JP4338528B2 - 弱毒化グラム陰性菌 - Google Patents
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Description
本発明は、弱毒化グラム陰性生細菌に関する。弱毒化株が研究者及び彼らが接触するもの（例えば、動物、ヒト）に対してより高い安全性を示すので、弱毒化グラム陰性菌を、例えば細菌感染を予防するための免疫原性組成物又はワクチン組成物、並びに研究において、用いることができる。
従って、本発明は、本発明のグラム陰性菌、例えば、弱毒化グラム陰性生細菌を含む、免疫原性組成物又はワクチン組成物に関する。この細菌は組成物中で不活性化させることもできるが、細菌は、弱毒化グラム陰性生細菌であることが好ましい。従って、本発明はさらに、かかる組成物の調製方法及び／又は製剤化方法に関する。例えば、適切な培地上又は培地中で前記細菌を培養又は成長又は増殖させ、細菌を回収し、場合によっては細菌を不活性化し、適切な獣医学上又は製薬上許容可能な担体、賦形剤、希釈剤又は媒体、及び／又はアジュバント、及び／又は安定剤と混合するか、或いは前記細菌を適切な獣医学上又は製薬上許容可能な担体、賦形剤、希釈剤又は媒体、及び／又はアジュバント、及び／又は安定剤と混合する方法が挙げられる。従って、本発明は、かかる組成物の製剤化における前記細菌の使用にも関する。
また、この弱毒化細菌は、発現又は複製ベクターとして作用することができる。例として、弱毒化細菌に、例えば、免疫原、抗原又は病原性物質（本弱毒化細菌以外の病原性物質など）由来のエピトープをコードする核酸分子に非相同の核酸分子を複製及び又は発現させるためのベクターが挙げられる。また、ベクターとして弱毒化細菌を使用することにより、弱毒化ベクターを用いて研究している研究者又は技術者及び彼らが接触し得るもの（例えば、動物、ヒト）に対してより高い安全性が得られる。
従って、本発明はさらに、例えば、細菌が非相同の核酸分子を含有し、場合によっては発現するように細菌を形質転換する、かかるベクターを調製する方法に関する。
また、本発明は、かかるベクターの使用にも関する。例えば、遺伝子産物、例えば、免疫原、エピトープ又は抗原等の細菌に非相同のポリペプチドを産生する方法で、発現に適切な条件下、遺伝子産物をコードする非相同の核酸分子を含有し発現するように形質転換された細菌を培養、成長又は増殖させるステップと、場合によってはその遺伝子産物を回収若しくは単離若しくは分離させるステップとを含む方法；又は遺伝子産物を発現するように形質転換された細菌から遺伝子産物を回収又は単離又は分離させるステップを含む方法；或いは、遺伝子産物及び／又は細菌に対する免疫応答若しくは免疫原応答、又は遺伝子産物が由来する若しくは取得される病原体及び／又は細菌に対する防御免疫反応を誘導する方法で、被験体、例えば動物（病原体及び／又は細菌による感染にかかりやすいウシ又はシチメンチョウなどの動物）に遺伝子産物を発現するように形質転換された細菌を投与することを含む方法；或いは、免疫原性組成物、免疫学的組成物又はワクチン組成物を調製する方法で、ベクター又は形質転換細菌を製薬上又は獣医学上許容可能な担体、希釈剤、媒体又は賦形剤、及び／又はアジュバンド、及び／又は安定剤と混合することを含む方法、が挙げられる。
また、本発明は、例えば、細菌を弱毒化するための標的をコードする突然変異ヌクレオチド配列又は遺伝子等の細菌を弱毒化するための標的と、細菌を弱毒化するためのポリペプチドを標的化する方法と、弱毒化細菌を生成する方法とに関する。弱毒化のための標的は、例えば、免疫原性組成物中若しくはワクチン組成物中で免疫原化合物として、又は免疫原性組成物若しくはワクチン組成物で使用するためのエピトープを産出するために用いることができる。従って、本発明は、例えば、製薬上又は獣医学上許容可能な担体、希釈剤、賦形剤又は媒体、及び／又はアジュバント、及び／又は安定剤と混合する等、組成物中での調製における弱毒化のための標的の使用に関する。
本発明はさらに、本発明のワクチン又は免疫原性組成物を動物に投与することを含む、被験体、例えば、パスツレラなどのグラム陰性菌による感染にかかりやすい動物（例えば、シチメンチョウ又はウシ）に免疫学的免疫反応又は免疫原性免疫反応又は防御免疫応答を誘導する方法に関する。
さらにまた本発明は、例えば、細菌へ１種又は複数の転位因子を導入するステップと、標的種に死をもたらさない（従って弱毒化されている）転位因子を含有する細菌を単離するステップとを含む、かかる弱毒化細菌（例えば、パスツレラなどのグラム陰性菌）の調製に関する。さらに、場合によっては、細菌の突然変異を同定することができ、それによって、弱毒化細菌を生成する選択的手段が可能となる。
本発明はさらに、弱毒化細菌を生成するためのかかる選択的手段に関する。突然変異は同定又は特徴付けされているので、例えば、相同組換えなどの、細菌へ１種又は複数の転位因子を導入する以外の相同組換え等の技術、例えば、細菌ゲノムの一部に、少なくとも１つのゲノムへの付加（挿入）、又は少なくとも１つのゲノムからの欠失（２つ以上の付加及び／又は欠失も想定される）、或いは置換（例えば、少なくとも１つのヌクレオチドを別のヌクレオチドで置換）をもたらす相同組換えによって、細菌へ突然変異を導入することができる。従って、本発明は、好ましくは組換えを介して、細菌ゲノムへ欠失又は挿入又は置換を導入するステップと、場合によっては、修飾又は突然変異を含有する細菌を同定及び／又は単離するステップとを含む、既知の、又はこれまでに同定されている修飾又は突然変異（例えば、本明細書で同定されている修飾又は突然変異）を含有する弱毒化細菌を生産する方法に関する。
従って、本発明はさらにグラム陰性菌の突然変異体であって、前記細菌が、配列番号２、６、９、１２、１６、１９、２２、２５、２８、３１、３４、３７、４０、４３、４６、４９、５２、５５、５８、６１、６４、６７、７０、７５、７８、８１、８４、８７、９０、９３として同定されているヌクレオチド配列からなる群から選択されるヌクレオチド配列によってコードされているアミノ酸配列と７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％若しくは９９％以上の同一性を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列中に少なくとも１つの突然変異を有しており、前記突然変異が細菌の弱毒化をもたらす、前記変異体に関する。さらに本発明は、本明細書に記載されているかかる細菌が関与する使用、組成物及び方法に関する。
本出願は、２００２年４月５日に出願された、米国仮出願第６０／３７０，２８２号（引用により本明細書に援用する）による優先権を主張する。この先行出願、及びその中に引用されている全ての文献、又はその審査中に引用された全ての文献「（出願引用文献」）、及び出願引用文献中に引用若しくは参照されている全ての文献、及び本明細書で引用若しくは参照されている全ての文献（「本明細書の引用文献」）、及び本明細書の引用文献中で引用若しくは参照されている全ての文献、並びに、全てのメーカーの取扱説明書、記載、製品仕様書、及び本明細書又は本明細書に引用により援用されている全ての文献に記載されている全ての製品の製品記入表は、これによって本明細書に引用により援用するものとし、本発明の実施において用いることができる。
弱毒化生存微生物は非常に効果的なワクチンであり得、かかるワクチンによって誘導される免疫反応は、多くの場合、非複製免疫原によって産出したものに比べて程度が高く、且つ長い持続性があるということが十分に立証されている。これに関する解釈の１つとしては、弱毒化生存株は宿主中で局限性感染を起こし、自然感染の初期段階を模倣するということであろう。さらに、殺菌又は不活性化された製剤とは異なり、生ワクチンは、マクロファージなどの抗原提示細胞における複製能力に関連し得る、強力な細胞性反応を誘導することができる。
特に化学的突然変異誘発技術を用いた動物及びヒトにおける弱毒化生ワクチンの使用については長い歴史がある。しかし、実験的な弱毒化ワクチン(empirically attenuated vaccines)には毒性が復帰する可能性がある。
細菌病原性に関する知識の高まりと最新の分子生物学技術によって、ｉｎ ｖｉｖｏでの微生物の増殖及び生存に関与する幾つかの遺伝子の同定を導いた。これは、弱毒化に新たな標的遺伝子を提供した。今後のワクチン株が、毒性に関連しているとして知られている選択遺伝子へ、定義された非復帰性の突然変異を導入することにより、「合理的に」弱毒化することが可能な、今後のワクチン株の構想に関しては、例えば、国際公開（ＷＯ−Ａ）第００／６１７２４号、国際公開第００／６８２６１号、及び欧州特許出願公開（ＥＰ−Ａ）第０８８９１２０号を参照されたい。
研究所では多数の弱毒化株が得られたが、動物で使用される有望なワクチン候補として適するものはほんのわずかであった。これは、１つには、微生物が復帰し、再び活性化し病原性となる可能性と、ワクチンの免疫原性とを平衡化する必要性があるためであろう。
適切なワクチン候補をもたらす、弱毒化に適当な遺伝子の選択は簡単ではなく、容易に予測することができないことは明らかである。ワクチンとしての弱毒化突然変異体の許容には多くの要因が影響を及ぼすと考えられ、従って、研究の目的達成には、適切な弱毒化遺伝子を同定し選択することが必要とされている。弱毒化実験の多くはｉｎ ｖｉｔｒｏのみで行われており、それらの結果からはｉｎ ｖｉｖｏにおける、特にワクチン注射した動物で生じる突然変異体の残留病原性に関して推定することができない。
以下のものを列挙する：
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Ｓｔｏｃｋｅｒ、米国特許第４，５５０，０８１号、第４，８３７，１５１号、第５，２１０，０３５号、及び第５，６４３，７７１号。
Ｈｉｇｈｌａｎｄｅｒ、米国特許第６，１８０，１１２号。
ＫａｃｈｌａｎｙにはＴａｄ遺伝子が記載されていた。Ｋａｃｈｌａｎｙの突然変異されたＴａｄ遺伝子と弱毒化の間には相関はない。Ｋａｃｈｌａｎｙでは動物試験は行われておらず、また本発明ではＴａｄ遺伝子は選択されていない。Ｆｕｌｌｅｒの報告には本発明では選択されていない配列が含まれている。Ｋｅｈｒｅｎｂｅｒｇには、弱毒化突然変異体、又は標識タグ付き突然変異誘発（Signature Tagged Mutagenesis）、すなわちＳＴＭ技術は含まれていなかった；しかしもっと正確に言えば、Ｋｅｈｒｅｎｂｅｒｇには、トランスポゾンの部位特異的挿入が記載されていた（同一挿入配列の使用）。ＤｅＡｎｇｅｌｉｓの１９９８ａには、ＳＴＭ技術の一般的な記載のみが提供されており、突然変異体自体について記載はない。ＤｅＡｎｇｅｌｉｓの１９９８ｂには、ＨＡ生合成遺伝子座（Ｇｅｎｂａｎｋ ＡＦ０３６００４）にトランスポゾンを挿入するためにＳＴＭ技術を使用することが記載されていた。この配列はＰＭ７０の配列Ｐｍ０７７５の相同体である。Ｐｍ０７７５をコードする配列は本発明では選択されていない。ＬｅｅはＴｎ１０トランスポゾンを用いたＳＴＭ技術を使用していたが、Ｌｅｅは動物実験に関するいかなる試験も、又は弱毒化突然変異体についてのいかなる探索も記載又は示唆していない。もっと正確に言えば、Ｌｅｅには栄養要求性突然変異体のみが記載されていた。ＣｈｏｉはPasteurella multocidaトランスポゾン挿入突然変異体に言及している。この突然変異体により誘発された死は認められなかったかもしれないが、Ｃｈｏｉにはトランスポゾン挿入の位置に関する詳細は記載されておらず、従って、再現可能であると言うことはできない。同様に、Ｎｎａｌｕｅには本発明は教示又は示唆されていない。Ｓｔｏｃｋｅｒの特許には、ａｒｏＡ遺伝子にＴｎ１０トランスポゾンを挿入することが記載されていた。しかし、ＡｒｏＡ遺伝子は本発明では選択されていない。Ｈｉｇｈｌａｎｄｅｒには、不活性ロイコトキシンにｌｋｔＣ遺伝子中のＴｎ１５４５トランスポゾンを挿入することが記載されている。しかし、ＬｋｔＣ遺伝子は本発明では選択されていない。従って、本発明は確かに当技術分野では教示又は示唆されていないと考えられる。
さらに、弱毒化に関係する遺伝子配列又は核酸配列を特徴付けること、及びこれをもとにした弱毒化細菌の開発、並びに弱毒化ワクチン又は免疫原性組成物、例えば、高い免疫原性を有するもの、及び副作用が制限された、又は副作用のない良好な安全性プロファイルを示すものの開発が望まれている。
本発明は、第１のポリペプチドをコードし、且つ弱毒化細菌をもたらす、第１のヌクレオチド配列中に突然変異を有するグラム陰性菌の突然変異体であって、
第１のポリペプチドがアミノ酸配列を有しており、
第２のポリペプチドが、配列番号２、６、９、１２、１６、１９、２２、２５、２８、３１、３４、３７、４０、４３、４６、４９、５２、５５、５８、６１、６４、６７、７０、７５、７８、８１、８４、８７、９０、又は９３として同定されているヌクレオチド配列によってコードされているアミノ酸配列を有しており、
第１のポリペプチドのアミノ酸配列が第２のポリペプチドのアミノ酸配列と同一であるか、第１のポリペプチドのアミノ酸配列が第２のポリペプチドのアミノ酸配列と７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％若しくは９９％以上の同一性を有している、前記変異体を提供する。
第１のポリペプチドがアミノ酸配列を有しており、
第２のポリペプチドが、配列番号２、６、９、１２、１６、１９、２２、２５、２８、３１、３４、３７、４０、４３、４６、４９、５２、５５、５８、６１、６４、６７、７０、７５、７８、８１、８４、８７、９０、又は９３として同定されているヌクレオチド配列によってコードされているアミノ酸配列を有しており、
第１のポリペプチドのアミノ酸配列が第２のポリペプチドのアミノ酸配列と同一であるか、第１のポリペプチドのアミノ酸配列が第２のポリペプチドのアミノ酸配列と７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％若しくは９９％以上の同一性を有している、前記変異体を提供する。
変異細菌はパスツレラセエ（Pasteurellaceae）であってよく、例えば、その細菌は、パスツレラ・ムルトシダ（Pasteurella multocida）、パスツレラ・ヘモリティカ（Pasteurella haemolytica）、パスツレラ・アナティペスティファ（Pasteurella haemolytica）、又はアクチノバチルス・プルロニューモニエ（Actinobacillus pleuropneumoniae）であってよく、そのうちパスツレラ・ムルトシダが好ましい。
突然変異は、第１のヌクレオチド配列における欠失、又は第１のヌクレオチド配列への挿入、又は核酸の置換であってよく、例えば、第１のヌクレオチド配列全体の欠失であり；或いは、配列番号２中のヌクレオチド１８０〜１８１、又はヌクレオチド１８２〜１８３、又はヌクレオチド１９０〜１９１、配列番号６中のヌクレオチド７７〜７８、又はヌクレオチド１０２６〜１０２７、又はヌクレオチド１０２７〜１０２８、配列番号９中のヌクレオチド４１６〜４１７、配列番号１２中のヌクレオチド３８９〜３９０、配列番号１６中のヌクレオチド３８１〜３８２、配列番号１９中のヌクレオチド２１９〜２２０、配列番号２２中のヌクレオチド１３５３〜１３５４、配列番号２５中のヌクレオチド１３６〜１３７、配列番号２８中のヌクレオチド３８４〜３８５、配列番号３１中のヌクレオチド２２２〜２２３又はヌクレオチド２２５〜２２６、配列番号３４中のヌクレオチド２１７〜２１８、配列番号３７中のヌクレオチド１４１１〜１４１２、配列番号４０中のヌクレオチド９４３〜９４４、配列番号４３中のヌクレオチド８５５〜８５６、配列番号４６中のヌクレオチド３６９〜３７０、配列番号４９中のヌクレオチド１１１〜１１２、配列番号５２中のヌクレオチド４４３〜４４４、配列番号５５中のヌクレオチド４〜５、配列番号６１中のヌクレオチド５７３〜５７４、配列番号６４中のヌクレオチド８７５〜８７６、配列番号７０中のヌクレオチド２１８〜２１９、配列番号７５中のヌクレオチド１０７２〜１０８７、配列番号７８中のヌクレオチド６４〜６５、配列番号８１中のヌクレオチド２８２〜２８３、配列番号８４中のヌクレオチド１４３１〜１４３２、配列番号８７中のヌクレオチド９７４〜９７５、配列番号９０中のヌクレオチド８０２〜８０３、配列番号９２中のヌクレオチド８５０〜８５１；又は配列番号５８のヌクレオチド１のすぐ上流；又は配列番号６７のヌクレオチド１のすぐ上流の間の挿入であってよい。
本突然変異体は、非相同の核酸配列、例えば、ウイルス性、寄生虫性若しくは細菌性病原体由来の免疫原、治療用タンパク質、アレルゲン、増殖因子、又はサイトカインをコードする非相同核酸配列を含んでいてよい。
また本発明は、本発明による突然変異体、及び製薬上又は獣医学上許容可能な希釈剤、担体、媒体又は賦形剤、場合によってはさらにアジュバントを含む、免疫原性組成物又はワクチンを提供する。
さらに本発明は、アミノ酸配列を有する単離された第１のポリペプチドであって、
配列番号２、６、９、１２、１６、１９、２２、２５、２８、３１、３４、３７、４０、４３、４６、４９、５２、５５、５８、６１、６４、６７、７０、７５、７８、８１、８４、８７、９０又は９３として同定されているヌクレオチド配列によってコードされているアミノ酸配列を有する第２のポリペプチドがあり、
第１のポリペプチドのアミノ酸配列が第２のポリペプチドのアミノ酸配列と同一であるか、或いは第１のポリペプチドのアミノ酸配列が、第２のポリペプチドのアミノ酸配列と７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％以上の同一性を有している、前記ポリペプチドを提供する。
配列番号２、６、９、１２、１６、１９、２２、２５、２８、３１、３４、３７、４０、４３、４６、４９、５２、５５、５８、６１、６４、６７、７０、７５、７８、８１、８４、８７、９０又は９３として同定されているヌクレオチド配列によってコードされているアミノ酸配列を有する第２のポリペプチドがあり、
第１のポリペプチドのアミノ酸配列が第２のポリペプチドのアミノ酸配列と同一であるか、或いは第１のポリペプチドのアミノ酸配列が、第２のポリペプチドのアミノ酸配列と７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％以上の同一性を有している、前記ポリペプチドを提供する。
本発明は、単離された第１のポリペプチド、及び製薬上又は獣医学上許容可能な希釈剤、担体、媒体又は賦形剤、場合によってはアジュバントを含有する免疫原性組成物又はワクチン組成物が考えられる。
さらにまた本発明は、第１の単離されたポリペプチドに特異的な抗体を含む抗体製剤が考えられる。
また本発明には、サンプル中の第１の単離されたポリペプチド、又はその第１の単離されたポリペプチドに特異的な抗体を検知することを含む、グラム陰性菌による感染を検出する診断方法が含まれる。
さらに、本発明は、前記抗体製剤を投与することを含む、受動免疫法に関する。
また本発明は、配列番号２、６、９、１２、１６、１９、２２、２５、２８、３１、３４、３７、４０、４３、４６、４９、５２、５５、５８、６１、６４、６７、７０、７５、７８、８１、８４、８７、９０、若しくは９３として同定されている配列、又は、配列番号１、４、５、８、１１、１４、１５、１８、２１、２４、２７、３０、３３、３６、３９、４２、４５、４８、５１、５４、５７、６０、６３、６６、６９、７２、７３、７７、８０、８３、８６、８９、９２、９５、９６、若しくは９７として同定されている配列を有する単離された核酸分子、並びに、配列番号２、６、９、１２、１６、１９、２２、２５、２８、３１、３４、３７、４０、４３、４６、４９、５２、５５、５８、６１、６４、６７、７０、７５、７８、８１、８４、８７、９０、若しくは９３として同定されているヌクレオチド配列、又は、配列番号１、４、５、８、１１、１４、１５、１８、２１、２４、２７、３０、３３、３６、３９、４２、４５、４８、５１、５４、５７、６０、６３、６６、６９、７２、７３、７７、８０、８３、８６、８９、９２、９５、９６、若しくは９７として同定されているヌクレオチド配列の少なくとも１０個の連続する核酸である配列を有する単離された核酸分子を含む、グラム陰性菌を検出するためのＰＣＲプライマーを提供する。プローブ又はプライマーは、少なくとも８個、好ましくは少なくとも１０個、さらに好ましくは少なくとも１２、１３、１４、又は１５個、例えば、少なくとも２０個、例えば、少なくとも２３個又は２５個、例えば、少なくとも２７個又は３０個のヌクレオチドの任意の長さであって、前記プローブ又はプライマーは、増幅しようとする配列に特有であるか、又は増幅しようとする配列中に存在し、さらに、少なくとも、例えば、グラム陰性菌の中、又はグラム陰性菌の特定の属若しくは種の中、例えば、パスツレラの中に、又はパスツレラ・ムルトシダ、パスツレラ・ヘモリティカ、パスツレラ・アナティペスティファ、若しくはアクチノバチルス・プルロニューモニエのいずれか１種の中、好ましくは、パスツレラ・ムルトシダの中に、保存されているものである。また、ＰＣＲ又はハイブリダイゼーションのプライマー又はプローブ、及びそれらに関する最適の長さについては、Ｋａｊｉｍｕｒａら、ＧＡＴＡ７（４）：７１〜７９頁（１９９０年）によって論じられている。
