BRPI0309001B1 - Bactérias gram-negativas atenuadas - Google Patents

Abstract

bactérias gram-negativas atenuadas. é descrito e reivindicado um mutante de uma bactéria gram-negativa, onde a dita bactéria tem pelo menos uma mutação em uma seqüência de nudeotídeo que codifica para um polipeptídeo tendo uma identidade que é igual a ou maior do que 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% com uma seqüência de aminoácido codificada por uma seqüência de nucleotídeo selecionada do grupo consistindo em seqüências de nucleotídeo identificadas seq id no: 2, 6, 9, 12, 16, 19, 22, 25, 28, 31, 34, 37, 40, 43, 46, 49, 52, 55, 58, 61, 64, 67, 70, 75, 78, 81, 84, 87,90 ou 93; a dita mutação resultando em virulência atenuada da bactéria. composições e vacinas imunogênicas contendo tal mutante são também descritas e reivindicadas.

Description

PEDIDOS RELACIQNADOS/INCORPORAÇÃO A TÍTULO DE REFERÊNCIA

O presente pedido reivindica prioridade do pedido de patente provisório U.S. N° de Série 60/370.282, depositado em 5 de abril de 2002, incorporado aqui a título de referência. O pedido acima, e todos os documentos citados nele ou durante seu processo (documentos citados no pedido) e todos os documentos citados ou referidos nos documentos citados nos 10 pedidos, e todos os documentos citados ou referidos aqui ("documentos citados aqui") e todos os documentos citados ou referidos nos documentos aqui citados, junto com quaisquer instruções do fabricante, descrições, especificações de produto e folhetos de produto para quaisquer produtos aqui mencionados ou em qualquer documento aqui incorporado a título de refe- 15 rência, são então aqui incorporados a título de referência, e podem ser empregados na prática da invenção.

CAMPO DA INVENÇÃO

A presente invenção refere-se a bactérias gram-negativas atenuadas vivas. Bactérias gram-negativas atenuadas podem ser usadas em 20 composições imunogênicas ou em composições de vacina, por exemplo, para a prevenção de infecções bacterianas, bem como em pesquisa, como cepas atenuadas presentes em um maior grau de segurança para pesquisadores e aqueles (por exemplo, animais, seres humanos) com os quais elas vão entrar em contato.

A invenção refere-se então a composições imunogênicas ou de vacina compreendendo bactérias gram-negativas da invenção; por exemplo, bactérias gram-negativas atenuadas vivas. As bactérias poderiam ser também inativadas nas composições; mas pode ser vantajoso que as bactérias sejam bactérias gram-negativas atenuadas. A invenção então refere-se ain- 30 da a métodos para preparação e/ou formulação de tais composições; por exemplo, cultura ou crescimento ou propagação da bactéria sob ou em meio adequado, coleta das bactérias, opcionalmente inativando as bactérias, e mistura com um carreador, excipiente, diluente ou veículo e/ou um adjuvante e/ou estabilizador veterinariamente ou farmaceuticamente aceitável; ou, misturando as bactérias com um carreador, excipiente, diluente ou veículo e/ou adjuvante e/ou estabilizador veterinariamente ou farmaceuticamente aceitável. Desse modo, a invenção refere-se também ao uso das bactérias na formulação de tais composições.

As bactérias atenuadas podem também agir como um vetor de expressão ou replicação, por exemplo, para replicação e/ou expressão de uma molécula de ácido nucléico heteróloga às bactérias atenuadas, por exemplo, uma molécula de ácido nucléico codificando um imunógeno, antí- geno ou epítopo de um agente patogênico, tal como um agente patogênico que é outro que não as bactérias atenuadas. O uso de bactérias atenuadas como um vetor também provê um grau maior de segurança para pesquisadores e técnicos que trabalham com os vetores atenuados e aqueles (por exemplo, animais, seres humanos) com os quais elas vão entrar em contato.

A invenção refere-se então ainda a métodos para preparação de tais vetores, por exemplo, transformação das bactérias de modo que as bactérias contenham e opcionalmente expressem uma molécula de ácido nucléico heteróloga.

A invenção refere-se também a usos de tais vetores; por exemplo, um método para produção de um produto de gene, por exemplo, polipeptídeo tal como um imunógeno, epítopo ou antígeno, heterólogo para a bactéria compreendendo cultura, crescimento ou propagação de bactérias transformadas para conter e expressar uma molécula de ácido nucléico heteróloga codificando o produto de gene sob condições adequadas para ex-pressão, e opcionalmente coleta ou isolamento ou separação do produto de gene; ou, coleta ou isolamento ou separação do produto de gene de bactérias transformadas para expressá-lo; ou, um método para elicitação de uma resposta imunológica ou resposta imunogênica contra um produto de gene e/ou bactéria ou uma resposta imunoprotetora como para um patógeno a partir do qual o produto de gene é derivado ou obtido e/ou as bactérias compreendendo administração a um indivíduo, por exemplo, animal, tal como um animal suscetível à infecção pelo patógeno e/ou bactéria, por exemplo, um bovino ou peru, bactérias transformadas para expressar o produto de gene; ou um método para preparação de uma composição imunogênica, imunoló- gica ou de vacina compreendendo mistura do vetor ou bactérias transformadas com um carreador, diluente, veículo ou excipiente e/ou adjuvante e/ou estabilizador farmaceuticamente ou veterinariamente aceitável.

A invenção refere-se também a alvos para atenuação de bactérias, por exemplo, sequências de nucleotídeo ou genes mutados codificando os alvos para atenuação de bactérias, e métodos para marcação de poli- peptídeos para atenuação de bactérias e métodos para geração de bactérias atenuadas. Os alvos para atenuação podem ser usados como compostos imunogênicos, por exemplo, em composições imunogênicas ou em compo- siçoes de vacina, ou para geraçao de epitopos para uso em composiçoes imunogênicas ou de vacina. Desse modo, a invenção refere-se ao uso de alvos para atenuação em preparação em composições, por exemplo, mistura com um carreador, diluente, excipiente ou veículo e/ou adjuvante e/ou um estabilizador farmaceuticamente ou veterinariamente aceitável.

A invenção refere-se ainda a métodos para indução de uma resposta imunológica ou imunogênica ou imunoprotetora em um indivíduo, por exemplo, um animal, tal como um animal suscetível à infecção por bactérias gram-negativas, tal como Pasteurella, por exemplo, um peru ou bovino, compreendendo administrar ao animal uma vacina ou composição imunogênica da invenção.

A invenção refere-se ainda à preparação de tais bactérias atenuadas, por exemplo, bactérias gram-negativas, tal com Pasteurella', por exemplo, compreendendo introdução de um ou mais elementos transponí- veis nas bactérias e isolamento das bactérias contendo o elemento transpo- nível que não cause mortalidade em uma espécie alvo (e são então atenuadas). Uma pessoa pode ainda opcionalmente identificar as mutações nas bactérias para então permitir meios alternativos para produção das bactérias.

A invenção refere-se ainda a tais meios alternativos para produ- ção de bactérias atenuadas. Uma vez que as mutações são identificadas ou caracterizadas, as mutações podem ser introduzidas nas bactérias através de técnicas outras que não introdução de um ou mais elementos transponí- veis nas bactérias, tal com através de recombinação homóloga, por exem- 5 pio, recombinação homóloga com o que uma porção do genoma bacteriano resulta em pelo menos uma adição a ela (inserção) ou uma deleção dela (duas ou mais adições e/ou deleções são também pretendidas) ou uma substituição (tal como uma substituição de pelo menos um nucleotídeo por um outro). Desse modo, a invenção refere-se a um método para produção 10 de bactérias atenuadas contendo uma modificação ou mutação conhecida ou anteriormente identificada, por exemplo, uma modificação ou mutação aqui identificada, compreendendo introdução de uma deleção ou inserção ou substituição no genoma bacteriano, vantajosamente através de recombinação, e opcionalmente, identificação e/ou isolamento das bactérias contendo 15 a modificação ou mutação.

Desse modo, a invenção refere-se a um mutante de uma bactéria gram-negativa, onde a dita bactéria tem pelo menos uma mutação em uma seqüência de nucleotídeo que codifica para um polipeptídeo tendo uma identidade que é igual a ou maior do que 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 20 96%, 97%, 98% ou 99% com uma seqüência de aminoácido codificada por uma seqüência de nucleotídeo selecionada do grupo consistindo em se- qüências de nucleotídeo identificadas como SEQ ID NO: 2, 6, 9, 12, 16, 19, 22, 25, 28, 31, 34, 37, 40, 43, 46, 49, 52, 55, 58, 61, 64, 67, 70, 75, 78, 81, 84, 87, 90, 93; a dita mutação resultando em virulência atenuada da bacté- 25 ria. E, a invenção refere-se a usos, composições e métodos envolvendo tal bactéria conforme aqui descrito.

ANTECEDENTES

É bem-compreendido que microorganismos atenuados vivos podem ser vacinas altamente eficazes; respostas imunes elicitadas por tais 30 vacinas são muitas vezes de magnitude maior e de duração mais longa do que aquelas produzidas por imunógenos de não-replicação. Uma explicação para isso pode ser que cepas atenuadas vivas estabelecem infecções limita- das no hospedeiro e imitam os primeiros estágios de infecção natural. Ainda, diferente das preparações mortas ou inativadas, vacinas vivas são capazes de induzir respostas mediadas por célula potentes que podem ser ligadas com uma habilidade em replicar em células apresentando antígeno, tal como 5 macrófagos.

Tem havido uma longa história de uso de vacinas atenuadas vivas em animais e seres humanos, notavelmente usando técnicas de muta- gênese química. No entanto, vacinas empiricamente atenuadas podem reverter para virulência.

Técnicas de biologia molecular modernas, acopladas com o grande conhecimento de patogênese bacteriana, levaram à identificação de vários genes que estão envolvidos no crescimento e sobrevivência dos microorganismos in vivo. Isso proveu novos alvos para gene para atenuação, e para o conceito de que cepas de vacina futuras poderiam ser 'racionalmente' 15 atenuadas através da introdução de mutações de não-reversão definidas em genes selecionados sabidos estar envolvidos em virulência, vide, por exem-plo, WO-A-OO/61724, WO-A-OO/68261 e EP-A-0889120.

Embora muitas cepas atenuadas tenham sido produzidas em laboratórios, apenas algumas foram qualificadas como candidatas à vacina 20 potenciais para uso em animais. Isso pode ser devido em parte à necessidade de equilibrar a imunogenicidade da vacina com a possibilidade de microorganismos em reverterem, tornando-se reativos e patogênicos.

Está claro que a seleção de genes apropriados para atenuação, que vão resultar em um candidato à vacina adequado, não é direta e não 25 pode ser facilmente prevista. Muitos fatores podem influenciar a aceitabilidade de um mutante atenuado como uma vacina, e conseqüentemente esforço de pesquisa é necessário para identificar e selecionar genes de atenuação adequados. Muitos experimentos de atenuação foram realizados apenas in vitro e seus resultados não podem ser extrapolados in vivo, principalmente 30 em relação à patogenicidade residual dos mutantes resultantes para os animais vacinados.

É feito menção a: Kachlany S.C., Planet P.J., Bhattacharjee M.K., Kollia E., DeSalle R., Fine D.H., Figurski D.H., Nonspecific adherence by Actinobacillus actinomycetemcomitans requires genes widespread in bacteria and archaea. J. Bacteriol. 2000, Nov; 182(21 ):6169-76. Fuller T.E., Martin S., Teel J.F., Alaniz G.R., Kennedy M.J., Lowery D.E., Identification of Actinobacillus pleuropneumoniae virulence genes using signature-tagged mutagenesis in a swine infection model. Microb. Pathog. 2000, Jul; 29(1):39-51. Fuller T.E., Kennedy M.J., Lowery D.E., Identification of Pasteurella multocida virulence genes in a septicemic mouse model using signature-tagged mutagenesis. Microb. Pathog., 2000 Jul; 29(1):25-38. Kehrenberg C., Werckenthin C., Schwarz S., Tn5706, a transposon-like element from Pasteurella multocida mediating tetracycline resistance. Antimicrob. Agents Chemother., 1998 Agosto; 42(8)12116-8. DeAngelis P.L., Transposon Tn916 insertional mutagenesis of Pasteurella multocida and direct sequencing of disruption site. Microb. Pathog., 1998a Abril; 24(4)1203-9. DeAngelis P.L., Jing W., Drake R.R., Achyuthan A.M., Identification and molecular cloning of a unique hyaluronan synthase from Pasteurella multocida. J. Biol. Chem., 1998b, Abril 3; 273(14)18454-8. Lee M.D., Henk A.D., Tn10 insertional mutagenesis in Pasteurella multocida. Vet. Microbiol., 1996 Maio; 50(1-2)1143-8. Choi K.H., Maheswaran S.K., Choi C.S., Colorimetric assay using XTT for assessing virulence of avian Pasteurella multocida strains. Vet Microbiol. 1995, Jul; 45(2-3)1191-200. Nnalue N.A. Tn7 inserts in both orientations at a single chromosomal location and apparently forms cointegrates in Pasteurella multocida. Mol Microbiol., 1990 Jan; 4(1)1107-17. Stocker Patentes US N°s 4.550.081, 4.837.151, 5.210.035 e 5.643.771. Highlander Patente US N° 6.180.112.

Kachlany envolvia genes Tad. Não há nenhuma relação entre genes Tad mutados em Kachlany e atenuação. Não há nenhum teste em animais em Kachlany e os genes Tad não são selecionados na presente invenção. Os documentos de Fuller envolvem seqüências que não são selecionadas na presente invenção. Kehrenberg não envolveu um mutante atenuado, ou um uma técnica Signature Tagged Mutagenesis ou STM; mas pelo contrário, Kehrenberg envolveu uma inserção direta de um transposon (uso de elemento de inserção idêntico). DeAngelis 1998a proveu apenas uma descrição geral de uma técnica de STM, e nada sobre mutantes, per se. DeAngelis 1998b envolveu o uso de uma técnica de STM para inserir um transposon no local de biossíntese de HA (Genbank AF036004). Esta seqüência é uma homóloga à seqüência Pm0775 de PM70. A seqüência codificando Pm0775 não é selecionada na presente invenção. Lee refere-se ao uso de uma técnica de STM com um transposon Tn10; Lee falha em descrever ou sugerir quaisquer testes em animais ou quaisquer pesquisas quanto a mutantes atenuados; mas pelo contrário, Lee envolveu apenas mutantes auxo- trópicos. Enquanto Choi cita um mutante de inserção de transposon de Pasteurella multocida, e pode não ter havido nenhuma mortalidade induzida por este mutante, Choi não contém quaisquer detalhes sobre a localização da inserção de transposon e desse modo não pode ser dito ser reproduzível. Nnalue similarmente falha em ensinar ou sugerir a presente invenção. As patentes de Stocker envolviam a inserção de um transposon Tn10 no gene aroA. O gene AroA não é selecionado na presente invenção. Highlander refere-se à inserção de um transposon Tn1545 no gene IktC para leucotoxina inativa. O gene LktC não é selecionado na presente invenção. Desse modo, acredita-se muito que a presente invenção não é ensinada ou sugerida na técnica.

Além disso, é desejável caracterizar genes ou seqüências de ácido nucléico envolvidas na atenuação e com base nisso desenvolver bactérias atenuadas, bem como vacinas atenuadas ou composições imunogênicas, tal como aquelas tendo um alto grau de imunogenicidade e que exibam um bom perfil de segurança com efeitos colaterais limitados ou nenhum.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

A invenção provê um mutante de uma bactéria gram-negativa tendo uma mutação em uma primeira seqüência de nucleotídeo que codifica para um primeiro polipeptídeo e resulta na bactéria tendo uma virulência atenuada, onde: o primeiro polipeptídeo tem uma seqüência de aminoácido; um segundo polipeptídeo tem uma seqüência de aminoácido codificada por uma seqüência de nucleotídeo identificada como SEQ ID NO: 2, 6, 9, 12, 16, 19, 22, 25, 28, 31, 34, 37, 40, 43, 46, 49, 52, 55, 58, 61, 64, 67, 70, 75, 78, 81,84, 87, 90 ou 93; e a seqüência de aminoácido do primeiro polipeptídeo é a mesma que aquela do segundo polipeptídeo, ou a seqüência de aminoácido do primeiro polipeptídeo tem uma identidade que é igual a ou maior do que 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% com a seqüência de aminoácido do segundo polipeptídeo.

A bactéria mutante pode ser uma Pasteurella, por exemplo, a bactéria pode ser: Pasteurella multocida, Pasteurella haemolytica, Pasteurella anatipestifer ou Actinobacillus pleuropneumoniae; vantajosamente Pasteurella multocida.

