JP2005532804A

JP2005532804A - ブラキスピラ・ヒオジセンテリアエワクチン

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Publication number: JP2005532804A
Application number: JP2004520623A
Authority: JP
Inventors: アドラー，ベン; カレン，ポール・アントニー; カウツ，スコツト・アダム・ジエイムズ; ブラツチ，デイーター・マーク; セーヘルス，ルード・フイリツプ・アントーン・マリア
Original assignee: アクゾ・ノベル・エヌ・ベー
Priority date: 2002-07-17
Filing date: 2003-07-11
Publication date: 2005-11-04
Also published as: WO2004007726A2; WO2004007726A3; AU2003250057B2; AU2003250057A1; CA2492716A1; US20090017048A1; EP1525312A2; US20060153875A1

Abstract

本発明は、６１ｋＤ及び２０ｋＤのＢｒａｃｈｙｓｐｉｒａｈｙｏｄｙｓｅｎｔｅｒｉａｅリポタンパク質をコードする核酸配列及びそのようなリポタンパク質の免疫原性フラグメントをコードするそのような核酸配列の部分、及びそのような核酸配列又はそのような部分を含むＤＮＡフラグメント、組換えＤＮＡ分子、生組換え担体及び宿主細胞に関する。本発明はまた、そのような配列によってコードされる６１ｋＤ及び２０ｋＤのＢｒａｃｈｙｓｐｉｒａｈｙｏｄｙｓｅｎｔｅｒｉａｅリポタンパク質及びその免疫原性部分に関する。さらに、本発明は、そのような核酸配列及びその部分、そのような核酸配列又はそのような部分を含むＤＮＡフラグメント、組換えＤＮＡ分子、生組換え担体及び宿主細胞、リポタンパク質又はその免疫原性部分及びそのようなリポタンパク質又はその免疫原性部分に対する抗体を含有するワクチンに関する。また、本発明は、ワクチン中での及びワクチンの製造のための、前記リポタンパク質の使用に関する。さらに、本発明は、診断又はワクチン接種のための前記核酸配列、リポタンパク質又は抗体の使用に関する。最後に本発明は、そのような核酸、リポタンパク質又はそのようなリポタンパク質に対する抗体を含む診断キットに関する。

Description

本発明は、Ｂｒａｃｈｙｓｐｉｒａｈｙｏｄｙｓｅｎｔｅｒｉａｅリポタンパク質をコードする核酸配列及びそのようなリポタンパク質の免疫原性フラグメントをコードするそのような核酸配列の部分、及びそのような核酸配列又はそのような核酸配列のそのような部分を含むＤＮＡフラグメント、組換えＤＮＡ分子、生組換え担体及び宿主細胞に関する。本発明はまた、そのような配列によってコードされるＢｒａｃｈｙｓｐｉｒａｈｙｏｄｙｓｅｎｔｅｒｉａｅリポタンパク質及びその免疫原性部分に関する。さらに、本発明は、そのような核酸配列及びその部分、そのような核酸配列又はそのような核酸配列のそのような部分を含むＤＮＡフラグメント、組換えＤＮＡ分子、生組換え担体及び宿主細胞、リポタンパク質又はその免疫原性部分、及びそのようなリポタンパク質又はその免疫原性部分に対する抗体を含有するワクチンに関する。また、本発明は、ワクチンにおける及びワクチンの製造のための前記リポタンパク質の使用に関する。さらに、本発明は、診断又はワクチン接種を目的とする前記核酸配列、リポタンパク質又は抗体の使用に関する。最後に本発明は、そのような核酸、リポタンパク質又はそのようなリポタンパク質に対する抗体を含む診断キットに関する。

Ｂｒａｃｈｙｓｐｉｒａｈｙｏｄｙｓｅｎｔｅｒｉａｅは、強いβ溶血性である、嫌気性、酸素耐性、グラム陰性スピロヘータである。過去には、ＢｒａｃｈｙｓｐｉｒａｈｙｏｄｙｓｅｎｔｅｒｉａｅはＴｒｅｐｏｎｅｍａｈｙｏｄｙｓｅｎｔｅｒｉａｅ及びＳｅｒｐｕｌｉｎａｈｙｏｄｙｓｅｎｔｅｒｉａｅとしても知られた。離乳後のブタの粘液出血性下痢疾患であるブタの赤痢の起因菌である。この細菌によるブタの感染は抗菌剤で抑制することができる。しかし、最近は動物試料における抗生物質の使用が制限されていることから、抗菌剤の使用に代るものとしてワクチン抗原候補物質の特定が急がれている。

ブタの赤痢（ＳＤ）は離乳後のブタの粘液出血性下痢疾患である。ＳＤは世界的に重大の経済的影響を及ぼす。症状の重症度は個体間及び群れの間で様々である。感染の最初の徴候は、黄色から灰色の軟便、食欲不振及び一部の動物では高い直腸温度を含む。これに続いて、便が血液の斑点及び粘液栓を含み始める。疾患が進行すると共に、水様便となり、長期的な下痢は脱水によって死を導くこともある。Ｂ．ｈｙｏｄｙｓｅｎｔｅｒｉａｅを含む便が感受性のあるブタに摂取され、その後菌は胃の酸性条件の通過に耐えて生存し、大腸に達する。実験での証拠は、この細菌が粘膜に対する走化性応答を有しており、それによって結腸粘膜へと誘導されて、結腸陰窩に侵入することを示唆している。大腸はブタにおける水及び電解質吸収の主要部位である；大腸への損傷は、それゆえ、結腸吸収不全と脱水を生じさせる。

ＳＤの診断は、臨床徴候、群れの履歴及び選択培地でのＢ．ｈｙｏｄｙｓｅｎｔｅｒｉａｅの単離に基づく。Ｂ．ｈｙｏｄｙｓｅｎｔｅｒｉａｅは、増殖が遅いこと、及び試料の保存や輸送の劣悪さによって増悪される問題である、嫌気性条件の必要性のために、しばしば単離が困難である。単離が可能なときでも、単離物の生化学試験は、Ｂ．ｈｙｏｄｙｓｅｎｔｅｒｉａｅと非病原性腸内スピロヘータ、Ｂ．ｉｎｎｏｃｅｎｓを識別することができない。ブタ又は適切な動物モデル（マウス、モルモット及びニワトリなど）における腸病原性試験の費用と時間のかかる性質は、定期的診断のためのこのアプローチをあらかじめ排除してしまう。

Ｂ．ｈｙｏｄｙｓｅｎｔｅｒｉａｅのいくつかのビルレンス因子が特定され、ブタの赤痢の病因におけるそれらの役割が検討されている。例えば、Ｂ．ｈｙｏｄｙｓｅｎｔｅｒｉａｅによる結腸の初期コロニー形成は、粘膜へのその走化性応答によって促進される（Ｋｅｎｎｅｄｙ，Ｍ．Ｊ．，Ｄ．Ｋ．Ｒｏｓｎｉｃｋ，Ｒ．Ｇ．Ｕｌｒｉｃｈ及びＲ．Ｊ．Ｙａｎｃｅｙ．１９８８、Ｊ．Ｇｅｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１３４：１５６５−１５７６）。（Ｋｅｎｎｅｄｙ，Ｍ．Ｊ．とＲ．Ｊ．Ｙａｎｃｅｙ．１９９６、Ｖｅｔ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．４９：２１−３０）。

走化性の重要性は、二重鞭毛突然変異体がマウスモデルにおいて著しく弱毒化されることを示した、Ｒｏｓｅｙ（Ｒｏｓｅｙ，Ｅ．Ｌ．，Ｍ．Ｊ．Ｋｅｎｎｅｄｙ及びＲ．Ｊ．Ｙａｎｃｅｙ，Ｊｒ．１９９６、Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．６４：４１５４−４１６２）によって明らかにされた。

ひとたびブタ盲腸のコロニー形成が確立されれば、ＮＡＤＨオキシダーゼがＢｒａｃｈｙｓｐｉｒａを酸素毒性から保護すると思われる。（Ｓｔａｎｔｏｎ，Ｔ．Ｂ．とＮ．Ｓ．Ｊｅｎｓｅ．１９９３，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１７５：２９８０−２９８７）。（Ｓｔａｎｔｏｎ，Ｔ．Ｂ．とＲ．Ｓｅｌｌｗｏｏｄ．１９９９、Ａｎａｅｒｏｂｅ５：５３９−５４６）。この仮説は、ＮＡＤＨオキシダーゼ突然変異体はブタ盲腸のコロニー形成の低下を示すという所見によって裏付けられる。慢性感染ブタの病理学的検査で明らかな盲腸病変をＢ．ｈｙｏｄｙｓｅｎｔｅｒｉａｅ溶血素含有抽出物の投与によって誘発することができる。最初に、３個の異なる推定上の溶血素遺伝子、ｔｌｙＡ、ｔｌｙＢ及びｔｌｙＣがクローン化され、配列決定された（Ｍｕｉｒ，Ｓ．，Ｍ．Ｂ．Ｋｏｏｐｍａｎ，Ｓ．Ｊ．Ｌｉｂｂｙ，Ｌ．Ａ．Ｊｏｅｎｓ，Ｆ．Ｈｅｆｆｒｏｎ及びＪ．Ｇ．Ｋｕｓｔｅｒｓ．１９９２，Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．６０：５２９−５３５）。（ｔｅｒＨｕｕｒｎｅ，Ａ．Ａ．，Ｓ．Ｍｕｉｒ，Ｍ．ｖａｎＨｏｕｔｅｎ，Ｂ．Ａ．ｖａｎｄｅｒＺｅｉｊｓｔ，Ｗ．Ｇａａｓｔｒａ及びＪ．Ｇ．Ｋｕｓｔｅｒｓ．１９９４，Ｍｉｃｒｏｂ．Ｐａｔｈｏｇ．１６：２６９−２８２）。Ｈｓｕらによる最近の報告は、ｔｌｙ遺伝子が実際に溶血素をコードするのかどうかに関して疑問を投げかけ、もう１つ別の遺伝子ｈｌｙＡを溶血素産生に関係づけた（Ｈｓｕ，Ｔ．，Ｄ．Ｌ．Ｈｕｔｔｏ，Ｆ．Ｃ．Ｍｉｎｉｏｎ，Ｒ．Ｌ．Ｚｕｅｒｎｅｒ及びＭ．Ｊ．Ｗａｎｎｅｍｕｅｈｌｅｒ．２００１、Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．６９：７０６−７１１）。