「免疫原性組成物（immunogenic composition）」及び「免疫学的組成物(immunological composition)」及び「免疫原性又は免疫学的組成物(immunogenic or immunological composition)」という用語は、標的化病原体に対する免疫反応を誘導するすべての組成物を網羅する。例えば、動物（鳥類、例えばシチメンチョウ、又はウシ、例えば雌ウシ）への投与又は注射後に、標的化病原体（例えば、パスツレラ・ムルトシダ）に対する免疫反応を誘導する組成物が挙げられる。「ワクチン接種組成物(vaccinal composition)」、「ワクチン(vaccine)」及び「ワクチン組成物(vaccine composition)」という用語は、標的化病原体に対する防御免疫応答を誘導するか、又は病原体に対して効果的な保護するすべての組成物を網羅する。例えば、動物（鳥類、例えばシチメンチョウ、又はウシ、例えば雌ウシ）への投与又は注射後に、標的化病原体に対する防御免疫応答を誘導するか、又は病原体（例えばＰ．ムルトシダ）に対して効果的な保護を提供するすべての組成物が挙げられる。病原体のサブユニット、例えば病原体から単離された抗原又は免疫原又はエピトープ、例えばグラム陰性菌、例えばＰ．ムルトシダなどの細菌；及びサブユニット組成物は、病原体、例えばグラム陰性菌、例えばＰ．ムルトシダなどの細菌から単離された１又は複数の抗原、免疫原又はエピトープを含むか、本質的にそれらから成る。
本明細書では、特に特許請求の範囲では、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」、「含まれている（ｃｏｍｐｒｉｓｅｄ）」、「含んでいる（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」等の用語は、米国特許法で与えられた意味を有し得る。例えば、それらは、「含む（ｉｎｃｌｕｄｅｓ）」、「含まれている（ｉｎｃｌｕｄｅｄ）」、「含んでいる（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」等を意味し得ることに注意されたい。また、「本質的に、から成っている（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ ｏｆ）」及び「本質的に、から成る（ｃｏｎｓｉｓｔｓ ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ ｏｆ）」などの用語は、米国特許法で与えられた意味を有する。例えば、それらの用語では明らかに列挙されていない要素は含まれるが、先行技術で明らかとなっている要素、又は本発明の基本的特性若しくは新しい特性に影響する要素は除外されることに注意されたい。
これらの実施形態及び他の実施形態は、以下の詳細な記載に記載されているか、或いはその記載から明らかであり、且つそれにより網羅されている。
本発明は、微生物、例えば細菌、例えばグラム陰性菌（パスツレラ・ムルトシダなど）の弱毒化に関与するヌクレオチド配列及び遺伝子、そのヌクレオチド配列によってコードされている産物（例えばタンパク質、抗原、免疫原、エピトープ）、かかるヌクレオチド配列、産物、微生物を生成する方法、並びに、例えばワクチン若しくは免疫原性組成物を調製するための使用、又は免疫学的反応若しくは免疫反応を誘導するための使用、或いはベクターとして、例えば発現ベクター（例えばｉｎ ｖｉｔｒｏ又はｉｎ ｖｉｖｏにおける発現ベクター）としての使用を提供する。
微生物のヌクレオチド配列及び遺伝子へ導入された突然変異によって、新規で非自明の弱毒化突然変異体が得られる。これらの突然変異体は、弱毒化生免疫原性組成物又は高い免疫原性を有する弱毒化生ワクチンの生産に有用である。
また、これらの突然変異体は、発現産物のｉｎ ｖｉｔｒｏにおける発現で、及びヌクレオチド配列の再生又は複製（例えばＤＮＡの複製）で、並びにｉｎ ｖｉｖｏにおける発現産物で有用となり得るベクターとして有用である。
その突然変異の同定によって、新規で非自明のヌクレオチド配列及び遺伝子、並びにそのヌクレオチド配列及び遺伝子によりコードされている新規で非自明の遺伝子産物が得られる。
かかる遺伝子産物は、抗原、免疫原及びエピトープを提供するとともに、単離された遺伝子産物として有用である。
また、かかる単離された遺伝子産物も、そのエピトープ同様、抗体を生成するのに有用であり、その抗体は診断用途に有用である。
また、エピトープ、抗原又は免疫原を提供又は生成可能なかかる遺伝子産物は、ワクチンと同様に免疫原性組成物又は免疫学的組成物に有用である。
一態様では、本発明は、ヌクレオチド配列又は遺伝子に弱毒化突然変異を含む細菌であって、前記突然変異は、遺伝子がコードするポリペプチド又はタンパク質の発現及び／又は生物活性を修飾、低減、若しくは消滅させ、その結果細菌の毒性の弱毒化を導く。
本突然変異は、その機能を阻止し、その結果として弱毒化をもたらすのに、必ずしもコード配列又は遺伝子内に位置する必要はない。また、本突然変異は、遺伝子発現の制御に関与しているヌクレオチド配列中、例えば、転写開始、翻訳及び転写終結を制御する領域中で作製され得る。従って、さらに、プロモーター及びリボソーム結合領域（一般に、これらの制御エレメントは、コード配列又は遺伝子の開始コドンの約６０〜２５０ヌクレオチド上流に位置する；Ｄｏｒｅｅ Ｓ Ｍら、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．、２００１年、１８３（６）：１９８３〜９頁；Ｐａｎｄｈｅｒ Ｋら、Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍ．、１９９８年、６６（１２）：５６１３〜９頁；Ｃｈｕｎｇ Ｊ Ｙら、ＦＥＭＳ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ ｌｅｔｔｅｒｓ、１９９８年、１６６：２８９〜２９６頁）、転写ターミネーター（一般にこのターミネーターは、コード配列又は遺伝子の停止コドンの約５０ヌクレオチド下流にある；Ｗａｒｄ Ｃ Ｋら、Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍ．、１９９８年、６６（７）：３３２６〜３６頁）も含まれる。オペロンの場合には、かかる制御領域は遺伝子又はコード配列のより遠位の上流に位置し得る。また、遺伝子間領域内の突然変異も弱毒化をもたらし得る。
このヌクレオチド配列の突然変異が、遺伝子によってコードされているポリペプチド又はタンパク質の発現及び／又は生物活性を修飾、阻害、消滅し、それによって細菌の毒性が弱毒化するようなコード配列又は遺伝子に関連しているかかる制御配列内の突然変異は、本発明で同定されている遺伝子又はコード配列内の突然変異に同等のものであり得る。
弱毒化は、細菌の病原性、及び重度の臨床的症状又は損傷を低減又は消滅させ、細菌の増殖率を低下させ、細菌による死を予防する。
本発明は、細菌、例えばグラム陰性菌、例えばパスツレラセエ属の細菌、例えばパスツレラ・ムルトシダ、パスツレラ・ヘモリティカ、パスツレラ・アナティペスティファ、及びアクチノバチルス・プルロニューモニエなどの微生物に関する。好ましくは、細菌はパスツレラ・ムルトシダである。
パスツレラ・ムルトシダはグラム陰性菌であって、生産動物における種々の疾患の原因因子であり、またヒトの日和見感染の病原体である。前記細菌は、家畜及び野生のトリの家禽コレラ、ウシ出血性敗血症及びブタ萎縮性鼻炎などの重篤なパスツレラ症の病原学的因子である（Ｈｕｎｔ ＭＬら、Ｖｅｔ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、２０００年、７２（１−２）：３〜２５頁）。単離物は血清学的に莢膜抗原に基づいた血清グループ（Ａ、Ｂ、Ｄ、Ｅ及びＦ）、又は菌体ＬＰＳ抗原に基づいた１６血清型へ分類することができる。
細菌の弱毒化に関与する潜在的なヌクレオチド配列は、標識タグ付き突然変異誘発（Signature Tagged Mutagenesis、ＳＴＭ）を用いて同定した。この方法は本明細書に引用した文献に論じられており、また国際公開第９６／１７９５１号に記載されている。
ＳＴＭには、特有の識別タグ付き（signature-tagged）トランスポゾンを微生物のゲノムへ挿入されることが含まれる。
挿入の遺伝子座では、そのゲノムヌクレオチド配列は破壊される。本発明では、得られた突然変異（従って、突然変異を保有する突然変異体）を弱毒化に関して分析する。
個々の弱毒化突然変異体の破壊領域（例えば、遺伝子又はコード配列又はオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ））の配列は、ＰＣＲ増幅（ポリメラーゼ連鎖反応）、クローニング及びトランスポゾンに隣接するＤＮＡ領域のシークエンシングによって検出される。
本発明の一実施態様では、パスツレラ・ムルトシダで機能するように国際公開第９６／１７９５１に記載されているＳＴＭ法を改良した。これらの改良には、特に、Ｔｎ５よりもむしろＴｎ１０トランスポゾンを使用し、ストレプトマイシン耐性選択よりもロイシン非含有ＣＤＭ培地の選択を使用することが含まれている。さらなる詳細は実施例で記載している。
ＳＴＭ法によって同定された潜在的な遺伝子由来の弱毒化に関与する遺伝子又はヌクレオチド配列は、動物へ本突然変異体細菌を接種した後に死亡例がないことに基づいてさらに選択する。
獣医学用途では、本発明の好ましい一態様には、動物モデルよりも、標的動物における実験上の直接的選択を実施することが含まれている。この方法では、変異細菌の適当な突然変異に関してより正確に選択することができる。パスツレラ・ムルトシダについては、パスツレラ・ムルトシダの野生の標的宿主の１つであるシチメンチョウで直接実験を行う。
十分量のプールの標識タグ付きＰ．ムルトシダ突然変異体をシチメンチョウに筋肉内注射する（例えば、０．５ｍｌ、動物１匹当たり１０７ＣＦＵ）。接種後の一定の時間に再単離されない突然変異体は弱毒化されている可能性があるものと考えられる。再単離されない突然変異体は、標識タグによるＰＣＲ増幅及び分析によって、再単離されるプール中のものとは区別される。
次いで、潜在的な各弱毒化突然変異体を筋肉内経路によりシチメンチョウに注射する（例えば、０．５ｍｌ、動物１匹当たり１０４ＣＦＵ）。シチメンチョウの死亡については、注射後７日間毎日記録する。死をもたらさない突然変異体は弱毒化されたものと考えられる。
この特定の方法をパスツレラ・ムルトシダＰ−１０５９株で実施し、多数の弱毒化突然変異体を得た。これらのうち５株は２００３年４月１日にフランス国パリ所在のパスツール研究所のＣＮＣＭ（Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ Ｎａｔｉｏｎａｌｅ ｄｅ Ｃｕｌｔｕｒｅｓ ｄｅ Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｓ）に寄託されている。４Ｇ１１突然変異体はアクセッション番号ＣＮＣＭ Ｉ−２９９９により入手可能である。５Ｄ５突然変異体はアクセッション番号ＣＮＣＭ Ｉ−３０００により入手可能である。９Ｃ８突然変異体はアクセッション番号ＣＮＣＭ Ｉ−３００１により入手可能である。９Ｈ４突然変異体はアクセッション番号ＣＮＣＭ Ｉ−３００２により入手可能である。１３Ｅ１突然変異体はアクセッション番号ＣＮＣＭ Ｉ−３００３により入手可能である。
トランスポゾン挿入の遺伝子座に隣接しているヌクレオチド配列は、配列番号１、４、５、８、１１、１４、１５、１８、２１、２４、２７、３０、３３、３６、３９、４２、４５、４８、５１、５４、５７、６０、６３、６６、６９、７２、７３、７７、８０、８３、８６、８９、９２、９５、９６、９７で表されている。
トランスポゾンは、各配列１、８、１１、１４、１５、２７、３３、４２、５４、５７、６６、７２、７３、７７、８０、９５及び９７の５’末端に近接して、また各配列４、５、１８、２１、２４、３０、３６、３９、４５、４８、５１、６０、６３、６９、８３、８６、８９及び９６の３’末端に近接して、パスツレラ・ムルトシダＰ−１０５９株に挿入した。突然変異体９Ｈ４については、トランスポゾンは、配列番号９２の配列の位置８５０〜８５１のヌクレオチド間に挿入した。
本発明の詳細な態様は、配列番号１、４、５、８、１１、１４、１５、１８、２１、２４、２７、３０、３３、３６、３９、４２、４５、４８、５１、５４、５７、６０、６３、６６、６９、７２、７３、７７、８０、８３、８６、８９、９２、９５、９６及び９７の配列から選択される配列を含む遺伝子若しくはＯＲＦ、及び／又はそれらの制御領域中に弱毒化突然変異を有するパスツレラ・ムルトシダＰ−１０５９株の弱毒化突然変異体である。
さらに本発明の詳細な実施形態には、ブダペスト条約の条件のもとにＣＮＣＭに寄託されている、本明細書に記載の弱毒化突然変異体などの弱毒化突然変異体が含まれている。
弱毒化Ｐ−１０５９突然変異体は、例えば、トランスポゾン挿入によって、又は部位特異的変異技術（欠失、挿入、置換）によって得ることができる。弱毒化突然変異は、これらのヌクレオチド配列又は遺伝子内に、並びにそれらの相補的配列内に作製することができる。また、この弱毒化突然変異は、前記遺伝子又はヌクレオチド配列の制御領域に含まれているヌクレオチド配列で作製することができる。
トランスポゾン挿入突然変異体を検出し選択するには、ＰＣＲプライマーとして、上述の各配列又はその一部（例えば、少なくともその１０、１５若しくは２０ヌクレオチド、例えば、少なくともその連続する１０ヌクレオチド、又は少なくともその連続する１５ヌクレオチド、さらに好ましくは、少なくともその連続する２０ヌクレオチドから各配列の完全長まで）を用いることができる。ＰＣＲは、例えば１組のプライマー、例えば、トランスポゾンに特異的なプライマー、及び突然変異されている遺伝子又はヌクレオチド配列に特異的なプライマーを含み得る。本方法は、ＰＣＲ増幅産物の予想サイズに基づいてＰＣＲ断片を増幅及び／又は検出することができる。生物、例えばパスツレラ属などのグラム陰性菌、例えばパスツレラ・ムルトシダ（例えばパスツレラ・ムルトシダＰＭ７０株又はＰ−１０５９株）（例えば、以下を参照されたい）中の対応する遺伝子若しくはＯＲＦ及び／又はそれらの制御領域に関する情報、例えば対応する遺伝子若しくはＯＲＦ及び／又はそれらの制御領域のサイズは、ＰＣＲプライマーを設計し、増幅されたＰＣＲ断片をスクリーニングし、突然変異体の選択を可能にする適切なサイズを有するものを検出するために用いることができる。
パスツレラ・ムルトシダＰＭ７０株の全ゲノムは、ＥＭＢＬデータベース、及びＭａｙ ＢＪら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、２００１年、９８（６）：３４６０〜５頁で入手可能である。配列番号１、４、５、８、１１、１４、１５、１８、２１、２４、２７、３０、３３、３６、３９、４２、４５、４８、５１、５４、５７、６０、６３、６６、６９、７２、７３、７７、８０、８３、８６、８９、９２、９５、９６、９７の配列を用いて実施したＢｌａｓｔでは、ＰＭ７０のゲノム上の相同配列が同定され、次いでＰＭ７０中の対応する遺伝子又はＯＲＦを検出することができた。
パスツレラ・ムルトシダＰＭ７０株のこれらのヌクレオチド配列は、配列番号２、６、９、１２、１６、１９、２２、２５、２８、３１、３４、３７、４０、４３、４６、４９、５２、５５、５８、６１、６４、６７、７０、７５、７８、８１、８４、８７、９０で表されている。
Ｐ−１０５９株の突然変異体９Ｈ４については、ＰＭ７０中では相同配列は見い出されなかった。Ｐ−１０５９ ＯＲＦは配列決定され、配列番号９３で表されている。
本発明の別の態様は、配列番号２、６、９、１２、１６、１９、２２、２５、２８、３１、３４、３７、４０、４３、４６、４９、５２、５５、５８、６１、６４、６７、７０、７５、７８、８１、８４、８７及び９０から選択されるヌクレオチド配列及び／又はそれらの制御領域を含む遺伝子又はＯＲＦ中に少なくとも１つの弱毒化突然変異を有するＰＭ７０株の弱毒化突然変異体である。
弱毒化突然変異は、これらのヌクレオチド配列又は遺伝子、並びにこれらの相補的配列内に作製することができる。また、弱毒化突然変異は、前記遺伝子の制御領域に含まれるヌクレオチド配列中でも作製され得る。弱毒化突然変異体は、例えばトランスポゾン挿入によって、又は部位特異的変異技術（欠失、挿入、置換）によって得ることができる。
本明細書の「相補的」という用語は、二本鎖ゲノム中の他方の鎖のヌクレオチド配列を意味し、従って、センス鎖の相補鎖としてのアンチセンス鎖と、またその逆も網羅する。また、「ヌクレオチド」という用語には、デオキシリボヌクレオチド（従って、デオキシリボ核酸、すなわちＤＮＡを構成しているもの）、リボヌクレオチド（従って、リボ核酸、すなわちＲＮＡを構成しているもの）、及びメッセンジャーリボヌクレオチド（ｍＲＮＡ）が含まれる。
より一般的には、弱毒化突然変異は、グラム陰性菌などの細菌のゲノム中に、例えば、パスツレラセエ属の細菌、例えばＰ．ムルトシダ、Ｐ．ヘモリティカ、Ｐ．アナティペスティファ、又はＡ．プルロニューモニエ、好ましくは、Ｐ．ムルトシダの種々の株のうちの任意の株（例えば、Ｐ−１０５９株、ＰＭ７０株）のゲノム中に、配列番号２、６、９、１２、１６、１９、２２、２５、２８、３１、３４、３７、４０、４３、４６、４９、５２、５５、５８、６１、６４、６７、７０、７５、７８、８１、８４、８７、９０、９３として同定されているヌクレオチド配列によってコードされているアミノ酸配列の１つに少なくとも約７０％の相同性、少なくとも約７５％の相同性、少なくとも約８０％の相同性、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％の相同性、好ましくは少なくとも約９５、９６、９７、９８、又は９９％以上の相同性を有するアミノ酸配列をコードする少なくとも１つのヌクレオチド配列中の突然変異を導入され得る。弱毒化突然変異は、これらのヌクレオチド配列又は遺伝子内、並びにこれらの相補的配列内で作製することができる。また、弱毒化突然変異は、前記遺伝子の制御領域に含まれているヌクレオチド配列内にも作製することができる。弱毒化突然変異体は、例えばトランスポゾン挿入によって、又は部位特異的変異技術（欠失、挿入、置換）によって得ることができる。得られた弱毒化突然変異体は本発明の実施形態である。詳細な実施形態は、Ｐ−１０５９の弱毒化突然変異体である。
２つのアミノ酸配列間の相同性の割合は、ＮＣＢＩ（米国国立生命工学情報センター）（米国、メリーランド州、Ｂｅｔｈｅｓｄａ）のペアワイズブラスト（pairwise blast ）及びblosum62 マトリックスにより、標準パラメーターを用いて、証明することができる。（すなわち、National Center for Biotechnology Informationのサーバー、並びにＡｌｔｓｃｈｕｌら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、１９９０年、２１５、４０３〜４１０頁で入手可能なＢＬＡＳＴ又はＢＬＡＳＴＸアルゴリズム；従って、本資料は、「ｂｌａｓｔ」という用語により、アルゴリズム又はＢＬＡＳＴ又はＢＬＡＳＴＸ及びＢＬＯＳＵＭ６２マトリックスを用いることを意味する。）
本明細書で用いられている動詞の「コードする（code）」とは、ヌクレオチド配列が実際上のコード配列に限定されることを意味するのではなく、非コード配列であるその制御配列を含む遺伝子全体を包含するものとする。
ヌクレオチド配列相同性などの配列相同性又は同一性も、ＮＣＢＩで入手可能な、Ｍｙｅｒｓ及びＭｉｌｌｅｒの「Ａｌｉｇｎ」プログラム（「Ｏｐｔｉｍａｌ Ａｌｉｇｎｍｅｎｔｓ ｉｎ Ｌｉｎｅａｒ Ｓｐａｃｅ」、ＣＡＢＩＯＳ ４、１１〜１７頁、１９８８年、引用によりこの文献は本明細書に援用する）、やＮＣＢＩサイトなどのインターネット上のサイトから、インターネットを介して入手可能な同一プログラム又は他のプログラムを用いて決定することができる。
或いは又はさらに、例えばヌクレオチド又はアミノ酸配列に関する「相同性(homology)」又は「同一性(identity)」という用語は、２つの配列間の相同性の定量的尺度を示すことができる。配列相同性のパーセントは、（Ｎｒｅｆ−Ｎｄｉｆ）＊１００／Ｎｒｅｆ（式中、Ｎｄｉｆは、整列させた場合に２つの配列で同一でない残基の総数であり、Ｎｒｅｆは、１つの配列中の残基の数である）として算出することができる。従って、ＤＮＡ配列のＡＧＴＣＡＧＴＣは、配列ＡＡＴＣＡＡＴＣと７５％の配列同一性を有する（Ｎｒｅｆ＝８；Ｎｄｉｆ＝２）。
