induce poros en las bicapas artificiales y por tanto es tóxica para células eucariotas y por tanto es un factor de virulencia de A. pleuropneumoniae.

Leyenda de las figuras:

Figura 1: Comparación de ApxIVAvar1 y ApxIVAvar3 (var permanece por el serotipo). Representación gráfica de las diferentes características encontradas en el extremo C. Los cuadros discontinuos representan las regiones de repetición directa en ApxIVA. Las barras verticales en negrita indican la posición de nonapéptidos ricos en glicina, y las firmas de la familia B de la ADN polimerasa se indican por triángulos negros. La secuencia aminoacídica YSDSANSKK representa la secuencia espaciadora en el gen ApxIVAvar3. El segmento de la secuencia de ApxIVAvar1 que se deleciona en ApxIVAvar3 también se indica en la figura.

Figura 2: Alineamiento de las secuencias aminoacídicas de repetición directa 1 (A), repetición directa 2 (B) y repetición directa 3 (C) de ApxIVvar3. Las copias de cada una de las repeticiones directas 1, 2 y 3 se marcan con letras para distinguirlas de la secuencia de comparación. Los restos de las variantes se muestran en negrita.

Figura 3: Mapas de restricción parcial de pBLac7 (Tesis de T.J. Anderson Universidad de Guelph, 1995), pROK7 y pROK5. Las diferentes fases de lectura abiertas (ORF) se indican con flechas. La flecha interrumpida de lacZ en pROK7 indica la secuencia parcial del gen. Los terminadores de la trascripción potenciales dependientes de rho se indican por (W), los sitios potenciales de comienzo de la transcripción se indican con un triángulo. Sitios de restricción: A=Asp700; B=BamHI; C= ClaI; E=EcoRV; Ec=EcoRI; H=hindIII; N= NruI; Nd= NdeI; Nh=Nhel; P= PstI; S= SpeI; Sm=SmaI.

Figura 4: Localización de los distintos oligonucleótidos y sondas en el mapa del gen apxIVAvar3.

Figura 5: Expresión de ApxIV in vitro en el serotipo 1 de la cepa 4074 de referencia cultivada. El panel A reaccionó con el anticuerpo monoclonal anti-ApxIA, en el panel B con el anticuerpo monoclonal anti-ApxIIA y en el panel C reaccionó con suero 522-409 anti-ApxIVA. calle El carril 1 contiene la proteína de fusión ApxIApolihistidina, el carril 2 contiene la proteína de fusión ApxIIA-polihistidina, el carril 3 contiene el sobrenadante concentrado del cultivo de la cepa 4074, el carril 4 contiene la proteína de fusión ApxIVA-polihistidina.

Figura 6: Inmunotransferencia que muestra las reactividades de sueros de cerdos que fueron infectados experimentalmente con la cepa de referencia de serotipo 1 (carril 1) o sueros de cerdo de las infecciones del serotipo 1 de campo (carril 2-4) con la proteína de fusión ApxIV-polihistidina. Como control positivo (+), se utilizó el suero 522-409, como control negativo (-), se utilizó el suero policlonal de conejo contra ApxI y ApxII (Frey y col., Infect. Immun.. 57;2050-2056, 1989) con una dilución de 1000 veces.

Figura 7: Transferencia de Southern del ADN genómico digerido por ClaI hibridado con la sonda APXIVA2. Carriles1-13: Cepas de referencia de A. pleuropneumoniae; 1: serotipo 1; 2: serotipo 2; 3: Serotipo 3; 4: serotipo 4 ; 5: serotipo 5a; 6: serotipo 5b; 7: serotipo 6; 8: serotipo 7; 9: serotipo 8; 10: serotipo 9; 11: serotipo 10; 12: serotipo 11; 13: serotipo 12; 14: cepa de campo HV114; 15: A. suis (ATCC 15558); 16: A. rossii (ATCC 27072); 17: A. equuli (ATCC 19392). El tamaño molecular de los marcadores se indica a la izquierda (en kilopares de bases).

5 Figura 8: amplificación por PCR de apxIV usando los cebadores APXIVA-1 L y APXIVA-1 R. Asignaciones de carriles: los carriles 1 a 13 contienen las cepas de referencia de A. pleuropneumoniae de los serotipos 1, 2, 3, 4, 5a, 5b, 6, 7, 8, 9, 10, 11 y 12 respectivamente; carril 14: cepa HV114; carril 15: A. suis ATCC 15558; carril

16: A. rossii ATCC 27072; carril 17: A. equuli ATCC 19392; carril 18: A. lignieresii ATCC 49236; carril 19: P.

haemolytica de tipo 1 ATCC 14003. A la izquierda se indican los marcadores de tamaño molecular (en pares de 10 kilobases).

