MXPA04009730A - Bacteria gram negativa atenuada. - Google Patents
Bacteria gram negativa atenuada.Info
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Abstract
Se divulga y se reivindica un mutante de bacteria Gram negativa, en donde la bacteria tiene por lo menos una mutacion en una secuencia de nucleotidos que codifica para un polipeptido que tiene una identidad que es igual o mayor que 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, o 99% con una secuencia de aminoacidos codificada por una secuencia de nucleotidos seleccionada del grupo que consiste de secuencias de nucleotidos identificadas como SEQ ID NO: 2, 6, 9, 12, 16, 19, 22, 25, 28, 31, 34, 37, 40, 43, 46, 49, 52, 55, 58, 61, 64, 67, 70, 75, 75, 78, 81, 84, 87, 90, 93; la mutacion resulta en virulencia atenuada de la bacteria. tambien se divulgan y reivindican composiciones inmunogenicas y vacunas que contiene tal mutante asi como un mutante.
Description
BACTERIA GRAM NEGATIVA ATENUADA INCORPORACION DE SOLICITUDES RELACIONADAS POR REFERENCIA Esta solicitud reivindica la prioridad de la publicación provisional norteamericana . No. de serie 60/370,282, presentada el 5 de Abril del 2002, incorporada en la presente por referencia. La solicitud anterior, y todos los documentos citados en la misma o durante su proseguimiento ("documentos citados en la solicitud") y todos los documentos citados o mencionados en los documentos citados en la solicitud, y todos los documentos citados o mencionados en la presente ("documentos citados en la presente") , y todos los documentos citados o mencionados en los documentos citados en la presente, junto con cualquiera de las instrucciones, descripciones, especificaciones de producto y hojas de producto del fabricante para cualquiera de los productos mencionados en la presente o en cualquier documento incorporado - por referencia en la presente, son incorporados en · la presente por referencia, y se pueden emplear en la práctica de la invención. CAMPO DE LA INVENCION Esta invención se relaciona a una bacteria gram negativa atenuada, viva. La bacteria gram negativa atenuada puede ser usada en composiciones inmunogénicas o en composiciones de vacuna, por ejemplo, para la prevención de infecciones bacterianas, asi como en la investigación, ya que las cepas atenuadas presentan un grado más grande de seguridad a los investigadores y para aquellos (por ejemplo, animales, humanos) con quienes pueden entrar en contacto. La invención por consiguiente se relaciona a composiciones inmunogénicas o de vacuna que comprenden la bacteria gram negativa de la invención, por ejemplo, la bacteria gram negativa atenuada, viva. La bacteria también podría ser inactivada en las composiciones; pero puede ser ventajoso que la bacteria sea bacteria gram negativa atenuada, viva. La invención por lo tanto además se relaciona a métodos para la preparación y/o formulación de tales composiciones; por ejemplo, el cultivo o el crecimiento o propagación de la bacteria sobre o en el medio adecuado, la cosecha de. la bacteria, opcionalmente la inactivación de la bacteria, y el mezclado con un portador, excipiente, diluyente o vehículo veterinariamente o farmacéuticamente aceptable y/o un adyuvante y/o un estabilizador; o, el mezclado de la bacteria con un portador, excipiente, diluyente o vehículo veterinariamente. o farmacéuticamente aceptable, adecuado y/o un adyuvante y/o estabilizador. Así, la invención también se relaciona al uso de la bacteria en la formulación de tales composiciones. La bacteria atenuada también puede actuar como un vector de expresión o de replicación, por ejemplo, para replicar y/o expresar una molécula de ácido nucleico heterologa a la bacteria atenuada, por ejemplo, una molécula de ácido nucleico que codifica un inmunógeno, antigeno o epitope de un agente patogénico, tal como un agente patogénico que es diferente de la bacteria atenuada. El uso de la bacteria atenuada como un vector también proporciona un grado más grande de seguridad a los investigadores o técnicos que trabajan con los vectores atenuados y aquellos (por ejemplo, animales, humanos) con quienes pueden entrar en contacto. La invención por lo tanto además se relaciona a métodos para la preparación de tales vectores, por ejemplo, la transformación de la bacteria de- modo que la bacteria contiene y opcionalmente expresa una molécula de ácido nucleico heterologa. La invención también se relaciona a usos de tales vectores; por ejemplo, un método para producir un producto de gen, por ejemplo, un polipéptido tal como un inmunógeno, epitope o antigeno, heterologa a la bacteria que comprende cultivar, crecer ó propagar la bacteria transformada para contener y expresar una molécula de ácido nucleico heterologa que codifica el producto de gen bajo condiciones adecuadas para la expresión, y opcionalmente la cosecha o aislamiento o la separación del producto del gen; o, la cosecha o aislamiento o separación del producto de gen de la bacteria transformada para expresarle; o, un método para inducir, una respuesta inmunológica o respuesta inmunogénica contra un producto de gen y/o la bacteria o una respuesta inmunoprotectora para un patógeno del cual se deriva o se obtiene el producto de gen y/o la bacteria que comprende administrar a un sujeto, por ejemplo, animal, tal como un animal susceptible a la infección por el patógeno y/o la bacteria, por ejemplo un animal bovino o pavo, la bacteria transformada para expresar el producto de gen; o un método para preparar una composición inmunogénica, inmunológica o de vacuna que comprende mezclar el vector o la bacteria transformada con un portador, diluyente, vehículo excipiente farmacéuticamente o veterinariamente aceptable y/o adyuvante y/o estabilizador. La invención también se relaciona a objetivos para la atenuación de la bacteria, por ejemplo, secuencias de nucleótidos mutadas o genes que codifican los objetivos para la atenuación de la bacteria, y métodos para dirigir los polipéptidos para la atenuación de la bacteria y métodos para generar bacteria atenuada. Los objetivos para la atenuación se pueden usar como compuestos inmunogénicos , por ejemplo, en composiciones inmunogénicas o en composiciones de vacuna, o para generar epítopes para el uso en composiciones inmunogénicas y de vacuna. Así, la invención se relaciona al uso de objetivos para la atenuación en la preparación en las composiciones, por ejemplo, el mezclado con un portador, diluyentes, excipiente o vehículo farmacéuticamente o veterinariamente aceptable y/o un adyuvante y/o un estabilizador . La invención además se relaciona a métodos para inducir una . respuesta inmunológica o inmunogénica o inmunoprotectora en un sujeto, por ejemplo un animal, tal como un animal susceptible a infección por una bacteria gram negativa, tal como Pasteurella, por ejemplo, un pavo o animal bovino, que comprende administrar al animal una vacuna o composición inmunogénica de la invención. Aun además adicionalmente la invención se relaciona a la preparación de tal bacteria atenuada, por ejemplo, bacteria gram negativa, tal como Pasteurella; por ejemplo, que comprende introducir uno o más elementos que pueden transponerse a la bacteria y aislar la bacteria que contiene el elemento que puede transponerse que no ocasiona mortalidad en una especie objetivo (y por consiguiente es atenuada) . Además se puede identificar opcionalmente las mutaciones en la bacteria, para de esta manera permitir medios alternativos para producir la bacteria atenuada. La invención aún además se relaciona a tales medios alternativos para producir bacteria atenuada. Puesto que las mutaciones son identificadas o caracterizadas, las mutaciones pueden ser introducidas en la bacteria a través de técnicas diferentes de la introducción de uno o más elementos que pueden transponerse a la bacteria, tal como mediante la recombinación homologa, por ejemplo, la recomendación homologa mediante la cual una porción del genoma bacteriano resulta en por lo menos una adición al mismo (inserción) o una supresión del mismo (dos o más adiciones y/o supresiones también son contempladas) o una sustitución (tal como un reemplazo de por lo menos un nucleótido por otro) . Por consiguiente, la invención se relaciona a un método para producir una bacteria atenuada que contiene una modi ic¿ieión o mutación conocida previamente identificada, por ejemplo, una modificación o mutación identificada en la presente, que comprende introducir una supresión o inserción o reemplazo en el genoma bacteriano, ventajosamente a través de la recombinación, y opcionalmente identificar y aislar la bacteria que contiene la modificación o mutación. Asi, la invención además se relaciona a un mutante de una bacteria gram negativa, en donde la bacteria' tiene por .lo menos una mutación en una secuencia de nucleótidos que codifica para un polipéptido que tiene identidad que es igual o mayor que 7C¾, 75%, 80%, 35%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% con una secuencia de aminoácidos codificada por una secuencia de nucleótidos seleccionada del grupo que consiste de secuencias de nucleótidos identificadas como SEQ ID NO: 2, 6, 9, 12, 16, 19, 22, 25, 28, 31, 34, 37, 40, 43, 46, 49, 52, 55, 58, 61, 64, 67, 70, 75, 78, 81, 84, 87, 90, 93; la mutación que resulta en la virulencia atenuada de la bacteria. Y, la invención se relaciona a los usos, composiciones y métodos que implican tal bacteria como es descrita en la presente ANECEDENTES Es bien establecido que los microorganismos atenuados vivos pueden ser vacunas altamente efectivas; las respuestas inmunes inducidas de tales vacunas frecuentemente son de mayor magnitud y. de más larga duración que aquellas producidas por los inmunógenos no replicantes. Una explicación de esto puede ser que las cepas atenuadas vivas establecen infecciones limitadas en el huésped e imitan las etapas tempranas de la infección natural. Además, distinto a las preparaciones muertas o activadas, las vacunas vivas son capaces de inducir potentes respuestas mediadas por la célula que pueden ser relacionadas con su habilidad para replicarse en las células que presentan antigeno, tales como macrófagos. Ha existido una larga historia del uso de vacunas atenuadas vivas en animales y hmmanos,- notablemente usando' técnicas de mutagénesis química. Sin embargo, las vacunas empíricamente atenuadas pueden revertir la virulencia. Las técnicas de biología molecular modernas, acopladas con el conocimiento incrementado de la patogénesis bacteriana, ha conducido a la identificación de varios genes que están implicados en el crecimiento y la supervivencia de los microorganismos in vivo. Esto ha proporcionado nuevos objetivos de genes para al atenuación, y al concepto de que cepas de vacunas futuras podrían ser "racionalmente" atenuadas al introducir mutaciones de no reversión definidas en genes seleccionados conocidos que están implicados en la virulencia, ver por ejemplo WO-A-00/61724 , WO-A-00/68261 y EP-A-0889120. Aunque muchas cepas atenuadas se han producido en los laboratorios, solamente unas cuantas se han calificado como candidatos de vacuna potenciales para el uso en animales. Esto puede ser debido en parte a la necesidad de equilibrar la inmunogenicidad de la vacuna con la posibilidad del microorganismo a revertirse, llegando a ser reactivo y patogénico . Es claro que la selección de genes apropiados para la atenuación, que darán por resultado un candidato de vacuna adecuado, no es directa y no puede ser fácilmente predic.ha. Muchos factores pueden influir en la aceptabilidad de un mutante atenuado como una vacuna, y consecuentemente se requiere esfuerzo de investigación para identificar y seleccionar genes atenuantes adecuados. Muchos experimentos de atenuación se condujeron solamente in vitro y estos resultados no pueden ser extrapolados in vivo, notablemente con relación a la patogenicidad residual de los mutante resultantes para los animales vacunados.
Se hace mención de: Kacklany SC, Planet PJ, Bhattacharj ee MK, Kollia E, DeSalle R, Fine DH, Figurshi DH, Nonspecidif adherence by Actinobacillus actionomycetemcomi tans requires genes widespread in bacteria and archaea. J Bacteriol. 2000 Nov; 182 (21) : 6169-76. Fuller TE, Martin S, Teel JF, Alaniz GR, Kennedy MJ, Lowery DE., Identification of Actinobacillus pleuropneumoniae virulence genes using signature-tagged mutagenesis in a swine infection model. Microb Pathog. 2000 Jul; 29 (1) :39-51. Fuller TE, Kennedy MJ, Lowery DE., Identificación of Pasteurella multocida virulence genes in a septicemic mouse model using signature-tagged mutagenesis. Microb Pathog. 2000 Jul; 29(l):25-38. Kehrenberg C, Werckenthin C, Schwarz S., Tn5706, a transposon-like element from PausteureJIa multocida mediating tetracicline resistance. Antimicrob Agents Chemother. 1998 Aug; 42 (8) : 2116-8. DeÁngelis PL., Transposon Tn916 insertional mutagenesis of Pasteurella multocida and direct sequencing of disruption site. Microb Patrhog. 1998a Apr; 24(4):203-9. DeAngelis PL., Jing W, Drake RR, Achyuthan A . , Identification and molecular cloning of a unique hyaluronan synthase from Pasteurella multocida. J. Biol Chem. 1998b Apr 3; 273 (14) :8454-8. Lee MD, Henk AD . , TnlO insertional mutagenesis in Pasteurella multocida. Ver Microbiol. 1996 May; 50(1-2) :143-8. Choi KH, Maheswaran SK, Choi CS . , Colorimetric assay using XTT for assessing virulence of avian Pasteurella multocida straing. Vet Microbiol. 1995 Jul; 45 (2-3) : 191-200. Nnalue NA. Tn7 inserts in both orientations at a single chromosomal location and apparently forms cointegrates in Pasteurella multocida. Mol Microbiol. 1990 Jan; 4(1) :107-17. Stocker, patentes norteamericanas Nos. 4,550,081, 4,837,151, 5,210,035 y 5,643,771. Highlander patente norteamericana No. 6,180,112. Kachlany implicó genes Tad. No hay relación entre los genes Tad mutados en Kachlany y la atenuación. No hay prueba sobre animales en Kachlany y los genes Tad no son seleccionados en la presente invención. Los artículos de Fuller implican secuencias que no son seleccionadas en la presente invención. Kehrenber no involucró un mutante atenuado, o una técnica de Signature Tagged Mutagenesis o STM; sino más bien, Kehrenberg implicó una inserción dirigida de un transposón (uso de elemento de inserción idéntico) . DeAngelis 1998a proporciona solamente una descripción general de una técnica STM, y nada acerca de los imitantes, per se.
DeAngelis 1998b implicó el uso de una técnica STM para insertar un transposón en el sitio de biosintesis de HA (Genbank AF36004) . Esta secuencia es un homólogo a la secuencia Pm0775 de PM70. La secuencia que codifica Pm0775 no es seleccionada en la presente invención. Lee se relaciona al uso de una técnica STM. con un transposón TnlO; Lee no logra describir o sugerir cualquiera de las pruebas sobre animales o cualquiera de las investigaciones para mutantes atenuados; sino más bien, Lee implicó solamente mutantes auxotróficos . Mientras que Choi cita un mutante de inserción de transposón de Pasteurella multocida, y ahí puede haber nada de mortalidad inducida por este mutante, Choi no contiene detalles acerca de la ubicación de la inserción del transposón y por lo tanto no se puede decir que sea reproductible. Nnalue de manera similar no logra enseñar o sugerir la presente invención. Las patentes de Stocker implicaron la inserción de un transposón TnlO en el gen AroA. El gen AroA no es seleccionado en la presente invención. Highlander se relaciona a la inserción de un transposón Tnl545 en el gen lktC para inactivar la leucotoxina. El gen LktG no es seleccionado en la presente invención. Por consiguiente, realmente se cree que la presente invención no es enseñada o sugerida en la técnica. Además, es deseable caracterizar los genes o secuencias de ácido nucleico implicadas en la atenuación y en esta base desarrollar bacteria atenuada, asi como vacunas o composiciones inmunogénicas atenuadas, tales como aquellas que tienen un alto grado de inmunogenicidad y que muestran un buen perfil de seguridad con limitados o nada de efectos secundarios. BREVE DESCRIPCION DE LA INVENCION La invención proporciona un mutante de una bacteria gram negativa que tiene una mutación en una primera secuencia de nucleótidos que codifica para un primer polipéptido y resulta en la bacteria que tiene virulencia atenuada, en donde : el primer polipéptido tiene una secuencia de aminoácidos; un segundo polipéptido tiene una secuencia de aminoácidos codificada por una secuencia de nucleótidos identificada como SEQ ID NO: 2, 6, 9, 12, 16, 19, 22, 25, 28, 31, 34, 37, 40, 43, 46, 49, 52, 55, 58, 61, 64, 67, 70, 75, 78, 81, 84, 87, 90 o 93; y la secuencia de aminoácidos del primer polipéptido es la misma como aquella del segundo polipéptido, la secuencia de aminoácidos del primer polipéptido tiene una identidad que es igual o mayor que 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% con la secuencia de aminoácidos del segundo polipéptido. La bacteria mutante puede ser una Pasteurellaceae, por ejemplo, la bacteria puede ser:" Pasteurella multocida , Pasteurella haemolytica , Pasteurella anatipestifer o Actinobacillus pleuropneumoniae; venaj osamente Pasteurella muí tocida . La mutación puede ser una supresión en la primera secuencia de nucleótidos, o una inserción en ésta o el reemplazo de ácidos nucleicos, tal como una supresión de la primera secuencia de nucleótidos completa; o una inserción entre: los nucleótidos 180-181 o los nucleótidos 182-183 o los nucleótidos 190-191 en la SEQ ID NO: 2,· los nucleótidos 77-78 o los nucleótidos 1026-1027 o los nucleótidos 1027-1028 en la SEQ ID NO: 6, los nucleótidos 416-417 en la SEQ ID NO: 9, los nucleótidos 389-390 en la SEQ ID NO: 12, los nucleótidos 381-382 en la SEQ ID NO: 16, los nucleótidos 219-220 en la SEQ ID NO: 19, los nucleótidos 1353-1354 en la SEQ ID NO: 22, los nucleótidos 136-137 en la SEQ ID NO: 25, los nucleótidos 384-385 en la SEQ ID NO: 28, los nucleótidos 222-223 o nucleótidos. 