防御免疫応答を誘発する抗原についての検索において、Ｂ．ｈｙｏｄｙｓｅｎｔｅｒｉａｅの外膜に局在するいくつかのタンパク質が特定された。プロテイナーゼＫ感受性の１６ｋＤａ抗原が外膜に局在した。その後この抗原をコードする遺伝子、ｓｍｐＡがクローン化され、インビボでは発現されないことが認められた（Ｔｈｏｍａｓ，Ｗ．，Ｒ．Ｓｅｌｌｗｏｏｄ及びＲ．Ｊ．Ｌｙｓｏｎｓ．１９９２，Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．６０：３１１１−３１１６）。（Ｓｅｌｌｗｏｏｄ，Ｒ．，Ｆ．Ｗａｌｔｏｎ，Ｗ．Ｔｈｏｍａｓ，Ｍ．Ｒ．Ｂｕｒｒｏｗｓ及びＪ．Ｃｈｅｓｈａｍ．１９９５，Ｖｅｔ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．４４：２５−３５）。細胞質外３９ｋＤａ抗原、Ｖｓｐ３９は、表面ヨウ素化によってＢ．ｈｙｏｄｙｓｅｎｔｅｒｉａｅの主要表面成分として特定された（Ｇａｂｅ，Ｊ．Ｄ．，Ｒ．Ｅ．Ｃｈａｎｇ，Ｒ．Ｊ．Ｓｌｏｍｉａｎｙ，Ｗ．Ｈ．Ａｎｄｒｅｗｓ及びＭ．Ｔ．Ｍｃｃａｍａｎ．１９９５、Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．６３：１４２−１４８）。Ｖｓｐ３９をコードする遺伝子はクローン化されていないが、８３−９０％の同一性を有する３９ｋＤａタンパク質をコードする一連の関連縦列パラロガス遺伝子が特定された（Ｇａｂｅ，Ｊ．Ｄ．，Ｅ．Ｄｒａｇｏｎ，Ｒ．Ｊ．Ｃｈａｎｇ及びＭ．Ｔ．ＭｃＣａｍａｎ．１９９８，ＩｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆａｌｉｎｋｅｄｓｅｔｏｆｇｅｎｅｓｉｎＳｅｒｐｕｌｉｎａｈｙｏｄｙｓｅｎｔｅｒｉａｅ（Ｂ２０４）ｐｒｅｄｉｃｔｅｄｔｏｅｎｃｏｄｅｃｌｏｓｅｌｙｒｅｌａｔｅｄ３９−ｋｉｌｏｄａｌｔｏｎｅｘｔｒａｃｙｔｏｐｌａｓｍｉｃｐｒｏｔｅｉｎｓ．Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１８０：４４４−４４８）。（ＭｃＣａｍａｎ，Ｍ．Ｔ．，Ｋ．Ａｕｅｒ，Ｗ．Ｆｏｌｅｙ及びＪ．Ｄ．Ｇａｂｅ．１９９９、Ｖｅｔ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．６８：２７３−２８３）。推定上の３０ｋＤａリポタンパク質、ＢｍｐＢは、回復期のブタ血清と反応することが認められた。しかしながら、このタンパク質についてのさらなるデータは公表されていない（Ｌｅｅ，Ｂ．Ｊ．，Ｔ．Ｌａ，Ａ．Ｓ．Ｍｉｋｏｓｚａ及びＤ．Ｊ．Ｈａｍｐｓｏｎ．２０００，Ｖｅｔ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．７６：２４５−２５７）。

それ故、新しい有効なワクチン、特に広い防御を提供するワクチンが求められていることは明らかである。

Ｂｒａｃｈｙｓｐｉｒａｈｙｏｄｙｓｅｎｔｅｒｉａｅ感染を制御するための新規ワクチンを提供することが本発明の目的である。

今や驚くべきことに、新規表面発現細菌リポタンパク質をコードすると思われる、２個の新規遺伝子が発見された。これらのリポタンパク質、ＢｌｐＢとＢｌｐＣは、Ｂｒａｃｈｙｓｐｉｒａｈｙｏｄｙｓｅｎｔｅｒｉａｅ感染を制御するためのワクチンにおいて、単独で及び特に互いの組合せで、適切なワクチン成分であることが判明する。今や両方の遺伝子がクローン化され、配列決定された。それらの配列を配列番号１（ＢｌｐＢ）及び配列番号３（ＢｌｐＣ）に示す。最初のＯＲＦ、ｂｌｐＢは、６１ｋＤの分子量を有する５３７アミノ酸のリポタンパク質をコードする（配列番号２に示す）。第二のＯＲＦ、ｂｌｐＣは、２０ｋＤの分子量を有する１７９アミノ酸のリポタンパク質をコードする（配列番号４に示す）。

多くの異なる核酸配列が全く同一のタンパク質をコードしうることは当技術分野において周知である。この現象は一般に、アミノ酸をコードする各々のトリプレットの第二及び特に第三塩基のゆらぎとして知られる。この現象は、まだ同じタンパク質をコードする２個の核酸配列について約３０％の非相同性をもたらしうる。それ故、約７０％の配列相同性を有する２個の核酸配列は、まだ同一のタンパク質をコードすることがありうる。

そこで、１つの実施態様は、配列番号１に記載のＢｒａｃｈｙｓｐｉｒａｈｙｏｄｙｓｅｎｔｅｒｉａｅリポタンパク質遺伝子の核酸配列と少なくとも７０％の相同性を有する、６１ｋＤのＢｒａｃｈｙｓｐｉｒａｈｙｏｄｙｓｅｎｔｅｒｉａｅリポタンパク質をコードする核酸配列又は前記リポタンパク質の免疫原性フラグメントをコードする前記核酸配列の部分に関する。

６１の分子量は、ポリアクリルアミドゲルでのゲル電気泳動において決定される。当技術分野でしばしば遭遇する分子量決定のわずかな変動性の故に、前記分子量は５６から６６ｋＤの間で変化しうる。それ故、本発明に従ったリポタンパク質の分子量は６１＋／−５ｋＤと解釈されるべきである。

好ましくは、この６１Ｂｒａｃｈｙｓｐｉｒａｈｙｏｄｙｓｅｎｔｅｒｉａｅリポタンパク質をコードする本発明に従った核酸配列又は前記リポタンパク質の免疫原性フラグメントをコードする前記核酸配列の部分は、配列番号１に記載のＢｒａｃｈｙｓｐｉｒａｈｙｏｄｙｓｅｎｔｅｒｉａｅリポタンパク質遺伝子の核酸配列と少なくとも８０％、好ましくは９０％、より好ましくは９５％の相同性を有する。

９８％、９９％又はさらに１００％の相同性レベルがより一層好ましい。

ヌクレオチド相同性のレベルは、ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｂｌａｓｔ／ｂｌ２ｓｅｑ／ｂｌ２．ｈｔｍｌに認められるサブプログラム「ＢＬＡＳＴＮ」を選択することにより、コンピュータプログラム「ＢＬＡＳＴ２ＳＥＱＵＥＮＣＥＳ」で決定することができる。

このプログラムについての参考文献は、ＴａｔｉａｎａＡ．Ｔａｔｕｓｏｖａ，ＴｈｏｍａｓＬ．ＭａｄｄｅｎＦＥＭＳＭｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｌｅｔｔｅｒｓ１７４：２４７−２５０（１９９９）である。使用するパラメータはデフォルトパラメータである：
マッチについてのリウォード：＋１。ミスマッチについてのペナルティー：−２。オープンギャップ：５。伸長ギャップ：２。ギャップｘ＿ドロップオフ：５０。

もう１つの実施態様は、配列番号３に記載のＢｒａｃｈｙｓｐｉｒａｈｙｏｄｙｓｅｎｔｅｒｉａｅリポタンパク質遺伝子の核酸配列と少なくとも７０％の相同性を有する、２０ｋＤのＢｒａｃｈｙｓｐｉｒａｈｙｏｄｙｓｅｎｔｅｒｉａｅリポタンパク質をコードする核酸配列又は前記リポタンパク質の免疫原性フラグメントをコードする前記核酸配列の部分に関する。

２０ｋＤの分子量は、ポリアクリルアミドゲルでのゲル電気泳動において決定される。当技術分野でしばしば遭遇する分子量決定のわずかな変動性の故に、前記分子量は１５から２５ｋＤの間で変化しうる。それ故、本発明に従ったリポタンパク質の分子量は２０＋／−５ｋＤと解釈されるべきである。

好ましくは、この２０ｋＤＢｒａｃｈｙｓｐｉｒａｈｙｏｄｙｓｅｎｔｅｒｉａｅリポタンパク質をコードする本発明に従った核酸配列又は前記リポタンパク質の免疫原性フラグメントをコードする前記核酸配列の部分は、配列番号３に記載のＢｒａｃｈｙｓｐｉｒａｈｙｏｄｙｓｅｎｔｅｒｉａｅリポタンパク質遺伝子の核酸配列と少なくとも８０％、好ましくは９０％、より好ましくは９５％の相同性を有する。

配列番号１又は配列番号３に記載の配列に相補的なヌクレオチド配列又は本発明に従った配列の縦列を含むヌクレオチド配列も本発明の範囲内である。

本発明は、新規６１ｋＤ及び２０ｋＤＢｒａｃｈｙｓｐｉｒａｈｙｏｄｙｓｅｎｔｅｒｉａｅリポタンパク質をコードする核酸配列を開示するので、今や初めて、これらのタンパク質を十分な量で入手することが可能となる。これは、例えば、前記タンパク質又はその免疫原性フラグメントをコードする遺伝子の全体又は部分を発現する発現系を用いることによって実施しうる。

それ故、この実施態様のより好ましい形態では、本発明は、本発明に従った核酸配列を含むＤＮＡフラグメントに関する。ＤＮＡフラグメントは、本発明に従った核酸配列のための担体として機能する一続きのヌクレオチドである。そのようなＤＮＡフラグメントは、例えば、本発明に従った核酸配列がその中にクローン化されたプラスミドでありうる。そのようなＤＮＡフラグメントは、例えば、下記で述べるように、プライマーとして使用するため及び本発明に従った核酸配列の発現のためのＤＮＡの量を高めるために有用である。

核酸配列の発現のための基本的必要条件は、その核酸配列がプロモーターの制御下にあるように、核酸配列に機能的に連結された適切なプロモーターである。プロモーターの選択が、タンパク質発現のための宿主細胞として使用される細胞において遺伝子の転写を指令することができるあらゆる真核生物、原核生物又はウイルスプロモーターに及ぶことは当業者には明白である。

それ故、この実施態様のさらに一層好ましい形態は、本発明に従った核酸配列が機能的に連結されたプロモーターの制御下に置かれている、本発明に従ったＤＮＡフラグメント及び／又は核酸配列を含む組換えＤＮＡ分子に関する。これは、例えば標準分子生物学手法によって入手できる（Ｍａｎｉａｔｉｓ／Ｓａｍｂｒｏｏｋ（Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒｃｌｏｎｉｎｇ：ａｌａｂｏｒａｔｏｒｙｍａｎｕａｌ，１９８９．ＩＳＢＮ０−８７９６９−３０９−６）。

機能的に連結されたプロモーターとは、それらが連結されている核酸配列の転写を制御することができるプロモーターである。そのようなプロモーターは、そのプロモーターが発現のために使用される細胞において機能性であることを条件として、Ｂｒａｃｈｙｓｐｉｒａの新規遺伝子の天然プロモーター又はもう１つ別のプロモーターでありうる。また、異種プロモーターであってもよい。宿主細胞が細菌であるとき、使用しうる有用な発現制御配列は、Ｔｒｐプロモーター及びオペレーター（Ｇｏｅｄｄｅｌら、Ｎｕｃｌ．ＡｃｉｄｓＲｅｓ．，８、４０５７，１９８０）；ｌａｃプロモーター及びオペレーター（Ｃｈａｎｇら、Ｎａｔｕｒｅ，２７５，６１５，１９７８）；外膜タンパク質プロモーター（Ｎａｋａｍｕｒａ，Ｋ．とＩｎｏｕｇｅ，Ｍ．，ＥＭＢＯＪ．，１、７７１−７７５，１９８２）；バクテリオファージλプロモーター及びオペレーター（Ｒｅｍａｕｔ，Ｅ．ら、Ｎｕｃｌ．ＡｃｉｄｓＲｅｓ．，１１、４６７７−４６８８，１９８３）；αアミラーゼ（枯草菌（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ））プロモーター及びオペレーター、終結配列及び選択宿主細胞と適合性である他の発現促進及び制御配列を含む。