LISTADO DE SECUENCIAS

(1)

INFORMACIÓN GENERAL: 15

(i) SOLICITANTE:

(A) NOMBRE: AKZO Nobel N.V.

(B)

CALLE: Velperweg 76 20 (C) CIUDAD: Arnhem

(E)

PAÍS: The Netherlands

(F)

CÓDIGO POSTAL (ZIP): 6824 BM

(ii)

TÍTULO DE LA INVENCIÓN: Actinobacillus pleuropneumoniae vivo atenuado 25

(iii) NÚMERO DE SECUENCIAS: 4

(iv) FORMA LEGIBLE POR ORDENADOR:

30 (A) TIPO MEDIO: Disco flexible

(B)

ORDENADOR: PC IBM compatible

(C)

SISTEMA OPERATIVO: PC-DOS/MS-DOS

(D)

SOFTWARE: PatentIn Release #1.0, Versión #1.30 (EPO)

35 (2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 1:

(i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: 1

(A)

LONGITUD: 6736 pares de base 40 (B) TIPO: ácido nucleico

(C)

CADENA: doble

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico) 45

(iii) HIPOTÉTICO: NO

(iv) ANTI-SENTIDO: NO

50 (vi) FUENTE ORIGINAL:

(A)

ORGANISMO: Actinobacillus pleuropneumoniae

(B)

CEPA: 4074 (cepa de referencia serotipo 1)

55 (vii) FUENTE INMEDIATA:

(B) CLON: pROK7

(ix) CARACTERÍSTICAS: 60

(A)

NOMBRE/CLAVE: CDS

(B)

LOCALIZACIÓN: 1576..6549

(D)

OTRA INFORMACIÓN:/codón de inicio= 1576

/función= "toxina RTX" 65 /producto= "ApxIV-var1" /gen= "apxIV_var1" /número= 1

(xi) DESCRIPCIÓN DE SECUENCIAS: SEC ID Nº: 1:

(2) INFORMACIÓN SOBRE LA SEC ID Nº: 2:

5 (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A)

LONGITUD: 1658 aminoácidos

(B)

TIPO: aminoácido

(D)

TOPOLOGÍA: lineal 10

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: proteína

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 2:

(2)

INFORMACIÓN SOBRE LA SEC ID Nº: 3: 5 (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A)

LONGITUD: 7004 pares de base

(B)

TIPO: ácido nucleico

(C)

CADENA: doble10 (D) TOPOLOGÍA: lineal

(ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)

(iii) HIPOTÉTICO: NO 15

(iv) ANTI-SENTIDO: NO

(vi) FUENTE ORIGINAL: 20 (A) ORGANISMO: Actinobacillus pleuropneumoniae

(B) CEPA: HV114 (cepa de campo de serotipo 3)

(vii) FUENTE INMEDIATA: 25 (B) CLON: pROK5

(ix) CARACTERÍSTICA:

(A)

NOMBRE/CLAVE: CDS

(B)

LOCALIZACIÓN: 1566..5714

5 (D) OTRA INFORMACIÓN:/codón de inicio= 1566 /función= "toxina-RTX" /producto= "ApxIV_var3" /gen= "apxIV_var3" /número= 1

(xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 3:

(2)

INFORMACIÓN SOBRE LA SEC ID Nº: 4:

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A)

LONGITUD: 1383 aminoácidos

(B)

TIPO: aminoácido

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: proteína

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 4:

(2)

INFORMACIÓN SOBRE LA SEC ID Nº: 5:

(i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A)

LONGITUD: 6736 pares de base (B)TIPO: ácido nucleico

(C)

CADENA: doble

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

(ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico) 5

(iii) HIPOTÉTICO: NO

(iv)

ANTI-SENTIDO: NO

(vi)

FUENTE ORIGINAL:

(A)

ORGANISMO: Actinobacillus pleuropneumoniae

(B)

CEPA: 4074 (cepa de referencia de serotipo 1)

15 (vii) FUENTE INMEDIATA:

(B) CLON: pROK7

(ix) CARACTERÍSTICA:

(A)

NOMBRE/CLAVE: CDS

(B)

LOCALIZACIÓN: 1132..6549

(C)

PROCEDIMIENTO DE IDENTIFICACIÓN: experimental

(D)

OTRA INFORMACIÓN:/codón de inicio= 1132

25 /función= "toxina RTX" /producto= "ApxIV" / /prueba= EXPERIMENTAL /gen= "ApxIV_v1"

(ix) CARACTERÍSTICA:

(A)

NOMBRE/CLAVE: CDS

(B)