A mutação pode ser uma deleção na primeira seqüência de nucleotídeo, ou uma inserção nela ou substituição de ácidos nucléicos, tal como uma deleção de toda a primeira seqüência de nucleotídeo; ou uma inserção entre: nucleotídeos 180-181 ou nucleotídeos 182-183 ou nucleotí- deos 190-191 na SEQ ID NO:2, nucleotídeos 77-78 ou nucleotídeos 10261027 ou nucleotídeos 1027-1028 na SEQ ID NO:6, nucleotídeos 416-417 na SEQ ID NO: 9, nucleotídeos 389-390 na SEQ ID NO:12, nucleotídeos 381382 na SEQ ID NO:16, nucleotídeos 219-220 na SEQ ID NO:19, nucleotídeos 1353-1354 na SEQ ID NO: 22, nucleotídeos 136-137 na SEQ ID NO:25, nucleotídeos 384-385 na SEQ ID NO:28, nucleotídeos 222-223 ou nucleotídeos 225-226 na SEQ ID NO:31, nucleotídeos 217-218 na SEQ ID NO:34, nucleotídeos 1411-1412 na SEQ ID NO:37, nucleotídeos 943-944 na SEQ ID NO:40, nucleotídeos 855-856 na SEQ ID NO:43, nucleotídeos 369- 370 na SEQ ID NO:46, nucleotídeos 111-112 na SEQ ID NO:49, nucleotí- deos 443-444 na SEQ ID NO:52, nucleotídeos 4-5 na SEQ ID NO:55, nucleotídeos 573-574 na SEQ ID NO:61, nucleotídeos 875-876 na SEQ ID NO:64, nucleotídeos 218-219 na SEQ ID NQ:70, nucleotídeos 1072-1087 na SEQ ID NO:75, nucleotídeos 64-65 na SEQ ID NO:78, nucleotídeos 282-283 na SEQ ID NO:81, nucleotídeos 1431-1432 na SEQ ID NO:84, nucleotídeos 974-975 na SEQ ID NO:87, nucleotídeos 802-803 na SEQ ID NQ:90, nucleotídeos 850-851 na SEQ ID NO:92; ou nucleotídeo 1 imediatamente a montante na SEQ ID NO:58; ou nucleotídeo 1 imediatamente a montante na SEQ ID NO:67.

O mutante pode compreender uma seqüência de ácido nucléico heteróloga, tal como uma seqüência de ácido nucléico heteróloga que codifica para um imunógeno de um agente patogênico virai, parasítico ou bacteri- ano, uma proteína terapêutica, um alérgeno, um fator de crescimento ou uma citocina.

A invenção também provê uma composição imunogênica ou de vacina compreendendo um mutante de acordo com a invenção, e um diluente, carreador, veículo ou excipiente farmaceuticamente ou veterinariamente aceitável, e opcionalmente ainda compreendendo um adjuvante.

A invenção provê ainda um primeiro polipeptídeo isolado tendo uma seqüência de aminoácido, onde há: um segundo polipeptídeo tendo uma seqüência de aminoácido codificada por uma seqüência de nucleotídeo identificada como SEQ ID NO: 2, 6, 9, 12, 16, 19, 22, 25, 28, 31, 34, 37, 40, 43, 46, 49, 52, 55, 58, 61, 64, 67, 70, 75, 78, 81, 84, 87, 90 ou 93; e a seqüência de aminoácido do primeiro polipeptídeo é a mesma que aquela do segundo polipeptídeo, ou a seqüência de aminoácido do primeiro polipeptídeo tem uma identidade que é igual a ou maior do que 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% a seqüência de aminoácido do segundo polipeptídeo.

A invenção prevê uma composição imunogênica ou de vacina contendo o primeiro polipeptídeo isolado, e um diluente, carreador, veículo ou excipiente farmaceuticamente ou veterinariamente aceitável, e opcionalmente um adjuvante.

Ainda, a invenção prevê uma preparação de anticorpo compreendendo um anticorpo específico para o primeiro polipeptídeo isolado.

A invenção também envolve um método de diagnóstico para detecção de infecção por uma bactéria gram-negativa, compreendendo detecção em uma amostra de um primeiro polipeptídeo isolado ou um anticorpo específico para aquele primeiro polipeptídeo isolado.

A invenção refere-se ainda a um método de imunização passivo compreendendo administrar a preparação de anticorpo.

A invenção também provê uma molécula de ácido nucléico isolada tendo uma seqüência identificada como SEQ ID NO: 2, 6, 9, 12, 16, 19, 22, 25, 28, 31, 34, 37, 40, 43, 46, 49, 52, 55, 58, 61, 64, 67, 70, 75, 78, 81, 84, 87, 90 ou 93, ou identificada como SEQ ID NO: 1, 4, 5, 8, 11, 14, 15, 18, 21,24, 27, 30, 33, 36, 39, 42, 45, 48, 51, 54, 57, 60, 63, 66, 69, 72, 73, 77, 80, 83, 86, 89, 92, 95, 96 ou 97, bem como um primer de PCR para detec ção de bactérias gram-negativas compreendendo uma molécula de ácido nucléico isolada tendo uma seqüência que é pelo menos 10 ácidos nucléicos contígua de uma seqüência identificada como SEQ ID NO: 2, 6, 9, 12, 16, 19, 22, 25, 28, 31, 34, 37, 40, 43, 46, 49, 52, 55, 58, 61, 64, 67, 70, 75, 78, 81, 84, 87, 90 ou 93, ou identificada como SEQ ID NO: 1, 4, 5, 8, 11, 14, 15, 18, 21, 24, 27, 30, 33, 36, 39, 42, 45, 48, 51, 54, 57, 60, 63, 66, 69, 72, 73, 77, 80, 83, 86, 89, 92, 95, 96 ou 97. Uma sonda ou primer pode ser qualquer prolongamento de pelo menos 8, de preferência pelo menos 10, com mais preferência pelo menos 12, 13, 14 ou 15, tal como pelo menos 20, por exemplo, pelo menos 23 ou 25, por exemplo, pelo menos 27 ou 30 nucleotí- deos que são únicos para a seqüência desejada ser amplificada ou que estão na seqüência desejada ser amplificada e são pelo menos conservados, por exemplo, conservados entre as bactérias gram-negativas ou entre uma família particular ou espécie de bactérias gram-negativas, tal como entre Pasteurella, ou entre qualquer um de Pasteurella multocida, Pasteurella ha- emolytica, Pasteurella anatipestifer ou Actinobacillus pleuropneumoniae; vantajosamente Pasteurella multocida. Como para PCR ou primers ou son-das de hibridização e comprimentos ótimos para eles, referência é também feita a Kajimura e outros, GATA 7(4):71-79 (1990).

Os termos "composição imunogênica" e "composição imunológi- ca" e "composição imunogênica ou imunológica" compreendem qualquer composição que elicite uma resposta imune contra o patógeno alvo; por exemplo, após administração ou injeção no animal (tal como uma ave, por exemplo, peru ou bovino, por exemplo, vaca), elicite uma resposta imune contra o patógeno alvo (por exemplo, Pasteurella multocida). Os termos "composição de vacina" e "vacina" e "composição de vacina" compreendem qualquer composição que induza uma resposta imunoprotetora contra o patógeno alvo ou que eficazmente proteja contra o patógeno; por exemplo, após administração ou injeção no animal (por exemplo, ave tal com peru ou bovino tal com vaca), elicite uma resposta imunoprotetora contra o patógeno alvo ou proveja proteção eficaz contra o patógeno (por exemplo, P. multoci-da). Uma subunidade de um patógeno, por exemplo, um antígeno ou imunógeno ou epítopo isolado do patógeno, por exemplo, bactérias tal como bactérias gram-negativas, por exemplo, P. multocida, e, uma composição de subunidade compreende ou consiste essencialmente em um ou mais antí- genos, imunógenos ou epítopos isolados do patógeno, por exemplo, bactérias, tal como bactérias gram-negativas, por exemplo, P. multocida.

É notado que neste relatório e particularmente nas reivindicações termos tal como "compreende", "compreendido", "compreendendo" e similar podem ter o significado atribuído a eles na lei de Patente U.S., eles podem significar "inclui", "incluído", "incluindo", e similar; e termos tal como "consistindo essencialmente em" e "consiste essencialmente em" têm o significado atribuído a eles na lei de Patente U.S., por exemplo, eles permitem elementos não explicitamente citados, mas excluem elementos que são encontrados na técnica anterior ou que afetem as características básicas ou novas da invenção.

Essas e outras modalidades são descritas ou são óbvias a partir da e compreendem, por exemplo, a Descrição Detalhada que segue.

DESCRIÇÃO DETALHADA

A presente invenção provê seqüências de nucleotídeo e genes envolvidos na atenuação de microorganismos, tal como bactérias, por exemplo, bactérias gram-negativas, por exemplo, Pasteurella multocida, 5 produtos (por exemplo, proteínas, antígenos, imunógenos, epítopos) codificados pelas seqüências de nucleotídeos, métodos para produção de tais seqüências de nucleotídeo, produtos, microorganismos, e seus usos, tal como para preparação de composições de vacina ou imunogênicas ou para elicitação de uma resposta imunológica ou imune ou como um vetor, por 10 exemplo, como um vetor de expressão (por exemplo, em um vetor de expressão in vitro ou in vivo).

Mutações introduzidas nas seqüências de nucleotídeo e genes de microorganismos produzem mutantes atenuados novos e não-óbvios. Esses mutantes são úteis para a produção de composições imunogênicas 15 atenuadas vivas ou vacinas atenuadas vivas tendo um alto grau de imuno- genicidade.

Esses mutantes são também úteis como vetores que podem ser úteis para expressão in vitro de produtos de expressão, bem como para a produção ou replicação de seqüências de nucleotídeo (por exemplo, replica- 20 ção de DNA), e para produtos de expressão in vivo.

A identificação das mutações provê seqüências de nucleotídeo e genes novos e não-óbvios, bem como produtos de gene novos e não-óbvios codificados pelas seqüências de nucleotídeo e genes.

Tais produtos de gene provêem antígenos, imunógenos e epíto- 25 pos, e são úteis como produtos de gene isolados.

Tais produtos de gene isolados, bem como seus epítopos, são também úteis para geração de anticorpos, que são úteis em aplicações de diagnóstico.

Tais produtos de gene, que podem prover ou gerar epítopos, 30 antígenos ou imunógenos, são também úteis para composições imunogênicas ou imunológicas, bem como vacinas.

Em um aspecto, a invenção provê bactérias contendo uma mu tação de atenuação em uma seqüência de nucleotídeo ou um gene onde a mutação modifica, reduz ou abole a expressão e/ou a atividade biológica de um polipeptídeo ou proteína codificando por um gene, resultando em viru-lência atenuada da bactéria.

A mutação não está necessariamente localizada dentro de uma seqüência de codificação ou gene para romper sua função, levando à atenuação. A mutação pode ser também feita em seqüências de nucleotídeo envolvidas na regulagem da expressão do gene, por exemplo, em regiões que regulam o início da transcrição, tradução e término da transcrição. Desse modo, também incluídos estão promotores e regiões de ligação de ribosso- ma (em geral esses elementos reguladores encontram-se aproximadamente entre 60 e 250 nucleotídeos a montante do códon de partida da seqüência de codificação ou gene; Dorees S. M. e outros, J. Bacterial., 2001, 183(6):1983-9; Pandher K. e outros, Infect Imm., 1998, 66(12):5613-9; Chung J.Y. e outros, FEMS Microbiol Letters, 1998, 166:289-296), termina- dores de transcrição (em geral o terminador está localizado dentro de aproximadamente 50 nucleotídeos a jusante do códon de parada da seqüência de codificação ou gene; Ward C.K. e outros, Infect. Imm., 1998, 66(7):3326- 36). No caso de um óperon, tais regiões de regulagem podem estar localizadas em uma distância maior a montante do gene ou seqüência de codificação. Uma mutação em uma região intergênica pode também levar à atenuação.

Uma mutação dentro de tais seqüências de regulagem associadas com a seqüência de codificação ou gene de modo que a mutação desta seqüência de nucleotídeo modifica, inibe ou abole a expressão e/ou a atividade biológica do polipeptídeo ou da proteína codificada pelo gene, resultando em virulência atenuada da bactéria, seria um equivalente para uma mutação dentro de um gene ou seqüência de codificação identificada na presente invenção.

A atenuação reduz ou abole a patogenicidade das bactérias e a gravidade dos sinais clínicos ou lesões, diminui a taxa de crescimento das bactérias e previne a morte das bactérias.

A invenção refere-se a microorganismos, tal como bactérias, por exemplo, bactérias gram-negativas, tal como bactérias da família Pasteure- llaceae, por exemplo, Pasteurella multocida, Pasteurella haemolytica, Pasteurella anatipestifer e Actinobacillus pleuropneumoniae. Vantajosamente, as 5 bactérias são Pasteurella multocida.

Pasteurella multocida é uma bactéria gram-negativa, que é o agente causador de várias doenças de animais de produção e um patógeno humano oportunístico. Ela é o agente etiológico de pasteurelose severa, tal como cólera da ave em aves domésticas e selvagens, septicemia hemorrá- gica bovina e rinite atrófica de porco (Hunt M.L e outros, Vet. Microbiol., 2000, 72(1-2):3-25). Isolates podem ser agrupados sorologicamente com base nos antígenos capsulares em sorogrupos (A, B, D, E e F) ou em 16 sorotipos baseados em antígenos LPS somáticos.

Seqüências de nucleotídeo potenciais envolvidas em atenuação 15 de bactérias foram identificadas usando o Signature Tagged Mutagenesis (STM). Este método é descrito nos documentos citados aqui e menção é feita do WO-A-96/17951.

STM envolve a inserção de um transposon único, marcado com sinal, no genoma de um microorganismo.

No local de inserção, a seqüência de nucleotídeo do genoma é rompida. Na presente invenção, a mutação resultante (e desse modo o mutante carregando a mutação) é analisada quanto à atenuação.

A seqüência da região rompida (por exemplo, gene ou seqüência de codificação ou quadro de leitura aberto (ORF)) para cada mutante 25 atenuado é determinada através de PCR-amplificação (reação de cadeia de polimerase), clonagem e seqüenciamento das regiões de DNA flanqueando o transposon.

Em uma modalidade da presente invenção, o método STM descrito no WO-A-96/17951 foi adaptado para ser funcional em Pasteurella 30 multocida. Essas adaptações incluem notavelmente o uso do transposon Tn10 ao invés de Tn5, e o uso para seleção de um meio CDM sem leucina ao invés de uma seleção de resistência à estreptomicina. Mais detalhes são dados nos exemplos.

Uma seleção adicional de genes ou seqüências de nucleotídeo envolvidos em atenuação dos genes potenciais identificados pelo método STM é baseada na ausência de mortalidade após inoculação das bactérias mutantes a animais.

Para aplicações veterinárias, um aspecto vantajoso da invenção compreende a implementação de uma seleção experimental diretamente no animal alvo, ao invés de em um modelo de animal. Este método permite uma seleção mais precisa de mutações apropriadas das bactérias mutantes. Para Pasteurella multocida, experimentos são feitos diretamente em perus, um dos hospedeiros alvo naturais de Pasteurella multocida.

Perus são inoculados intramuscularmente com uma quantidade suficiente de grupos de mutantes de P. multocida marcados com sinal (por exemplo, 0,5 ml, 107 CFU por animal). Os mutantes que não são novamente isolados em um certo tempo após inoculação são considerados como potencialmente atenuados. Os mutantes que não são novamente isolados são distinguidos daqueles no grupo que são novamente isolados através de amplificação PCR e análise das marcas de sinal.

Cada mutante potencialmente atenuado é então injetado através de via intramuscular em perus (por exemplo, 0,5 ml, 104 CFU por animal). A mortalidade dos perus é registrada diariamente por 7 dias após a inoculação. Os mutantes que não levam à morte são considerados como atenuados.

O método específico foi realizado em uma cepa Pasteurella multocida P-1059 e vários mutantes atenuados foram obtidos. Cinco deles foram depositados em 1o de abril de 2003 no CNCM (Collection Nationale de Cultures de Microorganismes) do Pasteur Institute, Paris, França. O mutante 4G11 está disponível sob o número de acesso CNCM I-2999. O mutante 5D5 está disponível sob o número de acesso CNCM I-3000. O mutante 9C8 está disponível sob o número de acesso CNCM 1-3001. O mutante 9H4 está disponível sob o número de acesso CNCM I-3002. O mutante 13E1 está disponível sob o número de acesso CNCM I-3003.

As seqüências de nucleotídeo flanqueando o local da inserção do transposon são chamadas SEQ ID NO: 1, 4, 5, 8, 11, 14, 15, 18, 21, 24, 27, 30, 33, 36, 39, 42, 45, 48, 51, 54, 57, 60, 63, 66, 69, 72, 73, 77, 80, 83, 86, 89, 92, 95, 96, 97.

Os transposons foram inseridos na cepa Pasteurella multocida P-1059 imediatamente na extremidade 5' das seqüências 1, 8, 11, 14, 15, 27, 33, 42, 54, 57, 66, 72, 73, 77, 80, 95 e 97, e imediatamente na extremidade 3' das seqüências 4, 5, 18, 21, 24, 30, 36, 39, 45, 48, 51, 60, 63, 69, 83, 86, 89 e 96. Para o mutante 9H4, o transposon foi inserido entre os nucleotídeos nas posições 850-851 da seqüência SEQ ID NO:92.

Um aspecto particular da invenção são mutantes atenuados da cepa Pasteurella multocida P-1059 tendo uma mutação de atenuação no gene ou ORF e/ou suas regiões de regulagem compreendendo uma se-qüência selecionada das seqüências SEQ ID NO: 1, 4, 5, 8, 11, 14, 15, 18, 21, 24, 27, 30, 33, 36, 39, 42, 45, 48, 51, 54, 57, 60, 63, 66, 69, 72, 73, 77, 80, 83, 86, 89, 92, 95, 96 e 97.

Modalidades particulares adicionais da invenção incluem mutantes atenuados de acordo com a invenção de modo que os mutantes atenuados aqui mencionados conforme depositado no CNCM sob os termos do Tratado de Budapeste.

Os mutantes atenuados P-1059 podem ser obtidos, por exemplo, através de inserção de transposon ou através de mutagênese direta (deleção, inserção, substituição). A mutação de atenuação pode ser feita dentro dessas seqüências de nucleotídeo ou genes bem como nas suas seqüências complementares. A mutação de atenuação pode ser também feita em seqüências de nucleotídeo envolvidas na região de regulagem dos ditos genes ou seqüências de nucleotídeo.