宿主細胞が酵母であるとき、有用な発現制御配列は、例えばα接合因子を含む。昆虫細胞については、バキュロウイルスのポリヘドリン又はｐ１０プロモーターが使用できる（Ｓｍｉｔｈ，Ｇ．Ｅ．ら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．３、２１５６−６５，１９８３）。宿主細胞が脊椎動物由来であるとき、有用な発現制御配列の例は、（ヒト）サイトメガロウイルス前初期プロモーター（Ｓｅｅｄ，Ｂ．ら、Ｎａｔｕｒｅ３２９，８４０−８４２，１９８７；Ｆｙｎａｎ，Ｅ．Ｆ．ら、ＰＮＡＳ９０、１１４７８−１１４８２，１９９３；Ｕｌｍｅｒ，Ｊ．Ｂ．ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ２５９，１７４５−１７４８，１９９３）、ラウス肉腫ウイルスＬＴＲ（ＲＳＶ、Ｇｏｒｍａｎ，Ｃ．Ｍ．ら、ＰＮＡＳ７９、６７７７−６７８１，１９８２；Ｆｙｎａｎら、前出；Ｕｌｍｅｒら、前出）、ＭＰＳＶＬＴＲ（Ｓｔａｃｅｙら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ５０、７２５−７３２、１９８４）、ＳＶ４０前初期プロモーター（ＳｐｒａｇｕｅＪ．ら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ４５、７７３、１９８３）、ＳＶ４０プロモーター（Ｂｅｒｍａｎ，Ｐ．Ｗ．ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ，２２２、５２４−５２７，１９８３）、メタロチオネインプロモーター（Ｂｒｉｎｓｔｅｒ，Ｒ．Ｌ．ら、Ｎａｔｕｒｅ２９６，３９−４２，１９８２）、熱ショックプロモーター（Ｖｏｅｌｌｍｙら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８２、４９４９−５３，１９８５）、Ａｄ２の主要後期プロモーター及びβアクチンプロモーター（Ｔａｎｇら、Ｎａｔｕｒｅ３５６，１５２−１５４、１９９２）を含む。調節配列はまた、ターミネーター及びポリアデニル化配列を含みうる。使用できる配列の中には、周知のウシ成長ホルモンポリアデニル化配列、ＳＶ４０ポリアデニル化配列、ヒトサイトメガロウイルス（ｈＣＭＶ）ターミネーター及びポリアデニル化配列がある。

細菌、酵母、真菌、昆虫及び脊椎動物発現系は非常に頻繁に使用される系である。そのような系は当技術分野において周知であって、一般に入手可能であり、例えばＣｌｏｎｔｅｃｈＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．４０３０ＦａｂｉａｎＷａｙ，ＰａｌｏＡｌｔｏ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ９４３０３−４６０７，ＵＳＡを通して市販されている。これらの発現系に次いで、寄生生物に基づく発現系が魅力的な発現系である。そのような系は、例えばフランス特許出願公開第２７１４０７４号及び米国特許出願公開ＮＴＩＳ第ＵＳ０８／０４３１０９号（Ｈｏｆｆａｍｎ，Ｓ．とＲｏｇｅｒｓ，Ｗ．：１９９３年１２月１日公開）に述べられている。

本発明のこの実施態様のさらに一層好ましい形態は、本発明に従った６１ｋＤ及び／又は２０ｋＤＢｒａｃｈｙｓｐｉｒａｈｙｏｄｙｓｅｎｔｅｒｉａｅリポタンパク質又はその免疫原性フラグメントをコードする核酸配列、本発明に従ったＤＮＡフラグメント又は本発明に従った組換えＤＮＡ分子を含む生組換え担体（ＬＲＣ）に関する。これらのＬＲＣは、その中に付加的な遺伝情報、この場合は本発明に従った６１ｋＤ及び／又は２０ｋＤＢｒａｃｈｙｓｐｉｒａｈｙｏｄｙｓｅｎｔｅｒｉａｅリポタンパク質又はその免疫原性フラグメントをコードする核酸配列がクローン化されている微生物又はウイルスである。そのようなＬＲＣに感染したブタは、その担体の免疫原に対してのみならず、それについての遺伝暗号が前記ＬＲＣ内に付加的にクローン化されているタンパク質の免疫原性部分、例えば本発明に従った新規６１ｋＤ及び／又は２０ｋＤＢｒａｃｈｙｓｐｉｒａｈｙｏｄｙｓｅｎｔｅｒｉａｅリポタンパク質遺伝子に対しても免疫応答を生じる。

細菌ＬＲＣの一例として、当技術分野で既知の弱毒化サルモネラ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）菌株が非常に魅力的に使用できる。

また、生組換え担体寄生生物は、中でも、Ｖｅｒｍｅｕｌｅｎ，Ａ．Ｎ．（Ｉｎｔ．Ｊｏｕｒｎ．Ｐａｒａｓｉｔｏｌ．２８：１１２１−１１３０（１９９８））によって記述されている。

さらに、ＬＲＣウイルスは、核酸配列を標的細胞内に輸送する手段として使用しうる。生組換え担体ウイルスはベクターウイルスとも呼ばれる。ベクターとしてしばしば使用されるウイルスは、ワクシニアウイルス（Ｐａｎｉｃａｌｉら；Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７９：４９２７（１９８２）、ヘルペスウイルス（欧州特許出願第０４７３２１０Ａ２号）及びレトロウイルス（Ｖａｌｅｒｉｏ，Ｄ．ら；Ｂａｕｍ，Ｓ．Ｊ．，Ｄｉｃｋｅ，Ｋ．Ａ．，Ｌｏｔｚｏｖａ，Ｅ．及びＰｌｕｚｎｉｋ，Ｄ．Ｈ．（編集）、ＥｘｐｒｅｉｍｅｎｔａｌＨａｅｍａｔｏｌｏｇｙｔｏｄａｙ−１９８８．ＳｐｒｉｎｇｅｒＶｅｒｌａｇ，ＮｅｗＹｏｒｋ：ｐ．９２−９９（１９８９））である。

当技術分野で周知の、インビボでの相同的組換えの手法を使用して、宿主動物において本発明に従った挿入核酸配列の発現を誘導することができる、選択細菌、寄生生物又はウイルスのゲノム内に組換え核酸配列を導入することができる。

最後に、本発明のこの実施態様のもう１つの形態は、本発明の従ったタンパク質をコードする核酸配列、そのような核酸配列を含むＤＮＡフラグメント又は機能的に連結されたプロモーターの制御下のそのような核酸配列を含む組換えＤＮＡ分子を含む宿主細胞に関する。この形態はまた、本発明に従った６１ｋＤ及び／又は２０ｋＤＢｒａｃｈｙｓｐｉｒａｈｙｏｄｙｓｅｎｔｅｒｉａｅリポタンパク質又はその免疫原性フラグメントをコードする核酸分子を含む生組換え担体を含む宿主細胞に関する。

宿主細胞は、ｐＢＲ３２２などの細菌ベースのプラスミド又はｐＧＥＸなどの細菌発現ベクター又はバクテリオファージと組み合わせた、細菌由来の細胞、例えば大腸菌、枯草菌及びＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ種でありうる。宿主細胞はまた、真核生物由来、例えば酵母特異的ベクター分子と組み合わせた酵母細胞、又はベクター又は組換えバキュロウイルスと組み合わせた昆虫細胞のような高等真核細胞（Ｌｕｃｋｏｗら；Ｂｉｏ−ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ６：４７−５５（１９８８））、例えばＴｉ−プラスミドに基づくベクター又は植物ウイルスベクターと組み合わせた植物細胞（Ｂａｒｔｏｎ，Ｋ．Ａ．ら；Ｃｅｌｌ３２：１０３３（１９８３））、やはり適切なベクター又は組換えウイルスと組み合わせた、ＨｅＬａ細胞、チャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ）又はＣｒａｎｄｅｌｌネコ腎臓細胞のような哺乳類細胞でありうる。

本発明のもう１つの実施態様は、本発明に従った新規６１ｋＤ及び／又は２０ｋＤＢｒａｃｈｙｓｐｉｒａｈｙｏｄｙｓｅｎｔｅｒｉａｅリポタンパク質及びその免疫原性フラグメントに関する。

免疫原性フラグメントの概念は下記で定義する。

この実施態様の１つの形態は、配列番号２に記載のアミノ酸配列と少なくとも７０％のアミノ酸配列相同性を有する、６１ｋＤのＢｒａｃｈｙｓｐｉｒａｈｙｏｄｙｓｅｎｔｅｒｉａｅリポタンパク質及びその免疫原性フラグメントに関する。

好ましい形態では、この実施態様は、配列番号２に記載のアミノ酸配列と少なくとも８０％の配列相同性、好ましくは９０％、より好ましくは９５％の相同性を有する、そのようなＢｒａｃｈｙｓｐｉｒａリポタンパク質及びその免疫原性フラグメントに関する。

この実施態様のもう１つの形態は、配列番号４に記載のアミノ酸配列と少なくとも７０％のアミノ酸配列相同性を有する、２０ｋＤのＢｒａｃｈｙｓｐｉｒａｈｙｏｄｙｓｅｎｔｅｒｉａｅリポタンパク質及びその免疫原性フラグメントに関する。

好ましい形態では、この実施態様は、配列番号４に記載のアミノ酸配列と少なくとも８０％の配列相同性、好ましくは９０％、より好ましくは９５％の相同性を有する、そのようなＢｒａｃｈｙｓｐｉｒａリポタンパク質及びその免疫原性フラグメントに関する。

この実施態様のもう１つの形態は、本発明に従った核酸配列によってコードされる６１ｋＤ及び／又は２０ｋＤのＢｒａｃｈｙｓｐｉｒａｈｙｏｄｙｓｅｎｔｅｒｉａｅリポタンパク質及び前記タンパク質の免疫原性フラグメントに関する。

タンパク質相同性のレベルは、ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｂｌａｓｔ／ｂｌ２ｓｅｑ／ｂｌ２．ｈｔｍｌに認められるサブプログラム「ＢＬＡＳＴＰ」を選択することにより、コンピュータプログラム「ＢＬＡＳＴ２ＳＥＱＵＥＮＣＥＳ」で決定することができる。

このプログラムについての参考文献は、ＴａｔｉａｎａＡ．Ｔａｔｕｓｏｖａ，ＴｈｏｍａｓＬ．ＭａｄｄｅｎＦＥＭＳＭｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｌｅｔｔｅｒｓ１７４：２４７−２５０（１９９９）である。使用する行列：「ｂｌｏｓｕｍ６２」。使用するパラメータはデフォルトパラメータである：
オープンギャップ：１１。伸長ギャップ：１。ギャップｘ＿ドロップオフ：５０。