225-226 en la' SEQ ID NO: 31, los nucleótidos 217-218 en la SEQ ID NO: 34, los nucleótidos 1411-1412 en la SEQ ID NO: 37, los nucleótidos 943-944 en la SEQ ID NO: 40, los nucleótidos 855-856 en la SEQ ID NO: 43, los nucleótidos 369-370 en la SEQ ID NO: 46, los nucleótidos 111-112 en la SEQ ID NO: 49, los nucleótidos 443-444 en la SEQ ID NO: 52, los nucleótidos 4-5 en la SEQ ID NO: 55, los nucleótidos 573-574 en la SEQ ID NO: 61, los nucleótidos 875-876 en la SEQ ID NO: 64, los nucleótidos 218-219 en la SEQ ID NO: 70, los nucleótidos 1072-1087 en la SEQ ID NO: 75, los nucleótidos 64-65 en la SEQ ID NO: 78, los nucleótidos 282-283 en la SEQ ID NO: 81, los nucleótidos 1431-1432 en la SEQ ID NO: 84, los nucleótidos 974-975 en la SEQ ID NO: 87, los nucleótidos 802-803 en la SEQ ID NO: 90, los nucleótidos 850-851 en la SEQ ID NO: 92; o inmediatamente corriente arriba del nucleótido 1 en la SEQ ID NO: 58; o inmediatamente corriente arriba del nucleótido 1 en la SEQ ID NO: 67. El mutante puede comprender una secuencia de ácido nucleico heteróloga, tal como una secuencia de ácido nucleico heteróloga que codifica para un inmunógeno de un agente patogénico, viral, parasítico o bacteriano, una proteína terapéutica, un alérgeno, un factor de crecimiento o una citoquina. La invención también proporciona una composición inmunogénica o vacuna que comprende un mutante de 'acuerdo a la invención, y un diluyente, portador, vehículo o excipiente farmacéuticamente o veterinariamente aceptable, y opcionalmente que además comprende un adyuvante. La invención además proporciona un primer polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos, en donde hay: un segundo polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos codificada por una secuencia de nucleótidos identificada como la SEQ ID NO: 2, 6, 9, 12, 16, 19, 22, 25, 28, 31, 34> 37, 40, 43, 46, 49, 52, 55, 58, 61, 64, 67, 70, 75, 78, 81, 84, 87, 90 o 93; y la secuencia de aminoácidos del primer polipéptido es la misma como aquella del segundo polipéptido, o la secuencia de aminoácidos del primer polipéptido tiene una identidad que es igual o mayor que 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, · 97%, 98% o 99% con la secuencia de aminoácidos del segundo polipéptido. La invención contempla una composición inmunogénica o de vacuna que contiene el primer polipéptido aislado, y un diluyente, portador, vehículo o excipiente farmacéuticamente o veterinariamente aceptable y opcionalmente un adyuvante. Aún además, la invención contempla una preparación de anticuerpo que comprende un anticuerpo específico al primer polipéptido aislado. La invención también implica un método de diagnóstico para detectar la infección mediante una bacteria gram negativa, que comprende detectar en una muestra el primer polipéptido aislado a un anticuerpo específico a aquel del primer polipéptido aislado. La invención además se relaciona a un método de inmunización pasiva que comprende administrar la preparación de anticuerpo. La invención también proporciona una molécula de ácido nucleico aislada que tiene una secuencia identificada como SEQ ID NO: 2, 6, 9, 12, 16, 19, 22, 25, 28, 31, 34, 37, 40, 43, 46, 49, 52, 55, 58, 61, 64, 67, 70, 75, 78, 81, 84, 87, 90 o 93, o identificada como SEQ ID NO: 1, 4, 5, 8, 11, 14, 15, 18, 21, 24, 27, 30, 33, 36, 39, 42, 45, 48, 51, 54, 57, 60, 63, 66, 69, 72, 73, 77, 80, 83, 86, 89, 92, 95, 96' o 97, así como un cebador de PCR para detectar bacteria gram negativa que comprende una molécula de ácido nucleico aislada que tiene una secuencia que es por lo menos 10 ácidos nucleicos contiguos de una secuencia de nucleótidos identificada como SEQ ID NO: 2, 6, 9, 12, 16, 19, 22, 25, .28, 31, 34, 37, 40, 43, 46, 49, 52, 55, 58, 61, 64, 67, 70, 75, 78, 81, 84, 87, 90 o 93, o identificada como SEQ ID NO: 1, 4, 5, 8, 11, 14, 15, 18, 21, 24, 27, 30, 33, 36, 39, 42, 45, 48, 51, 54, 57, 60, 63, 66, 69, 72, 73, 77, 80, 83, 86, 89, 92, 95, 96 o 97. Una sonda o cebador puede ser cualquier estiramiento de por lo menos 8, de preferencia por lo menos •10, más de preferencia por lo menos 12, 13, 14 o 15, tal como por lo menos 20, por ejemplo, por lo menos 23 o 25, por ejemplo por lo menos 27 o 30 nucleótidos que son únicos a la secuencia deseada a ser amplificada o que están en la secuencia deseada a ser amplificada y son por lo menos conservados, por ejemplo, conservados entre la bacteria gram negativa o entre una familia o especie particular de bacterias gram negativas, tales como entre Pasteurella , o entre cualquiera de Pasteurella multocida, Pasteurella haemolytica, Pasteurella anatipestifer o Actinobacillus pleuropneumoniae; ventajosamente Pasteurella multocida. En cuanto a la PCR o los cebadores o sondas de hibridación y las longitudes óptimas para los mismos, también se hace referencia a Kajimura y colaboradores, GATA 7(4):71-79 (1990) . Los términos "composición inmunogénica" y "composición inmunológica" y "composición inmunogénica o inmunológica" cubren cualquier composición que induce una respuesta inmune contra el patógeno dirigido; por ejemplo, después de la administración o inyección al animal (tal como un ave, por ejemplo, pavo o animal bovino, por ejemplo vaca) , induce una respuesta inmune contra el patógeno dirigido (por ejemplo, Pasteurella multocida) . Los términos "composición vacunal" y "vacuna" y "composición de vacunas" cubren cualquier composición que induce una respuesta inmunoprotectora contra el patógeno dirigido o que eficazmente protege contra el patógeno; · por ejemplo, después' de la administración o inyección en el animal (por ejemplo, ave tal como pavo o animal bovino tal como vaca) , induce una respuesta inmunoprotectora contra el patógeno dirigido o proporciona protección eficaz contra el patógeno (por ejemplo, P. multocida) . Una subunidad de un patógeno, por ejemplo, un antigeno o inmunógeno o epitope aislado del patógeno, por ejemplo, bacteria tal como una bacteria gram negativa, por ejemplo, P. multocida; y una composición subunitaria comprende o consiste esencialmente de uno o más antigenos, inmunógenos o epitopes aislados del patógeno, por ejemplo, bacteria, tal como una bacteria gram negativa, por ejemplo P. multocida . Se observa que en esta descripción y particularmente en las reivindicaciones, los términos tales como "comprende", "comprendido", "que comprende" y similares puede tener el significado atribuido a este en la ley de patentes norteamericana; por ejemplo, ellos pueden significar "incluye", "incluido", "que incluye" y similares; y aquellos términos tales como "que consiste esencialmente de" y "consiste esencialmente de" tienen los significados adscritos a estos en la ley de patentes norteamericana, por ejemplo, ellos permiten elementos no explícitamente recitados, pero excluyen elementos que son encontrados én la técnica previa o que afectan una característica básica o novedosa de la invención. Estas y otras modalidades son descritas o son obvias de, y comprendidas por, la siguiente Descripción Detallada. DESCRIPCION DETALLADA La presente invención proporciona secuencias de nucleótidos y genes implicados en la atenuación., de un microorganismo, tal como bacteria, por ejemplo bacteria gram negativa, por ejemplo, Pastuerella multocida , productos (por ejemplo, proteínas, antígenos, inmunógenos, epítope.s) codificados por las secuencias de nucleótidos, métodos para producir tales secuencias de nucleótidos, productos, micro-organismos y usos para los mismos, tal como para la preparación de composiciones de vacuna o inmunogénicas o para inducir una respuesta inmunológica o inmune o como un vector,, por ejemplo, como un vector de expresión (por ejemplo, un vector de expresión in vitro o in vivo) . Las mutaciones introducidas en las secuencias de nucleótidos y los genes de microorganismos producen mutantes atenuados novedosos y no obvios. Estos mutantes son útiles para la producción de composiciones inmunogénicas atenuadas vivas o vacunas atenuadas vivas que tienen un alto grado de inmunogenicidad . Estos mutantes también son útiles como vectores que pueden ser útiles para la expresión in vitro de productos de expresión, así como para la reproducción o replicación de secuencias de nucleótidos (por ejemplo, replicación de DNA) y para productos de expresión in vivo. La identificación de las mutaciones proporcionan secuencias de nucleótidos y genes novedosos y no obvios, así como productos de gen novedosos y no obvios codificados por las secuencias de nucleótidos y genes.
Tales productos de gen proporcionan antigenos, inmunógenos y epitopes, y son útiles como productos de gen aislados . Tales productos de gen aislados, asi como epitopes de los mismos, también son útiles para generar anticuerpos, que son útiles en aplicaciones de diagnóstico. Tales productos de gen, que pueden proporcionar o generar epitopes, antigenos o inmunógenos, también son útiles para composiciones inmunogénicas o inmunológicas , asi como para vacunas. En un aspecto, la invención proporciona una bacteria que contiene una mutación atenuante en una secuencia de nucleótidos o un gen en donde la mutación modifica, reduce o suprime la expresión y/o la actividad biológica de un polipéptido o proteina codificada por un gen, dando por resultado la virulencia atenuada de la bacteria. La mutación no necesariamente está ubicada dentro de una secuencia de codificación o gen para interrumpir su función, conduciendo la atenuación. La- mutación también se puede hacer en secuencias de nucleótidos implicadas en la regulación de la expresión del gen, por ejemplo, en regiones que regulan la iniciación de transcripción, traducción y la terminación de transcripción. Asi también se incluyen promotores y regiones de enlace de ribosoma (en general estos elementos reguladores están situados aproximadamente entre 60 y 250 nucleotidos corriente arriba del codón de partida de la secuencia de codificación o gen; Doree S M y colaboradores, J. Bacteriol. 2001, 183(6): 1983-9; Pandher K y colaboradores, Infect. Imm. 1998, 66(12): 5613-9; Chung J Y y colaboradores, FEMS Microbiol letters 1998, 166: 289-296), terminadores de transcripción (en general el terminador está ubicado dentro de aproximadamente 50 nucleotidos corriente abajo del codón de detención de la secuencia de codificación o gen; Ward C K y colaboradores, Infect. Imm. 1998, 66(7): 3326-36) . En el caso de un operón, tales regiones reguladoras pueden estar ubicadas en una distancia más grande corriente arriba del gen o la secuencia de codificación. Una mutación en una región intergénica también puede conducir a la atenuación. Una mutación dentro de tales secuencias reguladoras asociadas con la secuencia de codificación o gen,' de modo que la mutación de esta secuencia de nucleotidos modifica, inhibe o suprime la expresión y/o la actividad biológica del polipéptido o la proteina codificada por el gen, dando por resultado virulencia atenuada de la bacteria, seria un equivalente a una mutación dentro de un gen o secuencia de codificación identificada en la presente invención. La atenuación reduce o suprime la patogenicidad de la bacteria y la gravedad de los signos clínicos o lesiones, disminuye la velocidad de crecimiento de la bacteria y previene la muerte de la bacteria. La invención se relaciona a microorganismos, tal como bacteria, por ejemplo, bacteria gram negativa, tal como la bacteria de la familia Pasteurellaceae, por ejemplo, Pasteurella multocida , Pasteurella haemolytica, Pasteurella anatipestifer y Actinobacillus pleuropneumoniae .
Ventajosamente la bacteria es Pasteurella multocida . Pasteurella multocida es una bacteria gram negativa, que es el agente causante de varias enfermedades de los animales de producción y un patógeno humano oportunista. Esta es el agente etiológico de la pasteurelosis severa, tal como el cólera de aves en aves domésticas y silvestres, septicemia hemorrágica bovina y rinitis atrófica porcina (Hunt ML y colaboradores, Vet Microbiol 2000, 72 ( 1-2 ) : 3-25 ) . Los aislados se pueden agrupar serológicamente basado en los antigenos capsulares en los serogrupos (A, B, D, E y F) o en 16 serotipos basados en los antigenos LPS somáticos. Las secuencias ¦ de nucleótidos potenciales implicadas en la atenuación de la bacteria se han' identificado usando la Signature Tagged Mutagenesis (STM) . Este método es discutido en los documentos citados en la presente y también se hace mención de WO-A-96/17951. STM implica la inserción de un transposón, de etiqueta de rúbrica único, en el genoma de un microorganismo. En el sitio de la inserción, la secuencia de nucleótidos del genoma es. interrumpida. En la presente invención, la mutación resultante (y por consiguiente el mutante que lleva la mutación) es analizada para la atenuación. La secuencia de la región interrumpida (por ejemplo gen o secuencia de codificación o estructura de lectura abierta (ORF) ) para cada mutante atenuado es determinada mediante la amplificación por PCR (reacción en cadena de polimerasa) clonaciones y secuenciación de las regiones de DNA que flanquean el transposón. En una modalidad de la presente invención, el método STM descrito en O-A-96/17951 se adaptó para hacer funcionar en Pasteurella multocida. Estas adaptaciones notablemente incluyen el uso del transposón TnlO antes que Tn5, y el uso para la selección de un medio de CDM sin leucina antes que una selección de resistencia a la estreptomicina. Más detalles se dan en los ejemplos. Una selección adicional de genes o secuencias de nucleótidos implicadas en la atenuación de los genes potenciales identificados por el método STM está basada en ¦ la ausencia de mortalidad después de la inoculación de la bacteria mutante en los animales. Para aplicaciones veterinarias, un aspecto ventajoso de la invención comprende la implementación de una selección experimental directamente en el animal objetivo, antes que en un modelo de animal. Este método permite una selección más precisa para mutaciones apropiadas de la bacteria muíante ! Para Pasteurella multocida , los experimentos se hacen directamente en pavos, uno de los huéspedes objetivo naturales de Pasteurella multocida . Los pavos se inoculan intramuscularmente con una cantidad suficiente de acumulaciones de mutantes P. multocida de etiqueta de rúbrica (por ejemplo 0.5 mi, 107 CFU por animal) . Los mutantes que no son reaislados en un cierto tiempo después de la inoculación se consideran como potencialmente atenuados. Los mutantes que no son reaislados se distinguen de aquellos en la acumulación que son reaislados por amplificación por PCR y el análisis de las etiquetas de rúbrica. Cada mutante potencialmente atenuado luego es inyectado mediante la ruta intramuscular de pavo (por ejemplo, 0.5 mi, 104 CFU por animal). La mortalidad de los pavos es registrada diariamente por 7 dias después de la inoculación. Los mutantes que no conducen a la muerte se consideran como atenuados. El método específico se ha llevado a cabo en la cepa P-1059 de Pasteurella multocida y un número de mutantes atenuados se han obtenido. Cinco de estos se han depositado el Io de Abril de 2003 en el CNCM (Collection Nationale de Cultures de Microorganismos) del Institute Pasteur, París, Francia. El mutante 4G11 está disponible bajo el número de acceso CNCM 1-2999. El mutante 5D5 está disponible bajo el número de acceso CNCM 1-3000. El mutante 9C8 está disponible bajo el número de acceso CNCM 1-3001. El mutante 9H4 está disponible bajo el número de acceso CNCM 1-3002. El mutante 13E1 está disponible bajo el número de acceso CNCM 1-3003. Las secuencias de nucleótidos que flanquean el sitio de la inserción de transposón son designadas SEQ ID NO: 1, 4, 5, 8, 11, 14, 15, 18, 21, 24, 27, 30, 33, 36, 39, 42, 45, 48, 51, 54, 57, 60, 63, 66, 69, 72, 73, 77, 80, 83, 86, 89, 92, 95, 96, 97. Los transposones se insertaron en la cepa P-1059 de Pasteurella multocida inmediatamente en el extremo 5' de las secuencias 1, 8, 11, 14, 15, 27, 33, 42, 54, 57, 66, 72, 73, 77, 80, 95 y 97, e inmediatamente en el extremo 3' de las secuencias 4, 5, 18, 21, 24, 30, 36, 39, 45, 48, 51, 60, 63, 69, 83, 86, 89 y 96. Para el mutante 9H4, el transposón se insertó entre los nucleótidos en las posiciones 850-851 de la secuencia SEQ ID NO: 92. Un aspecto particular de la invención son los mutantes atenuados de la cepa P-1059 de Pasteurella multocida que tiene una mutación atenuante en el gen ORF y/o sus regiones reguladoras que comprenden una secuencia seleccionada de las secuencias SEQ ID NO: 1, 4, 5, 8, 11, 14, 15, 18 , 21, 24 , 27 , 30 , 33 , 36, 39, 42 , 45, 48 , 51, 54 , 57, 60, 63, 66, 69, 72, 73, 77, 80, 83, 86, 89, 92, 95, 96 y 97. Modalidades adicionales particulares de la invención incluyen mutantes atenuados de acuerdo con la invención tales como los mutantes atenuados mencionados en la presente como son depositados en la CNCM bajo los términos del Tratado de Budapest. Los mutantes P-1059 atenuados pueden ser obtenidos, por ejemplo, mediante la inserción de transposón o mediante la mutagénesis dirigida (supresión, inserción, reemplazo) . La mutación atenuante se puede hacer con estas secuencias de nucleótidos o genes asi como las secuencias complementarias de los mismos. La mutación atenuante también se puede hacer en secuencias de nucleótidos implicadas en la región reguladora de los genes o secuencias de nucleótidos. Las secuencias anteriores o partes de las mismas
(tales como por lo menos 10, 15 o 20 nucleótidos de las mismas, por ejemplo, por lo menos 10 nucleótidos contiguos de las mismas, o por lo menos 15 nucleótidos contiguos de las mismas y más ventajosamente por lo menos 20 nucleótidos contiguos de las mismas, hasta la longitud completa de la secuencia) se pueden utilizar como cebadores de PCR para detectar y seleccionar los mutantes de inserción de transposón. La PCR puede involucrar un par de cebadores, por ejemplo, un especifico al transposón, y el otro especifico al gen o secuencia de nucleótidos a ser mutado. Basado en el tamaño esperado de los productos amplificados por PCR, el método permite la amplificación y/o detección de los fragmentos de PCR. El conocimiento del gen correspondiente ORF y/o sus regiones reguladoras en el organismo, por ejemplo, bacteria gram negativa, tal como Pasteurella , por ejemplo, Pasteurella multocida , por ejemplo la cepa PM70 o P-1059 de Pasteurella multocida (ver, por ejemplo, infra) ; por ejemplo, el tamaño del gen correspondiente de ORF y/o sus regiones reguladoras se pueden usar para diseñar cebadores de PCR, para clasificar los fragmentos de PCR amplificados y para detectar aquellos que tienen un tamaño correcto que permite la selección de los mutantes. El genoma completo de la cepa PM70 de Pasteurella multocida está disponible en la base de datos de EMBL y en May BJ y colaboradores, Proc. Nati. Acad. Sci. USA, 2001, 98(6): 3460-5. Los blasts hechos con las secuencias SEQ ID NO: 1, 4, 5, 8, 11, 14, 15, 18, 21, 24, 27, 30, 33, 36, 39, 42, 45, 48, 51, 54, 57, 60, 63, 66, 69, 72, 73, 77, 80, 83, 86, 89, 92, 95, 96, 97 permitieron localizar las secuencias homologas sobre el genoma PM70 y luego determinar los genes correspondientes ORFs en PM70. Estas secuencias de nucleótidos en la cepa PM70 de Pasteurella multocida son designadas SEQ ID NO: 2, 6, 9, 12, 16, 19, 22, 25, 28, 31, 34, 37, 40, 43, 46, 49, 52, 55, 58, 61, 64, 67, 70, 75, 78, 81, 84, 87, 90.
