ES2371498T3 - Bacterias gram negativas atenuadas. - Google Patents

Abstract

Mutante de una bacteria gram negativa, en el que dicha bacteria presenta una mutación en una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido que tiene una identidad que es igual o superior al 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, ó 99% con una secuencia de aminoácidos codificada por la secuencia de nucleótidos SEC ID No: 75, dando lugar dicha mutación a una virulencia atenuada de la bacteria, en el que la mutación es una inserción entre los nucleótidos 1072-1087 en la SEC ID No: 75.

Description

Bacterias gram negativas atenuadas

SOLICITUDES RELACIONADAS/INCORPORACIÓN POR REFERENCIA

[0001] Esta solicitud reivindica prioridad de la Solicitud Provisional de Serie No. No. 60/370,282, solicitada el 5 de abril de 2002.

CAMPO DE LA INVENCIÓN

[0002] La presente invención se refiere a bacterias gram negativas atenuadas vivas. Las bacterias gram negativas atenuadas se pueden utilizar en composiciones inmunogénicas o en composiciones de vacuna, por ejemplo, para la prevención de infecciones bacterianas, así como en investigación, como cepas atenuadas presentan un mayor grado de seguridad para los investigadores y para aquellos (por ejemplo, animales, humanos) con los que pueden entrar en contacto.

[0003] La presente invención por consiguiente se refiere a composiciones inmunogénicas o de vacuna que comprenden bacterias gram negativas de la invención; por ejemplo, bacterias gram negativas atenuadas vivas. Las bacterias también se podrían estar inactivadas en las composiciones; pero puede ser ventajoso que las bacterias sean bacterias gram negativas atenuadas vivas. Por lo tanto, la descripción se refiere además a métodos para preparar y/o formular dichas composiciones; por ejemplo, cultivar o desarrollar o propagar las bacterias en un medio adecuado, recoger las bacterias, inactivando opcionalmente las bacterias, y mezclar con un portador, excipiente, diluyente o vehículo veterinariamente o farmacéuticamente aceptable adecuado y/o un adyuvante y/o estabilizante; o, mezclar las bacterias don un portador, excipiente, diluyente o vehículo veterinariamente o farmacéuticamente aceptable adecuado y/o un adyuvante y/o estabilizante. De este modo, la descripción también se refiere a la utilización de las bacterias en la formulación de dichas composiciones.

[0004] Las bacterias atenuadas también pueden actuar como un vector de expresión o replicación, por ejemplo, para replicar y/o expresar una molécula de ácido nucleico heteróloga a las bacterias atenuadas, por ejemplo, una molécula de ácido nucleico que codifica un inmunógeno, antígeno o epítopo de un agente patogénico, tal como un agente patogénico que es diferente de la bacteria atenuada. La utilización de bacterias atenuadas como vector también proporciona un mayor grado de seguridad a los investigadores o técnicos que trabajan con los vectores atenuadas y aquellos (por ejemplo, animales, humanos) con los que pueden entrar en contacto.

[0005] Por lo tanto, la descripción se refiere además a métodos para preparar dichos vectores, por ejemplo, transformando las bacterias de manera que la bacteria contenga y opcionalmente comprende una molécula de ácido nucleico heteróloga.

[0006] La descripción también se refiere a las utilizaciones de dichos vectores; por ejemplo, un método para producir un producto génico, por ejemplo, un polipéptido, tal como un inmunógeno, epítopo o antígeno, heterólogo a las bacterias que comprende cultivar, desarrollar o propagar bacterias transformadas para contener expresar una molécula de ácido nucleico heteróloga que codifica el producto génico bajo condiciones adecuadas para la expresión, y opcionalmente recoger o aislar o separar el producto génico; o, recoger o aislar o separar el producto génico de las bacterias transformadas para expresarlo; o, un método para obtener una respuesta inmunológica o una respuesta inmunogénica contra un producto génico y/o las bacterias o una respuesta inmune protectora con respecto a un patógeno del que deriva o se obtiene el producto génico y/o las bacterias que comprenden administrar a un sujeto, por ejemplo, un animal, tal como un animal susceptible de infección por el patógeno y/o las bacterias, por ejemplo, un animal bovino o un pavo, bacterias transformadas para expresar el producto génico; o un método para preparar una composición inmunogénica, inmunológica o de vacuna que comprende mezclar el vector o las bacterias transformadas con un portador, excipiente, diluyente o vehículo veterinariamente o farmacéuticamente aceptable y/o un adyuvante y/o estabilizante

[0007] La descripción también se refiere a dianas para la atenuación de bacterias por ejemplo, secuencias de nucleótidos o genes mutados que codifican las dianas para la atenuación de bacterias, y métodos para dirigir polipéptidos para la atenuación de bacterias y métodos para generar bacterias atenuadas. Las dianas para la atenuación se pueden utilizar como compuestos inmunogénicos, por ejemplo, en composiciones inmunogénicas o en composiciones de vacuna, o para generar epítopos para utilizar en composiciones inmunogénicas o de vacuna. De este modo, la descripción se refiere a la utilización de dianas para la atenuación en la preparación en composiciones, por ejemplo, mezclando con un portador, excipiente, diluyente o vehículo veterinariamente o farmacéuticamente aceptable y/o un adyuvante y/o estabilizante.

[0008] La descripción se refiere además a métodos para inducir una respuesta inmunológica o inmunogénica o inmune protectora en un sujeto, por ejemplo, un animal, tal como un animal susceptible de infección por una bacteria gram negativa, tal como una Pasteurella, por ejemplo, un pavo o un animal bovino, que comprende administrar al animal una vacuna o composición inmunogénica de la invención.

[0009] Incluso además la descripción se refiere a preparar dichas bacterias atenuadas, por ejemplo, bacterias gram negativas, tales como Pasteurella; por ejemplo, que comprende introducir uno o más elementos transposables en la bacteria y aislar la bacteria que contiene el elemento transposable que no causa mortalidad en una especie diana (y, por tanto, atenuada). Se pueden identificar opcionalmente las mutaciones en las bacterias, permitiendo así medios alternativos para producir las bacterias atenuadas.

[0010] La descripción se refiere además a dichos medios alternativos para producir bacterias atenuadas. Dado que las mutaciones se identifican o caracterizan, las mutaciones se pueden introducir en bacterias a través de técnicas diferentes a introducir uno o más elementos transposables en la bacteria, tal como mediante recombinación homóloga, por ejemplo, recombinación homóloga mediante la cual una parte del genoma bacteriano da lugar a por lo menos una adición a la misma (inserción) o una deleción de la misma (también se prevén dos o más adiciones y/o deleciones) o una sustitución (tal como una sustitución de por lo menos un nucleótido por otro). Por consiguiente, la descripción se refiere a un método para producir una bacteria atenuada que contiene una modificación o mutación conocida o identificada previamente, por ejemplo, una modificación o mutación identificada en la presente invención, que comprende introducir una deleción o inserción o sustitución en el genoma bacteriano, de manera ventajosa, a través de la recombinación y opcionalmente la identificación y/o aislamiento de las bacterias que contienen la modificación o mutación.

[0011] De este modo, la descripción se refiere además a un mutante de una bacteria gram negativa, donde dicha bacteria tiene por lo menos una mutación en una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido que tiene una identidad que es igual o superior al 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, ó 99% con una secuencia de aminoácidos codificada por una secuencia de nucleótidos seleccionada del grupo que consiste en las secuencias de nucleótidos identificadas como SEC ID No: 2, 6,9,12,16,19,22,25,28, 31,34,37,40,43,46,49, 52, 55, 58, 61, 64, 67, 70, 75, 78, 81, 84, 87, 90, 93; dando lugar dicha mutación a una virulencia atenuada de la bacteria. La descripción se refiere a utilizaciones, composiciones y métodos que implican dicha bacteria tal como se ha descrito en la invención.

ANTECEDENTES

[0012] Está bien establecido que los microorganismos vivos atenuados pueden ser vacunas muy eficaces; las respuestas inmunes obtenidas por dichas vacunas son a menudo de mayor magnitud y de duración más larga que las producidas por inmunógenos no replicantes. Una explicación de esto puede ser que las cepas vivas atenuadas establecen infecciones limitadas en el huésped e imitan las etapas tempranas de la infección natural. Adicionalmente, a diferencia de las preparaciones muertas o inactivadas, las vacunas vivas son capaces de inducir potentes respuestas mediadas por células que se pueden relacionar con su capacidad para replicarse en células presentadoras antígenos, tales como los macrófagos.

[0013] Existe una larga historia del uso de vacunas atenuadas vivas en animales y seres humanos, usando especialmente técnicas de mutagénesis química. Sin embargo, las vacunas empíricamente atenuadas pueden revertir a virulentas.

[0014] Las técnicas modernas de la biología molecular, junto con el aumento del conocimiento de la patogénesis bacteriana, han conducido a la identificación de varios genes que están implicados en el crecimiento y la supervivencia de los microorganismos in vivo. Esto ha proporcionado nuevos genes diana para la atenuación y al concepto de que se podrían atenuar “racionalmente” futuras cepas de vacuna introduciendo mutaciones no revertientes definidas en genes seleccionados conocidos por estar implicados en la virulencia, véanse por ejemplo los documentos Wo-A-00161724, Wo-A-00/68261 y EP-A-0889120.

[0015] Aunque se han producido muchas cepas atenuadas en laboratorios, sólo unas pocas se han calificado como potenciales vacunas candidatas para uso en animales. Esto puede ser debido en parte a la necesidad de equilibrar la inmunogenicidad de la vacuna con la posibilidad del microorganismo de revertir, volviéndose reactivo y patogénico.

[0016] Es evidente que la selección de los genes apropiados para la atenuación, que darán lugar a una vacuna candidata adecuada, no es sencilla y no se puede predecir fácilmente. Muchos factores pueden tener influencia

sobre la aceptabilidad del mutante atenuado como vacuna, y en consecuencia, se requiere un esfuerzo de investigación para identificar y seleccionar genes atenuantes adecuados. Se llevaron a cabo muchos experimentos de atenuación únicamente in vitro y sus resultados no se pueden extrapolar in vivo, especialmente, en relación con la patogenicidad residual de los mutantes resultantes para los animales vacunados.

[0017] Se hace mención de: Kachlany Sc, Planet PJ, Bhattacharjee MK, Kollia E, DeSalle r, Fine Dh, Figurski Dh., Nonspecific adherence by Actinobacillus actinomycetemcomitans requires genes widespread in bacteria and archaea. J Bacteriol. 2000 Nov; 182(21):6169-76. Fuller TE, Martin S, Teel JF, Alaniz Gr, Kennedy MJ, Lowery DE., Identification of Actinobacillus pleuropneumoniae virulence genes using signature-tagged mutagenesis in a swine infection model. Microb Pathog. 2000 Jul;29(1): 39

51. Fuller TE, Kennedy MJ, Lowery DE., Identification of Pasteurella multocida virulence genes in a septicemic mouse model using signature-tagged mutagenesis. Microb Pathog. 2000 Jul;29(1):25-38. Kehrenberg c, Werckenthin c, Schwarz S., Tn5706, a transposon-like element from Pasteurella multocida mediating tetracycline resistance. Antimicrob Agents chemother. 1998 Aug;42(8):2116-8. DeAngelis PL., Transposon Tn916 insertional mutagenesis of Pasteurella multocida and direct sequencing of disruption site. Microb Pathog. 1998a Apr;24(4):203-9. DeAngelis PL, Jing W, Drake rr, Achyuthan AM., Identification y molecular cloning of a unique hyaluronan synthase from Pasteurella multocida. J Biol chem. 1998b Apr 3;273(14):8454-8. Lee MD, henk AD., Tn10 insertional mutagenesis in Pasteurella multocida. Vet Microbiol. 1996 May;50(1-2):143-8. Choi Kh, Maheswaran SK, choi cS., colorimetric assay using XTT for assessing virulence of avian Pasteurella multocida strains. Vet Microbiol. 1995 Jul;45(2-3):191-200. Nnalue NA. Tn7 inserts in both orientations at a single chromosomal location y apparently forms cointegrates in Pasteurella multocida. Mol Microbiol. 1990 Jan;4(1):107-17. Stocker patentes de Estados Unidos Nos. 4,550,081, 4,837,151, 5,210,035 y 5,643,771. Highlander Patente de Estados Unidos No. 6,180,112.

[0018] Kachlany implicó genes de Tad. No existe relación entre los genes de Tad mutados en Kachlany y la atenuación. No hay pruebas en animales en Kachlany y los genes de Tad no están seleccionados en la presente invención. Los artículos de Fuller implican secuencias que no se seleccionan en la presente invención. Kehrenberg no implicó un mutante atenuado, o una Mutagénesis Etiquetada con Firma o técnica STM; sino que, Kahrenberg implicaba la inserción dirigida de un transposón (utilización de elemento de inserción idéntico). DeAngelis 1998a proporciona solo una descripción general de una técnica STM y nada sobre mutantes, per se. DeAngelis 1998b implicó la utilización de una técnica STM para insertar un transposón en el locus de la biosíntesis de HA (Banco de genes AF036004). Esta secuencia es un homólogo a la secuencia Pm0775 de PM70. La secuencia que codifica Pm0775 no está seleccionada en la presente invención. Lee se refiere a la utilización de una técnica STM con un transposón Tn10; Lee no describe ni sugiere ningún test en animales ni ninguna investigación para mutantes atenuados; sino que, Lee implicó únicamente mutantes autotróficos. Mientras que Choi cita un mutante de inserción de transposón de Pasteurella multocida, y puede no haber habido mortalidad inducida por este mutante, Choi no contiene detalles sobre la localización de la inserción del transposón y, por lo tanto, no se puede decir que sea reproducible. De forma similar, Nnalue no enseña ni describe la presente invención. Las patentes de Stocker implicaron la inserción de un transposón Tn10 en el gen aroA. El gen aroA no está seleccionado en la presente invención. Highlander se refiere a la inserción de un transposón Tn1545 en el gen lktc para inactivar leucotoxina. El gen lktc no está seleccionado en la presente invención. Por consiguiente, se cree verdaderamente que la presente invención no está descrita o sugerida en la técnica.

[0019] Además, es deseable caracterizar genes o secuencias de ácidos nucleicos implicadas en la atenuación y en base a esto desarrollar bacterias atenidas, así como composiciones de vacunas o inmunogénicas atenuadas, tales como las que tienen un grado elevado de inmunogenicidad y que muestran un buen perfil de seguridad con efectos secundarios limitados o ausentes.

DESCRIPCIÓN RESUMIDA DE LA INVENCIÓN

[0020] La presente invención proporciona un mutante de una bacteria gram negativa, donde dicha bacteria presenta una mutación en una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido que tiene una identidad que es igual o superior a 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, ó 99% con una secuencia de aminoácidos codificada por la secuencia de nucleótidos SEC ID No: 75, dando lugar dicha mutación a una virulencia atenuada de la bacteria, donde la mutación es una inserción entre los nucleótidos 1072-1087 en SEC ID No: 75.

[0021] En otro aspecto, la presente invención proporciona una vacuna que comprende un mutante atenuado según la presente invención y un diluyente, portador, vehículo o excipiente farmacéuticamente aceptable.

[0022] En un aspecto adicional, la presente invención proporciona una composición inmunogénica que comprende un mutante atenuado según la presente invención, y un diluyente, portador, vehículo o excipiente farmacéuticamente aceptable.

[0023] Además, la presente invención proporciona una molécula de ácido nucleico aislada que tiene la secuencia SEC ID No: 75 con una inserción entre los nucleótidos 1072-1087.

[0024] La presente invención proporciona, en otro aspecto, la utilización de un mutante según la presente invención en la producción de una composición o inmunogénica atenuada viva o una preparación de una composición de vacuna atenuada viva.

[0025] En otro aspecto, la presente invención proporciona un mutante según la presente invención, una vacuna según la presente invención, o una composición inmunogénica según la presente invención, para utilizar en la inmunización contra o la prevención de infección bacteriana en un animal.

[0026] En un aspecto adicional, la presente invención proporciona la utilización de un mutante de una bacteria gram negativa según la presente invención, una vacuna según la presente invención, o una composición inmunogénica según la presente invención, en la preparación de un medicamento para la inmunización contra o la prevención de la infección bacteriana en un animal.

[0027] La descripción proporciona un mutante de una bacteria gram negativa que presenta una mutación en una primera secuencia de nucleótidos que codifica un primer polipéptido y da lugar a la bacteria que tiene una virulencia atenuada, donde: el primer polipéptido tiene la secuencia de aminoácidos; un segundo polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos codificada por una secuencia de nucleótidos identificada como SEC ID No: 2, 6, 9, 12, 16, 19, 22, 25, 28, 31, 34, 37, 40, 43, 46, 49, 52, 55, 58, 61, 64, 67, 70, 75, 78, 81, 84, 87, 90, ó 93; y la secuencia de aminoácidos del primer polipéptido es la misma que la del segundo polipéptido, o la secuencia de aminoácidos del primer polipéptido tiene una identidad que es igual o superior a 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, ó 99% con la secuencia de aminoácidos del segundo polipéptido.

[0028] La bacteria mutante pueden ser una Pasteurellaceae, por ejemplo la bacteria puede ser: Pasteurella multocida, Pasteurella haemolytica, Pasteurella anatipestifer o Actinobacillus pleuropneumoniae; de manera ventajosa Pasteurella multocida.

[0029] La mutación puede ser una deleción en la primera secuencia de nucleótidos, o una inserción en la misma o una sustitución de ácidos nucleicos, tales como una deleción de toda la primera secuencia de nucleótidos; o una inserción entre: los nucleótidos 180-181 o los nucleótidos 182-183 o los nucleótidos 190-191 en SEC ID No: 2, los nucleótidos 77-78 o los nucleótidos 1026-1027 o los nucleótidos 1027-1028 en SEC ID No: 6, los nucleótidos 416417 en SEC ID No: 9, los nucleótidos 389-390 en SEC ID No: 12, los nucleótidos 381-382 en SEC ID No: 16, los nucleótidos 219-220 en SEC ID No: 19, los nucleótidos 1353-1354 en SEC ID No: 22, los nucleótidos 136-137 en SEC ID No: 25, los nucleótidos 384-385 en SEC ID No: 28, los nucleótidos 222-223 o los nucleótidos 225-226 en SEC ID No: 31, los nucleótidos 217-218 en SEC ID No: 34, los nucleótidos 1411-1412 en SEC ID No: 37, los nucleótidos 943-944 en SEC ID No: 40, los nucleótidos 855-856 en SEC ID No: 43, los nucleótidos 369-370 en SEC ID No: 46, los nucleótidos 111-112 en SEC ID No: 49, los nucleótidos 443-444 en SEC ID No: 52, los nucleótidos 4-5 en SEC ID No: 55, los nucleótidos 573-574 en SEC ID No: 61, los nucleótidos 875-876 en SEC ID No: 64, los nucleótidos 218-219 en SEC ID No: 70, los nucleótidos 1072-1087 en SEC ID No: 75, los nucleótidos 64-65 en SEC ID No: 78, los nucleótidos 282-283 en SEC ID No: 81, los nucleótidos 1431-1432 en SEC ID No: 84, los nucleótidos 974-975 en SEC ID No: 87, los nucleótidos 802-803 en SEC ID No: 90, los nucleótidos 850-851 en SEC ID No: 92; o inmediatamente en dirección 5’ del nucleótido 1 en SEC ID No: 58; o inmediatamente en dirección 5’ del nucleótido 1 en SEC ID No: 67.

[0030] El mutante puede comprender una secuencia de ácidos nucleicos heteróloga, tal como una secuencia de ácidos nucleicos heteróloga que codifica un inmunógeno de un agente viral, parasítico o bacteriano patogénico, una proteína terapéutica, un alérgeno, un factor de crecimiento o una citoquina.

[0031] La presente invención también proporciona una composición inmunogénica o una vacuna que comprende un mutante según la presente invención, y un diluyente, portador, vehículo o excipiente farmacéuticamente o veterinariamente aceptable, y que comprende opcionalmente además un adyuvante.

[0032] La descripción proporciona además un primer polipéptido aislado que tiene una secuencia de aminoácidos, en la que existe: un segundo polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos codificada por una secuencia de nucleótidos codificada como SEC ID No: 2, 6, 9, 12, 16, 19, 22, 25, 28, 31, 34, 37, 40, 43, 46, 49, 52, 55, 58, 61, 64, 67, 70, 75, 78, 81, 84, 87, 90, o 93; y la secuencia de aminoácidos del primer polipéptido es la misma que la del segundo polipéptido, o la secuencia de aminoácidos del primer polipéptido tiene una identidad que es igual o superior a 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, o 99% con la secuencia de aminoácidos del segundo polipéptido.

[0033] La descripción prevé una composición inmunogénica o de vacuna que contiene el primer polipéptido aislado, y un diluyente, portador, vehículo o excipiente farmacéuticamente o veterinariamente aceptable, y opcionalmente un adyuvante.