ここに包含される個々のタンパク質に関して、個々のＢｒａｃｈｙｓｐｉｒａ菌株の間で自然の変異が存在しうることは了解される。これらの変異は、全体配列中のアミノ酸の相違によって又は前記配列中のアミノ酸の欠失、置換、挿入、逆位又は付加によって明らかにされうる。生物学的及び免疫学的活性を基本的に変化させないアミノ酸置換は、「ＴｈｅＰｒｏｔｅｉｎｓ」ＡｃａｄｅｍｉｃＰｒｅｓｓＮｅｗＹｏｒｋ（１９７９）の中でＮｅｕｒａｔｈらによって述べられている。関連アミノ酸の間でのアミノ酸置換又は進化の過程でしばしば発生した置換は、中でも特に、Ｓｅｒ／Ａｌａ、Ｓｅｒ／Ｇｌｙ、Ａｓｐ／Ｇｌｙ、Ａｓｐ／Ａｓｎ、Ｉｌｅ／Ｖａｌ（Ｄａｙｈｏｆ，Ｍ．Ｄ．，Ａｔｌａｓｏｆｐｒｏｔｅｉｎｓｅｑｕｅｎｃｅａｎｄｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，Ｎａｔ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｒｅｓ．Ｆｏｕｎｄ．，ＷａｓｈｉｎｇｔｏｎＤ．Ｃ．，１９７８、第５巻、補遺３参照）である。他のアミノ酸置換は、Ａｓｐ／Ｇｌｕ、Ｔｈｒ／Ｓｅｒ、Ａｌａ／Ｇｌｙ、Ａｌａ／Ｔｈｒ、Ｓｅｒ／Ａｓｎ、Ａｌａ／Ｖａｌ、Ｔｈｒ／Ｐｈｅ、Ａｌａ／Ｐｒｏ、Ｌｙｓ／Ａｒｇ、Ｌｅｕ／Ｉｌｅ、Ｌｅｕ／Ｖａｌ及びＡｌａ／Ｇｌｕを含む。この情報に基づき、ＬｉｐｍａｎとＰｅａｒｓｏｎは、迅速で感受性のあるタンパク質比較（Ｓｃｉｅｎｃｅ，２２７，１４３５−１４４１，１９８５）及び相同タンパク質の間での機能的類似性を決定するための方法を開発した。本発明の例示的実施態様のそのようなアミノ酸置換、ならびに欠失及び／又は挿入を有する変異は、生じるタンパク質がそれらの免疫反応性を保持している限り、本発明の範囲内である。これは、なぜ本発明に従ったＢｒａｃｈｙｓｐｉｒａリポタンパク質が、異なる圃場単離物から単離したとき、まだ同じ免疫学的特徴を備えた同じタンパク質でありながら、約７０％の相同性レベルを有する場合があるかを説明する。

まだＢｒａｃｈｙｓｐｉｒａｈｙｏｄｙｓｅｎｔｅｒｉａｅによる感染に対して又は少なくとも前記感染の臨床症状に対して免疫応答を誘導することができるタンパク質を提供する、本発明に従ったある種のタンパク質のアミノ酸配列におけるそれらの変異は、「本質的に免疫原性に影響を及ぼさない」とみなされる。

タンパク質を、例えばワクチン接種のため又は抗体を惹起するために使用するとき、必ずしもタンパク質全体を使用する必要はない。それ自体で又は例えばＫＬＨなどの担体に結合して、そのタンパク質に対する免疫応答を誘導することができるそのタンパク質のフラグメント、いわゆる免疫原性フラグメントを使用することも可能である。「免疫原性フラグメント」は、脊椎動物宿主において免疫応答を誘導するその能力をまだ保持する完全長タンパク質のフラグメントと理解され、例えばＢ又はＴ細胞エピトープを含む。簡単に言えば、免疫原性フラグメントは、本発明に従った６１又は２０Ｂｒａｃｈｙｓｐｉｒａｈｙｏｄｙｓｅｎｔｅｒｉａｅリポタンパク質に対する抗原応答を誘導することができるフラグメントである。現在、抗原性フラグメント（決定基）をコードするＤＮＡフラグメントを容易に特定するための様々な手法が使用可能である。Ｇｅｙｓｅｎら（国際公開広報第ＷＯ８４／０３５６４号、国際公開広報第ＷＯ８６／０６４８７号、米国特許第４，８３３，０９２号、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８１：３９９８−４００２（１９８４）、Ｊ．Ｉｍｍ．Ｍｅｔｈ．１０２、２５９−２７４（１９８７））が述べた方法、いわゆるＰＥＰＳＣＡＮ法は、免疫学的に重要なタンパク質の領域である、エピトープの検出のための実施しやすく、迅速で、広く確立された方法である。この方法は世界中で使用されており、それ自体が当業者に周知である。この（経験的）方法は、Ｂ細胞エピトープの検出に特に適する。また、何らかのタンパク質をコードする遺伝子の配列を与えると、コンピュータアルゴリズムは、現在既知であるエピトープとのそれらの配列及び／又は構造上の一致に基づいて特定タンパク質フラグメントを免疫学的に重要なエピトープとして指定することができる。これらの領域の決定は、ＨｏｐｐとＷｏｏｄｓ（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．７８：３８２４８−３８２８（１９８１））に従った親水性基準と、ＣｈｏｕとＦａｓｍａｎ（ＡｄｖａｎｃｅｓｉｎＥｎｚｙｍｏｌｏｇｙ４７：４５−１４８（１９８７）及び米国特許第４，５５４，１０１号）に従った二次構造局面の組合せに基づく。Ｔ細胞エピトープは、同様にＢｅｒｚｏｆｓｋｙの両親媒性基準（Ｓｃｉｅｎｃｅ２３５，１０５９−１０６２（１９８７）及び米国特許出願ＮＴＩＳ第ＵＳ０７／００５，８８５号）を用いてコンピュータによってその配列から予測することができる。簡潔な概要は：一般的原理に関してはＳｈａｎＬｕ；Ｔｉｂｔｅｃｈ９：２３８−２４２（１９９１）、マラリアエピトープに関してはＧｏｏｄら、Ｓｃｉｅｎｃｅ２３５：１０５９−１０６２（１９８７）、総説についてはＬｕ；Ｖａｃｃｉｎｅ１０：３−７（１９９２）、ＨＩＶエピトープに関してはＢｅｒｚｏｆｓｋｙ；ＴｈｅＦＡＳＥＢＪｏｕｒｎａｌ５：２４１２−２４１８（１９９１）に認められる。免疫原性フラグメントは、通常、８アミノ酸の最小長、好ましくは９、１０、１２、１５又はさらに２０アミノ酸などの９アミノ酸以上の最小長を有する。それ故、そのようなフラグメントをコードする核酸配列は少なくとも２４核酸の長さ、好ましくは２７、３０、３６、４５又はさらに６０核酸の長さを有する。

それ故、本発明のさらにもう１つの実施態様の１つの形態は、医薬適合性の担体と共に、上述したような本発明に従った６１ｋＤ及び／又は２０ｋＤのＢｒａｃｈｙｓｐｉｒａｈｙｏｄｙｓｅｎｔｅｒｉａｅタンパク質又はその免疫原性フラグメントを含む、Ｂｒａｃｈｙｓｐｉｒａｈｙｏｄｙｓｅｎｔｅｒｉａｅ感染を制御するためのワクチンに関する。

本発明のさらにもう１つの実施態様は、ワクチンにおける使用のための、本発明に従った６１ｋＤ及び／又は２０ｋＤのＢｒａｃｈｙｓｐｉｒａｈｙｏｄｙｓｅｎｔｅｒｉａｅタンパク質又はその免疫原性フラグメントに関する。

本発明のさらにもう１つの実施態様は、Ｂｒａｃｈｙｓｐｉｒａｈｙｏｄｙｓｅｎｔｅｒｉａｅ感染を制御するためのワクチンの製造のための、本発明に従った核酸配列、ＤＮＡフラグメント、組換えＤＮＡ分子、生組換え担体、宿主細胞あるいはリポタンパク質又はその免疫原性フラグメントの使用に関する。

本発明に従ったワクチンを製造する１つの方法は、細菌を増殖させ、次にその細菌から６１ｋＤ及び／又は２０ｋＤのＢｒａｃｈｙｓｐｉｒａｈｙｏｄｙｓｅｎｔｅｒｉａｅリポタンパク質又はその免疫原性フラグメントを生化学的に精製することによる。これは、しかしながら、非常に時間のかかるワクチン製造方法である。

それ故、ワクチンにおいて６１ｋＤ及び／又は２０ｋＤのＢｒａｃｈｙｓｐｉｒａｈｙｏｄｙｓｅｎｔｅｒｉａｅタンパク質又はその免疫原性フラグメントをコードする遺伝子の発現産物を使用することははるかに簡便である。６１ｋＤ及び２０ｋＤリポタンパク質をコードする遺伝子の核酸配列が本発明において提供されるので、これが今や初めて可能となる。

これらの遺伝子の発現産物に基づくワクチンは、下記に述べるように、本発明に従ったタンパク質又は本発明に従ったその免疫原性フラグメントを医薬適合性の担体と混合することによって容易に製造できる。

あるいは、本発明に従ったワクチンは、本発明に従ったタンパク質又はその免疫原性フラグメントを発現することができる、上述したような生組換え担体を含みうる。例えばサルモネラ菌担体又はウイルス担体、例えばヘルペスウイルスベクターに基づくそのようなワクチンは、サブユニットワクチンに比べて、Ｂｒａｃｈｙｓｐｉｒａｈｙｏｄｙｓｅｎｔｅｒｉａｅの自然の感染方法をより良好に模倣するという利点を有する。さらに、それらの自己増殖は、免疫のためにごく少量の組換え担体しか必要としないので、好都合である。

ワクチンはまた、本発明に従ったタンパク質又はその免疫原性フラグメントを含む、上述したような宿主細胞に基づきうる。

上述したすべてのワクチンが能動ワクチン接種に寄与する、すなわち宿主の防御系の引き金となる。

あるいは、例えばウサギにおいて抗体を惹起するか又は上述したような抗体産生細胞系統から抗体を入手することができる。そのような抗体を、その後、ブタに投与することができる。このワクチン接種方法、受動ワクチン接種法は、動物が既に感染していて、自然の免疫応答を開始させるための時間がないときの選択ワクチン接種法である。また、突然高い感染圧にかかりやすい動物にワクチン接種するための好ましい方法でもある。投与された本発明に従ったタンパク質又はその免疫原性フラグメントに対する抗体は、これらの場合は、直接Ｂｒａｃｈｙｓｐｉｒａｈｙｏｄｙｓｅｎｔｅｒｉａｅに結合することができる。これは、Ｂｒａｃｈｙｓｐｉｒａｈｙｏｄｙｓｅｎｔｅｒｉａｅの増殖を低下又は停止させるという利点を有する。

それ故、本発明のこの実施態様の１つの形態は、本発明に従ったＢｒａｃｈｙｓｐｉｒａｈｙｏｄｙｓｅｎｔｅｒｉａｅタンパク質又は前記タンパク質の免疫原性フラグメントに対する抗体、及び医薬適合性の担体を含有する、Ｂｒａｃｈｙｓｐｉｒａｈｙｏｄｙｓｅｎｔｅｒｉａｅ感染を制御するためのワクチンに関する。

本発明のさらにもう１つの実施態様は、本発明に従ったＢｒａｃｈｙｓｐｉｒａｈｙｏｄｙｓｅｎｔｅｒｉａｅタンパク質又は前記タンパク質の免疫原性フラグメントに対する抗体に関する。