As seqüências acima ou suas partes (tal como pelo menos 10, 15 ou 20 nucleotídeos delas, por exemplo, pelo menos 10 nucleotídeos contíguos delas, ou pelo menos 15 nucleotídeos contíguos delas e mais vantajosamente pelo menos 20 nucleotídeos contíguos delas, até o comprimento completo das seqüências) podem ser usadas como primers de PCR para detectar e selecionar os mutantes de inserção de transposon. PCR pode envolver um par de primers, por exemplo, um específico para o transposon, e o outro específico para o gene ou seqüência de nucleotídeo a ser mutado. Com base no tamanho esperado dos produtos amplificados por PCR, o método permite amplificação e/ou detecção dos fragmentos PCR. O conhecimento do gene correspondente ou ORF e/ou suas regiões de regulagem no organismo, por exemplo, bactérias gram-negativas, tal como Pasteurella, por exemplo, Pasteurella multocida, por exemplo, a cepa de Pasteurella multocida PM70 ou P-1059 (vide, por exemplo, infra); por exemplo, o tamanho do gene correspondente ou ORF e/ou suas regiões de regulagem pode ser usado para projetar primers de PCR, para avaliar os fragmentos de PCR amplificados e para detectar aqueles tendo um tamanho certo permitindo a seção dos mutantes.

O genoma integral da cepa de Pasteurella multocida PM70 está disponível no banco de dados EMBL e em May B.J., Proc. Natl. Acad. Sei., USA, 2001,98(6): 3460-5. Blasts feitos com as seqüências SEQ ID NO: 1,4, 5, 8, 11, 14, 15, 18, 21, 24, 27, 30, 33, 36, 39, 42, 45, 48, 51, 54, 57, 60, 63, 66, 69, 72, 73, 77, 80, 83, 86, 89, 92, 95, 96, 97 permitiram localizar as seqüências homologas no genoma de PM70 e então determinar os genes correspondentes ou ORFs em PM70.

Essas seqüências de nucleotídeo na cepa de Pasteurella multo-cida PM70 são chamadas SEQ ID NO: 2, 6, 9, 12, 16, 19, 22, 25, 28, 31, 34, 37, 40, 43, 46, 49, 52, 55, 58, 61,64, 67, 70, 75, 78, 81, 84, 87, 90.

Para o mutante 9H4 da cepa P-1059, nenhuma seqüência ho-móloga foi encontrada em PM70. ORF de P-1059 foi seqüenciada e chamada SEQ ID NO: 93.

Um outro aspecto da invenção são mutantes atenuados da cepa PM70 tendo pelo menos uma mutação de atenuação em um gene ou ORF compreendendo uma seqüência de nucleotídeo selecionada da SEQ ID NO: 2, 6, 9, 12, 16, 19, 22, 25, 28, 31, 37, 40, 43, 46, 49, 52, 55, 58, 61, 64, 67, 70, 75, 78, 81, 84, 87 e 90 e/ou suas regiões de regulagem.

A mutação de atenuação pode ser feita dentro dessas seqüências de nucleotídeo ou genes bem como nas suas seqüências complementa- res. A mutação de atenuação pode ser feita em seqüências de nucleotídeo envolvidas na região de regulagem dos ditos genes. Mutantes atenuados podem ser obtidos, por exemplo, através da inserção de transposon ou através de mutagênese direta (deleção, inserção, substituição).

O termo "complementar" significa a seqüência de nucleotídeo do outro filamento no genoma de filamento duplo, então compreende o filamento de anti-sentido como complemento do filamento de sentido, e reciprocamente. O termo "nucleotídeo" também compreende desoxirribonucleotídeo (então constituído com ácidos desoxirribonucléicos ou DNA), ribonucleotídeo (então constituído com ácidos ribonucléicos ou RNA) e ribonucleotídeo mensageiro (mRNA).

Mais geralmente as mutações de atenuação podem ser introduzidas no genoma de uma bactéria tal como uma bactéria gram-negativa, por exemplo, uma bactéria da família Pasteurellaceae, por exemplo, P. multocida, P. haemolytica, P. anatipestifer, A. pleuropneumoniae, vantajosamente a bactéria no genoma de qualquer uma das várias cepas de P. multocida (por exemplo, cepa P-1059, cepa PM70), mutações em pelo menos uma seqüência de nucleotídeo que codifica para uma seqüência de aminoácido que tem pelo menos cerca de 70% de identidade, pelo menos cerca de 75% de identidade, pelo menos cerca de 80% de identidade, pelo menos cerca de 85%, pelo menos cerca de 90% de identidade, e vantajosamente pelo menos cerca de 95, 96, 97, 98 ou 99% ou mais de identidade para uma das seqüên-cias de aminoácido codificadas por uma seqüência de nucleotídeo identificada como SEQ ID NO: 2, 6, 9, 12, 16, 19, 22, 25, 28, 31, 34, 37, 40, 43, 46, 49, 52, 55, 58, 61, 64, 67, 70, 75, 78, 81, 84, 87, 90, 93. A mutação de atenuação pode ser feita dentro dessas seqüências de nucleotídeo ou genes bem como nas suas seqüências complementares. A mutação de atenuação pode ser também feita em seqüências de nucleotídeo envolvidas na região de regulagem dos ditos genes. Mutantes atenuados podem ser obtidos, por exemplo, através de inserção de transposon ou através de mutagênese direta (deleção, inserção, substituição). Os mutantes atenuados obtidos são modalidades da invenção. Modalidades particulares são os mutantes atenu- ados P-1059.

A porcentagem de identidade entre duas seqüências de aminoá- cido pode ser estabelecida pelo blast em par do NCBI (National Center for Biotechnology Information) e a matriz blosum62, usando os parâmetros padrão (isto é, observar o algoritmo BLAST ou BLASTX disponível no servidor "National Center for Biotechnology Information" (NCBI, Bethesda, Md., USA), bem como em Altschul e outros, J. Mol. Biol., 1990, 215, 403-410; e, desse modo, este documento fala do uso do algoritmo ou o BLAST ou BLASTX ou matriz BLOSUM62 através do termo "blasts").

O verbo "codificar" usado aqui não quer dizer que a seqüência de nucleotídeo é limitada a uma seqüência de codificação real mas também compreende o gene integral incluindo suas seqüências de regulagem que são seqüências de não-codificação.

Homologia de seqüência ou identidade tal como homologia de seqüência de nucleotídeo pode ser também determinada usando o programa "Align" de Myers e Miller, ("Optimal Alignments in Linear Space", CABIOS 4, 11-17, 1988, incorporado aqui a título de referência) e disponível no NCBI, bem como o mesmo ou outros programas disponíveis via Internet nos seus sites tal como o site do NCBI.

Alternativamente ou adicionalmente, o termo "homologia" ou "identidade", por exemplo, com relação a uma seqüência de nucleotídeo ou aminoácido, pode indicar uma medição quantitativa de homologia entre duas seqüências. A homologia de seqüência percentual pode ser calculada como (Nref- Ndjf)*100/Nref, onde Ndifé o número total de resíduos não-idênticos nas duas seqüências quando alinhadas e onde Nrefé o número de resíduos em uma das seqüências. Desse modo, a seqüência de DNA AGTCAGTC terá uma identidade de seqüência de 75% com a seqüência AATCAATC (Nref = 8; Ndif=2).

Alternativamente ou adicionalmente, "homologia" ou "identidade' com relação a seqüências pode se referir ao número de posições com nucleotídeos ou aminoácidos idênticos dividido pelo número de nucleotídeos ou aminoácidos na mais curta das duas seqüências onde o alinhamento das duas seqüências pode ser determinado de acordo com o algoritmo Wilbur e Lipman (Wilbur e Lipman, 1983, PNAS USA 80:726, incorporado aqui a título de referência), por exemplo, usando um tamanho de janela de 20 nucleotídeos, um comprimento de palavra de 4 nucleotídeos, e uma penalidade de 5 lacuna de 4, e análise e interpretação auxiliadas por computador dos dados da seqüência incluindo alinhamento podem ser convenientemente realizadas usando programas comercialmente disponíveis (por exemplo, Intelligene- tics® Suite, Intelligenetics Inc. CA). Quando as seqüências de RNA são ditas serem similares, ou têm um grau de identidade de seqüência ou homologia 10 com seqüências de DNA, timidina (T) na seqüência de DNA é considerada igual à uracila (U) na seqüência de RNA. Desse modo, seqüências de RNA estão dentro do escopo da invenção e podem ser derivadas de seqüências de DNA, através da timidina (T) na seqüência de DNA sendo considerada igual à uracila (U) em seqüências de RNA.

Vantajosamente, identidade ou homologia de seqüência tal como identidade ou homologia de seqüência de aminoácido pode ser determinada usando o programa BlastP (Altschul e outros, Nucl. Acids. Res., 25, 3389-3402, incorporado aqui a título de referência) e disponível no NCBI, bem como o mesmo ou outros programas disponíveis via Internet nos seus sites tal como no site do NCBI.

Os documentos que seguem (cada um aqui incorporado a título de referência) provêem algoritmos para comparação da identidade ou homologia relativa de seqüências tal como resíduos de aminoácido de duas proteínas, e adicionalmente ou alternativamente com relação ao acima, os 25 ensinamentos nessas referências podem ser usados para determinação da homologia ou identidade percentual: Needleman S.B. e Wunsch C.D., "A general method applicable to the search for similarities in the amino acid sequences of two proteins”, J. Mol. Biol., 48:444-453 (1970); Smith T.F. e Waterman M.S., "Comparison of Bio-sequences", Advances in Applied Mathe- 30 matics 2:482-489 (1981); Smith T.F., Waterman MS e Sadler J.R., "Statistical characterization of nucleic acid sequence functional domains", Nucleic Acids Res., 11:2205-2220 (1983); Feng D.F. e Dolittle R.F., "Progressive sequence alignment as a prerequisite to corret phylogenetic trees", J. of Molec. Evol., 25:351-360 (1987); Higgins D.G. e Sharp P.M., "Fast and sensitive multiple sequence alignment on a microcomputer", CABIOS, 5:151-153 (1989); Thompson J.D., Higgins D.G. e Gibson T.J., "ClusterW: improving the sensi- 5 tivity of progressive multiple sequence alignment through sequence weighing, positions-specific gap penalties and weight matrix choice", Nucleic Acid Res., 22:4673-480 (1994); e, Devereux J., Haeberlie P. e Smithies O., "A comprehensive set of sequences analysis program for the VAX", Nucl. Acids. Res., 12:387-395 (1984). E, sem experimentação indevida, o versado 10 na técnica pode consultar muitos outros programas ou referências para de-terminação da homologia percentual.

A invenção refere-se à mutação das seqüências de nucleotídeo ou genes codificando polipeptídeos ou proteínas tendo a mesma função biológica. A similaridade de função pode ser analisada ou identificada ou de- 15 terminada ou revista através da conservação de sítios ativos. Isso pode ser feito através de uma pesquisa de NCBI DART (Domain Architecture Retrieval Tool).

A presente invenção provê então mutantes atenuados de uma bactéria conforme aqui descrito, compreendendo uma mutação de atenua- 20 ção conforme aqui definido.

Os mutantes de bactérias gram-negativas atenuadas incluem uma mutação, onde todo ou parte de pelo menos um gene ou seqüência de ácido nucléico específico é mutado conforme aqui discutido. O gene ou seqüência de ácido nucléico específico inclui aqueles compreendendo, ou ho- 25 mólogos a (por exemplo, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% homólogo a), seqüência SEQ ID NO: 2, 6, 9, 12, 16, 19, 22, 25, 31, 34, 37, 40, 43, 46, 49, 52, 55, 58, 61,64, 67, 70, 75, 78, 81, 84, 87, 90 ou 93, ou suas regiões de regulagem. Vantajosamente, o gene ou seqüência de ácido nucléico específico inclui aqueles compreendendo, ou homólogos a, 30 seqüência SEQ ID NO: 2, 6, 9, 12, 25, 28, 31, 37, 40, 43, 46, 70, 75, 78, 81, 84, 87, 90 ou 93, ou suas regiões de regulagem. Mais vantajosamente, o gene ou seqüência de ácido nucléico específico inclui aqueles compreen dendo, ou homólogos a, a seqüência SEQ ID NO: 6, 12, 25, 31, 37, 40, 46, 70, 75, 84, 87, 90 ou 93, ou suas regiões de regulagem. E, mais vantajosamente ainda, o gene ou seqüência de ácido nucléico específico inclui aqueles compreendendo, ou homólogos a, seqüência SEQ ID NO: 37, 40, 75, 90 ou 93, ou suas seqüências de nucleotídeo homólogas. De preferência, o mutante é uma Pasteurella, tal como uma P. multocida, por exemplo, P-1059 ou PM70.

As mutações podem ser introduzidas no microorganismo usando qualquer técnica conhecida, tal como, por exemplo, tecnologia de DNA re- combinante, a fim de introduzir uma mutação bem-definida no gene ou seqüência de ácido nucléico selecionado (mutagênese direcionada). Tal mutação pode ser uma inserção de seqüência de ácido nucléico homóloga ou heteróloga, uma deleção, uma substituição, por exemplo, uma substituição de pelo menos um nucleotídeo por um outro ou uma combinação delas. Em uma modalidade, a mutação é uma mutação de deleção, onde o rompimento do gene ou seqüência de ácido nucléico é causado pela deleção de parte, e vantajosamente, pela deleção da seqüência de ácido nucléico ou gene todo. Deleção de ácidos nucléicos evita reversão para patogenicidade. Em uma outra modalidade, a mutação é uma inserção em um local que correspondeaos locais de inserção de transposon descritos aqui, por exemplo, nos exemplos. Esses locais, com referência à cepa P-1059, são vantajosamente localizados imediatamente na extremidade 5' das seqüências 1, 8, 11, 14, 15, 27, 33, 42, 54, 57, 66, 72, 73, 77, 80, 95 e 97, e imediatamente na extremidade 3’ das seqüências 4, 5, 18, 21, 24, 30, 36, 39, 45, 48, 51, 60, 63, 69, 83, 86, 89 e 96. Esses locais estão também localizados na cepa PM70 entre: nucleotídeos 180-181 ou 182-183 ou 190-191 na SEQ ID NO: 2, 77-78 ou 1026-1027 ou 1027-1028 na SEQ ID NO:6, 416-417 na SEQ ID NO: 9, 389-390 na SEQ ID NO: 12, 381-382 na SEQ ID NO: 16, 219-220 na SEQ ID NO: 19, 1353-1354 na SEQ ID NO: 22, 136-137 na SEQ ID NO: 25, 384-385 na SEQ ID NO: 28, 222-223 ou 225-226 na SEQ ID NO: 31, 217-218 na SEQ ID NO: 34, 1411-1412 na SEQ ID NO: 37, 943-944 na SEQ ID NO: 40, 855-856 na SEQ ID NO: 43, 369-370 na SEQ ID NO: 46, 111-112 na SEQ ID NO: 49, 443-444 na SEQ ID NO: 52, 4-5 na SEQ ID NO: 55, 573-574 na SEQ ID NO: 61, 875-876 na SEQ ID NO: 64, 218-219 na SEQ ID NO: 70, 1072-1087 na SEQ ID NO: 75, 64-65 na SEQ ID NO: 78, 282-283 na SEQ ID NO: 81, 1431-1432 na SEQ ID NO: 84, 974-975 na SEQ ID NO: 87, 802-803 na SEQ ID NO: 90, 850-851 na SEQ ID NO: 92; ou, o nucleotídeo imediatamente a montante 1 na SEQ ID NO: 58, ou nucleotídeo imediatamente a montante 1 na SEQ ID NO: 67. Esse locais estão também localizados entre os pares similares de nucleotídeos (então citados para PM70) em seqüências de nucleotídeo de uma outra bactéria gram-negativa, tal como membro da família Pasteurellacaea, por exemplo, P. multocida, P. haemolytica, P. anatipestifer, A. pleuropneumoniae, codificando uma seqüência de aminoá-cido homóloga conforme aqui definido com sua porcentagem de identidade. Desse modo, mutantes podem ser bactérias gram-negativas e são vantajosamente uma Pasteurella, tal como P. multocida, P. haemolytica, P. anatipestifer, A. pleuropneumoniae, por exemplo, uma P. multocida, tal como P1059 ou PM70.

Através de definição, mutantes de deleção compreendem pelo menos uma deleção de ou em uma seqüência de nucleotídeo de acordo com a invenção. Esses mutantes de deleção incluem aqueles onde toda ou parte de uma seqüência de gene específica ou seqüência de nucleotídeo específica é deletada. Em um aspecto, a mutação resulta na deleção de pelo menos um ácido nucléico, de pelo cerca de 10%, pelo menos cerca de 20%, pelo menos cerca de 30%, pelo menos cerca de 40%, pelo menos cerca de 50%, pelo menos cerca de 60%, pelo menos cerca de 70%, pelo menos cerca de 80%, pelo menos cerca de 90%, pelo menos cerca de 95%, pelo menos cerca de 98%, ou pelo menos cerca de 99% do gene ou seqüência de nucleotídeo específica. De preferência, o gene ou seqüência de nucleotídeo específica completo é deletado.

Os mutantes podem compreender mais de uma mutação, que pode resultar em graus aditivos ou sinérgicos de atenuação, e pode resultar em uma prevenção melhor da reversão de atenuação.

Essas mutações múltiplas podem associar mutação(ões) em seqüências de nucleotídeo ou genes conhecidos pela suas propriedades de atenuação tal como genes aro, por exemplo, aroA (Homchampa, P. e outros, Veterinary Microbiology, 1994, 42:35-44), e mutações em seqüências de nucleotídeo ou genes de acordo com a invenção.