[0034] Además, la descripción prevé una preparación de anticuerpos que comprende un anticuerpo específico para el primer polipéptido aislado.

[0035] La descripción también implica un método de diagnóstico para detectar la infección por una bacteria gram negativa, que comprende detector en una muestra el primer polipéptido aislado o un anticuerpo específico a ese primer polipéptido aislado.

[0036] La descripción se refiere además a un método de inmunización pasiva que comprende administrar la preparación de anticuerpos.

[0037] La descripción también proporciona una molécula de ácido nucleico aislada que tiene una secuencia identificada como SEC ID No: 2, 6, 9, 12, 16, 19, 22, 25, 28, 31, 34, 37, 40, 43, 46, 49, 52, 55, 58, 61, 64, 67, 70, 75, 78, 81, 84, 87, 90, o 93, o identificada como SEC ID No: 1, 4, 5, 8, 11, 14, 15, 18, 21, 24, 27, 30, 33, 36, 39, 42, 45, 48, 51, 54, 57, 60,63, 66, 69, 72, 73, 77, 80, 83, 86, 89, 92, 95, 96, ó 97, así como un cebador PCR para detectar bacterias gram negativas que comprende una molécula de ácido nucleico aislada que tiene una secuencia que es por lo menos 10 ácidos nucleicos contiguos de una secuencia de nucleótidos identificada como SEC ID No: 2, 6, 9, 12, 16, 19, 22, 25, 28, 31, 34, 37, 40, 43, 46, 49, 52, 55, 58, 61, 64, 67, 70, 75, 78, 81, 84, 87, 90, o 93, o identificada como SEC ID No: 1, 4, 5, 8, 11, 14, 15, 18, 21, 24, 27, 30, 33, 36, 39, 42, 45, 48, 51, 54, 57, 60, 63, 66, 69, 72, 73, 77, 80, 83, 86, 89, 92, 95, 96, ó 97. Una sonda o cebador puede ser cualquier tramo de por lo menos 8, preferiblemente por lo menos 10, más preferiblemente por lo menos 12, 13, 14, ó 15, tales como por lo menos 20, por ejemplo, por lo menos 23 ó 25, por ejemplo por lo menos 27 ó 30 nucleótidos que son únicos a la secuencia que se desea amplificar o que están en la secuencia que se desea amplificar y están menos conservadas, por ejemplo, conservadas entre las bacterias gram negativas o entre una familia o especie particular de bacterias gram negativas, tales como entre Pasteurella, o entre cualquiera de Pasteurella multocida, Pasteurella haemolytica, Pasteurella anatipestifer o Actinobacillus pleuropneumoniae; de manera ventajosa Pasteurella multocida. En cuanto a la PCR o cebadores o sondas de hibridación y longitudes óptimas para los mismos, se hace referencia también a Kajimura et al., GATA 7(4):71-79 (1990).

[0038] Los términos "composición inmunogénica" y "composición inmunológica" y "composición inmunogénica o inmunológica” cubren cualquier composición que obtiene una respuesta inmune contra el patógeno reconocido; por ejemplo, después de la administración o inyección en el animal (tal como un ave, por ejemplo, pavo o animal bovino, por ejemplo, una vaca), obtiene una respuesta inmune contra el patógeno reconocido (por ejemplo, Pasteurella multocida). Los términos "composición vacunal" y "vacuna" y "composición de vacuna" cubre cualquier composición que induce una respuesta inmune protectora contra el patógeno reconocido o que protege de forma eficaz contra el patógeno, por ejemplo, después de la administración o inyección en el animal (por ejemplo, un ave, tal como pavo o animal bovino, tal como una vaca), obtiene una respuesta inmune protectora contra el patógeno reconocido o proporciona una protección eficaz contra el patógeno (por ejemplo, P. multocida). Una subunidad de un patógeno, por ejemplo un antígeno o inmunógeno o epítopo aislado del patógeno, por ejemplo, bacterias, tales como una bacteria gram negativa, por ejemplo, P. multocida; y, una composición de subunidades comprende o consiste esencialmente en uno o más antígenos, inmunógenos o epítopos aislados del patógeno, por ejemplo, bacterias, tales como una bacteria gram negativa, por ejemplo, P. multocida.

[0039] Cabe indicar que en esta descripción y particularmente en las reivindicaciones, los términos, tales como “comprende”, “comprendido”, "que comprende" y similares pueden tener el significado atribuido según la ley de patentes de Estados Unidos; por ejemplo, pueden significar “incluye” incluido”, “que incluye”, y similares; y términos, tales como “que consiste esencialmente en” y “consiste esencialmente en” tiene el significado según la ley de patentes de Estados Unidos, por ejemplo, permiten elementos no indicados explícitamente, pero excluyen elementos que se encuentran en el estado de la técnica o que afectan a una característica básica o nueva de la invención.

[0040] Estas y otras realizaciones se describen o son obvias y están comprendidas por la siguiente descripción detallada.

DESCRIPCIÓN DETALLADA

[0041] La presente descripción proporciona secuencias de nucleótidos y genes implicados en la atenuación de un microorganismo, tal como bacterias, por ejemplo, bacterias gram negativas, por ejemplo, Pastuerella multocida, productos (por ejemplo, proteínas, antígenos, immunógenos, epítopos) codificados por la secuencia de nucleótidos, métodos para producir dichas secuencias de nucleótidos, productos, microorganismos, y utilizados de los mismos, tales como para preparar composiciones de vacuna o inmunogénicas o para obtener una respuesta inmunológica o inmune o como un vector, por ejemplo, como un vector de expresión (por ejemplo, en un vector de expresión in vitro

o in vivo).

[0042] Las mutaciones introducidas en las secuencias de nucleótidos y genes de microorganismos producen mutantes atenuados nuevos y no obvios. Estos mutantes son útiles para la producción de composiciones inmunogénicas atenuadas vivas o vacunas atenuadas vivas que tienen un grado elevado de inmunogenicidad.

[0043] Estos mutantes también son útiles como vectores que pueden ser útiles para la expresión in Vitro de productos de expresión, así como para la reproducción o replicación de secuencias de nucleótidos (por ejemplo, la replicación de ADN) y para productos de expresión in vivo.

[0044] La identificación de las mutaciones proporciona secuencias de nucleótidos y genes nuevos y no obvios, así como productos génicos codificados por la secuencia de nucleótidos y genes nuevos y no obvios.

[0045] Dichos productos génicos proporcionan antígenos, inmunógenos y epítopos y son útiles como productos génicos aislados.

[0046] Dichos productos génicos aislados, así como los epítopos de los mismos, también son útiles para generar anticuerpos, que son útiles en aplicaciones de diagnóstico.

[0047] Dichos productos génicos, que pueden proporcionar o generar epítopos, antígenos o inmunógenos, también son útiles para composiciones inmunogénicas o inmunológicas, así como vacunas.

[0048] En un aspecto, la descripción proporciona bacterias que contienen una mutación atenuante en una secuencia de nucleótidos o un gen, en los que la mutación modifica, reduce o suprime la expresión y/o la actividad biológica de un polipéptido o proteína codificados por un gen, dando lugar a una virulencia atenuada de la bacteria.

[0049] La mutación no se localiza necesariamente en una secuencia codificante o gen para alterar su función, conduciendo a la atenuación. La mutación también se puede producir en secuencias de nucleótidos implicadas en la regulación de la expresión del gen, por ejemplo, en regiones que regulan la transcripción, iniciación, traducción y terminación de la transcripción. De este modo, también se incluyen promotores y regiones de unión a ribosoma (en general, estos elementos reguladores se encuentran aproximadamente entre 60 y 250 nucleótidos en dirección 5’ del codón de partida de la secuencia codificante o gen; Doree S M et al., J. Bacteriol. 2001, 183(6): 1983-9 ; Pandher K et al., Infect. Imm. 1998, 66(12): 5613-9; Chung J Y. et al., FEMS Microbiol letters 1998,166: 289-296), terminadores de la transcripción (en general el terminador se localiza en aproximadamente 50 nucleótidos en dirección 3’ del codón de detención de la secuencia codificante o gen; Ward c K et al., Infect. Imm. 1998,66(7):332636). En el caso de un operón, dichas regiones reguladoras se puede localizar en una mayor distancia en dirección 5’ del gen o secuencia codificante. Una mutación en una región intergénica también puede conducir a la atenuación.

[0050] Una mutación en dichas secuencias reguladoras asociadas con la secuencia codificante o gen, de manera que la mutación de esta secuencia de nucleótidos modifica, inhibe o suprime la expresión y/o la actividad biológica del polipéptido o la proteína codificada por el gen, que da lugar a una virulencia atenuada de la bacteria, sería equivalente a una mutación en un gen o secuencia codificante identificada en la presente descripción.

[0051] La atenuación reduce o suprime la patogenicidad de las bacterias y la gravedad de las señales clínicas o lesiones, disminuye la velocidad de crecimiento de las bacterias y previene la muerte de las bacterias.

[0052] La descripción se refiere a microorganismos, tales como bacterias, por ejemplo, bacterias gram negativas, tales como bacterias de la familia de Pasteurellaceae, por ejemplo, Pasteurella multocida, Pasteurella haemolytica, Pasteurella anatipestifer y Actinobacillus pleuropneumoniae. De manera ventajosa, las bacterias son Pasteurella multocida.

[0053] La Pasteurella multocida es una bacteria gram negativa, que es el agente causante de varias enfermedades de animales de producción y un patógeno humano oportunista. Es el agente etiológico de la pasteurelosis severa, tal como la cólera de ave de corral en aves domésticas y salvajes, septicemia hemorrágica bovina y rinitis atrófica porcina (Hunt ML et al., Vet Microbiol 2000, 72(1-2): 3-25). Los aislados se pueden agrupar serológicamente en base a los antígenos capsulares en serogrupos (A, B, D, E y F) o en 16 serotipos en base a antígenos LPS somáticos.

[0054] Las potenciales secuencias de nucleótidos implicadas en la atenuación de bacterias se han identificado utilizando la Mutagénesis Etiquetada con Firma (STM). Este método se discute en los documentos citados en la presente invención y se menciona también en Wo-A-96/17951.

[0055] STM implica la inserción de un transposón único etiquetado con firma en el genoma de un microorganismo.

[0056] En el locus de la inserción, se altera la secuencia de nucleótidos del genoma. En la presente descripción, se analiza la mutación resultante (y por tanto, el mutante que porta la mutación) para la atenuación.

[0057] La secuencia de la región alterada (por ejemplo, gen o secuencia codificante o marco de lectura abierta (ORF)) para cada mutante atenuado se determina mediante amplificación por PCR (reacción en cadena de la polimerasa), clonación y secuenciación de las regiones de ADN que flanquean el transposón.

[0058] En una realización de la presente descripción, el método STM descrito en WO-A-96/17951 se adaptó para que fuera funcional en Pasteurella multocida. Estas adaptaciones incluyen de forma destacada la utilización del transposón Tn10 en lugar de Tn5, y la utilización para la selección de un medio CDM sin leucina en lugar de una selección por resistencia a estreptomicina. Se dan más detalles en los ejemplos.

[0059] Una selección adicional de genes o secuencias de nucleótidos implicados en la atenuación a partir de genes potenciales identificados por el método STM se basa en la ausencia de mortalidad después de la inoculación de la bacteria mutante en animales.

[0060] Para aplicaciones veterinarias, un aspecto ventajoso de la descripción comprende la implementación de una selección experimental directamente en el animal diana, en lugar de un modelo animal. Este método permite una selección más precisa para mutaciones apropiadas de las bacterias mutantes. Para Pasteurella multocida, los experimentos se realizan directamente en pavos, uno de los huéspedes diana naturales Pasteurella multocida.

[0061] Los pavos se inoculan intramuscularmente con una cantidad suficiente de grupos de mutantes de P. multocida etiquetados con firma (por ejemplo, 0,5 ml, 107 CFU por animal). Los mutantes que no se reaíslan en un cierto tiempo después de la inoculación se consideran como potencialmente atenuados. Los mutantes que no se reaíslan se diferencian de los del grupo en que se reaíslan mediante amplificación por PCR y análisis de las etiquetas firma.

[0062] A continuación, cada mutante potencialmente atenuado se inyecta mediante vía intramuscular en pavos (por ejemplo 0,5 ml, 104 CFU por animal). La mortalidad de los pavos se registra diariamente durante 7 días después de la inoculación. Los mutantes que no conducen a la muerte se consideran como atenuados.

[0063] El método específico se ha llevado a cabo en la cepa P-1059 de Pasteurella multocida se ha obtenido un conjunto de mutantes atenuados. Cinco de ellos se han depositado el 1 de abril de 2003 en la CNCM (Colección Nacional de Cultivo de Microorganismos) del Instituto Pasteur de París, Francia. El mutante 4G11 está disponible bajo el número de acceso CNCM 1-2999. El mutante 5D5 está disponible bajo el número de acceso CNCM 1-3000. El mutante 9c8 está disponible bajo el número de acceso CNCM I-3001. El mutante 9h4 está disponible bajo el número de acceso CNCM I-3002. El mutante 13E1 está disponible bajo el número de acceso CNCMI-3003.

[0064] Las secuencias de nucleótidos que flanquean el locus de la inserción del transposón se designan como SEC ID No: 1, 4, 5, 8, 11, 14, 15, 18, 21, 24, 27, 30, 33, 36, 39, 42, 45, 48, 51, 54, 57, 60, 63, 66, 69, 72, 73, 77, 80, 83, 86, 89, 92, 95, 96, 97.

[0065] Los transposones se insertaron en la cepa P-1059 de Pasteurella multocida inmediatamente en el extreme 5’ de las secuencias 1, 8,11,14,15,27,33, 42, 54, 57, 66, 72, 73, 77, 80, 95 y 97, e inmediatamente en el extremo 3’de las secuencias 4, 5, 18, 21, 24, 30, 36, 39, 45, 48, 51, 60, 63, 69, 83, 86, 89 y 96. Para el mutante 9h4, el transposón se insertó entre los nucleótidos en las posiciones 850-851 de la secuencia SEC ID No: 92.

[0066] Un aspecto particular de la descripción son mutantes atenuados de la cepa P-1059 de Pasteurella multocida que tiene una mutación atenuante en el gen u ORF y/o sus regiones reguladoras que comprenden una secuencia seleccionado entre las secuencias SEC ID No: 1, 4, 5, 8, 11, 14, 15, 18, 21, 24, 27, 30, 33, 36, 39, 42, 45, 48, 51, 54, 57, 60, 63, 66, 69, 72, 73, 77, 80, 83, 86, 89, 92, 95, 96, y 97.

[0067] Realizaciones particulares adicionales de la descripción incluyen mutantes atenuados según la descripción, tales como los mutantes atenuados mencionados de la presente invención depositados en la CNCM bajo los términos del Tratado de Budapest.

[0068] Los mutantes de P-1059 atenuados se pueden obtener, por ejemplo, mediante la inserción de transposones o mediante mutagénesis dirigida (deleción, inserción, sustitución). La mutación atenuante se puede realizar en estas secuencias de nucleótidos o genes, así como en las secuencias complementarias de las mismas. La mutación atenuante también se puede realizar en las secuencias de nucleótidos implicadas en la región reguladora de dichos genes o secuencias de nucleótidos.

[0069] Las secuencias anteriores o partes de las mismas (tales como, por lo menos 10, 15 ó 20 nucleótidos de las mismas, por ejemplo, por lo menos 10 nucleótidos contiguos de las mismas, o por lo menos 15 nucleótidos contiguos de las mismas y de manera más ventajosa por lo menos 20 nucleótidos contiguos de las mismas, hasta la longitud completa de las secuencias) se pueden utilizar como cebadores de PCR para detectar y seleccionar los mutantes de inserción de transposón. La PCR puede implicar una pareja de cebadores, por ejemplo, uno específico al transposón y el otro específico al gen o secuencia de nucleótidos a mutar. En base al tamaño esperado de los productos amplificados por PCR, el método permite la amplificación y/o detección de los fragmentos de PCR. El conocimiento del gen o ORF correspondiente y/o sus regiones reguladoras en el organismo, por ejemplo, bacterias gram negativas, tales como Pasteurella, por ejemplo, Pasteurella multocida, por ejemplo Pasteurella multocida cepa PM70

o P-1059 (véase, por ejemplo, infra); por ejemplo, el tamaño del correspondiente gen u ORF y/o sus regiones reguladoras se puede utilizar para diseñar cebadores de PCR, para cribar fragmentos de PCR amplificados y para detectar aquellos que tienen el tamaño correcto que permiten la selección de los mutantes.

[0070] El genoma completo de la cepa PM70 de Pasteurella multocida está disponible en la base de datos EMBL y en May BJ et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2001, 98(6): 3460-5. Los “Blasts” realizados con las secuencias SEC ID No: 1,4, 5, 8,11,14,15,18,21, 24, 27, 30, 33, 36, 39, 42, 45, 48, 51, 54, 57, 60, 63, 66,’69, 72, 73, 77, 80, 83, 86, 89, 92, 95, 96, 97 permitió localizar las secuencias homólogas en el genoma de PM70 y a continuación determinar los correspondientes genes u ORF en PM70.

[0071] Estas secuencias de nucleótidos en la cepa PM70 de Pasteurella multocida se designan como SEC ID No: 2, 6, 9, 12, 16, 19, 22, 25, 28, 31, 34, 37, 40, 43, 46, 49, 52, 55, 58, 61, 64, 67, 70, 75, 78, 81, 84, 87, 90.

[0072] Para el mutante 9h4 de la cepa P-1059, no se halló secuencia homóloga en PM70. El ORF de P-1059 se ha secuencia y designado como SEC ID No: 93.

[0073] Otro aspecto de la descripción son mutantes atenuados de la cepa PM70 que tiene por lo menos una mutación atenuante en un gen u ORF que comprende una secuencia de nucleótidos seleccionada entre SEC ID No: 2, 6, 9, 12, 16, 19, 22, 25, 28, 31, 34, 37, 40, 43, 46, 49, 52, 55, 58, 61, 64, 67, 70, 75, 78, 81, 84, 87 y 90 y/o sus regiones reguladoras.

[0074] La mutación atenuante se puede realizar en estas secuencias de nucleótidos o genes, así como en las secuencias complementarias de las mismas. La mutación atenuante también se puede realizar en las secuencias de nucleótidos implicadas en la región reguladora de dichos genes. Los mutantes se pueden obtener, por ejemplo, mediante la inserción de transposón o mediante mutagénesis dirigida (deleción, inserción, sustitución).

[0075] El término de "complementario" significa aquí la secuencia de nucleótidos de la otra cadena en el genoma de doble cadena, de manera que cubre la cadena antisentido como complemento de la cadena de sentido, y al revés. El término "nucleótido" también comprende desoxirribonucleótido (constituido con ácidos desoxirribonucleicos o ADN), ribonucleótido (constituido con ácidos ribonucleicos o ARN) y ribonucleótido mensajero (ARNm).

[0076] De manera más general, se pueden introducir mutaciones atenuantes en el genoma de una bacteria, tal como una bacteria gram negativa, por ejemplo una bacteria de la familia Pasteurellacaea, por ejemplo P. multocida, P. haemolytica, P. anatipestifer, A. pleuropneumoniae, de manera ventajosa una bacteria en el genoma de cualquiera de las diversas cepas de P. multocida (por ejemplo, la cepa P-1059, la cepa PM70), mutaciones en por lo menos una secuencia de nucleótidos que codifica una secuencia de aminoácidos que tiene por lo menos aproximadamente un 70% de identidad, por lo menos aproximadamente un 75% de identidad, por lo menos aproximadamente un 80% de identidad, por lo menos aproximadamente un 85%, por lo menos aproximadamente un 90% de identidad, y de manera ventajosa por lo menos aproximadamente un 95, 96, 97, 98, ó 99% o más de identidad con una de las secuencias de aminoácidos codificada por una secuencia de nucleótidos identificada como SEC ID No: 2, 6, 9, 12, 16, 19, 22, 25, 28, 31, 34, 37, 40, 43, 46, 49, 52, 55, 58, 61, 64, 67, 70, 75, 78, 81, 84, 87, 90, 93. La mutación atenuante se puede realizar en estas secuencias de nucleótidos o genes, así como en las secuencias complementarias de las mismas. La mutación atenuante también se puede realizar en secuencias de nucleótidos implicadas en la región reguladora de dichos genes. Los mutantes atenuados se pueden obtener, por ejemplo, mediante la inserción de transposón o mediante mutagénesis dirigida (deleción, inserción, sustitución). Los mutantes atenuados obtenidos son realizaciones de la descripción. Las realizaciones particulares son los mutantes atenuados de P-1059.