或いは又はさらに、配列に関しての「相同性」又は「同一性」は、同一のヌクレオチド又はアミノ酸を有する位置の数を２つの配列の短い配列中のヌクレオチド又はアミノ酸の数で割ったもの意味し得る。この場合、２つの配列のアライメントは、例えば、２０ヌクレオチドのウィンドウサイズ、４ヌクレオチドのワード長、及び４ギャップペナルティーを用いて、Ｗｉｌｂｕｒ及びＬｉｐｍａｎアルゴリズム（Ｗｉｌｂｕｒ及びＬｉｐｍａｎ、１９８３年、ＰＮＡＳ ＵＳＡ、８０：７２６頁、引用により本明細書に援用する）に従って検出することができる。このアライメントを含む配列データのコンピューターによる分析及び判断は、市販のプログラム（例えば、カリフォルニア州、Ｉｎｔｅｌｌｉｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｉｎｃ．のＩｎｔｅｌｌｉｇｅｎｅｔｉｃｓ（商標）Ｓｕｉｔｅ）を用いて容易に行うことができる。ＲＮＡ配列が類似している場合、或いはＤＮＡ配列と同一性又は相同性の配列程度を有すると考えられる場合、ＤＮＡ配列中のチミジン（Ｔ）はＲＮＡ配列のウラシル（Ｕ）と同じであると考えられる。従って、ＲＮＡ配列は本発明の範囲内であり、ＲＮＡ配列中のウラシル（Ｕ）と同じであると考えられるＤＮＡ配列中のチミジン（Ｔ）によりＤＮＡ配列から導かれ得る。
好ましくは、アミノ酸配列同一性又は相同性などの配列同一性又は相同性は、ＮＣＢＩで利用可能なＢｌａｓｔＰプログラム（Ａｌｔｓｃｈｕｌら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．、２５、３３８９〜３４０２頁、引用により本明細書に援用する）、並びにインターネットを介して入手可能な同一プログラム又は他のプログラム（ＮＣＢＩサイトなど）を用いて検出することができる。
以下の文献（各文献は引用により本明細書に援用する）は、２種類のタンパク質のアミノ酸残基などの配列の相対的同一性若しくは相同性を比較するアルゴリズムを提供しており、さらに又は或いは先の記述に関して、これらの文献での開示を相同性又は同一性のパーセントの検出に用いることができる：Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ ＳＢ及びＷｕｎｓｃｈ ＣＤ、「Ａ ｇｅｎｅｒａｌ ｍｅｔｈｏｄ ａｐｐｌｉｃａｂｌｅ ｔｏ ｔｈｅ ｓｅａｒｃｈ ｆｏｒ ｓｉｍｉｌａｒｉｔｉｅｓ ｉｎ ｔｈｅ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄ ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ ｔｗｏ ｐｒｏｔｅｉｎｓ」、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、４８：４４４〜４５３頁（１９７０年）；Ｓｍｉｔｈ ＴＦ及びＷａｔｅｒｍａｎ ＭＳ、「Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ ｏｆ Ｂｉｏ−ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ」、Ａｄｖａｎｃｅｓ ｉｎ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｍａｔｈｅｍａｔｉｃｓ、２：４８２〜４８９頁（１９８１年）；Ｓｍｉｔｈ ＴＦ、Ｗａｔｅｒｍａｎ ＭＳ及びＳａｄｌｅｒ ＪＲ、「Ｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｄｏｍａｉｎｓ」、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．、１１：２２０５〜２２２０頁（１９８３年）；Ｆｅｎｇ ＤＦ及びＤｏｌｉｔｔｌｅ ＲＦ、「Ｐｒｏｇｒｅｓｓｉｖｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｌｉｇｎｍｅｎｔ ａｓ ａ ｐｒｅｒｅｑｕｉｓｉｔｅ ｔｏ ｃｏｒｒｅｃｔ ｐｈｙｌｏｇｅｎｅｔｉｃ ｔｒｅｅｓ」、Ｊ．ｏｆ Ｍｏｌｅｃ．Ｅｖｏｌ．、２５：３５１〜３６０頁（１９８７年）；Ｈｉｇｇｉｎｓ ＤＧ及びＳｈａｒｐ ＰＭ、「Ｆａｓｔ ａｎｄ ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｌｉｇｎｍｅｎｔ ｏｎ ａ ｍｉｃｒｏｃｏｍｐｕｔｅｒ」、ＣＡＢＩＯＳ、５：１５１〜１５３頁（１９８９年）；Ｔｈｏｍｐｓｏｎ ＪＤ、Ｈｉｇｇｉｎｓ ＤＧ及びＧｉｂｓｏｎ ＴＪ、「Ｃｌｕｓｔｅｒ Ｗ：ｉｍｐｒｏｖｉｎｇ ｔｈｅ ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ ｏｆ ｐｒｏｇｒｅｓｓｉｖｅ ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｌｉｇｎｍｅｎｔ ｔｈｒｏｕｇｈ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｗｅｉｇｈｉｎｇ，ｐｏｓｉｔｉｏｎｓ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｇａｐ ｐｅｎａｌｔｉｅｓ ａｎｄ ｗｅｉｇｈｔ ｍａｔｒｉｘ ｃｈｏｉｃｅ」、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓ．、２２：４６７３〜４８０頁（１９９４年）；並びにＤｅｖｅｒｅｕｘ Ｊ、Ｈａｅｂｅｒｌｉｅ Ｐ及びＳｍｉｔｈｉｅｓ Ｏ、「Ａ ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ ｓｅｔ ｏｆ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｎａｌｙｓｉｓ ｐｒｏｇｒａｍ ｆｏｒ ｔｈｅ ＶＡＸ」、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．、１２：３８７〜３９５頁（１９８４年）。また、相同性のパーセントを決定するために、当業者は過度の実験を行うことなく、他の多数のプログラム又は文献を参考にすることができる。
本発明は、生物学上の同一機能を有するポリペプチド又はタンパク質をコードするヌクレオチド配列又は遺伝子の突然変異に関する。機能の類似性は、活性部位の保存によって分析又は同定又は決定又は調査され得る。これは、ＮＣＢＩ ＤＡＲＴリサーチ（ドメイン構造検索ツール：Ｄｏｍａｉｎ Ａｒｃｈｉｔｅｃｔｕｒｅ Ｒｅｔｒｉｅｖａｌ Ｔｏｏｌ）により実施することができる。
従って本発明は、本明細書に定義されている弱毒化突然変異を含む、本明細書に記載されている細菌の弱毒化突然変異体を提供する。
弱毒化グラム陰性菌突然変異体には１つの突然変異が含まれており、この場合、少なくとも１つの特定の遺伝子又は核酸配列の全部又は一部が本明細書に記載されているように突然変異されている。特定の遺伝子又は核酸配列には、配列番号２、６、９、１２、１６、１９、２２、２５、２８、３１、３４、３７、４０、４３、４６、４９、５２、５５、５８、６１、６４、６７、７０、７５、７８、８１、８４、８７、９０若しくは９３の配列又はそれらの制御領域を含むもの、或いはそれらに相同である（例えばそれらと７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％相同である）ものが含まれる。好ましくは、特定の遺伝子又は核酸配列は、配列番号２、６、９、１２、２５、３１、３７、４０、４３、４６、７０、７５、７８、８１、８４、８７、９０若しくは９３の配列又はそれらの制御領域を含むもの、或いはそれらに相同であるものが含まれる。より好ましくは、特定の遺伝子又は核酸配列は、配列番号６、１２、２５、３１、３７、４０、４６、７０、７５、８４、８７、９０若しくは９３の配列又はそれらの制御領域を含むもの、或いはそれらに相同であるものが含まれる。さらに好ましくは、特定の遺伝子又は核酸配列は、配列番号３７、４０、７５、９０若しくは９３の配列又はそれらの相同ヌクレオチド配列を含むもの、或いはそれらに相同であるものが含まれる。好ましくは、突然変異体は、Ｐ．ムルトシダ（例えばＰ−１０５９、ＰＭ７０）などのパスツレラである。
選択した遺伝子又は核酸配列に明確に定義された突然変異を導入するには、例えば組換えＤＮＡ技術など既知の任意の技術を用いて、微生物へ突然変異を導入することができる（定方向突然変異誘発（directed mutagenesis））。かかる突然変異は、相同核酸配列又は非相同核酸配列の挿入、欠失、置換、（例えば別のヌクレオチドによる少なくとも１つのヌクレオチドの置換）、或いはこれらの組み合わせであってよい。ある実施形態では、突然変異は、遺伝子又は核酸配列の破壊が一部の欠失によって、好ましくは核酸配列又は遺伝子全体の欠失によって起こる欠失突然変異である。核酸の欠失により病原性復帰が回避される。別の実施形態では、突然変異は、本明細書に（例えば実施例に）記載されているトランスポゾン挿入座に対応する遺伝子座への挿入である。これらの座は、Ｐ−１０５９株に関しては、各配列１、８、１１、１４、１５、２７、３３、４２、５４、５７、６６、７２、７３、７７、８０、９５及び９７の５’末端に隣接して、また各配列４、５、１８、２１、２４、３０、３６、３９、４５、４８、５１、６０、６３、６９、８３、８６、８９及び９６の３’末端に隣接して位置するのが有利である。また、これらの座は、以下の間のＰＭ７０株に位置しているものである：配列番号２中のヌクレオチド１８０〜１８１、又はヌクレオチド１８２〜１８３、又はヌクレオチド１９０〜１９１、配列番号６中のヌクレオチド７７〜７８、又はヌクレオチド１０２６〜１０２７、又はヌクレオチド１０２７〜１０２８、配列番号９中のヌクレオチド４１６〜４１７、配列番号１２中のヌクレオチド３８９〜３９０、配列番号１６中のヌクレオチド３８１〜３８２、配列番号１９中のヌクレオチド２１９〜２２０、配列番号２２中のヌクレオチド１３５３〜１３５４、配列番号２５中のヌクレオチド１３６〜１３７、配列番号２８中のヌクレオチド３８４〜３８５、配列番号３１中のヌクレオチド２２２〜２２３又はヌクレオチド２２５〜２２６、配列番号３４中のヌクレオチド２１７〜２１８、配列番号３７中のヌクレオチド１４１１〜１４１２、配列番号４０中のヌクレオチド９４３〜９４４、配列番号４３中のヌクレオチド８５５〜８５６、配列番号４６中のヌクレオチド３６９〜３７０、配列番号４９中のヌクレオチド１１１〜１１２、配列番号５２中のヌクレオチド４４３〜４４４、配列番号５５中のヌクレオチド４〜５、配列番号６１中のヌクレオチド５７３〜５７４、配列番号６４中のヌクレオチド８７５〜８７６、配列番号７０中のヌクレオチド２１８〜２１９、配列番号７５中のヌクレオチド１０７２〜１０８７、配列番号７８中のヌクレオチド６４〜６５、配列番号８１中のヌクレオチド２８２〜２８３、配列番号８４中のヌクレオチド１４３１〜１４３２、配列番号８７中のヌクレオチド９７４〜９７５、配列番号９０中のヌクレオチド８０２〜８０３、配列番号９２中のヌクレオチド８５０〜８５１；或いは配列番号５８のすぐ上流のヌクレオチド１；或いは配列番号６７のすぐ上流のヌクレオチド１。またこれらの座は、その同一性の割合を有する、本明細書で定義された相同アミノ酸配列をコードするパスツレラセエ属メンバー（例えばＰ．ムルトシダ、Ｐ．ヘモリティカ、Ｐ．アナティペスティファ、又はＡ．プルロニューモニエ）などの別のグラム陰性菌のヌクレオチド配列中のヌクレオチドの（ＰＭ７０で説明したものよりも）類似のペアの間に配置されているものである。従って、突然変異体はグラム陰性菌であってよく、好ましくはＰ．ムルトシダ、Ｐ．ヘモリティカ、Ｐ．アナティペスティファ又はＡ．プルロニューモニエなどのパスツレラ、例えばＰ−１０５９又はＰＭ７０などのＰ．ムルトシダである。
定義によれば、欠損変異株は、本発明によるヌクレオチド配列の、又は同配列中に少なくとも１つの欠失を含んでいる。これらの欠損変異株には、特定の遺伝子配列又は特定のヌクレオチド配列の全部又は一部が欠失されているものが含まれる。一態様では、突然変異により、遺伝子又は特定のヌクレオチド配列の少なくとも１つの核酸の、少なくとも約１０％、少なくとも約２０％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９８％、又は少なくとも約９９％の欠失が生じる。このうち、遺伝子又は特定ヌクレオチド配列の全部が欠失されるのが好ましい。
突然変異体は複数の突然変異を含み得る。この場合、追加的又は相乗的な弱毒化が起こり得、その結果、毒化の復帰が良好に阻止され得る。
これらの複数の突然変異は、ａｒｏ遺伝子、例えばａｒｏＡ（Ｈｏｍｃｈａｍｐａ Ｐ．ら、Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ、１９９４年、４２：３５〜４４頁）などの弱毒化特性が知られているヌクレオチド配列又は遺伝子への突然変異、及び本発明によるヌクレオチド配列又は遺伝子への突然変異に関連し得る。
一実施形態では、突然変異体には少なくとも２つの突然変異が含まれており、この場合、各突然変異については、特定の遺伝子又は核酸配列の全部又は一部が本明細書で述べているように突然変異されている。これらの特定の遺伝子又は核酸配列には、配列番号２、６、９、１２、１６、１９、２２、２５、２８、３１、３４、３７、４０、４３、４６、４９、５２、５５、５８、６１、６４、６７、７０、７５、７８、８１、８４、８７、９０若しくは９３又はそれらの制御領域を含むもの、或いはそれらに相同であるものが含まれる。従って、例えば、本明細書で述べているように欠失された、突然変異されている前述の配列の２つ以上を有する突然変異体が本発明により想定される。好ましくは、突然変異体は、以下の配列、或いは本明細書で述べているように欠失された、突然変異されている以下の配列を含む、或いはそれらに相同である配列の２つ以上を有している：配列番号２、６、９、１２、２５、３１、３７、４０、４３、４６、７０、７５、７８、８１、８４、８７、９０若しくは９３又はそれらの制御領域。より好ましくは、突然変異されている（例えば２つ以上が突然変異されている）特定の遺伝子又は核酸配列には、配列番号６、１２、２５、３１、３７、４０、４６、７０、７５、８４、８７、９０若しくは９３又はそれらの制御領域を含むもの、或いはそれらに相同であるものが含まれる。この突然変異体はグラム陰性菌であってよく、好ましくは、この突然変異体はＰ．ムルトシダ（例えばＰ−１０５９又はＰＭ７０）などのパスツレラである。
好ましくは、突然変異されている（例えば、本明細書に論述しているように欠失されている）以下の配列、すなわち、配列番号３７、４０、７５、９０及び９３、又はそれらの相同ヌクレオチド配列、或いはそれらの制御領域の２つ以上を有する突然変異体が本発明により想定される。
種々の実施形態には、配列番号３７及び４０；配列番号３７及び７５；配列番号３７及び９０；配列番号３７及び９３；配列番号４０及び７５；配列番号４０及び９０；配列番号４０及び９３；配列番号７５及び９０；配列番号７５及び９３；配列番号９０及び９３の配列、或いはそれらの制御領域を含むか、或いはそれらに相同である遺伝子又は核酸配列の欠失、或いは遺伝子又は核酸配列中の欠失を有する突然変異体が含まれる。この突然変異体はグラム陰性菌であってよく、好ましくは、この突然変異体はＰ．ムルトシダ（例えばＰ−１０５９又はＰＭ７０）などのパスツレラである。
特定のゲノム領域へ突然変異を導入する方法は既知であり、また本明細書の開示及び当技術分野の知識から当業者には明らかであろう。例えば、突然変異する遺伝子全体若しくは配列全体又は断片をベクターへクローニングし、その発現及び／又はその生物活性を停止させるように修飾する。ベクターは、例えばエレクトロポレーション（例えばＪａｂｌｏｎｓｋｉ Ｌ．ら、Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ Ｐａｔｈｏｇｅｎｅｓｉｓ、１９９２年、１２、６３〜６８頁）によって、又は接合（conjugation）（Ｌｅｅ Ｍ．Ｄ．ら、Ｖｅｔ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．、１９９６年、５０、１４３〜１４８頁）によって細菌へ導入する。改変ＤＮＡ断片は遺伝子組換えによって、好ましくは細菌染色体及びベクター間の相同組換えによって細菌ゲノム中へ再導入される。一例として、ベクターはＣａｒｄｅｎａｓ（Ｃａｒｄｅｎａｓ Ｍら、Ｖｅｔ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、２００１年５月３；８０（１）：５３〜６１頁）に記載されている自殺プラスミドであってよい。好ましくは、このベクターはさらに、すべての可能な翻訳を阻止するように、（相同組換えで用いられる）２つの隣接するアーム又は領域の間に、ポリ停止配列（例えば６個の停止コドン、各読み枠中に１個ずつ）を含んでいる。
本発明の弱毒化微生物（例えばＰ．ムルトシダなどのグラム陰性菌）は、さらにそのゲノムへ挿入されている少なくとも１つの相同核酸配列又は非相同核酸配列を含むことができる。これは、ｉｎ ｖｉｖｏ又はｉｎ ｖｉｔｒｏにおける非相同核酸分子の再生又は自己複製、及び／又は非相同核酸分子の発現に有用である。この非相同核酸配列は、弱毒化微生物によって自然に発現するものとは異なり、ウイルス性、寄生虫性若しくは細菌性病原体由来の免疫原、抗原又はエピトープをコードしているのが好ましい。この非相同配列は、別の微生物株又は細菌株（例えば別のＰ．ムルトシダ株）由来の免疫原、抗原又はエピトープをコードしていてもよい。免疫原又は抗原は、病原性物質又は病原性物質からの分泌抗原に対する免疫反応を誘導可能なタンパク質又はポリペプチドであり、１種又は複数のエピトープを含有している。エピトープは、病原性物質又は病原性物質由来の分泌抗原に対する免疫反応を誘導可能なペプチド又はポリペプチドである。
かかるベクターでの使用に適切な非相同核酸配列は当業者には明らかであり（Ｆｅｄｏｒｏｖａ ＮＤ及びＨｉｇｈｌａｎｄｅｒ ＳＫ、Ｉｎｆｅｃｔ Ｉｍｍｕｎ、１９９７年、６５（７）：２５９３〜８頁）、例えばパスツレラセエ属メンバー（特に、パスツレラ・ムルトシダ、パスツレラ・ヘモリティカ、パスツレラ・アナティペスティファ、又はアクチノバチルス・プルロニューモニエ）由来のもの、或いは大腸菌、サルモネラ、カンピロバクターなどの細菌由来のものが含まれている。
好ましくは、弱毒化微生物及び前記の発現免疫原の両方に対する免疫反応が現れるように投与した場合に、宿主中で微生物によって発現するように、この非相同配列を挿入する。この非相同配列は、プロモーターなどのその発現を可能とする制御エレメントに、又はその下流に挿入するか、又は操作的に結合させるのが好ましい。タンパク質のアドレス指定及び分泌に有用であるヌクレオチド配列もまた加えることができる。従って、細胞壁を介した輸送及び／又は分泌を促進するようにリーダー配列又はシグナル配列を発現産物に含めることができる。
一実施形態では、相同配列又は非相同配列は、弱毒化に用いられる選択ヌクレオチド配列又は選択遺伝子内に挿入される。この場合、相同配列又は非相同配列は、本明細書で確認されているトランスポゾン挿入座に対応する座の１つに挿入するのが好ましい。
発現を改善するために、用いる細菌ベクターにコドンを使用することができる。
また、本発明の弱毒化突然変異体は、治療用タンパク質、アレルゲン、増殖因子、又はサイトカイン、又は免疫修飾物質若しくは免疫促進物質、例えばＧＭ−ＣＳＦ、例えば標的種にマッチしたＧＭ−ＣＳＦ、をコードする核酸配列を含み得る（例えば、ウシへの投与に際して弱毒化ベクターがＰ．ムルトシダである場合、例えば、別の非相同タンパク質、ペプチド、ポリペプチド、抗原、免疫原又はエピトープのベクターによる発現とともに、ウシＧＭ−ＣＳＦがベクターにより発現され得る）。
本発明のさらなる態様によれば、弱毒化微生物は、弱毒化免疫原生組成物又は弱毒化生ワクチン組成物を得るために用いられる。
本発明の好ましい態様によれば、その弱毒化微生物は、パスツレラなどのグラム陰性菌、例えば、本発明により修飾されたＰ．ムルトシダ（例えばＰ−１０５９、ＰＭ７０）である。
好ましくは、本明細書に記載されているように、微生物は、パスツレラ以外の病原体による感染に対して、動物又はヒトに免疫化及び／又はワクチン接種するための組換えベクターとして作用し得る。
免疫原性組成物又はワクチン組成物は、弱毒化突然変異体、及び製薬上又は獣医学上許容可能な担体、賦形剤、希釈剤又は媒体、場合によっては安定剤又はアジュバントを含む。弱毒化突然変異体は、ベクターに非相同性の核酸分子、例えば非相同エピトープ、抗原、免疫原、及び／又は増殖因子、サイトカイン、免疫制御剤又は免疫賦活剤をさらに発現するベクターであってよい。
「免疫原性組成物」という用語は、本明細書では、動物又はヒトに注入した場合に、標的病原体に対する免疫反応を誘導可能なすべての組成物を網羅する。「ワクチン組成物」又は「ワクチン」という用語は、本明細書では、動物又はヒトに注入した場合に、標的化病原体に対する予防上の免疫反応を誘導可能なすべての組成物を網羅する。
製薬上又は獣医学上許容可能な媒体は、水又は生理的食塩水であってよいが、また、例えば細菌培地を含んでいてもよい。