Para el mutante 9H4 de la cepa P-1059, no se encontró secuencia homologa en P 70. La ORF de P-1059 se ha secuenciado y designado SEQ ID NO: 93. Otro aspecto de la invención, son los imitantes atenuados de la cepa PM70 que tienen por lo menos una mutación atenuante en un gen u ORF que comprende una secuencia de nucleotidos seleccionada de la SEQ ID NO: 2, 6, 9, 12, 16, 19, 22, 25, 28, 31, 34, 37, 40, 43, 46, 49, 52, 55, 58, 61, 64, 67, 70, 75, 78, 81, 84, 87 y 90 y/o sus regiones reguladoras. La mutación atenuante se puede hacer con estas secuencias de nucleotidos o genes asi como las secuencias complementarias de las mismas. La mutación atenuante también se puede hacer en las secuencias de nucleotidos implicadas en la región reguladora de los genes. Se pueden obtener mutantes atenuados, por ejemplo, mediante la inserción de transposón o mediante la mutagénesis dirigida (supresión, inserción, reemplazo) . El término de "complementario" significa en la presente la secuencia de nucleotidos de la otra hebra en el genoma de doble hebra, de modo que cubre la hebra . antisentido como el complemento de la hebra de sentido, y a la inversa. El término "nucleótido" también comprende desoxirribonucleótido (asi constituido con ácidos desoxirribonucleicos o DNA) , ribonucleótido (asi constituido con ácidos ribonucleicos o RNA) y ribonucleótido mensajero (mRNA) . Más generalmente, las mutaciones atenuantes pueden ser introducidas en el genoma de una bacteria tal como una bacteria gram negativa, por ejemplo, una bacteria de la familia Pasteurellacaea, por ejemplo P. multocida , P. haemolytica , . P. anatipestifer, A. pleuropneumoniae, ventajosamente una bacteria en el genoma de cualquiera de las diversas cepas de P. multocida (por ejemplo la cepa P-1059, cepa PM70) , mutaciones en por lo menos una secuencia de nucleótidos que codifica para una secuencia de aminoácidos que tiene por lo menos aproximadamente 70% de identidad, por lo menos aproximadamente 75% de identidad, por lo menos aproximadamente 80% de identidad, por lo menos aproximadamente 85%, por lo menos aproximadamente 90% de identidad, y ventajosamente por lo menos aproximadamente 95, 96, 97, 98 o 99% o más identidad a una de las secuencias de aminoácidos codificada por una secuencia de nucleótidos identificada como SEQ ID NO: 2, 6, 9, 12, 16, 19, 22, 25, 28, 31, 34, 37, 40, 43, 46, 49, 52, 55, 58, 61, 64, 67, 70, 75, 78, 81, 84, 87, 90, 93. La mutación atenuante se puede hacer con estas secuencias de nucleótidos o genes asi como en las secuencias complementarias de las mismas. La mutación atenuante también se puede hacer en secuencias de nucleótidos implicadas en la región reguladora de los genes. Los mutantes atenuados puede ser obtenidos, por ejemplo, mediante la inserción .de transposón o mediante la mutagénesis dirigida (supresión, inserción, reemplazo) . Los mutantes atenuados obtenidos son modalidades de la invención. Las modalidades particulares son los mutantes atenuados de P-1059. El porcentaje de identidad entre estas dos secuencias de aminoácidos puede ser establecido por el BLAST por pares de NCBI (National Center for Biotechnology Information) y la matriz blosum62, usando los parámetros estándares (Esto es, observar el algoritmo BLAST o BLASTX disponible en el servidor de "National Center for Biotechnology Information" (NCBI, Bethesda, Md., USA) asi como en Altschul y colaboradores, J. Mol. Biol . 1990. 215. 403-410; y asi, este documento menciona utilizar el algoritmo o el BLAST o BLAST y la matriz BLOSUM62 por el término "blasts"). El verbo "codificar" usada en la presente no significa que la secuencia de nucleótidos sea limitada a una secuencia de codificación real sino también comprende el gen completo que incluye sus secuencias reguladoras que son secuencias de no codificación. La homología de identidad de secuencia tal como la homología de secuencia de nucleótidos también puede ser determinada usando el programa "Align" de Myers y Miller, ("Optimal Alignments in Linear Space", CABIOS 4, 11-17, 1988, incorporada en la presente por referencia) y disponible en NCBI, asi cerno el mismo u otros programas disponibles por medio del Internet en los sitios en el mismo tal como el sitio NCBI. Alternativamente o adicionalmente, el término
"homología" o "identidad", por ejemplo, con respecto a una secuencia de nucleótidos o de aminoácidos, puede indicar una medición cuantitativa de homología entre dos secuencias. El por ciento de homología de secuencia puede ser calculado como (Nref - Ndif) *100/Nref, en donde Ndif es el número total de residuos no idénticos en las dos secuencias cuando son alineadas y en donde Nref es el número de residuos en una de las secuencias. Por consiguiente, la secuencia de DÑA AGTCAGTC tendrá una identidad de secuencia dé 75% con la secuencia AATCAATC (Nref=8; Ndif=2) . Alternativamente o adicionalmente, "homología" o "identidad" con respecto a las secuencias puede referirse al número de posiciones con nucleótidos o aminoácidos idénticos divididas entre el número de nucleótidos o aminoácidos en la más corta de las dos secuencias en donde la alineación de las dos . secuencias puede ser determinada de acuerdo con el algoritmo de Wilbur y Lipman (Wilbur y Lipman, 1983 PNAS USA 80:726> incorporada en la presente por referencia), por ejemplo, usando un tamaño de ventana de 20 nucleótidos, una longitud de palabra de 4 nucleótidos, y una sanción de espacio de 4, y el análisis asistido por computadora y la interpretación de los datos de la secuencia incluyendo la alineación puede ser convenientemente realizada usando programas comercialmente disponibles (por ejemplo, IntelligeneticsMR Suite, Intelligenetics Inc. CA) . Cuando las secuencias de RNA se dicen que son similares, o tienen un grado de identidad u homología de secuencia con la secuencia de DNA, la timidina (T) en la secuencia de DNA se considera igual al uracilo (U) de la secuencia de RNA. Así, las secuencias de RNA están dentro del alcance de la invención y pueden ser derivadas de secuencias de DNA, por timidina (T) en la secuencia de DNA que se considera igual al uracilo (U) de las secuencias de RNA. Venta osamente, la identidad u homología de secuencia tal como la identidad u homología de secuencia de aminoácidos puede ser determinada usando el programa BlastP (Altschul y colaboradores, Nucí. Acids Res.. 25, 3389-3402, incorporada en la presente por referencia) y disponible en NCBI, así como el mismo u otros programas disponibles por medio del Internet en sitios en el mismo tal como el sitio NCBI. Los siguientes documentos (cada uno incorporados en la presente por referencia) proporcionan algoritmos para la comparación de la identidad u homología relativa de secuencias tales como residuos de aminoácidos de dos proteínas y adicionalmente o alternativamente con respecto al anterior, las enseñanzas en estas referencias pueden ser utilizadas para determinar el por ciento de homología o identidad: Needleman SB and Wunsch CD, "A general method applicable to the search for similarities in the amino acid sequences of two proteins", J. Mol. Biol. 48:444-453 (1970); Smith TF y aterman MS, "Comparison of Bio-sequences", Advances in Applied Mathematics 2:482-489 (1981); Smith TF, Waterman MS y Sadler JR, "Statistical characterization of nucleic acid sequence functional domains", Nucleic Acids Res., 11:2205-2220 (1983); Feng DF y Dolittle RF, "Progressive sequence alignment as a prerequisite to correct phylogenetic trees", J. of Molec. Evol .,. 25 : 351-360 (1987); Higgins DG y Sharp PM, "Fast and sensitive múltiple sequence alignment on a microcomputer", CABIOS, 5:151-153 (1989); Thompson JD, Higgins DG y Gibson TJ, "Cluster W: improving the sensitivity of progressive múltiple sequence alignment through sequence weighing, positions-specific gap penalties and weight matrix choice", Nucleic Acid Res., 22:4673-480 (1994); y, Devereux J, Haeberlie P y Smithies O, "A comprehensive set of sequence analysis programa for the VAX", Nucí. Acids Res., 12:387-395 (1984). Y, sin la experimentación indebida, la persona experta puede consultar con muchos otros programas o referencias para determinar el por ciento de homología.
La invención se relaciona a la mutación de las secuencias de nucleótidos o genes que codifican polipéptidos o proteínas que tienen la misma función biológica. La similitud de función puede ser analizada o identificada o determinada o revisada por la conservación de sitios activos. Esto se puede hacer mediante una búsqueda de NCBI DART (Domairi Archxtecture Retrieval Tool) . La presente invención así proporciona mutantes atenuados de una bacteria como es descrito en la presente, que comprende una mutación atenuante como es definido en. la presente . Los mutantes de bacterias gram negativas atenuadas incluyen una mutación, en donde todo o parte de por lo menos un gen específico o secuencia de ácido nucleico está mutada como es discutido en la presente. El gen específico o secuencia de ácido nucleico incluye aquellos que comprenden, u homólogos a (por ejemplo, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%,' 95% 96%,. 97%, 98% o 99% homólogo a), secuencia SEQ ID NO: 2, 6, 9, 12, 16, 19, 22, 25, 28, 31, 34, 37, 40, 43, 46, 49, 52, 55, 58, 61, 64, 67, 70, 75, 78, 81, 84, 87, 90 o 93, o sus regiones reguladoras. Ventajosamente, el gen específico o secuencia de ácido nucleico incluye aquellas que comprenden, u homólogo a, la secuencia SEQ ID NO: 2, 6, 9, 12, 25, 31, 37, 40, 43, 46, 70, 75, 78, 81, 84, 87, 90 o 93, o sus regiones reguladoras. Más ventajosamente, el gen específico o secuencia de ácido nucleico incluye aquellas que comprenden, u homologas a, la secuencia SEQ ID NO: 6, 12, 25, 31, 37, 40, 46, 70, 75, 84, 87, 90 o 93, o sus regiones reguladoras. Y aun más ventajosamente, el gen especifico o secuencia de ácido nucleico incluye aquellos que comprenden, u homólogo a, la secuencia SEQ ID NO: 37, 40, 75, 90 o 93, o sus secuencias de nucleótidos homologas. De preferencia el mutante es una Pasteurella , tal como P. multocida, por ejemplo P-1059 o PM70. Las mutaciones pueden ser introducidas en el microorganismo usando cualquier técnica conocida, tal, como por ejemplo, la tecnología de DNA recombinante, con el fin de introducir una mutación bien definida en el gen o secuencia de ácido nucleico seleccionada (mutagénesis dirigida) . Tal mutación puede ser una inserción de la secuencia de ácido nucleico homologa o heteróloga, una supresión, un reemplazo, por ejemplo un reemplazo de por lo menos un nucleótido por otro o una combinación de los mismos. - En una modalidad, la mutación es una mutación de supresión, donde la interrupción del gen o la secuencia de ácido nucleico es ocasionada por la supresión de parte, y ventajosamente por la supresión de la secuencia de ácido nucleico o gen completo. La supresión de los ácidos nucleicos evita la reversión a la patogenicidad. En otra modalidad, la mutación es una inserción en un sitio que corresponde a los sitios de inserción de transposón descritos en la presente, por ejemplo, en los ejemplos. Estos sitios, con referencia a la cepa P-1059, ventajosamente están ubicados inmediatamente en el extremo 5' de las secuencias 1, 8, 11, 14, 15, 27, 33, 42, 54, 57, 66, 72, 73, 77, 80, 95 y 97, e inmediatamente en el extremo 3' de las secuencias 4, 5, 18, 21, 24, 30, 36, 39, 45, 48, 51, 60, 63, 69, 83, 86, 89 y 96. Estos sitios también están ubicados en la cepa P 70 entre: los nucleótidos 180-181 o 182-183 o 190-191 en la SEQ ID NO: 2, 77-78 o 1026-1027 o 1027-1028 en la SEQ ID NO: 6, 416-417 en la SEQ ID NO: 9, 389-390 en la SEQ ID NO: 12, 381-382 en la SEQ ID NO: 16, 219-220 en la SEQ ID NO: 19, 1353-1354 en la SEQ ID NO: 22, 136-137 en la SEQ ID NO: 25, 384-385 en la SEQ ID NO: 28, 222-223 o 225-226 en la SEQ ID NO: 31, 217-218 en la SEQ ID NO: 34, 1411-1412 en la SEQ ID NO: 37, 943-944 en la SEQ ID NO: 40, 855-856 en la SEQ ID NO: 43, 369-370 en la SEQ ID NO: 46, 111-112 en la SÉQ ID NO:. 49, 443-444 en la SEQ ID NO: 52, 4-5 en la SEQ ID NO: 55, 573-574 én la SEQ ID NO: ¦ 61, 875-876 en la SEQ ID NO: 64, 218-219 en la SEQ ID NO: 70, 1072-1087 en la SEQ ID NO: 75, 64-65 en la SEQ ID NO: 78, 282-283 en la SEQ ID NO: 81, 1431-1432 en la SEQ ID NO: 84, 974-975 en la SEQ ID NO: 87, 802-803 en la SEQ ID NO: . 90, 850-851 en la SEQ ID NO: 92; o inmediatamente corriente arriba del nucleótido 1 en la SEQ ID NO: 58; o inmediatamente corriente arriba del nucleótido 1 y la SEQ. ID NO: 67. Estos sitios también son aquellos ubicados entre pares similares de nucleótidos (que se mencionan para PM70) en las secuencias de nucleótidos de otra bacteria gram negativa, tal como un miembro de la familia Pasteurellacaea , por ejemplo, P. multocida, P. haemolytica , P. anatipestifer, A. pleuropneumoniae, que codifica una secuencia de aminoácidos homologa, como es definido en la presente con su porcentaje de identidad. Asi, los mutantes pueden ser bacteria gram negativa y son ventajosamente una Pasteurella , tal como P. multocida, P. haemolytica, P. anatipestifer, A. Pleuropneumoniae, por ejemplo una P. multocida , tal como P-1059 o PM70. Por definición, los mutantes de supresión comprenden por lo menos una supresión de, o en una secuencia de nucleótidos de acuerdo con la invención. Estos mutantes de supresión incluyen aquellos en donde todo o parte de una secuencia de gen especifica o secuencia de nucleótidos especifica es suprimida. En un aspecto, la mutación resulta en la supresión de por lo menos un ácido nucleico, de por lo menos 10%, por lo menos aproximadamente 20%, por lo menos aproximadamente 30%, por lo menos aproximadamente 40%, por lo menos aproximadamente 50%, por lo menos aproximadamente 60%, por lo menos aproximadamente 70%, por lo menos aproximadamente 80%, por lo menos aproximadamente 90%, por lo menos aproximadamente 95%, por lo menos aproximadamente 98%, o por lo menos aproximadamente 99% del gen o secuencia de nucleótidos especifica. De preferencia, el gen completo o la secuencia de nucleótidos especifica es suprimida. Los mutantes pueden comprender más de una mutación, que puede resultar en grados aditivos o sinergisticos de atenuación, y puede resultar en una mejor prevención de la reversión de la atenuación. Estas mutaciones múltiples pueden asociar la(s) mutación (es) en secuencias de nucleótidos o genes conocidos por sus propiedades atenuantes tales como los genes aro, por ejemplo aroA (Homchampa P. y colaboradores, Veterinary Microbiology, 1994, 42:35-44) , y mutaciones a secuencias de nucleótidos o genes de acuerdo con la invención. En una modalidad, los mutantes incluyen por lo menos dos mutaciones, en donde para cada mutación todo o parte de un gen especifico o secuencia de ácido nucleico es mutada como es discutido en la presente. Los genes específicos o secuencias de ácido nucleico incluyen aquellos que comprende, u homólogos a, las secuencias SEQ ID NO: 2, 6, 9, 12, 16, 19, 22, 25, 28, 31, 34, 37,· 40, 43, 46, 49, 52, 55, 58, 61, 64, 67, 70, 75, 78, 81,. 84, 87, 90 o 93, o sus regiones reguladoras. Así, los mutantes que tienen dos o más de las secuencias anteriores mutadas, por ejemplo, suprimidas como es discutido en la presente, son contemplados por la invención. De manera ventajosa, los mutantes que tienen dos o más de las siguientes secuencias o secuencias que comprenden, u homólogas a, las siguientes secuencias mutadas, por ejemplo, suprimidas como es discutido en la presente: SEQ ID NO: 2, 6, 9, 12, 25, 31, 37, 40, 43, 46, 70, 75, 78, 81, 84, 87, 90 o 93, o sus regiones reguladoras. Más ventajosamente los genes específicos o secuencias de ácido nucleico que son mutados (por ejemplo, los dos o más que son mutados) incluyen aquellos que comprenden, u. homólogos a, las secuencias SEQ ID NO: 6, 12, 25, 31, 37, 40, 46, 70, 75, 84, 87, 90 o 93, o sus regiones reguladoras. El mutante puede ser una bacteria gram negativa, y ventajosamente el mutante es una Pasteurella , tal como una P. multocida , por ejemplo P-1059 o. PM70. De manera ventajosa los mutantes que tienen dos o más de las siguientes secuencias, o sus regiones reguladoras, mutadas, por ejemplo, suprimidas como es discutido en la presente, se contemplan por la invención: SEQ ID NO: 37, 40, 75, 90 y 93, o sus secuencias de nucleótidos homólogas. Varias modalidades incluyen mutantes que tienen supresiones de o en los genes o secuencias de ácido nucleico que comprenden, u homólogos a, las secuencias SEQ ID NO: 37 y 40; SEQ ID NO: 37 y 75; SEQ ID NO: 37 y 90; SEQ ID NO: 37 "y 93; SEQ ID NO: 40 y 75; SEQ ID NO: 40 y 90; SEQ ID NO: 40 y 93; SEQ ID NO: 75 y 90; SEQ ID NO: 75 y 93; SEQ ID NO: 90 y 93, o sus regiones reguladoras. El mutante puede ser una bacteria gram negativa y ventajosamente el mutante es una Pasteurella , tal como una P. multocida, por ejemplo P-1059 o PM70. Los métodos para introducir las mutaciones en las regiones genómicas especificas son conocidos y serán evidentes para la persona experta a partir de esta descripción y conocimiento en la técnica. Por ejemplo, el gen o secuencia completa a ser mutada o un fragmento es clonado en un vector y modificado con el fin de suprimir su actividad de expresión y/o su actividad biológica. El vector es introducido en al bacteria, por ejemplo, mediante la electroporación (por ejemplo, Jablonski L. y colaboradores, Microbial Pathogenesis , 1992, 12, 63-68), o mediante conjugación (Lee M. D. y colaboradores, Vet . Microbiol., 1996, 50, 143-148). El fragmento de DNA modificado es reintroducir en el genoma bacteriano mediante recombinación genética, ventajosamente mediante recombinación homologa entre el cromosoma bacteriano y el vector. Como un ejemplo, el vector puede ser un plásmido suicida como es descrito en Cárdenas (Cárdenas M y colaboradores, Vet. Microbiol 2001 Mayo 3; 80 ( 1 ): 53-61 ) . Ventajosamente este vector adicionalmente comprende, entre los dos brazos flanqueantes o regiones (empleados en la recombinación homologa) una secuencia de polidetención (por ejemplo, 6 codones de detención, uno en cada estructura de lectura) para bloquear cualquier posible traducción. El microorganismo atenuado de la invención, por ejemplo bacteria gram negativa tal como P. multocida, además puede comprender por lo menos una secuencia de ácido nucleico homologa u heterologa insertada en su genoma. Esto es útil para reproducir o replicar moléculas de ácido nucleico heterólogas y/o para la expresión de moléculas de ácido nucleico heterólogas, ya sea in vivo o in vitro. La secuencia de ácido nucleico heterologa ventajosamente codifica para una inmunógeno, antigeno o epitope ' a partir de un agente patogénico, viral, parasítico o bacteriano que es diferente de aquellos naturalmente expresados por el microorganismo atenuado. Esta secuencia heterologa puede codificar un inmunógeno, antígeno o epitope a partir de otra cepa del microorganismo o bacteria, por ejemplo, otra cepa de P. multocida . Un inmunógeno o antígeno es una proteína o polipéptido capaz de inducir una respuesta inmune contra el agente patogénico o un antígeno secretado del agente patogénico, y contiene uno o más epítopes; y el epitope es un péptido o polipéptido que es capaz de inducir una respuesta inmune contra el agente patogénico o un antígeno secretado del agente patogénico. Las secuencias de ácido nucleico heterólogas que son adecuadas para este uso en tal vector serán evidentes para la persona experta (Fedorova ND y Highlander SK, Infect Immun 1997, 65 (7):2593-8) e incluyen por ejemplo aquellas que provienen de los miembros de la familia Pasteurellaceae (notablemente Pasteurella multocida , Pasteurella haemolytica , Pasteurella anatipestifer, Actinobacillus pleuropneumoniae) , o de la bacteria similar a E. coli, Salmonella , Campylobac er. La secuencia heteróloga venta osamente se inserta para ser expresada por el microorganismo en el huésped cuando se administra con el fin de desarrollar una respuesta inmune contra tanto el microorganismo atenuado, como el inmunógeno expresado. La secuencia heteróloga venta osamente se inserta con o se enlaza operablemente a o corriente abajo de los elementos reguladores permitiendo su