[0077] El porcentaje de identidad entre dos secuencias de aminoácidos se puede establecer mediante el blast por parejas y la matriz blosum62 de NCBI (Centro Nacional para la Información en Biotecnología), utilizando los parámetros estándar (es decir, cabe indicar el algoritmo BLAST o BLASTX disponible en el servidor del “Centro Nacional para la Información en Biotecnología” (NCBI, Bethesda, Md.,USA), así como en Altschul et al. J. Mol. Biol. 1990. 215. 403-410; y de este modo, este documento habla de utilizar el algoritmo o el BLAST o BLASTX y la matriz BLOSUM62 mediante el término “blasts”).

[0078] El verbo "codificar" utilizado en la presente invención no significa que la secuencia de nucleótidos está limitado a una secuencia codificante real, sino que comprende también el gen completo que incluye sus secuencias reguladoras que son secuencias no codificantes.

[0079] La homología o identidad de secuencia, tal como la homología de la secuencia de nucleótidos también se puede determinar utilizando el programa “Align” de Myers y Miller, ("Optimal Alignments in Linear Space", CABIOS 4, 11-17, 1988 y disponible en NcBI, así como el mismo u otros programas disponibles a través de Internet en los sitios del mismo, tal como el sitio de NCBI.

[0080] Alternativamente o adicionalmente, el término "homología" o "de identidad", por ejemplo, con respecto a una secuencia de nucleótidos o aminoácidos, puede indicar una medición cuantitativa de homología entre dos secuencias. El porcentaje de homología de secuencia se puede calcular como (Nref - Ndif)* 100/Nref, donde Ndif es el número total de residuos no idénticos en las dos secuencias cuando se alinean y donde Nref es el número de residuos en una de las secuencias. Por tanto, la secuencia de ADN AGTCAGTC tendrá una secuencia de identidad del 75% con la secuencia AATCAATC (Nref = 8; Ndif=2).

[0081] Alternativamente o adicionalmente, "homología" o "de identidad" con respecto a las secuencias se puede referir al número de posiciones con idénticos nucleótidos o aminoácidos dividido por el número de nucleótidos o aminoácidos en la más corta de las dos secuencias en las que se puede determinar la alineación de las dos secuencias según el algoritmo de Wilbur y Lipman (Wilbur y Lipman, 1983 PNAS USA 80:726, por ejemplo, utilizando un tamaño de ventana de 20 nucleótidos, un tamaño de palabra de 4 nucleótidos, y una penalización por espacio de 4, y se puede realizar convenientemente un análisis asistido por ordenador y la interpretación de los datos de la secuencia utilizando programas disponibles comercialmente (por ejemplo, Intelligenetics ™ Suite, Intelligenetics Inc. CA). Cuando se dice que las secuencias de ARN son similares, o presentan un grado de identidad u homología de secuencia, con las secuencias de ADN, se considera que la timidina (T) en la secuencia de ADN es igual a uracilo (U) en la secuencia de ARN. De este modo, las secuencias de ARN están dentro del alcance de la descripción y pueden derivar de secuencias de ADN, considerando que la timidina (T) en la secuencia de ADN es igual a uracilo (U) en las secuencias de ARN.

[0082] De manera ventajosa, la identidad u homología de secuencia, tal como la identidad u homología de la secuencia de aminoácidos se puede determinar utilizando el programa BlastP (Altschul et al., Nucl. Acids res. 25, 3389-3402) y disponible en NcBI, así como el mismo u otros programas disponibles a través de Internet en los sitios del mismo, tal como el sitio de NCBI.

[0083] Los siguientes documentos proporcionan algoritmos para comparar identidad u homología relativa de secuencias, tales como residuos de aminoácidos de dos proteínas, y adicionalmente o alternativamente con respecto a lo anterior, se pueden utilizar las enseñanzas en estas referencias para determinar el porcentaje de homología o identidad: Needleman SB y Wunsch CD, "A general method applicable to the search for similarities in the amino acid sequences of two proteins," J. Mol. Biol. 48:444-453 (1970); Smith TF y Waterman MS, "comparison of Bio-secuencias," Advances in Applied Mathematics 2:482-489 (1981); Smith TF, Waterman MS y Sadler Jr, "Statistical characterization of nucleic acid sequence functional domains," Nucleic Acids res., 11:2205-2220 (1983); Feng DF y Dolittle RF, "Progressive sequence alignment as a prerequisite to corrects phylogenetic trees," J. of Molec. Evol., 25:351-360 (1987); Higgins DG y Sharp PM, "Fast y sensitive multiple sequence alignment on a microcomputer," CABIOS, 5: 151-153 (1989); Thompson JD, higgins DG y Gibson TJ, "ClusterW: improving the sensitivity of progressive multiple sequence alignment through sequence weighing, positions-specific gap penalties y weight matrix choice," Nucleic Acid res., 22:4673-480 (1994); y, Devereux J, Haeberlie P y Smithies o, "A comprehensive set of sequence analysis program for the VAX," Nucl. Acids res., 12: 387-395 (1984). Y, sin una gran experimentación, el experto en la materia puede consultar muchos otros programas o referencias para determinar el porcentaje de homología.

[0084] La descripción se refiere a la mutación de las secuencias de nucleótidos o genes que codifican polipéptidos o proteínas que tienen la misma función biológica. La similitud de función se puede analizar o identificar o determinar o revisar mediante la conservación de sitios activos. Esto se puede realizar mediante una búsqueda DART de NCBI (Herramienta de recuperación de la Arquitectura del Dominio).

[0085] La presente descripción proporciona de este modo mutantes atenuados de una bacteria tal como se describen aquí, que comprende una mutación atenuante tal como se define aquí.

[0086] Los mutantes de bacterias gram negativas atenuadas incluyen una mutación, en la que se muta toda o parte de por lo menos una secuencia de ácidos nucleicos o gen especifico tal como se describe aquí. El gen o secuencia de ácidos nucleicos específica incluye aquellas que comprenden, o son homólogas a (por ejemplo, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, o 99% homólogas), la secuencia SEC ID No: 2, 6, 9, 12, 16, 19, 22, 25, 28, 31, 34, 37, 40, 43, 46, 49, 52, 55, 58, 61, 64, 67, 70, 75, 78, 81, 84, 87, 90 ó 93, o sus regiones reguladoras. De manera ventajosa, el gen o secuencia de ácidos nucleicos específica incluye aquellas que comprenden, o son homólogas a la secuencia SEC ID No: 2, 6, 9, 12, 25, 31, 37, 40, 43, 46, 70, 75, 78, 81, 84, 87, 90 ó 93, o sus regiones reguladoras. De manera más ventajosa, el gen o secuencia de ácidos nucleicos específica incluye aquellas que comprenden, o son homólogas a la secuencia SEC ID No: 6, 12, 25, 31, 37, 40, 46, 70, 75, 84, 87, 90 ó 93, o sus regiones reguladoras. E incluso de manera más ventajosa, el gen o secuencia de ácidos nucleicos específica incluye aquellas que comprenden, o son homólogas a la secuencia SEC ID No: 37, 40, 75, 90 ó 93, o sus secuencias de nucleótido homólogas. Preferiblemente, el mutante es una Pasteurella, tal como una P. multocida, por ejemplo P1059 o PM70.

[0087] Las mutaciones se pueden introducir en el microorganismo utilizando cualquier técnica conocida, tal como, por ejemplo, tecnología de ADN recombinante, a efectos de introducir una mutación bien definida en el gen la secuencia de ácidos nucleicos seleccionada (mutagénesis dirigida). Dicha mutación puede ser una inserción de una secuencia de ácidos nucleicos homóloga o heteróloga, una deleción, una sustitución, por ejemplo, una sustitución de por lo menos un nucleótido por otro o una combinación de los mismos. En una realización, la mutación es una mutación por deleción, donde la alteración del gen o la secuencia de ácidos nucleicos está causada por la deleción de parte, y de manera ventajosa, por la deleción de la secuencia de ácidos nucleicos o gen completo. La deleción de ácidos nucleicos evita la inversión a patogenicidad. En otra realización, la mutación es una inserción en un locus que corresponde a los locus de la inserción de transposón descritos aquí, por ejemplo, en los ejemplos. Estos locus, con referencia a la cepa P-1059, se localizan de manera ventajosa inmediatamente en el extremo 5’ de las secuencias 1, 8, 11, 14, 15, 27, 33, 42, 54, 57, 66, 72, 73, 77, 80, 95 y 97, e inmediatamente en el extremo 3’ de las secuencias 4, 5,18,21,24, 30, 36,39,45,48, 51, 60, 63, 69, 83, 86, 89 y 96. Estos locus también se localizan en la cepa PM70 entre: los nucleótidos 180-181 ó 182-183 ó 190-191 en la SEC ID No: 2, 77-78 ó 1026-1027 ó 1027-1028 en la SEC ID No: 6,416-417 en la SEC ID No: 9,389-390 en la SEC ID No: 12,381-382 en la SEC ID No: 16,219-220 en la SEC ID No: 19, 1353-1354 en la SEC ID No: 22,136-137 en la SEC ID No: 25, 384-385 en la SEC ID No: 28, 222-223 ó 225-226 en la SEC ID No: 31,217-218 en la SEC ID No: 34, 1411-1412 en la SEC ID No: 37, 943-944 en la SEC ID No: 40, 855-856 en la SEC ID No: 43, 369-370 en la SEC ID No: 46, 111-112 en la SEC ID No: 49,443-444 en la SEC ID No: 52,4-5 en la SEC ID No: 55, , 573-574 en la SEC ID No: 61, 875-876 en la SEC ID No: 64,218-219 en la SEC ID No: 70,1072-1087 en la SEC ID No: 75, 64-65 en la SEC ID No: 78,282-283 en la SEC ID No: 81, 1431-1432 en la SEC ID No: 84, 974-975 en la SEC ID No: 87, 802-803 en la SEC ID No: 90, 850-851 en la SEC ID No: 92; o, inmediatamente en dirección 5’ del nucleótido 1 en la SEC ID No: 58; o inmediatamente en dirección 5’ del nucleótido 1 en la SEC ID No: 67. Estos locus también son aquellos localizados entre parejas similares de nucleótidos (a los indicados para PM70) en secuencias de nucleótidos de otra bacteria gram negativa, tal como un miembro de la familia de Pasteurellacaea, por ejemplo P. multocida, P. haemolytica, P. anatipestifer, A. pleuropneumoniae, que codifica una secuencia de aminoácidos homóloga tal como se define en la presente invención con su porcentaje de identidad. De este modo, los mutantes pueden ser bacterias gram negativas y son de manera ventajosa una Pasteurella, tal como una P. multocida, P. haemolytica, P. anatipestifer, A. pleuropneumoniae, por ejemplo, una P. multocida, tal como P-1059 o PM70.

[0088] Por definición, los mutantes por deleción comprenden por lo menos una deleción de o en una secuencia de nucleótidos según la descripción. Estos mutantes por deleción incluyen aquellos en los que se elimina toda o parte de la secuencia génica o secuencia de nucleótidos específica. En un aspecto, la mutación da lugar a la deleción de por lo menos un ácido nucleico, de por lo menos aproximadamente el 10%, por lo menos aproximadamente el 20%, por lo menos aproximadamente el 30%, por lo menos aproximadamente el 40%, por lo menos aproximadamente el 50%, por lo menos aproximadamente el 60%, por lo menos aproximadamente el 70%, por lo menos aproximadamente el 80%, por lo menos aproximadamente el 90%, por lo menos aproximadamente el 95%, por lo menos aproximadamente el 98%, o por lo menos aproximadamente el 99% del gen o la secuencia de nucleótidos específica. Preferiblemente, se elimina el gen completo o la secuencia de nucleótidos específica.

[0089] Los mutantes pueden comprender más de una mutación, que pueden dar lugar a grados aditivos o sinérgicos de atenuación, y puede dar lugar a una mejor prevención de la inversión de la atenuación.

[0090] Estas mutaciones múltiples se pueden asociar con una mutación o mutaciones en las secuencias de nucleótidos o genes conocidos por sus propiedades atenuantes, tales como genes aro, por ejemplo, aroA (Homchampa P. et al., Veterinary Microbiology, 1994, 42: 35-44), y mutaciones en las secuencias de nucleótidos o genes según la descripción.

[0091] En una realización, los mutantes incluyen por lo menos dos mutaciones, en las que para cada mutación toda o parte de un gen o secuencia de ácidos nucleicos específica se muta tal como se describir aquí. Estos genes o secuencias de ácidos nucleicos específicas incluyen aquellas que comprenden, o son homólogas a, las secuencias SEC ID No: 2, 6, 9, 12, 16, 19, 22, 25, 28, 31, 34, 37, 40, 43, 46, 49, 52, 55, 58, 61, 64, 67, 70, 75, 78, 81, 84, 87, 90 ó 93, o sus regiones reguladoras. De este modo, los mutantes que tienen dos o más de las secuencias mutadas anteriores, por ejemplo, eliminadas tal como se describe aquí, están previstos por la descripción. De manera ventajosa, los mutantes tienen dos o más se las siguientes secuencias o secuencias que comprenden, o son homólogas a, las siguientes secuencias mutadas, por ejemplo, eliminadas, tal como se describe aquí: SEC ID No: 2, 6, 9, 12, 25, 31, 37, 40, 43, 46, 70, 75, 78, 81, 84, 87, 90 ó 93, o sus regiones reguladoras. De manera más ventajosa, los genes o las secuencias de ácidos nucleicos específicas que son mutadas (por ejemplo, las dos o más que son mutadas) incluyen aquellas que comprenden, o son homólogas a, las secuencias SEC ID No: 6, 12, 25, 31, 37, 40, 46, 70, 75, 84, 87, 90 ó 93, o sus regiones reguladoras. El mutante puede ser una bacteria gram negativa, y de manera ventajosa, el mutante es una Pasteurella, tal como una P. multocida, por ejemplo P-1059 o PM70.

[0092] De manera ventajosa, los mutantes que tienen dos o más de las siguientes secuencias, o sus regiones reguladoras, mutadas, por ejemplo, eliminadas tal como se describe aquí, están previstos por la descripción, SEC ID No: 37, 40, 75, 90 y 93, o sus secuencias de nucleótidos homólogas.

[0093] Varias realizaciones incluyen los mutantes que presentan deleciones de, o en los genes o secuencias de ácidos nucleicos, que comprenden, o son homólogas a, las secuencias SEC ID No: 37 y 40; SEC ID No: 37 y 75; SEC ID No: 37 y 90; SEC ID No: 37 y 93; SEC ID No: 40 y 75; SEC ID No: 40 y 90; SEC ID No: 40 y 93; SEC ID No: 75 y 90; SEC ID No: 75 y 93; SEC ID No: 90 y 93, o sus regiones reguladoras. El mutante puede ser una bacteria gram negativa y de manera ventajosa el mutante es una Pasteurella, tal como una P. multocida, por ejemplo P-1059

o PM70.

[0094] Se conocen bien los métodos para introducir las mutaciones en las regiones genómicas específicas y serán evidentes para el experto en la materia a partir de esta descripción y el conocimiento de la técnica. Por ejemplo, el gen o secuencia completa que se va a mutar o un fragmento se clonan en un vector y se modifican con el fin de suprimir su expresión y/o su actividad biológica. El vector de introduce en las bacterias, por ejemplo, mediante electroporación (por ejemplo, Jablonski L. et al., Microbial Pathogenesis, 1992,12, 63-68), o mediante conjugación (Lee M. D. et al., Vet. Microbiol., 1996, 50, 143-148). El fragmento de ADN modificado se reintroduce en el genoma bacteriano mediante recombinación genética, de manera ventajosa mediante recombinación homóloga entre el cromosoma bacteriano y el vector. Como ejemplo, el vector puede ser un plásmido suicida según se describe en Cardenas (Cardenas M et al., Vet Microbiol 3 de Mayo de 2001; 80(1): 53-61). Ventajosamente, este vector comprende adicionalmente entre los dos brazos o regiones flanqueantes (utilizadas en la recombinación homóloga) una secuencia de polidetención (por ejemplo, 6 codones de detención, uno en cada marco de lectura) para bloquear una posible traducción.

[0095] El microorganismo atenuado de la descripción, por ejemplo, bacterias gram negativas, tales como P. multocida, puede comprender adicionalmente por lo menos una secuencia de ácidos nucleicos homóloga o heteróloga insertada en su genoma. Esto es útil para reproducir moléculas de ácido nucleico heterólogas y/o para la expresión de moléculas de ácido nucleico heterólogas, ya sea in vivo o in vitro. La secuencia de ácidos nucleicos heteróloga codifica de manera ventajosa un inmunógeno, antígeno o epítopo de un agente patogénico viral, parasítico o bacteriano que es diferente de los expresados de forma natural por el microorganismo atenuado. Esta secuencia heteróloga puede codificar un inmunógeno, antígeno o epítopo de otra cepa del microorganismo o bacteria, por ejemplo, otra cepa de P. multocida. Un inmunógeno o antígeno es una proteína o polipéptido capaz de inducir una respuesta inmune contra el agente patogénico o un antígeno secretado del agente patogénico, y contiene uno o más epítopos; y epítopo es un péptido o polipéptido que es capaz de inducir una respuesta inmune contra el agente patogénico o un antígeno secretado del agente patogénico.

[0096] Las secuencias de ácidos nucleicos heterólogas que son adecuadas para este uso en dicho vector serán evidentes para el experto en la materia (Fedorova ND y Highlander SK, Infect Immun 1997, 65(7): 2593-8) e incluyen, por ejemplo, aquellas que provienen de los miembros de la familia de Pasteurellaceae (de manera destacada, Pasteurella multocida, Pasteurella haemolytica, Pasteurella anatipestifer, Actinobacillus pleuropneumoniae), o de bacterias como E. coli, Salmonella, campylobacter.

[0097] La secuencia heteróloga se inserta de manera ventajosa de tal manera que el microorganismo la expresa cuando se administra en el huésped con el fin de desarrollar una respuesta inmune contra el microorganismo atenuado y contra dicho inmunógeno expresado. La secuencia heteróloga se inserta o se une operativamente de manera ventajosa en dirección 3’ respecto a los elementos reguladores permitiendo su expresión, tal como un promotor. Se pueden añadir también secuencia de nucleótidos útiles para la dirección y la secreción de la proteína. Por consiguiente, se pueden incluir secuencias líder o señal en los productos expresados para facilitar el transporte a través de la pared celular y/o la secreción.

[0098] En una realización la secuencia homóloga o heteróloga se inserta en la secuencia de nucleótidos seleccionada o el gen seleccionado utilizados para la atenuación; de manera ventajosa la secuencia homóloga o heteróloga se inserta en uno de los locus correspondientes con los locus de inserción de transposón identificados aquí.

[0099] Para mejorar la expresión, el uso de los codones se puede adaptar a los vectores bacterianos utilizados.

[0100] Los mutantes atenuados de la descripción también pueden comprender una secuencia de ácidos nucleicos que codifica una proteína terapéutica, un alérgeno, un factor de crecimiento o una citoquina o un inmunomodulador o inmunoestimulador, tal como un GM-CSF, por ejemplo, un GM-CSF adaptado a las especies diana (por ejemplo, si el vector atenuado es P. multocida, para al administración a animales bovinos, el GM-CSF bovino podría ser expresado por el vector, por ejemplo, con la expresión por el vector de otra proteína, péptido, polipéptido, antígeno, inmunógeno o epítopo heterólogos).

[0101] Según un aspecto adicional de la descripción, los microorganismos atenuados se utilizan para producir composiciones inmunogénicas atenuadas vivas o composiciones de vacuna atenuadas vivas.

[0102] Según un aspecto ventajoso de la descripción, el microorganismo atenuado es una bacteria gram negativa, tal como una Pasteurella, por ejemplo, una P. multocida, por ejemplo P-1059 o PM70, mutada según la presente invención.

[0103] De manera ventajosa, tal como se describe aquí, el microorganismo puede actuar como un vector recombinante para inmunizar y/o vacunar animales o humanos contra infecciones causadas por otros agentes diferentes a Pasteurella.

[0104] Las composiciones inmunogénicas o las composiciones de vacuna comprenden el mutante atenuado y un portador, excipiente, diluyente o vehículo farmacéuticamente o veterinariamente aceptable, y opcionalmente un estabilizador y/o un adyuvante. El mutante atenuado puede ser un vector que expresa adicionalmente moléculas de ácido nucleico heterólogas al vector, tal como un epítopo, antígeno, inmunógeno y/o factor de crecimiento, citoquina, inmunoregulador o inmunoestimulador heterólogos.

[0105] El término de "composición inmunogénica" cubre en el presente documento cualquier composición capaz, una vez se ha inyectado a animales o a un ser humano, de obtener una respuesta inmune contra el patógeno diana. El término de "composición de vacuna" o "vacuna" cubre en el presente documento cualquier composición capaz, una vez se ha inyectado a animales o a un ser humano de inducir una respuesta inmune protectora contra el patógeno diana.

[0106] El vehículo farmacéuticamente o veterinariamente aceptable puede ser agua o solución salina, pero puede, por ejemplo, comprender también un medio de cultivo de bacterias.