本発明に従った抗体の大量生産のための方法も当技術分野において既知である。そのような方法は、ファージディスプレイのための線維状ファージにおける、本発明に従ったタンパク質をコードする遺伝情報（のフラグメント）のクローニングに基づく。そのような手法は、中でも特に、ｈｔｔｐ：／／ａｘｉｍｔ１．ｉｍｔ．ｕｎｉ−ｍａｒｂｕｒｇ．ｄｅ／〜ｒｅｋ／ａｅｐｐｈａｇｅ．ｈｔｍｌ．の「線維状ファージディスプレイ」の中の「ＡｎｔｉｂｏｄｙＥｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇＰａｇｅ」において、及びＣｏｒｔｅｓｅ，Ｒ．ら（１９９４）ＴｒｅｎｄｓＢｉｏｔｅｃｈｎ．１２：２６２−２６７、Ｃｌａｃｋｓｏｎ，Ｔ．とＷｅｌｌｓ，Ｊ．Ａ．（１９９４）ＴｒｅｎｄｓＢｉｏｔｅｃｈｎ．１２：１７３−１８３、Ｍａｒｋｓ，Ｊ．Ｄ．ら（１９９２）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６７：１６００７−１６０１０、Ｗｉｎｔｅｒ，Ｇ．ら（１９９４）Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１２：４３３−４５５、及びＬｉｔｔｌｅ，Ｍ．ら（１９９４）Ｂｉｏｔｅｃｈｎ．Ａｄｖ．１２：５３９−５５５による総説論文の中で述べられている。前記ファージは、その後、カメリド（ｃａｍｅｌｉｄ）重鎖抗体を発現するカメリド発現ライブラリーをスクリーニングするために使用される。（Ｍｕｙｌｄｅｒｍａｎｓ，Ｓ．とＬａｕｗｅｒｅｙｓ，Ｍ．，Ｊｏｕｒｎ．Ｍｏｌｅｃ．Ｒｅｃｏｇｎ．１２：１３１−１４０（１９９９）及びＧｈａｈｒｏｕｄｉ，Ｍ．Ａ．ら、ＦＥＢＳＬｅｔｔｅｒｓ４１４：５１２−５２６（１９９７））。所望抗体を発現するライブラリーからの細胞を複製し、その後抗体の大規模発現のために使用することができる。

さらにもう１つの実施態様は、本発明に従った抗体と医薬適合性の担体を混合することを含む、本発明に従ったワクチンの製造のための方法に関する。

代替的な効率のよいワクチン接種方法は、適切な抗原をコードするＤＮＡによる直接ワクチン接種である。タンパク質をコードするＤＮＡによる直接ワクチン接種は、多くの異なるタンパク質に関して成功を収めている（例えばＤｏｎｎｅｌｌｙら、Ｔｈｅｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｓｔ２：２０−２６（１９９３）において総説されている）。このワクチン接種方法はまた、Ｂｒａｃｈｙｓｐｉｒａｈｙｏｄｙｓｅｎｔｅｒｉａｅ感染に対するブタのワクチン接種についても魅力的である。それ故、本発明のこの実施態様のさらなる他の形態は、本発明に従ったタンパク質又はその免疫原性フラグメントをコードする核酸配列、そのような核酸配列を含むＤＮＡフラグメント、又は本発明に従った組換えＤＮＡ分子、及び医薬適合性の担体を含有するワクチンに関する。

本発明に従ったＤＮＡワクチン中での使用に適するＤＮＡプラスミドの例は、細菌、真核生物及び酵母宿主細胞のための従来のクローニング又は発現プラスミドであり、前記プラスミドの多くが市販されている。そのようなプラスミドの周知の例は、ｐＢＲ３２２及びｐｃＤＮＡ３（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）である。本発明に従ったＤＮＡフラグメント又は組換えＤＮＡ分子は、ヌクレオチドのタンパク質発現を誘導することができるべきである。前記ＤＮＡフラグメント又は組換えＤＮＡ分子は、本発明に従った１個以上のヌクレオチド配列を含みうる。さらに、前記ＤＮＡフラグメント又は組換えＤＮＡ分子は、非メチル化ＣｐＧジヌクレオチドを有する免疫刺激性オリゴヌクレオチド、又は他の抗原タンパク質又はアジュバントサイトカインをコードするヌクレオチド配列などの他のヌクレオチド配列を含みうる。

本発明に従ったワクチンにおいて使用される、好ましくは転写調節配列に作動可能に連結された、本発明に従ったヌクレオチド配列又は本発明に従ったヌクレオチド配列を含むＤＮＡプラスミドは、裸であってもよく、又は送達システムにパッケージングされうる。適切な送達システムは、すべて当技術分野において周知の、脂質小胞、ｉｓｃｏｍ、ｄｅｎｄｒｏｍｅｒ、ｎｉｏｓｏｍｅ、多糖マトリックス等（さらに下記参照）である。上述したような、サルモネラ属菌種などの弱毒化生菌及びヘルペスウイルスなどの弱毒化生ウイルスも送達システムとして非常に適する。

この実施態様のさらなる他の形態は、本発明に従った組換えＤＮＡ分子を含むワクチンに関する。

ＤＮＡワクチンは、例えば無針注射器を使用することなどの皮内適用を通して容易に投与することができる。この投与方法は、ワクチン接種する動物の細胞内にＤＮＡを直接送達する。１０ｐｇから１０００μｇの範囲内のＤＮＡの量が良好な結果を与える。好ましくは、１から１００μｇのマイクログラム範囲内の量を使用する。

さらなる実施態様では、本発明に従ったワクチンは、ブタの病原体及びウイルスに由来する１個以上の抗原、それらの抗原に対する抗体又はそのような抗原をコードする遺伝情報を付加的に含む。

言うまでもなく、そのような抗原は、例えば他のＢｒａｃｈｙｓｐｉｒａｈｙｏｄｙｓｅｎｔｅｒｉａｅでありうる。また、別のブタ病原体又はウイルスから選択される抗原でもよい。そのような病原体及びウイルスは、好ましくは仮性狂犬病ウイルス、ブタインフルエンザウイルス、ブタパルボウイルス、ブタ伝染性胃腸炎ウイルス、ロタウイルス、大腸菌、ブタ丹毒菌（Ｅｒｙｓｉｐｅｌｏｒｈｕｓｉｏｐａｔｈｉａｅ）、気管支敗血症菌（Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａｂｒｏｎｃｈｉｓｅｐｔｉｃａ）、ブタコレラ菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａｃｈｏｌｅｒａｓｕｉｓ）、Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓｐａｒａｓｕｉｓ、Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａｍｕｌｔｏｃｉｄａ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓｓｕｉｓ、Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａｈｙｏｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ及びＡｃｔｉｎｏｂａｃｉｌｌｕｓｐｌｅｕｒｏｐｎｅｕｍｏｎｉａｅの群から選択される。

６１ｋＤ及び／又は２０ｋＤＢｒａｃｈｙｓｐｉｒａｈｙｏｄｙｓｅｎｔｅｒｉａｅリポタンパク質に基づくワクチンはまた、マーカーワクチンとして非常に適する。マーカーワクチンは、例えば野生型感染によって誘発される抗体パネルとは異なる、特徴的な抗体パネルに基づいて、ワクチン接種ブタと圃場感染ブタを識別することを可能にするワクチンである。異なる抗体パネルは、例えば野生型細菌上に存在する免疫原性タンパク質がワクチン中に存在しないときに誘発される：その場合宿主は、ワクチン接種後、そのタンパク質に対する抗体を産生しない。それ故、本発明に従った６１ｋＤ及び／又は２０ｋＤＢｒａｃｈｙｓｐｉｒａｈｙｏｄｙｓｅｎｔｅｒｉａｅリポタンパク質に基づくワクチンは６１ｋＤ及び／又は２０ｋＤリポタンパク質に対する抗体だけを誘発し、一方、生野生型、生弱毒化又は不活性化全Ｂｒａｃｈｙｓｐｉｒａｈｙｏｄｙｓｅｎｔｅｒｉａｅに基づくワクチンはすべて又は大部分の細菌タンパク質に対する抗体を誘発する。

例えば精製組換え核タンパク質を含むウエルと精製６１ｋＤ及び／又は２０ｋＤＢｒａｃｈｙｓｐｉｒａｈｙｏｄｙｓｅｎｔｅｒｉａｅリポタンパク質だけを含むウエルを備える簡単なＥＬＩＳＡ試験は、ブタからの血清を試験し、そのブタが６１ｋＤ及び／又は２０ｋＤリポタンパク質ワクチンを接種されているか又はＢｒａｃｈｙｓｐｉｒａに圃場感染しているかを明らかにするのに十分である。

本発明に従ったすべてのワクチンは、医薬適合性の担体を含む。医薬適合性の担体は、例えば滅菌水又は滅菌生理食塩水でありうる。より複雑な形態では、前記担体は、例えば緩衝液でありうる。

ワクチンの製造のための方法は、本発明に従ったタンパク質又はその免疫原性フラグメント、及び／又は前記タンパク質又はその免疫原性フラグメントに対する抗体、本発明に従った核酸配列及び／又はＤＮＡフラグメント、組換えＤＮＡ分子、生組換え担体又は宿主細胞と、医薬適合性の担体を混合することを含む。

本発明に従ったワクチンは、好ましい形態では、免疫刺激性物質、いわゆるアジュバントも含みうる。一般にアジュバントは、非特異的に宿主の免疫応答を促進する物質を含む。いくつもの異なるアジュバントが当技術分野で知られている。ブタワクチンにおいてしばしば使用されるアジュバントの例は、ムラミルジペプチド、リポ多糖、いくつかのグルカン及びグリカン、及びＣａｒｂｏｐｏｌ（登録商標）（ホモポリマー）である。

前記ワクチンはまた、いわゆる「ビヒクル」も含みうる。ビヒクルとは、タンパク質が、それに共有結合することなく付着する化合物である。そのようなビヒクルは、中でも特に、すべて当技術分野で周知の、バイオマイクロカプセル、ミクロアルギネート、リポソーム及びマクロゾルである。

抗原が部分的にビヒクルに包埋されている、そのようなビヒクルの特殊な形態が、いわゆるＩＳＣＯＭ（欧州特許第１０９．９４２号、欧州特許第１８０．５６４号、欧州特許第２４２．３８０号）である。さらに、ビヒクルは１個以上の表面活性化合物又は乳化剤、例えばＳｐａｎ又はＴｗｅｅｎを含みうる。

しばしば、ワクチンは、例えば分解しやすいタンパク質を分解から保護するため、ワクチンの貯蔵寿命を高めるため、又は凍結乾燥効率を改善するために、安定剤と混合される。有用な安定剤は、中でも特に、ＳＰＧＡ（Ｂｏｖａｒｎｉｋら；Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ５９：５０９（１９５０））、糖質、例えばソルビトール、マンニトール、トレハロース、デンプン、スクロース、デキストラン又はグルコース、アルブミン又はカゼイン又はその分解産物などのタンパク質、及びアルカリ金属リン酸塩などの緩衝剤である。さらに、ワクチンは生理的に許容される希釈剤に懸濁しうる。

免疫増強、ビヒクル化合物又は希釈剤の添加、タンパク質の乳化又は安定化の他の方法も本発明に包含されることは言うまでもない。

本発明に従ったタンパク質又はその免疫原性フラグメントに基づく、本発明に従ったワクチンは、動物当たりタンパク質１から１００μｇの範囲の量で非常に適切に投与することができるが、より低い量は原則として使用できる。１００μｇを越える用量は、免疫学的には非常に適切であるが、商業的理由からあまり魅力的ではない。

上述したＬＲＣウイルス及び細菌などの生弱毒化組換え担体に基づくワクチンは、感染の間にそれら自体で増殖するので、はるかに低い用量で投与することができる。それ故、非常に適切な量は、それぞれ細菌及びウイルスについて１０^３から１０^９ＣＦＵ／ＰＦＵの範囲である。