Em uma modalidade, os mutantes incluem pelo menos duas mutações, onde, para cada mutação todo ou parte de um gene ou seqüência de ácido nucléico específico é mutado conforme aqui discutido. Esses genes ou seqüências de ácido nucléico específicos incluem aqueles compreendendo, ou homólogos a, seqüências SEQ ID NO: 2, 6, 9, 12, 16, 19, 22, 25, 28, 31, 34, 37, 40, 43, 46, 49, 52, 55, 58, 61,64, 67, 70, 75, 78, 81, 84, 87, 90 ou 93, ou suas regiões de regulação. Desse modo, mutantes tendo duas ou mais das seqüências mutadas acima, por exemplo, detetadas conforme aqui discutido, são pretendidos pela invenção. Vantajosamente, mutantes têm duas ou mais das seqüências que seguem ou seqüências compreendendo, ou homólogas às seqüências que seguem mutadas, por exemplo, detetadas, conforme aqui discutido: SEQ ID NO: 2, 6, 9, 12, 25, 31, 37, 40, 43, 46, 70, 75, 78, 81, 84, 87, 90 ou 93, ou suas regiões de regulagem. Mais vantajosamente, os genes ou seqüências de ácido nucléico específicos que são mutados (por exemplo, os dois ou mais que são mutados) incluindo aqueles compreendendo, ou homólogos a, as seqüências SEQ ID NO: 6, 12, 25, 31, 37, 40, 46, 70, 75, 84, 87, 90 ou 93, ou suas regiões de regulagem. O mu-tante pode ser uma bactéria gram-negativa, e vantajosa mente o mutante é uma Pasteurella, tal como uma P. multocida, por exemplo, P-1059 ou PM70.

Vantajosamente, mutantes tendo duas ou mais das seqüências que seguem, ou suas regiões de regulagem, mutadas, por exemplo, detetadas conforme aqui descrito, são pretendidos pela invenção: SEQ ID NO: 37, 40, 75, 90 e 93, ou suas seqüências de nucleotídeo homólogas.

Várias modalidades incluem mutantes tendo deteções de ou nos genes ou seqüências de ácido nucléico compreendendo, ou homólogas às seqüências SEQ ID NO: 37 e 40; SEQ ID NO: 37 e 75; SEQ ID NO: 37 e 90; e SEQ ID NO: 37 e 93; SEQ ID NO: 40 e 75; SEQ ID NO: 40 e 90; SEQ ID NO: 40 e 93; SEQ ID NO: 75 e 90; SEQ ID NO: 75 e 93; SEQ ID NO: 90 e 93, ou suas regiões de regulagem. O mutante pode ser uma bactéria gram- negativa e vantajosamente o mutante é Pasteurella, tal como P. multocida, por exemplo, P-1059 ou PM70.

Métodos para introduzir as mutações nas regiões genômicas específicas são conhecidos e ficarão aparentes à pessoa versada na técnica a partir deste relatório e do conhecimento na técnica. Por exemplo, o gene ou seqüência completo a ser mutado ou um fragmento é clonado em um vetor e modificado a fim de abolir sua expressão e/ou sua atividade biológica. O vetor é introduzido nas bactérias, por exemplo, através de eletrofora- ção (por exemplo, Jablonski L. e outros, Microbial Pathogenesis, 1992, 12, 63-68), ou através de conjugação (Lee M.D. e outros, Vet. Microbiol., 1996, 50, 143-148). O fragmento de DNA modificado é reintroduzido no genoma bacteriano através de recombinação genética, vantajosamente através de recombinação homóloga entre o cromossoma bacteriano e o vetor. Como um exemplo o vetor pode ser um plasmídeo suicida conforme descrito em Cardenas (Cardenas M. e outros, Vet. Microbiol., 2001, 3 de maio; 80(1): 5361). Vantajosamente, esse vetor compreende ainda, entre os dois braços ou regiões de flanqueamento (empregados em recombinação homóloga) uma seqüência de poliparada (por exemplo, 6 códons de parada, um em cada quadro de leitura) para bloquear qualquer tradução possível.

O microorganismo atenuado da invenção, por exemplo, bactérias gram-negativas, tal como P. multocida, pode ainda compreender pelo menos uma seqüência de ácido nucléico homóloga ou heteróloga inserida em seu genoma. Isso é útil para reprodução ou replicação de moléculas de ácido nucléico heterólogas e/ou para expressão de moléculas de ácido nucléico heterólogas, ou in vivo ou in vitro. A seqüência de ácido nucléico heteróloga vantajosamente codifica para um imunógeno, antígeno ou epítopo de um agente virai patogênico, parasítico ou bacteriano que é diferente daqueles naturalmente expressos pelo microorganismo atenuado. Esta seqüência heteróloga pode codificar um imunógeno, antígeno ou epítopo de uma outra cepa do microorganismo ou bactérias, por exemplo, cepa P. multocida. Um imunógeno ou antígeno é uma proteína ou polipeptídeo capaz de induzir uma resposta imune contra o agente patogênico ou um antígeno secretado do agente patogênico, e contém um ou mais epítopos; e epítopo é um peptí- deo ou polipeptídeo que é capaz de induzir uma resposta imune contra o agente patogênico ou um antígeno secretado do agente patogênico.

Seqüências de ácido nucléico heterólogas que são adequadas para este uso em tal vetor ficarão aparentes à pessoa versada na técnica (Fedovora N.D. e Highlander S.K., Infect. Immun., 1997, 65(7):2593-8) e incluem, por exemplo, aquelas dos membros da família Pasteurella (notavelmente Pasteurella multocida, Pasteurella haemolytica, Pasteurella anatipestifer, Actinobacillus pleuropneumoniae), ou de bactérias tal como E. coli, Salmonella, Campylobacter.

A seqüência heteróloga é vantajosamente inserida de modo a ser expressa pelo microorganismo no hospedeiro quando administrada a fim de desenvolver uma resposta imune contra ambos microorganismo atenuado e o dito imunógeno expresso. A seqüência heteróloga é vantajosamente inserida com ou operavelmente ligada a ou a jusante dos elementos de regulagem permitindo sua expressão, tal como um promotor. Seqüências de nucleotídeo úteis para o endereçamento e a secreção da proteína podem ser também adicionadas. Desse modo, seqüências líder ou de sinal podem ser incluídas em produtos expressos para facilitar o transporte através da parede celular e/ou secreção.

Em uma modalidade, a seqüência homóloga ou heteróloga é inserida na seqüência de nucleotídeo selecionada ou o gene selecionado usado para a atenuação; vantajosamente, a seqüência homóloga ou heteróloga é inserida em um dos locais correspondendo aos locais de inserção de transposon identificados aqui.

Para melhorar a expressão, o uso do códon pode ser adaptado para o vetor bacteriano usado.

Os mutantes atenuados da invenção podem também compreender uma seqüência de ácido nucléico codificando uma proteína terapêutica, um alérgeno, um fator de crescimento ou uma citocina ou um imunomodula- dor ou imunoestimulador tal como um GM-CSF, por exemplo, um GM-CSF VA combinado com a espécie alvo (por exemplo, se o vetor atenuado for P. multocida, para administração a bovinos, GM-CSF bovino poderia ser expresso pelo vetor, por exemplo, com a expressão pelo vetor de uma outra proteína, peptídeo, polipeptídeo, antígeno, imunógeno ou epítopo heterólo- go)-

De acordo com um aspecto adicional da invenção microorganismos atenuados são usados para produzir composições imunogênicas atenuadas vivas ou composições de vacina atenuadas vivas.

De acordo com um aspecto vantajoso da invenção, o microorganismo atenuado é uma bactéria gram-negativa, tal como uma Pasteurella, por exemplo, uma P. multocida, por exemplo, P-1059 ou PM70, mutada de acordo com a invenção.

Vantajosamente, conforme aqui descrito, o microorganismo pode agir como um vetor recombinante para imunizar e/ou vacinar animais ou seres humanos contra infecções causadas por outros agentes que não Pasteurella.

As composições imunogênicas ou as composições de vacina compreendem o mutante atenuado e um carreador, excipiente, diluente ou veículo farmaceuticamente ou veterinariamente aceitável, e opcionalmente um estabilizador e/ou um adjuvante. O mutante atenuado pode ser um vetor que adicionalmente expressa moléculas de ácido nucléico heterólogas com o vetor, tal como um epítopo, antígeno, imunógeno e/ou fator de crescimento, citocina, imunorregulador ou imunoestimulador heterólogo.

O termo "composição imunogênica" compreende aqui qualquer composição capaz de, uma vez tendo sido injetada nos animais ou a um ser humano, elicitar uma resposta imune contra o patógeno alvo. O termo "composição de vacina" ou "vacina" compreende aqui qualquer composição capaz de, uma vez tendo sido injetada em animais ou em um ser humano, induzir uma resposta imunoprotetora contra o patógeno alvo.

O veículo farmaceuticamente ou veterinariamente aceitável pode ser água ou solução salina, mas ele pode, por exemplo, também compreender meio de cultura bacteriana.

As bactérias atenuadas vivas de acordo com a invenção podem ser secas com congelamento vantajosamente com um estabilizador. Secagem com congelamento pode ser feita de acordo com procedimentos de secagem com congelamento padrão bem-conhecidos. Os estabilizadores farmaceuticamente ou veterinariamente aceitáveis podem ser carboidratos (por exemplo, sorbitol, manitol, lactose, sacarose, glicose, dextrano, trealose), glutamato de sódio (Tsvetkov T. e outros, Cryobiology, 1983, 20(3):318-23; Israeli E. e outros, Cryobiology, 1993, 30(5):519-23), proteínas tal como peptona, albumina, lactalbumina ou caseína, agentes contendo proteína tal como leite desnatado (Mills C.K. e outros, Cryobiology, 1988, 25(2): 148-52; Wolff E. e outros, Cryobiology, 1990, 27(5): 569-75) e tampões (por exemplo, tampão de fosfato, tampão de fosfato de metal alcalino).

Um adjuvante pode ser usado para fazer preparações secas com congelamento.

Exemplos de adjuvantes são emulsões óleo-em-água, água-em- óleo-em-água baseadas em óleo mineral e/ou óleo vegetal e tensoativos não-iônicos tal como copolímeros em bloco, Tween®, Span®. Outros adjuvantes adequados são, por exemplo, vitamina E, saponinas, e Carbopol®, hidróxido de alumínio ou fosfato de alumínio ("Vaccine Design, The subunit and adjuvant approach", Pharmaceutical Biotechnology, vol. 6, Editado por Michael F. Powell e Mark J. Newman, 1995, Plenum Press, Nova York).

As bactérias atenuadas vivas podem ser armazenadas a -70°C em um meio contendo glicerol.

Opcionalmente, a composição imunogênica ou vacina pode ser combinada com um ou mais imunógenos, antígenos ou epítopos selecionados de outros microorganismos patogênicos ou vírus em uma forma inativa- da ou viva.

Um outro aspecto da invenção são as seqüências de nucleotídeo ou genes de acordo com a invenção, tal como as seqüências de nucleotídeo ou genes de acordo com a invenção chamados SEQ ID NO: 2, 6, 9, 12, 16, 19, 22, 25, 28, 31, 34, 37, 40, 43, 46, 49, 52, 55, 58, 61, 64, 67, 70, 75, 78, 81,84, 87, 90 e 93, e vantajosamente aqueles chamados SEQ ID NO: 1, 4, 5, 8, 11, 14, 15, 18, 21, 24, 27, 30, 33, 36, 39, 42, 45, 48, 51, 54, 57, 60, 63, 66, 69, 72, 73, 77, 80, 83, 86, 89, 92, 95, 96, 97.

Um outro aspecto da invenção é o uso de seqüências de nucleotídeo ou genes de acordo com a invenção para a expressão e produção de peptídeos, polipeptídeos ou proteínas, ou mais geralmente, produtos de expressão, por exemplo, imunógenos, antígenos ou epítopos. Em uma modalidade, os polipeptídeos ou peptídeos ou proteínas codificados por essas seqüências de nucleotídeo ou genes podem ser usados como imunógenos ou antígenos ou epítopos de subunidade em composições imunogênicas ou de vacina. Procedimentos de determinação de epítopo, tal como geração de bibliotecas de peptídeo de sobreposição (Hemmer B. e outros, Immunology Today, 1998, 19(4), 163-168), Pepscan (Geysen H.M. e outros, Proc. Natl. Acad. Sei., USA, 1984, 81(13), 3998-4002; Geysen H.M. e outros, Proc. Natl. Acad. Sei., USA, 1985, 82(1), 178-182; Van der Zee R. e outros, Eur. J. Immunol., 1989, 19(1), 43-47; Geysen H.M., Southeast Asian J. Trop. Med. Public. Health, 1990, 21(4), 523-533; Multipin® Peptide Synthesis Kits de Chiron) e algoritmos (De Groot A. e outros, Nature Biotechnology, 1999, 17, 533-561), podem ser usados na prática da invenção, sem experimentação indevida.

Polipeptídeos vantajosos são aqueles tendo as seqüências de aminoácidos identificadas como SEQ ID NO: 3, 7, 10, 13, 17, 20, 23, 26, 29, 32, 35, 38, 41, 44, 47, 50, 53, 56, 59, 62, 65, 68, 71, 76, 79, 82, 85, 88, 91, 94, ou aqueles codificados pelas seqüências de nucleotídeo SEQ ID NO: 2, 6, 9, 12, 16, 19, 22, 25, 28, 31, 34, 37, 40, 43, 46, 49, 52, 55, 58, 61, 64, 67, 70, 75, 78, 81, 84, 87, 90, 93. Epítopos desses polipeptídeos podem ser também usados vantajosamente.

A invenção compreende os polipeptídeos equivalentes de uma outra bactéria, tal como uma bactéria gram-negativa, vantajosamente um membro da família Pasteurellaceae, por exemplo, P. multocida, P. haemolytica, P. anatipestifer, A. pleuropneumoniae, e mais vantajosamente no genoma de qualquer uma das várias cepas de P. multocida são então incluídas através de equivalência de polipeptídeos cujas seqüências de aminoácido têm pelo menos cerca de 70%, pelo menos cerca de 75%, pelo menos cerca de 80%, pelo menos cerca de 85%, pelo menos cerca de 90%, pelo menos cerca de 95% e pelo menos cerca de 96, 97, 98 ou 99% de identidade com uma das seqüências de aminoácido identificadas como SEQ ID NO: 3, 7, 10, 5 13, 17, 20, 23, 26, 29, 32, 35, 38, 41, 44, 47, 50, 53, 56, 59, 62, 65, 68, 71, 76, 79, 82, 85, 88, 91, 94 e/ou polipeptídeos que têm a(s) mesma(s) fun- ção(ões) biológica(s) que os polipeptídeos identificados acima com SEQ. Os critérios para estabelecimento da identidade ou a mesma função biológica foram descritos acima.

A invenção também compreende os fragmentos imunogênicos desse polipeptídeos, tendo pelo menos uma cadeia de 10 aminoácidos do polipeptídeo, pelo menos 20, tal como pelo menos 30, vantajosamente pelo menos 50 e mais vantajosamente pelo menos 70, por exemplo, fragmentos dos polipeptídeos contendo pelo menos 10 aminoácidos contíguos do poli- 15 peptídeo, vantajosamente pelo menos 20 aminoácidos contíguos do polipeptídeo, tal como pelo menos 30 e mais vantajosamente pelo menos 50 aminoácidos contíguos do polipeptídeo, e mais vantajosamente ainda pelo menos 70 aminoácidos contíguos do polipeptídeo. Por certo, um fragmento é menos do que o polipeptídeo completo. Um fragmento pode ser combinado 20 com outros polipeptídeos, por exemplo, em polipeptídeos de fusão; por exemplo, um polipeptídeo da invenção ou seu fragmento pode ser uma porção de um polipeptídeo de fusão que inclui uma outra porção (um outro poli-peptídeo), por exemplo, uma porção de aumento da imunogenicidade e/ou uma porção de aumento de secreção tal como uma porção de lipoproteína 25 que aumenta a imunogenicidade ou uma porção de seqüência de sinal ou líder. Desse modo, a invenção pretende a expressão de polipeptídeos, proteínas, antígenos, imunógenos ou epítopos - sejam as seqüências aqui identificadas ou seus fragmentos ou aquelas que são heterólogas para os vetores da invenção - como fusões, por exemplo, como uma porção de um poli- 30 peptídeo de fusão, por exemplo, um polipeptídeo de fusão que vantajosamente inclui uma porção de aumento da imunogenicidade tal como uma porção de lipoproteína e/ou uma porção de aumento da secreção tal como uma porção de seqüência de sinal ou líder.

Os polipeptídeos ou fragmentos são produzidos vantajosamente através de expressão in vitro. As seqüências de nucleotídeo de acordo com a invenção (por exemplo, SEQ ID NO: 2, 6, 9, 12, 16, 19, 22, 25, 28, 31, 34, 37, 40, 43, 46, 49, 52, 55, 58, 61, 64, 67, 70, 75, 78, 81, 84, 87, 90, 93) ou seus fragmentos são inseridos em um vetor, operavelmente ligados a elementos de regulagem tal como promotor, região e terminador de ligação de ribossoma e códon de partida e códon de parada. Vetores vantajosos são plasmídeos úteis para expressão in vitro em bactérias, isto é, Escherichia coli (Mahona F. e outros, Biochimie, 1994, 46(1 ):9-14; Watt M.A. e outros, Cell Stress Chaperones, 1997, 2(3); 180-90; Frey J., Res. Microbiol., 1992, 143(3):263-9).

Esses polipeptídeos podem ser também quimicamente sintetizados (Luo Y. e outros, Vaccine, 1999,17(7-8):821-31).

Um aspecto da invenção é então uma composição imunogênica ou de vacina compreendendo pelo menos um polipeptídeo ou fragmento de acordo com a invenção (composição imunogênica de subunidade ou vacina) ou pelo menos um vetor de expressão in vivo conforme aqui descrito (composições imunogênicas recombinantes vivas ou de vacina), e um carreador, excipiente, diluente ou veículo farmaceuticamente ou veterinariamente acei-tável, e opcionalmente um adjuvante. Exemplos de tais ingredientes foram aqui descritos em relação à vacina viva.