LOCALIZACIÓN: 639..1178

(D)

OTRA INFORMACIÓN:/codón de inicio= 639

35 /función= "desconocida" /producto= "ORF1" /gen= "orf1"

(ix) CARACTERÍSTICA:

(A)

NOMBRE/CLAVE: CDS

(B)

LOCALIZACIÓN: 1..453

(D)

OTRA INFORMACIÓN:/parcial /producto= "Met-G"

45 /gen= "mrp" /nombre convecional= "mrp" /marcador= mrp

(ix) CARACTERÍSTICA:

(A)

NOMBRE/CLAVE: -señal 10

(B)

LOCALIZACIÓN: 617..623

(D)

OTRA INFORMACIÓN:/nombre convencional = "-10"

/marcador= -10_s 55

(ix) CARACTERÍSTICA:

(A)

NOMBRE/CLAVE: -señal 35

(B)

LOCALIZACIÓN: 594..599

(D)

OTRA INFORMACIÓN:/nombre convencional= "-35 s"

(D)

OTRA INFORMACIÓN: nombre= "-35_ s" /marcador= -35_s

(ix)

CARACTERÍSTICA: 65

(A)

NOMBRE/CLAVE: promotor

(B)

LOCALIZACIÓN: 454..1131

(D)

OTRA INFORMACIÓN:/función= "Promotor" /nombre convencional = "promotor ApxIV" /marcador= promotor

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 5:

(2)

INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 6:

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A)

LONGITUD: 151 aminoácidos

(B)

TIPO: aminoácido

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: proteína

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 6:

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 7:

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: 15

(A)

LONGITUD: 1806 aminoácidos

(B)

TIPO: aminoácido

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

20 (ii) TIPO DE MOLÉCULA: proteína

(xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 7:

Claims (9)

1. REIVINDICACIONES

   1. Una vacuna sub-unitaria para la protección de animales contra la infección por una bacteria de la especie Actinobacillus pleuropneumoniae, caracterizada porque dicha vacuna comprende toxina ApxIV purificada y un vehículo farmacéuticamente aceptable.

   5 2. La vacuna de acuerdo con la reivindicación 1, caracterizada porque comprende un adyuvante.

2. 3.

   La vacuna de acuerdo con la reivindicación 1 o 2, caracterizada porque la vacuna está en forma liofilizada.

3. 4.

   La vacuna de acuerdo con las reivindicaciones 1-3, caracterizada porque comprende adicionalmente uno o más antígenos de microorganismos o virus patógenos para el cerdo.

4. 5.

   La vacuna de acuerdo con la reivindicación 4, caracterizada porque comprende adicionalmente uno o más

   10 antígenos seleccionados de entre el grupo que consiste en virus del Síndrome Respiratorio Reproductor Porcino (SRRP), virus de la Pseudorrabia, virus de la Influenza Porcina, Parvovirus porcino, virus de la Gastroenteritis Transmisible, rotavirus, Escherichia coli, Erysipelothrix rhusiopathiae, Pasteurella multocida, Bordetella bronchiseptica, Haemophilus parasuis y Streptococcus suis.
5. 6. Un procedimiento de preparación de una vacuna de acuerdo con las reivindicaciones 1-5, comprendiendo dicho 15 procedimiento la mezcla de toxina ApxIV purificada con un vehículo farmacéuticamente aceptable.

6. 7.

   Un ensayo diagnóstico para distinguir la infección por Actinobacillus pleuropneumoniae en cerdos de la infección por A. suis en cerdos, caracterizado porque dicho ensayo comprende toxina ApxIV purificada.

7. 8.

   Un procedimiento de detección de la presencia o ausencia de todos los serotipos de Actinobacillus pleuropneumoniae en cerdos que comprende las etapas de:

   20 -proporcionar toxina ApxIV purificada, -proporcionar una muestra de un cerdo, en que la muestra es suero, -incubar la toxina ApxIV con la muestra, y -detectar la presencia o ausencia de anticuerpos contra la toxina ApxIV.
8. 9. Un ensayo diagnóstico para distinguir entre cerdos infectados con cepas de campo de Actinobacillus

   25 pleuropneumoniae y cerdos vacunados con una vacuna que tiene una bacteria viva atenuada de la especie Actinobacillus pleuropneumoniae, en el que la vacuna no produce toxina ApxIV funcional, comprendiendo el ensayo toxina ApxIV purificada revestida sobre los pocillos de una placa de ELISA.
9. 10. El ensayo de diagnóstico de la reivindicación 9 que comprende además un anticuerpo anti-cerdo marcado que puede revelar la presencia o ausencia de anticuerpos contra la toxina ApxIV.