[0107] La bacteria atenuada viva según la invención puede liofilizarse, de manera ventajosa con un estabilizante. Se puede llevar a cabo la liofilización según los procedimientos de liofilización normalizados bien conocidos. Los estabilizantes farmacéuticamente o veterinariamente aceptables pueden ser carbohidratos (por ejemplo, sorbitol, manitol, lactosa, sacarosa, glucosa, dextrano, trehalosa), glutamato de sodio (Tsvetkov T et al., Cryobiology 1983, 20(3): 318-23; Israeli E et al., Cryobiology 1993, 30(5): 519-23), proteínas tales como peptona, albúmina, lactoalbúmina o caseína, proteínas que contienen agentes tales como leche desnatada (Mills CK et al., Cryobiology 1988, 25(2): 148-52; Wolff E et al., Cryobiology 1990, 27(5): 569-75), y tampones (por ejemplo, tampón fosfato, tampón fosfato de metal alcalino).

[0108] Se puede usar un adyuvante para hacer solubles las preparaciones liofilizadas.

[0109] Ejemplos de adyuvantes son aceite en agua, emulsiones de agua en aceite en agua basadas en aceite mineral y/o aceite vegetal y tensoactivos no iónicos, tales como copolímeros en bloque, Tween®, Span®. Otros adyuvantes adecuados son por ejemplo la vitamina E, las saponinas, y Carbopol®, hidróxido de aluminio o fosfato de aluminio ("Vaccine Design, The subunit and adjuvant approach", Pharmaceutical Biotechnology, vol. 6, editado por Michael F. Powell y Mark J. Newman, 1995, Plenum Press Nueva York).

[0110] Se pueden almacenar las bacterias atenuadas vivas a -70ºC en un medio que contiene glicerol.

[0111] Opcionalmente, la composición inmunogénica o de vacuna se puede combinar con uno o más inmunógenos, antígenos o epítopos seleccionados entre otros microorganismos o virus patógenos en una forma inactivada o viva.

[0112] Otro aspecto de la descripción es la secuencia de nucleótido o gen según la descripción, tal como las secuencias de nucleótidos o genes según la descripción designadas como SEC ID No: 2, 6, 9, 12, 16, 19, 22, 25, 28, 31, 34, 37, 40, 43, 46, 49, 52, 55, 58, 61, 64, 67, 70, 75, 78, 81, 84, 87, 90 y 93, y de manera ventajosa aquellas designadas como SEC ID No: 1, 4, 5, 8, 11, 14, 15, 18, 21, 24, 27, 30, 33, 36, 39, 42, 45, 48, 51, 54, 57, 60, 63, 66, 69, 72. 73, 77, 80, 83, 86, 89, 92, 95, 96, 97.

[0113] Otro aspecto de la descripción es el uso de las secuencias de nucleótidos o los genes según la descripción, para la expresión y la producción de péptidos, polipéptidos o proteínas, o más generalmente, productos de expresión, por ejemplo, inmunógenos, antígenos o epítopos. En una realización, se pueden usar los polipéptidos o péptidos o proteínas codificados por estas secuencias de nucleótidos o los genes como subunidades de inmunógenos antígenos o epítopos en las composiciones inmunogénicas o vacunas. Se pueden utilizar en la práctica de la descripción, sin una gran experimentación, procedimientos de determinación de epítopos, tales como la generación de bibliotecas de péptidos solapantes (Hemmer B. Et al., Immunology Today, 1998, 19 (4), 163-168), Pepscan (Geysen h. M. et al., Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 1984, 81 (13), 3998-4002; Geysen h. M. et al., Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 1985, 82 (1), 178-182; Van der Zee r. et al., Eur. J. Immunol., 1989, 19 (1),43-47; Geysen h. M., Southeast Asian J. Trop. Med. Public health, 1990,21 (4), 523-533; Multipin® Peptide Synthesis Kits de chiron) y algoritmos (De Groot A. et al., Nature Biotechnology, 1999, 17, 533-561).

[0114] Los polipéptidos ventajosos son aquellos que tiene las secuencias de aminoácidos identificadas como SEC ID No: 3, 7, 10, 13, 17, 20, 23, 26, 29, 32, 35, 38, 41, 44, 47, 50, 53, 56, 59, 62, 65, 68, 71, 76, 79, 82, 85, 88, 91, 94,

o las codificadas por las secuencias de nucleótidos SEC ID No: 2, 6, 9, 12, 16, 19, 22, 25, 28, 31, 34, 37, 40, 43, 46, 49, 52, 55, 58,61, 64, 67, 70, 75, 78, 81, 84, 87, 90, 93. También se pueden utilizar de manera ventajosa los epítopos de estos polipéptidos.

[0115] La descripción comprende los polipéptidos equivalentes de otra bacteria, tal como una bacteria gram negativa, de manera ventajosa un miembro de la familia de Pasteurellacaea, por ejemplo P. multocida, P. haemolytica, P. anatipestifer, A. pleuropneumoniae, y de manera más ventajosa en el genoma de cualquiera de las diversas cepas de P. multocida están de este modo incluidas por polipéptidos de equivalencia cuyas secuencias de aminoácidos tienen por lo menos aproximadamente un 70%, por lo menos aproximadamente un 75%, por lo menos aproximadamente un 80%, por lo menos aproximadamente un 85%, por lo menos aproximadamente un 90%, por lo menos aproximadamente un 95%, y por lo menos aproximadamente un 96, 97, 98 ó 99% de identidad con una de las secuencias de aminoácidos identificadas como SEC ID No: 3, 7, 10, 13, 17, 20, 23, 26, 29, 32, 35, 38, 41, 44, 47, 50, 53, 56, 59, 62, 65, 68, 71, 76, 79, 82, 85, 88, 91, 94 y/o polipéptidos que tiene la misma función o funciones biológicas que los polipéptidos identificados anteriormente con las secuencias. El criterio para establecer la identidad

o la misma función biológica se ha descrito anteriormente.

[0116] La descripción también comprende los fragmentos inmunogénicos de estos polipéptidos, que tienen por lo menos una cadena de 10 aminoácidos del polipéptido, por lo menos 20, tal como por lo menos 30, de manera ventajosa por lo menos 50 y de manera más ventajosa por lo menos 70, por ejemplo, fragmentos de los polipéptidos que contienen por lo menos 10 aminoácidos contiguos del polipéptido, de manera ventajosa por lo menos 20 aminoácidos contiguos del polipéptido, tal como por lo menos 30 y de manera más ventajosa por lo menos 50 aminoácidos contiguos del polipéptido, e incluso de manera más ventajosa por lo menos 70 aminoácidos contiguos del polipéptido. Naturalmente, un fragmento es menor que el polipéptido completo. Un fragmento se puede combinar con otros polipéptidos, por ejemplo, en polipéptidos de fusión; por ejemplo, un polipéptido de la descripción o fragmento del mismo puede ser una parte de un polipéptido de fusión que incluye otra parte (otro polipéptido), por ejemplo, un parte que aumenta la inmunogenicidad y/o una parte que aumenta la secreción, tal como una parte lipoproteica que aumenta la inmunogenicidad o una parte de secuencia señal o líder. Por consiguiente, la descripción prevé la expresión de polipéptidos, proteínas, antígenos, inmunógenos o epítopos – ya sean las secuencias o fragmentos de las mismas identificadas aquí o aquellas que son heterólogas a los vectores de la descripción – como fusiones, por ejemplo, como parte de un polipéptidos de fusión, por ejemplo, un polipéptido de fusión que de manera ventajosa incluye una parte que aumenta la inmunogenicidad, tal como una parte lipoproteica y/o una parte que aumenta la secreción, tal como una parte de secuencia señal o líder.

[0117] Los polipéptidos o fragmentos se producen de manera ventajosa mediante expresión in vitro. Las secuencias de nucleótidos según la descripción (por ejemplo SEC ID No: 2, 6, 9, 12, 16, 19, 22, 25, 28, 31, 34, 37, 40, 43, 46, 49, 52, 55, 58, 61, 64, 67, 70, 75, 78, 81, 84, 87, 90, 93) o fragmentos de las mismas se insertan en un vector, unidas operativamente a elementos reguladores, tal como promotor, región de unión a ribosoma y terminador, y codón de partida y codón de detención. Los vectores ventajosos son plásmidos útiles para la expresión in vitro en bacterias, es decir, Escherichia coli (Mahona F et al., Biochimie 1994,46 (1): 9-14 ; Watt M A et al., Cell Stress chaperones 1997, 2(3): 180-90 ; Frey J res. Microbiol. 1992, 143(3): 263-9).

[0118] Estos polipéptidos también se pueden sintetizar químicamente (Luo Y et al., Vaccine 1999, 17(7-8): 821-31).

[0119] Un aspecto de la descripción es de este modo una composición inmunogénica o de vacuna que comprende por lo menos un polipéptido o fragmento según la descripción (subunidad de la composición inmunogénica o de vacuna) o por lo menos un vector de expresión in vivo, tal como se describe aquí (composición inmunogénica o de vacuna recombinante viva), y un portador, excipiente, diluyente o vehículo veterinariamente o farmacéuticamente aceptable y opcionalmente un adyuvante. Ejemplos de dichos ingredientes se han descrito aquí en relación con la vacuna viva.

[0120] En otra realización, estas secuencias de nucleótidos o sus fragmentos se pueden insertar en vectores recombinantes para producir composiciones inmunogénicas o de vacuna recombinantes vivas capaces de expresar in vivo en el huésped el polipéptido codificado por esta secuencia de nucleótidos o fragmento.

[0121] El vector de expresión in vivo puede ser un vector de polinucleótidos o plásmido (EP-A2-1001025; Chaudhuri P res. Vet. Sci. 2001, 70(3), 255-6), virus (por ejemplo adenovirus, poxvirus, tal como la viruela aviar (US-A5,174,993 US-A-5,505,941 y US-A-5,766,599) o la viruela de canario (US-A-5,756,103)) o bacterias, es decir, Escherichia coli o Salmonella sp.

[0122] Los polipéptidos y fragmentos de la descripción también se pueden utilizar en terapia.

[0123] Los polipéptidos y fragmentos también se pueden utilizar como reactivos en reacciones anticuerpo-antígeno. Por consiguiente, otro aspecto de la descripción es de este modo un método de diagnóstico y/o un kit para detectar la infección por la bacteria grama negativa. Los kits, por ejemplo, ELISA, pueden incluir por lo menos un polipéptido

o fragmento según la descripción (por ejemplo, por lo menos un polipéptido identificado por la secuencia en la presente invención o un fragmento de la misma tal como se describen aquí).

[0124] Los anticuerpos contra los polipéptidos o fragmentos de la presente invención (por ejemplo, polipéptidos identificados por la secuencia de la presente invención o fragmentos de la misma tal como se describen aquí) se pueden utilizar como reactivo de diagnóstico o en inmunización pasiva o vacunación o en terapia. Las cantidades de anticuerpo administradas en inmunización pasiva pueden ser las mismas o análogas a las cantidades utilizadas en la técnica, tales como las del conocimiento en la técnica, el experto en la materia puede realizar la inmunización pasiva sin demasiada experimentación.

[0125] Otro aspecto de la descripción es una preparación de anticuerpos que comprende un anticuerpo específico para un polipéptido o un fragmento según la descripción y métodos de diagnóstico que utilizan el mismo. Con respecto a un anticuerpo específico para un polipéptido, se entiende que el anticuerpo se une preferiblemente al polipéptido, por ejemplo, el anticuerpo se une al polipéptido y no a otros polipéptidos o tiene una especificidad al polipéptido que es aceptablemente particular para el polipéptido, de manera que el anticuerpo se puede utilizar para aislar el polipéptido de una muestra o detectar su presencia en una muestra con no más de un 5% de falsos positivos, utilizando técnicas conocidas en el sector o descritas en documentos citados aquí, incluyendo Sambrook, infra.

[0126] Los anticuerpos pueden ser policlonales o monoclonales.

[0127] Los métodos para producir anticuerpos son conocidos por el experto en la materia.

[0128] Si se desean anticuerpos policlonales, se inmuniza un animal seleccionado (por ejemplo, ratón, conejo, cabra, caballo, etc.) con un polipéptido o un fragmento. Se recoge el suero del animal inmunizado y se trata según procedimientos conocidos y posiblemente se purifica. Véase, por ejemplo Jurgens et al. J. Chrom., 1985, 348: 363

370.

[0129] La metodología general para producir anticuerpos monoclonales mediante la utilización de la tecnología de hibridoma es conocida. Se pueden crear líneas celulares productoras de anticuerpos inmortales mediante la fusión celular, y también mediante otras técnicas, tales como la transformación directa de linfocitos B con ADN oncogénico,

o transfección con virus de Epstein-Barr. Véase, por ejemplo J. E. Liddell "A practical guide to monoclonal antibodies" ed. John Wiley y sons, 1991, p.188; S. J. de StGroth et al. J. Immunol. Methods, 1980, 35(1-2), 1-21.

[0130] Las secuencias de nucleótidos según la presente invención y sus fragmentos se pueden utilizar como sondas para hibridación, por ejemplo en un método de diagnóstico.

[0131] Se utilizan de manera ventajosa condiciones de hibridación rigurosa. Se puede hacer referencia a las descritas por Sambrook et al., Molecular cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989), 1.101-1.104. La hibridación bajo condiciones rigurosas significa que aún se observa una señal positiva de hibridación después del lavado durante 1 hora con 1 x tampón SSC y SDS al 0,1% a 55°C, de manera ventajosa a 62°C y de manera más ventajosa a 68°C, por ejemplo, durante 1 hora en 0,2 x tampón SSC y SDS al 0,1 % a 55°C, tal como a 62°C y de manera ventajosa a 68°C.

[0132] También se pueden caracterizar secuencias de nucleótidos por su capacidad de unirse bajo condiciones de hibridación rigurosas. De este modo, la descripción puede prever secuencias de ácidos nucleicos identificadas en la presente invención y moléculas de ácido nucleico que se unen a las mismas bajo condiciones de hibridación rigurosas.

[0133] Las secuencias de nucleótidos según la presente invención y sus fragmentos se pueden utilizar como cebadores para la PCR o en un método similar que implique la amplificación y/o hibridación, por ejemplo, para la detección de bacterias gram negativas en cualquier medio, por ejemplo, muestras de tejido, fluidos biológico, agua, alimentos.

[0134] De manera ventajosa, se utilizan fragmentos de la secuencia de nucleótidos que tienen por lo menos 20 ácidos nucleicos contiguos, tal como por lo menos 30 ácidos nucleicos contiguos, por ejemplo, por lo menos ácidos nucleicos 50 contiguos, por ejemplo por lo menos ácidos nucleicos 70 contiguos o de manera más ventajosa por lo menos 100 ácidos nucleicos contiguos de secuencias de nucleótidos o genes según la descripción, por ejemplo, de las SEC ID No: 2, 6, 9, 12, 16, 19, 22, 25, 28, 31, 34, 37, 40, 43, 46, 49, 52, 55, 58, 61, 64, 67, 70, 75, 78, 81, 84, 87, 90, 93.

[0135] Además, la presente descripción se refiere a métodos para inmunizar contra o evitar la infección bacteriana o proteger contra la infección bacteriana en animales, de manera ventajosa animales susceptibles de la misma, tal como aves, conejo, animales bovinos, especies porcinas, y de manera más ventajosa en especies aviares, tales como pollo, pavo y pato (incluyendo reproductores, jóvenes y ponedores) o en un ser humano.

[0136] Según estos métodos, se administran (1) una composición inmunogénica o de vacuna atenuada viva de la descripción, o (2) una subunidad de la composición inmunogénica o de vacuna de la descripción, o (3) una composición inmunogénica o de vacuna recombinante viva de la descripción, o combinaciones de las mismas. Naturalmente, se pueden utilizar las realizaciones de la invención con otras composiciones inmunogénicas o de vacuna que no son de la invención, por ejemplo, en procesos de sensibilización y refuerzo, tales como cuando se administra primero una composición inmunogénica o de vacuna de la invención y después se administra una composición inmunogénica o de vacuna, o viceversa.

[0137] La administración se puede realizar de manera destacada mediante inyección intramuscular (IM), intradérmica (ID) o subcutánea (Sc) o por vía intranasal, intratraqueal o administración oral. La composición inmunogénica o la vacuna según la invención se administra de manera ventajosa mediante jeringa, aparato sin aguja (como, por ejemplo Pigjet, Avijet, Dermojet o Biojector (Bioject, oregon, USA)), pulverizador, agua de beber, gotas para los ojos.

[0138] Las administraciones ventajosas para la composición inmunogénica o vacuna atenuada viva son in ovo, por vía oral (por ejemplo, agua de beber, pulverización de todo el cuerpo), ocular (por ejemplo, gotas para los ojos, pulverización de todo el cuerpo), traqueal (por ejemplo, pulverizador), intradérmica, subcutánea (Sc) o intramuscular (IM).

[0139] La cantidad de microorganismos atenuados vivos se puede determinar y optimizar por el experto en la materia, sin una gran experimentación, a partir de esta descripción y el conocimiento de la técnica. En general, se puede administrar un animal (incluyendo un ser humano) con aproximadamente 104-109 CFUs, de manera ventajosa aproximadamente 105-108 cFUs y de manera más ventajosa aproximadamente 106-107 CFUs en una dosis unitaria individual.

[0140] Mediante la ruta intramuscular, se puede administrar a un animal aviar con aproximadamente 104-107 CFUs, de manera ventajosa aproximadamente 105-106 CFUs en una dosis unitaria individual. El volumen de una dosis unitaria individual puede ser entre aproximadamente 0,2 ml y aproximadamente 0,5 ml y de manera ventajosa aproximadamente 0,3 ml. Por vía oral, traqueal u ocular, se puede administrar a un animal aviar con aproximadamente 105-108 cFUs, de manera ventajosa aproximadamente 106-107 CFUs en una dosis unitaria individual. Para la administración por pulverización, el volumen se ajusta al aparato y al tamaño de las gotas, desde aproximadamente 30 a aproximadamente 600 ml para aproximadamente 1000 animales y de manera ventajosa aproximadamente 0,2 ml por animal.

[0141] Para animales bovinos y porcinos, las rutas ventajosas son IM y SC. El animal se puede administrar con aproximadamente 104-109 CFUs, de manera ventajosa con aproximadamente 105-108 CFUs en una dosis unitaria individual. El volumen de una dosis unitaria individual puede estar entre aproximadamente 0,2 ml y aproximadamente 5,0 ml y de manera ventajosa entre aproximadamente 0,5 ml y aproximadamente 2,0 ml y de manera más ventajosa aproximadamente 1,0 ml.

[0142] Los conejos se pueden administrar mediante una ruta IM o SC con aproximadamente 104-108 cFUs, de manera ventajosa aproximadamente 105-107 CFUs en una dosis unitaria individual. El volumen de una dosis unitaria individual puede estar entre aproximadamente 0,2 ml y aproximadamente 0,5 ml y de manera ventajosa aproximadamente 0,5 ml. También se les puede administrar vía ID con aproximadamente 104-108 CFUs, de manera ventajosa con aproximadamente 105-107 CFUs en una dosis unitaria individual. El volumen de una dosis unitaria individual puede estar entre aproximadamente 0,1 ml y aproximadamente 0,2 ml.

[0143] A continuación se describirá la invención mediante los siguientes ejemplos no limitantes.

EJEMPLOS

Ejemplo 1: Construcción de una biblioteca de mutantes de transposón de P. multocida etiquetados con firma (cribado STM)

Construcción de transformantes pLOF/km SM10Apir etiquetados

[0144] Se produjeron las etiquetas según se describe en Hensel et al.., (Science, 1995, 269:400-403). Se seleccionaron inicialmente los plásmidos pUTminiTn5Km2 etiquetados que contienen etiquetas que se hibridan bien pero no se hibridan en cruzado entre sí. Se encontró que el transposón mini-Tn5 en el vector pUTminTn5Km2 etiquetado no se transponía en las diversas cepas de Pasteurella multocida. En cambio, se ha observado que el transposón mini-Tn10 funciona en P. multocida (Lee et al., Vet Microbiol, 1996, 50:143-8). Las etiquetas preseleccionadas se transfirieron por tanto desde los vectores pUTminiTn5 en el plásmido pLOF/Km que contenía mini-Tn10 (Herrero et al., J. Bacteriology, 1990, 172: 6557-6567). Se amplificaron las etiquetas mediante la PCR usando cebadores que se unen con el vector pUTminiTn5Km2, en cualquiera de los lados del sitio KpnI en el que se clonaron las etiquetas. Estos cebadores incluían las secuencias para la enzima de restricción SaII. A continuación se digirieron los productos de la PCR con SaII y se clonaron en el sitio SaII de una versión modificada del vector pLOF/Km, en la que un sitio SaII ha sustituido el único sitio de clonación SfII. A continuación, se transformaron los plásmidos pLOF/Km etiquetados en la cepa 8M10Apir de E. coli (Kmr, thi, thr, leu, tonA, lacY, supE, recA::RP4-2Tc::MuApir) (Miller V.L. et al., J. Bacteriol., 1988, 170: 2575-83). Esta cepa puede movilizar plásmidos tales como pLOF/Km en bacterias receptoras mediante conjugación.