expresión, tal como un promotor. También se pueden adicionar secuencias de nucleótidos útiles para la dirección y la secreción de la proteina. Por consiguiente, las secuencias guias o de señal pueden ser incluidas en productos expresados para facilitar el transporte a través de la pared celular y/o secreción. En una modalidad la secuencia homologa o heteróloga se inserta dentro de la secuencia de nucleótido seleccionada o el gen seleccionado usado para la atenuación; ventajosamente la secuencia homologa o heteróloga se inserta en uno de los sitios correspondientes al sitio de inserción de transposón identificado en la presente. Para mejorar la expresión, la utilización de codón puede ser adaptada al vector bacteriano utilizado. Los mutantes atenuados de la invención también pueden comprender una secuencia de ácido nucleico que codifica una proteina terapéutica, una alérgeno, un factor de crecimiento o una citoquiná o un inmunomodulador o inmunoestimulador tal como GM-CSF, por ejemplo un gen GM-CSF correspondiente a la especie objetivo (por ejemplo, si el vector atenuado es P. multocida , para la administración a animales bovinos, GM-CSF de bovino podría ser expresado por el vector, por ejemplo con la expresión mediante el vector de otra proteína heteróloga, péptido, polipéptido, antígeno, inmunógeno o epítope) . De acuerdo con un aspecto adicional de la invención los microorganismos atenuados se utilizan para producir composiciones inmunogénicas atenuadas vivas o composiciones de vacuna atenuadas vivas. De acuerdo con un aspecto ventajoso de la invención, el microorganismo atenuado es una bacteria gram negativa, tal como Pasteurella , por ejemplo, una P. multocida , por ejemplo P-1059 o PM70, mutada de acuerdo con la invención. Ventajosamente como es descrito en la presente, el microorganismo puede actuar como un vector recombinante para inmunizar y/o vacunar animales o humanos contra infecciones ocasionadas por otros patógenos diferentes de la Pasteurella. Las composiciones inmunogénicas o las composiciones de vacuna comprenden el mutante atenuado y un portador, excipiente, diluyente o vehículo farmacéuticamente o veterinariamente aceptable, y opcionalmente un estabilizador y/o un adyuvante. El mutante atenuado puede ser un vector que adicionaimente expresa moléculas de ácido nucleico heterólogas al vector, tal como un epítope heterólogo, antígeno, inmunógeno y/o factor de crecimiento, citoquina, inmunoregulador e inmunoestimulador . El término de "composición inmunogénica" cubre en la presente cualquier composición capaz de, una vez que se ha inyectado a los animales o a un humano de inducir una respuesta inmune contra el patógeno dirigido. El término de "composición de vacuna" o "vacuna" cubre en la presente cualquier composición capaz, una vez que se ha inyectado a los animales o un humano de inducir una respuesta inmune protectora contra el patógeno, dirigido. El vehículo farmacéuticamente o veterinariamente aceptable puede ser agua o solución salina, peró también puede comprender, por ejemplo, medio de cultivo bacteriano. La bacteria atenuada viva de acuerdo con la invención puede ser deshidratada por congelación ventajosamente con un estabilizador. La deshidratación por congelación se puede hacer de acuerdo con los procedimientos de deshidratación por congelación estándares bien conocidos. Los estabilizadores farmacéuticamente o veterinariamente aceptables pueden ser carbohidratos (por ejemplo, sorbitol, manitol, lactosa, sacarosa, glucosa, dextrano, trehalosa) , glutamato de sodio (Tsvetkov T y colaboradores, Cryobiology 1983, 20 (3) : 318-23; Israeli E y colaboradores, Cryobiology 1993, 30 (5) : 513-23) , proteínas tales como peptona, albúmina, lactalbúmina o caseína, agentes que contienen proteínas tal como la leche- descremada (Mills C y colaboradores, Cryobiology 1988, 25 (2 ): 148-52 ; Wolff E y colaboradores, Cryobiology 1990, 27 (5) : 569-75) , y soluciones reguladoras (por ejemplo, solución reguladora de fosfato, solución reguladora de fosfato de metal alcalino) . Se puede utilizar un adyuvante para hacer solubles las preparaciones deshidratadas por congelación. Ejemplos de adyuvantes son emulsiones de aceite en agua, o agua en aceite en agua, basadas en aceite mineral y/o aceite vegetal y agentes tensoactivos no iónicos tales como copolímeros de bloque, Tween®, Span®. Otros adyuvantes adecuados son por ejemplo la vitamina E, saponinas y Carbopol®, hidróxido de aluminio o fosfato de ' aluminio ("Vaccine Desing, The subunit and adjuvant approach", Pharmaceutical Biótechnology, vol. 6, Edited by Michael F. Powell and Mark J. Newman, 1995, Planum Press New York). La bacteria atenuada viva puede ser almacenada a -70°C en un medio que contiene glicerol. Opcionalmente, la composición inmunogénica o vacuna puede ser combinada con uno o más inmunógenos, antígenos o epitopes seleccionados de otros microorganismos patogénicos o virus en una forma inactivada o viva. Otro aspecto de la invención es las secuencias de nucleótidos o genes de acuerdo con la invención, tales como las secuencias de' nucleótidos o genes de acuerdo con la invención designadas SEQ ID NO: 2, 6, 9, 12, 16, 19, 22, 25, 28, 31, 34, 37, 40, 43, 46, 49, 52, 55, 58, 61, 64, 67, 70, 75, 78, 81, 84, 87, 90 y 93, y ventajosamente aquellas designadas SEQ ID NO: 1, 4, 5, 8, 11, 14, 15, 18, 21, 24, 27, 30, 33, 36, 39, 42, 45, 48, 51, 54, 57, 60, 63, 66, 69, 72, 73, 77, 80, 83, 86, 89, 92, 95, 96, 97. Otro aspecto de la invención es el uso de las secuencias de nucleótidos o genes de acuerdo con la invención, para la expresión y la producción de péptidos, polipéptidos o proteínas, o más generalmente productos de expresión, por ejemplo, inmunógenos, antígenos o epítopés. En una modalidad, los polipéptidos o péptidos o proteínas codificadas por estas secuencias de nucleótidos o genes se pueden usar como inmunógenos o antígenos o epitopes subunitarios en composiciones inmunogénicas o vacunas. Los procedimientos de determinación de epítope, tales como, la generación de bibliotecas de péptido sobrepuestas (Hemmer B. y colaboradores, Immunology Today, 1998, 19 (4), 163-168), Pepscan (Geysen H. M. y colaboradores, Proc. Nat . Acad. Sci. USA, 1984, 81 (13), 3998-4002; Geysen H. M. y colaboradores, Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 1985, 82 (1), 178-182; Van der Zee R. y colaboradores, Eur. J. Immunol., 1989, 19 (1), 43-47; Geysen H. M. , Southeast Asían J. Trop. Med. Public Health, 1990, 21 (4), 523-533; Multipin® Peptide Synthesis Kits de Chiron) y algoritmos (De Groot A. y colaboradores, Nature Biotechnology, 1999, 17, 533-561), se puede utilizar en la práctica de la invención, sin experimentación indebida. Los polipéptidos ventajosos son aquellos que tienen las secuencias de aminoácidos identificadas como SEQ ID NO: 3, 7, 10, 13, 17, 20, 23, 26, 29, 32, 35, 38, 41, 44, 47, 50, 53, 56, 59, 62, 65, 68, 71, 76, 79, 82, 85, 88, 91, 94 o aquellas codificadas por las secuencias de nucleótidos SEQ ID NO: 2, 6, 9, 12, 16, 19, 22, 25, 28, 31, 34, 37, 40, 43, 46, 49, 52, 55, 58, 61, 64, 67, 70, 75, 78, 81, 84, 87, 90, 93. Los epitopes de estos polipéptidos también se pueden utilizar venta osamente. La invención comprende los polipéptidos equivalentes de otra bacteria, tal como una bacteria gram negativa, ventajosamente un miembro ~ de la familia Pasteurellacaea, por ejemplo P. multocida, P. haemolytica , P. anatipestifer, A. pleuropneumoniae, y más ventajosamente en el genoma de cualquiera de las diversas cepas de P. multocida asi son incluidos por polipéptidos de equivalencia cuya secuencias de aminoácidos tienen por lo menos aproximadamente 70%, por lo menos aproximadamente 75%, por lo menos aproximadamente 80%, por lo menos aproximadamente 85%, por lo menos aproximadamente 90%, por lo menos aproximadamente 95%, y por lo menos aproximadamente 96., 97, 98 o 99% de identidad a una de las secuencias de aminoácidos identificadas como SEQ ID NO: 3, 7, 10, 13, 17, 20, 23, 26, 29, 32, 35, 38, 41, 44, 47, 50, 53, 56, 59, 62, 65, 68, 71, 76, 79, 82, 85, 88, 91, 94 y/o polipéptidos que tienen la misma función (es) biológica que los polipéptidos identificados en lo anterior con la SEQ. Los criterios para establecer la identidad o la misma función biológica se han descrito en lo anterior. La invención también comprende los fragmentos inmunogénicos de estos polipéptidos, que tienen por lo menos una cadena de 10 aminoácidos del polipéptido, por lo menos 20, tal como por lo menos 30, ventajosamente por lo menos 50 y más ventajosamente por lo menos 70, por ejemplo, fragmentos de los polipéptidos que contienen por lo menos 10 aminoácidos del polipéptido, ventajosamente por lo menos 20 aminoácidos contiguos del polipéptido, tal como por lo menos 30 y más ventajosamente por lo menos 50 aminoácidos contiguos · del polipéptido, y aun más ventajosamente por lo menos 70 aminoácidos contiguos del polipéptido. Por supuesto, un fragmento es menor que el polipéptido completo. Un fragmento puede ser combinado con otros polipéptidos, por ejemplo, en polipéptidos de fusión; por ejemplo, un polipéptido de la invención o fragmento del mismo puede ser una porción de un polipéptido de fusión que incluye otra porción (otro polipéptido) , por ejemplo, una porción incrementadora de inmunogenicidad y/o una porción incrementadora de secreción tal como una porción de lipoproteina que incrementa la inmunogenicidad o una porción de secuencia de señal o de guia. Por consiguiente, la invención contempla la expresión de polipéptidos , proteínas, antígenos, inmunógenos o epítopes - ya sea secuencias identificadas en la presente o fragmentos de las mismas o aquellos que son heterologos a los vectores de la invención - como fusiones, por ejemplo, como una porción de un polipéptido de fusión, por ejemplo, un polipéptido de fusión que ventajosamente incluye una porción incrementadora de inmunogenicidad tal como una porción de lipoproteina y/o una porción incrementadora de secreción tal como una porción de secuencia de señal o de guía. Los polipéptidos o fragmentos se producen ventajosamente mediante la expresión in vitro. Las secuencias de nucleótidos de acuerdo con la invención (por ejemplo SEQ ID NO: 2, 6, 9, 12, 16, 19, 22, 25, 28, 31, 34, 37, 40, 43, 4.6 , 49 , 52 , 55 , 5.8 , 61, 64 , 67 , 70 , 75 , 78 , 81, 84 , 87 , 90, 93) o fragmentos de las mismas son insertadas en un vector, operablemente enlazado a elementos reguladores tal como promotor, región de enlace de ribosoma y terminador, y codón de inicio y codón de detención. Los vectores ventajosos son plásmidos útiles para la expresión in vitro en bacterias es decir Escherichia coli (Mahona F y colaboradores, Biochimie 1994, 46(1):9-14; Watt M A y colaboradores, Cell Stress Chaperones 1997 , 2 ( 3 ) : 180-90 ; Frey J Res. Microbiol. 1992, 143 (3) :263-9) . Estos polipéptidos también se pueden sintetizar químicamente (Luo Y y colaboradores, Vaccine 1999, 17 (7-8) ¿821-31) . Un aspecto de la invención de esta manera es una composición inmunogénica o vacuna que comprende por lo menos un polipéptido o fragmento de acuerdo con la invención (composición inmunogénica sub-unitaria o vacuna) o por lo menos un vector de expresión in vivo como es descrito en la presente (composición inmunogénica recombinante viva o vacuna) y un portador, excipiente, diluyente o vehículo farmacéuticamente o veterinariamente aceptable, y opcionalmente un adyuvante. Ejemplos de tales ingredientes se han descrito en la presente con relación a la vacuna viva. En otra modalidad, estas secuencias de nucleótidos o sus fragmentos pueden ser insertadas en vectores recombinantes para producir composiciones inmunogénicas recombinantes vivas o vacunas capaces de expresar in vivo en el huésped el polipéptido codificado por esta secuencia o fragmento de nucleótidos. El vector de expresión in vivo puede ser un vector de polinucleótido o plásmido (EP- A2-1001025; Chaudhuri P Res. Vet. Sci. 2001, 70(3), 255-6), virus (por ejemplo adenovirus, poxvirus tal como fowlpox (US-A-5, 174 , 993 US-A-5, 505, 941 y US-A-5, 766, 599) o canarypox (US-A-5, 756, 103) ) o bacterias es decir Escherichia coli o Salmonella sp. Los polipéptidos y fragmentos de la invención también se pueden utilizar en terapia. Los polipéptidos y fragmentos también se pueden utilizar como reactivo? ·.· ¿en las reacciones de ánticuerpo-antigeno. Por consiguiente, otro aspecto de la invención de esta manera es un método de diagnóstico y/o kit para detectar la infección por la bacteria gram negativa. Los. kits, por ejemplo, ELISA, pueden incluir por lo menos un polipéptido o fragmento de acuerdo con la invención (por ejemplo, por lo menos un polipéptido identificado por la secuencia en la presente o un fragmento del mismo como es discutido en la presente) . Los anticuerpos contra los polipéptidos o fragmentos en la presente (por ejemplo, polipéptidos identificados por la secuencia en la presente o fragmentos de los mismos como se discute en la presente) se pueden utilizar como un reactivo de diagnóstico o en la inmunización o vacunación pasiva o en terapia. Las cantidades de anticuerpo administradas en inmunización pasiva pueden ser las mismas o análogas a las cantidades usadas en la técnica, tal que a partir del conocimiento en la técnica, la persona experta puede practicar la inmunización pasiva sin experimentación indebida . Otro aspecto de la invención es una preparación de anticuerpo que comprende un anticuerpo especifico a un polipéptido o un fragmento de acuerdo con la invención y métodos de diagnosis usando los mismos. Con respecto a un anticuerpo especifico a un polipéptido, se propone que el anticuerpo enlaza preferencial^ente al polipéptido, por ejemplo, el anticuerpo enlaza al polipéptido y no a otros polipéptidos o tiene una especificidad al polipéptido que es aceptablemente -particular al polipéptido de tal manera que el anticuerpo se puede usar para aislar el polipéptido de una muestra o detectar su presencia en una muestra con no más 5% de resultados positivos falsos, usando técnicas conocidas en el arte o discutidas en los documentos citados en la presente, incluyendo Sambrook, infra. Los anticuerpos pueden ser policlonales o monoclonales. Los métodos para producir anticuerpos son bien conocidos para la persona experta. Si se desean anticuerpos policlonales, un animal seleccionado (por ejemplo ratón, conejo, cabra, caballo, etc.) se inmuniza con un polipéptido o un fragmento. El suero del animal inmunizado es colectado y tratado de acuerdo con los procedimientos conocidos y posiblemente purificado. Ver, por ejemplo Jurgens y colaboradores, J. Chrom. , 1985, 348:363-370. La metodología general para hacer anticuerpos monoclonales al usar la tecnología de hibridoma es bien conocida. Las' líneas de células que producen anticuerpo inmortal pueden ser creadas mediante la fusión celular, y también mediante otras técnicas tal como la transformación directa de linfocitos B con DNA oncogénico, o la transfección con el virus Epstein-Barr virus. Ver, por ejemplo J. E. Liddell "A practical guide to monoclonal antibodies" ed. John Wiley y sons, 1991, p. 188; S. J. de StGroth y colaboradores, J. Immunol. Methods, 1980, 35 (1-2) 1-21. Las secuencias de nucleótidos de acuerdo con la invención y sus fragmentos se pueden utilizar como una sonda para hibridación, por ejemplo en un método de diagnóstico . Las condiciones de hibridación severas son utilizadas ventaj osaménte . Se puede referir a aquellas descritas por Sambrook y colaboradores, - Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press ¦(1989), 1.101-1.104. La hibridación bajo condiciones severas significa que una señal de hibridación positiva es todavía observada después del lavado .durante 1 hora con 1 x SSC de solución de reguladora SDS al 0.1% a 55°C, ventajosamente a 62°C y más ventajosamente a 68°C, por ejemplo, durante 1 hora en 0.2 x SSC de solución reguladora y SDS al 0.1% a 55°Cr tal como a 62°C y ventajosamente a 68°C. También se pueden caracterizar secuencias de nucleótidos por su habilidad para el enlace bajo condiciones de hibridación severas. Asi, la invención puede contemplar en la presente secuencias de ácido nucleico identificadas y moléculas de ácido nucleico que enlazan a las mismas bajo condiciones de hibridación severas. Las secuencias de nucleótidos de acuerdo con la invención y sus fragmentos pueden ser utilizadas como cebadores para PCR o en un método similar que implica la amplificación y/o hibridación, por ejemplo, para la detección de la bacteria gram negativa en cualquier medio, por ejemplo muestras de tejido, fluidos biológicos, agua, alimento. Ventajosamente se hace uso de los fragmentos de la secuencia de nucleótidos que tienen por lo menos 20 contiguos, tal como por lo menos 30 contiguos, por ejemplo, por lo menos 50 contiguos, por ejemplo por lo menos 70 contiguos o más ventajosamente por lo menos 100 ácidos nucleicos contiguos de las secuencias de nucleótidos o genes de acuerdo con la invención, por ejemplo, de SEQ ID NO: 2, 6, 9, 12, 16, 19, 22, 25, 28, 31, 34, 37, 40, 43, 46, 49, 52, 55, 58, 61, 64, 67, 70, 75, 78, 81, 84, 87, 90, 93. Además, la presente invención se relaciona a métodos para inmunizar contra o prevenir la infección bacteriana o proteger contra la infección bacteriana en animales, ventajosamente animales susceptibles a las mismas, tales como aves, conejo, animales bovinos y especies porcinas, y más venta osamente en especies de aves tales como pollo, pavo y paLos (incluyendo reproductores, pollos tiernos y gallinas ponedoras) o en un humano. De acuerdo con estos métodos, se administran (1) una composición inmunogénica atenuada viva o vacuna de la invención o (2) una composición inmunogénica sub-unitaria o vacuna de la invención o (3) una composición inmunogénica recombinante viva o vacuna de la invención, o combinaciones de los mismos. Por supuesto, se pueden emplear modalidades de la invención con otras vacunas o composiciones inmunogénicas que no son de la invención, por ejemplo, en procesos de cebado-refuerzo, tal como donde una vacuna o composición inmunogénica de la invención es administrada primero y una vacuna o composición inmunogénica diferente es. administrada después o viceversa. La administración se puede hacer notablemente mediante inyección intramuscular (IM), intradérmica (ID) o subcutánea (SC) o por la via de la administración intranasal, intratraqueal u oral. La composición inmunogénica o la vacuna de acuerdo con la invención ventajosamente se administra mediante jeringa, aparatos sin agujas (similar a por ejemplo Pigjet, Avijet, Dermojet o Biojector (Bioject, Oregon, EUA) ) , rocío, agua para beber, gotas para los o os . Las administraciones ventajosas para la composición inmunogénica atenuada viva o vacuna están en in ovo, por la vía de las rutas orales (por ejemplo agua para beber, rocío del cuerpo completo) , ocular (por ejemplo gotas para los ojos, rocío del cuerpo completo), traqueal (por ejemplo rocío) , intradérmica, subcutáneas (SC) o intramuscular (IM) . La cantidad de microorganismos atenuados vivos puede ser determinada y optimizada por la persona experta, sin experimentación indebida a partir de esta descripción y el conocimiento en . la técnica. Generalmente un animal (incluyendo un humano) se le puede administrar aproximadamente 104-109 CFUs, ventajosamente de manera aproximadamente 105-108 CFUs y más ventajosamente de manera aproximadamente 106-107 CFUs en una sola unidad de dosificación. Por medio de la ruta intramuscular a un ave se le puede administrar aproximadamente 104-107 CFUs, ventajosamente de manera aproximadamente 105-106 CFUs en una sola unidad de dosificación. El volumen de una sola unidad de dosificación puede estar entre aproximadamente 0.2 mi y aproximadamente 0.5 mi y ventajosamente de manera aproximadamente 0.3 mi. Por la ruta oral, traqueal o ocular a un ave se le puede administrar aproximadamente 105-108 CFUs, venta osamente de manera aproximadamente 106-107 CPUS en una sola unidad de dosificación. Para la administración por roció el volumen se ajusta al aparato y tamaño de gotita, de aproximadamente 30 