Em uma outra modalidade, essas seqüências de nucleotídeo ou seus fragmentos podem ser inseridos em vetores recombinantes para produzir composições imunogênicas recombinantes vivas ou vacinas capazes de expressar in vivo no hospedeiro o polipeptídeo codificado por esta seqüência de nucleotídeo ou fragmento.

O vetor de expressão in vivo pode ser um vetor de polinucleotí- deo ou plasmídeo (EP-A2-1001025; Chaudhuri P., Res. Vet. Sei., 2001, 70(3), 255-6), vírus (por exemplo, adenovirus, poxvirus tal como epitelioma contagioso (US-A-5.174.993, US-A-5.505.941 e US-A-5.766.599) ou "canarypox" (US-A-5.756.103)) ou bactérias, isto é, Escherichia coli ou Salmonella sp.

Polipeptídeos e fragmentos da invenção podem ser também usados em terapia.

Os polipeptídeos e fragmentos podem ser também usados como reagentes em reações de anticorpo-antígeno. Desse modo, um outro aspecto da invenção é então um método de diagnóstico e/ou kit para detecção de infecção pela bactéria gram-negativa. Kit, por exemplo, ELISA, podem incluir pelo menos um polipeptídeo ou fragmento de acordo com a invenção (por exemplo, pelo menos um polipeptídeo identificado pela presente seqüência ou um seu fragmento conforme aqui discutido).

Anticorpos contra os presentes polipeptídeos ou fragmentos (por exemplo, polipeptídeos identificados pela presente seqüência ou seus fragmentos conforme aqui discutido) podem ser usados como um reagente de diagnóstico ou em imunização ou vacinação passiva ou em terapia. As quantidades de anticorpo administradas em imunização passiva podem ser iguais às ou análogas às quantidades usadas na técnica, de modo que a partir do conhecimento na técnica, o versado na técnica pode praticar imunização passiva sem experimentação indevida.

Um outro aspecto da invenção é uma preparação de anticorpo compreendendo um anticorpo específico para um polipeptídeo ou um fragmento de acordo com a invenção e métodos de diagnóstico usando a mesma. Com relação a um anticorpo específico para um polipeptídeo, se quer dizer que o anticorpo se liga de preferência ao polipeptídeo, por exemplo, o anticorpo se liga ao polipeptídeo e não a outros polipeptídeos e tem uma especificidade para o polipeptídeo que é aceitavelmente particular para o polipeptídeo de modo que o anticorpo pode ser usado para isolar o polipeptídeo de uma amostra ou detectar sua presença em uma amostra com não mais do que 5% de falsos positivos, usando técnicas conhecidas no campo ou discutidas em documentos citados aqui, incluindo Sambrook, infra.

Anticorpos podem ser policlonais ou monoclonais.

Métodos para produção de anticorpos são bem-conhecidos do versado na técnica.

Se anticorpos policlonais forem desejados, um animal selecionado (por exemplo, camundongo, coelho, cabra, cavalo, etc) é imunizado com um polipeptídeo ou um fragmento. Soro do animal imunizado é coletado e tratado de acordo com procedimentos conhecidos e possivelmente purificado. Vide, por exemplo, Jurgens e outros, J. Chrom., 1985, 348:363-370.

A metodologia geral de fabricação de anticorpos monoclonais usando tecnologia de hibridoma é bem-conhecida. Tipos de célula de produção de anticorpo imortais podem ser criados através de fusão celular, e também através de outras técnicas tal como transformação direta de linfócitos B com DNA oncogênico, ou transfecção com vírus Epstein-Barr. Vide, por exemplo, J.E. Liddell "A practical guide to monoclonal antibodies", Ed. John Wiley and Sons, 1991, p. 188; S.J. de StGroth e outros, J. Immunol. Methods., 1980, 35(1-2), 1-21.

As seqüências de nucleotídeo de acordo com a invenção e seus fragmentos podem ser usados como uma sonda para hibridização, por exemplo, em um método de diagnóstico.

Condições de hibridização estringentes são vantajosamente usadas. Uma pessoa pode se referir àquelas descritas por Sambrook e outros, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989), 1.101-1.104. Hibridização sob condições estringentes significa que um sinal de hibridização positivo é ainda observado após lavagem por 1 hora com tampão 1xSSC e SDS 0,1% a 55° C, vantajosamente a 62° C e mais vantajosamente a 68° C, por exemplo, por 1 hora em tampão 0,2xSSC e SDS 0,1% a 55° C, tal como a 62° C e vantajosamente a 68° C.

Uma pessoa pode também caracterizar seqüências de nucleotídeo pela sua habilidade em se ligar sob condições de hibridização estringentes. Desse modo, a invenção pode pretender aqui identificar seqüências de ácido nucléico e moléculas de ácido nucléico que se ligam a elas sob condições de hibridização estringentes.

As seqüências de nucleotídeo de acordo com a invenção e seus fragmentos podem ser usados como primers para PCR ou em um método similar envolvendo amplificação e/ou hibridização, por exemplo, para detec ção de bactérias gram-negativas em qualquer meio, por exemplo, amostras de tecido, fluidos biológicos, água, alimento.

Uso vantajoso é feito de fragmentos de seqüência de nucleotídeo que têm pelo menos 20 ácidos nucléicos contíguos, tal como pelo menos 30 contíguos, por exemplo, pelo menos 50 contíguos, por exemplo, pelo menos 70 contíguos ou mais vantajosamente pelo menos 100 contíguos de seqüências de nucleotídeo ou genes de acordo com a invenção, por exemplo, da SEQ ID NO: 2, 6, 9, 12, 16, 19, 22, 25, 28, 31, 34, 37, 40, 43, 46, 49, 52, 55, 58, 61,64, 67, 70, 75, 78, 81,84, 87, 90, 93.

Ainda, a presente invenção refere-se a métodos para imunizar contra ou para prevenir infecção bacteriana ou proteger contra infecção bacteriana em animais, vantajosamente animais suscetíveis a ela, tal como espécies de ave, coelho, bovino e porco, e mais vantajosamente em espécies de ave tal como galinha, peru e pato (incluindo criações, frango para grelhar e poedeiras) ou em um ser humano.

De acordo com esses métodos, (1) uma composição imunogênica atenuada viva ou de vacina da invenção, ou (2) uma composição imunogênica de subunidade ou de vacina da invenção, ou (3) uma composição imunogênica recombinante viva ou de vacina da invenção, ou uma combinação delas, são administradas. Por certo, modalidades da invenção podem ser empregadas com outras composições imunogênicas ou de vacinas que não são da invenção, por exemplo, em processos iniciais-de reforço, tal como onde uma vacina ou composição imunogênica da invenção é administrada primeiro e uma vacina ou composição imunogênica diferente é admi-nistrada em seguida, ou vice-versa.

A administração pode ser feita de forma especial através de injeção intramuscular (IM), intradermal (ID) ou subcutânea (SC) ou através de administração intranasal, intratraqueal ou oral. A composição imunogênica ou a vacina de acordo com a invenção é vantajosamente administrada através de uma seringa, aparelho sem agulha (tal como por exemplo Pigjet, Avijet, Dermojet ou Biojector (Bioject, Oregon, USA)), spray, água para beber, colírio.

Administrações vantajosas para a composição imunogênica ou vacina atenuada viva são in ovo, através das vias oral (por exemplo, água para beber, spray para todo o corpo), ocular (por exemplo, colírio, spray para todo o corpo), traqueal (por exemplo, spray), intradermal, subcutânea (SC) ou intramuscular (IM).

A quantidade de microorganismos atenuados vivos pode ser determinada e otimizada pela pessoa versada na técnica, sem experimentação indevida a partir do presente relatório e do conhecimento na técnica. Em geral, um animal (incluindo um ser humano) pode ser administrado aproximadamente 104-109 CFUs, vantajosamente aproximadamente 105-108 CFUs e mais vantajosamente aproximadamente 106-107CFUs em uma unidade de dose única.

Através de via intramuscular um animal ave pode ser administrado aproximadamente com 104-107 CFUs, vantajosamente aproximadamente 105-106 CFUs em uma unidade de dose única. O volume de uma unidade de dose única pode estar entre cerca de 0,2 ml e cerca de 0,5 ml e vantajosamente cerca de 0,3 ml. Através de via oral, traqueal ou ocular um animal ave pode ser administrado com aproximadamente 105-108 CFUs, vantajosamente aproximadamente 106-107 CFUs em uma unidade de dose única. Para administração de spray, o volume é ajustado para o aparelho e o tamanho das gotículas, de a partir de cerca de 30 a cerca de 600 ml para cerca de 1000 animais e vantajosamente cerca de 0,2 ml por animal.

Para animais bovinos e porcinos, as vias vantajosas são IM e SC. O animal pode ser administrado com aproximadamente 104-109 CFUs, vantajosamente aproximadamente 105-108 CFUs, em uma unidade de dose única. O volume de uma unidade de dose única pode estar entre cerca de 0,2 ml e cerca de 5,0 ml e vantajosamente entre cerca de 0,5 ml e cerca de 2,0 ml e mais vantajosamente cerca de 1,0 ml. Coelhos podem ser administrados através de via IM ou SC com aproximadamente 104-108 CFUs, vantajosamente aproximadamente 105-107 CFUs, em uma unidade de dose única. O volume de uma unidade de dose única pode estar entre cerca de 0,2 ml e cerca de 0,5 ml e vantajosamente 36 cerca de 0,5 ml. Eles podem ser também administrados através de via ID com 104-108 CFUs, vantajosamente aproximadamente 105-107 CFUs, em uma unidade de dose única. O volume de uma unidade de dose única pode estar entre cerca de 0,1 ml e cerca de 0,2 ml.

A invenção será agora adicionalmente descrita a título dos exemplos não-limitantes que seguem.

EXEMPLOS Exemplo 1: Construção de uma biblioteca de mutantes de transposon de P. multocida marcados com sinal (avaliação STM) Construção dos transformantes SMIOXpir pLOF/km marcados

Marcadores foram produzidos conforme descrito em Hensel e outros (Science, 1995, 269:400-403). Inicialmente, plasmídeos pUTmi- niTn5Km2 com marcador foram selecionados, os quais continham marcadores que hibridizam bem mas não hibridizam com cruzamento um com o outro. O transposon mini-Tn5 no vetor pUTminiTn5Km2 com marcador foi verificado não transpor em várias cepas de Pasteurella multocida. Em contraste o transposon mini-Tn10 foi mostrado funcionar em P. multocida (Lee e outros, Vet. Microbiol., 1996, 50:143-8). Os marcadores pré-selecionados foram então transferidos dos vetores pUTminiTnõ para o plasmídeo pLOF/Km contendo mini-Tn10 (Herrero e outros, J. Bacteriology, 1990, 172:6557-6567). Os marcadores foram amplificados através de PCR usando primers que se ligam ao vetor pUTminiTn5Km2, em qualquer lado do local Kpnl no qual os marcadores foram clonados. Esses primers incluíam seqüências para a enzima de restrição Sail. Os produtos de PCR foram então digeridos com Sail e clonados no local Sall de uma versão modificada do vetor pLOF/Km, onde um local Sail substituiu o local de clonagem Sfil único. Os plasmídeos pLOF/Km com marcador foram então transformados na cepa de E. coli SMIOXpir (Kmr, thi, thr, leu, tonA, lacY, supE, recA::RP4-2-Tc::MuÀpir) (Miller V.L. e outros, J. Bacteriol., 1988, 170:2575-83). Esta cepa pode mobilizar plasmídeos tal como pLOF/Km em bactérias recipientes através de conjugação.

Métodos de Seleção e contra-seleção

O processo de conjugação requer um método de seleção da P. multocida recipiente, que obteve o plasmídeo pLOF/KM e um método de contra-seleção contra o doador SMIOXpir de E. coli.

No método de seleção as P. multocida recipientes são selecio nadas usando canamicina, que é codificada pelo transposon mini-Tn10. Inicialmente, para contra-seleção contra o doador de E. coli em conjugações, um mutante resistente à estreptomicina espontaneamente da cepa P-1059 de Pasteurella foi usado. No entanto, parece que esta cepa foi 10 atenuada em virulência para perus e então não foi útil aqui. Cepas de Pasteurella multocida podem crescer em um meio quimicamente definido (CDM) (Hu e outros, Infection and Immunity, 1986, 804-810). Uma versão modificada deste meio quimicamente definido contendo ágar mas não contendo leu- cina foi utilizada para permitir contra-seleção contra o doador de E. coli. A 15 cepa de Pasteurella era capaz de crescer neste meio, cuja composição é dada na Tabela 1, enquanto que a cepa de E. coli SMIOXpir, que é um au- xótropo de leucina, não. Tabela 1:

Continuação

Passagem da cepa de P. multocida em meio CDM

Uma ampola liofilizada de cepa de P. multocida (USDA P-1059, disponível da American Type Culture Collection, número de acesso ATCC 15742) foi reavivada através da adição de 200 μl de BHI (infusão cérebro- coração) e uma alíquota da suspensão colocada sobre uma placa de ágar BHI e a placa incubada a 37° C da noite para o dia. Material de colônia desta placa foi usado para inocular uma cultura de caldo de BHI, que foi incubada com agitação a 37° C da noite para o dia. Glicerol foi adicionado para uma concentração final de 15% v/v e as alíquotas foram armazenadas congeladas a -80° C. Uma amostra de uma dessas alíquotas congeladas foi colocada sobre uma placa de ágar de BHI e incubada da noite para o dia. Material de colônia desta placa BHI foi então coloado camada sobre placas de ágar CDM com a composição dada na tabela 1 e incubado a 37° C por 3 dias. Material de colônia desta placa de CDM foi inoculado em uma cultura de caldo BHI e incubado com agitação a 37° C da noite para o dia. Glicerol foi adicionado a esta cultura para uma concentração final de 15% v/v e as alíquotas congeladas a -80° C. Este cepa foi chamada 16084 (CDM).

Construção do banco de mutante

Os transformantes SMIOXpir pLOF/km marcados foram conjugados com a cepa de P. multocida 16084 (CDM). Para minimizar o isolamento de mutantes irmãos (mutante com o transposon localizado na mesma posição que surgiu devido à replicação do mutante durante o procedimento de conjugação) cada transformante SMWXpir marcado foi conjugado com a cepa de P. multocida em pelo menos três conjugações separadas. Mutantes de transposon de Pasteurella foram selecionados em placas de ágar CDM suplementadas com 50 μg/ml de canamicina.

Os mutantes resistentes à canamicina para cada um dos trans- posons marcados foram então espalhados em camada para formar colônias únicas duas vezes em placas de ágar de 50 μg/ml de canamicina no BHI. Colônias únicas foram então inoculadas em culturas de caldo de BHI, cresceram da noite para o dia a 37° C com agitação. Glicerol foi então adicionado para uma concentração final de 15% v/v e os mutantes armazenados a - 80°C em frascos individuais.

Exemplo 2: Avaliação do banco de mutante de Pasteurella marcado com sinal quanto a mutantes atenuados em virulência para perus

Culturas dos mutantes de P. multocida foram cultivadas para inoculação de perus misturando 20 μl de cada um dos estoques de glicerol dos mutantes obtidos no exemplo I com 200 μl de meio de cultura BHI, suplementado com 50 μg/ml de canamicina, e pondo em pratos de microtitula- ção de 96 cavidades. Esses pratos de microtitulação foram incubados em condições estáticas por cerca de 18 horas a 37° C. Então alíquotas de 10 μl das culturas de 18 horas de cada mutante foram misturadas com 200 μl de meio de cultura BHI suplementado com 50 μg/ml de canamicina em uma placa de microtitulação fresca e a placa incubada a 37° C por aproximadamente 4 horas. As culturas foram paradas na fase exponencial de crescimento e 100 μl de culturas de cada mutante foram transfectados para uma placa de microtitulação fresca e usados para determinação da densidade óptica (OD) a 650 nm.

Os inóculos ou grupos de entrada foram formados misturando os 100 μl restantes das culturas de 4 horas. Cada grupo de entrada consistia em 48 mutantes diferentes. O título dessas suspensões agrupadas foi determinado através de FACS (classificador de célula ativado por fluorescência) de alíquotas de 100 μl. Alíquotas (1 ml) da suspensão agrupada foram então diluídas em água fisiologicamente tamponada para se obter uma suspensão com um título de 2,107 cfu/ml. Grupos de 5 perus de três semanas de vida foram então inoculados intramuscularmente com alíquotas de 0,5 ml desta suspensão (107cfu por animal). O estado sorológico dos perus antes da inoculação foi determinado avaliando quanto à presença de anticorpos para Pasteurella em amostras de sangue tiradas um dia antes da inocula- ção. As células do restante dos grupos de entrada foram coletadas através de centrifugação e DNA cromossômico extraído dos péletes da célula.

Aproximadamente 14 horas após inoculação, amostras de sangue de 1 ml foram tomadas de 3 dos 5 perus. Séries de diluição (W1 a 10'7) 5 das amostras de sangue foram postas em placa em placas de ágar Columbia suplementadas com sangue de ovelhas 5%. As placas foram incubadas a 37° C por 24 horas, momento após o qual aproximadamente 10000 colônias de Pasteurella foram ressuspensas em meio BHI. Essas suspensões, que são chamadas grupo de saída, foram então centrifugadas e DNA cromos- 10 sômico extraído do pélete da célula.

Mutantes de Pasteurella que estavam presentes no grupo de entrada mas não foram novamente isolados dos perus foram identificados através de amplificação de PCR dos marcadores de sinal presentes em amostras de DNA dos grupos de entrada e saída, e hibridização dos produ- 15 tos de PCR amplificados contra "dot blots" carregados com DNA codificando os marcadores de sinal, conforme descrito em Hensel e outros (Science, 1995, 269:400-403). Esses mutantes foram considerados como potencialmente atenuados em virulência. Esta atenuação foi confirmada avaliando a falta de mortalidade após infecções únicas dos potencial mente mutantes em 20 perus.