本発明に従ったワクチンは、例えば皮内、皮下、筋肉内、腹腔内、静脈内経路、あるいは経口又は鼻内経路などの粘膜表面で投与することができる。

疾患に対する有効な防御のためには、Ｂｒａｃｈｙｓｐｉｒａ感染の迅速で正確な診断が重要である。

それ故、Ｂｒａｃｈｙｓｐｉｒａ感染の検出に適する診断ツールを提供することが本発明のもう１つの目的である。

本発明に従った核酸配列、タンパク質及び抗体はまた、診断における使用にも適する。

それ故、本発明のもう１つの実施態様は、診断における使用のための本発明に従った核酸配列、タンパク質及び抗体に関する。

本発明に従った核酸配列又はそのフラグメントは、ブタにおいてＢｒａｃｈｙｓｐｉｒａの存在を検出するために使用できる。Ｂｒａｃｈｙｓｐｉｒａに感染したブタから採取した試料は、本発明に従ったタンパク質をコードする核酸配列を含む、前記細菌に由来する核酸物質を含む。これらの核酸配列は本発明に従った核酸配列とハイブリダイズする。本発明の核酸配列と反応性である核酸配列の検出のための適切な方法は、ＰＣＲ手法及びＮＡＳＢＡ手法を含むがこれらに限定されないハイブリダイゼーション手法を包含する。そこで、本発明に従った核酸配列、特に配列番号１及び／又は配列番号３に記載の配列を使用して、ＰＣＲ及び／又はＮＡＳＢＡ手法において使用するためのプローブ及びプライマーを作製することができる。

Ｂｒａｃｈｙｓｐｉｒａｈｙｏｄｙｓｅｎｔｅｒｉａｅの検出のための診断試験キットは、例えば、試験するブタから単離した細菌核酸とそれらのツールとの反応を可能にするツールを含みうる。そのようなツールは、例えば、本発明に従った核酸配列に基づく、プライマーフラグメントとも称される特異的プローブ又は（ＰＣＲ）プライマーである。Ｂ．ｈｙｏｄｙｓｅｎｔｅｒｉａｅの遺伝物質がその動物中に存在する場合、これは、例えば特異的ＰＣＲプライマーに特異的に結合し、例えばｃＤＮＡ合成後、ＰＣＲ反応においてその後増幅される。次に、そのＰＣＲ反応産物をＤＮＡゲル電気泳動において容易に検出することができる。

標準ＰＣＲ教本は、ＢｒａｃｈｙｓｐｉｒａｈｙｏｄｙｓｅｎｔｅｒｉａｅＤＮＡに関する選択的ＰＣＲ反応のためのプライマーの長さを決定する方法を教示する。少なくとも１２ヌクレオチドのヌクレオチド配列を有するプライマーフラグメントがしばしば使用されるが、１５ヌクレオチド以上、より好ましくは１８ヌクレオチド以上のプライマーは幾分より選択である。特に、少なくとも２０、好ましくは少なくとも３０ヌクレオチドの長さを有するプライマーが非常に一般的に適用されうる。ＰＣＲ手法は、Ｄｉｅｆｆｅｎｂａｃｈ＆Ｄｒｅｋｓｌｅｒ；ＰＣＲｐｒｉｍｅｒｓ，ａｌａｂｏｒａｔｏｒｙｍａｎｕａｌ．ＩＳＢＮ０−８７９６９−４４７−５（１９９５）に広く記述されている。

核酸配列又はその部分が配列番号１及び／又は配列番号３に記載の核酸配列と少なくとも７０％の相同性を有する、本発明に従った核酸配列あるいは少なくとも１２、好ましくは１５、より好ましくは１８、さらに一層好ましくは、好ましい順に２０、２２、２５、３０、３５又は４０ヌクレオチドの長さを有するそれらの核酸配列のプライマーも、それ故、本発明の一部である。プライマーは、少なくとも１２ヌクレオチドの長さ及び配列番号１又は配列番号３に記載の核酸配列と少なくとも７０％、より好ましくは、好ましい順に８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％又はさらに１００％の相同性を有することが了解される。そのような核酸配列は、それらがコードするＤＮＡの量を高めるためのＰＣＲ反応において又はハイブリダイゼーション反応において、プライマーフラグメントとして使用することができる。これは、迅速な増幅及び、例えば上述したＢｒａｃｈｙｓｐｉｒａｈｙｏｄｙｓｅｎｔｅｒｉａｅの検出のための診断ツールとして使用するための特定ヌクレオチド配列のブロットでの検出を可能にする。

遺伝物質に関するもう１つの試験は、例えば綿棒から採取した遺伝物質の増殖、次に古典的ＤＮＡ精製、及びそれに続く放射性又は色標識プライマーフラグメントとの古典的ハイブリダイゼーションに基づく。色標識及び放射性標識フラグメントは一般に検出手段と呼ばれる。ＰＣＲ反応及びハイブリダイゼーション反応の両方が当技術分野において周知であり、中でも特に、Ｍａｎｉａｔｉｓ／Ｓａｍｂｒｏｏｋ（Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．ら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒｃｌｏｎｉｎｇ：ａｌａｂｏｒａｔｏｒｙｍａｎｕａｌ．ＩＳＢＮ０−８７９６９−３０９−６）に述べられている。

そこで、本発明の１つの実施態様は、Ｂｒａｃｈｙｓｐｉｒａｈｙｏｄｙｓｅｎｔｅｒｉａｅ核酸配列の検出のための診断試験キットに関する。そのような試験は、本発明に従った核酸配列又はそのプライマーフラグメントを含む。

特異的Ｂｒａｃｈｙｓｐｉｒａｈｙｏｄｙｓｅｎｔｅｒｉａｅの６１ｋＤ及び／又は２０ｋＤリポタンパク質の抗原物質の検出に基づく、及びそれ故Ｂｒａｃｈｙｓｐｉｒａｈｙｏｄｙｓｅｎｔｅｒｉａｅ感染の検出に適する診断試験キットは、中でも特に、標準ＥＬＩＳＡ試験を含みうる。そのような試験の一例では、ＥＬＩＳＡプレートのウエルの壁を前記６１ｋＤ及び／又は２０ｋＤリポタンパク質に対する抗体で被覆する。試験物質と共にインキュベートした後、標識抗Ｂｒａｃｈｙｓｐｉｒａｈｙｏｄｙｓｅｎｔｅｒｉａｅ抗体をウエルに加える。その後、呈色反応によってＢｒａｃｈｙｓｐｉｒａｈｙｏｄｙｓｅｎｔｅｒｉａｅからの抗原物質の存在を明らかにする。

それ故、本発明のさらにもう１つの実施態様は、Ｂｒａｃｈｙｓｐｉｒａｈｙｏｄｙｓｅｎｔｅｒｉａｅの抗原物質の検出のための診断試験キットに関する。そのような試験キットは、本発明に従った６１ｋＤ及び／又は２０ｋＤリポタンパク質又はそのフラグメントに対する抗体を含む。

血清におけるＢｒａｃｈｙｓｐｉｒａｈｙｏｄｙｓｅｎｔｅｒｉａｅの６１ｋＤ及び／又は２０ｋＤリポタンパク質に対する抗体の検出に基づく、及びそれ故Ｂｒａｃｈｙｓｐｉｒａｈｙｏｄｙｓｅｎｔｅｒｉａｅ感染の検出に適する診断試験キットは、中でも特に、標準ＥＬＩＳＡ試験を含みうる。そのような試験では、例えばＥＬＩＳＡプレートのウエルの壁を前記６１ｋＤ又は２０ｋＤリポタンパク質で被覆することができる。試験物質と共にインキュベートした後、標識抗６１ｋＤ又は２０ｋＤ抗体をウエルに加える。その後、呈色反応がないことはＢｒａｃｈｙｓｐｉｒａｈｙｏｄｙｓｅｎｔｅｒｉａｅに対する抗体の存在を明らかにする。

それ故、本発明のさらにもう１つの実施態様は、Ｂｒａｃｈｙｓｐｉｒａｈｙｏｄｙｓｅｎｔｅｒｉａｅに対する抗体の検出のための診断試験キットに関する。そのような試験キットは、本発明に従った６１ｋＤ及び／又は２０ｋＤのＢｒａｃｈｙｓｐｉｒａｈｙｏｄｙｓｅｎｔｅｒｉａｅリポタンパク質又はそのフラグメントを含む。

免疫測定法のデザインは変化させうる。例えば、免疫測定法は競合又は直接反応に基づきうる。さらに、プロトコールは、固体保持体又は細胞物質を使用しうる。抗体−抗原複合体の検出は標識抗体の使用を含みうる；前記標識は、例えば酵素、蛍光分子、化学発光分子、放射性分子又は染料分子でありうる。

試料中の、本発明に従ったタンパク質と反応性の抗体の検出のための適切な方法は、酵素結合イムノソルベント検定法（ＥＬＩＳＡ）、免疫蛍光試験（ＩＦＴ）及びウエスタンブロット分析を包含する。

例えば上述したように発現される、本発明に従ったタンパク質又はその免疫原性フラグメントは、ポリクローナル、単一特異性又はモノクローナル（又はその誘導体）でありうる、抗体を作製するために使用できる。ポリクローナル抗体を所望する場合、ポリクローナル血清を生産し、処理するための手法は当技術分野において周知である（例えばＭａｙｅｒとＷａｌｔｅｒ編集、ＩｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌＭｅｔｈｏｄｓｉｎＣｅｌｌａｎｄＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ，ＡｃａｄｅｍｉｃＰｒｅｓｓ，Ｌｏｎｄｏｎ，１９８７）。

本発明に従ったタンパク質又は本発明に従ったその免疫原性フラグメントに対して反応性のモノクローナル抗体は、やはり当技術分野で既知の手法により（ＫｏｈｌｅｒとＭｉｌｓｔｅｉｎ，Ｎａｔｕｒｅ，２５６，４９５−４９７，１９７５）、近交系マウスを免疫することによって作製できる。

細菌株及び培地。Ｂ．ｈｙｏｄｙｓｅｎｔｅｒｉａｅＢ２０４^Ｔを本試験において使用した。０．１％酵母抽出物を加えた５％脱線維素ウマ血液を含むトリプチケースソイ寒天で、嫌気的に３７℃で４８時間Ｂｒａｃｈｙｓｐｉｒａを増殖させた。Ｂ．ｈｙｏｄｙｓｅｎｔｅｒｉａｅのブロス培養はＷａｎｎｅｍｕｅｈｌｅｒら（Ｗａｎｎｅｍｕｅｈｌｅｒ，Ｍ．Ｊ．，Ｒ．Ｄ．Ｈｕｂｂａｒｄ及びＪ．Ｍ．Ｇｒｅｅｒ．１９８８．ＣｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎｏｆｔｈｅｍａｊｏｒｏｕｔｅｒｍｅｍｂｒａｎｅａｎｔｉｇｅｎｓｏｆＴｒｅｐｏｎｅｍａｈｙｏｄｙｓｅｎｔｅｒｉａｅ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．５６：３０３２−３０３９）が述べたように調製した。大腸菌ＤＨ５αをクローニング及び遺伝子ライブラリーの構築のために使用した。ブルーハロ表現型についてのプラスミドインサートを調べるために大腸菌ＫＳＳ３３０ｒ⁻［Ｆ⁻Δ（ａｒａ−ｌｅｕ）７６９７ｇａｌＥｇａｌＫ ΔｌａｃＸ７４ｒｐｓＬ（Ｓｔｒ^ｒ）ｄｅｇＰ４：：Ｔｎ５Ｉｐｐ５５０８］（Ｓｔｒａｕｃｈ，Ｋ．Ｌ．とＪ．Ｂｅｃｋｗｉｔｈ．１９８８，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８５：１５７６−１５８０）を使用した。大腸菌株は、Ｌｕｒｉａ−Ｂｅｒｔａｎｉ（ＬＢ）ブロス中又は１．５％ＬＢ寒天上で、３７℃で一晩培養した。