a aproximadamente 600 mi para aproximadamente 1000 animales y ventajosamente de manera aproximadamente 0.2 mi por animal. Para animales bovinos y porcinos, ' las rutas ventajosas son I y SC. Al animal se le puede administrar aproximadamente 104-109 CFUs, ventajosamente de manera aproximadamente 105-108 CFUS en una sola unidad de dosificación. El volumen de una sola unidad de dosificación puede estar entre aproximadamente .0.2 mi y aproximadamente 5.0 mi y ventajosamente entre aproximadamente 0.5 mi ynd aproximadamente 2.0 mi y más ventajosamente aproximadamente 1.0 mi. A los conejos se les puede administrar por la vía de la ruta IM o SC aproximadamente 10 -108 · CFUs, ventajosamente de manera aproximadamente 105-107 CFUs en una sola unidad de dosificación. El volumen de una sola unidad de dosificación puede estar entre aproximadamente 0.2 mi y aproximadamente 0.5 mi y ventajosamente de manera aproximadamente 0.5 mi. A ellos también se les puede administrar por la vía de la ruta ID aproximadamente 104-108 CFUS, ventajosamente de manera aproximadamente 105-107 CFUs en una sola unidad de dosificación. El volumen de una sola unidad de dosificación puede estar entre aproximadamente 0.1 mi y aproximadamente 0.2 mi. La invención ahora será descrita adicionalmente por medio de los siguientes ejemplos no limitativos. EJEMPLOS Ejemplo 1 : Construcción de una biblioteca de mutantes de transposón de P. multocida. etiquetados con rúbrica (clasificación de STM) Construcción de los transformantes pLOF/km de SMIO pir etiquetados Las etiquetas o marcas produjeron como es descrito en Hensel y colaboradores, (Science, 1995, 269:400-403). Inicialmente se seleccionaron plásmidos pUTminiTn5Km2 etiquetados que contienen etiquetas que se hibridan bien pero no se hibridan cruzadamente entre sí. El transposón mini-Tn5 en el vector pü miniTn5Km2 etiquetado se encontró que no se transpone en varias cepas de Pasteurella multocida. En "contraste el transposón mini-TnlO se ha mostrado que funciona en P. multocida (Lee y colaboradores, Vet Microbiol, 1996, 50:143-8). Las etiquetas preseleccionadas por lo tanto se transfirieron de los vectores püTminiTn5 al plásmido pLOF/Km que contiene mini-T10 (Herrero y colaboradores, J. Bacteriology, 1990, 172:6557-6567). Las etiquetas se amplificaron mediante PCR usando cebadores que enlazan al vector pUTminiTn5 m2, en cualquier sitio del Kpnl en- el cual se clonaron la etiquetas. Estos cebadores incluyeron secuencias para la enzima de restricción Salí. Los productos de PCR luego se digirieron con Salí y se clonaron en el sitio Salí de una versión modificada del vector pLOF/Km, en el cual un sitio de Salí ha reemplazado el único sitio de clonación Sfil. Los plásmidos pLOF/Km etiquetados luego se transformaron en la cepa S IO pir de E. coli (Kmr, thi, thr, leu, tonA, lacY, supE, recA: : RP4-2-Tc: :Mu pir) (Miller V. L. y colaboradores, J. Bacteriol., 1988, 170:2575-83). Esta cepa puede movilizar los plásmidos tal como pLOF/Km en la bacteria recipiente mediante conjugación. Métodos de selección y contra-selección El proceso de conjugación requiere un método de selección para la P. multocida recipiente, que ha adquirido el plásmido pLOF/Km y un método de contra-selección contra el donador SMlC^pir de E. coli. „' En el método de selección, se seleccionan el P. multocida recipiente al utilizar canamicina, que es codificada por el transposón mini-TnlO. · Inicialmente, para la contra-selección contra el donador de E. coli en conjugaciones, se utilizó un mutante espontáneamente resistente a la estreptomicina de la cepa p- 1059 de Pasteurella. Sin embargo, se presentó que esta cepa fue atenuada en virulencia para pavos y asi no fue utilizable en la presente. Las cepas de Pasteurella multocida pueden crecer en un medio químicamente definido (CDM) (Hu y colaboradores, Infection and Immunity 1986, 804-810) . Una versión modificada de este medio químicamente definido que contiene agar pero que no contiene leucina sé utilizó para permitir la contra-selección contra el donador de E. coli. La cepa de Pasteurella fue capaz de crecer en este medio, la composición de la cual se da en la tabla 1, mientras que la cepa 3?10 ??t de E. coli, que es un auxótrofo de leucina no lo hizo. Tabla 1 Componente Concentración g/litro Agar Noble 20 Na2HP04.12H20 32.31 KH2P04 1.368 NaCl 1.196 Glucosa 6.0 Clorhidrato de L-arginina 0.24 Clorhidrato de L-cisteina 0.12 L-serin'a 0.2 Ácido L-glutámico 0.15 L-isoleucina 0.064 L-fenilalanina 0.095 Ácido L-aspártico 1.6 L-tirosina 0.08 Clorhidrato de tiamina 0.0002 MgSO4.7H20 0.246 Pantotenato de calcio 0.004 Nicotinamida 0.01 Ácido orótico 0.003 Pasaje de la cepa de P. multocida sobre el medio CDM Una ampolleta liofilizada de la cepa P. multocida (USDA P-1059, disponible de la Colección Americana de Cultivos Tipo, número de acceso ATCC 15742) se revivió mediante la adición de 200 µ? de BHI (infusión de cerebro-corazón) y una alícuota de la suspensión se extendió en rayas sobre una placa de agar BHI y la placa se incubó a 37 °C durante la noche. El material de la colonia de esta placa se utilizó para inocular un cultivo de caldo BHI, que se incubó con agitación a 37 °C durante la noche. Se adicionó glicerol a una concentración final de 15% v/v y las alícuotas se almacenaron congeladas a -80°C. Una muestra de una de estas alícuotas congeladas. se extendió en rayas sobre una placa de agar de BHI y se incubó durante la noche. El material de la colina de esta placa de BHI luego se extendió en rayas sobre placas de agar de CDM con la composición dada en la tabla 1 y se incubó a 37 °C durante 3 días. El material de la colonia a partir de esta placa de CDM se inoculó en un cultivo de caldo BHI y se incubó con agitación a 37 °C durante la noche. Se adicionó glicerol a este cultivo a una concentración final de 15% v/v y las alícuotas se congelaron a -80°C. Esta cepa se llamó 16084 (CDM) . Construcción del banco de mutantes Los transformantes pLOF/km SMIO pir etiquetados o marcados se conjugaron con la cepa 16084 (CDM) de P. multocida. Para minimizar el aislamiento de mutantes hermanos (mutantes con el transposón ubicado en la misma posición que surge debido a la replicación del mutante durante el procedimiento de conjugación) cada transformante e?????^ etiquetado se conjugó con la cepa de P. multocida en por lo menos tres conjugaciones separadas.. Los mutantes de transposón de Pasteurella se seleccionaron sobre placas de agar de CDM complementadas con 50 µg/ml de canamicina. Los mutantes resultantes a la canamicina para cada uno de los transposones etiquetados luego se extendieron en rayas para formar colonias individuales dos veces sobre placas de agar de 50 µg ml de canamicina de BHI. Las colonias individuales luego se inocularon en cultivo de caldo de BHI, se cultivaron durante la noche a 37 °C con agitación. Luego se adicionó glicerol a una concentración final de 15% v/v y los mutantes se almacenaron a -80°C en frasquitos individuales. Ejemplo 2: Clasi icación del banco de mutantes de Pasteurella etiquetados con rubrica para mutantes atenuados en virulencia para pavos Los cultivos de los mutantes de P. multocida se cultivaron para la inoculación de pavos al mezclar 20 µ? de cada uno de los extractos de glicerol de los mutantes obtenidos en el ejemplo I con 200 µ? del medio del cultivo BHI , complementado con 50 µ?/??? de canamicina y la colocación en placas de microtitulo de 96 cavidades. Estas placas de microtitulo se incubaron en condiciones estáticas durante aproximadamente 18 horas a 37 °C. Luego alícuotas de 100 µ? de los cultivos de 18 horas de cada mutante se mezclaron con 200 µ? del medio de cultivo BHI complementado con 50 µg/ml de canamicina en una placa de microtitulo fresca y la placa se incubó a 37 °C durante aproximadamente 4 horas. Los cultivos se detuvieron en la fase exponencial de crecimiento y 10 µ? de los cultivos de cada montaje se transfirieron a una placa de microtitulo 'fresca y se utilizó para la determinación de la densidad óptica (OD) a 650 nm. Los inóculos o acumulaciones de entrada se formaron •al mezclar los 100 µ? restantes de los cultivos de 4 horas. Cada acumulación de entrada consistió de 48 mutantes diferentes. El título de estas suspensiones acumuladas se determinó mediante el análisis de FACS (clasificador de células activadas por fluorescencia) de alícuotas de 100 µ? . Las alícuotas (1 mi) de la suspensión acumulada luego se diluyeron en agua fisiológicamente regulada para obtener una suspensión con un título de 2.107 cfu/ml. Grupos de 5 pavos de tres semanas de edad luego se inocularon intramuscularmente con alícuotas de 0.5 mi de esta suspensión (107cfu por animal). El estado serológico de los pavos antes de la inoculación se determinó al clasificar la presencia de anticuerpos para Pasteurella en muestras de sangre tomadas un día antes de la inoculación. Las células del resto de las acumulaciones de entrada se cosecharon por centrifugación y DNA cromosómico se extrajo de las pelotillas de células. Aproximadamente 14 horas después de la inoculación, muestras de sangre de un 1 mi se tomaron de 3 de los 5 pavos. Las series de dilución (10_1 a 10"7) de las muestras de sangre se colocaron sobre placas de agar Columbia complementadas con sangre de oveja al 5%. Las placas se incubaron a 3 °C durante 24 horas tiempo después del cual aproximadamente 10000 colonias de Pasteurella colonias se resuspendieron en el medio BHI . Estas suspensiones, que son llamadas las acumulaciones de salida, luego se centrifugaron y el DNA cromosómico se extrajo de la pelotilla de células. Los mutantes de Pasteurella que estuvieron presentes en la acumulación de entrada pero que no se reaislaron de los pavos se identificaron mediante la amplificación de PCR de las etiquetas de rubrica presentes en las muestras de DNA a partir de las acumulaciones de entrada y de salida, y la hibridación de los productos de PCR amplificados contra manchas de puntos cargadas con DNA que codifica las etiquetas de rubrica como es descrito en Hensel y colaboradores, (Science 1995, 269:400-403). Estos mutantes se consideraron como potencialmente atenuados en virulencia. Esta atenuación se confirmó al clasificar una falta de mortalidad después de infecciones individuales de los mutantes potencialmente en pavos. Ejemplo 3 : Confirmación de la atenuación en virulencia para pavos de los mutantes de P. multoclda. Los mutantes de transposón identificados como potencialmente atenuados en el Ejemplo 2 o los mutantes que tienen habilidad limitada para crecer en el cultivo, se revivieron al mezclar 20 µ? de los extractos de glicerol con 200 µ? de medio de cultivo BHI complementado con 50 µ?/p?? de canamicina en placas de microtitulo. Estas placas de microtitulo se incubaron en condiciones estáticas durante 18 horas a 37°C. Luego alícuotas de 10 µ? de cada muíante de estos cultivos se tomaron y se mezclaron con 200 µ? del medio BHI, complementado con 50 µg/ l canamicina en una placa de microtitulo . fresca y esta . placa se incubó en condiciones estáticas durante aproximadamente 4 horas. Los .cultivos se detuvieron en la fase exponencial de crecimiento y 100 µ? de los cultivos de cada mutante se transfirieron a una placa de microtitulo fresca y se usaron para la determinación de la densidad óptica (OD) a 650 nm.
Los cultivos de cada uno de los mutantes luego se diluyeron 1 en 10000 en agua fisiológicamente regulada para obtener una concentración de aproximadamente 2.104 cfu/ml. Las alícuotas (0.5 mi) de estas diluciones luego se inocularon intramuscularmente en 2 pavos de cinco semanas de edad (104 cfu por animal). El estado serológico de uno cuantos animales de cada grupo de pavos se determinó a partir de las muestras de sangre tomadas el día antes de la inoculación. Los pavos se inspeccionaron por los siguientes 7 días para la mortalidad. De los mutantes probados 72 no dieron por resultado mortalidad en cualquiera de las dos aves inoculadas. Estos 72 mutantes se consideraron atenuados con virulencia . Ejemplo 4: Caracterización de mutantes de inserción de transposón identificados después de la clasificación en pavos
Los sitios de inserción de transposón en genoma de los mutantes de P. multocida atenuados se identificaron al clonar el DNA flanquea un lado de la inserción de transposón,' ya sea mediante la PCR inversa o mediante la PCR arbitrariamente cebada. Estos mutantes se revivieron de los extractos de glicerol a -80°C al extender en rayas una alícuota sobre placas de agar de BHI con 50 µg/ml de canamicina. Luego se utilizaron colonias individuales para inocular los cultivos de caldo BHI a partir del cual se preparó el DNA cromosómico.
Para la PCR inversa el DNA cromosómico se digirió con enzimas de restricción que tiene un sitio de reconocimiento de 4 pares bases, tales como Tsp509I, aTaql o Rsal. El DNA luego es ligado en un volumen grande para favorecer la ligación intramolecular. El DNA que flanquea el transposón luego es amplificado a partir de este patrón de DNA ligado usando cebadores que se enfrentan hacia afuera que templan a la secuencia conocida · del transposón, tal como StipJ (SEQ ID NO: 98, 20 mer) (5' AT.C TGA TCC TTC AAC TCA GC 3'), StipA ( SEQ ID NO: 99, 19 mer) (5' CGC AGG GCT TTA TTG ATT C 3'), KTGRI (SEQ ID NO: 100, 27 mer) (5' GCG GAA TTC GAT GAA TGT TCC GTT GCG 3'), TnlOIRl (SEQ ID NO: 101, 20 mer) (5' TTT ACC AAA ATC ATT AGG GG 3') y Tnl0lR4 (SEQ ID NO: 102, 19 mer) (5' GAT CAT ATG ACA AGA TGT G 3'). Estos productos de PCR luego se clonaron y se secuenciaron. Para la PCR arbitrariamente cebada, el DNA cromosómico se uso como un patrón en una reacción de PCR de primera ronda con un cebador enfrentado hacia afuera que templa al transposón, tal como StipA y un cebador arbitrario, tal como arbl (SEQ ID NO: 103, 35 mer) (5' GGC CAC GCG TCG ACT AGT ACN NNN NNN NNN GAT AT 3') o arb6 (SEQ ID NO: 104, 35 mer) (5' GGC CAC GCG TCG ACT AGT ACN NNN NNN NNN CAG CC 3' ) . La temperatura de templado de esta reacción de PCR de primera ronda inicialmente se ajusta muy baja, con la temperatura de templado que es elevado en ciclos subsecuentes. Una porción d los productos de esta PCR de primera ronda luego se utiliza como un patrón en una PRC de segunda ronda. Esta PCR de segunda ronda utiliza otro cebador enfrentado hacia afuera tal como KTGRI, que templa al transposón en una posición que esta más cercana al extremo del transposón que el cebador usado en la PCR de primera ronda. El otro cebador usado en esta PCR de segunda ronda tiene la misma secuencia como las 20 bases de la secuencia conocida en el extremo 5' del cebador arbitrario usado en las PCR de primera ronda, tal como arb2 (SEQ ID NO: 105, 20 mer) (5' GGC CAC GCG TCG ACT AGT AC 3' ) . Los productos de PCR de esta segunda PCR luego son clonados y secuenciados . Las secuencias obtenidas luego se analizaron para identificar estructuras de lectura abierta (ORF) , que pueden ser interrumpidas mediante el transposón y también se utilizaron para buscar secuencias similares actualmente disponibles en la base de datos EMBL y en la •secuencia del genoma de la cepa P 70 de Pasteurella multocida, determinado por la Universidad de Minnesota (May BJ y colaboradores, Proc. Nati. Acad. Sci. USA, 2001, 98 (6) :3460-5) . Para información, en las siguientes secuencias de nucleótidos, N es correspondiente a cualquier ácido nucleico (A o C o G o T) . Mutantes 1G4, 3F4, 3G12, 12D6 y 14C10 Los mutantes 1G4, 3F4 y 12D6 tienen exactamente el mismo sitio de inserción de transposón. Las secuencias de DNA que flanquea el sitio de inserción de transposón se da en la SEQ ID NO: 1 (775 mer) . El transposón está insertado inmediatamente en el extremo 5' de esta secuencia. Un codón de inicio está ubicado en las posiciones 179-181 de la secuencia SEQ ID NO: 1. Para el mutante 3G12, la secuencia de DNA que flanquea el sitio inserción de transposón se da en la SEQ ID NO: 95 (101 mer). El transposón está insertado inmediatamente en el extremo 5' de esta secuencia. Para el mutante 14C10, la secuencia de DNA que flanquea el sitio inserción de transposón se da en la SEQ ID NO: 96 (220 mer) . El transposón está insertado inmediatamente en el extremo 3' de esta secuencia. Cuatro de otras proteínas y genes- de Pasteurellaceae se identificaron mediante blasts hecho con una secuencia de 60 aminoácidos codificada por la SEQ ID NO:
Cepa Gen (ref. de Proteína (ref. % de Genbank) de Genbank) indentidad
P. multocída PhyA PhyA 100% sobre 60 taxon 747 (AF067175) (AAC67248) aminoácidos
P. multocída PM0773 PhyA 98% sobre 60 PM70 (AE006115) (AAK02857) aminoácidos p. multocida PhyA PhyA (AAK 98% sobre 60 P4218 (AF302467) 17919) aminoácidos
P. multocida PhyA PhyA 95% sobre 60 P934 (AF302465) (AAK17907) aminoácidos
La ubicación del transposón en los mutantes 1G4, 3F4 y 12D6 corresponde a la posición 8507-8508 de la secuencia del genoma PM70 de Pasteurella multocida, número de acceso de Genbank AE006115. La ubicación del transposón en el mutante 3G12 corresponde a la posición 8609-8610 de la secuencia AE006115. La ubicación del transposón en el mutante 14C10 corresponde a la posición 8517-8518 de la secuencia AE006115. El transposón interrumpe un homólogo del gen PM70, PM0773, PhyA. El gen PhyA se predice que está involucrado sobre la síntesis de al cápsula. La secuencia de nucleótidos de PM0773 es identificada en la presente como la SEQ ID NO: 2 y su secuencia de aminoácidos como SEQ ID NO: 3. Mutantes 1G8, 9D1 y 9D8 ' . En el mutante 1G8, el transposón está insertado .inmediatamente en el extremo 3' de la SEQ- ID NO: 4 (226 mer) . Esta secuencia tiene dos estructuras de lectura abierta (+2 y -2) que codifica las proteínas más largas potenciales. La ORF de acuerdo con la invención está en la estructura -2.
El transposón insertado en el muíante 9D1 está inmediatamente en el extremo 3' de la secuencia SEQ ID NO: 5 (87 mer) . El transposón insertado en el mutante 9D8 está después de la posición 225 de la secuencia SEQ ID NO: 4. Los transposónes en los mutantes 1G8, 9D1 y 9D8 interrumpen un homólogo del gen PM70, PM0871. Las ubicaciones de los transposónes en estos mutantes corresponden a las posiciones 9849-9850 (mutante 1G8) , 8899-8900 (mutante 9D1) o 9848-9849 (mutante 9D8) de la secuencia del genoma PM70 de Pasteurella ultocida, número de acceso de Genbank AE006125. La secuencia de nucleótidos de PM0871 es identificada en la presente como la SEQ ID NO: 6 y su secuencia de aminoácidos como la SEQ ID NO: 7. Uno de otro gen/proteina de Pasteurellaceae se identificó mediante blasts hecho con la SEQ ID NO: 7. Este es HI1586 de Haemophilus influenzae (números de acceso de Genbank U32832 y AAC23234). Los inventores encontraron una identidad de 72% sonre 507 aminoácidos entre PM0871 y HI1586. Mutante 2F2 La secuencia de DNA que flanquea el sitio de inserción de transposón se da en la SEQ ID NO: 8 (78 mer) . El transposón está inmediatamente en el extremo 5' de esta secuencia. Esta secuencia tiene tres estructuras de lectura abierta (+1, +2 y -1) que codifican proteínas más largas potenciales. La ORF de acuerdo con la invención está en la estrucura +2. El transposón en el imitante 2F2 interrumpe un gen homólogo del gen PM70, PM1727. Este transposón está ubicado en una función que corresponde a 644-645 de la secuencia PM70 de Pasteurella multocida , número de acceso de Genbank AE006210 (PM1727) . La secuencia de nucleótidos de PM1727 es identificada en la presente como la SEQ ID NO: 9 y su secuencia de aminoácidos como SEQ ID NO: 10. Uno de otro gen/proteina de Pasteurellaceae se indentificó mediante blasts heneo con SEQ ID NO: 10. Este es HI0621 de Haemophilus influenzae (números de acceso de Genbank U32744 y AAC22281) . Los inventores encontraron identidad de 77% sobre 183 aminoácidos entre PM1727 y HI0621. P 1727 es un miembro de una superfamilia de hidrolazas, en particular es relacionado con histidinol fosfato fosfatasas. Mutante 3A2 Las secuencias de DNA que flanquea el sitio de inserción de transposón se da en la SEQ ID NO: 11 (467 mer) . El transposón está inmediatamente en el extremo 5' de esta secuencia. Un codón de detención está ubicado en las posiciones 428-430.