Procesos de selección y de contraselección

[0145] El proceso de conjugación requiere un procedimiento de selección de la P. multocida receptora, que ha adquirido el plásmido pLOF/KM y un procedimiento de contraselección frente al donante SM10Apir de E. coli.

[0146] En el procedimiento de selección, se selecciona la P. multocida receptora para usar kanamicina, que está codificada por el transposón mini-Tn10.

[0147] Inicialmente, para la contraselección en conjugaciones frente al donante de E. coli, se usó un mutante

5 espontáneamente resistente a la estreptomicina de la cepa P-1059 de Pasteurella. Sin embargo, pareció que esta cepa atenuaba su virulencia en pavos y de esta manera no era utilizable aquí. Las cepas de Pasteurella multocida pueden crecer en medios químicamente definidos (CDM) (Hu et al., Infection and Immunity 1986, 804-810). Se utilizó una versión modificada de este medio químicamente definido que contenía agar pero no contenía leucina para permitir la contraselección frente al donante de E. coli. La cepa de Pasteurella fue capaz de crecer en este medio, la

10 composición del cual se proporciona en la tabla 1, mientras que la cepa SM10Apir de E. coli, que es un auxótrofo de leucina, no lo fue.

Tabla 1:

Componente

Concentración g/litro

Agar noble

20

Na2BPO4.12H2O

32,31

KH2PO4

1,368

NaCl

1,196

Glucosa

6,0

Clorhidrato de L-Arginine

0,24

Clorhidrato de L-cisteína

0,12

L-serina

0,2

Ácido L-glutámico

0,15

L-isoleucina

0,064

L-fenilalanina

0,095

Ácido L-aspártico

1,6

L-tirosina

0,08

Clorhidrato de tiamina

0,0002

MgSO4·7H2O

0,246

Pantotenato de calcio

0,004

Nicotinmida

0,01

Ácido orótico

0,003

Paso de la cepa de P. multocida en medio CDM

[0148] Se reavivó una ampolla liofilizada de la cepa de P. multocida (USDA P-1059, disponible de la American Type

20 Culture Collection, número de acceso ATCC 15742) mediante la adición de 200 !l de BHI (infusión de cerebrocorazón) y se rayó una alícuota de la suspensión sobre una placa de agar con BHI, y se incubó la placa a 37ºC durante la noche. El material de las colonias de esta placa se usó para inocular un caldo de cultivo con BHI, que se incubó con agitación a 37ºC durante la noche. Se añadió glicerol hasta una concentración final de 15% v/v y se almacenaron las alícuotas congeladas a -80ºC. Se rayó una muestra de una de estas alícuotas congeladas sobre

25 una placa de agar con BHI y se incubó durante la noche. El material de las colonias de esta placa con BHI se rayó a continuación sobre placas de agar con CDM con la composición proporcionada en la tabla 1 y se incubó a 37ºC durante 3 días. El material de las colonias de esta placa con CDM se inoculó en un caldo de cultivo con BHI y se incubó con agitación a 37ºC durante la noche. Se añadió glicerol a este cultivo hasta una concentración final de 15% v/v y se congelaron las alícuotas a -80ºC. Se denominó esta cepa 16084 como (CDM).

Construcción del banco de mutantes

[0149] Se conjugaron los transformantes pLOF/km SM10Apir etiquetados con la cepa 16084 (CDM) de P. multocida. Para minimizar el aislamiento de los mutantes hermanos (mutantes con el transposón localizado en la misma

35 posición que surge debido a la replicación del mutante durante el procedimiento de conjugación) cada transformante SM10Apir etiquetado se conjugó con la cepa P. multocida en al menos tres conjugaciones separadas. Se seleccionaron los mutantes de transposón de Pasteurella en placas de agar CDM suplementadas con 50 !g/ml de kanamicina.

40 [0150] A continuación se rayaron los mutantes resistentes a la kanamicina de cada uno de los transposones etiquetados para formar colonias únicas dos veces sobre placas de agar con BHI y con 50 !g/ml de kanamicina. A continuación se inocularon las colonias únicas en caldos de cultivo con BHI, se hicieron crecer durante la noche a 37ºC con agitación. A continuación se añadió glicerol hasta una concentración final de 15% v/v y se almacenaron los mutantes a -80ºC en viales individuales.

Ejemplo 2: Cribado del banco de mutantes de Pasteurella etiquetada con firma para los mutantes con virulencia atenuada en pavos

[0151] Se hicieron crecer cultivos de mutantes de P. multocida para la inoculación de pavos mezclando 20 !l de cada uno de las soluciones madre son glicerol de los mutantes obtenidos en el ejemplo I con 200 !l de medio de cultivo con BHI, suplementado con 50 !g/ml de kanamicina, y colocándolos en placas de microtitulación de 96 pocillos. Estas placas de microtitulación se incubaron en condiciones estáticas durante aproximadamente 18 horas a 37ºC. A continuación, se mezclaron alícuotas de 10 !l de los cultivos de 18 horas de cada mutante con 200 !l de medio de cultivo con BHI suplementado con 50 !g/ml de kanamicina en una placa de microtitulación reciente y se incubó la placa a 37ºC durante aproximadamente 4 horas. Se detuvieron los cultivos en la fase exponencial de crecimiento y se transfirieron 100 !l de los cultivos de cada mutante a una placa de microtitulación reciente y se usaron para la determinación de la densidad óptica (DO) a 650 nm.

[0152] Se formaron combinados de inóculos o de entrada mezclando los restantes 100 !l de los cultivos de 4 horas. Cada cultivo de entrada estaba constituido por 48 mutantes diferentes. Se determinó el título de estas suspensiones combinadas mediante análisis FACS (clasificador celular activado por fluorescencia) de alícuotas de 1000 !l. A continuación se diluyeron alícuotas (1 ml) de la suspensión combinada en agua fisiológicamente tamponada para obtener una suspensión con un título de 2·107 cfu/ml. A continuación se inocularon grupos de 5 pavos de tres semanas de edad intramuscularmente con alícuotas de 0,5 ml de esta suspensión (107 ufc por animal). Se determinó el estado serológico de los pavos antes de la inoculación mediante cribado para la presencia de anticuerpos de Pasteurella en muestras de sangre tomadas un día antes de la inoculación. Se recogieron las células del resto de combinados de entrada mediante centrifugación y se extrajo el ADN cromosómico de los residuos celulares.

[0153] Aproximadamente 14 horas después de la inoculación, se tomó 1 ml de muestra de sangre de 3 de los 5 pavos. Se emplacaron las diluciones en serie (10-1 a 10-7) de las muestras de sangre en placas de agar Columbia suplementado con sangre de ovejas al 5%. Se incubaron las placas a 37ºC durante 24 horas tras lo cual se volvieron a suspender aproximadamente 10000 colonias de Pasteurella en medio con BHI. Estas suspensiones, que se denominaron combinado de salida, se centrifugaron a continuación y se extrajo el ADN cromosómico procedente del residuo celular.

[0154] Los mutantes de Pasteurella que estaban presentes en el combinado de entrada pero que no se volvieron a aislar de los pavos, se identificaron mediante la amplificación por PCR de las etiquetas con firma presentes en las muestras de ADN procedentes de los combinados de entrada y salida, y se llevó a cabo la hibridación de los productos de la PCR amplificados frente a las inmunotransferencias cargadas con el ADN que codificaba las etiquetas con firma, según se describe en Hensel et al. (Science 1995, 269:400-403). Se consideraron estos mutantes como de virulencia potencialmente atenuada. Se confirmó esta atenuación mediante cribado para una ausencia de mortalidad tras las infecciones individuales de los potenciales mutantes en pavos.

Ejemplo 3

Confirmación de la atenuación de la virulencia en pavos de los mutantes de P. Multocida

[0155] Se revivieron los mutantes de transposón identificados como potencialmente atenuados en el ejemplo 2 o los mutantes que tienen limitada la capacidad para crecer en el cultivo, mezclando 20 !l de las soluciones madre con glicerol con 200 !l de medio de cultivo con BHI suplementado con 50 !g/ml de kanamicina en placas de microtitulación. Se incubaron estas placas de microtitulación en condiciones estáticas durante 18 horas a 37ºC. A continuación se tomaron alícuotas de 10 !l de cada mutante de estos cultivos y se mezclaron con 200 !l de medio con BHI, suplementado con 50 !g/ml de kanamicina en una placa de microtitulación reciente y se incubó esta placa en condiciones estáticas durante aproximadamente 4 horas. Se detuvieron los cultivos en la fase exponencial de crecimiento y se transfirieron 100 !l de los cultivos de cada mutante a una placa de microtitulación reciente y se usaron para la determinación de la densidad óptica (DO) a 650 nm. A continuación, se diluyeron los cultivos de cada uno de los mutantes 1 en 10000 en agua fisiológicamente tamponada para obtener una concentración de aproximadamente 2·104 ufc/ml. A continuación, se inocularon alícuotas (0,5 ml) de estas diluciones intramuscularmente en 2 pavos de cinco semanas de edad (104 ufc por animal). Se determinó el estado serológico de unos pocos animales de cada grupo de pavos a partir de las muestras de sangre tomadas el día antes de la inoculación. Se vigilaron los pavos durante los siguientes 7 días por la mortalidad. De los mutantes ensayados 72 no dieron como resultado mortalidad en ninguna de las dos aves inoculadas. Estos 72 mutantes se consideraron con virulencia atenuada.

Ejemplo 4: Caracterización de los mutantes de inserción del transposón identificados tras el cribado en pavos.

[0156] Se identificaron los sitios de inserción del transposón en el genoma de los mutantes de P. multocida atenuados clonando el ADN que flanqueaba un lado de la inserción del transposón, tanto mediante PCR inversa como mediante PCR arbitrariamente cebada.

[0157] Se revivieron estos mutantes de las soluciones madre con glicerol a -80ºC rayando una alícuota sobre placas de agar con BHI y con 50 !g/ml de kanamicina. A continuación se usaron las colonias individuales para inocular caldos de cultivo con BHI a partir de los cuales se preparó ADN cromosómico.

[0158] Para la PCR inversa, se digirió el ADN cromosómico con un enzima de restricción que tenía un sitio de reconocimiento de 4 pares de bases, tales como Tsp509I, aTaqI o Rsal. A continuación se unió el ADN en un volumen grande para estimular la unión intramolecular. A continuación, se amplificó el ADN que flanqueaba el transposón procedente de esta plantilla de ADN unido usando cebadores dirigidos hacia fuera que se hibridan a la secuencia conocida del transposón, tales como StipJ (SEC ID No: 98,20 unidades) (5’ ATC TGA TCC TTC AAC TCA GC 3’), StipA (SEC ID No: 99, 19 unidades) (5’ CGC AGG GCT TTA TTG ATT C 3’), KTGRI (SEC ID No: 100, 27 unidades) (5’ GCG GAA TTC GAT GAA TGT TCC GTT GCG 3’), Tn10Ir1 (SEC ID No: 101, 20 unidades) (5’ TTT ACC AAA ATC ATT AGG GG 3’) y Tn10Ir4 (SEC ID No: 102, 19 unidades) (5’ GAT CAT ATG ACA AGA TGT G 3’). Estos productos de PCR inversa a continuación se clonaron y secuenciaron.

[0159] Para la PCR arbitrariamente cebada, se utilizó el ADN cromosómico como plantilla en un primer ciclo de reacción de PCR con un cebador dirigido hacia fuera que se híbrida al transposón, tal como StipA, y un cebador arbitrario, tal como arb1 (SEC ID No: 103, 35 unidades) (5’ GGC CAC GCG TCG ACT AGT ACN NNN NNN NNN GAT AT 3’) o arb6 (SEC ID No: 104, 35 unidades) (5’ GGC CAC GCG TCG ACT AGT ACN NNN NNN NNN CAG CC 3’). La temperatura de hibridación de este primer ciclo de reacción de PCR se establece inicialmente muy baja, aumentando la temperatura de hibridación en los ciclos posteriores. A continuación, se utiliza una parte de los productos del primer ciclo de PCR como plantilla en un segundo ciclo de PCR. Este segundo ciclo de PCR utiliza otro cebador dirigido hacia fuera, tal como KTGRI, que se híbrida al transposón en una posición que está más cerca del extremo del transposón que el cebador utilizado en el primer ciclo de PCR. El otro cebador utilizado en este segundo ciclo de PCR tiene la misma secuencia que las 20 bases de la secuencia conocida en el extremo 5’ del cebador arbitrario utilizado en el primer ciclo de PCR, tal como arb2 (SEC ID No: 105,20 unidades) (5’ GGC CAC GCG TCG ACT AGT AC 3’). Los productos de PCR de esta segunda PCR a continuación se clonaron y secuenciaron.

[0160] A continuación, las secuencias obtenidas se analizaron para identificar los marcos de lectura abiertos (ORF) que se pueden alterar por el transposón y también se utilizaron para buscar secuencias similares disponibles actualmente en la base de datos EMBL y en la secuencia de genoma de la cepa PM70 de Pasteurella multocida, determinada por la University of Minnesota (May BJ et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2001, 98(6): 3460-5).

[0161] Para información, en las siguientes secuencias de nucleótidos, N corresponde a cualquier ácido nucleico (A o C o G o T).

Mutantes 1G4, 3F4, 3G12, 12D6 y 14C10.

[0162] Los mutantes 1G4, 3F4 y 12D6 presentan exactamente el mismo sitio de inserción del transposón. La secuencia de ADN que flanquea el sitio de inserción del transposón se proporciona en la SEC ID No: 1 (775 unidades). El transposón está insertado inmediatamente en el extremo 5’ de esta secuencia.

[0163] Se localiza un codón de partida en las posiciones 179-181 de la secuencia SEC ID No: 1.

[0164] Para el mutante 3G12, la secuencia de ADN que flanquea el sitio de inserción del transposón se proporciona en SEC ID No: 95 (101 unidades). El transposón está insertado inmediatamente en el extremo 5’ de esta secuencia.

[0165] Para el mutante 14C10, la secuencia de ADN que flanquea el sitio de inserción del transposón se proporciona en SEC ID No: 96 (220 unidades). El transposón está insertado inmediatamente en el extremo 3’ de esta secuencia.

[0166] Se identificaron otras cuatro proteínas y genes de Pasteurellaceae mediante “blasts” realizados con una secuencia de 60 aminoácidos codificada por la SEC ID No: 1.

Cepa

Gen (referencia Genbank) Proteína (referencia Genbank) % de identidad

taxón 747 de P. multocida

PhyA (AF067175) PhyA (AAc67248) 100% sobre 60 aminoácidos

PM70 de P. multocida

PM0773 (AE006115) PhyA (AAK02857) 98% sobre 60 aminoácidos

P4218 de P. multocida

PhyA (AF302467) PhyA (AAK17919) 98% sobre 60 aminoácidos

P934 de P. multocida

PhyA (AF302465) PhyA (AAK17907) 95% sobre 60 aminoácidos

[0167] La localización del transposón en los mutantes 1G4, 3F4 y 12D6 corresponde a la posición 8507-8508 de la secuencia del genoma de PM70 de Pasteurella multocida, Genbank Número de Acceso AE006115. La localización del transposón en el mutante 3G12 corresponde a la posición 8609-8610 de la secuencia AE006115. La localización

5 del transposón en el mutante 14C10 corresponde a la posición 8517-8518 de la secuencia AE006115. El transposón altera un homólogo del gen PM0773 de PM70, PhyA. Se prevé que el gen de PhyA está implicado en la síntesis en cápsulas. La secuencia de nucleótidos de PM0773 se identifica aquí como SEC ID No: 2 y su secuencia de aminoácidos como SEC ID No: 3.

10 Mutantes 1G8, 9D1 y 9D8

[0168] En el mutante 1G8, el transposón está insertado inmediatamente en el extremo 3’ de la secuencia SEC ID No: 4 (226 unidades). Esta secuencia tiene dos marcos de lectura abiertos (+2 y -2) que codifican potenciales proteínas más largas. El ORF según la descripción está en el marco -2.

15 [0169] El transposón insertado en el mutante 9D1 está inmediatamente en el extremo 3’ de la secuencia SEC ID No: 5 (87 unidades).

[0170] El transposón insertado en el mutante 9D8 está después de la posición 225 de la secuencia SEC ID No:4.

20 [0171] Los transposones en los mutantes 1G8, 9D1 y 9D8 alteran un homólogo del gen de PM70, PM0871. Las localizaciones de los transposones en estos mutantes corresponden a las posiciones 9849-9850 (mutante 1G8), 8899-8900 (mutante 9D1) o 9848-9849 (mutante 9D8) de la secuencia del genoma de PM70 de Pasteurella multocida de Genbank de número de acceso AE006125. La secuencia de nucleótidos de PM0871 se identifica en la

25 presente invención como SEC ID No: 6 y su secuencia de aminoácidos como SEC ID No: 7.

[0172] Se identificó otro gen/proteína de Pasteurellaceae mediante “blasts” realizados con la SEC ID No: 7. Éste es Haemophilus influenzae HI1586 (Genbank, números de acceso U32832 y AAC23234). Se halló una identidad del 72% sobre 507 aminoácidos entre PM0871 y HI1586.

Mutante 2F2

[0173] La secuencia de ADN que flanquea el sitio de inserción del transposón se proporciona en la SEC ID No: 8 (78 unidades). El transposón está inmediatamente en el extremo 5’ de esta secuencia. Esta secuencia tiene tres marcos 35 de lectura abiertos (+1, +2 y -1) que codifican potenciales proteínas más largas. El ORF según la descripción está en el marco +2.

[0174] El transposón en el mutante 2F2 altera un gen homólogo del gen de PM70 PM1727. Este transposón se localiza en una posición que corresponde a 644-645 de la secuencia de PM70 de Pasteurella multocida, Genbank 40 número de acceso AE00621 0 (PM1727). La secuencia de nucleótidos de PM1727 se identifica en la presente invención como SEC ID No: 9 y su secuencia de aminoácidos como SEC ID No: 10.

[0175] Se identificó otro gen/proteína de Pasteurellaceae mediante “blasts” realizados con la SEC ID No: 10. Éste es haemophilus influenzae HI0621 (Genbank, números de acceso U32744 y AAC22281). Se halló una identidad del

45 77% sobre 183 aminoácidos entre PM1727 y HI0621.

[0176] PM1727 es un miembro de la superfamilia de hidrolasas, en particular se refiere a histidinol fosfato fosfatasas.

Mutante 3A2

50 [0177] La secuencia de ADN que flanquea el sitio de inserción del transposón se proporciona en la SEC ID No: 11 (467 unidades). El transposón está inmediatamente en el extremo 5’ de esta secuencia.

[0178] Se localiza un codón de detención en las posiciones 428-430.

[0179] El transposón en el mutante 3A2 se localiza en una posición que corresponde a 5103-5104 de la secuencia de PM70 de Pasteurella multocida, Genbank número de acceso AE006094 (PM0586). La secuencia de nucleótidos de PM0586 se identifica en la presente invención como SEC ID No: 12 y su secuencia de aminoácidos como SEC ID

5 No: 13.

[0180] Se identificaron otros dos genes y proteínas de Pasteurellaceae mediante “blasts” realizados con la SEC ID No: 13. Estos genes y proteínas son A1 PlpD de Pasteurella haemolytica (Genbank, números de acceso AF058703 y AAC32565) y 31 kDa de Haemophilus somnus (Genbank, número de accesos L07795 y AAA24941). Se halló una

10 identidad del 73% sobre 276 aminoácidos entre PM0586 y PlpD de P. haemolytica y del 71% sobre 273 aminoácidos entre PM0586 y 31 kDa de H. somnus.

[0181] PlpD y PM0586 son miembros de la familia de ompA.

15 Mutante 3D3

[0182] Las secuencias de ADN que flanquean ambas partes del sitio de inserción del transposón se proporcionan en las SEC ID No: 14 (204 unidades, transposón en el extremo 5’) y SEC ID No: 15 (35 unidades, transposón en el extremo 5’).

20 [0183] Se localiza un codón de detención en las posiciones 7-9 de la SEC ID No: 14 y en las posiciones 33-35 de la SEC ID No: 15.

[0184] Se identificó otro gen/proteína de Pasteurellaceae mediante “blasts” realizados con la SEC ID No: 14 y su

25 secuencia de aminoácidos codificada (65 aminoácidos). Se halló una identidad del 100% sobre 65 aminoácidos con la proteína PM0064. La localización del transposón en el mutante 3D3 corresponde a las posiciones 4778-4779 o 4787-4788 de la secuencia del genoma de PM70 de Pasteurella multocida, Genbank número de acceso AE006042, posiciones deducidas a partir de SEC ID No: 14 y 15, respectivamente. Esta diferencia es probablemente debido a la inserción del transposón que da lugar a la duplicación de varios nucleótidos en el sitio de inserción del transposón.