本発明による弱毒化生細菌は、安定剤で凍結乾燥するのが好適であり得る。凍結乾燥は既知の標準の凍結乾燥方法に従って実施することができる。製薬上又は獣医学上許容可能な安定剤は、炭水化物（例えばソルビトール、マンニトール、ラクトース、ショ糖、グルコース、デキストラン、トレハロース）、グルタミン酸ナトリウム（Ｔｓｖｅｔｋｏｖ Ｔら、Ｃｒｙｏｂｉｏｌｏｇｙ、１９８３年、２０（３）：３１８〜２３頁；Ｉｓｒａｅｌｉ Ｅら、Ｃｒｙｏｂｉｏｌｏｇｙ、１９９３年、３０（５）：５１９〜２３頁）、タンパク質、例えば、ペプトン、アルブミン、ラクトアルブミン又はカゼイン、スキムミルクなどの作用物質を含有するタンパク質（Ｍｉｌｌｓ ＣＫら、Ｃｒｙｏｂｉｏｌｏｇｙ、１９８８年、２５（２）：１４８〜５２頁；Ｗｏｌｆｆ Ｅら、Ｃｒｙｏｂｉｏｌｏｇｙ、１９９０年、２７（５）：５６９〜７５頁）、及びバッファー（例えばリン酸緩衝液、アルカリ金属リン酸緩衝液）であってよい。
アジュバントは凍結乾燥製剤を溶け易くするために用いることができる。
アジュバントの例は及び／又は鉱油、植物油、及びブロック共重合体、Ｔｗｅｅｎ（登録商標）、Ｓｐａｎ（登録商標）などの非イオン性界面活性剤を基にした水中油型乳剤、水中油中水型乳剤である。他の好適なアジュバントは、例えばビタミンＥ、サポニン、及びＣａｒｂｏｐｏｌ（登録商標）、水酸化アルミニウム又はリン酸アルミニウムである（「Ｖａｃｃｉｎｅ Ｄｅｓｉｇｎ、 Ｔｈｅ ｓｕｂｕｎｉｔ ａｎｄ ａｄｊｕｖａｎｔ ａｐｐｒｏａｃｈ」、Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、第６巻、Ｍｉｃｈａｅｌ Ｆ．Ｐｏｗｅｌｌ及びＭａｒｋ Ｊ．Ｎｅｗｍａｎ編集、１９９５年、Ｐｌｅｎｕｍ Ｐｒｅｓｓ Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）。
弱毒化生細菌は、−７０℃にてグリセロール含有培地に保存することができる。
場合によっては、免疫原性組成物又はワクチンは、不活性化形態又は生存形態である他の病原性微生物又はウイルスから選択される１種又は複数の免疫原、抗原又はエピトープと組み合わせることができる。
本発明の別の態様は、配列番号２、６、９、１２、１６、１９、２２、２５、２８、３１、３４、３７、４０、４３、４６、４９、５２、５５、５８、６１、６４、６７、７０、７５、７８、８１、８４、８７、９０及び９３で表される本発明によるヌクレオチド配列又は遺伝子、好ましくは、配列番号１、４、５、８、１１、１４、１５、１８、２１、２４、２７、３０、３３、３６、３９、４２、４５、４８、５１、５４、５７、６０、６３、６６、６９、７２、７３、７７、８０、８３、８６、８９、９２、９５、９６、９７で表されるものなどの本発明によるヌクレオチド配列又は遺伝子である。
本発明の別の態様は、ペプチド、ポリペプチド又はタンパク質又はより一般的には、発現産物（例えば免疫原、抗原又はエピトープ）の発現及び産出のための本発明によるヌクレオチド配列又は遺伝子の使用である。一実施形態では、これらのヌクレオチド配列又は遺伝子によってコードされているポリペプチド又はペプチド又はタンパク質は、免疫原性組成物又はワクチンにおいてサブユニット免疫原又は抗原又はエピトープとして用いることができる。例えばオーバーラッピングペプチドライブラリーを作製する等のエピトープ測定方法（Ｈｅｍｍｅｒ Ｂ．ら、Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ Ｔｏｄａｙ、１９９８年、１９（４）、１６３〜１６８頁）、Ｐｅｐｓｃａｎ（Ｇｅｙｓｅｎ Ｈ．Ｍ．ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、１９８４年、８１（１３）、３９９８〜４００２頁；Ｇｅｙｓｅｎ Ｈ．Ｍ．ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、１９８５年、８２（１）、１７８〜１８２頁；Ｖａｎ ｄｅｒ Ｚｅｅ Ｒ．ら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１９８９年、１９（１）、４３〜４７；Ｇｅｙｓｅｎ Ｈ．Ｍ．、Ｓｏｕｔｈｅａｓｔ Ａｓｉａｎ Ｊ．Ｔｒｏｐ．Ｍｅｄ．Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ、１９９０年、２１（４）、５２３〜５３３頁；Ｍｕｌｔｉｐｉｎ（登録商標）Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ Ｋｉｔｓ ｄｅ Ｃｈｉｒｏｎ）及びアルゴリズム（Ｄｅ Ｇｒｏｏｔ Ａ．ら、Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、１９９９年、１７、５３３〜５６１頁）は、本発明の実施において過度の実験を行うことなく用いることができる。
好ましいポリペプチドは、配列番号３、７、１０、１３、１７、２０、２３、２６、２９、３２、３５、３８、４１、４４、４７、５０、５３、５６、５９、６２、６５、６８、７１、７６、７９、８２、８５、８８、９１、９４として同定されているアミノ酸配列を有するもの、又は配列番号２、６、９、１２、１６、１９、２２、２５、２８、３１、３４、３７、４０、４３、４６、４９、５２、５５、５８、６１、６４、６７、７０、７５、７８、８１、８４、８７、９０、９３のヌクレオチド配列によってコードされているものである。また、これらのポリペプチドからのエピトープを好適に用いることができる。
本発明には、別の細菌、例えばグラム陰性菌、好ましくはパスツレラセエ属中の種、例えばＰ．ムルトシダ、Ｐ．ヘモリティカ、Ｐ．アナティペスティファ、Ａ．プルロニューモニエ由来の同等なポリペプチドが含まれており、さらに好ましくは、Ｐ．ムルトシダの種々の株のうち任意の１株のゲノム中には、アミノ酸配列が、配列番号３、７、１０、１３、１７、２０、２３、２６、２９、３２、３５、３８、４１、４４、４７、５０、５３、５６、５９、６２、６５、６８、７１、７６、７９、８２、８５、８８、９１、９４として同定されているアミノ酸配列のうちの１つに対して少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、及び少なくとも約９６、９７、９８又は９９％の同一性を有する同等のポリペプチド、及び／又は上記に配列番号で同定されているポリペプチドと同一の生物学的機能を有するポリペプチドが含まれている。同一性又は同一の生物学的機能を証明する基準は、上に記載している。
また本発明は、ポリペプチドの少なくとも１０アミノ酸、少なくとも２０アミノ酸、少なくとも３０アミノ酸、好ましくは少なくとも５０アミノ酸、より好ましくは少なくとも７０アミノ酸の鎖長を有するこれらのポリペプチドの免疫原性断片、例えばポリペプチドの連続する少なくとも１０アミノ酸、好ましくはポリペプチドの連続する少なくとも２０アミノ酸、例えば、ポリペプチドの連続する少なくとも３０アミノ酸、より好ましくは少なくとも５０アミノ酸、さらに好ましくはポリペプチドの連続する少なくとも７０アミノ酸を含有するポリペプチド断片も含んでいる。もちろん、断片はポリペプチド全体よりも短いものである。断片は、他のポリペプチドと、例えば融合ポリペプチド中で組み合わせることができる。例えば、本発明のポリペプチド又は断片は、別の部分（別のポリペプチド）、例えば免疫原性増強部分及び／又は分泌増強部分（例えば、免疫原性を増強するリポタンパク質部分、或いはシグナル配列部分又はリーダー配列部分）を含んでいる融合ポリペプチドの一部であってよい。従って、本発明は、融合物として、例えば融合ポリペプチド、例えばリポタンパク質部分などの免疫原性増強部分、及び／又はシグナル配列部分若しくはリーダー配列部分などの分泌増強部分を好適に含んでいる、融合ポリペプチドの一部としてのポリペプチド、タンパク質、抗原、免疫原又はエピトープ−本明細書で同定した配列又はその断片、或いは本発明のベクターの非相同体であろうと−の発現を想定する。
これらのポリペプチド又は断片は、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおける発現によって好適に産生される。本発明によるヌクレオチド配列（例えば、配列番号２、６、９、１２、１６、１９、２２、２５、２８、３１、３４、３７、４０、４３、４６、４９、５２、５５、５８、６１、６４、６７、７０、７５、７８、８１、８４、８７、９０、９３）又はその断片は、プロモーター、リボソーム結合領域及びターミネーター、並びに開始コドン及び停止コドンなどの制御エレメントに操作的に結合させてベクターに挿入する。好ましいベクターは、細菌、すなわち大腸菌中でのｉｎ ｖｉｔｒｏ発現に有用なプラスミドである（Ｍａｈｏｎａ Ｆら、Ｂｉｏｃｈｉｍｉｅ、１９９４年、４６（１）：９〜１４頁；Ｗａｔｔ Ｍ Ａら、Ｃｅｌｌ Ｓｔｒｅｓｓ Ｃｈａｐｅｒｏｎｅｓ、１９９７年、２（３）：１８０〜９０頁；Ｆｒｅｙ、Ｊ Ｒｅｓ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．、１９９２年、１４３（３）：２６３〜９頁）。
また、これらのポリペプチドは化学的に合成することができる（Ｌｕｏ Ｙら、Ｖａｃｃｉｎｅ、１９９９年、１７（７−８）：８２１〜３１頁）。
従って、本発明の態様は、本発明による少なくとも１つのポリペプチド若しくは断片（サブユニット免疫原性組成物又はワクチン）又は本明細書に記載されている少なくとも１つのｉｎ ｖｉｖｏにおける発現ベクター（組換え生免疫原性組成物又は組換え生ワクチン）と、製薬上若しくは獣医学上許容可能な担体、賦形剤、希釈剤若しくは媒体、場合によってはアジュバントとを含む、免疫原性組成物又はワクチンである。かかる成分の例は、生ワクチンの関連で本明細書に記載されている。
別の実施形態では、これらのヌクレオチド配列又はそれらの断片を組換えベクターに挿入し、宿主内でこのヌクレオチド配列又は断片によりコードされているポリペプチドをｉｎ ｖｉｖｏで発現することが可能な組換え生免疫原性組成物又は組換え生ワクチンを産生させることができる。
ｉｎ ｖｉｖｏ発現ベクターは、ポリヌクレオチドベクター又はプラスミド（欧州出願特許公開第１００１０２５号；Ｃｈａｕｄｈｕｒｉ Ｐ Ｒｅｓ．Ｖｅｔ．Ｓｃｉ．、２００１年、７０（３）、２５５〜６頁）、ウイルス（例えばアデノウイルス、（鶏痘ウイルス（米国特許第５，１７４，９９３号、米国特許第５，５０５，９４１号、及び米国特許第５，７６６，５９９号）又はカナリア痘ウイルス（米国特許第５，７５６，１０３号）などのポックスウイルス）））或いは細菌（すなわち大腸菌又はサルモネラ種）であってよい。
また、本発明のポリペプチド及び断片は治療においても使用することができる。
また、ポリペプチド及び断片は抗体抗原反応の試薬として用いることもできる。従って、本発明の別の態様は、グラム陰性菌による感染を検出するための診断方法及び／又は診断キットである。キット（例えばＥＬＩＳＡ）は、本発明による少なくとも１つのポリペプチド又は断片（例えば、本明細書において配列により同定されている少なくとも１つのポリペプチド、又は本明細書に論述されているその断片）を含み得る。
本明細書のポリペプチド又は断片に対する抗体（例えば、本明細書の配列によって同定されているポリペプチド、又は本明細書に論述されているその断片）は、診断試薬として、又は受動免疫法若しくはワクチン接種において、又は治療において用いることができる。受動免疫法で投与される抗体の量は、当技術分野で用いられているのと同じ量であるか、類似の量であってよく、当技術分野の情報から当業者が過度の実験を行うことなく受動免疫法を実施することができる。
本発明の別の態様は、ポリペプチドに特異的な抗体又は本発明による断片を含む抗体製剤と、それを用いた診断方法である。ポリペプチドに特異的な抗体については、例えば、抗体が他のポリペプチドではなく本ポリペプチドに結合する等、抗体が本ポリペプチドに選択的に結合すること、又は本ポリペプチドに対して好ましい特有の、本ポリペプチドの特異性を有していることを意味し、当技術分野で既知の技術、又は下記のＳａｍｂｒｏｏｋをはじめとする本明細書で引用されている文献に記載されている技術を用いて、サンプルから本ポリペプチドを単離させるか、又は５％以下の偽陽性でサンプル中の本ポリペプチドの存在を検出するためにこの抗体を用いることができる。
抗体はポリクローナル又はモノクローナルであってよい。
抗体を産生する方法は、当業者には既知である。
ポリクローナル抗体を所望の場合、選択した動物（マウス、ウサギ、ヤギ、ウマなど）をポリペプチド又は断片で免疫化する。免疫動物の血清を回収し、既知の方法に従って処理し、場合により精製する。例えば、Ｊｕｒｇｅｎｓら、Ｊ．Ｃｈｒｏｍ．、１９８５年、３４８：３６３〜３７０頁を参照されたい。
ハイブリドーマ技術を用いてモノクローナル抗体を調製する一般的な方法は既知である。抗体産生不死細胞系は、細胞融合によって、また発癌性ＤＮＡによるＢリンパ球の直接形質転換、又はエプスタインバールウイルスによる形質移入などの他の技術によって得ることができる。例えば、Ｊ．Ｅ．Ｌｉｄｄｅｌｌ、「Ａ ｐｒａｃｔｉｃａｌ ｇｕｉｄｅ ｔｏ ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ」、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ ｓｏｎｓ編集、１９９１年、１８８頁；Ｓ．Ｊ．ｄｅ ＳｔＧｒｏｔｈら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ、１９８０年、３５（１−２）、１〜２１頁を参照されたい。
本発明によるヌクレオチド配列及びそれらの断片は、例えば診断方法において、ハイブリダイゼーション用のプローブとして用いることができる。
ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件を用いるのが好ましい。それについては、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ、Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、（１９８９年）、１．１０１〜１．１０４によって記載されているものを参照することができる。ストリンジェントな条件下のハイブリダイゼーションとは、５５℃にて、好ましくは６２℃、より好ましくは６８℃にて１×ＳＳＣバッファー及び０．１％ＳＤＳで１時間洗浄後、例えば５５℃にて、例えば６２℃、好ましくは６８℃にて０．２×ＳＳＣバッファー及び０．１％ＳＤＳで１時間した後、陽性のハイブリダイゼーションシグナルがなお確認されることを意味する。
またそれは、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で結合するそれらの能力によって、ヌクレオチド配列を特徴付けることができる。従って、本発明は、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でヌクレオチド配列に結合する本明細書で同定された核酸配列及び核酸分子を想定することができる。
本発明によるヌクレオチド配列及びそれらの断片は、例えば、任意の媒体中、（例えば組織サンプル、体液、水、食）中のグラム陰性菌を検出するために、ＰＣＲ用のプライマーとして、又は増幅及び／若しくはハイブリダイゼーションに関与する類似の方法で用いることができる。
好適には、例えば、配列番号２、６、９、１２、１６、１９、２２、２５、２８、３１、３４、３７、４０、４３、４６、４９、５２、５５、５８、６１、６４、６７、７０、７５、７８、８１、８４、８７、９０、９３の、本発明によるヌクレオチド配列又は遺伝子の少なくとも連続する２０の、少なくとも連続する３０の、例えば、少なくとも連続する５０の、例えば、少なくとも連続する７０の、より好ましくは少なくとも連続する１００の核酸を有するヌクレオチド配列断片を用いる。
さらに、本発明は、動物、好ましくは、トリ、ウサギ、ウシ、ブタなどの種、より好ましくはニワトリ、シチメンチョウ及びアヒルなどのトリ類（種畜、ブロイラー及び産卵鶏を含む）の細菌感染にかかりやすい動物、又はヒトにおいて、細菌感染に対して免疫化する方法、又は細菌感染を予防する方法、又は細菌感染に対して保護する方法に関する。
これらの方法によれば、（１）本発明の弱毒化生免疫原性組成物若しくは弱毒化生ワクチン、或いは（２）本発明のサブユニット免疫原性組成物又はワクチン、或いは（３）本発明の組換え生免疫原性組成物若しくは組換え生ワクチン、又はそれらの組み合わせ、を投与する。もちろん、本発明の実施形態は、例えば、プライムブースト法（本発明のワクチン又は免疫原性組成物を最初に投与し、その後、他のワクチン又は免疫原性組成物を投与する、或いはその逆）などにおいて、本発明のものではない他のワクチン又は免疫原性組成物を用いることができる。
投与は、特に、筋肉注射（ＩＭ）、皮内注射（ＩＤ）又は皮下注射（ＳＣ）によって、或いは鼻腔内投与、気管内投与又は経口投与によって行うことができる。本発明による免疫原性組成物又はワクチンは、注射器、針なし注射具（例えば、Ｐｉｇｊｅｔ、Ａｖｉｊｅｔ、Ｄｅｒｍｏｊｅｔ又はＢｉｏｊｅｃｔｏｒ（米国、オレゴン州、Ｂｉｏｊｅｃｔ）、スプレー、飲料水、点眼薬によって投与されるのが好ましい。
弱毒化生免疫原性組成物又は弱毒化生ワクチンは、卵内投与、経口投与（例えば飲料水、全身スプレー）、経眼投与（例えば点眼薬、全身スプレー）、経気管投与（例えばスプレー）、皮内投与、皮下（ＳＣ）投与又は筋肉内（ＩＭ）投与が好ましい。
生存している弱毒化微生物の量は、本明細書と当技術分野の情報から過度の実験を行うことなく、当業者によって決定され、最適化することができる。通常、１回の投与当たり、動物（ヒトを含む）には約１０４〜１０９ＣＦＵ、好ましくは約１０５〜１０８ＣＦＵ、さらに好ましくは約１０６〜１０７ＣＦＵを投与することができる。
筋肉内経路により、鳥類には約１０４〜１０７ＣＦＵ、好ましくは約１０５〜１０６ＣＦＵの単回投与量１単位を投与することができる。１回の投与当たりの容量は約０．２ｍｌから約０．５ｍｌの間であり、好ましくは約０．３ｍｌであってよい。経口、経気管、経眼により、鳥類には１回の投与当たり約１０５〜１０８ＣＦＵ、好ましくは約１０６−１０７ＣＦＵを投与することができる。噴霧投与については、容量は装置及び小滴の大きさに合わせるが、約１０００匹に対して約３０ｍｌから約６００ｍｌ、好ましくは１匹当たり約０．２ｍｌである。
ウシ及びブタの動物に関しては、好ましい経路はＩＭ及びＳＣである。動物に、１回の投与当たり、約１０４〜１０９ＣＦＵ、好ましくは約１０５〜１０８ＣＦＵを投与することができる。１回の投与当たりの容量は約０．２ｍｌから約５．０ｍｌの間であり、好ましくは約０．５ｍｌから約２．０ｍｌの間であり、より好ましくは約１．０ｍｌであってよい。
ウサギには、ＩＭ経路又はＳＣ経路によって１回の投与当たり、約１０４〜１０８ＣＦＵ、好ましくは約１０５〜１０７ＣＦＵを投与することができる。単回投与量１単位の容量は約０．２ｍｌから約０．５ｍｌの間であり、好ましくは約０．５ｍｌであってよい。またウサギには、ＩＤ経路によって１回の投与当たり、約１０４〜１０８ＣＦＵ、好ましくは、約１０５〜１０７ＣＦＵを投与することができる。１回の投与当たりの容量は約０．１ｍｌから約０．２ｍｌの間であってよい。
さらにここで、本発明を以下の実施例を参照してさらに記載するが、これに限定されるものではない。
標識タグ付きＰ．ムルトシダトランスポゾン突然変異体のライブラリーの構築（ＳＴＭスクリーニング）
タグ付きＳＭ１０λｐｉｒ ｐＬＯＦ／ｋｍ形質転換体の構築
タグはＨｅｎｓｅｌら（Ｓｃｉｅｎｃｅ、１９９５年、２６９：４００〜４０３頁）に記載されているようにして得た。まず、十分にハイブリダイズするが互いにクロスハイブリダイズしないタグを含む、タグ付きｐＵＴｍｉｎｉＴｎ５Ｋｍ２のプラスミドを選択した。タグ付きｐＵＴｍｉｎｉＴｎ５Ｋｍ２ベクター中のミニ−Ｔｎ５トランスポゾンは、パスツレラ・ムルトシダのうち数株では転移しないことが分かった。一方、トランスポゾンミニ−Ｔｎ１０は、Ｐ．ムルトシダ中で機能することが明らかになった（Ｌｅｅら、Ｖｅｔ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、１９９６年、５０：１４３〜８頁）。従って、あらかじめ選択したタグをｐＵＴｍｉｎｉＴｎ５ベクターからミニ−Ｔｎ１０を含有するプラスミドｐＬＯＦ／Ｋｍへ転移させた（Ｈｅｒｒｅｒｏら、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ、１９９０年、１７２：６５５７〜６５６７頁）。タグは、ｐＵＴｍｉｎｉＴｎ５Ｋｍ２ベクターでタグがクローニングされるＫｐｎＩ部位の片側に結合するプライマーを用いてＰＣＲにより増幅した。これらのプライマーには、制限酵素ＳａｌＩの配列が含まれていた。次いで、ＳａｌＩでＰＣＲ産物を消化し、ＳａｌＩ部位を特有のＳｆｉＩクローニング部位と置換したｐＬＯＦ／Ｋｍベクターの改変型のＳａｌＩ部位へクローニングした。次いで、タグ付きｐＬＯＦ／Ｋｍプラスミドを大腸菌株ＳＭ１０λｐｉｒ（Ｋｍｒ、ｔｈｉ、ｔｈｒ、ｌｅｕ、ｔｏｎＡ、ｌａｃＹ、ｓｕｐＥ、ｒｅｃＡ：：ＲＰ４−２−Ｔｃ：：Ｍｕλｐｉｒ）（Ｍｉｌｌｅｒ Ｖ．Ｌ．ら、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．、１９８８年、１７０：２５７５〜８３頁）に形質転換した。この株は、接合により宿主細菌へｐＬＯＦ／Ｋｍなどのプラスミドを移すことができる。
タグ付きＳＭ１０λｐｉｒ ｐＬＯＦ／ｋｍ形質転換体の構築