El transposón del mutante 3A2 está ubicado en una posición que corresponde a 5103-5104 de la secuencia P 70 de Pasteurella multocida, número de acceso de Genbank AE006094 (PM0586). La secuencia de nucleótidos de PM0586 es identificada en la presente como SEQ ID NO: 12 y su secuencia de aminoácidos como SEQ ID NO: 13. Dos de otros de genes de proteínas de Pasteurellaceae se identificaron mediante blasts hecho con la SEQ ID NO: 13. Estos genes y proteínas son Al PLPD de Pasteurella haemolytica (números de acceso de Genbanks AF058703 y AAC32565) y 31 kDa de Haemophilus somnus (números de acceso de Genbanks L07795 y AAA24941). Los inventores encontraron una identidad de 73% sobre 276 aminoácidos entré PM0586 y PlpD de P. haemolytica y de 71% sobre 273 aminoácidos entre P 0586 y 31 kDa de H. somnus. PlpD y PM0586 son miembros de la familia de proteína ompA. Mutante 3D3 Las secuencias de DNA que flanquean ambos lados del sitio de inserción del transposón se dan en la SEQ ID NO: 14 (204 mer, transposón en el extremo 5') y la SEQ ID NO: 15 (35 mer, transposón en el extremo 5' ) . Un codón de detención está ubicado en las posiciones 7-9 de la SEQ ID NO: 14 y en las posiciones 33-35 de la SEQ ID NO: 15.
Uno de otro gen/proteína de Pasteurellaceae se identificó mediante blasts hecho con la SEQ ID NO: 14 y su secuencia de aminoácidos codificadas (65 aminoácidos). Los inventores encontraron una identidad de 100% sobre 65 aminoácidos con la proteina PM0064. La ubicación del transposón en el mutante 3D3 corresponde a las posiciones 4778-4779 o 4787-4788 de la secuencia del genoma PM70 de Pasteurella multocida, número de acceso de Genbank AE006042, posiciones deducidas de la SEQ ID. NO: 14 y 15 respectivamente. Esta diferencia es probable que sea debido a la inserción del transposón que resulta en la duplicación' de unos cuantos nucleótidos en el sitio de inserción de transposón. La posición 4788 está ubicada en el gen PM0064. La posición 4778 está 6 corriente abajo del codón de detención PM0064. La secuencia de nucleótidos de PM0064 es identificada en la presente como la SEQ ID NO: 16 y su secuencia de aminoácidos como la SEQ ID NO: 17. Otros genes y proteínas de bacterias gram negativas ' se identificaron mediante blasts hecho con la. SEQ ID NO: 17. .
Cepa Gen (ref. de Proteína (ref. % de identidad Genbank) de Genbank. ) Haemophilus HI0017 HI0017 81% sobre 127 influenzae (U32687) (AAC21695) aminoácidos
Escherichia YfiD yfid 81% sobre 127 coli K12 (AE000344) (AAC75632) aminoácidos
Salfnonella STY2839 yfiD 81% sobre 127 typhi (AL627275) (CAD02795) aminoácidos
Salmonella STM2646 yfiD 81% sobre 127 typhimurium (AE008820) (AAL21540) aminoácidos
Serratia OrfX (X66505) OrfX 79% sobre 127 liquefaciens (CAA47136) aminoácidos
Yersinia YP02705 YP02705 79% sobre 127 pestis (AJ414153) (CAC92944) aminoácidos
Vibrio cholera VC2361 VC2361 73% sobre 127 (AE004306) (AAF95504) aminoácidos utante 3D8 La secuencia de DNA que flanquea el sitio de inserción de transposón se da en la SEQ ID NO: 18 (75 mer) . El transposón está inmediatamente en el extremo 3' de esta secuencia. La ubicación del transposón en el mutante 3D8 corresponde entre las posiciones 7769-7770 de la secuencia del genoma PM70 de Pasteurella multocida , número de acceso de Genbank AE006080. El transposón interrumpe un homólogo del gen PM70, PM0445. La secuencia de nucleótidos de PM0445 se identifica en la presente como la SEQ ID NO: 19 y su secuencia de aminoácidos como la SEQ ID NO: 20. Mutante 3E1 La secuencia de DNA que flanquea el sitio de inserción de transposón se da en la SEQ ID NO: 21 (29 mer) . El transposón está inmediatamente en el extremo 3' de esta secuencia . La ubicación del transposón en el mutante 3E1 corresponde entre las posiciones 9195-9196 de la secuencia del genoma PM70 de Pasteurella multocida, número de acceso de Genbank AE006080. El transposón interrumpe un homólogo del gen PM70, PM0940. La secuencia de nucleótidos de PM0940 se identifica en la presente como la SEQ ID NO: 22 y su secuencia de aminoácidos como la SEQ ID NO: 23. Otros genes y proteínas de bacterias gram negativas se identificaron mediante blasts hecho con la SEQ ID NO: 17.
Cepa Gen (ref. de Proteína (ref. % de identidad Genbank) de Genbank. ) Haemophilus HI0017 nrdD 87% sobre 713 influenzae (U32693) (AAC21751) aminoácidos
Escherichia nrdD nrdD 76% sobre 709 coli K12 (AE000495) (AAC77195) aminoácidos
Salfnonella STY4791 nrdD 76% sobre 709 typhi (AL627283) (CÁD06912) aminoácidos
Salmonella ST 4452 nrdD 76% sobre 709 typhimurium (AE008908) (AAL23272) aminoácidos Yersinia YP03464 nrdD 75% sobre 709 pestis (AJ414157) (CAC92983) aminoácidos
Vibrio cholera VCA0511 VCA0511 74% sobre 709 (AE004381) (AAF96414) aminoácidos utante 3H2 La secuencia de DNA que flanquea el sitio de inserción de transposón se da en la SEQ ID NO: 24 (58 mer) . El transposón está inmediatamente en el extremo 3' de esta secuencia. Esta secuencia tiene dos estructuras de lectura abierta (+1 y -3) que codifican proteínas más largas potenciales. La ORF de acuerdo con la invención está la estructura +1. Uno de otro gen de Pasteurellaceae se identificó mediante blasts hecho con la SEQ ID NO: 24 y con su secuencia de aminoácidos codificados (19 aminoácidos) . Los inventores encontraron identidad del 100% sobre 19 aminoácidos con la proteína PM1951.. La ubicación del transposón en el mutante 3H2 corresponde entre las posiciones 9418-9419 de la secuencia PM70 de Pasteúrella multocida-, número de acceso de Genbank AE006231 (PM1951, UVRA) . La secuencia de nucleótidos de PM1951 se identifica en la presente como la SEQ ID NO: 25 y su secuencia de aminoácidos como la SEQ ID NO: 26. Otros genes y proteínas de bacterias gram negativas se identificaron mediante blasts hecho con la SEQ ID NO: 26.
Cepa Gen (ref. de Proteina (ref. % de identidad Genbank) de Genbank. ) Haemophilus UvrA (U32711) UvrA 89% over 943 influenzae (AAC21915) aminoácidos
Escherichia UvrA UvrA 80% sobre 940 coli K12 (AE000479) (AAC77028) aminoácidos
Yersinia UvrA UvrA 80% sobre 943 pestis (AJ414142) (CAC89185) aminoácidos
Vibrio UvrA UvrA 80% sobre 940 cholerae (AE004127) (AAF93567) aminoácidos
Salmonella UvrA UvrA 80% sobre 941 typhi (AL627282) (CAD09238) aminoácidos
Salmonella UvrA UvrA 80% sobre 941 typhimurium (AE008898) (AAA27250) aminoácidos
Pseudomonas UvrA UvrA 75% sobre 943 aeruginosa (??004840) (AAG07622) aminoácidos UvrA es una nucleasa de escisión reparación de DNA. Mutante 4D6 ' La secuencia de DNA que flanquea inserción de transposón se da en la SEQ ID NO: 27 (54 mer) . El transposón está inmediatamente en el extremo 5' de esta secuencia. Esta secuencia tiene dos estructuras de lectura abierta (+1 y -2) que codifican proteínas más largas potenciales. La ORF de acuerdo con la invención está en la estructura +1. La ubicación del transposón en el mutante 4D6 corresponde entre las posiciones 6492-6493 de la secuencia PM70 de Pasteurella multocida, número de acceso de Genbank AE006036. El transposón interrumpe un homólogo del gen PM70, P 0032 o hktE. La secuencia de nucleótidos de PM0032 se identifica en la presente como la SEQ ID NO: 28 y su secuencia de aminoácidos como la SEQ ID NO: 29. Uno de otro gen/proteina de Pasteurellaceae se identificó mediante blasts hecho con SEQ ID NO: 29. Esta es la catalasa de Actinobacillus actinomycetemcomitans (números de acceso de Cenbanks AF162654 y AAF17882) . Los inventores encontraron una identidad de 85% sobre 482 aminoácidos entre PM0032 y la catalasa de A. actinojnycetemcomi.tans. HktE es una catalasa. Mutante 4F4 y 12A5 Para el mutante .4F4, la secuencia de DNA que ' flanquea- el sitio de inserción de transposón se da en la SEQ ID NO: 30 (172 mer) . El transposón está inmediatamente en el extremo 3' de esta secuencia. Para el mutante 12A5, la secuencia de DNA que flanquea el sitio de inserción de transposón se da en la SEQ ID NO: 97 (546 mer) . El transposón está insertado inmediatamente en el extremo 5' de esta secuencia.
Cuatro de otros genes de proteínas Pasteurellaceae se identificaron mediante blasts hecho con secuencia de 57 de aminoácidos codificada por la SEQ ID 30.
La ubicación del transposón en el mutante 4F4 corresponde entre las posiciones 5272-5273 de la secuencia del genoma de Pasteurella multocida , número de acceso de Genbank- AE006116. La ubicación del transposón en el mutante 12A5 corresponde entre las posiciones 5275-5276 de la secuencia AE0.06116. El transposón interrumpe un homólogo del gen PM70, PM0776. La secuencia de nucleótidos de PM0776 se identifica en la presente como la SEQ ID NO: 31 y su secuencia de aminoácidos como la SEQ ID NO: 32. Estas proteínas son UDP glucosa deshidrogenasas.
Mutante 4F12 La secuencia de DNA flanquea el sitio de inserción de transposón se da en la SEQ ID NO: 33 (226 mer) . El ' transposón está inmediatamente en el extremo 5' de esta secuencia. La ubicación del .transposón en él mutante 4F12 corresponde entre las posiciones 9263-9264 de la secuencia PM70 de Pasteurella multocida, número de acceso de Genbank AE006038. El transposón interrumpe un homólogo del gen P 70, PM0048 o fadR. La secuencia de nucleótidos de PM0048 se identifica en la presente como la SEQ ID NO: 34 y su secuencia de aminoácidos como la SEQ ID NO: 35. FadR es un homólogo de una proteina de E. coli que es un regulador de transcripción del metabolismo de ácido graso, que afecta varios genes de biosintesis de ácido graso (fab) y degradación de ácido graso (fad) . Mutante 4G11 La secuencia de DNA que flanquea el sitio de inserción de transposón se da en la SEQ ID NO: 36 (214 mer) . El transposón está inmediatamente en el extremo 3' de esta secuencia. Uno de otro gen de Pasteurellaceae se identificó mediante blasts hecho con la SEQ ID NO: 36 y su secuencia de aminoácidos codificados (70 aminoácidos) . Los inventores encontraron una identidad del 100% sobre 70 aminoácidos con la proteina PM1024. La ubicación del transposón en el mutante 4G11 corresponde entre las posiciones 3532-3533' de la secuencia del genoma PM70 de Pasteurella multocida, número de acceso' de Genbank AE006143. El transposón interrumpe un homólogo del gen PM70, PM1024 o HtpG. La secuencia de nucleótidos de P 1024 se identifica en la presente como la SEQ ID NO: 37 y su secuencia de aminoácidos como, la SEQ ID NO: 38. Otros genes y proteínas de bacterias gram negativas se identificaron mediante blasts hecho con la SEQ ID NO: 38.
Cepa Gen (ref. de Proteína % de Genbank) (ref. de identidad Genbank. ) Actinobacillus HtpG HtpG 88% sobre actinomycetemcomitans (U26968) (AAC44732) 625 aminoácidos
Haemophilirs HtpG HtpG 86% sobre influenzae (U32695) (AAC21778) 625 aminoácidos
Escherichia coli K12 HtpG HtpG 76% sobre (AE000.153) (AAC73575) 621 aminoácidos Yersitiia pestis HtpG HtpG 76% sobre (AJ414155) (CAC92355) 622 aminoácidos
Salmonella typhi STY0531 HtpG 76% sobre (AL627267) (CAD04972) 621 aminoácidos
Salmonella HtpG HtpG 75% sobre typhimurium (AE008718) (AAL19441) 621 aminoácidos HtpG es una proteina de choque térmico. El mutante 4G11 se t depositó bajo el Tratado de Budapest en el Pasteur Institute Collection y está disponible bajo el número de acceso CNCM 1-2999. Mutante 5D5 La secuencia de DNA que flanquea el sitio inserción de transposón se da en la SEQ ID NO: 39 . (2'52 raer) . El transposón está inmediatamente en el extremo 3' de esta secuencia. La ubicación del transposón en el ' mutante 5D5 corresponde entre las posiciones 5695-5696 de la secuencia de genoma PM70 de Pasteurella multocida , número de acceso de Genbank AE006188. El transposón interrumpe un homólogo del gen PM70, PM1517 o PlpE. La secuencia de nucleótidos de PM1517 se identifica en la presente como la SEQ ID NO: 40 y su secuencia de aminoácidos como la SEQ ID NO: 41.
PlpE se predice que es una lipoproteina de membrana. El mutante 5D5 se depositó bajo el Tratado de Budapest en el Pasteur Institute Collection y está disponible bajo el número de acceso CNCM 1-3000. Mutante 5F11 La secuencia de DNA que flanquea el sitio de inserción de transposón se da en la SEQ ID NO: 42 (546 mer) . El transposón está inmediatamente en el extremo 5' de esta secuencia . Un codón de detención está ubicado en las posiciones 148-150. La ubicación del transposón en el mutante 5F11 corresponde entre las posiciones 572-573 del genoma PM70 de Pasteurella multocida, número de acceso de Genbank AE006150. El transposón interrumpe un homólogo del gen PM70, PM1087 o NifR3. La secuencia de nucleótidos de PM1087 se identifica en la presente como la SEQ ID NO: 43 y su secuencia de aminoácidos como la SEQ ID NO: 44. Uno de otro gen/proteina de Pasteurellaceae se indentificó mediante blasts hecho con la SEQ ID NO: 44. Este es HI0979 de Haemophilus influenzae (números de acceso de Genbanks U32778 y AAC22639) . Los inventores encontraron una identidad de 78% sobre 332 aminoácidos entre PM1087 y HI0979. NifR3 es un gen regulador de nitrogenasa.
Mutante 5G9 La secuencia de DNA que flanquea el sitio de inserción de transposón se da en la SEQ ID NO: 45 (43 mer) . El transposón está inmediatamente en el extremo 3' de esta secuencia. Esta secuencia tiene tres estructuras de lectura abierta (+2, +3 y -1) que codifican proteínas más largas potenciales. La ORF de acuerdo con la invención está en la estructura +2. Cuatro de otros genes y proteínas de' Pasteurellaceae se identificaron mediante blasts hecho con una secuencia de 14 de aminoácidos codificada por la SEQ ID NO: 45.
La ubicación del transposón en el mutante SG9 corresponde entre las posiciones 573-574 de la secuencia del genoma PM70 de Pasteurella- multocida, número de acceso de Genbank AE006116. El transposón interrumpe un homólogo del gen PM70, P 0774 o HyaE. La secuencia de nucleótidos de PM0774 se identifica en la presente como la SEQ ID NO: 46 y su secuencia de aminoácidos como la SEQ ID NO: 47. Estos genes están implicados en la síntesis de la cápsula. Mutante 6E5 La secuencia de DNA que flanquea el sitio de inserción de transposón se da en la SEQ ID NO: 48 (279 mer) . El transposón está inmediatamente en el extremo 3' de esta secuencia . Un codón de inicio está ubicado en las posiciones
169-171. La ubicación del transposón en el mutante 6E5 corresponde entre las posiciones 6673-6674 de la secuencia del genoma PM70 de Pasteurella multocida, número de acceso de Genbank AE006182. El transposón interrumpe un homólogo del gen PM70, PM1459- o PGTB. La secuencia de nucleótidos dé PM1459 se identifica en la presente como' la SEQ ID NO: 49 y su secuencia de aminoácidos como la SEQ ID NO: 50. PgtB es una proteina reguladora de transporte de fosfoglicerato . Mutante 6E6 La secuencia de DNA que flanquea el sitio de inserción de transposón se da en la SEQ ID NO: 51 (93 mer) .
El transposón está inmediatamente en el extremo 3' de esta secuencia. Un codón de detención está ubicado en las posiciones 12-14. La ubicación del transposón en el mutante 6E6 corresponde entre las posiciones 9051-9052 de la secuencia del genoma PM70 de Pasteurella ultocida , número de acceso de Genbank AE006096. El transposón interrumpe un homólogo del gen P 70, PM0605. La secuencia de nucleótidos de PM0605 se identifica en la presente como la SEQ ID NO: 52 y su secuencia de aminoácidos como la SEQ ID NO: 53. Mutante 6F12 La secuencia de DNA que flanquea el sitio de inserción de transposón se da en la SEQ ID NO: 54 (772 mer) . El transposón está inmediatamente en el extremo 5' de esta secuencia. Un codón de inicio está ubicado en las posiciones
2-4. La ubicación del transposón ¦ en el mutante 6F12 corresponde entre las posiciones 5362-5363 de la secuencia del genoma FM7G de Pasteurella multocida, número de acceso de Genbank AE006192. El transposón interrumpe un homólogo del gen PM70, PM1556 o el gen comF. La secuencia de nucleótidos de PM1556 se identifica en la presente como la SEQ ID NO: 55 y su secuencia de aminoácidos como la SEQ ID NO: 56.
ComF es la proteina F de competencia. Mutante 6G4 La secuencia de DNA que flanquea el sitio de inserción de transposón se da en la SEQ ID NO: 57 (700 mer) . El transposón está inmediatamente en el extremo 5' -de esta secuencia . La ubicación del transposón en el mutante 6G4 corresponde entre las posiciones 3758-3759 de la secuencia de genoma PM70 de pasteurella multocida, número de acceso de Genbank AE006206. La inserción está entre los genes PM1696 y PM1697. El transposón está insertado entre la región de promotor y el codón de inicio de PM1696. El codón de inicio de P 1696 está ubicado en las posiciones 26-28 en la SEQ ID NO: 57. La secuencia de nucleótidos de PM1696 se identifica en la presente como la SEQ ID NO: 58 y su secuencia de aminoácidos como la SEQ ID NO: 59. Otros genes y proteínas de bacterias gram negativas se identificaron mediante blasts hecho con SEQ ID NO: 59.
Cepa Gen (ref. de Proteina (ref. % de identidad Genbank) de Genbank. ) Haemophilus HI0266 HI0266 87% sobre 184 influenzae (U32713) (AAC21932) aminoácidos
Salmonella STY3386 STY3386 71% sobre 185 typhi (AL627278) (CAD07732) aminoácidos
Salmonella STM3207 ygiH 71% sobre 185 typhimurium (AE008847) (AAL22081) aminoácidos
Mutante 6H1 La secuencia' de DNA que flanquea el sitio de inserción de transposón se da en la SEQ ID NO: 60 (188 mer) . El 'transposón está inmediatamente en el extremo 3' de esta secuencia. La ubicación del transposón en el mutante 6H1 corresponde entre las posiciones 4139-4140 de la secuencia del genoma PM70 de Pasteurella multocida PM70, número de acceso de Genbank AE006119. El transposón interrumpe un homólogo del gen PM70, PM0806 o el gen speF. La secuencia de nucleótidos de PM0806 se identifica en la presente como la SEQ ID NO: 61 y su secuencia de aminoácidos como la SEQ ID NO: 62. Dos de otros genes de Pasteurellaceae y
Vibrionaceae se identificaron mediante- blasts hecho con la SEQ ID NO: 62. Estos genes son speF de Haemophilus influenzae (números de acceso de Genbanks U32740 y AAC22248) y ornitina descarboxilasa de Vibrio cholerae (AE004431 y AAF96957) . Los inventores encontraron una identidad de 83% sobre 719 aminoácidos entre PM0806 y speF H. influenzae. SpeF es una ornitina descarboxilasa.