ＤＮＡ操作。Ｂ．ｈｙｏｄｙｓｅｎｔｅｒｉａｅからの染色体ＤＮＡは、臭化セチルトリメチルアンモニウム沈殿法（Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ａ．，Ｒ．Ｂｒｅｎｔ，Ｒ．Ｅ．Ｋｉｎｇｓｔｏｎ，Ｄ．Ｄ．Ｍｏｏｒｅ，Ｊ．Ｇ．Ｓｅｉｄｍａｎ，Ｊ．Ａ．Ｓｍｉｔｈ及びＫ．Ｓｔｒｕｈｌ．１９９１、Ｃｕｒｒｅｎｔｐｒｏｔｏｃｏｌｓｉｎｍｏｌｅｃｕｌａｒｂｉｏｌｏｇｙ．ＧｒｅｅｎｅＰｕｂｌｉｓｈｉｎｇａｎｄＷｉｌｅｙＩｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，ＮｅｗＹｏｒｋ）を用いて作製し、プラスミドＤＮＡは、ＢｉｒｎｂｏｉｍとＤｏｌｙ（Ｂｉｒｎｂｏｉｍ，Ｈ．Ｃ．とＪ．Ｄｏｌｙ．１９７９，ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓ．７：１５１３−１５２３）が述べたように単離した。

分子生物学における標準方法は、基本的にＳａｍｂｒｏｏｋら（Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．，Ｅ．Ｆ．Ｆｒｉｔｓｃｈ及びＴ．Ｍａｎｉａｔｉｓ．１９８９、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒｃｌｏｎｉｎｇ：ａｌａｂｏｒａｔｏｒｙｍａｎｕａｌ．ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｕｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙＰｒｅｓｓ，ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｕｒ，Ｎ．Ｙ．）が述べたように実施した。ヌクレオチド配列決定は、ｔｈｅＢｉｇＤｙｅＤｙｅＤｅｏｘｙＴｅｒｍｉｎａｔｏｒサイクルシーケンシングキット（ＴｈｅＰｅｒｋｉｎ−ＥｌｍｅｒＣｏｒｐ．，Ｎｏｒｗａｌｋ，ＣＮ．）及びＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓＩｎｃ．３７３Ａ自動シーケンサーを用いて実施した。

ブルーハロアッセイ。シグナルペプチド欠損アルカリホスファターゼベクターｐＭＧを使用してＢ．ｈｙｏｄｙｓｅｎｔｅｒｉａｅのゲノムライブラリーを構築し、先に述べられているように分析した（Ｂｌａｎｃｏ，Ｄ．Ｒ．，Ｍ．Ｇｉｌａｄｉ，Ｃ．Ｉ．Ｃｈａｍｐｉｏｎ，Ｄ．Ａ．Ｈａａｋｅ，Ｇ．Ｋ．Ｃｈｉｋａｍｉ，Ｊ．Ｎ．Ｍｉｌｌｅｒ及びＭ．Ａ．Ｌｏｖｅｔｔ．１９９１，Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．５：２４０５−２４１５）、（Ｇｉｌａｄｉ，Ｍ．，Ｃｈａｍｐｉｏｎ，Ｃ．Ｉ．，Ｈａａｋｅ，Ｄ．Ａ．，Ｂｌａｎｃｏ，Ｄ．Ｒ．，Ｍｉｌｌｅｒ，Ｊ．Ｆ．及びＬｏｖｅｔｔ，Ｍ．Ａ．（１９９３）．Ｕｓｅｏｆｔｈｅ「ｂｌｕｅｈａｌｏ」ａｓｓａｙｉｎｔｈｅｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆｇｅｎｅｓｅｎｃｏｄｉｎｇｅｘｐｏｒｔｅｄｐｒｏｔｅｉｎｓｗｉｔｈｃｌｅａｖａｂｌｅｓｉｇｎａｌｐｅｐｔｉｄｅｓ：ＣｌｏｎｉｎｇｏｆａＢｏｒｒｅｌｉａｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉｇｅｎｅｗｉｔｈａｓｉｇｎａｌｐｅｐｔｉｄｅ．ＪｏｕｒｎａｌｏｆＢａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ１７５，４１２９−４１３６）。

ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩＳＫにおけるゲノムライブラリーの構築。

Ｂ．ｈｙｏｄｙｓｅｎｔｅｒｉａｅ菌株Ｂ２０４からの染色体ＤＮＡを標準方法によって単離し、製造者の指示に従ってＨｉｎｄＩＩＩで消化した。フェノール抽出とエタノール沈殿によって制限酵素を除去した。消化した染色体ＤＮＡ５μｇをＨｉｎｄＩＩＩ消化したｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩＳＫ（ＳｔｒａｔａｇｅｎｅＣｏ．）０．１μｇと混合した。この混合物にＴ４ＤＮＡリガーゼ（Ｇｉｂｃｏ−ＢＲＬ）５単位を加え、１４℃で１８時間インキュベートした。大腸菌株ＤＨ５αをコンピテントにし（Ｈａｎａｈａｎ）、連結混合物１０μｌで形質転換して、ＬｕｒｉａＢｅｒｔａｎｉブロス中３７℃で１時間回収した後、その混合物を、アンピシリン１００μｇ／ｍｌを加えたＬｕｒｉａＢｅｒｔａｎｉ平板に植え付けた。合計＞４０００コロニーを得た。得られたＨｉｎｄＩＩＩライブラリーからの合計４０００コロニーを、アンピシリン１００μｇ／ｍｌを加えたＬＢ平板に植え付け、３７℃で１８時間増殖させた。コロニーをニトロセルロースフィルター上に置き、クロロホルム蒸気中で固定して、その後標準方法（Ｓａｍｂｒｏｏｋら）を用いてＳＤＳで溶解した。得られたフィルターを、Ｂ．ｈｙｏｄｙｓｅｎｔｅｒｉａｅ感染したブタからの血清と共にインキュベートした。そのコロニーブロットをウサギ抗ブタアルカリホスファターゼ複合二次抗体で展開した。回復期血清と反応するコロニーを精製し、アンピシリン１００μｇ／ｍｌを加えたＬＢ培地で増殖させた培養物からプラスミドＤＮＡを抽出した。

クローンＨＢＡ３は、１．８ｋｂＨｉｎｄＩＩＩインサートを含むことを示し、そのインサートから配列を決定した。ＢｌｐＢ（配列番号２）と称するリポタンパク質をコードする１６１４ｂｐのＯＲＦ（配列番号１）を特定した。そのリポタンパク質は６０．８ｋＤの算定分子量を有する。

ブルーハロライブラリーの構築とスクリーニング
シグナルペプチド欠損アルカリホスファターゼベクターｐＭＧ（Ｇｉｌａｄｉら、１９９３）を使用してＢ．ｈｙｏｄｙｓｅｎｔｅｒｉａｅ（Ｂ２０４）のゲノムライブラリーを構築した。ｐＭＧ１ｃ、２．７及び３．２９ベクターの混合物を、３つの読み枠すべてにおいてクローニングを可能にするためにＳｍａＩで消化した。ゲノムＤＮＡのアリコートをＡｌｕＩ及びＲｓａＩで完全に消化し、アルカリホスファターゼ処理したベクターに連結した。

エレクトロコンピテント大腸菌ＤＨ５α細胞を連結混合物で形質転換し、振とうしながら３７℃で１時間インキュベートして発現させ、その後アンピシリン、１ｍＭＩＰＴＧ及び４０μｇ／ｍｌＸＰ（５−ブロモ−４−クロロ−３−インドイルホスフェート）を含むＬＢ寒天に接種して、膜及び核外輸送タンパク質を部分的にコードするインサートを含む、青色コロニーを特定した。約１７００個の組換え体を得、そのうち２３個が青色表現型を示した。２３個の青色コロニーからのプラスミドＤＮＡを大腸菌ＫＳＳ３３０ｒ⁻に形質転換し、１ｍＭＩＰＴＧ及び２００μｇ／ｍｌＸＰ培地に接種して、ブルーハロ表現型を発現する５個のコロニーを生じた。ブルーハロ表現型を発現するコロニーからプラスミドＤＮＡを単離し、プラスミドインサートの大きさを決定するために、ポリリンカーに隣接するベクタープライマーによるＰＣＲにおける鋳型として使用した。得られたプラスミド上のベクタープライマーの１個に関する配列分析により、ｂｌｐＣ遺伝子の５’末端を得た。遺伝子配列の残りの部分はＳＳＰ−ＰＣＲ（Ｓｈｙａｍａｌａ＆Ａｍｅｓ，Ｇｅｎｅ８４，１−８，１９８９）によって得た。ＢｌｐＣ（配列番号４）と称するリポタンパク質をコードする５３７ｂｐのＯＲＦ（配列番号３）を特定した。そのリポタンパク質は２０ｋＤの算定分子量を有する。

大腸菌におけるＢｌｐＢ及びＢｌｐＣの発現
最終産物中にユニーク制限エンドヌクレアーゼ部位を導入するために設計されたプライマーを用いて、成熟長タンパク質ＢｌｐＢ及びＢｌｐＣをコードする遺伝子をＰＣＲによって増幅した。５’プライマーはＮｄｅＩ部位又はＢａｍＨ１部位のいずれかを含む。３’プライマーはＢａｍＨＩ部位又はＮｄｅＩ部位を含む。ＰＣＲ産物のアリコートをアガロースゲルで視覚化し、残りの部分を製造者の指示に従ってＢａｍＨＩ（Ｒｏｃｈｅ）及び／又はＮｄｅＩ（Ｒｏｃｈｅ）で消化した。制限エンドヌクレアーゼをフェノール抽出によって不活性化し、消化したＰＣＲ産物をエタノール沈殿によって精製した。ｐＥＴ−１５ｂベクターを消化し、ＰＣＲ産物と同様に精製して、アルカリホスファターゼで処理した。消化したＰＣＲ産物１５０μｇを、製造者の指示に従ってＴ４ＤＮＡリガーゼ（Ｒｏｃｈｅ）を用いて、消化したｐＥＴ１５ｂ８０ｎｇに連結した。連結産物を大腸菌ＤＨ５αに形質転換した。単一インサートを含むクローンを、ベクター：５’−ＴＡＡ−ＴＡＣ−ＧＡＣ−ＴＣＡ−ＣＴＡ−ＴＡＧ−Ｇ−３’及び５’−ＧＧＡ−ＡＡＣ−ＡＧＣ−ＴＡＴ−ＧＡＣ−ＣＡＴ−Ｇ−３’のマルチクローニングサイトに隣接するように設計されたプライマーによるコロニーＰＣＲを用いて特定した。各々の連結について、それらのクローンの１個のインサートを二本鎖ＤＮＡ塩基配列決定によって調べた。プラスミドＤＮＡを陽性クローンから単離し、発現のために大腸菌株ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳに形質転換した。組換えタンパク質の発現を調べるために、発現クローンの誘導培養物の全細胞溶解産物を、インサートを含まない、ｐＥＴ１５ｂプラスミドを内包する発現菌株と比較した。全細胞溶解産物をＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分離し（先に述べたように）、クマシーブリリアントブルー（ＣＢＢ）で染色した。ＢｌｐＢを除いて、すべての組換えタンパク質の予想分子量に相当するバンドを認めた。ｂｌｐＢ．ｐＥＴ１５ｂ構築物のＣｏｄｏｎＰｌｕｓＲＩＬ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）菌株への形質転換により、その分子量に相当するバンドも認められた。