Exemplo 3: Confirmação da atenuação em virulência para perus dos mutantes de P. multocida

Os mutantes de transposon identificados como potencialmente atenuados no Exemplo 2 ou os mutantes que têm habilidade limitada para 25 crescer em cultura foram reavivados misturando 20 μl de estoques de glice- rol com 200 μl de meio de cultura BHI suplementado com 50 μg/ml de ca- namicina em pratos de microtitulação. Esses pratos de microtitulação foram incubados em condições estáticas por 18 horas a 37° C. Então alíquotas de 10 μl de cada mutante dessas culturas foram tomadas e misturadas com 200 30 μl de meio BHI, suplementado com 50 μg/ml de canamicina em placa de microtitulação fresca e esta placa incubada em condições estáticas por cerca de 4 horas. As culturas foram paradas na fase exponencial de crescimento e 100 μl das culturas de cada mutante foram transferidos para uma placa de microtitulação fresca e usados para determinação da densidade óptica (OD) a 650 nm.

As culturas de cada um dos mutantes foram então diluídas 1 em 5 10000 em água fisiologicamente tamponada para se obter uma concentra ção de aproximadamente 2,104 cfu/ml. Alíquotas (0,5 ml) dessas diluições foram então inoculadas intramuscularmente em 2 perus de cinco semanas de vida (104 cfu por animal). O estado sorológico de alguns animais de cada grupo de perus foi determinado a partir de amostras de sangue tiradas um dia antes da inoculação. Os perus foram monitorados durante os 7 dias seguintes quanto à mortalidade. Dos mutantes testados 72 não resultaram em mortalidade em nenhuma das duas aves inoculadas. Esses 72 mutantes foram considerados atenuados na virulência.

Exemplo 4: Caracterização de mutantes de inserção de transposon identifi- 15 cados após avaliação em Perus

Os locais de inserção de transposon no genoma de mutantes de P. multocida atenuados foram identificados através de clonagem do DNA flanqueando um lado da inserção de transposon, ou através de PCR inverso ou através de PCR arbitrariamente iniciado.

Esses mutantes foram reavivados a partir de estoques de glice rol a -80° C espalhando em camada uma alíquota sobre placas de ágar de 50 μg/ml de canamicina de BHI. Colônias únicas foram então usadas para inocular culturas de caldo de BHI a partir das quais DNA cromossômico foi preparado.

Para PCR inverso, o DNA cromossômico foi digerido com uma enzima de restrição que tem um local de reconhecimento de 4 pares de base, tal como Tsp509l, aTaql ou Rsal. O DNA é então ligado em um volume grande para encorajar ligação intramolecular. O DNA flanqueando o transposon é então amplificado a partir deste molde de DNA ligado usando 30 primers de faceamento para fora que anelam para seqüência de transposon conhecida, tal como StipJ (SEQ ID NO: 98, 20 mer) (5' ATC TGA TCC TTC AAC TCA GC 3’), StipA (SEQ ID NO: 99, 19 mer) (5' CGC AGG GCT TTA TTG ATT C 3'), KTGRI (SEQ ID NO: 100, 27 mer) (5’ GCG GAA TTC GAT GAA TGT TOO GTT GCG 3'), Tn10IR1 (SEQ ID NO: 101, 20 mer) (5' TTT ACC AAA ATC ATT AGG GG 3') e Tn10IR4 (SEQ ID NO: 102, 19 mer) (5' GAT CAT ATG ACA AGA TGT G 3'). Esses produtos de PCR Inverso são então clonados e seqüenciados.

Para PCR arbitrariamente iniciado o DNA cromossômico foi usado como um molde em uma primeira reação de PCR de ciclo com um primer faceando para fora que anela para o transposon, tal como StipA, e um primer arbitrário, tal como arb1 (SEQ ID NO: 103, 35 mer) (5' GGC CAC GCG TCG ACT AGT ACN NNN NNN NNN GAT AT 3') ou arb6 (SEQ ID NO: 104, 35 mer) (5’ GGC CAC GCG TCG ACT AGT ACN NNN NNN NNN CAG CC 3'). A temperatura de anelamento desta primeira reação de PCR de ciclo é inicialmente ajustada muito baixa, com a temperatura de anelamento sendo aumentada em ciclos subsequentes. Uma porção dos produtos deste primeiro PCR de ciclo é então usada como um molde em um PCR de segundo ci-clo. Este segundo PCR de ciclo utiliza um outro primer faceando para fora, tal como KTGRI, que anela para o transposon em uma posição que é mais próxima da extremidade do transposon do que o primer usado no primeiro PCR de ciclo. O outro primer usado neste segundo PCR de ciclo tem a mesma seqüência que as 20 bases de seqüência conhecidas na extremidade 5' do primer arbitrário usado no primeiro PCR de ciclo, tal arb2 (SEQ ID NO: 105, 20 mer) (5' GGC CAC GCG TCG ACT AGT AC 3‘). Os produtos de PCR deste segundo PCR são então clonados e seqüenciados.

Essas seqüências obtidas foram então analisadas para identificar quadros de leitura abertos (ORF), que podem ser rompidos pelo transposon e foram também usadas para pesquisa quanto a seqüências similares atualmente disponíveis no banco de dados EMBL e na seqüência do genoma da cepa Pasteurella multocida PM70, determinada pela University of Minnesota (May B.J. e outros, Proc. Natl. Acad. Sc/., USA, 2001,98(6):3460- 5).

Para informação, nas seqüências de nucleotídeo que seguem, N está correspondendo a qualquer ácido nucléico (A ou C ou G ou T).

Mutantes 1G4, 3F4, 3G12,12D6 e 14C10

Os mutantes 1G4, 3F4 e 12D6 têm exatamente o mesmo local de inserção de transposon. A seqüência de DNA flanqueando o local de inserção de transposon é dada na SEQ ID NO: 1 (775 mer). O transposon é inserido imediatamente na extremidade 5' desta seqüência.

Um códon de partida está localizado nas posições 179-181 da seqüência SEQ ID NO:1.

Para o mutante 3G12, a seqüência de DNA flanqueando o local de inserção de transposon é dada na SEQ ID NO: 95 (101 mer). O transposon é inserido imediatamente na extremidade 5' desta seqüência.

Para o mutante 14C10, a seqüência de DNA flanqueando o local de inserção de transposon é dada na SEQ ID NO: 96 (220 mer). O transposon é inserido imediatamente na extremidade 3' desta seqüência.

Quatro outras proteínas e genes de Pasteurellaceae foram iden tificados por blasts feitos com uma seqüência de 60 aminoácidos codificada pela SEQ ID NO: 1.

A localização do transposon em mutantes 1G4, 3F4 e 12D6 corresponde à posição 8507-8508 da seqüência de genoma PM70 de Pasteurella multocida, Número de Acesso no Genbank AE006115. A localização do transposon no mutante 3G12 corresponde à posição 8609-8610 da seqüência AE006115. A localização do transposon no mutante 14C10 corresponde à posição 8517-8518 da seqüência AE006115. O transposon rompe um homólogo do gene PM70 PM0773, PhyA. O gene PhyA é previsto estar envoi- vido em síntese de cápsula. A seqüência de nucleotídeo de PM0773 é aqui identificada como SEQ ID NO: 2 e suas seqüências de aminoácido como SEQ ID NO: 3.

Mutantes 1G8, 9D1 e 9D8

No mutante 1G8, o transposon é inserido imediatamente na extremidade 3' da seqüência SEQ ID NO: 4 (226 mer). Esta seqüência tem dois quadros de leitura aberto (+2 e -2) codificando proteínas mais longas potenciais. O ORF de acordo com a invenção está no quadro -2.

O transposon inserido no mutante 9D1 está imediatamente na extremidade 3' da seqüência SEQ ID NO: 5 (87 mer).

O transposon inserido no mutante 9D8 está depois da posição 225 das seqüências SEQ ID NO: 4.

Os transposons em mutantes 1G8, 9D1 e 9D8 rompem um ho-mólogo do gene PM70, PM0871. As localizações dos transposons nesses mutantes correspondem às posições 9849-9850 (mutante 1G8), 8899-8900 (mutante 9D1) ou 9848-9849 (mutante 9D8) da seqüência de Genoma de PM70 de Pasteurella multocida de número de acesso no Genbank AE006125. A seqüência de nucleotídeo de PM0871 é aqui identificada como SEQ ID NO: 6 e sua seqüência de aminoácido como SEQ ID NO: 7.

Um outro gene/proteína de Pasteurella foi identificado pelos blasts feitos com a SEQ ID NO: 7. Este é Haemophilus influenzae HI1586 (números de acesso no Genbank U32832 e AAC23234). Foi encontrada uma identidade de 72% em 507 aminoácidos entre PM0871 e HI1586.

Mutante 2F2

A seqüência de DNA flanqueando o local de inserção do transposon é dada na SEQ ID NO: 8 (78 mer). O transposon está imediatamente na extremidade 5' desta seqüência. Esta seqüência tem três quadros de leitura abertos (+1, +2 e -1) codificando proteínas mais longas potenciais. O ORF de acordo com a invenção está no quadro +2.

O transposon no mutante 2F2 rompe um gene homólogo do gene de PM70 PM1727. Este transposon está localizado em uma posição que corresponde a 644-645 da seqüência PM70 de Pasteurella multocida, núme- ro de acesso no Genbank AE006210 (PM1727). A seqüência de nucleotídeo de PM1727 é aqui identificada como SEQ ID NO: 9 e sua seqüência de aminoácido como SEQ ID NO: 10.

Um outro gene/proteína de Pasteurellaceae foi identificado pelo blasts feito com a SEQ ID NO:10. Este é o HI0621 de Haemophilus influenzae (números de acesso no Genbank U32744 e AAC22281). Foi encontrada uma identidade de 77% em 183 aminoácidos entre PM1727 e HI0621. PM1727 é um membro de uma superfamília de hidrolases, em particular ele está relacionado com as histidinol fosfato fosfatases.

Mutante 3A2

A seqüência de DNA flanqueando o local de inserção do transposon é dada na SEQ ID NO: 11 (467 mer). O transposon está imediatamente na extremidade 5’ desta seqüência.

Um códon de parada está localizado nas posições 428-430.

O transposon no mutante 3A2 está localizado em uma posição que corresponde a 5103-5104 da seqüência de PM70 de Pasteurella multocida, número de acesso no Genbank AE006094 (PM0586). A seqüência de nucleotídeo de PM0586 é aqui identificada como SEQ ID NO: 12 e sua seqüência de aminoácido como SEQ ID NO: 13.

Dois outros genes e proteínas de Pasteurellaceae foram identifi cados através de blasts feitos com a SEQ ID NO: 13. Esses genes e proteínas são A1 P1pD de Pasteurella haemolytica (números de acesso no Genbank AF058703 e AAC32565) e Haemophilus somnus 31 kDa (números de acesso no Genbank L07795 e AAA24941). Foi verificada uma identidade de 73% em 276 aminoácidos entre PM0586 e PIpD de P. haemolytica e 71 % em 273 aminoácidos entre PM0586 e H. somnus de 31 kDa.

PIpD e PM0586 são membros da família da proteína ompA.

Mutante 3D3

As seqüências de DNA flanqueando ambos lados do local de inserção de transposon são dadas na SEQ ID NO: 14 (204 mer, transposon na extremidade 5’) e SEQ ID NO: 15 (35 mer, transposon na extremidade 5').

Um códon de parada está localizado nas posições 7-9 da SEQ ID NO: 14 e nas posições 33-35 da SEQ ID NO: 15.

Um outro gene/proteina de Pasteurellaceae foi identificado pelos blasts feitos com a SEQ ID NO: 14 e sua seqüência de aminoácido codificada (65 aminoácidos). Foi verificada uma identidade de 100% em 65 aminoá- eidos com a proteína PM0064. A localização do transposon no mutante 3D3 corresponde às posições 4778-4779 ou 4787-4788 da seqüência do genoma de PM70 de Pasteurella multocida, número de acesso no Genbank AE006042, posições deduzidas da SEQ ID NO: 14 e 15, respectivamente. Essa diferença é provável ser devido à inserção do transposon resultando na duplicação de alguns nucleotídeos no local de inserção do transposon. A posição 4788 está localizada no gene PM0064. A posição 4778 está 6 pb a jusante do códon de parada de PM0064. A seqüência de nucleotídeo de PM0064 é aqui identificada como SEQ ID NO: 16 e sua seqüência de aminoácido como SEQ ID NO: 17.

Outros genes e proteínas de bactérias gram-negativas foram identificados através de blasts feitos com a SEQ ID NO: 17.

Mutante 3D8

A seqüência de DNA flanqueando o local de inserção de trans poson é dada na SEQ ID NO: 18 (75 mer). O transposon está imediatamente na extremidade 3' desta seqüência.

A localização do transposon no mutante 3D8 corresponde entre as posições 7769-7770 da seqüência de genoma de PM70 de Pasteurella multocida, número de acesso no Genbank AE006080. O transposon rompe um homólogo do gene de PM70 PM0445. A seqüência de nucleotídeo de PM0445 é aqui identificada como SEQ ID NO: 19 e sua seqüência de aminoácido como SEQ ID NO: 20.

Mutante 3E1

A seqüência de DNA flanqueando o local de inserção de transposon é dada na SEQ ID NO: 21 (229 mer). O transposon está imediatamente na extremidade 3' desta seqüência.

A localização do transposon no mutante 3E1 corresponde entre as posições 9195-9196 da seqüência de genoma de PM70 de Pasteurella multocida, número de acesso no Genbank AE006133. O transposon rompe um homólogo do gene de PM70 PM0940. A seqüência de nucleotídeo de PM0940 é aqui identificada como SEQ ID NO: 22 e sua seqüência de aminoácido como SEQ ID NO: 23.

Outros genes e proteínas de bactérias gram-negativas foram identificados através de blasts feitos com SEQ ID NO: 17.

Mutante 3H2

A seqüência de DNA flanqueando o local de inserção de transposon é dada na SEQ ID NO: 24 (58 mer). O transposon está imediatamente na extremidade 3' desta seqüência. Esta seqüência tem dois quadros de 5 leitura abertos (+1 e -3) codificando proteínas mais longas potenciais. A ORF de acordo com a invenção está no quadro +1.

Um outro gene de Pasteurellaceae foi identificado por blasts feitos com SEQ ID NO: 24 e com sua seqüência de aminoácido codificada (19 aminoácidos). Foi constatada uma identidade de 100% em 19 aminoácidos 10 com proteína de PM1951. O local do transposon no mutante 3H2 corresponde a entre posições 9418-9419 da seqüência de PM70 de Pasteurella multocida, número de acesso no Genbank AE006231 (PM1951, urvA). A seqüência de nucleotídeo de PM1951 é aqui identificada como SEQ ID NO: 25 e sua seqüência de aminoácido como SEQ ID NO: 26.

Outros genes e proteínas de bactérias gram-negativas foram identificados por blastos feitos com SEQ ID NO: 26.

UvrA é uma nuclease de excisão de ABC de reparo de DNA.

Mutante 4D6

A seqüência de DNA flanqueando o local de inserção de transposon é dada na SEQ ID NO: 27 (54 mer). O transposon está imediatamente na extremidade 5' desta seqüência. Esta seqüência tem dois quadros de leitura abertos (+1 e -2) codificando proteínas mais longas potenciais. O ORF de acordo com a invenção está no quadro +1.

A localização do transposon no mutante 4D6 corresponde a entre as posições 6492-6493 da seqüência de PM70 de Pasteurella multocida, número de acesso no Genbank AE006036. O transposon rompe um homólogo do gene de PM70 PM0032 ou hktE. A seqüência de nucleotídeo de PM0032 é aqui identificada como SEQ ID NO: 28 e sua seqüência de aminoácido como SEQ ID NO: 29.

Um outro gene/proteína de Pasteurellaceae foi identificado através de blasts feitos com SEQ ID NO: 29. Este é uma catalase de Actinobacillus actinomycetemcomitans (número de acesso no Genbank AF162654 e AAF17882). Foi constatada uma identidade de 85% em 482 aminoácidos entre PM0032 e catalase de A. actinomycetemcomitans. HktE é uma catalase.

Mutantes 4F4 e 12A5

Para o mutante 4F4, a seqüência de DNA flanqueando o local de inserção de transposon é dada na SEQ ID NO: 30 (172 mer). O transposon está imediatamente na extremidade 3' desta seqüência. Para o mutante 12A5, a seqüência de DNA flanqueando o local de inserção de transposon é dada na SEQ ID NO: 97 (546 mer). O transposon é inserido imediatamente na extremidade 5' desta seqüência.

Quatro outros genes e proteínas de Pasteurellaceae foram identificados através de blasts feitos com a seqüência de 57 aminoácidos codificada pela SEQ ID NO: 30.

A localização do transposon no mutante 4F4 corresponde entre as posições 5272-5273 da seqüência de genoma de PM70 de Pasteurella multocida, número de acesso no Genbank AE006116. A localização do transposon no mutante 12A5 corresponde a entre as posições 5275-5276 da seqüência de AE006116. O transposon rompe um homólogo do gene de PM70 PM0776. A seqüência de nucleotídeo de PM0776 é aqui identificada como SEQ ID NO: 31 e sua seqüência de aminoácido como SEQ ID NO: 32. Essas proteínas são UDP glicose desidrogenase.

Mutante 4F12

A seqüência de DNA flanqueando o local de inserção de transposon é dada na SEQ ID NO: 33 (226 mer). O transposon está imediatamente na extremidade 5' desta seqüência.