Mutante 6H6. La secuencia de DNA que flanquea el sitio de inserción de transposón se da en la SEQ ID NO: 63 (101 mer) . El transposón está inmediatamente en el extremo 3' de esta secuencia. Esta secuencia tiene dos estructuras de lectura abierta (+1 y -1) que codifican proteínas más largas potenciales. La ORF de acuerdo con la invención está en la estructura +1. La ubicación del transposón en el mutante 6H6
•corresponde entre las posiciones 983-984 de la secuencia del genoma PM70 de Pasteurella multocida PM70, número de acceso de Genbank. AE006155. El transposón interrumpe un homólogo del gen PM70, PM1138. La secuencia de nucleótidos de PM1138 se identifica en la presente como la SEQ ID NO: 64 y su secuencia de aminoácidos como la SEQ ID NO: 65. Mutante 7A7 La secuencia de DNA que flanquea el sitio de inserción de transposón se da en .la SEQ ID NO:. 66 ( 222 mer) . El transposón está inmediatamente en el extremo' 5' .de esta secuencia. La ubicación del transposón en el mutante 7A7 corresponde entre las posiciones 7853-7854 de la secuencia del genoma PM70 de Pasteurella multocida, número de acceso de Genbank AE006170 (en la región intergénica entre PM1321 y PM1322) . El transposón está insertado* entre la región terminadora y el codón de detención de PM1322. El codón de detención está ubicado en las posiciones 25-27 en la secuencia SEQ ID NO: 66. La secuencia de nucleótidos de PM1322 se identifica en la presente como la SEQ ID NO: 67 y su secuencia.de aminoácidos como la SEQ ID NO: 68. Mutante 7F8 .. La secuencia de DNA que flanquea el sitio de inserción de transposón se da en la SEQ ID NO: 69 (55 mer) . El transposón está inmediatamente en el extremo 3' de esta secuencia. Esta secuencia tiene tres estructuras de lectura abierta ( +1, +3 y -3) que codifican proteínas más largas potenciales. La ORF de acuerdo con la invención está en la estructura +3. La ubicación del transposón en el mutante 7F8 corresponde entre las posiciones 8292-8293 de la · secuencia del genoma PM70 de Pasteurella multocida, número de acceso de Genbank' AE006224. El transposón interrumpe un homólogo del gen PM70, PM1866. La secuencia de nucleótidos de PM1866 se identifica en la presente como la SEQ ID NO: 70 y su secuencia de aminoácidos como la SEQ ID NO: 71. Mutante 9C8 -Las secuencias de DNA que flanquean ambos lados del sitio de inserción de transposón se dan en la SEQ ID NO: 72 (598 mer, transposón en el extremo 5') y SEQ ID NO: 73 (56G mer, transposón en el extremo 5' ) . Un codón de detención está ubicado en las posiciones 26-28 de la SEQ ID NO: 72. Las secuencias SEQ ID NO: 72 y 73 son combinadas conjuntamente y limitadas a la ORF. La secuencia resultante es designada SEQ ID NO: 74 (575 mer) . La ubicación del transposón en el mutante 9C8 corresponde entre las posiciones 2224-2225 o 2210-2211 de la secuencia del genoma PM70 de Pasteurella multocida , número de acceso de Genbank AE006132, posiciones deducidas de la SEQ ID NO: 72 y 73 respectivamente. Ambas posiciones están dentro del gen PM0926 (fimA). La secuencia de nucleótidos de PM0926 se identifica en la presente como la SEQ ID NO: 75 y su secuencia de aminoácidos como la SEQ ID NO: 76. Una de otro gen/proteina de Pasteurellaceae se identificó mediante blasts hecho con la SEQ ID NO: 76. Esto es FimA de Haemophilus influenzae (números de acceso de Genbank AF053125 y AAC08991) . Los inventores encontraron una identidad de 77% sobre 171 aminoácidos "entre PM0926 y FimA de H. influenzae. FimA es una adhesina, una proteina fimbriada. El mutante 9C8 se depósito bajo el Tratado de Budapest en el Pasteur Institute Collection y está disponible bajo en número de acceso CNCM 1-3001.
Mutante 9H4 Las secuencias de DNA que flanquean ambos lados del sitio de inserción de transposón se dan en la SEQ ID NO: 92 (1391 raer) . El transposón se insertó en la posición 850-851 de esta secuencia. Esta secuencia tiene solamente una estructura de lectura. La ORF de acuerdo con la invención está en la estructura -2. Un codón de inicio está ubicado en las posiciones . 1318-1316 y un codón de detención está ubicado en las posiciones 29-31 de la SEQ ID NO: 92. La secuencia resultante de ORF es designada SEQ ID NO: 93 (1290 mer) y su secuencia de aminoácidos es designada SEQ ID NO: 94. ! El blasts hecho con las secuencias SEQ ID NO: 92 y SEQ ID NO: 94 no identificaron ninguno de los genes o proteínas homologas. El mutante 9H4 se depositó bajo el Tratado de Budapest en- el Pasteur Institute Collection y está disponible bajo el número de acceso CNCM 1-3002. Mutante 10G11 La secuencia de DNA que flanquea el sitio de inserción de transposón se da en la SEQ ID NO: 77 (70 mer) . El transposón está inmediatamente en el extremo 5' de esta secuencia. Un codón de inicio está ubicado en las posiciones 62-64.
La ubicación del transposón en el mutante 10G11 corresponde entre las posiciones 2938-2939 de la secuencia del genoma PM70 de Pasteurella multocida , número de acceso de Genbank AE006056. El transposón interrumpe un homólogo del gen PM70, PM0220 (rpL31_l) . La secuencia de nucleótidos de PM0220 se identifica en la presente como la SEQ ID NO: 78 y su secuencia de aminoácidos como la SEQ ID NO: 79. RpL31 1 es una proteina ribosomal 50S. Mutante 11E8 La secuencia de DNA que flanquea el sitio de inserción de transposón se da en la SEQ ID NO: 80 (506 mer) . El transposón está inmediatamente en el extremo 5' de esta secuencia . Un codón de inicio está ubicado en las posiciones 195-197 de la SEQ ID NO: 80. La ubicación del transposón en el mutante 11E8 corresponde entre las posiciones 282-283 de la secuencia del genoma PM70 de Pasteurella multocida, número de acceso de' Genbank AE006085. El transposón interrumpe un homólogo del gen PM70, PM0488. La secuencia de nucleótidos de PM0488 se identifica en la presente como la SEQ ID NO: 81 y su secuencia de aminoácidos como la SEQ ID NO: 82. Mutante 12A1 La secuencia de DNA que flanquea el sitio de inserción de transposón se da en la SEQ ID NO: 83 (243 mer) .
El transposón está inmediatamente en el extremo 3' de esta secuencia . Uno de otro gen de Pasteurellaceae se indentificó mediante blasts hecho con la SEQ ID NO: 83 y su secuencia de aminoácidos codificadas (81 aminoácidos) . Los inventores encontraron una identidad de 100% sobre 81 aminoácidos con la proteina PM0063. La ubicación del transposón en el mutante 12A1 corresponde entre las posiciones 2880-2881 de la secuencia del genoma PM70 de Pasteurella multocida, número de acceso de Genbank AE006042. El transposón interrumpe un homólogo del gen P 70, PM0063 o gen lepA. La secuencia de nucleótidos de PM0063 se identifica en la presente como la SEQ ID NO: 84 y su secuencia de aminoácidos como la SEQ ID NO: 85. Otros genes y proteina de bacterias gram negativas se identificaron mediante blasts hecho con la SEQ ID NO: 85.
Cepa Gen (ref. de Proteina (ref. % de identidad Genbank) de Genbank. ) Haemophilus H10016 LepA 95% sobre 598 influenzae (U32687) (AAC21694) aminoácidos
Yersinia YP02716 LepA 88% sobre 597 pestis (AJ414153) (CAC92955) aminoácidos
Esch'erichia LepA LepA 89% sobre 597 coli K12 (AE000343) (AAC75622) aminoácidos Salmonella STY2829 LepA 89% sobre 597 typhi (AL627275) (CAD02785) aminoácidos
Salmonella LepA LepA 89% sobre 597 typhimurium (AE008817) (AAL21477) aminoácidos
Vibrio VC2463 LepA 84% sobre 597 cholerae (AE004316) (AAF95605) aminoácidos
Pseudomonas PA0767 LepA 75% sobre 594 aeruginosa (AE004511) (AAG04156) aminoácidos
LepA es una proteina de membrana que enlaza GTP. Mutante 12B3 La secuencia de DNA que flanquea el sitio de inserción de transposón se da en la SEQ ID NO: 86 (147 mer) . El transposón está inmediatamente en el extremo 3' de esta secuenci . La ubicación del transposón en el mutante 12B3 corresponde entre las posiciones 4028-4029 de la · secuencia del genoma PM70 de Pasteurella multocida, número de acceso de Genbank. AE006152. El transposón interrumpe un homólogo del gen PM70, PM1112 o gen deaD. La secuencia de nucleótidos 'de PM1112 se identifica en la presente como la SEQ ID NO: 87 y su secuencia de aminoácidos como la SEQ ID NO: 88. Uno de otro gen/proteina de Pasteurellaceae Se identificó mediante blasts hecho con la SEQ ID NO: 88. Este es HI0231 de Haemophilus ínfluenzae (números de acceso de Genbank U32709 y AAC21900) . Los inventores encontraron una identidad de 80% sobre 605 aminoácidos entre PM1112 y ??0231. DeaD es un RNA helicasa. Mutante 13E1 La secuencia de DNA que flanquea el sitio de inserción de transposón se da en la SEQ ID NO: 89 (187 mer) . El transposón está inmediatamente en el extremo 3' dé esta secuencia. Esta secuencia tiene dos estructuras de lectura abierta (+1 y -3) que codifican proteínas más largas potenciales. La ORF de acuerdo con la invención está en la estructura -3. La ubicación del transposón en el mutante 13E1 corresponde entre las posiciones 2173-2174 de la secuencia del genoma FM70 de Pasteurella multocida, número de acceso de Genbank AE006138 (PM0989) . La secuencia de nucleótidos de PM0989 se identifica en la presente como la SEQ ID NO: 90 y su secuencia de aminoácidos como la SEQ ID NO: 91. . Uno de otro gen/proteína de Pasteurellaceae se identificó mediante blasts hecho con la SEQ ID NO: 91. Este es HI0325 de Haemophilus influenzae (números de acceso de Genbank U32717 y ÁAC21988) . Los inventores encontraron una identidad de 79% sobre 414 aminoácidos entre PM0989 y HI0325. El mutante 13E1 se depositó bajo el Tratado de Budapest en el Pasteur Institute Collection y está disponible bajo el número de acceso CNCM 1-3003.
Ejemplo 5: Selección por PCR de imitantes de inserción de transposón El trañsposón puede insertarse en todas partes del genoma de la bacteria. Pero una selección de los mutantes correctos se puede hacer usando la PCR. Se utilizan un par de cebadores, uno especifico para el transposón, tales como TnlOIRl (SEQ ID NO: 101), TnlOIR4 (SEQ ID NO: 102), KTGRI (SEQ ID NO: 100), StipA (SEQ ID NO: 99) y StipJ ( SEQ ID NO: 98), y uno especifico para el gen o secuencia a ser mutada. La secuencia de nucleótidos de este gen o una parte de la misma (por ejemplo secuencias de la región cerca del sitio de inserción del transposón como es secuenciado anteriormente) es útil para el diseño de tales cebadores. Este puede ser adaptado a genes o secuencias de nucleótidos de otra cepas de Pasteurella multocida , u otras bacterias gram negativas, tales como las bacterias de la familia Pasteurellaceae, notablemente Pasteurella
•haemolytica, Pasteurella anatipestifer y Actinobacillus pleuropneumoniae. El conocimiento del gen correspondiente u ORF y/o sus. regiones reguladoras en la cepa PM70 o P-1059 de Pasteurella multocida (Ejemplo 4) tal como su tamaño, se utiliza para clasificar los fragmentos de PCR amplificados y para detectar aquellos que tienen un tamaño correspondiente a un transposón insertado en el gen o la secuencia a ser mutada . Si el transposón se insertó fuera del gen, este puede tener un fragmento de PCR no amplificado o pueden amplificar fragmentos con un tamaño demasiado largo, Asi la PCR permite la selección de los mutantes.- Para la cepa P-1059 de Pasteurella multocida , cebadores específicos del gen pueden ser:
En el caso de los mutantes obtenidos previamente, la PCR se llevo a cabo con los siguientes pares de cebadores y los fragmentos de PCR amplificados tuvieron un tamaño de:
Cebador especifico Cebador especifico del Tamaño de PCR del gen transposón (bp) 13E1C TnlOIR4 250 13E1C StipA 320 13E1C StipJ 1720 3A2C KTGRI 510 2F2C TnlOIRl 105 2F2C StipJ 1710 9C8C Tnl0IR4 500 12A1C TnlOIR4 310 5F11C TnlOIR4 560 5D5C StipJ 1705 4G11C StipJ 1680 12B3C StipJ 1720 5G9C StipJ 1660 9H4C TnlOIR4 585 3H2C StipJ 1690 10G11C TnlOIR4 395.
Ejemplo 6: Eficacia y protección de los mutantes de inserción de transposón contra la estimulación homologa Los mutantes de inserción de transposón derivados de la cepa 16084 de Pasteurella multocida (Ejemplo 1) se administraron mediante gotas para los ojos a pavos convencionales de tres semanas de edad. La eficacia se estudió contra una estimulación homologa ocular con la cepa 16084 de Pasteurella ultocida. 24 grupos de pavos convencionales de 3 semanas de edad se establecieron. En DO, los grupos se inocularon mediante gotas para los ojos con aproximadamente 103 CFU de los mutantes como es indicado en la siguiente tabla. Un grupo de pavos convencionales de 3 semanas de edad permanecieron no vacunados y sirvieron como controles (Grupo 25) . Todos los pavos se estimularon en
D23 usando la cepa 16084 de Pasteurella multocida administrada mediante gotas para los ojos a 108 CFU por ave . La mortalidad se registró diariamente durante 2 semanas después de la estimulación. Al final del estudio (D37), un examen clínico se llevó a cabo para determinar el estado de salud de las aves sobrevivientes. La proporción de protección se calculó considerando el número de aves estimuladas y el número de aves saludables en D37.
Grupo Mutan-te Número de Proporción de aves protección Grupo 1 1G4 8 25% Grupo 2 4F4 10 40% Grupo 3 3A2 6 67% Grupo 4 1G8 10 50% Grupo 5 13E1 22 82% Grupo 6 5D5 22 68% Grupo 7 7F8 10 40% Grupo 8 11E8 10 20% Grupo 9 9C8 22 82% Grupo 10 4G11 20 100% Grupo 11 12B3 6 100% Grupo 12 10G11 10 20% Grupo 13 5G9 8 63% Grupo 14 12A1 10 50% Grupo 15 2F2 10 20% Grupo 16 5F11 10 30% Grupo 17 9H4 7 100% Grupo 18 3H2 10 40% Grupo 19 Control 41 7% Para algunos grupos, estos experimentos se han reproducido en la proporción de protección es el resultado acumulativo. Algunos de los mutantes de la invención no se probaron en estos experimentos.
Ejemplo 7: Eficacia y protección de los imitantes de inserción de transposón contra la estimulación heteróloga Los mutantes de inserción de transposón derivados de la cepa 16084 de Pasteurella multocida (Ejemplo 1) se administraron mediante gotas para los ojos a pavos convencionales de tres semanas de edad. La eficacia se estudió contra una estimulación heteróloga ocular con la cepa X73 de Pasteurella multocida (USDA) . Cinco grupos de 10 pavos convencionales de 3 semanas de edad se establecieron. En DO, los grupos se inocularon mediante gotas para los ojos con aproximadamente 103 CFU de los mutantes como es indicado en la siguiente tabla. Un grupo de 10 pavos convencionales de 3 semanas de edad permanecieron sin vacunar y sirvieron como controles (Grupo 6) . Todos los pavos se estimularon en D21 usando la cepa X73 de · Pasteurella multocida administrada mediante gotas para los ojos en 106 CFU por ave. La mortalidad se registró diariamente por dos semanas después de la estimulación. Al final del estudio (D36) , se llevó a cabo un examen clínico para determinar el estado de salud de las aves sobrevivientes.
La proporción de protección se calculó considerando el número de aves estimuladas y el número de aves saludables en D36.
Ejemplo 8 : Construcción de mutan es de supresión definidos mediante conjugación Inicialmente , el gen dirigido más las secuencias de DNA flanqueantes se amplificaron mediante PCR . usando polimerasa de alta fidelidad y se clonaron en un vector de clonación adecuado. Se diseñan cebadores de PCR que suprimen el gen cuando se utiliza en la PCR inversa para generar una construcción inicial. Los cebadores de PCR contienen un sitio Xbal para introducir un nuevo sitio de restricción y de esta manera proporcionar un marcador para la supresión del gen. Las construcciones de supresión luego son transferidas en un vector suicida pCVD442 (Donnenberg y colaboradores, Infection and Immunity, 1991, 59:4310-4317) para la transferencia al cromosoma de Pasteurella. Los plásmidos pCVD442 luego se transforman en la cepa e??????t de E. coli. Esta construcción se introduce en la cepa de P. multocida 16084 (CDM) mediante conjugación con SM10 pir/PCVD442 de E. coli. Los tranformantes y recombinantes que contienen el plásmido integral en el cromosoma en el sitio homólogo (merodiploides ) se seleccionan usando el marcador de resistencia al antibiótico presente en el plásmido pCVD442 plasmid (gen de resistencia a la ampicilina) . Los mutantes de Pasteurella se seleccionan en placas de agar BHI complementadas con ampicilina 1 µg/ml. El plásmido pCVD442 requiere la proteina Pir para la replicación. Esta proteina es codificada por el gen pir, que está presente como un lisógeno de fago lambda en la cepa SMlC^pir donadora, pero no en la P. multocida- recipiente. Asi el plásmido pCVD442 no se replica en la cepa de P. nultocida recipiente: colonias resistentes al antibiótico son por lo tanto solamente obtenidas si el plásmido se integra en el cromosoma. Este vector suicidad también contiene el gen sacB que codifica la enzima levan sucrasa, que es tóxica para- la mayoría de bacterias Gram negativas en la presencia de sacarosa. La selección de sacarosa por lo tanto se puede emplear como una contraselección para aislar colonias en la cual un segundo evento de recombinación ha ocurrido, dando por resultado la perdida del plásmido del cromosoma. Este segundo evento de recombinación puede resultar en dos efectos, regeneración del alelo de tipo silvestre o generación de un mutante de supresión. Las colonias que contienen la mutación de supresión son identificadas mediante la PCR de colonia. Ejemplo 9 : Construcción de mutantes de supresión definidos mediante electroporacion Inicialmente, gen dirigido más la secuencia de DNA flanqueante son amplificadas mediante PCR usando polimerasa de alta fidelidad y clonados en un vector de clonación adecuado. Se diseñan cebadores de PCR que suprimen el gen cuando se utiliza en la PCR inversa para generar una construcción inicial. Los cebadores de PCR contienen un sitio Xbal para introducir un nuevo sitio de restricción y de esta manera proporcionar un marcador para la supresión del gen. Las construcciones de supresión luego son transferidas a un vector suicida pCVD442 para la transferencia al cromosoma de .Pasteurella. Esta - construcción se introduce en la cepa de dé P. multocida 16084 (CDM) mediante electroporacion. Para retirar la cápsula extracelular sustancial de 16084, las células en fase estacionaria son tratadas con hialuronidasa testicular ovina (tipo V, filtro esterilizado antes del uso, concentración final 25 µg ml) durante 1 hora antes de la cosecha y el lavado de la célula. El pCVD442 (1.5 µg) se mezcla con la suspensión de células en glicerol al 10% (0.05 i, 1010 celula/ml) justo antes del pipeteo de la mezcla en las probetas de electroporación de 1 mm enfriadas con hielo (Biorad, Hercules, CA, EUA) . El GenePulser (Biorad) se utiliza para pulsar las células (12.5 kV/cm, 250 ohms, 40, µ? . Inmediatamente después de la pulsación, las células se diluyen con 1 mi de BHI y porciones de cultivo (5-50 µ?) se extienden rápidamente (dentro de 1-5 minutos) sobre placas de agarg de BHI que contiene 1 µg/ml de ampicilina. Los recombinantes que contienen el plásmido integral en el cromosoma en el sitio homólogo (merodiploides) se selecciona usando el marcador de resistencia a antibiótico presente en el plásmido (gen de resistencia a la ampicilina) . El plásmido pCVD442 no se replica en la cepa de P. multocida recipiente: las colonias resistentes al antibiótico por lo tanto solamente se obtienen si el plásmido se integra en el cromosoma. Este vector suicida también contiene el gen sacB que codifica la enzima levan sucrasa, que es tóxica para la mayoría de bacterias gram negativas en la presencia de sacarosa. La selección con sacarosa por lo tanto se puede emplear como una .contraselección para aislar colonias donde un segundo evento de recombinación ha ocurrido, resultando en la perdida del plásmido del cromosoma: este segundo evento de recombinación puede resultar en dos efectos, regeneración del alelo de tipo silvestre o generación de un mutante de supresión.