タグはＨｅｎｓｅｌら（Ｓｃｉｅｎｃｅ、１９９５年、２６９：４００〜４０３頁）に記載されているようにして得た。まず、十分にハイブリダイズするが互いにクロスハイブリダイズしないタグを含む、タグ付きｐＵＴｍｉｎｉＴｎ５Ｋｍ２のプラスミドを選択した。タグ付きｐＵＴｍｉｎｉＴｎ５Ｋｍ２ベクター中のミニ−Ｔｎ５トランスポゾンは、パスツレラ・ムルトシダのうち数株では転移しないことが分かった。一方、トランスポゾンミニ−Ｔｎ１０は、Ｐ．ムルトシダ中で機能することが明らかになった（Ｌｅｅら、Ｖｅｔ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、１９９６年、５０：１４３〜８頁）。従って、あらかじめ選択したタグをｐＵＴｍｉｎｉＴｎ５ベクターからミニ−Ｔｎ１０を含有するプラスミドｐＬＯＦ／Ｋｍへ転移させた（Ｈｅｒｒｅｒｏら、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ、１９９０年、１７２：６５５７〜６５６７頁）。タグは、ｐＵＴｍｉｎｉＴｎ５Ｋｍ２ベクターでタグがクローニングされるＫｐｎＩ部位の片側に結合するプライマーを用いてＰＣＲにより増幅した。これらのプライマーには、制限酵素ＳａｌＩの配列が含まれていた。次いで、ＳａｌＩでＰＣＲ産物を消化し、ＳａｌＩ部位を特有のＳｆｉＩクローニング部位と置換したｐＬＯＦ／Ｋｍベクターの改変型のＳａｌＩ部位へクローニングした。次いで、タグ付きｐＬＯＦ／Ｋｍプラスミドを大腸菌株ＳＭ１０λｐｉｒ（Ｋｍｒ、ｔｈｉ、ｔｈｒ、ｌｅｕ、ｔｏｎＡ、ｌａｃＹ、ｓｕｐＥ、ｒｅｃＡ：：ＲＰ４−２−Ｔｃ：：Ｍｕλｐｉｒ）（Ｍｉｌｌｅｒ Ｖ．Ｌ．ら、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．、１９８８年、１７０：２５７５〜８３頁）に形質転換した。この株は、接合により宿主細菌へｐＬＯＦ／Ｋｍなどのプラスミドを移すことができる。
選択方法及び対抗選択方法
接合方法では、プラスミドｐＬＯＦ／ＫＭを獲得した宿主Ｐ．ムルトシダを選択する方法と、大腸菌ＳＭ１０λｐｉｒドナーに対する対抗選択方法が必要である。
接合方法では、プラスミドｐＬＯＦ／ＫＭを獲得した宿主Ｐ．ムルトシダを選択する方法と、大腸菌ＳＭ１０λｐｉｒドナーに対する対抗選択方法が必要である。
宿主Ｐ．ムルトシダを選択する方法では、ミニ−Ｔｎ１０トランスポゾンによりコードされているカナマイシンを用いる。
まず接合における大腸菌ドナーに対する対抗選択については、パスツレラＰ−１０５９株のストレプトマイシン自然耐性変異株を用いた。しかし、この株はシチメンチョウに対しては毒性が弱毒化されており、従って本発明においては使用不可と考えられた。パスツレラ・ムルトシダ株は既知組成培地（chemically defined media）（ＣＤＭ）上で増殖することができる（Ｈｕら、Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ ａｎｄ Ｉｍｍｕｎｉｔｙ、１９８６年、８０４〜８１０頁）。寒天を含有し、ロイシン非含有であるこの既知組成培地の改変型を大腸菌ドナーに対する対抗選択を行うために用いた。パスツレラ株は、この培地（その組成は表１に示す）上で増殖することができたが、大腸菌ＳＭ１０λｐｉｒ（ロイシン栄養要求体）は増殖しなかった。
ＣＤＭ培地上でのＰ．ムルトシダ株の継代
Ｐ．ムルトシダ株の凍結乾燥アンプル（ＵＳＤＡ Ｐ−１０５９、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎから入手可能、アクセッション番号ＡＴＣＣ１５７４２）にＢＨＩ（脳心臓滲出物）２００μｌを添加することによって復元し、その懸濁液の１分量をＢＨＩ寒天プレート上に画線塗布し、プレートを３７℃にて一晩インキュベートした。このプレートから得たコロニー物質を用いてＢＨＩ肉汁培養液（broth culture）に接種し、３７℃にて一晩振盪しながらインキュベートした。グリセロールを最終濃度が５％ｖ／ｖになるまで添加し、各分量を−８０℃にて凍結保存した。これらの凍結分量のうちの１つのサンプルをＢＨＩ寒天プレート上に画線塗布し、一晩インキュベートした。次いで、このＢＨＩプレートから得られたコロニー物質を表１に示した組成物を含むＣＤＭ寒天プレート上に画線塗布し、３日間３７℃にてインキュベートした。このＣＤＭプレートから得られたコロニー物質をＢＨＩ肉汁培養液へ接種し、３７℃にて一晩振盪しながらインキュベートした。グリセロールを最終濃度が５％ｖ／ｖになるまで添加し、各分量を−８０℃にて凍結した。この株を１６０８４（ＣＤＭ）と命名した。
Ｐ．ムルトシダ株の凍結乾燥アンプル（ＵＳＤＡ Ｐ−１０５９、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎから入手可能、アクセッション番号ＡＴＣＣ１５７４２）にＢＨＩ（脳心臓滲出物）２００μｌを添加することによって復元し、その懸濁液の１分量をＢＨＩ寒天プレート上に画線塗布し、プレートを３７℃にて一晩インキュベートした。このプレートから得たコロニー物質を用いてＢＨＩ肉汁培養液（broth culture）に接種し、３７℃にて一晩振盪しながらインキュベートした。グリセロールを最終濃度が５％ｖ／ｖになるまで添加し、各分量を−８０℃にて凍結保存した。これらの凍結分量のうちの１つのサンプルをＢＨＩ寒天プレート上に画線塗布し、一晩インキュベートした。次いで、このＢＨＩプレートから得られたコロニー物質を表１に示した組成物を含むＣＤＭ寒天プレート上に画線塗布し、３日間３７℃にてインキュベートした。このＣＤＭプレートから得られたコロニー物質をＢＨＩ肉汁培養液へ接種し、３７℃にて一晩振盪しながらインキュベートした。グリセロールを最終濃度が５％ｖ／ｖになるまで添加し、各分量を−８０℃にて凍結した。この株を１６０８４（ＣＤＭ）と命名した。
突然変異体バンクの構築
タグ付きＳＭ１０λｐｉｒ ｐＬＯＦ／ｋｍ形質転換体を１６０８４（ＣＤＭ）Ｐ．ムルトシダ株と接合させた。同胞突然変異体（接合法時に突然変異体の複製により生じる、同一位置に配置されているトランスポゾンを有する突然変異体）の単離を最小限にするため、各タグ付きＳＭ１０λｐｉｒ形質転換体は、少なくとも３回の個別の接合においてＰ．ムルトシダ株と接合させた。パスツレラトランスポゾン突然変異体は、カナマイシン５０μｇ／ｍｌ補充ＣＤＭ寒天プレート上で選択した。
タグ付きＳＭ１０λｐｉｒ ｐＬＯＦ／ｋｍ形質転換体を１６０８４（ＣＤＭ）Ｐ．ムルトシダ株と接合させた。同胞突然変異体（接合法時に突然変異体の複製により生じる、同一位置に配置されているトランスポゾンを有する突然変異体）の単離を最小限にするため、各タグ付きＳＭ１０λｐｉｒ形質転換体は、少なくとも３回の個別の接合においてＰ．ムルトシダ株と接合させた。パスツレラトランスポゾン突然変異体は、カナマイシン５０μｇ／ｍｌ補充ＣＤＭ寒天プレート上で選択した。
次いで、単一コロニーを形成させるため、各タグ付きトランスポゾンについてのカナマイシン耐性突然変異体をＢＨＩカナマイシン５０μｇ／ｍｌ寒天プレート上に２回画線塗布した。次いで、単一コロニーをＢＨＩ肉汁培養液へ接種し、振盪しながら３７℃にて一晩増殖させた。次いで、グリセロールを最終濃度が５％ｖ／ｖになるまで添加し、これらの突然変異体を個々のバイアル中で−８０℃にて保存した。
シチメンチョウに対して弱毒化した突然変異体を得るための、標識タグ付きパスツレラ突然変異体バンクのスクリーニング
シチメンチョウ接種用のＰ．ムルトシダ突然変異体の培養物は、実施例Ｉで得られた突然変異体のグリセロールストックの各２０μｌをカナマイシン５０μｇ／ｍｌ補充ＢＨＩ培地２００μｌと混合することによって増殖させ、９６ウェルのマイクロタイター皿中に入れた。これらのマイクロタイター皿は３７℃にて約１８時間、静的条件下でインキュベートした。次いで、各突然変異体の１８時間培養物の１０μｌ分量を新しいマイクロタイタープレート中、カナマイシン５０μｇ／ｍｌ補充ＢＨＩ培地２００μｌと混合し、そのプレートを約４時間３７℃にてインキュベートした。この培養は対数増殖期で停止させ、各突然変異体の培養物１００μｌを新しいマイクロタイタープレートに移し、６５０ｎｍの吸光度（ＯＤ）の測定に用いた。
シチメンチョウ接種用のＰ．ムルトシダ突然変異体の培養物は、実施例Ｉで得られた突然変異体のグリセロールストックの各２０μｌをカナマイシン５０μｇ／ｍｌ補充ＢＨＩ培地２００μｌと混合することによって増殖させ、９６ウェルのマイクロタイター皿中に入れた。これらのマイクロタイター皿は３７℃にて約１８時間、静的条件下でインキュベートした。次いで、各突然変異体の１８時間培養物の１０μｌ分量を新しいマイクロタイタープレート中、カナマイシン５０μｇ／ｍｌ補充ＢＨＩ培地２００μｌと混合し、そのプレートを約４時間３７℃にてインキュベートした。この培養は対数増殖期で停止させ、各突然変異体の培養物１００μｌを新しいマイクロタイタープレートに移し、６５０ｎｍの吸光度（ＯＤ）の測定に用いた。
接種液又はインプットプールは、４時間の培養で残存した１００μｌを混合することにより調製した。各インプットプールは４８種の異なる突然変異体から構成されていた。プールしたこれらの懸濁液の力価は、１００μｌ分量をＦＡＣＳ（蛍光標示式細胞分取器）で分析することによって決定した。次いで、プールした懸濁液の分量（１ｍｌ）を生理的緩衝液中（physiologically buffered water）で希釈し、２．１０７ｃｆｕ／ｍｌの力価を有する懸濁液を得た。３週齢の５羽のシチメンチョウの各群にこの懸濁液の分量０．５ｍｌ（１羽当たり１０７ｃｆｕ）を筋肉内注射した。注射前のシチメンチョウの血清状態は、注射１日前に得た血液サンプル中のパスツレラに対する抗体の存在をスクリーニングすることにより決定した。インプットプールの残部の細胞を遠心分離によって回収し、その細胞ペレットから染色体ＤＮＡを抽出した。
注射後約１４時間に５羽のシチメンチョウのうち３羽から血液サンプル１ｍｌを採取した。血液サンプルの希釈系列（１０−１〜１０−７）を５％ヒツジ血液補充Ｃｏｌｕｍｂｉａ寒天プレート上に塗布した。そのプレートを２４時間、３７℃にてインキュベートし、その後、ＢＨＩ培地中に約１００００個のパスツレラコロニーを再懸濁した。次いで、これらの懸濁液（これをアウトプットプールと称する）を遠心分離にかけ、細胞ペレットから染色体ＤＮＡを抽出した。
インプットプール中には存在するが、シチメンチョウから再単離されなかったパスツレラ突然変異体は、Ｈｅｎｓｅｌら（Ｓｃｉｅｎｃｅ、１９９５年、２６９：４００〜４０３頁）に記載されて通りに、インプットプール及びアウトプットプールから得たＤＮＡサンプル中に存在する標識タグのＰＣＲ増幅と、標識タグをコードしているＤＮＡが配置されているドットブロットに対する増幅ＰＣＲ産物のハイブリダイゼーションとにより同定した。これらの突然変異体は毒性が潜在的に弱毒化されているものと考えられた。この弱毒化については、シチメンチョウにこの潜在的突然変異体を一度感染させ、その後の死亡の有無をスクリーニングすることにより確認した。
Ｐ．ムルトシダ突然変異体のシチメンチョウに対する弱毒性の確認
実施例２で潜在的に弱毒化されたとして同定されたトランスポゾン突然変異体、又は培養時の増殖能力が抑制されていた突然変異体は、マイクロタイター皿中でグリセロールストック２０μｌをカナマイシン５０μｇ／ｍｌ補充ＢＨＩ培地２００μｌと混合することにより回復させた。これらのマイクロタイター皿は３７℃にて１８時間静置条件下でインキュベートした。次いで、これらの培養の各突然変異体の１０μｌ分量をとり、新しいマイクロタイタープレート中でカナマイシン５０μｇ／ｍｌ補充ＢＨＩ培地２００μｌと混合し、このプレートを約４時間静置条件下でインキュベートした。培養は対数増殖期で中止し、各突然変異体の培養物１００μｌを新しいマイクロタイタープレートに移し、６５０ｎｍの吸光度（ＯＤ）の測定に用いた。次いで、これらの突然変異体の各培養物を生理的緩衝液中１００００分の１に希釈し、濃度を約２．１０４ｃｆｕ／ｍｌとした。次いで、これらの希釈液の分量（０．５ｍｌ）を５週齢の２羽のシチメンチョウに筋肉内注射した（１羽当たり１０４ｃｆｕ）。各群のシチメンチョウ少数羽の血清状態は、注射前日に得た血液サンプルから決定した。シチメンチョウの死亡についてその後７日間モニターした。試験した突然変異体のうち７２株では、注射した鳥２羽のいずれも死亡しなかった。従って、これらの７２種の突然変異体は弱毒化していると考えられた。
実施例２で潜在的に弱毒化されたとして同定されたトランスポゾン突然変異体、又は培養時の増殖能力が抑制されていた突然変異体は、マイクロタイター皿中でグリセロールストック２０μｌをカナマイシン５０μｇ／ｍｌ補充ＢＨＩ培地２００μｌと混合することにより回復させた。これらのマイクロタイター皿は３７℃にて１８時間静置条件下でインキュベートした。次いで、これらの培養の各突然変異体の１０μｌ分量をとり、新しいマイクロタイタープレート中でカナマイシン５０μｇ／ｍｌ補充ＢＨＩ培地２００μｌと混合し、このプレートを約４時間静置条件下でインキュベートした。培養は対数増殖期で中止し、各突然変異体の培養物１００μｌを新しいマイクロタイタープレートに移し、６５０ｎｍの吸光度（ＯＤ）の測定に用いた。次いで、これらの突然変異体の各培養物を生理的緩衝液中１００００分の１に希釈し、濃度を約２．１０４ｃｆｕ／ｍｌとした。次いで、これらの希釈液の分量（０．５ｍｌ）を５週齢の２羽のシチメンチョウに筋肉内注射した（１羽当たり１０４ｃｆｕ）。各群のシチメンチョウ少数羽の血清状態は、注射前日に得た血液サンプルから決定した。シチメンチョウの死亡についてその後７日間モニターした。試験した突然変異体のうち７２株では、注射した鳥２羽のいずれも死亡しなかった。従って、これらの７２種の突然変異体は弱毒化していると考えられた。
シチメンチョウでのスクリーニング後に同定されたトランスポゾン挿入突然変異体の特性決定
弱毒化Ｐ．ムルトシダ突然変異体のゲノム中のトランスポゾン挿入部位は、逆ＰＣＲ、又はＡＰ−ＰＣＲによってトランスポゾン挿入の片側に隣接するＤＮＡをクローニングすることにより同定した。
弱毒化Ｐ．ムルトシダ突然変異体のゲノム中のトランスポゾン挿入部位は、逆ＰＣＲ、又はＡＰ−ＰＣＲによってトランスポゾン挿入の片側に隣接するＤＮＡをクローニングすることにより同定した。
これらの突然変異体は、ＢＨＩカナマイシン５０μｇ／ｍｌ寒天プレート上に分量を画線塗布することにより、−８０℃のグリセロールストックから回復させた。次いで、単一コロニーを用いてＢＨＩ肉汁培養液へ接種し、そこから染色体ＤＮＡを調製した。
逆ＰＣＲについては、染色体ＤＮＡを４塩基対の認識部位を有する制限酵素、例えばＴｓｐ５０９Ｉ、αＴａｑＩ又はＲｓａＩで消化した。次いで、ＤＮＡを大容量中で連結させて分子内の連結を促進させる。次いで、トランスポゾンの既知の配列にアニールする、外向きプライマー、例えばＳｔｉｐＪ（配列番号９８、２０ｍｅｒ）（５’ＡＴＣ ＴＧＡ ＴＣＣ ＴＴＣ ＡＡＣ ＴＣＡ ＧＣ ３’）、ＳｔｉｐＡ（配列番号９９、１９ｍｅｒ）（５’ＣＧＣ ＡＧＧ ＧＣＴ ＴＴＡ ＴＴＧ ＡＴＴ Ｃ ３’）、ＫＴＧＲＩ（配列番号１００、２７ｍｅｒ）（５’ＧＣＧ ＧＡＡ ＴＴＣ ＧＡＴ ＧＡＡ ＴＧＴ ＴＣＣ ＧＴＴ ＧＣＧ ３’）、Ｔｎ１０ＩＲ１（配列番号１０１、２０ｍｅｒ）（５’ＴＴＴ ＡＣＣ ＡＡＡ ＡＴＣ ＡＴＴ ＡＧＧ ＧＧ ３’）、及びＴｎ１０ＩＲ４（配列番号１０２、１９ｍｅｒ）（５’ＧＡＴ ＣＡＴ ＡＴＧ ＡＣＡ ＡＧＡ ＴＧＴ Ｇ ３’）を用いて、トランスポゾンに隣接するＤＮＡをこの連結されたＤＮＡテンプレートから増幅する。次いで、これらの逆ＰＣＲ産物をクローニングし配列決定する。
ＡＰ−ＰＣＲについては、トランスポゾンにアニールする１つの外向きプライマー、例えば、ＳｔｉｐＡ、及びランダムプライマー、例えばａｒｂ１（配列番号１０３、３５ｍｅｒ）（５’ＧＧＣ ＣＡＣ ＧＣＧ ＴＣＧ ＡＣＴ ＡＧＴ ＡＣＮ ＮＮＮ ＮＮＮ ＮＮＮ ＧＡＴ ＡＴ ３’）、又はａｒｂ６（配列番号１０４、３５ｍｅｒ）（５’ＧＧＣ ＣＡＣ ＧＣＧ ＴＣＧ ＡＣＴ ＡＧＴ ＡＣＮ ＮＮＮ ＮＮＮ ＮＮＮ ＣＡＧ ＣＣ ３’）を用いた１回目のＰＣＲ反応において、染色体ＤＮＡをテンプレートとして用いた。この１回目のＰＣＲ反応のアニール温度は、最初は非常に低く設定されており、後のサイクルではこのアニール温度は上昇させる。次いで、この１回目のＰＣＲ産物の一部は２回目のＰＣＲでテンプレートとして用いられる。この２回目のＰＣＲは、１回目のＰＣＲで用いられるプライマーよりもトランスポゾンの末端に近接している位置でトランスポゾンにアニールする、例えばＫＴＧＲＩなどの別の外向きプライマーを利用する。この２回目のＰＣＲで用いられる別のプライマーは、１回目のＰＣＲで用いられるランダムプライマーの５’末端に既知の２０塩基の配列と同じ配列を有しており、例えばａｒｂ２（配列番号１０５、２０ｍｅｒ）（５’ＧＧＣ ＣＡＣ ＧＣＧ ＴＣＧ ＡＣＴ ＡＧＴ ＡＣ ３’）などである。次いで、この第２のＰＣＲのＰＣＲ産物をクローニングし、配列決定する。
次いで、トランスポゾンによって破壊され得るオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を同定するために、この得られた配列を分析し、ＥＭＢＬデータベース及びミネソタ大学が決定したパスツレラ・ムルトシダＰＭ７０株のゲノム配列（Ｍａｙ ＢＪら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、２００１年、９８（６）：３４６０〜５頁）において現在入手可能な類似配列を調査するためにも用いた。
参考までに、以下のヌクレオチド配列では、Ｎは、任意の核酸（Ａ又はＣ又はＧ又はＴ）に対応する。
突然変異体１Ｇ４、３Ｆ４、３Ｇ１２、１２Ｄ６及び１４Ｃ１０
突然変異体１Ｇ４、３Ｆ４及び１２Ｄ６は全く同一のトランスポゾン挿入部位を有している。トランスポゾン挿入部位に隣接するＤＮＡ配列は、配列番号１（７７５ｍｅｒ）で示してある。トランスポゾンはこの配列の５’末端に接して挿入される。
突然変異体１Ｇ４、３Ｆ４及び１２Ｄ６は全く同一のトランスポゾン挿入部位を有している。トランスポゾン挿入部位に隣接するＤＮＡ配列は、配列番号１（７７５ｍｅｒ）で示してある。トランスポゾンはこの配列の５’末端に接して挿入される。
開始コドンは、配列番号１の配列の位置１７９〜１８１に位置する。
突然変異体３Ｇ１２については、トランスポゾン挿入部位に隣接するＤＮＡ配列は、配列番号９５（１０１ｍｅｒ）で示してある。トランスポゾンはこの配列の５’末端に接して挿入される。
突然変異体１４Ｃ１０については、トランスポゾン挿入部位に隣接するＤＮＡ配列は、配列番号９６（２２０ｍｅｒ）で示してある。トランスポゾンはこの配列の３’末端に接して挿入される。
他の４つのパスツレラセエタンパク質及び遺伝子は、配列番号１によってコードされている６０アミノ酸配列を用いて実施したブラスト（ｂｌａｓｔ）により同定された。
突然変異体１Ｇ４、３Ｆ４及び１２Ｄ６中のトランスポゾンの位置は、パスツレラ・ムルトシダＰＭ７０遺伝子配列、Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＡＥ００６１１５の８５０７〜８５０８の位置に相当する。突然変異体３Ｇ１２中のトランスポゾンの位置は、ＡＥ００６１１５配列の８６０９〜８６１０の位置に相当する。突然変異体１４Ｃ１０中のトランスポゾンの位置は、ＡＥ００６１１５配列の８５１７〜８５１８の位置に相当する。このトランスポゾンは、ＰＭ７０遺伝子ＰＭ０７７３、ＰｈｙＡの相同体を破壊する。ＰｈｙＡ遺伝子は莢膜合成に関与することが想定される。ＰＭ０７７３のヌクレオチド配列は本明細書では配列番号２として同定されており、そのアミノ酸配列は配列番号３として同定されている。
突然変異体１Ｇ８、９Ｄ１及び９Ｄ８
突然変異体１Ｇ８では、トランスポゾンは、配列番号４（２２６ｍｅｒ）の配列の３’末端に接して挿入される。この配列は、より長い潜在的タンパク質をコードする２つのオープンリーディングフレーム（＋２及び−２）を有している。本発明によるＯＲＦは、フレーム−２にある。
突然変異体１Ｇ８では、トランスポゾンは、配列番号４（２２６ｍｅｒ）の配列の３’末端に接して挿入される。この配列は、より長い潜在的タンパク質をコードする２つのオープンリーディングフレーム（＋２及び−２）を有している。本発明によるＯＲＦは、フレーム−２にある。
突然変異体９Ｄ１に挿入されているトランスポゾンは、配列番号５（８７ｍｅｒ）の配列の３’末端に接して存在する。
突然変異体９Ｄ８に挿入されているトランスポゾンは、配列番号４の配列の位置２２５の後に存在する。
突然変異体１Ｇ８、９Ｄ１及び９Ｄ８の中のトランスポゾンは、ＰＭ７０遺伝子、ＰＭ０８７１の相同体を破壊する。これらの突然変異体中のトランスポゾンの位置は、パスツレラ・ムルトシダＰＭ７０遺伝子配列、Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＡＥ００６１２５の位置９８４９〜９８５０（突然変異体１Ｇ８）、８８９９〜８９００（突然変異体９Ｄ１）又は９８４８〜９８４９（突然変異体９Ｄ８）に相当する。ＰＭ０８７１のヌクレオチド配列は、本明細書では配列番号６として同定されており、そのアミノ酸配列は配列番号７として同定されている。