O local do transposon no mutante 4F12 corresponde entre as posições 9263-9264 da seqüência de PM70 de Pasteurella multocida, número de acesso no Genbank AE006038. O transposon rompe um homólogo do gene de PM70 PM0048 de fadR. A seqüência de nucleotídeo de PM0048 é aqui identificada como SEQ ID NO: 34 e sua seqüência de aminoácido como SEQ ID NO: 35. FadR é um homólogo de uma proteína de E. coli que é um regulador de transcrição de metabolismo de ácido graxo, afetando vários genes de biossíntese de ácido graxo (fab) e de degradação de ácido graxo (fad).

Mutante 4G11

A seqüência de DNA flanqueando o local de inserção de trans- poson é dada na SEQ ID NO: 36 (214 mer). O transposon está imediatamente na extremidade 3' desta seqüência.

Um outro gene de Pasteurellaceae foi identificado pelos blasts feitos com SEQ ID NO: 36 e sua seqüência de aminoácido codificada (70 5 aminoácidos). Foi verificada uma identidade de 100% em 70 aminoácidos com a proteína de PM1024. A localização do transposon no mutante 4G11 corresponde entre as posições 3532-3533 da seqüência de genoma de PM70 de Pasteurella multocida, número de acesso no Genbank AE006143. O transposon rompe um homólogo do gene de PM70 PM1024. A seqüência 10 de nucleotídeo de PM1024 é aqui identificada como SEQ ID NO: 37 e sua seqüência de aminoácido como SEQ ID NO: 38.

Outros genes e proteínas de bactérias gram-negativas foram identificados através de blasts feitos com SEQ ID NO: 38.

HtpG é uma proteína de choque de calor.

O mutante 4G11 foi depositado sob o Tratado de Budapeste no Institute Pasteur Collection e está disponível sob o número de acesso CNCM I-2999.

Mutante 5D5

A seqüência de DNA flanqueando o local de inserção de trans- poson é dada na SEQ ID NO: 39 (252 mer). O transposon está imediata- mente na extremidade 3' desta seqüência.

A localização do transposon no mutante 5D5 corresponde a entre as posições 5695-5696 da seqüência do genoma de PM70 de Pasteurella multocida, número de acesso no Genbank AE006188. O transposon rompe um homólogo do gene de PM70 PM1517 ou PIpE). A seqüência de nucleotídeo de PM1517 é aqui identificada como SEQ ID NO: 40 e sua seqüência de aminoácido como SEQ ID NO: 41.

PIpE é prevista ser uma lipoproteína de membrana.

O mutante 5D5 foi depositado sob o Tratado de Budapeste no Pasteur Institute Collection e está disponível sob o número de acesso CNCM I-3000.

Mutante 5F11

A seqüência de DNA flanqueando o local de inserção de transposon é dada na SEQ ID NO: 42 (546 mer). O transposon está imediatamente na extremidade 5’ desta seqüência.

Um códon de parada está localizado na posição 148-150.

A localização do transposon no mutante 5F11 corresponde a entre as posições 572-573 do genoma de PM70 de Pasteurella multocida, número de acesso no Genbank AE006150. O transposon rompe um homólogo do gene de PM70 PM1087 ou NifR3. A seqüência de nucleotídeo de PM1087 é aqui identificada como SEQ ID NO: 43 e sua seqüência de aminoácido como SEQ ID NO: 44.

Um outro gene/proteína de Pasteurellaceae foi identificado pelos blasts feitos com a SEQ ID NO: 44. Este é um HI0979 de Haemophilus influenzae (números de acesso no Genbank U32778 e AAC22639). Foi verificada uma identidade de 78% em 332 aminoácidos entre PM1087 e HI0979.

NifR3 é um gene de regulagem de nitrogenase.

Mutante 5G9

A seqüência de DNA flanqueando o local de inserção de transposon é dada na SEQ ID NO: 45 (43 mer). O transposon está imediatamente na extremidade 3' desta seqüência. Esta seqüência tem três quadros de leitura abertos (+2, +3 e -1) codificando proteínas mais longas potenciais. O

ORF de acordo com a invenção está no quadro +2.

Quatro outros genes e proteínas de Pasteurellaceae foram iden tificados pelos blasts feitos com seqüência de 14 aminoácidos codificada pela SEQ ID NO: 45.

A localização do transposon no mutante 5G9 corresponde entre as posições 573-574 da seqüência de genoma de PM70 de Pasteurella multocida, número de acesso no Genbank AE006116. O transposon rompe um homólogo do gene de PM70 PM0774 ou HyaE. A seqüência de nucleotídeo de PM0774 é aqui identificada como SEQ ID NO: 46 e sua seqüência de 10 aminoácido como SEQ ID NO: 47. Esses genes estão envolvidos na síntese de cápsula.

Mutante 6E5

A seqüência de DNA flanqueando o local de inserção de transposon é dada na SEQ ID NO: 48 (279 mer). O transposon está imediata- 15 mente na extremidade 3' desta seqüência.

Um códon de início está localizado nas posições 169-171.

A localização do transposon no mutante 6E5 corresponde a entre as posições 6673-6674 do genoma de PM70 de Pasteurella multocida, número de acesso no Genbank AE006182. O transposon rompe um homó- logo do gene de PM70 PM1459 ou pgtB. A seqüência de nucleotídeo de PM1459 é aqui identificada como SEQ ID NO: 49 e sua seqüência de aminoácido como SEQ ID NO: 50.

PgtB é uma proteína de regulagem de transporte de fosfoglice- rato.

Mutante 6E6

A seqüência de DNA flanqueando o local de inserção de transposon é dada na SEQ ID NO: 51 (93 mer). O transposon está imediatamente na extremidade 3' desta seqüência.

Um códon de parada está localizado na posição 12-14.

A localização do transposon no mutante 6E6 corresponde entre as posições 9051-9052 da seqüência de genoma de PM70 de Pasteurella multocida, número de acesso no Genbank AE006096. O transposon rompe um homólogo do gene de PM70 PM0605. A seqüência de nucleotídeo de PM0605 é aqui identificada como SEQ ID NO: 52 e sua seqüência de aminoácido como SEQ ID NO: 53.

Mutante 6F12

A seqüência de DNA flanqueando o local de inserção de transposon é dada na SEQ ID NO: 54 (772 mer). O transposon está imediatamente na extremidade 5' desta seqüência.

Um códon de partida está localizado nas posições 2-4.

A localização do transposon no mutante 6F12 corresponde entre as posições 5362-5363 da seqüência do genoma de PM70 de Pasteurella multocida, número de acesso no Genbank AE006192. O transposon rompe um homólogo do gene de PM70 PM1556 ou gene comF. A seqüência de nucleotídeo de PM1556 é aqui identificada como SEQ ID NO: 55 e sua seqüência de aminoácido como SEQ ID NO: 56.

ComF é a proteína F competente.

Mutante 6G4

A seqüência de DNA flanqueando o local de inserção de transposon é dada na SEQ ID NO: 57 (700 mer). O transposon está imediatamente na extremidade 5' desta seqüência.

A localização do transposon no mutante 6G4 corresponde a entre as posições 3758-3759 da seqüência de genoma de PM70 de Pasteurella multocida, número de acesso no Genbank AE006206. A inserção está entre os genes de PM1696 e PM1697. O transposon é inserido entre a região de promotor e o códon de partida do PM1696.

O códon de partida de PM1696 está localizado nas posições 26- 28 na seqüência SEQ ID NO: 57.

A seqüência de nucleotídeo de PM1696 é aqui identificada como SEQ ID NO: 58 e sua seqüência de aminoácido como SEQ ID NO: 59.

Outros genes e proteínas de bactérias gram-negativas foram identificados através de blasts feitos com a SEQ ID NO: 59.

Mutante 6H1

A seqüência de DNA flanqueando o local de inserção de transposon é dada na SEQ ID NO: 60 (188 mer). O transposon está imediatamente na extremidade 3' desta seqüência.

A localização do transposon no mutante 6H1 corresponde a entre as posições 4139-4140 da seqüência de genoma de PM70 de Pasteurella multocida, número de acesso no Genbank AE006119. O transposon rompe um homólogo do gene de PM70 PM0806 ou gene speF. A seqüência de nucleotídeo de PM0806 é aqui identificada como SEQ ID NO: 61 e sua seqüência de aminoácido como SEQ ID NO: 62.

Os dois outros genes de Pasteurellaceae e Vibríonaceae foram identificados por blasts feitos com SEQ ID NO: 62. Esses genes são speF de Haemophilus influenzae (números de acesso no Genbank U32740 e AAC22248) e ornitinina descarboxilase de Vibrio cholerae (AE004431 e AAF96957). Foi verificada uma identidade de 83% em 719 aminoácidos entre PM0806 e speF de H. influenza.

SpeF é uma ornitinina descarboxilase.

Mutante 6H6

A seqüência de DNA flanqueando o local de inserção de transposon é dada na SEQ ID NO: 63 (101 mer). O transposon está imediata

mente na extremidade 3' desta seqüência. Esta seqüência tem dois quadros de leitura abertos (+1 e -1) codificando proteínas mais longas potenciais. O ORF de acordo com a invenção está no quadro +1.

A localização do transposon no mutante 6H6 corresponde a entre as posições 983-984 da seqüência de genoma de PM70 de Pasteurella multocida, número de acesso no Genbank AE006155. O transposon rompe um homólogo do gene de PM70 PM1138. A seqüência de nucleotídeo de PM1138 é aqui identificada como SEQ ID NO: 64 e sua seqüência de aminoácido como SEQ ID NO: 65.

Mutante 7A7

A seqüência de DNA flanqueando o local de inserção de transposon é dada na SEQ ID NO: 66 (222 mer). O transposon está imediatamente na extremidade 5' desta seqüência. A localização do transposon no mutante 7A7 corresponde entre as posições 7853-7854 da seqüência de genoma de PM70 de Pasteurella multocida, número de acesso no Genbank AE006170 (na região intergênica entre PM1321 e PM1322). O transposon é inserido entre a região de terminação e o códon de parada de PM1322.

O códon de parada está localizado nas posições 25-27 na seqüência SEQ ID NO: 66. A seqüência de nucleotídeo de PM1322 é aqui identificada como SEQ ID NO: 67 e sua seqüência de aminoácido como SEQ ID NO: 68.

Mutante 7F8

A seqüência de DNA flanqueando o local de inserção de transposon é dada na SEQ ID NO: 69 (55 mer). O transposon está imediatamente na extremidade 3' desta seqüência. Esta seqüência tem dois quadros de leitura abertos (+1, +3 e -3) codificando proteínas mais longas potenciais. O ORF de acordo com a invenção está no quadro +3.

A localização do transposon no mutante 7F8 corresponde a entre as posições 8292-8293 da seqüência de genoma de PM70 de Pasteurella multocida, número de acesso no Genbank AE006224. O transposon rompe um homólogo do gene de PM70 PM1866. A seqüência de nucleotídeo de PM1866 é aqui identificada como SEQ ID NO: 70 e sua seqüência de ami- noácido como SEQ ID NO: 71.

Mutante 9C8

A seqüência de DNA flanqueando ambos os lados do local de inserção de transposon é dada na SEQ ID NO: 72 (598 mer, transposon na extremidade 5') e SEQ ID NO: 73 (561 mer, transposon na extremidade 5').

Um códon de parada está localizado nas posições 26-28 na seqüência SEQ ID NO: 72. As seqüências SEQ ID NO: 72 e 73 são combinadas juntas e limitadas para o ORF. A seqüência resultante é chamada SEQ ID NO: 74 (575 mer).

A localização do transposon no mutante 9C8 corresponde entre as posições 2224-2225 ou 2210-2211 da seqüência de genoma de PM70 de Pasteurella multocida, número de acesso no Genbank AE006132, posições deduzidas das SEQ ID NOs: 72 e 73 respectivamente. Ambas posições estão dentro do gene PM0926 (fimA). A seqüência de nucleotídeo de PM0926 é aqui identificada como SEQ ID NO: 75 e sua seqüência de aminoácido como SEQ ID NO: 76.

Um outro gene/proteína de Pasteurellaceae foi identificado através de blasts feitos com a SEQ ID NO: 76. Este é um FimA de Haemophilus influenzae (número de acesso no Genbank AF053125 e AAC08991). Foi constatada uma identidade de 77% em 171 aminoácidos entre PM0926 e FimA de H. influenzae.

FimA é uma adesina, uma proteína fimbrial.

O mutante 9C8 foi depositado sob o Tratado de Budapeste no Pasteur Institute Collection e está disponível sob o número de acesso CNCM 1-3001.

Mutante 9H4

As seqüências de DNA flanqueando ambos lados do local de inserção de transposon são dadas da SEQ ID NO: 92 (1391 mer). O transposon foi inserido na posição 850-851 desta seqüência. Esta seqüência tem apenas um quadro de leitura. O ORF de acordo com a invenção está no quadro -2.

Um códon de partida está localizado nas posições 1318-1316 e um códon de parada está localizado nas posições 29-31 da SEQ ID NO: 92. A seqüência resultante de ORF é chamada SEQ ID NO: 93 (1290 mer) e sua seqüência de aminoácido é chamada SEQ ID NO: 94.

Os blasts feitos com as seqüências SEQ ID NO: 92 e SEQ ID NO: 94 não identificaram quaisquer genes ou proteínas homólogos.

O mutante 9H4 foi depositado sob o Tratado de Budapeste no Pasteur Institute Collection e está disponível sob o número de acesso CNCM I-3002.

Mutante 10G11

A seqüência de DNA flanqueando o local de inserção de transposon é dada na SEQ ID NO: 77 (70 mer). O transposon está imediatamente na extremidade 5' desta seqüência. Um códon de partida está localizado nas posições 62-64.

A localização do transposon no mutante 10G11 corresponde a entre as posições 2938-2939 da seqüência de genoma de PM70 de Pasteurella multocida, número de acesso no Genbank AE006056. O transposon rompe um homólogo do gene de PM70 PM0220 (rpL31_1). A seqüência de nucleotídeo de PM0220 é aqui identificada como SEQ ID NO: 78 e sua seqüência de aminoácido como SEQ ID NO: 79.

RpL31_1 é uma proteína ribossômica 50S.

Mutante 11E8

A seqüência de DNA flanqueando o local de inserção de transposon é dada na SEQ ID NO: 80 (506 mer). O transposon está imediatamente na extremidade 5' desta seqüência.

Um códon de partida está localizado nas posições 195-197 da SEQ ID NO: 80.

A localização do transposon no mutante 11E8 corresponde entre as posições 282-283 da seqüência de genoma de PM70 de Pasteurella multocida, número de acesso no Genbank AE006085. O transposon rompe um homólogo do gene de PM70 PM0488. A seqüência de nucleotídeo de PM0488 é aqui identificada como SEQ ID NO: 81 e sua seqüência de ami- noácido como SEQ ID NO: 82.

Mutante 12A1

A seqüência de DNA flanqueando o local de inserção de transposon é dada na SEQ ID NO: 83 (243 mer). O transposon está imediatamente na extremidade 3' desta seqüência.

Um outro gene de Pasteurellaceae foi identificado através de blasts feitos com a SEQ ID NO: 83 e sua seqüência de aminoácido codificada (81 aminoácidos). Foi verificada uma identidade de 100% em 81 aminoácidos com proteína de PM0063. A localização do transposon no mutante 12A1 corresponde entre as posições 2880-2881 da seqüência de genoma de 10 PM70 de Pasteurella multocida, número de acesso no Genbank AE006042. O transposon rompe um homólogo do gene de PM70 PM0063 gene lepA. A seqüência de nucleotídeo de PM0063 é aqui identificada como SEQ ID NO: 84 e sua seqüência de aminoácido como SEQ ID NO: 85.

Outros genes e proteínas de bactérias gram-negativas foram 15 identificados através de blasts feitos com a SEQ ID NO: 85.

LepA é uma proteína de membrana de ligação de GTP.

Mutante 12B3

A seqüência de DNA flanqueando o local de inserção de transposon é dada na SEQ ID NO: 86 (147 mer). O transposon está imediata- 20 mente na extremidade 3' desta seqüência.

A localização do transposon no mutante 12B3 corresponde entre as posições 4028-4029 da seqüência de genoma de PM70 de Pasteurella multocida, número de acesso no Genbank AE006152. O transposon rompe um homólogo do gene de PM70 PM1112. A seqüência de nucleotídeo de PM1112 é aqui identificada como SEQ ID NO: 87 e sua seqüência de aminoácido como SEQ ID NO: 88.

Um outro gene/proteína de Pasteurellaceae foi identificado através de blasts feitos com a SEQ ID NO: 88. Este é um HI0231 de Haemophilus influenzae (número de acesso no Genbank U32709 e AAC21900). Foi constatada uma identidade de 80% em 605 aminoácidos entre PM1112 e HI0231.

DeaD é uma RNA helicase.

Mutante 13E1

A seqüência de DNA flanqueando o local de inserção de transposon é dada na SEQ ID NO: 89 (187 mer). O transposon está imediatamente na extremidade 3' desta seqüência. Esta seqüência tem dois quadros de leitura abertos (+1 e -3) codificando proteínas mais longas potenciais. O ORF de acordo com a invenção está no quadro -3.

A localização do transposon no mutante 13E1 corresponde a entre as posições 2173-2174 da seqüência de genoma de PM70 de Pasteurella multocida, número de acesso no Genbank AE006138 (PM0989). A seqüência de nucleotídeo de PM0989 é aqui identificada como SEQ ID NO: 90 e sua seqüência de aminoácido como SEQ ID NO: 91.

Um outro gene/proteína de Pasteurellaceae foi identificado através de blasts feitos com a SEQ ID NO: 91. Este é um HI0325 de Haemophilus influenzae (número de acesso no Genbank U32717 e AAC21988). Foi constatada uma identidade de 79% em 414 aminoácidos entre PM0989 e HI0325.