組換えＢｌｐｓの回復期血清との反応
前記組換えタンパク質が回復期血清によって認識されるかどうかを調べるために、ＢｌｐＢ及びＢｌｐＣを発現するクローンの誘導培養物の全細胞溶解産物を、インサートを含まない、ｐＥＴ１５ｂプラスミドを内包する発現菌株と共にＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分離した。次にタンパク質を、Ｔｒａｎｓ−Ｂｌｏｔ（登録商標）ＥｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｔｉｃｔｒａｎｓｆｅｒＣｅｌｌ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）により、製造者の指示に従って１００Ｖで１時間、Ｉｍｍｏｂｉｌｏｎ−Ｐ膜（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）に移した。タンパク質の転移後、膜を５％脱脂乳緩衝液［ＴＢＳ−Ｔｗｅｅｎ２０（０．１５ＭＮａＣｌ、０．０５ＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．４、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０）中５％（ｗ／ｖ）脱脂粉乳］に１時間浸して遮断した。Ｂ．ｈｙｏｄｙｓｅｎｔｅｒｉａｅに感染したブタから得た血清を脱脂乳緩衝液中で１／１００に希釈し、一晩インキュベートした。ＴＢＳ−Ｔｗｅｅｎ中で５分間ずつ３回洗った後、二次抗体［ホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰＯ）複合ウサギ抗ブタＩｇＧ（Ｓｉｇｍａ）の１／４００希釈］と共に膜をインキュベートした。前記二次抗体を脱脂乳緩衝液中で希釈し、振とうしながら膜と共に３７℃で２時間インキュベートして、その後上記のように５分間ずつ３回洗い、さらに最後に５分間ＴＢＳ中で洗った。ＨＲＯＰ基質［４−クロロ−１−ナフトール（Ｍｅｒｃｋ）、１００％メタノール、３０％（ｗ／ｖ）Ｈ_２Ｏ_２ＴＢＳ］を用いて膜を展開した。

ＢｌｐＢ及びＢｌｐＣの予想分子量に相当するバンドが、それらのそれぞれの発現クローンの各々について認められた（図１）。

組換えＢｌｐｓに対する抗血清の生産
組換えＢｌｐＣを発現する菌株の培養物を６００ｎｍで０．６の光学密度に増殖させ、１０ｍＭイソプロピルチオ−β−Ｄ−ガラクトシド（ＩＰＴＧ；Ｓｉｇｍａ）で４時間誘導した。フレンチプレス細胞破砕機を用いて培養物を溶解し、Ｔａｌｏｎ樹脂（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）を製造者の指示に従って使用して、固定化金属親和性クロマトグラフィー（ＩＭＡＣ）によって組換えタンパク質を精製した。カラム溶出液をプールし、リン酸緩衝食塩水に対して一晩透析して、Ｃｅｎｔｉｃｏｎ−１０（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）濃縮器を用いて０．５ｍＬ容量に濃縮した。試料の濃度をＢｒａｄｆｏｒｄアッセイによって測定した。フロイント不完全アジュバントを前記組換えタンパク質の各々１００μｇと等容量で混合した。２匹のニュージーランド白色ウサギに精製組換えタンパク質５０μｇを皮下注射した。４週間後、前記ウサギにさらなる精製組換えタンパク質５０μｇを皮内注射した。さらに１週間後、ウサギを心臓穿刺によって放血致死させた。ウサギ抗血清は、１／２０００希釈でウエスタンブロット実験において組換えタンパク質と反応することを示した。

ブタ血清（１／１００希釈）と反応性の誘導ｂｌｐＢ及びｂｌｐＣ発現クローンからの全細胞溶解産物のウエスタンブロット。

【配列表】

Claims

配列番号１に記載のＢｒａｃｈｙｓｐｉｒａｈｙｏｄｙｓｅｎｔｅｒｉａｅリポタンパク質遺伝子の核酸配列と少なくとも７０％の相同性を有する、６１ｋＤのＢｒａｃｈｙｓｐｉｒａｈｙｏｄｙｓｅｎｔｅｒｉａｅリポタンパク質をコードする核酸配列又は前記リポタンパク質の免疫原性フラグメントをコードする前記核酸配列の部分。
配列番号１に記載のＢｒａｃｈｙｓｐｉｒａｈｙｏｄｙｓｅｎｔｅｒｉａｅリポタンパク質遺伝子の核酸配列と少なくとも８０％、好ましくは９０％、より好ましくは９５％の相同性を有することを特徴とする、請求項１に記載の核酸配列又はその部分。
配列番号３に記載のＢｒａｃｈｙｓｐｉｒａｈｙｏｄｙｓｅｎｔｅｒｉａｅリポタンパク質遺伝子の核酸配列と少なくとも７０％の相同性を有する、２０ｋＤのＢｒａｃｈｙｓｐｉｒａｈｙｏｄｙｓｅｎｔｅｒｉａｅリポタンパク質をコードする核酸配列又は前記リポタンパク質の免疫原性フラグメントをコードする前記核酸配列の部分。
配列番号３に記載のＢｒａｃｈｙｓｐｉｒａｈｙｏｄｙｓｅｎｔｅｒｉａｅリポタンパク質遺伝子の核酸配列と少なくとも８０％、好ましくは９０％、より好ましくは９５％の相同性を有することを特徴とする、請求項３に記載の核酸配列又はその部分。
請求項１から４の記載の核酸配列を含むＤＮＡフラグメント。
機能的に連結されたプロモーターの制御下で、請求項１から４に記載の核酸配列又は請求項５に記載のＤＮＡフラグメントを含む組換えＤＮＡ分子。
請求項１から４に記載の核酸配列、請求項５に記載のＤＮＡフラグメント又は請求項６に記載の組換えＤＮＡ分子を含む生組換え担体。
請求項１から４に記載の核酸配列、請求項５に記載のＤＮＡフラグメント、請求項６に記載の組換えＤＮＡ分子又は請求項７に記載の生組換え担体を含む宿主細胞。
配列番号２に記載のアミノ酸配列と少なくとも７０％のアミノ酸配列相同性を有する、６１ｋＤのＢｒａｃｈｙｓｐｉｒａｈｙｏｄｙｓｅｎｔｅｒｉａｅリポタンパク質又は前記リポタンパク質の免疫原性フラグメント。
配列番号２に記載のアミノ酸配列と少なくとも８０％、好ましくは９０％、より好ましくは９５％のアミノ酸配列相同性を有する、請求項９に記載の、６１ｋＤのＢｒａｃｈｙｓｐｉｒａｈｙｏｄｙｓｅｎｔｅｒｉａｅリポタンパク質又は前記リポタンパク質の免疫原性フラグメント。
請求項１又は２に記載の核酸配列によってコードされることを特徴とする、６１ｋＤのＢｒａｃｈｙｓｐｉｒａｈｙｏｄｙｓｅｎｔｅｒｉａｅリポタンパク質又はその免疫原性フラグメント。
配列番号４に記載のアミノ酸配列と少なくとも７０％のアミノ酸配列相同性を有する、２０ｋＤのＢｒａｃｈｙｓｐｉｒａｈｙｏｄｙｓｅｎｔｅｒｉａｅリポタンパク質又は前記リポタンパク質の免疫原性フラグメント。
配列番号４に記載のアミノ酸配列と少なくとも８０％、好ましくは９０％、より好ましくは９５％のアミノ酸配列相同性を有する、請求項１２に記載の、２０ｋＤのＢｒａｃｈｙｓｐｉｒａｈｙｏｄｙｓｅｎｔｅｒｉａｅリポタンパク質又は前記リポタンパク質の免疫原性フラグメント。
請求項３又は４に記載の核酸配列によってコードされることを特徴とする、２０ｋＤのＢｒａｃｈｙｓｐｉｒａｈｙｏｄｙｓｅｎｔｅｒｉａｅリポタンパク質又はその免疫原性フラグメント。
ワクチンにおける使用のための、請求項９から１１に記載の、６１ｋＤのＢｒａｃｈｙｓｐｉｒａｈｙｏｄｙｓｅｎｔｅｒｉａｅリポタンパク質又はその免疫原性フラグメント。
ワクチンにおける使用のための、請求項１２から１４に記載の、２０ｋＤのＢｒａｃｈｙｓｐｉｒａｈｙｏｄｙｓｅｎｔｅｒｉａｅリポタンパク質又はその免疫原性フラグメント。
Ｂｒａｃｈｙｓｐｉｒａｈｙｏｄｙｓｅｎｔｅｒｉａｅ感染を制御するためのワクチンの製造のための、請求項１から４に記載の核酸配列、請求項５に記載のＤＮＡフラグメント、請求項６に記載の組換えＤＮＡ分子、請求項７に記載の生組換え担体、請求項８に記載の宿主細胞又は請求項９から１４に記載のリポタンパク質又はその免疫原性フラグメントの使用。
請求項１から４に記載の核酸配列、請求項５に記載のＤＮＡフラグメント、請求項６に記載の組換えＤＮＡ分子、請求項７に記載の生組換え担体、請求項８に記載の宿主細胞又は請求項９から１４に記載のリポタンパク質又はその免疫原性フラグメント、及び医薬適合性の担体を含むことを特徴とする、Ｂｒａｃｈｙｓｐｉｒａｈｙｏｄｙｓｅｎｔｅｒｉａｅ感染を制御するためのワクチン。
請求項９から１４に記載のリポタンパク質又は前記リポタンパク質の免疫原性フラグメント、及び医薬適合性の担体を含むことを特徴とする、Ｂｒａｃｈｙｓｐｉｒａｈｙｏｄｙｓｅｎｔｅｒｉａｅ感染を制御するためのワクチン。
アジュバントを含むことを特徴とする、請求項１９に記載のワクチン。
ブタに対して病原性のウイルス又は微生物に由来する付加的な抗原、そのような抗原に対する抗体又は前記抗原をコードする遺伝情報を含むことを特徴とする、請求項１９又は２０に記載のワクチン。
前記のブタに対して病原性のウイルス又は微生物が、仮性狂犬病ウイルス、ブタインフルエンザウイルス、ブタパルボウイルス、ブタ伝染性胃腸炎ウイルス、ロタウイルス、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ）、ブタ丹毒菌（Ｅｒｙｓｉｐｅｌｏｒｈｕｓｉｏｐａｔｈｉａｅ）、気管支敗血症菌（Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａｂｒｏｎｃｈｉｓｅｐｔｉｃａ）、ブタコレラ菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａｃｈｏｌｅｒａｓｕｉｓ）、Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓｐａｒａｓｕｉｓ、Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａｍｕｌｔｏｃｉｄａ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓｓｕｉｓ、Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａｈｙｏｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ及びＡｃｔｉｎｏｂａｃｉｌｌｕｓｐｌｅｕｒｏｐｎｅｕｍｏｎｉａｅの群から選択されることを特徴とする、請求項２１に記載のワクチン。
請求項１から４に記載の核酸配列、請求項５に記載のＤＮＡフラグメント、請求項６に記載の組換えＤＮＡ分子、請求項７に記載の生組換え担体、請求項８に記載の宿主細胞、請求項９から１４に記載のリポタンパク質又は請求項９から１４に記載のリポタンパク質に対する抗体、及び医薬適合性の担体を混合することを含む、請求項１８−２２に記載のワクチンの製造のための方法。
適切な検出手段及び請求項１から４に記載の核酸配列又はそのプライマー、又は請求項９から１４に記載のリポタンパク質又はその免疫原性フラグメント、又は請求項９から１４に記載のリポタンパク質と反応性である抗体を含む診断キット。