他の１つのパスツレラセエ遺伝子／タンパク質は、配列番号７を用いて実施したブラストにより同定されている。これはインフルエンザ菌ＨＩ１５８６である。（Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号Ｕ３２８３２及びＡＡＣ２３２３４）。本発明者らは、ＰＭ０８７１とＨＩ１５８６の間の５０７アミノ酸にわたって７２％の同一性を見い出している。
突然変異体２Ｆ２
トランスポゾン挿入部位に隣接するＤＮＡ配列は、配列番号８（７８ｍｅｒ）で示してある。トランスポゾンは、この配列の５’末端に接して存在する。この配列は、より長い潜在的タンパク質をコードする３つのオープンリーディングフレーム（＋１、＋２及び−１）を有している。本発明によるＯＲＦは、フレーム＋２に存在する。
トランスポゾン挿入部位に隣接するＤＮＡ配列は、配列番号８（７８ｍｅｒ）で示してある。トランスポゾンは、この配列の５’末端に接して存在する。この配列は、より長い潜在的タンパク質をコードする３つのオープンリーディングフレーム（＋１、＋２及び−１）を有している。本発明によるＯＲＦは、フレーム＋２に存在する。
突然変異体２Ｆ２中のトランスポゾンは、ＰＭ７０遺伝子ＰＭ１７２７の相同遺伝子を破壊する。このトランスポゾンは、パスツレラ・ムルトシダＰＭ７０配列、Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＡＥ００６２１０（ＰＭ１７２７）の６４４〜６４５に相当する位置に配置されている。ＰＭ１７２７のヌクレオチド配列は、本明細書では配列番号９として同定されており、そのアミノ酸配列は配列番号１０として同定されている。
他の１つのパスツレラセエ遺伝子／タンパク質は、配列番号１０を用いて実施したブラストにより同定された。これはインフルエンザ菌ＨＩ０６２１（Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号Ｕ３２７４４及びＡＡＣ２２２８１）である。本発明者らは、ＰＭ１７２７とＨＩ０６２１の間に１８３アミノ酸にわたって７７％の同一性を見い出している。
ＰＭ１７２７は加水分解酵素のスーパーファミリーに属し、特にヒスチジノールリン酸ホスファターゼと関係がある。
突然変異体３Ａ２
トランスポゾン挿入部位に隣接するＤＮＡ配列は、配列番号１１（４６７ｍｅｒ）で示してある。トランスポゾンは、この配列の５’末端に接して存在する。
トランスポゾン挿入部位に隣接するＤＮＡ配列は、配列番号１１（４６７ｍｅｒ）で示してある。トランスポゾンは、この配列の５’末端に接して存在する。
停止コドンは位置４２８〜４３０に位置する。
突然変異体３Ａ２中のトランスポゾンは、パスツレラ・ムルトシダＰＭ７０配列、Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＡＥ００６０９４（ＰＭ０５８６）の５１０３〜５１０４に相当する位置に配置されている。ＰＭ０５８６のヌクレオチド配列は本明細書では配列番号１２として同定されており、そのアミノの配列は配列番号１３としての同定されている。
他の２つのパスツレラセエ遺伝子及びタンパク質は、配列番号１３を用いて実施したブラストにより同定された。これらの遺伝子とタンパク質は、パスツレラ・ヘモリティカＡ１ＰｌｐＤ（Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＡＦ０５８７０３及びＡＡＣ３２５６５）、並びにヘモフィルスソムヌス３１ｋＤａ（Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号Ｌ０７７９５及びＡＡＡ２４９４１）である。本発明者らは、ＰＭ０５８６とＰ．ヘモリティカＰｌｐＤの間に２７６アミノ酸にわたって７３％の同一性を見い出し、ＰＭ０５８６とＨ．ソムヌス３１ｋＤａの間に２７３アミノ酸にわたって７１％の同一性を見い出している。
ＰｌｐＤとＰＭ０５８６はｏｍｐＡタンパク質ファミリーに属する。
突然変異体３Ｄ３
トランスポゾン挿入部位の隣接するＤＮＡ配列は、配列番号１４（２０４ｍｅｒ、５’末端のトランスポゾン）及び配列番号１５（３５ｍｅｒ、５’末端のトランスポゾン）で示してある。
トランスポゾン挿入部位の隣接するＤＮＡ配列は、配列番号１４（２０４ｍｅｒ、５’末端のトランスポゾン）及び配列番号１５（３５ｍｅｒ、５’末端のトランスポゾン）で示してある。
停止コドンは、配列番号１４の位置７〜９及び配列番号１５の位置３３〜３５に位置する。
他の１つのパスツレラセエ遺伝子／タンパク質は、配列番号１４及びそれによってコードされているアミノ酸配列（６５アミノ酸）を用いて実施したブラストにより同定された。本発明者らは、ＰＭ００６４タンパク質と６５アミノ酸にわたって１００％の同一性があることを見い出している。突然変異体３Ｄ３中のトランスポゾンの位置は、配列番号１４及び１５からそれぞれ推定された位置である、パスツレラ・ムルトシダＰＭ７０遺伝子配列（Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＡＥ００６０４２）の位置４７７８〜４７７９又は４７８７〜４７８８に相当している。この違いは、トランスポゾン挿入部位に少数のヌクレオチドの重複をもたらすトランスポゾンの挿入によるものであろう。位置４７８８はＰＭ００６４遺伝子に位置する。位置４７７８は、ＰＭ００６４の停止コドンの６ｂｐ下流である。ＰＭ００６４のヌクレオチド配列は本明細書では配列番号１６として同定されており、そのアミノ酸配列は配列番号１７として同定されている。
他のグラム陰性菌遺伝子及びタンパク質は、配列番号１７を用いて実施したブラストにより同定された。
突然変異体３Ｄ８
トランスポゾン挿入部位に隣接するＤＮＡ配列は、配列番号１８（７５ｍｅｒ）で示してある。トランスポゾンは、この配列の３’末端に接して存在する。
トランスポゾン挿入部位に隣接するＤＮＡ配列は、配列番号１８（７５ｍｅｒ）で示してある。トランスポゾンは、この配列の３’末端に接して存在する。
突然変異体３Ｄ８中のトランスポゾンの位置は、パスツレラ・ムルトシダＰＭ７０遺伝子配列、Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＡＥ００６０８０の位置７７６９〜７７７０間に相当する。トランスポゾンは、ＰＭ７０遺伝子ＰＭ０４４５の相同体を破壊する。ＰＭ０４４５のヌクレオチド配列は、本明細書では配列番号１９として同定されており、そのアミノ酸配列は配列番号２０として同定されている。
突然変異体３Ｅ１
トランスポゾン挿入部位に隣接するＤＮＡ配列は、配列番号２１（２２９ｍｅｒ）で示してある。トランスポゾンは、この配列の３’末端に接して存在する。
トランスポゾン挿入部位に隣接するＤＮＡ配列は、配列番号２１（２２９ｍｅｒ）で示してある。トランスポゾンは、この配列の３’末端に接して存在する。
突然変異体３Ｅ１中のトランスポゾンの位置は、パスツレラ・ムルトシダＰＭ７０遺伝子配列、Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＡＥ００６１３３の位置９１９５〜９１９６の間に相当する。トランスポゾンは、ＰＭ７０遺伝子ＰＭ０９４０の相同体を破壊する。ＰＭ０９４０のヌクレオチド配列は、本明細書では配列番号２２として同定されており、そのアミノ酸配列は配列番号２３として同定されている。
他のグラム陰性菌遺伝子及びタンパク質は、配列番号１７を用いて実施したブラストにより同定されている。
突然変異体３Ｈ２
トランスポゾン挿入部位に隣接するＤＮＡ配列は配列番号２４（５８ｍｅｒ）で示してある。トランスポゾンは、この配列の３’末端に接して存在する。この配列は、より長い潜在的タンパク質をコードする２つのオープンリーディングフレーム（＋１及び−３）を有している。本発明によるＯＲＦはフレーム＋１にある。
トランスポゾン挿入部位に隣接するＤＮＡ配列は配列番号２４（５８ｍｅｒ）で示してある。トランスポゾンは、この配列の３’末端に接して存在する。この配列は、より長い潜在的タンパク質をコードする２つのオープンリーディングフレーム（＋１及び−３）を有している。本発明によるＯＲＦはフレーム＋１にある。
他の１つのパスツレラセエ遺伝子は配列番号２４を用いて、またそのコードされているアミノ酸配列（１９アミノ酸）を用いて実施したブラストにより同定された。本発明者らは、ＰＭ１９５１タンパク質と１９アミノ酸にわたって１００％の同一性を見い出している。突然変異体３Ｈ２中のトランスポゾンの位置は、パスツレラ・ムルトシダＰＭ７０配列、Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＡＥ００６２３１（ＰＭ１９５１、ｕｖｒＡ）の位置９４１８〜９４１９の間に相当する。ＰＭ１９５１のヌクレオチド配列は本明細書では配列番号２５として同定されており、そのアミノ酸配列は配列番号２６として同定されている。
他のグラム陰性菌遺伝子及びタンパク質は、配列番号２６を用いて実施したブラストにより同定された。
ＵｖｒＡはＤＮＡ修復ＡＢＣ除去ヌクレアーゼである。
突然変異体４Ｄ６
トランスポゾン挿入部位に隣接するＤＮＡ配列は、配列番号２７（５４ｍｅｒ）で示してある。トランスポゾンは、この配列の５’末端に接して存在する。この配列は、より長い潜在的タンパク質をコードする２つのオープンリーディングフレーム（＋１及び−２）を有している。本発明によるＯＲＦはフレーム＋１にある。
トランスポゾン挿入部位に隣接するＤＮＡ配列は、配列番号２７（５４ｍｅｒ）で示してある。トランスポゾンは、この配列の５’末端に接して存在する。この配列は、より長い潜在的タンパク質をコードする２つのオープンリーディングフレーム（＋１及び−２）を有している。本発明によるＯＲＦはフレーム＋１にある。
突然変異体４Ｄ６中のトランスポゾンの位置は、パスツレラ・ムルトシダＰＭ７０配列、Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＡＥ００６０３６の位置６４９２〜６４９３の間に相当する。トランスポゾンは、ＰＭ７０遺伝子ＰＭ００３２又はｈｋｔＥの相同体を破壊する。ＰＭ００３２のヌクレオチド配列は本明細書では配列番号２８として同定されており、そのアミノ酸配列は配列番号２９として同定されている。
他の１つのパスツレラセエ遺伝子／タンパク質は、配列番号２９を用いて実施したブラストにより同定された。これは、アクチノバチルスアクチノミセテムコミタンス（Ａｃｔｉｎｏｂａｃｉｌｌｕｓ ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｔｅｍｃｏｍｉｔａｎｓ）カタラーゼ（Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＡＦ１６２６５４及びＡＡＦ１７８８２）である。本発明者らは、ＰＭ００３２とＡ．アクチノミセテムコミタンスカタラーゼ間に４８２アミノ酸にわたって８５％の同一性を見い出している。
ＨｋｔＥはカタラーゼである。
突然変異体４Ｆ４及び１２Ａ５
突然変異体４Ｆ４に関しては、トランスポゾン挿入部位に隣接するＤＮＡ配列は配列番号３０（１７２ｍｅｒ）で示してある。トランスポゾンは、この配列の３’末端に接して存在する。突然変異体１２Ａ５に関しては、トランスポゾン挿入部位に隣接するＤＮＡ配列は、配列番号９７（５４６ｍｅｒ）中に提供されている。トランスポゾンは、この配列の５’末端に接して挿入されている。
突然変異体４Ｆ４に関しては、トランスポゾン挿入部位に隣接するＤＮＡ配列は配列番号３０（１７２ｍｅｒ）で示してある。トランスポゾンは、この配列の３’末端に接して存在する。突然変異体１２Ａ５に関しては、トランスポゾン挿入部位に隣接するＤＮＡ配列は、配列番号９７（５４６ｍｅｒ）中に提供されている。トランスポゾンは、この配列の５’末端に接して挿入されている。
他の４つのパスツレラセエ遺伝子及びタンパク質は、配列番号３０によってコードされている５７アミノ酸配列を用いて実施したブラストにより同定された。
突然変異体４Ｆ４中のトランスポゾンの位置は、パスツレラ・ムルトシダＰＭ７０遺伝子配列、Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＡＥ００６１１６の位置５２７２〜５２７３の間に相当する。突然変異体１２Ａ５中のトランスポゾンの位置は、ＡＥ００６１１６配列の位置５２７５〜５２７６の間に相当する。トランスポゾンは、ＰＭ７０遺伝子ＰＭ０７７６の相同体を破壊する。ＰＭ０７７６のヌクレオチド配列は本明細書では配列番号３１として同定されており、そのアミノ酸配列は配列番号３２として同定されている。これらのタンパク質はＵＤＰグルコースデヒドゲロナーゼである。
突然変異体４Ｆ１２
トランスポゾン挿入部位に隣接するＤＮＡ配列は、配列番号３３（２２６ｍｅｒ）で示してある。トランスポゾンは、この配列の５’末端に接して存在する。
トランスポゾン挿入部位に隣接するＤＮＡ配列は、配列番号３３（２２６ｍｅｒ）で示してある。トランスポゾンは、この配列の５’末端に接して存在する。
突然変異体４Ｆ１２中のトランスポゾンの位置は、パスツレラ・ムルトシダＰＭ７０配列、Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＡＥ００６０３８の位置９２６３〜９２６４の間に相当する。トランスポゾンは、ＰＭ７０遺伝子ＰＭ００４８又はｆａｄＲの相同体を破壊する。本明細書ではＰＭ００４８のヌクレオチド配列は配列番号３４として同定されており、そのアミノ酸配列は配列番号３５として同定されている。ＦａｄＲは大腸菌タンパク質の相同体であって、数種類の脂肪酸生合成（ｆａｂ）及び脂肪酸分解（ｆａｄ）遺伝子に影響を及ぼす脂肪酸代謝の調節因子である。
突然変異体４Ｇ１１
トランスポゾン挿入部位に隣接するＤＮＡ配列は、配列番号３６（２１４ｍｅｒ）で示してある。トランスポゾンは、この配列の３’末端に接して存在する。
トランスポゾン挿入部位に隣接するＤＮＡ配列は、配列番号３６（２１４ｍｅｒ）で示してある。トランスポゾンは、この配列の３’末端に接して存在する。
他の１つのパスツレラセエ遺伝子は、配列番号３６とそれによりコードさせているアミノ酸配列（７０アミノ酸）を用いて実施したブラストにより同定された。本発明者らは、ＰＭ１０２４タンパク質と７０アミノ酸にわたる１００％の同一性を見い出している。突然変異体４Ｇ１１中のトランスポゾンの位置は、パスツレラ・ムルトシダＰＭ７０遺伝子配列、Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＡＥ００６１４３の位置３５３２〜３５３３の間に相当する。トランスポゾンは、ＰＭ７０遺伝子ＰＭ１０２４又はＨｔｐＧの相同体を破壊する。本明細書ではＰＭ１０２４のヌクレオチド配列は配列番号３７として同定されており、そのアミノ酸配列は配列番号３８として同定されている。
他のグラム陰性菌遺伝子及びタンパク質は、配列番号３８を用いて実施したブラストにより同定された。
ＨｔｐＧは熱ショックタンパク質である。
４Ｇ１１突然変異体は、ブダペスト条約に基づいてＰａｓｔｅｕｒ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎに寄託されており、アクセッション番号ＣＮＣＭＩ−２９９９として入手可能である。
突然変異体５Ｄ５
トランスポゾン挿入部位に隣接するＤＮＡ配列は、配列番号３９（２５２ｍｅｒ）で示してある。トランスポゾンは、この配列の３’末端に接して存在する。
トランスポゾン挿入部位に隣接するＤＮＡ配列は、配列番号３９（２５２ｍｅｒ）で示してある。トランスポゾンは、この配列の３’末端に接して存在する。
突然変異体５Ｄ５中のトランスポゾンの位置は、パスツレラ・ムルトシダＰＭ７０遺伝子配列、Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＡＥ００６１８８の位置５６９５〜５６９６の間に相当する。トランスポゾンは、ＰＭ７０遺伝子ＰＭ１５１７又はＰＩｐＥの相同体を破壊する。本明細書ではＰＭ１５１７のヌクレオチド配列は配列番号４０として同定されており、そのアミノ酸配列は配列番号４１として同定されている。
ＰＩｐＥは膜リポタンパク質であると想定される。
５Ｄ５突然変異体は、ブダペスト条約に基づいてＰａｓｔｅｕｒ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎに寄託されており、アクセッション番号ＣＮＣＭＩ−３０００として入手可能である。
突然変異体５Ｆ１１
トランスポゾン挿入部位に隣接するＤＮＡ配列は、配列番号４２（５４６ｍｅｒ）で示してある。トランスポゾンは、この配列の５’末端に接して存在する。
トランスポゾン挿入部位に隣接するＤＮＡ配列は、配列番号４２（５４６ｍｅｒ）で示してある。トランスポゾンは、この配列の５’末端に接して存在する。
停止コドンは位置１４８〜１５０に位置する。
突然変異体５Ｆ１１中のトランスポゾンの位置は、パスツレラ・ムルトシダＰＭ７０ゲノム、Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＡＥ００６１５０の位置５７２〜５７３の間に相当する。トランスポゾンは、ＰＭ７０遺伝子ＰＭ１０８７又はＮｉｆＲ３の相同体を破壊する。本明細書ではＰＭ１０８７のヌクレオチド配列は配列番号４３として同定されており、そのアミノ酸配列は配列番号４４として同定されている。
他の１つのパスツレラセエ遺伝子／タンパク質は、配列番号４４を用いて実施したブラストにより同定された。これはインフルエンザ菌ＨＩ０９７９（Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号Ｕ３２７７８及びＡＡＣ２２６３９）である。本発明者らは、ＰＭ１０８７とＨＩ０９７９の間の３３２アミノ酸にわたって７８％の同一性を見い出している。
ＮｉｆＲ３はニトロゲナーゼ調節遺伝子である。
突然変異体５Ｇ９
トランスポゾン挿入部位に隣接するＤＮＡ配列は、配列番号４５（４３ｍｅｒ）で提供されている。トランスポゾンは、この配列の３’末端に接して存在する。この配列は、より長い潜在的タンパク質をコードする３つのオープンリーディングフレーム（＋２、＋３及び−１）を有している。本発明によるＯＲＦはフレーム＋２にある。
トランスポゾン挿入部位に隣接するＤＮＡ配列は、配列番号４５（４３ｍｅｒ）で提供されている。トランスポゾンは、この配列の３’末端に接して存在する。この配列は、より長い潜在的タンパク質をコードする３つのオープンリーディングフレーム（＋２、＋３及び−１）を有している。本発明によるＯＲＦはフレーム＋２にある。
他の４つのパスツレラセエ遺伝子及びタンパク質は、配列番号４５によってコードされている１４アミノ酸配列を用いて実施したブラストにより同定されている。
突然変異体５Ｇ９中のトランスポゾンの位置は、パスツレラ・ムルトシダＰＭ７０遺伝子配列、Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＡＥ００６１１６の位置５７３〜５７４の間に相当する。トランスポゾンは、ＰＭ７０遺伝子ＰＭ０７７４又はＨｙａＥの相同体を破壊する。本明細書ではＰＭ０７７４のヌクレオチド配列は配列番号４６として同定されており、そのアミノ酸配列は配列番号４７として同定されている。これらの遺伝子は莢膜合成（capsule synthesis）に関係する。
突然変異体６Ｅ５
トランスポゾン挿入部位に隣接しているＤＮＡ配列は、配列番号４８（２７９ｍｅｒ）で示してある。トランスポゾンは、この配列の３’末端に接して存在する。
トランスポゾン挿入部位に隣接しているＤＮＡ配列は、配列番号４８（２７９ｍｅｒ）で示してある。トランスポゾンは、この配列の３’末端に接して存在する。
開始コドンは位置１６９〜１７１に位置する。
突然変異体６Ｅ５中のトランスポゾンの位置は、パスツレラ・ムルトシダＰＭ７０ゲノム、Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＡＥ００６１８２の位置６６７３〜６６７４の間に相当する。トランスポゾンは、ＰＭ７０遺伝子ＰＭ１４５９又はｐｇｔＢの相同体を破壊する。本明細書ではＰＭ１４５９のヌクレオチド配列は配列番号４９として同定されており、そのアミノ酸配列は配列番号５０として同定されている。
ＰｇｔＢはホスホグリセリン酸輸送調節タンパク質である。
突然変異体６Ｅ６
トランスポゾン挿入部位に隣接するＤＮＡ配列は、配列番号５１（９３ｍｅｒ）で示してある。トランスポゾンは、この配列の３’末端に接して存在する。
トランスポゾン挿入部位に隣接するＤＮＡ配列は、配列番号５１（９３ｍｅｒ）で示してある。トランスポゾンは、この配列の３’末端に接して存在する。
停止コドンは位置１２〜１４に位置する。
突然変異体６Ｅ６中のトランスポゾンの位置は、パスツレラム・ルトシダＰＭ７０遺伝子配列、Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＡＥ００６０９６の位置９０５１〜９０５２の間に相当する。トランスポゾンは、ＰＭ７０遺伝子ＰＭ０６０５の相同体を破壊する。本明細書ではＰＭ０６０５のヌクレオチド配列は配列番号５２として同定されており、そのアミノ酸配列は配列番号５３として同定されている。