30 La posición 4788 se localiza en el gen de PM0064. La posición 4778 está 6 pb en dirección 3’ del codón de detención de PM0064. La secuencia de nucleótidos de PM0064 se identifica en la presente invención como SEC ID No: 16 y su secuencia de aminoácidos como SEC ID No: 17.

[0185] Se identificaron otros genes y proteínas de bacterias gram negativas mediante “blasts” realizados con la SEC 35 ID No: 17.

Cepa

Gen (referencia Genbank) Proteína (referencia Genbank) % de identidad

Haemophilus influenzae

HI0017 (U32687) HI0017 (AAC21695) 81% sobre aminoácidos 127

Escherichia coli K12

YfiD (AE000344) yfiD (AAC75632) 81% sobre aminoácidos 127

Salmonella typhi

STY2839 (AL627275) yfiD (CAD02795) 81% sobre aminoácidos 127

Salmonella typhimurium

STM2646 (AE008820) yfiD (AAL21540) 81% sobre aminoácidos 127

Serratia liquefaciens

OrfX (X66505) OrfX (CAA47136) 79% sobre aminoácidos 127

Yersinia pestis

YPO2705 (AJ414153) YPO2705 (CAC92944) 79% sobre aminoácidos 127

Vibrio cholerae

VC2361 (AE004306) VC2361 (AAF95504) 73% sobre 127 aminoácidos

Mutante 3D8

[0186] La secuencia de ADN que flanquea el sitio de inserción del transposón se proporciona en la SEC ID No: 18 (75 unidades). El transposón está inmediatamente en el extremo 3’ de esta secuencia. [0187] La localización del transposón en el mutante 3D8 corresponde entre las posiciones 7769-7770 de la

secuencia de genoma de PM70 de Pasteurella multocida, Genbank número de acceso AE006080. El transposón altera un homólogo del gen de PM70 PM0445. La secuencia de nucleótidos de PM0445 se identifica en la presente invención como SEC ID No: 19 y su secuencia de aminoácidos como SEC ID No: 20.

5 Mutante 3E1

[0188] La secuencia de ADN que flanquea el sitio de inserción del transposón se proporciona en SEC ID No: 21 (229 unidades). El transposón está inmediatamente en el extremo 3’ de esta secuencia.

10 [0189] La localización del transposón en el mutante 3E1 corresponde entre las posiciones 9195-9196 de la secuencia del genoma de Pasteurella multocida, Genbank número de acceso AE006133. El transposón altera un homólogo del gen de PM70 PM0940. La secuencia de nucleótidos de PM0940 se identifica en la presente invención como SEC ID No: 22 y su secuencia de aminoácidos como SEC ID No: 23.

15 [0190] Se identificaron otros genes y proteínas de bacterias gram negativas mediante “blasts” realizados con la SEC ID No: 17.

Cepa

Gen (referencia Genbank) Proteína (referencia Genbank) % de identidad

Haemophilus influenzae

HI0075 (U32693) nrdD (AAC21751) 87% sobre aminoácidos 713

Escherichia coli K12

nrdD (AE000495) nrdD (AAC77195) 76% sobre aminoácidos 709

Salmonella typhi

STY4791 (AL627283) nrdD (CAD06912) 76% sobre aminoácidos 709

Salmonella typhimurium

STM4452 (AE008908) nrdD (AAL23272) 76% sobre aminoácidos 709

Yersinia pestis

YPO3464 (AJ414157) nrdD (CAA92683) 75% sobre aminoácidos 709

Vibrio cholerae

VCA0511 (AE004381) VCA0511 (AAF96414) 74% sobre 709 aminoácidos

20 Mutante 3H2

[0191] La secuencia de ADN que flanquea el sitio de inserción del transposón se proporciona en SEC ID No: 24 (58 unidades). El transposón está inmediatamente en el extremo 3’ de esta secuencia. Esta secuencia tiene dos marcos de lectura abiertos (+1 y -3) que codifican potenciales proteínas más largas. El ORF según la descripción está en el

25 marco +1.

[0192] Se identificó otro gen de Pasteurellaceae mediante “blasts” realizados con la SEC ID No: 24 y con sus secuencia de aminoácidos codificada (19 aminoácidos). Se halló una identidad del 100% sobre 19 aminoácidos con la proteína PM1951. La localización del transposón en el mutante 3H2 corresponde entre las posiciones 9418-9419

30 de la secuencia de PM70 de Pasteurella multocida, Genbank número de acceso AE006231 (PM1951, uvrA). La secuencia de nucleótidos de PM1951 se identifica en la presente invención como SEC ID No: 25 y su secuencia de aminoácidos como SEC ID No: 26.

[0193] Se identificaron otros genes y proteínas de bacterias gram negativas mediante “blasts” realizados con la SEC 35 ID No: 26.

Cepa

Gen (referencia Genbank) Proteína (referencia Genbank) % de identidad

Haemophilus influenzae

UvrA (U32711) UvrA (AAC21915) 89% sobre aminoácidos 943

Escherichia coli K12

UvrA (AE000479) UvrA (AAC77028) 80% sobre aminoácidos 940

Yersinia pestis

UvrA (AJ414142) UvrA (CAC89185) 80% sobre aminoácidos 943

Vibrio cholerae

UvrA (AE004127) UvrA (AAF93567) 80% sobre aminoácidos 940

Salmonella typhi

UvrA (AL627282) UvrA (CAD09238) 80% sobre aminoácidos 941

Salmonella typhimurium

UvrA (AE008898) UvrA (AAA27250) 80% sobre aminoácidos 941

Pseudomonas aeruginosa

UvrA (AE004840) UvrA (AAG07622) 75% sobre 943 aminoácidos

[0194] UvrA es una nucleasa de escisión ABC de reparación de ADN.

Mutante 4D6

[0195] La secuencia de ADN que flanquea el sitio de inserción del transposón se proporciona en la SEC ID No: 27 (54 unidades). El transposón está inmediatamente en el extremo 5’ de esta secuencia. Esta secuencia tiene dos marcos de lectura abiertos (+1 y -2) que codifican potenciales proteínas más largas. El ORF según la descripción está en el marco +1.

10 [0196] La localización del transposón en el mutante 4D6 corresponde entre las posiciones 6492-6493 de la secuencia de PM70 de Pasteurella multocida, Genbank número de acceso AE006036. El transposón altera un homólogo del gen de PM70 PM0032 o hktE. La secuencia de nucleótidos de PM0032 se identifica en la presente invención como SEC ID No: 28 y su secuencia de aminoácidos como SEC ID No: 29.

15 [0197] Se identificó otro gen/proteína de Pasteurellaceae mediante “blasts” realizados con la SEC ID No: 29. Ésta es la catalasa de Actinobacillus actinomycetemcomitans (Genbank número de accesos AF162654 y AAF17882). Se halló una identidad del 85% sobre 482 aminoácidos entre PM0032 y catalasa de A. actinomycetemcomitans.

20 [0198] hktE es una catalasa.

Mutantes 4F4 y 12A5

[0199] Para el mutante 4F4, la secuencia de ADN que flanquea el sitio de inserción del transposón se proporciona

25 en la SEC ID No: 30 (172 unidades). El transposón está inmediatamente en el extremo 3’ de esta secuencia. Para el mutante 12A5, la secuencia de ADN que flanquea el sitio de inserción del transposón se proporciona en la SEC ID No: 97 (546 unidades). El transposón está insertado inmediatamente en el extremo 5’ de esta secuencia.

[0200] Se identificaron otros cuatro genes y proteínas de Pasteurellaceae mediante “blasts” realizados con la 30 secuencia de 57 aminoácidos codificada por la SEC ID No: 30.

Cepa

Gen (referencia Genbank) Proteína (referencia Genbank) % de identidad

taxón 747 de P. multocida

HyaC (AF067175) HyaC (AAC67251) 96% sobre 57 aminoácidos

PM70 de P. multocida

PM0776 (AE006116) AAK02860 96% sobre 57 aminoácidos

P4218 de P. multocida

FcbC (AF302467) FcbC (AAK17922) 91% sobre 57 aminoácidos

P934 de P. multocida

DcbC (AF302465) DcbC (AAK17904) 88% sobre 57 aminoácidos

[0201] La localización del transposón en el mutante 4F4 corresponde entre las posiciones 5272-5273 de la secuencia del genoma de PM70 de Pasteurella multocida, Genbank número de acceso AE006116. La localización

35 del transposón en el mutante 12A5 corresponde entre las posiciones 5275-5276 de la secuencia de AE006116. El transposón altera un homólogo del gen de PM70 PM0776. La secuencia de nucleótidos de PM0776 se identifica en la presente invención como SEC ID No: 31 y su secuencia de aminoácidos como SEC ID No: 32. Estas proteínas son UDP glucosa deshidrogenasas.

40 Mutante 4F12

[0202] La secuencia de ADN que flanquea el sitio de inserción del transposón se proporciona en la SEC ID No: 33 (226 unidades). El transposón está inmediatamente en el extremo 5’ de esta secuencia.

45 [0203] La localización del transposón en el mutante 4F12 corresponde entre las posiciones 9263-9264 de la secuencia del genoma de PM70 de Pasteurella multocida, Genbank número de acceso AE006038. El transposón altera un homólogo del gen de PM70, PM0048 o fadr. La secuencia de nucleótidos de PM0048 se identifica en la presente invención como SEC ID No: 34 y su secuencia de aminoácidos como SEC ID No: 35. Fadr es un homólogo de una proteína de E. coli que es un regulador de la transcripción del metabolismo de ácidos grasos, que afecta a los genes de la biosíntesis de ácidos grasos (fab) y a los genes de degradación de ácidos grasos (fad).

Mutante 4G11

[0204] La secuencia de ADN que flanquea el sitio de inserción del transposón se proporciona en la SEC ID No: 36 (214 unidades). El transposón está inmediatamente en el extremo 3’ de esta secuencia.

[0205] Se identificó otro gen de Pasteurellaceae mediante “blasts” realizados con la SEC ID No: 36 y su secuencia

10 de aminoácidos codificada (70 aminoácidos). Se halló una identidad del 100% sobre 70 aminoácidos con la proteína PM1024. La localización del transposón en el mutante 4G11 corresponde entre las posiciones 3532-3533 de la secuencia del genoma de PM70 de Pasteurella multocida, Genbank número de acceso AE006143. El transposón altera un homólogo del gen de PM70 PM1024 o htpG. La secuencia de nucleótidos de PM1024 se identifica en la presente invención como SEC ID No: 37 y su secuencia de aminoácidos como SEC ID No: 38.

15 [0206] Se identificaron otros genes y proteínas de bacterias gram negativas mediante “blasts” realizados con la SEC ID No: 38.

Cepa

Gen (referencia Genbank) Proteína (referencia Genbank) % de identidad

Actinobacillus actinomycetemcomitans

HtpG (U26968) HtpG (AAC44732) 88% sobre aminoácidos 625

Haemophilus influenzae

HtpG (U32695) HtpG (AAC21778) 86% sobre aminoácidos 625

Escherichia coli K12

HtpG (AE000153) HtpG (AAC73575) 76% sobre aminoácidos 621

Yersinia pestis

HtpG (AJ414155) HtpG (CAC92355) 76% sobre aminoácidos 622

Salmonella typhi

STY0531 (AL627267) HtpG (CAD04972) 76% sobre aminoácidos 621

Salmonella typhimurium

HtpG (AE008718) HtpG (AAL19441) 75% sobre aminoácidos 621

20 [0207] HtpG es una proteína de choque térmico. [0208] El mutante 4G11 se depositó bajo el Tratado de Budapest en la colección del Instituto Pasteur y está disponible bajo el número de acceso CNCM I-2999.

25 Mutante 5D5 [0209] La secuencia de ADN que flanquea el sitio de inserción del transposón se proporciona en la SEC ID No: 39 (252 unidades). El transposón está inmediatamente en el extremo 3’ de esta secuencia.

30 [0210] La localización del transposón en el mutante 5D5 corresponde entre las posiciones 5695-5696 de la secuencia del genoma de PM70 de Pasteurella multocida, Genbank número de acceso AE006188. El transposón altera un homólogo del gen de PM70, PM1517 o PlpE). La secuencia de nucleótidos de PM1517 se identifica en la presente invención como SEC ID No: 40 y su secuencia de aminoácidos como SEC ID No: 41.

35 [0211] PlpE se prevé que es una lipoproteína de membrana. [0212] El mutante 5D5 se depositó bajo el Tratado de Budapest en la colección del Instituto Pasteur y está disponible bajo el número de acceso CNCM I-3000.

40 Mutante 5F11 [0213] La secuencia de ADN que flanquea el sitio de inserción del transposón se proporciona en la SEC ID No: 42 (546 unidades). El transposón está inmediatamente en el extremo 5’ de esta secuencia.

45 [0214] Se localiza un codón de detención en las posiciones 148-150. [0215] La localización del transposón en el mutante 5F11 corresponde entre las posiciones 572-573 de la secuencia

del genoma de PM70 de Pasteurella multocida, Genbank número de acceso AE006150. El transposón altera un homólogo del gen de PM70, PM1087 o Nifr3. La secuencia de nucleótidos de PM1087 se identifica en la presente invención como SEC ID No: 43 y su secuencia de aminoácidos como SEC ID No: 44.

5 [0216] Se identificó otro gen/proteína de Pasteurellaceae mediante “blasts” realizados con la SEC ID No: 44. Ésta es Haemophilus influenzae HI0979 (Genbank números de acceso U32778 y AAC22639). Se halló una identidad del 78% sobre 332 aminoácidos entre PM1087 y HI0979. NifR3 es un gen regulador de la nitrogenasa.

10 Mutante 5G9

[0217] La secuencia de ADN que flanquea el sitio de inserción del transposón se proporciona en la SEC ID No: 45 (43 unidades). El transposón está inmediatamente en el extremo 3’ de esta secuencia. Esta secuencia tiene tres marcos de lectura abiertos (+2, +3 y -1) que codifican potenciales proteínas más largas. El ORF según la descripción

15 está en el marco +2.

[0218] Se identificaron otros cuatro genes y proteínas de Pasteurellaceae mediante “blasts” realizados con una secuencia de 14 aminoácidos codificada por la SEC ID No: 45.

Cepa

Gen (referencia Genbank) Proteína (referencia Genbank) % de identidad

P4218 de P. multocida

FcbE (AF302467) FcbE (AAK17920) 100% sobre 14 aminoácidos

PM70 de P. multocida

PM0774 (AE006116) HyaE (AAK02858) 100% sobre 14 aminoácidos

taxón 747 de P. multocida

HyaE (AF067175) HyaE (AAC67249) 100% sobre 14 aminoácidos

P934 de P. multocida

DcbE (AF302465) DcbE (AAK17906) 71% sobre 14 aminoácidos

[0219] La localización del transposón en el mutante 5G9 corresponde entre las posiciones 573-574 de la secuencia del genoma de PM70 de Pasteurella multocida, Genbank número de acceso AE006116. El transposón altera un

25 homólogo del gen de PM70, PM0774 o hyaE. La secuencia de nucleótidos de PM0774 se identifica en la presente invención como SEC ID No: 46 y su secuencia de aminoácidos como SEC ID No: 47. Estos genes están implicados en la síntesis de cápsulas.

Mutante 6E5

30 [0220] La secuencia de ADN que flanquea el sitio de inserción del transposón se proporciona en la SEC ID No: 48 (279 unidades). El transposón está inmediatamente en el extremo 3’ de esta secuencia.

[0221] Se localiza un codón de partida en las posiciones 169-171.

35 [0222] La localización del transposón en el mutante 6E5 corresponde entre las posiciones 6673-6674 del genoma de PM70 de Pasteurella multocida, Genbank número de acceso AE006182. El transposón altera un homólogo del gen de PM70, PM1459 o pgtB. La secuencia de nucleótidos de PM1459 se identifica en la presente invención como SEC ID No: 49 y su secuencia de aminoácidos como SEC ID No: 50.

[0223] PgtB es una proteína reguladora del transporte de fosfoglicerato.

Mutante 6E6

45 [0224] La secuencia de ADN que flanquea el sitio de inserción del transposón se proporciona en la SEC ID No: 51 (93 unidades). El transposón está inmediatamente en el extremo 3’ de esta secuencia.

[0225] Se localiza un codón de detención en las posiciones 12-14.

50 [0226] La localización del transposón en el mutante 6E6 corresponde entre las posiciones 9051-9052 de la secuencia del genoma de PM70 de Pasteurella multocida, Genbank número de acceso AE006096. El transposón altera un homólogo del gen de PM70 PM0605. La secuencia de nucleótidos de PM0605 se identifica en la presente

invención como SEC ID No: 52 y su secuencia de aminoácidos como SEC ID No: 53. Mutante 6F12

5 [0227] La secuencia de ADN que flanquea el sitio de inserción del transposón se proporciona en la SEC ID No: 54 (772 unidades). El transposón está inmediatamente en el extremo 5’ de esta secuencia. [0228] Se localiza un codón de partida en las posiciones 2-4.

10 [0229] La localización del transposón en el mutante 6F12 corresponde entre las posiciones 5362-5363 de la secuencia del genoma de PM70 de Pasteurella multocida, Genbank número de acceso AE006192. El transposón altera un homólogo del gen de PM70, PM1556 o el gen de comF. La secuencia de nucleótidos de PM1556 se identifica en la presente invención como SEC ID No: 55 y su secuencia de aminoácidos como SEC ID No: 56.

15 [0230] ComF es la proteína f de competencia. Mutante 6G4 [0231] La secuencia de ADN que flanquea el sitio de inserción del transposón se proporciona en la SEC ID No: 57

20 (700 unidades). El transposón está inmediatamente en el extremo 5’ de esta secuencia. [0232] La localización del transposón en el mutante 6G4 corresponde entre las posiciones 3758-3759 de la secuencia del genoma de PM70 de Pasteurella multocida, Genbank número de acceso AE006206. La inserción se encuentra entre los genes PM1696 y PM1697. El transposón se inserta entre la región de promotor y el codón de

25 partida de PM1696. [0233] El codón de partida de PM1696 se localiza en las posiciones 26-28 en la secuencia SEC ID No: 57. [0234] La secuencia de nucleótidos de PM1696 se identifica en la presente invención como SEC ID No: 58 y su

30 secuencia de aminoácidos como SEC ID No: 59. [0235] Se identificaron otros genes y proteínas de bacterias gram negativas mediante “blasts” realizados con la SEC ID No: 59.

Cepa

Gen (referencia Genbank) Proteína (referencia Genbank) % de identidad

Haemophilus influenzae

HI0266 (U32713) HI0266 (AAC21932) 87% sobre aminoácidos 184

Salmonella typhi

STY3386 (AL627278) STY3386 (CAD07732) 71% sobre aminoácidos 185

Salmonella typhimurium

STM3207 (AE008847) ygih (AAL22081) 71% sobre aminoácidos 185

Mutante 6H1

[0236] La secuencia de ADN que flanquea el sitio de inserción del transposón se proporciona en la SEC ID No: 60 (188 unidades). El transposón está inmediatamente en el extremo 3’ de esta secuencia.

40 [0237] La localización del transposón en el mutante 6H1 corresponde entre las posiciones 4139-4140 de la secuencia del genoma de PM70 de Pasteurella multocida, Genbank número de acceso AE006119. El transposón altera un homólogo del gen de PM70, PM0806, o el gen de speF. La secuencia de nucleótidos de PM0806 se identifica en la presente invención como SEC ID No: 61 y su secuencia de aminoácidos como SEC ID No: 62.

45 [0238] Se identificaron otros dos genes de Pasteurellaceae y Vibrionaceae mediante “blasts” realizados con la SEC ID No: 62. Estos genes son speF de Haemophilus influenzae (Genbank, número de accesos U32740 y AAC22248) y ornitin descarboxilasa de Vibrio cholerae (AE004431 y AAF96957). Se halló una identidad del 83% sobre 719 aminoácidos entre PM0806 y speF de H. influenzae.

[0239] SpeF es una ornitin descarboxilasa.

Mutante 6H6 [0240] La secuencia de ADN que flanquea el sitio de inserción del transposón se proporciona en la SEC ID No: 63 (101 unidades). El transposón está inmediatamente en el extremo 3’ de esta secuencia. Esta secuencia tiene dos marcos de lectura abiertos (+1 y -1) que codifican potenciales proteínas más largas. El ORF según la descripción está en el marco +1.

[0241] La localización del transposón en el mutante 6H6 corresponde entre las posiciones 983-984 de la secuencia del genoma de PM70 de Pasteurella multocida, Genbank número de acceso AE006155. El transposón altera un homólogo del gen de PM70 PM1138. La secuencia de nucleótidos de PM1138 se identifica en la presente invención como SEC ID No: 64 y su secuencia de aminoácidos como SEC ID No: 65.