O mutante 13E1 foi depositado sob o Tratado de Budapeste no Pasteur Institute Collection e está disponível sob o número de acesso CNCM I-3003.

Exemplo 5: Seleção de PCR de mutantes de inserção de transposon

O transposon pode se inserir em qualquer lugar no genoma das bactérias. Mas uma seleção dos mutantes certos pode ser feita usando PCR.

Um par de primers é usado, um específico para o transposon, tal como Tn10IR1 (SEQ ID NO: 101), Tn10IR4 (SEQ ID NO: 102), KTGRI (SEQ ID NO: 100), StipA (SEQ ID NO: 99) e StipJ (SEQ ID NO: 98) e um específico para o gene ou seqüência a ser mutado. A seqüência de nucleotídeo deste gene ou uma parte dela (por exemplo, seqüências da região próxima ao local de inserção do transposon conforme seqüenciado acima) é útil para a construção de tais primers. Isso pode ser adaptado para seqüências de gene ou nucleotídeo para outras cepas de Pasteurella multocida, ou outras bactérias gram-negativas, tal como bactérias da família Pasteurellaceae, notavelmente Pasteurella haemolytica, Pasteurella anatipestifer e Actinobacillus pleuropneumoniae.

O conhecimento do gene correspondente ou ORF e/ou suas regiões de regulagem na cepa PM70 ou P-1059 de Pasteurella multocida (Exemplo 4) de modo que seu tamanho é usado para avaliar os fragmentos de PCR amplificados e para detectar aqueles tendo um tamanho correspondendo a um transposon inserido no gene ou seqüência a ser mutado. Se o transposon foi inserido fora do gene, ele pode não ter nenhum fragmento de PCR amplificado ou ele pode amplificar fragmentos com um tamanho muito longo. Desse modo, PCR permite a seleção dos mutantes.

Para a cepa P-1059 de Pasteurella multocida, tais primers específicos de gene podem ser:

No caso dos mutantes anteriormente obtidos, o PCR foi realiza do com as partes de primers que seguem e os fragmentos de PCR amplifi cados tinham o tamanho de:

Exemplo 6: Eficácia e proteção de mutantes de inserção de transposon con- tra provocação homóloga

Os mutantes de inserção de transposon derivados da cepa 16084 de Pasteurefla multocida (Exemplo 1) foram administrados através de colírio a perus convencionais de três semanas de vida. A eficácia foi estudada contra uma provocação homóloga ocular com cepa 16084 de Pasteurella multocida. 24 grupos de perus convencionais de 3 semanas de vida foram formados. No DO, os grupos foram inoculados com colírio com cerca de 108 CFU dos mutantes conforme indicado na tabela que segue.

Um grupo de perus convencionais de 3 semanas de vida permaneceu não-vacinado e serviu como controles (Grupo 25).

Todos os perus foram provocados no D23 usando a cepa 16084 de Pasteurella multocida através de colírio em 108 CFU por ave.

A mortalidade foi registrada diariamente por 2 semanas após provocação. No final do estudo (D37), um exame clínico foi realizado para determinar o estado de saúde das aves sobreviventes.

A taxa de proteção foi calculada considerando o número de aves provocadas e o número de aves saudáveis em D37.

Para alguns grupos, esses experimentos foram reproduzidos e a taxa de proteção é resultado cumulativo. Alguns mutantes da invenção não foram testados nesses experimentos.

Exemplo 7: Eficácia e proteção de mutantes de inserção de transposon contra provocação heteróloga

Os mutantes de inserção de transposon derivados da cepa 16084 de Pasteurella multocida (Exemplo 1) foram administrados através de 5 colírio a perus convencionais de três semanas de vida. A eficácia foi estudada contra uma provocação heteróloga ocular com cepa X73 de Pasteurella multocida (USDA).

Cinco grupos de 10 perus convencionais de três semanas de vida foram formados. No DO, os grupos foram inoculados através de colírio 10 com cerca de 108 CFU dos mutantes conforme indicado na tabela que segue.

Um grupo de 10 perus convencionais de 3 semanas de vida permaneceu sem vacina e serviu como controles (Grupo 6).

Todos os perus foram provocados no D21 usando a cepa X73 15 de Pasteurella multocida administrada através de colírio a 106 CFU por ave.

A mortalidade foi registrada diariamente por 2 semanas após provocação. No final do estudo (D36), um exame clínico foi realizado para determinar o estado de saúde das aves sobreviventes.

A taxa de proteção foi calculada considerando o número de aves 20 provocadas e o número de aves saudáveis no D36.

Exemplo 8: Construção de mutantes de deleção definidos através de conjugação

Inicialmente, o gene marcado mais seqüências de DNA de flan- queamento são amplificados através de PCR usando polimerase de alta fi- 25 delidade e clonados em um vetor de clonagem adequado. Primers de PCR são construídos, os quais deletam o gene quando usados em PCR inverso para gerar um construto inicial. Os primers de PCR contêm um local Xbal para introduzir um novo local de restrição e desse modo provêem um marcador para a deleção de gene. Os construtos de deleção são então transferidos para um vetor suicida pCVD442 (Donnenberg e outros, Infection and Immunity, 1991, 59:4310-4317) para transferência para o cromossoma da Pasteurella. Os plasmídeos pCVD442 são então transformados em cepa SMIOÀpir de E. coli. Este construto é introduzido na cepa de P. multocida 16084 (CDM) através de conjugação com SM107pir/pCVD442 de E. coli. Transformantes e recombinantes contendo o plasmídeo integrados ao cromossoma no local homólogo (merodiplóides) são selecionados usando o marcador de resistência a antibiótico presente no plasmídeo pCVD442 (gene de resistência à ampicilina). Mutantes de Pasteurella são selecionados em placas de ágar de BHI suplementado com 1 μg/ml de ampicilina.

O plasmídeo pCVD442 requer a proteína Pir para replicação. Esta proteína é codificada pelo gene pir, que está presente como um lisóge- no de fago lambda nas cepas SMIOÀpir doadoras, mas não na P. multocida recipiente. Então o plasmídeo pCVD442 não replica na cepa de P. multocida recipiente: colônias resistentes a antibiótico são então apenas obtidas se o plasmídeo integrar ao cromossomo. Este vetor suicida também contém o gene sacB que codifica a enzima levan sucrase, que é tóxica para a maioria das bactérias gram-negativas na presença de sacarose. A seleção de sacarose pode ser então empregada como uma contra-seleção para isolar colônias onde um segundo caso de recombinação aconteceu, resultando em perda do plasmídeo do cromossomo. Este segundo caso de recombinação pode resultar em dois resultados, regeneração do alelo do tipo selvagem ou geração de um mutante de deleção. Colônias contendo a mutação de deleção são identificadas através de PCR de colônia.

Exemplo 9: Construção de mutantes de deleção definidos através de eletro- poração

Inicialmente, o gene marcado mais seqüências de DNA de flan- queamento são amplificados através de PCR usando polimerase de alta fidelidade e clonados em um vetor de clonagem adequado. Primers de PCR são construídos, os quais deletam o gene quando usados em PCR inversa para gerar um construto inicial. Os primers de PCR contêm um local Xbal para introduzir um novo local de restrição e desse modo prover um marcador para a deleção de gene. Os construtos de deleção são então transferidos para um vetor suicida pCVD442 para transferir para o cromossomo de Pasteurella. Este construto é introduzido na cepa de P. multocida 16084 (CDM) através de eletroporação. Para remover a cápsula substancialmente extra- celular de 16084, as células de fase estacionária são tratadas com hialuroni- dase testicular ovina (tipo V, esterilizado em filtro antes do uso, concentra- ção final 25 μg/ml) por 1 hora antes da coleta e lavagem das células. O pCVD442 (1,5 μg) é misturado com suspensão celular em glicerol a 10% (0,05 ml, 1010 célula/ml) um pouco antes de pipetar a mistura na cubeta de eletroporação de 1 mm fria (Biorad, Hercules, CA, USA). O GenePulser (Biorad) é usado para pulsar as células (12,5 kV/cm, 250 ohms, 40 μF). Imedia- tamente após o pulso, as células são diluídas com 1 ml de BHI e porções de cultura (5-50 μl) são rapidamente (dentro de 1-5 minutos) espalhadas em placas de ágar contendo 1 μg/ml de ampicilina. Recombinantes contendo o plasmídeo integrado ao cromossomo no local homólogo (merodiplóides) são selecionados usando o marcador de resistência a antibiótico presente no plasmídeo (gene de resistência à ampicilina).

O plasmídeo pCVD442 não replica na cepa de P. multocida recipiente: colônias resistentes a antibiótico são então apenas obtidas se o plasmídeo integrar ao cromossomo. Este vetor suicida também contém o gene sacB que codifica a enzima levan sucrase, que é tóxica para a maioria das bactérias gram-negativas na presença de sacarose. A seleção de sacarose pode então ser empregada como uma contra-seleção para isolar colônias onde um segundo evento recombinante aconteceu, resultando em perda do plasmídeo do cromossomo. Este segundo caso de recombinação pode resultar em dois resultados, regeneração do alelo do tipo selvagem ou geração de um mutante de deleção.

As colônias aparecem após incubação a 37° C por 2-4 dias. Espalhamento de colônias em placas similares isola transformantes individuais. Colônias contendo a mutação de deleção são identificadas através de PCR de colônia.

Exemplo 10: Vacina e teste de eficácia

Os mutantes de deleção atenuados obtidos nos Exemplos 8 e 9 são cultivados em meio de cultura CDM (Hu e outros, Infection and Immunity, 1986, 804-810) sob condição de agitação por 24 a 48 horas.

A cultura é coletada quando o crescimento pára, o que é seguido por medição de densidade óptica (OD) ou pH.

A concentração de bactéria é determinada através de densidade óptica e quando necessário uma concentração é ajustada para uma concentração final de 109 CFU por ml com meio de cultura fresco.

A eficácia da vacina é testada em perus de 3 semanas de vida através de vacinação e provocação.

Os perus são checados antes da vacinação quanto à ausência de anticorpos de Pasteurella através de ELISA de amostras sangüíneas.

Um primeiro grupo de perus é vacinado através de injeção de 108 CFU em 0,1 ml através de via ocular.

Um segundo grupo permanece sem vacina (grupo de controle).

Todos os animais foram provocados no D21 e D23 com a cepa P-1059 de P. multocida através de via ocular (108 CFU em 0,1 ml por ani mal).

A mortalidade é observada todos os dias até D35.

Uma mortalidade menor é observada nos animais vacinados comparado com os controles.

A invenção é ainda descrita pelos parágrafos que seguem: 1- Mutante de uma bactéria gram-negativa, onde a dita bactéria tem uma mutação em uma seqüência de nucleotídeo que codifica para um polipeptídeo tendo uma identidade que é igual ou maior do que 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% com uma seqüência de ami- 30 noácido codificada por uma seqüência de nucleotídeo selecionada do grupo consistindo em seqüências de nucleotídeo identificadas SEQ ID NO: 2, 6, 9, 12, 16, 19, 22, 25, 28, 31, 34, 37, 40, 43, 46, 49, 52, 55, 58, 61, 64, 67, 70, 75, 78, 81, 84, 87, 90, 93, a dita mutação resultando em virulência atenuada da bactéria. 2- Mutante do parágrafo 1, onde a bactéria é uma Pasteurellaceae. 3- Mutante do parágrafo 2, onde a bactéria é escolhida entre o grupo de: Pasteurella multocida, Pasteurella haemolytica, Pasteurella anati- pestifer e Actinobacillus pleuropneumoniae. 4- Mutante do parágrafo 3, onde a bactéria é Pasteurella multocida. 5- Mutante de acordo com qualquer um dos parágrafos 1 a 4, onde a mutação é uma deleção na seqüência de nucleotídeo, ou uma inserção nela ou substituição de ácidos nucléicos. 6- Mutante do parágrafo 5, onde a mutação é a deleção da seqüência de nucleotídeo completa. 7- Mutante do parágrafo 5, onde a inserção é feita entre os nucleotídeos 180-181 ou 182-183 ou 190-191 na SEQ ID NO:2, 77-78 ou 10261027 ou 1027-1028 na SEQ ID NO:6, 416-417 na SEQ ID NO: 9, 389-390 na SEQ ID NO:12, 381-382 na SEQ ID NO:16, 219-220 na SEQ ID NO:19, 1353-1354 na SEQ ID NO: 22, 136-137 na SEQ ID NO:25, 384-385 na SEQ ID NO:28, 222-223 ou 225-226 na SEQ ID NO:31, 217-218 na SEQ ID NO:34, 1411-1412 na SEQ ID NO:37, 943-944 na SEQ ID NO:40, 855-856 na SEQ ID NO:43, 369-370 na SEQ ID NO:46, 111-112 na SEQ ID NO:49, 443-444 na SEQ ID NO:52, 4-5 na SEQ ID NO:55, nucleotídeo 1 imediatamente a montante na SEQ ID NO:58; 573-574 na SEQ ID NO: 61, 875-876 na SEQ ID NO: 64, nucleotídeo 1 imediatamente a montante na SEQ ID NO:67, 218-219 na SEQ ID NO: 70, 1072-1087 na SEQ ID NO: 75, 64-65 na SEQ ID NO: 78, 282-283 na SEQ ID NO: 81, 1431-1432 na SEQ ID NO: 84, 974-975 na SEQ ID NO: 87, 802-803 na SEQ ID NO: 90, 850-851 na SEQ ID NO: 92. 8- Mutante de qualquer um dos parágrafos 1 a 7, o qual compreende uma seqüência de ácido nucléico heteróloga codificando para um imunógeno de um agente patogênico virai, parasítico ou bacteriano, para uma proteína terapêutica, para um alérgeno, para um fator de crescimento ou para uma citocina. 9- Composição imunogênica compreendendo um mutante atenuado de acordo com qualquer um dos parágrafos 1 a 8, e um diluente, car- 5 reador, veículo ou excipiente farmaceuticamente aceitável. 10- Composição imunogênica do parágrafo 9 compreendendo ainda um adjuvante. 11- Vacina compreendendo um mutante atenuado de acordo com qualquer um dos parágrafos 1 a 8, e um diluente, carreador, veículo ou 10 excipiente farmaceuticamente aceitável. 12- Vacina do parágrafo 11 compreendendo ainda um adjuvante. 13- Composição imunogênica compreendendo um polipeptídeo tendo uma identidade que é igual ou maior do que 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% com uma seqüência de aminoácido co- 15 dificada por uma seqüência de nucleotídeo selecionada do grupo consistindo em seqüências de nucleotídeo SEQ ID NO: 2, 6, 9, 12, 16, 19, 22, 25, 28, 31, 34, 37, 40, 43, 46, 49, 52, 55, 58, 61, 64, 67, 70, 75, 78, 81, 84, 87, 90, 93 e um diluente, carreador, veículo ou excipiente farmaceuticamente aceitável, e opcionalmente um adjuvante. 14- Preparação de anticorpo compreendendo um anticorpo es pecífico para um polipeptídeo tendo uma identidade que é igual ou maior do que 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% com uma seqüência de aminoácido codificada por uma seqüência de nucleotídeo selecionada do grupo consistindo em seqüências de nucleotídeo SEQ ID NO: 25 2, 6, 9, 12, 16, 19, 22, 25, 28, 31, 34, 37, 40, 43, 46, 49, 52, 55, 58, 61, 64,67, 70, 75, 78, 81,84, 87, 90, 93. 15- Método de diagnóstico para detecção de infecção por uma bactéria gram-negativa usando um polipeptídeo tendo uma identidade que é igual ou maior do que 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 30 99% com uma seqüência de aminoácido codificada por uma seqüência de nucleotídeo selecionada do grupo consistindo em seqüências de nucleotídeo identificadas SEQ ID NO: 2, 6, 9, 12, 16, 19, 22, 25, 28, 31, 34, 37, 40, 43, 46, 49, 52, 55, 58, 61, 64, 67, 70, 75, 78, 81, 84, 87, 90, 93, ou um anticorpo específico para o dito polipeptídeo. 16- Uso de uma preparação de anticorpo de acordo com o parágrafo 14 para a produção de uma composição de imunização passiva ou 5 uma composição terapêutica contra bactérias gram-negativas. 17- Uso de uma seqüência de nucleotídeo selecionada do grupo consistindo nas seqüências de nucleotídeo identificadas SEQ ID NO: 2, 6, 9, 12, 16, 19, 22, 25, 28, 31, 34, 37, 40, 43, 46, 49, 52, 55, 58, 61, 64, 67, 70, 75, 78, 81, 84, 87, 90, 93 ou um fragmento de pelo menos 20 nucleotídeos, 10 como primers para PCR para detecção de bactérias gram-negativas em um meio.

Tendo então descrito em detalhes as modalidades preferidas da invenção, deve ser compreendido que a invenção definida pelos parágrafos acima não deve ser limitada a detalhes particulares descritos no relatório 15 acima uma vez que muitas variações aparentes dela são possíveis sem se afastar de seu espírito ou escopo.

Claims (5)

1. Mutante de uma bactéria gram-negativa caracterizado pelo fato de ser o mutante 9C8 disponível sob o número de acesso CNCM 1-3001.

2. Vacina caracterizada pelo fato de que compreende um mutante atenuado conforme definido pela reivindicação 1, e um diluente, transportador, veículo ou excipiente farmaceuticamente aceitável.

3. Vacina, de acordo com a reivindicação 2, caracterizada pelo fato de que compreender ainda um adjuvante.

4. Composição imunogênica caracterizada pelo fato de que compreende um mutante atenuado conforme definido pela reivindicação 1 e um diluente, transportador, veículo ou excipiente farmaceuticamente aceitável.

5. Composição imunogênica, de acordo com a reivindicação 4, caracterizada pelo fato de compreender ainda um adjuvante.