Las colonias aparecen después de la incubación a 37°C durante 2-4 días. La dispersión de las colonias sobre placas similares aisla los transformantes individuales. Las colonias que contienen la mutación de supresión son identificadas mediante la PCR de colonia. Ejemplo 10 : Vacuna y prueba de eficacia Los inutantes de supresión atenuados obtenidos en el Ejemplo 8 o 9 se cultivan en el medio de cultivo CDM (Hu y colaboradores, Infection and Immunity 1986, 804-810) bajo condiciones de agitación durante 24 a 48 horas. El cultivo se cosecha cuando el crecimiento se detiene, que es seguido por la medición de la densidad óptica (OD) o el pH. La concentración bacteriana se determina mediante la densidad óptica y cuando es necesario la concentración se ajusta a una concentración final de 109 CFU por mi con- medio de cultivo fresco. La eficacia de la vacuna se prueba en pavos de 3 semanas de edad mediante la vacunación y la estimulación. Los pavos se verifican antes de la vacunación para la ausencia de anticuerpos de Pasteurella mediante ELISA de las muestras de sangre. Un primer grupo de pavos se vacuna mediante la inyección de 108 CFU en 0.1 mi por la vía de la ruta ocular.
Un segundo grupo permaneció sin vacunar (grupo de control) . Todos los animales se estimulan en D21 o D23 con la cepa P-1059- de P. multocida mediante la ruta ocular (108 CFU en 0.1 mi por animal) . La mortalidad se observa cada día hasta D35. Una mortalidad menor se observa en los animales vacunados comparados con los controles. La invención adicionalmente es descrita por los siguientes párrafos: 1- Un mutante de una bacteria gram negativa, en donde la bactreria tiene una mutación en una secuencia de nucleótidos que codifica para un polipéptido que tiene una identidad que es igual o mayor que 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% con una secuencia de aminoácidos codificada por una secuencia de nucleótidos seleccionada del grupo que consiste de secuencias de nucleótidos identificadas como SEQ ID NO: 2, 6, 9, 12r 16, 19, 22, 25, 28, 31, 34, 37, ¦ 40, 43, 46, 49. 52, 55, 58, 61, 64, 67, 70, 75, 78, 81, 84, 87, 90, 93, la mutación que resulta en la virulencia atenuada de la bacteria. 2- El mutante del párrafo 1, en donde la bacteria es una Pasteurellaceae. 3- EL mutante del párrafo 2, en donde la bacteria es elegida entre el grupo de: Pasteurella multocida, Pasteurella haemolytica , Pasteurella anatipestifer y Actinobacillus pleuropneumoniae . 4- El mutante del párrafo 3, en donde la bacteria es Pasteurella multocida . 5- El mutante de cualquiera de los párrafos 1 a , en donde la mutación es una supresión en la secuencia de nucleótidos, o una inserción en ésta o el reemplazo de ácidos nucleicos. 6- El mutante del párrafo 5, en donde la mutación es la supresión de la secuencia de nucleótidos completa. 7- El mutante del párrafo 5, en donde la inserción se hace entre: los nucleótidos 180-181 o 182-183 o 190-191 en la SEQ ID NO: 2, 77-78 o 1026-1027 o 1027-1028 en la SEQ ID NO: 6, 416-417 en la SEQ ID NO: 9, 389-390 en la SEQ ID NO: 12, 381-382 en la SEQ ID NO: 16, 219-220 en la SEQ ID NO: 19, 1353-1354 en la SEQ ID NO: 22, 136-137 en la SEQ ID NO: 25, 384-385 en la SEQ ID NO: 28', 222-223 o 225-226 en la SEQ ID NO: 31, 217-218 en la SEQ ID NO: 34, 1411-1412 en la SEQ . ID NO: 37, 943-944 en la SEQ ID NO: 40, 855-856 en la SEQ ID NO: 43, 369-370 en la SEQ ID NO: 46, 111-112 en la SEQ ID NO: 49, 443-444 en la SEQ ID NO: 52, 4-5 en la SEQ ID NO: 55, inmediatamente corriente arriba del nucleótido 1 en la SEQ ID NO: 58, 573-574 en la SEQ ID NO: 61, 875-876 en la SEQ ID NO: 64, inmediatamente corriente arriba del nucleótido 1 en la SEQ ID NO: 67, 218-219 en la SEQ ID NO: 70, 1072-1087 en la SEQ ID NO: 75, 64-65 en la SEQ ID NO: 78, 282-283 en la SEQ ID NO: 81, 1431-1432 en la SEQ ID NO: 84, 974-975 en la SEQ ID NO: 87, 802-803 en lan SEQ ID NO: 90, 850-851 en la SEQ ID NO: 92. 8- El mutante de cualquiera de los párrafos 1 a 7, que comprende una secuencia de ácido nucleico heteróloga que codifica para el inmunógeno de un agente patogénico viral, parasítico o bacteriano, para una proteína terapéutica, para un alérgeno, para un factor de crecimiento o para una citoquina. 9- Una composición inmunogénica que comprende un mutante atenuado de conformidad con cualquiera de los párrafos 1 a 8, y un diluyente, portador, vehículo o excipiente farmacéuticamente aceptable. 10- La composición inmunogénica del párrafo 9, que comprende además un adyuvante. 11- Una vacuna que comprende un mutante atenuado de conformidad con cualquiera de los párrafos 1 a 8 y un diluyente, potador, vehículo o excipiente farmacéuticamente aceptable . 12- La vacuna del párrafo 11, que comprende además un adyuvante. 13- Una composición inmunogénica que comprende un polipéptido que tiene una identidad que es igual o mayor que 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, o 99% con una secuencia de aminoácidos codificada por una secuencia de nucleótidos seleccionada del grupo que consiste de las secuencias de nucleótidos identificadas como SEQ ID NO: 2, 6, 9, 12, 16, 19, 22, 25, 28, 31, 34, 37, 40, 43, 46, 49, 52, 55, 58, 61, 64, 67, 70, 75, 78, 81, 84, 87, 90, 93 y un diluyente, potador, vehículo o excipiente farmacéuticamente aceptable y opcionalmente un adyuvante. 14- Un preparación de anticuerpo que comprende un anticuerpo específico a un polipéptido que tiene une identidad que es igual o mayor que 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, o 99% con una secuencia de aminoácidos codificada por "una secuencia de nucleótidos seleccionada del grupo que consiste de secuencias de nucleótidos identificadas com SEQ ID NO: 2, 6, 9, 12, 16, 19, 22, 25, 28, 31, 34, 37, 40, 43, 46, 49, 52, 55, 58, 61, 64, 67, 70, 75, 78, 81, 84, 87, 90, 93. 15- Método de diagnóstico para detectar la infección por una bacteria gram negativa, usando un polipéptido que tiene una identidad que es igual o mayor que 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% con una secuencia de aminoácidos codificada por una secuencia de nucleótidos seleccionada del grupo que consiste de secuencias de nucleótidos identificadas como SEQ ID NO: 2, 6, 9, 12, 16, 19, 22, 25, 28, 31, 34, 37, 40, 43, 46, 49, 52, 55, 58, 61, 64, 67, 70, 75, 78, 81, 84, 87, 90, 93 o un anticuerpo especifico al polipéptido . 16- Uso de una preparación de anticuerpo de conformidad con el párrafo 14 para la producción de una composición de inmunización pasiva o una composición terapéutica contra bacterias gram negativas. 17- Uso de una secuencia de nucleótidos seleccionada del grupo que consiste de secuencias de nucleótidos identificadas como SEQ ID NO: 2, 6, 9, 12, 16,
19, 22, 25, 28, 31, 34, 37, 40, 43, 46, 49, 52, 55, 58, 61,
64, 67, 70, 75, 78, 81, 84, 87, 90, 93 o un fragmento de po'r lo menos 20 nucleótidos, como cebadores para PCR para detección de una bacteria gram negativa en un medio. * * *
Habiéndose descrito de esta manera en detalle las modalidades preferidas de la presente invención, se va a entender que la invención definida por los párrafos anteriores no va a ser limitada a los detalles particulares expuestos en la descripción anterior ya que muchas variaciones evidentes de la misma son posibles sin apartarse del espíritu o alcance de la presente invención.
Claims (1)
- REIVINDICACIONES 1. Un mutante de una bacteria gram negativa que tiene una mutación en una primera secuencia de nucleótidos que codifica para un primer polipéptido y resulta en la bacteria que tiene virulencia atenuada, caracterizado porque : el primer polipéptido tiene una secuencia de aminoácidos; un segundo polipéptido tiene una secuencia de aminoácidos codificada por una secuencia de nucleótidos identificada como SEQ ID NO: 2, 6, 9, 12, 16, 19, 22, 25, 28", 31, 34, 37, 40, 43, 46, 49, 52, 55, 58, 61, 64, 67, 70, 75, 78, 81, 84, 87, 90 o 93; y la secuencia de aminoácidos del primer polipéptido es la misma como aquella del segundo polipéptido, o la secuencia de aminoácidos del primer polipéptido tiene una identidad que es igual o mayor que 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, o 99% con la secuencia de aminoácidos del segundo polipéptido. 2. El mutante de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque la bacteria es una Pasteurellaceae. ¦ 3. El mutante de conformidad con la reivindicación 2, caracterizado porque la bacteria es: Pasteurella multocida , Pasteurella haemolytica, Pasteurella anatipestifer o Actinobacillus pleuroneumoniae. 4. El mutante de conformidad con la reivindicación 3, caracterizado porque la bacteria es Pasteurella multocida . 5. El mutante de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque la mutación es una supresión en la primera secuencia de nucleótidos o una inserción en ésta o reemplazo de ácido nucleicos. 6. El mutante de conformidad con la reivindicación 5, caracterizado porque la mutación es la supresión de la primera secuencia de nucleótidos completa. 7. El mutante de conformidad con la reivindicación 5, caracterizado porque la mutación es una- inserción entre: los nucleótidos 180-181 o los nucleótidos 182-183 o los nucleótidos 190-191 en la SEQ ID NO: 2, lo.s nucleótidos 77-78 o los nucleótidos 1026-1027 o los nucleótidos 1027-1028 en la SEQ ID NO: 6, los nucleótidos 416-417 en la SEQ ID NO: 9, ios nucleótidos 389-390 en la SEQ ID NO: 12, los nucleótidos 381-382 en la SEQ ID NO: 16, los nucleótidos 219-220 en la SEQ ID NO: 19, los nucleótidos 1353-1354 en la SEQ ID NO: 22, los nucleótidos 136-137 en la SEQ ID NO: 25, los nucleótidos 384-385 en la SEQ ID NO: 28, los nucleótidos 222-223 o los nucleótidos 225-226 en la SEQ ID NO: 31, los nucleótidos 217-218 en la SEQ ID NO: 34, los nucleótidos 1411-1412 en la SEQ ID NO: 37, los nucleótidos 943-944 en la SEQ ID NO: 40, los nucleótidos 855-856 en la SEQ ID NO: 43, los nucleótidos 369- 370 en la SEQ ID NO: 46, los nucleótidos 111-112 en la SEQ ID NO: 49, los nucleótidos 443-444 en la SEQ ID NO: 52, los nucleótidos 4-5 en la SEQ ID NO: 55, los nucleótidos 573-574 en la SEQ ID NO: 61, los nucleótidos 875-876 en la SEQ ID NO: 64, los nucleótidos 218-219 en la SEQ ID NO: 70, los nucleótidos 1072-1087 en la SEQ ID NO: 75, los nucleótidos 64-65 en la SEQ ID NO: 78, los nucleótidos 282-283 en la SEQ ID NO: 81, los nucleótidos 1431-1432 en la SEQ ID NO: 84, los nucleótidos 974-975 en la SEQ ID NO: 87, los nucleótidos 802-803 en la SEQ ID NO: 90, los nucleótidos 850-851 en la SEQ ID NO: 92; o inmediatamente corriente arriba del nucleótido 1 en la SEQ ID NO: 58; o inmediatamente corriente arriba del nucleótido 1 en la SEQ ID NO: 67. 8. El mutante de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque comprende una secuencia de ácido nucleico heterologa. 9. El mutante de conformidad con la reivindicación 9, caracterizado porque la secuencia de ácido nucleico heterologa codifica para un inmunógeno desde un agente patogénico viral, parasítico o bacteriano, una proteína terapéutica, un alérgeno, un factor de crecimiento o una citoquina 10. Una composición inmunogénica o vacuna, caracterizada porque comprende un mutante de conformidad con la reivindicación 1 y un diluyente, portador, vehículo o excipiente farmacéuticamente o veterinariamente aceptable. 11. La composición inmunogénica o vacuna de conformidad con la reivindicación 10, caracterizada porque además comprende un adyuvante. 12. Una composición inmunogénica o vacuna, caracterizada porque comprende un mutante de conformidad con la reivindicación 9 y un diluyente, portador, vehículo o excipiente farmacéuticamente o veterinariamente aceptable. 13. La composición inmunogénica o vacuna, de conformidad con la reivindicación 12, caracterizada porque además comprende un adyuvante. 14. Un primer polipéptido aislado que tiene una secuencia de aminoácidos, caracterizado porque hay: un segundo polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos codificada por una secuencia de nucleótidos identificada como SEQ ID NO: 2, 6, 9, 12, 16, 19, 22, 25, 28,. 31, 34, 37, 40, 43, 46, 49, 52, 55, 58, 61, 64, 67, '70, 75, 78, 81, 84, 8^,- 90 o 93; y la secuencia de aminoácidos del primer polipéptido es la misma como aquella del segundo polipéptido, o la secuencia de aminoácidos del primer polipéptido tiene una identidad que es igual o mayor que 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% con la secuencia de aminoácidos del segundo polipéptido. 15. Una composición inmunogénica o vacuna, caracterizada porque contiene el primer polipéptido aislado U S de la reivindicación 14 y un diluyente, portador, vehículo o excipiente farmacéuticamente o veterinariamente aceptable y opcionalmente un adyuvante 16. Una preparación de anticuerpo, caracterizada porque comprende un anticuerpo específico al primer polipéptido aislado de la reivindicación 14. 17. Un método de diagnóstico para detectar la infección mediante una bacteria gram negativa, caracterizado porque comprende detectar en una muestra del primer polipéptido aislado de la reivindicación 14 o un anticuerpo específico para ese primer polipéptido aislado. 18. Un método de inmunización pasiva, caracterizado porque comprende administrar la preparación de anticuerpo de conformidad con la reivindicación 16. 19. Una molécula de ácido nucleico aislada, caracterizada porque tiene una secuencia identificada como SEQ ID NO: 2, 6, 9, 12, 16, 19, 22, 25, 28, 31, 34, 37, 40, 43, 46, 49, 52, 55, 58, 61, 64, 67, 70, 75, 78, 81, 84, 87, 90 o 93. 20. Un cebador de PCR para detectar una bacteria gram negativa, caracterizado porque comprende una molécula de ácido nucleico aislada que tiene una secuencia que es por lo menos 10 ácidos nucleicos contiguos de una secuencia de nucleótidos identificada como SEQ ID NO: 2, 6, 9, 12, 16, 19, 22, 25, 28, 31, 34, 37, 40, 43, 46, 49, 52, 55, 58, 61, 64, 67, 70, 75, 78, 81, 84, 87, 90 o 93. 21. El mutante de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el mutante es una bacteria gram negativa mutante que tiene una mutación en una secuencia de nucleótidos que codifica para un polipéptido y resulta en la bacteria que tiene virulencia atenuada, en donde: el polipéptido tiene una secuencia de aminoácidos codificada por una secuencia de nucleótidos identificada como SEQ ID NO: 2, 6, 9, 12, 16, 19, 22, 25, 28, 31, 34, 37, 40, 43, 46, 49, 52, 55, 58, 61, 64, 67, 70, 75, 78, 81, 84, 87, 90 o 93. 22. El polipéptido aislado de conformidad con la reivindicación 14, caracterizado porque tiene una secuencia de aminoácidos codificada por una secuencia de nucleótidos identificada como SEQ' ID NO: 2, 6, 9, 12, · 16, 19, 22, 25, 28, 31, 34, 37, 40, 43, 46, 49, 52, 55, 58, 61, 64, 67,. 70, 75, 78, 81, 84, 87, 90 o 93. 23. El mutante de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque es el mutante 4G11 disponible bajo el número de acceso CNCM 1-2999, o una bacteria que tiene todas las características de identificación del mismo; el mutante 5D5 disponible bajo el número de acceso CNCM 1-3000, o una bacteria que tiene todas las características de identificación del mismo; el mutante 9C8 disponible bajo el número de acceso CNCM 1-3001 o una bacteria que tiene todas las características de identificación del mismo; el muíante 9H4 disponible bajo el número de acceso CNCM 1-3002, o una bacteria que tiene todas las características de identificación del mismo; o el mutante 13E1 disponible bajo el número de acceso CNCM 1-3003 o una bacteria que tiene todas las características de identificación del mismo. 24. Una molécula de ácido nucleico aislada, caracterizada porque tiene una secuencia identificada como SEQ ID NO: 1, 4, 5, 8, 11, 14, 15, 18, 21, 24, 27, 30, 33, 36, 39, 42, 45, 48, 51, 54, 57, 60, 63, 66, 69, 72, 73, 77, 80, 83, 86, 89, 92, 95, 96 o 97. 25. Un cebador de PCR para detectar una bacteria gram negativa, caracterizado porque comprende una molécula de ácido nucleico aislada que tiene una secuencia que es por lo menos 10 ácidos nucleicos contiguos de ¦ una secuencia de nucleótidos identificada como SEQ ID NO: 1, 4, 5, 8, 11, 14, 15, 18, 21, 24, 27, 30, 33, 36, 39, 42, 45, 48, 51, 54, 57, 60, 63, 66, 69, 72, 73, 77, 80, 83, 86, 89, 92, 95, 96 o 97. 26. Una bacteria gram negativa mutante, caracterizada porque tiene una mutación en una secuencia de nucleótidos identificada como SEQ ID NO: 1, 4,- 5, 8, 11, 14, 15, 18, 21, 24, 27, 30, 33, 36, 39, 42, 45, 48, 51, 54, 57, 60, 63, 66, 69, 72, 73, 77, 80, 83, 86, 89, 92, 95, 96 o 97. 2 . El mutante de conformidad con la reivindicación 26, caracterizado porque es una Pasteurellaceae . 28. El mutante de conformidad con la reivindicación 26, caracterizado porque la bacteria es: Pasteurella multocida , Pasteurella haemolytica , Pasteurella anatipestifer o Actinobacillus pleuroneumoniae. 29. El mutante dé conformidad con la reivindicación 26, caracterizado porque la bacteria es Pasteurella multocida . 30. El mutante de conformidad con la reivindicación 26, caracterizado porque comprende una secuencia de ácido nucleico heteróloga. 31. El mutante de conformidad con la reivindicación 30, caracterizado porque la secuencia de ácido nucleico heteróloga codifica para un inmunógeno desde un agente patogénico viral, parasítico o bacteriano, una proteína terapéutica, un alérgeno, un factor de crecimiento o una citoquina . 32. Una composición inmunogénica o vacuna, caracterizada porque comprende un mutante de conformidad con la reivindicación 26 y un diluyente, portador, vehículo o excipiente farmacéuticamente o veterinariamente aceptable. 33. La composición inmunogénica o vacuna de conformidad con la reivindicación 32, caracterizada porque además comprende un adyuvante. 34. Una composición inmunogénica o vacuna, caracterizada porque comprende un mutante de conformidad con la reivindicación 30 y un diluyente, portador, vehículo o excipiente farmacéuticamente o veterinariamente aceptable. 35. La composición inmunogénica o vacuna de conformidad con la reivindicación 34, caracterizada porque además comprende un adyuvante. 36. Un polipéptido aislado, caracterizado porque es codificado por la molécula de ácido nucleico de la reivindicación 24.
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