Mutante 7A7

[0242] La secuencia de ADN que flanquea el sitio de inserción del transposón se proporciona en SEC ID No: 66 (222 unidades). El transposón está inmediatamente en el extremo 5’ de esta secuencia.

[0243] La localización del transposón en el mutante 7A7 corresponde entre las posiciones 7853-7854 de la secuencia del genoma de PM70 de Pasteurella multocida, Genbank número de acceso AE006170 (en la región intergénica entre PM1321 y PM1322). El transposón se inserta entre la región del terminador y el codón de detención de PM1322.

[0244] El codón de detención se localiza en las posiciones 25-27 en la secuencia SEC ID No: 66. La secuencia de nucleótidos de PM1322 se identifica en la presente invención como SEC ID No: 67 y su secuencia de aminoácidos como SEC ID No: 68.

Mutante 7F8

[0245] La secuencia de ADN que flanquea el sitio de inserción del transposón se proporciona en la SEC ID No: 69 (55 unidades). El transposón está inmediatamente en el extremo 3’ de esta secuencia. Esta secuencia tiene tres marcos de lectura abiertos (+1, +3 y -3) que codifica potenciales proteínas más largas. El ORF según la descripción está en el marco +3.

[0246] La localización del transposón en el mutante 7F8 corresponde entre las posiciones 8292-8293 de la secuencia del genoma de PM70 de Pasteurella multocida, Genbank número de acceso AE006224. El transposón altera un homólogo del gen de PM70 PM1866. La secuencia de nucleótidos de PM1866 se identifica en la presente invención como SEC ID No: 70 y su secuencia de aminoácidos como SEC ID No: 71.

Mutante 9C8

[0247] Las secuencias de ADN que flanquean ambas partes del sitio de inserción del transposón se proporcionan en las SEC ID No: 72 (598 unidades, transposón en el extremo 5’) y SEC ID No: 73 (561 unidades, transposón en el extremo 5’).

[0248] Se localiza un codón de detención en las posiciones 26-28 de la SEC ID No: 72. Las secuencias SEC ID No: 72 y 73 están combinadas y limitadas al ORF. La secuencia resultante se designa como SEC ID No: 74 (575 unidades).

[0249] La localización del transposón en el mutante 9C8 corresponde entre las posiciones 2224-2225 ó 2210-2211 de la secuencia del genoma de PM70 de Pasteurella multocida, Genbank número de acceso AE006132, posiciones deducidas a partir de las SEC ID No: 72 y 73, respectivamente. Ambas posiciones están en el interior del gen PM0926 (FimA). La secuencia de nucleótidos de PM0926 se identifica en la presente invención como SEC ID No: 75 y su secuencia de aminoácidos como SEC ID No: 76.

[0250] Se identificó otro gen/proteína de Pasteurellaceae mediante “blasts” realizados con la SEC ID No: 76. Ésta es FimA de Haemophilus influenzae (Genbank números de acceso AF053125 y AAC08991). Se halló una identidad del 77% sobre 171 aminoácidos entre PM0926 y FimA de H. influenzae.

[0251] FimA es una adhesina, una proteína fimbrial.

[0252] El mutante 9C8 se depositó bajo el Tratado de Budapest en la colección del Instituto Pasteur y está disponible bajo el número de acceso CNCM I-3001.

Mutante 9H4

[0253] Las secuencias de ADN que flanquean ambas partes del sitio de inserción del transposón se proporcionan en la SEC ID No: 92 (1391 unidades). El transposón se insertó en la posición 850-851 de esta secuencia. Esta secuencia sólo tiene un marco de lectura. El ORF según la descripción está en el marco -2.

[0254] Se localiza un codón de partida en las posiciones 1318-1316 y se localiza un codón de detención en las posiciones 29-31 de la SEC ID No: 92. La secuencia resultante del ORF se designa como SEC ID No: 93 (1290 unidades) y su secuencia de aminoácidos como SEC ID No: 94.

[0255] Los “blasts” realizados con las secuencias SEC ID No: 92 y SEC ID No: 94 no identificaron ningún gen o proteína homóloga.

[0256] El mutante 9H4 se depositó bajo el Tratado de Budapest en la colección del Instituto Pasteur y está disponible bajo el número de acceso CNCM I-3002.

Mutante 10G11

[0257] La secuencia de ADN que flanquea el sitio de inserción del transposón se proporciona en la SEC ID No: 77 (70 unidades). El transposón está inmediatamente en el extremo 5’ de esta secuencia. Se localiza un codón de partida en las posiciones 62-64.

[0258] La localización del transposón en el mutante 10G11 corresponde entre las posiciones 2938-2939 de la secuencia del genoma de PM70 de Pasteurella multocida, Genbank número de acceso AE006056. El transposón altera un homólogo del gen de PM70, PM0220 (rpL31_1). La secuencia de nucleótidos de PM0220 se identifica en la presente invención como SEC ID No: 78 y su secuencia de aminoácidos como SEC ID No: 79.

[0259] rpL31_1 es una proteína ribosómica 50S.

Mutante 11E8

[0260] La secuencia de ADN que flanquea el sitio de inserción del transposón se proporciona en la SEC ID No: 80 (506 unidades). El transposón está inmediatamente en el extremo 5’ de esta secuencia.

[0261] Se localiza un codón de partida en las posiciones 195-197 de la SEC ID No: 80.

[0262] La localización del transposón en el mutante 11E8 corresponde entre las posiciones 282-283 de la secuencia del genoma de PM70 de Pasteurella multocida, Genbank número de acceso AE006085. El transposón altera un homólogo del gen de PM70 PM0488. La secuencia de nucleótidos de PM0488 se identifica en la presente invención como SEC ID No: 81 y su secuencia de aminoácidos como SEC ID No: 82.

Mutante 12A1

[0263] La secuencia de ADN que flanquea el sitio de inserción del transposón se proporciona en la SEC ID No: 83 (243 unidades). El transposón está inmediatamente en el extremo 3’ de esta secuencia.

[0264] Se identificó otro gen de Pasteurellaceae mediante “blasts” realizados con la SEC ID No: 83 y su secuencia de aminoácidos codificada (81 aminoácidos). Se halló una identidad del 100% sobre 81 aminoácidos con la proteína PM0063. La localización del transposón en el mutante 12A1 corresponde entre las posiciones 2880-2881 de la secuencia del genoma de PM70 de Pasteurella multocida, Genbank número de acceso AE006042. El transposón altera un homólogo del gen de PM70 PM0063 o gen de lepA. La secuencia de nucleótidos de PM0063 se identifica en la presente invención como SEC ID No: 84 y su secuencia de aminoácidos como SEC ID No: 85.

[0265] Se identificaron otros genes y proteínas de bacterias gram negativas mediante “blasts” realizados con la SEC ID No: 85.

Cepa

Gen (referencia Genbank) Proteína (referencia Genbank) % de identidad

Haemophilus influenzae

HI0016 (U32687) LepA (AAA21694) 95% sobre aminoácidos 598

Yersinia pestis

YP02716 (AJ414153) LepA (AAC92955) 88% sobre aminoácidos 597

Escherichia coli K12

Lep A (AE000343) LepA (AAC75622) 89% sobre aminoácidos 597

Salmonella typhi

STY2829 (AL627275) LepA (AAD02785) 89% sobre aminoácidos 597

Salmonella typhimurium

LepA (AE008817) LepA (AAL21477) 89% sobre aminoácidos 597

Vibrio cholerae

VC2463 (AE004316) LepA (AAF95605) 84% sobre aminoácidos 597

Pseudomonas aeruginosa

PA0767 (AE004511) LepA (AAG04156) 75% sobre 594 aminoácidos

[0266] LepA es una proteína de membrana que se une a GTP.

5 Mutante 12B3

[0267] La secuencia de ADN que flanquea el sitio de inserción del transposón se proporciona en SEC ID No: 86 (147 unidades). El transposón está inmediatamente en el extremo 3’ de esta secuencia.

10 [0268] La localización del transposón en el mutante 12B3 corresponde entre las posiciones 4028-4029 de la secuencia del genoma de PM70 de Pasteurella multocida, Genbank número de acceso AE006152. El transposón altera un homólogo del gen de PM70 PM1112 o el gen de deaD. La secuencia de nucleótidos de PM1112 se identifica en la presente invención como SEC ID No: 87 y su secuencia de aminoácidos como SEC ID No: 88.

15 [0269] Se identificó otro gen/proteína de Pasteurellaceae mediante “blasts” realizados con la SEC ID No: 88. Ésta es HI0231 de Haemophilus influenzae (Genbank números de acceso U32709 y AAC21900). Se halló una identidad del 80% sobre 605 aminoácidos entre PM1112 y HI0231.

[0270] DeaD es una ARN helicasa.

Mutante 13E1

[0271] La secuencia de ADN que flanquea el sitio de inserción del transposón se proporciona en la SEC ID No: 89 (187 unidades). El transposón está inmediatamente en el extremo 3’ de esta secuencia. Esta secuencia tiene dos

25 marcos de lectura abiertos (+1 y -3) que codifican potenciales proteínas más largas. El ORF según la descripción está en el marco -3.

[0272] La localización del transposón en el mutante 13E1 corresponde entre las posiciones 2173-2174 de la secuencia del genoma de PM70 de Pasteurella multocida, Genbank número de acceso AE006138 (PM0989). La

30 secuencia de nucleótidos de PM0989 se identifica en la presente invención como SEC ID No: 90 y su secuencia de aminoácidos como SEC ID No: 91.

[0273] Se identificó otro gen/proteína de Pasteurellaceae mediante “blasts” realizados con la SEC ID No: 91. Ésta es HI0325 de Haemophilus influenzae (Genbank números de acceso U32717 y AAC21988). Se halló una identidad del

35 79% sobre 414 aminoácidos entre PM0989 y HI0325.

[0274] El mutante 13E1 se depositó bajo el Tratado de Budapest en la colección del Instituto Pasteur y está disponible bajo el número de acceso CNCM I-3003.

40 Ejemplo 5: Selección por PCR de los mutantes de inserción de transposón

[0275] El transposón se puede insertar en cualquier lugar en el genoma de las bacterias, No obstante, se puede realizar utilizando PCR una selección de los mutantes correctos.

45 [0276] Se utiliza una pareja de cebadores, uno específico para el transposón, tal como Tn10IR1 (SEC ID No: 101), Tn10IR4 (SEC ID No: 102), KTGRI (SEC ID No: 100), StipA (SEC ID No: 99) y StipJ (SEC ID No: 98), y uno específico para el gen o secuencia a mutar. La secuencia de nucleótidos de este gen o una parte del mismo (por ejemplo, secuencias de la región próxima al locus de inserción del transposón secuenciado anteriormente) resulta de ayuda para el diseño de dichos cebadores. Esto se puede adaptar a genes o secuencias de nucleótidos de otras

cepas de Pasteurella multocida, u otras bacterias gram negativas, tales como bacterias de la familia Pasteurellaceae, de forma destacada Pasteurella haemolytica, Pasteurella anatipestifer y Actinobacillus pleuropneumoniae.

5 [0277] El conocimiento del correspondiente gen u ORF y/o sus regiones reguladoras en la cepa PM70 o P-1059 de Pasteurella multocida (Ejemplo 4), tal como su tamaño, se utiliza para cribar los fragmentos de PCR amplificados y para detectar aquellos que tienen un tamaño correspondiente con un transposón insertado en el gen o secuencia a mutar. Si el transposón se insertó fuera del gen, puede no tener un fragmento amplificado por PCR o puede amplificar fragmentos con un tamaño demasiado grande. De este modo, la PCR permite la selección de los

10 mutantes.

Para la cepa P-1059 de Pasteurella multocida, dichos cebadores específicos de gen pueden ser:

Mutante

Nombre del cebador Secuencia del cebador SEC ID No:

13E1

13E1C 5’ TACGTTAACGCCACCCGTTG 106 (20 unidades)

3A2

3°2C 5’ GCTTCCATACCTTGTGAACC 107 (20 unidades)

2F2

2F2C 5’ GGGTGTACGCCTTCTGCTG 108 (19 unidades)

9C8

9C8C 5’ ATTGCAGTCATTGCGGATGC 109 (20 unidades)

12A1

12A1C 5’ CGATATGGTACGTGTCGAC 110 (19 unidades)

5F11

5F11C 5’ AAAAGGCGGACCTAAGTCCG 111 (20 unidades)

5D5

5D5C 5’ CCGACAACATGACAATGGAG 112 (20 unidades)

4G11

4G11C 5’ TTTGCAGTGGCTTACCGTC 113 (19 unidades)

12B3

12B3C 5’ CCTGACGACCAATACGGTG 114 (19 unidades)

5G9

5G9C 5’ GGATGGTCTGATCCTAATGC 115 (20 unidades)

9H4

9H4C 5’ CGTTCATCAGATGACACTGC 116 (20 unidades)

3H2

3H2C 5’ GTGATTACGGGATTATCGGG 117 (20 unidades)

10G11

10G11C 5’ TGAAGTGGTAACGAGGCTTG 118 (20 unidades)

15 [0278] En el caso de los mutantes obtenidos previamente, la PCR se llevó a cabo con los siguientes pares de cebadores y los fragmentos de PCR amplificados tenían el siguiente tamaño:

Cebador específico de gen

Cebador específico de transposón Tamaño PCR (pb)

13E1C

Tn10IR4 250

13E1C

StipA 320

13E1C

StipJ 1720

3A2C

KTGRI 510

2F2C

Tn10IR1 105

2F2C

StipJ 1710

9C8C

Tn10IR4 500

12A1C

Tn10IR4 310

5F11C

Tn10IR4 560

5D5C

StipJ 1705

4G11C

StipJ 1680

12B3C

StipJ 1720

5G9C

StipJ 1660

9H4C

Tn10IR4 585

3H2C

StipJ 1690

10G11C

Tn10IR4 395

20 Ejemplo 6: Eficacia y protección de los mutantes de inserción de transposón frente a estimulación homóloga

[0279] Los mutantes de inserción de transposón derivados de la cepa 16084 de Pasteurella multocida (Ejemplo 1) se administraron en gotas en los ojos a pavos convencionales de tres semanas de vida. Se estudió la eficacia frente a una estimulación homóloga ocular con la cepa 16084 de la Pasteurella multocida.

25 [0280] Se establecieron 24 grupos de pavos convencionales de 3 semanas de vida en el día 0, los grupos se inocularon mediante gotas en los ojos con aproximadamente 108 CFU de los mutantes tal como se indican en la siguiente tabla.

[0281] Un grupo de pavos convencionales de 3 semanas de vida permanecieron sin vacunar y sirvieron como controles (Grupo 25).

[0282] Todos los pavos se estimularon en el día 23 utilizando la cepa 16084 de Pasteurella multocida administrada 5 mediante gotas en los ojos a 108 CFU por pájaro.

[0283] La mortalidad se registró diariamente durante 2 semanas después de la estimulación. Al final del estudio (D37), se llevó a cabo un examen clínico para determinar el estado de salud de los pájaros supervivientes.

10 [0284] La tasa de protección se calculó considerando el número de pájaros estimulados y el número de pájaros sanos el día 37.

Grupo

Mutante Número de pájaros Tasa de protección

Grupo 1

1G4 8 25%

Grupo 2

4F4 10 40%

Grupo 3

3A2 6 67%

Grupo 4

1G8 10 50%

Grupo 5

13E1 22 82%

Grupo 6

5D5 22 68%

Grupo 7

7F8 10 40%

Grupo 8

11E8 10 20%

Grupo 9

9C8 22 82%

Grupo 10

4G11 20 100%

Grupo 11

12B3 6 100%

Grupo 12

10G11 10 20%

Grupo 13

5G9 8 63%

Grupo 14

12A1 10 50%

Grupo 15

2F2 10 20%

Grupo 16

5F11 10 30%

Grupo 17

9H4 7 100%

Grupo 18

3H2 10 40%

Grupo 19

control 41 7%

[0285] Para algunos grupos, se han reproducido estos experimentos y la tasa de protección es un resultado 15 acumulado. Algunos de los mutantes de la descripción no se analizaron en estos experimentos.

Ejemplo 7: Eficacia y protección de los mutantes de inserción de transposón frente a estimulación heteróloga

[0286] Los mutantes de inserción de transposón derivados de la cepa 16084 de Pasteurella multocida (Ejemplo 1) se 20 administraron en gotas en los ojos a pavos convencionales de tres semanas de vida. Se estudió la eficacia frente a una estimulación homóloga ocular con la cepa X73 de la Pasteurella multocida (USDA).

[0287] Se establecieron cinco grupos de 10 pavos convencionales de 3 semanas de vida en el día 0, los grupos se inocularon mediante gotas en los ojos con aproximadamente 108 CFU de los mutantes tal como se indican en la 25 siguiente tabla.

[0288] Un grupo de 10 pavos convencionales de 3 semanas de vida permanecieron sin vacunar y sirvieron como controles (Grupo 6).

30 [0289] Todos los pavos se estimularon en el día 21 utilizando la cepa X73 de Pasteurella multocida administrada mediante gotas en los ojos a 106 CFU por pájaro.

[0290] La mortalidad se registró diariamente durante 2 semanas después de la estimulación. Al final del estudio (D36), se llevó a cabo un examen clínico para determinar el estado de salud de los pájaros supervivientes.

[0291] La tasa de protección se calculó considerando el número de pájaros estimulados y el número de pájaros sanos el día 36.

Grupo

Mutante Número de pájaros Tasa de protección

Grupo 1

13E1 10 70%

Grupo 2

5D5 10 80%

Grupo 3

9C8 10 100%

Grupo 4

4G11 10 100%

Grupo 5

9H4 10 50%

Grupo 6

Control 10 20%

Ejemplo 8: Construcción de mutantes por deleción definidos mediante conjugación

5 [0292] Inicialmente, el gen diana más las secuencias de ADN flanqueantes se amplifican mediante PCR utilizando una polimerasa de alta fidelidad y se clonan en una vector de clonación adecuado. Los cebadores de PCR se diseñan de manera que eliminan el gen cuando se utiliza en PCR inversa para generar una construcción inicial. Los cebadores de PCR contienen un sitio XbaI para introducir un nuevo sitio de restricción y de este modo proporcionan un marcador para la eliminación del gen. Las construcciones por deleción se transfieren a continuación en un vector

10 suicida pCVD442 (Donnenberg et. al., Infection and Immunity, 1991, 59: 4310-4317) para la transferencia al cromosoma de Pasteurella. Los plásmidos pCVD442 se transforman a continuación en la cepa de E. Coli SM10Apir. Esta construcción se introduce en la cepa 16084 (CDM) de P. multocida mediante la conjugación con SM10Apir/pCVD442 de E. coli. Se seleccionan los transformantes y recombinantes que contienen el plásmido integrado en el cromosoma en el sitio homólogo (merodiploides) utilizando el marcador de resistencia a antibiótico

15 presente en el plásmido pCVD442 (gen de resistencia a ampicilina). Los mutantes de Pasteurella se seleccionan en placas agar con BHI suplementadas con 1 !g/ml de ampicilina.

[0293] El plásmido pCVD442 requiere la proteína Pir para la replicación. Esta proteína es codificada por el gen pir, que está presente como un lisógeno de fago lambda en la cepa donante SM10Apir, pero no en la P. Multocida 20 receptora. Como el plásmido pCVD442 no se replica en la cepa de P. Multocida receptora; las colonias resistentes a antibiótico sólo se obtienen por tanto si el plásmido se integra en el cromosoma. Este vector suicida también contiene el gen sacB que codifica la enzima levan sacarasa, que es tóxica para la mayoría de bacterias gram negativas en presencia de sacarosa. La selección de sacarosa se puede utilizar por tanto como una contraselección para aislar colonias en las que haya tenido lugar una segunda recombinación, dando lugar a una pérdida del

25 plásmido del cromosoma. Esta segunda recombinación puede dar lugar a dos resultados, la regeneración del alelo de tipo natural o la generación de un mutante por deleción. Las colonias que contienen la mutación por deleción se identifican mediante PCR de las colonias.