突然変異体６Ｆ１２
トランスポゾン挿入部位に隣接するＤＮＡ配列は、配列番号５４（７７２ｍｅｒ）で示してある。トランスポゾンは、この配列の５’末端に接して存在する。
トランスポゾン挿入部位に隣接するＤＮＡ配列は、配列番号５４（７７２ｍｅｒ）で示してある。トランスポゾンは、この配列の５’末端に接して存在する。
開始コドンは位置２〜４に位置する。
突然変異体６Ｆ１２中のトランスポゾンの位置は、パスツレラ・ムルトシダＰＭ７０遺伝子配列、Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＡＥ００６１９２の位置５３６２〜５３６３の間に一致する。トランスポゾンは、ＰＭ７０遺伝子ＰＭ１５５６又はｃｏｍＦ遺伝子の相同体を破壊する。本明細書ではＰＭ１５５６のヌクレオチド配列は配列番号５５として同定されており、そのアミノ酸配列は配列番号５６として同定されている。
ＣｏｍＦは受容能タンパク質Ｆである。
突然変異体６Ｇ４
トランスポゾン挿入部位に隣接するＤＮＡ配列は、配列番号５７（７００ｍｅｒ）で示してある。トランスポゾンは、この配列の５’末端に接して存在する。
トランスポゾン挿入部位に隣接するＤＮＡ配列は、配列番号５７（７００ｍｅｒ）で示してある。トランスポゾンは、この配列の５’末端に接して存在する。
突然変異体６Ｇ４中のトランスポゾンの位置は、パスツレラ・ムルトシダＰＭ７０遺伝子配列、Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＡＥ００６２０６の位置３７５８〜３７５９の間に相当する。その挿入はＰＭ１６９６とＰＭ１６９７の遺伝子間にある。トランスポゾンはＰＭ１６９６のプロモーター領域と開始コドンの間に挿入されている。
ＰＭ１６９６の開始コドンは、配列番号５７の配列中の位置２６〜２８に位置する。
本明細書ではＰＭ１６９６のヌクレオチド配列は配列番号５８として同定されており、そのアミノ酸配列は配列番号５９として同定されている。
他のグラム陰性菌遺伝子及びタンパク質は、配列番号５９を用いて実施したブラストにより同定された。
突然変異体６Ｈ１
トランスポゾン挿入部位に隣接するＤＮＡ配列は、配列番号６０（１８８ｍｅｒ）で示してある。トランスポゾンは、この配列の３’末端に接して存在する。
トランスポゾン挿入部位に隣接するＤＮＡ配列は、配列番号６０（１８８ｍｅｒ）で示してある。トランスポゾンは、この配列の３’末端に接して存在する。
突然変異体６Ｈ１中のトランスポゾンの位置はパスツレラ・ムルトシダＰＭ７０遺伝子配列、Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＡＥ００６１１９の位置４１３９〜４１４０の間に相当する。トランスポゾンは、ＰＭ７０遺伝子ＰＭ０８０６又はｓｐｅＦ遺伝子の相同体を破壊する。本明細書ではＰＭ０８０６のヌクレオチド配列は配列番号６１として同定されており、そのアミノ酸配列は配列番号６２として同定されている。
他の２つのパスツレラセエ遺伝子及びビブリオナセエ遺伝子は、配列番号６２を用いて実施したブラストにより同定された。これらの遺伝子は、インフルエンザ菌ｓｐｅＦ（Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号Ｕ３２７４０及びＡＡＣ２２２４８）、並びにコレラ菌オルニチンデカルボキシラーゼ（ＡＥ００４４３１及びＡＡＦ９６９５７）である。本発明者らは、ＰＭ０８０６とインフルエンザ菌ｓｐｅＦの間で７１９アミノ酸にわたって８３％の同一性を見い出している。
ＳｐｅＦはオルニチンデカルボキシラーゼである。
突然変異体６Ｈ６
トランスポゾン挿入部位に隣接するＤＮＡ配列は、配列番号６３（１０１ｍｅｒ）で示してある。トランスポゾンは、この配列の３’末端に接して存在する。この配列は、より長い潜在的タンパク質をコードする２つのオープンリーディングフレーム（＋１及び−１）を有している。本発明によるＯＲＦはフレーム＋１にある。
トランスポゾン挿入部位に隣接するＤＮＡ配列は、配列番号６３（１０１ｍｅｒ）で示してある。トランスポゾンは、この配列の３’末端に接して存在する。この配列は、より長い潜在的タンパク質をコードする２つのオープンリーディングフレーム（＋１及び−１）を有している。本発明によるＯＲＦはフレーム＋１にある。
突然変異体６Ｈ６中のトランスポゾンの位置は、パスツレラ・ムルトシダＰＭ７０遺伝子配列、Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＡＥ００６１５５の位置９８３〜９８４の間に相当する。このトランスポゾンは、ＰＭ７０遺伝子ＰＭ１１３８の相同体を破壊する。本明細書ではＰＭ１１３８のヌクレオチド配列は配列番号６４として同定されており、そのアミノ酸配列は配列番号６５として同定されている。
突然変異体７Ａ７
トランスポゾン挿入部位に隣接するＤＮＡ配列は配列番号６６（２２２ｍｅｒ）で示してある。トランスポゾンは、この配列の５’末端に接して存在する。突然変異体７Ａ７中のトランスポゾンの位置は、（ＰＭ１３２１とＰＭ１３２２の間の遺伝子間領域で）パスツレラ・ムルトシダＰＭ７０遺伝子配列、Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＡＥ００６１７０の位置７８５３〜７８５４の間に相当する。このトランスポゾンはＰＭ１３２２のターミネーター領域と停止コドンの間に挿入されている。
トランスポゾン挿入部位に隣接するＤＮＡ配列は配列番号６６（２２２ｍｅｒ）で示してある。トランスポゾンは、この配列の５’末端に接して存在する。突然変異体７Ａ７中のトランスポゾンの位置は、（ＰＭ１３２１とＰＭ１３２２の間の遺伝子間領域で）パスツレラ・ムルトシダＰＭ７０遺伝子配列、Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＡＥ００６１７０の位置７８５３〜７８５４の間に相当する。このトランスポゾンはＰＭ１３２２のターミネーター領域と停止コドンの間に挿入されている。
停止コドンは、配列番号６６の配列の位置２５〜２７に位置する。本明細書ではＰＭ１３２２のヌクレオチド配列は配列番号６７として同定されており、そのアミノ酸配列は配列番号６８として同定されている。
突然変異体７Ｆ８
トランスポゾン挿入部位に隣接するＤＮＡ配列は配列番号６９（５５ｍｅｒ）で示してある。トランスポゾンは、この配列の３’末端に接して存在する。この配列は、より長い潜在的タンパク質をコードしている３つのオープンリーディングフレーム（＋１、＋３及び−３）を有している。本発明によるＯＲＦはフレーム＋３にある。
トランスポゾン挿入部位に隣接するＤＮＡ配列は配列番号６９（５５ｍｅｒ）で示してある。トランスポゾンは、この配列の３’末端に接して存在する。この配列は、より長い潜在的タンパク質をコードしている３つのオープンリーディングフレーム（＋１、＋３及び−３）を有している。本発明によるＯＲＦはフレーム＋３にある。
突然変異体７Ｆ８中のトランスポゾンの位置はパスツレラ・ムルトシダＰＭ７０遺伝子配列、Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＡＥ００６２２４の位置８２９２〜８２９３の間に相当する。このトランスポゾンは、ＰＭ７０遺伝子ＰＭ１８６６の相同体を破壊する。本明細書ではＰＭ１８６６のヌクレオチド配列は配列番号７０として同定されており、そのアミノ酸配列は配列番号７１として同定されている。
突然変異体９Ｃ８
トランスポゾン挿入部位の両側に隣接しているＤＮＡ配列は、配列番号７２（５９８ｍｅｒ、５’末端のトランスポゾン）及び配列番号７３（５６１ｍｅｒ、５’末端のトランスポゾン）で示してある。
トランスポゾン挿入部位の両側に隣接しているＤＮＡ配列は、配列番号７２（５９８ｍｅｒ、５’末端のトランスポゾン）及び配列番号７３（５６１ｍｅｒ、５’末端のトランスポゾン）で示してある。
停止コドンは、配列番号７２の位置２６〜２８に位置する。配列番号７２及び７３の配列は互いに組み合わされ、且つＯＲＦに限定されている。得られた配列は配列番号７４（５７５ｍｅｒ）で表されている。
突然変異体９Ｃ８中のトランスポゾンの位置は、配列番号７２及び７３からそれぞれ推定された位置である、パスツレラ・ムルトシダＰＭ７０遺伝子配列、Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＡＥ００６１３２の位置２２２４〜２２２５又は位置２２１０〜２２１１の間に相当する。両位置はＰＭ０９２６（ｆｉｍＡ）遺伝子内にある。本明細書ではＰＭ０９２６のヌクレオチド配列は配列番号７５として同定されており、そのアミノ酸配列は配列番号７６として同定されている。
他の１つのパスツレラセエ遺伝子／タンパク質は配列番号７６を用いて実施したブラストにより同定された。これはインフルエンザ菌ＦｉｍＡ（Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＡＦ０５３１２５及びＡＡＣ０８９９１）である。本発明者らは、ＰＭ０９２６とインフルエンザ菌ＦｉｍＡの間に１７１アミノ酸にわたって７７％の同一性を見い出している。
ＦｉｍＡはアドヘシン（線毛タンパク質）である。
９Ｃ８突然変異体はブダペスト条約に基づいてＰａｓｔｅｕｒ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎに寄託されており、アクセッション番号ＣＮＣＭＩ−３００１として入手可能である。
突然変異体９Ｈ４
トランスポゾン挿入部位に隣接しているＤＮＡ配列は配列番号９２（１３９１ｍｅｒ）で示してある。トランスポゾンはこの配列の位置８５０〜８５１に挿入された。この配列は１つの読み枠のみを有している。本発明によるＯＲＦはフレーム−２にある。
トランスポゾン挿入部位に隣接しているＤＮＡ配列は配列番号９２（１３９１ｍｅｒ）で示してある。トランスポゾンはこの配列の位置８５０〜８５１に挿入された。この配列は１つの読み枠のみを有している。本発明によるＯＲＦはフレーム−２にある。
開始コドンは位置１３１８〜１３１６に位置し、停止コドンは配列番号９２の位置２９〜３１に位置する。このＯＲＦで得られる配列は配列番号９３（１２９０ｍｅｒ）で表されており、そのアミノ酸配列は配列番号９４で表されている。
配列番号９２及び配列番号９４を用いて実施されたブラストにより相同遺伝子又はタンパク質は同定されなかった。
９Ｈ４突然変異体は、ブダペスト条約に基づいてＰａｓｔｅｕｒ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎに寄託されており、アクセッション番号ＣＮＣＭＩ−３００２として入手可能である。
突然変異体１０Ｇ１１
トランスポゾン挿入部位に隣接するＤＮＡ配列は、配列番号７７（７０ｍｅｒ）で示してある。トランスポゾンは、この配列の５’末端に接して存在する。開始コドンは位置６２〜６４に位置する。
トランスポゾン挿入部位に隣接するＤＮＡ配列は、配列番号７７（７０ｍｅｒ）で示してある。トランスポゾンは、この配列の５’末端に接して存在する。開始コドンは位置６２〜６４に位置する。
突然変異体１０Ｇ１１中のトランスポゾンの位置は、パスツレラ・ムルトシダＰＭ７０遺伝子配列、Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＡＥ００６０５６の位置２９３８〜２９３９の間に相当する。トランスポゾンは、ＰＭ７０遺伝子ＰＭ０２２０（ｒｐＬ３１＿１）の相同体を破壊する。本明細書ではＰＭ０２２０のヌクレオチド配列は配列番号７８として同定されており、そのアミノ酸配列は配列番号７９として同定されている。
ＲｐＬ３１＿１は５０Ｓリボソームタンパク質である。
突然変異体１１Ｅ８
トランスポゾン挿入部位に隣接しているＤＮＡ配列は、配列番号８０（５０６ｍｅｒ）で示してある。トランスポゾンは、この配列の５’末端に接して存在する。
トランスポゾン挿入部位に隣接しているＤＮＡ配列は、配列番号８０（５０６ｍｅｒ）で示してある。トランスポゾンは、この配列の５’末端に接して存在する。
開始コドンは、配列番号８０の位置１９５〜１９７に位置する。
突然変異体１１Ｅ８中のトランスポゾンの位置は、パスツレラ・ムルトシダＰＭ７０遺伝子配列、Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＡＥ００６０８５の位置２８２〜２８３の間に相当する。このトランスポゾンは、ＰＭ７０遺伝子ＰＭ０４８８の相同体を破壊する。本明細書ではＰＭ０４８８のヌクレオチド配列は配列番号８１として同定されており、そのアミノ酸配列は配列番号８２として同定されている。
突然変異体１２Ａ１
トランスポゾン挿入部位に隣接しているＤＮＡ配列は、配列番号８３（２４３ｍｅｒ）で示してある。トランスポゾンは、この配列の３’末端に接して存在する。
トランスポゾン挿入部位に隣接しているＤＮＡ配列は、配列番号８３（２４３ｍｅｒ）で示してある。トランスポゾンは、この配列の３’末端に接して存在する。
他の１つのパスツレラセエ遺伝子は配列番号８３及びそのコードされているアミノ酸配列（８１アミノ酸）により実施されたブラストにより同定された。本発明者らは、ＰＭ００６３タンパク質と８１アミノ酸にわたって１００％の同一性を見い出している。突然変異体１２Ａ１中のトランスポゾンの位置は、パスツレラ・ムルトシダＰＭ７０遺伝子配列、Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＡＥ００６０４２の位置２８８０〜２８８１の間に相当する。このトランスポゾンは、ＰＭ７０遺伝子ＰＭ００６３又はｌｅｐＡ遺伝子の相同体を破壊する。本明細書ではＰＭ００６３のヌクレオチド配列は配列番号８４として同定されており、そのアミノ酸配列は配列番号８５として同定されている。
他のグラム陰性菌遺伝子及びタンパク質は配列番号８５を用いて実施したブラストにより同定された。
ＬｅｐＡはＧＴＰ結合膜タンパク質である。
突然変異体１２Ｂ３
トランスポゾン挿入部位に隣接しているＤＮＡ配列は、配列番号８６（１４７ｍｅｒ）で示してある。トランスポゾンは、この配列の３’末端に接して存在している。
トランスポゾン挿入部位に隣接しているＤＮＡ配列は、配列番号８６（１４７ｍｅｒ）で示してある。トランスポゾンは、この配列の３’末端に接して存在している。
突然変異体１２Ｂ３の中のトランスポゾンの位置はパスツレラ・ムルトシダＰＭ７０遺伝子配列、Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＡＥ００６１５２の４０２８〜４０２９の間に相当する。トランスポゾンは、ＰＭ７０遺伝子ＰＭ１１１２又はｄｅａＤ遺伝子の相同体を破壊する。本明細書ではＰＭ１１１２のヌクレオチド配列は配列番号８７として同定されており、そのアミノ酸配列は配列番号８８として同定されている。
他の１つのパスツレラセエ遺伝子／タンパク質は、配列番号８８を用いて実施したブラストによって同定された。これはインフルエンザ菌ＨＩ０２３１（Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号Ｕ３２７０９及びＡＡＣ２１９００）である。本発明者らは、ＰＭ１１１２とＨＩ０２３１の間で６０５アミノ酸にわたって８０％の同一性を見い出している。
ＤｅａＤはＲＮＡヘリカーゼである。
突然変異体１３Ｅ１
トランスポゾン挿入部位に隣接しているＤＮＡ配列は、配列番号８９（１８７ｍｅｒ）で示してある。トランスポゾンは、この配列の３’末端に接して存在している。この配列は、有望なより長いタンパク質をコードする２つのオープンリーディングフレーム（＋１及び−３）を有している。本発明によるＯＲＦはフレーム−３にある。
トランスポゾン挿入部位に隣接しているＤＮＡ配列は、配列番号８９（１８７ｍｅｒ）で示してある。トランスポゾンは、この配列の３’末端に接して存在している。この配列は、有望なより長いタンパク質をコードする２つのオープンリーディングフレーム（＋１及び−３）を有している。本発明によるＯＲＦはフレーム−３にある。
突然変異体１３Ｅ１中のトランスポゾンの位置は、パスツレラ・ムルトシダＰＭ７０遺伝子配列、Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＡＥ００６１３８（ＰＭ０９８９）の位置２１７３〜２１７４の間に相当する。本明細書ではＰＭ０９８９のヌクレオチド配列は配列番号９０として同定されており、そのアミノ酸配列は配列番号９１として同定されている。
他の１つのパスツレラセエ遺伝子／タンパク質は、配列番号９１を用いて実施したブラストによって同定された。これはインフルエンザ菌ＨＩ０３２５（Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号Ｕ３２７１７及びＡＡＣ２１９８８）である。本発明者らは、ＰＭ０９８９とＨＩ０３２５の間で４１４アミノ酸にわたって７９％の同一性を見い出している。
１３Ｅ１突然変異体はブダペスト条約に基づいてＰａｓｔｅｕｒ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎに寄託されており、アクセッション番号ＣＮＣＭＩ−３００３として入手可能である。
トランスポゾン挿入突然変異体のＰＣＲ選択
トランスポゾンは、細菌のゲノム内のあらゆる場所に挿入することができる。しかし適切な突然変異体の選択はＰＣＲを用いて行うことができる。
トランスポゾンは、細菌のゲノム内のあらゆる場所に挿入することができる。しかし適切な突然変異体の選択はＰＣＲを用いて行うことができる。
１組のプライマーが用いられるが、かかるプライマーは、トランスポゾンに特異的なもの、例えば、Ｔｎ１０ＩＲ１（配列番号１０１）、Ｔｎ１０ＩＲ４（配列番号１０２）、ＫＴＧＲＩ（配列番号１００）、ＳｔｉｐＡ（配列番号９９）及びＳｔｉｐＪ（配列番号９８）、並びに突然変異される遺伝子又は配列に特異的なものである。この遺伝子のヌクレオチド配列又はその一部（例えば、上に配列決定されているようなトランスポゾン挿入の遺伝子座近傍領域の配列）はかかるプライマーの設計に有用である。これは、パスツレラ・ムルトシダの他の株、又は他のグラム陰性菌、例えばパスツレラセエ属の細菌、特にパスツレラ・ヘモリティカ、パスツレラ・アナティペスティファ、及びアクチノバチルス・プルロニューモニエの遺伝子又はヌクレオチド配列に適合し得る。
パスツレラ・ムルトシダＰＭ７０株又はＰ−１０５９株（実施例４）中の対応する遺伝子又はＯＲＦ及び／又はそれらの制御領域に関する情報（例えばそのサイズなど）を用いて、増幅ＰＣＲ断片をスクリーニングし、突然変異すべき遺伝子又は配列に挿入するトランスポゾンに対応するサイズを有するものを検出する。トランスポゾンがその遺伝子の外部に挿入された場合には、ＰＣＲ断片は増幅されないか、非常に長いサイズを持つ断片が増幅され得る。従って、ＰＣＲにより本突然変異体を選択することができる。
パスツレラ・ムルトシダＰ−１０５９株について、かかる遺伝子に特異的なプライマーは次のとおりであり得る：
これまでに得られている突然変異体の場合には、ＰＣＲは、以下の組のプライマーを用いて実施し、増幅ＰＣＲ断片は以下のサイズを有していた：
相同体の感染に対するトランスポゾン挿入突然変異体の有効性及び予防
パスツレラ・ムルトシダ１６０８４株（実施例１）由来のトランスポゾン挿入突然変異体を３週齢の通常飼育のシチメンチョウに点眼投与した。パスツレラ・ムルトシダ１６０８４株を用いて、眼からの相同体感染に対する有効性を検討した。
パスツレラ・ムルトシダ１６０８４株（実施例１）由来のトランスポゾン挿入突然変異体を３週齢の通常飼育のシチメンチョウに点眼投与した。パスツレラ・ムルトシダ１６０８４株を用いて、眼からの相同体感染に対する有効性を検討した。
通常飼育の３週齢のシチメンチョウを２４群準備した。Ｄ０（接種日）に、それらの群には、以下の表に示した約１０８ＣＦＵの突然変異体を点眼により接種した。
３週齢の通常飼育のシチメンチョウの１群についてはワクチン接種を行わないで、対照として用いた（第２５群）。
Ｄ２３に、すべてのシチメンチョウに１羽当たり１０８ＣＦＵを点眼投与することによりパスツレラ・ムルトシダ１６０８４株を用いて感染させた。
感染後２週間の間、毎日死亡数を記録した。この試験の終了時（Ｄ３７）に臨床検査を実施し、生存している鳥の健康状態を判定した。
予防率は、Ｄ３７時点で検証した鳥の数と健康な鳥の数を考慮して算出した。
一部の群については、これらの実験を再現した。予防率は累積結果である。本発明の一部の突然変異体はこれらの実験では試験しなかった。
非相同体の感染に対するトランスポゾン挿入突然変異体の有効性及び予防
パスツレラ・ムルトシダ１６０８４株（実施例１）由来のトランスポゾン挿入突然変異体を３週齢の通常飼育のシチメンチョウに点眼投与した。パスツレラ・ムルトシダＸ７３株（ＵＳＤＡ）を用いて眼からの非相同体の感染に対する有効性を検討した。
パスツレラ・ムルトシダ１６０８４株（実施例１）由来のトランスポゾン挿入突然変異体を３週齢の通常飼育のシチメンチョウに点眼投与した。パスツレラ・ムルトシダＸ７３株（ＵＳＤＡ）を用いて眼からの非相同体の感染に対する有効性を検討した。
３週齢の通常飼育の１０羽のシチメンチョウを５群準備した。Ｄ０に、それらの群には、以下の表に示した約１０８ＣＦＵの突然変異体を点眼により接種した。
３週齢の通常飼育の１０羽のシチメンチョウについてはワクチン接種を行わないままで、対照として用いた（第６群）。
すべてのシチメンチョウに、Ｄ２１に１羽当たり１０６ＣＦＵを点眼投与することにより、パスツレラ・ムルトシダＸ７３株を用いて感染させた。
感染後２週間の間、毎日死亡数を記録した。この試験の終了時（Ｄ３６）に臨床検査を実施し、生存している鳥の健康状態を判定した。
予防率は、Ｄ３６時点の検証した鳥の数と健康な鳥の数を考慮して算出した。
接合による画定欠損変異株の構築
最初に、高忠実度（ｈｉｇｈ ｆｉｄｅｌｉｔｙ）ポリメラーゼを用いて標的遺伝子と隣接ＤＮＡ配列とをＰＣＲにより増幅し、好適なクローニングベクターへクローニングする。ＰＣＲプライマーは、逆ＰＣＲで用いて最初の構築物を産生する場合にその遺伝子を欠失するように設計されている。ＰＣＲプライマーには、新しい制限部位を導入し、従って遺伝子欠失にマーカーを供給するためのＸｂａＩ部位が含まれている。次いで、パスツレラ染色体に移入するために、この欠失構築物を自殺ベクターｐＣＶＤ４４２（Ｄｏｎｎｅｎｂｅｒｇら、Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ ａｎｄ Ｉｍｍｕｎｉｔｙ、１９９１年、５９：４３１０〜４３１７頁）へ導入する。次いで、ｐＣＶＤ４４２プラスミドを大腸菌株ＳＭ１０λｐｉｒ中へ形質転換する。大腸菌ＳＭ１０λｐｉｒ／ｐＣＶＤ４４２による接合によって１６０８４（ＣＤＭ）Ｐ．ムルトシダ株へこの構築物を導入する。ｐＣＶＤ４４２プラスミド（アンピシリン耐性遺伝子）上に存在する抗生物質耐性マーカーを用いて、相同部位（部分２倍体）で染色体中に組み込まれたプラスミドを含有する形質転換体及び組換え体を選択する。パスツレラ突然変異体は１μｇ／ｍｌアンピシリン補充ＢＨＩ寒天プレート上で選択する。
最初に、高忠実度（ｈｉｇｈ ｆｉｄｅｌｉｔｙ）ポリメラーゼを用いて標的遺伝子と隣接ＤＮＡ配列とをＰＣＲにより増幅し、好適なクローニングベクターへクローニングする。ＰＣＲプライマーは、逆ＰＣＲで用いて最初の構築物を産生する場合にその遺伝子を欠失するように設計されている。ＰＣＲプライマーには、新しい制限部位を導入し、従って遺伝子欠失にマーカーを供給するためのＸｂａＩ部位が含まれている。次いで、パスツレラ染色体に移入するために、この欠失構築物を自殺ベクターｐＣＶＤ４４２（Ｄｏｎｎｅｎｂｅｒｇら、Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ ａｎｄ Ｉｍｍｕｎｉｔｙ、１９９１年、５９：４３１０〜４３１７頁）へ導入する。次いで、ｐＣＶＤ４４２プラスミドを大腸菌株ＳＭ１０λｐｉｒ中へ形質転換する。大腸菌ＳＭ１０λｐｉｒ／ｐＣＶＤ４４２による接合によって１６０８４（ＣＤＭ）Ｐ．ムルトシダ株へこの構築物を導入する。ｐＣＶＤ４４２プラスミド（アンピシリン耐性遺伝子）上に存在する抗生物質耐性マーカーを用いて、相同部位（部分２倍体）で染色体中に組み込まれたプラスミドを含有する形質転換体及び組換え体を選択する。パスツレラ突然変異体は１μｇ／ｍｌアンピシリン補充ＢＨＩ寒天プレート上で選択する。
ｐＣＶＤ４４２プラスミドは複製のためにＰｉｒタンパク質を必要とする。このタンパク質はｐｉｒ遺伝子によってコードされており、宿主Ｐ．ムルトシダ中ではなく、ドナー株ＳＭ１０λｐｉｒ中のλファージ溶原として存在する。従って、ｐＣＶＤ４４２プラスミドは宿主Ｐ．ムルトシダ株中では自己複製しない。従って、このプラスミドが染色体へ取り込まれた場合のみに、抗生物質耐性のコロニーが得られる。また、この自殺ベクターは酵素レバンスクラーゼをコードするｓａｃＢ遺伝子を含有している。この酵素はショ糖の存在下、大部分のグラム陰性菌に有毒である。従って、第２の組換え現象が生じ、染色体からのプラスミドが失われたコロニーを単離する対抗選択として、ショ糖選択を用いることができる。この第２の組換え現象により、２つの結果、すなわち、野生型対立遺伝子の再生、又は欠損変異株の生成が生じ得る。欠失突然変異を含有するコロニーは、コロニーＰＣＲによって同定する。
エレクトロポレーションによる定義した欠損変異株の構築
最初に、高忠実度ポリメラーゼを用いて標的遺伝子と隣接ＤＮＡ配列とをＰＣＲにより増幅し、好適なクローニングベクターへクローニングする。ＰＣＲプライマーは、逆ＰＣＲで用いて最初の構築物を産生する場合にその遺伝子を欠失するように設計されている。ＰＣＲプライマーには、新しい制限部位を導入し、従って遺伝子欠失にマーカーを供給するためのＸｂａＩ部位が含まれている。次いで、パスツレラ染色体に移入するために、この欠失構築物を自殺ベクターｐＣＶＤ４４２へ導入する。エレクトロポレーションにより１６０８４（ＣＤＭ）Ｐ．ムルトシダ株へこの構築物を導入する。１６０８４の実質的な細胞外莢膜を除去するため、定常期細胞をヒツジ精巣ヒアルロニダーゼ（Ｖ型、使用前にろ過滅菌（最終濃度２５μｇ／ｍｌ）で１時間処理し、その後細胞を回収、洗浄する。ｐＣＶＤ４４２（１．５μｇ）を１０％グリセロール中の細胞懸濁液（０．０５ｍｌ、１０１０細胞／ｍｌ）と混合し、直後に氷冷した１ｍｍエレクトロポレーションキュベット（米国、カリフォルニア州、Ｈｅｒｃｕｌｅｓ、Ｂｉｏｒａｄ）へ混合物をピペットで移す。Ｇｅｎｅ Ｐｕｌｓｅｒ（Ｂｉｏｒａｄ）を用いて細胞にパルスを加える（１２．５ｋＶ／ｃｍ、２５０オーム、４０μＦ）。パルス直後に、１ｍｌのＢＨＩで細胞を希釈し、培養物の各一部（５〜５０μｌ）をすばやく（１〜５分以内に）１μｇ／ｍｌアンピシリン含有ＢＨＩ寒天プレート上に広げる。プラスミドに存在する抗生物質耐性マーカー（アンピシリン耐性遺伝子）を用いて、相同部位（部分２倍体）で染色体中に組み込まれたプラスミドを含有する組換え体を選択する。
最初に、高忠実度ポリメラーゼを用いて標的遺伝子と隣接ＤＮＡ配列とをＰＣＲにより増幅し、好適なクローニングベクターへクローニングする。ＰＣＲプライマーは、逆ＰＣＲで用いて最初の構築物を産生する場合にその遺伝子を欠失するように設計されている。ＰＣＲプライマーには、新しい制限部位を導入し、従って遺伝子欠失にマーカーを供給するためのＸｂａＩ部位が含まれている。次いで、パスツレラ染色体に移入するために、この欠失構築物を自殺ベクターｐＣＶＤ４４２へ導入する。エレクトロポレーションにより１６０８４（ＣＤＭ）Ｐ．ムルトシダ株へこの構築物を導入する。１６０８４の実質的な細胞外莢膜を除去するため、定常期細胞をヒツジ精巣ヒアルロニダーゼ（Ｖ型、使用前にろ過滅菌（最終濃度２５μｇ／ｍｌ）で１時間処理し、その後細胞を回収、洗浄する。ｐＣＶＤ４４２（１．５μｇ）を１０％グリセロール中の細胞懸濁液（０．０５ｍｌ、１０１０細胞／ｍｌ）と混合し、直後に氷冷した１ｍｍエレクトロポレーションキュベット（米国、カリフォルニア州、Ｈｅｒｃｕｌｅｓ、Ｂｉｏｒａｄ）へ混合物をピペットで移す。Ｇｅｎｅ Ｐｕｌｓｅｒ（Ｂｉｏｒａｄ）を用いて細胞にパルスを加える（１２．５ｋＶ／ｃｍ、２５０オーム、４０μＦ）。パルス直後に、１ｍｌのＢＨＩで細胞を希釈し、培養物の各一部（５〜５０μｌ）をすばやく（１〜５分以内に）１μｇ／ｍｌアンピシリン含有ＢＨＩ寒天プレート上に広げる。プラスミドに存在する抗生物質耐性マーカー（アンピシリン耐性遺伝子）を用いて、相同部位（部分２倍体）で染色体中に組み込まれたプラスミドを含有する組換え体を選択する。
ｐＣＶＤ４４２プラスミドは宿主Ｐ．ムルトシダ株中で自己複製しない。従って、プラスミドが染色体中に組み込まれている場合にのみ、抗生物質耐性のコロニーが得られる。また、この自殺ベクターは酵素レバンスクラーゼをコードするｓａｃＢ遺伝子を含有している。この酵素はショ糖の存在下、大部分のグラム陰性菌に有毒である。従って、別の組換え現象が生じ、染色体からプラスミドが失われたコロニーを単離する対抗選択としてショ糖選択を用いることができる。この第２の組換え現象により、２つの結果、すなわち、野生型対立遺伝子の再生、又は欠損変異株の生成が生じ得る。
コロニーは、２〜４日間３７℃でインキュベーションした後に現れる。同様のプレート上にコロニーを画線塗布することにより個々の形質転換体を単離する。欠失突然変異を含有するコロニーは、コロニーＰＣＲによって同定する。
ワクチン及び有効性の試験
実施例８又は実施例９で得られた弱毒化欠損変異株は、２４〜４８時間、振盪条件下、ＣＤＭ培地中で培養する（Ｈｕら、Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ ａｎｄ Ｉｍｍｕｎｉｔｙ、１９８６年、８０４〜８１０頁）。
実施例８又は実施例９で得られた弱毒化欠損変異株は、２４〜４８時間、振盪条件下、ＣＤＭ培地中で培養する（Ｈｕら、Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ ａｎｄ Ｉｍｍｕｎｉｔｙ、１９８６年、８０４〜８１０頁）。
増殖が停止したところで培養物を回収し、続いて吸光度（ＯＤ）又はｐＨ測定を行う。
吸光度により細菌の濃度を検出し、必要に応じて、新しい培地を用いて１ｍｌ当たり１０９ＣＦＵの最終濃度まで濃度を調節する。
ワクチンの有効性は、３週齢のシチメンチョウにおいて、ワクチン接種と細菌感染によって試験する。
シチメンチョウに対し、ワクチン接種前に、血液サンプルのＥＬＩＳＡによって、パスツレラ抗体のないことを確認する。
シチメンチョウの第１群に、０．１ｍｌ中１０８ＣＦＵを注射で眼にワクチン接種する。
第２群は、ワクチン接種はしないままとした（対照群）。
Ｄ２１又はＤ２３に、すべての動物にＰ．ムルトシダＰ−１０５９株を眼から感染させる（動物１匹当たり０．１ｍｌ中１０８ＣＦＵ）。
Ｄ３５まで毎日死亡数を確認する。
対照と比較すると、ワクチン接種した動物は死亡率が低いことが認められる。
さらに、以下の段落に本発明を記載する。
１ グラム陰性菌の突然変異体であって、前記細菌が、配列番号２、６、９、１２、１６、１９、２２、２５、２８、３１、３４、３７、４０、４３、４６、４９、５２、５５、５８、６１、６４、６７、７０、７５、７８、８１、８４、８７、９０、９３として同定されているヌクレオチド配列からなる群から選択されるヌクレオチド配列によってコードされているアミノ酸配列と７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％若しくは９９％以上の同一性を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列中に１つの突然変異を有しており、前記突然変異が細菌の毒性の弱毒化をもたらす変異体。
２ 細菌がパスツレラセエ（Pasteurellaceae）である、段落１に記載の突然変異体。
３ 細菌が、パスツレラ・ムルトシダ（Pasteurella multocida）、パスツレラ・ヘモリティカ（Pasteurella haemolytica）、パスツレラ・アナティペスティファ（Pasteurella haemolytica）、又はアクチノバチルス・プルロニューモニエ（Actinobacillus pleuropneumoniae）から選択される、段落２に記載の突然変異体。
４ 細菌がパスツレラ・ムルトシダである、段落３に記載の突然変異体。
５ 突然変異が、ヌクレオチド配列における欠失、又はそのヌクレオチド配列への挿入、又は核酸の置換である、段落１から４のいずれか１つに記載の突然変異体。
６ 突然変異がヌクレオチド配列全体の欠失である、段落５に記載の突然変異体。
７ 挿入が、配列番号２中のヌクレオチド１８０〜１８１、又はヌクレオチド１８２〜１８３、又はヌクレオチド１９０〜１９１、配列番号６中のヌクレオチド７７〜７８、又はヌクレオチド１０２６〜１０２７、又はヌクレオチド１０２７〜１０２８、配列番号９中のヌクレオチド４１６〜４１７、配列番号１２中のヌクレオチド３８９〜３９０、配列番号１６中のヌクレオチド３８１〜３８２、配列番号１９中のヌクレオチド２１９〜２２０、配列番号２２中のヌクレオチド１３５３〜１３５４、配列番号２５中のヌクレオチド１３６〜１３７、配列番号２８中のヌクレオチド３８４〜３８５、配列番号３１中のヌクレオチド２２２〜２２３又はヌクレオチド２２５〜２２６、配列番号３４中のヌクレオチド２１７〜２１８、配列番号３７中のヌクレオチド１４１１〜１４１２、配列番号４０中のヌクレオチド９４３〜９４４、配列番号４３中のヌクレオチド８５５〜８５６、配列番号４６中のヌクレオチド３６９〜３７０、配列番号４９中のヌクレオチド１１１〜１１２、配列番号５２中のヌクレオチド４４３〜４４４、配列番号５５中のヌクレオチド４〜５、配列番号６１中のヌクレオチド５７３〜５７４、配列番号６４中のヌクレオチド８７５〜８７６、配列番号７０中のヌクレオチド２１８〜２１９、配列番号７５中のヌクレオチド１０７２〜１０８７、配列番号７８中のヌクレオチド６４〜６５、配列番号８１中のヌクレオチド２８２〜２８３、配列番号８４中のヌクレオチド１４３１〜１４３２、配列番号８７中のヌクレオチド９７４〜９７５、配列番号９０中のヌクレオチド８０２〜８０３、配列番号９２中のヌクレオチド８５０〜８５１；或いは配列番号５８のヌクレオチド１のすぐ上流；或いは配列番号６７のヌクレオチド１のすぐ上流で行われる、段落５に記載の突然変異体。
８ 非相同の核酸配列が、ウイルス性、寄生虫性若しくは細菌性病原体由来の免疫原、治療用タンパク質、アレルゲン、増殖因子、又はサイトカインをコードする非相同核酸配列を含む、段落１から７のいずれか１つに記載の突然変異体。
９ 段落１から８のいずれか１つに記載の弱毒化突然変異体、及び製薬上許容可能な希釈剤、担体、媒体又は賦形剤を含む、免疫原性組成物。
１０ アジュバントをさらに含む、段落９に記載の免疫原性組成物。
１１ 段落１から８のいずれか１つに記載の弱毒化突然変異体、及び製薬上許容可能な希釈剤、担体、媒体又は賦形剤を含むワクチン。
１２ アジュバントをさらに含む、段落１１に記載のワクチン。
１３ 配列番号２、６、９、１２、１６、１９、２２、２５、２８、３１、３４、３７、４０、４３、４６、４９、５２、５５、５８、６１、６４、６７、７０、７５、７８、８１、８４、８７、９０、９３として同定されているヌクレオチド配列からなる群から選択されるヌクレオチド配列によってコードされているアミノ酸配列と７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％若しくは９９％以上の同一性を有するポリペプチドをコードするヌクレオチドと、製薬上許容可能な希釈剤、担体、媒体又は賦形剤、場合によってはアジュバントを含む、免疫原性組成物。
１４ 配列番号２、６、９、１２、１６、１９、２２、２５、２８、３１、３４、３７、４０、４３、４６、４９、５２、５５、５８、６１、６４、６７、７０、７５、７８、８１、８４、８７、９０、９３として同定されているヌクレオチド配列からなる群から選択されるヌクレオチド配列によってコードされているアミノ酸配列と７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％若しくは９９％以上の同一性を有するポリペプチドに特異的な抗体を含む抗体製剤。
１５ 配列番号２、６、９、１２、１６、１９、２２、２５、２８、３１、３４、３７、４０、４３、４６、４９、５２、５５、５８、６１、６４、６７、７０、７５、７８、８１、８４、８７、９０、９３として同定されているヌクレオチド配列からなる群から選択されるヌクレオチド配列によってコードされているアミノ酸配列と７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％若しくは９９％以上の同一性を有するポリペプチド、又は前記ポリペプチドに特異的な抗体を用いて、グラム陰性菌による感染を検出する診断方法。
１６ グラム陰性菌に対する受動免疫組成物又は治療用組成物を調製するための段落１４に記載の抗体製剤の使用。
１７ 培地中のグラム陰性菌を検出するＰＣＲ用プライマーとしての、配列番号２、６、９、１２、１６、１９、２２、２５、２８、３１、３４、３７、４０、４３、４６、４９、５２、５５、５８、６１、６４、６７、７０、７５、７８、８１、８４、８７、９０、９３として同定されているヌクレオチド配列からなる群から選択されるヌクレオチド配列、又は少なくとも２０ヌクレオチドの断片の使用。
このように本発明の詳細な好ましい実施形態を記述してきたが、上記の段落によって定義されている本発明は、本発明の趣旨又は範囲から逸脱することなく、その多くの明らかな改変が可能なように、上記で述べられている特定の詳細に限定されるものではないことを理解されたい。
Claims (18)
- ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列中に突然変異を有するグラム陰性菌の突然変異体であって、突然変異する前の前記ヌクレオチド配列が、配列番号３７のヌクレオチド配列と９０％、９５％、９６％、９７％、９８％若しくは９９％以上の同一性を有し、前記突然変異により前記細菌が弱毒化される、突然変異体。
- 細菌がパスツレラセエ（Pasteurellaceae）である、請求項１に記載の突然変異体。
- 細菌が、パスツレラ・ムルトシダ（Pasteurella multocida）、パスツレラ・ヘモリティカ（Pasteurella haemolytica）、パスツレラ・アナティペスティファ（Pasteurella anatipestifer）、及びアクチノバチルス・プルロニューモニエ（Actinobacillus pleuropneumoniae）からなる群から選択される、請求項２に記載の突然変異体。
- 細菌がパスツレラ・ムルトシダである、請求項３に記載の突然変異体。
- 突然変異が、ヌクレオチド配列へのトランスポゾン挿入、ヌクレオチド配列の定方向突然変異誘発、又は相同組換えによってもたらされる、請求項１〜４のいずれかに記載の突然変異体。
- 定方向突然変異誘発又は相同組換えによってもたらされる突然変異が、ヌクレオチド配列における欠失、ヌクレオチド配列への挿入、又は核酸の置換の結果である、請求項５に記載の突然変異体。
- 突然変異が、定方向突然変異誘発によってもたらされ、ヌクレオチド配列全体の欠失を含む、請求項５記載の突然変異体。
- 挿入が、配列番号３７中のヌクレオチド１４１１〜１４１２の間で行われる、請求項６に記載の突然変異体。
- 少なくとも１つの非相同の核酸配列をさらに含む、請求項１〜８のいずれかに記載の突然変異体。
- 少なくとも１つの非相同の核酸配列が、ウイルス性、寄生虫性若しくは細菌性病原体由来の免疫原、治療用タンパク質、アレルゲン、増殖因子、又はサイトカインをコードする、請求項９に記載の突然変異体。
- 突然変異体が、アクセッション番号ＣＮＣＭ Ｉ−２９９９により入手可能な突然変異体４Ｇ１１、又は該突然変異体を同定するための特性をすべて有する細菌であり、４Ｇ１１突然変異体が配列番号３７に突然変異を有する、請求項１に記載の突然変異体。
- 突然変異が、ヌクレオチド配列の発現を制御する制御配列内で生じ、前記制御配列が、転写開始領域、翻訳制御領域、転写終結領域、プロモーター、リボソーム結合領域、遺伝子間領域、及びオペロンと会合する制御領域からなる群から選択される、請求項１〜１０のいずれかに記載の突然変異体。
- ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列中に突然変異を有するグラム陰性菌の突然変異体であって、
前記ポリペプチドが、
配列番号３８のアミノ酸配列と９０％、９５％、９６％、９７％、９８％若しくは９９％以上の同一性を有し、前記突然変異により前記細菌が弱毒化される、突然変異体。 - 細菌がパスツレラセエ（Pasteurellaceae）である、請求項１３に記載の突然変異体。
- 細菌が、パスツレラ・ムルトシダ（Pasteurella multocida）、パスツレラ・ヘモリティカ（Pasteurella haemolytica）、パスツレラ・アナティペスティファ（Pasteurella anatipestifer）、及びアクチノバチルス・プルロニューモニエ（Actinobacillus pleuropneumoniae）からなる群から選択される、請求項１４に記載の突然変異体。
- 細菌がパスツレラ・ムルトシダである、請求項１５に記載の突然変異体。
- ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列中に突然変異を有し、ロイシン非含有ＣＤＭ培地で選択されたパスツレラセエ（Pasteurellaceae）の突然変異体であって、突然変異する前の前記ヌクレオチド配列が、配列番号３７のヌクレオチド配列と９０％、９５％、９６％、９７％、９８％若しくは９９％以上の同一性を有し、前記突然変異により前記細菌が弱毒化される、突然変異体。
- ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列中に突然変異を有し、ロイシン非含有ＣＤＭ培地で選択されたパスツレラセエ（Pasteurellaceae）の突然変異体であって、前記ポリペプチドが、配列番号３８のアミノ酸配列と９０％、９５％、９６％、９７％、９８％若しくは９９％以上の同一性を有し、前記突然変異により前記細菌が弱毒化される、突然変異体。
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