Ejemplo 9: Construcción de mutantes por deleción definidos mediante electroporación

30 [0294] Inicialmente, el gen diana más las secuencias de ADN flanqueantes se amplifican mediante PCR utilizando una polimerasa de alta fidelidad y se clonan en una vector de clonación adecuado. Los cebadores de PCR se diseñan de manera que eliminan el gen cuando se utiliza en PCR inversa para generar una construcción inicial. Los cebadores de PCR contienen un sitio XbaI para introducir un nuevo sitio de restricción y de este modo proporcionan

35 un marcador para la eliminación del gen. Las construcciones por deleción se transfieren a continuación en un vector suicida pCVD442 para la transferencia al cromosoma de Pasteurella. Esta construcción se introduce en la cepa 16084 (CDM) de P. multocida mediante electroporación. Para extraer la cápsula extracelular sustancial de 16084, las células de la fase estacionaria se tratan con hialuronidasa testicular ovina (tipo V, esterilizada por filtración antes de su uso, concentración final de 25 !g/ml) durante 1 hora antes de recoger y lavar las células. El pCVD442 (1,5 !g) se

40 mezcla con una suspensión celular en glicerol al 10% (0,05 ml, 1010 células/ml) justo antes de pipetear la mezcla en las cubetas de electroporación de 1 mm enfriadas en hielo (Biorad, Hercules, CA, USA). Se utiliza el GenePulser (Biorad) para pulsar las células (12,5 kV/cm, 250 ohms, 40 !F). Inmediatamente después del pulso, las células se diluyen con 1 ml de BHI y partes del cultivo (5-50 !l) se extienden rápidamente (en 1-5 min) en placas agar con BHI que contiene ampicilina 1 !g/ml. Se seleccionan los recombinantes que contienen el plámsido integrado en el

45 cromosoma en el sitio homólogo (merodiploides) utilizando el marcador de resistencia a antibiótico presente en el plásmido (gen de resistencia a ampicilina)

[0295] El plásmido pCVD442 no se replica en la cepa de P. Multocida receptora; las colonias resistentes a antibiótico sólo se obtienen por tanto si el plásmido se integra en el cromosoma. Este vector suicida también contiene el gen

50 sacB que codifica la enzima levan sacarasa, que es tóxica para la mayoría de bacterias gram negativas en presencia de sacarosa. La selección de sacarosa se puede utilizar por tanto como una contraselección para aislar colonias en las que haya tenido lugar una segunda recombinación, dando lugar a una pérdida del plásmido del cromosoma. Esta segunda recombinación puede dar lugar a dos resultados, la regeneración del alelo de tipo natural o la generación de un mutante por deleción.

[0296] Las colonias aparecen después de una incubación a 37°C durante 2-4 días. El rayado de las colonias sobre placas similares aísla transformantes individuales. Las colonias que contienen la mutación por deleción se identifican mediante PCR de las colonias.

Ejemplo 10: Vacuna y test de eficacia

[0297] Los mutantes por deleción atenuados obtenidos del ejemplo 8 ó 9 se cultivan en medio de cultivo CDM (Hu et. al., Infection and Immunity 1986, 804-810) bajo condiciones de agitación durante 24 a 48 horas.

[0298] El cultivo se recoge cuando se detiene el crecimiento, que es seguido mediante la medición de la densidad óptica (DO) o el pH.

[0299] La concentración bacteriana se determina mediante la densidad óptica y, cuando es necesario, se ajusta la concentración hasta una concentración final de 109 CFU por ml de medio de cultivo nuevo.

[0300] La eficacia de la vacuna se prueba en pavos de 3 semanas de vida mediante vacunación y estimulación.

[0301] Los pavos se comprueban antes de la vacunación para observar la ausencia de anticuerpos de Pasteurella mediante ELISA de las muestras de sangre.

[0302] Un primer grupo de pavos se vacuna mediante inyección de 108 CFU en 0,1 ml por vía ocular.

[0303] Un segundo grupo permaneció sin vacunar (grupo de control).

[0304] Todos los animales se estimularon en D21 o D23 con la cepa P-1059 de P. multocida por vía ocular (108 CFU en 0,1 ml por animal).

[0305] La mortalidad se observa cada día hasta D35.

[0306] Se observa una mortalidad inferior en los animales vacunados en comparación con los controles.

[0307] La descripción se describe adicionalmente mediante los siguientes párrafos:

1- Un mutante de una bacteria gram negativa, en el que dicha bacteria presenta una mutación en una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido que tiene una identidad que es igual o superior al 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, o 99% con una secuencia de aminoácidos codificada por una secuencia de nucleótidos seleccionada del grupo que consiste en las secuencias de nucleótidos identificadas como SEC ID No: 2, 6, 9, 12, 16, 19, 22, 25, 28, 31, 34, 37, 40, 43, 46, 49, 52, 55, 58, 61, 64, 67, 70, 75, 78, 81, 84, 87, 90, 93, dando lugar dicha mutación a una virulencia atenuada de la bacteria.

2- El mutante del párrafo 1, en el que la bacteria es una Pasteurellaceae.

3- El mutante del párrafo 2, en el que la bacteria se selecciona del grupo de: Pasteurella multocida, Pasteurella haemolytica, Pasteurella anatipestifer y Actinobacillus pleuropneumoniae.

4- El mutante del párrafo 3, en el que la bacteria es Pasteurella multocida.

5- El mutante de cualquiera de los párrafos 1 a 4, en el que la mutación es una deleción en la secuencia de nucleótidos, o una inserción en la misma o una sustitución de ácidos nucleicos.

6- El mutante del párrafo 5, en el que la mutación es la deleción de toda la secuencia de nucleótidos.

7- El mutante del párrafo 5, en el que la inserción se realiza entre: los nucleótidos 180-181 ó 182-183 ó 190-191 en la SEC ID No: 2, 77-78 ó 1026-1027 ó 1027-1028 en la SEC ID No: 6, 416-417 en la SEC ID No: 9, 389-390 en la SEC ID No: 12, 381-382 en la SEC ID No: 16, 219-220 en la SEC ID No: 19, 1353-1354 en la SEC ID No: 22, 136137 en la SEC ID No: 25, 384-385 en la SEC ID No: 28, 222-223 ó 225-226 en la SEC ID No: 31, 217-218 en la SEC ID No: 34, 1411-1412 en la SEC ID No: 37, 943-944 en la SEC ID No: 40, 855-856 en la SEC ID No: 43, 369-370 en la SEC ID No: 46, 111-112 en la SEC ID No: 49, 443-444 en la SEC ID No: 52, 4-5 en la SEC ID No: 55, inmediatamente en dirección 5’ con respecto al nucleótido 1 en la SEC ID No: 58, 573-574 en la SEC ID No: 61, 875876 en la SEC ID No: 64, inmediatamente en dirección 5’ con respecto al nucleótido 1 en la SEC ID No: 67, 218-219 en la SEC ID No: 70, 1072-1087 en la SEC ID No: 75, 64-65 en la SEC ID No: 78, 282-283 en la SEC ID No: 81, 1431-1432 en la SEC ID No: 84, 974-975 en la SEC ID No: 87, 802-803 en la SEC ID No: 90, 850-851 en la SEC ID No: 92.

8- El mutante según cualquiera de los párrafos 1 a 7, que comprende una secuencia de ácidos nucleicos heteróloga que codifica un inmunógeno de un agente patogénico viral, parasítico o bacteriano, para una proteína terapéutica, para un alérgeno, para un factor de crecimiento o para una citoquina.

9- Una composición inmunogénica que comprende un mutante atenuado según cualquiera de los párrafos 1 a 8, y un diluyente, portador, vehículo o excipiente farmacéuticamente aceptable.

10- La composición inmunogénica del párrafo 9 que comprende además un adyuvante.

11- Una vacuna que comprende un mutante atenuado según cualquiera de los párrafos 1 a 8, y un diluyente, portador, vehículo o excipiente farmacéuticamente aceptable.

12- La vacuna del párrafo 11 que comprende además un adyuvante.

13- Una composición inmunogénica que comprende un polipéptido que tiene una identidad que es igual o superior al 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, ó 99% con una secuencia de aminoácidos codificada por una secuencia de nucleótidos seleccionada del grupo que consiste en secuencias de nucleótidos identificadas como SEC ID No: 2, 6, 9, 12, 16, 19, 22, 25, 28, 31, 34, 37, 40, 43, 46, 49, 52, 55, 58, 61, 64, 67, 70, 75, 78, 81, 84, 87, 90, 93 y un diluyente, portador, vehículo o excipiente farmacéuticamente aceptable, y opcionalmente un adyuvante.

14- Una preparación de anticuerpos que comprende un anticuerpo específico para un polipéptido que tiene una identidad que es igual o superior al 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, ó 99% con una secuencia de aminoácidos codificada por una secuencia de nucleótidos seleccionada del grupo que consiste en secuencias de nucleótidos identificadas como SEC ID No: 2, 6, 9, 12, 16, 19, 22, 25, 28, 31, 34, 37,40, 43, 46, 49, 52, 55, 58, 61, 64, 67, 70, 75, 78, 81, 84, 87, 90, 93.

15- Método de diagnóstico para detectar una infección por una bacteria gram negativa, que utiliza un polipéptido que tiene una identidad que es igual o superior al 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, o 99% con una secuencia de aminoácidos codificada por una secuencia de nucleótidos seleccionada del grupo que consiste en secuencias de nucleótidos identificada como SEC ID No: 2, 6, 9, 12, 16, 19, 22, 25, 28, 31, 34, 37, 40, 43, 46, 49, 52, 55, 58, 61, 64, 67, 70, 75, 78, 81, 84, 87, 90, 93, o un anticuerpo específico para dicho polipéptido.

16- Utilización de una preparación de anticuerpos según el párrafo 14 para la producción de una composición de inmunización pasiva o una composición terapéutica contra bacterias gram negativas.

17- Utilización de una secuencia de nucleótidos seleccionada del grupo que consiste en secuencias de nucleótidos identificadas como SEC ID No: 2, 6, 9, 12, 16,19, 22, 25, 28, 31, 34, 37, 40, 43, 46, 49, 52, 55, 58, 61, 64, 67, 70, 75, 78, 81, 84, 87, 90, 93, o un fragmento de por lo menos 20 nucleótidos, como cebadores para la PCR para la detección de bacterias gram negativas en un medio.

LISTADO DE SECUENCIAS

[0308]

<110> MERIAL LIMITED

<120> Bacterias gram negativas atenuadas

<130> 454313-3171.1Wo

<150> 60/370,282

<151> 2002-04-05

<160> 118

<170> PatentIn version 3.1

<210> 1

<211> 775

<212> ADN

<213> Pasteurella multocida

<220>

<221> misc_feature

<222> (579)..(579)

<223> A o C o G o T

<220>

<221> misc_feature

<222> (580)..(580)

<223> A o C o G o T

<220>

<221> misc_feature

<222> (598)..(598)

<223> A o C o G o T

<220>

<221> misc_feature

<222> (599)..(599)

<223> A o C o G o T

<220>

<221> misc_feature

<222> (616)..(616)

<223> A o C o G o T

<220>

<221> misc_feature

<222> (617)..(617)

<223> A o C o G o T

<220>

<221> misc_feature

<222> (636)..(636)

<223> A o C o G o T

<220>

<221> misc_feature

<222> (637)..(637)

<223> A o C o G o T

<220>

<221> misc_feature

<222> (667)..(667)

<223> A o C o G o T

<220>

<221> misc_feature

<222> (668)..(668)

<223> A o C o G o T

<220>

<221> misc_feature

<222> (697)..(697)

<223> A o C o G o T <220>,

<221> misc_feature

<222> (698)..(698)

<223> A o C o G o T

<220>

<221> misc_feature

<222> (702)..(702)

<223> A o C o G o T

<220>

<221> misc_feature

<222> (703)..(703)

<223> A o C o G o T

<220>

<221> misc_feature

<222> (707)..(707)

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<220>

<221> misc_feature

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<223> A o C o G o T

<220>

<221> misc_feature

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<220>

<221> misc_feature

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<223> A o C o G o T

<220>

<221> misc_feature

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<221> misc_feature

<222> (412) .. (412)

<223> A o C o G o T

<220>

<221> misc_feature

<222> (451) .. (451)

<223> A o C o G o T

<220>

<221> misc_feature

<222> (471)..(471)

<223> A o C o G o T

<220>

<221> misc_feature

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<223> A o C o G o T

<220>

<221> misc_feature

<222> (546)..(546)

<223> A o C o G o T

<220>

<221> misc_feature

<222> (562)..(564)

<223> A o C o G o T

<220>

<221> misc_feature

<222> (576)..(576).

<223> A o C o G o T

<220>

<221> misc_feature

<222> (588)..(590)

<223> A o C o G o T

<220>

<221> misc_feature

<222> (595)..(595)

<223> A o C o G o T

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<213> Pasteurella multocida

<220>

<221> misc_feature

<222> (560)..(561)

<223> A o C o G o T

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<212> ADN

<213> Pasteurella multocida

<220>

<221> misc_feature

<222> (574)..(575)

<223> A o C o G o T

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<212> PRT

<213> Pasteurella multocida

<400> 79 <210> 80

<211> 506

<212> ADN

<213> Pasteurella multocida

<400> 80 <210> 81

<211> 348

<212> ADN

<213> Pasteurella multocida

<400> 81

<210> 82

<211> 115

<212> PRT

<213> Pasteurella multocida

<400> 82 <210> 83

<211> 243

<212> ADN

<213> Pasteurella multocida

<400> 83

<210> 84

<211> 1797

<212> ADN

<213> Pasteurella multocida

<400> 84

<210> 85

<211> 598

<212> PRT

<213> Pasteurella multocida

<400> 85

<210> 86

<211> 147

<212> ADN

<213> Pasteurella multocida

<400> 86

<210> 87

<211> 1833

<212> ADN

<213> Pasteurella multocida

<400> 87

<210> 88

<211> 610

<212> PRT

<213> Pasteurella multocida

<400> 88

<210> 89

<211> 187

<212> ADN

<213> Pasteurella multocida

<400> 89

<210> 90

<211> 1359

<212> ADN

<213> Pasteurella multocida

<400> 90

<210> 91

<211> 452

<212> PRT

<213> Pasteurella multocida

<400> 91

<210> 92

<211> 1391

<212> ADN

<213> Pasteurella multocida

<400> 92

<210> 93

<211> 1290

<212> ADN

<213> Pasteurella multocida

<400> 93

<210> 94

<211> 429

<212> PRT

<213> Pasteurella multocida

<400> 94

<210> 95

<211> 101

<212> ADN

<213> Pasteurella multocida

<400> 95

<210> 96

<211> 220

<212> ADN

<213> Pasteurella multocida

<400> 96

<210> 97

<211> 546

<212> ADN

<213> Pasteurella multocida

<220>

<221> misc_feature

<222> (529)..(529)

<223> n es a, g, c, o t

<220>

<221> misc_feature

<222> (532)..(532)

<223> n es a, g, c, o t <220>

<221> misc_feature

<222> (535)..(535)

<223> n es a, g, c, o t

<220>

<221> misc_feature

<222> (538)..(538)

<223> n es a, g, c, o t

<220>

<221> misc_feature

<222> (543)..(543)

<223> n es a, g, c, o t

<400> 97

<210> 98

<211> 20

<212> ADN

<213> Transposón Tn10

<400> 98 atctgatcct tcaactcagc 20

<210> 99

<211> 19

<212> ADN

<213> Transposón Tn10

<400> 99 cgcagggctt tattgattc 19

<210> 100

<211> 27

<212> ADN

<213> Transposón Tn10

<400> 100 gcggaattcg atgaatgttc cgttgcg 27

<210> 101

<211> 20

<212> ADN

<213> Transposón Tn10

<400> 101 tttaccaaaa tcattagggg 20

<210> 102

<211> 19

<212> ADN

<213> Transposón Tn10

<400> 102 gatcatatga caagatgtg 19

<210> 103

<211> 35

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> polinucleótido como cebador de PCR

<220>

<221> misc_feature

<222> (21) .. (30)

<223> n es a, g, c, o t

<400> 103 ggccacgcgt cgactagtac nnnnnnnnnn gatat 35

<210> 104

<211> 35

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> polinucleótido como cebador de PCR

<220>

<221> misc_feature

<222> (21) .. (30)

<223> n es a, g, c, o t

<400> 104 ggccacgcgt cgactagtac nnnnnnnnim cagcc 35

<210> 105

<211> 20

<212> ADN

<213> Transposón Tn10

<400> 105 ggccacgcgt cgactagtac 20

<210> 106

<211> 20

<212> ADN

<213> Pasteurella multocida

<400> 106 tacgttaacg ccacccgttg 20

<210> 107

<211> 20

<213>

ADN

<213>

Pasteurella multocida

<400> 107 gcttccatac cttgtgaacc 20

<210> 108

<211> 19

<212> ADN

<213> Pasteurella multocida

<400> 108 gggtgtacgc cttctgctg 19

<210> 109

<211> 20

<212> ADN

<213> Pasteurella multocida

<400> 109 attgcagtca ttgcggatgc 20

<210> 110

<211> 19

<212> ADN

<213> Pasteurella multocida

<400> 110 cgatatggta cgtgtcgac 19

<210> 111

<211> 20

<212> ADN

<213> Pasteurella multocida

<400> 111 aaaaggcgga cctaagtccg 20

<210> 112

<211> 20

<212> ADN

<213> Pasteurella multocida

<400> 112 ccgacaacat gacaatggag 20

<210> 113

<211> 19

<212> ADN

<213> Pasteurella multocida

<400> 113 tttgcagtgg cttaccgtc 19

<210> 114

<211> 19

<212> ADN

<213> Pasteurella multocida

<400> 114 cctgacgacc aatacggtg 19

<210> 115

<211> 20

<212> ADN

<213> Pasteurella multocida

<400> 115 ggatggtctg atcctaatgc 20

<210> 116

<211> 20

<212> ADN

<213> Pasteurella multocida

<400> 116 cgttcatcag atgacactgc 20

<210> 117

<211> 20

<212> ADN

<213> Pasteurella multocida

<400> 117 gtgattacgg gattatcggg 20

<210> 118

<211> 20

<212> ADN

<213> Pasteurella multocida

<400> 118 tgaagtggta acgaggcttg 20

Claims (20)

1. REIVINDICACIONES

   1.

   Mutante de una bacteria gram negativa, en el que dicha bacteria presenta una mutación en una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido que tiene una identidad que es igual o superior al 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, ó 99% con una secuencia de aminoácidos codificada por la secuencia de nucleótidos SEC ID No: 75, dando lugar dicha mutación a una virulencia atenuada de la bacteria, en el que la mutación es una inserción entre los nucleótidos 1072-1087 en la SEC ID No: 75.

2. 2.

   Mutante según la reivindicación 1, en el que dicho mutante tiene un segundo polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos codificada por la secuencia de nucleótidos SEC ID No: 75.

3. 3.

   Mutante según la reivindicación 1 ó 2, en el que la bacteria es una Pasteurellaceae.

4. 4.

   Mutante según la reivindicación 3, en el que la bacteria se selecciona del grupo de: Pasteurella multocida, Pasteurella haemolytica, Pasteurella anatipestifer y Actinobacillus pleuropneumoniae.

5. 5.

   Mutante según la reivindicación 4, en el que la bacteria es Pasteurella multocida.

6. 6.

   Mutante según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, que comprende una secuencia de ácidos nucleicos heteróloga que codifica un inmunógeno de un agente patogénico viral, parasítico o bacteriano, para una proteína terapéutica, para un alérgeno, para un factor de crecimiento o para una citoquina.

7. 7.

   Mutante según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, que presenta una mutación en la secuencia de nucleótidos SEC ID No: 75.

8. 8.

   Mutante según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, que es un mutante 9C8 disponible bajo el número de acceso CNCM 1-3001.

9. 9.

   Mutante según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en el que dicho mutante tiene dos o más mutaciones.

10. 10.

    Mutante según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, que tiene dos o más de las siguientes secuencias mutadas: SEC ID No: 2, 6, 9, 12, 16, 19, 22, 25, 28, 31, 34, 37, 40, 43, 46, 49, 52, 55, 58, 61, 64, 67, 70, 75, 78, 81, 84, 87, 90, 93.

11. 11.

    Mutante según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, que tiene dos o más de las siguientes secuencias mutadas: SEC ID No: 37, 40, 75, 90, 93.

12. 12.

    Mutante según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, que tiene dos o más de las siguientes secuencias mutadas: SEC ID No: 37 y 75; SEC ID No: 40 y 75; SEC ID No: 75 y 90; o SEC ID No: 75 y 93.

13. 13.

    Vacuna que comprende un mutante atenuado según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12, y un diluyente, portador, vehículo o excipiente farmacéuticamente aceptable.

14. 14.

    Vacuna según la reivindicación 13, que comprende además un adyuvante.

15. 15.

    Composición inmunogénica que comprende un mutante atenuado según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12, y un diluyente, portador, vehículo o excipiente farmacéuticamente aceptable.

16. 16.

    Composición inmunogénica según la reivindicación 15, que comprende además un adyuvante.

17. 17.

    Molécula de ácido nucleico aislada que tiene la secuencia SEC ID No: 75 con una inserción entre los nucleótidos 1072-1087.

18. 18.

    Utilización de un mutante según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12, en la producción de una composición inmunogénica atenuada viva o la preparación de una composición de vacuna atenuada viva.

19. 19.

    Mutante según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12, vacuna según la reivindicaciones 13 ó 14, o una composición inmunogénica según la reivindicación 15 ó 16, para utilizar en la inmunización contra o la prevención de una infección bacteriana en un animal.

20. 20.

    Utilización de un mutante de una bacteria gram negativa según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12, una

    vacuna según la reivindicación 13 ó 14, o una composición inmunogénica según la reivindicación 15 ó 16, en la preparación de un medicamento para la inmunización contra o la prevención de una infección bacteriana en un animal.